Lucrare de disertație [307149]

[anonimizat]. Dr. [anonimizat]: [anonimizat]

2016

UNIVERSITATEA BUCUREȘTI

FACULTATEA DE BIOLOGIE

BIOLOGIE MEDICALĂ

Lucrare de disertație

Caracterizarea fenotipică a rezistenței și virulenței tulpinilor de Proteus sp. [anonimizat]. Dr. [anonimizat]: [anonimizat]

2016

[anonimizat] a [anonimizat], capabile să inițieze un proces infecțios la o [anonimizat]. [anonimizat] a [anonimizat]: [anonimizat].

[anonimizat], [anonimizat]. [anonimizat]. Infecțiile sunt date de o [anonimizat]: [anonimizat], [anonimizat]., Staphylococcus saprophyticus etc.

[anonimizat], [anonimizat] o [anonimizat], pneumonii, [anonimizat] a tractului urinar. Proteus spp. [anonimizat].

[anonimizat], [anonimizat] a produce mai mulți factori de virulență ([anonimizat], fimbriile, hemolizina, IgA proteaza) și prin formarea de biofilme la nivelul cateterelor. Pentru a înțelege mai bine modul prin care aceste tulpini uropatogene infectează tractul urinar am urmărit factorii de virulență și mutațiile de la nivelul genomului.

Scopul urmărit în această lucrare este acela de a prezenta: [anonimizat]., sensibilitatea la antibiotice a [anonimizat], caracterizarea fenotipică și moleculară. Algoritmul de diagnostic de laborator are o [anonimizat].

CAPITOLUL I

INFECȚIILE TRACTULUI URINAR

NOȚIUNI GENERALE

Infecțiile tractului urinar (ITU) [anonimizat], cea mai obișnuită infecție întâlnită în practica pediatrică. ITU sunt definite de prezența microogranismelor în tractul urinar care în mod obișnuit este steril. Acestea sunt date de o [anonimizat]: [anonimizat], [anonimizat]. și Staphylococcus saprophyticus [Flores-Mireles și colab., 2015 ], [anonimizat]anii, Enterobacter aerogenes, Serratia spp.. ITU determinată de fungi apare la pacienții imunodeprimați și pacienții cu diabet.

Infecția de tract urinar poate fi inaparentă sau poate să dea simptomatologie. Afectează oricare segment al căilor urinare și, din cauza raporturilor anatomice, odată instalată într-un segment se extinde și la celelalte: uretrite, prostatite, cistite, pielonefrite. Uneori este un episod acut, autolimitat la căile urinare inferioare, alteori, la pacienții cu predispoziție înnascută sau dobândită episoadele se repetă (recurențe, reinfecții) și infectia se cronicizează [D. Buiuc și M. Neguț, 2009].

1.1.2. Clasificarea infecțiilor urinare

Infecțiile tractului urinar se clasifică după recurență și localizarea infecției. Factori care pot complica infecția sunt: evoluția ITU, vârsta și condiții particulare (patologii asociate).

După recurență infecțiile urinare se clasifică în:

ITU primară (infecția diagnosticată prima dată), este considerată complicată datorită incidenței crescute a anomaliilor reno-urinare subiacente responsabile de sechele renale.

ITU recurentă se referă la bacteriuria recurentă care este de obicei rezultatul unei terapii incorecte (doze medicamentoase inadecvate), a rezistenței selective la antibiotice, a infecțiilor cu germeni cu sensibilitate diferită la antibiotice, a insuficienței renale asociate, a unui sindrom de malabsobție sau a unei litiaze renale, situații în care, nivelel terapeutic în mod obișnuit eficient, devine inadecvat.

ITU persistentă este caracterizată prin prezența aceluiași germene în culturile de urină și se asociază adesea unei anomalii de tract urinar care acționează ca un scut împotriva unei terapii cu antibiotic. Reinfecția tractului urinar apare de obicei pe cale perineală-uretrală la fete și prin colonizare periuretrală la baieți [Brett Whitte și colab., 2011].

După localizare infecțiile urinare se clasifică în:

infecții urinare joase necomplicate (inferioare) – sunt cunoscute drept cistite simple (infecții ale vezicii urinare ce determină o iflamație superficială a mucoasei acesteia)

infecții urinare superioare – sunt cunoscute sub numele de pielonefrite (infecții ale rinichilor)

Pielonefrita întotdeauna este o condiție gravă: formele acute se pot complica cu necroză papilară, iar cele cronice duc la insuficientă renală cu hipertensiune arterială.

Factorii favorizanți ai infectiilor urinare

Există o serie de factori favorizanți ai ITU printre care se enumeră:

administrarea abuzivă a antibioticelor în practica medicală

folosirea antibacterienelor în alte scopuri decât infecțiile umane (în alimente pentru conservare, loțiuni etc.)

diabetul zaharat scade capacitatea de apărare a organismului

anomalii funcționale și anatomice ale tractului urinar

transplantul renal

cateterism uretral

parametrii farmacocinetici ai antibioticelor (Wagenlehner F. și Naber K., 2004)

Simptomatologie

Cele mai comune simptome ale infecției tractului urinar inferior sunt polakiuria și disuria. Sindromul cistitic este caracterizat prin unul sau mai multe dintre următoarele semne și simptome: disurie, polakiurie, micțiuni imperioase, durere suprapubiană, urini tulburi, senzația de a “urină fierbinte”. La acestea se pot adăuga și indispoziție, fatigabilitate, irascibilitate. Disuria poate aduce elemente suplimentare de diagnostic, astfel:

disuria “internă” – începe înainte sau odată cu debutul micțiunii și este tipică pentru cistită

disuria “externă” – este resimțită la nivelul perineului, sugerează vaginita sau inflamația vulvei și nu începe o dată cu micțiunea.

Durerea suprapubiană joasă, este prezentă în 10% din infecțiile urinare joase necomplicate. În prezența a cel puțin un simptom din sindromul cistitic, probabilitatea unei infecții urinare este de aproximativ 50%, iar combinații specifice de simptome (disuria și polakiuria) în absența secreției sau a iritației vaginale cresc la peste 90% probabilitatea diagnosticului.

Simptomele pielonefritei, pe lângă cele ale infecției tractului urinar inferior, includ febră (peste 38,5˚C) cu sau fără: grețuri, vărsături, durere colicativă lombară. Rareori se manifestă și prin hematurie sau piurie [Salvatore S. și colab., 2011].

Deasemenea, pot fi prezente unele dureri deasupra osului pubian sau în partea inferioară a spatelui. Aceste simptome pot varia de la forme ușoare la forme severe și, la femeile sănătoase, durează în medie șase zile. Deși cistitele acute necomplicate nu pot fi luate în considerare ca o condiție gravă, calitatea vieții pacienților este adesea afectată în mod semnificativ [Colan R., 2011].

Infecțiile tractului urinar afecteză toate vârstele, se întâlnesc totuși mai frecvent la femei decât la barbati, jumatate dintre femei având cel puțin o infecție la un moment dat în timpul vieții. La nou-născuți și sugari prelevața este mai mare la băieți decât la fetițe. Ulterior raportul se inversează din ce în ce mai accentuat până la vârsta adultă. Diferența dintre sexe dispare însă la vârstnici, prin creșterea mai rapidă a prevalenței la bărbați legat de afecțiunile prostatei. Aproximativ 10-20% din femei sunt confruntate cu ITU cel puțin o dată în viață [D. Buiuc și M. Neguț, 2009].

Condiția anatomo – histologică a tractului urinar

Sistemul urinar este format din cei doi rinichi, căile urinare intra- și extrarenale. Partea glandulară a rinichiului îmbracă sinusul, o mare cavitate alăturată hilului renal. Sinusul conține bazinetul renal, țesut conjunctiv lax și țesut adipos prin care trec spre și dinspre porțiunea glandulară nervii, arterele, respectiv venele și vasele limfatice.

Bazinetul renal se continuă la nivelul hilului cu ureterul prin care ajunge urina în vezica urinară, de unde este eliminată periodic prin uretră. În bazinet se deschid calicele mari, care reunesc calicele mici [D. Buiuc și M. Neguț, 2009].

Partea glandulară este concentrată în cortexul renal, care acoperă zona medulară, format din 8-18 piramide renale conice. Baza piramidelor renale este dispusă spre cortex, iar vârful sau papilla proemină în lumenul fiecărui calice mic. Vârful papilei este perforat de 10-25 de orificii prin care se deschid tubii uriniferi. Nefronul este unitatea secretorie a rinichiului și este format din segmente repartizate în cortex și medulară. La limita dintre cele două, fiecare tub contort distal se continuă cu un scurt tub colector. Aceștia din urmă străbat radiar zona externă a medularei și fuzionează repetat cu alți tubisimilari în zona internă pentru a forma ducturile papilare. Din arterele arciforme de la joncțiunea corticalei cu medulara radiază spre periferie arterele interlobulare ale căror mici ramificații formează glomerulii renali [D. Buiuc și M. Neguț, 2009].

Tractul urinar dispune o bogata rețea vasculară limfatică în musculatura și corionul bazinetului și căilor urinare extrarenale. Acesta, de la calice și bazinet până la uretra proximală, este acoperit de un epiteliu “ tranzițional” cu aspect variat al celulelor.

Uretra masculină are 18 -20 cm lungime, iar partea distal și ceaa mijlocie sunt acoperite cu un epiteliu columnar stratificat și pseudostratificat. În uretra distală, apar insule de epiteliu scuamos, care devine continuu la nivelul fosetei naviculare. Glandele tubular ramificate, deschise în partea dorsală a uretrei, secretă mucus.

Uretra feminină are numai 2,5- 3 cm lungime și este acoperită de un epiteliu scuamos în care apar insule cu epiteliu columnar pesudostratificat. În profunzimea numeroaselor invaginații ale mucoasei sunt frecvente cellule producătoare de mucus [D. Buiuc și M. Neguț, 2009].

Condiția microbiologică a tractului urinar

Tractul urinar, cu excepția uretrei, este în mod normal steril, deși sunt posibile contaminări ocazionale ale vezicii urinare, mai ales la femei din cauza traiectului scurt și direct al uretrei.

Tractul urinar prezintă bariere antimicrobiene, si anume:

continuitatea uroepiteliului dublat de mucopolizaharid, un glicozaminoglican care antagonizează aderența bacteriilor lipsite de linganzi speciali;

spălarea mucoasei prin fluxul normal al urinei;

marea osmolaritate și marea concentrație de uree ca și pH-ul scăzut al urinei fac un mediu defavorabil dezvoltării bacteriene;

efecte antibacteriene ale secreției prostatice și glandelor periuretrale.

Uretra distală este normal colonizată cu bacterii provenite de pe tegumentul perineal, din colon și vulvă, prin urmare, aici se găsesc în cantități moderate stafilococi coagulazo-negativi, bacili difterimorfi, enterobacteriacee, enterococi [D. Buiuc și M. Neguț, 2009].

Considerații etio – patogenetice

Spre deosebire de alte țesuturi, barierele antiinfecțioase ale căilor urinare sunt labile, pe mucoasa vezicală fagocitoza de suprafață este practic absentă, astfel în pelicula de urină reziduală bacteriile se pot multiplica în intervalul dintre micțiuni. Alte condiții rup echilibrul microorganism – gazdă în defavoarea gazdei cu apariția infecției căilor urinare:

Perturbarea fluxului urinar; cauză mecanică ( obstrucție prin calculi, stricture uretrale, ale colului, uterul gravid, tumori pelviene, hipertrofia prostatei) sau funcțională (leziuni neurologice, traumatisme medulare),

Reflux vezico – uretral,

Modificarea compoziției urinare (ex. Diabet zaharat, sarcină),

Lezarea mucoasei prin instrumentații,

Corpii străini devin o nișă pentru bacteria care inițiază și întrețin infecția.

Invazia tractului urinar se produce prin trei căi:

l. calea ascendentă

ll. calea limfatică

lll. calea hematogenă

Calea ascendentă este cea mai importantă pentru accesul bacteriilor condiționat patogene în tractusul urinar. Reprezintă cea mai frecventă modalitate de propagare bacteriană responsabilă de ITU. Bacterii provenite din flora fecală, colonizează aria periuretrală și acced prin uretră în vezica urinară. Escherichia coli fiind agentul etiologic cel mai frecvent al ITU. Cu toate acestea, numai câteva serogrupe au capacități uropatogene (01, 02, 04, 06, 07, 075) legate de adezine care recunosc receptori sfingolipidici de pe uroepiteliu (pilii M și P), abundența antigenului K, rezistența la acțiunea bactericidă a serului sanguine, producerea de hemolizină. Alte serogrupe, deși predomină în microbiota colonului, produc numai ocazional colonizări ale urinei sau cistite [D. Buiuc și M. Neguț, 2009].

Alte enterobacteriacee,Proteus spp., sau Pseudomonas aeruginosa determină infecții cornice sau recurente, pe fondul unei uropatii obstructive, disfuncții neurogene sau după instrumentații ale căilor urinare. Staphylococcus saprophyticus este o cauza mai frecventă a cistitelor la femeile tinere, active sexual, iar Corynebacterium urealyticum la pacienți spitalizați, aflați sub tratament cu antibiotic. Candida albicans determină urocistite la diabetic necontrolați metabolic. Bacteriile anaerobe nesporulate sunt ocazional cauză de infecție la pacienți cu cancer vezical.

Speciile ureazo-pozitive (Proteus, Klebsiella) alcalinizează urina și favorizează producerea de calculi, ceea ce crează dificultăți majore în eradicarea infecției.

Calea limfatică. Propagarea pe calea limfatică a infecției tractusului urinar inferior spre basinet și rinichi este o posibilitate demonstrată experimental.

Calea hematogenă presupune evoluția prealabilă a unei infecții sistematice cu bacteriemie sau septicemie. Localizarea renală poate fi o etapă constant, ca în leptospiroze, sau ocazională, cum sunt pielonefrite cu Candida albicans, Haemophilus influenzae, abcese renale stafilococice. În alte infecții eliminarea renală a bacteriei se realizează fără leziuni renale clinic manifeste, ca în febrele enterice [D. Buiuc și M. Neguț, 2009].

Adenovirusurile serovar 11 și 21 determină cistite hemoragice la copii, însă virusurile care se elimină prin urină nu determină manifestări de ITU. Apariția pielonefritei declanșază un raspuns imun umoral față de microorganismul infectat (anticorpi anti – O, anto –K, anti- lipid A, antii – fimbrii). Nici anticorpii serici (IgM și IgG), nici cei eliminați prin urină (IgG, IgA) nu par a juca un rol în apărarea rinichiului din cauza ineficienței activări a complementului și fagocitozei în medulara renală. În ITU inferioare răspunsul imun este absent, infecția fiind superficială [D. Buiuc și M. Neguț, 2009].

Microbiota tractului urogenital

Tractul urogenital este steril, cu excepția uretrei și a vaginului. Microorganismele pot să migreze ascendant prin uretră, până în vezica urinară, dar în mod normal sunt rapid eliminate de anticorpii din secreții, de acțiunea microbicidă a celulelor epiteliale ce căptușesc vezica, precum și de fluxul urinar descendent.

Uretra feminină este colonizată de un număr mare de lactobacilli, streptococi și stafilococi coagulazo-negativi. Bacteriile de origine fecală (E.coli, E. faecalis, P. mirabilis, C.albicans) pot coloniza tranzitoriu uretra, dar când ajung în vezica urinară, proliferează și produc infecții ale tractului urinar [Chifiriuc C.M.,și colab., 2015].

E.H. Kass (1956) a stabilit, prin cercetări la paciente cu pielonefrită, ca semnificativ pentru ITU este pragul ≥ UFC bacili/mL urină [D. Buiuc și M. Neguț, 2009]. După noile studii privind etiopatogenia variatelor entități nosologice ale ITU, cu perfecționarea metodelor de investigare a căilor urinare și de prelevare a probelor de urină și biopsice, a devenit inevitabilă și diversificarrea pragului semnificativ clinic al organismelor condiționat patogene izolate din urină. Bacteriuria nu însoțește în mod necesar orice ITU: la pacienți cu simptome recurente de ITU și uroculturi sterile, prin tehnici bacteriologice conventionale și prin microscopie electronică de baleaj, au fost demonstrate bacterii în 24% din probe biopsice din tractul urinar și pe 42% din probele de uroepiteliu vezical cu leziuni evidente.

Rezultatele uroculturilor cantitative ale probelor din jet mijlociu, se extind pe o gamă foarte variată de concentrații. Izolatele în cantități sub UFC/mL sunt cel mai frecvent contaminanți, iar cele peste UFC/mL au cel mai frecvent semnificație clinică. Între și UFC/mL cele două condiții se întrepătrund ( apar mai frecvent la femei decât la bărbați). În acestă zonă de întrepătrundere semnificația izolatelor trebuie hotărâtă prudent, folosind datele clinice, identitatea izolatelor, eventual rezultatele furnizate de examenul unei noi probe (prelevată, la nevoie, pe cale șuntată). Dacă bacteriile cu mare capacitate de multiplicare în urină (bacili coliformi, bacil pioceanic, enterococi) realizează cel mai frecvent UFC/ mL în urina pacienților cu ITU, pragul semnificativ pentru stafilococi este de 5x UFC/mL, iar pentru Candida albicans de UFC/mL [D. Buiuc și M. Neguț, 2009].

În ceea ce privește ITU la copii, încă de la începutul anilor 1970, bacteriemia ocultă a fost preocuparea majoră pentru clinicieni în evaluarea stării febrile la sugari, care nu au nici o sursă de infecție recunoscută. Odată cu introducerea vaccinurilor conjugate eficiente împotriva Haemophilus influenzae și Streptococcus pneumoniae (care a dus la scăderi dramatice ale bacteriemiei și meningitei) a fost în creștere asocierea tractului urinar ca locul cel mai frecvent de infecții bacteriene oculte și grave. Deoarece prezentarea clinică tinde să fie nespecifică la sugari și probe fiabile de urină pentru cultură nu pot fi obținute fără metode invazive (cateterism uretral sau aspirație suprapubiană), diagnosticul și tratamentul poate fi amanat. Cele mai multe date experimentale și clinice susțin conceptul că întârzierile în instituirea unui tratament adecvat al pielonefritei crește riscul de afectare renală [Bonadio WA, 1987].

Diagnosticarea și managementul infecțiilor inițiale ale tractului urinar la sugari și copii mici (2-24 luni) cu stări febrile, care nu au nici semne neurologice evidente sau anomalii anatomice cunoscute a fi asociate cu recurențe ITU sau leziuni renale sunt făcute în baza a două literaturi de specialitate, și anume, a literaturii Medline și o analiză sistematică a literaturii de specialitate cu privire la eficacitatea terapiei microbiene profilactice pentru a preveni reapariția stării febrile.

În cazul în care un clinician decide că un copil febril, cu nici o sursă aparentă pentru febră necesită terapie antimicrobiană, acesta trebuie să se asigure că un specimen de urină se obține înainte de administrarea unui agent antimicrobian. Proba trebuie obținută prin cateterizare sau aspirație suprapubiană, deoarece diagnosticul ITU nu poate fi stabilit în mod fiabil prin cultura de urină colectate în punguța pediatrică ( rezultat cu o precizie mai mare). Culturile de specimene de urină colectate într-un sac aplicat la perineu au o rata fals – pozitivă inacceptabil de ridicată și sunt valabile numai în cazul în care se obțin reezultate negative [Taylor MH și White RH, 1983].

Cu o prelevanță ITU de 5% și o rată mare de rezultate fals pozitive, un rezultat “pozitiv” pentru cultura urinei colectate într-o punguță ar fi un rezultat fals pozitiv 88%. Pentru băieți , cu o prelevanță ITU de 2%, rata de rezultate fals – pozitiv este de 95%; pentru băieți circumciși, cu o prelevanță ITU de 0,2% rata de rezultat fals – pozitiv este de 99%. Prin urmare, în cazurile în care terapia antimicrobiană va fi inițiată, cateterizarea sau aspirația suprapubiană este neceesară pentru a stabili diagnosticul de ITU. Un dignostic ratat de ITU poate duce la cicatrici renale. Odată ce terapia antimicrobiană este inițiată, posibilitatea de a face un diagnostic definitiv este pierdută. Studii multiple ale terapiei antimicrobiene au arătat că urina poate fi sterilizată rapid [Levine DA și colab., 2004].

Etiologie

În infecțiile tractului urinar sunt implicați cu preponderență germeni Gram negativi, atât bacili ( Escherichia coli- în 86% din cazuri, Proteus spp.- 3%, Kebsiella spp. – 3%, Enterobacter spp.- 1,4%, Citrobacter spp. – 0,8%, Pseudomonas aeruginosa, Morganella morganii, Providencia stuartii, Gardnerella vaginalis <1%), cât și coci Gram negativi (Neisseria gonorrhoeae), dar și o serie de coci Gram pozitivi ( Staphylococcus saprophyticus-4%, Enterococcus spp. – 1,4%, Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae <1%) [R. Colgan și M. Williams, 2011].

Alți germeni patogeni implicați în infecțiile urinare sunt Chlamydia, Mycoplasma, Ureaplasma și Candida spp.. S-au diagnosticat și infecții urinare virale, atât cu localizare înaltă cât și joasă (cistită).

Diagnosticarea ITU

Abordarea diagnostică și terapeutică a unei infecții a tractului urinar presupune:

Recunoașterea ITU drept cauză patologică

Promptitudinea și corectitudinea diagnosticului

Instituirea precoce a tratamentului

Identificarea anomaliilor reno – urinare subadiacente

Terapia profilactică antibacteriană corectă [R. Colgan și M. Williams, 2011].

Principalele semne paraclinice ale ITU care sunt căutate în proba de urină sunt: piuria, care semnalizează inflamația, și bacteriuria, care indică agentul etiologic.

Piuria reprezintă eliminarea a peste 400 000 leucocite pe oră. Aceasta poate avea mai multe cauze, ITU este numai una dintre ele. De aceea predicția pozitivă pentru ITU a unei piurii izolate este mediocră.

Prezența bacteriilor în urină poate fi urmare a contaminării probei micționate cu microbiota uretrei distale sau vulvo – vaginale, a infecției căilor urinare sau a colonizării urinei vezicale cu contaminanți ocazionali.

Semnificative clinic sunt:

Bacteriuriile cu bacterii patogene. Sensibilitatea depistării acestei condiții crește după concentrarea probelor și prin utilizarea mediilor de îmbogațire.

Bacteriuriile cu bacterii conditionat patogene care depășesc statistic concentrația contaminanților uzuali ai probelor de urină corect prelevate. Acestea sunt urmărite numai prin determinări cantitative [D. Buiuc și M. Neguț, 2009].

Proba pacientului adult, este din jetul mijlociu după o igienă completă și satisface exigențele examenului citobacteriologic curent. Scopul urmărit în special este de a preveni contaminarea probei cu microorganisme vehiculate prin fire de păr, orice fel de particule din regiunea perianală, sau antrenate prin jetul de urină din uretra distală, labii, pliul balano-prepuțial sau de pe mâini. Se examinează prima urină matinală sau la cel puțin 3 ore de la micțiunea anterioară. Volumul necesar este de aproximativ 20 mL pentru depistarea cantitativă a microorganismelor condiționat patogene și aproximativ 50 mL pentru depistarea unor patogeni specifici.

Proba copilului necooperant (nou-născut sau sugar) este dificilă. După igienizarea și uscarea organelor genitale externe se fixează în jurul penisului sau vulvei orificiul unei pungi sterile , punguța pediatrică.

Există și prelevări speciale, cum ar fi aspirația suprapubiană sau prelevări prin cateter. Prima variantă șuntează cel mai eficient contaminarea uretrală a probelor de urină, însă nu o elimină în mod absolut la femei. Această metodă este singura metodă care poate atesta semnificația clinică a bacteriilor anaerobe din urină. Prelevarea probei prin cateter reduce riscul contaminării probei fără a-l elinina complet, dar expun pacientul la riscul infecției, care crește de la 1% pentru pacienții ambulatorii până la 10% la pacienții spitalizați, în mod special vârstnicii imobilizați la pat. Se practică aceasta metodă pentru pacienții necooperanți, pacienții care nu micționează din cauze neurologice sau urologice, pacienți cateterizați pentru exploatare urologică.

Indiferent de tipul de recoltare, probele de urină trebuie examinate microbiologic în maximum 2 ore de la recoltare. În condițiile în care intervalul nu poate fi respectat, probele trebuie refrigerate la C imediat după prelevare ( Buiuc)

Examenul citobacteriologic al urinei (ECU)

Urina este produsul biologic analizat cu cea mai mare frecvență în laboratorul de microbiologie. Cele mai frecvente infecții ale tractului urinar sunt cele ale vezicii urinare (cistite) și cele ale uretrei. Din aceste situsuri, infecția poate evolua ascendant la nivelul ureterelor (uretrită) și ulterior, la nivelul rinichilor (pielonefrită). Femeile sunt mai predispose la ITU decât bărbații. La ambele sexe infecția poate fi asimptomatică, acută sau cronică. ITU acută este mai frecventă la femeile de diferite vârste și tratată în ambulatoriu. ITU cronică este prezentă atât la bărbați, cât și la femei, fiind asociată de obicei cu o afecțiune primară (pielonefrita, prostatita, anomalii congenital ale tractului genitor-urinar) și necesită internare.

Prezența a două sau mai multe tipuri de microorganism diferrite într-o urocultură semnifică recoltarea/manipularea necorespunzătoare a probei și necesită repetarea recoltării, cu excepția pacienților cateterizați unde pot fi adesea obținute culture polimorfe de urină.

Pentru realizarea corectă a diagnosticului citobacteriologic al urinii estee necesară respectarea următoarelor condiții:

recoltarea aseptică a urinii și transportul corect la laborator;

cunoașterea principalelor specii microbiene care produc ITU;

cunoașterea etapelor ECU;

interpretarea rezultatelor;

efectuarea unei antibiograme corecte [Chifiriuc C.M.,și colab., 2015].

Microscopia

Examenul preparatului umed în cameră hemocitometrică (identificarea elementelor tisulare, sanguine, a cilindrilor urinari, a cristalelor urinare, levuri, Trichomonas vaginalis; tirajul de calitate al probelor pentru urocultura cantitativă; aprecierea piuriei). Prezența a mai mult de 15 celule epiteliale scuamoase/, mai ales în asociație levuri-bacterii, semnifică o contaminare vaginală sau uretrală a probei, și este inacceptabilă pentru urocultura cantitativă

Examenul frotiului colorat Gram (urmărește și înregistrează mocroorganismele după categoria microscopică și următoarea scală semnificativă, deasemenea prezența celulelor epiteliale scuamoase și a leucocitelor).

Urocultura cantitativă – metoda de referință – prin însămânțare cu pipetă gradată

Urocultura cu ansă calibrată

Citirea uroculturilor cantitative

Cultura pe placa cu agar-sânge prin însămânțare cu pipeta gradată, favorizează dezvoltarea unei game mai largi de bacterii, în special cele Gram positive, inhibate pe mediul slab selective pentru bacilii Gram negative, sau tulpini exigent nutritiv. Mediul diferențial slab selectiv evită impasul creat eventual prin invazia cu Proteus și permite diferențieri între colonii.

Urocultura cantitativă prin testul amprentei folosește hîrtia de filtru cu o anume suprafață, iar după ce a absorbit liber urina cu bacteriile conținute, este amprentată pe o placă cu mediu agarizat. Între numărul de colonii dezvoltate pe suprafața amprentei și rangul bacteriuriei există o relație practice constant.

Identificarea izolatelor și comunicarea etapizată a rezultatelor

Probe de urină micționată sau prelevată prin cateter

Un singur izolat de pe placă care depășește concentrația de UFC/ml urrină. Se înregistrează și se comunică.

Două tipuri de isolate de pe placă care depășesc fiecare UFC/ml urină. Cel mai frecvent este o contaminare, se recomandă o nouă recoltare cu respectarea riguroasă a exigențelor de prelevare și transport.

Un număr mai mare de bacteria sunt isolate în concentrații de cca UFC/ml urină. Contaminare grosieră sau multiplicarea contaminanților în probă. Probă necorespunzătoare din cauza contaminării.

O singură specie izolată în cantitate UFC/ ml urină. Se comunică semnificativ clinic.

Creșterea absentă sau bacteriurie de ordinul UFC/ ml urină, în concordanță cu bacterioscopia direct negativă se comunică diferențiat.

Probele de aspirat suprapubian.

Probe de la pacienți cateterizați.

CAPITOLUL II

CARACTERELE GENERALE ALE GENULUI PROTEUS ȘI IMPLICAȚIILE SALE ÎN PATOLOGIA URINARĂ

Cele trei genuri Proteus, Morganella și Providencia sunt membri ai tribului Proteeae și cuprind în prezent un total de zece specii. Toate au motilitate activă și sunt bacterii Gram-negative cu flageli și cili peritrichi, ce aparțin Familiei Enterobacteriaceae pe baza unor caracteristici biochimice commune. Printre cele mai semnificative asemănări, sunt reprezentate de capacitatea lor de a oxida fenilalanina deaminată și, în majoritatea cazurilor, (cu excepția unor specii din Genul Providencia), de capacitatea de hidroliză a ureei [Farmmer și colab, 1977].

Caracteristici neobișnuite, includ capacitatea speciilor de Proteus să se difernțieze în colonii migratoare după colonizarea suprafețelor solide. Interesul față de speciile care cuprind aceste genuri a avut loc în principal, dintr-o perspectivă clinică, deoarece acestea includ un număr de agenți patogeni umani semnificativi. În patologia umană, cele mai multe infecții sunt asociate cu spitalizarea prelungită, ca în cazul infecțiilor date de Proteus spp. și Morganella spp. Aceste specii colonizează cateterele și determină infecții associate ale tractului urinar (ITU) [J. Manos și R. Bellas, 2006].

2.1. Taxonomie și filogenie

Înainte de apariția clasificării pe bază filogenetică, o serie de teste biochimice au format baza pentru clasificarea taxonomică din genurile Proteus, Providencia, și după aceasta, separarea într-un nou gen, Morganella. (Tabelul 1 și 2).

Tabelul 1. Caractere biochimice comune ale genurilor Proteus, Morganella și Providencia

( Simboluri și abrevieri: +, prezent; -, absent; KCN- cianură de potasiu; ONPG- o-nitrofenil-β-D- galactopiranozidă)

Așa cum este prezentat în Tabelul 1, caracteristicile comune cele mai semnificative sunt (oxidative) dezaminarea de fenilalanină și triptofan; ambele sunt folosite pentru a distinge între aceste trei genuri și alte Enterobacteriaceae care nu produc aceste dezaminaze. Testele pentru producerea acestor dezaminaze au fost dezvoltate în anii 1950 și încă mai sunt utilizate pe scară largă [ Henriksen, 1950; Thibault și Le Minor, 1957].

Tabelul 2. Testele biochimice caracteristice fiecărui Gen: Proteus, Morganella, Providencia

Tabelul 2 prezintă testele biochimice care sunt frecvent utilizate pentru a distinge între aceste genuri. Singurul test care distinge Morganella de Proteus și Providencia este testul lizină Fe- agar. Pe de altă parte mai multe teste disting Proteus de Providencia. Providencia este caracterizată prin producerea de acid dintr-o varietate de zaharuri, în timp ce Proteus se distinge de Providencia prin hidroliza gelatinei și producerea de lipază și hidrogen sulfurat. Utilizarea metodelor filogenetice moleculare a dus la clasificarea mai multor specii pe baza înrudirii la nivel de ADN și realocarea în genuri separate. Aceste modificări includ: noul Gen Morganella cu un transfer al specie Proteus morgannii [Brenner și colab., 1978], clasificarea Providencia alcalifaciens biogrup 3 ca specii distinctive (Providencia rustigianii) [Higashitani și colab., 1995], și identificarea unui subgroup din cadrul acesteia din urmă ca o specie distinctă, Providencia heimbachae [Muller și colab., 1986]. Izolată pentru prima dată în 1906, [Morgan, 1906], Morganella morganii a fost inițial inclusă în Genul Proteus unde este și Proteus morganii. [Brenner și colab. 1978] au arătat că P. morganii a avut mai puțin de 20% omologie cu Proteus și cu Providencia spp. Necesitând relocarea într-un nou gen. Metoda folosită de aceștia în reclasificare a fost prin compararea valorii ADN monocatenar marcat 32p reasociat cu ADN din aceeași sursă (reacție omoloagă), în raport cu cantitatea easociată de ADN de la alte specii din aceste genuri. Valoarea rezultată a fost exprimată ca ‘procente de înrudire ADN‘.

Morganella morganii ulterior a fost împărțită în două subspecii bazate pe capacitatea sa de a fermenta trehaloza. Subdiviziunea ulterioară a acestor specii este realizată prin aplicarea unor metode moleculare mai discriminatorii de caracterizare. De exemplu, prin identificare moleculară de ARN ribosomal 16 S ( ribotipizarea) s-a demonstrat că deși izolatele clinice ale P. mirabilis, P. penneri, M. morganii și P. heimbachae au modele identice ale ribotipizării cu cele ale tulpinilor respective, cele din speciile rămase toate sunt expuse diferit, conținând de la doi la patru ribogrupuri [Pignato și colab 1999]. Genul Proteus cuprinde în present cinci specii: P. mirabilis, P. vulgaris, P. penneri,P.hauseri și P.myxofaciens. Genul Morganella are o singură spcie (Morganella morganii), în timp ce Providencia conține cinci specii (Providenciaa stuartii, Providencia rettgeri, Providencia rustigianii, Providencia heimbachae și Providencia alcalifaciens) (Rozalski, 1997).

Secvențele de gene 16S ARNr din cele șase specii reprezentative au ajutat la formarea unui arbore filogenetic prin programul de aliniere Clustal W [Thompson și colab.,1994] pentru a afișa relațiile evolutive dintre speciile acestor genuri.

Figura 1. Arbore filogenetic

Figura 1 indică relația strânsă dintre cele două specii de Providencia, precum și similitudinea între două specii de Proteus (Proteus vulgaris, Proteus penneri). În schimb asemănarea dintre Proteus mirabilis și celelalte două specii P.vulgaris și P.penneri este mai mică, fapt reflectat și în graficul de mai sus. Această deosebire specifică Genului Proteus este dată de la nivelul ARNr 16S ce se reflectă asupra caracteristicilor fenotipice și fiziologice ale P. mirabilis, pe care acesta le-a stabilit ușor spre deosebire de ceilalți membrii ai genului. Cu ajutorul microscopului electronic au fost analizate cele șase specii din culturi crescute peste noapte pe bullion Luria-Bertani [Asubel și colab, 1987], acestea fiind prezentate în Figura 2.

Figura 2. Micrografii electronice de specii selectate cuprinzând genurile Proteus, Morganella și Providencia. (A) Proteus mirabilis – celulă înnotătoare; (B) Proteus mirabilis – celulă cățărătoare; (C) Proteus vulgaris; (D) Proteus penneri; (E) Morganella morganii; (F) Providencia stuartii și (G) Providencia rettgeri.

2.2. Genul Proteus

Genul Proteus face parte din Familia Enterobacteriaceae și este reprezentat de bacilli Gram-negativi, cu motilitate, care se găsesc în mod frecvent și în mod oportunist sunt agenți patogeni umani [O’ Hara și colab., 2000].

În prezent, genul este format din cinci specii:

Proteus mirabilis

Proteus penneri

Proteus vulgaris

Proteus myxofaciens

Proteus hauseri, și încă trei specii de genomuri a căror denumire de specie încă nu a fost stabilită ( Genomuri Proteus spp. 4,5 și 6) [O’ Hara și colab., 2000].

2.2.1. Scurt istoric

Literatura de specialitate abundă în studii cu privire la taxonomia Genului Proteus, încă de la publicația inițială realizată de către Hauser, care a descries pentru prima dată genul. Termenul Proteus înseamnă “substituibil deformă, așa cum este personificat Proteus în poemele lui Homer…și are darul de transformare fără sfârșit”.

1885 – Hauser a descries Genul Proteus cu speciile: P.mirabilis, P.vulgaris și P.zenkeri

1919 – Wenner și Rettger au separat P. vulgaris și P. mirabilis pe baza fermentării zaharurilor

1966 – Cosenza și Podgwaite au descries P. myxofaciens

1978 – Brenner și colab. au definit P. vulgaris de biogrup 1

1982 – Hickman și colab. au descries P. penneri și au stabilit încă două biogrupuri de P. vulgaris

1993 – Costas și colab. au folosit SDS- PAGE pentru a separa P. vulgaris biogrup 2 și mai mult, pentru a subdiviza biogrupul 3 in două “taxonomii” separate

1995 – Brenner și colab. au solicitat înlocuirea tulpinei de P. vulgaris de tip NCTC 4175 cu ATCC 29905

1999 – Truper a înlocuit tulpina de P. vulgaris cu ATCC 29905 acordat.

Genul a avut inițial două specii: P. mirabilis și P. vulgaris, ambele au fost descries pentru prima dată de către Hauser in 1885. El a menționat caracterul de roire al organismelor și a împărțit tulpinile în cele două specii bazate pe viteza lor de a lichefia gelatin: P.vulgaris lichefiază gelatin “rapid” în timp ce P.mirabilis face acest lucru „mai lent”. De asemenea, Hauser a descries “Proteus zenkeri”, care nu avea nici abilitatea de a se cățăra, nici aceea de a lichefia gelatina, însă a anulat această constatare 7 ani mai tarziu (G. Hauser, 1892).

În 1894, Theobald Smith a raportat caracteristicile fermentative ale celor două specii folosind glucoza, zaharoza, lactoza și diminurea proprietății lor de a lichefia gelatina la culturile în vârstă (Smit T., 1894). În anul precedent, acesta a demonstrat cantitatea neobișnuit de mică de gaz produs de către P.vulgaris prin fermentarea glucozei, comparativ cu ale organisme enterice cunoscute pe atunci.

În 1919, Wenner și Rettger au studiat caracteristicile biochimice ale unui grup mai mare de tulpini de Proteus. În concordanță cu activitatea din 1885 a lui Hauser, tulpinile lor, de asemenea, mișunau și lichefiau gelatina. Toate aceste tulpini, au eliberat hidrogen sulfurat și au fost lactozo-nonfermentative. Capacitatea de a fermenta glucoza, zaharoza, maltoza a servit ca un mijloc de a subdiviza în continuare tulpinile în două grupe, așa cum a făcut Hauser. P.vulgaris fermentează glucoza, zaharoza, maltoza ușor, în timp ce P. mirabilis fermentează glucoza și zaharoza lent și nu fermentează maltoza (Wenner J., 1919).

În anul 1952 Kauffmann și Edwards a publicat un tabel taxonomic în care apare P.hauseri ca o clasificare alternativă a variantei vulgaris și mirabilis, însă nu a fost de lungă durată (Kauffmann F., 1952).

În 1966, Cosezana și Podgwaite au descris o altă nouă specie P. myxofaciens (“myxo”= șlamul- lb.greacă, „faciens”= pentru producerea- lb.latină) , izolată din larvele moliei țigănești. Produce slime și nu se cunoaște dacă a fost izolată de la om (Cosezana B., 1966).

Până la începutul anilor 1960, clasificarea bacteriană s-a bazat în principal pe observații culturale și de analiză fenotipică. În anul 1961, Marmur a descris o procedură pentru izolarea de ADN stabil, biologic activ, extrem de polimerizat de la bacterii, care a fost relativ lipsit de proteine și ARN. Acest lucru a fost primul pas spre caracterizarea genetică moleculară a bacteriilor (Marmur J., 1961). Britten și Kohne au dezvoltat o tehnică de hibridizare a ADN-ului, care a devenit instrumentul pentru rezolvarea mai multor probleme din taxonomia bacteriană. Această tehnică utilizată pentru fracționarea ADN prin legarea hidroxiapatitei. Acest proces a folosit faptul că ADN dublu catenar poate fi scindat în componente unice și că benzile unice caută să se reunească cu catenele lor complementare. Cu cât sunt mai strâns legate organismele, cu atât mai eficient este procesul de refacere al ADN.

După apariția tehnicilor, cum ar fi, hibridizare ADN- ADN și determinarea guanină – plus – citozină ( G + C ) , au permis oamenilor de știință să plaseze corect noi specii în genurile lor, cu toate astea, testările biochimice au ramas importante. Tehnica a devenit clară după ani de experiență în determinarea taxonomică a izolatelor umane.

Într -un studiu din 1978 pe 122 de tulpini, Brenner și colab., folosind această tehnologie, a demonstrat pentru prima dată eterogenitatea genetică a P. vulgaris . Un grup de tulpini a fost indol pozitiv , salicina pozitiv , iar esculina negativ și a fost desemnat P. vulgaris biogroup 1. În 1982 , Hickman și colab . a propus ca acest grup să fie redenumit Proteus penneri în onoarea lui John Penner, microbiolog canadian care a făcut multe contribuții la studii ale celor trei genuri de Proteeae (Hickman F., 1982).

La mijlocu anilor 1980 s-a realizat pentru prima dată electroforeza în gel de poliacrilamidă a proteinelor și analiza computerizată a modelelor ca un alt instrument pentru a identifica tipurile de bacterii și încadrarea lor taxonomică (Laemmli U., 1970). În 1993, Costas și colab., în Anglia, au folosit această tehnică și în continuare au subdivizat P. vulgaris în două biogrupe 2,3a și 3c, cu tulpina de tip (NCTC4175/ ATCC13315), fiind inclusă în biogrup numai 3a cu o singură tulpină. În același timp, Ohara și colab., au studiat studiat aceleași tulpini prin hibridizare ADN-ADN, urmărind caracterizarea fenotipică și utilizarea sursei de carbon. În urma acestor studii, s-a demonstrat că tulpina de tip P. vulgaris a fost genetic necaracteristică cu sutele de tulpini considerate membri tipici P.vulgaris. Astfel, Brenner și colab., în 1995 au solicitat ca un nou tip de tulpină să fie desemnat pentru P. vulgaris, prin urmare a fost desemnat o nouă tulpină cu un fenotip prescris ATCC 29905.

Studiile O’Hara și colab., au confirmat existența a patru specii de genomuri în cadrul biogrupului 3 care au fost denumite 4,5 și 6 și au propus ca specia de genom 3 să fie numit P. hauseri și genomurile 4,5 și 6 răman fără nume (O’Hara și colab., 2000).

2.2.2. Taxonomie

Din punct de vedere taxonomic, Proteus spp. face parte din:

Regnul Bacteria

Phylum Proteobacteria

Clasă Gamma Proteobacteria

Ordin Enterobacteriales

Familie Enterobacteriaceae

Gen Proteus

Specii mirabilis, hauseri, vulgaris, penneri, myxofaciens

Taxonomic genul este format din 8 specii, dintre care numai 3 prezintă importanță medicală: P. vulgaris, P. mirabilis și P. penneri. În tabel este prezentată o asociere de teste prin care se pot diferenția aceste specii.

Tabelul 3. Diferențierea speciilor de Proteus (procente reacții pozitive după Framer,1995)

La începutul anilor 1980, secvențierea genelor ARNr 16S cu compararea ulterioară a acestor secvențe și de analiză filogenetică a devenit un alt instrument promițător de taxonomie. Gena ARNr 16S a trei tulpini de P. vulgaris ( nume de fișier GenBank PVU233425, PRMRRD, și PVRN 16S) au fost complet ordonate, dar studii ample care încă nu au fost finalizate, pot dovedi și alte relații taxonomice (O’Hara și colab., 2000).

2.2.3 Habitat

Proteus spp. face parte din flora intestinală umană, însă în anumite condiții aceste specii cauzează infecții ce apar la nivel mondial. Este de asemenea, larg răspândit în mediul înconjurător, găsindu-se în multe habitate de mediu, inclusiv în regnul animal, a solului și a apelor poluate, și participă la ecosistemele de reciclare biologică. Speciile de Proteus sunt importanți agenți cauzatori de infecții nosocomiale și infecții ale tractusului urinar. În Europa și America de Nord, 4-6% din infecțiile cu Proteus spp. sunt dobândite în comunitate și 3-6% sunt nosocomiale. În spital, nu este neobișnuit pentru bacilii Gram negativi, pentru a coloniza atât pielea și mucoasa orală a pacienților și a personalului medical. Cu toate acestea , speciile de Proteus nu sunt cele mai frecvente cauze ale infecțiilor nosocomiale.

Proteus spp. sunt considerate patogene pentru indivizii tineri și agenți patogeni oportuniși pentru persoanele în vârstă. Rata de infectare este cea mai mare în rândul persoanelor în vârstă, în special a celor cu catetere (cateterizarea pe termen lung) sau frecvent, în timpul terapiei cu antibiotice (Public Health Agency of Canada). Proteus mirabilis cauzează 90% dintre infecțiile date de Proteus și poate fi considerată o infecție dobândită în comunitate. Proteus vulgaris și Proteus penneri sunt ușor izolate de la persoane fizice cu îngrijire pe termen lung sau spitalizate și la pacienți cu boli subadiacente sau cu sistemul imunitar compromis (Gus Gonzalez, 2015).

Alte grupuri țintă includ persoane de gen masculin și feminin prepuberal, cu rată mai mare de infectare raportate în randul bărbaților necircumciși. Indivizii cu cateterizare pe termen lung sau anomalii structurale ale tractului urinar sunt mai sensibile la infecția cu Proteus spp. Au fost raportate focare nosocomiale cu rezistență la antibiotice a Proteus spp.

Mod de transmitere. Deoarece Proteus spp. face paprte din flora intestinală umană poate provoca infecții in zona anală. De asemenea poate fi transmis prin catetere contaminate (în special catetere urinare) sau prin inoculare parenterală accidentală.

2.2.4 Caractere morfologice

Din punct de vedere morfologic speciile de Proteus pe frotiul colorat Gram se prezintă sub forma unor bacili Gram negativi, pleomorfi, nesorulați, necapsulați, mobili. Dimensiunea variază în general de la 0,3 până la 1mm lățime și 0,6 pțnă la 6 mm lungime. Forma celulei cu cili și peritrichi permit migrarea pe medii solide.

2.2.5 Caractere de cultură

Pentru izolare din prelevate clinice (urocultura), Proteus spp. necesită medii complexe care conțin lichide organice, în mod curent folosindu-se sânge de berbec adâugat în concentrație de 5% la o geloză de bază- bood agar base sau geloză Columbia. Deasemenea se poate izola și de pe medii selective, cum ar fi, agar MacConkey sau agar CLED (mediu de cultură diferențială, care susține creșterea tuturor potențialilor agenți patogeni urinari, precum și un număr de contaminanți, cum ar fi, lactobacili și micrococi) sau pe mediu cromogen.

Specii facultativ anaerobe, cresc la temperatura de 37˚C după incubare 18-24 de ore,iar pe suprafața gelozei simple datorită mobilității accentuate, apare un aspect caracteristic denumit “fenomen de invazie”- creșterea inițială de la locul unde mediul a fost însămânțat se face sub formă de valuri concentrice, care în câteva ore invadează întreaga suprafață a mediului.

Figura 3. Creșterea sub formă de invazie a P.mirabilis pe CLED Agar și Columbia sânge

O altă proprietate a tulpinilor de Proteus este “fenomenul de demarcație” care se pune în evidență tot pe geloză simplă în place Petri și care constă în apariția unei zone de oprire a creșterii pe suprafața mediului atunci când s-au însămânțat două tulpini diferite de Proteus. Acest fenomen este cunoscut ca fenomen de “demarcație Dienes” și este folosit ca marker epidemic [D. Buiuc, 2009].

Figura 4. Fenomen de “demarcație Dienes” a P. mirabilis

Pe geloză înclinată cultura însămâțată în lichidul de conservare va putea fi găsită în partea superioară a gelozei – “fenomen de cățărare”.

Pe mediul selective Istrate-Meitert tulpinile de Proteus dezvoltă colonii lactozo-negative, rotunde, cu centru negru prin producerea de H2S (colonii cu aspect de “ochi de pisică”), coloniile neputând fi diferențiate de cele ale salmonelelor ori shigelelor.

Pe mediul SS determină colonii rotunde cu centru opac de culoare brună și periferia decolorată.

Pe mediile selective nu se manifestă fenomenul de invazie, creșterea microbiană fiind parțial inhibată de sărurile biliare din compoziția mediilor.

În bulion, tulbură uniform mediul cu formarea unei pelicule la suprafață și degajând un miros pronunțat de putrefacție.

2.2.6. Caractere biochimice

Genul Proteus cuprinde specii mobile care fermentează glucoza cu puțin gaz și produc H2S, urează și fenilalanideaminază; nu fermentează lactoza, nu produc lizin decarboxilază și β- galactozidază. Pe mediile nutritive gelozate 2% fără inhibitori prezintă fenomenul de invazie sau de migrare, characteristic genului.

Sistemele convenționale asociază teste în baterii variabile ca extindere în funcție de practica laboratoarelor. Acestea fiind referință pentru toate celelalte sisteme test exoenzimatice.

Sistemele multitest, realizate prin asocierea mai multor teste în același volum reactiv sunt larg răspândite datorită avantajelor economice. Cel mai des folosite sunt asocierile TSI (Triple Sugar Iron) cu MIU (Mobilitate, Indol, Uree) și MILF (Mobilitate, Indol, Lizină, Fenilalanină).

Fig 5. Teste biochimice P. penneri Fig 6. Teste biochimice P.vulgaris Fig 7.Teste biochimice P. mirabilis

Asocierea de medii multitest TSI și MILF diferențiază Proteus de celelalte enterobacterii lactozo-negative prin producerea de fenilalanideaminază și absența lizindecarboxilazei. Producerea de indol de către P. vulgaris diferențiază speciile de Proteus chiar în etapa preliminară diagnosticului.

Identificarea definitivă este dată de identificarea biochimică prin setul lărgit de teste convenționale recomandate pentru încadrarea de gen și specie la Fam. Enterobacteriaceae și este utilizată în cazuri rare de atipii fenotipice ale izolatelor de Proteus.

Tabelul 3. Caracterele biochimice în funcție de specie

Legenda: + pozitiv 90-100%, – negativ 90-100%, [+] pozitiv 75-89%, [-] negativ 75-89%, d pozitiv 25-74%

2.2.7. Tratament

Alegerea unui antibiotic depinde de eficacitatea agentului, deoarece există riscul efectelor adverse , creșterea rezistenței sau daune colaterale (de exemplu: efectele adverse acologice ale terapiei cu antibiotice, care pot permite organismelor rezistente la antibiotice să prolifereze și să colonizeze sau să dea infecții cu organisme cu rezistență multiplă la medicamente. În plus, medicii trebuie să ia în considerare costul, disponibilitatea și factorii specifici fiecărui pacient (cum ar fi istoricul alergiilor). În medie pacienții observ ameliorarea simptomelor în termen de 36 de ore de la începerea tratamentului (Gupta K., 2007).

Există mai mulți agenți de primă linie recomandați pentru tratamentul infețiilor urinare acute necomplicate. Fluorochinolonele (ofloxacin, ciprofloxacin și levofloxacin) sunt considerate substanțe antimicrobiene adecvate în anumite cazuri, cum ar fi la pacienții cu alergii. Cu toate că fluorochinolonele sunt eficiente , ele au tendința de a da daune colaterale și trebuie luate în considerare la pacienții cu infecții mai grave decât cistite acute necomplicate. Anumite substanțe antimicrobiene (antibioticele β-lactamice, amoxicilina/ amoxicilina cu acidul clavulanic, cefaclor, cefpodoxime) pot fi luate ca terapie alternativă dacă agenții recomandați nu pot fi folosiți din cauza rezistenței cunoscute sau intoleranței pacientului (Jepson RG., 2000).

Antibioticele beta-lactamice nu sunt recomandate ca terapie de primă linie pentru cistita acută necomplicată, din cauza ratelor de rezistență pe scară largă ( E.coli este peste 20% rezistentă la fluorochinolone). Pentru a păstra eficacitatea fluorochinolonelor acestea nu sunt recomandate ca o opțiune de prim nivel. Fosfomicina și nitrofurantoinul au păstrat rete ridicate de activitate in vitro, în cele mai multe domenii (Gupta K., 2010).

CAPITOLUL III

IMPORTANȚA BIOLOGIEI MOLECULARE ÎN DEPISTAREA GENELOR DE VIRULENȚĂ ȘI A GENELOR CARE CODIFICĂ REZISTENȚA LA ANTIBIOTICE A SPECIILOR DE PROTEUS

Grupul Proteus Morganella Providencia reunește specii TDA+, FAD+. Structurile implicate în virulență sunt reprezentate de proteine de membrană externă (OMP) implicate in aderență, mitogene pentru limfocitele B; fimbrii, cu rol în aderența țesutului epitelial: MR/P, MR/K-like, prin care aderă la capsula glomerulară; ATF (ambient temperature fimbriae), UCA (uroepithelial cell adhesion) – fimbriile de tip similare celor de E.coli și fimbrii de tip P; flageli cu rol în ascensiunea infecțiilor urinare; urează, Ag H foarte variabil; IgA-proteaze; TDA, care generează proteine cu α-cetoacizi ce acționează ca agenți chelatori de Fe.

Caracteristici antigenice:

Antigenele de grup au semnificație practică în reacția de serotipizare.

Tulpinile de Proteus “O” (Ox19, Ox2, Oxy) sunt utilizate în reacția Weil-Felix pentru diagnosticul infecțiilor rickettsiene. Capsula conține acizi uronici, acid piruvic, grupări fosfat cu character acid, ce pot lega Mg2+ și favorizează formarea calculior renali.

Patogeneză: infecții minore (urează = factor de patogenitate), plăgi suprainfectate, septicemia, meningite purulente neonatal.

Speciile de Proteus reprezintă a treia cauză a infecțiilor tractului urinar, în special al celor nosocomiale. P. vulgaris produce infecții pulmonare, ITU, bacteriemie numai atunci când dobândește o localizare extraintestinală. Sub acțiunea ureazei pe care o produce, P. vulgaris eliberează NH4 și alcalinizează urea, fără posibilitatea acidifierii, favorizând formarea calculilor. Acesta este un agent pathogen nosocomial important. Specia P. mirabilis determină infecții nosocomiale și este frecvent izolată în laboratoarele de microbiologie clinic.

Unele studii atribuie potențial enteropatogen speciilor de Proteus mirabilis și P. penneri.

P. mirabilis este agentul unor bacteriemii, osteomielite, precum și al meningoencefalitei neonatal. S-a dovedit implicarea P. penneri într-un caz de bacteriemie concomitant cu un abces cutanat femoral la un pacient neutropenic cu leucemie limfocitară acută și într-o urosepticemie nosocomială la un pacient cu diabet.

Studii recente sugerează că Proteus mirabilis poate fi implicat în etiologia unor artrite reumatoide (la pacienții cu artrite reumatoide s-a identificat frecvent infecția urinară cu densitate mare a celulelor de Proteus).

Tulpinile de P. mirabilis indol-negative sunt, în general, mai sensibile la antibiotice decât cele indol-pozitive (P. vulgaris, P. penneri și P. hauseri).

Chow (1979) raportează o epidemie de P. mirabilis cu tulpini rezistente la ampicilină, cefalotin, tetraciclină, cloramfenicol, carbenicilină, colistin, trimetroprim-sulfametoxazole, streptomicină și aminoglicozide.

Tulpini clonale de P. mirabilis rezistente la gentamicină și clorhexidină (un antiseptic utilizat ca și dezinfectant al mâinilor, dar și în calitate de conservant), ca și la alți agenți antimicrobieni, sunt frecvent izolate din cazuri de infecții urinare, dde obicei disseminate de la pacienți cateterizați. P. mirabilis sensibil la teraciclină a fost izolat din bacteriemii și meningite la nou-născuți.

P. penneri este, în general, mai rezistent la penicilină decât P.vulgaris, iar în privința profilului său de sensibilitate se aseamănă mai mult cu Morganella morganii, decât cu P.vulgaris. Această sppecie este, în general, sensibilă la cefotaxim, la cefalosporine cu spectru larg (ceftriaxon, ceftizoxim și ceftazidina), cefepime, aztreonam, aminoglicozide, ciprofloxacin, tazobactam și imipenem, și poate fi rezistentă la cefazolin, cefprozil, cefuroxim, cefamandol, cefdinir, cefoperazon și ampicilină.

Tiparea serologică a fost preconizată încă din 1917 de Weeil și Felix. O schemă antigenică propusă de Kauffman și Perch, după modelul schemei Kauffman-White de la Salmonella, se bazează pe 55 factori antigenici “O” si 31 “H”. Serovarurile s-au dovedit buni markeri epidemiologici, îndeosebi în serviciile de urologie cu o frecvență înaltă de infecții încrucișate.

În tipizarea antigenică pentru identificarea enterobacteriaceelor trei tipuri de antigene sunt importante: antigenele „O” (somatice), antigenele „K” (de înveliș) și antigenele „H” (flagelare).

Antigenele „O” sunt localizate în stratul extern al peretelui bacterian, de unde și numele de “somatice”. În schemele antigenice reprezintă “antigenele de grup”, specificitatea lor fiind dată de porțiunea polizaharidică din complexul structural lipopolizaharidic format din trei părți:

Lipidul A, asemănător la toate enterobacteriaceele, responsabil de activitățile toxice ale complexului.

Miezul polizaharidic format din unități oligozaharidice diferite.

Polizaharidele specifice constituite din lanțuri lungi și ramificate, formate dinunități oligozidice (4-6 monozaharide) repetitive.

Sinteza acestor antigene este codificată comosomal, orice mutații ale genelor responsabile determină deficite enzimatice care afectează ansamblul complexului. Apar astfel antigene degradate, cunoscute ca antigene “R”. Prezența acestora face ca tulpinile să-și piardă specificitatea “O” și să aglutineze spontan în soluții saline izotone sau în soluție de acriflavină 1/500.

Antigenele “K” (capsulare) maschează prin prezența lor antigenele “O”.

Antigenele H (flagelare) lipsesc la enterobacteriaceele immobile și la unele tulpini imobile. Sunt constituite din flagelină, protein cu greutate molecular de peste 40000 și structură asemănătoare miozinei. Antigenele H sunt termodegradabile dar sunt prezervate prin formolare 5/1000.

Din altă schemă de clasificare antigenică, cea propusă de Vinkle, sunt prezentate serovarurile de Proteus OX19, OX2 și OXY pentru înrudirile antigenice cu rickettsiile și utilizarea lor ca antigene în reacția de aglutinare Weil- Felix în serodiagnosticul unor rickettsioze de primoinfecție.

Tiparea bacteriofagică a fost propusă de către Farmer și Popovici, însă randamentul este inferior altor markeri epidemiologici.

Rezistopia poate folosi antibiotic din grupul β-lactaminelor, aminoglicozidelor și floxacinelor față de care tulpinile de Proteus au dovedit grade și spectre diferite de sensibilitate (D. Buiuc, 2009).

3.2 Rezistența antimicrobiană

P. mirabilis este cunoscut pentru abilitatea sa de a roi. În mediu lichid acesta există ca formă vegetativă, celulă de înnot flagelată, cu peritrichi. Cu toate acestea, după ce a fost plasat pe o suprafață solidă, în 3, 4 ore forma vegetativă cu celule alungite înnotătoare se diferențiază în multinucleate, aseptate, celule migratoare hiperflagelate. Aceste celule hiperflagelate agregate formează plute multicelulare și migrează concentric de la inoculul central. Acest ciclu de diferențiere și consolidare dă P. mirabilis aspectul caracteristic țintă pe plăci de agar. Biogeneza flagelară este strâns controlată în P.mirabilis prin o cascadă de reglări pe niveluri, constând din clasa I,II și clustere de genă III (Gupta K., 2010).

CAPITOLUL IV

SEMNIFICAȚIA IZOLĂRII TULPINILOR DE PROTEUS SPP UROPATOGENE LA DIFERITE GRUPE POPULAȚIONALE ȘI REZISTENȚA FENOTIPICĂ LA ANTIBIOTICE

Infecțiile tractusului urinar (ITU) sunt cea mai frecventă afecțiune nefrologică, și deasemenea cea mai obișnuită patologie infecțioasă întâlnită în practica pediatrică. Infecțiile sunt afecțiuni inflamatorii produse de diferite microorganisme care ajung la nivelul aparatului urinar, unde se multiplică și determină în timp modificări în funcționarea normală a rinichilor și a căilor urinare. Ogranismele cel mai des intalnite cauzatoare de infecție urinară sunt: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Enterococcus faecalis și Staphylococcus saprophyticus, mar rar se întâlnesc si tulpini de Pseudomonas aeruginosa, Morganella morganii, Enterobacter aerogenes sau fungi.

După localizare, ITU pot fi joase, când sunt afectate uretra și vezica urinară (cistită simplă) și înalte, când sunt cuprinse și ureterele și rinichii (pielonefrită).

După simptomatologie, ITU pot fi asimptomatice (bacteriurie fără simptomatologie clinică), și simptomatice (bacteriurie însoțită de reacție inflamatorie- piurie, și manifestări clinice).

În mod normal tractul urinar este steril, exceptând uretra distală, care este colonizată cu bacterii provenite de pe tegumentul perineal, iar la femei și vulva. Aceste bacteria contaminează accidental vezica în cazul unei recoltări inadecvate a probei de urină.

4.1 MATERIALE ȘI METODE

Diagnosticul bacteriologic pentru infecție urinară cu Proteus spp. are în vedere izolarea și identificarea acestui organism din urină (prin examinarea caracterelor de cultură, morfologice și biochimice sau în sistemm automat prin analiza spectrometrică a macromoleculelor biologice). Produsul patologic (urina) a fost însămâțată pe un mediu de cultură selectiv,CLED Agar (Cisteină-Lactoză- Deficient de electroliți),utilizat în izolarea și identificarea bacteriilor din urină. Acesta susține creșterea agenților patogeni urinary și a contaminanților, dar previne acumularea nedorită de specii de Proteus din cauza lipsei de electroliți [Prospect Becton Dickinson].

FAZA PREANALITICĂ

Prelevarea produselor patologice

Urocultura

În cadrul Laboratorului Synevo urina se recoltează pe Copan UriSwab, fiind un sistem avansat de colectare, transport și pentru conservarea probelor de urină de la locul de colectare până la laboratorul de testare. Acidul boric și formiatul de sodiu, polimerizate în buretele recipientului sunt activate la contactul cu urina. Prin urmare, nu există nici un risc de multiplicare a bacteriilor sau de distrugerea lor în timpul transportului. Acest recipient asigură stabilitatea probei până la 48 de ore, în condiții de refrigerare și la temperature camerei.

Figura 8. Copan UriSWAB (originală)

Etichetarea recipientelor se face vizibil pe etichetă albă, pe care este notat: numele și prenumele pacientului, prelevatul și codul de identificare.

Transportul probelor:

Transportul probelor către laborator se face imediat după prelevare, pentru a asigura viabilitatea bacteriilor la temperatura camerei.

FAZA ANALITICĂ

Materiale, aparate și consumabile necesare:

plăci Petri

ansă bacteriologică

termostat

Carduri Neg MIC Panel Type 40

Carduri AST- GN84

Densimat Biomerieux

Densichek

Suspensie salină NaCl 0.6%

Siemens MicroScan WalkAway Plus System 96

VITEK 2 Compact

Bruker MALDI®Biotyper System

Copan WASP

Reactivi utilizați

Mediile utilizate pentru culturi și identificări: medii solide – CLED, medii pentru teste biochimice (TSI, MIU, MILF, Citrat)

Matrix for Maldi TOF

Microcomprimate de antibiotice

Principiul metodei

Proba este însămânțată în sistem automat (Copan WASP) sau manual cu ansă calibrată de 1µL pentru a estima semnificativ concentrația bacteriană/ ml de urină. După însămânțare incubarea se face la 35-37˚C timp de 18-24 de ore. Rezultatele obținute vor fi raportate la numărul de UFC/ ml și sunt semnificative.

Figura 8. Tipul de însămânțare

Interpretarea rezultatului în funcție de creșterea bacteriană

În tabelul următorul tabel este prezentată interpretarea rezultatelor obtinuțe la urocultură în funcție de modul de recoltare și statusul clinic al pacientului, conform ghidurilor europene de analiza a urinei (ECLM-EUG European Urinalysis Guidelines – 2000).

Tabelul 4. Ghid de interpretare uroculturi

Probele de urină recoltate prin nefrostomă și puncție suprapubiană sunt considerate în mod normal sterile și rezultatul este comunicat clinicianului indiferent de numarul de colonii.

Rezultatele semicantitative ale probelor recoltate din jetul mijlociu se vor comunica tinând cont de urmatoarele situații:

Absența creșterii se comunica prin: Bacteriurie < 103  UFC/mL (fara semnificație clinica).

1000 UFC/mL = pragul de detectie al uroculturii uzuale

UFC = unitati formatoare de colonii.

Figura9. Urocultură cu creștere negativă

Prezența  unei singure specii bacteriene în cantitate de 103-104 UFC sau 104-105 UFC necesită informații suplimentare de la medicul clinician (prezența simptomatologiei clinice, timpul de la ultima micțiune, control după tratament). Numărul UFC/mL semnificativ pentru infecția urinară depinde de metoda de recoltare și statusul clinic (vezi tabelul de mai sus).

Prezența a trei sau mai multe specii bacteriene în cantitate mai mica de 100 000 se va comunica: Bacteriurie < 100 000 UFC/mL (prezente 3 specii bacteriene) – posibila contaminare și se recomandă repetarea recoltării.

Figura 10. Urocultură cu 3specii bacteriene

· Prezența a doua tipuri de izolate care depașesc fiecare 105 UFC/mL urină reprezintă cel mai frecvent o contaminare. În această situație se ia legatura cu clinicianul și se solicită o nouă probă recoltată în condiții de igiena corectă. Daca din a doua probă se izolează în cantitate semnificativă aceleași bacterii, se confirmă relevanța clinică a izolatelor și se testează sensibilitatea celor 2 germeni la antibiotice. Infecția mixta este confirmată doar în aproximativ 10% din cazurile în care pacienții recoltează probele de urină din jetul mijlociu și la aproximativ 36% din pacienții cateterizați.

Prezența mai multor germeni, izolați fiecare în cantitate de cca. 105 UFC/mL de urina indica o contaminare grosieră. În acest caz rezultatul se comunică : Bacteriurie > 100 000 UFC/mL (prezente 3 specii bacteriene) – posibilă contaminare și se recomandă repetarea recoltării.

· În cazul prezenței unei singure specii bacteriene în cantitate ≥ 105UFC/mL urină se continuă cu identificarea pana la nivel de specie și se efectuează antibiograma.

Figura 11. Urocultură pozitivă cu P. mirabilis

Examenul caracterelor de cultură

Pe mediile nutritive gelozate 2% , fără inhibitori, speciile de Proteus prezintă fenomenul de invazie sau de migrare. Din locul inoculării, valuri succesive de culturămigrează concentric până la marginea mediului.

Identificarea culturii bacteriene

Identificarea culturii bacteriene pure este realizată prin analiza spetrometrică a macromoleculelor biologice prin intermediul Maldi TOF.

Probele sunt ionizate cu ajutorul radiației laser

Probele sunt puse pe o matrice cu 96 de spoturi

Se obține un spectru unitar pentru întreaga probă

Extragerea ionilor este asistată software

Folosește un laser cu focalizare fixă, de 337 nm, cu pulsuri de 3ns

Figura 11. Identificarea microorganismelor

Efectuarea antibiogramei

Testarea sensibilității la antibiotice a fost făcută prin metode cantitative, prin tehnica diluțiilor în medii lichide, în sistem automat VITEK și Microscan. Acestea exprimă valoarea CMB –concentrația minimă bactericidă ( cantitatea cea mai mică de antibiotic care determină efectul bactericid).

Etapele efectuării antibiogramei:

Prepararea inoculului

Standardizarea inoculului

Transerul suspensiei in panelul Neg MIC Panel Type 40 sau AST- GN84

Incubare 18-20 ore la 37˚C

Citire antibiogramă

CMB corespunde ultimei concentrații de antibiotic care a determinat distrugerea completă a bacteriilor (efect bactericid).

FAZA POST ANALITICĂ

Raportarea și interpretarea rezultatelor

REZULTATE ȘI DISCUȚII

În perioada 15 Ianuarie-15Aprilie s-au izolat în Departamentul de Microbiologie al laboratorului Synevo, 111 tulpini de Proteus mirabilis uropatogene. Cele 111tulpini au fost izolate dintr–un număr total de 17475 de uroculturi, dintre care 2505 (într-un raport de 14,33%) fiind pozitive.

Figura12. Raportul uroculturilor pozitive

Dintre uroculturile pozitive, în primul rând 75,20% au fost determinate de Escherichia coli, 10,49% Klebsiella pneumoniae, 4,43% Proteus mirabilis, 4,15% Enterococcus faecalis, 2,075% Streprococcus agalactiae, 0,83% Klebsiella oxytocca, 0,75% Pseudomonas aeruginosa, 0,71% Enterobacter aerogenes, 0,63% Staphylococcus saprophyticus, 0,59% Staphylococcus aureus, 0,31% Morganella morganii, 0,31% Enterobacter cloacae, 0,31% Citrobacter freundii, 0,27 % Citrobacter koseri, 0,19% Serratia marcescens, 0,15% Citrobacter koseri, 0,11% Enterobacter kobei, 0,11% Providencia stuartii, 0,07% Enterococcus faecium, 0,03% Staphylococcus lungdunensis, 0,03% Acinetobacter pittii, 0,03% Proteus penneri.

Figura13. Specia bacteriană

Alții 2,3% fiind reprezentați de:

Dintre cele 111 tuplini de Proteus mirabilis izolate din uroculturi, s-a remarcat o incidență crescută la popuația infantilă (0-14 ani) cu o pondere mai mare în rândul persoanelor de gen masculin, spre deosebire de populația adultă unde se observă o frecveță mai crescută în rândul persoanelor de gen feminin.

În perioada de vârstă 21- 50 de ani se observă o incidență medie a infecțiilor urinare date de Proteus mirabilis, iar perioada 15-20 de ani și 51-90 de ani prezintă o incidență mult mai scazută.

Prin urmare, infecțiile tractusului urinar afectează toate vârstele. La nou-născuți și sugari prelevanța este mai mare la băieți decât la fetițe. Ulterior raportul se inversează din ce în ce mai accentuat până la vârsta adultă. Diferența dintre sexe dispare însă la vârstnici, prin creșterea mai rapidă a prelevanței la bărbați legat de afecțiunile prostatei și instrumentațiile pe care le impun. Aproximativ 10-20% din femei sunt confruntate cu ITU cel puțin o dată în viață [D. Buiuc, 2009].

Din analiza rezultatelor obținute referitoare la rezistența la antibioticele testate tulpinilor izolate de Proteus mirabilis uropatogene, se constată că rezistența cea mai mare s-a întâlnit la Tetraciclină, cu un procent de rezistență de 98,19% urmat de Nitrofurantoin 97,29%, Ampicilină 55,85% și Biseptol 52,25%. Se constată deasemenea o rezistență crescută și la Aztreonam 37,83%. Surprinzător, și la o cefalosporină de generația a IV a (cefepim) se întâlnește o rezistență destul de mare 37,83%. Tulpinile de Proteus mirabilis uropatogene au arătat o rezistență scăzută la Piperacilin/Tazobactan 1,80%, Levofloxacină 13,51%, Amoxicilin/Acid clavulanic 18,01% și Gentamicină 18,01%.

Sensibilitatea tulpinilor de Proteus mirabilis izolate de la pacienții cu infecție urinară în funcție de grupa de vârstă. Prin acestă statistică se observă o creștere a rezistenței la antibiotice a tulpinilor de Proteus mirabilis o dată cu înaintarea în vârstă. Este posibil acest fapt datorită infecțiilor tractusului urinar recurente, care este rezultatul unei terapii antimicrobiene incorecte (doze medicamentoase inadecvate), a rezistenței selective la antibiotice, a infecțiilor cu germeni cu sensibilitate diferită la antibiotice, a insuficienței renale asociate, a unui sindrom de malabsobție sau a unei litiaze renale, situații în care, nivelele terapeutice în mod obișnuit eficiente, devin inadecvate.

Analizând asocierea rezistenței la antibiotice în cadrul aceleiași tulpini de P. mirabilis se constată o incidență crescută a tulpinei de P. mirabilis cu sensibilitate crescută. Prin urmare, aceasta manifestă rezitență la Tetraciclină și Nitrofurantoin având sensibilitate la restul antibioticelor și are o frecvență după cum urmează (41,3% la persoanele cu vârsta până în 25 de ani, 45% la persoanele cu vîrsta 26-35 de ani, 20% în perioada 36-45 de ani, 0% în perioada 46-55 de ani, 45% în perioada 56-65 de ani și 6,66% la persoanele cu vârsta peste 65 de ani.

De asemenea se remarcă și tulpini de P. mirabilis multirezistente, în special la persoane peste vâsta de 36 de ani, rezistența manifestându-se la 6,7 și chiar 8 antibiotice, ceea ce presupune selectarea de noi șuse microbiene multirezistente prin internări repetate și prin infecții urinare recurente.

CONCLUZII

Bibliografie

Flores-Mireles A.L., Walker J.N., Caparon M., Hultgren S.J. , 2015. Urinary tract infections: epidemiology, mechanisms of infection and treatment options, Nat Rev Microbiol. May;13(5):269-84.

Laemmli U K., 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage, T4.Nature.,227:680–685.

Hickman F. W., Steigerwalt A. G., Farmer III J. J., Brenner D J.,1982. Identification of Proteus penneri sp. nov., formerly known as Proteus vulgaris indole negative or as Proteus vulgaris biogroup 1. J Clin Microbiol., 15:1097–1102.

Marmur J., 1961. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms. J Mol Biol.,3:208–218

Cosenza B J, Podgwaite J D.,1966. A new species of Proteus isolated from larvae of the gypsy moth Porthetria dispar (L.) Antonie Leeuwenhoek J Microbiol Serol., 32:187–191

Jepson RG, Mihaljevic L, Craig J., 2000.Cranberries for treating urinary tract infections. Cochrane Database Syst Rev., (2): CD001322.

Gupta K, Hooton TM, Roberts PL, Stamm WE. ,2007, Short-course nitrofurantoin for the treatment of acute uncomplicated cystitis in women. Arch Intern Med. 167(20): 2207-2212.

Gupta K, Hooton TM, Naber KG, et al.,2011. International clinical practice guidelines for the treatment of acute uncomplicated cystitis and pyelonephritis in women: a 2010 update by the Infectious Diseases Society of America and the European Society for Microbiology and Infectious Diseases. Clin Infect Dis., 52(5): e103-e120.

Kauffmann F, Edwards P R.,1952. Classification and nomenclature of Enterobacteriaceae. Int Bull Bacteriol Nomencl Taxon., 2:2–8.

Wenner J J, Rettger L F.,1919. A systematic study of the Proteus group of bacteria. J Bacteriol.,4:331–353.

Smith T. 1894. Modification, temporary and permanent, of the physiological characters of bacteria in mixed cultures;, Philadelphia ,Vol. 9 pp. 85–109.

Dumitru Buiuc, Marian Neguț, 2009. Tratat de microbiologie clinică, Ediția a lll a , editura medicală , București ,pag.255-278, 695-765.

K Amano, JC Williams, GA Dasch, 1998.Structural properties of lipopolysaccharides fromRickettsia typhi and Rickettsia prowazekii and their chemical similarity to the lipopolysaccharide from Proteus vulgaris …, Microbiol.,4:321–353.

Wagenlehner FME, Naber KG.,2004. Antibiotics and Resistance of Uropathogens, EAU Update Series 2. 125-135.

Salvatore, S; Salvatore, S, Cattoni, E, Siesto, G, Serati, M, Sorice, P, Torella, M (June 2011). "Urinary tract infections in women.". European journal of obstetrics, gynecology, and reproductive biology 156 (2): 131–6.

Colgan, R (1 octombrie 2011). „Diagnosis and treatment of acute uncomplicated cystitis.”. American family physician MD University of Maryland School of Medicine, Baltimore, Maryland, Volume 84, Number 7, 84 (7): 771–6.

Bonadio WA., 1987.Urine culturing technique in febrile infants. Pediatr Emerg Care. , 3(2):75–78

Taylor CM, White RH.,1983, The feasibility of screening preschool children for urinary tract infection using dipslides. Int J Pediatr Nephrol.,4(2):113–114

O’Hara, C. M., F. W. Brenner, and J. M. Miller. 2000. Classification, identification,

and clinical significance of Proteus, Providencia, and Morganella.

Clin. Microbiol. Rev. 13:534–546.

Levine DA, Platt SL, Dayan PS, et al. Risk of serious bacterial infection in young febrile infants with respiratory syncytial virus infections. Pediatrics. 2004;113(6):1728–1734

Diagnosis and Treatment of Urinary Tract Infections in Children, BRETT WHITE, MD, Oregon Health and Science University, Portland, Oregon

Am Fam Physician. 2011 Feb 15;83(4):409-415.

www.publichealth.gc.ca