Licență Ciublea B. [304991]

PROIECT DE DIPLOMĂ

PRINTARE 3D DE SUBSTRATURI POROASE PENTRU APLICAȚII BIOMEDICALE

Student: [anonimizat]-Maria Ciublea

Conducător Științific: SL. Dr. Ing. Diana-Maria Drăgușin-Žakman

București

Iulie 2018

1. Introducerea

1.1 Memoriu justificativ

Deși în ultimii ani progresele făcute în domeniul (bio)[anonimizat], datorate unui schimb ineficient de mediu în interiorul constructelor.

În acest studiu, s-a utilizat un proces de fabricare 3D, prin care canale microfluidice similare vaselor pot fi direct printate în forme complexe. Astfel, [anonimizat], [anonimizat], se consideră că integrarea unui sistem microfluidic în structura internă a structurilor fabricare prin (bio)[anonimizat].

[anonimizat]. Utilizarea acelor coaxiale permite reglarea cineticii de reticulare cu o precizie relativ mare prin ajustarea concentrațiilor soluțiilor de alginat și a agentului de reticulare.

[anonimizat]-[anonimizat]. Încercările inițiale de dezvoltare a scaffold-urilor au presupus o [anonimizat] 3D ca modalitate de fabricare a acestora.

[anonimizat] 3D [anonimizat], liofilizarea, etc. Aceste metode convenționale au o [anonimizat] a porilor, [anonimizat].

[anonimizat] 3D oferă posibilitatea de a [anonimizat] (ECM) și, [anonimizat], proliferarea, [anonimizat] a forma țesutul funcțional.

1.2 Stadiul actual al dezvoltării pe plan național și internațional

Imprimarea 3D este o [anonimizat] a practicii clinice. Utilizarea mai largă a unor astfel de tehnologii poate determina dezvoltarea personalizării diferitelor produse medicale (inclusiv echipamente și medicamente). Prima lucrare internațională de (bio)printare și (bio)fabricare a fost realizată la Universitatea din Manchester (Marea Britanie) în septembrie 2004 și a fost organizată de prof. [anonimizat].

Tehnologia de printare 3D [anonimizat]. Astfel, printarea 3D poate fi folosită pentru a depozita celule și biomateriale într-o matrice 3D [anonimizat] o [anonimizat]. Printarea 3D asigură fabricarea de structuri complexe, care reflectă îndeaproape arhitectura țesutului biologic.

Un studiu din 2010 a demonstrat o diferență considerabilă în viabilitatea celulelor în prezența, respectiv absența canalelor microfluidice în structurile scaffold-urilor. Într-un alt studiu, s-a arătat că prezența canalelor microfluidice crește furnizarea de substanțe nutritive suficiente către celulele încapsulate, iar viabilitatea celulară este mult crescută în apropierea canalului microfluidic. Până în prezent au fost utilizate mai multe metode de fabricare a canelelor microfluidice, printre care litografia, foto-modelarea, tehnologii pe bază de laser, matrițarea și (bio)printarea.

Tehnologia 3D reprezintă o tehnică medicală care își propune fabricarea artificială a

unor structuri de țesuturi și organisme biologice. Combină știința, ingineria și tehnologia modernă în scopul creării de organisme sau țesuturi care să înlocuiască țesuturile bolnave.

(Bio)printarea este un domeniu în curs de dezvoltare, care are un mare impact asupra științelor medicale. Oferă o precizie mare pentru plasarea spațială a celulelor, a proteinelor, a medicamentelor și a particulelor biologic active pentru o orientare mai bună, pentru generarea și formarea de țesuturi.

Această (bio)tehnologie este promițătoare pentru avansarea fabricației de țesuturi și organe funcționale pentru transplant, teste de droguri, investigații de cercetare a cancerului și a bolilor, și a atras recent interes tot mai mare în rândul cercetătorilor și al publicului larg.

Aflându-se încă în stadiile incipiente, strategiile de (bio)printare au demonstrat potențiala lor utilizare în medicina regenerativă pentru a forma o varietate de țesuturi transplantabile, incluzând pielea, cartilajul și osul. Cu toate acestea, (bio)printarea încă prezintă provocări tehnice în ceea ce privește depunerea celulelor de înaltă rezoluție, distribuțiile controlate a celulelor, vascularizarea țesuturile 3D complexe.

În domeniul ingineriei tisulare, scaffold-ul prezintă un rol important în asigurarea unui mediu ideal pentru proliferarea, migrarea și adeziunea celulelor. Încercările inițiale de dezvoltare a scaffold-urilor au presupus o serie de probleme, determinând astfel un interes tot mai mare față de printarea 3D ca modalitate de fabricare a acestora. Tehnicile convenționale utilizate pentru fabricarea scaffold-urilor 3D includ procedee precum separarea fazelor, turnarea topiturii, liofilizarea, etc. Aceste metode convenționale au o serie de limitări, nefiind adecvate pentru obținerea unor dimensiuni exacte a porilor, pentru controlul geometriei porilor, nivelului ridicat de interconectivitate și al rezistenței mecanice ridicate.

1.3 Descrierea problematicii abordate în proiect

Față de metodele convenționale, printarea 3D oferă posibilitatea de a proiecta scaffold-uri capabile să mimeze structurile complexe ale matricii extracelulare (ECM) și, prin urmare, să ofere un micro-mediu adecvat pentru atașarea, proliferarea, distribuția și diferențierea celulelor, cu potențial de a forma țesutul funcțional.

(Bio)printarea încă se află în stadiu de cercetare fiind utilizată în mod experimental, deoarece prezintă încă limitări:

viabilitatea celulelor

biocompatibilitatea

automatizarea proceselor

Instrumentele sunt fabricate în conformitate cu cele mai înalte standarde industriale. Se încearcă să se exploateze cele mai recente progrese tehnologice pentru a oferi echipamente de înaltă performanță, facilitând trecerea de la cercetare la dezvoltare. Flexibilitatea și modularitatea instrumentului de (bio)printare sunt factori cheie în realizările viitoare.

(Bio)printarea 3D implică complexități suplimentare, cum ar fi alegerea materialelor, tipurile de celule, factorii de creștere și factorii de diferențiere, provocările tehnice legate de sensibilitatea celulelor vii și de construcția țesuturilor.

Ingineria țesuturilor reprezintă un domeniu de cercetare promițător, oferind speranță pentru eliminarea decalajului dintre lipsa de organe și nevoia de transplant. Cu toate acestea, construirea de organe vasculare tridimensionale (3D) rămâne principala barieră tehnologică care trebuie depășită. Pentru a fi utilizate cu succes în ingineria țesuturilor, aceste materiale trebuie să fie biocompatibile și biodegradabile, și cu rezistență mecanică.
Dezavantajul major al abordărilor anterioare au fost combinațiile slabe sau inadecvate de imprimare a materialelor și substraturilor, precum și dimensiunile relativ mici ale construcțiilor imprimate.

(Bio)printarea a fost deja aplicată pe scară largă pentru a construi țesuturi funcționale cum ar fi mușchi, cartilaj și os. Această tehnologie are capacitate nu numai în fabricarea complexă a structurii țesuturilor pe baza imaginilor medicale convertite, ci și ca un instrument eficient pentru descoperirea de droguri și testarea preclinică.

2.Tehnologii de printare 3D

În ingineria tisulară (TE) sunt utilizate diferite tehnologii 3D de printare. Aceste tehnologii pot fi clasificate în sistemele cu laser și în sistemele cu duze (Billiet et al., 2012) așa cum se arată în Figura 1.

Figura 1. Tehnologii și aplicații ale printării 3D

Tabel 1. Avantajele și dezavantajele proceselor de fabricare

2.1 Echipament 3D Discovery (RegenHu)

Pentru fabricarea scaffold-urilor de alginat de sodiu, s-a folosit un echipament 3D Discovery (RegenHu) (Figura 2). Echipamentul este o (bio)imprimantă, dotată cu 4 capete de printare care folosesc tehnici diferite de dispensare a materialelor, controlate prin presiune pneumatică. Capul de printare de interes pentru acest studiu, este cel dotat cu un ac coaxial.

Figura 2. Echipamentul 3D Discovery RegenHu

Cei mai importanți factori pentru (bio)printarea 3D, sunt:

rezoluția de suprafață

viabilitatea celulelor

materiale biologice utilizate pentru imprimare

(Bio)printarea cu jet de cerneală este cea mai frecvent folosită și cea utilizată în această temă de licență. Acum, (bio)imprimantele cu jet de cerneală imprimă materiale la rezoluție, precizie și viteză mare. Imprimantele cu jet de cerneală elimină picături de lichid pe un substrat, care poate susține sau face parte din construcția finală.

Avantajele imprimantelor cu jet de cerneală includ:

viteză mare de imprimare

costuri reduse

disponibilitate largă

Progresul tehnologiei (bio)printării este limitat de disponibilitatea materialelor care facilitează atât logistica (bio)printării, cât și susținerea viabilități și funcția celulelor prin furnizarea de indicații specifice țesutului.

Introducerea (bio)printării 3D este de așteptat să revoluționeze domeniul ingineriei tisulare și medicinii regenerative. (Bio)printarea 3D este capabilă să distribuie materiale în timp ce se mișcă în direcțiile X, Y și Z, ceea ce permite proiectarea unor structuri complexe de jos în sus. BioCAD ™ este o aplicație intuitivă, ușor de utilizat care permite oamenilor de știință să proiecteze țesuturi, modele și scaffold-uri în câteva minute. Dispune de o gamă largă de funcții de parametrizare, pentru a regla instrumentul la materialele care sunt utilizate, potrivit cerințelor fiecărui material în parte.

Într-o configurație de bază, imprimanta 3D urmează mai întâi instrucțiunile din fișierul CAD pentru a construi fundația pentru obiect, deplasând capul de imprimare de-a lungul planului x-y. Imprimanta continuă să urmeze instrucțiunile, mișcarea capului de imprimare de-a lungul axei z pentru a construi obiectul vertical pe strat.

Figura 3. Aplicația BioCAD ™ folosită de echipamentul 3D Discovery (RegenHu)

2.2 Avantajele oferite de folosirea capului de printare cu ac coaxial

În această temă de licență, s-a utilizat un proces de fabricare 3D, prin care canale microfluidice similare vaselor pot fi direct printate în forme complexe. Astfel, canale microfluidice, sub formă de filamente goale, sunt printate direct pe suporturi de sticlă, folosind hidrogeluri pe baza de alginat de sodiu reticulat. Hidrogelurile de alginat sunt candidați foarte buni pentru printarea coaxială de constructe ce mimează sistemul de vascularizare al țesuturilor, datorită capacității de reticulare ionică rapidă. Utilizarea acelor coaxiale permite reglarea cineticii de reticulare cu o precizie relativ mare prin ajustarea concentrațiilor soluțiilor de alginat și a agentului de reticulare.

S-a folosit acul coaxial pentru printare, pentru a reticula o soluție din alginat, utilizând clorură de calciu. Acul coaxial este sincronizat cu un sistem de poziționare 3D pentru depunerea fibrelor într-un model controlat. Alginatul de sodiu devine repede gel. Procesul de printare 3D ajutat de debitul coaxial, conduc la producerea unor canale cilindrice.

Figura 4. Capul de printare cu ac coaxial

Pentru a evita instabilitatea și înfundarea, focalizarea în flux trebuie să fie coaxială, adică soluția de ioni de calciu înconjoară alginatul din toate părțile. Tehnica utilizează o focalizare coaxială a fluxului, după cum se observă în Figura 5.

Figura 5. Reprezentarea schematică a unui cap de printare cu ac coaxial și detaliu reprezentând curgerea celor 2 soluții și difuzia de ioni de calciu.

Imprimanta asistată de presiune cu ac coaxial a fost utilizată pentru imprimarea filamentelor de hidrogel de alginat. Au fost obținute hidrogeluri de alginat de sodiu de înaltă rezistență care conțin microcanale în interior. Într-o manieră similară, formarea de construcții vasculare perfuzabile a fost de asemenea realizată printr-o duză coaxială multistrat cu extrudare, cu canal concentric într-o (bio)printare 3D într-un singur pas. Reticularea a fost făcută cu ioni de calciu și utilizați pentru reglarea proprietăților mecanice și reologice.

Imprimanta cu jet de cerneală a fost echipată cu o soluție de clorură de calciu ca agent de reticulare și ca material de susținere. Soluția a fost utilizată pentru a conferi forță de susținere pentru regiunile în relief în imprimarea orizontală și verticală.

2.3 Criterii de alegere a materialului

Tehnologiile actuale de printare 3D pentru ingineria tisulară sunt împiedicate de lipsa de biomateriale avansate, ce ar putea reda complexitatea structurilor native, asigurând integrarea cu țesuturile/organele native. Disponibilitatea biomaterialelor cu proprietăți adecvate pentru printarea 3D a scaffold-urilor, este restricționată în funcție de tehnologia de printare utilizată. Prin utilizarea materialelor hibride și a multiplelor tehnologii de printare se pot fabrica scaffold-uri similare ECM-ului, capabile să depășească dezavantajele actuale.

Selectarea materialelor adecvate pentru utilizarea în (bio)printare și performanța lor într-o aplicație medicală, depind de mai multe caracteristici. Materialele utilizate în (bio)printare sunt enumerate în tabelul 2.

Tabel 2. Parametrii de material

Accentul pus tot mai mult pe îngrijirea specifică a pacientului împreună cu o cunoaștere în detaliu a interacțiunilor dintre celule și biomateriale, a condus cercetătorii să investigheze noi metode care să permită controlul asupra aranjamentului celulelor și asupra nanomaterialelor bioactive din arhitectura scaffold-urilor. Proiectarea arhitecturii scaffold-ului poate influența în mod semnificativ atât proprietățile mecanice cât și comportamentul celulelor.

Printabilitatea

O proprietate importantă a unui material adecvat este aceea de a putea fi pus cu precizie în spațiul dorit. Unele tipuri de tehnologii, spre exemplu (bio)imprimantele cu jet de cerneală, au limitări privind vâscozitatea materialului, în timp ce altele, cum ar fi cele pe bază de extrudare, pot necesita ca materialul să aibă reticulare specifică sau proprietăți de subțiere. De exemplu, imprimarea cu jet de cerneală necesită materiale cu un timp de reticulare rapid, pentru a facilita stratificarea structurii 3D complexă.

Biocompatibilitatea

Odată cu apariția ingineriei tisulare, obiectivul pentru biocompatibilitate s-a schimbat de la necesitatea unui material implantat de a coexista cu țesutul endogen fără a provoca orice efect nedorit asupra gazdei, pâna la producerea în mod activ de către implant a unor efecte dorite asupra organismului gazdă.

Timpul de degradare

Degradarea cinetică a materialelor trebuie înțeleasă și controlată. Aici sunt câteva aspecte ale degradării care trebuie luate în considerare. Primul este capacitatea de a controla ratele de degradare. În mod ideal, rata de degradare se potrivește cu capacitatea celulelor de a înlocui materialele cu propriile proteine ​​ale matricii extracelulare.

Produsele de degradare trebuie să fie netoxice, ușor metabolizate și să se curețe rapid din corp. Gonflarea și caracteristicile contractile ale materialelor sunt un motiv de îngrijorare în fabricarea produselor de inginerie tisulară. Gonflarea excesivă a materialului poate avea ca rezultat absorbția fluidului din țesuturile înconjurătoare și contracția poate duce la închiderea

poriilor sau vaselor care sunt esențiale pentru migrarea celulelor și livrarea de nutrienți.

Proprietati structurale si mecanice

Un material este esențial pentru întreținerea unei structuri 3D, pentru a rezista sau a produce anumite forțe, sau ca un punct de ancorare pentru pârghia mecanică. Materialele trebuie alese cu atenție în funcție de proprietățile mecanice necesare construcției. O abordare nouă, pentru depășirea limitări, este utilizarea materialelor de sacrificiu care pot furniza proprietăți structurale și mecanice necesare pe o perioadă dată de timp. Acest material sacrificat poate fi folosit fie la momentul imprimării pentru a permite realizarea unei reticulări suficiente în construct, sau în mod alternativ ar putea fi încorporate în construcție, funcționând până când materialele pot realiza singure funcția pentru care au fost implantate.

Proprietatea biomimetică

Importanța biomimtriei pentru biocompatibilitate a fost studiată recent. Capacitatea de a încorpora componente biomimetrice într-o construcție (bio)printată, poate avea un efect activ asupra atașamentului, migrației, proliferării și funcției atât a celulelor endogene cât și a celor exogene.

Deși în ultimii ani progresele făcute în domeniul (bio)fabricării de structuri care mimează țesuturile vii sunt impresionante, există însă limitări majore legate de biomimetismul acestor structuri, datorate unui schimb ineficient de mediu în interiorul constructelor.

De asemenea, această tehnică ilustrează o mare promisiune în proiectarea și controlul structurii scaffold-ului, permițând în același timp încorporarea unor factori bioactivi care induc scaffold-ului prefabricat un caracter biomimetic superior și flexibilitate în design.

2.4 Materiale utilizate in (bio)printare

Pe scurt, tehnica de printare 3D începe cu un model de proiectare asistată de calculator (CAD), ce este convertit într-un fișier STL, feliat și apoi imprimat. Pentru a fi o opțiune viabilă pentru regenerarea tisulară, este important să se țină cont de faptul că materialele utilizate pentru printarea 3D a scaffold-urilor trebuie să fie printate cu un grad ridicat de reproductibilitate. Aceste materiale trebuie să fie rentabile și maleabile pentru a obține morfologia dorită a scaffold-ului proiectat. Biomateriale naturale sau sintetice utilizate pentru printarea 3D a scaffold-urilor pot varia foarte mult în funcție de tipul tehnologiei de printare utilizate, și includ materiale metalice, ceramice, polimerice și compozite.

Polimerii reprezintă o categorie importantă de materiale cu potențial de utilizare în printarea 3D a scaffold-urilor pentru ingineria tisulară. Polimerii pot fi atât sintetici, precum poli (etilen glicol) diacrilat (PEGDA), cât și naturali, cum ar fi gelatina metacrilată (GelMA), ambii fiind folosiți în formarea de hidrogeluri.

Tabel 3. Materiale utilizate în (bio)printare

2.5 Hidrogelurile

Hidrogelurile sunt deosebit de atractive pentru (bio)fabricare, deoarece prezintă câteva caracteristici ale matricei extracelulare naturale (ECM). Hidrogelurile au un conținut ridicat de apă. Acestea au fost utilizate pe scară largă ca purtători de celule și ca scaffold-uri în inginerie tisulară. Odată cu avansarea în ingineria tisulară, posibilitatea regenerării țesuturilor rănite sau a organelor în stare defectuoasă a devenit o perspectivă realistă pentru prima dată în istoricul medical.

Hidrogelurile permit încapsularea celulelor într-un mediu tridimensional care au o susținere mecanică foarte hidratată. În plus, ele permit o însămânțare eficientă și omogenă a celulelor, pot furniza semnale chimice și fizice relevante din punct de vedere biologic și pot fi formate în diferite forme și caracteristici biomecanice.

Hidrogelurile au fost utilizate pentru mai multe aplicații biomedicale:

pansamente pentru arsuri

biosenzori

încapsularea celulelor

pentru aplicațiile de livrare a medicamentelor

Hidrogelurile sunt biomaterialele cu cea mai largă utilizare în (bio)fabricare, deoarece ele pot fi utilizate ca matrice celulară și pot fi adaptate pentru a imita sau a înlocui țesutul nativ. Proprietățile chimice și fizice ale hidrogelurilor vor determina comportamentul celulelor. Hidrogelurile sunt materiale asemănătoare gelurilor, în care componenta lichidă este apă.

Datorită proprietăților deosebite, se folosesc diferite hidrogeluri biocompatibile care susțin creșterea de celule:

agaroză

-gelatină

acid hialuronic

poliacilenglicol (PEG)

diacrilat

alginat

2.6 Alginat

Generalități

Alginații au fost descoperiți în 1883 de către Edward Stanford, însă comercializarea acestora a început în 1927. În prezent, se utilizează până la 40.000 tone/an în întreaga lume, 30% din această cantitate fiind destinată industriei alimentare, iar restul de alginat fiind utilizat în industria farmaceutică și medicină.

Alginații cuprind o gamă largă de compuși, ce includ atât acidul alginic cât și derivații acestuia, cum ar fi sărurile acestuia de sodiu, potasiu, amoniu, magneziu, calciu și esterii de tip propilen glicol alginat. Majoritatea algelor brune cu dimensiuni mari sunt potențiale surse de alginat.

Această polizaharidă permite obținerea unei game variate de biomateriale, matrici suport sau sisteme de livrare de medicamente, cu aplicații în medicina regenerativă. De asemenea, poate fi obținut într-o varietate de forme: hidrogeluri moi (în prezența ionilor de calciu), microsfere, fibre, spume, nanoparticule, multistraturi.

Alginatul de sodiu, sarea solubilă a acidului alginic, este o polizaharidă naturală, lineară, ce poate fi izolată dintr-o varietate de specii de alge brune. Acesta se prezintă sub forma unui solid incolor sau ușor gălbui.

Alginatul de sodiu este format din unități de acid α-(1,4)-L-guluronic (blocuri G), unități de acid β-(1,4)-D-manuronic (blocuri M), precum și din segmente ce alternează cele două unități (blocuri G-M). Regiunile din alginat formate exclusiv din unități M, respectiv G sunt denumite blocuri M, respectiv G, iar atunci când aceste unități sunt intercalate, avem blocuri alternante M-G. Raportul dintre cei doi acizi (M/G) variază în funcție de sursa utilizată și determină funcționalitatea tehnologică a alginatului. În general, acest raport este de 1,5.

Surse de obținere

Alginații se găsesc în cantități mari în natură, fiind constituenți structurali ai algelor brune (Fam. Phaeophyceae) și a capsulei unor microorganisme din sol în care îndeplinesc un rol incomplet elucidat până în prezent. Se extrag în special din unele specii de alge marine brune (Laminaria hyperborea, Ascophylum nodosum, Ecklonia maxima etc.), dar și din peretele celular al unor bacterii telurice (Azotobacter vinelandii). Alginații există în pereții celulari ai algelor marine brune ca săruri ale acidului alginic.

Caracterisctici

Compozița alginatului, masa moleculară, puritatea și concentrația utilizată în obținerea membranelor sunt caracteristici importante deoarece influențează rezistența mecanică, biocompatibilitatea, adeziunea celulară, proliferarea și diferențierea osteogenică. Proprietățile alginatului variază în funcție de specia de alge din care acesta se extrage. Astfel, alegerea algelor ce vor fi recoltate în scopul obținerii de alginat se bazează atât pe disponibilitate cât și pe proprietățile alginatului pe care acestea îl conțin.

Din punct de vedere al structurii chimice, alginatul este un copolimer, care conține doi acizi uronici (α-L-guluronic (G) și β-d-manuronic (M)) în proporții diferite. Acești acizi sunt uniți prin legături 1-4-β-glicozidice. Proporția în care se găsesc acești acizi și distribuția acestora variază foarte mult în funcție de sursa de alge. Raportul dintre acizii α-L-guluronic și β-d-manuronic influențează masa moleculară și proprietățile fizice ale polimerului.

Alginații se prezintă sub trei tipuri în functie de specia de alge din care sunt extrași. Primul tip constă în întregime din unități de acid D-manuronic, al doilea tip conține doar unități de acid L-guluronic și al treilea tip alternează unități de acid D-manuronic și L-guluronic, așa cum se poate observa în Figura 6 . Fiecare specie de alge prezintă proporții diferite din cele trei tipuri de alginat.

Figura 6. Caracteristici structurale ale alginatului: (a) monomerii alginatului, (b) conformația lanțului polimeric de alginat și (c) distribuția blocurilor M și G.

Modul de aranjare a catenei macromoleculare este deosebit de important deoarece influențează tăria moleculei. În funcție de aplicația vizată, se pot alege anumite tipuri de alginat, ținând cont de masa moleculară și de raportul dintre unitățile de acid manuronic și acid guluronic. De exemplu, viscozitatea depinde în principal de masa moleculară a polimerului, în timp ce gelifierea (afinitatea pentru cationi bivalenți) este influențată de conținutul de acid guluronic. Prin urmare, conținutul ridicat de acid guluronic duce la obținerea unui gel mai puternic.

Capacitatea de a gelifia

Gelifierea alginatului poate fi indusă prin scăderea pH-ului sau prin adăugarea de diferiți cationi bivalenți, în special Ca2+, care au rolul de a reticula blocurile G din cadrul lanțurilor de alginat. Afinitatea alginatului pentru ionii metalici bivalenți depinde de cantitățile relative de unități de acid D-manuronic și acid L-guluronic, și scade în următoarea ordine:

A. Pentru alginatul bogat în unități M (extras din Laminaria digitata): Pb > Cu > Cd > Ba > Sr > Ca > Co, Ni, Zn, Mn > Mg,

B. Pentru alginatul bogat în unități G (extras din Laminaria hyperborea): Pb > Cu > Ba > Sr > Cd > Ca > Co, Ni, Zn, Mn > Mg.

Pe lângă interacțiunile ionilor metalici cu grupările carboxil ale alginatului, grupările hidroxil de pe polimer au rol în legarea ionilor. În timpul procesului de reticulare, blocurile de acid L-guluronic împreună cu ionii de calciu (Ca2+) sau cu ionii metalelor grele sunt responsabili pentru formarea așa-numitelor structuri “egg-box”, după cum se poate observa în Figura 7.

Figura 7 .Gelifierea ionică a alginatului de sodiu în prezența ionilor divalenți de calciu

Gelifierea alginatului se produce în prezența cationilor bivalenți de Ca2+, Mg2+, Sr2+, Ba2+, deoarece aceștia interacționează cu grupările carboxil ale unităților de acid L-guluronic, formând punți ionice. Schimbul ionic se bazează pe disponibilitatea unităților de acid L-guluronic. Astfel, prin tratarea cu săruri de calciu a soluțiilor apoase de alginat de sodiu, se formează geluri termo-ireversibile de alginat de calciu.

Caracteristicile gelurilor de alginat sunt influențate de structura polimerului, masa moleculară și modalitatea de adăugare a ionilor de calciu. Gelul format din alginat cu conținut ridicat de acid guluronic este mult mai rigid, în timp ce gelul format din alginat cu mai mult acid manuronic prezintă o mai bună flexibilitate, dar o rigiditate slabă. Rigiditatea gelurilor este influențată de raportul acid guluronic/acid manuronic, iar rezistența gelului de alginat este dată de proporția ridicată de α-L-guluronic G.

Pentru a încetini și controla gelifierea, clorura de calciu (CaCl2) poate fi înlocuită cu sulfat de calciu (CaSO4) sau carbonat de calciu (CaCO3), deoarece aceștia prezintă solubilități mai mici. Schimbul ionilor de sodiu cu cei de calciu și procesul de gelifiere au loc în condiții relativ blânde, având rolul de a asigura termostabilitatea polimerului. Datorită legăturilor ionice, structura de gel este termostabilă în interval 0-100oC, prin urmare, încălzirea nu va determina lichefierea gelului. Totuși, gelul poate fi ușor redizolvat prin imersarea acestuia într-o soluție conținând o concentrație mare de sodiu, potasiu sau magneziu.

Soluțiile de alginat sunt stabile între pH 5–10. Scăderea rapidă a pH-ului sub 3,5 determină precipitarea acidului alginic și destabilizarea suspensiilor, în timp ce scăderea lentă a pH-ului conduce la formarea gelului. În general, ordinea stabilității este: alginat de sodiu> alginat de amoniu> acid alginic. Diferitele tipuri de săruri de alginat conferă o stabilitate diferită.

Solubilitatea

Solubilitatea în apă a alginaților variază în funcție de structură, masa moleculară, pH, și prezența unor cationi. Astfel, solubilitatea polizaharidei scade odată cu creșterea masei moleculare sau cu scăderea pH-ului. Acidul alginic este insolubil în apă, în timp ce sărurile monovalente (Na, K, NH4) sunt hidrosolubile. Pentru a asigura solubilitatea, este necesar să folosim alginații preponderent sub formă de săruri monovalente. Astfel, în funcție de tipul de sare produs, acidul alginic poate să fie solubil sau insolubil în apă.

Sărurile de sodiu și alte metale alcaline sunt solubile, în timp ce sărurile cationilor polivalenți și sărurile de calciu sunt insolubile în apă, cu excepția magneziului. Legarea cationilor polivalenți de alginat se realizează atunci când există două unități de acid guluronic învecinate. Astfel, cationii polivalenți sunt responsabili pentru legarea încrucișată a două molecule de polimer.

Alginatul se dizolvă în apă deionizată, la temperaturi scăzute pentru a se realiza dispersia uniformă, apoi se încălzește la 70oC pentru dizolvare completă. De asemenea, acesta este solubil în alcooli și cetone, dar nu este solubil în soluții ce conțin Ca2+. Dacă alginatul de sodiu trebuie să fie adăugat într-o astfel de soluție, poate fi utilizat un agent chelator pentru a capta Ca2+. Alginatul de propilen glicol (80-85% esterificat) este mai puțin afectat de ionii de calciu. Acesta este rezistent la acizi, rămânând solubil până la pH-ul 2.

Din cauza solubilității, metoda principală de extracție a alginatului din alge presupune transformarea tuturor sărurilor de alginat în săruri de sodiu, dizolvarea acestora în apă și îndepărtarea reziduurilor prin filtrare.

Vâscozitatea

Viscozitatea soluțiilor de alginat este influențată de o serie de factori. Tratamentul termic de scurtă durată determină scăderea reversibilă a viscozității soluțiilor, însă tratamentul termic de lungă durată afectează ireversibil viscozitatea soluțiilor de alginat, deoarece se produce depolimerizarea alginaților. În general, viscozitatea alginatului crește odată cu concentrația utilizată de alginat și scade odată cu creșterea temperaturii. Aceste modificări sunt mult mai evidente la tipurile de alginat cu viscozitate mare. Cei cu viscozitate mare se degradează mult mai rapid decât cei cu viscozitate medie sau scăzută.

Soluția pură de alginat de sodiu poate fi păstrată la temperatura camerei timp de câteva luni, fără a avea loc o schimbare evidentă a viscozității. Atunci când temperatura va crește, soluțiile de alginat se vor depolimeriza.

Biocompatibilitatea

Deși biocompatibilitatea alginatului a fost evaluată pe scară largă atât in vitro cât si in vivo, există încă nelămuriri cu privire la impactul compoziției alginatului. În cea mai mare parte, această confuzie se referă la nivelurile diferite de puritate ale alginatului studiat în diferite rapoarte M/G. Atât timp cât alginatul este purificat, acesta este biocompatibil.

3. Aplicații ale (bio)printării

Cel mai mare avantaj pe care îl oferă imprimantele 3D în aplicațiile medicale este libertatea de a produce produse și echipamente medicale personalizate. De exemplu, utilizarea tipăririi 3D pentru personalizarea protezelor și implanturilor poate deveni un mare ajutor atât pentru pacienți, cât și pentru medici.

Utilizările medicale actuale ale tipăririi 3D pot fi organizate în mai multe categorii:

fabricarea de țesuturi și organe(planificare chirurgicală-scanare 3D pentru producerea de modele fizice exacte)

crearea de proteze (inclusiv proteze personalizate)

implanturi și modele anatomice

cercetarea farmaceutică privind descoperirea, distribuirea și dozarea medicamentelor.

Deși, încă în fază incipientă, (bio)printarea 3D oferă avantaje importante suplimentare(care oferă în esență suport pentru scaffold-uri):

plasarea celulară foarte precisă

controlul digital de mare viteză

-rezoluție

concentrația celulară

volumul picăturilor

diametrul celulelor tipărite.

Sunt disponibile diferite materiale pentru a construi scaffold-uri, în funcție de forța dorită, porozitatea și tipul de țesut, cu hidrogeluri considerate de obicei cele mai potrivite pentru producerea țesuturilor moi. Deși (bio)printarea țesuturilor și organelor este încă în fază incipientă, multe studii au furnizat dovada conceptului. Cercetătorii au folosit imprimante 3D pentru a crea un menisc, genunchi, os și o ureche artificial.

Avantajele imprimării 3D includ controlul precis al dimensiunii și dozei picăturilor, reproductibilitatea ridicată și capacitatea de a produce forme de dozare cu profiluri complexe de eliberare a medicamentului .

.Fabricarea de țesuturi și organe

Denaturarea țesutului și organelor datorită îmbătrânirii, bolilor, accidentelor și defectelor congenitale este o problemă medicală critică. Soluția actuală pentru insuficiența organelor se bazează în mare parte pe transplanturile de organe de la donatori. Cu toate acestea, există o lipsă gravă de organe umane pentru transplant. Spre exemplu, în 2009, 154,324 pacienți din SUA așteptau un organ. Doar 27996 dintre ei (18%) au beneficiat de un transplant, iar 8,863 (25 pe zi) au decedat pe lista de așteptare. Chirurgia transplantului de organe și monitorizarea este, de asemenea, costisitoare, costând mai mult de 300 miliarde SUA în 2012.

O problemă suplimentară este că transplantul de organe, implică adesea dificila misiune de a găsi donatorul potrivit. Această problemă ar putea fi eliminată prin utilizarea celulelor luate din corpul pacientului pentru a construi un organ de înlocuire. Aceasta ar reduce la minimum riscul respingerii țesuturilor în cazul necompatibilității.

Progresele studiilor privind (bio)printării au fost realizate cu succes, dar organele care au fost produse sunt miniaturizate și relativ simple. De asemenea, ele sunt adesea avasculare, subțiri sau goale. Cu toate acestea, atunci când grosimea țesutului fabricat depășește 150-200 micro -metri, depășește limita pentru difuzia de oxigen dintre țesutul gazdă și cel transplantat.

Crearea de proteze

Abilitatea de a produce rapid implanturi și proteze personalizate, rezolvă o problemă clară și persistentă în ortopedie, unde implanturile standard nu sunt adesea suficiente pentru unii pacienți, în special în cazuri complexe.

Imprimarea 3D a avut deja un efect pozitiv asupra producției de aparate auditive. Astăzi, 99% dintre aparatele auditive care se potrivesc în ureche sunt personalizate folosind imprimarea 3D. Canalul urechilor fiecăruia are o formă diferită, iar utilizarea tipăririi 3D permite personalizarea în mod eficient din punct de vedere al costurilor.

Introducerea dispozitivelor auditive personalizate pe piață a fost facilitată de faptul că dispozitivele medicale de clasă I pentru uz extern sunt supuse mai puține restricțiilor de reglementare. Invisalign sunt o utilizare comercială reușită a tipăririi 3D, cu 50.000 tipărite zilnic. Aceste elemente ortodontice imprimate 3D, detașabile, sunt realizate la comandă și unice pentru fiecare utilizator. Acest produs oferă un bun exemplu pentru modul în care imprimarea 3D poate fi utilizată eficient și profitabil de a face elemente simple, personalizate, complexe.

Implanturi

Anterior, chirurgii au trebuit să efectueze operații de grefă osoasă sau să modifice implanturile prin răzuirea bucaților de metal și plastic într-o formă dorită, mărime și potrivire. Acest lucru este valabil și în neurochirurgie: craniile au forme neregulate, deci este greu de standardizat un implant cranial. La victimele leziunilor craniene , în cazul în care osul este îndepărtat pentru a oferi spațiu creierului, placa craniană care este montată mai târziu, trebuie să fie perfectă. Astfel, tot mai multe sunt create folosind imprimantele 3D, ceea ce face mult mai ușor să fie personalizat design-ul. Au existat multe alte succese comerciale și clinice în ceea ce privește imprimarea 3D a protezelor și a implanturilor.

Modelele neuro-anatomice tipărite 3D pot fi utile pentru neurochirurgi prin furnizarea unei reprezentări a unora dintre cele mai complicate structuri din corpul uman. Deformările spinale complexe pot fi, de asemenea, studiate mai bine prin utilizarea unui model 3D. Modelele anatomice 3D de înaltă calitate cu patologia potrivită pentru medicii, pentru efectuarea colonoscopiilor sunt de asemenea, vitale, deoarece cancerul colorectal este a doua cauza principala a deceselor legate de cancer in Romania. Modelele tipărite 3D au fost folosite în numeroase cazuri pentru a obține o perspectivă asupra anatomiei specifice a pacientului înainte de o procedură medicală.

Cercetarea farmaceutică privind descoperirea, distribuirea și dozarea medicamentelor

Scopul dezvoltării medicamentului ar trebui să fie creșterea eficacității și scăderea riscului de reacții adverse, obiectiv care poate fi realizat prin aplicarea tipăririi 3D pentru a produce medicamente personalizate. Tabletele orale sunt cea mai populară formă de dozare a medicamentului datorită ușurinței de fabricație, evitării durerii și dozării exacte. Tabletele orale se prepară în prezent prin procedee bine stabilite, cum ar fi amestecarea, măcinarea și granularea uscată și umedă a ingredientelor sub formă de pulbere, care se formează sub formă de tablete prin comprimare sau matrițare. Fiecare dintre aceste etape de fabricare poate întâmpina dificultăți, cum ar fi degradarea medicamentului și modificări ale formelor, care ar putea conduce la eșecul lotului.

Personalizate, medicamentele tipărite 3D pot beneficia în special pacienții despre care se știe că au un polimorfism farmacogenetic sau care utilizează medicamente cu indicatori terapeutici îngusti. Farmacistii ar putea analiza profilul farmacogenetic al pacientului, precum și alte caracteristici cum ar fi vârsta, rasa sau sexul, determinând o doză optimă de medicamente.

Imprimarea 3D, are de asemenea, potențialul de a produce medicamente personalizate în formulări complet noi, cum ar fi pastile care includ mai multe ingrediente active, fie ca un singur amestec, fie ca tablete multistratificate imprimate. Furnizarea pacienților o doză precisă, personalizată de medicament multiplu într-o singură tabletă ar putea îmbunătăți starea de sănătate a pacienților.

Tehnologiile de imprimare 3D folosite pentru producția farmaceutică sunt imprimantele 3D pe bază de jet de cerneală. Avantajele imprimării 3D includ controlul precis al dimensiunii și dozei picăturilor, reproductibilitatea ridicată și capacitatea de a produce forme de dozare cu profiluri complexe de eliberare a medicamentului .

3.1 Aplicații ale alginatului de sodiu cu ajutorul imprimantelor 3D

Alginatul prezintă un interes deosebit pentru o gamă largă de aplicații ca biomaterial și, în special, ca matrice de sprijin sau sistem de livrare pentru repararea și regenerarea țesuturilor. Datorită proprietăților excelente în ceea ce privește biocompatibilitatea, biodegradabilitatea, non-antigenicitatea, alginatul a fost utilizat pe scară largă într-o varietate de aplicații biomedicale, incluzând ingineria tisulară, administrarea de medicamente și în unele forme pentru prevenirea refluxul gastric.

Scaffold-urile sunt adesea folosite pentru livrarea de medicamente, factori de creștere și celule utile din punct de vedere terapeutic. La fel, materialele de scaffold-uri permit protecția substanțelor sau a celulelor biologic active de cele biologice din mediul inconjurator. În funcție de locul de implantare, biomaterialele sunt supuse unui pH diferit care afectează proprietățile de degradare, proprietățile mecanice și comportamentul de gonflare a materialului.

Alginatul poate fi ușor modelat în scaffold-uri de diferite forme (sfere, bureți, spume, fibre și tije) pentru cultura celulară, ceea ce îl face potrivit pentru aplicațiile în medicina regenerativă.

Aplicațiile alginaților se bazează pe următoarele trei caracteristici principale:

Capacitatea de a crește viscozitatea soluțiilor apoase prin dizolvarea alginatului în apă.

Capacitatea de a forma geluri atunci când se adaugă o sare de calciu într-o soluție apoasă de alginat de sodiu.

Capacitatea alginatului de a forma filme și fibre.

Astfel, alginatul este folosit frecvent în industria alimentară, farmaceutică, ingineria tisulară, în obținerea pansamentelor, ca material pentru încapsularea celulară sau ca vehicul injectabil pentru transplantarea celulelor, datorită proprietăților sale remarcabile: biocompatibilitate, cost relativ scăzut, biodegradabilitate, non-antigenicitate și gelifiere ușoară cu cationi bivalenți.

Fiind un polimer hidrofil, alginatul este utilizat pentru transportul medicamentelor hidrofile. Acesta nu poate fi încărcat cu cantități semnificative de medicamente hidrofobe.

De asemenea, se pot obține cu ușurință hidrogeluri, care se recomandă ca materiale pentru scaffold-uri cu aplicații în ingineria tisulară, precum și ca sisteme de transport pentru eliberarea controlată a medicamentelor.

Alginatul reprezintă una dintre cele mai studiate polizaharide în domeniul încapsulării medicamentelor și celulelor. Modificarea moleculei de alginat poate conduce la obținerea unor biomateriale utilizate pentru repararea și regenerarea diferitelor țesuturi, cum ar fi pielea, cartilajul și țesutul osos.

În concluzie, alginatul prezintă mai multe proprietăți care îl fac potrivit pentru obținerea de scaffold-urilor prin tehnica de fabricare printare 3D. Capacitatea sa de a crește vâscozitatea soluțiilor apoase atunci când se dizolvă, este deosebit de importantă în formularea unor amestecuri extrudabile pentru printarea 3D. Această polizaharidă permite obținerea unei game variate de biomateriale, matrici suport sau sisteme de livrare de medicamente, cu aplicații în medicina regenerativă.

Descărcarea hidrogelurilor în timpul (bio)printării prin extrudare, restricționează folosirea hidrogelurilor de alginat cu greutate redusă, care, în funcție de aplicație, prezintă proprietăți mecanice slabe. Cu toate acestea, proprietățile structurale și mecanice ale alginatului, necesare pentru fiecare țesut imprimat, pot fi reglate prin încorporarea altor biomateriale în scaffold sau prin utilizarea diferitelor metode de fabricare a hidrogelului .

Îmbină proprietățile termosensibile ale alginatului și reticularea chimică a sodiului pentru a realiza reticularea rapidă și integritatea structurală pe termen lung a construcțiilor imprimate 3D. Combinația ambelor materiale a întărit proprietățile mecanice, o cerință pentru ingineria tisulară.

Aplicații ale alginatului de sodiu în ortopedie

Proprietățile mecanice ale alginatului pentru (bio)printarea osoasă sunt slabe (de exemplu, rigiditatea în timpul deformărilor elastice ale osului variază între 15-25 GPa, în timp ce alginatul este mult mai mic: 150-550 kPa). Se poate concluziona că combinația dintre alginat și alți polimeri cum ar fi hidroxiapatită, policaprolactonă sau biosilică, printre altele, îmbunătățește imitarea proprietăților mecanice ale oaselor în construcțiile 3D tipărite.
Alginatul a fost utilizat pe scară largă în (bio)printarea 3D a cartilajelor. Cercetătorii de la Laboratorul Atala, Winston-Salem, NC, SUA au creat cartilaj stratificat cu proprietăți mecanice.

3.2 Studii realizate cu succes în domeniul (bio)printării

1. Medicii de la Universitatea din Michigan au publicat un studiu de caz în New England Journal of Medicine, care raportează că utilizarea unei imprimante 3D și imaginile CT ale căilor respiratorii ale pacientului le-au permis să fabrice o imitație precisă, bioresorbabilă, traheală care a fost implantată chirurgical unui sugar cu traheobronchomalacia. Implantarea s-a realizat cu succes, pacientul recuperându-se complet.

2. Un studiu realizat în cadrul companiei Organovo a dezvoltat benzi de țesut hepatic în scopul regenerării ficatului. Progresele studiilor privind (bio)printarea au fost realizate cu succes, dar organele care au fost produse sunt miniaturizate și relativ simple.

3. Colaboratorii unei rețele de instituții academice , inclusiv Universitatea din Sydney, Universitatea Harvard, Universitatea Stanford și Institutul de Tehnologie din Massachusetts, au reușit fabricarea unei rețele funcționale și perfuzabile de capilare, o realizare care reprezintă un pas semnificativ spre depășirea acestei probleme.

4. O echipă de cercetare de la Institutul de Cercetare BIOMED din Belgia a implantat cu succes prima proteză mandibulară titanică imprimată 3D. Implantul a fost realizat folosind un laser pentru a topi succesiv straturi subțiri de pulberi de titan.

5. În 2013, Oxford Performance Materials a primit aprobarea FDA pentru un implant cranian de polieterketoncetonă (PEKK) imprimat 3D, care a fost implantat cu succes în acel an.

4.Partea experimentală

4.1Materiale utilizate

Pentru studiul experimental, s-au folosit următoarele materiale: alginat de sodiu, furnizor Sigma-Aldrich, clorură de calciu (CaCl2) producător Sigma-Aldrich și apă dublu distilată, produsă în laborator cu un bidistilor tip GFL 2102.

În prima etapă, a fost realizat în laborator soluție tampon HEPES cu pH 7,42 la o concentrație de 25 mM. Pentru reglarea pH-ului, am folosit hidroxid de sodiu (NaOH), sub formă de soluție apoasă, de concentrație 1M, producător Sigma-Aldrich și acid clorhidric (HCl), sub formă de soluție apoasă, de concentrație 1M, furnizor Sigma-Aldrich. NaOH, având pH bazic, crește pH-ul soluției tampon și acidul clorhidric, având pH acid, scade pH-ul HEPES-ului.

Alginatul de sodiu (AlgNa) a fost dizolvat în HEPES. Pentru dizolvarea sa rapidă s-a folosit agitarea magnetică și o temperatură de 50șC.

Pentru obținerea de scaffold-uri poroase care integrează canale microfluidice, s-au utilizat soluții de AlgNa reticulate în timpul printării cu soluție de CaCl2. Pe scurt, pentru obținerea structurilor filamentare ce conțin aceste canale microfluidice, s-au parcurg următoarele etape:

Prepararea amestecurilor precursoare

Proces simultan de printare 3D cu ac coaxial a soluțiilor precursoare și reticulare

Post-reticularea structurilor fabricate

4.2 Prepararea amestecurilor precursoare

Pentru fabricarea structurilor poroase și optimizarea parametrilor de proces s-a pregătit o serie de soluții apoase de AlgNa cu concentrații de 3%, respectiv 5% w/v. În acest scop, în prima fază s-a pregătit o soluție tampon HEPES (25mM) cu pH 7,4. Pentru obținerea soluțiilor de AlgNa, acesta s-a adăugat treptat peste soluția tampon, sub agitare magnetică viguroasă, dizolvarea avand loc la o temperatură de 50°C.

Această temperatură a fost selectată pentru a grăbi procesul de solubilizare a polizaharidei. După pregătirea soluțiilor, înainte de a fi încărcate în cartușele imprimantei 3D, s-a realizat o degazare a acestora folosind o baie de ultrasonare, cu scopul de a îndepărta bulele de aer din interior soluțiilor. Acest pas este unul foarte important, deoarece prezența bulelor de aer conduce la defecte în filamentele de hidrogel printat.

A doua soluție, utilizată pentru reticularea alginatului, a fost obținută în condiții similare, prin dizolvarea CaCl2 în soluție de tampon HEPES, până la o concentrație finală de 5% w/v.

4.3. Proces simultan de printare 3D cu ac coaxial a soluțiilor precursoare și reticulare

Pentru fabricarea structurilor vizate s-a folosit un echipament 3D Discovery (RegenHu). Echipamentul este o (bio)imprimantă, dotată cu 4 capete de printare care folosesc tehnici diferite de dispensare a materialelor, controlate prin presiune pneumatică. Capul de printare de interes pentru acest studiu, este cel dotat cu un ac coaxial.

4.3.1 Capul de printare cu ac coaxial

Acest cap de printare are la bază tehnica de dozare a soluțiilor prin micro-valve cu deschidere electromagnetică, pentru distribuirea exactă prin contact a materialului. Este destinat distribuției de medii cu vâscozități scăzute sau medii. Aceast cap de printare permite extrudarea coaxială a două medii diferite. Soluțiile sunt stocate în cartușe pneumatice și aerul comprimat este utilizat pentru extrudarea materialului prin duză. Presiunea aplicată pe cartușe poate fi reglată cu ajutorul regulatorului de presiune deasupra instrumentului.

Cele două micro-valve inter-schimbabile (1) dispuse în canalul fluidic, controlează fluxul de material. Partea centrală a micro-valvei este o bilă de rubin (2) care este apăsată pe deschiderea valvei (3) cu un arc de închidere (4) pentru a etanșa duza în starea închisă a valvei. Această structură de etanșare realizează curse precise de deschidere de câteva sutimi de milimetru și repetă mișcarea cu acuratețe în acest interval de lungimi. Capul de printare poate fi echipat cu diferite ace coaxiale cu diametre interioare diferite (5) (Figura 8 )

Figura 8 Micro-valvele capului de printare coaxial (1), structura interna a unei micro-valve (2-4), acul de printare coaxial (5)

În figura 9 capul de printare (A) alimentează canalul de curgere interior al acului coaxial, în timp ce capul de printare (B) alimentează canalul de curgere exterior al acului coaxial. Micro-valvele sunt montate în suportul capului de printare (6) care găzduiește solenoidul care generează puterea pentru deschiderea valvelor. Capătul superior al micro-valvei se introduce în adaptorul de admisie (8). Materialele sunt introduse în cartușe (7) care sunt conectate la adaptorul de admisie (8) cu un adaptor cu filet Luer-Lock (9). Cartușele (7) sunt acoperite cu adaptoarele de presiune (10) care sunt conectate prin tubulatură pneumatică la regulatoarele de presiune.

Figura 9. Componentele capului de printare cu ac coaxial

Cele două duze au diametre de 300 μm, respectiv 450 μm. Prin duza cu diametru mai mic, respectiv capul (A) a fost injectată soluția de CaCl2, iar prin duza cu diametru mare, capul (B) a fost injectată soluția de AlgNa. Debitului celor două soluții a fost controlat prin reglarea presiunii de distribuire, a timpului de deschidere și închidere a supapei și a distanței de dozare. Forma și dimensiunile filamentelor de hidrogel printate au fost controlate prin ajustarea parametrilor menționați mai sus și viteza mișcării acului pe axele XY.

Dimensiuni ac coaxial: diametru interior: Ø 0.3 mm (acul interior); Ø 0.69 mm (acul exterior); lungime 8mm.

4.3.2Parametrii de printare specifici capului de printare cu ac coaxial

În figura 10 sunt ilustrați parametrii specifici de printare pentru acul coaxial:

Distanța de dozare

Distanța de dozare specifică distanța dintre fiecare picătură sau cantitate de material distribuită. Distanța minimă posibilă este de 0,02 mm; distanța maximă posibilă este de 5 mm.

Timpul de deschidere al valvei

Această valoare specifică durata de timp în care micro-valva capului de printare rămâne deschisă. Cu cât timpul de deschidere este mai mare, cu atât mai mare va fi volumul de picătură distribuit sau porțiunea de material. Sunt posibile valori între 100μs și 50000000μs.

Timpul de închidere al valvei

Această valoare specifică durata de închidere a micro-valvei capului de printare. Cu cât este mai mare timpul de închidere, cu atât mai mici vor fi volumul de picătură sau cantitatea de material distribuite. Acest parametru se va aplica numai în dozarea manuală sau în cazul distribuirii unui singur punct. Sunt posibile valori între 300μs și 50000000μs.

Figura 10. Parametrii de dozare ai capului de printare coaxial

4.3.3 Influența timpului de reticulare a soluției precursoare de hidrogel

Soluția de AlgNa a fost extrudat în straturi pentru a forma obiecte 3D stabile. Din această cauză trebuie îndeplinite două condiții importante:

Filamentele de hidrogel trebuie să fie reticulate suficient de rapid pentru a menține forma proiectată a obiectului printat

Straturile de material trebuie să se îmbine între ele

Materialul distribuit nu trebuie să se gonfleze sau să se micșoreze mult în timpul procesului de construcție

În general, în cazul acelor simple, materialul poate fi extrudat în prezența aerului sau într-un lichid. Dispersarea într-un mediu lichid are avantajul că efectul de flotabilitate în lichid împiedică deformarea în structura distribuită dar nu complet întărită. Prin urmare, numai materialele cu solidificare rapidă sau foarte vâscoase pot fi în general prelucrate în aer (ex. topitură de polimer).

Din punct de vedere al științei materialelor, pot fi luate în considerare patru tipuri diferite de procese de întărire:

solidificare indusă termic

solidificarea indusă de o reacție chimică

solidificarea indusă de precipitare

solidificarea post-proces prin sinterizare

Studiul de față a avut în vedere numai al doilea tip de proces de întărire, și anume reticularea ionică a alginatului de sodiu în prezența ionilor de Ca2+, proveniți din soluția apoasă de CaCl2, injectată prin acul intern al duzei coaxiale. Reticularea trebuie sa se petreacă în același timp cu dispensarea materialului pentru fi posibilă fabricarea scaffold-ului de alginat.

4.4.4 Presiunea și viteza de distribuire a soluțiilor

Presiunea de extrudare depinde de debitul de material prin duză și trebuie reglat la viteza la care materialul este reticulat. Cu cât precursorul de hidrogel este reticulat mai încet, cu atât este mai mic debitul de dispensare. Un debit scăzut de distribuire va permite materialului să se întărească, în timp ce acesta se află încă afectat de vârful acului, rezultând fire mai robuste, subțiri și mai rotunjite. Un debit de distribuție prea rapid în raport cu viteza de reticulare va duce la deformarea filamentului de hidrogel sub acțiunea propriei greutăți, până la reticularea completă a materialului.

Cu cât materialul este reticulat mai rapid, cu atât viteza de dozare trebuie să fie mai mare, astfel încât aderența materialului planificat să fie încă suficient de mare pentru a lega straturile atunci când filamentul de alginat atinge stratul anterior.

Rata de distribuire trebuie adaptată la viteza de mișcare XY a echipamentului. Figura 11 prezintă diferite situații ale fâșiei, având în vedere viteza de distribuire și viteza de deplasare. Dacă rata de distribuire este prea mare în comparație cu viteza de mișcare XY, atunci se va distribui prea mult material, iar filamentul își va mări diametrul sau va fi împins în lateral (Figura 12a). Figura 12b reprezintă situația optimă: materialul părăsește duza și este imediat așezat și lipit de stratul anterior. În acest fel, filamentul este doar puțin deformat.

Figura 12c ilustrează cazul în care viteza de deplasare pe XY este prea mare față de rata de distribuire. În acest caz, filamentul este întins după ce a fost distribuit, atingând mult prea târziu stratul anterior, de cele mai mult rezultând în formarea de picături sau de aglomerări de material.

De asemenea, relația dintre cei doi parametrii vor influența și aspectul colțurilor obiectului printat. O valoare prea mare a vitezei se va traduce prin rotunjirea colțurilor, pe când o valoare prea mică a vitezei va conduce la obținerea de aglomerări de material în colțurile obiectului. Astfel, obiectul va avea marginile mai înalte decât interiorul său. Situația ideală este un obiect care prezintă colțuri ascuțite (Figura 13)

Figura 11 Influența debitului de material și a vitezei de printare asupra aspectului unui filament

După pregătirea soluțiilor precursoare, s-a trecut la etapa propriu-zisă de printare. În acest sens, s-a început cu realizarea unor constructe simple, fără porozitate interioară, așa cum se poate observa in figura 12. Structurile au fost printate cu un număr variabil de straturi, pentru a se putea face o evaluare a stabilității constructelor sub propria greutate. S-a constat că pe măsura depunerii unui număr mai mare de staturi, marginile exterioare au tendința de a se aglomera pe verticală, pe când interiorul are o înălțime mai mică.

Figura 12. Structuri filamentare realizate în timpul optimizării parametrilor de printare

După reglarea concomitentă a parametrilor de depunere pentru fiecare soluție, în pasul următor s-au fabricat scaffold-uri după diferite modele, cu porozitate din ce în ce mai ridicată, așa cum se poate observa în figura 13, toate având dimensiunile conturului de 20 mm×20mm.

Figura 13. Structuri realizate folosind diferite modele de printare

Dimensiunile geometrice ale modelului final au fost de 20 mm×20mm pentru fiecare strat, cu un total de 10 straturi depuse la unghiuri de 90ș. Fiecare strat prezintă câte 36 de pori cu dimensiuni aproximative de 2 mm×2 mm (figurile 13, 14).

Figura 13. Stânga – imagine reprezentând procesul de printare a structurilor poroase după realizarea modelului final; dreapta – hidrogelurile printate 3D

Figura 14. Reprezentarea unui construct de AlgCa printate 3D

Tabelul 4 prezintă parametrii de printare optimizați, care au permis fabricarea de structuri stabile, manevrabile, cu dimensiuni și arhitectură reproductibilă.

Tabel 4 Parametrii de printare optimizați

4.4.5 Post-reticularea structurilor fabricate

Pentru a ne asigura de stabilitatea structurilor fabricate și pentru a le îmbunătății proprietățile mecanice, în ultima etapă experimentală s-a realizat post-reticularea unora dintre scaffold-urile printate. Mai mult s-a dorit o comparație cel puțin calitativă între proprietățile obiectelor strict reticulate în timpul procesului de printare și proprietățile obiectelor supuse unei reticulări suplimentare. Astfel, tabelul 4 prezintă codul probelor finale în funcție de compoziție și procesele de reticulare.

Tabel 4. Compoziția și procesele de sinteză a tipurilor de structuri printate 3D

După realizarea procesului de post-reticulare, toate cele patru tipuri de structuri fabricate au fost incubate în apă dublu distilată, timp de 24 de ore, atât pentru îndepărtarea reactivilor nereacționari, cât și pentru evaluarea stabilității lor.

Așa cum se poate observa din figura 15, proba BC1, fabricată din soluția de AlgNa cea mai diluată (3%) și nesupusă post-reticulării, are manevrabilitatea cea mai scăzută, aceasta rupându-se în timpul perioadei de purificare. Astfel se poate concluziona că reticularea acestei probe realizată doar în timpul printării 3D nu a fost suficientă. În ceea ce privește toate celelalte probe (BC2 – BC4), ele își păstrează integritatea, nemodificându-și semnificativ dimensiunile.

De asemenea, din analiza vizuală a substraturilor obținute, se poate constata că pe măsura creșterii concentrației soluțiilor precursoare de AlgNa, grosimea filamentelor crește și dimensiunile porilor scade.

Figura 15. BC1, BC3 – scaffold-uri care nu au fost supuse tratamentului de post-reticulare,

BC2, BC4 scaffold-uri care nu au fost supuse tratamentului de post-reticulare

Pentru o caracterizare aprofundată a hidrogelurilor printate din punct de vedere al evaluării canalului microfluidic, într-o primă fază probele au fost uscate în etuvă la 37 șC și apoi rehidratate. Cu toate că după uscare probele își pierd considerabil din înălțime, confundându-se practic cu fundul vasului Petri în care au fost uscate, după rehidratare ele revin la dimensiunile inițiale, așa cum se poate observa din figura 16.

Figura 16. Aspectul probei BC2 după uscare (a, b) și după rehidratare (c)

Acest aspect este unul foarte important în ceea ce privește stocarea ulterioară în stare uscată a constructelor fabricate, după o eventuală sterilizare.

4.4.6 Microscopie optică (MO)

În vederea examinării preliminare a morfologiei și arhitecturii interne a scaffold-urilor hidratate, s-au efectuat analize de microscopie optică (MO). S-a utilizat un microscop optic, model Zeiss AxioVert.A1 FL-LED, echipat cu un set de filtru LED FL-38 GFP, un modul LED de 470nm, un obiectiv de 5x și o cameră CCD camera Axiocam 503 mono. Acesta este dotat cu sistem computerizat care permite achiziția de imagini și prelucrarea acestora.

Microscopia optică reprezintă cea mai simplă și rapidă analiză pentru observarea structurilor fabricate prin printarea 3D, permițând analiza lor în stare hidratată (similară cu starea în care se va afla constructul pe perioada utilizării sale).

Imaginile de MO înregistrate pe diferite filamente ale structurii BC2 arată prezența canalului microfluidic prin care a circulat CaCl2. Mai mult, diametrele atât ale filamentelor cât și ale canalelor microfluidice din interiorul lor au dimensiuni asemănătoare de aproximativ 850 µm, respectiv 300 µm. În plus imaginile de MO dovedesc distribuția pe verticală a filamentelor unele peste celelalte pentru toate cele 5 straturi dispuse pe aceeași direcție. Acest lucru sugerează o bună reproductibilitate a morfologiei structurilor printate, atât în ceea ce privește filamentele cât și canalele microfluidice interne.

Figura 17. Imagini de MO înregistrate pentru proba BC2 după rehidratare, care prezintă dimensiunile filamentelor și ale canalelor microfluidice

Nu este de neglijat faptul că, independent de procesele de uscare/rehidratate la care materialul a fost supus, substratul are capacitatea de a reveni la forma și dimensiunile inițiale, cu păstrarea arhitecturii interne.

În ceea ce privește dimensiunea porilor, acești revin și ei la forma inițială, având o deschidere de aproximativ 1,7 mm (figura 18).

Figura 18. Imagine de MO care prezintă un por al structurii printate. Se poate constata interconectivitatea dintre pori pe toată înălțimea materialului

În concluzie, imaginile înregistrate cu ajutorul analizei de MO evidențiază succesul producerii de canale microfluidice în interiorul filamentelor care alcătuiesc structura polimerică tip hidrogel printat 3D. Prin urmare, parametrii de fabricare aleși au fost adecvați amestecurilor precursoare preparate. De asemenea, putem spune că și caracteristicile soluțiilor precum concentrația, viscozitatea, au fost optime.

5.PROIECTAREA

5.1 Schema fluxului tehnologic

În cadrul acestui capitol, este prezentat procesul de proiectare al structurilor poroase de hidrogel printate 3D obținute din alginat de sodiu reticulat cu ioni bivalenți de calciu. Reprezentativă pentru acest proces este schema Fluxului tehnologic (schema 1) în care se regăsesc ilustrate etapele ce intervin fabricarea produsului final.

Schema 1. Fluxul tehnologic

5.2 Descrierea schemei fluxului tehnologic – Bilanț de materiale

1) Dizolvare I

În cadrul acestei etape, s-a obținut soluția tampon HEPES cu pH 7,42 și o concentrație de 25 mM prin dizolvarea sării HEPES în apă bidistilată. Dizolvarea s-a realizat la temperatura camerei, sub agitare magnetică.

Tabel 5. Dizolvare I

2) Dizolvare II

Această etapă presupune obținerea soluției de alginat de sodiu (5% w/v) prin dizolvarea polizaharidei în 50 mL soluție HEPES (pregătită în etapa anterioară).

Tabel 6. Dizolvare II

3)Dizolvare III

În această etapă a fost pregătită soluția de reticulare. Astfel, în soluția tampon HEPES a fost dizolvată clorura de calciu sub agitare magnetică, la temperatura camerei până la atingerea concentrației finale vizate (5% w/v).

Tabel 7. Dizolvare III

4) Dozare I

În această etapă este încărcat primul cartuș cu soluția de alginat de sodiu. Soluția se toarnă cu grijă în cartuș, evitând formarea bulelor de aer care ar putea genera defecte în structura printată.

Întrucât mediul este vâscos, în această etapă apar pierderile de material pe pereții paharului, pierderile fiind de 5%.

Tabel 8. Dozare I

5)Dozare II

Această etapă presupune încărcarea celui de-al doilea cartuș cu soluția de clorură de calciu anterior preparată. Spre deosebire de prima dozare, pierderile considerate în această etapă sunt de numai 2%, soluția de clorură de calciu nefiind vâscoasă.

Tabel 9. Dozare II

6.Printare cu ac coaxial

Etapa presupune realizarea procesului de fabricare de structuri poroase utilizând parametrii experimentali optimizați în timpul etapelor experimentale. Procesul presupune extrudarea concomitentă a celor două soluții din cartușele anterior încărcate. În cadrul acestei operații pierderile sunt semnificative, fiind estimate la un total de 30%.

În timpul procesului de printare apar următoarele tipuri de pierderi:

-soluțiile rămase în cartușe

-soluțiile rămase în acul de printare

-soluția de clorură de calciu expulzată din scaffold după depunerea pe suport

În timpul procesului de printare, clorura de calciu reticulează alginatul de sodiu, obținându-se scaffold-uri de alginat de calciu.

Tabel 10. Printare cu ac coaxial

7.Post-reticulare

În această etapă, structurile printate în etapa anterioară au fost supuse unui nou proces de reticulare secundar, pentru îmbunătățirea proprietăților mecanice și a stabilității în medii de interes. Scaffoldurile de alginat de calciu anterior fabricate, au fost supuse unui proces de post-reticulare prin imersare în soluția de clorură de calciu rămasă după etapa de Dozare II.

Tabel 11. Post-reticulare

8. Purificare

După încheierea procesului de post-reticulare, hidrogelurile poroase au fost purificate prin spălare în băi succesive de apă bidistilată, pentru îndepărtarea reactivilor nereacționați (pierderi de 2% din substratul reticulat incomplet).

Tabel 12. Purificare

9.Uscarea

Uscarea are ca scop evaporarea solventului din obiectele printate 3D. Uscarea se realizează în etuvă la o temperatură de 37°C.

Tabel 13. Uscare

5.3 Bilanțul total de materiale

Bilanțul parțial de materiale a fost calculat pentru obținerea unui numar de 20 de bucăți (structuri cu porozitate controlată fabricate prin printarea 3D).

În tabelul 12 sunt prezentate calculele bilanțului de materiale pentru fiecare etapă.

Tabelul 14. Bilanțul total de materiale

5.4 Calculul economic

Pe baza acestui bilanț se poate realiza o estimare a costurilor cu materii prime necesare pentru obținerea unei producții de 20 de bucăți structuri poroase/ șarjă.

Calculul economic pentru o șarjă de producție, considerând numai costurile cu materii prime (fără costuri cu energia, personal și alte categorii):

Tabel 13 – Estimarea costuriilor materiilor prime estimate corespunzător prețurilor Sigma-Aldrich https://www.sigmaaldrich.com .

Tabel 15. Estimarea costurilor materiilor prime folosite

Tabel 16. Calculul economic pe baza bilanțului total

Concluzii