Lipopolizaharidele Si Efectele Lor Asupra Imunitatii Innascute In Infectiile Bacteriene

CUPRINS

I. INTRODUCERE ………………………………………………………………………………………………………… 1

II. BACTERIILE GRAM NEGATIVE …………………………………………………………………………….. 3

II. 1. Celula procariotă ………………………………………………………………………………………………. 3

II. 2. Bacteriile Gram negative …………………………………………………………………………………… 4

II. 3. Anvelopa celulară …………………………………………………………………………………………….. 4

II. 3.1. Membrana internă …………………………………………………………………………………….. 6

II. 3.2. Peretele celular …………………………………………………………………………………………. 6

II. 3.2.1. Stratul peptidoglicanic …………………………………………………………………………….. 8

II. 3..2.2. Membrana externă …………………………………………………………………………………. 8

III. LIPOPOLIZAHARIDELE ……………………………………………………………………………………….. 11

III. 1. Lipidul A ………………………………………………………………………………………………………. 12

III. 1.1. Generalități ……………………………………………………………………………………………. 12

III. 1.2. Acțiunea endotoxică a lipidului A …………………………………………………………….. 14

III. 1.3. Biosinteza lipidului A la Escherichia coli ………………………………………………….. 14

III. 1.4. Sisteme de modificare a lipidului A ………………………………………………………….. 16

III. 1.5. Lipidul A – activator al imunității înnăscute ……………………………………………… 16

III. 2. Regiunea oligozaharidică ………………………………………………………………………………… 17

III. 2.1. Structura miezului oligozaharidic …………………………………………………………….. 17

III. 2.2. Structura miezului oligozaharidic la unele specii patogene ………………………….. 18

III. 2.3. Rolul miezului oligozaharidic in stabilitatea membranei externe ………………….. 26

III. 2.4. Genetica și biosinteza regiunii oligozaharidice …………………………………………… 28

III. 2.4.1. Asamblarea miezului intern oligozaharidic ……………………………………………… 30

III. 2.4.2. Asamblarea miezului extern oligozaharidic …………………………………………….. 30

III. 2.5. Rolul regiunii oligozaharidice în heterogenitatea lipopolizaharidelor ………….. 31

III. 3. Antigenul O …………………………………………………………………………………………………… 32

III. 3.1. Structura polizaharidelor O ……………………………………………………………………… 33

III. 3.2. Biosinteza polizaharidelor O ……………………………………………………………………. 34

III. 4. Exportul lipopolizaharidelor …………………………………………………………………………….. 35

III. 5. Importanța biologică a lipopolizaharidelor ………………………………………………………… 36

IV. IMUNITATEA ÎNNĂSCUTĂ …………………………………………………………………………………. 37

IV. 1. Inflamația și răpunsul inflamator ……………………………………………………………………… 41

IV. 2. Bariere fizice în rezistența nespecifică (înnăscută) …………………………………………….. 42

V. EFECTELE LIPOPOLIZAHARIDELOR ASUPRA IMUNITĂȚII ÎNNĂSCUTE …………. 44

V. 1. Expunerea la endotoxine ………………………………………………………………………………….. 46

V. 2. Interacțiunile gazdei cu endotoxinele …………………………………………………………………. 47

V. 3. Patogeneza cascadei inflamatorii …………………………………………………………………………48

VI. CONCLUZII ………………………………………………………………………………………………………….. 50

VII. BIBLIOGRAFIE ……………………………………………………………………………………………………. 52

I. INTRODUCERE

Microorganismele sunt cele mai simple forme de viață din natură, având dimensiuni microscopice, majoritatea fiind unicelulare. Acestea reprezintă un grup heterogen de organisme, de mare diversitate, incluzând bacterii, microfungi, microalge, etc.

Bacteriile reprezintă un domeniu larg de microorganisme procariote, unicelulare, foarte răspândite în apă, aer, sol, sau chiar în simbioză cu alte organisme. În funcție de comportamentul acestora în cadrul tehnicii de colorație Gram, bacteriile se împart în două mari categorii: bacteii Gram pozitive (G+) și bacterii Gram negative (G-).

Bacteriile Gram negative reprezintă o clasă de bacterii care, datorită unor particularități structurale, nu rețin culoarea Violetului de Gențiană folosit în cadrul tehnicii coloratiei Gram, fiind necesară, în cazul lor, recolorarea cu Fuxină sau Safranină. Astfel, în urma acestei tehnici, bacteriile Gram pozitive se colorează în violet, datorită peretelui lor celular mai gros, compact, comparativ cu peretele celular al bacteriilor Gram negative, acestea colorându-se în roșu.

O principală particularitate structurală a bacteriilor Gram negative o reprezintă morfologia și structura peretelui lor celular, în a cărui componență intră și lipopolizaharidele. Peretele celular al bacteriilor Gram negative este structurat în 2 componente principale: complexul peptidoglican – lipoproteină și membrana externă. Membrana externă contrine un dublu strat fosfolipidic în care sunt inclavate lipopolizaharidele, dar și diferite categorii de proteine.

Numite și endotoxine, lipopolizaharidele din membrana externă a bacteriilor Gram negative au acțiune toxică, cauzând numeroase afecțiuni organismelor pe care bacteriile respective le infectează. Endotoxinele conferă, deci, patogenitate bacteriilor Gram negative, acestea invadând organismul gazdă.

Infecțiile bacteriene apar în urma pătrunderii unui microorganism patogen într-un organism viu. După invadare, bacteria respectivă se reproduce intens, atacând organismul gazdă, care încearcă să se protejeze prin intermediul mijloacelor de apărare naturale. Infecțiile apar atunci când aceste mijloace nu reușesc să facă față atacului microbian.

Detectarea și localizarea unui microorganism bacterian invadator determină declanșarea unui răspuns imun din partea organismului gazdă, acesta încercând să elimine cauza infecției. În cazul infecțiilor bacteriene, antigenele sunt reprezentate de microorganismele invadatoare, precum și de toxinele proteice sau glico-lipidice (LPS) eliberate de bacterii. Bacteriile Gram negative și endotoxinele lor pot reprezenta un factor important în apariția unor boli grave, cele mai comune sindroame asociate cu acestea fiind septicemia și șocul septic, care sunt complicații sistemice a numeroase afecțiuni. Indiferent de sursă, expunerea la endotoxine a unui organism viu induce apariția unui răspuns inflamator, numit și cascadă septică, ce implică numeroși mediatori celulari. Răspunsul inflamator se manifestă prin simptome precum febră, ritm respirator și ritm cardiac crescut, și alte simptome sistemice. Tratamentul, în general, în astfel de infecții, constă în administrarea de antibiotice.

Integritatea oricărui organism eucariot depinde nu numai de expresia genelor sale, ci și de abilitatea sa de apărare față de microorganismele invadatoare. Capacitatea gazdei de a rezista unei infecții depinde de o constantă apărare împotriva invaziei microbiene. Această rezistență provine atât din mecanismele de apărare nespecifice ale organismului (imunitatea înnăscută), cât și din cele specifice (imunitatea adaptativă). Apărarea nespecifică constă în mecanismele înnăscute, constitutiv manifestate în organismul gazdă, ce implică celule specializate, țesuturi, organe, procese celulare, bariere fizice, dar și mediatori chimici.

Sistemul imunitar adaptativ se bazează pe acțiunea unor proteine unice, de legare, cum sunt imunoglobulinele sau receptorii celulari T, care asigură recunoașterea specifică a agenților patogeni. În ceea ce privește mecanismele prin care acționează sistemul imunitar înnăscut, răspunsul inflamator față de endotoxine reprezintă un exemplu de recunoaștere înnăscută. Sistemul imunitar înnăscut acționează ca și prim mecanism de apărare al organismului infectat, declanșând elaborarea unui răspuns imun nespecific.

Această lucrare își propune să evidențieze efectele pe care le produce prezența endotoxinelor bacteriene la nivelul sistemului imunitar, respectiv sistemului imunitar nespecific, în urma invadării unui organism gazdă. De asemenea, scopul acestei lucrării este evidențierea corelației dintre imunitatea înnăscută și efectele toxice ale lipopolizaharidelor, prin comportamentul manifestat de organismul gazdă, în cazul infecțiilor cu bacterii Gram negative.

I. BACTERIILE GRAM NEGATIVE

1. Celula procariota

Celulele procariote sunt, din punct de vedere morfologic, mai simple comparativ cu celulele eucariote, însă nu reprezintă versiuni mai simple ale acestora. Deși există și structuri comune celor două tipuri de celule, procariotele au anumite componente unice, așa cum este, de exemplu, peretele celular, o structură complexă din punct de vedere chimic, cu rol important în viața celulei. În tabelul 1 (Modificat după Willey și colab., 2008) sunt sumarizate principalele structuri din componența celulei procariote și funcțiile lor majore.

Tabel 1. Functiile structurilor celulei procariote (Modificat după Willey și colab., 2008)

Procariotele pot fi diferențiate de eucariote în funcție de dimensiunile lor, de structura celulară și de anumite aspecte moleculare. Deși anumite componente celulare sunt prezente la ambele tipuri de celule, există numeroase deosebiri structurale și funcționale între celulele procariote și celulele eucariote.

2. Bacteriile Gram negative

Bacteriile reprezintă cele mai simple organisme, din punct de vedere structural și morfologic, dotate cu principalele atribute ale viului: organizare, autonomie, invarianță. Bacteriile constituie o categorie de microorganisme unicelulare de dimensiuni mici, capabile să se reproducă rapid și să supraviețuiască în condiții de mediu diverse, nefavorabile adesea, și chiar extreme, așa cum sunt, de exemplu, bacteriile acidofile.

Din punct de vedere al comportamentului lor în cadrul tehnicii colorației Gram, bacteriile se împart în Gram pozitive și Gram negative. Conform acestei colorații, bacteriile Gram pozitive se colorează în violet, datorită consistenței peretelui lor celular, în timp ce bacteriile Gram negative se colorează în roșu, ele necesitând aplicarea unui al doilea colorant. Însă diferențele dintre cele două categorii de bacterii nu sunt doar de tinctorialitate, ci și din punct de vedere biochimic, comportamental, antigenic și de patogenitate.

3. Anvelopa celulară

Unii cercetători numesc adesea structurile dinspre exteriorul membranei plasmatice anvelopă celulară, aceasta fiind constituită, deci, din membrana plasmatică, peretele celular și structuri precum capsula. Anvelopa celulei bacteriene înconjoară și protejează citoplasma. Spre deosebire de celulele organismelor superioare, bacteriile se confruntă cu anumite condiții de mediu nefavorabile; pentru a supraviețui, bacteriile au dezvoltat o anvelopă celulară complexă, care le protejează dar, totodată, permite pasajul selectiv al nutrienților din exterior, precum și eliminarea produșilor din interior. (Walker și colab., 2010)

Toate componentele anvelopei celulare a bacteriilor Gram negative sunt sintetizate fie la nivelul citoplasmei, fie la nivelul suprafeței interne a membranei interne. Ulterior, aceste componente sunt deplasate de la nivelul citoplasmei sau membranei interne. Componentele periplasmice sunt eliberate din membrana internă, componentele peptido-glicanice sunt eliberate și polimerizate iar componentele membranei externe sunt transportate de-a lungul periplasmului vâscos și, ulterior, asamblate într-un strat lipidic asimetric. (Silhavy și colab., 2010)

Anvelopa celulară (fig. 1) a bacteriilor Gram negative este constituită din 3 straturi principale, reprezentate de membrana externă, peretele celular peptidoglicanic și membrana citoplasmatică (internă).

Lanțuri lipopolizaharidice

Porina

Lipoproteina Braun

Fofsfolipide Proteină integrală

Peptidoglican

Fig. 1 Anvelopa celulară a bacteriilor Gram negative (Modificat după Willey și colab., 2008)

Un aspect important al anvelopei celulare este un spațiu frecvent observat între membrana plasmatică și membrana externă, numit spațiu periplasmic. Acest spațIu este diferit la bacteriile Gram negative față de cele Gram pozitive, având dimensiuni de 1 nm până la 71 nm. Unele studii arată faptul că la anumite celule acesta poate reprezenta chiar 20-40% din volumul celular total. Acesta conține o substanță numită periplasm, al cărei conținut este reprezentat de diferite seturi de proteine. Periplasmul este un compartiment celular apos, împachetat dens în proteine, fiind mai vâscos comparativ cu citoplasma. Această compartimentare permite bacteriilor Gram negative izolarea enzimelor potențial dăunătoare, cum este, de exemplu, fosfataza alcalină. De aceea, periplasmul a fost numit un precursor evolutiv al lizozomilor celulelor eucariote (Duve și Wattiaux, 1966).

Bacteriile denitrificatoare, care convertesc nitratul în nitrogen, și bacteriile care folosesc molecule anorganice ca și surse de energie au în componența periplasmului lor proteine de transport. (Silhavy și colab., 2010)

Alte proteine ce populează spațiul periplasmic sunt proteinele de legare, care funcționează în transportul zaharuruilor și aminoacizilor, dar și în chemotaxie, precum și moleculele chaperon-like, care funcționează în biogeneza anvelopei (Ehmann, 2007).

La nivelul spațiului periplasmic există și molecule de oligozaharide, implicate în procesele de osmoreglare. Acestea determină presiunea optimă necesară pentru a rezista presiunii interne care împinge membrana interna spre exterior. De asemenea, în spațiul periplasmic există și enzime, precum diferite hidrolaze, penicilaza, DN-aze, RN-aze. (Silhavy și colab., 2010)

3.1. Membrana internă

O trăsătură specifică celulelor eucariote este prezența organitelor intracelulare. Aceste organite sunt implicate în numeroase procese esențiale în viața celulei, ele fiind delimitate de membrane. De exemplu, mitocondria produce energie, reticulul endoplasmic neted sintetizează lipide, reticulul endoplasmic rugos sintetizează proteine. Membrana citoplasmatică conține receptorii ce detectează semnalele din mediul extern, dar și sistemele de transport al nutrienților și resturilor celulare. (Silhavy și colab., 2010)

Toate funcțiile asociate organitelor intracelulare la celulele eucariote, în cazul bacteriilor, se desfășoară la nivelul membranei interne. Numeroase din proteinele cu rol în producerea de energie, biosinteză lipidelor, secreția proteică și transport sunt conservate, dar localizarea lor celulară diferă la procariote. La bacterii, aceste proteine sunt localizate la nivelul membranei interne. (Walker și colab., 2010)

Membrana internă este alcătuită dintr-un bistrat fosfolipidic. La E.coli, principalele fosfolipide sunt reprezentate de fosfatidil-etanolamină și fosfaidil-glicerol, și, in cantități mai mici, fosfatidil-serină si cardiolipină. Alte lipide importante de la nivelul membranei interne sunt lipidele polizoprenoid carriers, care sunt implicate în translocatia intermediarilor zaharici activați, necesari în biogeneza anvelopei celulare. (Silhavy și colab., 2010)

3.2. Peretele celular

Bacteriile Gram negative sunt microorganisme unicelulare, procariote, caracterizate prin structura complexă a peretelui lor celular, la nivelul căruia se găsesc lipopolizaharidele – endotoxinele specifice acestor tipuri de bacterii.

Peretele celular este un înveliș cu multiple funcții în viața bacteriilor; el definește forma acestor microorganisme, exercită un control important asupra intrărilor respectiv ieșirilor de la nivelul celulei bacteriene, iar, în cazul bacteriilor patogene poate participa la desfășurarea procesului infecțios. Bacteriile Gram negative prezintă un perete celular alcătuit dintr-un strat peptidoglicanic de 2-7 nm, acoperit de o membrană externă cu o grosime de 7-8 nm. Datorită stratului peptidoglicanic mai subțire, comparativ cu bacteriile Gram pozitive, pereții bacteriilor Gram negative sunt mai puțin rezistenți presiunii osmotice. (Willey și colab., 2008)

Peretele celular al bacteriilor Gram negative este constituit din stratul peptidoglicanic și membrana externă. Membrana externă este situată în afara stratului peptidoglicanic subțire, și este legată de celulă prin două mecanisme, așs cum se observă în figura 2. Primul este reprezentat de lipoproteină Braun, cea mai abundentă proteină de la nivelul membranei externe. Această lipoproteină de dimensiuni mici este legată covalent de peptidoglican și atașată de membrana externă prin capătul ei hidrofobic. Membrana externă și peptoidoglicanul sunt strâns legate de această lipoproteină, putând fi izolate ca și o singură unitate. Cel de-al doilea mecanism de legare implică majoritatea situsurilor de adeziune ce unesc membrana externă și membrana plasmatică.

Fig. 2 Membrana externă și structurile asociate la E.coli (Modificat după Willey și colab., 2008)

La E.coli s-a observat o suprafață de contact de 20 până la 100 nm. În compoziția membranei externe intră și lipopolizaharidele, molecule complexe, de dimensiuni mari, constituite din lipide și carbohidrați. (Silhavy și colab., 2010)

3.2.1. Stratul peptidoglicanic

Peptidoglicanul bacterian este alcătuit din unități repetitive de dizaharid-N-acetil-glucozamină-α-acid N-acetil-muramic, legate încrucișat prin lanțuri pentapeptidice laterale. Sacul peptidoglicanic este un polimer de dimensiuni foarte mari, ce poate fi izolat și vizualizat la microscop. (Walker și colab., 2010)

Datorită rigidității lui, stratul peptidoglicanic conferă forma celulei bacteriene. De exemplu, vibrionii au forma unei virgule. Unele studii sugerează faptul că lanțurile glicanice se întind perpendicular, de-a lungul axei luni a unei bacterii în formă de bară (Gan și colab., 2008).

Agenți precum enzime sau antibiotice ce deteriorează stratul peptidoglicanic produce liza celulară datorită presiunii turgescenței citoplasmei. Fără peptidoglican, celulele își pierd forma lor caracteristică, celulele rezultate ulterior fiind numite sferoplaști. La E.coli, prin metodele obsnuite de producere a sferoplaștilor (structuri similare protoplaștilor, păstrează unele resturi ale peretelui celular, în special componentele lipidice) se obțin celule nonviabile, dar, care pot continua procesele de metabolism și biosinteză mai multe ore. (Silhavy și colab., 2010)

Membrana externă este unită de peptidoglican prin lipoproteină Braun, numită și murein-lipoproteină sau Lpp. Această proteină de dimensiuni mici, alcătuită din doar 58 de aminoacizi, este atașată de membrana externă prin intermediul unor lipide atașate la capătul ei amino-terminal. Lipoproteina Braun este cea mai abundență proteină din E.coli: peste 500 000 de molecule/celulă. (Walker și colab., 2010)

3.2.2. Membrana externă

Membrana externă reprezintă primul strat dinspre exterior, al celulei bacteriene Gram negative. Asemenea unei membrane tipice, această membrană externă este alcătuită dintr-un bistrat lipidic. Un aspect important al acestui tip de membrană este faptul că bistratul nu este de tip fosfolipidic. (Silhavy și colab., 2010)

Membrana externă conține fosfolipide, însă acestea sunt localizate pe fața internă a ei. Fața externă a membranei este compusă din glicolipide, în principal lipopolizaharide.

Lipopolizaharidele sunt molecule responsabile de șocul endotoxic asociat cu septicemia, cauzate de bacteriile Gram negative (Raetz, Withfield, 2002). Sistemul imunitar înnăscut este sensibilizat de aceste molecule toxice.

Proteinele de la nivelul membranei externe sunt de două categorii: lipoproteine și proteine cu structură β-pliată. Lipoproteinele conțin fragmente lipidice atașate la nivelul unui rest de cisteină amine-terminal. La E. coli există aproximativ 100 astfel de lipoproteine. (Walker și colab., 2010)

Aproape toate proteinele transmembranare de la nivelul membranei externe prezintă o conformație β-pliata. Aceste proteine sunt alcătuite din lanturi β, înfășurate în structuri cilindrice. Astfel de proteine, cum sunt, de exemplu, porinele, OmpF sau OmpC, permit difuzia pasivă a moleculelor de dimensiuni mici, precum monozaharidele, dizaharidele sau aminoacizii. Porinele prezintă 16 fâșii β transmembranare, ele funcționând ca și trimeri. Aceste tipuri de proteine sunt foarte abundente, fiind prezente în aproximativ 250 000 de copii/celula. (Willey și colab., 2008)

În ceea ce privește conținutul enzimatic, membrana externă conține puține enzime. De exemplu, există o fosfolipază, o protează și o enzimă ce modifică lipopolizaharidele. Situsul activ al acestor enzime este localizat la nivelul feței externe.

Principala funcție a membranei externe este cea de barieră protectoare. De exemplu, Salmonella, o enterobacterie, poate supraviețui la nivelul situsului de producere a sărurilor biliare din vezică biliară. De aceea, în general, bacteriile Gram negative sunt mai rezistente la anibiotice decât bacteriile Gram pozitive. (Willey și colab., 2008)

Membrana externă a bacteriilor Gram negative prezintă o structură trilamelară, fiind compusă din proteine, inclusiv porine și receptori, și lipide dispuse asimetric. Structura chimică a componentelor membranei externe este prezentată schematic în figura 3. Pe fața externă a membranei se găsesc, în cea mai mare parte, lipopolizaharidele. (Walker și colab., 2010)

Lipopolizaharidele au un rol esențial în funcția de barieră protectoare a membranei externe, în primul rând datorită prezenței în structura lor a antigenului O, un lanț polizaharidic extins. Lipopolizaharidele unei bacterii Gram negative prezintă 3 componente principale: lipidul A, miezul polizaharidic și antigenul O. Porțiunea lipidică a lipopolizaharidelor este, de obicei, compusă din acizi grași, zaharuri și grupări fosfat. (Willey și colab., 2008)

Moleculele de lipopolizaharide se leagă strâns unele de celelalte, mai ales în prezența unor factori precum ionii de Magneziu, care neutralizează sarcina negativă a grupărilor fosfat prezente în molecule. Acest șir continuu nonfluid format de moleculele de lipopolizaharide constituie o adevărată barieră pentru moleculele hidrofobice. (Ehmann, 2007)

Fig. 3 Structura membranei interne și stratul periplasmic intermediar, ce conține peptidoglicanul (Modificat după Chatterjee, 2012)

Anveopa celulelor bacteriene este o structură complexă, dinamică, ce îndeplinește o varietate de funcții adaptative și de protecție. Componenta principală a acestei anvelope este peptidoglicanul, acesta fiind esențial în stabilizarea membranei celulare împotriva presiunii osmotice interne ridicate. Însă peptidoglicanul nu este suficient pentru ca bacteria să poată supraviețui în medii ostile. Pe lângă acest compus, bacteriile Gram negative au în structura anvelopei celulare și o membrană externă, ce conține lipopolizaharidele. (Silhavy și colab., 2010)

II. LIPOPOLIZAHARIDELE

Endotoxinele bacteriilor Gram negative îndeplinesc funcții vitale în viabilitatea și supraviețuirea acestor bacterii. Din punct de vedere chimic aceste endotoxine sunt lipopolizaharide, carbohidrați complecși alcătuiți din două părți cu proprietăți contrastante: un polizaharid hidrofilic și un glicolipid fidrofobic.

Lipopolizaharidele sunt localizate la nivelul membranei externe din structrua peretelui celular, și au în componența lor un domeniu hidrofobic numit lipidul A, un miez oligozaharidic non-repetitiv și un polizaharid distal, numit antigenul O. În figura 4 se observă localizarea acestor componente în structura membranei externe, la E.coli.

Fig. 4 Modelul membranei interne și membranei externe la E.coli (Modificat după Raetz și Whitfield, 2008)

Prin intermediul lipidului A, lipopolizaharidele se ancorează la membrana celulară. Acest glicolipid hidrofobic este constituit dintr-un lanț dizaharidic de β-D-(1→6))glucozamină, ce conține acizi grași, și este responsabil de proprietățile endotoxice ale acestei molecule (Ummarino, 2003).

Lipopolizaharidele pot fi prezente sub două forme: forma S (Smooth) și forma R (Rough). Forma S prezintă regiunea polizaharidică, în timp ce forma R nu prezintă aceasta regiune, fiind numită și Lipooligozaharidă (LOS). Ambele forme conțin, însă, lipidul A și miezul oligozaharidic, ce cuprinde 15 resturi zaharice. În forma S a lipopolizaharidelor, regiunea oligozaharidică este substituită de un polizaharid, cel mai adesea un polizaharid O-specific (antigenul O). În alte cazuri, este substituită de un antigen enterobacterian comun, la Enterobacteriaceae, sau un polizaharid capsular. (Willey și colab., 2008)

O celula bacteriană conține aproximativ 3,5 · 106 molecule de lipopolizaharide, ocupând 4,9 μm2. La suprafața unei celule de E.coli, aproximativ trei sferturi din suprafața bacteriană este compusă din lipopolizaharide, restul suprafeței fiind ocupat de proteine. Membrana externă reacționează schimbărilor din mediu și inhibă intrarea compușilor potențial toxici pentru bacterie, cum sunt, de exemplu, antibioticele, integritatea acestei membrane și, implicit, a lipopolizaharidelor fiind esențială în viața celulei. (Raetz și Whitfield, 2008)

Atunci când bacteriile se multiplică, mor sau lizează, lipopolizaharidele sunt eliberate din membrana externă. O cantitate mică de lipopolizaharide este eliberată de bacterii și în timpul creșterii.

1. Lipidul A

1.1. Generalități

Lipidul A este porțiunea prin care molecula de lipopolizaharid este ancorată la membrana celulară. Reprezintă partea cea mai toxică a lipopolizaharidului, activitatea lui biologică fiind asociată mai ales cu acest lipid. Lipidul A îi conferă fragmentului amfifilic al polizaharidului caracteristicile hidrofobice și, totodată, reprezintă cel mai puțin heterogen component al moleculei de lipopolizaharid. (Raetz și Whitfield, 2008)

Lipidul A (fig. 5) este alcăuit dintr-un lanț dizaharidic de β-D-(1→6))glucozamină, de care sunt atașați acizii grași, in pozițiile O-2, O-3, O-2’ și O-3’, atât prin legături esterice, cât și prin legaturi amidice. Acești acizi grași sunt cel mai adesea prezenți în formă hidroxilată, de obicei în pozițiile C-2 sau C-3, iar gruparea hidroxil poate fi esterificată. Numărul și dimensiunile acizilor grași din componența lipidului A diferă între specii. De exemplu, la enterobacter agglomeranas lipidul A conține șase acizi grași, trei dintre ei fiind C14(3-OH), unul C14, unul C16 și doi C12. Lipidul A izolat de la B. cepacia conține cinci acizi grași: doi C16 (3-OH), doi C14 (3-OH) și unul C14. (Raetz și colab.2007)

Fig. 5 Structura chimică a lipidului A la E.coli

Deși acizii grași din compoziția lipidului A conțin, de obicei, 10-16 atomi de Carbon, există și câteva excepții. De exemplu, lanțuri cu 18 sau 20 de atomi de Carbon au fost observate la C. trachomati, un agent infecțios comun. Numărul de atomi de carbon al acestor acizi are o influența majoră asupra toxicității lipidului A: cei mai toxici sunt C12, C12 (OH), C14 și C14 (OH). Acizii grași nesaturați sunt rar observați în lipidul A; atunci când sunt prezenți în lipid, ei sunt în amestec cu acizii grași săturați. (Raetz și Whitfield, 2008)

Extractele naturale de lipopolizaharide, incluzand si lipidul A, sunt amestecuri complexe de glicoforme asociate structural, mai ales datorita prezentei unor cai biosintetice si de degradare variate, pe parcursul procesului de izolare. Pe langa substitutia cu acizi grasi, gruparile fosfat si, uneori, pirofosfat, se gasesc in pozitiile C-1 al restului reducator de Glucozamina si C-4’ al capatului nereducator. Aceste grupari fosfat pot fi substituite cu fosforiletanolamina, etanolamina, sau, ocazional, neutralizate cu alti substituenti, cum ar fi arabinozamina. Lipidul A este considerat, in general, un agent proinflamator. Insa anumiți analogi sintetici au fost evaluati cu succes drept factori antagonisti impotriva lipidului A de la E.coli. (Raetz și colab.2007)

1.2. Acțiunea endotoxică a lipidului A

Lipidul A prezintă o structură complexă, esențială în desfășurarea activitățatii lui endotoxice. Modificări ale regiunii hidrofilice, substituția grupării fosfat α-anomerice cu anomerul β (în forma derivată a oxietilului) sau omiterea unei grupări fosforil pot reduce semnificativ bioactivitatea lipidului, structurile monozaharidice fiind cele mai puțin active. Alterarea regiunii hidrofobice are, totodată, efecte puternice asupra funcționării lipidului A. Omiterea unei grupări acil sau adiția unui acid gras pot reduce, de asemenea, bioactivitatea lipidului. (Rietschel și colab., 1994)

Activitatea endotoxică completă este desfășurată de o moleculă conținând două resturi de hexozamină, două grupări fosforil și șase acizi grași saturați, în cea mai mare parte 3-hidroxilati, dar și grupări 3-aciloxiacil, cu o lungime a lanțului bine definită și localizare distinctă. Din punct de vedere endotoxic, mai puțin active sau inactive sunt structurile parțial incomplete, la care lipsește un singur constituent lipidic, moleculele ce conțin constituenți diferiți, dar înrudiți, dar și compușii analogi, cu un aranjament distinct al constituenților. Așadar, structura moleculară și conformația lipidului A este unică, permițând exprimarea optimă a endotoxicității acestuia in vivo. Acest concept implică, totodată, prezența unei molecule de recunoaștere fie în circulație, fie exprimată la nivelul monocitelor și macrofagelor endotoxino-senzitive. (Kirikae și colab., 1994)

1.3. Biosinteza lipidului A la Escherichia coli

Enzimologia și genetica moleculară a biosintezei lipidului A au fost cel mai bine descrise la E.coli. Prima reacție din cadrul fenomenului de biosinteză a lipidului A este reprezentată de acilarea nuclotidei UDP-GlcNAc. Enzima UDP-GlcNAc-transferaza (LpxA) de la E.coli este selectivă pentru β-hidroximiristat, având o necesitate absolută de o proteină acil-carrier (ACP). (Raetz și Whitfield, 2008)

Enzima LpxA de la E.coli este un homotrimer ce conține multiple repetiții adiacente de hexadă, de asemenea întalnite și la alte aciltransferaze și acetiltransferaze. Aceste hexade definesc o proteină pliată, constituită dintr-un helix de stânga alcătuit din lanțuri β paralele, scurte. Trei hexade formează o buclă a β-helixului, și fiecare monomer LpxA conține zece astfel de bucle, așezate una deasupra celeilalte. Situsul activ al enzimei LpxA de la E.coli este localizat între buclele subunitaților adiacente și funcționează ca și o hidrocarbură tipică, ce încorporează lanțuri de acil, fiecare lanț având 14 atomi de Carbon. La Pseudomonas aeruginosa, aceste lanțuri au câte 10 atomi de Carbon. Substituirea unui singur aminoacid poate converti LpxA de la Pseudomonas într-o aciltrasferază cu 14 atomi de Carbon sau LpxA de la E.coli într-o enzimă cu 10 atomi de Carbon. LpxA de la Chlaymidia trachomatis este unică prin acțiunea ei pentru că utilizează miristoil-ACP în locul hidroximiristoil-ACP, generând noi specii hibride de lipid A atunci când sunt substituite cu LpxA de la E.coli în celule vii. (Raetz și Whitfield, 2008)

Fig. 6 Structura și biosinteza lipidului A la E.coli (Modificat după Raetz și Whitfield, 2008)

În figura 6 sunt prezentate schematizat etapele biosintezei lipidului A la E.coli și structura acestuia, enzimele implicate în catalizarea acestui proces și genele ce codifică aceste enzime. Simbolurile indică genele structurale ce codifică fiecare enzimă. Fiecare reacție este catalizată de o singură enzimă. Genele ce codifică enzimele biosintezei lipidului A de la E.coli sunt prezente într-o singură copie. La nivelul proteinelor, genele ortoloage ce codifică LpxA și LpxC sunt cele mai înalt conservate la baccterii. Lanțul de acil încorporat în LpxA este reprezentat cu roșu în schemă.

1.4. Sisteme de modificare a lipidului A

Bacterii Gram negative, precum E.coli, conțin enzime pentru modificarea lipidului A cu fosfoetanolamină, L-Ara4N sau palmitat. La Salmonella typhimurium sunt prezente și două enzime selective deacilaze, dar și o dioxigenaza. Multe dintre aceste enzime sunt reglate, în funcție de modificările apărute în condiții de creștere. De exemplu, adiția palmitatului la PagP și eliminarea unui lanț de acil de la PagL pot fi activate de către peptide cationice, ce acționează prin intermediul factorului de transcripție PhoP. Modificările pattern-ului lipidului A pot produce rezistența la anumite peptide cationice antimicrobiale sau pot atenua proprietățile endotoxice ale lipidului A. Atașarea fosfoetanolaminei la enzima EptA și L-Ara4N la enzima ArnT poate fi indusă prin activarea factorului de transcripție PmrA, fie prin expunerea celulelor la un acid slab, fie prin mutații ale genei pmrA. Grupul L-Ara4N este încărcat pozitiv la pH neutru, neutralizând sarcina negativă agrupării fosfat 4’ a lipidului A, și, implicit, susceptibilitatea bacteriei la peptide cationice antimicrobiene și polimixină. (Raetz și colab.2007)

1.5. Lipidul A – activator al imunității înnăscute

Moleculele de lipid A din lipopolizaharide sunt detectate de către receptorii TLR4/MD2 de la nivelul sistemului imunitar înnăscut al mamiferelor. Prezența lipidului A induce sinteza potențialilor mediatori ai inflamației de către macrofage, cum ar fi TNF-α sau IL-1 β. Lipidul A activează producerea de molecule costimulatoare, necesare pentru imunitatea adaptativă. În celulele mononucleare și endoteliale, lipidul A stimulează producerea de factori tisulari. Toate aceste procese au ca scop eliminarea infecțiilor locale. În cazul septicemiei, inflamația produsă de unele din aceste proteine afectează vasele de sânge mici și poate grăbi apariția șocului septic. Caracteristicile structurale ale lipidului A de la E.coli , în special grupările fosfat și aciloxiacil, determină activarea receptorilor TLR4/MD2 în celulele umane. Unii analogi ai lipidului A, mai ales cei care conțin mai puține lanțuri acil, sunt potențiali antagoniști pentru TLR4/MD2. (Raetz și colab.2007)

În cadrul interacțiunii lipidului A cu celulele animale, o proteină de transfer specială transportă lipidul A bacterian la nivelul receptorilor CD14 de pe suprafața celulelor animale. Recunoașterea subsecvențială a lipidului A de către receptorul TLR4 reprezintă etapa inițială a transmiterii semnalului. Interacțiunea lipidului A cu TLR4 implică și alte proteine, inclusiv fosfatidilinozitol-glicanul. Receptorii TLR2 sunt mai puțin specifici, comparativ cu receptorii TLR4, fiind activați de diverși liganzi, inclusiv lipoproteine bacteriene sau fragmente peptidoglicanice. Receptorii TLR6 pot funcționa împreună cu receptorii TLR2 în recunoașterea unui subset de proteine ale membranei bacteriene și lipopeptide. Receptorii TLR3 sunt activați de ARN-ul dublu răsucit, iar receptorii TLR5 sunt activați de flagelul bacterian. Receptorii TLR9 răspund în prezența unor secvențe ADN ce conțin CpG. Toți acești receptori prezintă omologie de secvență semnificativă cu domeniul intracelular al receptorilor IL-1. (Raetz și Whitfield, 2008)

2. Regiunea oligozaharidică

Regiunea oligozaharidică a lipopolizaharidelor poate varia, de la o specie la alta, însă există un element structural esențial în componența acestei regiuni, prezent la toate lipopolizaharidele, indiferent de specie. Acest element se numește rest Kdo și leagă miezul oligozaharidic de lipidul A. La numeroase bacterii, regiunea oligozaharidică conține L-glycero-D-mano-heptoza (L,D-Hep) si L-α-D-Hep-(1→3)-L-α-D-Hep-(1→5)-[α-Kdo-(2→4)]-α-Kdo tetrazaharid (Hep II, Hep I, Kdo II și, respectiv, Kdo I), care pot fi, ulterior, substituiți de alte zaharuri, resturi fosfat, sau, uneori, degrupari acetil sau aminoacizi. Pe lângă L,D-Hep, unele lipopolizaharide conțin și precursorul biosintetic al acestuia: D-glicero-D-mano-heptoză (D,D-Hep). Există și lipopolizaharide care conțin doar D,D-Hep sau care nu conțin nicio heptoză. Atât Kdo I (la Acinetobacter) cât și Kdo II (la Serratia marcescens, de exemplu) pot fi înlocuite de acidul zaharic Ko, similar din punct de vedere stereochimic. (Knirel, 2011)

2.1. Structura miezului oligozaharidic

La bacteriile care produc lipopolizaharide de tip S (Smooth), miezul oligozaharidic este divizat în două părți: miezul intern (din apropierea lipidului A) și miezul extern. Regiunea eternă a miezului oligozaharidic are rol de situs de legare pentru antigenul O. La patogenii mucoaselor, adesea lipsește antigenul O, acestea producând în schimb lipooligozaharide (LOS), ce conțin un miez intern din care se extind unul sau mai multe brațe monozaharidice sau oligozaharidice, echivalente miezului extern oligozaharidic. Aceste extensii determină specificitate serologică. În cadrul unui gen sau unei familii bacteriene, structura mezului intern oligozaharidic este bine conservată, iar faptul că miezurile oligozaharidice ale unor specii bacteriene îndepărtate filogenetic prezintă similarități mari în structura miezului intern oligozaharidic evidențiază importanța acestui miez în menținerea integrității membranei. Miezul intern conține resturi de Kdo și L-glicero-D-mano-heptoză. Structura de bază a miezului intern prezintă adesea structuri adiționale non-stoichiometrice, precum alte zaharuri sau resturi de fosfați, pirofosforiletanolamină, 2-aminetanol, fosforilcolină. Variația acestor modificări structurale contribuie la heterogenitatea moleculelor de lipopolizaharide. (Raetz și colab.2007)

Deși situat într-o regiune expusă presiunii selective răspunsurilor imunitare ale gazdei, bacteriofagilor și stresului ecologic, miezul extern oligozaharidic prezintă o diversitate structurală semnificativă. De exemplu, la E.coli există 5 tipuri de miez : R1, R2, R3, R4 si K-12. Tipul R1 predomina în cazul infecțiilor extraintestinale. Aceste tipuri de miez oligozaharidic diferă între ele prin substituenții non-stoichiometrici de la nivelul miezului intern, însă, cele mai evidente diferențe se observă la nivelul miezului extern. Variația structurală relativ limitată a miezului oligozaharidic în cadrul unui gen este în contrast cu hipervariabilitatea polizaharidului O. (Raetz și Whitfield, 2008)

2.2. Structura miezului oligozaharidic la unele specii patogene

Miezul oligozaharidic la Enterobacteriaceae

La toate speciile familiei Enterobacteriaceae restul Kdo poate fi gliozilat cu unul sau două fragmente glicozil, cunoscute ca și Kdo I și Kdo II. Trei resturi de L-licero-D-mano-heptoză sunt, de asemenea, legate de primul Kdo, fiind denumite Hep I, Hep II și, respectiv Hep III. (Banoub și colab., 2009)

Există două tipuri diferite de miez oligozaharidic la enterobacterii. Unul dintre acestea este denumit tipul Salmonella și este caracterizat de elementul structural comun L-α-D-Hep-(1→7)L-α-D-Hep-(1→3)-L-α-D-Hep-(1→5)-Kdo substituit în poziția O-3 a Hep II de glucopiranoză. Hep I și Hep II sunt fosforilate iar O-4 a Hep I nu este substituită de un zaharid. În cazul celui de-al doilea tip, diferit de Salmonella, aceași structură comună este prezentă, însă lipsește Glcp din poziția O-3 a Hep II, resturile de heptoză nu sunt fosforilate iar Hep I este substituită de un rest de hexoză. În figura de mai jos sunt prezentate regiunile oligozaharidice ale lipopolizaharidelor de la E.coli (fig.7), și specii de Providencia (fig. 8) și Yersinia (fig. 9). (Knirel, 2011)

Fig. 7 Miezul oligozaharidic R4 la E.coli, tipul Salmonella (Modificat după Knirel, 2011)

Fig. 8 Miezul oligozaharidicla Providencia rustigianii O-34, tipul Salmonella (Modificat după Knirel, 2011)

Fig. 9 Miezul oligozaharidic la Yersinia pestis, tipul diferit de Salmonella (Modificat după Knirel, 2011)

Miezul oligozaharidic la Pasteurellaceae

Miezul oligozaharidic de la specii de Pasteurellaceae, cum ar fi Haemophilus influenzae, prezintă ca și structură comună zaharidul L-α-D-Hep-(1→2)-[PEtN→6]-L-α-D-Hep-(1→3)-[β-D-Glcp-(1→4)]-L-α-D-Hep-(1→5)-[PPEtN→4]-αKdo. Doar acest rest Kdo este prezent, legând regiunea oligozaharidică de lipidul A. Alte substituții apar, mai ales, la nivelul I²-D-Glcp și Hep II. În figura 10 este prezentată structura miezului oligozaharidic la Haemophilus influenzae (Knirel, 2011).

Fig. 10 Miezul oligozaharidic la Haemophilus influenzae (Modificat după Knirel, 2011)

În cazul lipopolizaharidelor de la Histophilus (Haemophilus) somnus, regiunea oligozaharidică cuprinde dizaharidul α-Kdo)(2→4)-α-Kdo și structura comună L-α-D-Hep-(1→3)-[β-D-Glcp-(1→4)]-L-α-D-Hep-(1→5)-α-Kdo. Restul β-D-Glcp este, ulterior, substituit iar Hep II poartă fie α-D-GlcpNAc, fie β-D-Galp în poziția O-2. Hep II poate conține unul sau două resturi PEtN, iar acidul N-acetilneuraminic poate fi încorporat, aspect important în rezistența serică și reducerea legării anticorpilor. În figura 11 este prezentat miezul oligozaharidic la Histophilus somnus (Knirel, 2011).

Fig. 11 Miezul oligozaharidic la Histophilus somnus (Modificat după Knirel, 2011)

Miezul oligozaharidic din structura lipopolizaharidelor de la Pasteurella multocida prezintă o structură comună a hexazaharidului L-α-D-Hep-(1→2)-L-α-D-Hep-(1→3)-[β-D-Glcp-(1→6)]-L-αD-Hep-(1→5)-α-Kdo. (Knirel, 2011)

Miezul oligozaharidic la Pseudomonaceae

În miezul lipopolizaharidelor familiei Pseudomonaceae este prezent un rest de α-D-GalpN, ulterior acetilat de către L-alanina. Acest rest substituie în poziția O-3 a Hep II din tetrazaharidul L-α-D-Hep-(1→3)-L-α-D-Hep-(1→5)-[α-Kdo-(2→4)]-α-Kdo, ulterior Hep II fiind substituit în O-7 de o grupare carbamoil. Regiunea oligozaharidică a lipopolizaharidelor de la Pseudomonaceae este înalt fosforilata. Regiunea externă apare sub două glicoforme și este O-acetilata întâmplător. În figura 12 sunt prezentate cele două glicoforme la Pseudomonas aeruginosa. (Knirel, 2011)

Glicoforma 1

Glicoforma 2

Fig. 11 Miezul oligozaharidic la Pseudomonas aeruginosa (Modificat după Knirel, 2011)

La Pseudomonas aeruginosa, miezul oligozaharidic este divizat, de asemenea, în miezul intern și miezul extern. Miezul intern este reprezentat de un tetrazaharid cuprins în 2 resturi de acid 3-deoxi-D-mano-oct-2-ulozonic (Kdo I și Kdo II) și două resturi de L-glicero-D-mano-heptoză (Hep I și Hep II). acest miez intern este înalt fosforilat și prezintă trei situsuri comune de fosforilare: O2 și O4 la Hep I și O6 la Hep ÎI. Miezul extern este alcătuit din o D-galactozamina (D-GalN), o L-Ramnoza (L -Rha) și trei resturi de D-glucoză (Glc I-Glc III). GalN este ulterior substituită cu o grupare alanil. Pseudomonas aeruginosa sintetizează simultan două glicoforme ale miezului oligozaharidic. Miezul acoperit este legat covalent de antigenul O, în timp ce miezul neacoperit este separat de antigenul O. Miezurile interne ale formelor acoperite și, respectiv, neacoperite sunt identice, conservate, însă miezurile externe diferă prin poziția lor și legătura cu restul L-Rha. Miezul acoperit este legat de antigenul O prin restul L-RhaB, legat 1,3 de GlcI, în timp ce miezul neacoperit conține L-RhaA legat 1,6 la GlcII. (Kocinkova și Lam, 2011)

Miezul oligozaharidic la Moraxellaceae

Ïn cazul acestei familii, au fost descoperite structuri ale miezului oligozaharidic atât posedând Ko, cât și fără Ko. La Acinetobacter lwoffii, acest miez prezintă dizaharidul α-Kdo-(2→8)-α-Kdo, întâlnit și la Chlamydia/Chlamydophila. În figurile 12, 13 și 14 sunt prezentate miezurile oligozaharidice a trei specii de Acinetobater. (Knirel, 2011)

Fig. 12 Miezul oligozaharidic la Acinetobacter haemolyticus (Modificat după Knirel, 2011)

Fig. 13 Miezul oligozaharidic la Acinetobacter baumannii (Modificat după Knirel, 2011)

Fig. 14 Miezul oligozaharidic la Acinetobacter lwoffii (Modificat după Knirel, 2011)

Miezul oligozaharidic la Vibrionaceae

Familia Vibrionaceae aparține grupului major numit Proteobacteria, bacterii ce populează apele dulci sau apele sarate. Anumite specii ale acestui gen sunt patogene, inclusiv V.cholerae, care este agentul ce produce holera (febra porcină). Majoritatea bacteriilor bioluminiscente aparțin acestei familii și sunt intalnite, de obicei, în simbioză cu animale acvatice, ce trăiesc la mare adâncime. (Madigan și Martinko, 2005)

Ïn urma hidrolizei în prezență de acizi tari, derivații Kdo, fosforilați în poziția O-5, sunt eliberați din lipopolizaharide la V.cholerae. Kdo fosforilat a fost identificat ca și Kdo 5-fosfat prin tehnici de cromatografie și spectrometrie, în urma supuneriireducerii și permetilarii. (Brade, 1985)

Fig. 15 Miezul oligozaharidic la Vibrio cholerae, structura generala (Modificat după Knirel, 2011)

La Vibrionaceae, structura comună este reprezentată de un rest de Kdo fosforilat în poziția O-4 și substituit în poziția O-5 de trizaharidul α-D-GlcpNAc-(1→7)-L-α-D-Hep-(1→2)-L-α-D-Hep-(1→3)-L-α-D-Hep, în care Hep I este substituit de β-Glcp în poziția O-4 și α-Glcp în poziția O-6. Variații ale structurii miezului oligozaharidic apar în urma a diferite substituții în poziția O-6 a resturilor de Glcp și Hep II, precum și în pozițiile O-2 și O-4 a Hep III. În figura 15 se observă structura regiunii oligozaharidice la Vibrio cholerae. (Knirel, 2011)

La unele specii ale genului Aeromonas, cum ar fi Aeromonas salmonicida, subspecia salmonicida, regiunea oligozaharidică conține patru resturi L-α-D-Hep, în care Hep I este legat α-(1→5) la Kdo-4-fosfat. Restul de heptoză al acestei unități este substituit în mod diferit, în poziția O-4. La Aeromonas hydrophila, pe lângă cele patru resturi de L-α-D-Hep, regiunea oligozaharidică conține și dizaharidul D-α-D-Hep, substituind O-6 din β-D-Glcp în poziția O-4 din Hep I.

Miezul oligozaharidic la Burkholderiaceae

Bacteriile din genul Burkholderia prezintă caracteristici structurale ale regiunilor oligozaharidice din lipopolizaharidele lor, cu valoare chemotaxonomică. Miezul oligozaharidic al acestor bacterii conține cantități mari de dizaharide: α-Kdo-(2→4)-α-Kdo si α-Ko-(2→4)-α-Kdo. Structura comună a acestui miez este reprezentată de L-α-D-Hep-(1→7)-L-α-D-Hep-(1→3)-[β-D-Glcp-(1→4)]-L-α-D-Hep-(1→5)-α-Kdo. Ïn miezul lipopolizaharidelelor de la Burkholderia caryophylli, Hep II este substituit în poziția O-3 de un glican ramificat, de care este legat un polizaharid O-specific. Această regiune oligozaharidica prezintă ca și caracteristică unică două fragmente de L-α-D-Hep-(1→5)-α-Kdo. De asemenea, conține și un pentazaharid linear, ce prezintă patru resturi L,DHep și un rest terminal D,D-Hep. În figura 16 este prezentată structura miezului oligozaharidic la Burkholderia pyrocinia. (Knirel, 2011)

Fig. 16 Miezul oligozaharidic la Burkholderia pyrocinia (Modificat după Knirel, 2011)

Hexazaharidul α-L-Rh-1→2)-L-α-D-Hep-(1→3)-[β-D-Glcp-(1→4)]-L-α-D-Hep-(1→5)-[-Ko-(2→4)]-α-Kdo de la Burkholderia pyrocinia se găsește și la Burkholderia cepacia si Ralstonia solanacearum. În figura 17 este prezentată structura miezului oligozaharidic la R.solanacearum. (Knirel, 2011)

Fig. 17 Miezul oligozaharidic la Ralstonia solanacearum (Modificat după Knirel, 2011)

Miezul oligozaharidic la Neisseriaceae

În general, lipopolizaharidele bacteriilor din această familie sunt de tip R (Rough). Cu toate acestea, miezul oligozaharidic conține trizaharidul L-α-D-Hep-(1→3)-L-α-D-Hep-(1→5)-Kdo, care este substituit de β-D-Glcp în poziția O-4 a Hep I și de αD-GlcpNAc în poziția O-2 a Hep II. Variații structurale apar prin diferite substituții, în pozițile O-4 a β-Glcp și în Hep II. În figura 18 este prezentată structura generală a acestei regiuni la Neisseria meningitidis. (Knirel, 2011)

Fig. 18 Miezul oligozaharidic la Neisseria meningitidis (Modificat după Knirel, 2011)

Au fost identificate 6 serotipuri la Neisseria gonorrhoeae, agentul infecțios al gonoreei. Rezistența acestei bacterii poate fi cauzată de sializarea lipopolizaharidelor, care apare la nivelul unui rest de β-D)Galp legat 1→4 de α-D-GlcpNAc. Neisseria meningitidis este un agent infecțios ce produce afecțiuni severe la om, cum ar fi septicemia și meningita. Au fost diferențiate, inc azul acestei bacterii, 12 serotipuri, din care 8 conțin lacto-N-neotetroza β-Galp-(1→4)-β-GalpNAc-(1→3)-β-Galp-(1→4)-β-Glcp. Această structură comună este identică cu fragmentul de glicozil din lactoneotetraglicozilceramida, de la nivelul membranei eritrocitelor umane și se consideră că reprezintă un antigen ce ajută bacteria să scape de apărarea gazdei infectate. Sializarea apare, de asemenea, în unele lipopolizaharide meningococale, unde α-Neu5Ac este legat 2→3 de restul Galp terminal al lacto-N-neotetraozei. Alți substituenți ai miezului oligozaharidic: două resturi de PEtN la Hep I în Neisseria meningitidis, glicina în poziția O-7 a Hep II în diferite imunotipuri, dar și o grupare O-acetil, ce poate fi prezentă în poziția O-3 a GlcpNAc. (Knirel, 2011)

2.3. Rolul miezului oligozaharidic in stabilitatea membranei externe: fenotipul “deep-rough”

Acest tip de fenotip “dur” (rough) apare la mutanți ai unor specii de bacterii Gram negative, la care lipsește regiunea heptozica de la nivelul miezului intern oligozaharidic. Fenotipul rough reprezintă o serie de caracteristici care, împreună, reflectă modificări atât în structura cât și în compoziția membanei externe, ducând la instabilitatea acesteia. Aceste caracteristici includ modificări ale hidrofilicitatii suprafeței, efectul fiind de hiersensibilitate la coloranți hidrofobici, detergenți, antibiotice hidrofobice, acizi grași, fenoli și hidrocarburi policiclice. Acești mutanți eliberează, de bicei, cantități semnificative de enzime periplasmice în cultură, dacă mediul nu conține concentrații mari de Mg2+. Membrana externă a unor astfel de bacteii suferă și o diminuare a concentrației de proteine, asociată cu o creștere a concentrației de fosfolipide. Mutanții deep-rough de la E.coli activează exprimarea acidului colanic, își pierd pilii și flafgelul și secretă o formă a hemolizinei, cu activitate hemolitică redusă. Toți acești factori pot influența formarea biofilmelor. (Raetz și colab.2007)

Primele studii realizate pe acest tip de fenotip la mutanți de Salmonella cu multiple defecte ale lipopolizaharidelor au evidențiat molecule secționate cu reducerea fosforilarii. Grupările fosforil sunt implicate în formarea unei membrane stabile pe parcursul furnizării situsurilor ce ar permite moleculelor de lipopolizaharide să fie legate încrucișat prin cationi divalenți.

Fig. 19 Structura miezului oligozaharidic la Klebsiella pneumoniae O1 și Pseudomonas aeruginosa O5 (Modificat după Raetz și Whitfield, 2008)

Tratamentul celulelor cu EDTA are un efect dăunător asupra integrității membranei externe și viabilității celulei. Descoperirea și caracterizarea biochimică a kinazei lipopolizaharidice WaaP a permis construirea unor mutanți unde nu are loc fosforilarea miezului oligozaharidic. În laborator, mutanții waaP prezintă unele caracteristici specifice fenotipului deep-rough, precum hipersensibilitatea la compușii hidrofobici, dar nu prezintă alterări ale conținutului proteic al membranei externe. Mutațiile ce elimină sinteza miezului extern oligozaharidic determină creșterea susceptibilității la anumiți compuși hidrofobi, datorită unui efect indirect asupra fosforilarii miezului. În timp ce E.coli și Salmonella se pot adapta în lipsa fosforilării miezului oligozaharidic, la P.aeruginosa mutanții cu defecte la nivelul waaP sau asamblării heptozei miezului intern nu sunt viabili. Miezul oligozaharidic de la Pseudomonas prezintă o heptoză multiplu fosforilată în componența miezului intern, aceste bacterii fiind înalt susceptibile lizării în prezență de EDTA. La K.pneumoniae, nu are loc fosforilarea regiunii heptozice, sarcinile încărcate negativ fiind asigurate de acizii uronici. Structura miezului oligozaharidic la Klebsiella pneumonae si Pseudomonas aeruginosa este prezentată în figura 19. Heterogenitatea structurală a lipopolizaharidelor extrase de la K.pneumoniae rezultă din variantele structurale la care lipsesc unul sau ambele resturi de acid β-galacturonic. K.pneumoniae elimină, de obicei, cantități semnificative de complex entracelular toxic ce conține capsula polizaharidică, lipopolizaharide și proteine, acest complex fiind implicat în deteriorarea țesutului pulmonar, specifică pneumoniei cauzate de infecția cu aceasta bacterie. (Raetz și Whitfield, 2008)

2.4. Genetica și biosinteza regiunii oligozaharidice

Lipidul A are rol de acceptor, la nivelul căruia miezul oligozaharidic și lanțurile lipooligozaharidice se asamblează prin transferul unor secvențe glicozil de la precursorii zaharici ai nucleotidelor. Activitatea endogenă in vitro a glicoziltransferazei poate fi identificată în fracții membranare, numeroase dintre enzime fiind proteine periferice. O sinteză rapidă și eficientă a miezului oligozaharidic reflectă un complex coordonat membrană – glicoziltransferazele asociate. Acest complex acționează la nivelul feței citoplasmatice a membranei interne, unde sunt disponibile zaharurile nucleotidice. Regiunea cromozomală waa conține operonii cu rol principal în asamblarea oligozaharidelor miezului. Analiza unor secvențe comparative ale acestei regiuni, la E.coli și S.enterica a evidențiat unele rearanjamente observate în structuri diferite ale miezului oligozaharidic. Gene omoloage ale genelor responsabile de biosinteză miezului oligozaharidic au fost identificate la o varietate de bacterii non-enterice. (Raetz și colab.2007)

La E.coli, Salmonella și K.pneumoniae, genele responsabile de biosinteza miezului oligozaharidic sunt grupate la nivelul cromozomului bacterian. Acesti loci codifică toate procesle necesare asamblării miezului extern oligozaharidic, dar și toate enzimele transferaze necesare sintezei miezului intern oligozaharidic. La E.coli și Salmonella, locusul waa constă in 3 operoni, asociați între cysE și pyrE, la nivelul cromozomului. Operonii sunt definiți de prima genă din fiecare unitate transcripțională: gmhD-, waaQ- și waaA. Genele gmhD-waaFC sunt necesare biosintezei și transferului L,D-heptozei. Transcripția operonului gmhD la E.coli este reglată de un promotor “heat-shock” (șoc termic), cel mai probabil indicând necesitatea domeniului heptozic al lipopolizaharidelor pentru creșterea la temperaturi ridicate. Operonul central waaQ conține gene necesare biosintezei miezului extern.

Fig. 20 Structura și biosinteza miezului oligozaharidic la E.coli R1 (Modificat după Raetz și Whitfield, 2008)

La E.coli (fig. 20), în cazul miezurilor de tip R1 și R4, acest operon conține și genele structurale “ligazice” (waaL), al căror produs este necesar în legarea polizaharidului O de miezul complet. Operonul waaQ este precedat de o secvență JUMPStart (Just Upstream of Many Polysaccharide-associated gene Starts), care include o regune conservată, numita ops (operon olarity suppresor), împreună cu RfaH (un omolog al NusG), fiind necesari supresării polarității operonului. Transcriptul waaA conține gena structurală ce codifică transferaza Kdo bifuncțională, dar și o genă “non-lipopolizaharidica”, ce codifică adenililtransferaza-fosfopanteina. Examinarea unor genomuri adnotate de la organisme îndepărtate din punct de vedere al gradului de înrudire a evidențiat existența unor subseturi de gene grupate, ce codifică biosinteză miezului oligozaharidic. (Raetz și Whitfield, 2008)

2.4.1. Asamblarea miezului intern oligozaharidic

Prima etapă este reprezentată de sinteza NDP-heptozei, ce presupune convertirea sedoheptuloz-7-fosfatului în D,D-heptoz-7-fosfat, de către izomerazaGmhA. Enzima esențială în formarea lipopolizaharidelor ce conțin heptoză este RfaE. Secvența acestei enzime prezintă două domenii, unul având similaritate cu ribokinazele, celălalt fiind similar nucleotidiltransferazelor. (Raetz și Whitfield, 2008)

Genele care codifică enzimele pentru sinteza GDP-D,D-heptozei sunt grupate la nivelul cromozomului bacterian, ca și în cazul genelor care codifică ADP-heptoza la Campylobacter jejuni și Helicobacter pylori, în timp ce la E.coli, P.aeruginosa și H.influenzae aceste gene sunt răspândite în structura cromozomului. Deși majoritatea genelor omoloage sunt bine conservate la bacteriile Gram negative, la N.meningitidis HldE prezintă două domenii în polipeptide separate. Distribuția acestor enzime la patogeni importanți și necesitatea lipopolizaharidelor ce conțin heptoză în formarea unei membrane externe stabile sunt importante în stabilirea strategiilor terapeutice, în cazul infecțiilor cu aceste bacterii. (Raetz și colab.2007)

Modificarea regiunii oligozaharidice la E.coli se desfășoară sub acțiunea a trei enzime: WaaP (o kinază lipopolizaharidică), WaaY (o enzimă necesară celelei de-a doua fosforilări) și WaaQ (o tranferază ce adaugă brațul lateral al heptozei). WaaP este prima enzimă ce acționează, fiind urmată de WaaQ și ulterior de WaaY.. Enzima WaaP de la P.aeruginosa prezintă similaritate crescută cu omoloagele de la E.coli și Salmonella, putând fi schimbate între ele, din punct de vedere funcțional. Mutanții la care lipoolizaharidele nu prezintă miezul extern sunt fosforilati ineficient de către enzimă WaaP, ccea ce determină scăderea eficienței miezului oligozaharidic. (Raetz și Whitfield, 2008)

2.4.2. Asamblarea miezului extern oligozaharidic

Toate miezurile oligozaharidice de la E.coli și Salmonella au în structura miezului extern ca prim zaharid un rest de glucoză. Date biochimice, structura lipoolizaharidelor și experimente de complementație genică au identificat WaaG ca și UDP-glucoză: α 1,3-glucoziltransferaza (heterozil) lipopolizaharidică la E.coli și Salmonella. Omoloagele lui WaaG din fiecare tip de miez oligozaharidic sunt înalt conservate. (Raetz și Whitfield, 2008)

Enzima LgtC este o α 1,4-galactoziltransferază, implicată în sinteza lipooligozaharidelor la Neisseria meningitidis. La E.coli și S.enterica, enzimele ce catalizează legăturile conservate sunt înrudite, genele care le codifică ocupând poziții similare in loci. O excepție este reprezentată de glicoziltransferaza responsabilă de glucoza terminală legată α 1,2, la E.coli R3 și S.enterica. Enzimele implicate în aceste cazuri nu prezintă similaritate semnificativă și sunt localizate în poziții diferite în operonii corespunzatori waaQ. (Raetz și colab.2007)

La E.coli și Salmonella, miezurile oligozaharidice de tip R1 și R4 sunt singurele ce implică β-glicoziltransferaza. Ele prezintă similaritate de secvență și caracteristici bidimensionale. Aceste enzime necesită cel puțin două grupări carboxil catalitice, unul folosind pentru a coordona un cation divalent asociat cu nucleotida-donor și celălalt folosind ca și bază pentru activarea donorului. Sistemele R1 și R4 adaugă zaharuri diferite în același situs, iar enzimele ce intervin în cazul fiecărui sistem aparțin unor familii diferite de glicoziltransferaze: WaaV și WaaX. (Raetz și Whitfield, 2008)

2.5. Rolul regiunii oligozaharidice in heterogenitatea lipopolizaharidelor

Moleculele de lipopolizaharide prezintă variații la nivelul extensiei miezului oligozaharidic. Heterogenitatea lipopolizaharidelor este influențată de modificări ale regiunii Kdo a miezului intern oligozaharidic. Analiza unor profiluri SDS-PAGE ale lipopolizaharidelor de la mutanți de E.coli K-12 au evidențiat faptul că enzimele WaaS (1,5-ramnoziltransferaza), WaaZ (α-2,4-Kdo-transferaza) și WaaQ au un rol esențial în producerea celor două forme de lipopolizaharide. Enzima WaaZ este conservată la E.coli, tip R2, dar și la S.enterica. În cazul tipului R1, însă, gena waaZ este absentă. (Raetz și colab.2007)

Diferențele de la nivelul miezului extern pot, de asemenea, determina eficiența legării anigenului O la nivelul miezului, influențând, prin urmare, heterogenitatea lipopolizaharidelor. La P.aeruginosa există diferențe semnificative în structura regiunii oligozaharidice, cu sau fără polizaharide O atașate. La K.pneumoniae, moleculele de lipopolizaharide de tip R conțin un heptan dar nu conțin restul α-Kdo în miezul extern oligozaharidic. La Salmonella, moleculele de lipopolizaharide de tip S nu conțin restul terminal de α-(→)-Glc. Heterogenitatea moleculelor lipopolizaharidice este complexă și, în mod cert, influențată de structura regiunii oligozaharidice a lipopolizaharidului respectiv. (Raetz și Whitfield, 2008)

3. Antigenul O

Antigenul O al lipopolizaharidelor de tip S este alcătuit din unități oligozaharidice repetitive, ce se extind în afata celulei bacteriene, având o structură ce variază între diferite genuri și serotipuri bacteriene. Aceste variații pot fi datorate compoziției unităților zaharidice, poziției legăturilor O-glicozidice sau naturii constituenților non-carbohidrați. De aceea, lanțurile O-specifice (fig.21) sunt prezente doar la bacteriile Gram negative de tip smooth. La speciile patogene, lanțul O polizaharidic este, de obicei, expus direct asupra gazdei, pe parcursul infecției, și are rol protector față de mediul înconjurător bacteriei. (Banoub și colab., 2009)

Fig. 21 Structura unui lipopolizaharid

Lanțurile O-specifice ajută bacteria să scape de acțiunea litică a complementului format în urma răspunsului imun din partea gazdei. De asemenea, ele protejează bacteria de efectele antibioticelor, lucru evidențiat și de sensibilitatea bacteriilor de tip roughm comparativ cu cele de tip smooth. (Banemann și colab., 1998)

Structura unică a lanțurilor O se datorează diversității monozaharidelor din componența lor, posibilităților numeroase de legături glicozidice, substituții și configurații ale zaharurilor, dar și capacităților genetice a unor diverse organisme. Structura lanțurilor O poate fi lineară sau ramificată, cu resturi zaharidice glicozilate. Cei mai comuni substituenți sunt grupările N-acetil, fosfat și fosforiletanolamina. (Banoub și colab., 2009)

Pe parcursul biosintezei, unitățile repetitive sunt polimerizate și, ulterior, adăugate miezului oligozaharidic. Natura lanțului O poate fi, în unele cazuri, asociată efectelor patogenice ale bacteriei respective. De exemplu, în lanțurile O de la Proteus apar frecvent compuși precum acidul uronic, grupări fosfat sau acidul lactic. În unele cazuri, ultimul zahar de la capătul nereducător al lanțului O poartă un substituent ce blochează adiția de subunități, ca și semnal terminal. Acesta poate fi o simplă grupare metil sau un zahar terminal distinct, cu alți substituenți într-o structură homopolimerica. Grupările terminale nereducătoare au un rol important în cadrul reacțiilor serologice. (Banoub și colab., 2009)

3.1. Structura polizaharidelor O

Lipopolizaharidele de tip S (smooth) sunt produse, de obicei, de specii aparținând familiilor Enterobacteriaceae, Pseudomonaceae, Pasteurellaceae, Vibrionaceae, dar și alte familii aparținând clasei bacteriilor Gram negative. Diversitatea structurală a antigenului O este deosebită, fiind cunoscute peste 60 de monozaharide și 30 de non-carbohidrați din compoziția sa. Unitățile structurale repetitive ale polizaharidului O pot diferi prin poziția și stereochimia legăturilor O-glicozidice, dar și prin prezența sau absența substituenților noncarbohidrați. Unitățile O-repetitive din diferite structuri ale antigenului O pot conține un număr variat de monozaharide, pot fi lineare sau ramificate, și, de asemenea, pot forma homopolimeri, sau, adesea, heteropolimeri. În unele cazuri, modificările nonstoichiometrice, cum sunt, de exemplu, acetilarea și glicozilarea, complică identificarea exactă a unei unități repetitive. Prin separarea moleculelor de lipopolizaharide de tip S, în prezența de SDS-PAGE, se observă o heterogenitate extensivă a dimensiunii moleculelor, datorită variațiilor lungimii lanțului de polizaharide O. (Raetz și Whitfield, 2008)

Structură polizaharidului O definește specificitatea serologică a antigenului O într-un organism, dar numărul antigenelor O unice în cadrul unei specii variază considerabil. De exemplu, E.coli produce aproximativ 170 de serotipuri O. La S.enterica, există 46 de serogrupuri, dar modificările unităților repetitive bazale crează mai mulți “factori O” adiționali. O bacterie izolată exprimă, de obicei, un singur antigen O. Există, însă, și excepții, unde bacteria respectivă conține mai mulți polimeri legați la nivelul complexului lipid A-miez oligozaharidic, complicând atât structura cât și terminologia antigenului O. Ïn cazul lui E.coli, de exemplu, complexul format de lipidul A și miezul oligozaharidic pote acționa ca și ancoră pentru antigenul O, atât pentru o formă a polimerului ECA (Enterobacterial Common Antigen), cât și pentru un subset de antigene K capsulare. La unele specii de Salmonella, acest complex folosește ca și acceptor pentru antigenul O. Ïn unele cazuri, S.enterica produce un antigen O codificat cromozomal. Pseudomonas aeruginosa, de asemenea, exprimă doi polimeri legați la nivelul complexului lipid A-miez oligozaharidic: un homopolimer poliramnozic conservat, numit lipopolizaharid A-band, și un antigen O serotip-specific, numit lipopolizaharid B-band. (Raetz și colab.2007)

Polizaharidul O este localizat la suprafața celulei, la nivelul interfaței dintre bacterie și mediul înconjurător. Rolul primar al polizaharidului O este de protecție. La patogenii mamiferelor, polizaharidele O pot contribui la evitarea răspunsurilor imune ale gazdei. Lungimea lanțului polizaharidului influențează, de exemplu, sensibilitatea lui E.coli la proteina BPI (Bactericidal Permeability Increasing). Așadar, rolul polizaharidelor O la diferite bacterii este variabil. (Raetz și Whitfield, 2008)

3.2. Biosinteza polizaharidelor O

Cu mici excepții, enzimele implicate în asamblarea polizaharidelor O sunt gene de la nivelul locusului numit rfb. Deși majoritatea sunt codificate cromozomal, există și excepții, cum este polizaharidul O:54, codifical plasmidial, la S.enterica. Diversitatea structurii polizaharidului O este reflectată în polimorfismul înalt al locusului rfb. Majoritatea operonilor rbf sunt exprimați constitutiv, și sunt adesea precedați de o secvență JUMPStart. O excepție este cazul Y.enterocolitica, unde locusul biosintezei polizaharidului O este reglat transcripțional de temperatură, această reglare fiind mediată de un represor codificat în afara cluster-ului. (Raetz și Whitfield, 2008)

Polizaharidele O sunt sintetizate din nucleotide zaharice, de către enzime glicozil transferaze, adesea solubile, sau de proteine membranare periferice, sugerând faptul că asamblarea unităților repetitive are loc la nivelul feței interne a membranei citoplasmatice. (Raetz și colab.2007)

Există trei căi de biosinteză a plizaharidelor O: calea Wzy-dependentă (fig. 22), calea ABC-transportor dependentă și calea sintetaz-dependentă. Deși sunt diferențe în privința exportului, toate aceste căi presupun reacții de inițiere similare, și sunt completate de același proces de ligare. (Raetz și Whitfield, 2008)

Fig. 22 Biosinteza și asamblarea polizaharidelor O pe calea Wzy-dependentă (Modificat după Raetz și Whitfield, 2008)

A. Secvența reacțiilor implicate în formarea unităților repetitive și polimerizarea lor, la S.enterica

B. Etapele polimerizării și procesele ce implică enzima Wzy

4. Exportul lipolizaharidelor

Pentru a fi exportate la suprafața celulei bacteriene, moleculele de lipopolizaharide trebuie să traverseze periplasmul și membrana externă. Procesul de translocație nu face diferența între lipopolizaharide cu structuri ale polizaharidului O diferite și între lipopolizaharide de tip S, respectiv de tip R, toate aceste molecule fiind exportate cu aceeași eficiență. (Raetz și Whitfield, 2008)

Modelele de asamblare și translocație a polizaharidelor capsulare presupun un “scaffold” molecular la nivelul periplasmului, conținând proteine implicare în procesul de translocație. Sistemele de secreție proteică de tip II și III, la bacterii, presupun anumite mecanisme de multi-translocație a proteinelor. (Raetz și colab.2007)

Locusul biosintezei capsulei bacteriilor Gram negative codifică proteine implicate în translocatia prin periplasm și membrana externă, dar nu sunt codificate și proteinele corespunzătoare de locusul biosintezei miezului lipopoliaharidic sau poizaharidului O. (Raetz și Whitfield, 2008)

5. Importanța biologică a lipopolizaharidelor

Grupul clasic al formelor puternic agoniste de lipopolizaharide cuprinde un set de tipuri similare de lipid A. O serie de structuri naturale sau derivate ale lipidului A au fost identificate, prezentând comparativ imunostimulare scăzută, sau chiar neprezentând imunostimulare, la unele specii mamaliene. (Banoub și colab., 2009)

Forme agonistice ale lipidului A pot declanșa numeroase efecte fiziologice imunostimulatoare la organismele mamaliene, dar în doze mai mari poate, de asemenea, produce reacții patologice, cum este inducerea șocului septic. Celulele linei mieloide reprezintă senzorii celulari primari pentru lipopolizaharide, în sistemul imunitar al mamiferelor. (Alexander și Rietschel, 2001)

Mici cantități de diferite porțiuni de lipopolizaharide au fost folosite în vaccinuri și tratamente anticanceroase. (Banoub și colab., 2009)

IV. IMUNITATEA ÎNNĂSCUTĂ

Pentru a se instala o infecție, microorganismul invadator trebuie, mai întâi, să depășească mai multe bariere de suprafața, precum pielea, enzime degradative și mucus, acestea având fie activitate antimicrobială directă, fie inhibând atașarea microorganismului la organismul gazdă. Deoarece nici suprafața pielii și nici cavitățile corpului acoperite de mucus nu reprezintă medii ideale pentru majoritatea microorganismelor, cei mai mulți patogeni trebuie să pătrundă prin aceste bariere, pentru a ajunge la țesuturile interne. Orice microoganism ce depășește aceste bariere se confruntă cu două nivele de rezistență: alte mecanisme de rezistență nespecifică și răspunsul imun specific.

Vertebratele, inclusiv omul, sunt în permanență expuse microorganismelor și produșilor metaboliți ai acestora, ce pot cauza diferite boli. Aceste animale sunt dotate cu un sistem imunitar ce le protejează împotriva consecințelor adverse ale acestei expuneri.

Sistemul imunitar este alcătuit din celule distribuite în mare măsură uniform în organism, organizate sub forma unor țesuturi și organe ce recunosc substanțele străine, inclusiv microorganismele, acționând împreună în veederea distrugerii acestora.

Imunitatea se referă la abilitatea generală a gazdei de a rezită unei potențiale infecții sau boli. Există două tipuri fundamentale de răspuns imun la un microorganism/substanță străină: răspunsul imun nespecific și răspunsul imun specific. (Willey și colab., 2008)

Răspunsul imun nespecific, ce implică rezistența nespecifică, reprezintă imunitatea înnăscută. Acesta oferă rezistență la orice microorganism sau substanță străină cu care organismul vine în contact. Acest tip de răspuns imun mecanisme generale înnăscute, ce fac parte din structura și funcționarea fiecărui animal, cum sunt pielea, mucucsul sau mediatori antimicrobiali produși constitutiv, precum lizozimul. Aceste mecanisme acționează ca și primă linie de apărare a organismului. Răspunsul imun nespecific apără organismul împotriva particulelor străine fără a avea însă memorie imunologică.

În contrast cu imunitatea înnăscută, răspunsul imun specific reprezintă imunitatea adaptativă, dobândită. Eficiența acestui tip de răspuns imun crește pe măsură ce se repetă expunerea la un anumit agent străin, cum sunt virușii, bacteriile sau toxinele. Răspunsul imun specific prezintă, deci, “memorie” imunologică. Substanțele ce sunt recunoscute ca și străine organismului și produc emiterea unui răspuns imun se numesc antigene. Antigenele determină replicarea unor celule specifice, ce produc o varietate de proteine, cu rolul de a proteja organismul gazdă . Astfel de celule sunt celulele B, care produc și secretă glicoproteine, numite anticorpi. Anticorpii se leagă de antigene specifice, pe care le inactivează sau contribuie la eliminarea lor. Alte celule ale sistemului imunitar sunt activate, ulterior, și distrug celulele patogene. Răspunsul nonspecific și răspunsul specific funcționează, de obicei, împreună, pentru a asigura eliminarea microorganismelor patogene sau altor agenți străini pătrunși în organism (fig. 23). (Willey și colab., 2008)

Fig. 23 Sistemul imunitar mamalian (Modificat după Willey și colab., 2008)

Deși sistemul înnăscut predomină imediat după expunerea inițială la substanțe străine, apar multiple conexiuni între componentele sistemului înnăscut și cele ale sistemului adaptativ. Cel mai important aspect este faptul că există o varietate de celule ce funcționează atât în imunitatea înnăscută, cât și în imunitatea adaptativă: leucocitele. Dezvoltarea celulelor sangvine are loc la nivelul măduvei osoase hematogene, la mamifere, pe parcursul procesului numit hematopoieză (fig. 24).

Leucocitele sunt împărțite între sistemul imunitar înnăscut și cel adaptativ. Celulele mature care părăsesc măduva osoasă hematogenă și sunt capabile să răspundă fiziologic în prezența unui antigen sunt alocate sistemului iunitar înnăscut, în timp ce celulele imature, care nu sunt complet funcționale atunci când părăsesc măduva, dar se diferențiază ca răspuns la diferite antigene, sunt alocate sistemului imunitar adaptativ.

Leucocitele provin din celule stem pluripotente. Celulele stem pluripotente sunt nediferențiate; ele se diferențiază atunci când migrează în alte situsuri, unele devenind celule ale liniei leucocitare, ce vor formă leucocitele. În apărarea gazdei împotriva microorganismelor patogene, leuocitele cooperează între ele, mai întâi pentru a recunoaște patogenul ca și invadator, și apoi pentru a îl distruge. (Willey și colab., 2008)

Există și numeroși mediatori chimici ce intervin în rezistența nespecifică (înnăscută). Gazdele mamaliene prezinte bariere specifice ce contribuie la combaterea atacului microorganismelor patogene, cum ar fi peptid cationice, bacteriocine, citokine, interferoni, pirogeni, proteine de fază-acută, complement, și alte substanțe chimice cu rol de mediatori chimici. Sistemul complement este compus dintr-un număr mare de proteine serice, cu rol important în elaborarea răspunsului imun. Citokinele sunt necesare atât în reglarea răspunsului imun specific, cât și în reglarea răspunsului imun nespecific. Interferonii reprezintă un grup de citokine ce răspund în mod defensiv infecțiilor virale, endotoxinelor, stimulilor antigenici, agenților mitogenici dar și altor potențiali patogeni, capabili de creștere intracelulară.

Febra indusă de un microorganism stimulează sistemul imunitar al gazdei și, implicit, mecanismele de apărare, prin trei modalități: fie prin stimularea leucocitelor care să distrugă microoganismele invadatoare, fie prin diminuarea cantității de fier disponibilă microorganismului, fie prin stimularea sctivitatii sistemului imunitar specific și declanșarea răspunsului imun adaptativ.

Fig. 24 Diferitele tipuri de celule sangvine la om (Modificat după Willey și colab., 2008)

1. Inflamația și răpunsul inflamator

Inflamația este o importantă reacție de apărare nespecifică atunci când țesutul este afectat, așa cum este și în cazul unui agent patogen pătruns în organism.

Capilar

Marginație

Diapedeză

Permeabilitate crescută

Chemotaxie

Mastoicite

Fagocitoză

Bacterii

Mediatori chimici

Fig. 25 Procesele fiziologice din cadrul răspunsului inflamator acut (Modificat după Willey și colab., 2008)

Inflamația acută este răspunsul imediat al organismului în cazul unei leziuni sau morții celulare. Răspunsul inflamator acut (fig. 25) este declanșat atunci când celulele țesutului lezat eliberează semnale chimice ce activează endoteliul capilarelor din apropierea leziunii. Printre capilare, selectinele, o familie de molecule de adeziune celulară, sunt expuse pe celulele endoteliale activate. aceste molecule de adeziune atrag și atașează neutrofile la nivelul celulelor endoteliale. Acest lucru încetinește neutrofilele, rămânând în zona endoteliului, unde întâlnesc semnalele chimice ale inflamației. Aceste semnale activează integrinele, receptori de adeziune, la nivelul neutrofilelor. Ulterior, integrinele se atașează puternic de selectine, ceea ce cauzează blocarea neutrofilelor la nivelul endoteliului, apărând astfel marginatia. Neutrofilele suferă aici modificări importante de formă și pătrund prin peretele endotelial în lichidul interstițial, migrând la situsul leziunii. Aici, neutrofilele atacă potențialii patogeni sau alte cauze ale leziunii tisulare. (Willey și colab., 2008)

Neutrofiele și alte leucocite sunt atrase către infecție de factorii chemotactici, numiți și chemotaxine. Aceștia includ substanțe eliberate de bacterii, celulele endoteliale, mastocite sau produși tisulari. În funcție de severitatea și natura deteriorării suferite de țesut, și alte tipuri de leucocite pot urma neutrofilele.

În contrast cu inflamația acută, care este un proces rapid, inflamația cronică este un proces încet, caracterizat prin formarea unui nou țesut conectiv, care, de obicei, deteriorează tesustul permanent. inflamația cronică poate fi cauzată de persistența unei bacterii, prin diferite mecanisme. Inflamația cronică este caracterizată prin infiltrarea densă a limfocitelor și macrofagelor. Dacă macrofagele nu reușesc să protejeze gazda de lezarea tisulară, organismul încearcă să izoleze situsut respectiv, formându-se astfel un granulom. Granuloamele apar atunci când neutrofiele și macrofagele nu reușesc să distrugă microorganismele, pe parcursul inflamației. (Willey și colab., 2008)

2. Bariere fizice în rezistența nespecifică (înnăscută)

Cu mici excepții, un microorganism potențial patogen ce invadează o gazdă umană se confruntă imediat cu numeroase mecanisme de apărare nespecifice. Deși eficiența individuală a unora dintre aceste mecanisme nu este întotdeauna semnificativă, aceste mecanisme au un efect colectiv remarcabil.

Mai mulți factori direcți, cuma ar fi vârsta sau nutriția, sau bariere fizice, propriu-zise contribuie într-o măsură semnificativă în apărarea înnăscută.

Barierele fizice și mecanice, împreună cu secrețiile gazdei, reprezintă prima linie de apărare împotriva microorganismelor. Pielea reprezintă o barieră mecanică foarte eficientă în apărarea nespecifică. În stratul extern al pielii se găsesc keratinocitele, scleroproteine insolubile, ce produc keratine. Pielea este ușor acidă, datorită uleiului, secrețiilor glandulare și acizilor organici produși de stafilococii de la nivelul pielii. Pielea conține și o concentrație crescută de NaCl, având rolul de a limita invadatorii microbieni în zona din imediata apropiere a epidermei. Celulele Langerhans sunt celule mieloide care au capacitatea de a fagocita antigene. (Willey și colab., 2008)

Pelicula mucoasă de la nivelul ochiului (conjunctiva), sistemului respirator, digestiv, și urogenital rezistă invaziei microbiene deoarece epiteliul scvamos stratificat intact și secrețiile mucoasei formează o peliculă protectoare rezistentă, ce capturează numeroase microorganisme. Acest mecanism face parte din imunitatea nespecifică.

Numeroase suprafețe mucoase plutesc în secreții specifice, antimicrobiale. Aceste secreții conțin lizozim, o enzimă ce lizează bacteriile prin hidroliză, dar și proteine imunitare specifice, ce previn atașarea microorganismelor la gazdă. (Willey și colab., 2008)

Așadar, barierele fizice și mecanice împreună cu secrețiile organismului gazdă reprezintă prima linie de apărare declanșată în momentul invadării acestuia de un microorganism, potențial patogen. Din această categorie fac parte pielea, peliculele mucoase, epiteliul respirator, epiteliul gastrointestinal și epiteliul urogenital.

V. EFECTELE LIPOPOLIZAHARIDELOR ASUPRA IMUNITĂȚII ÎNNĂSCUTE

Endotoxinele sunt lipopolizaharide complexe, componente majore ale peretelui celular al bacteriilor Gram negative, ce pot pătrunde în sânge prin 2 modalități: fie prin infecție locală sau sistemică cu bacterii exogene Gram negative, fie prin deplasarea bacteriilor Gram negative sau a unor fragmente prin membrana intestinală, atunci când permeabilitatea este crescută în urma unei traume.

Fig. 26 Evenimentele imunologice din cadrul socului septic (Modificat după Brade și colab., 2007)

Endotoxinele circulante pot induce un răspuns inflamator din partea gazdei, numit și cascadă septică. Mediat inițial de legarea lipopolizaharidelor de proteinele specifice de legare a LPS, complexul format stimulează sistemul imunitar, declanșând anumite reacții și activând anumite celule. Rezultatul acestor procese este fie apariția fenomenului de septicemie, atunci când infecția poate fi detectată, fie apariția sindromului răspunsului inflamator sistemic. Endotoxinele sunt, de asemenea, asociate cu numeroase boli și sindroame, precum fibroză chistică, boli ale ficatului, rinichilor, astmul, boli autoimune, și alte afecțiuni. (Silverman, 1998)

Lipopolizaharidele determină o reacție imună în organismul gazdă, responsabilă în principal de efectele șocului septic (fig. 26.). Distrugerea bacteriilor prin tratamentul cu antibiotice nu este în acest caz suficientă, deoarece nu are loc neutralizarea lipopolizaharidelor. În urma invadării gazdei de către bacterii, infecția se instalează prin localizarea bacteriilor la nivelul țesutului subepitelial și în sângele circulant. (Silverman, 1998)

Diferiți receptori ai celulelor imunitare sunt implicați în recunoașterea imunitară înnăscută, în care receptorii Toll-like (TLR) au un rol esențial. Procesele care determină activarea sistemului imunitar printr-un stimul lipopolizaharidic presupun formarea complexului LPS-LBP (lipopolizaharid-proteină de legare a lipopolizaharidului), asociindu-se, ulterior cu receptorii Toll-like (lipidul A al lipopolizaharidului este recunoscut de receptorul TLR4). Ulterior, formează împreună cu proteina MD-2 un complex de semnalizare la nivelul membranei. Proteinele LBP (Lipopolisaccharide Binding Protein) și CD14 leagă lipopolizaharidele și sunt esențiale în elaborarea răspunsurilor inflamatorii senzitive. Aceste proteine transportă lipopolizaharidele de la nivelul miceliilor la suprafața celulei, printr-un mecanism ce cuprinde 2 etape: într-o primă etapă LBP catalizează transferul monomerilor de lipopolizaharide de la nivelul miceliilor la nivelul unui situs de legare, iar, într-o etapă ulterioară, monomerii de lipopolizaharide sunt transferați de la nivelul complexelor LPS-sCD14 la nivelul membranei plasmatice a celulelor. Însă proteinele LBP nu transportă numai lipopolizaharide, ci și fosfolipide. (Brade și colab., 2007)

1. Expunerea la endotoxine

Există două modalități prin care gazda poate fi expusă endotoxinelor bacteriene.

Prima și cea mai comună este reprezentată de infecția sistemică sau localizată cu o bacterie Gram negativă, printr-o sursă exogenă. Ca și consecință a infecției cu un patogen specific, bacteria și fragmente de perete celular bacterian pot cauza răspunsuri inflamatorii locale sau sistemice, după caz. Cu toate acestea, chiar și după ce bacteriile sunt distruse în totalitate, endotoxinele lor reziduale pot continua să mențină activ răspunsul inflamator. (Silverman, 1998)

Tratamentul cu antibiotice în cazul infecțiilor produse de bacteriile Gram negative poate chiar stimula efectul toxic al lipoolizaharidelor și exacerba răspunsul inflamator. Unele studii sugerează faptul că bacterioliza indusă de antibiotice chiar eliberează lipopolizaharidele. Eliberarea lipopolizaharidelor sub acțiunea antibioticelor este însă nedemonstrată, fiind doar o ipoteză elaborată în urma obținerii unor rezultate ce sugerează acest lucru.

Cea de-a doua modalitate prin care gazda poate fi expusă lipopolizaharidelor este deplasarea bacteriilor de la nivelul intestinului. Tractul gastrointestinal conține, în mod normal, o populație de bacterii nepatogene, în primul rând bacterii Gram negative anaerobe. Fragmente ale membranei externe a bacteriilor Gram negative, incluzând endotoxine, sunt produse în permanență în intestinul normal, fără că gazda să aibă de suferit (van Leeuwen). Aceste endotoxine sunt ulterior procesate la nivelul ficatului, fără a afecta organsimul gazdă în vreun fel. Pe parcursul acestui proces, lipopolizaharidele sunt preluate, în mod normal, de celulele endoteliale și de celulele Kupffer, dar și, posibil, de hepatocite, prin mecanisme picnotic sau receptor-dependente (van Leewen).

Atunci când acest proces eșuează, bacterii patogene pot ajunge accidental în circulația sangvină sau limfatică. Când acest lucru se produce, concentrații mari de endotoxine ajung la nivelul nodulilor limfatici mezenterici, la nivelul ficatului, splinei, dar și în circulația generală. (Silverman, 1998)

2. Interacțiunile gazdei cu endotoxinele

Endotoxinele își exercită efectele patofiziologice într-o ordine extrem de complexă, interacționând în interiorul gazdei cu elementele celulare și umorale ale organismului invadat. Aceste elemente mediază răspunsul normal al gazdei împotriva agentului infecțios.

Activarea mediatorilor celulari, LBP și CD14 se bazează pe interacțiunea endotoxinelor cu celulele sistemului imunitar. Lipopolizaharidele sunt preluate de către neutrofile ducând la activarea celulară și intensificarea abilităților fagocitice ale acestor celule. Ulterior, pot activa neutrofilele, pentru a exprima molecule de adeziune celulară, care mediază neutrofil-neutrofil, neutrofil-ceulala endotelială vasculară și neutrofil-țesut, cauzând inflamația locală și scurgeri vasculare. (Silverman, 1998)

De asemenea, lipopolizaharidele afectează diverse populații de limfocite, stimulând celulele T să secrete citokine și celule T supresoare.

Cele mai semnificative efecte celulare ale lipopolizaharidelor implică interacțiunea acestora cu celulele liniei monocit/macrofag, care exprimă receptorul membranar CD14.

Lipopolizaharidele circulante se leagă de factorul seric glicoproteic, LBP, care facilitează legarea lipopolizaharidelor de recptorul lor celular principal, molecula CD14 (Ulevitch).

Legarea lipopolizaharidelor la CD14 induce producerea și secreția de către monocite a unui număr foarte mare de citokine proinflamatorii și citokine antiinflamatorii, inclusiv interleukine (IL-1, IL-6, IL-8, IL-10), factori de inhibiție a migrării macrofagelor, dar și TNF (Tumor Necrosis Factor).

În timp ce mulți alți mediatori umorali sunt induși de lipopolizaharide, producerea de citokine proinflamatorii pare a fi fenomenul ce stă la baza insuficienței sistemice în care cedează majoritatea organelor, sindromului răspunsului inflamator sistemic, septicemiei și șocului septic, produse de lipopolizaharide. (Silverman, 1998)

3. Patogeneza cascadei inflamatorii

Endotoxinele pot declanșa răspunsuri inflamatorii complexe, prin invadarea unui organism gazdă. Însă, sursa endotoxinelor poate fi și alta decât infecția bacteriană dobândită prin expunerea gazdei; de exemplu, procesarea eșuată a toxinelor, la nivelul ficatului, sau deplasarea unor bacterii aparținând microbiotei normale intestinale.

Fig. 27 Cascada inflamatorie (Sursa: Nature.com)

Endotoxinele neeliminate de componentele celulare care îndeplinesc această funcție, cum este BPI în leucocitele polimorfonucleare, vor interacționa cu LBP, formând complexul LPS-LBP, care se leagă selectiv la CD14. Acest complex reprezintă elementul declanșator al producerii și eliberării de mediatori umorali, cum ar fi TNF sau interleukinele, de către monocite sau macrofage, celulele endoteliale, granulocite și limfocite. (Silverman, 1998)

De exemplu, TNF, ÎL-1 și ÎL-6 induc febră, iar ficatul eliberează proteine de fază acută, ceea ce va duce tot la eliberarea de TNF. Factorii de coagulare ai sângelui sunt consumați, iar sistemul complement este activat, producând citomodulatori suplimentari, care, asociați cu TNF și agregarea leucocitelor, pot produce leucopenie și lezarea vaselor de sânge. Celulele endoteliale sunt stimulate să producă oxid nitric, care cauzează vasodilatație, hipotensiune și ritm cardiac crescut. Celulele T eliberează factori stimulatori și γ-interferon, cauzând leucocitoză, astfel avansând răspunsul inflamator. (Triantafilou și colab., 2002)

Dacă răspunsul normal al gazdei scăpa de sub control, se declanșează o cascadă inflamatorie (fig. 27). Atunci când agentul infecțios nu este identificat, apare fenomenul de septicemie. Septicemia se caracterizează prin febră, frisoane, leucopenie sau leucocitoză, hipotensiune. Datorită inflamației puternice, pot apărea hemoragii, edem pulmonar, acidoză metabolică, insuficiență renală, ischemie intestinală, comă și, în fază terminală, insuficiență respiratorie sau insuficiență cardiacă. (Silverman, 1998)

VI. CONCLUZII

Endotoxinele bacteriene reprezintă, din punct de vedere biochimic, lipopolizaharide constituite din o parte lipidică (lipidul A) și o parte polizaharidica (antigenul O, cu unitățile repetitive și miezul oligozaharidic, intern, și, respectiv, extern). Aceste molecule complexe sunt constituenți ai membranei externe, din structura peretelui celular al bacteriilor Gram negative. Când aceste bacterii infectează un organism animal, lipopolizaharidele au efect toxic asupra gazdei, fiind responsabile de apariția septicemiei și șocului septic.

Prezența lipopolizaharidelor într-un organism infectat cu o specie bacteriană Gram negativă este detectată intial de sistemul imunitar înnăscut. Atunci când un microorgansim patogen pătrunde într-un organism animal, sistemul imunitar al gazdei reacționează imediat, imunitatea nespecifică, înnăscută, reprezentând prima linie de apărare a organismului respectiv. Reacțiile declanșate de prezența unui microorganism sau unei substanțe străine constituie răspunsul imun nespecific al sistemului imunitar gazdă.

Inițial, lipopolizaharidele au rol protector asupra bacteriilor, protejându-le de atacul complementului. Lipidul A este recunoscut de receptorii Toll-like 4 (TLR4), care transmit semnale sistemului imunitar înnăscut, activând mecanismele de apărare nespecifică.

Dacă în urma invadării organismului gazdă de către patogeni apar leziuni celulare sau tisulare, sistemul imunitar înnăscut detectează aceste leziuni și declanșează procesul inflamator. Răspunsul inflamator este o reacție de apărare nespecifică, prin care sistemul imunitar încearcă să elimine sursa inflamației.

Însă nu întotdeauna celulele sistemului imunitar reușesc să elimine în totalitate sursa infecției; astfel, pot exista molecule de lipopolizaharide ce persistă în organismul gazdă, și în încercarea de a elimina complet infecția, sistemul imunitar înnăscut declanșează o cascadă inflamatorie. Atunci când agentul infecțios nu este identificat, se poduce septicemia, inducând simptome grave gazdei: febră, frisoane, hipotensiune, leucopeenie/leucocitoză, insuficiență renală, insuficiență respiratorie, comă, etc. aceste simptome sunt fatale organismului infectat.

Așadar, lipopolizaharidele stimulează activitatea sistemului imunitar înnăscut atunci când pătrund într-un organism animal; gazda detectează microorganismul invadator, respectiv substanța străină, ulterior declanșând mecanismele de apărare nespecifică.

VII. BIBLIOGRAFIE

Anwar M.A., Choi S., 2014. Gram-negative marine bacteria: structural features of lipopolysaccharides and their relevance for economically important diseases. Mar Drugs 12, 2485-2514

Banoub J.H., El Aneed A., Cohen A.M., Joly N., 2010. Structural investigation of bacterial lipopolysaccharides by mass spectrometry and tandem mass spectrometry. Mass Spectrom Rev 29, 606-650

Bazaka K., Crawford R. J., Nazarenko E. L., Ivanova E. P., 2011. Bacterial extracellular polysaccharides. Adv Exp Med Biol 715, 213-226

Beveridge T.J., 1999. Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles. J Bacteriol 181, 4725-4733

Chatterjee S.N., Chaudhuri K., 2012. Gram-negative bacteria the cell membrane. Ïn: Outer Membrane Vesicles of Bacteria, 15-34

Dagorn A., Chapalain A., Mijouin L., Hillion M., Duclairoir-Poc C., Chevalier S., Taupin L., Orange N., Feuilloley M.G., 2013. Effect of GABA, a Bacterial Metabolite, on Pseudomonas fluorescens Surface Properties and Cytotoxicity. Int J Mol Sci 14, 12 186 – 12 204

Dai L., DeFee M.R., Cao Y., Wen J., Wen X., Noverr MC., Qin Z., 2014. Lipoteichoic acid (LTA) and lipopolysaccharides (LPS) from periodontal pathogenic bacteria facilitate oncogenic herpesvirus infection within primary oral cells. PLoS One 9, 1-11

Fukunishi S., Sujishi T., Takeshita A., Ohama H., Tsuchimoto Y., Asai A., Tsuda Y., Higuchi K., 2014. Lipopolysaccharides accelerate hepatic steatosis in the development of nonalcoholic fatty liver disease in Zucker rats. J Clinn Biochem Nutr 54, 39-44

Gladwin M., Trattler B., 2004. Gram-negative bacteria. În: Clinical Microbiology Made Ridiculously Simple, 3rd Edition. 49-91

Howard J.G., Rowley D., Wardlaw A.C., 1958. Investigations on the mechanism of stimulation of non-specific immunity by bacterial lipopolysaccharides. Immunology 1, 181-203

Im H.J., Park N.H., Kwon Y.J., Shin S., Kim D., Chun Y.J., 2012. Bacterial lipopolysaccharides induce steroid sulfatase expression and cell migration through IL-6 pathway in human prostate cancer cells. Biomol Ther (Seoul) 20(6), 556-561

Kadrmas J.L., Raetz C.R., 1998. Enzymatic synthesis of lipopolysaccharide in Escherichia coli. Purification and properties of heptosyltransferase I. J Biol Chem 273, 2799 -2807

Kalynych S., Yao D., Magee J., Cygler M., 2012. Structural characterization of closely related O-antigen lipopolysaccharide (LPS) chain length regulators. J Biol Chem 287, 15 696 – 15 705

Knirel Y.A., Valvano M.A., 2011. Structure of the Lipopolysaccharid Core Region. Springer

Kocíncová D., Lam J.S., 2011. Structural diversity of the core oligosaccharide domain of Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide. Biochemestry (Mosc) 76, 755-760

Li D., Lyons J.A., Pye V.E., Vogeley L., Aragão D., Kenyon C.P., Shah S.T., Doherty C., Aherne M., Caffrey M., 2013. Crystal structure of the integral membrane diacylglycerol kinase. Nature 497, 521-524

Lorenz W, Buhrmann C, Mobasheri A, Lueders C, Shakibaei M., 2013. Bacterial lipopolysaccharides form procollagen-endotoxin complexes that trigger cartilage inflammation and degeneration: implications for the development of rheumatoid arthritis. Arthritis Res Ther 15, 1-17

Mao Y., Zhou C., Zhu L., Huang Y., Yan T., Fang J., Zhu W., 2013. Identification and expression analysis on bactericidal permeability-increasing protein (BPI)/lipopolysaccharide-binding protein (LBP) of ark shell, Scapharca broughtonii. Fish Selfish Immunol 35, 642-652

Martirosyan A., Ohne Y., Degos C., Gorvel L., Moriyón I., Oh S., Gorvel J.P., 2013. Lipopolysaccharides with acylation defects potentiate TLR4 signaling and shape T cell responses. PLoS One 8, 1-16

Matsuura M., 2013. Structural Modifications of Bacterial Lipopolysaccharide that Facilitate Gram-Negative Bacteria Evasion of Host Innate Immunity. Front Immunol 4, 1-9

Müller-Loennies S., Brade L, Brade H., 2007. Neutralizing and cross-reactive antibodies against enterobacterial lipopolysaccharide. Int J Med Microbiol 297, 321-340

Munford R.S., Varley A.W., 2006. Shield as signal: lipopolysaccharides and the evolution of immunity to gram-negative bacteria. PLoS Pathoq 2, 467-471

Nguyen A.T., Mandard S., Dray C., Deckert V., Valet P., Besnard P., Drucker D.J., Lagrost L., Grober J. Lipopolysaccharides-mediated increase in glucose-stimulated insulin secretion: involvement of the GLP-1 pathway. Diabetes 63, 471-482

Polissi A., Sperandeo P., 2014. The lipopolysaccharide export pathway in Escherichia coli: structure, organization and regulated assembly of the Lpt machinery. Mar Drugs 12, 1023-1042

Raetz C.R., Reynolds C.M., Trent M.S., Bishop R.E., 2007. Lipid A modification systems in gram-negative bacteria. Annu Rev Biochm 76, 295-329

Raetz C.R., Whitfield C., 2002. Lipopolysaccharide endotoxins. Annu Rev Biochem 71, 635-700

Rietschel E.T., Kirikae T., Schade F.U., Mamat U., Schmidt G., Loppnow H., Ulmer A.J., Zähringer U., Seydel U., Di Padova F., 1994. Bacterial endotoxin: molecular relationships of structure to activity and function. The FASEB Journal 8, 217-225

Schromm A.B., Brandenburg K., Loppnow H., Moran A.P., Koch M.H., Rietschel E.T., Seydel U., 2000. Biological activities of lipopolysaccharides are determined by the shape of their lipid A portion. Eur J Biochem 267(7)

Serrato R.V., 2014. Lipopolysaccharides in diazotrophic bacteria. Front Cell Infect Microbiol, 119, 1-6

Silhavy T.J., Kahne D., Walker S., 2010. The bacterial cell envelope. Cold Spring Harb Perspect Biol 2, 1-16

Silverman M. H., Ostro M. J., 1999. Bacterial endotoxin in human disease. XOMA Ltd, 1-29

Thieblemont N., Thieringer R., Wright S.D., 1998. Innate immune recognition of bacterial lipopolysaccharide: dependence on interactions with membrane lipids and endocytic movement. Immunity 8, 771-777

Triantafilou M., Miyake K., Golenbock D.T., Triantafilou K., 2002. Mediators of innate immune recognition of bacteria concentrate in lipid rafts and facilitate lipopolysaccharide-induced cell activation. J Cell Sci 115, 2603-2611

Willey J.M., Sherwood L.M., Woolverton C.J., 2008. Prescot, Harley and Klein’s Microbiology, Seventh Edition, Higher education, 1-79, 743-7773