Legislatia Uniunii Europene Si a Romaniei Pentru Verificarea Criteriilor de Igiena la Carnea de Pasare

Drept

Legislatia Uniunii Europene Si a Romaniei Pentru Verificarea Criteriilor de Igiena la Carnea de Pasare

Byadmin ianuarie 1, 2024

INTRODUCERE

În țara noastră dezvoltarea sectorului avicol determină creștrea consumului cărnii de pasăre în alimentația populației. Aceasta deține o pondere importantă în comerțul mondial ocupând locul trei după carnea de porc și vită.

Valoarea calitativă și cea igienică a unui aliment poate fi compromisă fie din cauza procesului tehnologic, fie pentru că materia primă a fost contaminată cu microorganisme. De aceea în toate unitățile cu profil alimentar pentru asigurarea normelor de igienă este necesară îndeplinirea unor condiții generale referitoare la amplasare, construcție, dotare cât și respectarea unor condiții specifice.

Nerespectarea condițiilor de igienă și a parametrilor fluxului tehnologic de sacrificare a păsărilor cât și natura florei microbiene înmagazinată conduce la diminuarea calității cărnii de pasăre.

Regulile privind încărcătura microbiană ce se aplică pe carnea de mamifere sunt utilizate și pentru carnea de pasăre întrucât în țara noastră nu există reglementări speciale pentru această categorie de carne.

Creșterea calității cărnii reprezintă un avantaj economic datorită utilizării unei tehnologii adecvate cu un flux tehnologic impus de condițiile igienico-sanitare. Pentru prevenirea introducerii în circuitul alimentelor a unor produse improprii pentru consum sau contaminarea lor cu germeni patogeni este necesar controlul sanitar veterinar în toate fazele de prelucrare.

Abatorele de păsări trebiue să aplice procedee de lucru standard privind tehnologia de sacrificare și igienizare; procedee ce reperzintă reguli și mijloace care urmăresc diminuarea riscurilor de contaminare.

Odată cu aderarea României la normele Uniunii Europene, principiile și procedurile privind legislația în domeniul igienei alimentelor devin obligatorii, fiind aplicate și de către aceasta.

Experții FAO/OMS au arătat că tehnologiile actuale de creștere și de sacrificare a păsărilor nu pot elimina germenii existenți pe suparfața carcaselor și de aceea măsurile de igienă luate micșorează numărul acestora.

Pentru susținerea celor mai potrivite decizii în domeniul siguranței alimentelor legislația adoptată stabilește principii și responsabilități comune.

Pentru elaborarea, evaluarea sau modificarea acestei legislații este necesar realizarea unui proces deschis și transparent prin care se consultă publicul direct sau prin intermediul organizațiilor reprezentative.

În România, legislația privind igiena abatoarelor este structurată astfel încât să fie corelată cu prevederile europene.

În unitățile de abatorizare pentru menținerea stării de igienă pe întreg fluxul tehnologic se va avea în vedere : recepția materiei prime, depozitarea, salubritatea teritoriului, pregătirea și manipularea în condiții salubre a cărnii.

În concluzie prezenta lucrare face referire la ansamblul de reguli și măsuri pe care întreg fluxul tehnologic trebuie să le respecte pentru a nu afecta sănătatea populației.

Partea I

CONSIDERAȚII GENERALE

CAPITOLUL 1:

LEGISLAȚIA UNIUNII EUROPENE ȘI A ROMÂNIEI PENTRU VERFICAREA CRITERIILOR DE IGIENĂ LA CARNEA DE PASĂRE

Regulamentul C.E. 853/2004.

Regulamentul 853/2004 prevede stabilirea unor norme specifice ce trebuiesc aplicate produselor alimentare de către operatorii din sectorul alimentar. Acest regulament se aplică doar acelor produse obținute din produse de origine animală prelucrate. Regulamentul nu se aplică producției primare, preparării, manipulării destinate unei utilizări în gospodării, sau aprovizionarea directă de către producător cu cantități mici de carne de pasăre a consumatorului final.

Produsele de origine animală sunt introduse pe piață numai dacă au fost preparate și manipulate în unități autorizate. În situația în care o autoritate competentă îi retrage unei unități autorizația sau nu îi prelungeste autorizația dacă este vorba de o autorizație condiționată operatorii trebuie să asigure că acea unitate își încetează activitatea. O unitate supusă autorizării ce nu prezintă o marcă de salubritate aplicată în conformitate cu Reg.854/2004 nu poate să introducă pe piață produsele pe care le prelucreză. Marca trebuie aplicată înainte ca produsul să iasă din unitate. Dacă este îndepărtat ambalajul sau învelișul unui produs sau dacă acesta este supus unei prelucrări într-o altă unitate, este necesară aplicarea unei noi mărci. Operatorii din sectorul alimentar pot retrage marca de salubritate a cărnii numai în cazul în care este tranșată, prelucrată sau se efectuează alte operații într-o unitate ce nu este prevăzută în prezentul regulament.

Importul de produse de origine animală are loc doar dacă operatorii asigură că țările terțe din care sunt importate,unitățile în care au fost prelucrate produsele, abatoarele și secțiile de tranșare a cărnii sunt prevăzute în regulament. În ceea ce privește comerțul cu produse alimentare de origine animală, operatorii trebuie să se asigure că loturile de produse destinate pentru comerț sunt însoțite de certificate sau documente. Certificatele ce însoțesc carnea de bovine, porcine și carnea de pasăre trebuie să arate că au fost efectuate testele microbiologice având rezultate negative și carnea să fie destinată pasteurizării sau sterilizării.

Pentru aplicarea regulamentului ce poate avea un efect important asupra sănătății publice, Comisia trebuie să se consulte cu Autoritatea Europeană pentru Siguranța Alimentelor.

Regulamentul C.E. 854/2004.

Prezentul regulament se aplică în completarea Regulamentului nr. 882/2004 al Parlamentului European și al Consiliului din 29 aprilie 2004 privind controalele oficiale efectuate pentru a verifica conformitatea cu legislația privind hrana pentru animale și produsele alimentare și cu normele referitoare la sănătatea animală și la bunăstarea animalelor.

Prezentul regulament stabilește norme specifice de organizare a controalelor oficiale privind produsele de origine animală. Sunt necesare norme specifice pentru controalele oficiale privind produsele de origine animală, astfel încât să fie luate în considerare anumite aspecte specifice asociate acestui tip de produse.

Controalele oficiale ale produselor de origine animală ar trebui să cuprindă toate aspectele care au importanță în privința protecției sănătății publice și, după caz, pentru sănătatea animală și bunăstarea animalelor. Aceste controale trebuie să se bazeze pe cele mai recente informații relevante și, prin urmare, trebuie să fie posibilă adaptarea acestora în funcție de noile informații relevante disponibile. Controalele oficiale privind producția de carne sunt necesare pentru a verifica dacă operatorii din sectorul alimentar respectă regulile de igienă, precum criteriile și obiectivele stabilite de legislația comunitară. Aceste controale trebuie să includă audituri ale activităților operatorilor din sectorul alimentar și inspecții, inclusiv verificări ale controalelor efectuate chiar de operatori. Autoritatea competentă dă tuturor unităților desemnate, inclusiv celor care au obținut o autorizație condiționată, un număr de autorizație, căruia i se pot adăuga coduri pentru a indica tipurile de produse de origine animală fabricate. În ceea ce privesc piețele, la numărul de autorizație se pot adăuga numere secundare care să indice unitățile sau grupurile de unități de vânzare sau de fabricare a produselor de origine animală.

Carnea proaspătă, carnea tocată, preparatele din carne, produsele din carne și carnea separată mecanic (MDM) pot fi importate în comunitate numai în cazul în care au fost produse din carne obținută în abatoare și secții de tranșare care sunt înscrise pe listele întocmite și actualizate în conformitate cu prezentul articol sau în unități comunitare desemnate.

Regulamentul C.E. 882/2004.

Acest regulament stabilește normle generale pentru desfășurarea controalelor oficiale care în verificarea respectării normelor ce vizează prevenirea, eliminarea sau reducerea riscurilor ce pot apărea atât pentru oameni cât și pentru animale. Regulamentul nu se aplică controalelor oficiale pentru verificarea respectării normelor privind organizarea comună a pieței produselor agricole.

Controalele oficiale desfășurate în cadrul acestui regulament nu aduc atingere responsabilității legale primare pe care o au operatorii din sectorul alimentar de a asigura siguranța produselor alimentare și nici unei răspunderi civile sau penale care apare în nerespectarea obligațiilor acestora. Efectuarea controalelor trebuie să aibă loc cu regularitate în funcție de riscuri și frecvența corespunzătoare pentru a putea atinge obiectivele acestui regulament. Controalele oficiale se ectuează fără avertisment prealabil spre deosebire de audituri ce necesită o notificare prealabilă a operatorilor din sectorul alimentar.

Aceste controale au loc în orice etapă a producției, prelucrare și distribuire a produselor alimentare aplicându-se cu aceeași prudență exporturilor în afara comunității. Statele exportatoare iau toate măsurile necesare pentru a se asigura că produsele destinate exportului sunt controlate cu aceeași prudență ca cele destinate introducerii pe piață de pe propriul teritoriu. Dacă pe parcusul unui control desfășurat la locul destinației sau pe parcursul depozitării sau transportului, un stat membru constată nereguli acesta paote lua măsuri necesare pentru reexpedierea în țara de origine.

Autoritatea competentă căreia îi revine responsabilitatea controalelor oficiale este desemnată de către state membre, asigurând desfășurarea activităților la un nivel al transparenței ridicate.

Regulamentul C.E. 2073/2005.

Prezentul regulament stabilește criteriile microbiologice pentru anumite microorganisme și normele de punere în aplicare care trebuie respectate de operatorii din sectorul alimentar în procesul de punere în aplicare a măsurilor de igienă generale și specifice.

Modificarea cerințelor specifice referitoare la carnea prospătă de pasăre și introducerea de norme detaliate privind criteriul referitor la salmonelă sunt esențiale pentru asigurarea corectă a legislației Uniunii. Autoritatea Europeană pentru Siguranța Alimentară a elaborat un raport în care arată că 80% din cazurile de salmoneloză la om sunt provocate de Salmonella enteritidis și Salmonella Typhimurium. Una din sursele principale de salmoneloză rămâne carnea de pasăre.

Stabilirea unui criteriu pentru Salmonella enteritidis și Salmonella typhimurium ar permite stabilirea unui raport optim între reducerea cazurilor de salmoneloză la om și consecințele economice ale aplicării criteriului în cauză. Dar în același timp i-ar putea încuraja pe operatorii din sectorul alimentar să ia măsuri ce pot contribui la reducerea tuturor serotipurilor de salmonelă. Standardul internațional EN/ISO 6579 este metoda orizontală de detecție a Salmonella spp. în alimentație și în hrana pentru animale.

Regulamentul C.E. 2073/2005 stabilește un criteriu de igienă procedeelor, aplicabile salmonelei din carcasele de pui și cele de curcan răcite în abatoare, criteriu ce este destinat contaminării cu fecale a carcaselor în cazul în care provin de la efective infectate sau în cazul contaminării încrucișate în abator.

CAPITOLUL 2:

CARACTERISTICI GENERALE ALE GENURILOR CAMPYLOBACTER ȘI SALMONELLA.

2.1. Genul Salmonella spp.

Genul Salmonella spp. este definit ca o grupare de Enterobacteriaceae mobile care metabolizează glucoza fermentativ cu producere moderată de gaz și care produc acid din manitol și sorbitol. Salmonelele, produc H2S și folosesc citrații ca unică sursă de carbon. Nu hidrolizează ureea, nu produc fenilalanindeaminază, indol și acetil metil carbinol.

Salmonelele sunt bacterii ubicvitare aflându-se în mediul înconjurător, de unde ajung în intestinul omului și animalelor. Factorul uman joacă un rol mai puțin important, rolul decisiv este reprezentat de activități incorecte, mai ales când este purtător. Animalele bolnave și/sau purtătoare sunt adesea implicate în transmiterea salmonelelor, în contaminarea materiilor prime, a alimentelor destinate consumului. Omul, deși este considerat o sursă primară de contaminare, deține un rol contaminant modest al alimentelor și implicit al furajelor. Intervenția omului este decisivă prin deprinderea incorectă a activităților de manipulare, transport, stocare și procesare. Un alt factor la fel de important îl constituie creșterea în sistem intensiv a animalelor, în special al păsărilor, precum și industrializarea pe scară largă a procesării alimentelor.

În perioada 1990-1992, Salmonella a ocupat locul întâi la nivel european ca agent etiologic al toxinfecțiilor alimentare. Din cercetările facute atunci s-a constatat că 9.882 din cele 11.699 de focare au fost determinate de Salmonella spp., reprezentând 84,5 %. În mai multe țări din Europa s-au semnalat majorări semnificative în ceea ce privește morbididatea prin salmoneloze. În România, în 1997, au fost confirmate și tipizate de către Centrul Național de Referință pentru Salmonella de la Institutul Cantacuzino din București un număr de 1 475 de tulpini de Salmonella spp.

Toxiinfecțiile alimentare se manifestă cu precădere în anotimpurile calde, cauzate de temperaturile care constituie un factor important pentru dezvoltarea și proliferarea germenilor. Mijloacele prin care Salmonella spp. ajunge în carne sunt:

– stresul la care sunt supuse animalele pe durata transportării în condiții neprielnice pe distanțe mari.

– nerespectarea regulilor de igienă pe durata fluxului tehnologic.

– contaminări cauzate de igiena necorespunzătoare a personalului, prin intermediul mâinilor și a echipamentului de protecție.

Alimentele care pot cauza o infecție cu Salmonella spp. sunt cărnurile crude, ouăle, lapte și produsele derivate din lapte, pește, sosuri și creme pentru salate, pentru prăjituri. Alimentele care au stat la baza izbucnirii epidemiilor cu grad ridicat de importanță, au fost consumul cărnii de pasăre, a ouălor precum și a laptelui pasteurizat.

O altă cauză majoră a TIA grave cu Salmonella spp, este consumul ouălor de galinacee, cauzate de contaminarea conținutului acestora sau chiar a infestării cojilor, în condițiile unei depozitări necorespunzătoare.

Aspectele morfologice ale bacteriilor sunt puse în evidență prin examinare microscopică directă, pe frotiuri colorate, utilizându-se mai multe metode de colorare, cea mai utilizată fiind tehnica Gram.

Salmonelozele se dezvoltă cu temperaturi cuprinse între 20 și 540C. Conservarea alimentelor ambalate sub vacuum la temperaturi de 40-60C nu stopează înmulțirea salmonelelor. Atmosfera îmbogățită cu 20-50 % CO2 la temperaturi cuprinse între 80-110C împiedică proliferarea în carnea tocată. În urma experimentelor efectuate pe carnea de pui contaminată în laborator s-a constatat înmulțirea salmonelelor la 450C, spre deosebire de mutante de Salmonella Typhimurium care s-a multiplicat la 540C. Salmonelele sunt foarte permisive în ce privește pH-ul, proliferând la valori încadrate în intervalul 4,5-9,5, iar valoarea optimă fiind reprezentată între 6,5 și 7,5.

Pe mediile solide și lichide (agar, bulion) salmonelele proliferează generând de regulă colonii mici, netede, rotunde de tip S, cu marginile regulate, uneori având suprafață umedă, pot fi bombate și de dimensiuni mici, coloniile având diametrul de 2-3mm, într-un interval de 18-24 ore la 370C.

2.2. Genul Campylobacter spp.

La început în acest gen erau incluse numai două specii : Campylobacter fetus și Campylobacter bubulus.

În prezent genul Campylobacter cuprinde mai mult de 20 de specii și subspecii cunoscute în privința ecologiei și capacității lor patogene.

Campylobacter spp.este frecvent izolat din apele de suprafață supravențuind mai bine la temperature joase și fiind redusă prin procesul de aerare-oxidare al apei.

Comitetul de experți FAO/OMS a inclus bacteria de Campylobacter jejuni pe lista agenților care produc boli de origne alimentară datorită rolului important în producerea a 85-90% din cazurile de gastroenterită acută la om cu caracter epidemiologic de toxiinfecție alimentară. Este larg răspandită la păsări și mamifere, cele mai multe cu rol de purtător intestinal. Transmiterea la om are loc prin ingestie a alimentelor de origine animală contaminate și a apei contaminate, netratate sau prin contactul direct cu animalele infectate. Foarte rar infecția se poate transmite de la om la om.

Campylobacter jejuni trăiește în tractul intestinal al multor animale domestice și sălbatice cu sânge cald. Păsările de fermă sunt purtătoare de Campylobacter jejuni în proporție de 91-100%, bovinele de 43%, cainii de curte de 49%. Carnea de pasăre este contaminată cu Campylobacter jejuni într-o proporție mult mai mare datorită procentului foarte mare de purtători intestinali și procesului de tăiere și obținere a carcaselor ce determină contaminarea prin fecale.

Toxiinfecția alimentară produsă de Campylobacter jejuni se mainifestă ca o enterită, enterocolită sau gastroenterită acută avand o perioadă de incubație de 1-3 zile. În ziua de azi Campylobacter jejuni este considerat ca fiind una din cele mai frecvente cauze a infecțiilor gastro-intestinale umane în multe țări ale lumii. În SUA aceasta bacteria depășește speciile de Salmonella spp. în producerea bolilor gastro-intestinale.

2.3. Date bibliografice privind contaminarea carcaselor de pasăre

Contaminarea carcaselor de pasăre cu microorganisme poate determina alterarea cărnii reducând termenul de valabilitate al acesteia și poate reprezenta un pericol pentru sănătatea publică determinând declanșarea unor toxiinfecții alimentare. De-a lungul timpului s-au efectuat un numar foarte mare de studii cu privire la contaminarea carcaselor de pasăre cu bacteria de genul Salmonella spp. și Campylobacter spp.

Un studiu efectuat în județul Iași pe o perioadă de trei ani pe un număr de 460 de probe de carne și organe de pasăre arată că, s-a stabilit o incidență de 3,91% probe contaminate cu Salmonella spp. cu o frecvență de 2,78% în carnea de pasăre si 5,78% în proble de organe de pasare (după Elena Ișan și colab., 2003).

Pe plan mondial un număr mare de toxiinfecții alimentare (TIA) este provocat de Salmonella spp., vinovate de aceste toxiifecții fiind în special varietățile Salmonella enteritidis și Salmonella typhimurium. În România cele mai frecvente izolări se fac din carnea de pasăre dezosată mecanic, din organele de pasăre dar și din alte alimente de origine animală.

În ceea ce privește influența pH-ului și a temperaturii asupra speciei Salmonella spp. de pe carnea de pasăre proaspătă, a fost efectuat un studiu ce arată că principalele surse de Salmonella spp. le reprezintă pasările și produsele din carne de pasăre. De aceea pentru a reduce contaminarea, s-a ajuns la tratarea apelor de spălare a carcaselor cu soluție de acid lactic 1%,stopându-se în acest fel înmulțirea microorganismelor sensibile la schimbările de pH ale mediului. Această schimbare a pH-ului a redus încărcătura microbiologică a probelor, în special cea reprezentată de speciile de Salmonella spp., ce proveneau de pe exteriorul carcasei. (după Elena Ișan și colab., 2003).

În urma studiului efectuat contaminarea carcaselor de pasăre cu Salmonella spp. după tratarea apei de spălare cu acid lactic a scăzut de la 14,06% la 4,6%.

CAPITOLUL 3:

METODE DE IGIENIZARE UTILIZATE ÎN ABATORIZAREA CĂRNII DE PASĂRE.

3.1. Igiena personslului, încaperilor și echipamentelot în unitățile de abatorizare.

În ceea ce privește termenul de curat presupune trei aspect:

-curat fizic – ce constă în aprecierea spațiilor de producție, aparatelor și ustensilelor.

-curat chimic – se urmărește absența substanțelor folosite pentru igienizarea și decontaminarea spațiilor de producție si a utilajelor de pe întreg fluxul tehnologic.

-curat microbiologic – vizează absența germenilor patogeni, iar numărul de microorganisme să nu depășeasca limitele admise.

Starea de igienă se apreciază atât înaintea începerii producției cât și pe parcursul desfășurării fluxului tehnologic. Igienizarea și decontaminarea se practică în toate spațiile în care se prelucrează produsele de origine animală pentru a putea fi corespunzătoare din punct de vedere al salubrității. Personalul ce lucrează într-o unitate de abatorizare trebuie ca în timpul lucrului să poarte echipament de protecție specific locului de muncă. Schimbul de haine și consumul de alimente în aceste locuri nu sunt admise. Accesul operatorilor din spațiile de prelucrare a produselor crude în spațiile de tratere termică a produselor este interzisă.

În situații speciale când se impune trecerea dintr-un sector în altul operatorii trebuie să își spele și să își decontamineze mâinile și să treacă printr-un decontaminator de încălțăminte la părăsirea și la intrarea în spațiile respective.

Echipamentul de lucru va avea culori distincte, separate pentru personalul din spațiile de prelucrare a produselor crude față de personalul care lucrează în sapțiile destinate produselor tratate termic.

Operațiunile pe fluxul de tăiere a păsărilor trebuie să se execute în condiții igienice pentru obținerea carcaselor necontaminate și de aceea trebuie avute în vedere o serie de acțiuni în procesul de tăiere a păsărilor.

Operatorii își spală și își decontamineză mâinile, cuțitele, manșetele și alte ustensile manipulate ori de cate ori este necesar în timpul lucrului. Echipamentul de lucru trebuie să fie în permanență curat și se schimbă cel puțin odată pe zi și după caz ori de cate ori este necesar. Spălatoarele de mâini trebuie sâ fie acționate la pedală, șă fie dotate cu recipient pentru săpun lichid, hartie prosop cu o singură folosire, recipient pentru colectarea hârtiei utilizate și să fie racordate la sistemul de canalizare.

Controlul microbilogic al suprafețelor de lucru se face înaintea începerii lucrului sau după igienizare sau decontaminare urmărindu-se (după Bazgan O., 1999).

-numărul total de germeni mezofili aerobi (NTGMA).

-prezența bacteriilor coliforme.

-prezența salmonelelor.

– prezență stafilococilor cuagulazo-pozitivi.

Igiena echipamentului se realizează prin mai multe etape succesive cum ar fi: dezasamblarea echipamentului,curătarea mecanică a părților componente, spălarea pentru îndepărtarea resturilor organice, spălarea chimică cu detergenți aprobați, decontaminarea cu decontaminanți aprobați, clătirea cu apă potabilă si reasamblarea echipamentului. Dacă utilajul este contaminat se trece la spălarea și decontaminarea înainte de reutlizare stabilindu-se cauza contaminării și luându-se măsuri de remediere. Sterilizatoarele pentru instrumentarul de lucru vor fi prevăzute cu termometre de control montate la loc vizibil și vor fi racordate la sistemul de canalizare.

Pavimentele și pereții se igienizează la sfarșitul fiecărei zile de producție și ori de cate ori este necesar. Plafoanele se igienizeaza cel puțin odată pe săptămană.

3.2. Igiena cărnii.

Pentru obținerea cărnii, a preparatelor din carne și a celorlalte produse de origine animală în condiții de igienă și pentru a preveni apariția bolilor infecțioase este necesar ca spațiile tehnologice să respecte o serie de norme igienice.

Tăierea păsărilor se realizeză în flux continuu în abatoare conveierizate. În abatore controlul saniatar veterinar al păsărilor destinate tăierii începe cu stabilirea provenieinței acestora pe baza certificatelor sanitar veterinare ce sunt obligatorii pentru fiecare mijloc de transport (după V. Stănescu, 2010).

Pe fluxul tehnologic de tăiere, carcasele căzute din conveier în timpul deplumării și antrenate în canalele de recirculare a apelor uzate nu se admit în consum.

Carnea de pasăre spre deosebire de carnea de mamifere, are țesutul muscular mai compact, fibrele musculare mai fine, sarcolema foarte subțire si bobul de carne mai fin. țesutul conjunctiv este mai redus, irigația sanguină este redusă, nu prezintă fenomenul de marmorare si perselare. Carnea de pasăre răspunde la două orientări nutriționale moderne: aportul caloric redus si bogăția în acizi grași esențiali.

Pentru obținerea cărnii de pasăre în condiții igienice trebuie ținut cont de o serie de factori precum: conținutul în agenți patogeni, valoarea pH, activitatea apei, potențialul redox, reziduri: antibiotice, hormoni, Pb,Ag, As, Se, Zn etc.

Dacă linia tehnologică prevede decapitarea automată și îndepărtarea picioarelor înainte de mutarea pe conveierul de eviscerare, în acest punct vor fi examinate carcasele în general. Examinatorul efectuează atat controlul exeterior al carcasei urmarind aspectul culoarea și integritatea pielii, starea de întreținere, musculatura, gradul de sângerare, gradul de poluare al carcasei cu materii fecale cât și controlul interior. Toate puncetele de control sanitar veterinar vor fi dotate cu rastele metalice cu carlige, pentru agățarea păsărilor suspecte și cu containăre metalice prevăzute cu capac pentru confiscare.

Controlul efectuat de catre medical verinar are în vedere ca pielea să fie curată, intacă și fără resturi de pene, extremitatea picioarelor să fie curată de murdărie, carcasa și organele să nu prezinte modificări morfopatologice. Aspectul general al carcasei și masa corporală trebuie să fie în concordanță cu prevederile standardelor de stat.

În ceea ce priveste transportul cărnii de pasăre este necesar ca acesta să se facă în mijloace de transport prevăzute cu un sistem de închidere ermetică și să corespundă prevederilor legislației naționale. Toate acestea sunt necesare pentru a putea ajunge carnea la consumatori în condiții igienice.

Regulile de igienă aplicate într-o unitate de abatorizare a păsărilor trebuiesc respectate și aplicate de întreg personalul întreprinderii.

Partea a-II-a

CERCETĂRI PROPRII

DESCRIEREA DIRECȚIEI SANITAR VETERINARE ȘI PENTRU SIGURANȚA ALIMENTELOR

Laboratorul Sanitar Veterinar și pentru Siguranța Alimentelor Iași (L.S.V.S.A.) este o unitate componentă în cadrul structurii D.S.V.S.A. Iași și reprezintă autoritatea veterinară de stat în probleme de diagnostic veterinar, de expertiza produselor de origine animală și non animală și furajelor.

Laboratorul Sanitar Veterinar si pentru Siguranța Alimentelor Iași este conceput astfel încât să respecte condițiile tehnologice de lucru, condițiile de biosecuritate pentru personal, evitarea interferențelor și a incompatibilităților în fluxul analitic, în conformitate cu cerințele legislative comunitare pentru activitatea de laborator.

Activitatea laboratorului este axatǎ pe diagnosticul bolilor la animale, acțiuni de supraveghere a stării de sănătate a efectivelor de animale, expertiza alimentelor de origine animală și non animală și a furajelor, precum și de protecție a mediului, controlul reziduurilor și a gradului de contaminare radioactivă din alimente și furaje de pe întreg județul, indiferent de origine.

Laboratorul Sanitar Veterinar și pentru Siguranta Alimentelor Iași prezintă următoarele atribuții și responsabilități:

verifică proiectul planului cifric al acțiunilor veterinare elaborat în baza „Programului acțiunilor de supraveghere, profilaxie și combatere a bolilor la animale și prevenirea transmiterii de boli de la animale la om și protecția mediului” și îl înaintează pentru aprobare Directorului Executiv al D.S.V.S.A.;

aplică metodele noi autorizate pentru diagnosticul de laborator în activitatea proprie;

efectuează investigații epidemiologice în teritoriu, stabilește diagnosticul de laborator pe baza probelor examinate și împreună cu șefii serviciilor/compartimentelor de specialitate, dispune măsuri pentru prevenirea și combaterea bolilor la animale;

verifică documentația și îndeplinirea condițiilor necesare cu privire la autorizarea laboratoarelor de unitate (uzinale), societăților comerciale și altor asemenea unități, o înaintează spre aprobare Directorului Executiv al D.S.V.S.A. pentru emiterea Autorizației sanitare veterinare de funcționare;

participă la întocmirea proiectelor de norme veterinare și instrucțiuni tehnice privind depistarea și combaterea bolilor epizootice, asanarea bolilor infecto-contagioase, parazitare, cronice și apărarea sănătății publice;

întocmește informări și efectuează analize epidemiologice privind evoluția în teritoriu a unor boli epizootice, zoonoze, a altor stări morbide și propune măsurile ce se impun;

Fig.1.1. Laboratorul Sanitar Veterinar și pentru Siguranta Alimentelor – microbiologie carne, camera termostatelor (laboratorul de incubare-pasare)

CAPITOLUL 4:

REZULTATELE OBȚINUTE ÎN PERIOADA DE CERCETARE 01.01.2012-31.12 2013 PRIVIND GENUL SALMONELLA SPP.

4.1. Scopul cercetărilor

Pe plan mondial, cel mai des întâlnit agent etiologic al toxiinfecțiilor alimentare (TIA) sunt reprezentate de salmonele.

În 1997, în România au fost confirmate și tipizate de către Centrul Național de Referință pentru Salmonella spp. de la Institutul Cantacuzino, București un număr de 1 475 de tulpini, incidența tulpinilor izolate de la om fiind în scădere comparativ cu cele izolate de la mamifere și păsări

În România, sunt citate izolări frecvente din carnea de pasăre dezosată mecanic, din organele de pasăre sau carnea de pasăre, din alte tipuri de alimente de origine animală.

Obiectivele pe care le-am propus pe parcursul acestei teze de licență sunt următoarele:

Centralizarea rezultatelor obținute pe probele de carcase/carne și organe de pasăre care au fost analizate în cadrul L.S.V.S.A. Iași pentru Salmonella spp. în perioada 01.01.2012-31.12.2013 și serotipizarea acestora.

Identificarea și confirmarea tulpinilor izolate de Salmonella spp., în perioada 01.01.2012-31.12.2013 și serotipizarea acestora.

Centralizarea rezultatelor obținute pe probele de carcase pasăre și probe de cecumuri pasăre, analizate în cadrul L.S.V.S.A. Iași, în perioada 01.01.2012 – 01.06.2014.

1.Centralizarea rezultatelor obținute pe probele de carcase/carne și organe de pasăre care au fost analizate în cadrul L.S.V.S.A. Iași pentru Salmonella spp.,;

4.2. Metode de analiză utilizate în laboratorul de microbiologia alimentelor pentru izolarea și confirmarea Salmonella spp.

Metoda de lucru utilizată a fost SR-ISO 6579/2006; 2007; AC 2009.

Metoda orizontală de determinare a Salmonella spp. SR ISO 6579.

Conform SR-EN -ISO 6579/2006-2007/AC, este urmărită detectarea prezenței sau absenței germenilor din genul Salmonella într-o cantitate determinată de produs (25g), atunci când analiza este efectuată conform prezentului Standard Internațional.

Mod de lucru

ETAPA 1. Preîmbogățirea (îmbogățire neselectivă)

Din proba de analizat se prelevează 25 de grame (din profunzimea produsului) care se însămânțează în unul din mediile de preîmbogățire: apă peptonată tamponată. Mediul de preîmbogățire – apă peptonată tamponată (APT), poate fi utilizată și pentru efectuarea diluțiilor. APT se folosește în cantitate de 225ml la care se adaugă 25 g probă, respectând în mod obligatoriu raportul probă/mediu este de 1/9. Incubația se efectuează la 350C sau la 370C -/+ 10C, timp de 16-20 ore.

ETAPA 2. Îmbogățirea selectivă.

Din mediul de preîmbogățire se prelevează 0,1 ml de cultură (APT) care se introduce în 10 ml de bulion cu verde malahit și clorură de magneziu, denumit și mediul Rappaport–Vassiliadis cu soia (R-VS), iar 1 ml din cultură se introduc în 10 ml de mediu Műller Kauffman tetraționat cu novobiocină (MKTTn). Incubația se efectuează astfel:

eprubeta cu Rappaport–Vassiliadis (RVS) se incubează timp de 24 ore +/-3 ore la 41,50C;

eprubeta cu Muller Kauffman tetraționat – novobiocină (MKTTn) se incubează la 370C +/- 10C, timp de 24 ore, +/-3 ore .

ETAPA 3. Izolare și identificare

Cu ansa bacteriologică încărcată cultura obținută din MKTTn și RVS (medii de îmbogățire selectivă) se striază pe suprafața uscată a unei plăci Petri de dimensiuni 10 cm diametru, în care s-a turnat mediul xiloză-lizină-deoxicolat (XLD) și o altă placă cu un alt mediu selectiv RVS semisolid. Concomitent cu inocularea efectuată pe mediul XLD, se vor efectua însămânțări și pe un al doilea mediu la alegere: agar Hektoen (HK), agar Salmonella-Shigella (SS), agar Rambach, agar Mac-Conkey (McK), Istrati-Meitert (IM), agar-deoxicolat-citrat-lactoză (ADCL), Drigalsky (Dky), etc. Mediul Wilson Blair se va utiliza facultativ numai atunci când se estimează poluarea produselor alimentare cu tulpini de Salmonella înalt selective.

Mediul Hektoen (bioMerieux), este inhibitor al speciilor de E. coli, Citrbacter și Proteus, însă nu inhibă dezvoltarea vibrionului coleric.

Salmonella H2S (+) produce colonii de culoare verde cu centrul negru, iar Salmonella H2S (-) prezintă colonii de culoare verde cu centrul albastru.

Coloniile de culoare roz pot fi de Salmonella Arizonae, dar se pot dezvolta slab și colonii de E. coli, Enterbacter, Citrobacter, Klebsiella, Serratia, chiar cu același aspect.

Coloniile roz cu centru negru sunt produse de Proteus vulgaris.

Interpretare. Pentru diferențierea coloniilor de Salmonella de Shigella urmărim: coloniile de culoare verde cu centrul negru ce sunt considerate colonii suspecte, posibil de P. mirabilis sau de Salmonella, în timp ce coloniile verzi sau albastre sunt considerate suspecte și pot fi de Shigella, tulpini H2S- de Salmonella, M. Morganii, Providencia rettgeri sau Pseudomonas. Coloniile roz, galbene, cu sau fără centru negru nu sunt suspecte și pot fi colonii de: E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter, P. vulgaris, etc. Limitele mediului constau în faptul că speciile Salmonella Arizonae și Shigella Sonnei nu sunt suspecte în aparență.

Alte medii recomandate pentru Salmonella spp sunt: mediul cu roșu fenol și verde briliant, BGA sau Edel și Kampelmacher (Oxoid).

Aspecte culturale obținute în laboratorul de microbiologie alimentară carne

Pe mediul semi-solid Rappaport Vassiliadis, coloniile de culoare gri cenusiu sunt caracteristice pentru Salmonella în timp ce coloniile de culoare albă sau alte culori sunt necaracteristice.

Fig.4.2. Colonii de culoare albă pe mediul semi-solid Rappaport Vassiliadis – (foto original)

Fig.4.3. Colonii de culoare albă pe mediul semisolid Rappaport Vassiliadis – ( foto original)

Coloniile de Salmonella sunt pe mediul XLD (xiloză, lizină, lactoza, deoxicolat) (bioMerieux), de culoare roșie, deoarece acestea nu utilizează lactoza. Tulpinile de E. coli, Citrobacter, Enterobacter, etc., care folosesc atât lactoza cât și xiloza, determină apariția coloniilor de culoare galbenă în prezența indicatorului roșu fenol, deoarece pH-ul devine acid.

Acest mediu este recomandat în special pentru diferențierea coloniilor de Salmonella de cele de Shigella, deoarece permite producerea de H2S, aceste colonii având centrul negru.

Fig. 4.4. Colonii fine, netede, lucioase, de culoare roșie, semi-transparente și înnroșirea mediului din jurul coloniilor – colonii prezumtive – Salmonella spp. H2S pozitive, pe mediul XLD.

Agar Hektoen – este un mediu selectiv pentru izolarea bacteriilor enterice de tipul Salmonella și Shigella (fig.nr.4.5.).

Principiu – mediul are ca principiu de bază abilitarea bacteriilor de a fermenta trei zaharuri: lactoza, sucroza și salicina. În prezența citratului de fier și a hiposulfitului, H2S produs de bacterii provoacă apariția de colonii cu centru negru. Bacteriile care fermentează cel puțin un zahăr, determină apariția în mediu a coloniilor roz, iar cele care fermentează toate zaharurile formează colonii verzi sau albastre.

Mediul conține inhibitori pentru E. coli, care își extind efectul asupra lui Proteus și Citrobacter. Pe acest mediu se dezvoltă și Vibrio cholerae.

Utilizare – Acest mediu permite dezvoltarea și facilitează izolarea enterobacteriilor patogene din produse alimentare. Mediul este perfect adaptat pentru detecția Salmonella din produsele de origine animală.

Interpretare- Pentru diferențierea coloniilor de Salmonella de Shigella urmărim:

colonii de culoare verde cu centrul negru sunt considerate colonii suspecte, posibil de P. mirabilis sau de Salmonella,

colonii verzi sau albastre sunt considerate suspecte și pot fi de Shigella, tulpini H2S- de Salmonella, M. Morganii, Providencia rettgeri sau Pseudomonas,

colonii roz, galbene, cu sau fără centru negru nu sunt suspecte și pot fi colonii de: E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter, P. vulgaris, etc. (tabelul nr.4.1.)

Tabelul nr.4.1.

Identificarea caracterelor coloniilor pe mediul Hektoen

Fig.4.5. Colonii mici, netede, lucioase, de culoare verde-albăstrui prezumtive de Salmonella spp.-pe mediul Hektoen

Mediul SS (bioMérieux) – este un mediu selectiv și de izolare pentru enterobacterii Salmonella și Shigella.

Principiu – se bazează pe fermentarea lactozei și tiosulfatului de către bacteriile: Salmonella și Shigella.

Interpretare – este un mediu care permite dezvoltarea coloniilor care fermentează lactoza și reducerea tiosulfatului, iar prezența sărurilor biliare inhibă prezența coliformilor și a bacteriilor Gram (+):

coloniile semi-transparente, incolore, apar în cazul tulpinilor care nu fermentează lactoza și sunt colonii suspecte pentru Shigella și Salmonella H2S (-);

coloniile semi-transparente, incolore, cu centru negru sunt suspecte pentru Salmonella H2S (+);

coloniile roz sau roșii, sunt dezvoltate în cazul tulpinilor care fermentează lactoza, respectiv în cazul coliformilor. Aceste colonii nu sunt considerate suspecte și sunt reprezentate de E. coli, Enterobacter, Klebsiella;

uneori, mediul permite dezvoltarea coloniilor de Pseudomonas, care pot fi eliminate prin testul oxidazei, celelalte colonii suspecte vor fi identificate prin teste biochimice sau imunologice.

Fig.4.6. Colonii mici, netede. lucioase, semi-transparente, cu centrul negru H2S(+)

prezumtive Salmonella spp., pe mediul SS

Agar Rambach (Merck) – este un mediu cromogen folosit pentru detecția, identificarea și diferențierea Salmonella din produse alimentare. Mediul nu este prevăzut în metodele de lucru menționate, însă poate fi utilizat ca al treilea mediu, pentru selectarea caracterelor coloniilor izolate și compararea aspectelor morfologice ale coloniilor cu cele obținute pe alte medii.

Principiu – mediul folosește un amestec cromogen care relevă caractere coloristice ale coloniilor de Salmonella și B. coliforme distincte și inhibă dezvoltarea florei de asociație.

Fig.4.7. Colonii mici, netede, lucioase, de culoare roșie, cu înnroșirea mediului din jurul coloniilor pe mediul Rambach – prezumtive Salmonell spp.

Fig.4.8. Salmonella spp. prezumtivă – colonii netede, lucioase, de culoare neagră

pe mediul Wilson Blair

Compass Salmonella agar – este un mediu cromogenic, utilizat pentru izolarea, diferențierea și enumerarea Salmonella

Principiu – Compass Salmonella agar combină două substraturi cromogenice care detectează două enzime active:

5-bromo-6-cloro-3-indolil-caprilat (caprilat – mageta) care detectează enzima esterază, produsă de Salmonella, ea determină apariția colorației roșu-magenta((fig.nr.4.9).

5-bromo-4-cloro-3-indolil- β-D-glucopiranozida (X-glucozida) care clivează produsul într-un precipitat de culoare albastră (fig.nr.4.10).

Fig.4.9. Colonii prezumtive Salmonlella spp., colonii roșu-mageta pe mediul Compass Salmonella

Fig.4.10. Colonii Salmonella spp. – colonii albastre pe mediul Compass Salmonella

Studiile efectuate pe acest mediu au evidențiat faptul că acesta permite detecția unor Salmonella care nu pot fi detectate prin alte metode. Izolarea lui Salmonella Typhi și Paratyphi, lactozo-pozitive sau Salmonella Saftenberg, subspeciile Arizonae și Diarizonae sucrozo-pozitive și serotipurile imobile: Salmonella Pullorum și Gallinarum sunt detectate pe acest mediu.

Interpretare

Mediul Compass Salmonella permite vizualizarea următoarelor colonii caracteristice: colonii roșii-magenta sunt reprezentate de Salmonella spp., colonii incolore sunt reprezentate de E. Coli., coloniile albastru-verzui sunt reprezentate de Enterobacter spp, Klebsiella spp., colonii maronii sau incolore sunt reprezentate de Proteus, Pseudomonas și bacteriile Gram-pozitive sunt inhibate.

Datorită numărului mare și diversității sortimentale a produselor de origine animală, folosirea mediului necesită aplicații speciale pentru diferite categorii de produse alimentare.

Examenul pentru izolarea și identificarea Salmonella pe mediul Compass Salmonella se face conform metodei NF EN ISO 6579/2000 (fig.nr.4.11).

Fig.4.11. Salmonella spp. și bacterii coliforme colonii prezumtive pe mediul Compass.

Testarea bichimică a coloniilor prezumtive de Salmonella spp.

ETAPA 4. Confirmarea Salmonella spp. se face prin efectuarea testelor biochimice, a reacțiilor serologice

În ultimii ani se dorește dezvoltarea metodei de confirmare a speciilor bacteriene prin testarea ADN-ului utilizând reacția PCR.

Testarea biochimică

Efectuarea testelor biochimice se face pe mediile clasice de tip multitest sau pe testare individuală pe medii biochimice.

Mediul TSI conține trei zaharuri glucoză, lactoză și zaharoză, care pune în evidență reacția de fermentare/ nefermentare a acestor zaharuri. Mediul mai conține compuși cu fier, care ajută la evidențierea reacției pentru H2S.

Interpretarea reacțiilor biochimice se face prin vizualizarea culorii formate după incubare pe coloana și panta mediului TSI:

coloana galbenă a mediului denotă fermentarea glucozei (reacție pozitivă);

panta mediului de culoare rosie denotă nefermentarea lactozei și/sau zaharozei (lactoză și/sau zaharoză pozitivă);

apariția colorației negre, denotă producerea de hidrogen sulfurat;

fermentarea zaharurilor se face cu producere de gaz (din glucoză) și se vizualizează prin apariția bulelor de gaz în mediu sau chiar prin ruperea mediului.(fig.4.12).

Salmonella nu produce indol, reacția este negativă pe banda de hârtie impregnată cu para-dimetilamino-benzaldehidă. Salmonella spp. sunt mobile, cu excepția serotipurilor Gallinarum și Pullorum serotipuri care sunt imobile.

Fig 4.12. Utilizarea glucozei, zaharozei și lactozei de Salmonella spp.

Mediul MILF – mobilitate, indol, lizină, fenilalanină:

apariția unei colorații violete după incubare indică o reacție pozitivă, deci producerea lizindecarboxilazei, salmonelele fiind de regulă lizindecarboxilază pozitive;

verificarea producerii de feninalanindecarboxilază se verifică prin adăugarea clorurii ferice la suprafața mediului, salmonelele fiind feninalanindecarboxilază negative nu se produce virarea culorii în verde (reacție negativă);

mobilitatea tulpinilor însămânțate determină modificarea turbidității mediului, indiferent de modificările de culoarea care pot apărea

Mediul citrat Simmons. Bacteriile din genul Salmonella utilizeză citratul de sodiu. Reacție pozitivă, apariția colorației albastre a mediului, deci virarea din verde în albastru, după incubare (fig.4.13). Reacție negativă nu se modifică culoarea inițială a mediului.

Fig.4.13. Utilizarea citratului de Salmonella spp.

Mediul MIU și Christensen este utilizat pentru verificarea utilizării ureeii prin hidroliză. Germenii din grupul Salmonella nu folosesc urea- reacție negativă. Colorația mediului (maronie pentru MIU și galben deschis la mediul Cristensen) nu este modificată. Reacția pozitivă – se produce o îngălbenire a mediului (fig.nr.4.14).

Fig.4.14. Salmonella spp. utilizează ureea

Testul Voges –Proskauer (VP).

Acest test pune în evidență acetil-metil-carbinolul, un metabolit rezultat prin oxidarea de către bacterii a 2,3 butilen-glicolului. Pentru cultivarea bacteriilor se folosește mediul Clark-Lubs. La cultura de 5 zile se adaugă un volum egal de hidroxid de potasiu 10%. Tuburile se observă timp de 6 ore, la 370C. În cazul reacției pozitive apare o culoare roșie.

Testul roșului de metil (MR)

Se execută în același scop ca și reacția precedentă, se folosește același mediu. La cultura de 5 zile se adaugă 5 picături dintr-un reactiv format din 0,1 g roșu de metil, 300 ml alcool și 500 ml apă distilată. În cazul reacției pozitive, mediul se colorează în roșu, iar în cazul reacției negative, în galben.

Fig.4.15 Testare biochimică pe medii multitest

Confirmarea serologică

Confirmarea serologică pentru Salmonella spp., s-a efectuat cu ajutorul trusei de seruri anti-Salmonella polivalent ABDEL, CFGH. Încadrearea în grupe serologice a fost efectuată cu ajutorul trusei de seruri anti-Salmonella monovalente A,B,C,D,E,F,G,H.

Serotipizarea a fost efectuată de Institutul de Igienă și Sănătate Publică Veterinară București, care este Centrul Național de Referință pentru Salmonella pentru tulpinile izolate din domeniu animal, ce a funcționat în cadrul Institutului Cantacuzino București, până în anul 2007.

Citirea testelor biochimice – sunt specificate și sunt identice cu descrierea de la SR-ISO 6579/95.

Pentru testare biochimică s-au utilizat mediile agar TSI, MIU sau MIO, MIL sau MILF, citrat Simmons, RM-VP, geloză nutritivă, etc, și reactivii pentru reacția RM-VP, citrat de fier, reactivi pentru indol, etc., toate provenite de la Institutul Cantacuzino (384).

Confirmarea serologică presupune punerea în contact a tulpinilor izolate cu seruri anti-Salmonella polivalente și de grup, pe baza antigenilor “O”. Reacția este pozitivă în cazul în care o colonie pură , recunoscută ca nefiind auto-aglutinabilă, în contact cu serul anti-Salmonella ( ser “O”) se produce aglutinarea concretizată prin apariția unor flocoane în masa suspensiei care inițial este omogen.

Pe o lamă din sticlă se pune o picătură de ser anti-Salmonella “Vi” care se dispersează cu o colonie din tulpina de cercetat. Reacția este considerastă pozitivă dacă se produce aglutinare.

Pe mediul agar nutritiv se însămânțează o colonie pură, care nu este auto-aglutinabilă, care se incubează la 18-24 ore la 370C. Dacă prin punerea în contact a tulpinii cu serul după tehnica descrisă mai sus se produce aglutinare, reacția se consideră pozitivă.

Tabelul nr.4.2.

Interpretarea reacțiilor biochimice și serologice.

4.3. Rezultate obținute

Scopul cercetarilor

Obiectivul pe care l-am propus pe parcursul acestui studiu a fost următorul:

Centralizarea rezultatelor obținute pe probele care au fost analizate pentru identificarea și confirmarea serotipurilor izolate de Salmonella spp., în perioada 01.01.2012-31.12.2013.

Am centralizat și am efectuat calcule statistice pe probele de carne pui recoltate în cadrul Programelor Strategic și de Autocontrol pe anii 2012 și 2013.

Au fost examinate 448 probe de carcase de pasăre, în stare crudă, refrigerată, prezentată în laborator sub formă de carcasă pui Grill și sub formă de carne de pasăre porționată: aripioare, pulpe inferioare, pulpe superioare, etc. Au mai fost luate în calcul și 62 probe de organe de pasăre, fiind reprezentate de ficăței de pui. Numărul total de probe analizate a fost de 510 probe de carne și organe de pasăre.

Studiul a fost efectuat cu scopul de a se stabili care a fost incidența cărnii poluate cu Salmonella spp.

În anul 2012, au fost izolate 35 de tulpini de Salmonella spp. și s-a constatat o incidență de 13,20%.

În anul 2013, au fost identificate 8 probe pozitive, ceea ce a reprezentat 35 tulpini expediate pentru confirmare, deoarece la una din probe au fost confirmate 2 eșantioane, iar la o altă probă 3 eșantioane.

Tabelul nr.4.3.

Incidența Salmonella spp. în probele de carcase și carne de pui.

Din totalul de 448 de probe de carne și organe de pasăre examinate, 12 probe, cu o reprezentare de 2,67% probe au fost contaminate Salmonella spp.(tabelul nr.4.3).

Raportat la totalul de 448 de probe de carne și organe de pasăre examinate, 436 probe, cu o reprezentare de 97,33% probe au fost libere la Salmonella spp.

Tabelul nr.4.4.

Incidența tulpinilor de Salmonella spp. stabilită pe eșantioane de carcase și carnea de pui.

Din cele 448 probe de carcase și carne de pasăre analizate, au fost izolate 50 de tulpini de Salmonella spp.

Aceasta cifră relativ rotundă, se explică prin faptul că analiza a fost efectuată conform Reg. C.E. 2073/2005, reactualizat, prin care analiza se face pe câte 5 eșantioane pentru o probă, iar în anul 2012 au fost identificate 10 probe pozitive pentru Salmonella spp., în toate cele 5 cazuri au fost pozitive toate cele 5 eșantioane.

Carnea de pasăre a prezentat un procent mediu de contaminare de 11,16 % (tabelul nr. 4.4). Incidența salmonelelor stabilită pentru carnea de pasăre, pe ani a fost:

în anul 2012, s-a constatat o incidență de 13,20% – fiind izolate 35 de tulpini de Salmonella spp.;

în anul 2013, frecvența stabilită a fost de 8,19% – de menționat faptul că, cele 15 tulpini de Salmonella spp., au fost izolate din 4 seturi de probe a câte 5 eșantioane, un set complet cu 5 eșantioane pozitive și două seturi parțiale, cu câte 2 eșantioane pozitive, respectiv 3 eșantioane pozitive la Salmonella spp.;

incidența medie pentru cei doi ani luați în studiu, a fost de 11,16%, carcase și carne de pasăre contaminată cu Salmonella spp., pe probele provenite și analizate din județul Iași;

Tabelul nr. 4.5.

Incidența Salmonella spp. în probele de organe de pui

Tabelul nr. 4.6.

Incidența tulpinilor de Salmonella spp. pe eșantioane de organe de pui

Contaminarea cu salmonele constatată la organele de pasăre care a fost identificată este relativ constatată pe ani de studiu, pentru acest tip de matrice (tab.nr.4.6).

în 2012, au fost examinate 36 probe de organe de pasăre, au fost izolate 5 tulpini de Salmonella spp. și s-a constatat incidență 13,88% pentru Salmonella spp.

în 2013, au fost examinate 26 probe de organe de pasăre din care s-au izolat trei tulpini de Salmonella spp.;

incidența medie pentru cei doi ani luați în studiu, a fost de 12,90%, organe de pasăre contaminate cu Salmonella spp., pe probele provenite și analizate din județul Iași;

Din cele 50 tulpini de Salmonella spp., a avut o pondere de: 10% pentru tulpinile de Salmonella enterica, serovar Kentucky și Hadar, 16% pentru tulpinile de Salmonella enterica, serovar Kottbus, 20% pentru tulpinile Salmonella enterica, serovar Colindale și Virchow, 24 % reprezentare pentru tulpinile de Salmonella enterica, serovar Infantis; (tabelul nr.4.7).

Confirmarea tulpinilor de Salmonella spp. izolate din carne și organe în anii 2012-2013 în cadrul L.S.V.S.A. Iași.

Tipizarea tulpinilor izolate a fost efectuată la Centrul Național de Referință pentru Salmonella din cadrul Institutului de Igiena și Sănătatea Publica Veterinara București. Confirmarea a stabilit că tulpinile aparțineau speciilor nepatogene sau slab patogene, acestea fiind precizate în rezultatele obținute după tipizare (tabul.nr.4.7).

Tabelul nr.4.7.

Rezultatele tipizării tulpinilor de Salmonella spp.

Concluzii

În perioada 01.01.2012 – 31.12.2013, au fost izolate din carne și organe de pasăre 50 tulpini de Salmonella spp.,

Din totalul de 448 de probe de carcase și carne de pasăre examinate 436 probe, cu o reprezentare de 97,33% probe au fost libere la Salmonella spp., iar în ceea ce privește probele de organe pasăre, 58 probe au fost negative, ceea ce reprezintă 93,55% probe libere de Salmonella spp.;

Rezultatul pentru probele de carcase, carne pasăre examinate, 12 probe, cu o reprezentare de 2,67% probe au fost contaminate Salmonella spp., iar în ceea ce privește probele de organe pasăre, 4 probe, reprezentând 6,45% probe au fost contaminate la Salmonella spp.;

Incidența medie pentru Salmonella spp. stabilită pe eșantioane de lucru a fost de: 11,16% la carcasele și carnea de pasăre, iar în organele de pasăre s-a stabilit o incidență de 12,90%.

Tipizarea celor 50 tulpini a confirmat următoarele serotipuri: 12 tulpini de Salmonella enterica, subspecia enterica, serovar Infantis, câte 10 tulpini de Salmonella enterica, subspecia enterica, serovar Colindale și Vircow, 8 tulpini de Salmonella enterica, subspecia enterica, serovar Kottbus și 5 tulpini de Salmonella enterica, subspecia enterica, serovar Kentucky, 5 tulpini de Salmonella enterica, subspecia enterica, serovar Hadar;

Cele 50 tulpini de Salmonella spp., a avut o pondere de: 10% pentru tulpinile de Salmonella enterica, serovar Kentucky și Hadar, 16% pentru tulpinile de Salmonella enterica, serovar Kottbus, 20% pentru tulpinile Salmonella enterica, serovar Colindale și Vircow, 24 % reprezentare pentru tulpinile de Salmonella enterica, serovar Infantis;

Tulpinile izolate, au fost expediate pentru confirmare și au indicat faptul că pe carcasele de pasăre, în carnea de pasăre și din organele acestora s-au izolat serotipuri nepatogene sau slab patogene;

Loturile din care proveneau probele pozitive au fost supuse restricțiilor conform legislației sanitare veterinare și nu au existat implicații epidemiologice.

CAPITOLUL 5

REZULTATELE OBȚINUTE ÎN PERIOADA DE CERCETARE 01.01.2012-01.06 2014 PRIVIND GENUL CAMPYLOBACTER SPP.

5.1. Metode de analiză utilizate în laboratorul de microbiologia alimentelor pentru izolarea și confirmarea Campylobacter spp.

Conform SR EN ISO 10272/2000:

Campylobacter spp. sunt microorganisme care formează colonii caracteristice pe medii solide selective specifice, la temperatură de incubare de 41,5˚C, dar nu și la 25˚C, în condiții de microaerofilie.

Campylobacter termotolerant are următoarele caracteristici: morfologic – bacilli ușor încurbați, cu mobilitate caracteristică, sunt bacterii Gram negative, oxidază pozitive, glucoză, lactoză și zaharoză negative, hidrolizează hipuratul și nu produc gaz, conform descrierii din SR ISO 10 272/2006.

Conform SR EN ISO 10272-1/2006 și 10272-2/2007:

Campylobacter spp. sunt bacterii care produc colonii caracteristice pe medii selective. Campylobacter termotolerant are următoarele caracteristici: crește la temperatură de incubare de 41,5˚C, cu mobilitate caracteristică, fiind bacterii Gram negative, oxidază pozitive, catalază pozitivă. Teste biochimice pentru diferențierea speciilor care se fac sunt: sensibilitatea la acidul nalidixic, la cefalotină, detecția hidrolizei indoxil acetatului și a hipuratului. Este rezistent la cefalotină și în general catalază pozitivă (exp. Campylobacter. upsaliensis), hidrolizează adesea hipuratul și nu produc gaz.

Numărarea coloniilor confirmate de Campylobacter termotolerant se face pe 1, 5, 10 sau 25 mililitri sau pe grame.

Medii de cultură, alte materiale : Bulion Bolton; Agar modificat cu cărbune cefoperazonă deoxicolat (mCCD); Bulion Columbia; Bulion Brucella; Agar Columbia cu sânge; Agar Mueller Hinton cu sânge.

Materiale de referință certificate : tulpini bacteriene standardizate, liofilizate, tip ATCC de Campylobacter jejuni NCTC 11351 control pozitiv și Campylobacter lari NCTC 11352 – control negativ; sau Staphylococcus aureus NCTC 8532 – control pozitiv, Enterococcus faecalis NCTC 775 – control negativ; galerii API CAMP – achiziționate de la producătorul Biomerieux, Franța ;

Materiale și sticlărie :cutii Petri sterile, cu diametre diferite (100mm,140mm); baloane cu diferite capacități, eprubete sterile cu diametrul de 16x160mm; pipete gradate sau automate cu capacitatea nominală de 10 ml și 1 ml cu gradații de 0,5 și respectiv 0,1 ml diviziuni; pipete Pasteur sterile cu diametrul de aprox. 3 mm sau 10 μl sau pipete sterile ; foarfece, pense, spatule sterile; anse bacteriologice cu bucla de aprox. 3mm, de nichel/crom (sau ace de însămânțare) ; stative pentru eprubete; baie de apă 42 – , cu termometru; baie de apă 37°C ±1°C, cu termometru; pH-metru.

Mod de lucru

Pregătirea probei de analizat și a suspensiei inițiale

Pentru detectarea Campylobacter se recoltează direct din probă cantitatea care reprezintă eșantionul pentru introdus în lucru.

Pentru numărarea Campylobacter se prepară suspensia inițială și diluții seriate. Se utilizează ca diluant ser fiziologic sterilazat, apă distilată sterilizată. Masa specifică a probei este de 1, 5, 10 sau . Dacă masa specificată a probei pentru analiză este alta decât (1g, 5g, 25g, etc), se folosește cantitatea necesară de diluant pentru a realiza o diluție de 1/10 sau 1/5, cu ser fiziologic sau apă distilată sterile.

Însămânțarea

Pentru a se stabili dacă Campylobacter termotolerant este prezent/absent se are în vedere:

Efectuarea prin însămânțare a diluției inițiale a 1, 10 sau sau X ml în (x) x 10 sau (x) x 5.

Detectarea Campylobacter spp. se efectuează astfel:

Îmbogățirea. Însămânțarea tuburilor sau baloanelor cu o cantitate specificată (1, 5, 10, sau x grame) de probă recoltată direct din produsele lichide sau solide.

Incubarea în condiții de microaerofilie a tuburilor sau baloanelor la 37˚C timp de 4-6 ore, apoi bulionul Bolton se incubează timp de 44 h +/-4h, la 41,5˚C.

Însămânțarea pe medii solide selective: agar-cărbune-cefoperazonă-deoxicolat (mCCD).

Identificarea coloniilor prin studiu creșterii bacteriologice –aspectul coloniilor pe medii specifice, morfologic, teste biochimice, conform descrierii din PS – L- MA-15.

Se citește rezultatul. Se rețin plăcile în care s-a constatat creștere microbiană și se numără coloniile caracteristice.

Colonii tipice (C.T.)

pe agar mCCD (agar modificat cu cărbune-cefoperazonă-deoxicolat) coloniile tipice sunt cenușii, adesea cu un luciu metalic, plate și umede, cu o tendință de împrăștiere. Coloniile se împrăștie mai puțin pe suprafețe de agar uscate. Pot să apară și alte forme de colonii.

pe agar Karmali coloniile tipice sunt nerugoase, de culoare gri, transparente, rotunde cu margini clare.

Colonii atipice (C.A.)

creștere microbiană cu alte caractere culturale decât cele descrise la C.T.

Absență creștere microbiană (A.C.M.)

mediul fără creștere microbiană.

Identificarea genului Campylobacter – obligatoriu

Conform descrierii din SR ISO 10272-1/2006 și 10272-2/2007 bacteriile aparținând genului Campylobacter are următoarele caracteristici: prezintă creștere abundentă microaerobă la 25˚C și aerobă la 41,5˚C, după 44h +/-4h, sunt oxidază pozitive, prezintă mobilitate, iar morfologic la examenul microscopic – prezintă bacilli ușor încurbați, cu mobilitate caracteristică.

Identificarea speciilor de Campylobacter – opțional

Sunt bacterii catalază positive – de regulă, se determină sensibilitatea la acidul nalidixic, sunt rezistente la cefalotină și se examinează reacțiile de hidroliză indoxil acetatului și a hipuratului.

Este rezistent la cefalotină și în general catalază pozitiv (exp. Campylobacter upsaliensis) și produce rezultat variabil la hidroliza hipuratului și indoxyl-acetatului.

Fig.5.16. Cultură de Campylobacter spp. – colonii fine gri-albicioase, confluente sau izolate, pe mediul MCCD-( foto original)

Fig.5.17. Colonii fine gri-albicioase, cu aspect de boabe de rouă pe mediul MCCD. (foto original)

Fig.5.18 Colonii fine gri-albicioase, cu aspect de boabe de rouă pe mediul MCCD. Cultură abundentă de Campylobacter spp. Pe mediul agar Columbia cu sânge -( foto original)

Fig.5.19 Termostat de tip LEEC, cu atmosferă de CO2 si N reglabilă și controlată (foto original)

Fig.5.20. Mediul agar Columbia cu sânge –plăci inscripționate (denumire mediu, cod probă) pentru pasare tulpini prezumtive de Campylobacter spp.- ( foto original)

Fig.5.21. Colonii izolate și confluate de Campylobacter spp. pe mediul agar Columbia cu sânge.-( foto original)

Fig.5.22. Testul pozitiv pentru hipuratul de sodium – Campylobacter spp.-( foto original)

Fig.5.23 Testul pozitiv pentru hipurat de sodium – Campylobacter spp. – ( foto original)

Fig.5.24. Cultura de Campylobacter spp., pe mediul bulion cu tioglicolat – formare unui inel superior ( foto original).

Fig. 5.25. Cultura de Campylobacter spp., pe mediul bulion cu tioglicolat – mediu de păstrare pentru pasare, efectuare teste biochimice ( foto original).

5.2 Scopul cercetărilor

Obiectivul pe care l-am propus pe parcursul acestui studiu a fost următorul:

Centralizarea rezultatelor obținute pe probele care au fost analizate pentru identificarea și confirmarea serotipurilor izolate de Campylobacter termotolerant, în perioada 01.01.2012-01.06.2014.

Am centralizat și am efectuat calcule statistice pe probele de carcase pui refrigerate, recoltate în cadrul Programelor Strategic și de Autocontrol pe anii 2012 și 2013.

Au fost examinate 24 de probe de carcase de pasăre crudă, refrigerată, prezentată în laborator sub formă de carcasă pui Grill. Recoltarea s-a făcut semestrial, câte 2 probe de unitate de abatorizare, rezultând un total de 24 probe pe an pentru cele 6 unități ce creștere a păsărilor din judeșul Iași.

Au mai fost luate în calcul și recoltările de cecumuri de pasăre, recoltate în Programul Național de monitorizare Campylobacter spp. (comun cu identificare E. coli comensal și Salmonella spp.). Programul a fost demarat începând cu anul 2014, izolarea și incidența Campylobacter spp. este mult mai veridică pe aceste probe. Numărul total de probe analizate, a fost de 96 carcase de pasăre și 16 probe de cecumuri (01.01. – 01.06.2014).

Studiul a fost efectuat cu scopul de a se stabili care a fost incidența cărnii poluate cu Campylobacter spp.

Din cele 96 probe de carcase și carne de pasăre analizate, au fost izolate 5 tulpini de Campylobacter termotolerant (tab. nr. 5.8).

Toate speciile de Campylobacter termotolerant izolate, au fost confirmate ca fiind tulpini de Campylobacter jejuni. Izolarea tulpinilor de Campylobacter termotolerant de pe carcasele de pasăre au rol de stabilire a gradului de contaminare a acestora, având importanță deosebită în transmiterea campilobacteriozelor la om, deci prezintă criteriu de evaluare în Siguranța Alimentelor.

Tabelul nr.5.8.

Incidența Campylobacter spp. în probele de carcase de pui

Tabelul nr.5.9.

Incidența Campylobacter spp. în probele de cecumuri.

Din cele 16 probe de cecumuri au rezulta 14 probe pozitive de Campylobacter spp. cu având o frecvență de 87,5%.

Confirmarea a fost efectuată de Institutului de Igienă și Sănătatea Publică Veterinara București și I.D.S.A. și a stabilit că tulpinile aparțineau diferitelor specii, din care Campylobacter coli și jejuni, au fost cele mai frecvente.

Toate speciile de Campylobacter spp. izolate, au fost confirmate ca fiind tulpini de Campylobacter jejuni și Campylobacter coli (tabelul nr. 5.10).

Izolarea tulpinilor de Campylobacter spp. Din cecumurile de pasăre au rol de stabilire a gradului de contaminare păsărilor abatorizate, cu importanță deosebită în transmiterea campilobacteriozelor la om, fiind criteriu de evaluare în Sănătatea animală.

Tabelul nr.5.10.

Tulpini de Campylobacter jejuni și Campylobacter coli.

Cele 14 tulpini pozitive de Campylobacter spp a avut o frecvență de: 57,14% reprezentând 8 tulpini de Campylobacter jejuni, și 42,86% fiind 6 tulpini de Campylobacter coli.

5.3. Rezultate obținute

În perioada 01.01.2012 – 31.12.2013, au fost izolate din carne de pasăre 5 tulpini de Campylobacter spp.;

În perioada 01.01 – 01.06.2014, au fost analizate 16 probe de cecumuri, din care 14 probe au fost pozitive pentru Campylobacter spp.; (tabelul nr.5.9.)

Din totalul de 96 de probe de carcase de pasăre examinate, 5 probe cu o reprezentare de 5,20%, au fost contaminate cu Campylobacter spp..;

În 2012, au fost examinate 48 probe de carcase de pasăre, în urma cărora au rezultat 3 tulpini de Campylobacter spp. și s-a constatat o incidență de 6,25% pentru Campylobacter spp.;

În 2013, au fost examinate 48 probe de carcase de pasăre, în urma cărora au rezultat 2 tulpini de Campylobacter spp. cu o incidență de 4,16% pentru Campylobacter spp.;

Incidența medie pentru cei doi ani luați în studiu, a fost de 5.20%, carcase de pasăre contaminate cu Campylobacter spp., pe probele provenite și analizate din județul Iași;

În perioada 01.01 – 01.06.2014 au fost examinate 16 probe de cecumuri de unde au rezultat 14 probe pezitive cu o incidență de 87,50% pentru Campylobacter spp.;

Incidența medie pentru Campylobacter spp., stabilită pe eșantioane de lucru a fost de: 5.20% în probele de carcase de pui, iar în probele de cecumuri s-a stabilit o incidență de 87,50%.

Din cele 14 tulpini de Campylobacter spp a rezultat: 8 tulpini de Campylobacter jejuni, si 6 tulpini de Campylobacter coli.

Cele 14 tulpini de Campylobacter spp.,, a avut o pondere de: 57,14% pentru tulpini de Campylobacter jejuni, 42,86% pentru tulpinile de Campylobacter coli.

Tulpinile expediate la confirmare au indicat faptul că pe carcasele de pasăre, în carnea de pasăre și din organele acestora s-au izolat serotipuri cu rol în producerea toxiinfecțiilor alimentare și a îmbolnăvirilor cu Campylobacter spp;

Loturile din care proveneau probele pozitive au fost supuse restricțiilor conform legislației sanitare veterinare și nu au existat implicații epidemiologice.

CONCLUZII

Contaminarea carcaselor de pasăre cu microorganism poate determina alterarea cărnii reducând termenul de valabilitate al acesteia și poate reprezenta un pericol pentru sănătatea publică determinând declanșarea unor toxiinfecții alimentare. De-a lungul timpului s-au efectuat un numar foarte mare de studii cu privire la contaminarea carcaselor de pasăre cu bacteria de genul Salmonella spp. și Campylobacter spp.

Ținând cont de frecvența îmbolnăvirilor și capacitatea de rezistență a Salmonella spp. este de o importanță majoră o colaborare între domeniul sanitar și sanitar-veterinar pentru a stabili măsurile de prevenție a îmbolnăvirilor, având drept scop principal eradicarea salmonelelor animale, dar mai ales umană

Salmonella rămâne cel mai important agent etiologic care stă la baza numeroaselor izbucniri la nivel mondial. Un mediu prielnic proliferării salmonelelor este în strânsă legătură cu păstrarea alimentelor pentru un timp îndelungat la temperatura camerei precum și cu consumul acestora insuficient tratate termic.

Comitetul de experți FAO/OMS a inclus bacteria de Campylobacter jejuni pe lista agenților care produc boli de origne alimentară datorită rolului important în producerea a 85-90% din cazurile de gastroenterită acută la om cu caracter epidemiologic de toxiinfecție alimentară. Este larg răspandită la păsări și mamifere, cele mai multe cu rol de purtător intestinal. Transmiterea la om are loc prin ingestie a alimentelor de origine animală contaminate și a apei contaminate, netratate sau prin contactul direct cu animalele infectate. Foarte rar infecția se poate transmite de la om la om.

În urma studiilor realizate pe o perioadă de doi ani jumătate s-au obținut o serie de rezultate precum:

Incidența medie pentru Salmonella spp. stabilită pe eșantioane de lucru a fost de: 11,16% la carcaselel și carnea de pasăre, iar în organele de pasăre am stabilit o incidență de 12,90%.

Incidența medie pentru Campylobacter spp., stabilită pe eșantioane de lucru a fost de: 5.24% în probele de carcase de pui, iar în probele de cecumuri s-a stabilit o incidență de 87,5%.

BIBLIOGRAFIE

1. Bondoc I., 2014. Controlul produselor și alimentelor de origine alimentară. Editura „Ion Ionescu de la Brad”, Ediția I. Iași.

2. Bazgan O., 1999. Diagnostic de laborator și igiena alimentelor de origine animala. Editura „Moldogrup”. Iași.

3. Leonte D., 2011. Elemente de igienă alimentară. Editura „Ion Ionescu de la Brad”, Ediția I. Iași.

4. Pascal C.,2010. Tehnologii generale animale. Editura „Ion Ionescu de la Brad”, Ediția I. Iași.

5. Stănescu V. și Apostu S., 2010. Igiena, inspecția și siguranța alimentelor de origine animală. Vol. I. Editura „ Risoprint”. Cluj-Napoca.

6. Stănescu V. și Apostu S., 2010. Igiena, inspecția și siguranța alimentelor de origine animală. Vol. II. Editura „ Risoprint”. Cluj-Napoca.

7. Stănescu V. și Apostu S., 2010. Igiena, inspecția și siguranța alimentelor de origine animală. Vol. III. Editura „ Risoprint”. Cluj-Napoca.

8. Șindilar E.,1997. Controlul igienic al produselor și subproduselor de origine animală. Vol.I. Editura „Gh. Asachi”. Iași

9. Vacaru Opriș I., 2007. Tratat de avicultură. Vol.III. Editura „ Ceres”. București.

10. Crețu C., Floreștean V., Carp-Cărare M., Ișan Elena, 2009. The Influence of PH and temperature on Salmonella spp. From Fresh, Chiled and Frozen Poultry Carcasses. Cercetări Agronomice în Moldova Vol. XLII , No. 2 (138) / 2009, pag 79-83.

11. Ișan Elena, 2001 – Observații privind calitatea și salubritatea preparatelor din carne comercializate pe teritoriul județului Iași. Lucrări științifice USAMV, Vol. 44, Editura. „Ion Ionescu de la Brad”, Iași, (pag 56-59).

12. Ișan Elena, Eleonora Guguianu, 2001 – Cercetări privind microflora cărnii, semipreparatelor și preparatelor din carne examinate în cadrul L.S.V.S. Iași. Lucrări științifice USAMV, Vol. 44, Editura. „Ion Ionescu de la Brad”, Iași.

13. Ișan Elena, Eugenia Burtan, Floriștean C.V., 2003 – Incidența unor serotipuri de Salmonella spp. izolate din carne și organe de pasăre. Lucrări științifice USAMV, seria Medicină Veterinară, Vol. 46. Editura. „Ion Ionescu de la Brad”, Iași.

14. Ișan Elena, Eugenia Burtan, Floriștean C.V., 2003 – Incidența unor serotipuride Salmonella spp. izolate din carne și organe de pasăre. Revista de Medicină Veterinară. 13, 3-4, Al IX-lea Congres Național de Medicină Veterinară 24-27 sept.

15. Ișan Elena, Eugenia Burtan, Floriștean C.V., 2003 – Prevalența unor serotipuri de Salmonella spp. izolate de pe suprafața carcaselor de pasăre. Lucrări științifice USAMV, seria Medicină Veterinară, Vol. 46, Editura. „Ion Ionescu de la Brad”, Iași.

16. Ișan Elena – Unele modificări organoleptice, morfopatologice și microbiologice ale cărnii destinate consumului. Teză de doctorat. 2004

18. Pezzotti G.,2003. Occurrence and resistance to antibiotics of Campylobacter Jejuni and Campylobacter Coli in animals and meat in northeastern Italy. International Journal of Food Microbiology. Vol. 82, pag 281-287.

19. Jurnalul Oficial al Uniunii Europene. Regulamentul C.E. 853/2004. http://eur-lex.europa.eu/oj/direct-access.html (accesat la data de 12.04.2013).

20. Jurnalul Oficial al Uniunii Europene. Regulamentul C.E. 854/2004. http://eur-lex.europa.eu/oj/direct-access.html (accesat la data de 23.09.2013).

21. Jurnalul Oficial al Uniunii Europene. Regulamentul C.E. 882/2004. http://eur-lex.europa.eu/oj/direct-access.html (accesat la data de 07.10.2013).

22. Jurnalul Oficial al Uniunii Europene. Regulamentul C.E. 2073/2005. http://eur-lex.europa.eu/oj/direct-access.html (accesat la data de 28.10.2013).