Listă abrevieri [310404]

Listă abrevieri

5-HT – serotonină

5-HTR – receptorul serotoninei

CARA – N-glicozilarea A

CARB – N-glicozilarea B

CARC – versiunea inversă a [anonimizat] – [anonimizat]/[anonimizat] – [anonimizat] – [anonimizat] γ-[anonimizat] γ-[anonimizat] – [anonimizat] – human embrionic kidney

IP3 – [anonimizat]-dezordonată

– [anonimizat] – [anonimizat]

MβCD – metil β-[anonimizat] – [anonimizat] – Protein Data Bank

PIP2 – fosfatidilinozitol- 4,5-[anonimizat] – proteina A

PROB – proteina B

PROC – proteina C

PSM – [anonimizat]-ul segmentului

SLC6 – solute carrier 6

SM – [anonimizat] – [anonimizat] – [anonimizat]. 1. Liganzii prezenți în structura SERT (5i75) 41

Tabel nr. 2. Liganzii transportorului în funcție de culoarea utilizată în reprezentarea lor 44

Tabel nr. 3. Numărul lipidelor alese în cazul membranelor care conțin SERT (cu o moleculă de colesterol ca ligand) și mărimea sistemului obținut 51

Tabel nr. 4. Numărul lipidelor alese în cazul membranelor care conțin SERT (fără colesterol ca ligand) și mărimea sistemului obținut 52

Listă figuri

Figura nr. 1. Structurile principalelor clase de lipide prezente în membranele plasmatice. 11

Figura nr. 2. Diferite stadii ale bistratului lipidic în funcție de compoziție și de temperatura ambientală. 13

Figura nr. 3. Reprezentarea schematică a domeniilor membranare.. 15

Figura nr. 4. Modelul mozaicului fluid. 19

Figura nr. 5. [anonimizat] 25

Figura nr. 6. [anonimizat] 27

Figura nr. 7. Structurile chimice ale substraturilor endogene ale transportorilor familiei SLC6 și stoechiometria ionilor de sodiu și clor pentru recaptarea neurotransmițătorului. 28

Figura nr. 8. Mecanismul transportorului de serotonină. 32

Figura nr. 9. Consecințele scăderii aportului alimentelor bogate în colesterol și în energie. 36

Figura nr. 10. Prezentarea generală a mecanismelor moleculare de recaptare a serotoninei în creier. 40

Figura nr. 11. Structurile chimice ale citalopramului, R-citalopramului și S-citalopramului. 41

Figura nr. 12. Structura SERT (5i75), reprezentată cu ajutorul programului VMD 47

Figura nr. 13. Moleculele alese din fișierul pdb al SERT pentru a [anonimizat] 50

Figura nr. 14. Fișierul pdb în format CHARMM al SERT 51

Figura nr. 15. Etapele realizării membranei nr.1. 57

Figura nr. 16. Etapele realizării membranei nr.2. 58

Figura nr. 17. Etapele realizării membranei nr.3. 59

Figura nr. 18. Etapele realizării membranei nr.4 60

Figura nr. 19. Etapele realizării membranei nr.5. 61

Figura nr. 20. Etapele realizării membranei nr.6. 62

1.Introducere

Transportorul de serotonină (SERT) încheie transmisia sinaptică prin recaptarea serotoninei extracelulare de la nivelul fantei sinaptice. Recuperarea serotoninei este esențială pentru semnalizarea serotonergică normală a creierului, cu implicații asupra stării de spirit, a cogniției, a comportamentului și a apetitului. În consecință, funcționarea necorespunzătoare a transportorului de serotonină este asociată cu numeroase tulburări neurologice, incluzând boli precum depresia, autismul și tulburarea bipolară. (Chan și colab., 2019).

SERT are 12 domenii transmembranare și prezintă două situsuri de N-glicozilare. Acest transportor este în principal localizat în domenii membranare bogate în colesterol, adică în microdomenii lipidice. Aceste microdomenii funcționează ca platforme pentru asamblarea și funcționarea optimă a receptorilor și transportorilor de semnalizare (Baudry și colab., 2019).

Microdomeniile lipidice sunt domenii organizate ale membranei plasmatice, care asigură un nivel distinct de reglare a metabolismului celular. Acestea sunt implicate și în răspunsul la stimuli extracelulari, influențând o gamă diversă de procese fiziologice și patologice (Sviridov și Miller, 2019).

Sfingolipidele și colesterolul sunt principalele componente ale acestor microdomenii. Colesterolul umple spațiile goale dintre glicerofosfolipide pentru a forma o structură ordonată și pentru a stabiliza microdomeniul. Consolidarea structurii microdomeniilor lipidice este realizată prin interacții strânse între ciclurile sterolului și resturile sfingozinei, și între gruparea hidroxil a colesterolului și grupările hidrofile ale sfingomielinei (Kalinichenko și colab., 2020).

Scopul lucrării este de a construi modele membranare care conțin o compoziție în lipide specifică microdomeniilor lipidice și SERT drept proteină transmembranară. Obținerea acestor modele moleculare va ajuta la înțelegerea modului în care SERT își modifică conformația când se află în compoziția microdomeniilor lipidice și ce rol au aceste modificări asupra funcției transportorului. Obținerea unor astfel de modele moleculare este importantă în studiul funcției proteinelor, deoarece extragerea domeniilor membranare împreună cu proteina componentă și studiul acestora in vitro este greu realizabilă. Majoritatea modelelor moleculare realizate până acum au ținut cont de liganzii SERT și de situsurile de legare ale acestora, urmărind controlarea funcției transportorului prin intermediul acestora. Modelele membranare realizate în cadrul acestei lucrări se bazează pe mediul în care se află SERT și pe modul în care compoziția acestuia îi poate afecta funcția.

PARTEA TEORETICĂ

CAPITOLUL I. MICRODOMENIILE LIPIDICE

2.1. Componentele lipidice din membranele celulare

Toate celulele sunt delimitate de o membrană care le conferă identitate spațială și care reprezintă granița dintre spațiul intracelular și cel extracelular. Membranele joacă un rol important, nu numai în interacțiile dintre celulă și mediul extern, dar și în procesele fiziologice ale celulelor cum ar fi: semnalizarea și adeziunea celulară, transportul intracelular, conversia energiei sau homeostaza tumorilor. Membranele celulare sunt constituite din 50% lipide, 40% proteine, 2%-10% glucide, cantități mici de apă, săruri anorganice și ioni metalici (Simons și Sampaio, 2011; Shi și colab., 2018).

Au fost descoperite sute de lipide membranare, majoritatea fiind implicate direct în semnalizarea celulară. Proteinele ocupă aproximativ 50% din suprafața membranei plasmatice și pot fi împărțite în trei tipuri principale: integrale, periferice și proteine ancorate la lipide. Aceste proteine membranare au cel mai important rol la nivelul funcțiilor membranelor și sunt implicate în procese de tipul transportului molecular sau în transducția semnalului. Pe lângă rolul de definire a limitelor celulare, membranele funcționează și ca un mediu esențial pentru comunicarea celulară. Structura și dinamica sistemelor biologice guvernează funcția acestora, iar membranele celulare nu fac excepție de la acest lucru. Pentru a putea determina caracteristicile fizico-chimice ale membranelor celulare, este nevoie de o înțelegere a funcțiilor biologice și de detalii despre organizarea și modul în care sunt combinate lipidele și proteinele membranare (Cheng și Smith, 2019).

Principalele lipide din structura membranelor sunt glicerofosfolipidele, cele mai abundente lipide din această clasă fiind fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, respectiv fosfatidilserina. Glicerofosfolipidele sunt alcătuite dintr-un schelet de glicerol, două lanțuri acil, legate printr-o legătură esterică de glicerol și o grupare hidroxil fosforilată. Lanțul acil conține, de obicei, un număr par de atomi de carbon, între 16 și 20 în total și un lanț hidrocarbonat saturat și altul nesaturat. Sfingolipidele sunt următoarea categorie de lipide des întâlnită în membrane și au la bază o moleculă de sfingozină, care prezintă un lanț acil legat de o amidă. Acesta este de obicei saturat și poate conține până la 24 de atomi de carbon și, fie o grupare hidroxil fosforilată, fie una sau mai multe glucide legate de gruparea hidroxil a sfingozinei. Al doilea lanț hidrocarbonat al sfingolipidelor reprezintă porțiunea nepolară a sfingozinei și prezintă la nivelul atomului de carbon din poziția trei, o grupare hidroxil neesterificată, ce poate participa la formarea punților de hidrogen. Sterolii sunt a treia categorie de lipide membranare și sunt prezenți în ambele straturi ale membranelor. Colesterolul prezintă o structură rigidă, ciclică, cu patru inele condensate, conține o singură grupare hidroxil și o catenă laterală, sistemul ciclic având o structură planară. Conținutul membranelor în lipide este diferit de la un organit la altul. Reticulul endoplasmic și aparatul Golgi conțin în proporții mari glicerofosfolipide și în proporții mai mici sfingolipide, pe când membrana plasmatică este bogată în sfingomieline și glicosfingolipide. Conținutul în lipide al celulelor eucariote este mai bogat în sfingolipide și colesterol și mai sărac în glicerofosfolipide, lipide reprezentate în figura nr.1 (McMullen și colab., 2004; Fielding, 2006).

Figura nr. 1. Structurile principalelor clase de lipide prezente în membranele plasmatice. (sursă proprie)

Lipidele sunt componentele de bază ale membranelor, acestea oferind un mediu pentru menținerea conformațiilor și funcționarea proteinelor membranare. Proteinele execută funcțiile principale ale membranei și sunt implicate în transportul ionilor, conversia energiei și în semnalizarea celulară. Părțile hidrofobe ale lipidelor au tendința de a se asocia între ele. Părțile hidrofile ale lipidelor se asociază între ele sau cu mediul apos. Toate aceste proprietăți stau la baza formării spontane a bistratului lipidic. Principiul de amfipaticitate al lipidelor este proprietatea chimică care le permite celulelor să își separe constituenții interni de mediul extern. Același principiu se aplică și la nivel subcelular la asamblarea membranelor care înconjoară fiecare organit celular .

2.2. Rolul colesterolului în structura membranelor

O altă proprietate importantă a membranelor plasmatice este aceea că prezintă o asimetrie compozițională lipidică transversală, adică prezintă o concentrație diferită de lipide în cele două straturi. Mai exact, fosfatidilcolina și sfingomielina sunt prezente în cantități mari în stratul extern al bistratului, pe când stratul intern este bogat în fosfatidiletanolamină și fosfatidilserină. Din moment ce colesterolul este prezent în cantități mari în membrana plasmatică, este important să se ia în considerare efectul pe care acesta îl are asupra structurii și organizării bistratului alcătuit din glicerofosfolipide și sfingofosfolipide. În absența colesterolului, bistratul lipidic poate exista în una dintre cele două stări fizice: starea de gel, la temperaturi scăzute și starea lichid-cristalină (lichid-dezordonată), la temperaturi crescute (McMullen și colab., 2004).

În faza de gel, lanțurile hidrocarbonate ale fosfolipidelor se află într-o conformație trans, aria secțiunii transversale a moleculelor fosfolipidelor este minimă, grosimea bistratului fosfolipidic este maximă și ambele mișcări intra- și intermoleculare sunt restricționate. În timpul fazei lichid-cristalină, lanțurile hidrocarbonate prezintă conformeri rotaționali, aria secțiunii transversale a moleculelor de fosfolipide crește considerabil, grosimea bistratului fosfolipidic scade și sunt prezente rate mari ale mișcărilor intra- și intermoleculare. Numeroase studii biofizice ale membranelor celulelor vii care nu conțineau colesterol au arătat că, în condiții fiziologice, bistratul lipidic există predominant, dacă nu exclusiv, în faza lichid-cristalină, ca în figura nr.2. Această fază este necesară pentru creșterea normală a celulelor și pentru funcționarea membranelor (McMullen și colab., 2004).

Figura nr. 2. Diferite stadii ale bistratului lipidic în funcție de compoziție și de temperatura ambientală. Trecerea printr-o temperatură de tranziție (), duce la încălzirea membranei și la schimarea stării, de la una solid-ordonată de gel, la o stare lichidă, mai puțin fluidă și mai puțin densă. Adăugarea colesterolului stabilizează efectul temperaturii, oferind o rigiditate crescută și o împachetare mai densă. Prezența fosfolipidelor nesaturate duce la o împachetare mai slabă și o stare mai fluidă. Legăturile duble ale acestor lipide duc la îndoirea lanțurilor resturilor de acizi grași, ceea ce provoacă repulsii sterice între lipide (Zalba și ten Hagen, 2017). Figură adaptată după Zalba și ten Hagen, 2017.

Ar fi de așteptat ca amestecul de lipide de la nivelul membranei plasmatice să existe ca un amestec al fazelor în absența colesterolului, datorită temperaturilor de tranziție mai mici ale glicerofosfolipidelor nesaturate și temperaturilor mai mari de tranziție ale sfingolipidelor saturate. De fapt, s-a propus că unul dintre rolurile colesterolului în membranele plasmatice este acela de a reduce tendința intrinsecă a glicerofosfolipidelor și a sfingolipidelor de a exista în faze separate, prin inducerea formării unei faze intermediare (McMullen și colab., 2004).

Colesterolul îndeplinește funcții majore la nivelul membranei, acesta fiind implicat în semnalizarea și modelarea structurii membranelor. Pentru a putea fi înțeleasă difuzia laterală a colesterolului, s-au realizat studii cu analogi de colesterol fluorescent atât în membranele celulare, cât și în membranele model. S-a constatat că mișcarea colesterolului este mai rapidă decât cea a fosfolipidelor și a sfingolipidelor, în cazul modelelor membranare, care sunt la echilibru din punct de vedere termodinamic. Și în celulele vii, acesta difuzează semnificativ mai rapid decât celelalte lipide membranare. Difuziunea mai lentă a fosfo- și sfingolipidelor nu depinde de formarea domeniilor membranare. Analizele luminozității analogilor fluorescenți ai colesterolului au arătat faptul că aceștia difuzează rapid în membrană datorită localizării și poziționării eterogene a colesterolului la nivelul membranei. Aceste lucruri pot fi consecința compartimentării asimetrice între straturile interne și externe ale bistratului lipidic și sunt susținute de difuziunea asemănătoare a analogilor colesterolului și fosfolipidelor, în momentul în care sunt localizați în stratul extern al membranei (Pinkwart și colab., 2019).

2.3. Microdomeniile lipidice ca principiu de organizare membranar

Membranele celulare prezintă o varietate de lipide care diferă din punctul de vedere al proprietăților lor fizico-chimice. Imiscibilitatea lipid-lipid produce eterogenitatea laterală în planul membranei ce duce la formarea unor domenii, unele dintre acelea fiind microdomeniile lipidice. Microdomeniile lipidice au fost definite inițial, din punct de vedere biochimic, ca membrane rezistente la detergent (DRM). Acestea pot fi definite ca ansambluri submicroscopice extrem de dinamice, care se află în stratul lichid-dezordonat al membranelor celulare. Un rol important în asamblarea acestor domenii îl joacă sfingolipidele și colesterolul din stratul extern al membranelor (Rajendran și Simons, 2005).

Efectele majore ale încorporării unor cantități crescătoare de colesterol în interiorul bistraturilor lipidice sunt: de lărgire și reducere a entalpiei de tranziție între faze, de a crește/ scădea aria secțiunii transversale a moleculelor de fosfolipide, grosimea bistratului fosfolipidic în faza lichid-cristalină/ de gel și de a scădea/ crește rata de mișcare a lanțurilor hidrocarbonate în faza lichid-cristalină/ de gel. Adăugarea progresivă de colesterol a crescut de asemenea rigiditatea mecanică și coeficiența. În plus, are loc reducerea permeabilității bistratului fosfolipidic în faza lichid-cristalină, reducând totodată rata de difuzie laterală și rotațională a unor molecule fosfolipidice. Adăugarea progresivă de colesterol convertește faza lichid-cristalină și faza de gel a bistratului fosfolipidic la o stare intermediară care are proprietăți în general intermediare între cele ale fazei solide și fazei fluide. De aici și termenul de fază lichid-ordonată () pentru a descrie această stare intermediară, pe când faza lichid-cristalină a fost denumită faza lichid-dezordonată (). O ipoteză dezvoltată în domeniul biologiei membranelor este faptul că membranele plasmatice și alte membrane ale celulelor animale ar putea conține domenii de lipide segregate lateral cunoscute sub numele de microdomenii lipidice (McMullen și colab., 2004).

Definiția microdomeniilor lipidice este încă în curs de dezvoltare, dar în ansamblu, aceste microdomenii ar putea fi văzute ca domenii de 2-20 nm în diametru, în care moleculele de colesterol și cele care conțin lanțuri acil lungi, saturate sunt asamblate într-o fază asemănătoare fazei . Acest lucru are loc datorită interacțiilor dintre colesterol și lanțurile acil lungi, saturate, și imiscibilitatea lor cu lanțuri acil nesaturate printr-un mecanism asemănător cu separarea fazelor. În acest fel, domeniile lipidice acumulează molecule care prezintă o miscibilitate mai bună cu domenii asemănătoare fazei . Domeniile își păstrează proprietățile asemănătoare lichidelor, permițând moleculelor să difuzeze la nivelul acestora și să facă schimb cu moleculele care se află în domenii asemănătoare fazei . Durata de viață a moleculelor recrutate la nivelul microdomeniilor lipidice este de cele mai multe ori de ordinul fracțiunilor de secundă (Kusumi și colab., 2020).

Figura nr. 3. Reprezentarea schematică a domeniilor membranare. Membrana celulară conține grupuri de lipide, microdomenii lipidice și un mediu lipidic în general dezordonat. Aceste microdomenii lipidice sunt domenii mici, eterogene și puternic dinamice. În asemenea domenii, sfingolipidele cu lanțuri hidrocarbonate nesaturate se asociază cu colesterolul. Pe lângă aceste lucruri, microdomeniile lipidice mai conțin (i) proteine ancorate la glicozilfosfatidilinozitol (GPI), (ii) proteine atașate la stratul intern al membranei, (iii) proteine transmembranare care prezintă un domeniu citoplasmatic, în plus față de domeniul extracelular care este expus la suprafața celulei (El-Sayed și Harashima, 2013). Figură adaptată după El-Sayed și Harashima, 2013.

Baza fizico-chimică a ipotezei acestor microdomenii este interacția dintre steroli și lipidele saturate ce pot forma o stare unică a materiei numită faza lichid-ordonată. Datorită complexității membranelor celulare, multe studii au imitat proprietățile acestor microdomenii și fazele materiei utilizând sisteme model alcătuite dintr-un lipid cu punct de topire înalt, altul cu punct de topire scăzut și un sterol. Un asemenea amestec poate forma faze și faze asemănătoare cu imiscibilitatea lichid-lichid din membranele celulare. Amestecurile de trei lipide cum ar fi sfingomielina, fosfatidilcolina și colesterolul sunt asemănătoare cu speciile predomi-nante de lipide din stratul extern al bistratului lipidic al celulelor eucariote (Kurniawan și colab., 2017).

Studiile modelului original al membranelor, care au furnizat informații esențiale legate de microdomeniile lipidice, s-au bazat pe o compoziție a membranei asemănătoare cu cea a celulelor epiteliale: un amestec aproape echimolar de colesterol, un lipid saturat ca sfingomielina și o fosfatidilcolină nesaturată care prezintă de obicei două lanțuri acil nesaturate. De atunci, a devenit clar că acest amestec este un model inexact al membranelor plasmatice ale mamiferelor. În primul rând, combinația de lipide este o replică fidelă a stratului extern al bistratului lipidic, pe când stratul intern conține în abundență lipide încărcate electric și polinesaturate (Levental și colab., 2020).

În plus, lipidele cu două lanțuri acil nesaturate sunt relativ rar întâlnite în membranele eucariotelor superioare, care sunt alcătuite dintr-un amestec de lipide hibride și au un lanț acil saturat și altul nesaturat. Această diferență subtilă pare a fi de mare importanță, deoarece membranele cu lipide hibride drept componente nesaturate majore nu se separă în domenii macroscopice, ci formează mai degrabă domenii ordonate nanoscopic. Separarea fazei lipidice în modelul membranei duce la producerea unor domenii macroscopice de ordinul multor micrometri, care de obicei nu sunt observate în celule vii (Levental și colab., 2020).

Totuși, mai multe experimente au demonstrat că principiile separării fazei lichid-lichid pot fi cooptate pentru a produce domenii nanoscopice. Când sunt construite membrane care să imite microdomenii folosind lipide hibride drept componentele nesaturate, acestea apar uniforme la microscop. Totuși, tehnici precum împrăștierea neutronilor, transferul de energie prin rezonanță fluorescentă și spectroscopia de rezonanță a spinului electronilor au arătat faptul că membranele prezentau domenii nanoscopice ordonate și dezordonate (Levental și colab., 2020).

2.3.1. Colesterolul în structura microdomeniilor lipidice

În modelul original al microdomeniilor lipidice, formarea domeniilor s-a bazat pe interacțiile dintre colesterol și sfingolipide. S-a constatat, de asemenea, că sfingomielina este prezentă și în DRM și la nivelul fazei lipid-ordonate, datorită legăturii puternice de hidrogen dintre lipide și colesterol. Cu toate acestea, distribuirea colesterolului între domenii mai mult sau mai puțin ordonate este încă neclară. Studii experimentale și computaționale sugerează că sterolul este abundent și în fazele ordonate (asemănătoare microdomeniilor lipidice) și în fazele dezordonate (cele care nu formează microdomenii). Alte tipuri de lipide ce interacționează cu colesterolul sunt lipidele gangliozide, ce duc la formarea microdomeniilor în membranele model. În plus, aceste lipide au fost constant identificate la nivelul domeniilor ordonate în membranele model (Sezgin, 2017).

Se consideră că moleculele de colesterol au rolul de a separa lanțurile hidrocarbonate ale sfingolipidelor și funcționează ca un lipici dinamic care menține ansamblul microdomeniilor. Acesta prezintă afinitate mai mare pentru sfingolipidele aflate în microdomenii, decât pentru fosfolipidele nesaturate din membrană. Îndepărtarea colesterolului duce la disocierea multor proteine din microdomeniile lipidice, acestea devenind nefuncționale (Simons și Ehehalt, 2002).

Metoda originală care ducea la perturbarea microdomeniilor și a proceselor legate de aceste domenii membranare a fost epuizarea colesterolului cu ajutorul ciclodextrinei (CD). CD este un polizaharid care poate extrage colesterolul cu o specificitate și eficiență rezonabilă. Epuizarea colesterolului ar trebui să ducă la perturbarea ansamblului și funcționalității microdomeniilor. În concordanță cu această idee este și faptul că îndepărtarea colesterolului reduce rezistența proteinelor la detergenți și afectează transportul membranar, activarea celulelor imunității și alte procese celulare (Levental și Veatch, 2016).

Colesterolul este unic în rândul lipidelor membranare, deoarece este policiclic, are o grupare polară foarte mică și nu conține niciun lanț acil care să permită variabilitatea biochimică. Este prezent în fiecare strat al membranei plasmatice unde poate interacționa cu lipide specifice, cum ar fi fosfatidilserina din stratul intern al membranei. Mai mult decât atât, interacțiile dintre moleculele de colesterol într-o topologie simetrică au fost evidențiate în membranele model. În stratul extern al membranei, colesterolul prezintă o preferință pentru sfingolipide, ale căror fragmente nepolare sunt în general mai rigide decât cele ale glicerofosfolipidelor. Prin urmare, există o distribuție laterală a colesterolului, care este îmbogățit în domenii sfingolipidice. În aceste zone ale membranei, complexele colesterol condensat-sfingolipide formează o fază fizică specifică numită faza lichid-ordonată. În schimb, colesterolul este slab asociat cu glicero-fosfolipidele și constituie o fază distinctă, denumită faza lichid-dezordonată. Atracția față de sfingolipide și, în același timp, lipsa unei adeziuni ferme la fosfatidilcolină duce la o separare a colesterolului pe baza lipidelor într-o fază și o distribuție redusă a colesterolului în faza (Fantini și colab., 2016).

Din punct de vedere pur geometric, există doar două unghiuri de apropiere a colesterolului față de plasmalemă: din spațiul extracelular (abordare verticală) sau din regiunea nepolară a membranei (abordare laterală). Abordarea verticală implică faptul că molecula de colesterol trebuie să fie accesibilă proteinelor extracelulare sau domeniilor extracelulare ale proteinelor membranare. În acest caz, grupările accesibile ale colesterolului (adică atomii care sunt susceptibili legării) sunt limitate în general la gruparea hidroxil. Această grupare a coles-terolului este disponibilă numai în faza . În această fază, colesterolul este complet mascat de grupările polare ale sfingolipidelor, incluzând atât sfingomielinele, cât și glicosfingolipidele, printr-un efect bine caracterizat, numit efect umbrelă. Mecanismul molecular al acestui efect se bazează pe formarea unei rețele de legături de hidrogen care include și gruparea hidroxil a colesterolului. Prin urmare, există puține șanse ca gruparea hidroxil a colesterolului aflat în microdomeniu și înconjurat de sfingolipide să fie vizat de o proteină extracelulară. În schimb, asocierea scăzută a colesterolului cu fosfatidilcolina face ca gruparea hidroxil să fie atât accesibilă, cât și lipsită de legături, ceea ce o face complet disponibilă pentru liganzii extracelulari (Fantini și colab., 2016).

2.4. Interacțiile dintre microdomenii lipidice și proteinele membranare

Organizarea lipidelor în membranele celulare a atestat reglarea funcției proteinelor implicate în diferite procese celulare. Ca acest lucru să aibă loc, proteinele trebuie să se împartă în platformele laterale bogate în sfingolipide și colesterol. Când detergenți ca Triton X-100 au fost adăugați în celule, complexele lipidice au fost găsite în domenii rezistente la detergent, împreună cu anumite proteine. Deoarece compoziția în lipide a DRM era asemănătoare cu cea a microdomeniilor lipidice membranare s-a constatat că proteinele găsite în DRM sunt proteine care intră în compoziția microdomeniilor lipidice. După aceste experimente, s-a ajuns la concluzia că DRM și microdomeniile lipidice nu sunt același lucru, ci DRM sunt produse de reorganizarea lipidelor și proteinelor membranare în prezența detergenților (Nyholm, 2015).

Proteinele membranare prezintă o complexitate mare , datorită faptului că provin din mai multe clase despre care se știe că îndeplinesc funcții esențiale și diferite. Proteinele membranare sunt implicate în interacții proteină-lipid, în recunoașterea celulară, în transportul moleculelor prin bariera membranară, în sinteza de energie, în menținerea concentrației diferiților gradienți, în transducția semnalului, dar și în formarea veziculelor. Aceste proteine membranare pot fi împărțite în două clase mari, reprezentate în figura nr.4 (J. Loschwitza, 2020):

a)Proteine periferice care interacționează direct cu membrana sau cu proteine integrate în membrană

b)Proteine integrale încorporate în membrană sau asociate cu o ancoră lipidică

Figura nr. 4. Modelul mozaicului fluid. Acesta este reprezentat de un bistrat fosfolipidic (PL) care separă două medii diferite: intracelular/extracelular sau luminal/citosolic. Bistratul conține lipide care mențin structura membranei, proteine integrale și periferice care pot prezenta modificări post-translaționale (ex: glicozilarea care produce glicoproteine). Acestea servesc drept transportori și canale pentru substrat, dar și ca receptori membranari. În ultimii ani, a apărut teoria microdomeniilor lipidice, în care membrana este separată în regiuni dezordonate (, care conțin glicerofosfolipide (GPL) nesaturate și regiuni ordonate (, asemănătoare microdomeniilor lipidice, bogate în colesterol și sfingomielină (SM). Pe lângă acestea, în regiunea mai sunt prezente și proteine și lipide glicozilate, precum și glicozilfosfatidilinozitolul (J. Loschwitza, 2020). Figură adaptată după J. Loschwitza, 2020.

Proteinele periferice nu sunt, de obicei, în contact complet cu partea hidrofobă a membranei și pot fi îndepărtate prin schimbarea concentrației ionice sau a pH-ului sistemului. În schimb, proteinele integrale interacționează cu o parte a structurii lor direct cu miezul hidrofob al membranei. Exemplele includ ancorarea prin lipidarea post-translațională a aminoacizilor și interacțiunile care implică secvențele hidrofobe ale structurilor transmembranare. Lipidele membranare pot influența proteinele membranare prin legarea directă care afectează alosteric preferințele conformaționale ale proteinelor (J. Loschwitza, 2020).

O altă forță motrice pentru organizarea domeniilor membranare derivă din interacțiile hidrofobe între proteinele transmembranare și diferitele tipuri de lipide. Nepotrivirea hidrofobă reprezintă diferența dintre grosimile regiunilor hidrofobe ale unei proteine transmembranare și grosimea membranei biologice. Această nepotrivire conduce la expunerea suprafeței hidrofobe a proteinei la apă, ceea ce duce la afectarea orientării proteinelor în membrană. Proteinele trans-membranare și lipidele înconjurătoare se pot adapta la nepotrivirile hidrofobe prin mai multe moduri. Atunci când partea hidrofobă a proteinei este mai lungă decât grosimea bistratului lipidic, proteina poate agrega în membrană pentru a reduce expunerea segmentului hidrofob sau poate adopta o conformație diferită. Lipidele pot în schimb să regleze grosimea membranei prin alungirea lanțurilor acil sau prin asamblarea într-o altă stare a membranei. Când partea hidrofobă a proteinei transmembranare este prea mică pentru a se potrivi cu grosimea părții hidrofobe a bistratului, acest lucru poate duce din nou la agregarea proteinelor sau la modificări ale orientării sau conformației proteinei. Lipidele pe de altă parte, ar putea reduce grosimea efectivă a bistratului, devenind mai dezordonate sau distrugând ordinea bistratului pentru a forma o structură lamelară inversă (Strandberg și colab., 2012; J. Loschwitza, 2020).

Separarea proteinelor în faza a fost studiată utilizând microscopia fluorescentă. Date publicate de microscopie sugerează faptul că foarte puține proteine transmembranare intră în faza , iar cele care o fac, preferă faza (Kahya, 2010).

Aceste studii arată că foarte rar proteinele preferă bistraturi bogate în lanțuri acil față de bistraturi cu ordine fluidă scăzută. Un factor important care poate influența asocierea proteinelor cu faza în experimentele de separare este natura simetrică a membranelor. Natura asimetrică a membranelor celulare prezintă un mediu lipidic diferit în partea internă a bistratului, ceea ce le permite proteinelor să pătrundă în domeniile aflate în faza mult mai ușor. S-a crezut că potrivirea hidrofobă între domeniile transmembranare ale proteinelor și bistratul lipidic influențează organizarea laterală în membranele celulare. Pe baza diferențelor între lungimea regiunilor hidrofobe ale proteinelor transmembranare, a variațiilor în grosime a bistraturilor din celulă și a domeniilor și , această ipoteză pare foarte plauzibilă. Mai mult, au fost observate proteine care răspund la nepotrivirea hidrofobă, de exemplu, acestea se grupează împreună pentru a minimiza costurile existenței într-un bistrat cu grosime nefavorabilă. În primele încercări de a studia impactul potrivirii hidrofobe asupra preferințelor proteinelor transmembranare pentru domenii ale bistratului cu grosimi diferite, a fost studiată compartimentarea unei singure peptide transmembranare împărțită între domeniile lichid-ordonate și cele lichid-dezordonate. Aceste studii au arătat că pentru o singură peptidă, costurile de a pătrunde într-un domeniu strâns împachetat erau prea nefavorabile din punct de vedere energetic (Hussain și colab., 2013; Nyholm, 2015).

O posibilă explicație a lipsei de impact a potrivirii hidrofobe poate fi faptul că există alte posibilități, mai puțin costisitoare, pentru ca sistemul să reducă stresul indus de nepotrivire, altele decât reorganizarea bistratului. De exemplu, un singur helix nepotrivit s-ar putea înclina față de bistratul normal, pentru a scurta lungimea părții hidrofobe. Proteine mai mari, cu mai multe segmente transmembranare se adaptează mai puțin și s-a dovedit că au un efect mai mare asupra lipidelor din jur decât proteinele cu un singur domeniu transmembranar. Prin urmare, este posibil ca proteinele mai mari să fie mai predispuse să se adapteze la nepotrivirea hidrofobă prin re-locarea într-un mediu lipidic mai favorabil. A fost sugerat faptul că oligomerizarea ar putea modifica gradul în care proteinele se asociază cu domeniile membranare. Oligomerii proteinelor mai mici pot începe să se comporte ca proteinele mai mari și, prin urmare, pot fi mai predispuși să intre într-o fază mai ordonată, pentru a minimiza nepotrivirea segmentelor hidrofobe. Rezultatele experimentelor efectuate cu proteina virusului gripal (hemaglutinina), au sugerat că interacțiile dintre domeniile transmembranare ale proteinelor și mediul lipidic înconjurător pot fi influențate de concentrații mari ale proteinelor membranare din mediu. Prin urmare, se poate concluziona că oligomerizarea poate fi un factor important care ar putea modifica modul în care proteina este percepută în mediul lipidic înconjurător și că, pentru unele proteine, oligomerizarea duce la modificări ale preferințelor pentru acest mediu (Sharpe și colab., 2010; Hussain și colab., 2013; Nyholm, 2015).

În proteinele care se asociază cu aceste microdomenii lipidice se găsesc patru tipuri de lipidare. Lipidarea reprezintă legătura covalentă dintre un lanț peptidic și o grupare lipidică. Acestea sunt: acilarea cu acidul miristic la gruparea N-terminală; acilarea acidului palmitic la resturile de cisteină; legătura glicozilfosfatidilinozitol (GPI) și atașarea covalentă a colestero-lului. Ar fi de așteptat ca lanțurile acil saturate și grupările colesterolului atașate la proteine să se repartizeze în microdomenii, datorită suprafeței lor netede și regulate. Colesterolul liber, în sine, este o componentă a microdomeniilor lipidice. În plus, lanțurile acil saturate sunt mai ușor integrate în microdomenii decât lipidele cu lanțuri acil nesaturate, iar lipidele cu grupări acil polinesaturate sunt excluse din microdomeniile lipidice. Structura legăturii GPI este reprezentată de un fragment fosfatidilinozitol care este glicozilat suplimentar la glucidul inozitolului (Wassall și colab., 2004; Epand, 2008).

Se știe mai puțin despre modul în care lanțurile peptidice ale proteinelor afectează împărțirea proteinelor între microdomeniile membranare și zonele membranei care nu prezintă domenii. În afară de lipidarea proteinelor, mai există trei metode prin care proteinele vor fi concentrate în mod preferențial în domeniile bogate în colesterol. Un mecanism este indirect și reprezintă o consecință a interacțiunii proteinei cu altă proteină scaffold, care se află într-un anumit domeniu. Proteinele scaffold sunt proteine care participă la cascada de semnalizare și ajută la transmiterea rapidă a mesajului între membrana celulară și nucleu. Exemple de proteine scaffold sunt caveolina, componentul major din caveole și flotilina, proteină prezentă în microdomeniile din multe celule. Un al doilea mecanism este prin natura topologiei segmentului hidrofob transmembranar al proteinei. A fost precizat faptul că lanțurile acil polinesaturate sunt excluse din aceste microdomenii, la fel ca helixurile care nu prezintă un contur neted. Acest lucru ar fi identic pentru proteinele prenilate care prezintă grupări metil proeminente din lanțul hidrocarbonat, acestea fiind excluse din microdomenii. Un exemplu de lanț peptidic hidrofob care s-a dovedit că interacționează în mod preferențial cu colesterolul este segmentul hidrofob al izoformei ε a diacilglicerol kinazei. Al treilea mecanism este reprezentat de interacțiunea preferențială a proteinei poziționate la interfața membranei cu anumite componente lipidice. În prezent, acest mecanism este înțeles doar parțial. O ipoteză privind cerințele de recunoaștere a colesterolului la interfața membranei este prin interacțiunea sterolului cu domeniile CRAC-Cholesterol Recognition/ interaction Amino acid Consensus (Glukhov și colab., 2007; Sprenger și Horrevoets, 2007; Epand, 2008).

2.5. Relația dintre colesterol și proteinele membranare

Impactul structurii colesterolului asupra structurii și funcției proteinelor membranare a fost recunoscut de acum câteva decenii, dar mecanismele moleculare care stau la baza acestui proces nu au fost încă elucidate. Se pare că există mecanisme multiple prin care colesterolul interacționează cu proteinele. Inițial, s-a crezut că efectul colesterolului asupra fluidității membranelor este nespecific. Ulterior, s-a arătat că acest lipid ar putea interacționa în mod specific cu proteinele membranare și că le poate afecta atât structura, cât și funcția (Wang și colab., 2019).

Proteinele se leagă în principal la colesterol prin intermediul grupării hidroxil. După legarea la această grupare, proteinele trebuie să își stabilizeze asocierea la membrana plasmatică. O singură interacțiune cu o moleculă de colesterol care implică doar gruparea hidroxil este departe de a fi suficientă. În aceste condiții, proteina are trei posibilități: să rupă legătura cu colesterolul și să revină în spațiul extracelular sau să își stabilizeze adeziunea la membrană prin interacția cu alte grupări ale lipidelor sau să pătrundă în membrană. Ultima variantă corespunde unui proces de inserție care are loc, de exemplu, în primele etape ale infecției cu un virus (Fantini și colab., 2016).

Marea majoritate a proteinelor membranare, incluzând receptorii și canalele ionice, prezintă unul sau mai multe domenii transmembranare (TM) care traversează bistratul lipidic. Schematic, un domeniu TM este alcătuit dintr-un segment α-helix de 20-25 aminoacizi nepolari, flancat la fiecare capăt de reziduuri polare. Această configurație simetrică are două roluri: de a facilita tranziția între interiorul nepolar al membranei și mediul polar care acoperă suprafața acesteia și permiterea domeniului TM să interacționeze atât cu lanțurile nepolare, cât și cu grupările polare ale lipidelor membranare. Lipidele membranare pot fi împărțite în trei categorii: glicerofosfolipide, sfingolipide și colesterol. Dacă se ia în considerare distribuția ordonată a resturilor de aminoacizi nepolari și polari, este clar că un domeniu TM poate interacționa cu oricare dintre aceste trei tipuri de lipide, în interiorul sau la exteriorul microdomeniilor lipidice. Cu toate acestea, trebuie făcută o distincție între lipidele care pot fi schimbate și cele care rămân strâns legate de proteină. În primul caz, asocierea lipid-proteină nu este selectivă și are o afinitate suficient de mică pentru a permite schimbul de lipide (relativ rapid). În al doilea caz, domeniul TM prezintă un situs specific de legare care este specific unui anumit lipid, de exemplu colesterolul. Acest tip de lipide interacționează specific cu proteinele membranare, influențând conformația lor și reglând funcțiile acestora (Fantini și colab., 2002, 2016).

Aminoacizii prezenți în TM au rolul de a stabiliza helixul în interiorul membranei și de a media tranzițiile între mediile polare și cele nepolare. Din acest motiv, resturile de lizină, arginină, tirozină și triptofan sunt cele mai frecvente resturi prezente în pozițiile de flancare ale helixurilor. Aminoacizii bazici, cum sunt lizina și arginina prezintă o catenă laterală lungă, inserată în regiunea nepolară a membranei și o grupare bazică situată la suprafața membranei. Această topologie unică și schimbările funcționale pe care le induce sunt denumite metaforic ca efectul „snorkeling” (Fantini și Barrantes, 2013).

Modul în care colesterolul interacționează cu domeniul TM al unei proteine depinde de faza membranară în care se află. Deși colesterolul este concentrat în microdomenii lipidice împreună cu sfingolipidele, acesta este prezent și în afara acestor domenii membranare. Colesterolul este prezent și în faza a membranei plasmatice care prezintă concentrații mari de glicerofosfolipide, cum ar fi fosfatidilcolina. Există diferite posibilități de interacțiune a colesterolului cu domeniile TM, datorită faptului că acest sterol se află în ambele straturi ale bistratului lipidic. Explicarea mecanismelor moleculare implicate în această interacțiune necesită descrierea complexului colesterol/α-helix și a mediului lipidic/ proteină. În continuare vor fi prezentate diferitele tipuri de structuri proteice care sunt capabile să interacționeze cu colesterolul aflat în membrană (Fantini și Barrantes, 2013).

2.5.1. Domeniul CRAC al proteinelor

Cel mai popular domeniu de legare al colesterolului descris în literatura științifică este domeniul CRAC denumit și Cholesterol Recognition/interaction Amino acid Consensus sequence, adică domeniul de recunoaștere al colesterolului pentru interacțiunea cu secvența consens a aminoacizilor. Domeniul CRAC prezintă de la capătul N-terminal la cel C-terminal următoarea secvență: un rest nepolar de valină sau leucină urmat de 1-5 resturi de aminoacid, apoi un rest aromatic care trebuie să fie tirozina, din nou un segment alcătuit din 1-5 resturi de aminoacid, iar în final un aminoacid bazic cum ar fi arginina sau lizina. În codul cu o singură literă al aminoacizilor, această secvență poate fi scrisă ca (L/V)-X1−5-(Y)-X1−5-(K/R), schematic reprezentat în figura nr.5. Acest domeniu a fost găsit în structura multor proteine ce leagă colesterolul și în multe cazuri această interacțiune a fost confirmată de abordări fizico-chimice. În plus, mutații la nivelul domeniului CRAC scad semnificativ sau chiar distrug această interacțiune. În cazul restului central aromatic care trebuie să fie tirozina, aceasta nu poate fi înlocuită cu niciun alt aminoacid aromatic. Deși cu ajutorul domeniului CRAC se poate identifica modul în care colesterolul se poate lega la domeniul TM, acesta poate să se lege diferit la nivelul domeniului CRAC. În acest fel, colesterolul își ajustează forma în funcție de structura tridimensională a TM (Palmer, 2004; Jamin și colab., 2005; Fantini și Barrantes, 2013).

Figura nr. 5. Geometria complexului CRAC-colesterol. Motivul este orientat din direcția capătului N-terminal (sus) spre capătul C-terminal (jos). Motivul CRAC prezintă trei zone distincte, nepolară în albastru, aromatică în galben și cationică în roz. Toate aceste zone se potrivesc cu structura chimică a colesterolului (Fantini și colab., 2019). Figură adaptată după Fantini și colab., 2019.

Un alt lucru care trebuie luat în considerare pentru interacțiunile la nivelul domeniului CRAC este faptul că acesta prezintă la capătul N-terminal un rest de aminoacid nepolar și la capătul C-terminal un rest de aminoacid polar. Din acest motiv, dacă un domeniu CRAC interacționează cu colesterolul, trebuie îndeplinite mai multe condiții. În primul rând, restul de aminoacid bazic de la capătul C-terminal trebuie să fie situat la interfața lipid-apă pentru ca interacțiunea cu structura membranei să fie optimă. Astfel, dacă domeniul TM este inserat în membrană din direcția capătului N-terminal spre cel C-terminal, atunci domeniul CRAC va interacționa cu colesterolul aflat în stratul citoplasmatic al membranei. În schimb, dacă domeniul TM este inserat în direcția opusă în membrană, atunci domeniul CRAC va interacționa cu colesterolul aflat în stratul extern al membranei. În ambele cazuri, resturile de aminoacizi ale segmentelor variabile care separă valina și leucina de tirozină, și tirozina de lizină și arginină pot varia, dar trebuie să fie resturi de aminoacizi nepolari , deoarece sunt încorporați în zona nepolară a membranei. În definiția inițială a domeniilor CRAC, resturile de aminoacizi X pot proveni de la orice aminoacid, deoarece nu a fost luat în considerare faptul că acest domeniu poate fi inserat în membrană. În cazul domeniului CRAC care aparține de domeniul TM al proteinei, definiția ar trebui să fie limitată la (L/V)-X1−5-(Y)-X1−5-(K/R), unde X sunt resturi de aminoacizi nepolari compatibili cu mediul hidrofob. Dacă nu se ține cont de acest lucru, algoritmul CRAC ar putea prezice existența unui potențial domeniu de legare al colesterolului, dar care se află în exteriorul membranei plasmatice (Oddi și colab., 2011; Sengupta, 2012; Fantini și Barrantes, 2013).

2.5.2. Domeniul CARC al proteinelor

Domeniul CARC de legare al colesterolului este asemănător cu domeniul CRAC, dar orientarea lanțului peptidic este opusă, mai exact, acest domeniu este domeniul CRAC inversat. Secvența este reprezentată astfel (K/R)-X1−5-(Y/F)-X1−5-(L/V), pornind de la capătul N-terminal spre capătul C-terminal. Pe lângă diferențele legate de orientare, cele două domenii se mai deosebesc prin faptul că domeniul CARC poate avea ca aminoacid aromatic și tirozina și fenilalanina, domeniul CARC fiind schematic reprezentat în figura nr.6. Practic, secvența de aminoacizi este reprezentată, de la capătul N-terminal spre capătul C-terminal, de un rest de aminoacid bazic, cum ar fi lizina sau arginina, un aminoacid aromatic care poate fi tirozina sau fenilalanina și un rest alifatic, cum ar fi leucina sau valina. Existența aminoacidului bazic asigură poziționarea corectă a motivului CARC, exact la interfața polar-nepolar a domeniului TM, unde ar trebui să se afle colesterolul. Acest lucru se datorează efectului ,,snorkeling” menționat mai sus, ce poate fi atribuit faptului că lizina și arginina prezintă o catenă laterală lungă și flexibilă inserată în regiunea hidrofobă a membranei, în timp ce gruparea cationică este prezentă la suprafața membranei. În plus, resturile de lizină și arginină sunt mai des întâlnite la nivelul capătului N-terminal decât la capătul C-terminal, ceea ce indică faptul că acest fenomen de snorkeling este asimetric ( Strandberg, 2003; Baier și colab., 2011; Fantini și Barrantes, 2013).

Figura nr. 6. Geometria complexului CARC-colesterol. Motivul este orientat în direcția capătului N-terminal (sus) spre capătul C-terminal (jos). Legenda este ca cea de la figura nr.5 (Fantini și colab., 2019). Figură adaptată după Fantini și colab., 2019.

Pentru a putea identifica un motiv funcțional CARC aparținând domeniului TM, aminoacidul bazic din prima poziție este esențial, chiar dacă nu interacționează cu colesterolul. Din acest motiv, domeniul CARC, care prezintă o ordine inversă a aminoacizilor, nu aparține mereu domeniilor TM . În plus, restul de tirozină, care este absolut necesar pentru CRAC, poate fi înlocuit cu fenilalanina la nivelul domeniului CARC. În cazul domeniului CARC, interacțiunea dintre aminoacidul aromatic și molecula de colesterol are loc în regiunea nepolară a membranei, departe de gruparea hidroxil a colesterolului. Această interacțiune cu colesterolul este mediată de aranjamentele de stivuire dintre gruparea aromatică a aminoacidului (tirozină sau fenilalanină) și unul dintre inelele sterolice ale colesterolului. Este de remarcat faptul că același domeniu TM poate prezenta atât o secvență CRAC, cât și o secvență CARC, ceea ce permite legarea simultană a două molecule de colesterol, atunci când este cazul (Barrantes și colab., 2010; Fantini și Barrantes, 2013).

CAPITOLUL II.

DINAMICA TRANSPORTORULUI DE SEROTONINĂ

3.1. Familia de transportori SLC6

Familia de transportori solute carrier 6 sunt co-transportori activi secundari care utili-zează gradientul chemo-osmotic al ionilor de sodiu pentru a cupla transportul acestora cu transportul substratului lor prin biomembrane. Unii dintre membrii acestei familii co-transportă ioni de clor și de aceea au fost numiți inițial transportori dependenți de sodiu și clor. Pe baza substratului pe care aceste molecule îl transportă, membrii acestei familii de transportori au fost împărțiți în patru subgrupe, dintre care o subgrupă este reprezentată de transportorii neurotransmițătorilor care includ transportorul acidului gama-aminobutiric (GAT), doi transportori ai glicinei (GLYT) și transportorii dopaminei (DAT), serotoninei (SERT) și ai norepinefrinei (NET), reprezentați în figura nr.7. Celelalte subgrupe sunt cele ale transportorilor aminoacizilor, transportorilor osmoliți și transportorii creatinei (Kristensen și colab., 2011; Pramod și colab., 2013).

Figura nr. 7. Structurile chimice ale substraturilor endogene ale transportorilor familiei SCL6 și stoechiometria ionilor de sodiu și clor pentru recaptarea neurotransmițătorului. Transportorii pentru serotonină, norepinefrină și dopamină sunt reprezentați în albastru și pot utiliza unul sau doi ioni de sodiu și unul de clor pentru a recapta neurotransmițătorii. Transportorii pentru acidul γ-aminobutiric (GABA) sunt de patru tipuri, schematic reprezentați cu culoarea roșie și pot utiliza 2 sau 3 ioni de sodiu și 1 sau 2 ioni de clor pentru recaptarea acidului γ-aminobutiric. Ultimii tansportori reprezentați sunt cei care recaptează glicina, în culoare verde. Aceștia pot utiliza 2 sau 3 ioni de sodiu și un ion de clor pentru recaptarea aminoacidului. Figură adaptată după Kristensen și colab., 2011.

NET, DAT și SERT se găsesc în principal la nivelul creierului. NET și SERT au de asemenea o localizare la nivelul celulelor cromatinice suprarenale, mastocitelor și trombocitelor din sânge. Acești transportori reglează multe funcții ale sistemului nervos central inclusiv învățatul, somnul, atenția, apetitul, mișcarea. Pe lângă transportul substraturilor endogene, transportorii monoaminici pot transloca neurotoxine și amfetamine. Printre inhibitorii selectivi ai acestor transportori sunt incluși și analogi ai cocainei, benztropina și medicamente împotriva depresiei (Pramod și colab., 2013).

Deși au fost înregistrate progrese importante în ceea ce privește modul în care transportorii SLC6 pot fi reglați, este clar că mecanismele implicate în aceste procese sunt complexe și multifuncționale și pot fi ușor diferite în funcție de membrii acestei familii. Este nevoie de o analiză mult mai complexă pentru a putea elucida modul în care aceste elemente reglatoare interacționează și duc la alterarea funcției transportorului. În plus, au fost identificate mai multe variante de codare ale transportorilor SLC6. Polimorfismele de la nivelul lui SERT și DAT au fost asociate cu tulburări psihice, dintre care autismul, bipolaritatea și deficitul de atenție. Multe dintre mutațiile identificate sunt prezente la nivelul capetelor N- și C-terminale în apropierea multor componente reglatoare ale acestor transportori. Aceste lucruri sugerează faptul că mutațiile sunt capabile de modificarea mecanismelor de reglare și, drept urmare, poate fi compromisă semnalizarea sinaptică, ceea ce duce la tulburări psihice (Hahn și Blakely, 2007; Pramod și colab., 2013).

3.1.1. Transportorul de serotonină (SERT)

Serotonina sau 5-HT modulează activitatea sistemului nervos central, dar și procese din întregul corp, de la funcția sistemului cardiovascular la cea a sistemului digestiv, endocrin sau reproducător. Această moleculă a fost descoperită la sfârșitul anilor 1940, fiind o moleculă de semnalizare. Serotonina este sintetizată în creier, din aminoacidul triptofan și distribuită la aproape toate regiunile majore din creier. Aceasta este eliberată în fanta sinaptică de unde difuzează pentru a activa receptorii specifici serotoninei. Aceștia aparțin grupului de receptori cuplați cu proteine G care participă la neurotransmisia atât inhibitorie cât și excitatorie. Pe lângă aceste lucruri, receptorii serotoninei sunt implicați și în modularea eliberării multor neurotransmițători, dar și a hormonilor. Astfel, semnalizarea serotonergică este implicată în procesele neurologice precum somnul, starea de spirit, cogniția, foamea, durerea și comportamentul agresiv (Berger și colab., 2009; Coleman și colab., 2016).

Transportorul de serotonină sau SERT este membru al familiei de transportori NSS (neurotransmitter sodium symporter). Termenul de simport reprezintă transportul a două molecule sau ioni diferiți, în aceeași direcție, printr-o membrană, utilizând un mecanism de transport comun. Din familia NSS fac parte și transportorii dopaminei și norepinefrinei, cunoscută și ca noradrenalină. Transportorii din această familie sunt responsabili de recaptarea dependentă de sodiu și clor a neurotransmițătorilor, astfel terminându-se semnalizarea aminelor biogenice. În plus, SERT este inclus și în familia transportorilor SLC6 . Această familie a transportorilor conține proteine ce transportă aminoacizi sau derivați ai aminoacizilor în celulele corpului și își exercită funcția prin cuplarea cu un ion de sodiu (Coleman și colab., 2016; Schumann-Gillett și colab., 2019).

SERT este o proteină membranară integrală, care este implicată în eliminarea serotoninei din fanta sinaptică, după eliberarea acestui neurotransmițător. Serotonina se acumulează în celule prin intermediul co-transportului ionilor de sodiu și clor și contra-transportului ionilor de potasiu. Modificări endogene care pot afecta activitatea SERT pot proveni de la interacțiunea transportorului cu proteine reglatoare sau din modificări post-translaționale reversibile. Până în prezent, reglajul expresiei SERT la nivelul membranei plasmatice putea fi inhibat prin activarea protein kinazei G, urmată de creșterea concentrației ionilor de calciu intracelular. Pentru a-și îndeplini funcția de a elimina serotonina extracelulară, SERT trebuie să fie introdus în membrana plasmatică într-o formă activă. Din acest motiv, poate fi necesară orientarea SERT către anumite regiuni din membrana plasmatică. Studiile despre cum asimetria este generată și menținută în celulele polarizate au schimbat conceptele vechi despre membranele plasmatice. Conform modelului mozaicului fluid, bistratul lipidic poate fi un solvent bidimensional pentru proteinele membranare. Cu toate acestea, în modelele bistraturilor lipidice, lipidele pot exista sub două forme: sub formă lichid-ordonată sau lichid-dezordonată. Acest model a fost confirmat pentru membranele celulare, unde stratul exoplasmic al membranei conține microdomenii lipidice bogate în colesterol și sfingolipide. S-a demonstrat că pentru stabilizarea structurii SERT este nevoie de colesterolul membranar. Epuizarea colesterolului poate duce la reducerea în mod reversibil a legării ligandului la moleculele de SERT exprimate în celulele insectelor sau în celulele HEK (human embryonic kidney). În ambele cazuri, funcția transportorului poate fi salvată parțial prin înlocuirea colesterolului, dar nu cu alți steroli (Brown și London, 1998; Rietveld și Simons, 1998; Magnani și colab., 2004).

3.1.2. Mecanismul de acțiune al SERT

Pentru a înțelege în detaliu mecanismul unui transportor ca SERT, este nevoie de cunoașterea a patru proprietăți cheie ale proteinei:

Natura situsului de legare. Acesta determină modul în care SERT poate transporta selectiv un substrat. În cazul transportorului de serotonină, unde ionii sunt co-transportați cu substratul, poziționarea relativă a situsurilor de legare a ionilor și a substratului poate fi critică pentru cuplare;

Căile care sunt utilizate de substrat și de ioni pentru a ajunge dintr-o parte a membranei la situsul de legare și apoi în partea cealaltă a membranei. Aceste căi trebuie să fie strâns legate între ele, astfel încât să nu fie ambele deschise în același timp. Dacă acestea sunt deschise simultan, se va forma un flux necuplat cu transportorul;

Modificări conformaționale care duc la închiderea accesului dintr-o parte a membranei și la deschiderea accesului din partea cealaltă a membranei. Aceste procese sunt necesare pentru ca translocarea să aibă loc;

Controlarea modificărilor conformaționale, astfel încât acestea să aibă loc doar când liganzii corespunzători sunt legați la situsurile de legare. În caz contrar, transportorul ar cataliza fluxul oricărui ligand care ocupă aceste situsuri (Rudnick, 2006).

Cele 2 mecanisme importante pentru transport sunt numite simport și antiport. Acestea cuplează mișcările a două molecule care se mișcă în aceeași direcție prin membrană în cazul simportului și în direcții opuse în cazul antiportului. În cazul simportului, două sau mai multe molecule se leagă la transportorul aflat într-o conformație inițială. Pentru a putea elibera moleculele în partea opusă a membranei, transportorul își modifică conformația. În cazul antiportului, legarea unei molecule facilitează conversia conformației transportorului la o formă orientată spre partea opusă a membranei. După disocierea primei molecule, legarea celei de-a doua molecule permite schimbarea conformației în direcție inversă. În acest mod, a doua moleculă este eliberată pe partea membranei de unde a provenit prima moleculă (Rudnick, 2006).

SERT catalizează o reacție complexă care încorporează atât simportul cât și antiportul. În transportul serotoninei, SERT leagă un ion de sodiu, unul de clor și o moleculă de serotonină într-un raport stoichiometric de 1:1:1. De abia în urma legării acestor molecule are loc schimbarea conformațională care reține moleculele la nivelul situsului de legare din mediul extracelular și le expune citoplasmei. Disocierea ionilor și a moleculei de serotonină permite transportorului să se întoarcă la conformația inițială, dar numai după ce leagă un ion de potasiu citoplasmatic, pe care îl va elibera în mediul extracitoplasmatic. Stoichiometria totală a procesului este un schimb electroneutru de 1:1:1:1 al potasiului cu un ion de sodiu, de clor și o moleculă de serotonină, reprezentată în figura nr.8 (Rudnick, 2006).

Figura nr. 8. Mecanismul transportorului de serotonină. Transportul serotoninei împreună cu ionii de sodiu și clor necesită legarea tuturor moleculelor la transportor. Aceste evenimente ale legării sunt ilustrate în primii trei pași ai figurii. Nu există nicio dovadă că legarea are loc în această ordine. Doar după ce cele trei molecule sunt legate, transportorul poate suferi o serie de modificări conformaționale care restricționează accesul la mediul extracelular și expune situsurile de legare, la citoplasmă. Această schimbare conformațională este expusă în partea dreaptă a figurii. După disocierea serotoninei și ionilor la nivelul citoplasmei, descrisă în cei trei pași din partea de jos a figurii, un ion de potasiu citoplasmatic se poate lega la transportor (stânga jos). În momentul legării , SERT este capabil să sufere o altă serie de modificări conformaționale care restricționează accesul la citoplasmă și expune situsul de legare la mediul extracelular. Disocierea închide ciclul (Rudnick, 2006). Figură adaptată după Rudnick, 2006.

3.2. SERT în microdomeniile lipidice

Organizarea laterală a membranelor în microdomenii lipidice prezintă un interes deosebit pentru funcția proteinelor membranare, deoarece s-a dovedit că aceste microdomenii pot încorpora sau exclude selectiv proteinele membranare. Există date biochimice și morfologice care pot confirma faptul că SERT este asociat cu microdomeniile lipidice și că această asociere este necesară pentru ca proteina să își îndeplinească funcția. Ipoteza microdomeniilor lipidice sugerează că separarea fazelor duce la agregarea colesterolului, sfingolipidelor și proteinelor, formând microdomenii distincte la nivelul membranelor, acestea fiind insolubile în detergenți neionici (Schroeder și colab., 1998; Magnani și colab., 2004).

Prin diferite experimente, a fost examinată prezența SERT în membrane solubilizate cu diferiți detergenți ionici, cum ar fi Triton X-100. S-a observat că SERT este parțial solubil și în Brij 58, Tween 20 sau Tween 80. Se cunoaște faptul că structura detergenților poate afecta gradul de solubilizare al SERT, iar din acest motiv, profilurile de flotație ale SERT au fost diferite în funcție de detergentul utilizat în experiment. Acest lucru poate rezulta și din proprietățile diferențiale ale detergenților de a se insera la nivelul lipidelor din microdomenii. Acest lucru va duce la izolarea unor subpopulații de microdomenii, fiecare dintre acestea caracterizată printr-o compoziție specifică de lipide. În urma experimentului, s-a observat că microdomeniile lipidice izolate cu ajutorul detergentului Brij 58 conțineau de 10 ori mai multe fosfolipide decât microdomeniile izolate cu Triton-X (Röper și colab., 2000; Magnani și colab., 2004).

Mai departe, experimentul a arătat faptul că dezagregarea microdomeniilor prin deleția colesterolului afectează viteza maximă a transportului serotoninei. Acest lucru s-ar putea datora faptului că se reduce numărul transportorilor localizați la nivelul membranei plasmatice sau se reduce numărul de molecule de serotonină transportate pe unitatea de timp. Din datele experi-mentului, se poate ajunge la concluzia că SERT necesită asocierea cu microdomeniile lipidice pentru a putea cataliza transportul serotoninei. În cazul în care SERT nu interacționează cu microdomeniile lipidice, pot avea loc modificări conformaționale ale transportorului, care afectează în principal translocarea substratului la nivelul membranei plasmatice. Modificările proprietăților fizice ale microdomeniilor, cum ar fi grosimea bistratului lipidic, poate duce la schimbarea conformației transportorului de la una activă la una inactivă, similară cu cele din cazul canalelor ionice. Deși capacitatea serotoninei de a se lega la SERT nu este alterată, transportorul este grav afectat. Asocierea cu microdomeniile lipidice ar putea fi importantă pentru schimbările conformaționale asociate cu procesul de translocare, care implică pașii ulteriori legării serotoninei. Astfel de modificări pot fi cauzate fie printr-o pierdere a interacțiunii directe cu colesterolul sau prin pierderea interacțiunii dintre SERT și alte proteine asociate microdomeniilor lipidice. (Schuck și colab., 2003; Magnani și colab., 2004).

La nivelul neuronilor, SERT are rolul de a recapta serotonina eliberată la nivelul membranei presinaptice. S-a demonstrat că SERT este prezent la nivelul axolemei și la nivelul butonilor terminali și în cantități scăzute la nivelul membranei dendritelor. Acest lucru demonstrează că funcția transportorului este strâns legată de poziția acestuia de la nivelul membranei. SERT prezent la nivelul membranei poate fi găsit la echilibru între forma activă asociată microdomeniilor lipidice și forma inactivă prezentă în afara microdomeniilor. Distribuția acestora la nivelul membranei poate depinde de condițiile fiziologice, de exemplu, conformația activă a SERT ar putea fi preferată în urma eliberării neurotransmițătorului (Tao-Cheng și Zhou, 1999; Magnani și colab., 2004).

3.3. Efectul colesterolului asupra SERT

Compoziția lipidelor de la nivelul membranei, în care sunt încorporate proteinele membranare, este cunoscută prin faptul că poate modula activitatea diferitelor proteine, cum ar fi proteinele receptoare. Pentru a obține informații legate de proprietățile colesterolului asupra funcției transportorului serotoninei, au fost măsurate: activitatea de transport a substratului și proprietățile de legare ale antagonistului la diferite concentrații de colesterol membranar. Măsurătorile au fost făcute pentru SERT exprimat în celulele HEK. Pentru a fi distinse interacțiunile transportor-colesterol de efectele fluidității membranei, au fost folosite diverse metode pentru a epuiza colesterolul membranar. O primă metodă utilizată a fost modificarea conținutului în colesterol al membranei printr-un tratament cu MβCD (Methyl-β-cyclodextrin), cunoscut pentru proprietățile sale de a extrage colesterolul. Complexele formate de MβCD cu colesterolul pot fi folosite prin inserarea acestora în membranele sărace în colesterol. O altă metodă de modificare a concentrației colesterolului membranar a fost de a incuba membrana cu enzima de transformare a colesterolului, colesterol oxidaza. Această metodă a permis analizarea funcțiilor transportorului la o fluiditate constantă a membranei. Cea de-a treia metodă utilizată pentru evaluarea dependenței activității SERT de colesterol a fost prin tratarea membranelor cu filipin fluorocrom. Filipinul este un antibiotic care formează complexe cu colesterolul la nivelul membranelor, astfel modificând distribuția fizică a sterolului, fără a îndepărta colesterolul din membrană și fără a provoca modificări chimice la nivelul acestuia (Klein și colab., 1995; Gimpl și colab., 1997; Scanlon și colab., 2001).

Toate aceste trei tratamente au dus la reducerea colesterolului până la concentrații care nu sunt toxice pentru celule și la pierderea afinității SERT pentru substrat și pentru legarea antagoniștilor. Aceste rezultate indică faptul că există proteine membranare ale căror stări conformaționale depind de interacțiunea directă a polipeptidei cu colesterolul. În plus, în cazul transportorului de serotonină, atunci când colesterolul este legat la acesta, substratul și antagonistul au o afinitate mai mare de legare. Eliminarea colesterolului din membrană până la concentrații netoxice duce la reducerea vitezei maxime a transportului de serotonină. Acest lucru este în concordanță cu inducerea conformației optime pentru transport a SERT prin interacțiunea cu colesterolul (Scanlon și colab., 2001).

Colesterolul are un rol fundamental în menținerea structurii membranelor plasmatice, schematic reprezentat în figura nr.9. În creierul matur, colesterolul face parte din aparatul de exocitoză de la nivelul butonilor terminali presinaptici și în biogeneza și transportul veziculelor sinaptice. Microdomeniile bogate în colesterol sunt prezente și la nivelul membranelor veziculare. Pe lângă aceste lucruri, cantități mari de colesterol au fost găsite și în membrana postsinaptică, în vecinătatea diferitelor grupuri de receptori ai neurotransmițătorilor. Prin urmare, se poate spune că moleculele de colesterol prezintă un rol important în sistemul serotoninei. O ipoteză prezentată este că o concentrație scăzută de colesterol seric duce la reducerea vâscozității microdomeniilor lipidice de la nivelul membranelor celulelor neuronale. Drept consecință, expunerea receptorilor serotoninei poate fi afectată scăzând durata de viață a transportorilor de serotonină. Mai precis, SERT trebuie să fie introdus activ în membrana presinaptică pentru a-și putea efectua funcția. (Wallner și Machatschke, 2009).

Figura nr. 9. Consecințele scăderii aportului alimentelor bogate în colesterol și în energie. Reducerea consumului de alimente bogate în glucoză duce la reducerea furnizării de energie pentru sinteza autonomă a colesterolului cerebral. Împreună cu o scădere a absorbției complexelor lipoproteine-colesterol și a glucozei, aceste procese duc la reducerea colesterolului din membranele sinaptice. Consecințele unei lipse prelungite a acestor alimente sunt reprezentate printr-un model în patru etape ale efectelor de destabilizare ale membranei plasmatice: a)intactă- în acest caz, recaptarea serotoninei are loc în condiții normale. b)ușor afectată- concentrațiile de colesterol scad, ceea ce duce la scăderea activității SERT. Drept consecință, mecanismul de recaptare presinaptic al serotoninei începe să eșueze, marcat cu X. Concentrația serotoninei (punctele roșii) va crește la nivelul fantei sinaptice. c)afectată- o lipsă susținută a alimentelor bogate în colesterol, va scădea concentrația colesterolului de la nivelul membranei presinaptice. Ca rezultat, concentrația serotoninei de la nivelul fantei sinaptice scade. d)grav afectată- scăderea continuă a concentrației serotoninei determină o scădere treptată a activității subtipurilor de receptori (sfera neagră- receptori intacți, sfera albă- receptori afectați). Aceste afecțiuni vor activa agresiunea impulsivă (Wallner și Machatschke, 2009). Figură adaptată după Wallner și Machatschke, 2009.

3.4. Reglarea funcției transportorului de serotonină

Un mecanism de reglare al SERT are legătură cu traficul și biodisponibilitatea transportorului la nivelul unor subdomenii membranare. Primele dovezi legate de această afirmație provin din studii legate de epuizarea colesterolului de la nivelul celulelor membranelor HEK293 unde SERT este exprimat în mod normal. În urma deleției colesterolului, activitatea SERT a scăzut, iar moleculele transportorului de serotonină au fost repartizate într-o subpopulație a membranei plasmatice numită microdomeniu lipidic. Colesterolul prezent în bistratul lipidic afectează conformația transportorului și parametrii săi cinetici de transport. Aceste lucruri au loc datorită legării colesterolului la situsul conservat de legare al colesterolului din structura SERT, localizat între domeniile hidrofobe TM1a, TM5 și TM7 (Laursen și colab., 2018; Baudry și colab., 2019).

Pe lângă colesterol, activitatea SERT și transportul serotoninei la nivelul membranei plasmatice pot fi influențate și de fosfatidilinozitol- 4,5-bifosfat (PIP2). Legarea PIP2 la SERT localizat la nivelul reticulului endoplasmatic, duce la oligomerizarea SERT prin vizarea homooligomerilor SERT de la suprafața celulelor. În concluzie, PIP2 are un efect pozitiv asupra activității SERT, prin legarea sa la nivelul transportorului. Efectul PIP2 asupra SERT membranar este in prezent necunoscut, deoarece nivelul PIP2 scade la nivelul membranei datorită conversiei sale în inozitol trifosfat (IP3) și diacilglicerol (DAG) sub acțiunea fosfolipazei C (Anderluh și colab., 2017; Baudry și colab., 2019).

Din punct de vedere structural, capătul carboxi terminal al SERT este un domeniu critic, necesar pentru ca SERT să fie transportat la nivelul membranei plasmatice. Moleculele SERT care sunt truncate la nivelul capătului C-terminal, prin eliminarea a 17-30 resturi de aminoacizi, nu prezintă glicozilarea completă. Deoarece nu prezintă o glicozilare matură, moleculele SERT nu pot ajunge la suprafața celulelor în timpul procesului de sinteză sau în timpul procesului de secreție. Subdomenii specifice localizate la nivelul capătului C-terminal influențează plierea transportorului și formarea unui locus de ancorare pentru o componentă a proteinei de acoperire. Această proteină are rolul de a exporta SERT din reticulul endoplasmatic în membrana plasmatică ( Baudry și colab., 2019).

Pe de altă parte, interacția directă dintre capătul C-terminal al SERT și integrina αIIbβ3 activă îmbunătățește activitatea transportorului care este corelată cu creșterea expresiei SERT la suprafața celulelor HEK293. Înțelegerea interacțiunii funcționale dintre transportorul de serotonină și integrina β3 a oferit dovezi ale modulării strânse a unei subpopulații de SERT de către subtipul receptorului pentru integrina αvβ din creier. Epuizarea parțială a subunității β3 a integrinei neuronale duce la reducerea transportului serotoninei mediată de SERT, prin reducerea numărului de molecule SERT active de la nivelul creierului șobolanilor. În acest context, polimorfismul integrinei umane β3 a fost sugerat să prezinte un impact asupra receptivității unor pacienți la medicamentele ce reprezintă inhibitori selectivi ai recaptării serotoninei (SSRIs) (Mazalouskas și colab., 2015; Baudry și colab., 2019).

Asocierea SERT cu diverse proteine, la regiuni diferite față de capătul C-terminal, s-a dovedit că influențează traficul transportorului. O astfel de proteină este și proteina membranară secretorie carrier 2, care interacționează cu capătul N-terminal al SERT. Această interacțiune duce la redistribuirea subcelulară a SERT, cu o scădere a densității acestuia la suprafața celulei. Alte proteine, ale căror situs de legare la SERT încă nu a fost descoperit, au de asemenea un impact asupra localizării SERT. α-sinucleina, o proteină cunoscută pentru implicațiile în boala Parkinson, se leagă la SERT prin interacții directe proteină-proteină și promovează internalizarea SERT , ceea ce duce la reducerea recaptării serotoninei (Müller și colab., 2006; Wersinger și colab., 2006; Wersinger și Sidhu, 2009).

3.5. Medicamente care au efect asupra funcției SERT

Depresia face parte din categoria bolilor mentale comune, iar potrivit Organizației Mondiale a Sănătății, peste 350 de milioane de oameni suferă de această boală. Tulburarea depresivă majoră (MDD) sau depresia unipolară este reprezentată doar de episoade depresive și deși patogeneza acestei boli a fost studiată în detaliu, nu se poate spune că există un mecanism clar responsabil pentru dezvoltarea acestei boli. Există mai multe teorii care țin de neurotransmițători, cea mai populară fiind teoria monoaminelor. Din această categorie fac parte serotonina, noradrenalina și dopamina. Cel mai comun tratament se bazează pe medicamentele care influențează aceste monoamine, în principal serotonina. Recent, au fost concepute medicamente care acționează asupra transportorului de serotonină și asupra diverșilor receptori monoaminergici. SSRIs sunt medicamentele de bază ale tratamentului tulburărilor stării de spirit deși nu limitează remisia bolilor (Mathew și colab., 2008; Taciak și colab., 2018).

SSRI sunt cele mai prescrise antidepresive. Acestea sunt de obicei prescrise pentru tratarea depresiei ușoare și a depresiei moderate, a tulburărilor de anxietate, migrenelor și a altor dureri neuropatice. SSRI inhibă acțiunea SERT prin interacțiunea lor cu grupările sulfhidrice ale transportorului. Această interacțiune duce la o concentrație mai mare de serotonină la nivelul fantei sinaptice, prin urmare, mai multe molecule de serotonină se pot lega la receptorii postsinaptici (Taciak și colab., 2018).

Principalele medicamente care fac parte din clasa inhibitorilor selectivi ai recaptării serotoninei sunt citalopramul, escitalopramul, fluoxetina, paroxetina și sertralina. Acești compuși sunt utilizați pentru tratarea depresiei și a altor boli asociate depresiei și prezintă mai multe asemănări precum (Lochmann și Richardson, 2019):

Eficiență antidepresivă;

Eficiență în tulburările de anxietate;

O curbă doză-răspuns plană pentru eficiența antidepresivă;

O curbă doză-răspuns crescătoare pentru efecte adverse;

Un profil al efectelor adverse în concordanță cu agonismul excesiv al serotoninei;

Inhibiția recaptării serotoninei la doza cea mai scăzută administrată (Lochmann și Richardson, 2019) .

Scopul dezvoltării medicamentelor precum SSRI a fost acela de a proiecta un antidepresiv care inhibă atât potențial, cât și selectiv pompa de captare a serotoninei. Toate SSRI prezintă un mecanism asemănător de acțiune, blocând selectiv pompele de absorbție ale serotoninei, ceea ce are ca efect creșterea disponibilității serotoninei. Selectivitatea, în acest caz, este definită ca fiind o separare de cel puțin un ordin de mărime între efectele medicamentului asupra celui mai potent situs de acțiune și efectele asupra următorului cel mai puternic situs de acțiune. Pe scurt, medicamentele de acest tip sunt capabile să aibă efecte semnificative farmaceutice și clinice asupra țintei sale, fără a avea efecte asupra oricăror alte ținte (Lochmann și Richardson, 2019).

Primul pas în modul de acțiune al SSRI este legarea la moleculele SERT, care sunt localizate la suprafața neuronilor serotonergici. Drept rezultat, SSRI inhibă recaptarea dependentă de SERT a serotoninei înapoi în neuroni, astfel prelungind semnalizarea serotoninei, reprezentat în figura nr.10. Inhibarea activității SERT dependentă de SSRI crește semnalizarea serotoninei prin activarea crescută a receptorilor postsinaptici ai serotoninei. Al doilea pas al activității SSRI este reprezentat de procesele de întârziere și adaptare care includ (Etievant și colab., 2020):

Reducerea moleculelor SERT funcționale și disponibile la suprafața neuronilor serotonergici;

Desensibilizarea receptorilor serotoninei;

Îmbunătățirea plasticității neuronale afectate sau deteriorate în timpul progresiei tulburării depresive.

Administrarea SSRI ce are loc în etapa a doua este un eveniment dependent de timp și de concentrația SSRI. În principal, redistribuirea transportorilor către compartimentele intracelulare în timpul tratamentului cu SSRI, scade numărul transportorilor care preiau serotonina după eliberarea în fanta sinaptică (Etievant și colab., 2020).

Figura nr. 10. Prezentarea generală a mecanismelor moleculare de recaptare a serotoninei (5-HT) în creier. SERT este prezent mai ales în neuronii presinaptici, în timp ce receptorii serotoninei (5-HTR) sunt localizați în principal în membranele neuronilor postsinaptici și sunt cuplați cu proteina G. În lipsa SSRI, serotonina se leagă la SERT, iar apoi este reciclată în interiorul neuronului presinaptic. Aceste lucruri sunt reprezentate în schema a. În schema din dreapta, b, SSRI se leagă la SERT și reglează activitatea acestuia, ducând la creșterea nivelului extracelular de serotonină (Fakhoury, 2016). În acest fel, nivelul serotoninei crește în afara neuronului. Același mecanism de acțiune îl prezintă SSRI și asupra transportorilor de serotonină care sunt localizați în apropierea fantei sinaptice. În acest fel, serotonina nu va mai fi recaptată și va avea o durată de viață mai lungă la nivelul fantei sinaptice. Figură adaptată după Fakhoury, 2016.

3.5.1. Efectul escitalopramului asupra SERT

Escitalopram este un antidepresiv utilizat la nivel global, prescris la mai mult de 240 milioane de pacienți, de la aprobarea lui în 2001. Ținta moleculară principală a escitalopramului

este reprezentată de transportorul de serotonină, acesta fiind responsabil pentru recaptarea serotoninei de la nivelul butonilor terminali și a somei neuronilor. Escitalopramul și restul SSRI inhibă funcția transportorului prin legarea lor la situsul activ al SERT, unde se leagă și substratul. Escitalopramul este enantiomerul S al citalopramului racemic. Citalopramul conține o cantiatate egală de enantiomer fără efect terapeutic, R-citalopram și S-citalopram, structurile lor fiind reprezentate în figura nr.11. Enantiomerul din urmă poate interacționa atât cu situsul activ al SERT, cât și cu situsul alosteric, în timp ce R-citalopramul prezintă o legătură mai slabă cu situsul activ. Afinitatea celor doi enantiomeri pentru situsul alosteric al transportorului este

aproximativ egală (Zhong și colab., 2012).

Figura nr. 11. Structurile chimice ale citalopramului, R-citalopramului și S-citalopramului. Diferența dintre S-citalopram și R-citalopram este reprezentată prin desenarea în mod diferit a legăturii dintre atomii de carbon ai ciclului și ai catenei laterale. În cazul R-citalopramului, legătura este hașurată și reprezintă faptul că aceasta se află în planul din spatele ciclurilor. În cazul S-citalopramului, aceasta este îngroșată, iar asta înseamnă că legătura se află în planul situat în fața planului ciclurilor. (sursă proprie)

Prin efectul exercitat de aceste medicamente, crește nivelul serotoninei la nivelul sinapselor, ceea ce duce la o neurotransmisie serotonergică îmbunătățită. Pe lângă situsul activ, SERT prezintă și unul sau mai multe situsuri alosterice. Un compus ca escitalopramul, care se poate lega la situsul alosteric, poate modula proprietățile situsului activ, fără a afecta direct recaptarea serotoninei. În acest sens, escitalopramul este un inhibitor alosteric al recaptării serotoninei (Zhong și colab., 2012).

Pe lângă legarea la SERT și inhibarea recaptării serotoninei, citalopramul duce și la internalizarea moleculelor transportorilor de serotonină în compartimentele intracelulare. Analize ale localizării SERT la nivelul suprafeței celulare în neuronii serotonergici proveniți de la celule stem, in vitro, au arătat faptul că S-citalopramul induce o redistribuție mai puternică a SERT departe de suprafața celulară, în comparație cu citalopramul racemic. Deși R-citalopramul este caracterizat de o afinitate scăzută pentru situsul alosteric al SERT, acesta duce la o scădere a numărului transportorilor de la suprafața celulelor neuronale. Acest lucru are loc când este administrat în doze mici, dar s-a observat că nu este la fel de eficient ca S-citalopramul sau citalopramul racemic (Etievant și colab., 2020).

PARTEA EXPERIMENTALĂ (IN SILICO)

CAPITOLUL III.

4.1. Scopul lucrării

Scopul lucrării a fost realizarea unor modele de membrane care conțin drept proteină transmembranară transportorul de serotonină, cu scopul de a le examina dinamica moleculară. Membranele au fost realizate cu două tipuri de transportori, diferiți din punctul de vedere al liganzilor. Unele membrane au fost construite cu SERT care prezintă drept ligand molecula de colesterol, iar celelalte membrane au fost construite cu SERT care nu prezintă colesterolul legat la transportor. Lipidele membranelor model corespund lipidelor ce se găsesc preponderent în microdomeniile lipidice. Aceste membrane au fost realizate astfel, pentru a observa comportamentul și funcția transportorului de serotonină atunci când se află în microdomeniile lipidice ale membranelor plasmatice.

Obiective:

Utilizarea programelor de dinamică moleculară pentru realizarea membranelor;

Realizarea fișierelor de tip pdb pentru SERT împreună cu colesterol și fără colesterol;

Transformarea fișierelor pdb în format CHARMM pentru a putea fi utilizate mai departe în construirea membranelor;

Construirea membranelor care conțin transportorul de serotonină.

4.2. Materiale și metode

Pentru realizarea membranelor au fost utilizate mai multe programe de dinamică moleculară. Fișierele introduse în aceste programe au fost procurate din bazele de date. Modul de lucru cu aceste programe a fost descris în următoarele subcapitole, în funcție de programul utilizat.

4.2.1. PDB

Primul pas realizat pentru construirea membranelor a fost acela de a alege ce moleculă de SERT va intra în compoziția membranelor. Pentru acest lucru, a fost accesată baza de date a proteinelor- Protein Data Bank (PDB) cu scopul de a selecta transportorul de serotonină. Această bază de date cuprinde structuri tridimensionale ale macromoleculelor biologice și ale complexelor acestor biomolecule, determinate experimental. PDB a fost înființată în 1971, devenind prima resursă digitală în științele biologice cu acces deschis. Datele din arhiva PDB sunt accesibile publicului fără a exista restricții de utilizare. Datele sunt publicate pe acest site fie după ce au fost validate fie, ca în cele mai multe cazuri, după ce au fost publicate într-o revistă științifică (Burley și colab., 2017).

Fiecare proteină înregistrată pe acest site prezintă un număr de identitate, care se numește PDB ID. Toate proteinele au un ID diferit și pot fi căutate sau recunoscute în baza de date după acesta.

Proteina aleasă din baza de date pentru a face parte din membrană este transportorul de serotonină ts3 complexat cu S-citalopram la situsul central și cu Br-citalopram la situsul alosteric. Acest SERT are PDB ID: 5i75 (Coleman și colab., 2016).

Pe lângă coordonate pentru structura transportorului de serotonină, în fișiere pdb există și coordonatele liganzilor. SERT ales prezintă următorii liganzi, prezentați în tabelul nr.1 sunt liganzii cu PDB ID și cu situsul de legare la SERT, în funcție de aminoacidul la care se leagă:

Tabel nr. 1. Liganzii prezenți în structura SERT (5i75)

Structura SERT-ului uman ales este cea a unui transportor de serotonină la care este legat S-citalopram , care prezintă o conformație deschisă spre exterior, cu medicamentul antidepresiv legat la situsul central, într-o cavitate formată din domeniile transmembranare- TM1, TM3, TM6, TM8, TM10. SERT prezintă 12 domenii TM. Transportorii ts2 și ts3 se suprapun bine, ceea ce demonstrează faptul că mutația suplimentară din construcția trasportorului ts3 nu perturbă substanțial structura activă a transportorului ts2. Denumirile de ts3 și ts2 reprezintă mutațiile pe care transportorii le prezintă la nivelul structurii primare. La nivelul SERT-ului, TM1 și TM6 adoptă conformații non-helicale scurte și contribuie la legarea inhibitorilor precum și la coordonarea ionilor de sodiu și clor. Conformațiile TM1 și TM6 nu sunt compatibile cu starea activă a transportorului, ceea ce înseamnă că moleculele antidepresive au blocat molecula într-o conformație deschisă spre exterior. Suprafața extracelulară a transportorului este alcătuită în mare parte din bucle extracelulare (EL). Aceste bucle fac ca o parte din suprafața extracelulară, mai exact 3,376 Å, să fie accesibilă solventului. La nivelul EL2 se formează o punte disulfurică între cisteina din poziția 200 și cisteina din poziția 209. În plus, EL2 mai conține două situsuri de N-glicozilare la nivelul Asn208 și Asn217. TM12 prezintă o buclă pronunțată la jumătatea membranei, iar la nivelul acestui domeniu există o moleculă de colesterol (Coleman și colab., 2016).

Structura SERT arată că la nivelul aminoacizilor există schimbări datorită polimorfismului nucleotidic și a mutațiilor asociate cu tulburările psihice. Majoritatea schimbărilor la nivelul resturilor de aminoacid au loc la interfața cu solventul sau cu lipidele, ceea ce afectează structura și funcția SERT-ului. Un exemplu de mutație este schimbarea restului de prolină din poziția 339 cu un rest de leucină (Pro339Leu), localizată la nivelul TM6, în apropierea situsului de legare a ligandului. Varianta care prezintă această mutație, prezintă și o activitate scăzută a transportorului. Pe de altă parte, alte mutații și polimorfisme asociate bolilor, inclusiv mutații la nivelul izoleucinei din poziția 425, Lys201Asn din EL2, Ser293Phe și Leu362Met de la nivelul TM5 și TM7 stimulează activitatea transportorului și îmbunătățesc transportul de serotonină. O altă clasă de mutații cum ar fi Phe465Leu de la nivelul TM9 și Leu550Val din TM11 destabilizează transportorul, iar mutația Lys605Asn de la nivelul capătului C-terminal afectează transportorul în așa fel încât să nu mai poată fi sensibil la reglarea prin protein kinaza G (Coleman și colab., 2016).

4.2.2. VMD

Pentru vizualizarea membranelor și fișierelor realizate, s-au utilizat mai multe programe de dinamică moleculară, unul dintre ele fiind VMD (Visual Molecular Dynamics). Acesta este un program conceput pentru vizualizarea și analiza ansamblurilor moleculare, în special al biopolimerilor, cum ar fi proteinele și acizii nucleici. VMD poate afișa în același timp orice număr de molecule sau structuri, folosind o mare varietate de stiluri și metode de colorare a acestora. Moleculele sunt afișate drept una sau mai multe reprezentări, iar fiecare dintre aceste reprezentări întruchipează o anumită metodă de redare specifică fiecărei molecule și o schemă de colorare pentru atomii selectați. Pe lângă acestea, VMD oferă o interfață grafică completă utilizată pentru controlul programului, precum și o interfață text folosind analizatorul încorporat Tcl. Această interfață din urmă permite utilizarea unor scripturi complexe cu substituție variabilă sau bucle de control. În plus, este acceptată înregistrarea completă a sesiunii de utilizare a programului, care produce un script de comandă VMD, folositor pentru o redare ulterioară. Imaginile de înaltă rezoluție ale moleculelor afișate în reprezentări pot fi produse prin generarea unor scripturi de intrare. Aceste scripturi pot fi apoi utilizate de o serie de aplicații de afișare ale imaginilor. Programul VMD a fost conceput și pentru a anima traiectorii ale simulărilor dinamicii moleculare (MD). Aceste dinamici moleculare pot fi importate fie din fișiere, fie dintr-o conexiune directă la o simulare ce rulează. După cum îi spune și numele, VMD este com-ponenta de vizualizare a MDScope, care este un set de instrumente ce rezolvă interactiv problemele din biologia structurală. Printre setul de instrumente se numără și alte programe, cum ar fi programul MD paralel, NAMD și software-ul MDCOMM utilizat pentru a conecta programele de simulare cu cele de vizualizare. VMD este scris în C++, folosind un design orientat pe obiecte și este disponibil gratuit prin World Wide Web (Humphrey și colab., 1996).

Pentru a introduce fișierul moleculei în VMD, din fereastra VMD Main, este aleasă opțiunea File, apoi New Molecule, iar în caseta Filename se introduce fișierul pdb care va fi vizualizat.

Toate reprezentările au fost realizate cu opțiunile programului VMD. Din meniul inițial este ales Graphics- Representations. Din fereastra nou apărută la opțiunea Selections este apoi selectat de la Singlewords- resname și apoi PDB ID-ul fiecărui ligand în parte. Acestea sunt comenzile care trebuie urmate pentru a selecta un anumit ligand din structura introdusă. De la Draw style în funcție de molecula aleasă este selectat Drawing Method și Coloring Method. Anticorpul este reprezentat cu opțiunea NewCartoon și cu ColorID 0, aceasta fiind culoarea albastră. La fel este reprezentat și transportorul, dar din figura nr.12 se poate observa că transportorul prezintă alfa helixuri și că la nivelul acestuia sunt prezenți și liganzii, iar anticorpul prezintă în structura sa foi beta pliate.

Figura nr. 12. A-Structura SERT (5i75), reprezentată cu ajutorul programului VMD; B- Strucura SERT c fără anticorp, doar cu colesterolul drept ligand (mov) și cu N-glicozilările pe care le prezintă (roșu)

Toți liganzii se leagă de transportor și au fost reprezentați cu Drawing Method (metoda de desenare) VDW, adică au fost desenate sferele lor Van Der Waals. Diferențele dintre aceștia sunt reprezentate de culorile alese și de localizarea lor la nivelul transportorului, deoarece fiecare prezintă un situs diferit de legare la SERT.

În tabelul nr.2 sunt prezentați liganzii reprezentați în figura nr.12, împreună cu ID-ul culorii utilizat în VMD pentru a realiza structura transportorului.

Tabel nr. 2. Liganzii transportorului în funcție de culoarea utilizată în reprezentarea lor

Utilizând în continuare programul CHARMM, fișierul pdb a fost editat pentru a putea avea un fișier pdb cu molecula de SERT, la care sunt legați doar liganzii de interes.

4.2.3. CHARMM-GUI

Înțelegerea funcționării sistemelor macromoleculare biologice, cum sunt proteinele, acizii nucleici sau membranele plasmatice, reprezintă un obiectiv major al cercetărilor realizate de bioinformaticieni. Ipoteza pe care sunt bazate modelele de calcul ale macromoleculelor biologice este aceea că dinamica sistemelor poate fi descrisă în termenii principiilor fizice de bază ce guvernează mișcările și interacțiile constituenților atomici ai sistemului. În acest fel, modelele au la baza lor legile fundamentale ale fizicii și chimiei, mecanica statistică și cuantică și electrostatica (Wu și colab., 2014).

CHARMM este un program de cercetare academică, fiind utilizat pe scară largă pentru dinamica și mecanica macromoleculară. Acesta prezintă instrumente de analiză și manipulare a coordonatelor atomice și a traiectoriei dinamicii. CHARMM-GUI, http://www.charmm-gui.org a fost dezvoltat cu scopul de a furniza o interfață grafică bazată pe web, pentru a genera diferite fișiere de input și sisteme moleculare. Acest lucru a dus la facilitarea și standardizarea utilizării tehnicilor de simulare în CHARMM. Internetul oferă o platformă ideală pentru construirea și validarea unui sistem de modelare moleculară într-o manieră interactivă. În modul acesta, dacă este constatată o problemă prin vizualizarea sistemului, este posibilă revenirea la configurația anterioară, pentru a regenera întregul sistem (Allouche, 2012).

a) CHARMM-GUI Input Generator

Obiectivul principal al proiectului este acela de a furniza fișiere de input CHARMM optime, astfel încât persoanele care utilizează acest program să poată descărca și rula fișierele pe calculatoarele lor locale. Opțiunea Input Generator, pentru generarea automată a fișierelor input, poate evita diversele greșeli banale făcute de obicei în scrierea fișierelor. În acest mod, calitatea calculelor poate fi controlată cu standardele generale și metode calificate. Este estimat că o astfel de generare de fișiere îi va ajuta pe utilizatori să citească și să modifice fișierele pentru input în scopul cercetărilor lor științifice. Prin urmare, se poate spune că Input Generator este nucleul CHARMM-GUI. Modul de operare este de a genera fișiere input și sisteme moleculare bazate pe parametrii reglabili ce prezintă instrucțiuni corespunzătoare și fișiere care pot fi descărcate în urma generării lor. La fiecare etapă prezentată în Input Generator utilizatorii au posibilitatea de a vizualiza în mod interactiv structurile generate pe browser, utilizând opțiunea integrată, de vizualizare online. Un avantaj semnificativ pe care acest program îl prezintă, este că, în cazul constatării unei probleme, utilizatorii se pot întoarce la pagina web anterioară. Acest lucru va duce la regenerarea întregului sistem, iar parametrii pot fi modificați, până la obținerea cu succes a sistemului model. Un exemplu ar fi atunci când sistemul generat este de dimensiuni prea mici sau prea mari în urma vizualizării, există posibilitatea de întoarcere la etapele anterioare pentru ca dimensiunea sistemului să fie ajustată. În fiecare etapă de generare a fișierelor de input, sunt efectuate calcule scurte la nivelul serverului principal CHARMM-GUI, pentru a verifica dacă fișierele de input și sistemele generate funcționează corespunzător. Există și posibilitatea apari-ției încetării anormale a sistemului, din cauza unor probleme. În acel moment, CHARMM-GUI va afișa un avertisment în care este explicată problema și va opri procedura (Allouche, 2012).

Pentru a putea construi membranele plasmatice ce conțin proteina noastră de interes, a fost nevoie de fișierul pdb al acestei proteine. Deoarece fișierul pdb inițial conținea toți liganzii asociați proteinei în momentul în care a fost determinată structura, a fost utilizat instrumentul PDB Reader, aflat în meniul CHARMM Input Generator.

b) PDB Reader

Citirea unui fișier pdb cu ajutorul unui program de simulare nu este simplă și poate reprezenta una dintre primele dificultăți care pot apărea pe parcursul procesului. În mod obișnuit, mai greu de introdus sunt stările de potențare ale unor reziduuri titrabile, a legăturilor disulfurice sau a modificărilor post-translaționale. Instrumentul PDB Reader pune la dispoziția utilizatorilor o interfață web flexibilă pentru a converti fișierele din format pdb în format CHARMM cu ajutorul mai multor opțiuni (Allouche, 2012):

-selecția parțială a lanțurilor proteice

-selecția grupării terminale

-selecția protonării

-selecția legăturilor disulfurice

-selecția fosforilărilor

-generarea unei unități biologice funcționale

-generarea unei împachetări de cristal

Deoarece numele unor reziduuri din formatul pdb nu se potrivește cu numele reziduurilor din format CHARMM, utilizatorii trebuie să verifice dacă toate reziduurile care sunt supuse citirii există și în fișierele de topologie charmm (Allouche, 2012).

Primul pas în utilizarea instrumentului este de a introduce fișierul pdb în site. Acest lucru se poate face fie prin încărcarea fișierului pe site, fie prin adăugarea PDB ID în caseta Download PDB File, pentru ca acesta să poată fi direct descărcat din baza de date. Acest pas introduce fișierele pdb în instrumentul PDB Reader pentru a putea fi citite și convertite mai apoi în fișiere pdb de tip CHARMM.

În următorul pas putem să alegem ce lanțuri peptidice și ce liganzi păstrăm pentru construirea fișierului CHARMM. În acest pas au fost alese moleculele folositoare pentru etapa următoare, ca în figura nr.13.

Figura nr. 13. Moleculele alese din fișierul pdb al SERT pentru a obține molecula transportorului care va fi introdusă în modelele de membrane. (sursă proprie)

Proteina cu SEGID (ID-ul segmentului) PROA, este SERT-ul, celelalte segmente, PROB și PROC fiind lanțurile proteice ale anticorpului utilizat la extragerea SERT. Pentru această proteină au fost păstrate glicozilările de la nivelul polipeptidei A, cu SEGID: CARA și CARB. Singurul ligand ales a fost colesterolul, numele reziduului în fișiere pdb fiind CLR. Mai departe, a fost făcut același lucru pentru alt fișier pdb al SERT, dar nu a mai fost ales ca ligand colesterolul. În final, au fost obținute două fișiere pdb: unul care conține coordonatele proteinei, glicozilărilor și colesterolului și un fișier care conține doar coordonatele proteinei și glicozilărilor.

Se poate observa că pe lângă segmentele alese, în această etapă, PDB Reader a citit toate coordonate liganzilor din fișierul PDB , fiecare având un PDB ID, SEGID și numele resturilor.

În următorul pas, au fost redenumite reziduurile alese, deoarece numele acestora din fișiere pdb nu se potrivesc cu cele din formatul CHARMM, iar pentru ca programul să poată scrie coordonatele pentru aceste resturi, trebuie să aibă același nume. În urma acestui pas, se obține fișierul pdb în format CHARMM, cu toate coordonatele moleculelor alese. În figura nr.14 este un fragment din fișierul obținut, împreună cu datele pe care acesta le conține.

Figura nr. 14. Fișierul pdb în format CHARMM al SERT. (sursă proprie)

În figură se poate observa conținutul fișierului pdb obținut cu ajutorul PDB Reader. Prima coloană a tabelului, după primele 3 rânduri este reprezentată de numărul de rânduri din fișier (coloana albastră) și de denumirea ATOM pentru toți constituenții proteinei și celorlalte molecule ale căror coordonate sunt scrise în acest fișier. Următoarea coloană este reprezentată de numărătoarea atomilor, pornindu-se ne la numărul 1. Mai departe, este descris ce fel de atom este: de azot, de carbon, de hidrogen și în ce poziție se află, de exemplu dacă este atomul de carbon alfa din aminoacid, în coloană este scris CA. Următoarea coloană prezintă codul aminoacidului de la care provine atomul, în codul de trei litere al aminoacizilor, fiind urmată de coloana în care sunt scrise numerele aminoacizilor în structura proteinei. De exemplu, primii atomi aparțin aminoacidului glicină, acesta fiind al 77-lea aminoacid din structura proteinei. Cele mai importante coloane sunt următoarele, acestea reprezentând coordonate atomilor pe axele x, y și z. Ultima coloană prezintă molecula din care fac parte atomii prezentați. De exemplu, în ultima coloană scrie PROA, deoarece atomii aminoacizilor descriși provin de la proteina A, adică de la transportorul de serotonină.

În continuare a fost utilizat instrumentul Membrane Builder din meniul Input Generator pentru a genera fișierele membranei plasmatice.

c) Membrane Builder

Proteinele membranare sunt abundente în celule și responsabile pentru multe dintre funcțiile acestora. Studierea structurii și funcției acestor proteine a fost dificilă, mai ales datorită naturii lor hidrofobe. Pentru a depăși aceste obstacole, este necesară utilizarea simulării dinamicii moleculare. Aceasta începe de la structura atomică sau de la un model structural al proteinei membranare. Simulările cele mai recente au capacitatea de a explora conformațiile proteinelor membranare și interacțiile proteină-lipide în medii asemănătoare bistraturilor lipidice native. Deși simulările MD sunt un instrument puternic, pregătirea sistemului este cel mai complex proces, acesta putând consuma mult timp chiar și pentru experți (Wu și colab., 2014).

Membrane Builder din CHARMM-GUI are ca scop simplificarea procesului de construire a sistemelor complexe proteină-membrană sau a sistemelor membranare. Acesta oferă o interfață interactivă pentru utilizator, bazată pe web printr-un proces de construire generalizat și automatizat. Pe baza fișierelor de input introduse de utilizator, Membrane Builder va putea calcula dimensiunea sistemului, va putea genera componentele membranei, cum ar fi bistratul lipidic, ionii sau moleculele de apă și apoi le va putea asambla. Acest lucru începe cu încărcarea fișierului pdb, sau cu specificarea codului PDB ID, pentru a putea identifica fișierul proteinei. Mai departe, Membrane Builder generează bistratul lipidic în jurul proteinei, compoziția acestuia putând fiind aleasă de utilizator. Folosind acest protocol, de a genera bistratul lipidic în jurul proteinei, procesul complex de a construi sisteme proteină-membrană devine mult mai simplu. Un avantaj al acestui instrument este acela de a avea funcționalități variate disponibile, cu care sunt citite fișierele liganzilor (Wu și colab., 2014).

Construirea membranei este realizată cu instrumentul Bilayer Builder, din meniul Membrane Builder. Primul pas este de a introduce fișierul pdb în format CHARMM al proteinei. Acest lucru poate fi realizat în două moduri: fie prin descărcarea fișierului pe baza PDB ID, fie prin introducerea unui fișier deja existent. În urma încărcării fișierului sunt alese segmentele care urmează să fie introduse în membrană. Deoarece în pașii anteriori s-a realizat obținerea fișierului pdb, în această etapă vor fi aleși toți liganzii.

Următorul pas este asemănător cu cel de la PDB Reader, deoarece liganzii trebuie redenumiți în așa fel încât numele să corespundă cu cele din formatul CHARMM. Din acest motiv, în acest pas, molecula de colesterol va fi redenumită de la CLR la CHL1, iar glicozilările de la nivelul transportorului de serotonină vor fi redenumite de la BGL la BGLCNA. Mai departe, trebuie ales modul în care proteina va fi orientată în interiorul membranei. Există mai multe variante pentru orientarea proteinei, dar cea aleasă este folosirea orientării PDB. Această opțiune este utilizată deoarece în fișierele pdb, moleculele sunt deja orientate, iar din moment ce membrana va fi construită în jurul acesteia, nu este nevoie ca moleculele să fie reorientate.

Pasul al treilea va determina mărimea sistemului. Acest lucru este realizat prin alegerea lipidelor care vor face parte din membrană. Utilizatorul poate alege tipurile de lipide care vor fi introduse în structura membranei și numărul acestora. Lipidele alese pentru realizarea membranelor au fost lipidele din clasa sfingomielinelor (SM): palmitosfingomielina (PSM) și stearosfingomielina (SSM) și din clasa sterolilor: colesterolul. Interacțiile dintre colesterol și sfingomieline duc la formarea microdomeniilor lipidice și acest lucru este urmărit prin realizarea acestor membrane. Pentru a obține rezultate comparabile au fost realizate 3 membrane pentru fiecare fișier pdb al SERT, adică 6 membrane în total. Fiecare dintre cele 3 membrane care conțin deja SERT și colesterolul ca ligand al SERT, a avut o compoziție diferită a lipidelor, prezentată în tabelul nr.3:

Tabel nr. 3. Numărul lipidelor alese în cazul membranelor care conțin SERT (cu o moleculă de colesterol ca ligand) și mărimea sistemului obținut

Membranele sunt caracterizate astfel:

O membrană este simetrică, adică conține un număr aproximativ egal de PSM și SSM în ambele straturi ale membranei și un număr egal de molecule de colesterol în ambele straturi;

O membrană asimetrică-extern, adică conține un număr mai mare de molecule de colesterol la nivelul stratului extern al membranei și un număr de SM corespunzător mărimii sistemului;

O membrană asimetrică-intern, adică prezintă un număr mare de molecule de colesterol în stratul intern și un număr SM corespunzător mărimii sistemului.

Tabel nr. 4. Numărul lipidelor alese în cazul membranelor care conțin SERT (fără colesterol ca ligand) și mărimea sistemului obținut

Pasul patru în construirea membranelor se referă la asamblarea componentelor. Pe baza determinării mărimii sistemului din pașii anteriori, în acest pas sunt asamblate componente individuale, adică bistratul lipidic în jurul proteinei. În plus, sunt adăugați și ioni pentru o anumită concentrație. Pentru toate membranele a fost aleasă o concentrație de 0.15M. Distribuția lor la nivelul membranei a fost realizată cu ajutorul algoritmului Monte Carlo. În pasul următor, toate componentele sunt asamblate împreună: proteina, bistratul lipidic și ionii.

Ultimul pas este reprezentat de echilibrarea întregului sistem. În urma tuturor acestor pași, fișierul membranei va conține pe lângă fișierul pdb al membranei, toate fișierele pdb de la fiecare pas, fișiere de topologie, fișiere de parametri și fișiere input pentru simularea dinamicii moleculare a membranelor.

4.3.Rezultate și discuții

4.3.1.Rezultate

Studiul realizat cu ajutorul programelor de dinamică moleculară a avut ca rezultat realizarea a 6 membrane diferite, cu o compoziție în lipide diferită în funcție de membrană. O altă diferență dintre aceste membrane este faptul că 3 membrane au în compoziția lor un SERT care are drept ligand o moleculă de colesterol și alte 3 membrane care au drept proteină trans-membranară un SERT care nu prezintă niciun ligand. Ambele molecule de SERT prezintă glicozilările specifice acestui transportor, care au rol în transportul acestuia la nivelul membranei.

În toate figurile care urmează, componentele sistemului sunt reprezentate utilizând programul VMD astfel:

SERT este albastru, fiind reprezentat în funcție de structura sa terțiară;

Glicozilările sunt reprezentate cu culoarea roșie, acestea fiind desenate cu opțiunea Drawing Method- VDW (sunt reprezentate prin sferele lor Van Der Waals);

Colesterolul legat la SERT are culoarea mov, reprezentat ca glicozilările;

Colesterolul membranar este galben, reprezentat cu Drawing Method- Licorice (este reprezentat scheletul moleculei). Această opțiune a fost utilizată și pentru moleculele de SSM și PSM;

SSM au culoarea verde și PSM au culoarea portocaliu.

Prima membrană obținută, membrana nr.1 a fost cea care conține o concentrație egală de colesterol membranar în ambele straturi, reprezentată în figura nr.15.

Figura nr. 15. Etapele realizării membranei nr.1. A- reprezentarea SERT, în albastru (+glicozilări, în roșu și colesterol ca ligand, în mov); B- SERT împreună cu colesterolul membranar, în galben; C- SERT cu colesterolul membranar și SSM, în verde; D- SERT cu colesterolul membranar, SSM și PSM, în portocaliu (membrana completă); E- vederea superioară asupra stratului extern al membranei; F- vederea superioară asupra stratului intern al membranei. În stânga fiecărei figuri sunt reprezentate schematic axele sistemului, axa X fiind reprezentată de o săgeată de culoare roșie, axa Y de una verde și axa Z de o săgeată de culoare albastră. (sursă proprie)

A doua membrană, membrana nr.2, reprezentată în figura nr.16, conține colesterolul ca ligand pentru SERT, dar și o concentrație inegală de colesterol membranar, stratul extern prezentând o concentrație mai mare de colesterol decât stratul intern.

Figura nr. 16. Etapele realizării membranei nr.2. A- SERT (+glicozilări și colesterol); B- colesterolul membranar, aflat în concentrații mai mari în stratul extern, C- adăugarea SSM (în verde); D- adăugarea PSM (în portocaliu); E- vedere superioară asupra stratului extern al membranei; F- vedere superioară asupra stratului intern, care conține mai puțin colesterol membranar. Axele sistemului sunt reprezentate schematic în partea stângă, jos, a fiecărei etape. (sursă proprie)

Membrana nr.3 este reprezentă în figura nr.17, și prezintă SERT cu colesterol ca ligand. Spre deosebire de celelalte membrane, aceasta conține colesterolul membranar în proporții mari în stratul intern, cum este reprezentat și în figura nr.17, B.

Figura nr. 17. Etapele realizării membranei nr.3. A- reprezentarea SERT; B-adăugarea colesterolului membranar la A, în principal în stratul intern, C- adăugarea SSM; D- adăugarea PSM; E- membrana văzută de sus (stratul extern); F- membrana văzută de jos (stratul intern). Axele sistemului sunt reprezentate de săgețile din partea stângă a etapelor. (sursă proprie)

Următoarele membrane au fost construite în același mod, dar SERT nu prezintă drept ligand colesterolul. Membrana nr.4 este reprezentată în figura nr.18 și conține colesterol în proporții egale în ambele straturi ale membranei.

Figura nr. 18. Etapele realizării membranei nr.4. A- SERT în albastru, care prezintă și glicozilări, în roșu; B- adăugarea colesterolului membranar în cantități egale la nivelul ambelor straturi ale membranei, în galben; C- adăugarea SSM, în verde, D- adăugarea PSM, reprezentate cu portocaliu; E- vedere asupra stratului extern al membranei; F- vedere asupra stratului intern al membranei. Săgețile din partea stângă a fiecărei etape reprezintă axele sistemului astfel: axa X în roșu, axa Y în verde și axa Z în albastru. (sursă proprie)

Membrana nr.5, reprezentată în figura nr.19, conține SERT și o cantitate mai mare de colesterol în stratul extern al membranei.

Figura nr. 19. Etapele realizării membranei nr.5. A- SERT ; B- adăugarea colesterolului membranar, în principal în stratul extern; C- adăugarea SSM; D- adăugarea PSM; E- vedere de sus asupra stratului extern; F- vedere de deasupra spre stratul intern. (sursă proprie)

Ultima membrană construită este cea care conține SERT și colesterol membranar în proporții mai mari în stratul intern față de stratul extern. Structura acesteia este reprezentată în figura nr.20.

Figura nr. 20. Etapele realizării membranei nr.6. A- structura SERT; B- adăugarea colesterolului membranar, în galben, în principal în stratul intern; C- adăugarea SSM, în verde; D- adăugarea PSM, în portocaliu; E- vedere asupra stratului extern de sus; F- vedere asupra stratului intern de sus. Axele sistemului sunt reprezentate prin săgeți: axa X este săgeata roșie, axa Y este săgeata verde și axa Z este săgeata albastră. Această reprezentare schematică se află în stânga jos pentru fiecare etapă. (sursă proprie)

4.3.2.Discuții

Pe lângă fișierele membranelor, am obținut și fișiere de input care pot fi rulate pentru a afla dinamica moleculară a acestor membrane. Au fost și alte studii pe modele membranare alcătuite fie din SM și colesterol, fie din SM, colesterol și un alt lipid care poate duce la formarea microdomeniilor lipidice. Ambele modelări moleculare arată că, în urma unei concentrații prag de colesterol în membrane, lipidele tind să se asocieze într-o fază , care la rândul ei duce la formarea microdomeniilor lipidice.

Zidar și colab., 2009 au prezentat o lucrare a dinamicii moleculare a tuturor atomilor bistratului lipidic care prezenta raporturi molare diferite de colesterol/ sfingomielină. Rezultatele lor au indicat faptul că schimbările dinamice arată că distribuția aleatorie a lipidelor în bistratul lipidic este înlocuită la concentrații mai mari de 30 mol% ale colesterolului. La această concentrație, are loc formarea unei faze lichid-ordonate, care este precursorul microdomeniilor lipidice. Împachetarea moleculelor în bistrat este arătată a fi asociată cu formarea legăturii de hidrogen dintre colesterol și sfingomielină. Moleculele tind să migreze spre o distribuție în care moleculele de sfingomielină pot forma, în medie, o legătură de hidrogen cu molecula de colesterol (Zidar și colab., 2009).

Au fost făcute o serie de simulări ale dinamicii moleculare a tuturor atomilor de sfingomielină cu concentrații molare diferite de colesterol (0/100, 20/80, 30/70, 35/65, 40/60). Aceste simulări au pornit de la plasarea aleatorie a lipidelor în planul bistratului și au arătat că prezintă caracteristici structurale importante, implicate în formarea fazei lichid-ordonate. Concentrația prag de colesterol la care apare tranziția între și este de 30 mol%, concentrație care a fost obținută și în urma experimentelor. Elementele critice pentru împachetarea diferită par a fi interacțiile dintre sfingomielină și colesterol și interacțiile dintre diferitele molecule de sfingomielină. S-a constatat că legătura de hidrogen formată între sfingomielină și colesterol este importantă în formarea concomitentă a Rezultatele au arătat faptul că amestecul de colesterol/ sfingomielină sub concentrația de 30 mol% este determinat de entropie, iar concentrațiile peste această valoare sunt determinate de entalpie (Zidar și colab., 2009).

Un alt studiu de Wang și Klauda, 2017 realizat cu ajutorul CHARMM, a efectuat simulări pentru bistraturi lipidice alcătuite doar din PSM, dar și bistraturi realizate dintr-o combinație de PSM cu SSM la diferite concentrații ale colesterolului și la temperaturi diferite. A fost arătat faptul că suprafața lipidelor, unghiul de înclinare, grosimea membranei și ordinea lanțurilor acil depind de concentrația colesterolului membranar. Aceste interacțiuni duc la o auto-asociere a colesterolului la concentrații mari, fiind motivul pentru care interacțiile colesterol-SM nu mai au loc (Wang și Klauda, 2017).

Studii ale modelării dinamice ale amestecurilor binare de SM/ colesterol și studii computaționale ale unui amestec terțiar care include SM și colesterolul folosind CHARMM au dus la identificarea unor posibili factori care duc la formarea Rezultatele arată o scădere a legăturilor de hidrogen dintre SM-SM. Scăderea numărului acestor legături poate fi explicată prin tendința colesterolului de a dezorganiza grupuri de SM asociate, care mai apoi se răspândesc păstrând ordinea. Acest lucru duce la o creștere a suprafeței lipidelor. În acest mod, scade numărul legăturilor de hidrogen, deoarece scade și distanța dintre grupările care pot forma legături de hidrogen. De asemenea, nu toate SM sunt indicate pentru astfel de modelări. Oleosfingomielina nu poate fi considerată un factor în formarea microdomeniilor lipidice, din cauza incapacității de a forma domenii segregate cu colesterolul, rezultat al nesaturării (Wang și Klauda, 2017).

Amestecurile binare de lipide rămân modele adecvate pentru microdomeniile lipidice bazate pe concentrații mari de SM și colesterol. Deși există dificultăți în a trece de la studiul amestecurilor binare la cele terțiare, sunt făcute eforturi pentru a examina o diversitate mai mare de lipide. Folosirea fosfatidilcolinelor (PC) nesaturate este comună, deoarece colesterolul pro-movează separarea fazelor între Tm scăzută a PC și Tm crescută a SM. Rezultatele studiilor experimentale asupra amestecurilor terțiare au arătat prezența complexelor SM/colesterol cu separarea acestora în faza PC. Acest lucru este asemănător cu existența acestor complexe în amestecurile binare. În plus, a fost arătat faptul că folosirea diferitelor PC (1-palmitoil- 2-oleoil-glicero-3-fosfocolină versus 1-stearoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolină) a avut rezultate similare și pot fi utilizate în modelarea microdomeniilor lipidice (Wang și Klauda, 2017).

Amestecurile prezentate de Wang și Klauda sunt fie bistraturi pure de SM sau amestecuri binare de SM/colesterol la diferite concentrații și temperaturi. Aceste modelări moleculare au arătat faptul că la concentrații mari ale colesterolului, moleculele tind să se asocieze între ele. Rezultatele legăturilor de hidrogen arată că legăturile de hidrogen SM-SM scad cu creșterea concentrației colesterolului, ceea ce are implicații în studiul domeniilor și, în consecință, asupra studiului microdomeniilor lipidice (Wang și Klauda, 2017).

5.Concluzii

Membranele celulare sunt alcătuite în principal din trei categorii mari de lipide: glicerofosfolipide, sfingolipide și steroli. În urma studiilor experimentale, a fost demonstrat faptul că lipidele din ultimele două categorii participă la formarea unor domenii în cadrul structurii membranei. Aceste domenii se numesc microdomenii lipidice și sunt alcătuite în principal din sfingolipide și colesterol. Funcțiile membranelor plasmatice se bazează pe formarea acestor microdomenii, deoarece multe proteine transmembranare fac parte din structura acestora.

Din date ale modelării moleculare a acestor microdomenii, a fost estimată concentrația minimă de colesterol (30 mol%) care duce la formarea microdomeniilor lipidice. Formarea microdomeniilor se bazează pe legăturile de hidrogen formate între colesterol și SM. Nu există o concentrație optimă de colesterol membranar pentru care are loc formarea microdomeniilor lipidice. Se cunoaște faptul că o concentrație prea mare de colesterol va duce la formarea unor legături între moleculele de colesterol și nu între colesterol și SM, ceea ce va duce la destabilizarea microdomeniilor lipidice.

Lipidele din microdomeniile lipidice au o asamblare asemănătoare fazei lichid-ordonate membranare. Această asamblare simetrică le permite proteinelor transmembranare să pătrundă mult mai ușor la nivelul acestor domenii membranare. SERT este una dintre proteinele trans-membranare care se află în structura acestor microdomenii. Funcția transportorului depinde foarte mult de proprietățile fizice ale microdomeniilor. Dacă acestea se modifică, transportorul poate trece dintr-o stare activă la una inactivă. Datorită poziționării SERT la nivelul microdomeniilor lipidice, acesta poate să își schimbe conformația și să își exercite funcția.

Din acest motiv, modelele membranare construite au ca scop observarea dinamicii transportorului, pentru a putea înțelege modul în care microdomeniile lipidice influențează funcția SERT. Înțelegerea acestor aspecte va avea un impact important în reglarea SERT, reglare care nu implică utilizarea medicamentelor sau a altor liganzi care pot bloca funcția transportorului.

Prin modelarea dinamicii moleculare a membranelor dorim să înțelegem modul în care se formează microdomenii lipidice în funcție de concentrația colesterolului membranar. Pe lângă aceasta, putem observa și efectul pe care îl are formarea microdomeniilor lipidice în modificarea conformației SERT, cu scopul de a înțelege cum este reglată funcția transportorului în aceste condiții.