Listă de abrevieri [308639]

Listă de abrevieri

BBE = B. [anonimizat] = B. fragilis toxin

BHI = Broth Hearth Infusion

CMI = Concentrație Minimă Inhibitorie

CLSI = Clinical and Laboratory Standards Institute

CDC = Anaerobic Blood Agar

CAMP factor = Christie, Atkins, Munch-Peterson factor

EF = electroforeza

FAF = Finegoldia magna adhesion factor

G+C = Guanină și Citozină

HACCA matrix = acid α- cyano-4-hydroxycinnamic în 50% acetonitril/ 2,5% acid triflouracetic

LPS = [anonimizat] = [anonimizat] = Eagle Minimal Essential Medium

MLS = Macrolide-Lincomycin-Streptogramin mechanism

OMP = outer membrane proteins

PAB = [anonimizat] = penicilin binding proteins

PEA = Phenylethyl alcohol blood agar

PCR = Polymerase Chain Reaction

SufA = serin protează extracelulară

TFS = Tampon Fosfat Salin

Introducere

Bacteriile anaerobe nesporulate sunt componente ale microbiotei normale a omului și animalelor. [anonimizat], tegumentul și epiteliul tractului urogenital la femei (tabelul 1). Devin patogene oportuniste când ajung în situsuri sterile și exprimă factori proprii de virulență (capsulă, toxine, enzime) sau când statusul gazdei este imunocompromis.

Tabelul 1. Componentele microbiotei specifice diferitelor situsuri anatomice (după Bennett și colab. – Mandell., Douglas, Bennett's principles and practice of Infectious Diseases, 2015)

[anonimizat]:

[anonimizat] O2 ca acceptor final de e-, [anonimizat];

bacteriile anaerobe nu folosesc O2 molecular ca acceptor de e-. În interiorul acestui grup se disting două diviziuni fiziologice:

a) bacteriile anaerobe aerotolerante cresc puțin (dar cresc) [anonimizat]-o ambianță care conține între 2-8% O2. Creșterea optimă are loc în anaerobioză ([anonimizat]);

b) bacteriile anaerobe obligate variază în privința sensibilității lor la O2: unele tolerează cantități mici de O2, [anonimizat] 0,5% O2.

Efectul toxic asupra bacteriilor anaerobe îl exercită O2 și nu potențialul redox ridicat al mediului. In prezența O2, [anonimizat] O2: H2O2, O2- (radicalul superoxid), OH- (ionul hidroxil), OH. (radicalul hidroxil), 1O2 (oxigen singlet*) (Mihăescu, 2000).

Multe bacterii anaerobe obligate sunt bogate în flavine (enzime), care pot reacționa spontan cu O2 și formează produse toxice. [anonimizat] O2 [anonimizat] a crea un potențial redox scăzut.

[anonimizat].

Clasificarea bacteriilor anaerobe nesporulate pe baza caracterelor tinctoriale (colorația Gram).

[anonimizat]. [anonimizat], decât la adulți (https://emedicine.medscape.com/article/23339-overview).

Speciile bacteriene anaerobe izolate cel mai des din infecțiile endogene aparțin g. Bacteroides, Prevotella, Fusobacterium, Peptostreptococcus și Finegoldia.

În 2016, Centrul European de Prevenire și Control al Bolilor (ECDC) a raportat că 2,9% din infecțiile postoperatorii sunt cauzate de tulpini anaerobe, dintre care 1,8% aparțin g. Bacteroides (https://ecdc.europa.eu/sites/portal/documents/AER-HCAI-SSI.pdf).

Conform unui raport publicat în 2018 de ECDC, în perioada 2008-2012 au fost izolate tulpini anaerobe în 0,1% dintre cazurile de pneumonii ale pacienților internați în unitățile de terapie intensivă și în 1,2% dintre hemoculturile pozitive. Institul Național de Sănătate Publică din România nu a roportat nicio probă pozitivă pentru bacterii anaerobe (http://ecdc.europa.eu/sites/portal/files/documents/surveillance-report-HAI-ICU-mortality-2008-2012.pdf).

Având în vedere rezultatele limitate raportate de România la nivel european și datele insuficiente privind patogenitatea și virulența tulpinilor anerobe implicate în infecțiile endogene, această teză a avut ca scop investigarea prin metode fenotipice și genotipice a profilurilor de rezistență și de virulență ale unor tulpini bacteriene anaerobe nesporulate izolate din infecții endogene în vederea eficientizării terapiei antimicrobiene și prevenirea creșterii ratei de rezistență la antibioticele cu spectru larg.

I.PARTEA TEORETICĂ

Capitolul 1

MICROBIOTA FIZIOLOGICĂ

În cursul vieții intrauterine, organismele uman și animale sunt sterile (Keeler și Weitkamp, 2015). Imediat după naștere, acestea sunt colonizate progresiv cu un număr mare de microorganisme, care se localizează pe tegument și suprafața epitelială a diferitelor mucoase, în special a tractului digestiv (Frese și Mills, 2015).

Caracterizarea microorganismelor, care alcătuiesc microbiota organismului uman a evoluat foarte mult în ultimii ani, odată cu folosirea unor noi metode de cultivare și identificare.

Bacteriile reprezintă componenta microbiotei cel mai bine studiată. Microbiota organismului uman cuprinde aproximativ 1014 celule bacteriene, cu un ordin de mărime superior celulelor organismului uman (1013) (Ursell și colab., 2012).

Microorganismele asociate organismului uman și animal sunt de două categorii: autohtone sau indigene și alohtone sau străine, a căror proveniență este mediul extern (aer, sol, animale).

1.1.Microbiota autohtonă a organismului

Microbiota autohtonă, ascociată sau permanentă, cuprinde microorganismele indigene sau autohtone, care sunt asociate de-a lungul evoluției comune cu o anumită specie animală. Totalitatea microoganismelor care populează tegumentele și cavitățile naturale ale unui organism sănătos alcătuiește microbiota normală și este reprezentată de bacterii, microfungi și protozoare (Chifiriuc și colab., 2015).

Studii experimentale cu animalel axenice (germ-free) au arătat că microbiota fiziologică, în special ceea intestinală exercită efecte benefice asupra organismului gazdă:

– stimulează dezvoltarea organelor cu care vine în contact direct;

– sintetizează vitamine necesare metabolismului gazdei;

– stimulează mecanismele imunitare ale gazdei;

– inhibă colonizarea suprafețelor epiteliale (tegument, mucoasă) cu microorganisme patogene;

– degradează compuși chimici alimentari, care nu pot fi hidrolizați de sucurile digestive;

– favorizează eliminarea fecală a colesterolului.

1.2. Microoganismele alohtone sau străine

Microorganismele alohtone își au originea în mediul extern: aer, sol, alimente sau de la alte animale. Se găsesc în orice habitat normal, iar unele dintre ele pot fi patogene. Unele pot fi tranzitorii, altele se pot localiza într-o nișă eliberată de un microorganism autohton, numai dacă echilibrul acesteia este perturbat, sau la un organism aflat într-o condiție anormală (Chifiriuc și colab., 2015).

1.3. Microbiota anaerobă a cavității bucale

Cavitatea bucală cuprinde diferite nișe: secreția salivară, crevasele gingivale, suprafața limbii, situsuri pentru creșterea și dezvoltarea a sute de specii bacteriene (peste 700) (Paster și colab., 2006). Totuși, saliva prin conținutul său de 0,5% substanță uscată, reprezentată de enzime, substanțe antibacteriene (lizozim, lactoperoxidază), substanțe anorganice nu constituie un mediu favorabil pentru dezvoltarea microorganismelor (Van't Hof și colab., 2014). Bacteriile aderă la suprafața dinților, proliferarea lor este dependentă de producerea glucanului și determină formarea plăcii dentare (Banas și Vickerman, 2003). Inițial placa dentară este populată cu bacterii aerobe, iar pe măsură ce oxigenul este consumat se creează condiții de anaerobioză, care permit dezvoltarea microoganismelor fermentative ale glucidelor cu producere de acid lactic. Acizii rezultați din fermentație hidrolizează hidroxiapatita din smalțul subdiacent și conduc la apariția cariei dentare. Speciile strict anaerobe, care predomină în microclimatele anaerobe de la nivelul cavității bucale aparțin g. Prevotella (P. gingivalis), Porphyromonas (P. gingivalis), Fusobacterium (Sultan și colab., 2018).

1.4.Microbiota intestinului gros

La om și la cele mai multe mamifere, microbiota acestui segment este reprezentată de câteva sute de specii bacteriene intolerante la O2, dintre care puține au fost cultivate și identificate (Tuddenham și Sears, 2015). Microorganismele alohtone devin semnificative dacă densitatea lor depășește 106 celule/g de conținut intestinal. Ele sunt contaminante ale alimentelor sau își au originea în etajele superioare ale tractului digestiv (Jorgensen și colab., 2015).

La om, numai colonul conține circa 1014 microorganisme (Maier și colab., 2015), densitatea bacteriilor strict anaerobe fiind de 1011-1012 celule/g de conținut intestinal (Bull și Plummer, 2014). Microbiota este alcătuită din circa 1000 de specii anaerobe, marea majoritate necultivabilă, ce aparțin filumurilor Firmicutes și Bacteroidetes. Celulele bacteriene sunt atașate ca biofilme de materialul intestinal particulat și de stratul de mucus ce tapetează celulele epiteliale ale colonului (Brenchley, 2012). Multe bacterii aderă strâns la mucoasă sau sunt chiar inclavate între celulele epiteliale (Sadabad și colab., 2015). În microbiota intestinului gros predomină bacteriile anaerobe: Bifidobacterium spp., grupul Bacteroides fragilis, Clostridium spp. (Jandhyala și colab., 2015), iar bacteriile facultative (coliformii) formează numai 0,1-1% și au rolul de a menține potențialul redox scăzut pentru anaerobi (Llyod-Price și colab., 2016).

Interacțiunile microbiotei cu gazda sunt benefice (simbiotice) sau patologice (Wexler, 2007).

Relația simbiotică este reflectată de faptul că animalele germ-free sunt mai sensibile la infecție, vascularizația mucoasei tractului digestiv este mai puțin dezvoltată, activitatea enzimelor digestive este inferioară, peretele intestinal este mai subțire, nivelul Ig serice mai scăzut, plăci Peyer mai mici, limfocitele intraepiteliale mai puține (Chow și colab., 2010).

Unii anaerobi (membrii ai g. Bifidobacterium și Bacteroides) fermentează polizaharidele complexe, nedigerate din alimente, până la glucide simple și acizi grași cu catenă scurtă (Flint și colab., 2012; Zhang și colab., 2018).

Bacteriile anaerobe nu pot transloca, deoarece se leagă greu de enterocite, neavând situsuri-receptor pentru celulele epiteliale intestinale .

1.5. Microbiota tegumentului

Tegumentul este colonizat de un număr mare și divers de microorganisme. Majoritatea acestor microorganisme este inofensivă și protejează tegumentul de atașarea bacteriilor patogene (Grice, 2015). Bacteriile microbiotei tegumentului pot deveni patogeni foarte virulenți după pierderea integrității și bacteriile pătrund în situsurile sterile (Dryden, 2010). Densitatea microorganismelor, care colonizează tegumentul diferă de la o regiune a tegumentului la alta (regiunile axilară, inghinală, interdigitală, care oferă condiții favorabile dezvoltării microorganismelor), fiind influențată de pH și de factori de mediu (Ying și colab., 2015). Pe suprafața pielii, bacteriile anaerobe sunt de 10-100 de ori mai numeroase decât cele aerobe (Mihăescu, 2000).

Metodele de biologie moleculară au demonstrat că microbiota tegumentului cuprinde bacterii heterogene din punct de vedere genomic, astfel încât pot fi încadrate în patru filumuri: Actinobacteria, Proteobacteria, Firmicutes și Bacteroides (Hannigan și Grice, 2012).

Una dintre bacteriile anaerobe endogene, care colonizează tegumentul este Propinibacterium acnes, Gram pozitivă, aerotolerantă, componentă a microbiotei. Se găsește în foliculul pilos și în glandele sebacee, unde metabolizează trigliceridele din sebum cu eliberare de acizi grași (Marples și colab., 1971). Acizii grași oferă protecție față de colonizarea tegumentului cu bacterii patogene (Staphylococcus aureus și Streptococcus pyogenes) (Tomida și colab., 2013). De asemenea, produce bacteriocine – de exemplu, thiopeptide, care inhibă creșterea bacteriilor patogene (Christensen și Bruggemann, 2014). Numeroase studii au arătat implicarea P. acnes în acnee (Bojar și Holland, 2004; Linfante și colab., 2017), însă apariția acestei infecții este condiționată și de alți factori: procesul de maturizare funcțională a glandelor sebacee, sistemul imunitar, factori genetici și de mediu.

Capitolul 2

CARACTERIZAREA PRINCIPALELOR GENURI BACTERIENE ANAEROBE COMPONENTE ALE MICROBIOTEI AUTOHTONE

2.1. Bacterii anaerobe nesporulate Gram negative

2.1.1. Bacili Gram negativi anaerobi

Bacilii anaerobi Gram negativi nesporulați au extremități ascuțite sau rotunjite, sunt fusiformi, filamentoși și de cele mai multe ori, pleomorfi. Sunt o componentă semnificativă a microbiotei, colonizând mucoasa cavității bucale și a tractului digestiv inferior la om și animale. Unele specii metabolizează celuloza și alte polizaharide din rumen.

Veillon și Zuber (1898) au izolat și identificat bacili anaerobi nesporulați, pe care i-au denumit Bacillus fragilis, Bacillus fusiformis etc. Această clasificare a fost restructurată de Castellani și Chalmers (1919), care au încadrat bacilii anaerobi nesporulați în genul Bacteroides. Knorr (1922) a încadrat bacteriile nesporulate anaerobe cu aspect fusiform în genul Fusobacterium. Bacteroides fragilis a fost menționat în prima ediție a Bergey’s manual (1923).

Egerth și Gagnon (1933) au izolat 18 specii asemănătoare morfologic și metabolic, ulterior încadrate în grupul Bacteroides fragilis.

Rezultatele analizei cu metodele biologiei moleculare (ribotipizarea ARNr 16S) au permis modificări taxonomice majore ale g. Bacteroides. Astfel, din g. Bacteroides s-au desprins alte două genuri: Porphyromonas și Prevotella (Shah și Collins, 1989). Au fost identificate alte noi specii, care au fost incluse în genul Bacteroides: B. dorei, B. intestinalis (Bakir și colab., 2006), B. coprophilus (Hayashi și colab., 2007), B. plebeius, B.coprocola (Kitahara și colab., 2011), B. barnesiae, B. salanitronis, B. gallinarum (Lan, 2006).

2.1.1.1. Genul Bacteroides

g. Bacteroides este încadrat în familia Bacteroidaceae, ordinul Bacteroidales, clasa Bacteroidetes, filum Bacteroidetes. Cuprinde aproximativ 90 de specii, dintre care 40 aparțin grupului Bacteroides fragilis (http://www.bacterio.net), iar 25 dintre acestea au fost izolate de la om (Wexler, 2007). Alte specii cu importanță clinică sunt B. vulgatus, B. ovatus, B. distasonis și B. thetaiotaomicron.

Speciile g. Bacteroides fac parte din microbiota tractului digestiv, la copiii hrăniți artificial colonizarea începând în primele 10 zile de la naștere (Simon și colab., 1984). La copiii hrăniți natural, primele specii, care colonizează tractul digestiv aparțin genului Bifidobacterium (Mackie și colab., 1999).

Sunt  bacili  scurți, groși cu extermități rotunjite, drepți  sau ușor curbați, 2-4 μm lungime, nesporulați și imobili. Pe frotiul colorat Gram apar izolați, în perechi sau lanțuri scurte (fig.1).

Fig.1. Morfologia bacililor g. Bacteroides pe frotiul colorat Gram.

(https://en.wikipedia.org/wiki/Bacteroides_fragilis#/media/File:BacteroidesFragilis_Gram.jpg).

Sunt strict anaerobi, cresc la o temperatură între 22-440C, la un pH optim de 7.0, perioada de lag fiind 24-48h. Nu  produc  indol,  H2S,  nu  reduc  nitrații. Fermentează  glucoza, maltoza, lactoza cu producere de acizi grași volatili (succinic și acetic) și gaz. Nu fermentează adonita, dulcita,  inozita,  manita. Sunt bacterii pretențioase din punct de vedere metabolic: pentru izolare necesită medii îmbogățite cu sânge, bilă sau esculină, factori de creștere (hemina, vitamina B12 și menadiona). Uneori necesită medii cu adaus de antibiotice (kanamicină, streptomicină, neomicină, polimixina B) (Jorgensen și colab., 2015).

Pe mediul geloză cu sânge de cal, incubat în condiții de anaerobioză, coloniile cresc în 24-48 h, circulare, cu un diametru de 1-3 mm, translucide, semiopace, gri și uneori mucoide. Majoritatea speciilor nu sunt hemolitice, însă o proporție mică produc α-hemoliză. B. fragilis pe mediul selectiv cu bilă și esculină formează colonii cenușii, care precipită mediul în zona proximală (fig.2).

Fig.2. Colonii de B. fragilis pe mediul cu bilă și esculină.

Conținul de G+C (Guanină și Citozină) este 40-48 mol%, iar secvențierea ARNr a arătat omologia nucleotidelor între specii de aproximativ 93% (Jorgensen și colab., 2015).

Sunt catalazo-negativi, dar B. fragilis și alte câteva specii glicolitice pot produce catalază și superoxid-dismutază (Gregory și colab., 1977).

Majoritatea speciile g. Bacteroides sunt rezistente la penicilină, deoarece sunt producătoare de β-lactamază (Garrod, 1955).

Rolul benefic al g. Bacteroides în ansamblul microbiotei organismului

Speciile g. Bacteroides au rol benefic pentru organismul uman, deoarece acizii grași volatili rezultați din metabolizarea glucidelor sunt absorbiți la nivelul intestinului gros și utilizați ca sursă importantă de energie. Studiile pe animale germ-free au arătat că acestea au nevoie cu 30 % mai multe calorii decât cele convenționale pentru a-și menține o masă corporală normală (Gilmore și Ferretti, 2003).

Alte bacterii ale microbiotei intestinale, care nu au enzime de scindare a glucidelor, beneficiază de activitatea metabolică a speciilor g. Bacteroides. De exemplu, Bacteroides thetaiotaomicron scindează legăturile glicozidice ale polizaharidelor, eliberând glucide simple pentru Bifidobacterium longum (Sonnenburg și colab., 2006).

Majoritatea bacteriilor, care alcătuiesc microbiota intestinală sintetizează proteaze și peptidaze, care scindează proteinele la peptide, aminoacizi, fenol, amoniac și gaze. B. fragilis produce trei tipuri de proteaze (P1, P2 și P3) (Gibson și Macfarlene, 1988). P2 este o metaloprotează cu o gr. mol de 52 kDa, iar P3 este o cistein-protează de 34 kDa. Ambele proteaze sunt localizate la nivelul membranei externe și au rol de inițiere a procesului de proteoliză. Proteaza P1 este localizată în spațiul periplasmatic și în citoplasmă (Salyers și O `Brien, 1980). Are o gr. mol de 73 kDa și continuă procesul de scindare a peptidelor inițiat la nivelul membranei externe de celelalte două proteaze.

Speciile g. Bacteroides limitează colonizarea tractului digestiv cu bacterii patogene și împiedică translocația bacteriilor microbiotei endogene din intestin. Studii recente evidențiază rolul speciilor g. Bacteroides în prevenirea infecțiilor cu Clostridium difficile (Hopkins și Macfarlane, 2002). De asemenea, B. thetaiotamicron stimulează sinteza unei lectine cu efect bactericid, care se leagă de stratul de peptidoglican al bacteriilor Gram pozitive patogene împiedicând dezvoltarea unui proces infecțios (Cash și colab., 2006). Studii experimentale au arătat rolul B. thetaiotamicron de a stimula celulele Panteth cu producere de proteine angiogenice cu efect inhibitor asupra unor bacterii potențial patogene (Hooper și colab., 2003).

Bacteroides fragilis

Reprezintă aproximativ 1-2% din totalul bacteriilor, care alcătuiesc microbiota endogenă a organismului uman (Simon și Gorbach, 1984). În intestinul gros, B. fragilis utilizează ca sursă de carbon, atât glucidele simple cât și pe cele complexe, nehidrolizate. În situsurile de infecție poate utiliza ca sursă de carbon: glicoproteinele și glicolipidele celulelor gazdei, atât simple- manoza și galactoza, cât și complexe- N- acetil-D-glucozamina (NAG) și acidul N-acetilneuraminic (Baughn și Malamy, 2002).

B. fragilis este un bacil Gram negativ cu o lățime de 0,5 – 0,8 µm și lungime de 1,5 – 4,5µm. Majoritatea tulpinilor sunt capsulate, capsula fiind un factor de virulență foarte important (Jorgensen și colab., 2015).

Este cea mai comună specie anaerobă izolată din infecțiile endogene (Duerden, 1994). Unele specii sunt toxigene, produc enterotoxine, care determină infecții diareice, în special la copii (Caceres și colab., 2000).

Patogenitatea și factorii de virulență ai speciilor g. Bacteroides

Cu toate că aparține microbiotei normale, B. fragilis poate deveni un patogen oportunist foarte important, fiind izolat dintr-un număr mare de situsuri anatomice: cavitatea abdominală, ficat, plămâni, creier și din fluxul sanguin (Jorgensen și colab., 2015).

Factorii de virulență ai B. fragilis pot fi împărțiți în trei categorii (Wexler, 2007):

– cu rol în aderența celulelor bacteriene la țesuturi (adezine);

– cu rol în protecția față de efectorii imunitari;

– enzime degradative ale componentelor tisulare.

Adezinele sunt reprezentate de fimbrii și de unele proteine ale membranei externe.

Capsula polizaharidică a fost evidențiată prin colorație cu roșu de ruteniu la B. fragilis subsp. fragilis. În funcție de gradul de dezvoltare, se disting trei tipuri de capsulă: microcaspulă, o capsulă medie și o macrocapsulă, cu grade diferite de virulență. Expresia lor este codificată de gene diferite (Patrick și colab., 2009). Capsula, prin efectul repelent, protejează celula bacteriană de fagocite (Coyne și colab., 2000). Polizaharidul capsular este un factor de virulență cu rol important în formarea abceselor, fapt dovedit experimental: injectarea capsulei a fost suficientă pentru inducerea abcesului (Coyne și colab., 2000).

Formarea abcesului este o reacție de răspuns a gazdei la invazia celulelor bacteriene. Abcesul, format din celule bacteriene, resturi celulare și polimorfonucleare moarte este delimitat de o structură colagenică. Netratat, se extinde, celulele bacteriene trec în mediul intern și se diseminează (Kozlov și colab., 2018).

Din punct de vedere chimic, capsula la B. fragilis este alcătuită din variante biochimice de polizaharide: A, B, C (Baumann și colab., 1992). A fost evidențiată și clonată gena care codifică polizaharidul C (Kalka-Moll și colab., 2001).

Capsula limitează difuzia O2, favorizând supraviețuirea tulpinilor capsulate de B. fragilis în condiții de aerobioză (Patrick și colab., 1984).

Lipopolizaharidele (LPS) sunt componente majore ale celulelor Gram negative. Au activitate toxică slabă (dată de lipidul A), iar componenta polizaharidică- antigenul O, conferă specificitate serologică de grup. Structura LPS diferă în funcție de condițiile de creștere (Pumbwe și colab., 2006).

Proteinele membranei externe a peretelui celular (outer membrane proteins-OMP) au rol structural și funcțional:

– păstrează forma celulei bacteriene;

– reglează permeabilitatea celulei: funcționează în transportul pasiv și activ al apei, ionilor și nutrienților;

– unele OMP au rol de adezine: OmpA, mediază aderența celulelor bacteriene la celulele mucoasei intestinale (Wexler și colab., 2002).

Sensibilitatea la antibiotice a speciilor g. Bacteroides

Din situsurile de infecție, în care sunt implicate bacterii anaerobe, speciile g. Bacteroides sunt izolate cu cea mai mare frecvență. Unele tulpini sunt foarte virulente și au rezistență înaltă la un număr mare de antibiotice. De cele mai multe ori, tratamentul include antibiotice β-lactamice (cu și fără inhibitori ai β-lactamazelor), carbapeneme, clindamicină și metronidazol (Jorgensen și colab., 2015). Frecvența tulpinilor de Bacteroides rezistente la diferite antibiotice variază foarte mult. De exemplu, frecvența tulpinilor rezistente la clindamicină este cuprinsă între 15 și 44%, pentru cefotetan între 13-94%, iar pentru cefoxitin între 3,5 și 41,5% (CLSI, 2016). Rezistența la imipenem, ampicilină cu sulbactam, piperacilină cu tazobactam și metronidazol este întâlnită ocazional la tulpinile grupului Bacteroides (Turner și colab., 1995).

La speciile g. Bacteroides funcționează un număr mare de mecanisme care conferă rezistență la antibiotice.

Producerea de β-lactamază este cel mai frecvent mecanism care conferă rezistență la antibioticele β-lactamice. β-lactamaza este o enzimă codificată de gena cepA și este sintetizată de majoritatea speciilor g. Bacteroides. Acțiunea β-lactamazei este inhibată de inhibitorii comuni (acid clavulanic și sulbactam) (Edwards, 1997).

Carbapenemazele sunt rareori sintetizate de speciile g. Bacteroides. Au fost identificate două gene, cfiA și ccrA, care codifică două metalo-β-lactamaze încadrate în clasa B (Thompson și Malamy, 1990; Rasmussen și colab., 1990). Aceste enzime conferă rezistență la carbapeneme, la antibiticele β-lactamice simple sau în combinație cu inhibitori ai β-lactamazelor.

Un alt mecanism care conferă rezistență la antibioticele β-lactamice este modificarea numărului și tipului de proteine cu afinitate pentru peniciline (penicilin binding proteins-PBPs). Astfel, legarea și pătrunderea antibioticului în celulă sunt blocate (Edwards, 1997).

2.1.1.2. Genul Prevotella

g. Prevotella este încadrat în familia Prevotellaceae, ordinul Bacteroidales, clasa Bacteroidetes. A fost descris de Oliver și Wherry în 1921 (Shan și Collins, 1990). Autorii au identificat, în condiții de anaerobioză, colonii pigmentate pe mediu geloză cu sânge, formate din bacili Gram negativi anaerobi, pe care i-au denumit Bacterium melanogenicum. În 1995, Willems stabilește denumirea actuală a genului (Krieg și colab., 2010).

Genul Prevotella este foarte heterogen și cuprinde multe specii, care diferă între ele prin capacitățile metabolice. Astfel, unele sunt indol-negative și metabolizează lactoza. Speciile indol-pozitive aparțin grupului P. intermedia, care cuprinde: P. intermedia, P. pallens și P. nigrescens (Jorgensen și colab., 2015).

Aceste specii sunt componente ale microbiotei orale, dar se găsesc și în intestin. Sunt bacili Gram negativi imobili, nesporulați, majoritatea necapsulați.

Cresc lent, în 1-2 săptămâni, în condiții de strictă anaerobioză, pe medii îmbogățite cu sânge, glucoză și factori de creștere, hemină și menadionă. Coloniile produc un pigment negru uneori brun roșcat. Pigmentul poate să coloreze colonia (paracromofore) sau să difuzeze în mediul din jurul coloniei (cromopare) (fig.3). Uneori pot produce ușoară hemoliză. Temperatura optimă de creștere este 370C, dar anumite specii cresc între 25-450C (Zhou și Li, 2015).

Au un bogat echipament enzimatic fermentativ. Speciile se diferențiază pe baza produsului final al procesului fermentativ. Produșii majori ai metabolismului energetic fermentativ sunt acidul succinic și acidul acetic (Zhou și Li, 2015). Nu reduc nitrații, iar majoritatea speciilor nu produc indol. Conținutul de C+G este cuprins între 42% și 52% (Jorgensen și colab., 2015).

Fig.3. Colonii cu nuanță metalică de Prevotella nigrescens pe geloză agar cu sânge.

(https://microbewiki.kenyon.edu/index.php/File:P_nigrescens_1.jpg).

Provotella melanogenica

P. melanogenica denumită anterior Bacteroides melanogenicus este un bacil anaerob Gram negativ, pigmentat. Coloniile au 1-2 mm diametru sunt rotunde, convexe și opace. După 48 h, coloniile devin gri deschis, iar pe măsura creșterii timpului de incubare, coloniile se pigmentează de la maro închis la negru. Este imobilă, fermentează glucide, catalază negativă, iar unele tulpini pot forma capsulă (Jorgensen și colab., 2015). Aparține microbiotei normale a cavității orale, fiind izolată de pe epiteliul gingival, lingual și de pe suprafața dentară (Allisson și Hillman, 1997; Jorgensen și colab., 2015).

P. melanogenica a fost izolată din diferite situsuri de infecție, cel mai adesea din infecțiile dentare. De asemenea, a fost izolată ca unic patogen din osteoemielite (Panagiotis și colab., 2010), din abcese peritonsilare (Jousimies-Somer și colab., 1993) și din infecții vaginale (Athanasiou și colab., 2006).

În situsul de infecție, P. melanogenica exprimă factori de virulență: adezine, colagenaze, neuraminidaze, proteaze care hidrolizează IgG și IgA, fosfolipaza A și capsula polizaharidică. Unele tulpini sunt producătoare de hemolizine (Heather și Hillman, 1997).

Sensibilitatea la antibiotice a speciilor g. Prevotella

Aproximativ 95% dintre speciile g. Prevotella sunt rezistente la penicilină și ampicilină (Kononen și colab., 2011), însă si-au păstrat sensibilitatea la moxifloxacin, metronidazol, carbapeneme și amoxicilină cu acid clavulanic. Rezistența la peniciline este datorată sintezei β-lactamazei.

2.1.1.3. Genul Porphyromonas

G. Porphyromonas (porphyreos, lb. greacă = vișiniu; monas = unitate) aparține familiei Porphyromonadaceae, ordinul Bacteroidales, clasa Bacteroidetes. Din punct de vedere morfologic sunt bacili sau cocobacili, imobili, nesporulați, care pe geloză agar cu sânge, formează colonii mici, rotunde, convexe cu diametrul de circa 3 mm. Temperatura optimă de creștere este de 370C. Prezența fierului în mediu este o condiție esențială pentru creștere.

Fermentează glucidele, produșii rezultați fiind acidul n-butiric, propionic, acidul acetic, acizii izo-butiric, izo-valerianic, succinic și acidul fenilacetic, cu excepția P. gingivalis care este azaharolitic. Conținutul de C+G este cuprins între 40% și 55%. Caracteristica importantă a speciilor g. Porphyromonas este producerea pigmenților porfirinici (Jorgensen și colab., 2015).

Speciile g. Porphyromonas sunt componente ale microbiotei orale a omului și animalelor. Unele specii patogene au fost izolate din infecții ale cavității orale, dar și din sânge, lichid amniotic, lichid peritoneal, abcese pelviene, endometrite. De asemenea, speciile izolate de la animale pot cauza infecții ale rănilor la om, produse prin mușcătură (Abrahamian și Goldstein, 2011).

Cea mai studiată specie a g. este P. gingivalis. Este un patogen important, asociat cu bolile periodontale (Jorgensen și colab., 2015). Este imobil, azaharolitic, obligat anaerob, cu formă cocobacilară. Pe geloză cu sânge de cal, coloniile sunt inițial albe sau crem, iar după 4-8 zile devin roșii sau negre datorită producerii pigmenților porfirinici (Bennett și colab., 2015) (fig.4).

P. gingivalis sintetizează factori de virulență: capsula, fimbrii, lipopolizaharide, proteine ale membranei externe și proteinaze. De asemenea, sintetizează enzime care inactivează sistemele moleculare imunitare ale gazdei: imunoglobulinele, inhibitorii proteazelor, proteinele cu rol bactericid și proteinele cascadei complementului (Zenobia și Hajishengallis, 2015).

Fig.4. Colonii negru-metalic de P. gingivalis pe mediul geloză îmbogățit cu sânge de cal.

(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4746253).

Sensibilitatea la antibiotice a speciilor g. Porphyromonas

Speciile g. Porhyromonas sunt sensibile la antibioticele utilizate în mod curent în tratamentul infecțiilor determinate de bacteriile anaerobe: amoxicilină cu acid clavulanic, piperacilină cu tazobactam, imipenem, cefalosporine și metronidazol. Producerea de β-lactamază a fost evidențiată la câteva specii: P. asaccharolytica, P. somerae (Summanen și colab., 2005), P. catoniae (Nyfors și colab., 1999), P. uenonis (Finegold și colab., 2004).

2.1.1.4. Genul Fusobacterium

g. Fusobacterium este clasificat în familia Fusobacteriaceae, ordinul Fusabacteriales, clasa Fusobacteria. Denumirea g. Fusobacterium a fost dată de Knorr (1923) și cuprinde bacili Gram negativi, strict anaerobi cu aspect fusiform. Se găsesc pe suprafața mucoaselor omului și animalelor. Speciile F. nucleatum, F. necrophorum, F. periodonticum fac parte din microbiota cavității orale. F. naviforme și F. gonidiaformans au fost izolate din mucoasa vaginală, iar F. mortiferum și F. varium din tractul gastrointestinal. Pot determina infecții ale cavității orale, pulmonare și ale țesuturilor moi (Huggan și Murdoch, 2008).

Din punct de vedere morfologic, g. Fusobacterium este heterogen: specii cu forme bacilare, filamentoase (F. nucleatum) (fig.5), iar unele tulpini au forme atât bacilare, filamentoase, cât și cocobacilare (F. necrophorum) (fig.5).

Fig.5. F. nucleatum- forme filamentoase (stânga). Celule filamentoase și cocobacilare (dreapta).

(https://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Fusobacterium_nucleatum).

Pe mediile de cultură, speciile g. Fusobacterium cresc relativ repede: în 2 zile apar colonii circulare convexe, cu contur regulat sau ușor neregulat, albe sau crem cu un diametru de 1-2 mm (fig.6).

Fig.6. Morfologia coloniillor de Fusobacterium spp. pe mediul geloză cu sânge.

(http://www.perioexpertise.com/en/bacterial-diversity-and-interactions).

Conținutul de G+C este de 26-34% (Bennette și Eley, 1993).

Folosesc aminoacizii și peptidele ca sursă principală de energie, dar în absența aminoacizilor pot metaboliza glucidele. Produsul major al metabolismului anaerob este acidul butiric.

Fusobacteriile pot determina infecții severe: abcese peritonsilare, infecții ale epiteliului regiunii capului și gâtului, abcese craniene, meningite, infecții ale tractului genital, abcese intraabdominale (Jorgensen și colab. 2015). F. nucleatum este izolată cu cea mai mare frecvență din focare infecțioase, iar F. necrophorum este specia cea mai virulentă a genului. Este un patogen oportunist care determină infecții severe. Este o bacterie pleomorfă, β-hemolitică pe medii cu sânge. A fost izolat din cavitatea orală, tractul gastrointestinal, tractul urogenital și din materii fecale (Langworth, 1997). Determină sindromul lui Lemierre, o complicație a unei infecții orofaringiene cu extensie secundară și tromboflebită la nivelul venei jugulare, dar și a altor infecții metastatice în diferite organe (Karkos și colab., 2009).

Alte specii (F. necrophorum, F. mortiferum și F. varium) sunt frecvent izolate din infecțiile clinice (Jousimies-Somer și colab., 2002).

Multe dintre aceste specii codifică sinteza unor factori de virulență, care determină creșterea patogenității: endotoxine, hemolizină, hemaglutinină și adezine.

Sensibilitatea la antibiotice a speciilor g. Fusobacterium

Speciile g. Fusobacterium sunt în general sensibile la antibioticele β-lactamice (cefalosporine de generația a 3-a), la clindamicină și metronidazol. Penicilina este tratamentul de primă linie a infecțiilor cauzate de fusobacterii. F. nucleatum este singura specie raportată frecvent ca fiind producătoare de β-lactamază (Tuner și colab., 1985).

2.2. Bacterii anaerobe Gram pozitive

2.2.1. Coci anaerobi Gram pozitivi

Cocii anaerobi Gram pozitivi sunt un grup heterogen de bacterii anaerobe, componente ale microbiotei autohtone a cavității orale, a tegumentului, a tractului intestinal și urogenital.

Pe baza caracterelor morfotinctoriale au fost clasificați în două genuri: Peptostreptococcus și Peptococcus (Kluyver și van Niel, 1936). Pe frotiurile colorate Gram, celulele g. Peptococcus sunt grupate în grămezi asemenea stafilococilor, iar ale g. Peptostreptococcus sunt grupate în perechi și lanțuri scurte ca și streptococii. Modul de grupare al celulelor este influențat de mai mulți factori, în special de compoziția mediului de creștere.

Prevot (1948) clasifică cocii anaerobi Gram pozitivi în opt genuri pe baza unor caractere metabolice: producerea indolului, lichefierea gelatinei etc.

Hare și colab, (1965) au clasificat cocii anaerobi pe baza capacității de metabolizare a unui set de 5 glucide și 5 acizi organici, dar și a specificității antigenice prin teste serologice. Astfel, autorii au împărțit cocii Gram pozitivi anaerobi în zece genuri.

Ulterior, cocii Gram pozitivi au fost din nou clasificați, dar, în esență, criteriile clasificării anterioare (Hare și colab., 1965) au fost păstrate.

Rogosa (1971) a reunit în familia Peptostreptococacae, g. Peptostreptococcus, Peptococcus și Ruminococcus, iar în 1974 adaugă și genul Sarcina.

Odată cu introducerea tehnicilor de biologie moleculară, g. Peptococcus și Peptostreptococcus au suferit numeroase modificări sistematice: au fost adăugate noi specii bacteriene sau cele deja existente au fost redenumite.

În prezent, majoritatea speciilor cu importanță clinică sunt incluse în g. Peptostrepcoccus, care din punct de vedere filogenetic este foarte heterogen, familia Peptostreptococcaceae, ordinul Clostridiales, clasa Clostridia.

Metodele de biologie moleculară (secvențierea 16S ARNr) au adus argumente pentru o nouă sistematizare a speciilor g. Peptostreptococcus: unele au fost afiliate g. Anaerococcus, Peptoniphilus, Finegoldia, Micromonas, Gallicola, Slakia, Ruminococcus și Atopobium.

Cocii Gram pozitivi au fost izolați din infecții periodontale, ale tegumentului capului și gâtului, infecții ale tractului genital feminin, din răni, în special ale membrelor inferioare cu ulcer varicos (Bowler și Davies, 1999), din infecții respiratorii și infecții intraabdominale. Speciile izolate cu cea mai mare frecvență sunt Finegoldia magna, Parvimonas micra și Peptoniphilus harei (Wildeboer-Veloo și colab., 2007).

2.2.1.1. Genul Peptostreptococcus

Pe frotiurile colorate Gram, celulele bacteriene sunt așezate în perechi, tetrade, lanțuri și grămezi, unele specii fiind Gram variabile. Sunt obligat anaerobe, dar pot fi aerotolerante. Unele specii metabolizează glucidele ca sursă de energie, altele sunt azaharolitice. Multe specii metabolizează aminoacizii și peptidele ca sursă principală de energie.

Specia cea mai importantă a genului este P. anaerobius. Pe mediul de cultură, coloniile cresc relativ repede, au un 1 mm în diametru, sunt gri, cu centru ușor emergent și un miros specific. Temperatura optimă de creștere este 370C (Zhou și Li, 2015).

Metabolizează peptone și acizi grași cu producere de acid acetic, butiric, izobutiric, caproic și izocaproic. Deși aparține microbiotei tracturilor gastrointestinal și genital, poate determina infecții la acest nivel (Brook, 1989; Brook și Frazier, 2000).

2.2.1.2. Genul Parvimonas

g. Parvimonas conține o singură specie- P. micra, denumită inițial Peptostreptococcus micros. Murdoch și Shah (1999) transferă această specie din g. Pepstreptococcus în g. Micromonas, denumind-o Micromonas micros. Tindall și Euzeby (2006) schimbă denumirea g. Micromonas în Parvimonas.

Pe frotiul colorat Gram, celulele P. micra sunt coci Gram pozitivi, izolați, în perechi sau lanțuri scurte. Pe mediile de cultură, coloniile au un diametru de 1 mm, albe, bombate, înconjurate de un halou galben-maroniu.

P. micra este membru al microbiotei tractului gastrointestinal și a cavității orale. Ca patogen a fost izolat în special din infecțiile periodontale, de obicei din infecțiile mixte (Kumar, 2012).

Factorii de virulență sunt reprezentați de capsulă, adezine și de proteinele care se leagă la regiunea Fc a imunoglobulinelor și le inactivează (immunoglobulin Fc-binding proteins) (Grenier și Michaud, 1994).

2.2.1.3. Genul Finegoldia

g. Finegoldia conține o singură specie- F. magna. Taxonomia acestei specii s-a schimbat foarte mult. Astfel, în 1933 a fost descrisă de Prevot și numită Diplococcus magna. Hodeman și Moore (1986) au încadrat-o în g. Peptococcus, numind-o Peptococcus magnus. Ezaki și colab. (1983) au transferat-o în g. Peptostreptococcus. Metodele de biologie moleculară au confirmat că această specie este diferită de celelalte ale g. în ceea ce privește compoziția bazelor azotate și profilul acizilor grași volatili rezultați din fermentație. Secvențierea 16S ARNr a arătat că din punct de vedere filogenetic, această specie este distinctă față de ceilalți coci Gram pozitivi. Astfel, s-a propus includerea acestei ei într-un nou gen – Finegoldia.

Celulele de F. magna pe frotiurile colorate Gram sunt grupate în tetrade sau grămezi și pot varia ca mărime. Coloniile se dezvoltă după 48h de incubare, având un diametru de 1mm. Pe aceeași placă pot apărea mai multe tipuri morfologice de colonii, dând impresia unei culturi mixte. Majoritatea speciilor fermentează fructoza și doar câteva specii glucoza. Acidul acetic este produsul principal de fermentație. Peptidele și aminoacizii pot fi utilizați ca sursă principală de energie. Toate speciile produc amoniac din glicină și numai o parte și din treonină și serină (Jorgensen și colab., 2015).

Este componentă a microbiotei tegumentului și tracturilor urogenital și gastrointestinal.

Spre deosebire de ceilalți coci Gram pozitivi, F. magna este specia izolată cel mai frecvent în cultură pură din situsurile de infecție. A fost izolată din abcese ale țesuturilor moi (Castello și colab., 2007), din infecțiile periprotetice (Davies și colab., 1988), din plăgi postoperatorii (Ananth-Shenoy, 2016).

Au fost identificate patru proteine cu rol important în patogenitatea acestei specii: proteina L (Bjork, 1988) cu afinitate pentru lanțurile L ale imunoglobulinelor, proteina PAB (Peptostreptococcal albumin-binding protein) (Chateau și Bjork, 1994), care se leagă la albumina din serul uman, proteina FAF ( F. magna adhesion factor) (Frick și colab., 2008) cu rol în aderența celulei bacteriene la suprafața celulei gazdă și proteina SufA (Karlsson și colab., 2007) cu rol în colonizare și inițierea procesului infecțios.

Sensibilitatea cocilor Gram pozitivi anaerobi la antibiotice

Determinarea paternului sensibilității la antibiotice a cocilor Gram pozitivi anaerobi este dificilă, deoarece necesită condiții de anaerobioză. În acest scop s-au elaborat mai multe variante metodologice. Cea mai utilizată metodă pentru determinarea CMI în laboratorul clinic de diagnostic este metoda diluțiilor în agar, însă are inconvenientul costurilor ridicate.

Antibioticele (penicilina, clindamicina și metronidazolul) sunt folosite frecvent în tratamentul infecțiilor determinate de cocii Gram pozitivi anaerobi. Mai multe studii au evidențiat că speciile P. asaccharolyticus, F.magna, P. micra au sensibilitate înaltă la penicilină, însă Wren (1996) a raportat că 16% dintre tulpinile de F.magna și 8% dintre cele de P.micra erau rezistente.

În general, cocii Gram pozitivi sunt sensibili la antibioticele β-lactamice asociate sau nu cu inhibitori de β-lactamaze (cefalosporine, carbapeneme) și la cloramfenicol.

Capitolul 3

PATOGENITATEA ȘI VIRULENȚA

BACTERIILOR ANAEROBE ENDOGENE

Patogenitatea (gr. pathos-boală, gr. geneia, fr. genie-născut, produs) este proprietatea esențială a oricărui agent patogen, ce constă în capacitatea acestuia de a genera un proces infecțios, același din punct de vedere clinic, manifestat prin starea de boală, după ce pătrunde în organismul sensibil pe cale naturală sau pe cale experimentală (Chifiriuc și colab., 2015).

În anumite situații (când numărul bacteriilor anaerobe, care colonizează o suprafață crește foarte mult, când pătrund în zone care în mod normal sunt sterile, când gazda este imunosupresată), bacteriile anaerobe endogene devin agenți infecțioși foarte virulenți, determinând infecții cu diferite localizări: tegumentare, dentare, intraabdominale, pneumonii, abcese craniene și bacteriemii.

3.1. Factorii de virulență ai bacteriilor anaerobe

Capacitatea bacteriilor anaerobe endogene de a produce o infecție depinde de virulența tulpinii bacteriene și de capacitatea de apărare a gazdei.

Factorii majori de virulență ai bacteriilor anaerobe endogene sunt

– capacitatea de aderență la suprafața celulei epiteliale și de invazie;

– sinteza toxinelor, a enzimelor (superoxid-dismutaza, imunoglobulin-proteaza, hialuronidaza, colagenaza, fibrinolizina);

– prezența capsulei polizaharidice sau lipopolizaharidice (tabelul 2).

Tabelul 2. Factori de virulență ai bacteriilor anaerobe endogene ( după Nagmoti J.M., 2014)

Capsula

Capsula este un factor de virulență pentru toate bacteriile patogene, dar la bacteriile anaerobe, capsula este un factor de virulență foarte important, argumentat de numeroase raportări cu privire la producerea de abcese la animalele inoculate cu bacterii anaerobe endogene capsulate (Takazae și colab., 1971; Botta și colab., 1994; Onderdonk și colab., 1977). Rolul polizaharidelor capsulare ca factor de virulență a fost evidențiat la bacteriile g. Bacteroides, Prevotella, Porphyromonas și Peptostretococcus (Brook, 1994).

Capsula bacteriilor anaerobe endogene a fost evidențiată inițial la Bacteroides fragilis ssp. fragilis. Metoda microscopiei electronice, după colorația cu roșu ruteniu, a evidențiat o capsulă groasă polizaharidică, alcătuită din opt polizaharide, clasificate A – H. Nivelul cantitativ al expresiei acestor polizaharide în structura capsulei este diferit. Au fost raportate tulpini necapsulate (Brook și colab., 1994), care sunt mai puțin virulente.

Capsula este repelentă pentru fagocite și inhibă activitatea leucocitelor polimorfonucleare, fapt evidențiat prin inocularea bacteriilor capsulate la animalele de laborator (Simon și colab., 1984).

Fimbriile

Fimbriile sunt formațiuni filamentoase rigide, scurte, neflexibile, de natură proteică. Mediază aderența celulei bacteriene la suprafețe vii sau inerte, determinând formarea biofilmului. Pentru bacteriile patogene, prezența fimbriilor (tulpinile fim+) le conferă un grad superior de virulență, deoarece fimbriile aderă ferm de receptorii suprafeței celulelor epiteliale ale mucoaselor și ai hematiilor (Mihăescu și colab., 2007).

Structura și rolul fimbriilor s-au studiat la Porphyromonas gingivalis, un anaerob endogen. Această bacterie exprimă două tipuri de fimbrii, o subunitate proteică mai lungă, numită FimA sau fimbrilina (fimbria lungă) codificată de gena fimA și o subunitate mai mică – fimbria Mfa (fimbria scurtă) codificată de gena mfa1 (Morten și colab., 2013). Numeroase studii au demonstrat că subunitatea mai lungă mediază aderența specifică a bacteriei la celulele gazdei (Lanant si Jenkinson, 2000).

P. gingivalis este un patogen periodontal, dar s-a evidențiat rolul lui în formarea plăcilor de ateroscleroză, atribuit fimbriei lungi, care mediază aderența bacteriei la celulele cardiovasculare (Nakano și colab., 2009).

Hemaglutinina

Hemaglutininele sunt factori de virulență de natură proteică prezenți la multe bacterii anaerobe endogene, dar cele mai studiate au fost hemaglutininele de la P. gingivalis. Rolul lor este de inițiere a colonizării prin legarea la receptorii celulelor țesutului gingival și în aglutinarea și liza hematiilor in vivo, din care se eliberează nutrienți (Boyd și McBride, 1984).

Progulske-Fox și colab. (1989) au clonat gena hagA, care determină expresia hemaglutininei pe suprafața celulei bacteriene, o proteină cu o gr. mol de 283 kDa.

Superoxid-dismutaza

Superoxid-dismutaza este o metaloenzimă antioxidantă cu rol protector față de radicalii reactivi ai oxigenului: convertește radicalii superoxid în apa și peroxid de hidrogen, care este apoi convertit in O2 si H2O, de glutation peroxidază și catalază. Multe bacterii anaerobe patogene nu supraviețuiesc în prezența oxigenului, dar unele precum Bacteroides fragilis pot crește la o concentrație de 8% O2. Protecția față de efectul toxic al oxigenului este conferită de superoxid-dismutaza.

Superoxid-dismutaza a fost evidențiată la specii ale g. Bacteroides și Fusobacterium (Gregory și colab., 1978) ca factor de virulență în studii pe tulpini anaerobe patogene izolate din diferite situsuri de infecție și tulpini din microbiota tractului digestiv. Tulpinile izolate din situsurile de infecție devin aerotolerante, datorită capacității de a produce superoxid-dismutaza ca factor de virulență (Tally și colab., 2011)

Proteinaza

Setul de proteaze, ca factori de virulență ai bacteriilor anaerobe a fost analizat la P. gingivalis, agentul infecțiilor periodontale. Proteazele hidrolizează unele proteine serice și tisulare, cu rol protector antiinfecțios, contribuind astfel la neutralizarea răspunsului imun. Activitatea proteazelor eliberate de P. gingivaliss poate fi inhibată de o serie de compuși derivați din plante (ceai verde și merișor), putând fi considerați noi agenți terapeutici folosiți în prevenirea sau tratarea bolilor periodontale (Grenier și colab., 2011).

Proteaza care hidrolizează IgA, IgM și IgG

Multe specii anaerobe patogene produc enzime, care inhibă activitatea efectorilor răspunsului imun umoral. Astfel, bacteriile anaerobe, care colonizează mucoasele secretă proteaze, care inhibă activitatea IgA. Speciile anaerobe producătoare de pigment sintetizează enzime proteolitice, care degradează și inactivează imumoglobulinele și proteinele complementului. Proteazele eliberate de Porphyromonas (P. gingivalis, P. asacchorolytica și P. endodontalis) și de Prevotella (P. melaninogenica, P. intermedia) hidrolizează IgA, IgM și IgG, dar și proteinele C3 și C5 ale complementului (Goulbourne și colab., 1991).

Colagenaza

Colagenaza este un factor de virulență important al bacteriilor anaerobe. Patogenitatea ei s-a evidențiat în special la tulpinile de P. melaninogenica, P. gingivalis și F. magna (Dame-Teixeira și colab., 2018; Murphy și colab., 2014).

Neuraminidaza

Neuraminidaza degradează acidul neuraminic, component al structurilor care solidarizează celulele epiteliale. Este codificată de gena nanH, identificată la specii ale g. Bacteroides (Russo și colab., 1990). Este considerată un factor de virulență important, deoarece distruge bariera de apărare a gazdei, favorizând astfel procesul infecțios.

3.2. Patogenitatea bacililor Gram negativi anaerobi

În categoria bacililor anaerobi sunt incluse g. Bacteroides, Porphyromonas, Prevotella și Fusobacterium.

Familia Bacteroidaceae cuprinde 27 de specii, dintre care cele mai importante sunt B. fragilis, B. vulgatus, B. ovatus, B. distasonis și B. thetaiotaomicron.

Speciile g. Bacteroides sunt predominante în microbiota intestinală (1011 celule/gram de conținut intestinal) (Finegold și colab., 1983), dar sunt prezente și în celelalte cavități naturale umane.

Sunt  bacili  scurți, groși cu extremități rotunjite, drepți  sau ușor curbați, de 2-4 μm lungime, nesporulați, imobili.

Bacilii Gram negativi anaerobi sunt agenții cei mai frecvenți ai infecțiilor anaerobe endogene (Finegold, 1996). Speciile izolate cu cea mai mare frecvență aparțin g. Bacteroides (B. thetaiotaomicron, B. distasonis și B. uniformis). Au fost izolate specii pigmentate ale aceluiaș grup (B. asaccharolyticus, B. malaninogenicus și B. gingivalis) (Finegold, 1996).

B. fragilis este cel mai frecvent implicat în infecțiile care își au originea în tubul digestiv, fiind urmat de B. thetaiotaomicron. De asemenea, specii ale g. Bacteroides au fost izolate din infecțiile ORL și din infecțiile tractului genital și respirator.

Speciile g. Bacteroides, Prevotella, Porphyromonas și Fusobacterium produc enzime care au un rol foarte important în patogeneză. P. melaninogenica este una dintre puținele bacterii anaerobe care produce colagenază. Neuraminidazele produse de speciile g. Bacteroides alterează acidul neuraminic al glicoproteinelor membranare. Tulpinile de B. fragilis izolate din probele clinice au o activitate neuraminidazică mai înaltă decât cele izolate din materii fecale, iar tulpinile de B. fragilis au o activitate neuraminidazică mai intensă, decât celelalte specii ale genului (Finegold, 1977).

Hialuronidaza poate fi produsă de B. fragilis, dar și de alte specii pigmentate de bacili Gram negativi anaerobi. Alte enzime, care au un rol foarte important în patogenitate:

DN-aza, fosfataza, heparinaza produse de B. fragilis. Heparinaza determină coagularea intravasculară, crescând astfel doza de heparină necesară în tratamentul tromboflebitei septice cauzată de B. fragilis;

fibrinolizina produsă de multe tulpini ale speciei de P. melaninogenica, dar și de câteva tulpini de B. fragilis;

proteinaza produsă de Porphyromonas asaccharolytica;

fosfolipaza A produsă de P. melaninogenica.

Fusobacterium necrophorum sintetizează leucocidină care lizează leucocitele umane și ale altor specii (cal, iepure) (Kasper și colab., 1979).

3.3. Patogenitatea cocilor Gram pozitivi anaerobi

Cocii Gram pozitivi anaerobi au fost inițial clasificați în două genuri: Peptostreptococcus și Peptococcus (Kluvyer și Niel, 1936). Separarea taxonomică s-a făcut pe baza caracterelor morfologice. Peptococii sunt coci anaerobi grupați în forme nedefinite, pe când peptostreptococii sunt grupați în lanțuri scurte asemenea streptococilor aerobi. Mai târziu la aceste două genuri au fost adăugate altele, taxonomia cocilor Gram pozitivi anaerobi fiind modificată frecvent după introducerea metodelor de biologie moleculară.

Cocii Gram pozitivi anaerobi reprezintă 25-30% din totalul bacteriilor anaerobe izolate din infecțiile clinice (Brook, 1988). Identificarea lor este dificilă din cauza dificultăților de cultivare, timpul lung necesar incubării și implicarea lor în infecțiile mixte.

În prezent speciile g. Anaerococcus, Finegoldia, Parvimonas, Peptoniphilus și Peptostreptococcus sunt cel mai frecvent izolate din infecțiile clinice.

Cei mai cunoscuți factori de virulență ai cocilor Gram pozitivi sunt proteina L (Bjorck, 1998), proteina care leagă albumina PAB (peptostreptococcal albumim-binding protein) (Chateau și Bjork, 1994), proteina SufA (Karlsson 2007), proteina FAF (Frick, 2008) și colagenaza sintetizată de F. magna.

Dintre cocii Gram pozitivi anaerobi, F. magna este izolată cu cea mai mare frecvență din infecțiile clinice, aproximativ 30% (Wren și colab. 1977). Colagenul se găsește în cantitate mare în piele, tendoane, cartilaje. Colagenaza hidrolizează colagenul, țesuturile își pierd integritatea, iar bacteriile microbiotei fiziologice, pătrund în situsurile sterile și astfel este inițiat procesul infecțios. Colagenaza are un rol important în creșterea bacteriilor azaharolitice (de exemplu, F. magna): aminoacizii eliberați din colagenul hidrolizat sunt utilizați în metabolismul celulei bacteriene ca principală sursă de C și energie (Harrington, 1996).

Capitolul 4

IMPLICAȚIILE BACTERIILOR ANAEROBE ENDOGENE

ÎN ETIOLOGIA INFECȚIILOR CLINICE

4.1. Infecții cu localizare în sfera ORL

La nivelul cavității orale, bacteriile anaerobe endogene determină infecții periodontale, care se pot disemina la nivelul capului si gâtului. Infecțiile dentare includ pulpite, abcese periapicale, infecții ale spațiilor perimandibulare, gingivite, periodontite și abcese periodontale. Prin diseminare, infecțiile cu bacterii anaerobe endogene se pot extinde la nivelul mandibulei și maxilei, cauzând osteomielite (Chakrabarty și Karim, 2018).

Sindromul Lemierre, determinat în cele mai multe cazuri de Fusobacterium necrophorum este o infecție a peretelui posterior al spațiului faringian lateral (Alperstein și colab., 2017).

Un număr mic de specii ale bacteriilor anaerobe endogene determină sinuzite acute și cronice la copii si adulți. Cu cea mai mare frecvență sunt izolate speciile g. Peptostreptococcus, Fusobacterium, Prevotella și Propionibacterium (Brook, 2007).

4.2. Infecții pulmonare

Infecțiile pulmonare, cauzate de bacterii anaerobe endogene apar de obicei ca o complicație a bolilor periodontale (Abeysundere și colab., 1978). Genurile cel mai des implicate in acest tip de infecții sunt Prevotella, Peptostreptococcus, Bacteroides și Fusobacterium (De și colab., 2002).

4.3. Infecții intraabdominale

Translocația bacteriilor din intestin semnifică trecererea acestora prin epiteliul intestinal intact, din lumen în ganglionii mezenterici și de aici în alte organe. (Berg, 1999). Teoria translocației bacteriilor din intestin datează de la sfârșitul secolului al 19-lea, când cercetătorii apărau ideea, conform căreia bacteriile din intestin determină sepsisul prin trecerea lor prin peretele intestinal intact (Vaischnavi, 2013). Infecțiile intraabdominale, reprezentate în special de peritonită (generalizată sau localizată) sunt de obicei polimicrobiene și sunt rezultatul deversării microbiotei intestinale în cavitatea peritoneală, consecutiv perforării structurii peretelui intestinal sau translocării celulelor bacteriene. Tulpinile cel mai frecvent izolate din acest tip de infecții sunt: E. coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Enterococcus spp. Au fost izolate tulpini de Peptostreptococcus micros, Prevotella intermedia și specii ale g. Fusobacterium. Bacteriile strict anaerobe nu sunt translocate în mod normal, ci numai împreună cu bacterii strict și facultative aerobe, atunci când integritatea structurală a mucoasei intestinale este compromisă de diferiți factori (Goldstein și Snydman, 2004).

Bacteriile anaerobe endogene sunt implicate în enterocolite: B. fragilis determină diareea apoasă la copii, deoarece este producător de enterotoxină (Sears și colab., 1995).

4.4. Infecții pelviene

Tractul genital feminin este o nișă importantă pentru creșterea bacteriilor anaerobe, care pot determina abcese pelviene, endometrite, boala inflamatorie pelvină si infecții postoperatorii. Bacteriile anaerobe cel mai frecvent izolate din acest tip de infecții sunt specii ale g. Prevotella, Bacteroides și g. Peptostreptococcus (Saini și colab., 2003).

Ca și infecțiile intraabdominale, infecțiile pelviene, de cele mai multe ori, sunt infecții mixte, fiind implicate atât bacterii anaerobe cât si aerobe.

4.5. Infecții ale pielii și țesuturilor moi

Infecțiile anaerobe ale pielii si țesuturilor moi sunt determinate de pătrunderea microbiotei endogene în situsuri, care în mod normal sunt sterile. Speciile izolate cu cea mai mare frecvență din acest tip de infecții aparțin g. Bacteroides, Porphyromonas și Prevotella (Brook, 2007).

4.6. Infecții ale oaselor și articulațiilor

Speciile genului Fusobacterium spp. sunt cel mai adesea implicate in acest tip de infecții și cel mai probabil, infecțiile sunt consecința diseminării din țesuturile moi adiacente (Gregory și colab., 2015).

4.7. Infecții ale sistemului nervos central

Infecțiile sistemului nervos central, asociate cu bacterii anaerobe includ abcesele craniene si abcesele epidurale. Speciile anaerobe implicate în acest gen de infecții aparțin g. Fusobacterium, Prevotella și Bacteroides. Abcesele craniene determinate de bacterii anaerobe se datorează, fie diseminării bacteriilor pe cale hematogenă din situsuri mai depărtate, fie prin complicațiile otitelor, sinuzitelor și infecțiilor dentare (Bennet și colab., 2015).

4.8. Bacteriemii

Un procent cuprins între 5% -15% dintre cazurile de bacteriemii sunt determinate de bacterii anaerobe (Brook, 2010). B. fragilis este izolat cu cea mai mare frecvență din acest tip de infecții (aproximativ 60% din cazuri) (Aldridge și colab., 2003). Bacteriemia anaerobă este o infecție secundară a celor intraabdominale (Algarni și colab., 2018).

II. PARTEA EXPERIMENTALĂ

FACTORII DE VIRULENȚĂ ȘI ANTIBIOREZISTENȚĂ

AI BACTERIILOR ANAEROBE NESPORULATE IDENTIFICAȚI PRIN METODE

FENOTIPICE ȘI GENOTIPICE

SCOPUL ȘI OBIECTIVELE LUCRĂRII

Scopul: investigarea prin metode fenotipice și genotipice a profilurilor de rezistență și de virulență ale unor tulpini bacteriene anaerobe nesporulate izolate din infecții endogene.

Obiective

1- Identificarea tulpinilor bacteriene anaerobe nesporulate izolate din infecții ale pacienților spitalizați într-o clinică.

2- Studiul fenotipic al factorilor solubili de virulență ai tulpinilor izolate din infecțiile intraabdominale.

3- Identificarea substratului genetic al factorilor de virulență la tulpinile anaerobe din infecții intraabdominale.

4- Analiza fenotipică și genotipică a profilului de rezistență la antibiotice a bacteriilor anaerobe nesporulate.

Capitolul 5

IDENTIFICAREA TULPINILOR BACTERIENE ANAEROBE NESPORULATE IZOLATE DE LA PACIENȚI SPITALIZAȚI

5.1. Materiale și metode

Populația analizată

Studiul s-a desfășurat pe un lot de 198 pacienți spitalizați într-o unitate din București, în perioada ianuarie 2015-februarie 2016.

Prelevarea probelor

Produsele patologice: puroi, țesut, aspirate și sânge, au fost recoltate în timpul intervențiilor chirurgicale. Prelevarea probelor pentru cultivarea anaerobă necesită precauții datorită intoleranței bacteriilor anaerobe la oxigenul atmosferic. Pentru recoltarea probelor din infecțiile intraabdominale și a celor din plăgile postoperatorii s-au folosit tampoane speciale (eSwab-Copan Diagnostics), care asigură stabilitatea probei până la 72h la temperatura camerei, iar pentru hemoculturi au fost utilizate recipiente pentru analizoare automate de tip Bactec (Beston Dickinson). Probele au fost recoltate înaintea începerii terapiei cu antibiotice, cu evitarea contaminării cu microorganisme aerobe.

Examenul microscopic direct

Examenul microscopic al frotiurilor preparate direct din produsul patologic, colorate Gram este util în diagnostic, mai ales pentru probele recoltate din situsuri sterile, permițând evidențierea tipului și densității microorganismelor, precum și a celulelor inflamatorii. Colorația Gram este în același timp și o metodă calitativă de control în diagnosticul infecțiilor cu bacterii anaerobe (fig. 7-8).

Fig.7. Frotiu colorat Gram din p.p. (lichid peritoneal): celule inflamatorii, bacili Gram negativi, coci Gram pozitivi (ob. 100 x).

Fig.8. Frotiu colorat Gram din p.p. (lichid peritoneal): celule inflamatorii, bacili Gram pozitivi, coci Gram pozitivi (ob. 100 x).

De exemplu, infecțiile urinare repetate, cu urocultura sterilă în condiții de aerobioză pot fi determinate de bacterii anaerobe, care se evidențiază pe frotiul colorat Gram (Cattoir, 2012). Incubarea se poate prelungi în aceste cazuri folosind medii speciale pentru bacteriile anaerobe.

Pe preparatul colorat Gram se poate pune diagnosticul de vaginoză bacteriană, atunci când densitatea lactobacililor, care formează o populație dominantă numeric în alcătuirea microbiotei fiziologice scade, iar numărul cocobacililor si bacililor Gram variabili crește. Cultura bacteriană în acest caz nu este recomandată, deoarece analiza moleculară a sugerat că majoritatea bacteriilor anaerobe implicate în vaginoza bacteriană nu este cultivabilă (Ling și colab., 2010).

Examinarea frotiurilor colorate Gram, preparate din probele patologice, recoltate din infecțiile intraabdominale este o etapă importantă în diagnostic. Prezența microoganismelor pe frotiul colorat Gram și cultura anaerobă negativă poate indica deficiențe de ordin tehnic: transportul neadecvat al probei, expunerea produsului patologic pentru o perioadă lungă la oxigenul atmosferic, atmosfera aerobă a recipientului etc. (Washinton și colab., 2006).

Izolarea și identificarea tulpinilor bacteriene

Însămânțarea probelor

După examinarea microscopică a frotiurilor colorate Gram, produsele patologice au fost însămânțate prin varianta „pentagon deschis" pe medii speciale pentru bacterii anaerobe, neselective, selective și îmbogățite cu diferiți factori de creștere (Anaerobic Blood Agar, Phenylethyl alcool agar, Schaedler Anaerobe Agar) în vederea identificării preliminare (tabelul 3). Probele au fost însămânțate și pe Columbia agar, Chocolat agar și MacConkey agar, care au fost incubate în aerobioză la 370C timp de 24-48h.

Tabelul 3. Medii de cultură pentru izolarea bacteriilor anaerobe endogene (după Koneman s , Atlas and Text Book of Diagnostic Microbiology, 2007)

Incubarea s-a făcut imediat după ce probele au fost însămânțate la 370C pentru cel puțin 48h, folosindu-se sisteme speciale GasPak (Becton Dickinson Microbiology System), care asigură condiții de anaerobioză. Sistemele GasPak conțin un reactiv cu carbonat, carbon activat, acid ascorbic și apă. Reactivul se activează la contact cu aerul și scade rapid concentrația de oxigen. În reacție, carbonatul produce dioxid de carbon.

După 2-7 zile, pe mediile de cultură apar colonii mici sau mari, transparente, unele pigmentate (fig. 9-11).

Fig.9. Colonii de B. thetaiotaomicron pe mediul phenylethyl alcool agar.

Fig.10. Colonii de B. fragilis pe mediul phenylethyl alcool agar.

Fig.11. Colonii pigmentate de P. nigrescens pe mediul phenylethyl alcool agar.

Examenul microscopic al frotiurilor din cultură pură

Examinarea frotiurilor colorate Gram a confirmat tipul morfologic și afinitatea tinctorală a tulpinilor izolate (fig.12-13).

Fig. 12. Bacili Gram negativi (ob. 100 x).

Fig. 13. Bacili Gram negativi fusiformi (ob.100 x).

Identificarea bacteriilor anaerobe prin metode automate

Metodele convenționale de identificare a bacteriilor anaerobe (examenul microscopic, morfologia și culoarea coloniilor, creșterea pe medii selective, testele metabolice) sunt laborioase și cronofage. De aceea, în ultimul timp, laboratoarele de diagnostic clinic folosesc metode automate pentru identificarea bacteriilor anaerobe.

O astfel de metodă este MALDI-TOF- Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight (Bruker Daltonik, Bremen, Germany). Este o metodă de spectrometrie de masă, de analiză a proteomului.

Metoda MALDI folosește un puls laser pentru a produce ioni dintr-un primer extins, care a fost co-cristalizat cu o matrice chimică absorbantă a laserului. Timpul necesar ionilor să traverseze – time of flight – TOF – detectorul, este invers proporțional cu raportul m/z (masă moleculară/sarcină electrică) și permite calculul masei.

Principiu: metoda spectroscopiei de masă se folosește pentru măsurarea raportului m/z a ionilor, raport din care poate fi dedusă greutatea lor moleculară.

Tehnica specifică MALDI permite analiza moleculelor mari, intacte, nevolatile, termolabile, prin MS și e adecvată pentru examinarea schimbărilor greutății moleculare a primerilor, ca rezultat al încorporării bazelor. Proteinele sunt identificate prin compararea tabloului lor peptidic, cu al proteinelor din baza de date a aparatului (fig.14). Pentru fiecare tulpină s-a depus un spot de celule bacteriene pe plăcuța aparatului, peste care, după uscare la temperatura camerei se adaugă 1µl de HACCA matrix (acid α- cyano-4-hydroxycinnamic în 50% acetonitril/ 2,5% acid triflouracetic). Spotul este analizat cu programul Burker Biotyper (Bruker Daltonik, Bremen, Germany).

Fig.14. Aparatul MALDI-TOF și spectrul de identificare pentru Slakia exigua.

Conservarea tulpinilor bacteriene

Tulpinile izolate și identificate au fost conservate în mediu bulion cu glicerol 20% (depozitat la -80°C). Din culturile conservate s-a făcut un număr limitat de pasaje pe medii proaspete, în vederea obținerii culturilor de lucru, pentru a asigura păstrarea particularitătilor biologice, a genelor de rezistență și de virulență.

5.2. Rezultate și discuții

Studiul a fost realizat pe 374 tulpini bacteriene izolate din diferite probe patologice recoltate de la 198 de pacienți, dintre care 74 (37,37%) bărbați și 124 (62,62%) femei, cu media de vârstă de 55 ani (20-90) spitalizați pentru afecțiuni inflamatorii intraabdominale. Infecțiile intraabdominale complicate sunt consecința diseminării procesului infecțios de la nivelul unui organ, în cavitatea peritoneală determinând apariția peritonitelor și a abceselor intraabdominale (Chow și colab., 2010).

Probele au fost aspirate din abcese intraabdominale și lichide peritoneale, drenaje biliare și fragmente tisulare, recoltate după intervențiile chirurgicale. Tulpinile bacteriene au fost izolate majoritar din probele de lichid peritoneal, din apendice, din secreția biliară, fosa iliacă dreaptă, abces intraabdominal, ulcer perforat, abces perihepatic, sac Douglas, hemocultură, mezenter, abces pelvic și perigastrită cronică (tabelul 4).

Tabelul 4. Probele și procentul de izolare a tulpinilor bacteriene anaerobe.

Din cele 198 de probe însămânțate au rezultat 144 (72,7%) culturi bacteriene mixte (aerobe și anaerobe), 27 (13,6%) culturi aerobe, iar 27 (14%) probe au fost sterile.

Am izolat 374 de tulpini bacteriene, din care 151 (40,3%) anaerobe și 223 (59,6%) aerobe. Rezultate asemănătoare au obținut Israil și colab. (2010): din 110 tulpini bacteriene izolate din focare infecțioase abdominale, au identificat 72 tulpini (65%) aerobe și 38 tulpini (34%) anaerobe.

Din numărul total de tulpini, bacilii Gram negativi aerobi au reprezentat 46% (173/374), tulpinile de E. coli fiind izolate în proporție de 37%, iar procentul cocilor Gram pozitivi a fost de 14% (50/374), cu predominanța tulpinilor g. Enterococcus (10%) (tabelul 5).

Tabelul 5. Distribuția tulpinilor bacteriene aerobe izolate din probele analizate.

Bacilii Gram negativi anaerobi au fost izolați în proporție de 25% (94/374), iar speciile g. Bacteroides, 20% (75/374). Au fost izolate 26 (35%) tulpini de B. fragilis, 16 (21%) tulpini de B. vulgatus, 12 (16%) tulpini de B. uniformis, 8 (11%) tulpini de B. thetaiotaomicron, 7 (9%) tulpini de B. ovatus, 5 (7%) tulpini de B. stercoris și 1 (2%) tulpină de B. caccae (fig. 15).

Fig. 15. Distribuția procentulă a speciilor g. Bacteroides izolate din infecțiile intraabdominale.

Bacilii Gram pozitivi au fost izolați în proporție de 12% (44/374), predominând tulpinile g. Clostridium (8,2%). Cocii Gram pozitivi au reprezentat 3% (12/374) dintre tulpinile izolate, g. Finegoldia fiind cel mai frecvent (1,8%), iar cocii Gram negativi au fost izolați într-o proporție foarte mică de 0,5% (2/374) (tabelul 6).

Tabelul 6. Distribuția tulpinilor bacteriene anaerobe izolate din probele analizate.

Rezultate similare au obținut Takesue și colab. (2015), autorii unui studiu pe durata ianuarie 2014- februarie 2015, în care au analizat probe recoltate din infecții intraabdominale. Din cele 504 tulpini izolate, E.coli (108/504 – 21,4%) și speciile g. Bacteroides (69/504- 13,69%), au cel mai mare procent de izolare, B. fragilis- 46,4% au fost cele mai frecvente.

Secvențierea 16S ADNr a confirmat identificarea tulpinilor prin metoda automată MALDI –TOF. Pentru secvențiere am ales 8 tulpini din numărul total al tulpinilor. Secvențele ampliconilor obtinuți au fost analizate în programul NCBI BLAST (http://www.ncbi.nim. nih.gov/blast/cgi). Rezulatele obținute sunt prezentate în tabelul 7, iar secvențele ampliconilor sunt reprezentate în anexa 2. 7 tulpini au fost corect identificate cu metoda automată MALDI-TOF (scorul de identificare: 2.008-2.188), 1 tulpină a fost identificată până la nivel de gen (scorul de identificare: 1.899), specia identificată prin metoda automată fiind diferită de cea obținută prin secvențiere 16S ADNr.

Tabelul 7. Comparerea rezultatelor de identificare obținute prin metoda automată (MALDI-TOF) și secvențierea 16S ADNr

Capitolul 6

FACTORI DE VIRULENȚĂ IDENTIFICAȚI PRIN ANALIZA FENOTIPICĂ

6.1. Materiale și metode

Factorul slime

Factorul slime (exopolizaharid hidrofil, care mediază aderența celulelor bacteriene la suprafețe vii sau inerte) este un indicator al gradului de rezistență și al capacității de supraviețuire a tulpinilor bacteriene în mediul extern, este un factor de virulență, prin protecția antifagocitară (Chifiriuc și colab., 2015).

Tulpinile bacteriene au fost cultivate în condiții de anaerobioză pe medii speciale pentru bacterii anaerobe timp de 48h la 370C. Din culturile bacteriene s-au realizat suspensii la densitatea standardului nefelometric 0,5 McFarland, care au fost însămânțate în mediu lichid ( mediu Schaedler) repartizat în plăci cu 6/12/24/96 de godeuri. Plăcile au fost incubate timp de 48h în condiții de anaerobioză. După incubare, plăcile au fost golite de cultura bacteriană, spălate de 3 ori cu apă de la robinet și fixate cu metanol rece timp de 5 minute, apoi au fost colorate cu cristal violet 1% timp de 15 minute, spălate cu apă de la robinet și resuspendate cu acid acetic 33%. Intensitatea culorii suspensiei colorate este direct proporțională cu capacitatea de aderență la substratul inert și se măsoară spectrofotometric (A 490 nm) (fig. 16).

Fig. 16. Evidențierea cantitativă a producerii de slime prin metoda microtitrării a tulpinilor de Bacteroides.

Aderența bacteriilor la celulele epiteliale este prima etapă a colonizării tisulare. Este un proces selectiv, care implică receptori ai diferitelor tipuri de celule și liganzi pe suprafața celulei bacteriene. La B. fragilis aderența este mediată de structuri pili-like, de capsulă și de proteinele membranei externe, care funcționează ca o interfață dinamică între celula bacteriană și celulele tisulare. După ințierea colonizării, celulele bacteriene intră în competiție cu microbiota rezidentă prin producerea cataboliților, care inhibă creșterea altor specii: acizi organici, alcooli, baze anorganice, amoniac și alți produși ai catabolismului bacterian. Wexler și colab. (2002) au evidențiat la B. fragilis proteina OmpA (outer membrane protein A) cu rol important în aderența la stratul de mucus.

Am utilizat linia celulară Hep-2 (Human Epithelioma) cultivată în mediul MEM (Eagle Minimal Essential Medium) suplimentat cu ser fetal bovin 10%, glutamină 1%, soluție penicilină-streptomicină 1%, soluție fungizon 1%, ITS 1%.

În godeurile cu monostrat celular am adăugat suspensie bacteriană cu densitate 0,5 McFarland. Plăcile au fost incubate la 370C, timp de 2 h, perioadă în care bacteriile aderă la suprafața celulelor substratului. Monostratul celular a fost spalat cu TFS (Tampon Fosfat Salin) (3x), fixat cu metanol rece (1ml) 10 minute, după care, celulele aderate s-au colorat cu soluție Giemsa (1:2) timp de 20 min. Godeurile au fost spălate cu apă de la robinet, uscate și examinate la microscop cu O.I.

Am determinat tipul de aderență și indicele de aderență (numărul de celule cu bacterii aderate/100 celule numărate) (Chifiriuc și colab., 2015).

Speciile g. Bacteroides produc enzime extracelulare, cu acțiune litică asupra celulelor și țesuturilor gazdei: hemolizine, hialuronidază, DNA-ază, lipaze, proteaze, colagenaze etc. (Chen și colab., 1995).

Pentru evidențierea producerii factorilor solubili de virulență și patogenitate, tulpinile au fost însămânțate pe medii solide speciale, incubate în condiții de anaerobioză la 370C, 4- 7 zile (Chifiriuc și colab., 2011).

Evidențierea hemolizinelor

Hemolizinele sunt enzime extracelulare, care în patogeneza diferitelor specii bacteriene acționează ca toxine formatoare de pori. Producerea hemolizinelor se evidențiază prin însămânțarea tulpinilor în striu pe agar Brucella, repartizat în plăci Petri cu adaus de hemină 5µg/ml, vitamina K 1µg/ml și 5% sânge de berbec. După incubarea la 370C timp de 24h în condiții de anaerobioză s-a notat prezența sau absența hemolizei:

β-hemoliza- liza completă a hematiilor: zona este clară, transparentă;

α-hemoliza- liza incompletă a hematiilor: zona are o culoare verzuie datorită degradării parțiale a hemoglobinei la methemoglobină;

absența hemolizei – γ-hemoliză, care nu se exprimă in vitro (fig.17). Dacă plăcile se stochează câteva ore la 4oC, zona de hemoliză se intensifică (Popa și Popa, 2007; Chifiriuc și colab., 2011).

Fig.17. Evidențierea hemolizei pe mediu agar Brucella cu adaus de hemină 5µg/ml, vitamina K 1µg/ml și 5% sânge de berbec. Zonele de hemoliză – halou transparent, clar, caracteristic pentru tulpinile β-hemolitice sau verzui, caracteristic tulpinilor α -hemolitice.

Evidențierea factorului CAMP-like

Tulpinile s-au însămânțat sub formă de striuri paralele pe agar Brucella cu hemină 5 µg/ml, vitamin K 1µg/ml și 5% sânge de berbec, iar perpendicular pe aceste striuri s-a însămânțat o tulpină β-hemolitică de Staphylococcus aureus. Plăcile Petri se incubează la 370C, 24-48h în condiții de anaerobioză. Prezența factorului CAMP este indicată de apariția unei zone sinergice, de hemoliză completă la extermitatea striurilor din vecinătatea tulpinii de S. aureus, striuri cu aspect de săgeată (Chifiriuc și colab., 2015) (fig.18)

Fig.18. Evidențierea factorului CAMP-like.

Evidențierea producerii de lecitinaze și lipaze

Lecitinazele și lipazele sunt enzime implicate în virulența tulpinilor bacteriene, determinând formarea porilor în membrana celulelor eucariote prin alterarea arhitecturii moleculare (Chifiriuc și colab., 2015).

Pentru producerea lecitinazei tulpinile au fost însămânțate în spot pe agar cu gălbenuș de ou (2,5%) și incubate 24-48h la 370C ȋn condiții de anaerobiozǎ. Apariția unei zone de precipitat în jurul spoturilor a fost înregistrată careacție pozitivă (fig.20).

Pentru evidențierea lipazelor, tulpinile bacteriene au fost însămânțate în spot pe agar cu adaus de 1% Tween 80 (monooleat de sorbitol) și incubate 24-48 h la 370C ȋn condiții de anaerobiozǎ. Prezența unei zone opace de precipitare în jurul spotului de cultură, determinată de formarea precipitatului de oleat de Ca insolubil (format între acizii grași eliberați sub acțiunea lipazelor și ionii de Ca2+) (fig.19).

Fig.19. Evidențierea acțiunii lipazei. În zona de hidroliză se evidențiază precipitatul format de acizii grași eliberați sub acțiunea fosfolipazelor.

Fig. 20. Evidențierea acțiunii lecitinazei. În zona de hidroliză, precipitatul este format de acizii grași eliberați sub acțiunea fosfolipazei D.

Evidențierea producerii de amilaze

Amilazele se detectează pe geloză simplă la care se adaugă o sursă de amidon, iar hidroliza se relevă prin inundarea plăcii cu HCl și apariția unui halou transparent în jurul spotului de cultură sau cu soluție Lugol și apariția unui inel galben în jurul spotului de cultură, mediul se colorează în albastru (Israil și colab., 2011).

Tulpinile au fost însămânțate în spot pe geloză suplimentată cu 1% amidon. După incubare la 370C timp de 24-48h ȋn condiții de anaerobiozǎ s-a înregistrat prezența zonei de clarificare a mediului în jurul spoturilor de cultură ale tulpinilor pozitive (Chifiriuc și colab., 2011) (fig. 21).

Fig. 21. Evidențierea acțiunii amilazei pe mediu suplimentat cu 1% amidon. Zona de hidroliză a amidonului în jurul spotului de cultură este transparentă.

Evidențierea producerii proteazelor

Proteazele sunt enzime extracelulare cu specificitate scăzută, care hidrolizează proteinele până la peptide și aminoacizi. Sunt implicate în distrugerea integrității țesuturilor gazdei și în progresia infecției (Chifiriuc și colab., 2011).

Pentru evidențierea producerii proteazelor, tulpinile au fost însămânțate în spot pe medii solide cu cazeină, respectiv cu gelatină și incubate 24-48h la 370C ȋn condiții de anaerobiozǎ. Prezența unei zone de precipitare în jurul ariei de creștere a indicat proteoliza cazeinei/gelatinei (prezența cazeinazei/gelatinazei) (Chifiriuc și colab., 2011) (fig. 22).

Fig. 22. Evidențierea acțiunii cazeinazei.

Evidențierea producerii de DN-ază

Sub acțiunea DN-azei, ADN este degradat și rezultă mono- sau dinucleotide. Tulpinile au fost însămânțate în spot pe geloză cu ADN și incubate 24-48 h la 370C ȋn condiții de anaerobiozǎ. După incubare, plăcile au fost inundate cu soluție de HCl 1N, care precipită ADN nedegradat, producând opacifierea, cu excepția zonelor din jurul spoturilor de cultură ale tulpinilor pozitive, care au rămas transparente, datorită fragmentării anterioare a lanțului de ADN la mononucleotide, sub acțiunea DN-azei bacteriene (Lazăr și colab. 2004) (fig. 23).

Fig. 23. Evidențierea acțiunii DN-zei. Colorație cu albastru de toluidină. În jurul spotului culturii bacteriene, hidroliza ADN apare ca un halou de nuanță roz.

Evidențierea producerii esculinazei

Tulpinile au fost însămânțate cu ansa prin înțepare în placi cu mediu cu esculină (1%) și citrat de fier. După incubare 24-48h la 370C, ȋn anaerobiozǎ, reacția pozitivă se înregistrează prin înnegrirea mediului ca urmare a hidrolizei esculinei și formării esculetolului, care prin combinație cu sărurile de fier au determinat înnegrirea mediului (Israil și colab., 2013) (fig. 24). Esculetolul este un chelator al ionilor de fier (asemenea transferinei) furnizând astfel, ionii de fier esențiali celulelor bacteriene pentru activarea unor gene și exprimarea unor factori de virulență (Chifiriuc și colab., 2011).

Hidroliza esculinei este o caracterisitică fenotipică importantă în identificarea speciilor bacteriene. Prezența esculinazei a fost utilizată pentru diferențierea genurilor familiei Enterobacteriaceae și pentru separarea g. Bacteroides, Listeria și a streptococilor de grup D de alte bacterii patogene (Trepeta și Edberg, 1987). Utilizarea mediului B. fragilis bilă-esculină (BBE) pentru identificarea prezumtivă a speciilor g. Bacteroides a fost demonstrată de Livingston și colab. (1978). Edberg și Bell (1985) au arătat rolul esculinazei ca factor de diferențiere a g. Bacteroides de g. Fusobacterium.

Fig. 24. Evidențierea hidrolizei esculinei pe mediu cu adaus de esculină și citrat de fier. Prin hidroliza esculinei se formează esculetolul, care în reacție cu sărurile de fier determină formarea unui compus de culoare închisă.

6.2. Rezultate și discuții

Producerea slime a fost evaluată prin metoda microtitrării. Au fost analizate 75 tulpini ale grupului Bacteroides fragilis și am evaluat nivelul aderenței celulelor bacteriene la godeu. Aderența celulelor a fost exprimată cantitativ: aderență de nivel scazut (+), moderată (++) și aderență intensă (+++), absentă.

Rezultatele au evidențiat că gradul de aderență al speciilor g. Bacteroides este diferit. Astfel, 50,3% dintre tulpinile de B. ovatus au un indice înalt de aderență, 30,6% un nivel de aderență moderată, 10,3% – aderență scăzută și un procent de 8,8% nu aderă la substratul inert (fig.25 ).

Fig.25. Reprezentarea diagramatică a nivelului de aderență la substratul inert al tulpinilor de B. ovatus.

Un procent de 10,4% dintre tulpinile de B. fragilis au un grad ridicat de aderență si respectiv aderență moderată, în timp ce 40,17% au un nivel de aderență scăzută, iar 39,03% nu aderă la substratul inert (fig.26).

Fig.26. Reprezentarea diagramatică a nivelului de aderență al tulpinilor de B. fragilis la substratul inert.

Un procent scăzut de 10% din tulpinile de B. uniformis nu a aderat la substrat, 10% au avut o aderență scăzută, 30% au prezentat o aderență moderată și 50% au aderat intens

(fig.27) .

Fig.27. Reprezentarea diagramatică a nivelului de aderență al tulpinilor de B. uniformis la substratul inert.

20,2% dintre tulpinile de B. thetaiotaomicron sunt intens aderate la substratul inert, 30,4% au aderență moderată, 20,2% au un nivel scăzut de aderență, iar 29,2% nu sunt aderate (fig.28).

Fig.28. Reprezentarea diagramatică a nivelului de aderență al tulpinilor de B. thetaiotaomicron la substratul inert.

70,4% dintre tulpinile de B. vulgatus sunt intens aderate la substratul inert, 10,4% – aderență moderată, 10,4% – aderență scăzută și 8.8% neaderente (fig.29).

Fig.29. Reprezentarea diagramatică a nivelului de aderență al tulpinilor de B. vulgatus la substratul inert.

Indicele de aderență (70,4%) al tulpinilor de B. vulgatus este un indicator al capacității de colonizare a mucoasei intestinale, dar și al rezistenței și capacității de supraviețuire în mediul extern.

Pentru determinarea capacității de aderență și invazie a substratului celulular am analizat 75 de tulpini ale g. Bacteroides., 11 tulpini ale g. Propionibacterium (10 tulpini de P. acnes și o tulpină de P. avidum) și 7 tulpini de Finegoldia magna.

Pattern-ul de aderență al tulpinilor g. Bacteroides este unul predominant difuz- agregativ, iar indicele de aderență este de aproximativ 23% (fig.30). Tulpinile de Propionibacterium spp. au un indice de aderență scăzut (9%) și aderență difuză (fig.31), cele de Finegoldia spp. au un nivel de aderență ridicat (40%), iar tipul de aderență este difuz-agregativ (fig.32). Aderența este mediată de expresia la peste 90% dintre tulpini a proteinei FAF (F. magna adhesion factor) (Murphy și colab., 2014).

Fig.30. Aderență difuz-localizată a unei tulpini Bacteroides fragilis la celulele Hep-2 (colorație Giemsa, x100).

Fig.31. Aderență de tip difuz a unei tulpini de Propionibacterium acnes la celule Hep-2

(colorație Giemsa, x100).

Fig.32. Aderență de tip difuz a unei tulpini de Finegoldia magna la celule Hep-2

(colorație Giemsa, x100).

Finegoldia magna este o componentă importantă a microbiotei tegumentului, cavității bucale, tractului gastrointestinal și urogenital (Higaki și Morohashi, 2003; Murdoch, 1998), dar în situsuri sterile devine patogen oportunist (Lood și colab., 2015), datorită prezenței a doi factori de virulență: o serin protează extracelulară (SufA) și o proteină cu rol în inițierea aderenței la celulele epiteliale, proteina FAF (Murphy și colab., 2014), favorizând formarea biofilmelor bacteriene (Donelli și colab., 2012).

Pentru evidențierea factorilor solubili de virulență am analizat un lot de 75 tulpini de Bacteroides spp., 11 tulpini de Propionibacterium acnes și 7 tulpini de Finegoldia magna.

Din cele 75 tulpini de Bacteroides spp., cele mai multe au fost pozitive pentru enzime, care hidrolizează esculina 55 (73,3%), 35 (46,6%) au produs amilază, 20 (26,6%) au fost pozitive pentru cazeinază, 17 (22,6%) au produs DN-ază, 2 (2,6%) au fost pozitive pentru lipaze și 1 tulpină pentru lecitinaze. Toate tulpinile au fost γ- nehemolitice și nici una nu a fost pozitivă pentru factorul CAMP (fig.33).

Fig. 33. Distribuția factorilor solubili de virulență ai tulpinilor de Bacteroides spp.

Cei mai frecvenți factori de virulență ai tulpinilor de B. fragilis au fost: esculinaza (22 tulpini), amilaza (14 tulpini), DN-aza (6 tulpini) și cazeinaza (5 tulpini). Nici una dintre tulpini nu a fost pozitivă pentru lipază, lecitinază, factor CAMP sau hemolizine (fig.34).

Fig.34. Distribuția factorilor solubili de virulență ai tulpinilor de B. fragilis.

Dintre cele 16 tulpini de B. vulgatus, 13 au fost pozitive pentru esculinază, 7 pentru amilază, 5 pentru cazeinază, 4 pentru DN-ază, 1 pentru lecitinază. Nici una nu a fost pozitivă pentru lipază, factor CAMP sau hemolizine (fig.35).

Fig.35. Distribuția factorilor solubili de virulență ai tulpinilor de B.vulgatus.

Esculinaza este factorul de virulență pe care-l exprimă cele mai multe tulpini de B. uniformis: 7 dintre cele 12. Cazeinaza este produsă de 6 tulpini, amilaza de 5 tulpini, DN-aza de 3 tulpini, lipaza de 1 tulpină. Nicio tulpină nu a fost pozitivă pentru lecitinază, factor CAMP și hemolizine (fig.36).

Fig.36. Distribuția factorilor solubili de virulență ai tulpinilor de B.uniformis.

Factorii de virulență cel mai frecvent identificați la tulpinile de B. ovatus au fost esculinaza și amilaza (câte 4 tulpini), DN-aza la 2 tulpini, cazeinaza la 1 tulpină. Nicio tulpină nu a fost pozitivă pentru lecitinază, lipază, factor CAMP sau pentru hemolizine (fig.37).

Fig.37. Distribuția factorilor solubili de virulență ai tulpinilor de B. ovatus.

5 tulpini de B. thetaiotaomicron au fost pozitive pentru esculinază, 4 tulpini pentru amilază, 2 tulpini pentru DN-ază, 1 tulpină pozitivă pentru cazeinază și 1 pentru lipază. Nicio tulpină nu a fost pozitivă pentru lecitinază, factor CAMP sau hemolizine (fig.38).

Fig. 38. Distribuția factorilor de virulență solubili ai tulpinilor de B. thetaiotaomicron.

Dintre cele 5 tulpini de B. stercoris, 3 tulpini au fost pozitive pentru esculinază, 2 pentru cazeinază, 1 pentru amilază. Nicio tulpină nu a fost pozitivă pentru DN-ază, lipază, lecitinază, factor CAMP sau hemolizine (fig.39).

Fig.39. Distribuția factorilor solubili de virulență ai tulpinilor de B. stercoris.

Analizând distribuția fiecărui factor de virulență în funcție de specie, constatăm că esculinaza este exprimată în special de tulpinile de B. fragilis (85%), de tulpinile de B. vulgatus (81%), B. thetaoiotaomicron (63%), B. stercoris (60%) și B. ovatus (57%) (fig. 40).

Fig.40. Distribuția procentuală a exprimării esculinazei ca factor solubil de virulență la tulpinile de Bacteroides spp.

57% dintre tulpinile de B. ovatus produc amilază, urmate tulpinile de B. fragilis (54%), B. thetaiotamicron (50%), B. vulgatus (44%), B. uniformis (42%) și B.stercoris (20%) (fig.41).

Fig.41. Distribuția procentuală a exprimării amilazei ca factor solubil de virulență la tulpinile de Bacteroides spp.

50% dintre tulpinile de B. uniformis și 40% dintre tulpinile de B. stercoris sunt pozitive pentru sinteza cazeinazei. Cel mai mic procent de exprimare al acestui factor de virulență l-am înregistrat la tulpinile de B. thetaiotaomicron (13%) (fig.42 ).

Fig.42. Distribuția procentuală a exprimării cazeinazei ca factor de virulență solubil la tulpinile de Bacteroides spp.

Analizând capacitatea de sinteză a DN-azei la tulpinile g. Bacteroides am constatat că toate speciile genului sunt pozitive în procente aproximativ egale. Astfel, tulpinile de B. ovatus, B. uniformis, B. thetaiotaomicron și B. vulgatus au sintetizat DN-ază în procente asemănătoare (25%). Tulpinile B. stercoris au fost negative pentru DN-ază (fig.43).

Fig.43. Distribuția procentuală a exprimării DN-azei la tulpinile de Bacteroides spp.

Lipaza a fost sintetizată de 13% dintre tulpinile de B. thetaiotaomicron și de 8% B. uniformis. Celelalte specii ale genului nu au fost producătoare de lipază (fig.44).

Fig.44. Distribuția procentuală a exprimării lipazei la tulpinile de Bacteroides spp.

În concluzie, specia B. uniformis a exprimat fenotipic cei mai mulți factori de virulență, urmată de B. fragilis, B. vulgatus, B. thetaiotaomicorn, B. ovatus și B. stercoris (fig.45).

Colonul este ecosistemul anaerobic complex, la nivelul căruia se găsesc numeroase specii bacteriene cu rol în degradarea polizaharidelor ingerate și a glicoproteinelor endogene (mucina). Speciile g. Bacteroides au un echipament enzimatic, care hidrolizează glicoproteinele, rezultând monozaharide și aminoacizi, folosiți de alte specii bacteriene ca sursă de carbon. Numărul mare de tulpini pozitive pentru esculinază reflectă adaptarea celulelor de Bacteroides la deficitul de Fe al mediului colonic printr-un mecanism molecular care leagă cu mare afinitate elementul esențial pentru creștere.

Fig.45. Gradul de exprimare al factorilor de virulență solubili ai speciilor g. Bacteroides

Toate cele 11 tulpini de Propionibacterium sunt pozitive pentru cazeinază, 10 tulpini produc factorul CAMP, 1 tulpină este pozitivă pentru lipază și 1 tulpină hidrolizează esculina (fig.46). Exprimarea ridicată a factorului CAMP (90,9%) la tulpinile g. Propionibacterium indică gradul înalt de virulență. Factorul CAMP se leagă la IgG și IgM, dar acționează ca o toxină formatoare de pori la nivelul membranei celulelor gazdei (Achermann și colab., 2014).

Fig.46. Distribuția factorilor solubili de virulență ai tulpinilor de Propionibacterium spp.

Factorul de virulență reprezentativ pentru tulpinile (4 tulpini din cele 7) de Finegodia magna a fost DN-aza, 1 tulpină a produs amilază și o alta a fost pozitivă pentru cazeinază. Nicio tulpină nu a fost producătoare de esculinază, lipază, lecitinază, factor CAMP și hemolizine (fig.47).

Fig.47. Distribuția factorilor solubili de virulență ai tulpinilor de Finegoldia magna.

Procentul mare de tulpini pozitive pentru cazeinază și amilază, evidențiază rolul speciilor F. magna în degradarea unei game variate de polizaharide, inclusiv a amidonului. Gradul ridicat de virulență a speciilor g. Finegoldia este indicat de numărul mare de tulpini pozitive pentru DN-ază, care asigură reducerea vâscozității secrețiilor în care se acumulează ADN din celulele lizate, pemițând diseminarea bacteriilor și furnizând nucleotide pentru propriile sinteze (Chifiriuc și colab., 2011).

6.3. Concluzii

1. Studiul nostru evidențiază gradul ridicat de virulență al speciilor g. Bacteroides, demonstrat de capacitatea de aderență la celulele Hep-2. Pattern-ul de aderență la substratul celular al tulpinilor g. Bacteroides este predominant difuz-agregativ, iar indicele de aderență este de aproximativ 23%.

2. Esculinaza este factorul de virulență exprimat fenotipic de majoritatatea tulpinilor g. Bacteroides (73,3%).

2. Tulpinile de Propionibacterium spp. au un indice de aderență de 9% și o aderență de tip difuz.

3. Tulpinile de Finegoldia spp. au un indice de aderență ridicat (40%), iar pattern-ul de aderență a fost difuz-agregativ.

Capitolul 7

EVIDENȚIEREA FACTORILOR DE VIRULENȚĂ

PRIN METODE MOLECULARE

7.1. Materiale și metode

Extracția ADN genomic

În vederea realizării screening-ului genelor de virulență, ADN genomic a fost extras utilizând metoda de extracție alcalină a ADN. Metoda constă în prelevarea unei colonii din cultura bacteriană incubată 48h la 370C în condiții de anaerobioză și realizarea unui inocul într-o soluție de 20 µl soluție 0,05 NaOH+ SDS 0,25%, care se termostatează 15 min la 950C, urmată de adăugarea 180 µl soluție tampon TE 1X- pH=8 și centrifugarea la 13000 r.p.m timp de 3 minute cu obținerea sedimentului celular. Recuperarea supernatantului s-a făcut într-un tub Eppendorff nou și stocat la -200C. Identificarea genelor de virulență ale tulpinilor g. Bacteroides s-a realizat prin PCR multiplex. În reacția de amplificare am folosit primeri descriși în literatură. Genele ftn și sod, respectiv genele kat și bft au fost amplificate în cuplu. Secvențele primerilor, dimensiunea ampliconilor și specificitatea sunt prezentate în tabelul 8. Programele de amplificare sunt redate in tabelul 9, iar componentele reacției sunt enumerate in tabelul 10.

Tabelul 8. Secvențele nucleotidice ale primerilor și dimensiunile ampliconilor rezultați

Tabelul 9 . Programul de amplificare al reacțiilor PCR

Tabelul 10. Componentele reacției PCR

*Dream Taq Green (Thermo Scientific, USA), 2X

Reacțiile PCR au fost efectuate cu aparatul Thermal Cycler Corbet. Produșii de amplificare au fost vizualizați prin electoforeză în gel de agaroză 1%, colorat cu bromură de etidium (10µg/ml) și identificați pe baza dimensiunilor caracteristice cu markeri specifici de gr. mol (100 pb, ThermoScientific). Gelurile au fost fotografiate cu instrumentul de documentare pentru geluri UVP.

Tehnica PCR ne-a permis caracterizarea la nivel molecular a genelor codificatoare pentru 4 factori de virulență ai tulpinilor g. Bacteroides: gena bft pentru enterotoxina BFT, gena kat pentru catalază, gena sod pentru superoxid-dismutază și gena ftn pentru feritină.

7.2. Rezultate și discuții

20 tulpini au fost pozitive pentru gena sod (230 bp), 13 pozitive pentru gena ftn (183 bp), 10 pentru kat (173 bp) și 15 tulpini de B. fragilis au fost pozitive pentru gena bft (500 pb) (fig. 48-54).

Fig. 48. Electroforegrama ampliconilor genelor de virulenta bft (500bp) și kat (170 bp). Tulpini pozitive pentru gena bft: 47; 11; 25; 62; 49; 77; 31; 28; 59. Tulpini pozitive pentru gena kat: 47; 49.

Fig. 49. Electroforegrama ampliconilor genelor de virulenta bft (500bp) și kat (170 bp). Tulpini pozitive pentru gena bft: 51; 24; 38; 17; 27; 46; 36; 57; 4F; 29. Tulpini pozitive pentru gena kat: 51; 24; 27; 29.

Fig. 50. Electroforegrama ampliconilor genelor de virulenta bft (500bp) și kat (170 bp). Tulpini pozitive pentru gena bft: 6; 5; 41; 21; 35; 75; 67. Tulpini pozitive pentru gena kat: 6; 5; 41; 35.

Fig. 51. Electroforegrama ampliconilor genelor de virulență ftn (183bp) si sod (230 bp). Tulpini pozitive pentru gena ftn: 5; 47; 14; 12; 7. Tulpini pozitive pentru gena sod: 32; 18; 30.

Fig. 52. Electroforegrama ampliconilor genelor de virulență ftn (183bp) și sod (230 bp). Tulpini pozitive pentru gena ftn: 40; 71; 33; 48; 24; 53; 37. Tulpini pozitive pentru gena sod: 46.

Fig. 53. Electroforegrama ampliconilor genelor de virulență ftn (183bp) si sod (230 bp). Tulpină pozitivă pentru gena ftn: 27. Tulpini pozitive pentru gena sod: 49 ; 13; 27; 65; 25; 64; 52.

Fig. 54. Electroforegrama ampliconilor genelor de virulență ftn (183bp) si sod (230 bp). Tulpini pozitive pentru gena sod: 42; 50; 76; 6; 17; 4; 33; 78; 45. Tulpini pozitive pentru gena ftn: 20; 63; 43; 11; 51.

B. thetaiotaomicron are cel mai mare procent de tulpini pozitive pentru gena sod (62,8%), B. fragilis (34,65%), B. ovatus (14,2%), B. uniformis (16.6%) și B. vulgatus (12,5%). Gena kat a fost prezentă în proporție de 34.6% la tulpinile de B. fragilis și 12,5% la B. thetaiotaomicron.

Tulpinile de B. fragilis au prezentat o distribuție procentuală a genei ftn de 30,4%, tulpinile de B. ovatus – 28,5%, B. uniformis – 25% și B. thetaiotaomicron – 12,5% (tabelul 11).

Tabelul 11. Distribuția genelor de virulență a tulpinilor de Bacteroides spp.

Gena sod este cea mai frecventă genă de virulență identificată la tulpinile de Bacteroides: 26,6%- pozitive, gena ftn – 17,3% și gena kat – 13,3%. Gena bft a fost identificată la 15 tulpini (57,6%) de B. fragilis. Au fost evidențiate tulpini pozitive pentru gena bft care nu aparțin aparțin speciei B. fragilis. Acest rezultat indică legarea nespecifică a primerilor.

Gena sod a fost evidențiată la 10 tulpini izolate din lichidul peritoneal, la 4 tulpini izolate din apendice, la 5 tulpini din fosa iliacă dreaptă, la 1 tulpină izolată din secreția biliară. Nicio tulpină izolată din abcesul intraabdominal și din ulcerul perforat nu a fost pozitivă pentru superoxid -dismutaza (fig. 55).

Fig. 55. Distribuția genei sod la tulpinile de Bacteroides în diferite situsurile anatomice.

În respirația celulară se formează intermediarii reducerii O2, peroxidul de hidrogen (H2O2), radicalul superoxid (O2-) și radicalul hidroxil (OH) cu potențial oxidant, determinând modificări funcționale ale macromoleculelor celulei bacteriene anaerobe, prin ruperea legăturilor peptidice, depolimerizarea acizilor nucleici și oxidarea polizaharidelor și a acizilor grași nesaturați. Pentru a supraviețui, speciile g. Bacteroides și-au dezvoltat un sistem enzimatic de apărare anti-oxidant: superoxid-dismutază (SOD) și catalază (Fridovich și colab., 1995; Rocha și colab., 2007; Sund și colab., 2008). Pe măsura expunerii la oxigenul atmosferic pentru o perioadă mai îndelungată crește cantitatea de feritină (proteină codificată de gena ftn) cu rol în legarea Fe din mediul extern și transportul în celulă (Rocha și Smith, 2004; Rocha și Smith, 2013).

Superoxid-dismutaza a fost evidențiată la specii ale g. Bacteroides și Fusobacterium (Gregory și colab., 1978) ca factor de virulență al tulpinilor anaerobe patogene, izolate din diferite situsuri anatomice, dar și la tulpini din microbiota tractului digestiv.Tulpinile anaerobe izolate din diferite situsuri de infecție, devin aerotolerante, datorită capacității de producere a superoxid-dismutazei ca factor protector antioxidant (Tally și colab., 1977).

9 din cele 10 tulpini pozitive pentru gena kat aparțin speciei B. fragilis, ceea ce sugerează capacitatea înaltă de supraviețuire a acestei specii în prezența oxigenului atmosferic. Tulpinile de B. vulgatus și B. uniformis sunt catalazo-negative (Tang și colab., 2015).

Catalaza produsă de B. fragilis este o hemoproteină alcătuită din două subunități identice, fiecare cu gr. moleculară de 60 kDa, iar catalaza produsă de B. thetaiotaomicron are o gr. moleculară de 250 kDa (Patrick, 2015). Are rolul de a cataliza reacția de transformare a H2O2 în H2O și O2 protejând celula față de efectul distructiv al H2O2 (Rocha și Smith, 1995). Există două tipuri de catalază: un tip monofuncțional, care folosește H2O2 ca donor de electroni și unul bifuncțional, catalază-peroxidază, la care donorul de electroni este reprezentat de diferiți compuși organici (pirogalol, diaminobenzidina, NADH, NADPH, etc.) (Brioukhanov și Netrusov, 2004). Tulpinile mutante, negative pentru gena kat supravețuiesc în prezența oxigenului, dar sunt foarte sensibile la efectul toxic al H2O2 (Rocha și Smith, 1998).

B. fragilis este singura specie a g. Bacteroides asociată cu sindromul diareic (Sears și colab., 2008; Wick și Sears, 2010; Chen și colab., 2015). Toxina produsă de tulpinile enterotoxigenice se numește fragilizină și este codificată de gena bft. Toxina este un factor de virulență al tulpinilor de B. fragilis prin efectul citopatic asupra celulelor epiteliului intestinal, fapt argumentat experimental (Sears și colab., 2008). Fragilizina este o enterotoxină extracelulară din clasa metaloproteinelor (un atom de Zn în centrul catalitic activ) și are o gr. mol de 20 kDa. Tulpini producătoare de fragilizină au fost izolate de Myers și colab. (1984) din materiile fecale ale mieilor cu diaree. Au fost identificate 3 subtipuri de fragilizină (BFT-1, BFT-2 și BFT-3), subtipul BFT-1 fiind cel mai des izolat (Kato și colab., 2000).

Tulpinile enterotoxigenice de B. fragilis determină tulburări diareice, cauzând efecte citopatice la nivelul membranei celulelor epiteliale intestinale in vivo și in vitro (Obiso și Wilkins, 1995). Studii recente au demonstrat rolul tulpinilor de B. fragilis producătoare de fragilizină în bolile inflamatorii intestinale (colita ulcerativă) (Zamani și colab., 2017).

Choi și colab. (2016) au evidențiat rolul tulpinilor enterotoxigenice în producerea sepsisului. Aceste tulpini constituie un factor de risc pentru dezvoltarea carcinoamelor colorectale (Toprak și colab., 2006 ; Sears și colab., 2008; Boleij și colab., 2015).

Dintre cele 26 tulpini de B. fragilis analizate, 15 tulpini (57,69%) au fost pozitive pentru gena fragilizinei (500 bp). 6 tulpini purtătoare ale genei bft au fost izolate din lichidul peritoneal, 3 tulpini din fosa iliacă dreaptă, 2 tulpini din apendice, 2 tulpini din secreția biliară și 2 tulpini din abces intraabdominal (tabelul 12).

Tabelul 12 . Distribuția genei bft la tulpinile de B. fragilis izolate din diferite situsurile anatomice.

Avila-Campos și colab. (2007), într-un studiu pe un lot de 329 de tulpini de B. fragilis, izolate din diferite situsuri anatomice, dintre cele 51 tulpini izolate din lichidul peritoneal, 4 tulpini au fost purtătoare ale genei bft, 8 dintre cele 58 izolate din apendice au fost pozitive pentru gena bft, 8 din 41 izolate din abces intraabdominal, 1 din cele 3 izolate din abces sacral și 1 din cele 3 tulpini izolate din secreția biliară au fost pozitive pentru gena bft.

Un alt studiu pe 200 tulpini de B. fragilis, colectate din infecții intraabdominale, Sarvari și colab. (2017) au evidențiat 26 tulpini (13%) pozitive pentru gena bft.

Dintre cele 65 de tulpini de Bacteroides izolate de Luczak și colab. (2001), 12 (18,46%) au fost pozitive pentru gena bft.

Feritina are capacitatea de a lega o cantitate mare de fier (3000-4000 atomi/ moleculă) element esențial pentru creșterea celulei bacteriene și în homeostazia stresului oxidativ (Rocha și Smith, 2004).

Gena pentru feritină (ftn) a fost identificată la 13 tulpini de Bacteroides. Cele mai multe tulpini pozitive pentru această genă au fost izolate din lichidul peritoneal (5), 3 din apendice, 2 din abces intraabdominal, 2 din fosa ilacă dreaptă și 1 din ulcer perforat. (fig.56).

Fig.56. Distribuția genei ftn la tulpinile de Bacteroides spp. izolate din diferite situsuri anatomice.

7.3. Concluzii

1. Profilurile genelor de virulență cel mai frecvent izolate la tulpinile g. Bacteroides au fost bft, kat, ftn; bft, kat, sod și ftn, sod, kat .

2. Caracterizarea genotipică a factorilor de virulență ai tulpinior g. Bacteroides a arătat că: 26,6% dintre tulpini sunt pozitive pentru gena sod, 17,33% pentru gena ftn, 10,66% pentru gena kat, iar 57,69% au fost pozitive pentru gena bft.

3. Tulpinile izolate din abcesul intraabdominal au cel mai mare număr de gene codificatoare ale factorilor de virulență. 67% au gena bft, 67% gena kat, 67% gena ftn. Nicio tulpină nu posedă gena sod. Tulpinile izolate din ulcerul perforat sunt cel mai puțin virulente: 25% au gena ftn. La nicio tulpină nu s-au evidențiat genele bft, kat și sod (fig.57).

Fig.57. Profilurile genelor de virulență izolate din diferite situsuri anatomice.

Capitolul 8

PROFILULURI FENOTIPICE DE REZISTENȚĂ

LA ANTIBIOTICE A TULPINILOR DE Bacteroides spp.

8.1. Materiale și metode

Sensibilitatea la antibiotice

Determinarea spectrului de sensibilitate la antibiotice s-a realizat prin metoda microdiluțiilor. Tulpinile bacteriene au fost însămânțate pe mediul lichid Brucella agar, suplimentat cu hemină (5µ/ml), vitamina K (1µg/ml) și 5% sânge de cal. Suspensia bacteriană, cu o densitate 0,5 McFarland, în volum de 100µl a fost inoculată într-o placă cu 96 de godeuri, cu concentrații descrescătoare de antibiotice (Sensititre Anaerobe MIC Plate – TREK Diagnostic System, UK). Plăcile au fost introduse in sistemele GasPak și incubate la 370C timp de 48 h (fig.58). Acuratețea rezultatului a fost testată cu un control de calitate, reprezentat de o tulpină de referință de Bacteroides fragilis ATCC 25285. Creșterea bacteriană a fost marcată prin apariția turbidității și virarea culorii mediului. Au fost testate următoarele antibiotice: ampicilină cu sulbactam, amoxicilină cu acid clavulanic, cefotetan, penicilină, imipenem, meropenem, clindamicină, cefoxitin, metronidazol, cloramfenicol, ampicilină, tetraciclină și piperacilină cu tazobactam.

Astfel, am determinat concentrația minimă inhibitorie- concentrația la care un antibiotic inhibă multiplicarea microorganismelor conform CLSI (2015 și 2016), pe baza căreia tulpinile bacteriene sunt considerate rezistente, intermediare sau sensibile.

A.B.

C.

Fig. 58. Testarea sensibilității la antibiotice prin metoda microdiluțiilor.

Realizarea inoculului bacterian. B. Pipetarea suspensiei bacteriene în placa cu godeuri. C. Virarea culorii datorită turbidității mediului.

Testul producerii de β-lactamază

Pentru determinarea producerii de β-lactamază s-au folosit discuri impregnate cu o cefalosporină cromogenică (OXOID, UK). Colonii izolate din cultura bacteriană au fost așezate pe acest disc, în prealabil umezit cu apă deionizată. Pentru tulpinile pozitive (secretoare de β-lactamază) după 5-10 minute, culoarea discului virează (din galben în roz) (fig.59).

Fig. 59. Confirmarea producerii de β-lactamază prin testul cefinazei.

8.2. Rezultate și discuții

Din numărul total de tulpini bacteriene (374) am selectat 75 tulpini de Bacteroides pentru care am determinat CMI (concentrția minimă inhibitorie) a antibioticelor de uz curent: ampicilină cu sulbactam, amoxicilină cu acid clavulanic, cefotetan, penicilină, imipenem, meropenem, clindamicină, cefoxitin, metronidazol, cloramfenicol, ampicilină, tetraciclină și piperacilină cu tazobactam (tabelul 13).

Tabelul 13. Concentrația minimă inhibitorie și procentul de rezistență a tulpinilor de Bacteroides spp.

Toate tulpinile au fost rezistente la ampicilină (CMI 2 – >16 mg/l), penicilină ( CMI 2- > 4 mg/l) și tetraciclină (CMI 8 – >8 mg/l). 16 tulpini (21,9%) au fost rezistente la clindamicină (CMI 0,25 >8 mg/l), 8 tulpini (10,95%) rezistente la cefotetan (CMI 64 – >64 mg/l) și 1 tulpină (1,36%) rezistentă la cefoxitin (CMI >32 mg/l). Nicio tulpină nu a fost rezistentă la metronidazol, augmentin, ampicilină cu sulbactam, imipenem, meropenem, cloramfenicol și piperacilină cu tazobactam (fig.60 ).

Fig.60. Numărul tulpinilor de Bacteroides spp. rezistente la antibiotice.

Sarvari și colab. (2018) au raportat rezultate similare, tulpinile anaerobe fiind rezistente la ampicilină (98% dintre tulpini), iar 65% dintre tulpini au fost rezistente la tetraciclină. Tulpinile au fost sensibile în proporție de 100% la metronidazol și la cloramfenicol, la augmentin și meropenem de 4% și respectiv 7%, iar la clindamicină de 36,7%.

Rezistența Bacteroides fragilis la penicilină a fost raportată de Kreush și O' Connell (1966). În 2015 și 2017 proporția tulpinilor de Bacteroides rezistente la penicilină a ajuns la 99% (Javerica și colab. 2015; Kolenc și colab. 2017).

Marina și colab. (2009) au raportat rate de rezistență de 100% la penicilină, Kenneth și colab. (2001) o rezistentă la penicilină de 100% a tulpinilor de Bacteroides spp., izolate din diferite situsuri anatomice, Novak și colab. (2015) au raportat proporția de 97% a rezistenței la penicilină, din 63 de tulpini de Bacteroides, izolate din infecții intraabdominale.

Spre deosebire de celelalte antibiotice β-lactamice, cefamicinele (cefoxitinul și cefotetanul) și-au păstrat activitatea față de tulpinile g. Bacteroides. Noi am identificat o singură tulpină de B.thetaiotaomicron rezistentă la cefoxitin (CMI >32 mg/l). Fille și colab. (2006) au evidențiat creșterea ratei de rezistență la cefoxitin a tulpinilor de Bacteroides, de la 0% (1992) la 4,6% (2003-2004).

Cea mai înaltă rată de rezistență la cefotetan au avut-o tulpinile de B. ovatus- 42,8% (CMI 32 – >64 mg/l), B. thetaiotaomicron- 37,5% (CMI 8 – >64 mg/l), B. uniformis- 25% (CMI 4-64 mg/l), B. vulgatus- 6,25% (CMI 4-64 mg/l) și B. fragilis- 3,8% (CMI 4-64 mg/l). Toate tulpinile de B. caccae și B. stercoris au fost sensibile la cefotetan (CMI -4 mg/l respectiv CMI 4-8 mg/l ) (fig. 61).

Rezulate similare au obținut Wybo și colab. (2007), care au raportat o rată de rezistență de 17% a tulpinilor de B. fragilis, comparativ cu o rată a rezistenței de 89%, înregistrată la celelalte specii ale g. Bacteroides.

Fig. 61. Rata rezistenței la cefotetan a tulpinilor de Bacteroides spp.

Am determinat activitatea antibacteriană a trei antibiotice β-lactamice asociate cu inhibitor de β-lactamază: amoxicilină cu acid clavulanic, ampicilină cu sulbactam și piperacilină cu tazobactam. Nicio tulpină nu a fost rezistentă la aceste antibiotice, spre deosebire de studiul lui Novak și colab (2015), care au evidențiat o rezistență de 5,7% la amoxiclină cu acid clavulanic și de 8,6% la piperacilină cu tazobactam. Jamal și colab. (2015) au raportat o scădere a rezistenței la amoxiclină cu acid clavulanic de la 15,3% în perioada 2002-2007, la 13,1% în perioada 2002-2007. Ullrich și colab. (2017) au raportat o rezistență de 7,8% la augmentin a tulpinilor de B. fragilis și o rezistență de 6,8% la celelalte specii ale g. Bacteroides, iar rezistența la piperacilină cu tazobactam este de 2% la B. fragilis și 16,9% la celelalte specii ale g. Bacteroides.

Un procent de 98% dintre tulpinile g. Bacteroides, izolate între 2011-2013 de Veloo și van Winkelhoff (2015) au fost rezistente la amoxicilină și numai 1% au prezentat rezistență la amoxicilină cu acid clavulanic.

Conform sudiilor realizate în Europa pe parcusul a 20 de ani, rezistența la amoxicilină cu acid clavulanic și piperacilină cu tazobactam a crescut de la 1% la 10,4% pentru amoxicilină cu acid clavulanic și de la <1% la 10,1% pentru piperacilină cu tazobactam (Nagy, 2010).

Din numărul total al tulpinilor g. Bacteroides, 16 tulpini (21,9%) au fost rezistente la clindamicină (CMI 0,25- >8 mg/l). O rată de rezistență de 29% fost raportată de Novak și colab. (2015) prin determinarea CMI la clindamicină a unui lot de 63 de tulpini. Veloo și van Winkelhoff (2015) au studiat procentul de rezistența la clindamicină pe parcursul a trei ani consecutiv. Astfel, în 2011 rezistența la clindamicină era de 14%, în 2012 a fost 27%, iar în 2013 de 21%.

Tulpinile de B. vulgatus sunt rezistente la clindamicină în proporție de 56,2% (CMI 0,25- >8mg/l); tulpinile de B. ovatus – 28,5% (CMI 0,5- >8mg/l); B. thetaiotaomicron – 12,8% (CMI 0,25- >8mg/l); B. uniformis – 8,33% (CMI 0,25- >8mg/l); B. fragilis – 15,3% (CMI 0,25- >8mg/l) ). Tulpinile de B. caccae și B. stercoris au fost sensibile la clindamiciă (CMI 0,25 mg/l respectiv 0,25-0,5 mg/l) (fig.62).

Fig. 62. Rata rezistenței la clindamicină a tulpinilor de Bacteroides spp.

Rata rezistenței speciilor g. Bacteroides diferă: 56% dintre tulpinile de B. vulgatus sunt rezistente la clindamicină, rezultatele fiind asemănătoare celor obținute de Sarvari și colab. (2018).

Jeverica și colab. (2017) au evidențiat o rată de rezistență la clindamicină de 42% a tulpinilor de B. thetaiotaomicron.

.

Rezistența la carbapeneme a speciilor g. Bacteroides raportată în Europa și SUA este aproximativ 1%, (Nagy și colab., 2011; Snydman și colab., 2010) și este mediată de prezența unei metalo-β-lactamaze codificată de gena cfiA.

Toate tulpinile de Bacteroides au o sensibilitate de 100% la imipenem (CMI 0,12-5 mg/L) și meropenem (CMI 0,5-2 mg/L). Rezultate asemănătoare au fost evidențiate de Snydman și colab. (2009) cu o rată de rezistență la carbapeneme între 1,1% și 2,5%. O rată de rezistență de 5% și 7% la carbapeneme au obținut Siefert și colab. (2010), respectiv Hughes și colab. (2018). Maja și colab. (2018) au izolat prima tulpină de Bacteroides fragilis rezistentă la imipenem, de la un pacient cu tumoră de vezică urinară.

Metronidazolul (5-nitroimidazol) este cel mai important agent terapeutic al infecțiilor determinate de bacteriile anaerobe. Rezistența la metronidazol este deteminată în special de prezența genei nim, care codifică 5-nitroimidazol-reductaza, cu rol în scindarea metronidazolului în derivați aminici, nontoxici pentru celula bacteriană (Carlier și colab., 1997). Activitatea pompelor de eflux este al doilea mecanism de rezistență la metronidazol al bacteriilor anaerobe (Pumbwe și colab., 2007; Ghetaslou și colab., 2018). În Europa, rata rezistenței la metronidazol a tulpinilor de Bacteroides s-a modificat de la 0% în 1990 (Tuner și colab., 1993) la 0,5% în 2010 (Soki și colab., 2013).

Ingham și colab. (1978) au izolat prima tulpină de Bacteroides fragilis rezistentă la metronidazol. Ulterior au fost semnalate tulpini rezistente la metronidazol în India (Chaudry și colab., 2001), Statele Unite (Schapiro și colab., 2004; Sadarangani și colab., 2015), Turcia (Toprak și colab., 2013), Ungaria (Urban și colab., 2015), Brazilia (Vieira și colab., 2006), Polonia (Wojcik-Stojec și colab., 2000), Franța (Breuil și colab., 1989) și Rusia (Shilnikova și Dmitrieva, 2015).

Cele 75 de tulpini ale g. Bacteroides analizate de noi au fost sensibile la metronidazol în proporție de 100% (CMI 0,5-2 mg/l). Rezultate asemănătoare au fost raportate de Nagy și colab. (2011), pentru 824 de tulpini de B. fragilis, izolate din 13 țări europene. Nicio tulpină nu a fost rezistentă la metronidazol. De asemenea, toate cele 363 tulpini de Bacteroides, analizate de Canigia-Fernandez și colab. (2012) au fost sensibile la metronidazol. Rezultate alarmante au fost obținute în Spania, unde rata rezistenței la metronidazol a fost de 3,6% (Trevino și colab., 2012).

Tetraciclina a fost utilizată pe scară largă în antibioterapia infecțiilor anaerobe, datorită toxicității scăzute și spectrului larg de activitate. Utilizarea acestui antibiotic s-a diminuat din cauza selecției unui număr mare de tulpini bacteriene anaerobe, importante din punct de vedere clinic, rezistente la tetraciclină.

Tulpinile analizate de noi au rezistență de nivel înalt la tetraciclină (100%) (CMI 8 – > 8 mg/L), comparativ cu rezultatele obținute de Szekely și colab. (2015), conform cărora rata rezistenței la tetraciclină a fost 75,9%, iar Sarvari și colab. (2018) au raportat procentul de rezistență de 65% al tulpinilor anaerobe.

8.3.Concluzii

1. Tulpinile analizate de noi au fost rezistente la ampicilină (100%), penicilină (100%), tetraciclină (100%), clindamicină (21,9%), cefotetan (10,95%) și cefoxitin (1,36%).

2. Nicio tulpină nu a fost rezistentă la metronidazol, augmentin, ampicilină cu sulbactam, imipenem, meropenem, cloramfenicol și piperacilină cu tazobactam.

Capitolul 9

PROFILULURI GENOTIPICE DE REZISTENȚĂ

LA ANTIBIOTICE A TULPINILOR DE Bacteroides spp.

9.1. Materiale și metode

Extracția ADN

ADN genomic a fost extras prin metoda alcalină. Am evidențiat genele cepA, cfxA, tetQ și ermF prin tehnologia PCR.

Au fost folosiți primeri din literatură pentru genele cepA, tetQ și ermF, iar pentru gena cfxA, secvența primerilor a fost preluată din articolul lui Parker și colab. (1993). Secvențele nucleotidice ale primerilor, programul și componentele reacției PCR sunt redate în tabelele 14, 15 și 16.

Tabelul 14. Secvențele nucleotidice ale primerilor și dimensiunile ampliconilor obținuți

Tabelul 15. Programul reacției PCR

Tabelul 16. Componentele reacției PCR

*Dream Taq Green (Thermo Scientific, USA), 2X

9.2. Rezultate și discuții

După analiza EF a ampliconilor celor 75 de tulpini de Bacteroides spp. analizate, 40 tulpini (53,3%) poartă gena cepA (779 bp), 14 (18,6%) au fost pozitive pentru gena ermF (446 bp), 74 pentru tetQ (460 bp). Nicio tulpină nu a fost pozitivă pentru gena cfxA (802 pb) (fig.63-69).

Fig. 63. Electroforegrama ampliconilor genelor de rezistența ermF (446 bp) si cepA (779 bp). Tulpini pozitive pentru gena cepA: 38; 24; 53; 56; 16; 44; 6; 35; 28; 58; 12. Tulpini pozitive pentru gena ermF: 20; 9; 50.

Fig. 64. .Electroforegrama ampliconilor genelor de rezistență ermF (446bp) si cepA (779 bp). Tulpini pozitive pentru gena cepA: 36; 43; 15; 14; 76; 25; 55; 42; 51; 13; 5. Tulpini pozitive pentru gena ermF: 39; 32; 55; 47; 70; 33.

Fig. 65. Electroforegrama ampliconilor genelor de rezistență ermF (446bp) si cepA (779 bp). Tulpini pozitive pentru gena cepA: 19; 26; 57; 60; 22; 61; 51; 80; 75. Tulpini pozitive pentru gena ermF: 64; 4 și 75.

Fig. 66. Electroforegrama ampliconilor genelor de rezistență ermF (446bp) si cepA (779 bp). Tulpini pozitive pentru gena cepA:52; 79; 31; 71; 59; 11; 77; 68; 21. Tulpini pozitive pentru gena ermF: 46 și 27.

Fig. 67. Electroforegrama ampliconilor genei de rezistență la tetraciclină tetQ (460bp). Tulpini pozitive: 60; 34;18; 38; 58; 57; 36; 76; 55; 80; 15; 65; 20; 23; 30; 22; 64; 51.

Fig. 68. Electroforegrama ampliconilor genei de rezistență la tetraciclină tetQ (460bp). Tulpini pozitive: 44; 31; 26; 63; 32; 43; 17; 35; 53; 5; 77; 54; 46; 14; 56; 78; 41; 37; 9.

Fig. 69. Electroforegrama ampliconilor genei de rezistenta la tetraciclină tetQ (460bp). Tulpini pozitive: 67; 2 ; 79 ; 28; 3; 10; 71; 52; 66; 39; 75.

Rezistența la peniciline și cefalosporine este mediată în special de gena cepA, care codifică sinteza de penicilinaze și cefalosporinaze la speciile g. Bacteroides și Parabacteroides (Gutacker și colab., 2000). Prezența acestor enzime determină rezistența tulpinilor la aminopeniciline și cefalosporine, însă tulpinile rămân sensibile la piperacilină și la antibioticele β-lactamice cu inhibitori de β-lactamază (Nagy și colab., 2011). Gena cfxA codifică sinteza de β-lactamaze cu spectru larg, determinând în principal rezistență la cefoxitin (Garcia și colab., 2008; Bonte și colab., 2010).

Modificarea numărului și tipului proteinelor cu afinitate pentru peniciline (penicilin binding proteins-PBPs) este un alt mecanism de rezistență la antibioticele β- lactamice. Sunt localizate în citoplasmă și la nivelul membranei externe a peretelui celular și blochează legarea și pătrunderea antibioticului în celula bacteriană (Rasmussen și colab., 1993; Edwards, 1997; Piriz și colab., 2004).

Toate cele 75 de tulpini de Bacteroides spp. sunt rezistente la ampicilină și penicilină. 55 (72%) sunt producătoare de β-lactamază, 40 (53,3%) au gena cepA. Nicio tulpină nu este pozitivă pentru gena cfxA. Majoritatea tulpinilor producătoare de β-lactamză aparțin speciei B. fragilis (96.1%) (fig.70).

Fig.70. Numărul tulpinilor de Bacteroides spp. producătoare de β-lactamază.

Dintre cele 20 de tulpini de Bacteroides cu rezistență mare la ampicilină (CMI > 16mg/l), 12 au fost pozitive pentru gena cepA și 7 negative. 54 tulpini au avut un nivel ridicat de rezistență la penicilină (CMI > 4 mg/l), 30 au fost pozitive pentru gena cepA și 24 au fost negative. În acest studiu, prezența genei cepA nu a fost corelată cu valoarea CMI la ampicilină (fig.71) și la penicilină (fig.72), ceea ce sugerează rolul altor mecanisme în rezistența la antibioticele β-lactamice, precum PBPs (penicilin binding proteins) (Piriz și colab., 2004), activitatea pompelor de eflux (Ghotaslou și colab., 2018) sau prezența altor gene codificatoare pentru β-lactamaze.

Fig. 71. Distribuția genei cepA la tulpinile de Bacteroides spp. nu se corelează cu valoarea CMI la ampicilină.

Fig. 72. Distribuția genei cepA la tulpinile de Bacteroides spp.nu se corelează cu valoarea CMI la penicilină.

25 tulpini (96,1%) de B. fragilis au fost producătoare de β-lactamază și numai 17 au evidențiat gena cepA. 13 tulpini (81,02%) de B. vulgatus sintetizează β-lactamază, dar numai 10 tulpini poartă gena cepA. 8 tulpini (66.6%) de B.uniformis au sintetizat β-lactamază, dar numai 6 poartă gena cepA. 4 tulpini (57,1%) de B. ovatus au produs β-lactamază, dar numai 1 are gena cepA (fig.73).

3 tulpini (37,5%) de B. thetaiotaomicron au fost producătoare de β-lactamază și 4 au prezentat gena cepA. Acest rezultat indică legarea nespecifică a primerilor.

Tulpinile pozitive pentru β-lactamază, dar negative pentru gena cepA sunt probabil putătoarea ale altor gene codificatoare de β-lactamaze (cfiA, cbl).

Câte 1 tulpină (14,2%) de B. stercoris și B. caccae a fost pozitivă pentru gena cepA și ambele au fost producătoare de β-lactamază..

Fig.73. Distribuția numărului de tulpini de Bacteroides spp. producatoare de β-lactamază necorelată cu prezența genei cepA. Unele tulpini negative pentru gena cepA în PCR sintetizează β-lactamaza.

În acest studiu o tulpină de B.thetaiotaomicron a fost rezistentă la cefoxitin (CMI >32 mg/l), dar negativă pentru gena cfxA. Probabil că rezistența se datorează PBPs modificate prin mutație (Rashchian și colab., 1982; Fang și colab., 2002).

În analiza noastră, rata rezistenței la cefoxitin este scăzută, comparativ cu rezistența raportată în studii anterioare: 6% (Hedberg și Nord, 2003), 10% (Snydman și colab., 2007; Betriu și colab., 2008) și 15% (Nagy și colab., 2011).

Rezistența la clindamicină este mediată în principal prin mecanismul MLSB (Macrolide-Lincomycin-Streptogramin mechanism) codificat de gena ermF, genă cu localizare atât cromosomală cât și plasmidială (Sebald, 1994). Mecanismul MLS presupune metilarea a două resturi de adenină a ARNr 23S, blocând legarea antibioticului la nivelul ribosomilor (Gupta și colab., 2003). Prezența genei ermF este adesea asociată cu prezența genei tetQ, (Quesada-Gomez și colab., 2013; Ohashi și Fujisawa, 2017). Activitatea pompelor de eflux (codificate de genele msrSa și mefA) este un alt mecanism de rezistență la clindamicină (Pumbwe și colab., 2007; Eitel și colab., 2013).

Din numărul total al tulpinilor g. Bacteroides (75), 16 (21,9%) au fost rezistente la clindamicină (CMI 0,25- >8 mg/l) și 14 (18,6%) au gena ermF, ceea ce sugerează corelarea rezistenței la clindamicină cu prezența genei ermF (fig.74).

Fig.74. Distribuția genei ermF la tulpinile de Bacteroides spp. corelată cu valoarea CMI la clindamicină.

Asocierea prezenței genei ermF cu rezistența la clindamicină a fost evidențiată și de Kierzkowska și colab. (2018). 31% dintre tulpinile izolate au fost rezistente la clindamicină și tot atâtea au evidențiat gena ermF. Rezultate asemănătoare au obținut Johnsen și colab. (2017), care au izolat un număr 175 tulpini de Bacteroides spp. dintre care 27 (15%) au fost rezistente la clindamicină, iar gena ermF a fost identificată la 28 de tulpini (16%).

Mecanismele moleculare de rezistență la tetraciclină includ: prezența pompelor de eflux (Wang și colab., 2014), protecția proteinelor ribosomale prin legarea antibioticului la subunitatea ribosomală 30S blocând accesul aminoacil-ARNt la situsul acceptor (Connell și colab., 2003; Li și colab., 2013) și scăderea permeabilității membranei celulare pentru tetraciclină (Chopra și Roberts, 2001). Gena tetQ determină rezistența la tetraciclină prin sinteza unei proteine cu localizare citoplasmatică, care se leagă la nivel ribosomal (Salyers și colab., 1990).

Toate tulpinile sunt rezistente la tetraciclină. Analiza EF a ampliconilor corelează rezistența la tetraciclină cu prezența genei tetQ la 74 (98.6%) tulpini (fig.75).

Fig.75. Distribuția genei tetQ a tulpinilor de Bacteroides spp. corelată cu valoarea CMI la tetraciclină.

Rezultate asemănătoare au raportat Meggersee și Abratt (2015) și Szekely și colab. (2015).

9.3. Concluzii

1. Analiza moleculară a rezistenței la antibiotice a tulpinilor de Bacteroides a arătat că 72% dintre tulpini au fost producătoare de β-lactamază, 98,6% tulpini poartă gena tetQ, 53,3 % au gena cepA și 18,6 % sunt pozitive pentru gena ermF amplificate electroforetic (tabelul 18).

Tabelul 17. Distribuția genelor de rezistență la antibiotice a tulpinilor de Bacteroides spp.

2. Tulpinile izolate din secreția biliară au cel mai mare număr de gene de rezistență la antibiotice: tetQ (100%), cepA (75%) și ermF (38%). Tulpinile izolate din ulcerul perforat exprimă genele tetQ și cepA cu o rată mai mică (75% respectiv, 50%) (fig.76).

Fig.76. Distribuția genelor de rezistență la antibiotice la tulpinile de Bacteroides izolate din diferite situsuri anatomice.

CONCLUZII GENERALE

În studiul nostru am analizat componenta anaerobă a proceselor inflamatorii intraabdominale de origine endogenă.

Etiologia bacteriană a infecțiilor intraabdominale are un spectru larg de specii bacteriene: majoritatea tulpinilor implicate sunt specii de Enterobacteriaceae, ale g. Clostridium și ale g. Bacteroides.

Din 151 tulpini bacteriene anaerobe izolate, 75 (49,6%) au fost specii ale g. Bacteroides, 31 (20,5%) tulpini ale g. Clostridium

Rata de izolare a bacteriilor anaerobe este de 40,3%.

Pentru investigarea rezistenței la antibiotice și a factorilor de virulență am utilizat metodele de analiză fenotipică și genotipică.

Infecțiile endogene produse de bacterii anaerobe au avut o etiologie mixtă în 73% din cazuri, cele mai frecvente asocieri fiind ale enterobacteriaceelor cu specii ale g. Bacteroides.

Bacteriile anaerobe determină frecvent infecții endogene în diferite situsuri anatomice, în special în cavitatea abdominală, apendice și în vezica biliară.

Tulpinile anaerobe au un număr mare de factori de virulență, care condiționează severitatea infecțiilor intraabdominale. Cele mai virulente au fost speciile g. Bacteroides, B. fragilis exprimă cel mai mare set de factori de virulență, evidențiați fenotipic: adezine și factori solubili.

Profilul factorilor solubili de virulență este variabil. Astfel, esculinaza, amilaza și lecitinaza sunt sintetizate predominant de speciile g. Bacteroides, cazeinazele de speciile g. Bacteroides și Propionibacterium, DN-azele de speciile g. Finegoldia, iar factorul CAMP a fost produs predominat de speciile g. Propionibacterium.

Profilul genelor de virulență al tulpinilor g. Bacteroides constă în diferite asocieri: bft, kat, ftn; bft, kat, sod și ftn, sod, kat.

Tulpinile g. Bacteroides sunt rezistente la ampicilină, penicilină, tetraciclină în proporție de 100%.

Rezistență la clindamicină (21,9%), cefotetan (10,95%) și cefoxitin (1,36%) se înscrie într-o tendință de creștere.

Nicio tulpină nu este rezistentă la metronidazol, augmentin, ampicilină cu sulbactam, imipenem, meropenem, cloramfenicol și piperacilină cu tazobactam.

Rezistenta la anitibotice β-lactamice este codificată de gena cepA, la macrolide de gena ermF și la tetraciclină de gena tetQ, dar unele tulpini sunt rezistente, deși metoda PCR nu evidențiază gena de rezistență.

Caracterizarea genotipică a genelor de rezistență la antibiotice a tulpinilor de Bacteroides a arătat că 53,3% dintre tulpini au gena care codifică de β-lactamaza.

Creșterea ratei de rezistență la antibiotice a bacteriilor anaerobe, componente ale microbiotei, pledează pentru determinarea spectrului de sensibilitate la antibiotice înaintea administrării tratamentului, precum și schimbarea periodică a tratamentelor empirice aplicate preoperator.

Antibioticele cu cea mai mare eficiență față de anaerobii implicați în infecții endogene sunt cele cu spectru larg: metronidazolul, cloramfenicolul, carbapenemele (imipenem și meropenem) și penicilinele cu inhibitori de β-lactamază (amoxiclina cu acid clavulanic, ampicilină cu sulbactam, piperacilină cu tazobactam) active față de bacteriile anaerobe și aerobe, asociate frecvent în etiologiile acestor infecții.

Bibliografie:

1. Abeysundere R.L., Hodson M.E., Szawarkowski M., Noone P., 1978, Pleuropulmonary lung infection by anaerobic bacteria, British Journal of Diseases of the Chest, 72: 187.

2. Abrahamian F.M., Goldstein E.J., 2011, Microbiology of animal bite wound infections, Clinical Microbiology Reviews, 24(2):231-246.

3. Acherman Y., Goldstein E.J.C., Coenye T., Shirtliff M.S., 2014, Propionibacterium acnes: from commensal to oppotusnistic biofilm-associated implant pathogen, Clinical Microbiology Reviews, 27(3):419-440.

4. Aldridge K.E., Ashcraft D., O'Brien M., Sanders C.V., 2003, Bacteremia due to Bacteroides fragilis Group: Distribution of Species, β-Lactamase production, and antimicrobial susceptibility patterns, Antimicrobial Agents and Chemoterapy, 47(1):148-153.

5. Algarni A., Kantor E., Grall N., et al., 2018, Clinical characteristic and prognosis of bacteremia during postoperative intra-abdominal infections, Critical Care, 22:175.

6. Alperstein A., Fertig R.M., Feldman M., Watford D., Nystrom S., Delva G., Muddassir, 2017, Septic thrombophlebitis of the internal jugular vein, a casa of Lemier's syndrome, Intractable and Rare Diseases Research, 6(2):137-140.

7. Allison H.E.,Hilman J.D., 1997, Cloning and characterization of a Prevotella melaninogenica haemolysin, Infection and Immunity, 65(7):2765-2771.

8. Ananth-Shenoy P., Vishwanath S., Targain R., Shetty S., Rodriguez G., Mukhopadhyay C:, Chawla K., 2016, Anaerobic infections in surgical wards- A two year study, Iranian Journal of Microbiology, 3:181-186.

9. Athanasiou S., Matthaiou D.K., Falagas M.E., 2006, Vaginal mesh infection due to Bacteroides melaninogenicus: A case report of another emerging foreign body related infection, Scandinavian Journal Infection Diseases, 38(11-12):1108-1110.

10. Avila-Campos M.J., Liu C., Song Y., Rowlinson M.C., Finegold M., 2007, Determination of bft gene subtypes in Bacteroides fragilis clinical isolates, Journal of Clinical Microbiology, 45(4):1336-1338.

11. Banas J.A., Vickerman M.M., 2003, Glucan-binding proteins of the oral Streptococci, Critical Reviews in Oral Biology and Medicine, 14(2):89-99.

12. Bennett K.W., Eley A., 1993, Fusobacteria: new taxonomy and related disease, Journal of Medical Microbiology, 39:246-254.

13. Baughn A.D., Malamy M.H., 2002, A mitochondrial-like aconitase in the bacterium Bacteroides fragilis: implications for the evolution of the mitochondrial Krebs cycle, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 99: 4662-4667.

14. Baumann H., Tzianabos A.O, Brisson J.R., Kasper D.L., Jennings H.J., 1992, Structural elucidation of two capsular polysaccharides from one strain of Bacteroides fragilis using high-resolution NMR spectroscopy, Biochemistry 31:4081–4089.

13. Berg R.D., 1999, Bacterial translocation from the gastrointestinal tract, Advances in Experimental Medicine and Biology, 473:11-30.

14. Betriu C., Culebras E., Gomez M., Lopez F., Rodriguez-Avial I., Picazo J.J., 2008, Resistance trens of the Bacteroides fragilis group over a 10-year period, 1997 to 2006, in Madrid, Spain, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 52(7):2686-2690.

15. Björck L.,1988, Protein L. A novel bacterial cell wall protein with affinity for Ig L chains, Journal Immunology, 140:1194–1197.

16. Boente R.F., Ferreira L.Q., Falcao L.S., et. al., 2010, Detection of resistance genes of resistance genes and susceptibility pattern in Bacteroides and Parabacteroides strains, Anaerobe, 16:190-194.

17. Boyd J., McBride B.C., 1984, Fraction of hemagglutiting and bacterial binding adhesinins of B. gingivalis, Infection and Immunity, 45(2):103-409.

18. Bojar R.A., Holland K.T., 2004, Acne and Propionibacterium acnes, Clinics in Dermatology, 22(5):375-379.

19. Boleij A., Hechenbleikner E.M., Goodwin A.C., Badani R., Stein E.M., Lazarev M.G., Ellis B., Carroll K.C., Albesiano E., Wick E.C., Platz E.A., Pardoll D.M., Saers C.L., 2015, The Bacteroides fragilis toxin gene is prevalent in the colon mucosa of colorectal cancer patients, Clinical Infections Diseases, 60(2):215-218.

20. Botta G.A., Arseze A., Minisini R., Trani G., 1994, Role of Structural and Extracellular Virulence Factors in Gram-Negative Anaerobic Bacteria, Clinical Infectious Disease, 18:260-264.

21. Bowler P.G., Davies B.J., 1999, The microbiology of infected and noninfected leg ulcer, International Journal of Microbiology, 38:573-578.

22. Brenchley J.M., Douek C., 2012, Microbial Translocation across the GI Tract, Annual Review of Immunology, 30:149-173.

23. Breuil J., Dublanchet A., Truffaut N., Sebald M., 1989, Transferable 5-nitroimidazole resistance in the Bacteroides fragilis group, Plasmid, 21(2):151-154.

24. Brioukanov A.L., Netrusov A.I., 2004, Catalase and superoxide dismutase: Distribution, properties and physiological role in cell of strict anaerobes, Biochemistry, 69 (9):1170-1186.

25. Brook I., 1988, Recovery of anaerobic bacteria from clinical specimens in 12 years at two military hospitals, Journal Clinical Microbiology, 26:1181-1188.

26. Brook I., 1989, Anaerobic bacteria in suppurarive genitourinary infections, Journal of Urology, 141:889-893.

27. Brook I., 1994, The role of encapsulated anaerobic bacteria in synergistic infections, FEMS Microbiology Review, 13(1): 65-74.

28. Brook I., 2007, Acute and chronic bacterial sinusitis. Infectious Disease Clinics North America, 21:427-448.

29. Brook I., 2007, The role of anaerobic bacteria in cutaneous and soft tissue abscesses and infected cyts, Anaerobe, 13:171-177.

30. Brook I., 2010, The role of anaerobic bacteria in bacteremia, Anaerobe, 16:183-189.

31. Brook I., Frazier E., 2000, Aerobic and anaerobic microbiology in intra-abdominal infections associated with diverticulitis, Journal of Medical Microbiology, 49: 827-830.

32. Bull M.J., Plummer N.T., 2014, Part 1: The human gut microbiome in health and disease, Integrative Medicine, 13(6):17-22.

33. Caceres M., Zhang G.,Weintraub A., Nord C.E., 2000, Prevalance and antimicrobial susceptibility of enterotoxigenic Bacteroides fragilis in children with diarrhoea in Nicaragua, Anaerobe, 6:143-148.

34. Carlier J.P., Sellier N., Rager M.N., Reysset G., 1997, Metabolism of a 5-nitroimidazole in susceptible and resistance isogenic strains of Bacteroides fragilis, Antimicrobial Agents Chemoterapy, 41:1495-1499.

35. Cash H. L. Whitham C.V., Behrendt C.L., Hooper L.V., 2006, Symbiotic bacteria direct expression of an intestinal bactericidal lectin, Science 313:1126–1130.

36. Castello L., Bou M., Bazzana M.S., Predari S.C., 2007, Nonpuerperal breast abscess caused by Finegodia magna, Revista Argentina de Microbiologia, 39(2):95-98.

37. Chakrabarty R.P., Karim M.M., 2018, Anaerobic bacteria in oral cavities and dental health, Annals Dentistry, 25(01).

38. Cattoir V., 2012, Actinobaculum schaali: review of an emerging uropathogen, Journal Infectious, 64:260-267.

39. Chaudhry R., Mathur P., Dhawan B., Kumar L., 2001, Emergence of Metronidazole-Resistant Bacteroides fragilis, Emerging of Disease, 7(3):485-486.

40. Château M., Björck L., 1994, Protein PAB, a mosaic albumin-binding bacterial protein representing the first contemporary example of module shuffling, The Journal of Biological Chemestry, 269: 12147–12151.

41. Chen L., Van Meerbeke S., Albesiano E., Goodwin A., Wu S., Yu H., Carroll K., Sears C, 2015, Fecal detection of enterotoxigenic Bacteroides fragilis, European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases, 34(9):1871-1877.

42. Chen Y., Kinouchi T., Kataoka K., Akimoto S., Ohnishi Y., 1995, Purification and Characterization of a Fibrinogen-Degrading Protease in Bacteroides fragilis Strain YCH46, Microbiology and Immunology, 39(12):967-977.

43. Chifiriuc C., Mihăescu G., Lazăr V., 2015, Microbiologie și Virologie medicală, Ed. Universității din București, p.88.

44. Chifiriuc C.M., Mihăescu G., Lazăr V., 2011, Microbiologie și virologie medicală, Editura Universității din București, pp:352-355, 747.

45. Chifiriuc C.M., Mihăescu G., Lazăr V., 2015, Microbiologie și virologie medicală, Editura Universității din București, p. 71.

46. Choi V.M., Herrou J., Hecht A., Ping Teoh W., Turner J.R., Crosson S., Wardenburg J.B., 2016, Activation of Bacteroides fragilis toxin by o novel bacterial protease contributes to anaerobic sepsis, Nature Medicine, 22(5):563-567.

47. Chopra I., Roberts M., 2001, Tetracycline antibiotics: mode of action, applications, molecular biology and epidemyology of bacterial resistance, Microbiology and Moelcular Biology Reviews, 65(2):232-260.

48. Chow A.W. et al., 2010, Canadian practice guidelines for surgical intra-abdominal infections, Canadian Journal of Infectious Diseases and Medical Microbiology, 21:11-37.

47. Chow J., Lee S.M., Shen Y., Khosravi A., Mazmanian S.K., 2010, Host-bacterial symbiosis in health and disease, Mucosal Immunity, chap.8, pp. 243-274.

49. Christensen G.J.M., Bruggemann H., 2014, Bacterial skin commensals and their role as host guardians, Beneficial Microbes, 5(2):201-205.

50. Clinical and Laboratory Standards Institute, 2016, Methods for antimicrobial susceptibility testing of anaerobic bacteria; approved standard, 7th ed. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA.

51. Connell S.R., Tracz D.M., Nierhaus K.H., Taylor D.E., 2003, Ribosomal protection protein and their mechanism of tetracycline resistance, Antimicorbial Agents and Chemotherapy, 47(12)3675-3681.

52. Coyne M.J., Kalka-Moll W., Tzianabos A.O., Kasper D.L., Comstock L.E., 2000, Bacteroides fragilis NCTC9343 produces at least three distinct capsular polysaccharides: cloning, characterization and reassignment of polysaccharide B and C biosynthesis loci, Infection and Immunity 68: 6176-6181.

53. Davies U.M., Leak A.M, Dave J., 1988, Infection of a prostetic knee joint with Peptostreptococcus magnus, Annals of the Reumatic Disease, 47:866-868.

54. Dame-Teixeira N., Parolo C.C.F., Mlatz M., Rup A.G., Devine D.A., Do T., Gene expression of bacterial collagenolytic proteases in root caries, Journal of Oral Microbiology, 10(1), 1424475.

55. De A., Varaiya A., Mathur M., 2002, Anaerobes in pluropulmonary infections, Indian Journal of Medical, 20(3):150-152.

56. De Chateau M., Bjorck L., 1994, Protein PAB, a mosaic albumin-binding bacterial pritein representing the first contemporary exemple of module shuffling, The Journal of Biological Chemistry, 269:12147-12151.

57. Donelli G., Vuotto C., Cardines R., Mastrantonio P., 2012, Biofilm-growing intestinal anaerobic bacteria, FEMS Immunology and Medical Microbiology, 65:318-325.

58. Dryden M.S., 2010, Coplicated skin and soft tissue infection, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 65(3):25-44.

59. Duerden B.I., 1994, Virulence factors in anaerobes, Clinical Infection Disease, 18: 253–259.

60. Edberg S.C., Bell S.R., 1985, Lack of constitutive beta-glucosidase (esculinase) in the genus Fusobacterium, Journal of Clinical Microbiology, 22(3):435-437.

61. Edwards R., 1997, Resistance to β-lactam antibiotics in Bacteroides spp., Journal of Medical Microbiology, 46: 979–986.

62. Fang H., Edlund C., Nord C.E., Hedberg, 2002, Selection of cefoxitin-resistance Bacteroides thetaiotaomicron mutans and mechanism involved in β-lactam resistance, Clinical Infectious Diseases, 35:47-53.

63. Fernandez-Canigia L., Litterio M., Legaria M.C., et al., 2012, First National survey of antibiotic susceptibility of the Bacteroides fragilis group: Emerging resistance to carbapenems in Argentina, Antimicrobial Agents and Chemoterapy, 56(3):1309-1314.

64. Fille M., Mango M., Lechner M., Schaumann R., 2006, Bacteroides fragilis group: Trends in resitance, Current Microbiology, 52(2):153-157.

65. Finegold S.M., 1977, Anaerobic Bacteria in Human Disease, Academic Press, New York.

66. Finegold S.M., Sutter V.L., Mathidsen G.E., 1983, Normal indigenous intestinal flora in human intestinal microflora in health and disease, Academic Press, Londra, pp. 3-31.

67. Finegold S.M., Vaisanen M.L., Rautio M., Eerola E., Summanen P, Molitoris D., Song Y., Liu C., Jousimies-Somer H., 2004, Porphyromonas uenonis sp. nov., a pathogen for humans distinct from P. asaccharolyrica and P. endodontalis, Journal of Clinical Microbiology , 42(11): 5298-5301.

68. Flint H.J., Scott K.P., Duncan S.H., Louis P., Foano E., 2012, Microbial degradation of complex carbohydrates in the gut, Gut Microbes, 3(4): 289-306.

69. Frese S.A., Mills D.A., 2015, Birth of the infant gut microbiome: Moms deliver twice!, Cell Host and Microbe, 17(5):543-544.

70. Frick I.M., Karlsson C., MorgelinM., Olin A., Janjusevic R., Hammarstrom C., Holst E., De Chateau M., Bjork L., 2008, Identification of a novel protein promoting the colonization and survival of Finegoldia magna, a bacterial commensal and opportunistic pathogen, Molecular Microbiology, 70:695-708.

71. Fridovich I., 1995, Superoxide radical and superoxide dismutases, Annual Review of Biochemistry 64, 97–112.

72. Garcia N., Gutierrez G., Lorenzzo M., Garcia J.E., Piriz S., Quesada A., 2008, Genetic determinants for cfxA expression in Bacteroides strains isolated from human infections, Journal Antimicrobial Chemotherapy, 62:942-947.

73. Garrod L.P., 1955, Sensitivity of four species of Bacteroides to antibiotics, British Medicine Journal, 2:1529-1531.

74. Ghetaslou R., Baghi H.B., Alizadeh N., Yekani M., Arbabi S., Memar M.Y., Mechanism of Bacteroides fragilis resistance to metronidazole, 2018, Infection, Genetics and Evolution, 64:156-163.

75. Ghotaslou R., Yekani M., Memar M.Y., 2018, The role of efllux pumps in Bacteroides fragilis resistance antibiotics, Microbiological Research, 210:1-5.

76. Gibson S.A., Macfarlane G.T., 1988, Characterization of proteases formed by Bacteroides fragilis, Journal of General Microbiology, 134: 2231-2240.

77. Gilmore M.S., Ferretti J.J., 2003, The thin line between gut comensal and pathogen, Science, 299: 1999-2002.

78. Goldstein E.J.C., Snydman D.R., 2004, Intra-abdominal infections: review of the bacteriology, antimicrobial susceptibility and the role of ertapenem in their therapy, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 53:29-36.

79. Goulbourne P.A., Ellen R.P., 1991, Evidence that Porphyromanas(Bacteroides) gingivalis fimbriae function in adhesion to Actinomyces viscosus, Journal of Bacteriology, 173:5266-5274.

80. Granier D., Michaud J., 1994, Demonstation of human immunoglobulin G Fc-binding activity in oral bacteria, Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, 1:247-249.

81. Gregory E. M., Kowalski J.B., Holdeman L.V., 1977, Production and some proprieties of catalase and superoxid dismutase from the anaerobe Bacteroides distasonis, Journal of Bacteriology, 129 :1298-1302.

82. Gregory E.M., Moore W.E.C., Holdeman L.V., 1978, Superoxide dismutase in anaerobes: survey, Applied and Environmental Microbiology, 35:988-991.

83. Gregory S.W., Boyce T.G., Larson A.N., Patel R., Jackson M.A., 2015, Fusobacterium nucleatum osteomyelitis in 3 previously healthy children: A case series and review of the literature, Journal of the Pediatric Infectiuos Diseases Society, 4(4):155-159.

84. Grenier D., La V.D., 2011, Proteases of Porphyromonas gingivalis as important virulence factor in periodontal disease and potential targets for plant-derived compounds: a review article, Current Drug Targets, 12(3):322-331.

85. Grice E.A., 2015, The intersection of microbiome and host at the skin interface: genomic-and metagenomic-based insights, Genome Research, 25:1514-1520.

86. Gupta A., Vlamakis H., Shoemaker N., Salyers A.A., 2003, A new Bacteroides conjugative transposon that carries an ermB gene, Applied and Environmental Microbiology, 69:6455-6463.

87. Gutacker M., Valsangiacomo C., Piffaretti J.C., 2000, Identification of two genetic groups in Bacteroides fragilis by multilocus enzyme electrophoresis: distribution of antibiotic resistance (cfiA, cepA) and enterotoxin (bft) encoding genes, Microbiology, 146:1241-1244.

88. Hannigan G.D., Grice E.A, 2012, Microbial ecology of the skin in the era of metagenomics and molcecular microbiology, Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine, 3(12):a0153662.

89. Hare R., 1967, The anaerobic cocci. Recent advances in medical microbiology, London, United Kingdom: Churchill, pp. 285–317.

90. Harrington D.J., 1996, Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease, Infection and Imunity, 64:1885-1891.

91. Heather E.A., Hillman J.D, 1997, Cloning and characterization of a Prevotella melanogenica hemolysin, Infection and Immunity, 65(7): 2765-2771.

92. Heberg M., Nord C.E., 2003, Antimicrobial susceptibility of Bacteroides fragilis group isolates in Europe, Clinical Microbiology Infections, 9:475-488.

93. Higaki S., Morohashi M., 2003, Characteristic of anaerobes from skin specimen, Drugs under experimental and clinical research, 29:153-155.

94. Hooper L.V., Stappenbeck T.S, Hong C.V., Gordon J.I, 2003, Angiogenins: a new class of microbicidal proteins involved in innate immunity, Nature Immunology, 4:269–273.

95. Hopkins M. J., Macfarlane G.T., 2002, Changes in predominant bacterial populations in human faeces with age and with Clostridium difficile infection, Journal of Medical Microbiology, 51:448–454.

96. Huggan P.J., Murdoch D.R., 2008, Fusobacterial infections: clinical spectrum and incidence of invasive disease, The Journal of Infection, 57(4):283-289.

97. Hughes C., Ashhurt-Smith C, Ferguson J.K., 2018, Gram negative anaerobe susceptibility testing in clinical isolates using Sensititre and E-test methods, Pathology, 50(4): 437-441.

98. Ingham H.R., Eaton S., Venables C.W., Adams P.C., 1978, Bacteroides fragilis resistant to metronidazole after long term therapy, Lancet, 1:214.

99. Israil A.M, Chifiriuc C., Palade G., Cotar A., 2013, Clinical and bacteriological of bacterial infections associates to abdmoninal surgical emergencies, Ars Docenti Publ. House, p. 150.

100. Israil A.M., Delcaru C., Palade R.S., Chifiriuc C., Iordache C., Vasile D., Grigoriu M., Voiculescu D., 2010, Bacteriogical aspects implicated in abdominal surgical emergensis, Chirurgia, 105:779-787.

101. Jamal W., Al Hashem G., Rotimi V.O., 2015, Antimicrobial resistance among anaerobes isolated from clinical specimens in Kuweit hospitals: Comparative analysis of 11-year data, Anaerobe, 31:25-30.

102. Jandhyala S.M., Talukdar R., Subramanyam C., Vuyyuru H., Sasikala M., Reddy N., 2015, Role of the normal gut microbiota, World Journal of Gastroenterology, 21(29):8787-8803.

103. Jeverica S., Kolenc U., Mueller-Premru M., Papst L., 2017, Evaluation of the routine antimicrobial susceptibility testing results of clinically significant anaerobic bacteria in a Slovenian tertiary-care hospital in 2015, Anaerobs, 47:64-69.

104. Johnsen B.O., Handal N., Meisal R., Bjornholt J.V., Gaustad P., Leegaard T.M., 2017, erm gene distribution among Norwegian Bacteroides isolates and evaluation of phenotypic tests to detect inductible clindamycin resistance in Bacteroides species, Anaerobe, 47:226-232.

105. Jorgensen J.H., Carrol K.C., Funke G., Pfaller M.A., 2015, Manual of Clinical Microbiology, vol.I, ASM Press, Washington, DC, chapter 54, pp. 967-985.

106. Jousimies-Somer H., Savolainen S., Mäkitie A., Ylikoski J., 1993, Bacteriologic findings in peritonsillar abscesses in young adults, Clinical Infectious Diseases, 4:292-298.

107. Jousimies-Somer H., Summanen P, Citron D.M., Baron E.J., Wexler H.M., Finegold S.M., 2002, Wadsworth-KTL anaerobic bacteriology manual 6th ed. Belmont, CA: Star Publishing Co.

108. Kalka-Moll W.M., Wang Y., Comstock L.E., Gonzalez S.E., Tzianabos A.O., Kasper D.L, 2001, Immunochemical and biological characterization of three capsular polysaccharides from a single Bacteroides fragilis strain, Infection and Immunity, 69:2339–2344.

109. Karkos P.D., Asrani S., Karkos C.D., Leong S.C., Theochari E.G., Alexopoulou T.D., Assimakopoulos A.D., 2009, Lemierre's syndrome: A systematic review, Laringoscope, 119(8):1552-1559.

110. Karlsson C., Andersson M.L., Collin M., Schmidtchen A., Bjork L., Frick I.M., 2007, Suf A- a novel subtilisin-like serine proteinase of Finegoldia magna, Microbiology 153:4208-4218.

111. Kasper D.L., Finegold S.M., 1979, Virulence factors of anaerobic bacteria (symposium), Infectious Diseases,1:1-400.

112. Kato N., Liu C.X., Kato H., Watanabe K., Tanaka Y., Yammato T., Suzuki K., Ueno K., 2000, A new subtype of the metalloprotease toxin gene and the incidence of the three bft subtypes among Bacteroides fragilis isolates in Japan, FEMS Microbiology Letters, 182: 171-176.

113. Keeler J.R., Weitkamp J.H., 2015, Maternal influences on fetal microbial colonization and immune development, Pedriatic Research, 77:189-195.

114. Kenneth E. A., Ashcraft D., Cambre K., Pierson C.L., Jenkins S.G., Rosenblatt J.E., 2001, Multicentre survey of the chanding in vitro antimicrobial susceptibilities of clinical isolates of Bacteroides fragilis group, Prevotella, Fusobacterium, Porphyromonas and Peptostreptococcus species, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 45(4):1238-1243.

115. Kierzkowska M., Majewska A., Szymanek-Majchzak K., Sawicka-Grzelak A., Mlynarczyk A, Mlynarczyk G., 2018, In vitro effect of clindamicyn against Bacteroides and Parabacteroides isolates in Poland, Journal of Global Antimicrobial Resistance, 13:49-52.

116. Kluyver A.J., van Niel C.B., 1936, Prospects for a natural system of classification of bacteria, Zentralbl. Bakteriol. Parasitenkd. Infektionskr.Hyg. Abt. II , 94:369-403.

117. Kononen E., Wade W.G., Citron D.M., 2011, Bacteroides, Porphyromonas, Prevotella, Fusobacterium and other anaerobic Gram-negative rods. (Versalovic J., Carroll KC, Funke G., Jorgensen J.H., Landry M.L., Warnock D.W., Manual of clinical microbiology. Vol 1.10th edition, Washington, DC: ASM Press, pp. 858-880.

118. Kozlov A., Bean L., Emilie V.H., Zhao L., Wang G.P, 2018, Molecular identification of bacteria in intra-abdominal abscesses using deep sequencing, Open Forum Infectious Diseases, 5(2).

119. Krieg N.R., Staley J.T., Brown, Hedlund B.P., Paster B.J., Ward N.L., Ludwig W., Whitman B.W., 2010, Bergeys s manual of Systematic Bacteriology, Second Edition, vol. 4, p. 44.

120. Kumar P.S., 2012, Smoching and the subgingival ecosystem: a pathogen-enriched community, Future Microbiology, 7(8):917-919.

121. Langworth B.F., 1977, Fusobacterium necrophorum: Its characteristics and roles as an animal pathogen, Bacteriological Reviews 41: 373-390.

122. Lazar V., Herlea V., Cernat R., Chifiriuc C., Bulai D., Moraru A., 2004. Microbiologie generală (Manual de lucrari practice), Editura Universității din Bucuresti.

123. Lederberg J., McCray A.T., 2001, Genealogical treasury of Words, Scientist, 15:8.

124. Li W., Atkinson G.C., Thankor N.S., Allas U., Lu C.C., Chan K.Y., Tenson T., Schulten K., Wilson K.S., Hauruliuk V., Frank J., 2013, Mechanism of tetracycline resistance by ribosomal preotection protein Tet(O), Nature Communications, 4:1477.

125. Linfante A, Allawh R.M., Allen H.B., 2017, The role of Propionibacterium acnes Biofilm in acnea vulgaris, Journal of Clinical and Experimental Dermatology Research, 9:1.

126. Ling Z., Kong J., Liu F., Zhu H., Chen X., Wang Y., Li L.,Nelson K.E., Xia Y., Xiang C., 2010, Molecular analysis of the diversity of vaginal microbiota associated with bacterial vaginosis, BMC Genomics, 11:488.

127. Livingston S.J., Kominos S.D., Yee R.B., 1978, New medium for selection and presumptive identification of the Bacteroides fragilis group, Journal of Clinical Microbiology, 7(5):448-453.

128. Llyod-Price J., Abu-Ali G., Huttenhower, 2016, The healty human microbiome, Genom Medical , 8:51.

129. Lood R., Waldetoft K.W., Nordenfelt P., 2015, Localization-triggerd bacterial pathogenesis, Future Microbiology, 10:1659-1668.

130. Luczak M., Woszczatynski P.O., Pituch H., Leszczynski P., Martilosan G., Patrick S., Poxton I., Wintermans R.G.F., Dubreuil L., Mikolajczyk F.M., 2001, Search for enterotoxin gene in Bacteroides fragilis strains isolated from clinical specimens in Poland, Great Britain, the Netherland and France,Medical Science Monitor, 7(2):222-225.

131. Mackie R. I., Sghir A., Gaskins H., 1999, Developmental microbial ecology of the neonatal gastrointestinal tract, American Journal of Clinical Nutrition, 69:1035S– 1045S.

132. Maier E., Anderson R.C., Roy N.C, 2014, Understanding how commensal obligate anaerobic bacteria regulate immune functions in the large intestine, Nutrients, 7(1):45-73.

133. Maja B., Peric L., Ordog K., Vukovic D., Urban E., Soki J., 2018, The first characterized carbapenem-resistant Bacteroides fragilis strain from Croatia and the case study for it, Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica, 65(3):317-323.

134. Bennett J.E., Dolin R., Blase M.J., 2015, Mandell., Douglas and Bennett's Principles and practice of Infectious Diseases, Eighth Edition, Elsevier, p. 2737-2739.

135. Marina M., Ivanova M., Kantardjiev T., 2009, Antimicrobial susceptibility of anaerobic bacteria in Bulgaria, Anaerobe, 15(4):127-132.

136. Marples R.R., Dowing D.T., Kligman A.M., 1971, Control of free fatty acids in human surface lipids by Corynebacterium acnes, The Journal of Investigative Dermatology, 56(2):127-131.

137. Meggersee R., Abratt V., 2015, The occurrence of antibiotic resistance genes in drug resistant Bacteroides fragilis isolates from Groote Schuur Hospital, South Africa, Anaerobe, 32:1-6.

138. Mihăescu G., 2000, Microbiologie generală și virologie, Editura Universității din București, pp. 505-506.

139. Mihăescu G., Chifiriuc C. M., Dițu L.M., 2007, Antibiotioce și substanțe chimioterapeutice antimicrobiene, Editura Academiei Române, p. 54.

140. Morten E., Kazuhiko N., Amano A., 2013, Porphyromonas gingivalis fimbriae, Oral Microbiology, 5:10.3402/jom.v5i0.20265.

141. Murdoch D.A., 1998, Gram positive anaerobic cocci, Clinical Microbiology Review, 11:81-120.

142. Murdoch D.A., Shan H.N., 1999, Reclassification of Peptostreptococcus magnus (Prevot 1933) Holdeman and Moore 1972 as Finegoldia magna comb. nov. and Peptostreptococcus micros (Prevot 1933) Smith 1957 as Micromonas micros comb. nov Anaerobe, 5:555-559.

143. Murphy E.C., Morgelin M., Reinhardt P. D., Olin A.I, Bjork L., Frick I.M., 2014, Identification of molecular mechanisms used by Finegoldia magna to penetrate and colonize human skin, Molecular Biology, 94(2):403-417.

144. Myers L. L., Firehammer B. D., Shoop D. S., Border M. M., 1984, Bacteroides fragilis: a possible cause of acute diarrheal disease in newborn lambs, Infection and Immunity, 44:241-244.

145. Nagmoti J.M., 2014, Virulence factors of nonsporing anaerobes; a revisit to explore their diagnostic and therapeutic potential, Journal of Public Health Research, 2(1):1-7.

146. Nagy E., 2010, Anaerobic infections., Drug, 70(7):841-858.

147. Nagy E., Urban E., Nord C.E., 2011, ESCMID Study Group on Antimicrobial Resistance in Anaerobic Bacteria, Antimicrobial Susceptibility of Bacteroides fragilis group isolates in Europe. 20 yaears of experience, Clinical Microbiology Infection, 17: 371-379.

148. Nakano K., Nemoto H., Nomura R., Inaba H., Yoshioka H., Taniguchi K., 2009, Detection of oral bacteria in cardiovascular specimens, Oral Microbiology Immunology, 24(1): 64-68.

149. Novak A., Rubic Z., Dogas V., Goic-Barisic I., Radic M., Tonkic, 2015, Antimicrobial susceptibilility of clinical isolated anaerobic bacteria in a University Hospital Centre Split, Croatia in 2013, Anaerobe, 31:31-36.

150. Nyfors S., Kononen E., Takala A., Jousimies-Somer H., 1999, Betalactamase production by oral anaerobic Gram negative species in relation to previous antimicrobial therapy, Antimicrobial agents and chemotherapy, 1591-1594.

151. Obiso R.J., Wilkins T.D, Characteriztion and molecular analysis fragilysin: the Bacteroides fragilis toxin, Departament of Biochemistry and Anaerobic Microbiology, Blacksburg, Virginia.

152. Ohashi Y., Fujisawa T., 2017, Detection of antibiotic resistance genes in the faeces of young adult Japanese, Bioscience of Microbiota, Food and Health, 36(4):151-154.

153. Onderdonk A.B., Ksper D.L., Cisneros R.L., Barlett J.G., 1977, The capsular polysaccharide of Bacteroiedes fragilis as a virulence factor, comparasion of the pathogenic potential of encapsulated and unencapsulated strains, Journal Infectious Disease: 136(1): 82-89.

154. Panagiotis K.K., Evangelopoulos D.S., Athanasopouluo M.G., Vlamis J., 2010, Hematogenous long bone osteomyelitis by Prevotella (Bacteroides) melanogenicus, Journal of Clinical Medicine Research, 2(6):277-280.

155. Parker A. C., Smith C.J., 1993, Genetic and biochemical analysis of a novel Ambler class A β-lactamase responsible for cefoxitin resistance in Bacteroides species, Antimicrobial Agents Chemotherapy, 37: 1028– 1036.

156. Paster B. J., Olsen I., Aas J.A., Dewhirst F.E., 2006, The breadth of bacterial diversity in the human periodontal pocket and other oral site, Periodontal, 42:80-87.

157. Patrick S., 2015, Bacteroides. Molecular Medical Microbiology, Academic Press, pp. 917-944.

158. Patrick S., Houston S., Thacker Z., Blakely G.W., 2009, Mutational analysis of genes implicated in LPS and capsular polysaccharide biosynthesis in the opportunistic pathogen Bacteroides fragilis, Microbiology, 155: 1039-1049.

159. Patrick S., Reid J.H., Larkin M.J., 1984, The growth and survival of capsulate and non–capsulate B. fragilis in vivo and in vitro, Journal of Medical Microbiology, 17: 237-246.

160. Piriz S., Vadillo S., Quesada A., Criado J., Cerrato R., Ayala J., 2004, Relationship between penicillin-binding protein patterns and β-lactamases in clinical isolates of Bacteroides fragilis with different susceptibility to β-lactam antibiotics, Journal of Medical Microbiology, 53:213-221.

161. Popa G.L., Popa M.I., 2007, Microbiologie Medicală, Renaissance, pp. 395-429.

162. Prevot A.R., 1933, Etudes de systematique bacterienne: I.Lois generales. II. Cocci anaerobies, Annales des Sciences Naturelles, 15:23-260.

163. Prevot A.R., 1948, Manuel de classification et le determination des bacteries anaerobies, Second Edition Masson, Paris, France.

164. Progulske-Fox A., Tumwasorn S., Holt S.C., 1989, The expression and function of a Bacteroides gingivalis hemagglutinin gene in Escherichia coli, Oral Microbiology and Immunology, 4:121-131.

165. Pumbwe L., Skilbeck C., Wexler H., 2006, The Bacteroides fragilis cell envelope: quarterback, linebacker, coach—or all three? Anaerobe, 12: 211–220.

166. Pumbwe L., Wareham D.W., Aduse-Opoku J., Brazier J.S., Wexler H.M., 2007, Genetic analysis of mechanismsof multidrug resistance in a clinical isolate of Bacteroides fragilis, Clinical Microbiology and Infection, 13(2):183-189.

167. Quesada-Gomez C., Rodriguez-Cavallini E., Rodriguez C., 2013, Scare detection of mobile erm genes associated with tetQ in Bacteroides and Parabacteroides from Costa Rica, Anaerobe, 21:18-21.

168. Rashtchian A., Dubes G.R., Both S.J., et al., 1982, Transferable resistance to cefoxitin in Bacteroides thetaiotaomicron, Antimicrobial Agents Chemotherapy, 22:701-703.

169. Rasmussen B.A., Bush K., Tally F.P., 1993, Antimicrobial resistance in Bacteroides, Clinical Infectious Diseases, 16(4):390-400.

170. Rasmussen B. A., Gluzman Y., Tally F. P., 1990, Cloning and sequencing of the class B β-lactamase gene (ccrA) from Bacteroides fragilis TAL3636, Antimicrobial Agents Chemotherapy, 34:1590–1592.

171. Rocha E.R, Smith C.J, 2004, Transcriptional regulation of the Bacteroides fragilis ferritin gene (ftnA) by redox stress, Microbiology., 150: 2125-2134.

172. Rocha E.R., Smith C.J., 1995, Biochemical and genetic analysis of a catalase from the anaerobic bacterium, Bacteroides fragilis, Journal of Bacteriology, 177:3111–3119.

173. Rocha E.R., Smith C.J., 1998, Characterization of a peroxide-resistant mutant of the anaerobic bacterium Bacteroides fragilis, Journal of Microbiology, 180:5902-5912.

174. Rocha E.R., Smith C.J., 2013, Ferritin-like family proteins in the anaerobe Bacteroides fragilis: when an oxygen storm is coming, take your iron to the shelter, Biometals, (26)4:577-591.

175. Rocha E.R., Tzianabos A.O., Smith C.J., 2007, Thioredoxin reductase is essential for thiol/disulfide redox control and oxidative stress survival of the anaerobe Bacteroides fragilis, Journal of Bacteriology, 189:8015–8023.

176. Rogosa M., 1974, Family III. Peptococcaceae. In: Buchanan R E, Gibbons N E, editors. Bergey’s manual of determinative bacteriology, 8th ed. Baltimore, Md: The Williams &Wilkins Co., pp. 517–527.

177. Russo, T. A., Thompson J.S., Godoy V.G., Malamy M.H, 1990, Cloning and expression of the Bacteroides fragilis TAL2480 neuraminidase gene, nanH, in Escherichia coli, Journal of Bacteriology, 172:2594-2600.

178. Sadabad M.S., von Martels J.Z.H., Khan M.T., Blokzijl T., Paglia G., Dijkstra G., Harmsen H.J.M., Faber K.N., 2015, A simple coculture system shows mutualism between anaerobic faecal bacteria and epithelial Caco-2 cells, Scientific Reports, vol. 5, Article number: 17906.

179. Sadarangani S.P., Cunningham S.A., Jeraldo P.R., Wilson J.W., Patel R., 2015, Metronidazole and carbapenem resistant Bacteroides thetaiotaomicron isolated in Rochester, Minnesota in 2014, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 59(7): 4157-4161.

180. Saini S., Gupta N., Aparna, Batra G., Arora D.R., 2003, Role of anaerobes in acute pelvic inflammatory diseases, Indian Journal of Medical Microbiology, 21(3):189-192.

181. Salyers A. A., O’Brien M., 1980, Cellular location of enzymes involved in chondroitin sulfate breakdown by Bacteroides thetaiotaomicron, Journal of Bacteriology, 143:722-780.

186. Salyers A. A., Speer B.S., Shoemaker N.B., 1990, New perspectives in tetracycline resistance, Molecular Microbiology, 4(1):151-156.

182. Sarvari K.P., Soki J., Ivan M.., Miszti C., Latkoczy K., Melegh S.Z., Urban E., 2017, Detection of enterotoxin and protease genes among Hungarian clinical Bacteroides fragilis isolates, 2017, Anaerobe, 48:98-102.

183. Sarvari K.P., Soki J., Kristof K., Juhasz E., Miszti C., Latkoczy K., Melegh S.Z., Urban E., 2018, A multicenter survey of the antibiotic susceptibility of clinical Bacteroides species from Hungary, Infectious Diseases, 50(5):372-380.

184. Schapiro J.M., Gupta R., Stefansson, Fang F.C., Limaye A.P., 2004, Isolation of metronidazole-resistant Bacteroides fragilis carrying the nimA Nitroreductase gene from a patient in Washinton State, Journal of Clinical Microbiology, 42(9):4127-4129.

185. Sears C.L., Islam S., Saha A., Arjumand M., Alam N.H., Faruque A.S., Salam M.A., Shin J., Hecht D., Weintraub A., Sack R.B., Qadri F., 2008, Association of enterotoxigenic Bacteroides fragilis infection with inflammatory diarrhea, Clinical Infection Disseases, 47(6):797–803.

186.Sears C.L., Myers L.L., Lazenby A., van Tassell R.L.,1995, Enterotoxigenic Bacteroides fragilis, Clinical Infectious Disease, 20 (2):142-148.

187. Sebald M., 1994, Genetic basis for antibiotic resistance in anaerobes, Clinical Infectious Diseases, 18(4):297-304.

188. Shan H.N., Collins D.M., 1990, Prevotella, a new genus to include Bacteroides melanogenicus and related species formely classified in the genus Bacteroides, International Journal of Systematic Bacteriology, 205-208.

189. Shilnikova I.I., Dmitrieva N.V., 2015, Evaluation of antibiotic susceptibility of Bacteroides, Prevotella and Fusobacterium species isolated from patients of the N. N. Blokhin Cancer Research Center, Moscow, Russia, Anaerobe, 31:15-18.

190. Simon G. L., Gorbach S. L., 1984, Intestinal flora in health and disease, Gastroenterology, 86:174–193.

191. Simon G., Klemper M., Kasper L., Gorbach S., 1984, Alterations in opsonophagocytic killing by neutrohilis of Bacteroides fragilis associated with animal and laboratory passage, effect of capsular polysaccharde, Journal Infectious Disease, 145:72-77.

192. Snydman D. R., Jacobus N.V., McDermott L.A., Golan Y., Hecht D.W., Goldstein E.J.C., Harrel L., Jenkins S., Newton D., Pierson C., Rihs J.D.R., Yu V.L., et. al., 2010, Lessons learned from the anaerobe survey: Historical perspective and review of the most recent data (2005-2007), Clinical Infectious Diseases, 50(1):26-33.

193. Snydman D.R., Jacobus N.V., McDermott L.A., et al., 2007, National survey on the susceptibility of Bacteroides fragilis group: Report and analysis of trends in the United States from 1997 to 2004, Antimicrobial Agents and Chemoterapy, 51(5):1649-1655.

194. Snydman D.R., Jacobus N.V., McDermott L.A., Golan Y., Goldstein E.J.C., Harell S., Jenkins S., Newton D., Pierson C., Rosenblatt J., Venezia R., Gorbach S.L., Qeenan A.M., Hecht D.W., 2011, Update on resistance of Bacteroides fragilis group and related species with special attention to carbapenem 2006-2009, Anaerobe, 17(4):147-151.

195. Soki J., Eitel Z., Urban E., Nagy E., 2013, Molecular analysis of the carbapenem and metronidazole resistance mechanism of Bacteroides strains reported in a Europe-wide antibiotic resistance survey, Internațional Journal of Antimicrobial Agents, 41(2):122-125.

196. Sonnenburg J.L., Chen C.T., Gordon J.I., 2006, Genomic and metabolic studies of the impact of probiotics on a model gut symbiont and host, PloS Biology,4(12):413.

197. Sultan A.S., Kong E.F., Rizk A.M., Jabra-Rizk M.A., 2018, The oral microbiome: A lesson in coexistence, PLOS Pathogens, 14(1), e1006719.

198. Summanen P., Durmaz B., Vaisanen ML., Liu C., Molitoris D., Eerola E., I.M. Helander și Finegold S.M, 2005, Porphyromonas somerae sp. nov., a pathogen isolated from humans and distinct from Porphyromonas levii, Journal of Clinical Microbiology 43(9): 4455-4459.

199. Sund C.J., Rocha E.R., Tzianabos A.O., Wells W.G., Gee J.M., Reott M..A, O'Rourke D.P., Smith C.J, 2008, The Bacteroides fragilis transcriptome response to oxygen and H2O2: the role of OxyR and its effect on survival and virulence, Molecular Microbiology 67: 129-142.

200. Szekely E., Eitel Z., Molnar S., Szasz I.E., Bilca D., Soki J., 2015, Analysis of Romanian Bacteroides isolates for antibiotic resistance levels and the corresponding antibiotic resistance genes, Anaerobe, 31:11-14.

201. Takazoe I., Tanaka M., Homma T., 1971, A pathogenic strain of Bacteroides melaninogenicus, Archives of Oral Biology Journal, 16:817-822.

207. Takesue Y., et al, 2018, Antimicrobial susceptibility of common pathogens isolated from postoperative intr-abdominal infections in Japan, Journal of Infection and Chemotherapy, 24: 330-340.

202. Tally F.P., Goldin B.R., Jacobus N.V., Gorbach S.L., 1977, Superoxide dismutase in anaerobic bacteria of clinical significance, Infection and Immunity, 16:20-25.

203. Tang Y.W., Sussman M., Liu D., Poxton I., Schawartzman, 2015, Molecular Medical Microbiology, Seconrd Edition, Elsevier, p. 928.

204. Thompson J.S., Malamy M.H., 1990, Sequencing the gene for an imipenem-cefoxitin-hydrolyzing enzyme (CfiA) from Bacteroides fragilis TAL2480 reveals strong similarity between CfiA and Bacillus cereus β-lactamase II, Journal of Bacteriology, 172:2584–2593.

205. Tindall B.J., Euzéby J.P., 2006, Proposal of Parvimonas gen. nov. and Quatrionicoccus gen. nov. as replacements for the illegitimate, prokaryotic, generic names Micromonas Murdoch and Shah 2000 and Quadricoccus Maszenan et al. 2002, respectively, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 56: 2711-2730.

206. Toprak N.U., Yagci A., Gulluoglu B.M., et al., 2006, A possible role of Bacteroides fragilis enterotoxin in the aetiology of colorectal cancer, Clinical Microbiology Infection, 12:782–786.

207. Toprak N., U., Savin E., Soyad A., Danr F., Soyletir G., 2013, The first metronidazole-resistant Bacteroides species isolated at Marmara University Hospital: Bacteroides thetaiotaomicron, Mikrobiyoloji Buletini, 47:717-721.

208. Trepeta R.W., Edberg S.C., 1987, Esculinase (β-glucosidase) for the rapid estimation of activity in bacteria utilizing a hydrolysable substrate, p-nitrophenyl-β-D- glucopyranoside, Antonie van Leeuwenhoek, 53(4):273-277.

209. Trevino M., Areses P., Penalver M.D., Cortizo S., Pardo F., del Molino M.L.P, Garcia-Riestra C., Hernandez M., Llovo J., Regueiro B.J., 2012, Susceptibility trends of Bacteroides fragilis and characterisation of carbapenemase-producing strains by automated REP-PCR and MALDI TOF, Anaerobe, 18(1):37-43.

210. Tuddenham S., Sears C.L., 2015, The intestinal microbiome and health, Current Opinion in Infectious Diseases, 25(5):464-470.

211. Tuner K., Lindqvist L., Nord, C. E., 1985, Purification and properties of a novel β-lactamase from Fusobacterium nucleatum, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 27, 943–947.

212. Tuner K., Nord C.E., 1993, Antibiotic susceptibility of anaerobic bacteria in Europe, Clinical Infections Diseases, 16(4):387-389.

213. Turner P., Edwards R., Weston V., Gazis A., Ispahani P., Greenwood D., 1995, Simultaneous resistance to metronidazole, co-amoxiclav and imipenem in clinical isolate of Bacteroides fragilis, The Lancet, 345:1275-1277.

214. Ullrich E., Ziegler H.P., Hedberg J., Feierl G., Leitner E, 2017, Antimicrobial susceptibility of Bacteroides fragilis group isolates derived from clinical specimens in Southeast Austria, ECCMID, Vienna, 22-25 April.

215. Urban E., Horvath Z., Soki J., Lazar G., 2015, First Hungarian case of an infection caused by multidrug-resistant Bacteroides fragilis strain, Anaerobe, 31:55-58.

216. Ursell L.K., Metcalf J.L., Parfrey L.W., Knight R., 2012, Defining the human microbiome, Nutrition Reviews, 70(1):38-44.

217. Vaishnavi C., 2013, Tranlocation of gut flora and its role in sepsis, 31(4):334-342.

218. Van Tassell R.L., Lyerly D.M., Wilknis T.D., 1992, Purification and characterization of an enterotoxin from Bacteroides fragilis, Infection and Immunity, 60: 1343-1350.

219. Van't Hof, Veerman E.C., Amerongen A.V.N., Ligtenberg A.J.M., 2014, Antimicrobial defense systems in saliva. Saliva: secretion and functions, Monographs in Oral Science, 44:40-51.

220. Veira B.D., Beonte R.F., Rodriquez Miranda K., Avelar K.E., Domigues R., Fereira M., 2006, Decreased susceptibility to nitroimidazoles among Bacteroides species in Brazil, Current Microbiology Journal, 52:27-32.

221. Veloo A.C.M. și van Winkelhoff A.J., 2015, Antibiotic susceptibility profiles of anaerobic pathogens in The Netherlands, Anaerobe, 31:19-24.

222. Wang W., Guo Q., Xu X., Sheng Z.K., Ye X., Wang M., 2014, High-level tetracycline resistance mediated by efflux pumps Tet(A) and Tet(A)-1 with two start codons, Journal of Medical Microbiology, 63(11):1454-1459.

223. Washinton C.W., Koneman E. et al., 2006, Koneman’s color atlas and textbook of diagnostic microbiology, Philadelphia: Lippincott Williams &Wilkins, Chapter 16, p. 894.

224. Wexler H.M., 2007, Bacteroides: the good, the bad and the nitty-gritty, Clinical Microbiology Reviews, 20(4):593-621.

225. Wexler H.M., Read E.K., Tomzynski T.J., 2002, Identification of an OmpA protein from Bacteroides fragilis: ompA gene sequence, OmpA aminoacid sequence and prediction of protein structure, Anaerobe, 8:180-191.

226. Wick C.E., Sears C.L., 2010, Bacteroides spp. and diarrhea, Current Opinion in Infectious Diseases, 23(5):470-474.

227. Wildeboer-Veloo A.C.M., Harmsen H.J.M, Welling G.W., Degener J.E., 2007, Development of 16S rRNA-based probes for the identification of Gram-positive anaerobic cocci isolated from human clinical specimens, Clinical of Microbiology Infection,. 13:985-992.

228. Wojcik-Stojek B., Bulanda M., Martirosian G., Heczko P., Meisel-Mikolajcyk F, 2000, In vitro antibiotic susceptibility of Bacteroides fragilis strain isolated from excised patients with phlegmonous or gangrenous appendicitis, Acta Microbiologica Polonica, 49:171-175.

229. Wren M.W.D., 1996, Anaerobic cocci of clinical importance, British Journal of Biomedical Science, 53:294-301.

230. Wren M.W.D., Baldwin A.W.F., Eldon C.P., Sanderson P.J., 1977, The anaerobic culture of clinical specimens; a 14-month study, Journal of Medical Microbiology, 10:49-61.

231. Wybo I., Pierard D., Verschraegen I., Reynders M., Vandoorslaer K., Claeys G., Delmee M., Glupcznski Y., et al., 2007, Third Belgian multicenter survey of antibiotic susceptibility of anaerobic bacteria, Journal of Antimicrobial Chemoterapy, 59:132-139.

232. Ying S., Zeng D.N., Chi L., Tan Y., Galzote C., Cardona C., Lax S., Gilbert J., Quan, 2015, The influence of age and gender on skin-associated microbial communities in urban rural human populations, Plos One, 10(10), e0141842.

233. Zamani S., Sherati H.S., Zali M. R., Aghdaei H.A., Asiabar A.S., Bokaie S., Nomanpour B., Sechi L.A., Feizabadi M.M., 2017, Detection of enterotoxigenic Bacteroides fragilis in patients with ulcerative colitis, Gut Pathogens, 9:53.

234. Zarnea G. și Popescu O.V., 2011, Dicționar de microbiologie generală și biologie moleculară, Editura Academiei Române, București, ISBN 978-973-27-2135-3.

235. Zenobia C., Hajishengallis G., 2015, Porphyromonas gingivalis virulence factors involved in subversion of leukocytes and microbial dysbiosis, Virulence, 6(3):236-243.

236. Zhang T., Yang Y., Liang Y., Jiao X., Zhao C., 2018, Beneficial effect of intestinal fermentation of natural polysaccharides, Nutrients, 10:1-22.

237. Zhou X., Li Y., 2015, Atlas of Oral Microbiology, From Healthy Microflora to Disease, Academic Press, Chapter 4, pp. 67-93.

238. http://www.bacterio.net

239.https://en.wikipedia.org/wiki/Bacteroides_fragilis#/media/File:BacteroidesFragilis_Gram.jpg

240. https://microbewiki.kenyon.edu/index.php/File:P_nigrescens_1.jpg

241. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4746253

242. https://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Fusobacterium_nucleatum

243. http://www.ncbi.nim. nih.gov/blast/cgi

Anexe

Anexa 1. Medii de cultură utilizate pentru identificarea prezumtivă a bacteriilor anaerobe și determinarea factorilor solubili de virulență și patogenitate

Schaedler Anaerobe Agar

Tryptone soya broth 10 g

Peptone 5 g

Yeast Extract 5 g

Glucose 5 g

Cysteine HCl 0,4 g

Haemin 0,01 g

Tris buffer 0,75 g

Agar 13,5 g

Apă distilată 1000 ml

Se sterilizează la 1210C, 15 min.

Se toarnă in plăci Petri sterile, se lasă la uscat la temperatura camerei și se verifică sterilitatea prin incubare la 370C, 24h-48h în anaerobioză.

Phenylethyl alcohol agar

Pancreatic Digest of Casein 15 g

Papaic Digest of Soybean Meal 5 g

Sodium Chloride 5 g

Phenylethyl Alcohol 2,5 g

Agar 15 g

Sheep Blood 5%

Apă distilată 1000 ml

Se suspendă compnentele în apă distilată, se fierbe 1 min până la dizolvarea completă.

Se sterilizează la 1210C, 15 min.

Se toarnă in plăci Petri sterile, se lasă la uscat la temperatura camerei și se verifică sterilitatea prin incubare la 370C, 24h-48h în anaerobioză.

Anaerobic Blood Agar

Casein Peptone 15 g

Sodium Chloride 5 g

Soy Peptone 5 g

Yeast Extract 5 g

L-Cystine 0,4 g

Vitamina 10 g

Hemin 5 g

Sheep Blood 5%

Agar 20 g

Apă distilată 1000 ml

Se sterilizează la 1210C, 15 min.

Se toarnă in plăci Petri sterile, se lasă la uscat la temperatura camerei și se verifică sterilitatea prin incubare la 370C, 24h-48h în anaerobioză.

Mediu cu gălbenuș de ou

Protease peptone 40 g

KH2PO4 5 g

NaCl 2 g

MgSO4 0,1 g

Dextrose 2 g

Hemină 5 mg/ml

Agar 20 g

Apă distilată 1000 ml

Se sterilează 15 min. la 1150C. Se răcește pâna la 500C și se adaugă emulsie de gălbenuș de ou (1ml la 20ml mediu).

Se toarnă in plăci Petri sterile, se lasă la uscat la temperatura camerei și se verifică sterilitatea prin incubare la 370C, 24h-48h în aerobioză și anaerobioză.

Se utilizează pentru evidențierea producerii de lecitinază.

Mediu Tween (pH = 7)

Pepsic peptone 10 g

NaCl 5 g

CaCl2 0,1 g

Geloză 25 g

Apă distilată 1000 ml

Se lichefiază pe baie clocotită, se menține la 500C și se adaugă 1% TWEEN 80 (sterilizat la 1200C).

Se toarnă in plăci Petri sterile, se lasă la uscat la temperatura camerei și se verifică sterilitatea prin incubare la 370C, 24h-48h în aerobioză și anaerobioză.

Se utilizează pentru evidențierea lipazei.

Mediu cu cazeină (pH 7,5-7,6)

Agar 15 g

Bulion Tripticar 1000 ml

Cazeinază 15 g

Agarul se dizolvă în 700 ml bulion prin încălzire, cazeinaza se dizolvă la cald în 300 ml bulion. Se combină cele două medii și se ajustează pH-ul la 7,5-7,6.

Se sterilizează la 1000C, 30 min.

Se toarnă in plăci Petri sterile, se lasă la uscat la temperatura camerei și se verifică sterilitatea prin incubare la 370C, 24h-48h în aerobioză și anaerobioză.

Se utilizează pentru evidențierea cazeinazei.

Mediu cu gelatină (pH 6,8)

Peptonă 5 g

Extract de carne 3 g

Gelatină 12 g

Apă distilată 1000 ml

Se sterilizează la 1210C, 15 min.

Se toarnă in plăci Petri sterile, se lasă la uscat la temperatura camerei și se verifică sterilitatea prin incubare la 370C, 24h-48h în aerobioză și anaerobioză.

Se utilizează pentru evidențierea capacității bacteriilor de a lichefia gelatina.

Mediu cu ADN

ADN agar 42 g

Apă distilată 1000 ml

Se sterilizează la 1210C, 15 min.

Se toarnă in plăci Petri sterile, se lasă la uscat la temperatura camerei și se verifică sterilitatea prin incubare la 370C, 24h-48 în aerobioză și anaerobioză.

Se utilizează pentru evidențierea DN- azei.

Mediu cu esculină

Peptone 25 g

Extract de carne 25g

Esculină 10 g

Bilă 20 g

Citrat de fier 10 g

Agar 10 g

Apă distilată 1000 ml

Se topește mediul pe baie de apă.

Se sterilizează prin autoclavare la 1210C, 15 min.

Se toarnă in plăci Petri sterile, se lasă la uscat la temperatura camerei și se verifică sterilitatea prin incubare la 370C, 24h-48h în aerobioză și anaerobioză

Se utilizează pentru evidențierea esculinazei.

Mediile de cultură pentru evidențierea factorilor de patogenitate și virulență conțin și adaos de hemină- 5µg/ml și vit. K 1µg/ml.

Anexa 2. Secvențele ampliconilor obținuți în urma experimentelor de PCR și secvențiere

P. acnes- tulpina 1P

TGCAGTCGACGGAAAGGCCCTGCTTTTGTGGGGTGCTCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAAC

ACGTGAGTAACCTGCCCTTGACTTTGGGATAACTTCAGGAAACTGGGGCTAATACCGGAT

AGGAGCTCCTGCTGCATGGTGGGGGTTGGAAAGTTTCGGCGGTTGGGGATGGACTCGCGG

CTTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAGTGGCTTACCAAGGCTTTGACGGGTAGCCGGCCTGAG

AGGGTGACCGGCCACATTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTG

GGGAATATTGCACAATGGGCGGAAGCCTGATGCAGCAACGCCGCGTGCGGGATGACGGCC

TTCGGGTTGTAAACCGCTTTCGCCTGTGACGAAGCGTGAGTGACGGTAATGGGTAAAGAA

GCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTGATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGGA

TTTATTGGGCGTAAAGGGCTCGTAGGTGGTTGATCGCGTCGGAAGTGTAATCTTGGGGCT

TAACCCTGAGCGTGCTTTCGATACGGGTTGACTTGAGGAAGGTAGGGGAGAATGGAATTC

CTGGTGGAGCGGTGGAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGTTCTC

TGGGCCTTTCCTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGCTTAGATACCCTG

GTAGTCCACGCTGTAAACGGTGGGTACTAGGTGTGGGGTCCATTCCACGGGTTCCGTGCC

GTAGCTAACGCTTTAAGTACCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGG

AATTGACGGGGCCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGTAGA

ACCTTACCTGGGTTTGACaTTGGATCGGGAAgTGCTCAGAGATGG

Prevotella spp.- tulpina 14PR

GTCGAGGGGCAGCATGGGGTTTGCTTGCAAACCCCGATGGCGACCGGCGCACGGGTGAGT

AACGCGTATCCAACCTTCCCGCGACTCGGGTATAACCTGCCGAAAGGCAGACTAATCCCC

GATGTCCTCCACTTGAGACATCTTTGGTGGAGCAAAGGCTTCGGCCGGTTGCGGATGGGG

ATGCGTCCGATTAGCTTGTTGGCGGGGCAATGGCCCACCAAGGCTTCGATCGGTAGGGGT

TCTGAGAGGAAGGCCCCCCACATTGGAACTGAGACACGGTCCAAACTCCTACGGGAGGCA

GCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGGCGGAAGCCTGAACCAGCCAAGTAGCGTGCAGGACG

ACGGCCCTATGGGTTGTAAACTGCTTTTATGCGGGGATAACCGGGGCCACGCGTGGCCCC

CTGCAGGTACCGCATGAATAAGGACCGGCTAATTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGG

AAGGTCCGGGCGTTATCCGGATTCATTGGGTTTAAAGGGAGCGTAGGCCGTGGATTAAGC

GTGTTGTGAAATGTAGGCGCTCAACGTCTGACTTGCAGCGCGAACTGGTCCACTTGAGTG

TGCGCGACGCAGGCGGAATTCGTGGTGTAGCGGTGAAATGCTTAGATATCACGAGGAACC

CCGATTGCGAAGGCAGCTTGCGGGAGCACCACTGACGCTGAGGCTCGAAGGTGCGGGTAT

CGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCGCACGGTAAACGATGGATGCCCGTTCTCCGGC

TTTTTTGTCGGGGGACCGAGCGAAAGCATTGAGCATCCCACCTGGGGAGTACGCCGGCAA

CGGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGAGGAACATGTGGTTTAATT

CGATGATACGCGAGGAACCTTACCCGGGCTTGAATTGCAGA

B. fragilis- tulpina 14

TGCAGTCGAGGGGCATCAGGAAGAAAGCTTGCTTTCTTTGCTGGCGACCGGCGCACGGGT

GAGTAACACGTATCCAACCTGCCCTTTACTCGGGGATAGCCTTTCGAAAGAAAGATTAAT

ACCCGATAGCATAATGATTCCGCATGGTTTCATTATTAAAGGATTCCGGTAAAGGATGGG

GATGCGTTCCATTAGGTTGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGCCTTCGATGGATAGGGG

TTCTGAGAGGAAGGTCCCCCACATTGGAACTGAGACACGGTCCAAACTCCTACGGGAGGC

AGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGGCGCTAGCCTGAACCAGCCAAGTAGCGTGAAGGAT

GAAGGCTCTATGGGTCGTAAACTTCTTTTATATAAGAATAAAGTGCAGTATGTATACTGT

TTTGTATGTATTATATGAATAAGGATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACG

GAGGATCCGAGCGTTATCCGGATTTATTGGGTTTAAAGGGAGCGTAGGTGGACTGGTAAG

TCAGTTGTGAAAGTTTGCGGCTCAACCGTAAAATTGCAGTTGATACTGTCAGTCTTGAGT

ACAGTAGAGGTGGGCGGAATTCGTGGTGTAGCGGTGAAATGCTTAGATATCACGAAGAAC

TCCGATTGCGAAGGCAGCTCACTGGACTGCAACTGACACTGATGCTCGAAAGTGTGGGTA

TCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACACAGTAAACGATGAATACTCGCTGTTTGC

GATATACAGTAAGCGGCCAAGCGAAAGCATTAAGTATTCCACCTGGGGAGTACGCCGGCA

ACGGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGAGGAACATGTGGTTTAAT

TCGATGATACGCGAGGAACCTTACCCGGGCTTAAATTGCAGTGGA

B. thetaiotaomicron- tulpina 13

TGCAGTCGAGGGGCAGCATTTCAGTTTGCTTGCAAACTGGAGATGGCGACCGGCGCACGG

GTGAGTAACACGTATCCAACCTGCCGATAACTCGGGGATAGCCTTTCGAAAGAAAGATTA

ATACCCGATGGTATAATTAGACCGCATGGTCTTGTTATTAAAGAATTTCGGTTATCGATG

GGGATGCGTTCCATTAGGCAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAACCTTCGATGGATAGG

GGTTCTGAGAGGAAGGTCCCCCACATTGGAACTGAGACACGGTCCAAACTCCTACGGGAG

GCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGGCGCAGGCCTGAACCAGCCAAGTAGCGTGAAGG

ATGACTGCCCTATGGGTTGTAAACTTCTTTTATATGGGAATAAAGTTTTCCACGTGTGGA

ATTTTGTATGTACCATATGAATAAGGATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATA

CGGAGGATCCGAGCGTTATCCGGATTTATTGGGTTTAAAGGGAGCGTAGGTGGACAGTTA

AGTCAGTTGTGAAAGTTTGCGGCTCAACCGTAAAATTGCAGTTGATACTGGCTGTCTTGA

GTACAGTAGAGGTGGGCGGAATTCGTGGTGTAGCGGTGAAATGCTTAGATATCACGAAGA

ACTCCGATTGCGAAGGCAGCTCACTGGACTGCAACTGACACTGATGCTCGAAAGTGTGGG

TATCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACACAGTAAACGATGAATACTCGCTGTTT GCGATATACAGTAAGCGGCCAAGCGAAAGCATTAAGTATTCCACCTGGGGAGTACGCCGG

CAACGGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGAGGAACATGTGGTTTA

ATTCGATGATACGCGAGGAACCTTACCCGGGCTTAATTGCATTTG

B. ovatus- tulpina 12

TCGAGGGGCAGCATTTTAGTTTGCTTGCAAACTGAAGATGGCGACCGGCGCACGGGTGAG

TAACACGTATCCAACCTGCCGATAACTCCGGGATAGCCTTTCGAAAGAAAGATTAATATC

GGATGGCATACGAATATCGCATGATATTATTATTAAAGAATTTCGGTTATCGATGGGGAT

GCGTTCCATTAGTTTGTTGGCGGGGTAACGGCCCACCAAGACTACGATGGATAGGGGTTC

TGAGAGGAAGGTCCCCCACATTGGAACTGAGACACGGTCCAAACTCCTACGGGAGGCAGC

AGTGAGGAATATTGGTCAATGGACGAGAGCCTGAACCAGCCAAGTAGCGTGAAGGATGAC

TGCTCTATGGGTCGTAAACTTCTTTTATATGGGAATAAAGTATTCCACGTGTGGAATTTT

GTATGTACCATATGAATAAGGATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAG

GATCCGAGCGTTATCCGGATTTATTGGGTTTAAAGGGAGCGTAGGTGGATTGTTAAGTCA

GTTGTGAAAGTTTGCGGCTCAACCGTAAAATTGCAGTTGAAACTGGCAGTCTTGAGTACA

GTAGAGGTGGGCGGAATTCGTGGTGTAGCGGTGAAATGCTTAGATATCACGAAGAACTCC

GATTGCGAAGGCAGCTCACTAGACTGTCACTGACACTGATGCTCGAAAGTGTGGGTATCA

AACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACACAGTAAACGATGAATACTCGCTGTTTGCGAT

ATACAGTAAGCGGCCAAGCGAAAGCATTAAGTATTCCACCTGGGGAGTACGCCGGCAACG

GTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGAGGAACATGTGGTTTAATTCG

ATGATACGCGAGGAACCTTACCCGGGCTTAAATTGCATT

P. acnes – tulpina 11P

TGCAGTCGAACGGAAAGGCCCTGCTTTTGTGGGGTGCTCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAA

CACGTGAGTAACCTGCCCTTGACTTTGGGATAACTTCAGGAAACTGGGGCTAATACCGGA

TAGGAGCTCCTGCTGCATGGTGGGGGTTGGAAAGTTTCGGCGGTTGGGGATGGACTCGCG

GCTTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAGTGGCTTACCAAGGCTTTGACGGGTAGCCGGCCTGA

GAGGGTGACCGGCCACATTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT

GGGGAATATTGCACAATGGGCGGAAGCCTGATGCAGCAACGCCGCGTGCGGGATGACGGC

CTTCGGGTTGTAAACCGCTTTCGCCTGTGACGAAGCGTGAGTGACGGTAATGGGTAAAGA

AGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTGATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGG

ATTTATTGGGCGTAAAGGGCTCGTAGGTGGTTGATCGCGTCGGAAGTGTAATCTTGGGGC

TTAACCCTGAGCGTGCTTTCGATACGGGTTGACTTGAGGAAGGTAGGGGAGAATGGAATT

CCTGGTGGAGCGGTGGAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGTTCT

CTGGGCCTTTCCTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGCTTAGATACCCT

GGTAGTCCACGCTGTAAACGGTGGGTACTAGGTGTGGGGTCCATTCCACGGGTTCCGTGC

CGTAGCTAACGCTTTAAGTACCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAG

GAATTGACGGGGCCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGTAG

AACCTTACCTGGGTTTGACATGGATCGGGAGTGCTCA

P. bivia – tulpina 10PR

TGCAAGTCGAGGGGCAGCGAATAGATAGCTTGCTATTgATGTCGGgCGACCGGCGCACGG

GTGAGTAACGCGTATgCCAACCTGCCCATAACTAAGGGATAACCCAGCGAAAGTTGGACT

AATACCTTATGTATTCGTTTGATCTCATGAGATTACGAATAAAGATTTATCGGTTATGGA

TGGGGATGCGTCTGATTAGCTTGTTGGCGGAGTAACGGCCCACCAAGGCAACGATCAGTA

GGGGTTCTGAGAGGAAGGTCCCCCACATTGGAACTGAGACACGGTCCAAACTCCTACGGG

AGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGACGCAAGTCTGAACCAGCCAAGTAGCGTGCA

GGATGACGGCCCTATGGGTTGTAAACTGCTTTTATATGGGGATAAAGTGGGGAACGTGTT

CTCTTTTGCAGGTACCATATGAATAAGGACCGGCTAATTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAA

TACGGAAGGTTCGGGCGTTATCCGGATTTATTGGGTTTAAAGGGAGCGTAGGCCGTTTGG

TAAGCGTGTTGTGAAATGTAGGAGCTCAACTTCTAGATTGCAGCGCGAACTGTCAGACTT

GAGTGCGCACAACGTAGGCGGAATTCATGGTGTAGCGGTGAAATGCTTAGATATCATGAA

GAACTCCGATTGCGAAGGCAGCTTACGGGAGCGCAACTGACGCTGAAGCTCGAAGGTGCG

GGTATCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCGCACAGTAAACGATGGATGCCCGCTGT

TAGCACCTAGTGTTAGCGGCTAAGCGAAAGCATTAAGCATCCCACCTGGGGAGTACGCCG

GCAACGGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGAGGACATGTGGTTTA

ATTCGATGATACGCGAGGAACCTTACCCGGGCTTGAATTGCAGATGAA

P. acnes- tulpina 10P

TGCAGTCGAACGGAAAGGCCCTGCTTTTGTGGGGTGCTCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAA

CACGTGAGTAACCTGCCCTTGACTTTGGGATAACTTCAGGAAACTGGGGCTAATACCGGA

TAGGAGCTCCTGCTGCATGGTGGGGGTTGGAAAGTTTCGGCGGTTGGGGATGGACTCGCG

GCTTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAGTGGCTTACCAAGGCTTTGACGGGTAGCCGGCCTGA

GAGGGTGACCGGCCACATTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT

GGGGAATATTGCACAATGGGCGGAAGCCTGATGCAGCAACGCCGCGTGCGGGATGACGGC

CTTCGGGTTGTAAACCGCTTTCGCCTGTGACGAAGCGTGAGTGACGGTAATGGGTAAAGA

AGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTGATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGG

ATTTATTGGGCGTAAAGGGCTCGTAGGTGGTTGATCGCGTCGGAAGTGTAATCTTGGGGC

TTAACCCTGAGCGTGCTTTCGATACGGGTTGACTTGAGGAAGGTAGGGGAGAATGGAATT

CCTGGTGGAGCGGTGGAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGTTCT

CTGGGCCTTTCCTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGCTTAGATACCCT

GGTAGTCCACGCTGTAAACGGTGGGTACTAGGTGTGGGGTCCATTCCACGGGTTCCGTGC

CGTAGCTAACGCTTTAAGTACCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAG

GAATTGACGGGGCCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGTAG

AACCTTACCTGGGTTTGACATGGATCGGGAGTGCTCA