Lipoproteinele cu Densitate Mare

CAPITOLUL 1 Lipidele

Generalități

Lipidele reprezintă o categorie de compuși foarte răspândiți în lumea vie, reprezentând forma principală de depozitare a rezervelor de energie ale organismelor. În asociere cu proteinele și într-o mai mică măsură cu zaharurile, sunt componentele structurale fundamentale ale celulelor, fiind implicate în căile metabolice și hormonale. Cunoașterea tulburărilor lipidice este importantă, mai ales în cazuri asociate cu ateroscleroza precum boala coronariană, una din cele mai mari cauze de mortalitate din societatea urbana.

O caracteristica importantă generală a lipidelor este solubilitatea lor în diferiți solvenți organici cât și insolubilitatea lor în apă. Lipidele se găsesc și asociate cu proteine si glucide sub formă de lipoproteine, respectiv glicolipide, care se găsesc în cantitate mai mare în membrane, mitocondrii, nucleu.

Principalele componente lipidice provenite din alimentație sunt trigliceridele, după care urmează fosfolipidele (lecitine, cefaline, sfingomieline), colesterolul liber și esterificat, carotenii și vitaminele liposolubile (A, D, E si K). Digestia și absorbția lipidelor este un process complex intrucât, pe lângă necesitatea degradării lor hidrolitice, se mai adaugă problema solubilității și menținerii într-un mediu apos a unor substanțe hidrofobe. Acizii biliari deversați cu bila în duoden împreuna cu unele lipide alimentare au un rol essențial în solubilizarea lipidelor și încorporarea lor într-o formă usor absorbabilă prin peretele intestinal.

Când lipidele alimentare intră în contact cu bila, care cuprinde cantități importante de acizi biliari și lecitine, sunt dispersate sub forma unei soluții coloidale (emulsie) cu grad de dispersie mijlociu. Asupra lipidelor emulsionate acționează hidrolaze pancreatice specific: lipazele asupra trigliceridelor, fosfolipazele asupra fosfatidelor și colesterol esteraza asupra esterilor colesterolului.

Fosfolipazele acționează asupra fosfatidelor, transformând lecitinele în lizolecitine, care au proprietăți detergente foarte puternice participând alături de ceilalți factori la solubilizarea lipidelor în intestine.

Colesterolul și esterii săi prezenți în lumenul intestinal provin din trei surse: din alimentație, din bilă și din descuamațiile mucoasei intestinale. Esterii colesterolului sunt hidrolizați în totalitate sub acțiunea colesterol esterazei pancreatice.

Lipidele alimentare, nehidrolizate și produșii de hidroliză insolubili în apă sau parțial solubili, împreuna cu acizii biliari, datorită structurii lor particulare, au un rol stabilizator essențial. Aceste agregate micelare pătrund în spațiile intervilozitare și moleculele lipidice străbat membrana enterocitelor. Acizii biliari nu sunt absorbiți la acest nivel al intestinului, ei se reîntorc în lumen participând la solubilizarea și transportul altor molecule lipidice. Digestia și absorbția lipidelor are loc în regiunea proximală a jejunului. Prin sistemul port, acizii biliari ajung la ficat și din nou în bilă și intestine, realizându-se în acest fel circuitul entero-hepatic.

Colesterolul. Generalitati

În organismul uman, colesterolul este compusul steroidic major, având rol important în metabolismul celular. El intră în componența membranelor biologice, în structurile mielinizate ale creierului. Este precursor al unor hormoni steroidici precum corticosteronul, deoxicorticosteronul, cortizon, hidrocortizon, estrogeni, testosteron. De asemenea, este precursor al acizilor biliari, cu funcție în facilitarea absorbției triacilglicerolilor, a vitaminelor solubile din dietă. De aceea, colesterolul este esențial pentru organismul uman, însă nivelul crescut al acestuia în organism este asociat cu o serie de afecțiuni, în principal la nivel cardiovascular.

Colesterolul este un compus cu 27 atomi de carbon derivat din acetat, a cărui structură include un nucleu ciclofenantrenic, o grupare hidroxil la C-3 și o catenă ramificată atașată la poziția 18 a inelului D. Colesterolul este un lipid cu o foarte mică solubilitate în apă, la 25˚ C, limita de solubilitate fiind de 0,2 mg/100ml. Valoarea normală în plasmă este de 150-200mg/100ml (Cristea et al, 1980).

Colesterolul este foarte hidrofob, iar faptul că de cele mai multe ori se găsește sub formă esterificată la C3 cu un acid gras, în special cu acidul linoleic, face structura și mai hidrofobă. De aceea, datorită hidrofobicității sale, pentru a putea fi transportat în sânge, el are nevoie de complexele lipoproteice, care au capacitatea de a-l lega. Doar 30% din totalul colesterolului din circulație se găsește sub formă liberă, restul fiind esterificat.

În toate celulele, calea de sinteză de novo a colesterolului poate fi folosită ca o metodă de producere a sa de la moleculele precursoare întâlnite în mod natural. Acetil-CoA, cele două precursoare de carbon a tuturor moleculelor de sterol, este ințtial converittă în hidroximetilglutaril-CoA (HMG-CoA) de către acțiunea a două enzime, tiolat și HMG-CoA sintetaza. HMG-CoA este apoi convertit la mevalonat (în citosol), un alt intermediar major în calea de biosinteză a colesterolului, de către HMG-CoA reductaza, etapa limitantă de viteză în sinteza colesterolului (Voet,2004).

Figura 1. Structura colesterolului

Sinteza colesterolului

Toți atomii de carbon ai colesterolului sunt proveniți de la acetat și NADPH furnizează echivalenti reducători. Calea este endogenă, fiind controlată de hidroliza legăturii tioester de mare energie a acetil coenzimei A (acetilCoA) și legătura fosfat terminală a adenozin trifosfatului (ATP). Sinteza necesită enzime atât din citosol cât și din membrana reticuluilui endoplasmatic neted. Calea este sensibilă la schimbările concentrației de colesterol, însă există mecanisme pentru a echilibra rata sintezei colesterolului față de rata de excreție a colesterolului.

A. Sinteza 3-hidroxi-3-metilglutaril CoA (HMG CoA)

În primul pas, două molecule de acetil CoA se leagă pentru a forma acetoacetil CoA. Ulterior, se adaugă o a treia moleculă de acetil CoA pentru a rezulta HMG CoA, un compus format din șase atomi de carbon. În celulele parenhimale ale ficatului se găsesc două izoforme a HMG CoA sintetazei; enzima citosolică participă la sinteza colesterolului, în timp ce enzima mitocondrială este implicată în procesul de sinteză a corpilor cetonici.

Figura 2. Sinteza 3-hidroxi-3-metilglutaril CoA

B. Sinteza mevalonatului

Următorul pas, reducerea HMG CoA la mevalonat este o reacție catalizată de HMG CoA reductaza, este o etapă limitantă de viteza și pasul cheie în reglarea sintezei colesterolului. Are loc în citosol și necesită două molecule de NADPH ca și agent de reducere, și eliberează CoA, fiind o reacție ireversibilă. HMG CoA reductaza este o proteină membranară intrinsecă a reticulului endoplasmatic.

Figura 3. Sinteza mevalonatului

Sinteza colesterolului

Mevalonatul este convertit în 5-pirofosfomevalonat în doi pași, fiecare pas necesită transferul grupării fosfat de la molecula de ATP.

Se formează o unitate izoprenă cu 5 atomi de carbon – isopentenil pirofosfat (IPP) – prin decarboxilarea 5-pirofosfomevalonat. Și această reacție necesită ATP.

Figura 4. Sinteza 3-izopentenil pirofosfat

IPP este izomerizat la 3,3-dimetilalil pirofosfat (DPP) (Harvey, Ferrier, 2008).

IPP și DPP formează geranil pirofosfat (GPP) (Harvey, Ferrier, 2008).

O a doua moleculă de IPP formează împreună cu GPP farnesil pirofosfat (FPP) (Harvey, Ferrier, 2008).

Două molecule de FPP se unesc sub acțiunea enzimei scualen sintaza (Richard, Ferrier, 2008).

2 Farnesil pirofosfat + NADPH scualen + 2 PPi + NADPH+ + H+

Scualenul este convertit în lanosterol printr-o succesiune de reacții catalizate de enzime asociate reticulului endoplasmatic. Scualen monooxigenaza convertește scualenul la 2,3-epoxid-scualen. Această reacție are nevoie de FAD și NADPH ca și coenzime și necesită O2. O a doua enzimă a membranei reticulului endoplasmatic, 2-3-oxidoscualen lanosterol ciclaza catalizează a doua reacție, care implică o succesiune de schimbări de ioni hidrură și grupări metil (R H. Garrett, C. M. Grisham,2008)

Figura 5. Sinteza lanosterolulu

Ca și structură lanosterolul este similar cu colesterolul, însă pentru conversia lanosterolului în colesterol sunt necesari 20 pași. Enzimele responsabile pentru această etapă sunt asociate cu reticulul endoplasmatic. Prima cale implică 7 dehidrocolesterolul ca penultim intermediar. O cale alternativă, formată de asemenea din mai mulți pași, are ca produs intermediar demosterolul. Reducerea dublei legături de la C24 produce colesterolul. Colesterol esterii-principala formă de colesterol circulant – sunt sintetizați de acil acetil CoA-colesterol transferaza (ACAT) la suprafața citoplasmatică a reticulului endoplasmatic (R. H. Garrett, C. M. Grisham,2008)

Figura6. Sinteza colesterolului

Absorbția colesterolului

Asimilarea colesterolului. Absorbția colesterolului este un proces complex, strâns legat de calitatea și cantitatea acizilor biliari și reglat strict de senzori moleculari. Reprezintă un proces complex care are loc în intestinul subțire și implică o serie de enzime și molecule de transport. Pentru a traversa bariera intestinală și să intre în circulație, colesterolul trebuie emulsionat de acizii biliari, hidrolizat (dacă este esterificat de o esterază pancreatica), încorporat în micelii, preluat de enterocite în principal în jejun, re-esterificat și în final transferat în limfă (Iqbal et al, 2009).

Transportul colesterolului. Mai multe proteine au fost studiate pentru potentialul rol în transportul colesterolului intestinal. Printre aceste proteine, s-a identificat Niemann-Pick C1-like (NPC1L1) ca transportator în asimilare și ATP-binding casette (ABC) proteins ABCG5 și ABCG8 ca transportatori în efluxul colesterolului. Se pare că aceste molecule joacă un rol important în absorbția colesterolului din lumenul intestinal (Iqbal et al, 2009).

ABCG5 și ABCG8, care funcționează ca un heterodimer, au un rol decisiv în controlul absorbției sterolilor. Mutații la nivelul genelor care codifică aceste două proteine cauzează sitosterolemia, care este caracterizată prin acumularea de steroli în sânge și alte țesuturi, ca un rezultat al creșterii absorbției lor în intestin și a scăderii eliminării în bilă (Iqbal et al, 2009).

Alți factori de reglare. Receptorii factorului nuclear X din ficat (LXR), LXR α, expresat în principal în ficat, rinichi, intestin, splină și glandele suprarenale, și LXR β expresat ubicuitar, reglează căile implicate în metabolismul colesterolului și în biosinteza lipidelor (Iqbal et al, 2009).

Receptorul scavenger clasa B de tip I (SR-BI), care este localizat atât în zona apicală cât și bazolaterală a membranei enterocitelor, are de asemenea un rol în controlul absorbției colesterolului. Posibilitatea ca SR-BI să fie un transportator de colesterol este sugerată de faptul că supraexpresia SR-BI în intestin la șoareci conduce la o creștere a absorbției colesterolului și trigliceridelor la experimentele de absorbție pe termen scurt (Iqbal et al, 2009).

Un alt pas implicat în reglarea absorbției colesterolului implică acțiunea a două enzime localizate în membrana reticulului endoplasmatic: colesterol acil transferaza 1 (ACAT1) și colesterol aciltransferaza 2 (ACAT2), care catalizează esterificarea colesterolului intracelular. ACAT2 pezintă specificitate crescută pentru colesterol și nu esterifică sterolii vegetali. Este enzima predominată responsabilă de sinteza colesterol esterilor și de secreția lor ulterioară cu lipoproteinele. Deficitul de ACAT2 are ca efect o scădere considerabilă a ratei de absorbție a colesterolului (Iqbal et al, 2009).

S-a speculat de asemenea și că ATP-binding cassette transporter A1 (ABCA1) are un rol important în controlul absorbtiei colesterolului. Importanța ABCA1 în biogeneza HDL în intestin a fost demonstrată prin deleția Abca1 din intestin, ceea ce a condus la o scădere de 30% a nivelului HDL colesterolului din plasmă. Enterocitele cu un deficit de ABCA1 absorb cantități mici de colesterol.

Figura 7. Absorbția colesterolului. Pentru a pătrunde în bariera intestinală și a intra în circulație, colesterolul este încorporat în micelii și preluat de către enterocite în principal în zona proximală a jejunului, re-esterificat și în final transferat în limfă. În zona apicală a enterocitelor, NPC1L1 este implicat în internalizarea colesterolului din lumen. Colesterolul și majoritatea fitosterolilor care nu au fost esterificați de ACAT2 sunt secretați înapoi în lumen de către ABCG5 și ABCG8. În porțiunea bazolateraă a celulei, ABCA1 este importantă în producerea moleculelor HDL (Philippe Costet, 2010).

Homeostazia colesterolului

Menținerea și reglarea colesterolului este importantă în organism pentru a preveni acumularea unui nivel de colesterol în exces. Homeostazia colesterolului în celulă se realizează prin trei mecanisme diferite: reglarea HMG-CoA reductazei, reglarea sintezei receptorului LDL și reglarea esterificării și eliberării colesterolului liber (White, 1984).

HMG-CoA reductaza este o enzimă care controlează sinteza colesterolului, catalizând conversia HMG-CoA în mevalonat. Reglarea HMG-CoA reductazei se realizează prin intermediul factorilor de transcripție cunoscuti sub numele de proteine de legare a elementului reglator sterol („sterol regulatory element binding protein”) (SREBP), precum și prin fosforilarea enzimei la restul de Serina 872. SREBP este responsabil de conentrațiile intracelulare de colesterol dar și de reglarea sintezei receptorului LDL, cea de-a doua metodă de control a colesterolului în interiorul celulei. SREBP se găsește atațat de suprafața reticulului endoplasmatic sau de membrana nucleară și rămâne atașat când nivelul colesterolului este mare. O scădere a colesterolului va conduce la clivarea proteinei membranare și SREBP va pătrunde în nucleu. Odată ajuns în nucleu, SREBP se leagă de elementele reglatoare sterol (SRE) pentru a iniția transcripția receptorilor LDL și enzimei HMG-CoA reductaza pentru a încerca să crească nivelul colesterolului intracelular (Istvan, 2000).

Reglarea SREBP este așadar importantă în metabolismul lipoproteinelor de când reglează transcripția genelor necesare pentru sinteza acizilor grași și colesterolului.

SREBP este o proteinnă membranară care are două situsuri de clivare. Clivajul de la situsul unu separă două segmente legate de membrana SREBP prematur. Clivajul de la situsul doi este clivajul activ, separând SREBP matur de membrană permițând-i să intre în nucleu pentru a facilita transcripția genelor implicate în sinteza colesterolului (Brown,1997).

SREBP este reglat prin intermediul actiunii SCAP (proteina de activare a clivajului SREBP), care are un domeniu de indentificare a sterolului si Insig-1. Insig-1 este mentinut legat de SCAP care atunci este incapabil sa activeze clivajul proteinei SREBP. In absenta sterolilor, Insig-1 nu mai este legat de SCAP si in aceste conditii, poate activa clivajul SREBP. Eliberarea SREBP in nucleu pentru a activa expresia genelor, rezulta in cresterea nivelului de enzime pentru biosinteza colesterolului (Brown,1997).

La oameni, există 3 izoforme ale SREBP: SREBP-1a, SREBP-1c si SREBP-2. SREBP-1c și SREBP-1a au efecte asupra genelor implicate în metabolismul acizilor grași, în timp ce SREBP-2 activează în principal genele implicate în sinteza colesterolului.

Când colesterolul este abundent, SREBP ramane în reticulul endoplasmatic asociat cu proteina SCAP (proteina de activare a clivajului SREBP), care are un domeniu de activare a sterolului și cu proteina de retenție Insig. Nivelul scăzut de colesterol are ca efect o modificare a conformației domeniului de activare a sterolului din componența SCAP, disociind de Insig și permițând SREBP-SCAP să ajungă în aparatul Golgi. Două proteaze din aparatul Golgi eliberează forma activă a SREBP, care este translocat în nucleu pentru a activa transcripția genelor țintă.

Sinteza colesterolului este reglată și posttranscripțional: nivelul crescut de colesterol grăbește degradarea HMG-CoA prin sustinerea procesului de asociere a domeniului de detectare a sterolului cu Insig.

SREBP-1 joacă un rol important în dezvoltarea „ficatului gras”, consecința patologică majoră a abuzului de alcool. În ficatul gras, se acumulează cantități mari anormale de colesterol și trigliceride în citosol sub formă de picături lipidice, ceea ce poate contribui la ciroză sau hepatită. Rezultatele experimentale folosind culturi de celule hepatice sugerează că metabolismul alcoolului la acetaldehidă de către alcool dehidrogenaza hepatică, conduce la activarea SREBP-1 și eliberarea SREBP-1 în nucleu, ceea ce induce sinteza în exces a trigliceridelor și acizilor grasi. În concordanță cu această sugestie este și constatarea faptului că forma activă a SREBP-1 în ficatul șoarecilor crește semnificativ atât sinteza acizilor grași cât și a colesterolului, rezultând în final ficatul gras (Lodish, 2004).

SREBP prezintă trei domenii diferite: domeniu N-terminal citosolic care include motivul de legare ADN helix-loop-helix și funcționează ca factor de transcripție; un domeniu central atașat de membrană și un domeniu de reglare C-terminal citosolic (Lodish,2004).

CAPITOLUL 2. LIPOPROTEINELE

2.1. Generalitati

Deoarece lipidele nu sunt solubile în mediu apos, ele circulă în plasmă sub forma unor asociații moleculare cu proteinele care le asigura solubilitatea. Această asociere poartă numele de lipoproteine. Lipidele sau derivatii ei pot fi legate de proteine covalent sau non-covalent. Numeroase enzime, proteine structurale, de transport, antigene, proteine de adeziune si toxine reprezintă din punct de vedere biochimic lipoproteine.

Structural lipoproteinele contin un 1miez hidrofob, alcatuit din trigliceride si esteri de colesterol, iar catre exterior se gaseesc apolipoproteinele, fosfolipidele și colesterolul care orientează partea polară a moleculei catre exterior si partea hidrofoba catre interior.

Fiecare lipoproteina contine cinci elemente diferite: un monostrat fosfolipidic, apoproteine, colesterol liber localizat la nivelul membranei, trigliceride si colesterol ester, gasiti in centrul particulei (Feher, 1997).

Monostratul fosfolipidic – reprezinta o bariera intre miezul hidrofob ce contine trigliceride si colesterol esteri si exteriorul hidrofilic.

Apoproteinele reprezinta proteine care acopera monostratul fosfolipidc si actiuneaza ca molecule semnal pentru a intentifica continutul si tipul lipoproteinelor. Fiecare lipoproteina este acoperita de o apoproteina diferita care le ajuta sa se distinga unele fata de altele. Apoproteinele au de asemenea rolul de a interactiona cu mediul apos ca un receptor al liganzilor.

Colesterolul liber incorporat in monostratul fosfolipidc a carui grupari alcoolice polare de pe colesterolul neesterificat sunt proiectate in mediul apos

Trigliceridele reprezinta o metoda de transport a acizilor grasi si lipidelor, de obicei localizate in miezul lipoproteinelor. Clasele de lipoproteine contin proportii diferite de trigliceride si colesterol esteri.

Colesterol esterii reprezinta colesterol esterificat atasat de acizi grasi folosind gruparea hidroxil a colesterolului pentru a forma legaturi ester. Colesterolul este transportat in principal sub forma de colesterol esteri.

Figura 1. Structura unei lipoproteine

Proteinele cu care se cupleaza lipidele plasmatice se numesc apolipoproteine sau apoproteine. Acestea reprezintă componenta proteică a lipoproteinelor și sunt denumite după literele alfabetului (Apo-A, Apo-B, C, D, E) urmate de o cifră (AI, AII) deoarece în interiorul aceleiași familii de apoproteine structura primară este diferită. Apoproteinele îndeplinesc mai multe roluri, printre care:

structural, activator sau inhibitor enzimatic

de recunoaștere de către receptorii specifici (de exemplu receptorul LDL recunoaște specific lipoproteinele care conțin apo-E și apo-B100) (Denisa Mihele, 2003)

ApoA, in principal apoA-1 si apoA-2 este grupul de apoporoteine asociat cu particulelele HDL. ApoB (apoB-100) se gaseste in principal asociata cu particulele LDL si reprezinta ligandul pentru receptorul LDL. Lipoproteinele cu densitate joasa au o molecula de apoB-100 per particula. ApoC este importanta in metabolismul trigliceridelor si, impreuna cu apoE, elibereaza interschimbarile intre diferite lipoproteine (Martin A. Crock, 2012).

Separarea lipoproteinelor

Particulele de lipoproteine variaza ca marime de la 10 pana la 1000 nanometri. In metoda ultracentrifugarii plasma diluata cu o solutie salina este supusa intr-o ultracentrifuge unui camp de acceleratie foarte puternic. Particulele cu densitati mai mari decat ale mediului cad potrivit marimii si densitatii lor. In schimb particulele cu densitati mai mici decat ale mediului de suspensie au tendinta de a se ridica in sus, floteaza deasupra mediului. Lipidele au densitati mai mici decat apa. Trigliceridele pure au densitatea cea mai mica 0,95g/cm3, proteinele in schimb sunt mai grele decat apa, au densitati mai mari de 1,2 g/cm3.

Lipoproteinele plasmatice constituie o populatie heterogena cu raporturi diferite intre lipide si proteine si pot fi separate prin ultracentrifugare. In acest scop se dilueaza plasma cu o solutie de clorura de sodium pentru a obtine un mediu cu o densitate de 1,063g/cm3. Aceasta valoare este aleasa deoarece corespunde densitatii unei lipoproteine cu un continut egal de lipide si proteine. Lipoproteinele se separa in fractiuni potrivit densitatii fiecareia. Fractiunile cu densitati mai mici de 1.063 vor tinde sa se ridice in sus pe cand cele mai grele se vor deplasa spre fundul tubului de centrifuga. Cu cat densitatea lipoproteinelor creste, cu atat marimea particulei scade. Prin aceasta etapa se obtin urmatoarele fractiuni lipoproteice:

Chilomicronii

Lipoproteinele cu densitate foarte joasa- very low density lipoprotein (VLDL)

Lipoproteinele cu densitate intermediara (IDL) sunt intermediare intre VLDL si LDL

Lipoproteinele cu densitate joasa- low density lipoprotein (LDL)

Lipoproteinele cu densitate mare- high density lipoprotein (HDL)

Figura 2. Lipoproteinele in functie de densitate

Metoda electroforetica. Datorita sarcinii electrice diferite pe care le poarta in campurileelectrice, fract proteice lipoproteice au mobilitati diferite care permit separarea lor. Electroforeza se poate realiza atat pe hartie cat sip e suporturi solide. In electroforeza pehartie, lipoproteinele pot fi vizualizate prin colorarea lor cu un compus cu afinitate pentru lipide. Prin decuparea spoturilor colorate, eluarea colorantului si masurarea densitatii optice a fiecarui eluat se pot stabili proportiile relative ale diverselor fractiuni lipoproteice din ser. Prin aceasta metoda se pot obtine 4 fractii:

chilomicronii care nu au sarcina electrica nu migreaza in camp electric si vor fi regasiti la linia de start.

α lipoproteinele cu mobilitatea cea mai mare,

pre-β lipoproteinele

β lipoproteinele cu mobilitatea cea mai mica.

.

2.2. Chilomicroni

Chilomicronii reprezintă clasa de lipoproteine cele mai mari si cele mai putin dense, avand un continut bogate în trigliceride formate la nivelul intestinului in timpul absorbtiei lipidelor, fiind o modalitate de a transporta colesterolul și trigliceridele către restul corpului. Sunt sintetizati din trigliceridele alimentare in reticulul endoplasmatic al celulelor epiteliale din intestinul subtire si intra in circulatia sanguina prin sistemul limfatic (Koolman, 2005). Proteinele din chilomicroni sunt sintetizate in mucoasa intestinala sau sunt de origine hepatica.

Termenul de chilomicroni a fost inventat de Gage in 1920 pentru a descrie particulele mari observabile în plasmă după absorbția lipidelor (Peter H. R Green, Robert M Glickman, 1981).

Mărimea chilomicronilor este determinată de fluxul trigliceridelor la nivelul celulelor intestinului. Ls inceput acestia sunt mici si se maresc in timpul mariririi absorbtiei lipidelor. Componenta fosfolipidică a chilomicronilor este reprezentată în principal din lecitină (70-100%) și de mici cantități de sfingomielină și fosfatidiletanolamină.

Structural, chilomicronii constau într-un miez hidrofob ce conține majoritatea trigliceride si colesterol ester si aproximativ 30 % colesterol liber dar nu fosfolipide. Fosfolipidele sunt localizate la suprafata membranara care se consideră a fi formată dintr-un monostrat de fosfolipide, apoproteine, colesterol liber. Cantitatea de fosfolipide prezentă este suficientă pentru a acoperi intre 80-100% din suprafață iar restul de 10-20% este acoperită de proteine (Peter H. R Green, Robert M Glickman, 1981) . Apolipoproteinele chilomicronilor sunt ApoB-48, ApoE si ApoC-2.

Figura Structura lipoproteinei chilomicron

Chilomicronii părăsesc intestinul prin intermediul sistemului limfatic și intră în circulația sanguina. ApoC-2 activeaza lipoprotein lipaza in prezenta fosfolipidelor in capilarele tesutului adipos, inima, musculatura scheletica si tesutul mamar, permitand eliberarea acizilor grasi liberi in tesuturi. Chilomicronii transporta astfel acizii grasi catre tesuturi unde vor fi consumati sau depozitati sub forma de energie. Resturile de chilomicroni (ramase fara mare parte din trigliceride, dar avand inca in compozitie colesterol, apoE si apoB-48) circula prin sange catre ficat. Receptorii din ficat se leaga de apoE din resturile de chilomicroni si ii mediaza incorporarea in endocitoza. In ficat, resturile elibereaza colesterolul si sunt degradate in lizozomi. (Lehninger, 2008).

Figura Transportul chilomicronilor

Lipoproteinele cu densitate foarte joasa

Cand dieta contine mai multi acizi grasi decat este imediat necesar ca sursa de energie, ei sunt convertiti in trigliceride in ficat si formeaza structuri cu apolipoproteine specifice sub forma de lipoproteine cu densitate foarte joasa (very low density lipoprotein). Excesul de carbohidrati din dieta pot fi de asemenea transformati in trigliceroli in ficat si exportati prin intermediul VLDL.

VLDL sintetizat in ficat este format dintr-un miez lipidic (in mare parte trigliceride), in jurul caruia se afla fosfolipide, colesterol ester si apolipoproteine specifice. Dimensiunea diametrului unei particule VLDL este intre 35-100 nm. Apolipoproteinele din structura VLDL sunt reprezentate de apoB-100, apoC-1, apo-C2, aboC-3 si apoE (Lehninger, 2008).

Fig. Structura unei lipoproteine cu densitate foarte joasa

Dintre apolipoproteine, apolipoproteina B (apoB) este cea mai importanta si confera stabilitate structurala particulei VLDL (Samanta Tiwari, A Siddiqi, 2012).

ApoB este o componenta structura esentiala pentru VLDL, IDL, LDL si chilomicroni. Aceasta proteina exista sub doua forme: apoB-100 (4536 resturi de aminoacizi) si apoB-48(2152 resturi de aminoacizi). ApoB-100 este sintetizata in ficat si reprezinta proteina structurala cheie a VLDL, IDL si LDL, in timp ce apoB-48 este sintetizata in primul rand in intestin si reprezinta o mare parte din structura chilimoicronilor (Segrest, Jones MK, 2001).

Biogeneza VLDL are loc in lumenul reticulului endoplasmatic si acest proces este realizat prin doi pasi. Procesul de formare al VLDL incepe cu translocarea apoB100 la exteriorul membranei reticulului endoplasmatic rugos. In primul pas, apoB100 este partial lipidata pentru a forma particula pre-VLDL saraca in lipide. Acest pas este facilitat de proteina microzomala de transfer a trigliceridelor. Aceasta este o proteina de transfer a lipidelor, capabila sa transfere atat lipide polare cat si neutre pentru dezvoltarea particulei VLDL. In al doilea pas, particula pre-VLDL fuzioneaza cu particulele bogate in trigliceride deja prezente in citosol (Samanta Tiwari, A Siddiqi, 2012).

Acizii grasi din VLDL sunt eliberati in tesutul adipos si muscular prin actiunea lipoprotein lipazei. Adipocitele preiau acizii grasi si ii transforma in trigliceride stocandu-le sub forma de picaturi lipidice intracelulare, in timp ce miocitele oxideaza acizii grasi pentru a furniza energie.

Dupa o lipoliza initiala, miezul resturilor VLDL care raman fara apo E sunt ulterior modificate, probabil de actiunea combinata a lipoprotein lipazei si a lipazei hepatice si a proteinelor de transfer lipidc, pentru a deveni proteine cu densitate mica (low density lipoproteins), in timp ce resturile VLDL ce contin apoE sunt eliberate de ficat prin intermediul legarii mediate de apoE la receptorii LDL, proteinele legate de reptorii LDL si/sau proteoglicanul heparat sulfat din hepatocite (B. H. Chung&Nassrin Dashti, 2000). Putem concluziona ca apoE actioneaza ca un ligand de legare specifica intre resturile VLDL si receptorii lipoproteinelor celulelor hepatice.

Odata cu pierderea triacilglicerolilor, o mare parte din resturile VLDL ce contin apoB-100 si apoE sunt convertiti in LDL.

Exista studii care au aratat ca apoC are un rol inhibitor asupra legarii lipoproteinelor ce contin apoE sau apoB la receptorii celulelor hepatice si celule non-hepatice (B. H. Chung&Nassrin Dashti, 2000).

Deoarece apoC are un rol direct inhibitor in legarea apoE din compozitia lipoproteinelor la receptorii lipoproteinelor, o eliberare eficienta a resturilor VLDL de catre ficat necesita disocierea apoC. Disocierea apoC de VLDL are loc atunci cand trigliceridele din VLDL sunt hidrolizate de lipoprotein lipaza, unde gradul de disociere a apoC din resturile VLDL este proportional cu gradul lipolizei. Exista studii care au demonstrat ca resturile de suprafata lipolitice, care sunt componentele de suprafata ale VLDL formate din fosfolipide, colesterol, apoC si/sau apoE, generate in timpul lipolizei VLDL au fost transformate in HDL (B. H. Chung&Nassrin Dashti, 2000).

Fig. Transportul resturilor VLDL

CAPITOLUL 3. LIPOPROTEINELE CU DENSITATE JOASA

Generalitati

Pe langa colesterolul sintetizat de novo, celulele obtin colesterol prin absorbtia lipoproteinelor plasmatice prin calea receptorului LDL. Colesterolul obtinut din hrana este transportat inital din intestinul subtire catre ficat, de unde mai apoi este transportat catre restul corpului. Colesterolul din dieta este absorbit de enterocitele intestinului subtire unde este impachetat cu trigliceride, in chilomicroni. Odata ce chilomicronii ajung in circulatie prin limfa, o parte din trigliceride sunt hidrolizate de catre lipoprotein lipaza si resturile de chilomicroni sunt preluate de catre hepatocite.

La randul sau, hepatocitele secreta lipide in particulele VLDL, care sunt transformate in circulatie in LDL, lipoproteina principala care furnizeaza colesterol catre celulele periferice. Asimilarea LDL si a altor lipoproteine ce contin apoE/apoB are loc prin intermediul receptorilor LDL si reprezinta un exemplu clasic pentru endocitoza mediata de receptori (L. Goedeke et al, 2012).

Lipoproteinele cu densitate joasa reprezinta transportorul majoritar al colesterolului in sange. Aceste particule lipoproteice au diamteru aproximativ 22 nm si o masa de aproximativ 3 milioane Da. Contine un miez de aproximativ 1500 molecule de colesterol esterificat. Miezul inalt hidrofob este acoperit de o pelicula de fosfolipide si colesterol neesterificat. Tot la exterior se gaseste apolipoproteina B-100 care este recunoscuta de celulele target. Rolul LDL este de a transporta colesterol catre tesuturile periferice si de a regla sinteza colesterolului de novo la acest nivel (Berg J.M., 2002).

Fig. Structura unei lipoproteine cu densitate joasa

Reglarea prin endocitoza mediata de receptori

Endocitoza mediata de receptori este principalul mecanism prin care celulele sunt capabile sa preia macromolecule din spatiul extracelular. Pentru celulele eucariote reprezinta un proces fundamental. In functie de tipul de receptor, soarta liganzilor poate cauza degradarea in lizozomi, re-secretia sau transcitoza. Initial, endocitoza a fost recunoscuta ca o cale ce poate furniza celulei nutrienti esentiali si regla concentratia metabolitilor din fluidele extracelulare (T. E. Willnow, 2012).

Functia principala a receptorului LDL este asimilarea lipoproteinelor cu densitate joasa boaate in colesterol din circulatie. Semnificatia acestui receptor pentru homeostazia colesterolului a fost subliniat in caracteristicile patologice ale pacientilor cu defect genetic ereditar la nivelul receptorului LDL in hipercolesterolemie familiala.

LDLR este o glicoproteina membranara cu rol in legarea si internalizarea particulelor lipoproteice circulantece contin colesterol. LDLR reprezinta un receptor cheie in mentinerea homeostaziei colesterolului la mamifere. Endocitoza mediata de LDLR este esentiala pentru metabolismul lipidic si lipoproteic. Recunoasterea apoB-100 din particulele LDL are loc cu stoechiometria unei singure copii a apoB-100 per o particula LDL per receptor monomer. VLDL, LDL, HDL si resturile de chilomicroni pot fi de asemenea recunoscuti de LDLR la un pH neutru. Complexul ligand-receptor este endocitat prin vezicule acoperite cu clatrina (A. Mani, 2012)

Fig. Endocitoza prin vezicule acoperite cu clatrina

Endocitoza incepe cu legarea unui ligand extracelular (portocaliu) la receptorul sau (verde) de pe suprafata celulei. Complexul receptor-ligand trece in regiunea membranei plasmatice marcate de structura citosolica de proteine, dintre care clatrina este componenta majora, ceea ce conduce la endocitoza mediata de clatrina (pasul 1). Tintirea receptorilor endocitati in veziculele acoperite cu clatrina implica un complex adaptor, precum proteina adaptor ubicuitara 2 (AP2; gri) sau receptori adaptori selectivi precum Disabled-2 la mamifere (nu este reprezentat pe desen). Aceste proteine adaptor interactioneaza cu motivul de internalizare din domeniul citoplasmatic al receptorilor si, direct sau indirect, leaga receptorii de veziculele de clatrina. Invaginarea in membrana plasmatica produce vezicule acoperita de clatrina care transporta receptorul si ligandul in interiorul celulei (pasul 2). Indepartarea stratului de clatrina permite acestor vezicule sa fuzioneze cu endozomii timpurii in care o scaadere a pH scindeaza legatura dintre ligand si receptor (pasul 3). Receptorii sunt reciclati inapoi la suprafata celulelor pentru urmatorul cicluc de endocitoza (pasul 4), in timp ce liganzii se deplaseaza intr-un endozom tarziu catre lizozomi (pasul 5) extracelulare. Unele complexe ligand-receptor rezista pH ului scazut din endozomii timpurii (pasull 6). Ei sunt reciclati inapoi la suprafata celulelor, rezultant resecretia liganzilor (pasul7). O a treia cale, care are loc in epitelul polarizat, implica receptori care conduc incarcatura lor de la regiunea basolaterala la cea apicala a membranei plasmatice (sau invers), permitatnd transcitoza liganzilor (pasul 8) (T. E. Willnow, 2012).

Receptorul LDL

Generalitati

Receptorul LDL este o proteina transmembranara de 839 aminoacizi, care prezinta urmatoarele domenii:

domeniul de legare (292 aminoacizi);

domeniu EGF like (400 aminoacizi);

domeniul bogat in carbohidrati (58 aminoacizi);

domeniul transmembranar (22 aminoacizi);

domeniul citoplasmatic (50 aminoacizi).

Receptorul LDL joaca un rol important si crucial in metabolismul colesterolului in ficat. LDL-R leaga LDL la un pH neutru de pe suprafata celulelor hepatocite. Complexul ligand-receptor este internalizat prin endocitoza mediata de receptor in vezicule acoperite de clatrina, eliberand ligandul sau in endozomi dupa expunerea la pH acid. Dupa eliberarea ligandului, LDLR este reciclat la suprafata celulei, in timp ce LDL este preluat de lizozomi unde este degradat. Daca ligandul nu este eliberat, intregul complex este supus degradarii lizozomale, pe termen lung acest fapt conduce la epuizarea receptorilor de pe suprafata celulelor. Legarea si eliberarea LDL de catre LDLR este esentiala in mentinerea nivelului normal al lipoproteinelor plasmatice; pacientii cu hipercolesterolemie familiala (FH) reprezinta rezultatul mutatiilor LDLR avand ca efect nivelul crescut de LDL plasmatic, ateroscleroza pematura sau boli cardiovasculare (Huang S.,2010).

Domeniul extracelular al LDLR contine 7 repetitii bogate in Cisteina, doua repetitii EGF like (Epidermal growth factor) (EGF-A si EGF-B), un domeniu β helical si o a treia repetitie EGF like (EGF-C) legat la suprafata celulei printr-un singur segment transmembranar. Fiecare secventa repetitiva bogata in Cys contine doua bucle stabilizate de trei punti disulfurice si un ion de Ca2+ (Huang S.,2010).

LDLR se leaga de LDL interactionand cu apolipoproteina B. Resturile incarcate negativ din jurul ionilor de Ca2+ din regiunile repetitive bogate in Cys se leaga de doua resturi incarcate pozitiv ale apoB din LDL si de proteina apoE din structura VLDL. Eliberarea particulelor lipoproteice necesita un domeniu omolog EGF-precursor (Huang S.,2010).

Descoperirea receptorului LDL

In 1972, Goldstein si Brown in loc sa masoare sinteza colesterolului din acetat, au decis sa masoare activitatea unei singure enzime si anume 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A reductaza in culturi celulare de fibroblaste. Ulterior, studiile pe ficat de soarece au dovedit ca HMG-CoA reductaza catalizeaza etapa limitanta de viteza in producerea de colesterol si activitatea ei este redusa cand soarecii au ingerat colesterol.

Goldstein si Brown au stabilizat un microtest pentru HMG-CoA reductaza. Cand fibroblastele umane normale au fost cultivate in prezenta de ser, activitatea HMG-CoA a scazut. Atunci cand lipoproteinele transportoare de colesterol au fost indepartate din mediu de cultura, activitatea enzimei a crescut de 50 ori in 24 ore. Enzima indusa a fost rapid supresata cand s-a adaugat LDL inapoi in mediu. Nu toate lipoproteinele au putut suprima activitatea HMG-CoA; dintre cele doua clase majore de lipoproteine plasmatice transportoare de colesterol LDL si HDL, doar LDL a fost eficient. Acesta a fost primul indiciu a existentei unui receptor implicat in acest proces. Un al doilea indiciu a fost concentratia necesara de LDL (Brow, Goldstein, 1973).

Cheia mecanismului de receptor a aparut in 1973 din studiile realizate pe celule de la pacienti cu hipercolesterolemie familiala heterozigota. Cand au fost crescute in ser ce continea lipoproteine, activitatea HMG-CoA a fost de 50-100 ori mai mare decat valoarea normala. Aceasta activitate nu a crescut in mod semnificativ cand lipoproteinele au fost inlaturate din ser si nu a existat nici o supresie atunci cand LDL a fost adaugat din nou.

Ulterior, urmatorul experiment a constat in furnizarea colesterolului in etanol in loc in LDL. Cand s-a amestecat cu solutii ce contin albumina, colesterolul a format o emulsie cvasi-solubila care a patruns in celula prin absorbtie in membrana plasmatica. Cand s-a adaugat colesterol in aceasta forma, activitatea HMG-CoA reductazei a fobroblastelor normale si cele cu hipercolesterolemie familiala homozigota au fost supresate in egala masura (Brown, Goldstein, 1973).

Atunci, Brown si Goldstein au mers pe ipoteza ca LDL actioneaza prin legarea la un receptor si genereaza cativa mesageri secundari care supreseaza activitatea HMG-CoA reductaza.

Existenta receptorilor LDL a fost demonstrata in mod formal in 1974, tot de Brown si Goldstein, prin radiomarcarea LDL cu iod si au aratat ca celulele normale au situsuri cuu mare afinitte de legare pentru I-LDL, in timp ce celulele provenite de la indivizi cu hipercolesterolemie familiala homozigota nu dispun de aceste situsuri (Goldstein, 1974). Au fost dezvoltate tehnici care au demonstrat ca receptorul care se leaga de LDL ramane la suprafata celulelor normale pentru mai putin de 10 minute. Pana in acel moment, majoritatea particulelor LDL se leaga de suprafata celulelor patrunzand in interiorul acestora, in alte 60 minute proteina din ILDL a fost degerata complet la aminoacizi si I, care fusese atasat la resturile de Tirozina a LDL, fusese introdus in mediu ca I-monotirozina (Goldstein 1976). Intre timp, colesterolii esteri din structura LDL au fost hidrolizati, generand coleterolul neesterificat, care ramane in interiorul celulei (Brown, 1975).

Origine si concept

Rapiditatea internalizarii si degradarii receptorului legat de LDL sugereaza faptul ca celula poseda un mecanism special de transport al receptorului legat de LDL de la suprafata celulei catre lizozom. Acest mecanism este reprezenat de endocitoza, procesul prin care moleculele din spatiul extracelular se internalizeaza in celule prin intermediul unor vezicule care se formeaza din membrana plasmatica. Pentru a determina daca endocitoza este implicata in asimilarea particulelor LDL, Goldstein si Brown au realizat un studiu in colaborare cu Richard G. W. Anderson in 1975.

Prin utilizarea LDL cuplat cu feritina electrono-densa, au identificat ca receptorul cuplat cu LDL este internalizat prin endocitoza. Ba mai mult, studiile morfologice au explicat eficienta internalizarii: eficienta este conditionata de gruparea receptorilor LDL in vezicule acoperite. Studiile au aratat ca veziculele acoperite de la suprafata celulelor internalizeaza pentru a forma vezicule endocitice acoperite care transporta fluid extracelular si continutul acestuia in interiorul celulei. In 1976, Pearse a purificat veziculele acoperite si a descoperit ca stratul citoplasmic era compus in principal dintr-o proteina, clatrina. Descoperirea ca receptorii LDL sunt grupati in vezicule acoperite de clatrina a crescut posibilitatea ca aceste structuri servesc ca drept vezicule de colectare pentru receptorii de pe supafata celulara destinati endocitozei. Alte proteine membranare, care nu sunt incluse in vezicule acoperite, nu pot patrunde atat de rapid in interiorul celulei (Goldstein, 2009).

Interpretarea functiei veziculelor acoperite a fost intarita de studiul asupra hipercolesterolemiei familiale homozigote. Majoritatea celulelor FH homozigotice pur si simplu reusesc sa se lege de LDL. In colaborare cu Anderson, Brown si Goldstein au stabilit ca rolul estential al veziculelor acoperite este eficienta sporita a asimilarii moleculelor legate de receptori (Goldstein, 2009).

Alte studii asupra receptorilor LDL au identificat o alta caracteristica generala a endocitozei mediata de receptori, aceea ca receptorii pot fi reciclati. Dupa internalizare, receptorii disociaza de liganzii lor atunci cand sunt supusi unei scaderi a pHului in endozomi. Dupa disociere, receptorii se intorc catre suprafata celulei. Receptorii LDL realiceaza un drum in interiorul si in afara celulei o data la 10 minute. In masura ce fiecare particula LDL contine aproximativ 1600 molecule de colesterol, aceasta reciclare rapida a receptorilor LDL este o dovada a mecansimului eficient de livrare a colesterolului catre celule (Goldstein, 2009).

Endocitoza LDL

Calea de endocitoza prin care particulele LDL sunt internalizate in interiorul celulei presupune mai mlte etape, etape ce pot fi observate si in figura

Receptorii LDL de pe suprafata celulelor se leaga de apoB d in stratul exterior fosfolipidc al particulei LDL. Interactia dintre NPXY din coada citosolica a receptorului LDL si complexul AP2 incorporeaza complexul receptor-ligand in veziculele endocitice formate.

Veziculele acoperite cu clatrina contin complexe LDL-receptor

Endozomii timpurii fuzioneaza cu endozomii tarzii. pH-ul acid din acest compartiment determina o modificare a conformatiei receptorului LDL care conduce la eliberarea lui din complexul LDL-LDLR.

Endozomul tarziu fuzioneaza cu lizozomul iar in lizozom particulele LDL sunt degradate sub actiunea lipazei acide eliberand colesterolul ester. Colesterolul liber iese din lizozom si este transportat catre reticulul endoplasmatic, membrana plasmatica si alte componente celulare avand rol reglator, functional si structural.

Receptorul LDL este reciclat inapoi la membrana plasmatica printr-un mecanism care depinde de Rab GTPaza precum Rab8 si Rab11. Ajuns la suprafata celulei, datorita pH-ului neutru, receptorul este supus unei schimbari conformationale ca sa se poata lega de alta particula LDL si sa initieze din nou acelasi proces.

Figura Endocitoza LDL

Dupa ce ajunge la RE colesterolul derivat din LDL (LDL-C) inhiba calea proteinei de legare a elementului reglator SREBP, si ulteror urmeaza reducerea transcriptiei genelor responsabile de sinteza si asimilarea colesterolului. Acumularea LDL-C in ER de asemenea blocheaza sinteza colesterolului prin accelerarea degradarii proteozomale a enzimelor cheie printre care HMG-CoA reductazasi scualen monooxigenaza. Mai mult, LDL-C induce activitatea ACAT-1, o enzima care catalizeaza conversia colesterolului in colesterol ester depozitat sub forma de picaturi lipidice in citosol, scazand direct nivelul colesterolului liber in ER (Ximing Du et al, 2012).

Transportul intracelular al colesterolului

Deoarece colesterolul este insolubil, transportul non-vezicular este mediat de proteina transportoare difuzabile, care au cavitati hidrofobe pentru a lega si transporta colesterolul din citosol. Au fost identificate o serie de proteine implicate in transportul intracelular al colesterolului: SCP-2 (sterol carrier protein 2), familia ORP (oxysterol-binding protein-related protein) si START [STAR (steroidogenic acute regulatory protein)-related lipid transport] (L. Goedeke et al, 2012).

SCP este o proteina mica de transfer a lipidelor solubile, capabila sa transporte sterolii si o varietate de lipide intre membrane in vitro. Mai multe studii au demonstrat ca ca SCP-2 poate transfera colesterol intre membranele biologice si ca transportul si distributia colesterolului sunt afectate cand expresia SCP-2 creste sau scade. Unele studii au demonstrat ca are de asemenea un rol pentru caveoline, proteine membranare asociate cu colesterolul si sfingolipidele in transportul colesterolului. Se presupune ca aceste caveoline formeaza un complex Chaperone cu colesterolul si ca aceste particule lipidice intracelulare transporta colesterolul de-a lungul celulei (L. Goedeke et al, 2012)..

Membrii familiei ORP au fost identificati ca receptori citosolici pentru 25-hidrocolesterol si cativa membrii s-au dovedit a media traficul colesterolului in sistemul endozomul tarziu, precum ORP-9, ORP4-S, ORP-1L di ORP5. OSBP, primul membru identificat, a fost izolat pentru abilitatea sa de a lega oxisterol. ORP9 leaga si transporta colesterolul intre membrane si joaca un rol in transportul colesterolului intre ER si aparatul Golgi. ORP4-S se asociaza cu filamentele intermediare si supraesxpresia sa scade esterificarea colesterolului derivat de la LDL. Recent, s-a descoperit ca ORP5 joaca un rol in transportul non-vezicular al colesterolului din endozomul tarziu in ER(L. Goedeke et al, 2012)..

S-a identificat ca familia de proteine care contine domeniu START se leaga de lipide si joaca un important rol in traficul intracelular. Aceste proteine sunt localizate in citosol si se leaga de membrana sau in nucleu (L. Goedeke et al, 2012).

Reglarea transportului colesterolului derivat din LDL din endozomi in membrana plasmatica si reticulul endoplasmatic

Niemann-Pick C1 si Niemann Pick C2. Niemann-Pick C1 (NPC1) si NPC2 sunt doua proteine distincte cunoscute pentru reglarea transportului colesterolului endozomal. Mutatii la nivelul Npc1 sau Npc2 au drept rezultat cumularea colesterolului neesterificat in endozomii tarzii/lizozomi. Aceasta acumulare a colesterolului liber si altor libide datorita mutatiilor la nivelul genelor care codifica aceste proteine este un eveniment rar intalnit, o afectiune medicala fatala numita Niemann-Pick.

A doua gena NPC (Npc) a fost identificata in 2000. NPC2 este localizata in principal in lumenul endozomului tarziu. Se pare ca actiunea NPC2 este strict dependenta de receptorii pentru manoza-6-fosfat. Cand doi astfel de receptori sunt absenti, NPC2 nu msi sjung in endozomul tarziu/lizozom conducand la acumularea colesterolului in endozomul tarziu/lizozom (Ximing Du et al, 2012)..

ORP5 au fost identificate ca noile proteine implicate in traficul colesterolului endozomal. ORP5 la oameni este o proteina cu 879 de aminoacizi, capabila sa lege colesterol si 25-hidrocolesterol atat in vivo cat si in vitro. O scadere a expresiei ORP5 conduce la acumularea LDL-C in endozomii tarzii si afecteaza transportul LDL-C in reticulul endoplasmatic. Potentialul rol al ORP5 in traficul colesterolului endozomal poate indica o interactie intre ORP5 si NPC1. Intradevar, ORP5 pare sa functioneze in aval de NPC1 pentru a facilita iesirea colesterolului din membrana lizozomului. Se pare ca se acumuleaza colesterol in membrana lizozomului dupa o scadere al ORP5, ceea ce difera de scaderea NPC1, unde colesterolul se acumuleaza in lumen. Insa, scaderea atat a ORP5 cat si a NPC1 presupune un fenotip similar doar scaderii NPC1, acumularea colesterolului predominant in lumenul lizozomului. Aceste observatii sustin impoteza ca NPC1participa la ajungerea LDL-C in membrana lizozomului, unde ORP5 poate fi necesar pentru a forma un mecanism de eliberare a colesterolului (Ximing Du et al, 2012).

PCSK9. Hexin subtilizina convertaza de tip 9 este o serin proteaza ce joaca un rol important in controlul nivelului LDLR, dar mecanismul precis nu era inca elucidat. In 2003 mutatii la nivelul aceste proteine au fost asociate cu hipercoleserolemie transmisa autozomal dominant (Abifadel et al, 2003).

Disponibilitatea LDLR de a intra in endocitoza este reglata de proteina PCSK9. Secretia PCSK9 concureaza cu apoproteinele asociate proteinelor ca un ligand pentru LDLR in legarea la receptor si conduce la endocitoza si degradarea complexului. PCSK9 pare sa intrerupa reciclarea receptorilor intracelulari prin legarea de LDLR inaintea plasarii acestora pe suprafata hepatocitelor (Geoghegan, 2009).

PCSK9 este sintetizata ca o proproteina care trebuie sa se scindeze singura pentru a ajunge la aparatul Golgi, dupa ce este secretata si degradeaza receptorii LDL. PCSK9 secretata actioneaza ca o proteina Chaperone legandu-se de domeniul extracelular al receptorilor LDL la regiunile repetitive EGF-like,scazand reciclarea acestora catre suprafata membranei (Zhang et al, 2007).

Studii recente au descoperit un numar mare de variatii genetice ale PCSK9 care moduleaza nivelul colesterolului pozitiv sau negativ, astfel influentin riscul aterosclerozei.

CAPITOLUL 3. LIPOPROTEINELE CU DENSITATE MARE

Compozitia HDL

Principala componenta proteica din structura HDL este apolipoproteina A-1 (apoA-1), care inconjoara particula. Functional, apoA-1 formeaza structura initiala a HDL discoidal si este recunoscuta de cele mai importante proteine implicate in RCT: LCAT, ABCA1 si receptorul scavenger BI. ApoA-1 nu reprezinta numai componenta structurala principala, ci serveste ca molecula de recunoastere pentru majoritatea proteinelor care interactioneaza cu particulele HDL. Studiile umane au demonstrat ca mutatiile la nivelul apoA-1 reprezinta o expunere mai mare la dezvoltarea aterosclerozei comparativ cu alte proteine RCT (Hovingh, 2005)

HDL inlatura excesul colesterolului din tesuturile si celulele periferice. HDL transporta acest colesterol catre ficat pentru eliminarea lui in bila. Acest proces a efluxului colesterolului periferic in HDL si transportul lui catre ficat se numeste transportul invers al colesterolului (RCT).

Transportul invers al colesterolului (RCT) este o cale de transport al colesterolului din celulele extrahepatice catre ficat si intestin pentru excretie. Prin reducerea acumularii colesterolului in peretii vaselor de sange , RCT poate preveni dezvoltarea aterosclerozei. Efluxul colesterolului, parte din procesul RCT reprezinta un proces major prin care macrofagul din peretele vaselor de sange secreta colesterolul in afara celulelor. Nivelul HDL poate determina eficienta RCT si efluxul colesterolului.

Biosinteza HDL

Biosinteza HDL este un process complex si implica sinteza si secretia compoentelor proteice majore ale HDL urmate de dobandirea lipidelor (fosfolipide si cholesterol) si asamblarea si generarea particulei mature HDL. Aporoteinele majore ale HDLsunt apoA-1 si apoA-2 si ambele sunt necesare pentru biosinteza normal a HDL. ApoA-1 reprezinta aproximativ 70% din proteinele HDL si este prezenta pe intraga molecula HDL. Astfel nu este de mirare ca deletia genei Apoa! Are ca rezultat nivel extreme de scazut al HD (9). ApoA-1 este sintetizat atat in instestin cat si in ficat. ApoA-2 reprezinta aproximativ 20% din proteinele HDL si este sintetizata numai in ficat (Radr, 2006). Noile apolipoproteine necesita lipide pentru a genera particule HDL. Studii recente au stabilit ca lipidarea apoproteinelor HDL are loc initial dupa secretia lor si ABCA1 este un participant decisive in lipidarea apoA-1 nou secretate. In timp ce ficatul si intestinal sunt decisive pentru lipidarea initiala a apoA-1 prin BCA1, HDL isi procura o mare parte din lipide de la alte surse precum alte tesuturi si alte lipoproteine (Radr, 2006).

Nu se cunosc foarte multe despre sursele sau mecanismul lipidarii extrahepatice a HDL. Macrofagul, cel mai important tip cellular pentru efluxul colesterolului din punct de vedere a aterosclerozei, in mod cert nu confera mult cholesterol molecule HDL. Deoarece toate celulele extrahepatice necesita cholesterol si inca nu il pot metabolize, au nevoie de efluxul colesterolului din HDL(Radr, 2006).

HDL dobandeste lipide, in principal fosfolipide, de la alte lipoproteine. Lipoproteinele bogate in triglyceride sunt supuse hidrolizei miezului trigliceridic, suprafata fosfolipidica (si apoproteinele) sunt transferate catre HDL. Astfel, activitatea lipoproteinlipazei este invers asociata cu nivelul HDL-C. Fosfolipidele derivate de la alte lipoproteine sunt trasferate catre HDL de catre protein de transfer fosfolipaza (PLTP).

Dezvoltarea si maturarea HDL necesita esterificarea colesterolului pentru a forma cholesterol ester si miezul hidrofob lipidic al HDL. HDL-CE este format de catre actiunea lecithin-colesterol aciltransferaza (LCAT). LCAT este importanta in mentinerea metabolismului normal al HDL (Radr, 2006).

Figura Biosinteza HDL. Enterocitele si hepatocitele sintetizeaza apoA-1, care este secretata in forma saraca in lipide si apoi imediat necesita prezenta colesterolului liber (FC) si a fosfolipidelor (PLs) prin calea ABCA1, formand HDL nascenta. Aceasta se ataseaza de mai multe lipide din tesuturile periferice si lipoproteine si LCAT genereaza colesterol ester (CE), formand HDL matur. Ficatul de asemenea sintetizeaza apoA-2, care rezulta o alta clasa de HDL care contine atat apoA-1 cat si apoA2

HDL catabolism

Locul major al absorbtiei colesterolului HDL este ficatul. Mecanismul cel mai bine inteles al absorbtiei directe a colesterolului HDL de catre ficat este cel mediat de receptorii scavenger clasa B1 (SR-BI). Important, SR-BI initiaza absorbtia hepatica a colesterolului HDL (atat cel esterificat cat sic el neesterificat.) fara sa medieze degradarea apolipoproteinelor HDL, un process cunoscut ca absorbtie selectiva. Exista studii care sugereaza ca SR-BI mediaza internalizarea intregii particule a HDL, cu eliberarea ulterioara a colesterolului si resecretiei particulelor HDL fara colesterol. Numeroase studii indica faptul ca SR-BI are un rol important in metabolismul HDL(Radr, 2006)..

La oameni, o alta cale alternativa prin care colesterolul HDL este metabolizat si transportat catre ficat, o cale mediata de proteina de transfer CE (CETP). CETP transfera trigliceridele din lipoproteinele ce contin apoB in schimb pentru HDL-CE, astfel rezultant epuizarea CE si imbogatirea cu trigliceride a HDL (Radr, 2006).

Efluxul colesterolului in HDL nascent

Etapa limitanta de viteza in RCT este efluxul colesterolului, proces mediat de productia genei ABCA1 (ATP-binding membrane cassette transport protein A1). Aceasta gena initiaza efluxul colesterolului prin catalizarea transferului de colesterol si fosfolipide din celulele potential aterogenice in tesuturile periferice in HDL discoidal (Wang, 2000). Procesul de eflux conduce la legarea HDL discoidal de ABCA1 de pe suprafata celulelor, internalizarea si ulterior transportarea prin vezicule endocitice in interiorul celulei. In timp ce sunt in interiorul endozomului, ABCA1 si proteina Niemann-Pick C1 mediaza transferul lipidelor in HDL intracelular. Ulterior, complexul revine la suprafata celulei si disociaza, astfel eliberand molecula nedegradata de pre-β2-HDL bogata in colesterol.

Studiile genetice au stabilit ca ABCA1 are un rol important in geneza HDL. Studii recenta au identificat mutatii comune care joaca un rol important in homeostazia HDL. De exemplu, in studiul lor pe pacienti cu niveluri scazute al HDL, Cohen si colaboratorii au identificat o mutatie la nivelul ABCA1 la 20 de cazuri dintr-un esantion de 128 pacienti. Ba mai mult, studii pe un numar mai mare de populatie au estimat ca mutatiile la nivelul gene ABCA1 sunt responsabile pentru 10% din cazurile cu nivel scazut de HDL (Nordestgaard, 2004).

Maturarea HDL

In timpul maturizarii HDL, pre-β-HDL discoidal este convertit in α-HDL sferic prin intermediul conversiei colesterolului in colesterol ester, conversie mediata de LCAT. Aceasta proteina formata din 416 aminoacizi este sintetizata in ficat si secretata in circulatie, unde se gaseste atat legata de lipoproteine cat si de lipide libera. La particulele HDL, LCAT genereaza colesterol esteri prin catalizarea transferului a doua grupara acyl a lecitinei la gruparea hidroxil a colesterolului. LCAT poate de asemenea esterifica colesterolul din LDL, dar HDL prezinta specificitate mai mare datorita prezentei apoA-1, care reprezinta un cofactor (Francone, 1997).

Colesterol esterii sunt compusi mai hidrofobi decat colesterolul liber si se acumuleaza in centru particulelor HDL conducand la o schimbare geometrica de la forma discoidala la forma sferica. Acest proces este critic pentru efluxul colesterolului, deoarece contribuie la mentrinerea unui gradient de concentratie favorizand cresterea colesterolului liber in lipoproteine inclusiv HDL (Fielding, 1984).

In absenta colesterolului, LCAT este o fosfolipaza care genereaza lisolecitina si acizii grasi liber. (C. F. Fielding, 1995). La oameni, mutatiile la nivelul LCAT poate cauza deficienta familiala de LCAT (FLD), care este caracterizata prin opacitati corneene severe, nivel scazut de HDL, crestere brusca a LDL si a trigliceridelor si acumularea HDL sub forma discoidala in plasma. In plus, unele deficeiente LCAT pot perturba interactiunea cu apoA1, ceea ce conduce la boala de ochi de peste, scaderea HDL (dar nu si scaderea LDL), scaderea colesterol esterilor (Kuivenhoven, 1997).

Activitatea lipazelor

Lipazele sunt enzime solubile in apa care hidrolizeaza legaturile esterice ale substraturilor insolubile in apa precum trigliceridele, fosfolipidele si colesterol esterii.

Lipaza endoteliala (EL), lipaza hepatica (HL) si lipoprotein lipaza (LPL) sunt trei protein lipaze vasculare care migreaza la celulele endoteliale si se ancoreaza la partea distala prin interactii cu proteoglicanii sulfat de haparina. Aceste protein lipaze sunt factori importanti implicati in metabolismul lipoproteinelor si homeostazia coelsterolului. Unele lipaze interactioneaza direct cu receptorii lipoproteinelor, precum receptorii LDL, imbunatatind metabolismul si circulatia lipoproteinelor. Majoritatea activitatii catalitice a EL este hidroliza fosfolipidelor din VLDL, chilomicroni si HDL (Marchadier, 2002).

HL este sintetizata de hepatocite si apoi secretata si atasata de matricea extracelulara a celulelor endoteliale hepatice. HL are capacitatea de a hidroliza trigliceridele, IDL si VLDL, precum si de a cataliza conversia subspeciilor α-HDL HDL2 in HDL3 mai dens. Aceasta a doua functie are implicatii directe in RCT pentru ca este mult mai probabil ca HDL2 sa interactioneze cu SR-BI pentru endocitoza sau efluxul colesterolului (Catalano, 2008).

LPL este o enzima esentiala implicata in hidroliza particulelor bogate in trigliceridele din muschi, tesut adipos si macrofage, un proces ce genereaza acizi grasi liberi si glicerol necesari metabolismului energetic sau stocarii (Goldenburg, 1996).

Modificarile lipoproteinelor circulante

Homeostazia colesterolului este modulata de proteine care catalizeaza schimbul colesterolului si alte lipide din clasa lipoproteinelor plasmatice. In plasma exista doua proteine de transfer importante: proteina de transfer a colesterolului ester (CETP) si proteina de transfer fosfolipidic (PLPT).

CETP catalizeaza schimbul de colesterol esteri din HDL pentru trigliceridele din LDL si VLDL.

PLPT regleaza dimensiunea si compozitia HDL prin remodelarea particulei si prin schimbul lipidic. PLPT este capabila sa catalizeze fuziunea a doua particule de HDL3 pentru a forma o particula mare de HDL2, in timp ce elibereaza lipidele sarace in apoA-1, precursorul pre-β. PLPT faciliteaza transferul de fosfolipide si intr-o masura mai mica, a colesterolului din lipoproteinele bogate in trigliceride precum VLDL si chilomicroni in HDL. PLPT este esentiala pentru mentinerea normala a concentratiei HDL plasmatice (Rao R, 1997).

Implicare SR-BI

In final, excesul de colesterol este indepartat (prin efluxul colesterolului) si lipoproteinele bogate in colesterol sunt transportate catre ficat pentru excretia lipidelor (eliminarea HDL). Proteina SR-BI este foarte importanta deoarece este implicata in ambele procese. Gena este exprimata in principal in tesuturile suprarenale si in ficat, unde se ataseaza de epitelii. Exista studii care au aratat ca eliminarea HDL este redusa cand exista un deficit de SR-BI (Out R., 2004).

SR-BI catalizeaza absorbtia colesterolului dinpparticulele HDL in hepatocite, unde este convertit in acizi biliari. Mecanismul de eliminare a HDL este diferit de efluxul colesterolului mediat deABCA1 si internalizarea intregii particule in celula a receptorilor LDL prin endocitoza; colesterol esterii sunt patrund in mod selectiv in tesuturi. Astfel, molecula matura α-HDl poate fi reciclata rapid inapoi sub forma de pre-β-HDL si RCT incepe din nou. Afinitatea interactiilor SR-BI/lipoproteine este complexa si strans legata de compozitia apoproteinei si geometria particulei. SR-BI leaga atat LDL cat si HDL, insa are o specificitate de legare mai mare pentru lipoproteinele care contin apoA1. De fapt, cele trei apoproteine asociate moleculei HDL- apoA1, apoA2, apoA3- fiecare interactineaza cu SR-BI si astfel creste afinitatea pentru deplasarea colesterolului (Huang X., 1997).

SR-BI joaca un rol important in efluxul colesterolului, actionand ca un donor de colesterol pentru HDL, fiind proteina cea mai importanta in RCT.

Fig Transportul invers al colesterolului

Sinteza hepatica a aicizilor biliari

Colesterolul in exces este eliminat prin formarea acizilor biliari si urmata de excretia in bila.

Colesterolul ajuns la ficat prin intermediul HDL intra in calea de sinteza a acizilor biliari, numita si catabolismul colesterolului, care incepe cu modularea enzimatica a colesterolului hepatic in 7-α-hidroxicolesterol de catre colesterol 7-α-hidroxilaza (CYP7A1). Activitatea transcriptionala a CYP7A1 are rol decisiv in eficacitatea caii catabolice a colesterolului si rol critic in homeostazia colesterolului hepatic. Unul din reglatorii transcriptionali ai CYP7A1 este receptorul Farnesoid X (FXR). Acesta supreseaza activitatea CYP7A1 cand concentratia hepatica a sarurilor biliare este mare. Urmatoarele etape ale conversiei colesterolului in saruri biliare precum acid taurocolic si glicocolic implica cel putin 16 enzime. Dupa ce sunt sintetizati, acizi biliari pleaca de la ficat la vezica biliara, in duoden, inapoi la enterocitele din ileon, prin vena porta si inapoi in hepatocite de maii multe ori pe zi pana in timp indeplinesc functia primara de protectie a digestiei lipidelor (Russel, 2009).

CAPITOLUL 4. ROLUL LIPOPROTEINELOR SI AFECTIUNI

Transportul vitaminei E.

Vitamina E este cel mai abundentent antioxidant intalnit in plasma umanasi exista sub doua forme: tocoferoli si tocotrienoli.

Absorbtia vitaminei E. Pentru absorbtia vitaminei E este necesar formarea unor formatiuni micelare. Enzimele pancreatice pot de asemenea ajuta absorbtia vitaminei E, acest fapt fiind sugerat prin gasirea unui deficit al vitaminei E la pacientii cu fibroza cistica, care nu secreta enzyme pancreatice. Se credea ca absorbtia vitaminei E este un process simplu de difuzie pasiva. Studii recente sugereaza ca SR-BI joaca un rol in absorbtia vitaminei E. Se crede ca absorbtia vitaminei E in intestine are loc predominant prin trecerea chilomicronilor din sistemul limfatic. In concordant cu aceasta ipoteza este observatia ca absorbtia vitaminei E este dependent de disponibilitatea acidului olei pentru sinteza trigliceridelor si formarea chilomicronilor si este inhibata de inhibitorii proteinelor microzomale de transport a trigliceridelor (MTP).

Absorbtia intestinala a vitaminei E este mediate de SR-B1 intr-un mechanism similar cu al absorbtiei colesterolului. Absorbtia intestinala a vitaminei E implica mecanisme complexe precum modularea receptorilor nuclear, activitatea Adenosine triphosphate binding cassette transporters. Dispersia vitaminei E in lumenul intestinal impreuna cu aportul lipidic, poate influenta marcabil digestia si absorbtia vitaminei E. Odata intrat in circulatia prin limfa, trigliceridele chilomicronilor sunt hidrolizate de LPL, resultant resturile de chilomicroni. Acizii grasi eliberati si cateva molecule de vitamina E sunt transferate catre tesuturile periferice, in timp ce resturile de chilomicroni, ce transporta vitamina E, sunt preluati de catre endocitoza hepatica printr-un mecansim mediat de receptori (Iqbal et al, 2009).

Metabolismul hepatic al vitaminei E.

Receptorii hepatici, precum receptorii LDL sunt implicate in acest process de asimilare. Forma hepatica a vitaminei E α tocoferoleste selectata specific de catre α TTP (protein de transfer a α tocoferol), o protein hepatica citoplasmatica mica cu afinitate diferita pentru α-tocoferol. Aceasta protein este expresata nu numai in ficat, ci si in creierul uman si in placenta, limitand astfel utilizarea altor forme de vitamina E la oameni. Functia α-TTP este de a ncorpora vitamina E preluata de celulele hepatice in VLDL, insa mecanismul exact nu este cunoscut inca. Similar particulelor de chilomicroni, trigliceridele VLDL sunt catabolizate de LPL la suprafata endoteliului vascular a tesuturilor periferice transferand tocoferolul in tesuturile adiacente si in particulele HDL (Iqbal et al, 2009)..

Aproximativ 50-60% din resturile VLDL (sau IDL) formate astfel sunt preluate de catre ficat, in timp ce 40-50% este catabolizat in LDL si transportat catre alte tesuturi periferice. In final, schimburile de α-tocoferol au loc de asemenea intre particulele HDL si LDL, care sunt importante pentru transportul vitaminei E in circulatie si livrarea la tesuturile reproducatoare si alte tesuturi, in special in ficat, plamani si creier. Dobandirea tocoferolului de catre tesuturi este in principal mediat de receptorul SR-BI (Amelie et al, 2009).

Transportul vitaminei A.

Formele principale ale vitaminei A din dieta sunt reprezentate de carotenoizii din fructe si legume si esterii acizilor grasi cu lant lung al retinolului in hrana de origine animal. Carotenoizii sunt fie clivati pentru a genera retinol, fie absorbiti in forma intact, in timp ce retinil esterii necesita o hidrolizare complete in lumenul intestinal pentru a elibera retinol liber inainte ca retinolul sa poata fi preluat de catre enterocite. Hidroliza retinil esterilor necesita activitate lipazica. Procesul de hidroliza a trigliceridelor furnizeaza un mediu propice pentru solubilizarea vitaminei E.

Retinolul liber este preluat de catre celulele mucoasei intestinale. Dupa absobtia celulara, proteinele intracelulara de legare a retinolului (CRBPs), CRBP-1 si CRBP-2 acapareaza imediat retinolul liber. CRBP-1 este prezent in mai multe tesuturi, in timp ce CRBP-2 este prezent in principal in celulele absorptive din intestinul subtire. CRBP-2 este cea mai abundenta proteina solubila din mucoasa jejunului, ceea ce indica faptul ca poate fi singura c favorizeaza absorbtia retinolului din intestin. O parte din retinolii liberi ramasi in enterocite asociati cu CRPB, insa in special retinolul este esterificat in general de lecitin retinol aciltransferaza si depozitate in celule.

Studii metabolice au descoperit ca majoritatea dintre retinil esteri sunt prezenti in plasma in compozitia chilomicronilor mici, o parte semnificativa se gasesc in chilomicronii mari si o mica parte se gasesc in VLDL.(108)

Pluronic L81, care inhiba secretia chilomicronilor, scade secretia retinil esterilor si secretia lor nu a crescut in prezenta lipoproteinelor mici.Acest fapt sugereaza ca secretia retinil esterilor reprezinta un proces de reglar de mare specificitate dependent de formarea si secretia chilomicronilor. De asemenea in circulatia portala, este secretat un numar semnificativ de retinol, probabil sub forma de retinol liber; acesta se pare ca este semnificatia fiziologica in conditii patologice care afecteaza secretia chilomicronilor.

Hipercolesterolemia familiala

Perspectiva istorica

Hipercolesterolemia familiala, cea mai comuna si severea forma de hipercolesterolemie monogenica, a fost prima boala genetica a metabolismului lipidic caracterizata clinic si genetic. Boala are un patern de mostenire autozomal codominanta si este cauzata de mutatii la nivelul genei LDLR; indivizii cu doua alele LDLR mutante (FH homozigota) sunt afectati intr-o maniera mai severa decat cei cu o singura alela mutanta (FH heterozigota). Nivelul plasmatic al LDL colesterolului este foarte mare si unifrom in FH homozigota indiferent de dieta, medicatie sau stil de viata. De exemplu, persoanele diagnosticate cu FH homozigota care traiesc in China, unde absorbtia din alimentatie si grasimi saturate este scazuta, prezinta un nivel de LDL colesterol similar cu a celor diagnosticati cu aceeasi afectiune care locuiesc in tarile vestice (D.J.Rader et al, 2003).

Persoanele cu FH homozigota dezvolta in copilarie ateroscleroza coronariana sau xantoame cutanate. Gradul de severitate a aterosclerozei este direct proportional cu masura si durata si masura LDL colesterol plasmatic (calculat ca si nivelul colesterolului anual). Daca nivelul LDL colesterolului nu este redus, indivizii cu FH homozigota mor datorita aterosclerozei premature(D.J.Rader et al, 2003).

Pacientii cu Fh homozigota sunt clasificati intr-un grup bazat pe totalitatea activitatii LDLR masurata in fibroblastele pielii lor: pacientii cu o activitate a LDLR de 2% mai mica decat cea normala(receptor negativ) si pacientii cu activitate de 2-25% mai mica decat cea nornala (defectiv de receptor). In general, nivelul LDL colesterol din plasma este invers corelata cu activitatea LDLR (D.J.Rader et al, 2003).

La indivizii cu FH heterozigota nivelul colesterolului LDL plasmatic este mai scazut si mult mai dependent de alti factori de mediu si genetici comparativ cu cei FH homozigota.

Diagnostic. In general, diagnosticul dislipidemiei familiale este bazat pe istoria familiala a hipercolesterolemiei si aterosclerozei premature, profilul lipidic si prezenta xantoamelor. Peste 900 de mutatii la nivelul genei LDLR cauzeaza hipercolesterolemia familiala (D.J.Rader et al, 2003).

Tratament. Statinele sunt eficiente pentru indivizii cu hipercolesterolemie familiala heterozigota deoarece inhiba HMG-CoA reductaza si conduce la reglarea alelelor normale LDLR (D.J.Rader et al, 2003).

Inhibitorii HMG-CoA au un efect mai scazut asupra nivelului plasmatic al LDL colesterolului la indivizii cu hipercoelsterolemie familiala homozigota, chiar si administrati in doze mari. Tratamentul actual pentru hipercolesterolemia familiala homozigota, dar si pentru cea heterozigota cand nivelul LDL colesterolului ramane mare chiar si in cazul administrarii medicamentelor este LDL afereza. Acst proces consta in eliminarea selectiva a particulelor LDL din organism prin legarea extracorporala a heparinei sau dextran sulfatului si sustine regresia xantoamelor sau poate incetini progresia aterosclerozei(D.J.Rader et al, 2003).

Ateroscleroza

Resturile de chilomicroni si LDL pot migra si ramane in spatiul subendotelial unde pot fi acaparate de catre macrofage/monocite. Particulele mici si dense de LDL prezinta o afinitate crescuta pentru pentru proteoglicanii din artere ceea ce sporeste acumularea lipoproteinelor in spatiul endotelial (Tabas et al, 2007)

Resturile de chilomicroni si VLDL din spatiul subendotelial nu necesita o modificare pentru a permite asimilarea receptorilor Scavengeri ai macrofagului, spre deosebire de LDL nativ (Klop et al, 2012)

S-a dovedit ca particulele mici dense de LDL sunt mult mai predispuse procesului de oxidare, in principal datorita compozitiei mici de colesterol liber si antioxidant. Un fapt important este ca marimea lipoproteinelor este factorul limitant pentru migrarea in endoteliu, de aceea particulele LDL migreaza mult mai usor decat resturile de chilomicroni, insa numarul particulelor migrate nu este corelat cu o depozitare a unei cantitati mai mari de colesterol deoarece resturile de chilomicroni contin de aproximatix 40 de ori mai mult colesterol decat particulele LDL. Alternativ, resturile de chilomicroni si VLDL imbogatite cu lipoprotein lipaza pot fi transportate la tesuturi unde interactia proteoglicanilor cu receptorii lipoproteinelor conduce la indepartarea particulelor(Proctor et al, 2002)

Implicatiile LDL in ateroscleroza

Exista multe studii care sugereaza ca oxidarea LDL joaca un rol important in patogeneza aterosclerozei, oxidarea LDL repreziznta un marker de risc in bolile cardiovasculare umane, fiind principal cauza ce conduce la ateroscleroza. Prima sic ea mai comuna leziune aterosclerotica este acumularea grasimilor, care consta intr-o spuma incarcata cu lipide in celulele subendoteliale, predominant macrofage. Mai multe studii au raportat ca tratamentul cu statine scade nivelul LDL-colesterolului si astfel previne bolile cardiovasculare si astfel cresterea colesterolului LDL este privita ca un factor de risc major penru debutul bolilor cardiovasculare. Mecanismul exact prin care LDL initiaza dezvoltarea spumei incarcate cu lipide nu este inca foarte bine definit. Absorbtia colesterolului prin intermediul receptorilor LDL nu poate acumula cholesterol in macrofag deoarece receptorii sunt reglati cand colesterolul intracelular creste prin mecanismul SREBP. Insa anumite forme modificate ale LDL precum LDL oxidat si LDL acetilat, sunt preluate de catre macrofage prin intermediul receptorilor scavenger, ceea ce conduce la o acumulare substantiala a colesterolului si formarea spumei celulare lipidice deoarece receptorul scavenger este suprareglat supra-reglat de LDL oxidat. Asa numita ipoteza de oxidate a LDL a aterosclerozei indica faptul ca oxidarea LDL este un proces timpuriu in ateroscleroza si ca LDL oxidat cotribuie la aterogeneza (Yoshidaa et al.,2010).

Se pare ca oxidarea LDL nu are loc in circulati, ci in peretele vaselor de sange deoarece lipoproteinele serice sunt protejate de oxidare prin protecia antioxidanta iar LDL insusi contine mult α-tocoferol, vitamina antioxidanta, fiind o molecula de transport pentru aceasta. LDL pot fi expuse la oxidanti derivati din celule in spatiull subentotelial al arterelor. LDL poate fi oxidat non-enzimatic de catre ionii metalici de tranzitie si multi alti catalizatori.Pe de alta parte, exista studiicare au observat alte mecanisme prin care LDL poate fi oxidat de diferite enzime din peretii arterelor. Particulele LDL sunt supuse unor modificari oxidative prin incubarea cu macrofagul, celule endoteliale si celule musculare netede (Yoshidaa et al.,2010).

Oxidarea LDL

Se considera ca procesul de oxidare a LDL are loc prin doua etape principale. In timpul etapei initiale a oxidarii LDL in vitro, modificarile oxidative ale lipidelor LDL pot avea loc in absenta schimbarilor la nivelul apoB-100. O molecula LDL modificata astfel se numeste LDL oxidat minim, care pastreaza afinitatea pentru receptorul LDL, are o sarcina usor negativa, activeaza semnalizarea anti-apoptotica si induce modificari inflamatorii cu cresterea citokinelor si chemokinelor. Recrutarea celulelor inflamatorii poate conduce la o varietate mare de citokine imbunatatite si la o oxidare continua a LDL. Ulterior, lipidele LDL sunt oxidate in continuare si proteinele LDL sunt de asemenea modificate, ceea ce conduce la pierderea capacitatii de recunoastere de catre receptorul LDL si o schimbare a recunoasterii de catre receptorii Scavenger, care conduce la dezfoltarea unei celule de macrofag spumoase, principalul semn al leziunilor arteriale de catre o grupare de grasimi. Aceasta oxidare puternica este intalnita sub termenul de LDL oxidat, dar LDL sufera diferiti pasi de oxidare. De fapt, aceasta diversitate a oxidarii LDL confera efecte biologice diferite a LDL oxidat in celulele vasculare. Pe langa rolurile importante a macrofagelor in progresia leziunii aterosclerotice (Yoshidaa et al.,2010).

Moartea macrofagului in faza timpurie a aterosclerozei poate contribui la reducerea incarcaturii macrofagului si incetinirea progresiei leziunii, in timp ce moartea macrofagului in faza tarzie a leziunii poate cauza ruptura placii. Miezul lipidic al particulelor LDL este format din colesterol ester si trigliceride, stratul exterior este compus din colesterol liber si fosfolipide printre care fosfatidilcoline, si o molecula de apoB-100 care inconjoara particula LDL. Odata ce radicalii liberi mediaza oxidarea acizilor grasi nesaturati, o reactie in lant conduce la formarea colesterolului ester hiperoxid si fosfatidilcolina hiperoxid. Deoarece colesterol linoleat este lipidul majoritar al LDL colesterol linoleat hiperoxid, colesterol linoleat hydorxid sunt prezente in LDL oxidat (Yoshidaa et al.,2010).

Fig. Mecanismul oxidarii LDL si formarea celulelor spumoase macrofage in peretii arterelor. LDL care intra in peretii arterelor poate fi oxidat de celulele vasculare (celulele endoteliale, celulele musculaturii netede sau macrofage) de enzime oxidative precum lipoxigenaza si mieloperoxidaza in prezenta sau absenta ionilor metalici (fier sau cupru). LDL oxidat minim are o afinitate scazuta pentru receptorii Scavenger si astfel LDL oxidat minim poate fi reciclat in circulatia sanguina si poate fi detectat ca un LDL oxidat seric. Astfel de LDL oxidat minim stimuleaza adeziunea moleculelor si chemokinelor. LDL larg oxidat poate fi preluat de macrofag prin receptorii Scavenger conducand la formarea celulelor spumoase

HDL in ateroscleroza

Obezitate

Excesul de greutate este o afectiune cronica, devenita o problema de sanatate majora, in special in America de Nord si in unele tari din Europa, poate cauza numeroase boli care, in cele mai multe cazuri scade calitatea vietii. In 2001, un studiu realizat in 63 tari estimeaza ca 40% dintre barbati si 30% dintre femei sunt supraponderali si 24% barbati respectiv 27% femei erau obezi (Knight,2011).

Obezitatea a devenit o epidemie la nivel mondial. In ultimele decenii, numarul pacientilor obezi a crescut considerabil. Este deosebit de alarmant faptul ca, in ultimii ani, cresterea a fost mai pronuntata la copii si poate aparea atat in tarile slab dezvoltate, cat si in cele in curs de dezvoltare. In 2007, 16,4% dintre copiii din USA erau obezi, iar 31,6% supraponderali (Knight,2011).

In martie 2013 in Romania, Organizatia Mondiala a sanatatii a realizat un studiu din care a reiesit ca 34% din populatia Romaniei este supraponderala, iar 20% sufera de obezitate.

Dislipidemia in obezitate consta in cresterea trigliceridelor si acizilor grasi liberi, scaderea nivelului HDL si o crestere a nivelului LDL, in special a particulelor mici si dense (Wamg et al, 2011).

Hipertrigliceridemia poate fi cauza majora a anomaliilor lipidice deoarece aceasta va conduce la o intarziere a eliminarii lipoproteinelor bogate in trigliceride si formarea LDL.

Lipoliza lipoproteinelor bogate in trigliceride este afectata in obezitate de reducerea activitatii lipoproteinlipazei in tesutul adipos in muschii scheletici. Cresterea lipemiei postprandiale conduce la niveluri crescute de acizi grasi liberi, rezultand detasarea lipoproteinlipazei de pe suprafata endoteliala. LPL poate ramane atasata de VLDL si IDL contribuind la eliberarea trigliceridelor. Schimbul trigliceridelor din aceste resturi pentru colesterol esterii din HDL de catre CETP sub actiunea lipazei hepatice conduce in final la formarea LDL. In prezenta hipertrigliceridemiei, continutul de colesterol ester al LDL scade, in timp ce continutul trigliceridelor din LDL creste ca urmare a activitatii CETP. Continutul crescut de trigliceride din LDL este hidrolizat de lipaza hepatica, ceea ce conduce la formarea unor particule mici, LDL dens. Dezvoltarea acestora in obezitate se datoreaza in principal unor concentratii crescute de triglicerite si nu depinde in totalitate de masa acizilor grasi.Aceste particule mici si dense de LDL sunt metabolizate extrem de lent cu un timp de stationare de aproximativ 5 zile, ceea ce ii sporeste aterogenitatea (Knight,2011).

In cazurile de obezitate, metabolismul HDL este de asemenea afectat datorita creserii numarului de chilomicroni si VLDL si a scaderii lipolizei. Datorita cresterii numarului de lipoproteine bogate in trigliceride rezulta o crestere a activitatii CETP, care transfera colesterol esterii din HDL pentru trigliceride din VLDL si LDL. Mai mult, lipoliza acestor HDL bogate in trigliceride are loc sub actiunea lipazei hepatice, rezultand particule mici de HDL cu afinitate redusa pentru apoA-1, ceea ce conduce la o disociere a apoA1 din HDL. Ca un rezultat final, nivelul HDL colesterol va scadea si de asemenea se vor reduce particulele HDL circulante si transportul invers al colesterolului va fi afectat (Deeb et al, 2012)

In urma unor sudii folosind izotopi stabili, s-a observat o scadere a catabolismului resturilor de chilomicroni la subiectii obezi.Taskinen si colaboratorii au aratat ca in cazul obezitatatii, dezechilibrul procesului de eliminare a resturilor lipoproteinelor poate fi explicat de concentratiile ridicate de apolipoproteina C-3. Expresia receptorului LDL este redus in obezitate (Knight,2011).

Asadar, displipidemia in obezitate este reprezentata de hipertrigliceridemie datorata in principal cresterii fluxului acizilor grasi liberi in ficat, ceea ce conduce la acumularea hepatica a trigliceridelor. Aceast fapt determina cresterea sintezei hepatice a lipoproteinelor VLDL, care impiedica lipoliza chilomicronilor in principal datorita raportului inegal dintre nivelul de lipoprotein lipaza si resturile de trigliceride transportate la ficat. Hipertrigliceridemia induce cresterea schimbului de colesterol ester si trigliceride dintre VLDL si HDL cu LDL de catre CETP, ceea ce confera o scadere a concentratiei colesterolului HDL si o reducere a trigliceridelor in compozitia LDL. In plus, lipaza hepatica indeparteaza trigliceridele si fosfolipidele din LDL ca in final sa rezulte formarea particulelor mici dense de LDL (Knight,2011) .

Contributii personale

Studiul prezent presupune analiza valorile concentratiilor colesterolului total, HDL-colesterol, LDL-colesterol, respectiv nivelul trigliceridelor provenite de la un numar de 258 de subiecti.

Scopul principal a fost acela de a scoate in evidenta valorile care depasesc limitele biologice de referinta, pentru a putea trage un semnal de alarma referitor la stilul de viata, respectiv de a evidentia cat de important este sa se realizeze analize anuale copiilor, indiferent de starea lor de sanatate.

Laboratorul clinic are un rol extrem de important in diagnosticarea pacientilor. In continuare voi prezenta o statistica a rezultatelor pacientilor cu diferite valori ale colesterolului total, trigliceridelor, HDL-colesterol, LDL-colesterol, rezultate realizate pe baza analizelor ce s-au efectuat in laborator.

Parametrii biochimici

Recoltarea. Concentratia lipidelor plasmatice este labila si poate fi influentata de alimentatie, fumat, consumul de alcool si stres. Din acest motiv este necesar ca recoltarea probelor sa se realizeze sub anumite conditii:

Determinarile sa se efectueze pe ser recoltat dimineata á jeun (pe nemancate), la 8-12h dupa ultima masa cu lipide.

Este important ca pacientul sa nu administreze medicamente care sa influenteze valorile lipoproteinelor plasmatice.

Concentratia lipoproteinelor poate fi afectata de pozitia organismului. Concentratia colesterolului poate creste cu pana la 10% in pozitie verticala faa de pozitia de culcat

Recipiente de colectare-vacutest fara anticoagulant. Dupa recoltare este necesara o prelucrare – se separa serul prin centrifugare cat mai curand posibil.

5.1 Metode

Rezultatele au fost determinate intr-un laborator de biochimie, probele fiind lucrate pe COBAS INTEGRA 400 plus.

1. Colesterolul total

Colesterolul este un steroid cu o grupare hidroxil la C-3. El este sintetizat in mai multe tipuri de tesuturi, in principal in ficat si in peretele intestinal. Analiza colesterolului este utilizata pt screening pentru riscuri de ateroscleroza si in diagnosticul si tratamentul unor disfunctii care implica niveluri crescute de colesterol.

Analiza colesterolului a fost initial raportata de Liebermann in 1885, urmata de Burchard in 1889. In reactia Liebermann-Burchard, colesterolul formeaza un colorat albastru-verzui de la polimerii de carbohidrati nesaturati intr-un mediu acid cu acid sulfuric concentrat

Metoda Abell si Kendall este specifica pentru colesterol, dar reprezinta o tehnica mai complexa si necesita utilizarea reactivilor corozivi. In 1974, Roeschlau si Allain au descris prima metoda enzimatica complexa. Aceasta metoda se bazeaza pe determinarea Δ-4 colestenon dupa clivajul enzimatic al colesesterolului ester de catre colesterol esteraza, conversia colesterolului de colesterol oxidaza si ulterior masurarea hidrogen peroxidului format prin reactia Trinder.

Principiul testului

Metoda colorimetrica, enzimatica

Colesterol esterii sunt clivati sub actiunea colesterol esterazei prin care se elibereaza colesterol liber si acizi grasi. Colesterol oxidaza catalizeaza oxidarea colesterolului la colest-4-en-3-on si hidrogen peroxid. In prezenta peroxidazei, hidrogenul peroxid format realizeaza cuplarea oxidativa a fenolului si 4 aminofenazona pentru a forma un colorat quinona-imina rosu.

Colesterol ester + H2O CE colesterol + RCOOH

Colesterol + O2 CHOD colest-4-en-3-on +H2O2

2 H2O2 + 4-AAP + fenol POD colorat quinona-iminic + 4 H2O

Intensitatea culorii compusului colorat format este direct proportionala cu concentratia de colesterol. Aceasta este determinata prin masurarea cresterii ei la o absorbanta de 512 nm.

Reactivi utilizati

1. Colesterol esteraza; 2. Colesterol oxidaza; 3. Peroxidaza

Colectarea si prepararea specimenelor

Pentru prepararea si colectarea specimenelor, se folosesc doar tuburi sau recipiente de colectare corespunzatoare.

Tipurile de probe listate au fost testate cu o selectie de tuburi de colectare a probelor care erau disponibile comercial la momentul testelor. Unele sisteme de colectare pot contine diferite materiale care pot afecta in anumite cazuri rezultatele testelor.

Parametrii de pipetare

2. HDL Colesterol

Lipoproteinele cu densitate mare sunt responsabile de transportul colesterolului de la

tesuturile periferice catre ficat. Aici, colesterolul este transformat in acizi biliari care sunt excretate in intestin prin tractul biliar. Monitorizarea colesterolului HDL in ser are o importanta clinica de cand exista o corelatie inversa intre concentratia HDL in sange si riscul bolii ateroscleroza. Concentratiile ridicate de HDL sunt protectoare impotriva bolii coronariene, in timp ce concentratii reduse de HDL, in principal in corelatie cu nivelul crescut de trigliceride, creste riscul bolilor vasculare. S-a dovedit ca strategia pentru tratarea bolilor cardiovasculare poate fi cresterea nivelului de HDL.

Sunt disponibile o varietate de metode pentru determinarea nivelului HDL precum ultracentrifugare, electroforeza, HPLC si metode directe. Dintre acestea, metodele directe sunt cele mai folosite. Au fost propuse mai multe abordari pentru masurarea directa a colesterolului HDL, printre care folosirea particulelor sensibile magnetic orecum combinatii de metal polianion si folosirea polietilen glicol (PEG) si anticorpi anti-apoproteina B, respectiv anti-apoproteina C3.

Aceasta metoda automata pentru determinarea directa a colesterolului HDL in ser foloseste enzime modificate polietilen glicol si sulfat dextran. Cand colesterol esteraza si colesterol oxidaza sunt modificate de polietilen glicol, ele arata activitati catalitice selective fata de fractiile lipoproteice, cu reactivitate crescatoare in urmatoarea ordine: LDL< VLDL = chilomicroni< HDL.

Determinarea HDL-colesterol prin intermediul reactivilor de generatia a 3 a este conceput pentru determinarea directa specifica a colesterolului-HDL in prezenta LDL, VLDL si chilomicronilor. Nu este necesar urmarea unor pasi pre tratament.

Principiul testului

Analiza colorimetrica enzimatica omogena

In prezenta ionilor de magneziu si a dextranului sulfat, sunt formate complexele solubile in apa cu LDL, HDL si chilomicroni, care sunt rezitente la enzima polietilen glicol modificata. Concentratia de colesterol a HDL colesterolului este determinata enzimatic de colesterol esteraza si colesterol oxidaza cuplate cu polietilen glicol la gruparea amino (aproximativ 41%). Colesterol esterii sunt transformati in colesterol si acizi grasi de colesterol esteraza. In prezenta oxigenului, colesterolul este oxidat de colesterol oxidaza la Δ4-colestenon si peroxid de hidrogen.

HDL-colesterol ester + H2O PEG-colesterol esteraza HDL-colesterol + RCOOH

HDL-colesterol + O2 PEG-colesterol oxidaza Δ4-colestenon + H2O2

2 H2O2 + 4-aminoantipirina + HSDA1 + H+ + H2O peroxidaza complex colorat albastru + 5 H2O

Sodiu N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)-3,5-dimethoxianilina

acid 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetansulfonic

acid 2-(N-ciclohexilamino)etan-sulfonic

Stabilitate: 7 zile la 2-8 C

30 zile la -70 C

Parametrii de pipetare

3. LDL COLESTEROL

Lipoproteinele cu densitate joasa (LDL) au un rol cheie in cauza si influenta progresiei aterosclerozei si, in particular, sclerozei coronariene. Lipoproteinele cu densitate joasa deriva din lipoproteine cu densitate foarte joasa bogate in trigliceride prin actiunea unor diferite enzime lipolitice si sunt sintetizate in ficat. Eliminarea LDL din plasma are loc in principal prin celulelele parenchimale din ficat prin receprotorii specifici LDL.

Majoritatea colesterolului depozitat in placile aterosclerotice deriva din LDL. Valoarea colesterolului LDL este cel mai important parametru predictiv cu privire la ateroscleroza coronariana. Terapiile centrate pe reducerea nivelului de lipide au ca tinta in primul rand reducerea colesterolului LDL care este exprimata prin imbunatatirea functiei endoteliale, prevenind ateroscleroza si reducand progresia precum si prevenind ruptura placii de aterom.

Sunt disponibile diferite metode de determinare a colesterolului LDL precum ultracentrifugare ca si metoda de referinta, electroforeza lipoproteinelor sau metode de precipitare.

In metodele de precipitare, apolipoproteina B din compozitia LDL colesterol, este, de exemplu precipitata folosind oricare dintre compusii polivinil sulfat, dextran sulfat sau anioni policiclici. Continutul de colesterol LDL este in general calculat in repel (VLDL si LDL colesterol) in supernatant dupa precipitarea cu polivinil sulfat si dextran sulfat. Lipid Research Clinics recomanda o combinatie intre metoda de centrifugare si precipitare folosind polianioni in prezenta cationilor bivalenti. Metoda de precipitare necesita mult timp, nu poate di automata si este susceptibila de interferenta serului hiperlipidemic, in particular a concentratiilor mari de acizii grasi liberi. O metoda mai recenta se bazeaza pe determinarea colesterolului LDL dupa ce proba este supusa unei imunoabsorbtii si centrifugare.

Calcularea concentratiei colesterolului LDL conform formulei lui Friedewald este cea mai des utilizata. Formula se bazeaza pe doua determinari ale colesterolului, una fiind reprezentata de determinarea trigliceridelor si cealalta precipitarea particulelor HDL si se presupune ca exista o relatie directa intre VLDL colesterol si trigliceride in probele de sange. Chiar si in prezenta unor mici cantitati de chilomicroni sau proteine anormale, formula da nastere unor valori false mai mici de colesterol LDL. Din acest motiv, este neaparat nevoie de o metoda simpla si sigura pentru determinarea colesterolului LDL sa fie fara calcule sau pasi preparatorii.

Principiul testului

Analiza colorimetrica enzimatica

Metoda automata pentru determinarea directa a colesterolului LDL are avantajul solubulizarii selective a miceliilor din structura colesterolului LDL de un detergent nonionic si interactia dintre un compus zaharat si lipoproteine (VLDL si chilomicroni). Cand detergentul inclus in metoda enzimatica pentru determinarea colesterolului (reactia cuplului colesterol esteraza colesterol oxidaza), reactivitatea realativa a colesterolului in fractii lipoproteice creste in urmatoarea ordine: HDL < chilomicroni < VLDL < LDL. In prezenta ionilor de Mg2+, Compusul zaharat reduce marcabil reactia enzimatica a masurarii colesterolului din VLDL si chilomicroni.

Combinatia compusului zaharat cu detergentul permite determinarea selectiva a colesterolului LDL in ser. In prezenta oxigenului, colesterolul este oxidat de colesterol oxidaza la Δ4-colestenon si peroxid de hidrogen.

LDL-colesterol ester + H2O detergent colesterol esteraza colesterol + acizi grasi liberi (solubilizare

selectiva a miceliilor)

LDL colesterol + O2 colesterol oxidaza Δ4 colestenon + H2O2

H2O2 + 4-aminoantipirina + HSDA1 + H+ + H2O peroxidaza pigment albastr-mov + 5 H2O

Sodiu N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)-3,5-dimethoxianilina

Intensitatea culorii compusului albastru format este direct proportionala cu concentratia de LDL colesterol. Aceasta este determinata prin masurarea cresterii la o absorbanta de 583 nm.

Stabilitate: 7 zile la 2-8 C

30 zile la -70 C

Reactivi

acid 3-morfolino-propan sulfonic

Parametrii de pipetare

4. Trigliceride

Trigliceridele sunt esteri ai glicerolului cu 3 lanturi lungi de aiczi grasi. O parte dintre acestia sunt sintetizati in ficat si o parte provinde din aport alimentar.

Determinarea trigliceridelor este ultilizata in diagnosticul si tratamentul pacientilor care au diabet zaharat, obstructii ale ficatului, tulburari ale metabolismului lipidic, nefroza si numeroase boli de natura endocrina.

Analiza enzimatica a trigliceridelor descrisa de Eggstein si Kreutz inca necesita reactia de saponificare cu hidroxid de potasiu. Ulterior, s-au realizat numeroase incercari de inlocuire a reactiei alcaline de saponificare prin hidroliza enzimatica cu lipaza. Bucolo si David au incercat sa foloseasca un mix format din proteaza si lipaza. Wahlefeld a folosit o esteraza izolata din ficat in combinatie cu lipaza izolata din Rhizopus arhizus pentru hidroliza.

Aceasta metoda se bazeaza pe lucrarea lui Wahlefeld ce utilizeaza o lipoprotein lipaza izolata din microorganisme pentru o hidroliza rapida si completa a trigliceridelor la glicerol, urmata de oxidarea dihidroxi aceton fosfat si a peroxidului de hidrogen. Peroxidul de hidrogen reactioneaza ulterior cu 4 amino fenazona si 4-clorofenol sub actiunea catalitica a peroxidazei formand un compus colorat rosu. Intensitatea culorii compusului format este direct proportionala cu concentratia de trigliceride si poate fi masurata fotometric.

Trigliceride + 3 H2O LPL glicerol + 3 RCOOH

Glicerol + ATP GK glicerol-3 fosfat + ADP

Glicerol-3-fosfat + O2 GPO dihidroxiaceton fosfat + H2O2

H2O2 + 4-aminofenazon + 4-clorofenol POD 4- (p-benzoquinona-monoimino)-fenazona + 2 H2O + HCL

Stabilitate: 5-7 zile la 2-8 C

3 luni la -15 – -25 C

cativa ani la -60 – -80 C

Reactivi

Parametrii de pipetare

Rezultate si discutii

In urma centralizarii datelor obtinute de la un numar de 285 pacienti cu varste cuprinse intre 1 si 18 ani, s-au obtinut urmatoarele rezultate.

Analiza colesterolului total

Din total pacientilor analizati, un numar de 206 pacienti reprezentand 72% prezinta un nivel al colesterolului total in limita volorilor biologice de referinta, in timp ce 79 dintre ei reprezentand 28% au un nivel al colesterolului ce depaseste limitele valorilor de referinta.

Valori biologice de referinta:

Dintre cei 28% cu rezultate peste limitele valorilor biologice de referinta, am realizat o distributie in functie de varsta. Astfel, dintre pacientii cu o concentratie mare de colesterol in sange, 6 au sub 1 an (8%), 20 au varste cuprinse intre 1-4 ani (25%), 44 intre 5-12 ani (56%) si 9 pacienti cu varste cuprinse intre 13-18 ani (11%).

Pacientul x prezinta o valoare a colesterolului de 330 datorita faptului ca este diagnosticat cu hipotiroidism, care se manifesta prin cresterea coelsterolului datorita unei incetiniri a transferului acestuia in saruri biliare

Trigliceridele

In ceea ce priveste rezultatele concentratiilor trigliceridelor, am observat ca din numarul total de 285 pacienti, 249 reprezentant 87% prezinta concentratii in limite normale, in timp ce 36 dintre ei reprezentand 13% au valori ce depasesc limitele biologice de referinta.

Valori de referinta: 1 – 3 ani 30-170 mg/dl

3 – 18 ani 35-160 mg/dl

Dintre cei 20 pacienti cu varste cuprinse intre 1-18 ani, exista 3 cazuri in care nivelul crescut de trigliceride se explica datorita patologiei, a caror simptome si urmari sunt caracterizate de un nivel crescut de trigliceride.

Un caz particular este reprezentat de un pacient ce prezinta o valoare de 245 a trigliceridelor, avand boala autoimuna Lupus.

Alte doua cazuri cu o concentratie a trigliceridelor de 337, respectiv 683 reprezinta rezultatele unor pacienti diagnosticati cu sindrom nefrotic, afectiune asociata atat cu hipertrigliceridemie cat si cu hipercolesterolemie. Aceasta afectiune este caracterizata prin eliminarea pe cale renala proteinelor din organism (Lloyd, 1975). Printre proteinele care se pierd prin urina se numara si apoproteinele, ceea ce conduce la o scadere a lipoproteinelor, principala forma de transport a trigliceridelor in organism.

LDL colesterol

In ceea ce priveste rezultatele obtinute in urma analizei colesterolului LDL, am observat un numar semnificativ de pacienti care prezinta concetratii ce depasesc valorile biologice de referinta, mai exact 117 reprezentand 41% iar pacientii cu valori ce se incadreaza in limitele normale 59% din total mai exact 168 de pacienti.

Valori de referinta: 1-4 ani: 40-100 mg/dl

4-18 ani: 40-110 mg/dl

LDL poate fi determinat si prin metoda de calcul dupa urmatoarea formula:

LDL= colesterol tatal-trigliceride/5-HDL

Facand o comparatie intre rezultatele LDL colesterol prin metoda de determinare enzimatica si metoda de calcul, am obsevat ca LDL colesterolul calculat este cu precadere mai mare decat LDL colesterolul determinat enzimatic.

HDL colesterol

Valori de referinta : 0-18 ani: 40-60 mg/dl

Din totalul pacientilor analizati, am observat ca 53% (152 de pacienti) prezinta concentratii HDL-C aflate in limitele normale biologice, 18% (50) cu valori crescute si 29% (83) cu valori scazute.

Persoanele care prezinta concentratii mai mici de 40 mg/dl sunt mult mai predispuse la dezvoltarea bolilor coronariene, in special cei care odata cu valoarea mica a HDL coloesterol, prezinta si valori mai mari decat cele de referinta in ceea ce priveste concentratia LDL-colesterolului. Din cei 29% cu HDL-colesterol scazut, 27% reprezentand 22 de indivizi prezinta si un nivel al LDL colesterol crescut, restu de 73%, 61 de indivizi, prezinta un nivel normal al LDL colesterolului.

Concluzii

Biobliografie