Licenta Craciun.s.corina Maria 2020 [624480]
PARTEA GENERALĂ
INTRODUCERE
Apariția geneticii a constituit un moment de referință în istoria științei. Aceasta își propune
înțelegerea genezei și evoluției vieții și implicit a complexității mecanismelor care
condiționează individualitatea, în întreaga ei desfășurare normală și patologică.
Unii autori apreciază chiar că în zilele noastre biologia umană nu poate fi concepută fără
genetică, după cum, în aceleași condiții, medicina nu ar înțelege capitole întregi din patologie.
Așa că Gedda ( 1967) afirmă că '' medicina celei de -a doua jumătăți a secolului XX este
dominată de geniul lui Mendel'' . Ea a impus concluzia atât de fecundă că originea multor
boli se află în interiorul organismului. Și chiar dacă factorul primar treb uie căutat în afara lui,
reactivitatea individuală este condiționată genetic. Vechiul aforism a lui Ambroise Paré –
conform căruia nu există boli, ci numai bolnavi – se sprijină astfel pe un suport solid faptic.
În doar câteva decenii o serie remarcabilă de descoperiri au asigurat geneticii o poziție
prioritară în biologie și medicină. Este suficient să reamintim nașterea patologiei moleculare,
apariția citogeneticii, posibilitatea de a diagnostica corect un număr mereu mai mare de
tulburări ereditare, dete ctarea heterozigoților, monitorizarea parenterală a grupelor cu risc
mare și descoperirea unor tratamente eficiente în multe boli ereditare.
Evident, s -a schimbat și conceptul de boală. Prin sănătate se înțelege starea de echilibru a
organismului cu mediul său. Boala înseamnă o rupere a acestui echilibru. Ea poate fi
dereminată fie de o anomalie genetică, fie de un factor de mediu. Genetica accentuează
importanța factorului intern, genetic, iar medicina, importanța factorului extern. Din punct de
vedere ge netic, fiecare individ are un risc specific pentru o tulburarea particulară.
Explozia geneticii a fost favorizată și de modificarea spectrului patologiei umane. Bolile
infecto -contagioase, unul dintre coșmarurile umanității, au fost stăpânite, mortalitatea
infantilă a coborât impresionant. [ 1]
Antibioticele (gr. “anti” -“împotriva”, “bios” – “viață ”), sunt substanțe capabile sa distrugă
bacteriile, să î mpiedice multiplicarea acestora și sa ajute sistemul imunitar să facă față bolii,
nu este atat de veche pe cât am fi t entați să credem. Este adevărat că, î nca din Antichitate,
oamenii au că utat tot felul de remedii, pentru diversele boli, de la ierburi, usturoi , mucegai, la
ochi de salamandră , dar rezul tatele erau temporare sau nemulțumitoare. Î n secolul al XV I-lea,
Paracelsus, medic, astrolog, alchimist elvețian, considera că diverse substanțe chimice, toxice
în cantități mari, printre care și mercurul, folosite î n anumite doze, ar avea proprietăți
vindecă toare. [2]
Pe la sfarsitul secolului al XIX -lea, mai m ulți oameni de ș tiință , au constatat ca solul, în care
se adăpostesc o mulțime de bacterii și de ciuperci nevătămă toare, nu acceptă bacterii
responsabile de declanș area unor boli (pneumonie, tuberculoză , sifilis, tetanos etc.), intuindu –
se ca, în loc de a se căuta substanțe anorganice (în coloranți, de exemplu), î n scop terapeutic,
mai bine s -ar cerceta posi bilitatea extragerii unor compuș i organici. [3]
De la apariția antibioticelor și până astăzi au fost introduse multe antibiotice noi, cu nivel
ridicat de compatibilitate pentru pacienți pentru tratamentul infecțiilor comunitare, precum și
cefalosporine orale, noi macrolide, doxiciclin și fluorochinolone sunt exemple de aceste
medicamente moderne. [2]
CAPITOLUL I
DATE GENERALE PRIVIND IMPORTANȚA GENETICII CA ȘTIINȚĂ
ÎN DOMENIUL BIOMEDICAL
În ultimele decenii, cunoștințele de genetică, au devenit din ce în ce mai importante în teoria
și practica medicală. Pentru orice persoană neavizată se poate pune firesc întrebarea: de ce
genetica medicală are astăzi un rol major în teoria și practica medicală?
Răspunsul este complex, dar edificator:
Factorii genetici participă la formarea structurilor și desfășurarea funcțiilor
organismului; ei acționează în orice organ și în fiecare etapă a vieți i, la orice vârstă;
astfel, genetica oferă medicinei un concept unificator, integrator.
Cunoștințele despre rolul major al mutațiilor în producerea bolilor sau vulnerabilității
la boală au progresat rapid și masiv.
Ponderea bolilor genetice, atât la copi i, cât și la adult, a crescut (ș i va crește) prin
scăderea prevalenței bolilo r infecțioase și nutriționale ( mai vizibilă în țările
dezvoltate), devenind o problemă importantă de sănătate publică.
Solicitările de evauare a riscului genetic și de testare gene tică, prenatală sau
postnatală, au crescut, devenind frecvente în practica medicală.
Genomica a deschis drumul spre o medicină personalizată și predictivă, cu largi
aplicații în toate specialitățile medicale.
Sintetizând aceste date, se poate afirma că me dicina actuală se bazează în mare măsură pe
genetică, devenind o medicină moleculară sau genomică. În aceste condiții nici un medic nu
mai poate ignora bazele geneticii medicale, iar studentul în medicină este obligat să le
însușească. Genetica ''înarmează '' viitorul medic cu principiile necesare înțelegerii viitorului
medicinei.
Bolile genetice și impactul lor clinic și social.
Bolile genetice, erau considerate rarități cu care practicianul se întâlnea întâmplător în cursul
activității sale. Pe măsură ce tehnologiile de studiu și cunoștintele de genetică au progresat, iar
frecvența bolilor negenetice (cauzate de malnutriție, infe cție ș.a) s -a diminuat spectaculos, a
devenit evident impactul masiv al patologiei genetice în practica medicinei moderne.
Bolile genetice sunt numeroase. Se cunosc peste 10.000 de boli determinate sau condiționate
genetic; ele au o mare diversitate, se m anifestă la orice vârstă, la orice sistem de organe și, de
aceea, se regăsesc în aproape toate specialitățile medicale . Bolile genetice sunt frecvente; ele
afectează cel puțin 5 -8% dintre nou -născuții vii și probabil 30 -40% din indivizi în tot cursul
vieții( incluzând și bolile comune ale adultului).
Bolile genetice au o contribuție majoră la mortalitatea infantilă și morbiditate. Acum mai
puțin de un secol, bolile produse de cauze negenetice(malnutriție, infecție, condiții insalubre
etc) produceau majorita tea deceselor la copil. În secolul XX, sănătatea publică s -a îmbunătățit
și, ca rezultat, mortalitatea infantilă s -a redus, iar bolile genetice au devenit o cauză majoră a
deceselor la copil. Se apreciază că, în prezent, 30 -50% dintre internările în spital ele de copii
sunt determinate de afecțiuni genetice sau anomalii congenitale, iar circa 10% dintre
internările în spitalele de adulți sunt produse de boli genetice sau condiționate genetic. Circa
60% dintre avorturile spontane din trimestrul I de sarcină s unt produse de anomalii
cromozomiale. Aproximativ 2 -3% dintre nou -născuți au o anomalie congenitală majoră,
deseori produsă de factori genetici; iar 3% dintre nou -născuți au anomalie cromozomială(0,6 –
0,9%) sau o boală monogenică(2,4%).
Bolile genetice sunt boli cronice care realizează frecvent un handicap fizic, senzorial, motor
sau mintal. Bolile genetice produc peste 50% din cazurile severe de retard mintal , de surditate
sau cecitate la copil. Îngrijirea pacienților cu boli genetice implică cheltuieli im portante.
Se poate conchide, fără rezerve, că bolile genetice reprezintă o problemă majoră de sănătate
publică, ce impune acțiuni concrete și eficace de diagnostic și un program național de
profilaxie a bolilor genetice, bazat pe sfat genetic, screening și diagnostic prenatal, screening
neonatal(pentru unele boli frecvente și tratabile), registre regionale sau naționale și diagnostic
pre-simptomatic în familiile cu risc genetic crescut.
Implicațiile geneticii medicale în practica clinică
Genetica medicală – ca parte a geneticii umane – a devenit o specialitate clinică distinctă, care
se ocupă de ingrijirea și diagnosticul pacienților cu boli genetice, precum și a familiilor lor
prin: sfat genetic, diagnostic prenatal, screening neonatal sau diagnostic presim ptomatic. În
felul acesta genetica este implicată în asigurarea ''sănătății de -a lungul generațiilor''. Ponderea
serviciilor de genetică medicală în asistența medicală a populației a devenit importantă și nu
mai poate fi ignorată.
În fiecare an se nasc în România circa 7.200 copii cu anomalii congenitale, iar 12.000 vo fi
afectați de diferite boli genetice înainte de 25 de ani. Deci, circa 20.000 de copii și familiile
lor au nevoie anual de diagnostic, exploatări și sfat genetic ; acesta impune cu necesitat e
dezvoltarea Centrelor de genetică medicală – unități in tegrate de clinică și laborator – care se
ocupă cu diagnosticul și explorarea pacienților cu anomalii congenitale și boli genetice,
precum și a familiilor lor, confruntate cu riscul de recurență a ace stor afecțiuni.
Serviciile de genetică medicală și medicii geneticieni realizează, ca și alți specialiști,
diagnosticul, explorările și îngrijirea pacienților care prezintă o afecțiune în care factorii
genetici au o contribuție semnificativă. Activitățile lor multiple au câteva particularități
determinate de specificul bolilor genetice , care afectează orice organ, la orice vârstă și sunt
produse de mutații, ce pot fi ereditare.
Genetica modernă a demonstrat că fiecare om es te unic, atât prin structura sa genetică
(genotip) cât și prin mediul în care s -a dezvoltat.
Mediul cuprinde totalitatea factorilor ecologici și socioculturali care acționează asupra
omului, într -o anumită perioadă a dezvoltării sale ontogenetice. El determină unele caractere
ale organismului și influenț ează realizarea multor caractere condiționate primar de ereditate.
Cele doua ''forțe'' care participă la formarea caracterelor noastre se condiționează reciproc.
Ereditatea determină un potențial pentru formarea unor caractere, care se finalizează variat, în
funcție de condițiile specifice de mediu socioeconomic și cultural în care se dezvoltă o
anumită persoană. Rezultă,deci, că unicitatea omului este bio -psiho -socială. Ansamblul unic
de caractere manifeste și specifice ale unui organism, produse prin int eracțiunea permanentă,
dar în proporții diferite, dintre ereditate(genotip) și mediu se numește individualitate biologică
sau fenotip.
Caracterele fenotipice normale sau anormal e ale organismului sunt produse prin acțiunea
eredității și mediului. În funcți e de ponderea celor doi factori cauzali, se pot deosebi trei
categorii de caractere: caractere pur ereditare, caractere determinate de interacțiunea ereditate –
mediu, caractere pur ecologice (neereditare).
Fig.1
Varietatea clinică – determină afectarea unor țesuturi și organe diferite – este importantă și
solicită medicului genetician cunoștințele sintetice, dar solide, din diferite domenii de
patologie și o colaborare strânsă cu specialiștii de ''organ''. La fel de valabil este și ''reversul''
situației: medicii specialiști, confruntați cu patologia genetică a domeniului lor, trebuie sa aibă
cunoștințe de bază în genetica medicală și, mai ales, un mod de abordare genetic în relația
medic -pacient -familie. Posibilitatea transmiterii genelor mutante sau a ge nelor de
susceptibilitate la rudele bolnavului determină implicarea medicului în viața familiei, pentru a
evita apariția sau recurența bolii la alte persoane.
Fig.2
Numeroase boli genetice debutează și se manifestă la copil, motiv pentru care patologia
genetică este considerată , în esență, ''pediatrică''. Dar bolile genetice au implicații și în
patologia adultului, mai ales prin tulburările de reproducere, bolile genetice cu debut tardiv(
de exemplu, hipercolesterolemia familială sau polichistoza renală a adultului), bolile comune,
bolile neurodegenerative și cancerul. De altfel, screeningul și diagnosticul prenatal sunt cele
mai frecvente acțiuni medicale la adultul tânăr în perioada reproductivă.
Testele genetice – moleculare, metabolice sau cromozomial e-pun diagnosticul de certitudine
într-un număr din ce în ce mai mare de boli, indentificând mutațiile sau efectul lor primar,
proteinele anormale. În anumite situații, testele genetice pot pune un diagnostic pre –
simptomatic sau prenatal de boală genetică. De asemenea, cu ajutorul unor sonde specifice, se
pot detecta genomurile unor virusuri, bacterii și paraziți care infectează organismul uman.
Diagnosticul genotipic devine astfel o nouă și eficace acțiune în medicina practică; de aceea,
cunoașterea indica țiilor și interpretarea testelor genetice sunt '' obligatorii'' pentru orice medic
practician.
Deoarece mutațiile pot fi transmise ereditar, rudele bolnavilor au un risc genetic de a moșteni
mutația cauzatoare de boală. De aceea, caracteristic pentru genetica medicală este sfatul
genetic, un proces de comunicare prin care pacienții și/sau rudele lor cu risc de boală ereditară
sunt informați asupra consecințelor bolii, probabilității apariției sau transmiterii ei în famil ie și
căilor prin care boala poate fi ameliorată sau prevenită . În genetica medicală unitatea de
acțiune este familia.
Profilaxia bolilor genetice se poate realiza prin screening genetic populațional, prenatal sau
postnatal sau screening familial. Scopul a cestor acțiuni este recunoașterea precoce a unei boli
sau a unui genotip anormal, astfel că printr -o intervenție precoce adecvată, procesele
patogenice să poată fi prevenite sau persoanele implicate să poată lua o decizie informată.
Întrucât bolile genetic e sunt produse de modificări ale cromozomilor sau genelor, în mod
obișnuit nu există tratamente care să corecteze alterările genetice în fiecare celulă a corpului.
Totuși, în multe afecțiuni genetice există po sibilități de tratament patogenic sau simptomat ic,
iar recent s -a dezvoltat terapia de modulare a expresiei genice și terapia genică, prin
introducerea unei gene normale în celulele somatice ale pacienților cu mutații, ceea ce poate
ameliora efectul genelor mutante.
Toate aceste date pledează convingă tor pentru rolul major al geneticii medicale în medicina
actuală. O recunoaștere a impactului bolilor genetice asupra stării de sănătate este
Comunicatul Comisiei europene pentru sănătate către Parlamentul European și Consiliul
Europei, intitulat ''Boli ra re- o provocare pentru Europa''(11 noiembrie 2008). În acest rapo rt
se subliniază că bolile r are, fiecare cu o prevalență sub 1:2.000, sunt afecțiuni diverse și
complexe care pun adesea în pericol viața sau provoacă o invaliditate cronică. Deoarece sunt
numeroase ( peste 5.000), ele afectează 6 -8% din populație, într -un anumit moment al
vieții(circa 30 de milioane în UE și aproape un milion în România).
Abordarea bolilor rare necesită o strategie generală, bazată pe eforturi combinte, pentru
ameliorarea acc esului și egalității pacienților la profilaxie, diagnostic și tratament. [4]
CAPITOLUL II
ORGANIZAREA MATERIALULUI GENETIC
2.1.Genomul
Prin genom întelegem totalitatea inform ației genetice cuprinse în ADN ș i prezente î n toate
celulele unui organism, ansamblul genelor sale. Spre deosebire de proteom , prin care se
întelege setul de proteine codificat de genom. Celulele au același ge nom dar nu au același
proteom, î ntrucat activitatea genelor este diferențiata in funcție d e tipul de celula, de țesut, de
etapa a vieții. Proteomica studiază setul de pr oteine iar genomica este ramura biotehnologiei
care se ocupa cu cartogra fierea, secvențierea ș i analizarea genomului uman. [5]
2.1.1 Structura și organizarea genomului uman
În concepția clasică, termenul de genom(introdus în anul 1920 de Hans Winkler) se referă la
setul complet de cromozomi din gameți. În genetica moleculară semnificația noțiunii de
genom a fost extinsă la ansamblul informației ereditare din ADN unei celule sau al unui
organism. Deci, genomul include genele și secvențele necodante din ADN nuclear (genom
nuclear -mare și complex) și ADN mitocondrial(genom mitocondrial -mic și simplu). În
realitate, termenul de genom uman se utilizează astăzi cel mai frecvent pentru informația din
ADN nuclear/cromozomial, iar secvențele genomului uman a însemnat determinarea
secvenței nucleotidice a celor 24 molecule diferite de ADN: 22 autozomi + X + Y, una pentru
fiecare cromozom.
Termenul de genom nu se referă la informația geneti că a unui singur individ( genom
personal), ci la ansamblul unei secvențe ADN, identice la toți indivizii speciei, care alcătuiesc
un genom nuclear de referință; deci genomul nu include diversitatea sau polimorfismul
genetic al indivizilor speciei. Precizăm de asemenea că pentru a se face distincția dintre
genomul gameților și cel al celulelor somatice se folosesc termenii de genom hiploid și genom
diploid.
Desigur, nu putem ignora din prezentarea genomului uman, ADN sau genomul mitocondrial,
definit printr -un singur tip de ADN circular, bicatenar, format din 16.569 pb. Secvența sa
nucleotidică a fost complet descifrată, în 1981, și se caracterizează printr -o mare densitate de
secvențe codante.
Tabelul.1 . Diferențele dintre genomurile umane nuclear și mitocondrial
( modificat după Strachan și Read, 2010)
Cunoștințele despre genomul nuclear uman au fost dependente în timp de metodele folosite.
Descoperirea tehnologiei ADN recombint a marcat începutul unei perioade revoluționare
pentru biologie în general și medicină în special. În 1980, a apărut ideea cartografierii genice
și a secvențierii întregului genom uman, care treptat a început să prindă contur, devenind în
1990 Proiectul Genom Uman (PGU). Coordonarea cercetătorilor în acest mega -proiect
internațional de cercetare -realizat în 15 ani – a fost efectuată de Human Genome Organization
(HUGO) și a inclus 20 de centre din 6 țări (SUA, Marea Britanie, Frața, Germania, Japonia și
China), reunite în International Human Genome Sequencing Consortium (IHG SC).
Cantitatea totală de ADN din nucleul celulelor umane diploide a fost apreciată la 3.6
picograme per genom haploid și corespunde teoretic la circa 3.2 miliarde de perechi de baze
(gigabaze).
Nucleul celulelor umane conține peste 99.5% din ADN celular. Această cantitate enormă de
ADN este fragmentată în 24 de tipuri distincte de molecule liniare de ADN care, prin asociere
cu proteine, formează cromozomii: 22 de tipuri distincte de autozomi și doi cromozomi
sexuali, X și Y.
Fiecare cromatidă conține o si ngură moleculă de ADN care formează, împreună cu proteinele
histonice și nehistonice, o structură supramoleculară numită cromatină. Această structură și
organizarea sa spațială sunt cruciale pentru funcția genomului, deoarece reglează expresia
genică; să n e reamintim că eucromatina este puțin condensată, activă genetic (transcripțional)
și conține genele ce codifică proteine, iar heterocromatina este puternic condensată, inactivă
transcripțional și, foarte probabil, lipsită de gene sau are foarte puține gen e.
PGU a finalizat în fapt secvența ''de referință'' a genomului nuclear hiploid, alcătuit din 24 de
molecule liniare diferite de ADN , ce constituie fiecare un cromozom: 22A+X+Y. Cele 24
tipuri de c romozomi, diferă prin lungime ( de la 249 Mb pentru cromoz omul 1 la 47 Mb pentru
cromozomul 21, cel mai mic cromozom), prin poziția centromerului și prin modelul
caracteristic de benzi alternative – de culoare închisă sau deschisă – ce reflectă o structură, o
compoziție și o organizare internă specifică fiecărui cr omozom.
În versiunea CRCh 38 (iunie 2016) și Ensemble release 85 genomul uman are o lungime
totală de 3.270 Mb (eucromatina = 3.100 Mb ~ 93% și heterocromatina = 170 Mb ~ 7%) și
conține 20.441 gene ce codifică proteine, 14.606 pseudogene și 22.219 gene ARN necodant.
Simplificând, pentru a reține mai ușor datele putem spune că genomul nuclear conține circa
20.000 de gene ce codifică proteine și 22.000 de gene ARN necodant.
Principalele componente din structura genomului uman pot fi grupate în doua categorii:
ADN genelor , ce codifică proteine și secvențe înrudite cu acestea (pseudogenele) ;
ADN intergenic (extragenic), reprezentat de: genele ARN necodant, duplicațiile
segmentare și ADN repetitiv, de diferite tipuri.
O altă clasificare deosebește:
ADN codant ( secvențele codante transcrise și translate, ce corespund exonilor genelor
pentru proteine), ce reprezintă numai 1.2% din genom ( ''marea surpriză'' a secvențierii
genomului uman) ;
ADN necodant reprezentat de: secvențele necodante din structura genei, pseud ogene,
genele ARN necodant și diferite clase de ADN repetitiv ( ADN satelit, micro – și
minisateliții, ADN produs prin transpoziție, duplicațiile segmentale); proiectul
ENCODE a demonstrat recent că o mare parte din ADN necodant( circa 8 0%) este
''semnificativ funcțională'', fiind reprezentată de secvențe transcrise (de exemplu,
genele ARN) (75%) sau secvențele asociate cu o structură specifică a cromatinei (5%) .
Compararea structurii genomului uman cu genomurile altor specii a produs o altă surpriz ă:
numai circa 5% din secvențele genomului uman sunt puternic conservate în evoluție fiind
reprezentate de elementele funcționale de bază: genele ce codifică proteine; genele ARN
necodant; regiuni de reglare a transcripției; alte 5% se află ''sub constrân geri selective'' pentru
menținerea funcției, iar restul genomului (90%) sunt secvențe de ADN care au evoluat rapid și
divergent.
Tabelul.2 . Date relevante despre structura și organizarea genonumui uman
( după CRCh38.p7, Ensemble release 85, GENECODE 25 – iunie 2016)
2.1.2 Genomul mitocondrial
Celulele umane conțin între 500 și 2.000 de mitocondrii, fiecare dintre aceste organite având
în alcătuirea ei 210 molecule circulare de ADN dublu catenar. Excepție fac eritrocitele, care
nu au mitocondrii, ovulele nefertilizate și trombocitele, în ale căror mitocondrii se află doar o
singură moleculă de ADN.
Fiecare celulă umană conține câteva mii de copii ale ADN mitocondrial (ADNmt) și, de
aceea, cantitatea lui totală reprezintă circa 0.5% din ADN unei celule soma tice.
Trebuie subliniat faptul că genomul mitocondrial al zigotului provine aproape exclusiv din
ovul, deci de la mamă, fapt ce determină un tip particular de transmitere maternală a genelor
mitocondriale: de la mamă la toți copiii săi; bărbații bolnavi nu transmit boala.
Particularitățile ADN mitocondrial
Genomul mitocondrial este definit printr -un singur tip de ADN circular, bicatenar, format din
16.569 pb. Secvența sa nucleotidică a fost complet descifrată, în 1981, și se caracterizează
printr -o mare densitate de secvențe codante. Cele două catene de ADNm t se deosebesc prin
conținutul lor de baze azotate și, implicit, prin densitatea de ''plutire '': una dintre catene este
bogată în guanină (lanțul greu , H); în mod corespunzător, catena complementară are conținut
mare de citozină ( lanțul ușor, L). Într -o mică regiune, bucla CR/D (CR de la control region –
deoarece aici se află situl de inițiere al transcripției și punctele de origine ale replicării; D de
la displacement loops), ADN este alcătuit din trei catene, prin sinteza unei piese scurte
adiționale la c atena H, numită ADN 7S.
Fig.3 . Formarea buclei D în ADN mitocondrial
Genomul mitocondrial prezintă câteva elemente particulare, diferite de genomul nuclear:
– NU este asociat cu proteine histonice sau nehistonice și ap roape nu conține ADN repetitiv.
– Genomul mitocondrial este extrem de compact: circa 93% din ADNmt este format din
secvențe codante (absente doar în bucla D), ce formează 37 de gene (28 pe catena H și 9 pe
catena L): 13 gene codifică polipeptide sintetizate de ribozomii mitocondriali (consti tuienți ai
sistemului de fosforilare oxidativă, prin care se produce ATP), 22 gene codifică ARNt și 2
gene ARNr . Majoritatea proteinelor mitocondriale sunt codoficate de gene nucleare,
sintetizate în citoplasmă și importate în mitocondrii.
– Genele mitoco ndriale sunt ''strâns impachetate'', aproape totdeauna contigue sau separate
prin doar 12 pb, iar unele chiar suprapuse ; ele nu conțin introni.
– Transcripția începe în promotorii (PH și PL) aflați în bucla D, este continuă și se desfășoară
bidirecțional pe cele două catene, generând un transcript multigeic mare (policistronic), ce va
fi ulterior secționat în mai multe molecule de ARN.
– Codul genetic mitocondrial diferă puțin de c el nucle ar. El are 60 de codoni sens, patru
codoni stop (nonsens), dintre care doi sunt codoni sens în ADN nuclear ; codonul stop TGA
din ADN nuclear este codon sens (codifică triptofan) în ADNmt; AGG și AGA codifică un
codon stop în locul argininei, iar AU A codi fică metionina în loc de izoleucină.
– Replicarea este unidirecțională și începe în puncte diferite de origine (O) pentru cele două
catene. Atât în procesul replicării, cât și în cel al transcrierii, ADNmt se comportă ca o
unitate: odată inițiate, ce le două procese se desfășoară fără întrerupere, parcurgând întreaga
lungime a moleculei.
– ADN polimeraza ɣ, enzima replicării ADNmt, operează cu fidelitate infer ioară celei a ADN
polimerazelor δ și Ԑ, acceptând împerecheri greșite sau alunecând peste unul sau mai multe
nucleotide.
– Mitocondriile nu posedă sisteme eficiente de reparare a ADN și, ca atare, erorile inerente
replicării, precum și leziunile produse accidental rămân, în marea lor majoritate, necorectate și
se acumulează în genom sub formă de mu tații; în plus, rata evenimentelor recombinaționale
este foarte redusă.
– ADNmt nu formează complexe cu histonele ( care au rol protector) și de aceea este deosebit
de vulnerabil la acțiunea agenților mutageni, dintre care unii – radicalii liberi de oxigen
puternic agresivi – sunt generați în cantități mari chiar în matricea mitocondrială, adică în
mediul în care se află moleculele de ADNmt.
Fig.4 . Schița structurii genomului mitocondrial uman
( modificat după Stracham și Read , 2010)
Ultimele trei caracteristici sunt cele care furnizează explicația faptului că în ADNmt
mutațiile( induse în special de la radicalii liberi de oxigen) se produc cu o frecvență de 1020
de ori mai mare decât în ADN nuclear. Aceste mutații somatice se acumulea ză rapid, după
naștere, și au probabil un rol important atât în debutul și progresia bolilor mitocondriale, ale
unor boli degenerative, cât și în procesul de senescență.
Homoplasmia, heteroplasmia și segregarea replicativă
Ca urmare a ratei înalte a mut ațiilor produse de ADNmt, celulele somatice ale unui adult
conțin, de regulă, mixturi de mitocondrii – unele cu genom normal și altele cu genom
modificat prin mutații. Termenul utilizat pentru a desemna coexistența într -o celulă a
mitocondriilor genetic nor male și a celor mutante este heteroplasmite, iar cel ce definește
prezența exclusivă a unui tip -normal sau anormal -de mitocondrii este homoplasmite.
În cursul diviziunilor, distribuția mitocondriilor în celulele -fiice se realizează aleatoriu. În
succesiune a generațiilor de celule -somatice sau germinale -, raportul dintre numărul
mitocondriilor normale și cel al mitocondriilor mutante este însă supus unor variații
importante, datorate fenomenului derivei genetice. Variațiile se pot solda cu excluderea totală
a uneia dintre subpopulații. Procesul prin care se realizează reducerea de la heteroplasmie la
homoplasmie se numește segregare replicativă .
Reducerea la homoplasmie a celulelor somatice necesită un număr mare de diviziuni. În linia
germinală feminină, seg regarea replicativă este însă foarte rapidă: după numai doua generații,
populațiile mitocondriale ale celulelor germinale se omogenizează.
Fig.5 . Segregarea replicativă a mutațiilor mitocondriale heteroplasmice
( după Nussbaum, McInnes și Willard,2001)
Împărțirea aleatorie a mitocondriilor normale și mutante, prin mitoze succesive, determină o
colecție de celule -fiice cu proporții variabile a celor două tipuri de mitocondrii. Atunci când
predomină mitocondriile mutante se produce o disfuncție celulară și tisulară, care generează
starea de boală. [4]
2.2 Cromozomii
La începutul diviziunii, cromatina se organizează în cromozomi, organite nucleare care
fixează intens coloranții bazici (''chroma '' – culoare; ''soma'' – corp) și îndeplinesc două funcții
importante:
transportă materialul genetic de la părinți la descendenți (prin gameții formați în
meioză), precum și de la o celulă ''mamă'' la celulele ''fiice'' (prin mitoză), asigurând
transmiter ea fidelă a informației ereditare;
realizează amestecul materilului ereditar între generații succesive, prin procesele de
recombinare ce au loc în meioză, sursa principală de variabilitate.
Anomaliile de număr și structură ale cromozomilor sunt implicate în numeroase stări
patologice (anomalii congenitale multiple, dizabilități intelectuale și tulburări de
comportament, tulburări de sexualizare și de reproducere, cancer) și , de aceea,explorările
citogenetice reprezintă o metodă importantă de diagnosticare în medicina clinică. [4]
Citogenetica este o ramură a geneticii care studiază cromozomii,combinând metode citologice
și genetice. Prin studiul cromozomilor se înțelege analiza numărului, structurii ș i
comportamentului cromozomilor în timpul mitozei și meioz ei, precum și a anomaliilor
cromozomiale ș i a efectelor lor fenotipice .[6]
Progresele din domeniul citologiei, studiul celulei și a componenților celulari, a condus
la o realizare majoră î n înțelegerea naturii fizice a eredității. Cromozomii sunt structuri
celulare dinamice și constante, cu funcții citologice și genetice esențiale. Cromozomii
eucariotelor sunt constituiți din cromatină , nume colectiv dat cromozomilor î n interfază,
despiraliza ți. În interfază, cromatina are rol î n transmiterea informației ge netice de la o
moleculă de ADN la alta, precum și de la ADN la ARNm. Cromatina reprezintă un complex,
alcătuit din ADN, histone, prot eine nehistonice și puțin ARN câ t și ioni de calciu și magneziu
care formează cromozomii. Există sub două forme: densă (heterocromatină) și cromatină
dispersată (eucromatină). ADN -ul din eucromatină este format î n special din secvențe
nucleotidice unice, dar și din secvențe repetitive care servesc ca situsuri de inițiere și de
stopare a transcripției, precum și ca puncte de î mpachetare pentru menț inerea structurii
cromozomiale î n timpul diviziunii celulare. ADN heterocromatic este format î n mare parte din
ADN repetitiv.
Proteinele cromozomiale sunt histone , proteine bazice și conțin peste 20% aminoacizi
bazici, î n special argi nină și lizină. Se cunosc patru tipuri de histone: H1, H2, H3 și H 4.
Histonele au rol î n stabilitatea dublului helix de ADN, represarea transcripției genelor prin
legarea lor de ADN. Proteinele cromozomiale nehistoni ce sunt proteine acide, bogate î n acid
glutamic și acid aspartic. Ele î ndeplinesc rolul de reglatori ai transcripției genice.
Dator ită marilor progrese realizate î n ultimele decenii avem o nouă imagine a organizării
cromatinei. Ea este formată din subunități repetate, numite nucleozomi . Un nucle ozom este o
structură cilindrică, turtită, alcătuită din 8 molecule de histone globulare, (un octamer) 2 (H2A
+ H2B + H3 + H4 ). În jurul acestui nucleu se desfășoară ADN -ul. Segmentul ADN dintre doi
nucleozomi succesivi are o lungime variabilă de cateva zeci de perechi de nucleotide și este
asociat cu histone H1; acestea sunt situate la exterior deoarece protejează, mai bine decat
celelalte tipuri de histone, ADN -ul de atacul ADN -azelor, având și un rol structural.
Aceste structuri globulare sunt dispuse regulat și legate î ntre ele prin filamente de ADN
internucleosomal, realizând î n ansamblu aspectul unui “colier de perle”. Fibrele mai groase
(cu diametrul de 250 -300 Ǻ) se formează prin s piralizarea î n “selenoid” a fibrelor subțiri.
Pornind de la ADN, con densarea generală este de circa 7 000 ori pană la 250.000 de ori î n
cromozomul metafizic. Așa se explică cum moleculele de ADN extinse de la nivelul
cromozomilor umani având o lungime totală de aproximativ 2 m/celulă, pot fi adăpostite la
nivelul celor 46 d e cromozomi a căror lungime tot ală este de pană la 220 μm. La î nceputul
diviziunii (profază) fibrele de cromatină realizează o nouă spiralizare, mult mai intensă, se
plicaturează, se condensează, devenind vizibile sub formă de cromatide și cromozomi. Fieca re
cromatidă este alcătuită dintr -o singură moleculă de ADN , continuă (neî ntreruptă nici la
centromer), fixată la capete (telomere). Această moleculă de ADN se condensează puternic
prin spiralizare și/sau plicaturare, pentru a realiza sub formă de cromatide și cromozomi,
împachetarea regulată a materialului genetic (ADN), ușurâ nd și protejand distribuția
(segregarea) sa prin diviziune, î n celulele fiice. La sfarșitul telofazei, fenomenele sunt
reversibile, întrucat cromozomii se despiralizează și devin filamente de cromatină.
Cromatidele au î n lungul lor o structură heterogenă sub forma unor benzi . Ele sunt
determinate de: tipul și cantitatea de ADN, interacțiunea ADN cu proteinele cromozomiale,
gradul de co ndensare. Distribuția benzilor este precisă, specifică fiecărui cromozom ș i
identică la toți indivizii speciei. Cromozo mii din cariotipul uman aflați în metafază conțin 400
benzi, î n prometafază 900 benzi, iar î n profază 1700 benzi.
În funcție de tehnica folosită se pot evidenția următoarele tipuri de benzi cromozomiale:
G – prin colorarea Giemsa;
Q – se colorează cromozomii metafizici cu quinacrină (substanță fluorescentă);
C – se evidențiază cromatina constitutivă din vecinătatea centromerilor prin
denaturare termică;
R – se pun in evidență benzile ce au dispoziție inversă față de benzile G și Q. Benzile
G și Q au o dispoziție identică (se suprapun).
Există și alte tipuri de benzi cum ar fi benzile din regiunile telometrice, la extremitatea
brațelor cromozomale, așa -numitele benzi T.
Fiecare braț cromozomal este constituit din regiuni, una sau mai multe, și fiecare regiune este
formată din benzi succ esive colorate sau necolorate, î n funcție de tehnica folosită. Ca atare nu
există regiuni nebandate. Un cromozom metafizic este format din două cromatide surori unite
la nivelul centromerului. Regiunea centromerică a cromozomului mitotic este formată din
constricția primară care unește cele două cromatide surori și de doi kinetocori . Kinetocorii
sunt situsu rile de ancoraj a cromatidelor de microtubulii fusului de diviziune. Centromerul are
poziția constantă î n fiecare cromozom și constituie unul din markerii citogenetici caracteristici
pentru identificarea cromozomilor.
Fig.6 Modelul marcajului în benzi a fiecărui cromozom prometafazic
și nomencaltura benzilor
(după ISCN, 2003)
În funcție de poziția centromerului la om, există trei tipuri de cromozomi:
– metacentrici cu centromerul situat median;
– submetacentrici cu centromerul situat sub median spre capătul brațelor scurte;
– acrocentrici cu centromerul localizat foarte aproape de capătul brațelor scurte. Acrocentricii
pot prezenta sateliți (formațiuni mici, rotunde situate la extremitatea anumitor cromozomi (D
și G) legați de corpul cromozomulu i printr -un filament subțire ce conține genele care codifică
ARNr 18 S și 28 S .
(a) (b) (c)
Fig.7 Tipuri de cromozomi: (a) Metacentrici; (b) Subcentrici;
(c) Acrocentrici
Tot î n funcție de poziția centromerului, cromozomul are două brațe: unul scurt notat cu
p și altul lung notat cu q. Capetele brațelor (cromatidelor) cromozomiale se numesc telomere
și îndeplinesc următoarele funcții:
– sunt asociate cu me mbrana nucleară
– au rol î n organizarea croma tinei și facilitează inițierea î mperecherii cromozomilor in
meioză;
– intervin î n replicarea cromozomilor .[7]
Numărul cromozomilor este relativ constant pentru specie. În celulele somatice, numărul
cromozomilor este dublu ( diploid ) și se notează 2n, iar în celulele gametice (sexuale) este
redus la jumătate în comparație cu celulele somatice (haploid ) și se notează cu n.[8]
Cariotipul uman (totalitatea cromozomilor unui individ sau grup de indivizi, populație
sau specie, ordonați după criterii precise: lungime, poziția centromerului, constricții
secundare, sateliți, numărul și poziția benzilor) normal conține 23 de perechi de cromozomi,
22 de perechi sunt autosomi, iar o singură pereche sunt cromozomi de sex (heter ozomi ): XX
la femeie și XY la bărbat. Celulele somatice, adică totalitatea celulelor corpului î n afară de
cele sexuale, conțin două seturi de cromozomi, unul de la mamă (23 cromozomi) și altul de la
tată (23 cromozomi).
Cromozomii unei perechi, cu origine dublă, nu sunt identici ci similari sau omologi. Pe baza a
trei parametrii: lungimea cromozomilor, poziția centromerului și prezența sau absența
sateliților, c romozomii umani sunt impărțiți î n 7 grupe. .[7]
2.3 Genele – organizare și funcționare
2.3.1 Structura genelor și tipuri de gene
Conc epția actuală despre structura ș i funcția genei se bazează în esență pe rolul genetic al
ADN -lui. Gena a fost definită ca un ansamblu liniar de secvențe nucleotidice necesar pentru a
produce un polipeptid sau o mole culă de ARN funcțional ; acest complex includ e secvențe
transcrise (codante ș i necodante) precum și secvențe de reglare ale transcripției. În cea mai
succintă definiție gena este o unitate de transcripție .
Numai o mică parte din ADN nuclear este transcrisă, formând cele aproximativ 35.000 de
gene ale genomului uman. În funcție de produsul funcțional pe care îl codifică și de ARN
polimeraza care realizează transcripția, genele se clasifică în:
– gene ribosom ale (gene de clasă I), t ranscrise de ARN polimeraza I , ce codifică precursorul
de 45 S al moleculelor de ARNr de 28 S, 18 S si 5,8 S;
– gene ce codifică proteine (gene de clasă II), transcrise de ARN polimeraza II;
– gene ce codifică ARN de transfer (ARN t) și alte molecule mici de ARN, transcrise de
ARN polimeraza III.
Majoritatea genelor umane au o structură discontinuă (alcătuită din secvențe codante și
secvențe necodante) pentru desco perirea căreia Richard ROBERTS ș i Philip SHARP au
primit premiul Nobel (în 1993).
Genele care codifică proteine prezintă o parte centrală , transcrisă (copiată) în ARN mesager
precursor, numită ș i "cadrul de lectură " al informației genetice deoarece conține mesajul
codificat pentru sinteza proteinei, flancată de două părți laterale , netranscrise, cu rolul de a
regla expresia genei . În descrierea acestor regiuni ne vom referi la catena 5' -3' a ADN sau
catena sens .
Regiunea centrală ( cadrul de lectură) a genei
Regiunea centrală a genei este transcrisă integral în AR N mesager precursor prin acțiunea
ARN polimerazei II. Această regiune este alcătuită din alternanța regulată a două tipuri
distincte de secvențe: exoni și introni , prezente sau nu în versiunea finală a ARNm matur , ce
va părăsi nucleul.
Regiunea centrală a genei începe cu situsul d e inițiere (start) al transcripț iei. Care este numit,
prescurtat , SIT sau INR (de la initiator sequence). După S.I.T. urmează o regiune necodantă
(transcrisă dar netranslată) de câteva sute de nucleotide si numită 5’UTR (de la untranslated
region ); ea con ține o secvenț ă consensus (prezentă la toate genele ) 5'-CCAGCC ATG -3', care
pare să joace un rol important dar încă nedefinit în reglarea translaț iei. Cert este ca această
secvență conține ș i codonul inițiator ATG , care semna lează locul de debut al translaț iei (va
corespunde primului aminoacid în polipeptid). Urmează exonul 1 .
Fig.8 Structura și expresia unei gene prototip ce codifică proteine
(modificat după Strachan și Read, 1999; Gelherter et al., 1998)
Exonii sunt secvențe transcrise în ARN mesager precursor și păstrate în ARNm matur
(denumirea lor se bazează pe faptul că sunt secvențe ce se exprimă și părăsesc – exit –
nucleul ). Ei sunt regiunile funcționale din structura genei, care deobicei codifică anumite p ărți
structurale și/sau funcționale distincte ale proteinei, numite domenii . Numărul exonilor
variază de la o genă la alta (între 2 și mai mult de 50) precum și la diferite organisme .
Este util de precizat că nu este obligatoriu ca exonii să fie întotdeaun a părți codante/translate
ale genei; în unele gene unii exoni nu sunt translați deși sunt prezenți în ARNm matur (de ex.,
exonul 1 în gena pentru insulină).
Recent s -a constatat un alt lucru surprinzător: gene diferite pot avea unul sau mai mulți exoni
identici , în consecință diferite proteine complexe, neînrudite, pot avea unele domenii identice.
Spre exemplu, gena pentru receptorul LDL (lipoproteine cu densitate joasă) are exoni ce
produc în structura receptorului domenii proteice regăsite în multe alt e proteine. Explicația
acestui fenomen nu este clară dar unii autori susțin că în evoluție s -ar fi putut asambla gene
noi din exonii unor gene preexistente.
Intronii – numiți și "Intervening Sequences" sau IVS ( intercalante pentru că se interpun între
exon i) – sunt secvențe necodante, transcrise inițial în ARNm precursor (transcript primar) dar
decupate precis și îndepărtate ulterior din ARNm matur , ce va fi alcă tuit prin asamblarea
exonilor .
Fig.9 Evoluția filogenetică a genei mioglobinei
și genelor glob ulinelor, prin duplicațiile succesive,
dintr -o genă ancestrală
Numărul intronilor este cu unul mai mic decât cel al exonilor iar lungimea lor este variabilă,
neconcordantă cu a exonilor, deobicei mult mai mare. Important de precizat este faptul că
aproape to/i intronii încep întotdeauna cu dinucleotidele 5' GT și sfârsesc cu AG 3' ; o
minoritate a intronilor sunt delimitați de secvențele dinucleotidice AT la capătul 5', respectiv
AC la capătul 3'.
Aceste perechi de nucleotide au rolul unor semnale (balize) p entru decuparea precisă ș i
corectă a intronilor. Rolul intronilor nu este încă bine cunoscut . Cert este că numărul și
mărimea lor variază la diferite gene, fiind cel mai adesea mult mai mari în dimensiuni decât
exonii pe care îi separă. Rolul lor cel mai i mportant este acela de a asigura posibilitatea
aranjari i alternative, care este o sursă majoră de sporire a diversită ții proteinelor (o gena poate
astfel conduce la sinteza mai multor proteine).
Uneori, surprinzător ș i inexplicabil, ei pot lipsi în unele gene (precum genele pentru histone,
angiotensină, receptori beta adrenergici, ADN mitocondrial) iar alteori unii introni (din genele
pentru NF1, factor VIII, s.a.) pot conține elemente transcrise (în direcție opusă) fără nici -o
legătură cu gena în care se găsesc. De asemeni, la nivelul intronilor se pot găsi secvențe cu rol
reglator în funcția genei, precum insulele CpG la nivelul genelor amprentate.
După ultimul exon din zona centrală transcrisă a genei există o secvenț ă 3'UTR necodantă
(transcrisă dar netranslată). Ea începe cu unul din codonii stop (TAA, TAG, TGA) ce
reprezintă semnalul de oprire a translaț iei sau sintezei proteinei .
Regiunile laterale sau secvențele de reglare a genei
Cadrul de lectură al oricărei gene este flancat de două regiuni laterale, netranscrise , care au
rolul de a semnaliza inițierea transcripț iei de către ARN polimerază și de a regla intensitatea
ei; mutaț ii în aceste regiuni nu modifică structura de aminoacizi a proteinei codificate de genă
ci numai nivelul ei de expresie (rata sintezei).
De exemplu, mutaț ii în regiunea reglatoare 5' a genei pentru beta -globină reduc sinteza
catenelor beta la adult, produc ând boala denumită beta-talasemie și/sau cresterea e xpresiei
catenelor gama în afecț iunea denumită persistenț a ereditară a hemoglobinei fetale.
Regiunea laterală 5' . Această regiune, situată în amonte de cadrul de lectură al genei,
reprezintă locul unde se fixează ARN polimeraza ș i serveste la inițierea transcripț iei; ea este
numită generic promotor și conț ine mai multe elemente sau module (cis -activatoare) cu o
secvenț ă nucleotidică scurtă și precis definită. Pe aceste secvenț e se fixează niște proteine
reglatoare ( trans -activatoare ) numite factori de transcripț ie (TF II) care au rolul să fixeze și
poziț ioneze ARN polimeraza II – astfel ca transcripț ia să înceapă exact la SIT, cu primul
nucleotid (+1) – precum ș i de a activa enzima . Trebuie precizat că ARN polimeraza nu poate
recunoaște direct promotorul și nu poate iniț ia singură transcripț ia. Este nevoie de o
interacț iune complexă între enzimă, elementele cis -activatoare ale p romotorului genei ș i
proteinele trans -reglatoare (TF II), care se vor fixa la p romotor.
Regiunea laterală 3' . Orice genă se termină în regiunea 3' cu o secvenț ă netranscrisă, care
flanchează "cadrul de lectură a genei" sau zona ei centrală. Această secvenț ă este imprecis
delimitată și cunoscută dar existenț a ei certă îi conferă teore tic un rol structural sau funcț ional.
În această regiune se găsesc secvenț e semnal care afectează procesarea, stabilitatea și durata
de viaț ă a ARNm. Se mai ș tie că la unele gene (ex. gena beta -globinei) în această regiune 3' a
genei se pot găsi secvenț e reglatoare de tip activator (enhancer).
Semală m existența unor gene umane cu secvenț e codante fără introni (de ex.: genele pentru
histone, genele pentru recep tori hormonali sau diferiț i neuro -transmiț ători ș i altele) și de
asemeni existenț a (rară în genomu l uman) a unor gene parț ial suprapuse (ce folosesc cadre de
citire diferite, fiecare pe o catenă distinctă a ADN; ex unele di n genele HLA de clasă III) ș i
chiar de gene incluse sau " gene în gene" (ex. gena pentru neurofibromatoza tip I sau gena
pentru fact orul VIII al coagulă rii conț in în anumiț i introni alte gene mai mici, transcrise de pe
catena opusă celei folosită de gena de bază. [8]
2.3.2 Transcripția și translația
2.3.2.1 Transcripția
Transcripția este procesul de copiere a inf ormației genetice de la nivelul secvenței centrale a
unei gene, sub formă codificată, complementară și antiparalelă, într -o moleculă de ARNm.
Sinteza in vivo a ARNm este asigurată de aparatul de transcripție, constituit din:
– o catenă de ADN (transcrisă), ce funcționează ca o matriță ;
– ARN polimeraza de clasa II ( dependentă de ADN );
– factori de transcripție (TF), ce reglează ghidarea și activarea ARN polimerazei;
– un complex mediator între TF și ARN pol II;
– ribonucleotide activate ( sub formă de ribo nucleozid -trifosfați).
Catena transcrisă . Numai una dintre cele două catene ale ADN (3' →5') este transcrisă și
servește ca ''matriță'' pentru sinteza unei molecule complementare și antiparalele (5' →3') de
ARNm; dar, la gene diferite, transcripția (în direc ția 3'→5') se poate face pe una sau cealaltă
catenă a ADN. Alegerea catenei transcrise depinde, de localizarea și orientarea promotorului,
locul unde se fixează ARN polimeraza, prin intermediul factorilor de transcripție.
ARNm car e se formează prin transcripție, va avea aceeași secvență de nucleotide ( exceptând
înlocuirea T cu U) și același sens (5'→3') ca și catena ADN netranscrisă sau ''catena de
referință'', motiv pentru care aceasta se numește catena sens, iar catena transcris ă este numită
adesea antisens.
5'…ATGTTACGACGT…3 ' catena ADN ''sens'' (netranscrisă de referință)
3'…TACAATGCTGCA…5 ' catena ADN ''antisens '' (transcrisă)
Transcripție
↓
5'…AUGUUACGACGU…3 ' ARNm
Catena transcrisă prezintă, in amonte de regiunea centrală, o serie de secvențe cis -reglatoare,
specifice fiecărei gene și constituite din promotor și secvențele de reglare proximale și distale
acestuia care interacționează cu FT trans -reglatori, determinând fixarea, poziționarea și
activarea ARN pol II, astfel că transcripția să înceapă exact la situl de start al
stranscripției(SST).
ARN polimeraza II (RNAP sau pol II) transcrie catena matriț ă genelor ce codifică proteine și
a unor gene ARNnc. RNAP începe transcripția la SST, după f ixarea prealabilă la promotor,
proces inițiat de intervenția factorilor de trasncripție.
Factorii de transcripție sunt generali și speciali. Factorii generali (TFII) se atașează și se
asamblează secvențial la promotor și apoi recrutează RNAP, formând comp lexul de inițiere al
transcripției. Fcatorii speciali/activatori se fixează la elementele cis -reglatoare situate în
amonte de promotor, influențând momentul și intensitatea transcripției.
Mediatorul este un complex multiproteic care funcționează ca activat or al TF și RNAP.
Procesul de transcripție la eucariote se desfășoară în două mari etape, interdependente,
determinate de structura discontinuă a genelor eucariote. Aceste sunt:
– formarea ARNm precursor (pre-ARNm) sau transcriptul primar, prin transcripția integrală a
genei (exoni și introni);
– maturarea pre -ARNm , printr -o serie de modificări din care rezultă ARNm matur, ce va trece
în citoplasmă.
Formarea ARNm precursor (pre-ARNm)
După decondensarea locală a cromatinei, formarea pre -ARNm se realizează în trei etape:
1. Inițierea transcripției . Primul pas al transcripției este fixarea și poziționarea ARN –
polimerazei în regiunea promotor ( alcătuită din secvențele consens TATA box, CCAAT box
și GC box) , astfel că transcripția să poată începe în ''situl de start'' (SST sau Inr) cu primul
nucleotid (numerotat ''+1''). ARN polimeraza II nu recunoaște direct promotorul și nici nu
inițiază singură transcripția, necesitând prezența unor factori de transcripți e generali (TF II
sau de clasă II) care se fixează secvențial pe elementele promotorului pentru a recruta, ghida,
și activa ARN – polimeraza.
2. Transcripția propriu -zisă (elongația ). ARN polimeraza și unii TF se deplasează în lungul
moleculei de ADN; cele două catene se separă ( prin acțiunea TFIIH , cu rol de helicază),
eliberându -se catena transcrisă 3' → 5', care servește drept matriță pentru așezarea secvențială
și complementară a ribonucleotidelor activate; ele vor fi apoi polimerizate de către ARN
polimerază, formându -se ARNm precursor, în care sunt copiați atât exonii, cât și intronii.
Transcripția se face numai în sensul 5'→ 3' , fapt ce asigură fidelitatea '' citirii '' informației
genetice.
ARNm se desprinde treptat de p e catena transcrisă (rămânând fixat temporar numai la capătul
3'), iar cele două catene ale ADN se reunesc și refac dublul helix.
3. Terminarea transcripției se face când ARN -polimeraza întâlnește situl de terminare a
transcripției; aici se află secvența AATAAA (citită pe catena netran scrisă) care semnalează
clivarea 3' a transcriptului primar. Secțio narea ARNm sintetizat are loc ( sub acțiunea unei
exonucleaze) la 15 -30 nucleotide în aval de situl de poliadenilare.
Transcripția unei gene poate fi realizată concomitent de mai multe molec ule de ARN
polimerază, formându -se mai multe copii de ARNm ce conțin aceeasi informație genetică
(această amplificare va crește considerabil în cursul translației și astfel o genă va determina
sinteza concomitentă a mii de molecule proteice identice).
Maturarea ARNm precursor
Transcriptele primare (ARNm precursor) suferă un proces de maturare nucleară, ce cuprinde
două procese distincte (derulate pe măsura realizării transcripției) destinate să facă ARNm
disponibil și mai util translației.
Modificarea extremităților ARNm precursor determină creșterea stabilității sale ( protecție la
degradarea de către ribonucleaze) și facilitează transportul în citoplasmă, prec um și
recunoașterea și fixarea sa la subunitatea 40S a ribozomului.
La capătul 5 ' se adaugă, la primul nucleotid al transcriptului primar, o moleculă de 7 -metil –
guanozină, ce formează o structură specială, numită cap ( capac sau calotă);
La extremitatea 3' se adaugă ( prin acțiunea unei poli -A polimeraze) o serie de 50 -200 de
nucleotide cu adenină, formând o ''coadă'' poliadenilică. Această operație de poliadenilare este
caracteristică ARNm, fiind indispensabilă pentru protecția și stabilirea ARNm, precum și
pentru inițierea translației.
Procesarea ARNm precursor. Transcriptul primar conține secvențe complementare regiunii
transcrise din genă (cadrul de letură) alcătuită din exoni (regiuni codante) și introni (regiuni
necodante). Pe măsură ce se sintetizează, transcriptul primar suferă o procesare complexă, ce
constă în decuparea precisă și e liminarea ARN intronic, urmată de innădirea (legarea) ''cap la
cap'' a ARN exonic, cu formarea ARNm matur, alcătuit dintr -o serie continuă și contiguă de
exoni. Procesul denumit splicing, în limba engleză, sau éppisage, în limba franceză, poate fi
tradus î n limba română prin matisare . Excizia și reunirea fragmentelor de ARN sunt deosebit
de precise: o eroare de decupare a unui singur nucleotid schimbă cadrul de lectură, și după
translație, va produce o proteină anormală.
Procesul este favorizat de secvențele nucleotidice -semnal, situate la granița exoni -introni:
5'GU sau situs donor și 3'AG sau situs acceptor; o altă secvență importantă situată foarte
aproape de capătul 3' al intronului este situsul de conexiune sau de legătură (''branch site''), ce
conține nucleotidul A. Mecanismul de decupare se derulează în trei etape:
1. secționarea joncțiunii exon -intron 5'GU;
2. ataș area nucleotidului terminal G la nucleotidul A al situsului de conexiune și formarea
unei structuri în buclă;
3. secționarea intro nului la joncțiunea 3'AG, îndepărtarea lui și unirea segmentelor de ARN
exonic.
Reacțiile sunt mediate de un complex de matisare ARN -proteine, ce cuprinde cinci tipuri de
ARNsn (small nuclear) și numeroase proteine Sm și SMN.
Ordinea exonilor din ADN și tr anscriptul primar sunt păstrate în ARNm matur. există însă o
flexibilitate de utilizare a exonilor, prin care , în celule diferite, vor fi reținuți în ARNm matur
numai o pa rte din exoni, alții putând fi î ndepărtați odată cu intronii, proces numit matisare
alternativă (sau diferențială) și care permite sint eza a mai multor tipuri de ARNm și deci de
proteine de către o singură genă.
Fig.10 Matisarea ARNm precursor și formarea ARN matur
Erorile de transcripție și matisare se produc frecvent (20% din transcripte), fiind induse de:
persistența unui sau mai multor introni, absența odonului stop sau prezența de codoni stop
prematuri. Celulele posedă însă mecanisme complexe de detecție și degradare a ARNm
anormali, denumite mecanisme de supraveghere a ARN, care asigură precizia transcripției,
fără de care ar fi sintetizate proteine anormale, deseori cu efect toxic. [4]
2.3.2.2 Translația
A doua etapă a expresiei genice este translația, procesul de decodificare a informației
genetice din ARNm (reprezentată de o secvență de codoni) într -o secvență specifică de
aminoacizi, ce formează un polipeptid; acesta va suferi ulterior o serie de modificări devenind
o proteină activă.
Procesul de translație necesită ''un dicționar'' reprezentat de codul genetic, și un aparat de
translație, care include, printre alte componente, și ''traducătorul'', reprezentat de moleculele
de ARNt.
Informația genetică este asigurată de succesiunea specifi că a celor patru tipuri de nucleotide :
A, G, T, C. Ea este copiată complementar (U, C, A, G) în ARNm și apoi ''tradusă'' într -o
anumită secvență de aminoacizi, care vor forma o catenă polipeptidică ; această translație se
face cu ajutorul unui fel de ''dicț ionar bilingv'' care este codul genetic .
Codul genetic este reprezentat de un sistem de corespondențe între o anumită secvență de trei
nucleotide, numită codon și un anumit amoniacid. Cu cele patru litere ale ''alfabetului'' genetic
se pot scrie ''cuvinte'', alcătuite din trei litere; gena ar fi deci ''o frază'' f ormată dintr -o însușire
de codoni, ce determină o anumită secvență a aminoacizilor într -un polipeptid.
Tabelul.3 Codul genetic
Codul genetic prezintă următoarele proprietăți:
– este triplet , în condițiile în care prin combinarea câte trei a celor patru baze azotate (43) se
formează 64 de combinații, suficiente pentru cei 20 de aminoacizi standard care se găsesc în
structura proteinelor.
– are un codon inițiator (AUG) și trei codoni st rop (UAA, UAG, UGA), veritabile '' semne de
punctuație '' , cu care se în cepe și se termină sinteza polipeptidului. Codonul inițiator AUG
seminifică metionina. Codonii stop sunt numiți și codoni nonsens, deoarece nu semnifică
niciun aminoacid ; ei semnalează încheierea sintezei și eli berarea polipeptidului format.
Ceilalți 61 de codoni sunt codoni sens ce semnifică cei 20 de aminoacizi.
– este degenerat deoarece mai mulți codoni semnifică un același aminoacid, fiind numiți
codoni sinonimi. Exceptând metionia și triptofanul, codificați de un singur codon, ceilalți 18
animoacizi sunt codificați de 2 -6 codoni, de regul ă diferiți prin cel de -al treilea nucle otid.
Degenerarea interesează aminoacizii cei mai reprezentați în proteine, avantajând celula,
deoarece unele substituții genetice produc codoni sinonimi, fără a modifica proteina codificată
de genă. Această proprietate a codului genetic este un veritabil sistem de protecție contra
efectelor mutațiilor.
– este nesuperpozabil și fără virgule . Astfel, pot fi explicate efectele grave ale delecțiilor sau
inserțiilor a 1 -2 nucleotide prin care se produce o decalare a cadrului de lectură al genei,
rezultând o suc cesiune de alți codoni și, implicit, schimbarea ordinii aminoacizilor din
proteină, începând cu locul în care s -a produs mutația.
– este lipsit de ambiguitate, întrucât un codon semnifică întotdeauna un anumit aminoacid,
întotdeauna același.
– este univers al, fiind același la toate organismele: bacterii, plante, animale sau om. Caracterul
universal al codului genetic este important în ''ingineria genetică'', deoarece bacteriile
recombinate, în care s -a introdus o genă umană, fabrică proteina umană folosind codul genetic
bacterian care, este același ca și la om.
Aparatul de tran slație este alcătuit din numeroase componente: ARNm, ribozomi, ARNt,
aminoacizi, factori de inițiere, factori de elongație, enzime, surse de energie, etc. În sinteză,
ARNm – ce conține informația (secvența de codoni) care va fi translată într -o secvență de
aminoacizi din proteină – se fixează pe ribozom; folosind informația din ARNm ''translatorul''
ARNt fixează un aminoacid specific și apoi îl amplas ează în poziția corespunzătoare
codonu lui din ARNm.
Ribozomii sunt organite citoplasmatice ( descrise de George Emil Palade, premiul Nobel
pentru medicină în 1974) ce alcătuiesc platforma de asamblare a aminoacizilor în proteine, pe
baza instrucțiunilor ARNm. Ribozomii eucariotelor sunt alcătui ți din două subunități inegale
(care se deosebesc prin constanta de sedimentare, 40S și 60S); în repaus ele sunt disociate și
libere în citoplasmă, reunindu -se la începutul translației pentru a forma ribozomul activ .
Fiecare subunitate este alcătuită din A RN ribozomal și proteine, care au rol structural și
funcțional. Ribozomii prezintă patru situri funcționale: pe subunitatea mică se află situl de
fixare al extremității 5' a ARNm, iar pe subunitatea mare: situl P (peptidil) și A (aminoacil)
unde se fixează moleculele de ARNt cuplate cu aminoacizii lor specifici, precum și situl de
ieșire E.
În procesul de translați e, ribozomii se deplasează în lu ngul moleculei de ARNm, spre capătul
3', câte trei nucleotide la fiecare pas. Pe măsura deplasării, alți ribozom i pot începe translația
aceleiași molecule de ARNm, alcătuind împreună un poliribozom.
ARNt transportă aminoacizii din citoplasmă la robozomi. ARNt funcționează ca ''translator''
asigurând recunoașterea codonului din ARNm corespunzător aminoacidului transportat și
poziționarea specifică a aminoacidului în dreptul codonului .
Enzimele și cofactorii proteici . Peptidil -transferaza catalizează formarea legăturii p eptidice
între doi aminoacizi. Aminoacil -ARNt sintetazele sunt 20 de enzime cu dublă specific itate:
fiecare recunoaște un anumit aminoacid (pe baza mărimii și conformației radicalului), precum
și ARNt sau ARNt izo -acceptori corespunzător(i) (pe baza secvenței lor nucleotidice).
Cofactorii proteici intervin în diferite etape ale translației. Ei sunt reprezentați de factorii de
inițiere (IF 1 -6), factorii de elongație (EF 1 -2) și un factor de terminare (RF). Inactivarea lor
(de exemplu, prin toxine microbiene) blochează procesul de translație și produce moarte
celulară.
Procesul de translație
Translaț ia se realizează cu consum energetic (furnizat de ATP sau GTP) , în etape succesive –
activarea aminoacizilor, inițierea, elongația și terminarea translației, fiecare controlată de
molecule reglatoare diferite.
Fig.11 Etapele procesului de translație
În etapa de activare , aminoacil -ARNt sintetaza fixează covalent( prin grupul carboxil) un
anumit aminoacid la ARNt corespunzător, proces extrem de fidel deoarece enzima recunoaște
și îndepărtează orice aminoacid incorect încărcat.
Inițierea translației este o etapă complexă care constă în atașarea metioninei, primul
aminoacid (AA -1) al proteinei în dreptul codonului inițiator AUG din ARNm, urmată de
atașarea celor două subunități ribozomale, cu formarea ribozomului activ.
Într-un prim timp, ARNm se fixează cu extremitatea 5'cap și secvența 5'CCACC AUG C-3' pe
subunitatea mică a ribozomului; apoi, se formează un complex de inițiere între ARNm,
metionil -ARNt -l și diferiți factori de inițiere ai translației(IF2, IF3) cu rol catalizator. În final,
un alt IF se fi xează pe subunitatea mare 60S a ribozomului, cu activarea acestuia. ARNt –
inițiator se plasează direct în situl P al ribozomului.
Elongația este o etapă repetată succesiv, în cursul căreia se formează legături peptidice între
aminoacizii conectați secvențial pe baza ordinii codonilor din ARNm.
După fixarea metionil -ARNt -l în poziția P a ribozomului, în situl A liber se fixează
aminoacil 2-ARNt -2 codificat de al doilea codon din ARNm. În continuare, peptidil –
transferaza formează legătura peptidică din tre primii doi aminoacizi, formându -se complexul
dipeptidil -ARNt -2. După formarea dipeptidilului, sub influența factorului de elongație EF2,
GTP și a translocazei, ribozomul se deplasează cu trei nucleotide în lungul ARNm, în direcția
5'→3'. Astfel, ARNt -l ajunge la nivelul sitului E, dipeptidil -ARNt -2 ocupă situl P, iar
aminoacil 3-ARNt -3 se fixează în situl A.
Ciclul celor trei faze se repetă, iar catena polipeptidică crește la fiecare ciclu cu un aminoacid.
Pe măsură ce un ribozom avansează în lungul catenei de ARNm, alți ribozomi pot începe
''lectura'' aceleiași catene de ARNm, formându -se concomitent până la mii de molecule
proteice identice. Procesul de sinteză a polipeptidului este marcat de diverse erori, care sunt
corectate prin diferite mecanisme, ce implică diferite enzime și factori de elongație.
Terminarea translației . Elongația polipeptidului se oprește când în situl aminoacil al
ribozomului ajunge un codon stop. În acest moment, se produce dezasamblarea comple xului
ribozom -ARNm -polipeptid (prin intervenția factorului RF) și polipeptidul este eliberat din
ribozom. Ribozomul poate fi reciclat pentru o nouă sinteză, iar polipeptidul suferă o serie de
modificări post -translaționale, ce îî conferă configurația tridi mensională specifică .[4]
CAPITOLUL III
FACTORII REGLATORI AI ACTIVITĂȚII GENELOR
3.1 Mecanisme epigenetice
3.1.1 Metilarea ADN
Metilarea ADN -ului, care modifică o bază de citozină la reziduurile de dinucleotide CpG cu
grupări metil, este catalizat de Dnmt și reglează modelele de expresie genică prin modificarea
structurilor cromatinei. În prezent, sunt cunoscute 5 Dnmt diferite: Dnmt1,Dnmt2, Dnmt3a,
Dnmt3b și DnmtL. Dnmt1 este un Dnmt de întreținere și Dnmt3a, 3b și L sunt de novo Dnm t.
Funcția Dnmt2 nu este încă clară . Prin afectarea acestor Dnmt în timpul vieții noastre ,
nutrienții și componentele alimentare bioactive pot schimba metilarea ADN -ului global , care
este asociat cu integritatea cromozomială , precum și metilarea ADN -ului promotorului
specific genei , care este strâns asociat cu expresia genelor . În plus, aceste Dnmts lucrează
împreună cu enzime care catalizează alte fenomene epigenetice , iar modificările în activitatea
acestor enzime pot fi implicate în dezvoltarea diferite lor boli .
Comparativ cu reacțiile de metilare ADN, procesul de demetilare ADN nu a fost bine
delimitat . În orice caz, mecanismul de demetilare ADN este evidențiat în prezent , deoarece
demetilarea ADN -ului este importantă în procesele celulare în timpul dezvoltării embrionare
și diferențierea celulelor stem. Sunt sugerate mai multe mecanisme de candidat :
1. reparația de excizie a bazelor inițiată de 5 -metilcitozină ADN glicozilază ;
2. reparația de excizie a bazelor ini țiată prin activități cuplate de 5 -mC deaminază care
transformă 5 -mC în T, și neportivirea G/T ADN glicozilazei care corectează nepotrivirea G/T;
3. reparația de excizie a nucleotide lor care îndepărtează dinucleotidele CpG metilate ;
4. îndepărtarea oxidativă a grupării metil;
5. îndepărtarea hidrolitică a grupării metil .[9]
Cel mai recent, s -a găsi t hidroximetilcitoz ină. Conversia 5 -metilcitozinei în 5 –
hidroximetilcitozină (5hmC) în ADN -ul de mamifer este mediată de metilcitozina oxigenază
TET1. [10] În plus, 5hmC poate fi produs prin adăugarea de formaldehidă la citozine în ADN
de proteinele Dnmt . [11] Se pa re că 5hmC ar putea servi roluri biologice importante de la
sine, sau ar putea servi ca intermediar în demetilarea ADN . S-a sugerat, de asemenea, că o
reacție enzimatică revers ibilă catalizată de proteinele Dnmt poate produce citozină
nemodificată de la 5hmC, susținerea acelui 5hmC că ar putea fi un intermediar în demetilare a
directă a ADN -ului. Deoarece 5hmC este prezent în ADN -ul de mamifere la un nivel
semnificativ într -o manieră specifică a țesutului, [12] sunt necesare studii suplimen tare pentru
a delimita rolul de 5hmC, în special în îmbătrânire și cancer, ambele demonstrează
hipometilarea ADN -ului.
Efectele nutrienților asupra metilării ADN -ului. Folatul, o vitamină B solubilă în apă, a
fost studiat pe larg pentru efectul său asupra metilării ADN -ului, deoarece folatul poartă o
grupare metil și în cele din urmă furnizează acea grupare metil pentru sinteza AdoMet,
donatorul unic de metil pentru reacțiile de metilare ADN. În orice caz, folatul nu este singurul
determinant al metilării ADN -ului, deoarece alți nutrienți donanți de metil, cum ar fi
metionina, colina, betaina, și vitamina B -12, precum și alți factori de mediu pot schimba, de
asemenea, starea de metilare a ADN -ului. Întru -un studiu recent realizat pe animale, nivelele
folatice dietetice au fost corelate pozitiv atât cu statutul de metilare al ADN -ului genomic, cât
și cu cel al promotorului p16 , împreună cu un nivel modificat de expresie a genei p16 la
nivelul colonului de șoareci îmbătrâniți . [13] Acest rezultat este în concordanță cu un studiu
uman pentru că limfocitele T au arătat demetilarea ADN -ului și supraexprimarea genelor
asociate cu autoimunitatea după vârsta de 50 de ani când limfocitele T de la adulți sănătoși cu
vârsta cuprinsă între 22 și 81 de ani au fost cultivate cu un mediu cu folat scăzut și -metionină .
Efectele au fost reproduse prin doborârea Dnmt în limfocitele T de la participanții tineri .
Pentru că se știe că expresia Dnmt1 este scăzută odată cu îmbătrânirea, putem specula că
scăderi dependente de vârstă ale nivelului de Dnmt și a substanțelor nutritive ale donatorilor
de metil dietetici modifică sinergic starea ADN -ului de metilare și expresia genei mediată de
metilarea ADN -ului. [14]
Vitamina B -12, o vitamină solubilă în apă, și cofactor esențial de metionină sintază în
metabolismul cu 1 carbon, a fost cunoscut că afectează metilarea ADN -ului genomic. Cel mai
recent, Uekawa și colab .[15] a demonstrat că deficitul sever de vitamina B -12 induce
promotorul hipometil ării genei ꞵ-sintazei cistationinei și reprimă această transcripție genică
la șobolani, chiar dacă suplimentarea cu metionină, precursorul AdoMet și produsul de
metionină sintază , nu a putut inversa acest efect. Colina este un nutrient donator de metil și
disponibilitatea colinei materne este esențială pentru neurogeneza fetală, cum ar fi dezvoltarea
hipocampului, precum și pentru funcția de memorie de -a lungul vieții. Într -un st udiu pe
șoareci, privarea colinei în perioada embrionară a provocat hipermetilarea unui situs specific
CpG în cadrul genei calbindină 1 (Calb1), ceea ce este important în dezvoltarea hipocampului,
împreună cu expresia sporită a Calb1 . [16] Acest studiu indică faptul că deficitul de colină în
perioada embrionară ar putea modifica metilarea ADN -ului și astfel modifică dezvoltarea
creierului fetal.
3.1.2 Modificările histonelor
Structura nucleozomului și a cromatinei . Un nucleozom , care este format din 146 pb ADN și
un octamer de proteine histonice ( histona 2A, histona 2B, histona 3 și histona 4), este un bloc
constructiv al cromatinei, care poate regla procesele transcripționale prin modificări post –
sintetice ale ADN -ului și histonei. Spre deosebire de ADN -ul care este modificat doar prin
metilare, histonele pot fi modificate prin metilare, acetilare, fosforilare, biotinilare,
ubiquitinare, sumoylare și ADP -ribozilare. Locația modificărilor histonice se află la cozile
histonice care constau din 15 –38 aminoacizi. Reziduurile de lizină din cozile histonice pot fi
fie metilate (mono -, di- și tri-), fie acetilate, iar reziduurile de arginină pot fi mono – sau di –
metilate. Starea de acetilare a histonei este echilibrată de HAT și HDAC. Metilarea hi stonelor
este menținută de metiltranferaze histonice și demetilaze histonice.
Fig.12 Modificarea nucleozom ului și a histonei . Fiecare nucleozom cuprinde un octamer de
molecule de histonă și ADN dublu catenar. Terminațiile amino ale histonelor, care se numesc
cozi histonice, pot fi modificat e post-translațional și funcționează ca platforme de integrare a
semnalului. Principalele modificări epigenetice la situsurile cozii de histonă sunt: lizina și
metilarea argininei (Met K și respectiv MetR), fosforilare (P), acetilare (Ac) și ubiquitinarea
(Ub).
Studiile epigenetice curente determină rolul modificărilor individuale, precum și efectele
combinatorii ale acestor modificări. O întrebare interesantă în modificările histonice este
modul în care tiparele de metilare ale ADN -ului și histonelor sunt stabil ite, șterse, recunoscute
și moștenite. Se pare că metiltransferazele, demeti lazele, și proteinele accesorii
interacționează și coordonează starea cromatinei. De exemplu, metilarea ADN -ului mamifer
este foarte asociat cu st area de metilare a histonelor, î n mod deosebit la histona H3 lizină
(H3K) 4 și H3K9, care au efecte reciproce asupra exprimării genelor; metilarea H3K4 (marca
de metil activ) crește expresia genelor și metilarea H3K9 (marca metilică represivă) scade
expresia genelor. Prin urmare, corelația metilării ADN cu H3K4 nemetilat și H3K9 metilat
necesită un mecanism care să asigure că H3K4 și H3K9 nu sunt simultan metilate sau
demetilate. Studiile enzimatice și structurale sugerează că demetilazele Jumonji, care
demetilează H3K4 sau H3K9, și metilt ransferazele histonice, care conțin domenii atât pentru
sintetizare cât și pentru recunoaștere, pot juca roluri critice în metilarea reciprocă H3K4 și
H3K9. [17]
Acetilarea histonelor este una dintre cele mai studiate modificări ale histonelor . Acetilarea
reversibilă a reziduurilor de lizină N -terminale la pozițiile 9, 14, 18 și 23 din H3 și 5, 8, 12 și
16 din H4 mediază decondensarea structurii nucleozomilor, modifică interacțiunea histonică
și ADN, și facilitează accesul și legarea factorilor de transcrip ție. În general, creșterea
acetilării histonice la histona H4 lizină 5 sau H4 lizină 8 se găsește în regiunile eucromatinei
unde transcrierea este potențial activă, în timp ce acetilarea H4 liz inei 12 este crescută în
regiunile heterocromatinei, unde trans crierea este potențial inactivă. HAT și HDAC reglează
echilibrul în stare constantă a acetilării histonelor. Interesant, inhibitorii HDAC au fost
recunoscuți ca potențiali agenți terapeutici pentru cancer, deoarece induc arestarea ciclului
celular și apop toza prin îmbunătățirea expresiei anumitor proapoptotici sau a genelor care
mediază ciclul celular. [18,19 ]
Acetilarea histonelor este foarte asociată cu inflamația. HDAC reglează genele
proinflamatorii, cum ar fi interleukina (IL) -1,5, 8, 12, și gene le antiinflamatorii precum IL –
10. [20] Expresia COX -2 este de asemenea reglată prin acetilarea histonică a regiunii
promotor ului [21] și suprimată de sirtuină 1 (Sirt1), care funcționează ca HDAC. [22] Expresia
oxidului nitric inductibil sintază (iNOS) este, de asemenea, cunoscută a fi reglementată de
p300 HAT .[23] Pentru că HAT, în special proteina de legare p300 / CREB (CBP), au fost
asociate cu creșterea și supraviețuirea celulelor canceroase, HAT ar putea fi noi ținte
moleculare pentru dezvoltarea agenților chimioterapeutici ai cancerului. Interesantă este
curcumina, ale căror proprietăți medicinale sunt recunoscute de multă vreme în India și Su d-
Estul Asiei, este un inhibitor al p300 / CBP HAT. În celule, curcumina favorizează degradarea
dependentă de proteazom a p300 și a proteinei CBP în strânsă legătură. Pe lângă inducerea
degradării p300, curcumina inhibă activitatea acetiltransferazei p300. Aceste date indică
faptul că curcumina poate fi un compus nou pentru dezvoltarea inhibitorilor terapeutici
specifici p300 / CBP. [24] În plus, curcumina previne anomaliile asociate diabetului la rinichi
prin inhibarea p300 și NF -kB. [25]
Biotina , o esenția lă vitamină B solubilă în apă, a fost cunoscută că modifică cozile histonice
H2A, H3 și H4 printr -o atașare covalentă a biotinei la resturile specifice de lizină catalizate de
enzimele biotinidază și holocarboxilază sintază. Biotinilările la histona H4 lizină 8 și lizină 12
au fost asociate cu structuri de heterochromatină, silențierea genelor, condensarea mitotică a
cromatinei, și repararea ADN -ului. [26,27 ] Biotinilarea histonică este un proces reversibil,
chiar dacă debiotinilazele nu au fost caracter izate. P entru biotinilare este necesară
suplimentarea dietetică a biotinei iar o deficiență de biotină poate avea efecte profunde asupra
structurii cromatinei [28], deși un studiu recent asupra culturii celulare susține cu tărie că
biotina este absentă în histonele native. [29] Deoarece există multe întrebări fără răspuns în
biotinilarea histonei, sunt necesare studii suplimentare pentru a delimita semni ficația
biotinilării histonice, o modificare a histonei direct de către un nutrient.
3.2 Mecanisme transcripționale
3.2.1 Factor ii de transcripție
Factorii de transcripție trans -reglatori sunt proteine reglatoare, care se fixează pe elementele
cis-reglatoare ale ADN și interacționează cu alte proteine, determinând inițierea sau reglarea
transcripției. Factorii de transcripție sunt vitali pentru numeroase procese celulare: controlul
ciclului celular, diferențierea celulară și dezvoltarea organismului, răspunsul la semnalele
inter- și extracelulare etc.
Factorii de transcripție sunt de obicei dimeri ( hetero – sau homodimeri). Fiecare monomer
posedă cel puțin două domenii: domeniul de fixare al ADN ( la promotor) și domeniul de
activare al transcripției, prin care interacționează cu alți factori de transcripție pentru a regla
transcripția. Unii factori d e transcripție pot conține un al treilea domeniu senzor al semnalelor
externe ( un s it de fixare al unor liganzi: hormoni, ioni etc., sau cofactori, prin care factorii de
transcripție pot fi activați/dezactivați). De menționat că factorii de transcripție d iferiți pot
conține domenii similare de fixare la ADN, dar au domenii diferite de trans -activare; în acest
caz, TF se fixează la aceeași secvență de ADN, dar activează transcriția în mod diferit. Există
și situația inversă: TF cu domenii diferite de fixare la ADN și cu domenii identice de trans –
activare.
Domeniul de fixare la ADN are o structură particulară de aminoacizi ce formează un ''motiv
structural'' caracteristic, care permite recunoașterea și interacțiunea fizică cu secvențele
specifice de 4 -9 nucl eotide. Legarea la ADN necesită prezența unei cromatine necondensate
sau chiar pierderea locală a nucleozomilor. În funcție de alcătuirea domeniului de fixare la
ADN, există mai multe familii de factori de transcripție.
1. FT în degete de zinc ( zinc finge r), în care aminoacizii se dispun spațial sub forma unor
degete de mănușă, la baza cărora se fixează (de cisteină și/sau histidină) un ion de Zn2+,
indispensabil activității proteinei; din această categorie fac parte receptorii nucleari pentru
hormoni și p roteina SP1, care se fixează pe promotorul a numeroase gene comune.
2. FT elice -cot-elice (helix -turn-helix), în care aminoacizii ce alcătuiesc domeniul de fixare la
ADN formează două spirale, unite între ele printr -un ''cot'' , ce produce o rotație prin c are cele
două spirale sunt orientate în planuri diferite; acest tip de structură (numit și homeodomeniu)
apare în proteine care reglează procesele de dezvoltare, numite homeoproteine (proteine
HOX, SOX etc.).
3. FT elice -bulcă -elice (helix -loop-helix) sun t proteine dimerice alcătuite dintr -un domeniu de
fixare specifică la ADN, o spirală, o buclă laterală și o altă spirală; cele două molecule, ce
formează dimerul, se leagă prin interacțiuni ce se stabilesc între zonele din spirală ; astfel de
structuri sunt prezente la proteinele care stimulează sinteza de imunoglobuline (de exemplu
proteinele din familia E, precum E12, E47, E2 -2 și HEB).
4. FT cu fermoar de leucină (leucine zipper) sunt proteine dimerice, alcătuite dintr -un
domeniu de fixare specifică la ADN și un domeniu în spirală, bogat în leucină, care
interacționează cu domeniul omolog al celeilalte catene. Exemple de astfel de proteine sunt
proteina CREB și pr odusele oncogenelor JUN și FOS.
Factorii de transcripție se pot clasifica:
– pe baza mecanismului de acțiune în: FT generali, care interacționează cu miezul
promotorului, fiind implicați în formarea complexului de preinițiere, și FT specifici, care se
fixează pe elemente cis -reglatoare situate în amonte de promotor;
– după funcția reglatoare în: FT constituționali activi, prezenți în toate celulele, în toate
momentele (de exemplu, FT generali, SP1, NF1) și FT condiționali activi (necesită activare);
în ult ima categorie se includ: FT de dezvoltare specific celulari (de exemplu, GATA în celule
hematopoietice sau PIT1, factorul specific glandei hipofize) și FT dependenți (activați) de
semnale externe (extra -celulare – endocrine sau paracrine, intracelulare – autocrine) sau de
receptori membranari.
Pe lângă factorii de transcripție, există și proteine care pot regla transcripția fără a se lega
direct la ADN. În schimb, ele realizează interacțiuni proteină -proteină cu FT, cărora le
modifică activitatea. Există do uă categorii de asemenea proteine: co -activatori ai transcripției
(care stimulează activitatea TF) și co -represori ai transcripției (care reduc activitatea TF).
Gene care codifică factori de transcripție
Factorii de transcripție sunt ultima verigă din căile de semnalizare intracelulară, care intervin
în controlul dezvoltării; de exemplu, factorii de transcripție din familia GLI (calea de
semnalizare Hedgehog) sau factorii de semnalizare TCF (calea de semnalizare Wingless).
Există numeroase familii de fa ctori de transcripție care îndeplinesc roluri majore în controlul
dezvoltării, mutațiile lor determinând anomalii congenitale diverse.
Exemple de gene care codifică factori de transcripție cu rol major în controlul dezvoltării
sunt:
– gene homeobox, precum familiile HOX, au un rol major în specificarea axei antero –
posterioare a embrionului ;
– genele PAX au un rol major în dezvoltarea unor organe (de exemplu, gena PAX6 intervine
în dezvoltarea ochiului) ;
– genele EMX sunt importante în dezvoltarea creierului (mutațiile EMX1 determină
schizencefalie) ;
– genele MSX sunt implicate în dezvoltarea scheletului ;
– genele cu casetă HMG (high mobility group) precum familia genelor SOX (implicate în
formarea gonadelor, condrogeneză ș.a) și genele cu casetă T, precum fa milia genelor TBX (cu
rol major în dezvoltarea axei antero -posterioare a embrionului). [4]
3.2.2 Activitatea moleculară a ARN
Dogma centrală a biologiei moleculare sugerează că ADN -ul menține informațiile pentru a
codifica toate proteinele noastre, și că trei tipuri diferite de ARN convertesc mai degrabă
pasiv acest cod în polipeptide. Mai exact, ARN -ul mesager (ARNm) transportă modelul
proteinei de la ADN -ul unei celule la ribozomii săi, care sunt „mașinile” care conduc sinteza
proteinelor. Transf erul ARN (ARNt) transportă apoi aminoacizii adecvați în ribozom pentru a
fi incluși în noua proteină. Între timp, ribozomii înșiși constau în mare parte din molecule de
ARN ribozomal (ARNr).
Cu toate acestea în jumătatea secolului de când structura ADN -ului a fost elaborată pentru
prima dată , oamenii de știință au aflat că ARN face mult mai mult decât pur și simplu joacă
un rol în sinteza proteinelor. De exemplu, multe tipuri de ARN s -au dovedit a fi catalitice –
adică, ele realizează reacții biochim ice la fel ca și enzimele. Mai mult, s -a constatat că multe
alte varietăți de ARN au roluri de reglementare complexe în celule.
Astfel, moleculele de ARN joacă numeroase roluri atât în procesele celulare normale, cât și în
stările de boală. În general, a cele molecule de ARN care nu iau forma ARNm sunt denumite
necodări, pentru că nu codifică proteinele. Implicarea ARNm necodate în multe procese de
reglementare, abundența și diversitatea funcțiilor lor au dus la ipoteza că o „lume ARN” ar fi
putut preceda evoluția ADN -ului și proteinelor.
În eucariote, ARN -ul necodat vine în mai multe soiuri, cel mai proeminent transferul ARN
(ARNt) și ARN ribozomal (ARNr). După cum sa menționat anterior, atât ARNm, cât și ARNr
sunt cunoscute de mult timp ca fiind esențial e în traducerea ARNm în proteine. De exemplu,
Francis Crick a propus existența moleculelor de ARN adaptor care s -au putut lega de codul
nucleotidic al ARNm, facilitând astfel transferul aminoacizilor în lanțurile polipeptidice în
creștere. Munca lui Hoagla nd și colab. (1958) a confirmat într -adevăr că o fracțiune specifică
de ARN celular a fost legată covalent la aminoacizi. Ulterior, faptul că ARNr -ul s-a dovedit a
fi o componentă structurală a ribozomilor a sugerat că, la fel ca ARNm, ARNr -ul a fost și el
necodat.
În plus față de ARNr și ARNt, există și alte ARN -uri necodate în celulele eucariote. Aceste
molecule ajută în multe funcții esențiale, care sunt încă enumerate și definite. Ca grup, aceste
ARN sunt deseori denumite ARN -uri de reglementare mici (A RNs), și, în eucariote, acestea
au fost în continuare clasificate într -o serie de subcategorii. Împreună, aceste diferite ARN -uri
de reglementare își exercită efectele printr -o combinație de împerechere de baze
complementare, complexare cu proteine și activități enzimatice proprii.
Una dintre subcategoriile importante ale ARN -urilor de reglementare mici constă în
moleculele cunoscute sub numele de ARN -uri nucleare mici (ARNsn). Aceste molecule joacă
un rol critic în reglarea genelor prin intermediul despicării ARN. ARNsn -urile se găsesc în
nucleu și sunt de obicei strâns legate de proteine în complexe numite snRNPs ( mici
ribonucleoproteine nucleare, uneori pronunțate "snurps"). Cele mai abundente dintre aceste
molecule sunt particulele U1, U2, U5 și U4 / U6, care sunt implicate în despicarea pre -ARNm
pentru a da naștere la ARNm.
Un alt subiect de interes intens pentru cercetare este cel al microARN (miARN), care sunt
ARN -uri de reglementare mici, care au lungimea de aproximativ 22 până la 26 de nuc leotide.
Existența miARN și funcțiile lor în reglarea genelor au fost descoperite inițial la nematodul C.
elegans. De la descoperirea lor, miARN -urile au fost găsite și în multe alte specii, inclusiv
muște, șoareci și oameni. Până acum s -au identificat cât eva sute de miARN și pot exista multe
altele.
miARN s -a dovedit că inhibă expresia genelor prin reprimarea traducerii. De exemplu,
miARN -urile codificate de C. elegans, lin-4 și let -7, se leagă de regiunea 3 'netradusă a
ARNm -urilor țintă, împiedicând prod ucerea proteinelor funcționale în anumite etape ale
dezvoltării larvelor. Majoritatea miARN studiate până acum par să controleze expresia
genelor prin legarea la ARNm -urile țintă prin împerecherea bazelor imperfecte și prin
inhibarea ulterioară a traduceri i, deși s -au remarcat unele excepții.
Studii suplimentare indică faptul că miRNA -urile joacă, de asemenea, roluri semnificative în
cancer și în alte boli. De exemplu, specia miR -155 este îmbogățită în celule B derivate din
limfomul Burkitt, iar secvența sa se corelează, de asemenea, cu o translocare cromozomială
cunoscută (schimb de ADN între cromozomi).
ARN -urile mici interferente (ARNsi ) sunt încă o clasă de ARN -uri mici . Deși aceste molecule
au doar 21 până la 25 de perechi de baze, ele funcționează, de asemenea, pentru a inhiba
expresia genelor. Mai exact, o catenă a unei molecule de ARNsi dublu catenar poate fi
încorporată într -un complex numit RISC. Acest complex care conține ARN poate inhiba
transcripția unei molecule de ARNm care are o secvență complementară componentei sale
ARN.
ARNsi -urile au fost definite pentru prima dată prin participarea lor la interferența ARN
(ARNi). Este posibil să fi evoluat ca un mecanism de apărare împotriva virușilor ARN cu
catenă dublă. ARNsi -urile sunt derivate din transcrieri mai lungi într -un proces similar cu cel
prin care sunt derivate ARNmi, iar procesarea ambelor tipuri de ARN implică aceeași enzimă,
Dicer. Cele două clase par să se distingă prin mecanismele lor de represiune, dar au fost găsite
excepții în care ARNsi -urile prezintă un comportament mai tipi c pentru ARNmi -uri și invers.
În interiorul nucleului eucariot, nucleolul este structura în care are loc prelucrarea ARNr și
asamblarea ribozomală. Moleculele numite ARN -uri nucleolare mici (ARNsno) au fost izolate
din extractele nucleare din cauza abundenței lor în această structură. Aceste molecule
funcționează pentru procesarea moleculelor de ARNr, adesea rezultând metilarea și pseudo
uridilarea nucleozidelor specifice. Aceste modificări sunt mediate de una dintre cele două
clase de ARNsno: caseta C / D sau casetele H / ACA, care mediază în general adăugarea
grupărilor metil sau izomerizarea uridinei în molecule de ARN imatur, respectiv.
ARN -urile cu activitate enzimatică (î n special, catalitică), cum ar f i moleculele de auto –
împletire, sunt denumite în mod obișnuit ribozime. Ribozimele au roluri în replicare,
procesare ARNm și despicare. Prin definiție, aceste molecule își pot iniția activitățile fără
asistența unor componen te proteice suplimentare, deși deseori sunt mai eficiente in vivo.
Formele de ARN necodificatoare cu funcții noi continuă să fie descoperite și azi. Această
bogată complexitate și diversitate a formelor și activităților ARN atât în procariote, cât și în
eucariote, acordă credință așa -numitei ipoteze „lumea ARN” ; această ipoteză afirmă că ARN –
ul ar fi putut evolua înainte de ADN și proteine, și este posibil să fi jucat rolur ile ambelor
molecule în primele forme de viață. Faptul că unele ARN au capacitate de codificare și
catalitică, fără a fi nevoie de o enzimă pe bază de proteine, face o astfel de ipoteză viabilă. Cu
toate acestea, nu este clar dacă moleculele de ARN de astăzi cu proprietăți catalitice sunt
rămășițe ale trecutului evolutiv sau dacă au origini mai recente. Descoperirea continuă a
noilor molecule mici de ARN de reglementare sugerează că funcțiile suplimentare pot fi încă
descoperite. Astfel, contribuția completă a ARN la viața celulei poate fi încă necunoscută. [30]
PARTEA SPECIALĂ
CAPITOLUL IV
4.1 Terapia care influențează expresia genică
Cunoașterea semnificativă a mecanismelor epigenetice luminează dilema „natura sau
alimentație” și constituie o componentă foarte importantă pentru rezultatul tratamentului
psihiatric și relația psihoterapeutică cu pacienții sau clienții care raportează ami ntiri
traumatice și au suferit neglijență sau maltratare.
Povestea începe de la începutul secolului al XIX -lea, când Lamarck a susținut că organismele
pot dobândi caracteristici și proprietăți prin interacțiunea și adaptarea lor la mediu. [ 31]
Aceste noi „trăsături de personalitate” pot deveni stabile pe tot parcursul vieții și pot fi
moștenite de următoarea generație.[ 32] Termenul „epigenetică” care a derivat din greacă, a
fost dat acestei proprietăți organice. Înseamnă „mai presus de genetică ”.
Există două mecanisme importante implicate în genetică: metilarea ADN și modificarea
histonelor. Un al treilea mecanism privind ARN -ul care nu codifică (ncRNA) trebuie să fie
mai elucidat.[ 33]
Metilarea ADN apare atunci când o grupare metil (CH 3) se adaugă pe citozina aminoacidă.
Aceasta se completează prin acțiunea unei metiltransferaze numai atunci când citozina este
urmată de guanină, și are ca rezultat reducerea pe termen lung a expresiei genei specifice. Este
important de menționat că metilarea g enelor este o procedură în mai multe etape, în timp ce
demetilarea se realizează printr -o singură etapă. [34]
Aceste fapte sunt extrem de importante pentru schimbările de personalitate în timpul
intervențiilor psihoterapeutice și psihiatriei, întrucât prezintă un potențial și o flexibilitate
foarte ridicată pe multitudinea de experiențe trăite și au un rol determinant în funcțiile
neuroplastice precum învățarea, memorarea și comportamentul adaptativ.
Al doilea mecanism se referă la modificarea histonei. Histonele sunt proteine încărcate
pozitiv. ADN -ul neutilizat, care nu este necesar, are o sarcină negativă și, prin atracție, este
ambalat în jurul unui octamer de histone. [32] Moleculele de histonă sunt supuse la metilare,
acetilare sau fosforilare și poate reprima expresia genelor prin creșterea sarcinii electrostatice
și strângerea bobinelor, reducând astfel expresia ADN -ului. Modificarea histonei este
tranzitorie, ducând la modificări mai puțin permanente decât metilarea ADN -ului.[35]
În ceea ce privește cercetările privind diabetul Mellitus tip 2, Dayeh și colab. [36] au găsit
aproximativ 17 gene care par diferit metilate în insulele pancreatice, contribuind astfel la
scăderea eliberării insulinei după stimularea glucozei. Doi ani mai târziu, acee ași echipă de
cercetare a redus numărul de gene implicate la patru.[ 37]
Un alt exemplu genial de modificări epigenetice este metilarea crescută a genei care
controlează producerea factorului neurotrofic derivat din creier (BDNF) în medii stresante.
BDNF ar e un rol crucial în crearea de noi sinapse. Reducerea producției de BDNF determină
un număr scăzut de noi sinapse și reducerea simbolizării experiențelor, diminuând astfel
capacitatea de a memora și învăța.[ 38,39 ]
Reducerea nivelului de BDNF în copilăria traumatică poate avea și o semnificație teleologică,
spre exemplu, ca o protecție naturală, pentru a reduce simbolizarea exactă a amintirilor
dureroase și pentru a susține supraviețuirea emoțională.
McGowan și colab. [40] a studiat creierul copiilor sinucig ași și a constatat hipermetilarea
ARN -ului ribozomal în regiunea 5 ' în zona hipocampului care controlează axul hipotalamo –
hipofizo -suprarenalian (HPA). Rezultatul acestei hipermetilări a fost reglarea anormală a
răspunsului la stres și tendința de suicid. În plus, Bustamante și colab. [41] a găsit o relație
directă între creșterea metilării ADN -ului de citozină -fosfat -guanină, maltratarea la copii și
tulburări depresive majore (MDD).
Oxitocina calmează amigdala prin întărirea fibrelor aductive ale GABA.[ 42] Pentru a avea
acest rezultat, producția de BDNF trebuie crescută prin demetilarea genei BDNF. Psihoterapia
sau relaxare a sau chiar un mediu adecvat va duce la această demetilare a genelor așa cum va fi
descris mai jos.
Ascultarea empatică crește simboliza rea și reduce aprinderea amigdalei prin activarea
nucleului său central și bazolateral. [43] Uzefovsky și colab[ 44] a studiat calea neurogenetică a
empatiei la 367 de participanți și a arătat relația strânsă cu genele asociate oxitocinei și
argininei -vasopresinei. Schneiderman și colab [45] a găsit o relație directă a secreției de
oxitocină cu reciprocitatea partenerilor, atenția lor pozitivă, și grija pentru relație. Au ajuns la
concluzia că această situație are multe asemănări cu relația mamă -copil și atașamentul primar.
Lutz și colab. [ 46] afirmă că empatia și compasiunea creează un mediu pentru un grad de
integrare mai ridicat al sistemului nostru nervos.
În ceea ce privește progresul farmacologic în acest domeniu, Lopez și colab. [47] a arătat o
scădere a metilării genei BDNF în cortexul prefrontal după o terapie de opt săptămâni cu
citalopram. Semnele clinice de depresie au fost, de asemenea, îmbunătățite. Au propus că
procedura de demetilare și metilare este un proces dinamic care est e inclus în substratul
modificărilor cognitive în timpul terapiei.
Inhibitori de metiltransferază și deacetilază histonică sunt, în prezent, ținta principală pentru
prepararea medicamentelor epigenetice care vor fi utilizate în tulburările mintale [48], și au
arătat deja rezultate interesante.
Din perspectiva Psihoterapiei, Perroud și colab. [49] a studiat schimbările metilării ADN în
BDNF plasmatică la 115 pacienți cu tulburare bipolară și 52 de controale în timpul procesului
intensiv de patru săptămâni cu DBT.[ 50] Au descoperit o scădere semnificativă a metilării
BDNF, care a fost urmată de modificări semnificative ale scorurilor depresiei, disperării și
spontaneității extrovertite. Ei au adăugat că, cu cât gradul de traumă este mai mare, cu atât
mai mare e ste metilarea BDNF și reducerea silenței genice.
Yehuda și colab. [ 51] a studiat biomarkerii epigenetici NR3C1 și FKBP5, care sunt gene
legate de receptorii glucorticoizi, ca predictori ai rezultatului terapeutic și indicatori ai
îmbunătățirii, la cincispr ezece veterani de luptă cu PTSD,care au suferit o expunere prelungită
de doisprezece săptămâni în psihoterapie. Ei au descoperit că nivelul de metilare NR3C1 ar
putea prezice în mod semnificativ rezultatul terapeutic, în timp ce metilarea FKBP5 a arătat
un rezultat corespunzător odată cu îmbunătățirea simptomelor care sugerează o creștere a
expresiei genice. Mai mult decât atât, sensibilitate crescută a receptorului glucorticoid, care,
după cum afirmă, este un semn distinctiv al PTSD, a arătat o expresie ma i scăzută după
terapie.
Arthur Weidman [ 52] observă că, atunci când relația afectivă copil -părinte și psihoterapia sunt
concentrate pe atașamentul primar, atunci ele pot fi instrumente semnificative pentru
demetilarea genelor importante. Kohut [ 53] a susți nut că oamenii au o tendință înnăscută, care
poate fi evitată de comportamentul non -empatic al părinților, abordând astfel atitudinea
umanistă a tendinței de actualizare și a reacțiilor de apărare descrise de Rogers în teoria
personalității sale. [54]
Schimbarea de atitudine și dezvoltarea personalității se po ate întâmpla și prin relația cu
parteneri buni sau prieteni. Cu toate acestea, psihoterapia este probabil cel mai puternic proces
după relația afectivă copil -părinte de care oamenii dispun, pentru a-și modifica convingerile,
ușurând astfel durerea psihică. Psihoterapia ajută la reducerea hiperreactivității axei HPA
printr -o îmbogățire bazată pe experiență a emoțiilor, credințelor și comportamentelor .
Procesul terapeutic ajută și sprijină oamenii să -și descopere o gama largă de însușiri ale
organismului, să -și schimbe expresia genelor și să dezvolte mai multe abilități pentru a -și
realiza obiectivele de viață. [54]
4.2 Polimorfismul genetic
Polimorfismul genetic este definit ca variație la nivelul unei secvențe de ADN, variație ce
apare cu o frecvență de cel puțin 1%, în populația omenească. De ex.: genele ce codifică
enzimele CYP 2A6, 2C9, 2C19, 2D6 și 3A4 sunt polimorfice, cu mutații funcționale de peste
1%, la dife rite grupuri etnice.
Polimorfismul genetic poate exista în stare :
– homozigotă (atunci când cele două alele sunt identice, la un locus genetic particular);
– heterozigotă (atunci când sunt prezente alele diferite, una normală și una modificată, la un
anum it locus genetic).
Polimorfismul genetic se manifestă clinic semnificativ, atunci când afectează medicamentele
care au un indice terapeutic mic (ca fenitoina, mercaptopurina, warfarina), putând rezulta fie o
creștere periculoasă a toxicității, fie o pierde re tot atât de periculoasă a efectului terapeutic.
4.2.1 Polimorfismul enzimelor metabolizatoare de medicamente
Biotransformarea enzimatică a medicamentelor este un proces complex, cu numeroase
variabile, ce generează variabilitate interindividuală și i ntraindividuală.
Complexitatea procesului metabolizării medicamentelor este corelată cu următoarele
fenomene: – multiplicitatea enzimatică;
– polifuncționalitatea medicamentului;
– metaboliții toxici celulari ai unor med icamente.
Multiplicitatea enzimatică este un concept caracterizat prin următoarele fenomene cunoscute
în metabolizarea medicamentelor și xenobioticelor:
– o enzimă (izoenzimă) poate biotransforma o întreagă varietate de structuri chimice (având o
specificitate relativă de substrat);
– diverse enzime pot interveni în biotransformarea unui medicament .
Polifuncționalitatea medicamentului este o noțiune ce evide nțiază faptul că un medicament
poate fi substrat enzimatic pentru diferite sisteme enzimatice, participând la diferite tipuri de
reacții enzimatice, din care rezultă diferiți metaboliți (activi, toxici sau inactivi). Exemplu:
warfarina racemică este metabo lizată de diferite isoforme ale citocromului P450, rezultând cel
puțin șapte metaboliți hidroxilați.
Metaboliții chimic reactivi și toxic celulari, capabili să se lege ireversibil (prin legături
covalente) de macromoleculele celulare (proteine, acizi nucle ici) pot fi cauza unor efecte
adverse grave ale medicamentelor respective. De exemplu: hepatotoxicitatea
acetaminofenului, teratogenitatea fenitoinei.
Polimorfismul enzimatic complică la maxim fenomenul complex al biotransformării
medicamentelor, multiplic ând factorii de variabilitate interindividuală într -o populație,
precum și de variabilitate interetnică.
Există patru fenotipuri metabolizatoare, corelate cu polimorfismul genelor ce codifică
proteinele enzimatice, astfel:
– tipul metabolizator normal – care prezintă cel puțin o alelă normală funcțională, nemutantă
(wilde -type) sau două copii ale genei wilde -type;
– tipul metabolizator intermediar – la care o alelă codifică o enzimă cu activitate redusă și
cealaltă alelă codifică o enzimă inactivă;
– tipul metabolizator lent – la care ambele alele codifică enzime inactive;
– tipul metabolizator ultrarapid – care posedă alele normale funcționale (wilde -type) în copii
multiple (3 -13 copii).
Există mai mult de 30 de familii de enzime metabolizatoare de medicamen te la om. Toate
prezintă variante genetice și, dintre acestea, majoritatea se exprimă prin modificări ale
proteinelor codificate. Vom aborda polimorfismul enzimatic oferit de sistemele enzimatice
mai bine studiate farmacogenetic, dintre cele implicate majo r în metabolizarea
medicamentelor, respectiv:
– din cadrul sistemului oxidativ microzomal hepatic (SOMH), ce utilizează citocromul P450
(Cyp): Cyp2C9, Cyp2C19, Cyp2D6, CyplA2, Cyp3A4;
– din cadrul sistemului de transferaze (sintetaze): N -acetiltransferaza, Tiopurin S –
metiltransferaza (TPMT), UDP -glucuronosyl transferaza (UGT), Dihidropirimidin
dehidrogenaza (DPD).
Consecințele clinice ale influenței polimorfismului genetic al enzimelor metabolizatoare de
medicamente asupra profilului farmacocinetic al medic amentelor:
1. Toxicitatea dependentă de concentrație, prin supradozare relativă datorată clearance -ului
redus al medicamentului, la indivizii metabolizatori -insuficienți sau deficienți (denumiți și
lenți sau slabi) (PMs) ;
De exemplu:
– neuropatie, indusă de perhexilină (antianginos), la metabolizatorii -insuficienți CYP2D6 ;
– accidentele hemoragice, datorate efectului anticoagulant excesiv al warfarinei, la
metabolizatorii -insuficienți CYP2C9;
– toxicitatea crescută a fenitoinei, la metabolizatorii -insufici enți CYP2C9 și CYP2C19;
– neuropatia ireversibilă, indusă de 6 -mercaptopurină, la pacienții cu deficiență de TPMT.
2. Ineficiența terapeutică, prin subdozare relativă datorată clearance -ului ridicat al
medicamentului, la metabolizatorii rapizi și ultrarapi zi (UMs);
De exemplu:
– răspunsul terapeutic scăzut al dozelor standard de antidepresive triciclice și necesitatea de
megadoze, la indivizii metabolizatori -ultrarapizi, cu multiple copii ale genei CYP2D6 ;
– rata scăzută de eradicare a H.P., după doze stand ard de omeprazol sau lansoprazol și
necesitatea de doze zilnice crescute, la metabolizatori -rapizi CYP2C19.
3. Reducerea efectului (debut și intensitate), datorată afectării biotransformării prodrogurilor
inactive la compușii terapeutic activi, la metaboli zatorii -ineficienți;
De exemplu:
– reducerea eficacității analgezice a codeinei, datorată afectării conversiei codeinei la morfină,
la metabolizatorii -ineficienți CYP2D6;
– reducerea eficacității analgezice a tramadolului, datorată afectării conversiei tra madolului la
O-desmetiltramadol, la metabolizatorii -ineficienți CYP2D6.
Polimorfismul CYP2C19 și consecințele clinice
Polimorfismul CYP2C19 cuprinde 21 de alele diferite, descoperite. Variabilitatea fenotipică
CYP2C19 este bimodală. Pacienții pot fi încadr ați în numai două fenotipuri metabolizatoare
CYP2C19: metabolizatori normali și lenți.
Metabolizatorii normali (extensivi și intermediari) posedă alela normală CYP2C19*1.
Distribuția alelei normale CYP2C19*1 la pacienții cu origine etnică diferită este de cca:
– 84% la asiatici;
– 65% la albii caucazieni;
– 18% la afro -americani.
Metabolizatorii ultrarapizi (UM) dețin varianta alelică CYP2C19*17.
Deficiența de CYP2C19 (cunoscută ca deficiența de ''mefenitoin hidroxilază'') este moștenită
ca o trăsătură autozomal -recesivă și au fost identificate, până în prezent, patru alele deficiente.
Principalele alele deficiente (defective alleles), ce generează enzime inactive, încadrate la
fenotipul metabolizator lent (PM), sunt:
– CYP2C19*2 (aberrant splice site) ;
– CYP2C19*3 (premature stop codon).
Deficiența de CYP2C19, manifestată la metabolizatorii lenți, a fost identificată la un procent
de:
– 13-23% indivizi din populația asiatică și descendenți;
– 3-5% la populația albă caucaziană;
– 4% la populația afro -amer icană și africană.
Această reprezentare semnificativă a metabolizatorilor lenți la populația asiatică și la
descentenți susține științific practica prescrierii de doze mici de diazepam, la pacienții chinezi
și descendenți.
Medicamentele metabolizate de CY P2C19 includ: anticonvulsivante, antidepresive,
antiulceroase inhibitoare ale pompei gastrice de protoni, anxiolitice benzodiazepine lipofile,
beta-blocante lipofile.
Consecințele clinice ale polimorfismului CYP2C19.
Exemplu: Omeprazol. Rata de vindecare a ulcerului duodenal HP+ (Helicobacter pylori,
pozitiv), cu omeprazol, este în funcție de polimorfismul CYP2C19.
Revelanța clinică a polimorfismului CYP2C19, identificat în populația asiatică, asupra ratei
de vindecare a ulcerului duodenal HP+, într -o dublă terapie (cu omeprazol, în doză de
20mg/zi, asociat cu amoxicilină), după tratament timp de patru săptămâni, a fost demonstrată
de mai multe studii. Rata de vindecare înregistrată a fost cu mult mai mare la pacienții genetic
metabolizatori lenți (cu alele mutante), comparativ cu metabolizatorii extensivi (cu alele
nemutante= wild type allele).
Rezultatele unor studii care au pledat în acest sens, sunt:
– Rata de vindecare a ulcerului HP pozitiv, a fost de 100% la metabolizatorii lenți (slabi), și de
numai 6 0% și 29% la metabolizatorii extensivi (rapizi), respectiv heterozigoți și homozigoți.
– Ariile de sub curbele concentrațiilor plasmatice (ASC) au fost de 5 -12 ori mai mari la
metabolizatorii lenți, comparativ cu cei extensivi (rapizi).
Este emisă părerea că: administrând doze de 40 sau 60 mg omeprazol pe zi, la toți pacienții, s –
ar putea realiza un beneficiu uniform, fără a fi nevoie de teste farmacogenetice pentru
identificarea genotipului pacientului. Considerăm că sunt necesare studii suplimentare, în
vederea determinării rapoartelor beneficiu/risc, pentru aceste doze ridicate de omeprazol,
propuse pentru pacienții metabolizatori lenți.
Fig.13 Rata de vindecare a ulcerului duodenal HP+, sub tratament timp de patru săptămâni,
cu omeprazol 20mg/zi asociat cu amoxicilină, la pacienți cu genotipuri CYP2C19 WT/WT
(wild -type allele) și WT/M și M/M (alele mutante)
(după Flockhart D.A., Bertilsson L., 2007; datele după Furuta T. și colab., 1998) .
Fig.14 Ariile sub curbele concentrațiilor plasmatice (ASC) de omeprazol, (sub tratament
timp de 4 saptămâni, cu omeprazol 20mg/zi asociat cu amoxicilină), la pacienții
metabolizatori CYP2 C19 lenți (*2/*2), intermediari (*1/*2) și extensivi (*1/*1)
(după Hirata M.H., 2008).
Un alt studiu a înregistrat o eradicare a HP, la metabolizatorii lenți (PMs), după dublă terapie
(cu omeprazol și amoxicilină) și triplă terapie (cu omeprazol, amoxicili nă, claritromicină),
într-un proces de 100%. În timp ce, la metabolizatorii extensivi (EMs), eredicarea a fost
numai 41% după dublă terapie, și 83% după triplă terapie.
Alt studiu a rezolvat problema eredicării HP, în cazuri refractare, la metabolizatorii extensivi
(EMs), cu o dublă terapie (lansoprazol, în doză mare de 30 mg de 4 ori pe zi, și amoxicilină),
într-un procent de 97%.
Alte studii au demonstrat corelația dintre statusul genetic metabolizator CYP2C19 și rata de
eredicare a ulcerului HP+, sub tra tament cu diverși inhibitori de pompă de protoni (IPP):
esomeprazol, lansoprazol, omeprazol, rabeprazol. Rabeprazol este singurul IPP ce nu este
metabolizat de CYP2C19 și, în consecință, rata de eredicare a HP cu regimuri de terapie,
incluzând rabeprazol, nu variază semnificativ în populații, în funcție de statusul metabolizator
CYP2C19.
O metaanaliză a 19 studii clinice de eredicare a HP, cu inhibitori de pompă de protoni (IPP),
în regim de dublă sau triplă terapie, incluzând antibiotic, în funcție de stat usul genetic de
metabolizator CYP2C19 a evidențiat următoarele:
– Pentru toat medicamentele IPP, rata de erdicare a HP a fost mai înaltă la grupul PM (89%),
comparativ cu grupurile intermediar IM (83%) și extensiv EM (71%), diferența între grupuri
fiind se mnificativă statistic (p < 0,0001);
– Cea mai mare diferență în ratele de eredicare a HP, între grupurile PM și EM, s -a înregistrat
pentru omeprazol (93% vs 63%), comparativ cu lansoprazol (88% vs 74%) și rabeprazol
(81% vs 77%).
Polimorfismul la N-Acetiltransferaza -2 (NAT -2) și consecințele clinice
Mutațiile enzimei N -acetiltransferaza -2 (NAT -2) sunt frecvente. Ele induc variabilitate
farmacocinetică, dar până în prezent nu au fost evidențiate consecințe importante asupra
efectului farmacodinamic.
Fenotipul acetilator lent este asociat cu moștenirea a două alele nefuncționale NAT -2.
Proporția de indivizi acetilatori NAT -2 lenți și rapizi într -o populație variază în funcție de
originea etnică și geografică, pe o scară foarte extinsă. Astfel, procent ul de acetilatori NAT -2
lenți variază:
– de la numai 1 -5% la eschimoșii canadieni,
– cca 7% la polinezieni,
– 15-22% la chinezi,
– până la 42 -55% la americanii de origine caucaziană și africană,
– 49-57% la africani,
– crescând până la 33 -70% la europeni ș i americanii de origine europeană,
– 55-75% la populațiile mediteraneene (evrei iesraelieni etc.),
– atingând un maximum de 82% la egipteni.
Variabilitatea frecvenței de distribuție a fenotipului acetilator rapid, în grupurile populaționale
cu diferite ori gini etnice este sintetizată în continuare:
– grupurile etnice de origine asiatică au frecvența distribuției =40 -100%;
– grupurile etnice de origine africană au frecvența de distribuție = 20 -59%;
– grupurile etnice de origine europeană au frecvența de dist ribuție = 30 -67%;
– grupurile etnice de origine mediteraneană au frecvența de distribuție = 18 -45%.
Consecințele clinice ale polimorfismului NAT -2 la acetilatorii lenți a fost observată o
exacerbare a RA.
Exemplu: Izoniazida (HIN) (antituberculos). Izoniazida prezintă un fenomen mult mai
complex. Responsabil pentru hepatotoxicitatea izoniazidei este metabolitul acetilat,
acetilhidrazina, care se formează mai rapid și în cantitate mai mare la acetilatorii rapizi.
Acetilhidrazina este apoi polimorfic a cetilată la diacetilhidrazină, această reacție având loc
mai rapid la acetilatorii rapizi, care însă elimină mult mai multă acetilhidrazină decât
diacetilhidrazină, comparativ cu acetilatorii lenți. Rezultanta acestor mecanisme, referitor la
tipul de aceti lator expus la hepatită, este dificil de stabilit teoretic.
4.2.2 Polimorfismul genelor transportorilor transmembranari de
medicamente
Variația genetică a tuturor acestor transportori transmembranari generează o variabilitate în
distribuția medicamentelo r în organism și în excreția acestora, influențând concentrația
medicamentelor la locul de acțiune.
Membrii familiei dependente de ATP (adenozin trifosfat) sunt cei mai bine studiați
transportori membranari implicați în distribuția medicamentelor și implic it în efectele
acestora. P -glicoproteina este un membru al familiei de transportori membranari dependenți
de ATP, și este codificată de gena ABCB1 (numită și MDR1). Polimorfismul genetic este
bine evidențiat pentru P -glicoproteină.
Genele pentru alți ABC t ransportori (genele ABCC4, sau MRP4) sunt în curs de studiu.
Polimorfismul genetic al transportorilor implicați în recaptarea neuromediatorilor este în curs
de studiu. Răspunsul la tratamentul cu antidepresive a fost asociat cu polimorfismul genei
transpor torului de serotonină în sinapse.
Polimorfismul P -glicoproteinei
P-glicoproteina (P -GP) este o proteină membranară ce funcționează ca pompă de eflux
transmembranar, dependentă de energia ATP.
Răspândirea în organism este largă: enterocite, hepatocite, celu lele endoteluilui capilar din
bariera hemato -encefalică, celulele tubului proximal renal, precum și în placentă și celulele
canceroase.
P-GP prezintă următoarele caracteristici:
– este transportor membranar, ce transportă (''pompează'') activ xenobiotice ' 'afară din celulă'';
– este ATP -dependentă;
– nu are specificitate de substrat.
Rolul fiziologic al P -glicoproteinei este:
– rol în limitarea absorbției orale a peptidelor și peptidomimeticelor ;
– rol protector celular, prin efluxul substanțelor toxice și metaboliților toxici, din celule.
P-GP realizează efluxul celular dependent de energia ATP, a multor substraturi chimice,
endogene și exogene, ca: bilirubina, glucocorticosteroizi, glicozizi cardiotonici,
anticanceroase, imunosupresive, inhibitori de prote ază HIV tip 1 și altele.
Rolul P -glicoproteinei în farmacocinetică este deosebit de important. P -GP este responsabilă
de excreția xenobioticelor și metaboliților acestora în lumenul intestinal, în bilă și urină. Ca
urmare, P -glicoproteina are un rol import ant în reglarea absorbției, distribuției și excreției
multor medicamente.
Variațiile în exprimarea P -glicoproteinei, în enterocite, influențează absorbția medicamentelor
transportate, astfel:
– creșterea activității P -glicoproteinei limitează absorbția, scăzând biodisponibilitatea,
rezultatul fiind neatingerea concentrației plasmatice terapeutice;
– scăderea activității P -glicoproteinei facilitează absorbția, cu creșterea biodisponibilității și
atingerea concentrațiilor plasmatice supraterapeutice toxice.
La nivelul barierei sânge -creier, în plexul coroid, P -glicoproteina limitează acumularea în
creier a multor xenobiotice și metaboliți ai acestora, inclusiv medicamente; de ex.: digoxina,
dexametazona, ciclosporina, vinblastina.
La nivelul placentei, P -glicoproteina intervine în transportul unor medicamente; de ex.:
digoxină, progesteron, vinblastină , vincristină.
P-GP este responsabilă de rezistența organismului la medicamentele anticanceroase, prin
explusia acestora din celulele canceroase.
Gena ce codif ică P -glicoproteina este: gena MDR -1 (Multidrug -resistant genes) denumită și
gena ABCB1. Polimorfismul genei MDR -1 (ABCB1) cuprinde 15 variante.
În gena MDR -1, două variante de polimorfism nucleotidic singular (single -nucleotide
polymorphism = SNP) se află într-un link de dezechilibru:
– SNP sinonim (SNP synonymous) (fără schimbarea unui aminoacid), cu mutația 3435C→T
în exonul 26;
– SNP non -sinonim (SNP nonsynonymous) (cu un aminoacid schimbat, conducând la
Ala893Ser), cu mutația (2677G→T) în exonul 21.
SNP sinonim , reprezentat de forma homozigotă cu mutația 3435C→T în exonul 26 al MDR –
1, este corelat cu nivelele semnificativ scăzute de P -glicoproteină. Exprimarea duodenală a
acestei forme conduce la un nivel de P -glicoproteină sub jumătate din nivelul exp rimat la
genotipul CC. Genotipul 3435C→T prezintă o creștere semnificativă a biodisponibilității, cu
realizarea de concentrații plasmatice înalte de digoxină. La nivel rasial, se manifstă o variație
considerabilă a frecvenței acestui SNP 3435C→T. Frecvența acestei variante polimorfice este
semnificativ mai scăzută la descendenții africani, față de descendenții europeni. Această
formă poliformică 3435C→T la exonul 26 servește ca marker util pentru predicția
biodisponibilității per os și concentrațiile plasma tice ale substraturilor transportorului P –
glicoproteină.
SNP non -sinonim, reprezentat de mutația 2677G→T, în exonul 21 al MDR -1, este asociat cu
creșterea funcției P -glicoproteinei. SNP 2677G→T nu a fost genotipat.
Medicamentele transportate de P -glicoprot eină sunt: antineoplazice (adriamicina,
doxorubicina, vinblastina etc.), glicozizii cardiotonici (digoxina), glucocorticosteroizii
(dexametazona), imunosupresive (ciclosporina etc.), inhibitori de HIV protează (ivermectina).
Rezistența la medicamentele ant ineoplazice este consecința unei supraexprimări a genei
MDR -1 în anumite tumori și, ca urmare, a exportului activ al acestor antineoplazice, din
celulele canceroase, prin intermediul P -glicoproteinei.
Consecințele clinice ale polimorfismului P-glicoproteinei
Forma cu mutația 3435C→T în exonul 26 al MDR -1 fiind corelată cu nivelele semnificativ
scăzute de P -glicoproteină, conduce la concentrații plasmatice înalte de medicamente (de ex.
digoxină).
Screeningul pentru mutația 3435C→T în exonul 26 al genei MDR -1 poate servi ca metodă
marker utilă pentru predicția biodisponibilității per os și concentrațiilor plasmatice ale
ciclosporinei, putând fi aplicabil la optimizarea posologiei ciclosporinei, în vederea reducerii
riscului de rejecție a transpla ntului.
Ciclosporina este un imunosupresiv frecvent administrat, pentru reducerea riscului de rejecție
a organului transplantat. Are un indice terapeutic mic și absorbție per os foarte variabilă,
dependentă de polimorfismul P -glicoproteinei. Concentrațiil e plasmatice subterapeutice cresc
riscul de rejecție a organului, iar cele supraterapeutice cresc riscul de reacții adverse
(neurotoxicitate și nefrotoxicitate).
Rezistența la medicamentele antineoplazice este consecința exportului activ rapid, al acestora ,
din celulele canceroase, prin intermediul P -GP, la indivizii transportori rapizi.
Asocierea între variantele genetice în gena ABCB1 și efectul tratamentului, a fost studiată la
pacienții infectați cu HIV. Polimorfismul ABCB1 (MDR1) 3435C→T a fost asocia t cu
diferențe semnificative în farmacocinetica nivelelor plasmatice de nelfinavir și efavirenz, la
pacienții infectați cu HIV.
Supra -exprimarea genelor pentru alți ABC transportori (ABCC4 sau MRP4) conferă
rezistență la unii agenți antiretrovirali nucleos idici (de ex.: zidovudina).
Polimorfismul genetic mimat de inhibiția și inducția transportorilor transmembranari
Inhibiția și inducția provocate de medicamente și de alte xenobiotice asupra transportorilor
prin membranele biologice pot să mimeze polimorfis mul transportorilor, influențând cinetica
medicamentelor transportate și răspunsul terapeutic.
Inhibiția transportorului P -GP ar putea fi transformată într -un avantaj la asocierea cu
medicamentele anticanceroase, rezultând reducerea efluxului celular al a nticanceroaselor (ca
vincristina și adriamicina). Ca urmare ar putea fi contracarată instalarea rezistenței la
farmacoterapia anticanceroasă și poate crește eficacitatea tratamentului.
Exemple de inhibitori ai P -GP:
– Verapamil (blocant al canalelor de cal ciu). Verapamil este biotransformat pe mai multe căi
enzimatice (CYP 3A4 și 1A2). Calea principală este CYP3A4 și conduce la metabolitul
desmetilverapamil (norverapamil) cu activitate mai redusă decât a medicamentului părinte.
Verapamil este inhibitor pute rnic al enzimelor CYP (CYP 3A4 și 1A2), dar și al
transportorului membranar P -GP.
-ISRS (antidepresivele moderne inhibitoare ale recaptării serotoninei). Fluoxetina și
paroxetina sunt inhibitori potenți CYP2D6. De asemenea, sunt inhibitori ai transportului
membranar P -GP și pot genera consecințe clinice la asocierea cu alte medicamente
transportate transmembranar de P -GP. [55]
4.3 Terapia genică
Terapia genică presupune modificarea directă a genomului unor celule ale pacientului, în
scopul obținerii unui efect terapeutic. În funcție de tipul celular țintit, se disting terapia genică
somatică și terapia genică germinală. Aceasta din urmă presupune modificarea genetică
permanentă a unui gamet sau a zigotului, care se poate transmite la urmași. De aceea, tera pia
genică germinală este considerată inacceptabilă conform principiilor eticii la om, singurele
protocoale de terapie genică aprobate fiind cele de terapie somatică.
În cadrul protocoalelor de terapie genică somatică, celulele țintă sunt, deseori, cele im plicate
direct în procesul patogenic. O excepție notabilă este aceea a cancerului, în care terapia genică
poate distruge selectiv celulele canceroase, direct sau indirect, prin modificarea celulelor
sistemului imunitar, cu scopul de a crește capacitatea lo r de recunoaștere și luptă împotriva
celulelor tumorale.
Pentru modificarea genetică a celulelor somatice s -au folosit modalități diferite, în funcție de
boala în cauză:
– Amplificarea genică sau adiția (inserția) genică are ca scop inducerea unei copii n ormale a
unei gene ce nu funcționează în tipul celular afectat de boală. Acest tip de terapie ''de
înlocuire'' poate fi aplicat bolilor genetice produse prin mutații cu pierderea funcției (de
exemplu, fibroza chistică). Adiția genică poate fi aplicată și î n cancer, prin introducerea unei
copii normale a unor gene supresor tumorale, care sunt afectate de mutații.
– Corecția unor mutații patogenice, cu scopul restaurării funcției mutante, este necesară în
cazul bolilor produse prin mutații cu câștig de funcți e. Gena mutantă poate fi ''reparată '' la
nivel ADN, prin înlocuirea secvenței care conține mutația cu o secvență normală, dar și prin
inducerea modificării matisării genei, în așa fel încât exonul care conține mutația patogenă să
fie ''sărit'' în cursul pr ocesării ARNm precursor.
– Inhibiția (inactivarea) țintă a expresiei genice este utilizată, în special, în cazul bolilor
infecțioase sau în cancer, în cazul oncogenelor. Alte aplicații ar putea fi reducerea expresiei
unor gene responsabile de inducerea uno r boli autoimune sau atenuarea expresiei unor alele
produse de mutații cu câștig de funcție.
– Distrugerea țintă a unor celule specifice este aplicată în mod particular în cancer și este
obținută fie prin introducerea în celule a unor gene care codifică to xine, fie a unor gene care
induc un răspuns imunitar foarte puternic împotriva celulei modificate genetic.
În terapia genică, molecula de acid nucleic terapeutic (genă clonată, ARN sau
oligonucleotide), numită adesea transgenă, trebuie să fie transferată în celulele pacientului. În
funcție de boală, acestea sunt foarte diferite.
Unele celule și țesuturi sunt ușor accesibile (sânge, piele, mușchi, ochi), dar altele (neuroni)
sunt greu de accesat, datorită unor bariere mecanice. În ambele situații, răspunsul imun
puternic este o barieră importantă. O altă diferență majoră între celule este durata de viață. La
celulele cu viață scurtă, materialul genetic trebuie înlocuit în celulele noi. O alternativă este
introducerea moleculelor de acid nucleic în celulele s tem care generează celule cu viață
scurtă, dar acestea sunt greu de obținut și trebuie procesate ex vivo. O excepție fericită sunt
celulele măduvei osoase, ce pot fi folosite pentru terapia genică a bolilor sangvine.
În terapia genică problema esențială es te eficiența metodelor de inserție a moleculelor
terapeutice de acid nucleic și siguranța acestor proceduri. Vectorii virali au o eficiență înaltă,
dar și riscul integrării în alte gene endogene, putând altera funcția lor. Un risc suplimentar este
posibili tatea declanșării unui răspuns inflamator și imun puternic.
Există mai multe metode alternative de transfer al genelor, moleculelor ARN sau
oligonucleotidelor în interiorul celulelor pacientului. Transferul ADN în interiorul celulelor
umane, ex vivo sau in vivo, cu ajutorul unor vectori virali este denumit transducție.
Avantajele principale ale acestei metode sunt eficiența crescută a virusurilor de a infecta
celulele (dobândită în cursul evoluției), inserarea lor în genomul celulelor -gazdă
(caracteristică numai anumitor virusuri) și expresia genelor transferate (datorită prezenței unor
promotori puternici). Integrarea virusurilor în genomul celulelor -gazdă are avantajul asigurării
unei expresii de durată a genei transferate, dar adaugă și o serie de riscuri legate de sediul de
integrare.
Alteori, transferul genelor, al moleculelor ARN sau al oligonucleotidelor în interiorul
celulelor pacientului poate fi efectuat fără ajutorul unor virusuri, procedeu numit transfecție.
În asemenea cazuri nu există riscuri le gate de integrarea ADN exogen în genom ; în schimb,
eficiența transfecției este, de regulă, redusă.
În multe protocoale de terapie genică celulele -țintă sunt mai întâi extrase din organismul
pacientului, multiplicate în cultură și apoi modificate genetic, p rin transferul acidului nucleic
dorit. Astfel de celule pot fi analizate extensiv pentru identificarea acelora care sunt purtătoare
ale modificării genetice dorite (de regulă, prin utilizarea unor metode de selecție). Celulele
selectate sunt amplificate și apoi sunt injectate înapoi în corpul pacientului. Deoarece
modificarea genetică a celulelor pacientului este realizată în afara organismului, această
metodă este denumită terapie genică ex vivo. Metoda folisită pentru acele boli în care
celulele -țintă pot fi ușor accesate și pot supraviețui timp îndelungat după transplantare. Astfel
de celule sunt cele ale sistemului hematopoietic și cele tegumentare.
O metodă alternativă este cea a terapiei genice in vivo, în care transferul genic este realizat in
situ, î n interiorul organismului pacientului, de exemplu, prin injectarea într -un organ (creier,
mușchi,ochi etc.), prin intermediul unor aerosoli (plămâni) ș.a.m.d. Terapia genică in vivo
este folosită în cazul acelor boli în care celulele -țintă nu pot fi cultiv ate in vitro în număr
suficient (de exemplu, neuroni) sau în care celulele cultivate nu pot fi reimplementate eficient
în organismul pacienților. Spre deosebire de terapia genică ex vivo, în cazul terapiei in vivo
nu există nici o metodă de selecție sau de amplificare a celulelor care au fost modificate
genetic. Ca urmare, succesul acestor metode de terapie depinde în mare măsură de eficiența
procesului de transfer genic.
Țintirea unui anumit organ este un anumit obiectiv important în terapia genică. Ca o
alternativă la introducerea directă a genei în țesutul -țintă, aceasta poate fi administrată uneori
pe cale sistemică. De exemplu, injectarea în vena portă poate fi folosită ca o cale alternativă
de administrare a genei în ficat.
Pentru asigurarea unui efect terapeutic de durată este de dorit integrarea genei terapeutice în
genomul celulelor -țintă (de preferință populația de celule stem a organului afectat). În acest
fel, gena este replicată, ori de câte ori celulele -gazdă se divid.
În prezent, se folosesc câ teva tipuri de vectori virali, care asigură integrarea intracrozomială a
genei terapeutice. Majoritatea acestor virusuri se integrează însă la întâmplare în genom și, ca
urmare, diferite celule au gena inserată în poziții diferite ale unor cromozomi. Integ rarea
virusului în anumite poziții (ca, de pildă, în regiunile heterocromatinice) poate conduce la
expresia de scurtă durată, expresia redusă sau chiar absența completă a expresiei genei
terapeutice. Integrarea întâmplătoare a virusurilor în genom genereaz ă, de asemenea, riscuri
semnificative legate de alterarea expresiei unor gene endogene (inactivarea genei prin inserția
în interiorul acestora). Riscul cel mai important este însă cel al activării prin inserție a unor
proto -oncogene sau prin disrupția unor gene supresor ale creșterii tumorale, ceea ce va genera
subsecventa inițiere a proliferărilor maligne.
Sistemele de administrare a genelor în care ADN nu se integrează în interiorul genomului
celulei -gazdă, devenind epizomi extracromozomiali, nu se asocia ză cu riscurile de integrare
prezentate mai sus. În schimb, dezavantajul lor major este durata limitată a expresiei genei
transferate. Acest sistem de tratament este însă preferat în cazurile în care nu este necesar un
efect terapeutic de durată (de exempl u, terapia genică a cancerului sau a unor boli
infecțioase).
Terapia bolilor monogenice
Odată cu identificarea și caracterizarea genelor implicate în diferite acțiuni, tot mai multe boli
monogenice au devenit candidate potențiale pentru implementarea unor protocoale de terapie
genică. Primul trial clinic de terapie genică pentru o boală eredi tară a fost inițiat în anul 1990
(deficiența adenozin dezaminazei). Progresele obținute până în prezent sunt însă modeste, iar
durata efectelor terapeutice este, în general, scurtă. Principala problemă care trebuie să fie
depășită în viitor este găsirea un or metode de eliberare a genelor care să fie mult mai
eficiente. În plus, există dificultăți în abordarea terapiei genice, care depind de natura
particulară a genei și a mutației implicate în etiologia bolii. Până în prezent, 125 de trialuri
clinice, adică 7,9% din total, au avut în vedere bolile monogenice. O treime din acestea au
avut drept țintă fibroza chistică, frecvent întâlnită în Europa și în Statele Unite. Un grup de
boli monogenice tratate prin terapia genică est e reprezentat de sindroamele de
imunodeficiență.
Deși numărul trialurilor clinice folosite în terapia bolilor monogenice este relativ mic în raport
cu cele folosite în cancer, acestea au fost primele inițiate și, totodată, cele care au adus până în
prezent cele mai spectaculoase rezultate t erapeutice. S -a observat că bolile recesive sunt, în
mod particular, candidate ideale pentru terapia genică. În aceste boli chiar și obținerea unui
nivel relativ modest al proteinei absente poate asocia beneficii clinice evidente. În schimb,
bolile dominan te în care boala este prezentă, în ciuda existenței unei alele normale, ridică mai
multe probleme întrucât este necesară atingerea dozei corecte a proteinei mutante (bolile prin
haploinsuficiență) sau contracararea efectelor negative ale genei mutante (bol i prin mutații cu
efect dominant negativ).
Fibroza chistică (FC). Protocoalele de terapie genică utilizate până în prezent se bazează pe
administrarea, cu ajutorul unui bronhoscop sau cu ajutorul aerosolilor, a unui vector
adenoviral ori a unor lipozomi ca re conțin o minigenă CFTR. Primele încercări au debutat în
anul 1993, iar rezultatele obținute inițial au fost sub așteptări. În cazul administrării cu
ajutorul adenovirusurilor (AAV), principala problemă era răspunsul imun (dezvoltarea unei
pneumonii inte rstițiale care punea chiar probleme vitale). În schimb, administrarea cu ajutorul
lipozomilor, deși sigură, avea o eficacitate redusă a transferului genei în celulele epiteliale. În
anul 2009, în urma mai multor cercetări, s -a obținut, prin mutații repetat e ale AAV, o variantă
cu proprietăți imbunătățite, în sensul unei creșteri a abilității de a infecta celulele pulmonare,
repetării transferului genei CFTR și al unei toleranțe mai bune din partea sistemului imun al
gazdei. Rezultatele observate în culturi celulare au indicat o vindecare totală a celulelor
provenite de la un pacient cu fibroză chistică. La începutul anului 2010, s -a anunțat obținerea
unui lentivirus (SIV) cu un înveliș proteic de la virusul Sendai, care are o eficiență mai mare a
transducție i genei CFTR în celulele epiteliului pulmonar; expresia durează 15 luni și
readministrarea intranazală este fezabilă. Ca urmare, efectele terapeutice sunt relevante clinic
pentru pacienții cu fibroză chistică. Reușitele experimentale au creat chiar și sper anța utilizării
intrauterine a terapiei genice în cazul fibrozei chistice. [ 4]
CAPITOLUL V
ANTIBIOTICELE
5.1 Date generale
Deși antibioticele au fost utilizate în cantități mari de câteva decenii, până de curând existența
acestor substanțe în mediul înconjurător a primit prea puțină importanță. Abia în ultimii ani a
fost întreprinsă o investigare mai complexă a substanțelor an tibiotice pentru a permite o
evaluare a riscurilor asupra mediului. Un antibiotic într -un sens mai larg este un agent
chimioterapeutic care inhibă sau elimină creșterea microorganismelor, cum ar fi bacteriile,
ciupercile sau protozoarele. Alți termeni care sunt adesea folosiți sunt chimioterapicele sau
antimicrobienele, cu toate acestea, acești termeni nu sunt sinonimi. De exemplu,
antimicrobienele pot fi, de asemenea, eficiente împotriva virusurilor. Expresia
„chimioterapeutică” se referă la compuși utilizați pentru tratamentul bolilor care omoară
celulele, în special microorganisme sau celule canceroase. În utilizarea populară, se referă
adesea la medicamente anti -neoplazice utilizate pentru tratarea cancerului. Termenul
chimioterapeutic se poate ref eri, de asemenea, la antibiotice (''chimioterapie antibacteriană'').
Termenul de antibiotic s -a referit inițial la orice agent cu activitate biologică împotriva
organismelor vii ; cu toate acestea, ''antibiotic'' se referă acum la substanțe cu activitate
antibacteriană, anti -fungică sau antiparazitară. [56] Antibioticele pot fi grupate fie prin
structura lor chimică, fie prin mecanismul de acțiune. Sunt un grup divers de substanțe
chimice care poate fi împărțit în diferite subgrupuri. Adesea, sunt molecule c ompl exe care pot
avea funcționalități diferite în cadrul aceleiași molecule. Prin urmare, în condiții diferite de
pH, antibioticele pot fi neutre, cationice, anionice sau amfionice. [57]
Problema concentrațiilor naturale de antibiotice este importantă pentr u evaluarea riscului de
antibiotice. Mai multe antibiotice cum ar fi unele ß -lactamine, streptomicine, aminoglicozide
și altele sunt produse de bacteriile din sol. Grupul de actinomicete include multe bacterii din
sol, cum ar fi Streptomicetele . Streptomicetele produc antibiotice. Activitatea antibioticelor
din probele locale de sol este variabilă și necesită examinarea mai multor probe pentru a găsi
câteva care produc zone de inhibiție. [58]
Antibioticele sunt utilizate pe scară largă în medicina umană și veterinară, precum și în
acvacultură, în scopul prevenirii (profilaxie) sau tratarea infecțiilor microbiene. Câteva sute de
substanțe diferite, antibiotice și antimicotice sunt utilizate la om și în medicina veterinară, de
exemplu mai mult de 250 în Germania. [56] Modelele de utilizare pot fi diferite în diferite
țări.[59] În SUA, de exemplu, utilizarea streptomicinei în pomicultură este răspândită, în timp
ce utilizarea sa în acest scop este interzisă în alte țări, cum ar fi Germania. Wise (2002) a
estimat consumul de antibiotice în întreaga lume se situează între 100.000 și 200.000 tone pe
an. În 1996, în UE au fost utilizate aproximativ 10.200 de tone de antibiotice, din care
aproximativ 50% au fost aplicate în medicina veterin ară și ca promotori de creștere. Conform
datelor furnizate de Federația Europeană de Sănătate Animală [60], în 19 99 existau în total
13.216 tone de antibiotice utilizate în Uniunea Europeană și Elveția, 65% dintre ele fiind
aplicate în medicina umană. [61]
5.1.1 Clasificarea antibioticelor și chimioterapicelor antimicrobiene , în
functie de structura chimică
I. Antibiotice:
AB betalactamine
a. Dibactami: – Penami (peniciline)
– Peniciline naturale
– Peniciline antista filococice
– Aminopeniciline
– Carboxipeniciline
– Ureidopeniciline
– Amidinopeniciline
– Penemi -Carbapenemi
– Cefeme( cefalosporine)
– Carbacefeme
b. Monobactami
c.Tribactami
AB aminoglicozide – streptomicina, kanamicina, gentamicina, spectinomicina, neomicina,
tobramicina, amikacina, netilmicina.
AB macrolide – eritromicina, oleandomicina, spiramicin a, roxitromicina, diritromicina,
claritromicina, fluritromicina, azitromicina, sinergistine.
AB lincomocine(lincosamide) – lincomicina, clindamicina
AB glicopeptidice -vancomicina, teicoplanina, daptomicina.
AB cu spectru larg -tetraciclinele, amfenicoli.
Grupul rifampicinei
AB polipeptidice -polimixine, bacitracina
II. Chimioterapice antimicrobiene:
a. Chinolone și fluorochinolone ;
b. Sulfamide antibacteriene;
c. Diaminopirimidine: trimetoprim;
d. Derivați de nitrofuran;
e. Derivați de chinolină;
f. Derivați de imodazol;
g. Derivați de formaldehidă;
h. Alte structuri: acid mandelic, dapsona, mesalazina;
i. Alte antimicrobiene: linezolid, spectinomicină, fosfomicină, acid fusidic; [62]
5.1.2 Mecanismul de acțiune
Antibioticele și chimioterapicele antimicrobiene pot acționa asupra microorganismelor
patogene, bactericid sau bacteriostatic.
Acțiunea bactericidă constă în intoxicarea ireversibilă a germenilor microbieni la
concentrațiile minime inhibitorii( sau ceva mai mari) de către chimioterapice.
Acțiunea bactericidă poate fi:
-bactericidă absolută -afectează germenii atât in stare de repaus cât și în faza de
multiplicare:polimixinele;
-bactericid degenerativă -afectează germenii numai în faza de multiplicare: peniciline,
cefalosporin e, aminoglicozide.
Acțiunea bacteriostatică constă în înhibarea multiplicării germenilor. Germenii pot fi omorâti
in vivo ca urmare a intervenției mecanismelor de apărare a organismului. Au mecanism de
acțiune bacteriostatic: sulfamidele, tetraciclinele, c loramfenicolul, macrolidele, lincosamidele.
Aminoglicozidele și fluorochinolonele pot avea și un efect postantibiotic, antimicrobian,
caracterizat prin menținerea efectului la concentrații minime, subinhibitorii( acest efect este
datorat împiedicării sinte zei proteinelor bacteriene și permite administrarea acestor substanțe
la intervale de timp mai mari decât cele determinate de concentrația plasmatică eficace).
Mecanismele de acțiune la nivelul celulei bacteriene sunt următoarele:
a. acțiune asupra peretelui celular(inhibarea sintezei peptoglicanului care intră în constituția
peretelui bacterian): betalactamine, vancomicină;
b. acțiune asupra membranei citoplasmatice ( modifică bariera osmotică a membranei
bacteriilor gram -negativ, care pierd constit uienți citoplasmatici și mor) -polimixinele;
c. inhibarea sintezei proteice ribozomale prin legarea de subunitățile:
-30S: tetracicline;
-50S: cloramfenicolul, macrolide, lincosamide;
-interferența dintre subunitățile 30S și 50S: aminoglicozide;
d. acțiune la nivelul aparatului nuclear prin:
-inhibarea ARN polimerazei ADN -dependentă și blocarea sintezei ARN – mesager urmată de
scăderea sintezei proteinelor ribozomale: rifampicina;
-inhibarea ADN girazei bacteriene, enzimă care supraspiralizează ADN, blocând a stfel
diviziunea celulară: acidul nalidixic și fluorochinolonele;
-acțiune competitivă cu metaboliți omologi: cortimoxazol;
-efect toxic asupra ADN: metronidazol.
Antibioticele și chimioterapicele cu efect bacteriostatic la doze terapeutice sunt utilizate în:
-infecții ușoare sau medii;
-bolile ciclice cu tendință spontană la vindecare, deoarece după oprirea multiplicării
bacteriilor organismul declanșează mecanismele proprii de apărare antiinfecțioasă.
Antibioticele bactericide se utilizează în următoarele situații:
-infecții bacteriene cu focare greu sterilizabile( endocardite, osteomielite, tromboflebite,
tuberculoză);
-infecții bacteriene cronice sau cu tendință la cronicizare(angiocolite, pielonefrite,
metroanexite, etc);
-pacienți imunodeprimați. [62]
5.1.3 Farmacoterapia antibioticelor și c himioterapicelor antimicrobiene
Administrarea antibioticelor și chimioterapicelor trebuie să țină cont de următoarele aspecte:
a. Alegerea medicamentelor se face în funcție de tipul de gravitate al infecției:
-în infecții acute sau cronice este necesară identificarea agentului patogen pe baza
antibiogramei ;
-în urgențe( meningită, septicemii), antibiograma se instituie înaintea rezultatelor de laborator
pe baza indicațiilor date de semnele clinice, conștiințele privind sensibilitatea agenților
patogeni întâlniți în mediul unde a apărut infecția, date privind frecvența localizării infecțiilor
acute produse de diverși agenți patogeni.
b. De regulă pentru tratarea unor infecții există antibiotice sau chimioterapice de primă
alegere(de elecție) și de alternativă dacă medicamentul de elecție nu este suportat de bolnav(
de exemplu în cazul existenței unei alergii la betalactamine se aleg medicamente de
alternativă: macrolide sau tetracicline).
c.Se pot folosi antibiotic e și chimioterapice bactericide sau bacteriostatice. Bactericidele sunt
indicate în:
-infecții grave cu localizare greu accesibile ;
-la persoane imunodeprimate ca urmare a unor boli(HIV), sau ca urmare a unor
tratamente(corticosteroizi, antitumorale, radio terapie);
-la bolnavi cu organism debilitat( bătrâni, nou năsuți, prematuri);
-infecții cu evoluție subacută.
Bacteriostaticele se utilizează în:
-infecții ușoare și medii ;
-la persoane cu sistem imun competent.
d. Dozele se aleg în funcție de localizarea infecției, agentul antimicrobian și sensibilitatea lui
la antibiotice și chimioterapice, reacțiile adverse ale medicamentului, particulariitățile
bolnavului( insuficiență renală, hepatică, etc) ;
e. Se urmărește realizarea unei concentrații optime de antibi otice și chimioterapice la nivelul
focarului infecțios, ținând cont de sistemul imun al organismului tratat(competent sau
deficitar) și de localizarea infecției. Atenție deosebită se acordă în cazul organismelor
imunodeprimate la care este necesară realiza rea unei concentrații mari de antibiotice sau
chimioterapice și infecțiilor cu localizare meningeală și în țesuturi cu vascularizație
redusă(ochi, prostată). De exemplu, în meningite bacteriene, cloramfenicolul traversează
bariera hematoencefalică, penicil inele antistafilococice, clindamicina și lincomicina difuzează
la nivelul oaselor și sunt utile în osteomielite stafilococice.
f. Ph -ul optim la locul infecției este influențat de proprietățile fizico -chimice ale unei
substanțe. De exemplu penicilinele, ac idul nalidixic, nitrofurantoina, sunt eficace la ph ușor
acid 5,0 -6,5; aminoglicozidele, macrolidele și lincosamidele sunt eficace la ph alcalin 7,5 -8,5.
g. Calea de administrare și forma farmaceutică sunt condiționate de localizarea și gravitatea
infecție i, de particularitățile farmacocinetice ale substanței, de starea fiziologică sau
patologică a bolnavului. Calea de administrare orală este cea mai comodă și este utilizată în
cazul infecțiilor ușoare și medii. În acest caz sunt preferate antibioticele și chimioterapicele cu
biodisponibilitate orală bună cum ar fi: aminopeniciline, macrolide, tetracicline din generația
a doua, fluorochinolone etc. În infecții severe( septicemii, endocardite, abcese cerebrale)
administrarea se face injectabil. De asemenea an tibioticele și chimioterapicele cu
biodisponibilitate orală mică: aminoglicozide, vancomicină, cefalosporine din generația II și
III, imipenem, aztreonam se administrează parenteral. În cazul administrării parenterale se
ține seama de incompatibilitățile c are pot apărea la asocierea in vitro a doua substanțe
medicamentoase.
h. Durata tratamentului este influențată de situația clinică. De exemplu în gonoree
necomplicată se poate administra o singură doză de spectinomicină, 2g i.m iar în osteomielite
stafiloc ocice durata tratamentului este de 6 săptămâni.
i. Utilizarea antibioticelor și chimioterapicelor în sarcină se face cu prudență, deoarece multe
substanțe traversează bariera placentară realizând concentrații mari în lichidul fetal. Este
contraindicată ad ministrarea de:
-aminoglicozide( streptomicină și kanamicină), datorită potențialului nefrotoxic și ototoxic ;
-tetracicline, deoarece se acumulează în oase și mugurii dentari, producând tulburări de
creștere și colorarea dinților ; pentru mamă sunt hepatotoxice;
-amfenicoli, deoarece pot produce leucopenie reversibilă, aplazie medulară ireversibilă la făt
și sindrom gri la nou -născut;
-fluorochinolonele, deoarece în studiile efectuate pe animale de laborator s -a dovedit
acumularea l or în cartilajele de creștere, ceea ce antrenează artropatii ireversibile;
-sulfamidele antimicrobiene, în primul trimestru de sarcină s -au dovedit a fi teratogene la
animale de laborator, iar în ultimul trimestru pot produce hiperbilirubinemie cu icter nu clear
și hemoliză la nou -născuți cu deficit în glucozo 6 fosfat dehidrogenază.
j. Utilizarea antibioticelor și chimioterapicelor local(topic) este utilă în infecții cutanate și
dermatoze infecțioase, arsuri infectate, infecții bacteriene ale căilor aeriene superioare ( sub
formă de aerosoli), instilații locale. Pentru a putea fi utilizat topic, un antibiotic sau
chimioterapic trebuie sa îndeplinească anumite condiții:
-să nu fie iritant pentru țesuturi;
-să nu prezinte capacitate alergizantă mare;
-rezisten ța să se instaleze rar;
-spectrul antimicrobian să fie cât mai larg ;
-să nu se absoarbă sistemic după aplicarea locală pe piele sau pe mucoase . [62]
5.2 Antibioticele și cazuri de interacțiuni cu genele
5.2.1 Rezistența la antibiotice și chimioterapice
Rezistența microbiană reprezintă capacitatea microorganismelor patogene de a se
menține în stare activă și de a se multiplica în prezența antibioticelor si chimioterapicelor.
Rezistența poate fi:
a.Naturală – este determinată genetic si reprezintă capacitat ea microorganismelor de a
se multiplica si dezvolta în prezența unui antibiotic sau chimioterapic.
Exemplu: bacilul Koch a fost si a rămas rezistent la benzilpenicilina.
b.Dobandită – poate fi naturală genetică si negenetică.
Rezistența dobandită genetic, c onstă în apariția și selectarea de germeni rezistenți la
antibiotic si chimioterapic. Poate să apară prin transfer cromozomial (fenomen mai puțin
frecvent) sau prin transfer extracromozomial, prin achiziție de plasmide (cel mai frecvent
mecanis m de apariț ie a rezistenței).
Rezistența prin transfer cromozomial are următoarele caracteristici:
-mutațiile cromozomiale survin spontan sau sunt induse de agenți mutageni
-mutațiile în genomul bacterian apar prin schimbarea unui singur nucleotid din
molecula de ADN , sau prin transpoziția unor secvențe mai mari de nucleotide.
-se poate instala brusc, (independent de concentrația antibioticului sau
chimioterapicului) sau lent, prin mutații succesive (fenomen dependent de concentrația
antibioticului sau chimioterapicu lui).
Rezistența prin transfer extracronozomial are urmatoarele caracteristici:
-transmiterea se face prin intermediul plasmidelor, care sunt elemente
extracromozomiale (molecule circulante de ADN bacterian autonom) prezente in citoplasma
bacteriana.
Transniterea plasmidelor de la o ba cterie la alta se face prin :
-conjugare – fenomen frecvent pentru bacili gram -negativi (E. Coli, Serratia,
Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas)
-traducere prin intermediul bacteriofagilor (Staphilococus aureus si unii colib acili)
-transformare (materialul plasmidic este preluat direct de la alt microorganism, in
urma distrugerii unei bacterii)
Rezistența mediată plasmatic apare în următoarele grupe de AB si CT beta lactamine
(peniciline, cefalosporine), macrolide tip eritr omicina si lincosamide, aminoglicozide,
antibiotice cu spectru larg, sulfamide antibacteriene si trimetroprim.
Caracterul rezistenței poate fi incrucisat între grupe chimice diferite de AB si CT.
Rezistența de natură negenetică este dată de starea metaboli că inactivă (ex.rezistența
bacteriilor sub forma de persisteri , care pot supraviețui in prezența chimioterapicelor
bactericide, deși sunt sensibile la acestea (tuberculoza, lepra, bruceloza, infecții stafilococice)
si de pierderea structurii țintă pentru un medicament (ex. trecerea bacteriilor in forma L
(protoblaști) lipsite de perete celular care pot apare in cursul tratamentului cu peniciline sau
cefalosporine).
Mecanismele biochimice ale rezistenței naturale si dobandite sunt urmatoarele:
a.Producer ea de enzime care inactivează AB si CT – cele mai numeroase enzime
inactivatoare sunt betalactamazele care desfac inelul betalactam al betalactamazelor,
anulandu -le astfel acțiunea antibacteriană. Betalactamazele pot fi:
Exoenzime secretate de coci gram poz itiv (stafilococ), bacili gram pozitiv, coci
gram negativ (inactivează penicilinele naturale, aminopenicilinele, carboxipenicilinele,
ureidopenicilinele si cefalosporinele din generatia I).
Endoenzime produse de bacili gram negativ si care se împart in 6 clase:
Clasa I secretată de piocianic, Enterobacter, Serrata;
Clasele II, III, IV, V – secretate de majoritatea celorlanți bacili gram negativ aerobi;
Clasa VI – secretată de Bacteroide fragilis.
b.Scăderea permeabilitații bacteriei pentru antibiotic la nivelul peretelui bacterian sau
membranei citoplasmatice;
c.Producerea de enzime modificate (polimeraze, transpeptidaze, carboxipeptidaze),
care limiteaza sau anuleaza acțiunea antibacteriană a anti bioticului exercitată la nivelul
enzimei țintă.
d.Alterarea țintei extracelulare (prin modificarea proteinelor ribozomale);
e.Creșterea sintezei de APAB, care anulează efectul de inhibare competitivă a
sulfamidelor. [62]
5.2.2 Transferul d e gene
Transferul de gene orizontal este schimbul lateral de gene î ntre organisme unicelulare și/ sau
multicelulare. Spre deosebire de transferul genic vertical, adică, între generații, HGT permite
transferul secvențelor genetice între speciile îndepărtate mediate de obicei prin transformare,
transducție și transfer conjugal sau cu agenți de transfer de gene specifici. [63,64 ]
Transferul de gene orizontal a fost demonstrat pentru aproape toate grupările filogenetice din
cele trei domenii ale vieții ca factor crucial în evoluția diferitelor organisme [65-67], inclusiv
plante [68,69 ], virusuri [70], arhaea [71], ciuperci [72,73 ] și animale [74]. În timp ce evoluția
eucariotelor este determinată în mare parte prin moștenire verticală, forma predominantă de
evoluție în rândul bacteriilor și arhaea este HGT, a căror rată este comparabilă cu rata mutației
punctuale, depășind rata de duplicare a genelor [75]. Astfel, pentru aceste două domenii, HGT
este o modalitate esențială pentru diversificarea genomului și achizițiile de funcții noi pentru a
supraviețui sub presiunea selecției naturale și pentru a se reproduce. Prin urmare, HGT este
motorul principal al evoluției microbiene și al ecologiei. Bacteriile au dezvoltat mai multe
instrumente genetice naturale pentru a schimba materialul genetic între tulpini, specii, genuri
și chiar taxoni mai mari. În timp ce fenomenul HGT poate fi întâln it în aproape orice
ecosistem, punctul de vedere al prezentei analize este HGT în intestinul uman. Acest lucru
este completat de o contribuție potențială la schimbarea obiceiurilor alimentare și a stilului de
viață la HGT.
Unul dintre evenimentele HGT bine documentate pe care omenirea le -a cunoscut în istoria sa
este consecința consumului plin de antibiotice, ceea ce a dus la diseminarea pe scară largă a
genelor de rezistență la antibiotice între multe bacterii [76]. Aceste mecanisme le -au permis să
obțină protecție împotriva presiunii de selecție a antibioticelor pentru a permite supraviețuirea
și proliferarea cu succes. În general, HGT determină extinderea familiilor de proteine din
bacterii și arhaea pentru a face față i mpactului asupra mediului și impactului antropic impus
acestora. [77]
Pe scurt, mecanismele de HGT includ următoarele:
– Transformarea: Modificarea genetică a celulei datorită absorbției de material genetic străin.
Competența naturală și transformarea sunt relativ frecvente în bacterii și, într -o oarecare
măsură, în arhaea, dar nu și în eucariote. Transformarea artificială este adesea folosită în
tehnologia recombinantă pentru cercetare, în scopuri industriale sau medicale.
– Transducția: Când ADN -ul microbian este transferat de la o bacterie la alta printr -un
intermediar viral.
– Conjugarea: Transferul ADN -ului printr -un element conjugativ [plasmidă, transpozon, ICE
sau alte elemente genetice mobile (MGEs)] de la un donator la o celulă receptoare în timpul
atingerii de la celulă la celulă. [78,79 ]
– Agenți de transfer de gene: Elemente similare cu virusul codificate de gazdă, găsite în
bacteriile Alphaproteo, bacteriile Rhodo, și alte câteva bacterii.
În general, se acceptă faptul că HGT prin agenții d e transducție, conjugare, și transfer de gene
este mai eficient decât transformarea prin ADN gol, deoarece în primele mecanisme ADN -ul
este protejat de degradare. Cu ajutorul HGT, genele întregi și secvențele funcționale pot fi
încorporate în genomul unui destinatar. Deși cele mai cunoscute exemple se numără printre
bacterii și arhaea, ele pot fi găsite și în Eukarya, inclusiv primate și oameni. [80] Astfel, HGT
a apărut și continuă să apară, la o scară considerabilă, în toate cele trei domenii ale vieții, ș i
este probabil să fie unul dintre factorii importanți care au contribuit la diversificarea în timpul
evoluției. Spre deosebire de evoluție prin duplicări și mutații genice, care sunt procese lente și
progresive, HGT permite o achiziție rapidă a unei noi f uncții importante pentru specii să
treacă prin bariera de selecție naturală și să se reproducă cu succes.
HGT în intestin
Deoarece intestinul este o nișă colonizată în principal de o multitudine de specii microbiene,
este logic să presupunem că genomii din arhaea metanogenă din intestin și -au dobândit
capacitatea de a supraviețui și proliferează în acest mediu prin interdomeniul HGT de la
omologul microbian care domină această nișă. Recent, contri buția HGT la repertoriul genic
într-un metanogen comensal ada ptat la intestin Methanobrevibacter smithii, care este cel mai
bogat arheon din intestinul brut uman, a fost evaluat . [81] Un sondaj filogenetic bazat pe
arborele genomului la un nivel larg al genelor putative, dobândit probabil ca urmare a HGT, a
stabilit că peste 15% din secvențele de codificare din M. smithii pot fi deduse ca de origine
bacteriană.Genele dobândite lateral contribuie în mare măsură la funcțiile de suprafață și
codifică glicoziltransferazele și proteinele asemănătoare adezinei, care, de as emenea, pot
acționa ca factori de virulență la agenți patogeni. În plus, mai mulți transportatori importanți
ABC, în special transportorii de metal sunt potențial de origine microbiană. Metale precum
zincul, de exemplu, sunt importante pentru creșterea bac teriilor, și există și o concurență
puternică pentru aceasta și între microbiota intestinală. [82] Astfel, genele microbiene
dobândite de acest arheon au contribuit la adaptarea gazdei, permițând o varietate extinsă de
structuri de suprafață și îmbunătățirea eficienței absorbției ionilor metalici în nișa competitivă
a intestinului. Luate împreună, adapt area M. smithii la nișă a implicat achiziția de gene
bacteriene în genomul său pentru a -și regla stilul de viață. [83]
Majoritatea cunoștințelor noastre despre HGT au fost obținute din studiile in vitro. În cazul în
care caracteristicile sunt substanțial diferite, în special în intestin, este datorită microbiotei
extrem de dense și diverse. Multitudinea de funcții include suprimarea așezării de către
patobionți, degradarea componentelor alimentare și prod use in situ, producerea factorilor
nutritivi, modularea și menținerea unei imunități funcționale a mucoasei, sprijinirea
integrității joncțiunii inter epiteliale, și contribuția la homeostazia epitelială intestinală.
Recent, au fost raportate dovezi ale schimbului de ADN crescut între speciile Bacteroidales
din intestinul uman. [84]Genele care sunt schimbate intens între aceste spec ii codifică
capacitatea proteinel or și modificări multiple ale unor cicluri ca expresia genelor.
Componentele Fimbrii pot îmbunătăți atașamentul, utilizarea de noi substraturi crește baza
nutritivă, și secreția de molecule antimicrobiene poate conferi un avantaj competitiv în nișa
ecologi că. Conținutul genetic al „transferomului” sugerează că transferul genei de la membrii
adaptați cu succes al unui ecosistem conferă proprietăți utile beneficiarilor, sporindu -le
capacitatea și conferindu -le un avantaj competitiv în ecosistemul microbian in testinal.
Omul și consumerismul cultivat de viață sunt principalii beneficiari de antibiotice, sporind
astfel procesele HGT. [79,85-88]De fapt, microbiota intestinală reprezintă un habitat major al
genelor de rezistență la antibiotice [89-92],numit astfel și „intestin rezistente ”, în cadru
„intestin mobilom''. [93-95] Interesant și oarecum alarmant este faptul că , frecvențele ridicate
ale HGT la meconiul sugarilor și probele fecale timpurii au fost raportate recent. [96]
Bacteriile comensale sensibile la antibiotice pot dobândi rezistență la antibiotice prin mutații
în genele țintă sau dobândirea genelor de rezistență de către HGT, în principal prin transferul
mediat de MGE -uri. Transferul de marfă genetică mediat de MGE de la un org anism la altul
contribuie în mare măsură la diseminarea genelor de rezistență la antibiotice, deoarece poate
avea loc între specii strânse sau fără legătură și în medii diversificate, inclusiv intestinul
animal și uman. [97-102]
În special,din punct de ved ere taxonomic procariotele îndepărtate ale microbiomului intestinal
ar putea împărții rezervorul cu cele mai apropiate gene de rezistență antimicrobiană. [103]
Rolul bacteriofagilor, plasmidelor, transpozonilor conjugați, și integronelor în transferul
genelor de către patobionți enterici patogeni umani și dobândirea ulterioară a patogenității a
indicat, de asemenea, HGT ca un pas important în extinderea trăsăturilor de virulență și a
rezistenței la antibiotice. [104-106] Mai mult, existența u nor transferuri antice și, eventual,
recente ale genelor de rezistență la antibiotice de la actinobacterii producătoare de antibiotice
la proteobacteriile patogene au fost descrise în ultimul timp. [107]
Mediul luminal intestinal in vivo poate încuraja inci dența transferului și poate spori
moștenirea constantă a MGE -urilor,chiar și î n lipsa influenței antibiotice. [108,109 ]
Explorarea microcosmosului solului, reprezentată de Escherichia c oli ca un donator cu o
plasmidă conjugativă genetică mare RP4luc și prezența sau absența viermilor de pământ, a
furnizat dovezi directe că trecerea intestinului este o condiție necesară pentru transferul
plasmidelor în microbiota solului. [110] Surprinzător, ratele de transfer de plasmide au fost
chiar mai mari decât se poa te obține în experimentele de împerechere cu filtru, sugerând că
ritmul HGT în natură ar putea fi mai mare decât laboratorul evaluat. Dacă MGE -urile din sol
pot pătrunde în intestinul viermilor de pământ, atunci se pot depune în intestinul creaturii care
se află în lanțul alimentar, de exemplu, cârtițe și păsări.
Un exemplu suplimentar de HGT îmbunătățit în mediul intestinal a fost demonstrat în
ciliat. [111] Ciliații sunt comuni în multe ecosisteme acvatice și în rumen. Vacuolele lor
alimentare sunt formate din fagocitoză și își urmează calea prin celulă, imitând astfel un tract
enteric primitiv. Ciliaț ii pot spori ritmul transferului conjugal între tulpinile de E. coli cu două
ordine de mărime, iar calea sugerată implicată este reprezentată de acumularea de bacterii în
vezicule care permit HGT extins. [111] Această cale poate spori difuzarea rezistenței la
antibiotice în comunitățile bacteriene. [112] Intestinul insectelor poate fi considerat, de
asemenea, ca un loc potrivit pentru HGT. De exemplu, ''ratele de transfer de plasmide
conjugative între Salmonella enterica Newport și E.coli în intestinul celui mai mic gândac de
vierme sunt de două ori mai mari ca magnitudine comparat cu filtru de legare'' .[113]
5.2.3 Tetraciclină – expresia genică inductibi lă și ștergerea genelor în
Candida albicans
Analiza genetică a Candida albicans, principalul agent patogen fungic al omului, este
împiedicată de genom său diploid, absența unui ciclu sexual normal și o utilizare a codonului
standard. Deși în ultimii ani au fost dezvoltate metode eficiente de studiu a funcției genice,
sistemele de control al expresiei genice în C. albicans sunt l imitate. Am stabilit un sistem care
permite inducerea expresiei genice în C. albicans prin adăugarea de tetraciclină (Tet).
Infuzând versiunile modificate genetic ale represo rului Tet convertit din Escherichia coli și
domeniul de activare a transcr ierii pr oteinei Gal4 din Saccharomyces cerevisiae, a C.
albicans – un transactivator Tet dependent adaptat convertit (rtTA), a fost creat pentru a
exprima constituția ADH1 sau a promotorului OP4 specific opac . Pentru a monitoriza
expresia genelor T et-inductibile, g ena reporter ca GPF a fost plasată sub controlul unui
promotor dependent de Tet, obținut prin contopirea unui promotor minim din C. albicans la
șapte copii ale secvenței operatorului Tet. Fluorescența celulelor a demonstrat că expresia
genelor ar putea fi i ndusă în mod eficient prin adăugarea de doxiciclină în celule de drojdie,
hiphale și opace de C.albicans. Apoi, sistemul de expresie genică inductibilă a fost folosit
pentru a manipula comportamentul diferitelor forme de creștere ale C.albicans. Expresia
indusă de Tet a unei alele CDC42 dominant -negative a condus la oprirea creșterii ca celule
mari, multinucleate.
Creșterea filamentoasă a fost inhibată eficient în toate condițiile de promovare a creșterii
hipale testate prin expresia Tet -inductibilă a repre sorului NRG1. Expresia indusă de Tet
a genei MTLa 1 în celulele opace ale unei tulpini MTL α a forțat celulele să treacă la faza albă,
în timp ce expresia indusă de Tet a factorului de transcripție MTLa 2 a indus frotarea.
Când gena ecaFLP, care codifică reco mbinaza FLP specifică site -ului, a fost plasată sub
controlul promotorului dependent de Tet, ștergerea Tet -inductibilă a genelor care au fost
flancate de secvențele țintă FLP s -au obținut cu o eficiență ridicată pentru a genera mutanți
nuli condiționali. Î n combinație cu markerul de selecție dominant caSAT1, sistemul de
expresie genică inductibilă a fost aplicat și la tulpinile de tip sălbatic de C. albicans, incluzând
izolații clinice rezistente la medicamente le care a u supraexprimat pompele de flux multidrog
MDR1, CDR1 și CDR2. Prin urmare, acest sistem, permite o creștere independentă de mediu,
a expresiei Tet-inductibilă și ștergerea genelor în C.albicans și oferă o metodă convenabilă,
instrument nou versatil pentru s tudiere a funcției genice și manipularea comportamentul ui
celular în acest model de ciupercă patogenă.
Drojdia Candida albicans este un membru al microflorei normale pe suprafețele mucoase ale
tractului gastro -intestinal și urogenitar la persoanele sănătoa se, dar poate provoca, de
asemenea, severe infecții, în special la pacienții imunocompromiși. Analiza moleculară a C.
albicans este împiedicată de genomul său diploid, absența unui ciclu sexual normal, și o
utilizare a codonului standard. Cu toate acestea, au fost dezvoltate tehnici în ultimii ani
pentru o manipulare genetică eficientă a C.albicans, care ne -a avansat considerabil
cunoștințele despre biologia și mecanismele de patogenitate ale acestei ciuperci. [114,115 ]
Sistemele care permit cercetătorilor să controleze experimental expresia genelor specifice
dintr -un organism în studiu sunt foarte valoroase pentru analiza funcției genice și, de
asemenea, pentru manipularea comportamentului organismului. Câțiva promotori reglabili
sunt angajați de investigatori pentru a induce sau reprima expresia genelor în C. albicans, de
exemplu, promotorul PCK1, promotorul MAL2, și promotorul MET3, care sunt reprimați prin
glucoză sau metionină / cisteină .[116,117,118 ] Când o genă țintă este plasată sub controlul
unuia dintre acești promotori, expresia sa poate fi pornită sau oprită prin incubarea celulelor
C. albicans în inducerea corespunzătoare sau reprimarea mediilor de creștere. Cu toate
acestea, în multe scopuri, este de dorit să se controleze expresia genelor fără necesitatea
schimbării mediului de creștere, ci pur și simplu prin adăugarea unei induceri sau reprimarea
substanței care în sine nu afectează metabolismul. Sistemul tetraciclină (Tet) permite un
asemenea mediu de creștere independent de controlul expresiei genice de către o moleculă
mică care se poate difuza cu ușurință în celule. Se bazează pe proteina represoare a
tetraciclinei (TetR) din Escherichia coli, care se leagă de secvența sa țintă, operatorul tet
(tetO), în regiunea promotoare a genelor de rezistență la tetraciclină pentru reprimarea
expresiei în absența tetraciclinei. Când este prezent, tetraciclina se leagă cu afinitate ridicată
de TetR, rezultând disocierea represorului de promotor și expresia genelor Tet[119]. Sistemul
bacterian Tet a fost adaptat pentru utilizarea în celulele eucariote prin fuzionarea domeniului
de activare a unui factor de transcripție c u TetR, transformându -l astfel î ntr-o tetraciclină
activator transcripțional controlat (tTA) [120].O genă care este plasată sub controlul unui
promotor minim în care toate secvențele de activare au fost eliminate și înlocuite prin
secvența tetO vor fi exprimate în celulele care produc tTA, care în absența tetraciclinei se
leagă de tetO pentru a permite transcrierea. Adăugarea de tetraciclină la celule are ca rezultat
disocierea activatorului de la promotor, oprind astfel expresia genică. Acest sistem Tet -Off a
fost stabilit și în C. albicans și folosit eficie nt controlează expresia genelor specifice.
[121,122,123 ]
Promotorii reglabili menționați mai sus sunt de obicei folosiți pentru a reduce expresia
genelor, în special a genelor esențiale care nu pot fi șterse din genom, pentru a obține
informații despre funcția genelor prin epuizarea produsului genic din celule. [117,122] Dar de
o importanță egală pentru abordarea întrebărilor biologice este posibilitatea de a induce
expresia genelor specifice în condiții în care în mod normal nu sunt exprimate. Sistemul Tet –
Off este mai puțin potrivit pentru acest scop, deoarec e inducerea genelor ar necesita
îndepărtarea eficientă de tetraciclină din celulele cultivate în prezența medicamentului, ceea
ce nu este întotdeauna posibil. În plus, pentru a păstra genele ale căror produse au un efect
toxic asupra celulelor într-o stare reprimată înainte de inducție, tetraciclina ar trebui să fie
prezentă în concentrații suficiente tot timpul după ce s-au construit tulpini corespunzătoare.
Remarcabil, în anumiți aminoacizi s -a constatat că schimburile din TetR au inversat
dependența sa de tetraciclină, adică, represorul Tet invers (rTetR) se leagă la tetO numai în
prezența tetraciclinei, nu în absența acesteia. [124] Fuziunea rTetR într -un domeniu de activare
a transcrierii a generat un transactivator controlat cu tetraciclină inversă (rtTA) care poate fi
utilizat pentru a induce expresia genelor într -o mare varietate de celule eucariote prin
adăugarea derivatului de tetraciclină, doxiciclina (Dox). [124] De atunci, acest sistem Tet -On a
fost îmbunătățit în continuare prin identificarea noilor mutanți rtTA cu activitate bazală
redusă și sensibilitate crescută la Dox. [125]
În studiul de față, am stabilit un astfel de sistem de expresie a genelor Tet -inducti bil pentru C.
albicans și l -am folosit pentru a investiga consecințele expr esiei genelor specifice asupra
comportamentului celulelor de drojdie și a celulelor hipalice C. albicans precum și a celulelor
opace, forma competent ă de împerechere a ciupercii .
Proiectarea unui sistem de expresie genică inductibilă cu tetraciclină pentru C.albicans
Pentru a obține o inducție independentă de mediu de creștere a genelor țintă din C. albicans
prin adăugarea de tetraciclină, am proiectat o casetă de expresie care conți ne următoarele
componente : o genă care codifică un transactivator dependent de tetraciclină inversă (rtTA)
sub controlul ADH1 promotor, o expresie care controlează un promotor rtTA dependent a
genei țintă, și gena URA3 ca marker pentru selectarea transformatoarelor. Gena CartTA
codifică o proteină de fu ziune formată din represorul Tet invers din E.coli și domeniul de
activare a transcripț iei proteinei Gal4 din Saccharomyces cerevisiae . Conține cinci schimbu ri
de aminoacizi care convertesc represorul Tet inițial , care se leagă numai în absența
tetraciclinei la secvența sa țintă , de represorul Tet , care se leagă numai în prezența
doxiciclinei la operatorul tet. [125] În plus, toate codonurile CTG, care s -ar fi tradus în mod
eronat ca serină în loc de leucină datorită utilizării codonilor non canonici C. albicans, au fost
transformate în codonul de leucină TTG . Gena CartTA adapta tă de C.albicans a fost
fuzionată la secvența de terminare a transcri erii genei ACT1 și plasată sub controlul
promotorului ADH1 . Promotorul dependent de rtTA (Ptet) constă din promotorul minim al
genei OP4 C. albicans, din care secvențele de activare în amonte descrise de Lockhart și
colab. [126] au fost eliminate, și șapte copii ale secvenței operatorului tet, tetO. Secvențele
ADH1 flancare permit integrarea întregii construcții într -una dintre alelele ADH1 din
genomul C. albicans într-o singură etapă de transformare. După integrare, gena CartTA
trebuie exprimată în mod constitutiv de la promotorul ADH1 . Deoarece legarea rtTA la
secvențele operatorului tet necesită doxiciclină, expresia unei gene țintă trebuie să fie
inductibilă la adăugarea doxiciclinei la mediul de creștere .
CONCLUZII
Genetica a arătat că o bună parte din patologia umană este de origine ereditară și, de aceea,
boala î și pierde caracteru l individual devenind o problemă care interesează g enerații și,
uneori, populații î ntregi.
Știm că psihicul uman, viața mentală, raportul dintre sexe, fecunditatea, precum și moartea
sunt condiționate ereditar, cu al te cuvinte, genetica a pătruns î n toate domeniile existenței
umane.
Prin munca asiduă de cercetare depusă, sau descoperit cateva mii de mal adii ereditare, s -a
standardizat cariotipul uman norm al și s -au făcut mari progrese î n elaborarea hărții genetice la
om (în luna iunie 2000 a fost anunțată finalizarea secvențierii genomului uman, realizandu -se
astfel Proiectul Genomul Uman).
Testarea sens ibilității la medicamentele antimicrobiene se realizează (din punct de vedere
didactic) în ultima etapă a diagnosticului de laborator microbiologic, pentru majoritatea
microorganismelor implicate etiologic. Testarea este necesară datorită apariției și exti nderii
rezistenței microorganismelor la antibiotice și chimioterapice. Rezistența poate fi naturală sau
dobândită. Rezistența naturală este determinată gen etic. Rezistența dobândită este
„achiziționată” de anumite subpopulații dintr -o anumită specie microb iană, în circumstanțe
date, ex. prin „presiunea de selecție” exercitată de antibiotic .
Descoperirea de substanțe chimice specifice, precum antibioticele (de exemplu penicilina,
streptomicina, tetraciclina și cloramfenicolul) a contrib uit la îmbunătățirea modului de
abordare medicală a problematicii bolilor infecțioase.
Virusurile sunt insensibile la acțiunea antibioticelor ; administrarea interferonilor induce la
nivelul celulelor neparazitate o stare antivirală care le face rezistente la infecție .
Antibioticele sunt considerate de OMS ca fiind unul dintre pilonii sănătății noastre, care ne
permit să trăim mai mult și mai sănătos. Însă utilizarea lor abuzivă le -a făcut aproape
ineficiente în câteva decenii.
Instituirea unui tratament cu antibiotice (AB) se bazează pe particularitățile specifice
pacientului, pe cele ale microorganismului sau microorganismelor implicate, precum și
sensibilitatea acestora la antibiotice.
În general, un tratament cu antibiotice este continuat până la eredicar ea infecției sau până
când organismul, cu mijloacele lui de apărare, devine capabil să înlăture infecția. În infecțiile
acute se recomandă de obicei tratament scurt, 7 -10 zile (infecții ac ute ale tractului respirator,
infecții urinare). În infecțiile cronice (tuberculoză), tratamentul este de lungă durată, 4 -6 luni.
După instituire, tratamentul cu antibiotice trebuie controlat, în vederea aprecierii eficienței sau
ineficienței lui.
Eficiența tratamentului cu antibiotice se apreciază după:
– date clinic e (ameliorarea stării generale, scăderea febrei, diminuarea fenomenelor morbide)
– date paraclinice (de exemplu: ameliorarea sau remiterea aspectului radiologic al organului
afectat de infecție)
– date de laborator (scăderea leucocitozei sau vitezei de sed imentare a hematiilor,
normalizarea urinii, negativarea culturilor).
Tratamentul trebuie întrerupt, în situația în care se dovedește ineficient sau nociv sau când
reacțiile adverse întrec avantajele tratamentului.
BIBLIOGRAFIE
1. Constantin Maximilian, Genetică umană , Editura Științifică și Enciclopedică, București,
1982
2. Angelescu Mircea, Folosirea rațională a antibioticelor , Editura Medicală, București, 1986
3. Balș, Matei G., Antibioticele , Ediția a II -a, Editura Medicală, București, 1965
4. Mircea Covic, Dragoș Ștefănescu, Ionel Sandovici, Eusebiu Vlad Gorduza – Genetică
medicală , Ediția a III – a, rev , Editura Polirom, Iași, 2017
5. Conf. univ. dr. Stana Adriana – Noțiuni fundamentale de genetică pentru psihologi ,
Universit atea ''Titu Maiorescu'', Facultatea de psihologie
6. Severin Emilia Maria, Albu Crenguța, Ioachim Ileana – Genetică umană: concepte și
aplicații practice , Editura Scripta, București, 2002
7. Conf. dr. Dăbală Ioan – Curs semestrul I, Genetica comportamentul ui uman: implicații ale
geneticii umane în psihologie , Universitatea ''Babeș -Bolyai'' Cluj -Napoca, Facultatea de
psihologie și științele educației, Secția psihologie
8. ȘL dr. Schroder Verginica – Genetică medicală, Note de curs
9. Zhu JK. Active DNA demethylation mediated by DNA glycosylases . Annu Rev Genet.
2009;43:143 –66. ;
10. Tahiliani M, Koh KP, Shen Y, Pastor WA, Bandukwala H, Brudno Y,Agarwal S, Iyer
LM, Liu DR, et al. Conversion of 5 -methylcytosine to5 -hydroxymethylcytosine in mammalian
DNA by MLL partner TET1 . Science. 2009;324:930 –5.;
11. Liutkeviciute Z, Lukinavicius G, Masevicius V, Daujotyte D, Klimasauskas S. Cytosine –
5-methyltransferases add aldehydes to DNA . Nat Chem Biol. 2009;5:400 –2. ;
12. Jin SG, Kadam S, Pfeifer GP . Examination of the specificity of DNA methylation profiling
techniques towards 5 -methylcytosine and 5 – hydroxymethylcytosine. Nucleic Acids Res .
2010;38:e125.;
13. Keyes MK, Jang H, Mason JB, Liu Z, Crott JW, Smith DE, Friso S, Choi SW. Older age
and dietary folate are d eterminants of genomic and p16 -specific DNA methylation in mouse
colon . J Nutr. 2007;137:1713 –7. ;
14. Li Y, Liu Y, Strickland FM, Richardson B. Age-dependent decreases in DNA
methyltransferase levels and low transmethylation micronutrient levels synergize to promote
overexpression of genes implicated in autoimmunity and acute coronary syndromes . Exp
Gerontol. 2010;45:312 –22. ;
15. Uekawa A, Katsushima K, Ogata A, Kawata T, Maeda N, Kobayashi K, Maekawa A,
Tadokoro T, Yamamoto Y . Change of epigenetic contro l of cystathionine beta -synthase gene
expression through dietary vitamin B12 is not recovered by methionine supplementation . J
Nutrigenet Nutrigenomics.2009;2:29 –36. ;
16. Niculescu MD, Craciunescu CN, Zeisel SH. Dietary choline deficiency alters global an d
gene -specific DNA methylation in the developing hippocampus of mouse fetal brains . FASEB
J. 2006;20:43 –9. ;
17. Cheng X, Blumenthal RM. Coordinated chromatin control: structural and functional
linkage of DNA and histone methylation . Biochemistry.2010;49: 2999 –3008.;
18. Richon VM, Sandhoff TW, Rifkind RA, Marks PA . Histone deacetylase inhibitor
selectively induces p21WAF1 expression and gene -associated histone acetylation . Proc Natl
Acad Sci USA. 2000;97:10014 –9.;
19. Johnstone RW. Histone -deacetylase inh ibitors: novel drugs for the treatment of cancer .
Nat Rev Drug Discov. 2002;1:287 –99. ;
20. Villagra A, Sotomayor EM, Seto E. Histone deacetylases and the immunological network:
implications in cancer and inflammation . Oncogene. 2010;29:157 –73.;
21. Cowar d WR, Watts K, Feghali -Bostwick CA, Knox A, Pang L . Defective histone
acetylation is responsible for the diminished expression of cyclooxygenase 2 in idiopathic
pulmonary fibrosis . Mol Cell Biol. 2009; 29:4325 –39. ;
22. Zhang R, Chen HZ, Liu JJ, Jia YY, Zh ang ZQ, Yang RF, Zhang Y, Xu J,Wei YS, et al.
SIRT1 suppresses activator protein -1 transcriptional activity and cyclooxygenase -2
expression in macrophages . J Biol Chem. 2010;285:7097 –110. ;
23. Qiu X, Brown KV, Moran Y, Chen D. Sirtuin regulation in calori e restriction . Biochim
Biophys Acta. 2010;1804:1576 –83. ;
24. Marcu MG, Jung YJ, Lee S, Chung EJ, Lee MJ, Trepel J, Neckers L. Curcumin is an
inhibitor of p300 histone acetylatransferase . Med Chem. 2006;2:169 –74. ;
25. Chiu J, Khan ZA, Farhangkhoee H, Chak rabarti S. Curcumin prevents diabetes -associated
abnormalities in the kidneys by inhibiting p300 and nuclear factor -kappaB . Nutrition.
2009;25:964 –72. ;
26. Zempleni J, Chew YC, Bao B, Pestinger V, Wijeratne SS. Repression of transposable
elements by histo ne biotinylation . J Nutr. 2009;139:2389 –92.;
27. Hassan YI, Zempleni J. A novel, enigmatic histone modification: biotinylation of histones
by holocarboxylase synthetase . Nutr Rev. 2008;66:721 –5.;
28. Camporeale G, Giordano E, Rendina R, Zempleni J, Eissen berg JC. Drosophila
melanogaster holocarboxylase synthetase is a chromosomal protein required for normal
histone biotinylation, gene transcription patterns, lifespan, and heat tolerance . J Nutr.
2006;136:2735 –42.;
29. Healy S, Perez -Cadahia B, Jia D, McDo nald MK, Davie JR, Gravel RA. Biotin is not a
natural histone modification . Biochim Biophys Acta. 1789;2009:719 –33.
30. https://www.nature.com/scitable/topicpage/rna -functions -352/
31. Handel AE, Ramagopalan SV (2010) Is Lamarckian evolution relevant to medicine?
BMC Med Genet 11: 73.
32. Ooi SK, Qiu C, Bernstein E, Li K, Jia D, et al. (2007) DNMT3L connects unmethylated
lysine 4 of histone H3 to de novo methylation of DNA . Nature 448: 714 -717.
33. Collins LJ, Schonfeld B, Chen XS (2011) The epigenetics of non -coding RNA. In
Handbook of epigenetics: the new molecular and medical genetics . Academic Press, US. pp:
49-61.
34. Peckham Η (2013) Epigenetics : The Dogma -defying discovery th at genes learn from
experience. International Journal of Neuropsychotherapy 1: 9 -20.
35. Dolinoy DC (2008) The agouti mouse model: an epigenetic biosensor for nutritional and
environmental alterations on the fetal epigenome . Nutr Rev 66:S7 –S11.
36. Dayeh T , Volkov P, Salö S, Hall E, Nilsson E, et al. (2014) Genome -wide DNA
methylation analysis of human pancreatic islets from type 2 diabetic and nondiabetic donors
identifies candidate genes that influence insulin secretion . PLoS Genetics.
37. Bacos K, Gillberg L, Volkov P, Olsson AH, Hansen T, et al. (2016) Blood -based
biomarkers of age -associated epigenetic changes in human islets associate with insulin
secretion and diabetes . Nat Commun 7: 11089.
38. Boulle F, Van den Hove DL, Jakob SB, R utten BP, Hamon M, et al. (2012) Epigenetic
regulation of the BDNF gene: implications for psychiatric disorders . Mol Psychiatry 17: 584 –
596.
39.Branchi I, Karpova NN, D’Andrea I, Castren E, Alleva E (2011) Epigenetic modifications
induced by early enrichme nt are associated with changes in timing of induction of BDNF
expression . Neurosci Lett 495: 168 -172.
40. McGowan PO, Sasaki A, Huang TCT, Unterberger A, Suderman M, et al. (2008)
Promoter -wide hypermethylation of the ribosomal RNA gene promoter in the sui cide brain .
PLoS ONE 3: e2085.
41. Bustamante AC, Aiello AE, Galea S, Ratanatharathorn A, Noronha C, et al.(2016)
Glucocorticoid receptor DNA methylation, childhood maltreatment and major depression . J
Affect Disord 206: 181 -188.
42. Graham L (2013) Bounci ng back: Rewiring your brain for maximum resilience and well –
being . New World Library.
43. Creswell JD, Way BM, Eisenberger NI, Lieberman MD (2007) Neural correlates of
dispositional mindfulness during affect labeling . Psychosom Med 69: 560 -565.
44. Uzefov sky F, Shalev I, Israel S, Edelman S, Raz Y, et al. (2015) Oxytocin receptor and
vasopressin receptor 1a genes are respectively associated with emotional and cognitive
empathy . Horm Behav 67: 60 -65.
45. Schneiderman I, Zagoory -Sharon O, Leckman JF, Feldman R (2012) Oxytocin during the
initial stages of romantic attachment: relations to couples’ interactive reciprocity .
Psychoneuroendocrinology 37: 1277 -1285.
46. Lutz A, Greischar LL, Rawlings NB, Ricard M, Davidson RJ (2004) Longterm meditators
self-induce high-amplitude gamma synchrony during mental practice. Proceedings of the
National academy of Sciences of the United States of America. pp: 16369 -16373.
47. Lopez JP, Mamdani F, Beaulieu MM, Yang J, Berlim MT, et al. (2013) Epigenetic
regulation of BDNF ex pression according to antidepressant response . Mol Psychiatry 18:398
-399.
48. Ptak C, Petronis A (2008) Epigenetics and complex disease. From etiology to new
therapeutics . Annu Rev Pharmacol Toxicol 48: 257 –276.
49. Perroud N, Salzmann A, Prada P, Nicastro R, Hoeppli M, et al. (2013) Response to
psychotherapy in borderline personality disorder and methylation status of the BDNF gene .
Transl Psychiatry 3: e207.
50. Linehan MM, Schmidt H, Dimeff LA, Craft JC, Kanter J, et al. (1999) Dialectical
behavior therapy for patients with borderline personality disorder and drugdependence . Am J
Addict 8: 279 -292.
51. Yehuda R, Daskalakis NP, Desarnaud F, Makotki ne I, Lehrner AL, et al. (2013)
Epigenetic biomarkers as predictor s and correlates of symptom improvement following
psychotherapy in combat veterans with PTSD . Front Psychiatry 4:118.
52. Becker -Weidman A (2013 ) Attachment -focused psychotherapy & epigenetics: What your
grandparents past on. Center for Family Development Attachment -Focused Treatment
Institute.
53. Kohut H (2013) The analysis of the self: A systematic approach to the psychoanalytic
treatment of narcissistic personality disorders . University of Chicago Press, Chicago.
54. Rogers CR (1951) Client -centred ther apy: Its current practice, implications, and theory .
Houghton Mifflin Co., London.
55. Cristea Aurelia Nicoleta -Farmacia clinică în farmacia de spital , vol II, Ed.Medicală,
București, 2017
56. Kümmerer, K., Henninger, A., 2003. Promoting resistance by the emission of antibiotics
from hospitals and households into effluents . Clin. Microbiol. Infec. 9, 1203 –1214.
57. Cunningham, V., 2008. Special characteristics of pharmaceuticals related to
environmental fate . In: Kümmerer, K. (Ed.), Pharmaceuticals in the Environment. Sources,
Fate, Effects and Risk, third ed. Springer, Berlin Heidelberg, pp. 23 –34
58. Li, D., Yang, M., Hu, J., Ren, L., Zhang, Y., Chang, H., Li, K., 2008a. Determination and
fate of oxytetracycline and related compounds in oxyteracycline pr oduction wastewater and
the receiving river . Environ. Toxicol. Chem. 27, 80 –86.
Li, D., Yang, M., Hu, J., Zhang, Y., Chang, H., Jin, F., 2008b. Determination of penicillin G
and its degradation products in a penicillin production wastewater treatment plan t and the
receiving river . Water Res. 42, 307 –317
59. Kümmerer, K., submitted for publication. The presence of pharmaceuticals in the
environment due to human use – present knowledge and future challenges . J. Environ.
Manage
60. European Federation of Anim al Health (FEDESA), 2001 . Antibiotic Use in Farm Animals
does not threaten Human Health . FEDESA/FEFANA Press release, Brussels.
61.Union of Concerned Scientists, 2001. 70 Percent of all Antibiotics Given to Healthy Live –
stock . Press Release, 8 January, Ca mbridge, MA.
62.Cristea Aurelia Nicoleta – Tratat de farmacologie , Ediția I, Editura Medicală, București,
2012
63. Aminov RI. Horizontal gene exchange in environmental microbiota. Front Microbiol
(2011) 2:158. doi:10.3389/fmicb.2011.00158
64. Aminov RI . The extent and regulation of lateral gene transfer in natural microbial
ecosystems. In: Francino MP, editor . Horizontal Gene Transfer in Microorganisms . (Chap.
6), Norwich, UK: Horizon Scientific Press (2012). p. 93 –100.
65. Hotopp JCD. Horizontal gene transf er between bacteria and animals . Trends in Genetics
(2011) 27:157 –63. doi:10.1016/j.tig.2011.01.005
66. Robinson KM, Sieber KB, Hotopp JCD. A review of bacteria -animal lateral gene transfer
may inform our understanding of diseases like cancer . PLoS Genet (2013) 9:e1003877.
doi:10.1371/journal.pgen.1003877
67. Gyles C, Boerlin P. Horizontally transferred genetic elements and their role in
pathogenesis of bacterial disease . Vet Pathol (2014) 51:328 –40.
doi:10.1177/0300985813511131
68. Yue J, Hu X, Sun H, Yan g Y, Huang J. Widespread impact of horizontal gene transfer on
plant colonization of land. Nat Commun (2012) 3:1152. doi:10.1038/ncomms2148
69. Yang Z, Liu L, Fang H, Li P, Xu S, Cao W, et al. Origin of the plant Tm -1-like gene via
two independent horizont al transfer events and one gene fusion event . Sci Rep (2016)
6:33691. doi:10.1038/srep33691
70. Durzyńska J, Goździcka -Józefiak A. Viruses and cells intertwined since the dawn of
evolution . Virol J (2015) 12:169. doi:10.1186/s12985 -015-0400 -7
71. Caetano -Anollés G, Nasir A, Zhou K, Caetano -Anollés D, Mittenthal JE, Sun FJ, et al.
Archaea: the first domain of diversified life . Archaea (2014) 2014:590214.
doi:10.1155/2014/590214
72. Qiu H, Cai G, Luo J, Bhattacharya D, Zhang N. Extensive horizontal gene trans fers
between plant pathogenic fungi . BMC Biol (2016) 14:41.doi:10.1186/s12915 -016-0264 -3
73. Fitzpatrick DA. Horizontal gene transfer in fungi. FEMS Microbiol Lett (2012) 329:1 –8.
doi:10.1111/j.1574 -6968.2011.02465.x
74. Gladyshev EA, Meselson M, Arkhipova IR. Massive horizontal gene transfer in bdelloid
rotifers . Science (2008) 2008(320):1210 –3. doi:10.1126/science.1156407
75. Koonin EV. Horizontal gene transfer: essentiality and evolvability in prokaryotes, and
roles in evolutionary transitions . F1000Res (2016) 5:1805.doi:10.12688/f1000research.8737.1
76. Aminov RI. A brief history of the antibiotic era: lessons learned and challenges for the
future . Front Microbiol (2010) 1:134. doi:10.3389/fmicb.2010.00134
77. Treangen TJ, Rocha EP. Horizontal transfer, not duplication, drives the expansion of
protein families in prokaryotes . PLoS Genet (2011)
7:e1001284.doi:10.1371/journal.pgen.1001284
78. Babic A, Berkmen MB, Lee CA, Grossman AD. Efficient gene transfer in bacterial cell
chains . MBio (2011) 2:e27 –11. doi:10.1128/mBio.00027 -11
79. Lopatkin AJ, Huang S, Smith RP, Srimani JK, Sysoeva TA, Bewick S, et al . Antibiotics as
a selective driver for conjugation dynamics . Nat Microbiol (2016) 1:16044.
doi:10.1038/nmicrobiol.2016.44
80. Crisp A, Boschetti C, Perry M, Tunnacliffe A, Micklem G. Expression of multiple
horizontally acquired genes is a hallmark of both vertebrate and invertebrate genomes .
Genome Biol (2015) 16:50. doi:10.1186/s13059 -015-0607 -3
81. Lurie -Weinberger MN, Peeri M, Gophna U. Contribution of l ateral gene transfer to the
gene repertoire of a gut -adapted methanogen. Genomics (2012) 2012(99):52 –8.
doi:10.1016/j.ygeno.2011.10.005
82. Gielda LM, DiRita VJ. Zinc competition among the intestinal microbiota . mBio (2012)
3(4):171 –112. doi:10.1128/mBio.0 0171 -12
83. Hansen EE, Lozupone CA, Rey FE, Wu M, Guruge JL, Narra A, et al. Pan-genome of the
dominant human gut -associated archaeon , Methanobrevibacter smithii , studied in twins. Proc
Natl Acad Sci U S A (2011) 108(Suppl 1):4599 –606. doi:10.1073/pnas.100 0071108
84. Coyne MJ, Zitomersky NL, McGuire AM, Earl AM, Comstock LE . Evidence of extensive
DNA transfer between bacteroidales species within the human gut . MBio (2014) 5:e1305 –14.
doi:10.1128/mBio.01305 -14
85. Ma H, Bryers JD. Non-invasive determination of conjugative transfer of plasmids bearing
antibiotic -resistance genes in biofilm -bound bacteria:effects of substrate loading and
antibiotic selection . Appl Microbiol Biotechnol (2013) 97:317 –28. doi:10.1007/s00253 -012-
4179 -9
86.Yosef I, Manor M, Qimron U . Counteracting selection for antibiotic -resistant bacteria .
Bacteriophage (2016) 6:e1096996. doi:10.1080/21597081.2015.1096996
87.Long H, Miller SF, Strauss C, Zhao C, Cheng L, Ye Z, et al. Antibiotic treatment enhances
the genome -wide mutation rate of ta rget cells . Proc Natl Acad Sci U S A (2016) 113:E2498 –
505. doi:10.1073/pnas.1601208113
88. Koike S, Mackie R, Aminov R. Agricultural use of antibiotics and antibiotic resistance .
In: Mirete S, Pérez ML, editors. Antibiotic Resistance Genes in Natural Envir onments and
Long -Term Effects . (Chap. 8), Hauppauge, NY: Nova Science Publishers. Inc (2017). p. 217 –
50.
89. Salyers AA, Gupta A, Wang Y. Human intestinal bacteria as reservoirs for antibiotic
resistance genes . Trends Microbiol (2004) 12:412 –6.doi:10.1016/ j.tim.2004.07.004
90. Schjørring S, Krogfel KA. Assessment of bacterial antibiotic resistance transfer in the
gut. Int J Microbiol (2011) 2011:312956. doi:10.1155/2011/312956
91. Huddleston JR. Horizontal gene transfer in the human gastrointestinal tract: potential
spread of antibiotic resistance genes. Infect Drug Resist (2014) 7:167 –76.
doi:10.2147/IDR.S48820
92. Francino MP. Antibiotics and the human gut microbiome: dysbioses and accumulation of
resistances. Front Microbiol (2016) 6:1543. doi:10.3389/fmi cb.2015.01543
93. Kazimierczak KA, Scott KP, Kelly D, Aminov RI. Tetracycline resistome of the organic
pig gut. Appl Environ Microbiol (2009) 75:1717 –22.doi:10.1128/AEM.02206 -08
94. van Schaik W. The human gut resistome . Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci (2015)
370:20140087. doi:10.1098/rstb.2014.0087
95. Perry JA, Wright GD. The antibiotic resistance "mobilome": searching for the link
between environment and clinic . Front Microbiol (2013)
4:138.doi:10.3389/fmicb.2013.00138
96. Gosalbes MJ, Vallès Y, Jiménez -Hernández N, Balle C, Riva P, Miravet -Verde S, et al.
High frequencies of antibiotic resistance genes in infants’ meconium and early fecal samples .
J Dev Orig Health Dis (2016) 7:35 –44. doi:10.1017/S2040174415001506
97. Amino v RI, Mackie RI. Evolution and ecology of antibiotic resistance genes . FEMS
Microbiol Lett (2007) 271:147 –61. doi:10.1111/j.1574 – 6968.2007.00757.x
98. Aminov RI . The role of antibiotics and antibiotic resistance in nature . Environ Microbiol
(2009) 11:2970 –88. doi:10.1111/j.1462 -2920.2009.01972.x
99.Verraes C, Van Boxstael S, Van Meervenne E, Van Coillie E, Butaye P, Catry B, et al.
Antimicrobial resistance in the food chain: a review . Int J Environ Res Public Health (2013)
10:2643 –69. doi:10.3390/ijerph100 72643
100. Flórez AB, Campedelli I, Delgado S, Alegría Á, Salvetti E, Felis GE, et al . Antibiotic
susceptibility profiles of dairy Leuconostoc , analysis of the genetic basis of atypical
resistances and transfer of genes in vitro and in a food matrix . PLoS One (2016)
11:e0145203. doi:10.1371/journal.pone.0145203
101. Hu Y, Yang X, Li J, Lv N, Liu F, Wu J, et al. The bacterial mobile resistome transfer
network connecting the animal and human microbiomes . Appl Environ Microbiol (2016)
82:6672 –81. doi:10.1128/AEM.01802 -16
102. Aviv G, Rahav G, Gal -Mor O. Horizontal transfer of the Salmonella enterica serovar
infantis resistance and virulence plasmid pESI to the gut microbiota of warm -blooded hosts .
MBio (2016) 7:e1395 –1316. doi:10.1128/mBio.01395 -16
103. Frye JG, Lindsey RL, Meinersmann RJ, Berrang ME, Jackson CR, Englen MD, et al.
Related antimicrobial resistance genes detected in different bacterial species co -isolated from
swine fecal samples . Foodborne Pathog Dis (2011) 8:663 –79. doi:10.1089/fpd. 2010.0695
104. Barondess JJ, Beckwith J. A bacterial virulence determinant encoded by lysogenic
coliphage lambda . Nature (1990) 346:871 –4. doi:10.1038/346871a0
105. Brabban AD, Hite E, Callaway TR. Evolution of foodborne pathogens via temperate
bacteriopha ge-mediated gene transfer . Foodborne Pathog Dis (2005) 2:287 –303.
doi:10.1089/fpd.2005.2.287
106. Broaders E, Gahan CG, Marchesi JR. Mobile genetic elements of the human
gastrointestinal tract: potential for spread of antibiotic resistance genes . Gut Microb es
(2013) 4:271 –80. doi:10.4161/gmic.24627
107. Jiang X, Ellabaan MMH, Charusanti P, Munck C, Blin K, Tong Y, et al. Dissemination
of antibiotic resistance genes from antibiotic producers to pathogens . Nat Commun (2017)
8:15784. doi:10.1038/ncomms15784
108. Johnsen PJ, Simonsen GS, Olsvik O, Midtvedt T, Sundsfjord A. Stability, persistence,
and evolution of plasmid -encoded VanA glycopeptide resistance in enterococci in the absence
of antibiotic selection in vitro and in gnotobiotic mice . Microb Drug Resist (2002) 8:161 –70.
doi:10.1089/107662902760326869
109. Dahl KH, Mater DD, Flores MJ, Johnsen PJ, Midtvedt T, Corthier G, et al. Transfer of
plasmid and chromosomal glycopeptide resistance determinants occurs more readily in the
digestive tract of mice than in vitro and exconjugants can persist stably in vivo in the absence
of glycopeptide selection . J Antimicrob Chemother (2007) 59:478 –86. doi:10.1093/jac/dkl530
110. Thimm T, Hoffmann A, Fritz I, Tebbe CC. Contribution of the earthworm Lumbricus
rubellus (Annelida, Oligochaeta) to the establishment of plasmids in soil bacterial
communities . Microb Ecol (2001) 41:341 –51. doi:10.1007/s002480000115
111. Matsuo J, Oguri S, Nakamura S, Hanawa T, Fukumoto T, Hayashi Y, et al. Ciliates
rapidly enhance the frequency of conjugation between Escherichia coli strains through
bacterial accumulation in vesicles . Res Microbiol (2010) 161:711 –9.
doi:10.1016/j.resmic.2010.07.004
112. Oguri S, Matsuo J, Hayashi Y, Nakamura S, Hanawa T, Fukumoto T, et al. Ciliates
promote the tr ansfer of the gene encoding the extended -spectrum β -lactamase CTX -M-27
between Escherichia coli strains. J Antimicrob Chemother (2011) 66:527 –30.
doi:10.1093/jac/dkq487
113. Poole T, Crippen T. Conjugative plasmid transfer between Salmonella enterica
NEWPORT and Escherichia coli within the gastrointestinal tract of the lesser mealworm
beetle , Alphitobius diaperinus (Coleoptera: Tenebrionidae). Poult Sci (2009) 88:1553 –8.
doi:10.3382/ps.2008 -00553
114. Berman, J., and P. E. Sudbery. 2002. Candida albica ns: a molecular revolution built on
lessons from budding yeast. Nat. Rev. Genet. 3:918–930.
115. De Backer, M. D., P. T. Magee, and J. Pla. 2000. Recent developments in molecular
genetics of Candida albicans . Annu. Rev. Microbiol. 54:463–498.
116. Backen, A. C., I. D. Broadbent, R. W. Fetherston, J. D. Rosamond, N. F. Schnell, and M.
J. Stark. 2000. Evaluation of the CaMAL2 promoter for regulated expression of genes in
Candida albicans . Yeast 16:1121 –1129.
117. Care, R. S., J. Trevethick, K. M. Binley, and P. E. Sudbery. 1999. The MET3 promoter:
a new tool for Candida albicans molecular genetics. Mol. Microbiol. 34:792–798.
118. Leuker, C. E., A. Sonneborn, S. Delbru¨ck, and J. F. Ernst. 1997. Sequence and promo ter
regulation of the PCK1 gene encoding phosphoenolpyruvate carboxykinase of the fungal
pathogen Candida albicans . Gene 192:235–240.
119. Hillen, W., and C. Berens. 1994. Mechanisms underlying expression of Tn 10 encoded
tetracycline resistance. Annu. Rev . Microbiol. 48:345–369.
120. Gossen, M., and H. Bujard. 1992. Tight control of gene expression in mammalian cells
by tetracycline -responsive promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547 –5551.
121. Nakayama, H., T. Mio, S. Nagahashi, M. Kokado, M. Arisawa , and Y. Aoki. 2000.
Tetracycline -regulatable system to tightly control gene expression in the pathogenic fungus
Candida albicans . Infect. Immun. 68:6712 –6719.
122. Roemer, T., B. Jiang, J. Davison, T. Ketela, K. Veillette, A. Breton, F. Tandia, A.
Linteau , S. Sillaots, C. Marta, N. Martel, S. Veronneau, S. Lemieux, S. Kauffman, J. Becker,
R. Storms, C. Boone, and H. Bussey. 2003. Large -scale essential gene identification in
Candida albicans and applications to antifungal drug discovery. Mol. Microbiol. 50:167–
181.
123. Saville, S. P., A. L. Lazzell, C. Monteagudo, and J. L. Lopez -Ribot. 2003. Engineered
control of cell morphology in vivo reveals distinct roles for yeast and filamentous forms of
Candida albicans during infection. Eukaryot. Cell 2:1053 –1060.
124. Gossen, M., S. Freundlieb, G. Bender, G. Mu¨ller, W. Hillen, and H. Bujard. 1995.
Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells . Science 268:1766 –1769.
125. Urlinger, S., U. Baron, M. Thellmann, M. T. Hasan, H. Bujard, and W. Hillen. 2000.
Exploring the sequence space for tetracycline -dependent transcriptional activators: novel
mutations yield expanded range and sensitivity . Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:7963 –7968.
126. Lockhart, S. R., M. Nguyen, T. Srikantha, and D. R. Soll. 1998 . A MADS box protein
consensus binding site is necessary and sufficient for activation of the opaque -phase -specific
gene OP4 of Candida albicans . J. Bacteriol. 180: 6607 –6616.
Copyright Notice
© Licențiada.org respectă drepturile de proprietate intelectuală și așteaptă ca toți utilizatorii să facă același lucru. Dacă consideri că un conținut de pe site încalcă drepturile tale de autor, te rugăm să trimiți o notificare DMCA.
Acest articol: Licenta Craciun.s.corina Maria 2020 [624480] (ID: 624480)
Dacă considerați că acest conținut vă încalcă drepturile de autor, vă rugăm să depuneți o cerere pe pagina noastră Copyright Takedown.