Lector univ. dr. Carmen Curuțiu ABSOLVENT Tănase Nicoleta – Doina BUCUREȘTI 2018 UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI FACULTATEA DE BIOLOGIE LUCRARE DE… [308138]

UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI

FACULTATEA DE BIOLOGIE

LUCRARE DE DISERTAȚIE

CONDUCĂTOR ȘTIINȚIFIC

Lector univ. dr. Carmen Curuțiu

ABSOLVENT: [anonimizat]

2018

UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI

FACULTATEA DE BIOLOGIE

LUCRARE DE DISERTAȚIE

Caracterizarea unor tulpini bacteriene implicate în infecțiile nosocomiale

CONDUCĂTOR ȘTIINȚIFIC

Lector univ. dr. Carmen Curuțiu

ABSOLVENT: [anonimizat]

2018

CUPRINS

Introducere …

Capitolul 1 – [anonimizat] …

1.1. [anonimizat]……………………..

1.2. Tulpini bacteriene implicate în infecțiile nosocomiale………………….

1.3. Biofilme bacteriene în infecțiile nosocomiale și opțiuni terapeutice……

Capitolul 2 – Partea practică. Caracterizarea unor tulpini bacteriene frecvent implicate în infecții nosocomiale: Acinetobacter sp. și Stenotrophomonas maltophilia ……

2.1. Scop si obiective………………………………………………………..

2.2. Materiale și metode……………………………………………………….

2.3. Rezultate și discuții……………………………………………………….

2.3.1. Expresia factorilor de virulență la tulpinile analizate……………..

2.3.2. Capacitatea de aderența la substrat inert și formarea de biofilme a tulpinilor analizate

2.3.3. Profilul de antibiorezistență al tulpinilor analizate…………………

2.4. Concluzii

Bibliografie

INTRODUCERE

Infecțiile nosocomiale ([anonimizat], [anonimizat] (francofon), crossinfection (anglosaxon), hospitalismus (german))- sunt conform Organizației Mondiale a Sănătății (O.M.S.) infecții apărute la un pacient: [anonimizat]-o altă unitate de îngrijire care nu era infectat sau în perioada de incubație a bolii la data internării precum și infecțiile ocupaționale în rândul personalului.

Termenul nosokomeia în lb. greacă semnifică "locul unde sunt adunați și îngrijiți cei suferinzi", iar nosokomeion înseamnă spital (nosos = boală, komeo = a avea grijă de…).

[anonimizat]/sau microbiologic. Se apreciază că 5-10 % dintre pacienții spitalizați sunt afectați de o [anonimizat], arși și hematologie.

[anonimizat]-[anonimizat], [anonimizat], [anonimizat], [anonimizat], [anonimizat]. Costurile tratamentelor pacienților cu infecții nosocomiale sunt în medie de 2,9 [anonimizat] 2,5 ori mai mare (în medie 11 zile).

Mortalitatea datorată acestor infecții este de 8000-10.000 decese /an în Franța, >5000 în UK, 77.000 [anonimizat].

[anonimizat] a [anonimizat] a patternului de antibiorezistenta.

CAPITOLUL 1 – [anonimizat]

1.1. [anonimizat] ca infecții dobândite de către pacienții aflați sub îngrijire medicală în perioada intraspitalicească, ce se pot manifesta fie pe perioada internării, fie după externare. Infecțiile nosocomiale creează mari probleme în rândul pacienților, ele întâlnindu-se atât în țările dezvoltate cât și în cele în curs de dezvoltare (Rafique și colab., 2017). Organizația Mondială a Sănătății (OMS) a estimat că aproximativ 15% dintre pacienții internați dezvoltă o infecție nosocomială (Khan și colab., 2016). De asemenea, s-a constatat că frecvența infecțiilor nosocomiale este de trei ori mai ridicată în rândul țărilor slab dezvoltate comparativ cu țările bine dezvoltate sau în curs de dezvoltare (Khan și colab., 2016). Totodată, s-a constatat că în unitățile de terapie intensivă frecvența infecțiilor nosocomiale este de până la 5 ori mai mare decât în celelalte secții ale spitalelor (Sang și colab., 2017).

Studiile au demonstrat faptul că infecțiile nosocomiale dobândite de către pacienții care prezintă arsuri severe conduc inevitabil la moartea acestora (Koraichi și colab., 2017). Spitalizarea presupune contactul direct al pacientului cu tot ceea ce se află în jurul acestuia, de la personalul medical și alți pacienți internați, până la obiecte contaminate care reprezintă o sursă de infecție. Prin urmare, se considera că dezvoltarea infecțiile nosocomiale depinde de mai mulți factori, exogeni și endogeni (Koraichi și colab., 2017).

Factorii exogeni care contribuie la dezvoltarea infecțiilor nosocomiale sunt reprezentați de agenți patogeni, personal medical, alți pacienți spitalizați, diverse obiecte cotaminate din spital, condițiile de igienă (Khan și colab., 2016; Koraichi și colab., 2017). În literatura de specialitate apar informații privind rolul apei contaminate din spitale în dobândirea infecțiilor nosocomiale. S-a constatat că agenții patogeni prezenți în apă, cum ar fi Legionella pneumophila, Acinetobacter sp., Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas sp., Enterobacter sp., Serratia marcescens, Stenotrophomonas maltophilia au capacitatea de a forma biofilme bacteriene în mediul acvatic (Anaissie și colab., 2002).

Alți factori importanți care favorizează infecțiile sunt reprezentați de spitalizarea pe un timp îndelungat, folosirea tehnicilor invazive, precum și imunitatea pacientului (Sethy și Rout, 2017; Rafique și colab., 2017).

Agenții patogeni care produc infecții nosocomiale sunt bacteriile, fungii și virusurile. (Khan și colab., 2016). Aceștia sunt răspândiți pe diverse suprafețe cum ar fi paturile și lenjeriile de pat din spitale, clanțe, obiecte sanitare, dispozitive medicale (de exemplu stetoscop) (Khan și colab., 2016; Essein-Baidoo și colab., 2018). Alte surse importante de infecție sunt reprezentate de transfuziile de sânge, utilizarea obiectelor incorect sterilizate sau nesterilizate, cum ar fi acele, seringile, bisturiele (Rafique și colab., 2017). În acest mod se pot transmite cu mare ușurință virusurile hepatitei B (VHB) și hepatitei C (VHC) (Khan și colab., 2016).

Pe lângă factorii exogeni care favorizează infecția, o importanță deosebită o au și factorii endogeni care se referă microbiota pacientului. Astfel, în condițiile în care pacientul suferă o operație iar rana intră în contact cu bacteriile de la nivelul tractului gastro-intenstinal, acesta prezintă un risc foarte mare de a dezvolta o infecție, mai ales cu bacteriile Gram- negative (Khan și colab., 2017). Conform datelor actuale, cele mai frecvente infecții nosocomiale dobândite în special în unitățile de terapie intensivă (Polec și colab., 2017) sunt:

infecțiile tractului respirator

infecțiile fluxului sanguin

infecții ale tractului urinar

infecții gastro-intestinale

infecții ale situsului chirurgical

Cele mai răspândite infecții nosocomiale ale tractului respirator sunt pneumoniile (Prisacari și colab., 2008), care apar la cel puțin 48-72 de ore după spitalizare (Dalhoff și Ewig, 2013). Dezvoltarea pneumoniei nosocomiale multirezistente la antibiotice implică mai mulți factori de risc printre care intubația endotraheală, tratamentul neadecvat cu antibiotice, ventilația mecanică, diferite boli structurale ale plămânilor (Dalhoff și Ewig, 2013; Vincent, 2003). Diagnosticul pneumoniilor nosocomiale se realizează prin mai multe metode, atât prin diagnostic diferențial, cât și prin efectuarea testelor microbiologice de laborator și utilizarea radiografiei (Dalhoff și Ewig, 2013). Criteriile pentru diagnosticul pneumoniei nosocomiale includ prezența febrei mai mare de 38 °C, prezența în sânge a unui număr mai mic de 4000 de leucocite per μL sau peste 10000 de leucocite /μL, precum și secreții purulente. Agentul patogen incriminat se identifică pe baza culturii din secreția traheo-bronșică (Dalhoff și Ewig, 2013). De asemenea, s-a constatat că pacienții care suferă de boli cronice pulmonare prezintă un risc ridicat de a dezvolta infecții nosocomiale (Vincent, 2003).

Infecțiile asociate fluxului sanguin apar ca urmare a utilizării prelungite a cateterelor intravenoase care sunt utilizate în scopul administrării de medicamente și substanțe nutritive (Khan și colab., 2016). Diagnosticul infecțiilor asociate fluxului sanguin se realizează pe baza îndeplinirii a cel puțin unui criteriu dintre următoarele: adulții trebuie să prezinte febră mai mare de 38 ° C, hipotensiune sau frisoane, însoțită de valori pozitive ale testului de detectare al antigenului din sânge, în condițiile în care organismul detectat nu colonizează alt loc de pe corp. În cazul copiilor cu vârsta mai mică de 1 an, diagnosticul presupune apariția simptomelor de febră, bradicardie sau hipotermie și valori pozitive ale testului de detectare al antigenului din sânge, în condițiile în care organismul respectiv să nu colonizeze alte situsuri (Garner și colab., 1988).

Infecțiile tractului urinar asociate cu cateter sunt determinate de diverse specii bacteriene cum ar fi Proteus sp., Escherichia coli, chiar și fungice precum Candida sp. Majoritatea bacteriilor implicate în acest tip de infecție formează biofilme pe suprafața interioară a cateterului, ceea ce le conferă o rezistență ridicată la terapia antimicrobiană (Stamm, 1991). Pe lângă utilizarea îndelungată a cateterelor urinare, în apariția infecțiilor tractului urinar au fost incriminați mai mulți factori de risc printre care manipularea cateterului de către personalul medical care nu utilizează mănuși, sexul pacientului și unele boli (malnutriție, diabet)(Bearman și colab., 2006). Diferența dintre sexe este foarte semnificativă în ceea ce privește dezvoltarea acestui tip de infecție, întrucât se consideră că tractul urinar al femeilor este infectat de către bacteriile care provin din zona rectală (Stamm, 1991). Diagnosticul infecției urinare asociate cu cateter la adulți se realizează pe baza îndeplinirii a două condiții. În primul rând, pacientul trebuie să aibă febră mai mare de 38 ° C, iar urocultura trebuie să fie pozitivă, cu ≥ UFC per ml de urină (Garner și colab., 1988; Rosenthal și colab., 2006). A doua condiție o reprezintă piuria, adică prezența leucocitelor în urină (Garner și colab., 1988).

Infecțiile gastro-intestinale sunt foarte răspândite și includ mai multe categorii: gastroenterită, infecții ale tractului gastro-intestinal, enterocolită necrozantă, hepatită (Garner și colab., 1988). Pentru a se stabili exact dacă aceste afecțiuni au fost dobândite în spital, fiecare dintre ele trebuie să îndeplinească mai multe condiții. Diagnosticul de gastroenterită se realizează pe baza îndeplinirii mai multor criterii. Un prim criteriu este reprezentat de prezența diareei cu febră mai mare de 38 °C, însoțită sau nu de vărsături. Al doilea criteriu presupune existența unei stări generale alterate însoțită de dureri de cap, greață, dureri abdominale și identificarea agentului patogen din fecale sau identificarea anticorpilor specifici în sânge (Garner și colab., 1988). Pe lângă acestea, este necesară izolarea agentului patogen din țesutul obținut în urma intervenției chirurgicale sau din probă de sânge sau evidențierea infecției în urma efectuării endoscopiei (Garner și colab., 1988).

Infecțiile plagilor chirurgicale reprezintă o problemă majoră în spitale deoarece plăgile se pot infecta foarte rapid cu diverse microorganisme, cele mai frecvente fiind Staphylococcus aureus, Escherichia coli și diverse specii ale genului Enterococcus. Acestea sunt de două tipuri: infecții superficiale și profunde (Owens și Stoessel, 2008). Cercetătorii atrag atenția că infecțiile nosocomiale pot fi prevenite, insistând asupra măsurilor de prevenție (Rafique și colab., 2017). În acest scop, se recomandă igiena riguroasă a mâinilor, utilizarea soluțiilor speciale pentru curățarea podelelor, a ferestrelor, a băilor, precum și utilizarea mănușilor și a măștilor de unică folosință (Khan și colab., 2016). Se consideră că în lipsa accesului la apă și săpun, alcoolul medicinal reprezintă o alternativă eficientă (Rafique și colab., 2017). Totodată, se recomandă sterilizarea apei din spitale, întrucât există anumite categorii de pacienți care sunt mult mai vulnerabili de a dezvolta o infecție nosocomială cu bacterii din apă (de exemplu, pacienții imunocompromiși)(Anaissie și colab., 2002).

1.2. Tulpini bacteriene implicate în infecțiile nosocomiale

Principalele tulpini bacteriene implicate în infecțiile nosocomiale sunt: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Acinetobacter baumannii (Sethy și Rout, 2017), Proteus mirabilis, Clostridium difficile, Enterococcus faecalis, Stenotrophomonas maltophilia (Khan și colab., 2015). Staphylococcus aureus este o specie Gram-pozitivă, ale cărei celule sferice sunt grupate în formă de ciorchine, de unde și denumirea de stafilococ (Chifiriuc și colab., 2011). Coloniile cresc în condiții aerobe, iar pe mediile de cultură solide sunt opace, cremoase și au culoare galben citrin datorită pigmentului sintetizat (Fig. 1) (Brooks și colab., 2012; Chifiriuc și colab., 2011). Deși este comensal la nivelul tegumentului și a cavității nazale, Staphylococcus aureus este un agent patogen oportunist implicat în diverse tipuri de infecții, inclusiv în cele nosocomiale (Chifiriuc și colab., 2011; Tong și colab., 2015). Tulpini de Staphylococcus aureus au fost izolate de la pacienții care au catetere urinare, precum și de la cei care au suferit intervenții chirurgicale (Khan și colab., 2016; Tong și colab., 2015). Tulpinile de Staphylococcus aureus, mai ales cele rezistente la meticilină (MRSA) sunt responsabile de apariția infecțiilor nosocomiale primare asociate fluxului sangvin, plagilor chirurgicale, precum și pneumoniilor (Gordon și Lowy, 2008; Sethy și Rout, 2017). De asemenea, acestea deternină complicații serioase la pacienții cu arsuri severe (Koraichi și colab., 2017).

Staphylococcus aureus se diferențiază de restul stafilococilor prin capacitatea sa de a coagula plasma, iar de streptococi se diferențiază prin potențialul său de a sintetiza catalază (Chifiriuc și colab., 2011). De asemenea, această bacterie fermentează glucoza și manitolul (Chifiriuc și colab., 2011). Factorii de virulență pe care Staphylococcus aureus îi deține sunt: adezine (proteina A, proteine de legare a fibronectinei, proteine de legare a colagenului, factorii clumping (ClfA, ClfB), toxine (alfa-hemolizina, beta-hemolizina, gama-hemolizina), exoenzime (proteaze, lipaze, nucleaze, colagenaza, stafilokinaza, hialuronidaza) (Costa și colab., 2013; Chifiriuc și colab., 2011). Majoritatea tulpinilor prezintă o capsulă polizaharidică ce le permite să se apere împotriva mecanismelor de fagocitoză ale gazdei (Gordon și Lowy, 2008). Proteina A este localizată pe suprafața celulei bacteriene, intrând în alcătuirea peretelui celular și mediază aderarea la diverse suporturi. Este un factor de virulență foarte important deoarece se leagă cu mare afinitate de domeniul Fc al IgG, exceptâng IgG3, ceea ce determină evitarea procesului de fagocitoză (Brooks și colab., 2013). Odată pătruns în organism, Staphylococcus aureus secretă o paletă largă de exoenzime care îi permit invazia, degradând anumite componente ale țesuturilor. Astfel, lipaza și leticinaza formează pori în membranele celulelor alterând structura dublului strat fosfolipidic (Chifiriuc și colab., 2011). Proteazele, așa cum le spune și denumirea, au capacitatea de a descompune proteinele, distrugând țesuturile gazdei, pe când cele trei tipuri de hemolizine lizează o parte din elementele figurate ale sângelui (Costa și colab., 2013; Chifiriuc și colab., 2011).

Reprezentanții genului Acinetobacter, care aparțin familiei Moraxellaceae, sunt cunoscuți pentru frecvența cu care sunt implicați în infecțiile nosocomiale, dar și pentru că fac parte din flora bacteriană a tegumentului (Peleg și colab., 2008; Chifiriuc și colab., 2011). Din punct de vedere biochimic, tulpinile de Acinetobacter prezintă testul catalazei pozitiv, testul oxidazei negativ, hidrolizează esculina și anumite specii fermentează lactoza (Chifiriuc și colab., 2011; Constantiniu și colab., 2004, pag. 38). Studiind caracteristicile biochimice ale tulpinilor de Acinetobacter sp. din diverse probe biologice (sânge, urină, puroi, secreție traheo-bronșică, izolare de la nivelul cateterelor), Gupta și colab. au identificat că aceste tulpini hidrolizează gelatina și numai Acinetobacter haemolyticus izolat din puroi produce hemolizine, restul tulpinilor neproducând hemoliză (Gupta și colab., 2015).

Genul Acinetobacter cuprinde cocobacili Gram-negativi care se dezvoltă pe medii de cultură la temperaturi de până la 42 grade C, în condiții de aerobioză (Chifiriuc și colab., 2011). Acinetobacter baumannii, cel mai studiat reprezentant al genului, formează colonii mici, netede, uneori mucoide, care au culoare alb-crem (Fig. 2) (Peleg și colab., 2008).

Acinetobacter baumannii este cunoscut pentru frecvența cu care este izolat din infecțiile nosocomiale, mai ales din cele ale tractului respirator, în unitățile de terapie intensivă. A fost izolat din infecții ale fluxului sangvin, meningite, infecții ale tractului urinar asociate cu cateter și endocardite (Poirel și Nordmann, 2006; Reena și colab., 2017). Severitatea infecțiilor produse se datorează factorilor de virulență pe care îi posedă, cum ar fi capsula polizaharidică, fosfolipaze, porine, pili (Lee și colab., 2017). Pseudomonas aeruginosa este un bacil flagelat Gram-negativ care se dezvoltă pe diverse medii de cultură în condiții de aerobioză, la temperaturi de până la 42°C (Chifiriuc și colab., 2011). Coloniile au miros plăcut de flori de tei, sunt netede și mari (Fig. 3) (Chifiriuc și colab., 2011). Există anumite tulpini de Pseudomonas aeruginosa care produc pigmenți de diferite culori (roșu, verde, negru, albastru), aceștia fiind factori de virulență toxici pentru alte celule (Chifiriuc și colab., 2011; Dorobăț, 2006).

Tulpinile acestei specii au capacitatea de a produce numeroși factori de virulență care le permite să pătrundă și să colonizeze cu ușurință țesuturile gazdei. De asemenea, acesți factori de virulență amplifică severitatea bolilor produse și conferă multirezistența la antibiotice (Gillespie și Bamford, 2012). Cei mai importanți factori de virulență produși de Pseudomonas aeruginosa sunt exotoxina A, exoenzima S, proteaze, lipaze, fimbriile, exopolizaharidele, lipopolizaharidele (Chifiriuc și colab., 2011). Exotoxina A este o proteină alcătuită din trei domenii care se aseamănă cu toxina produsă de Corynebacterium diphtheriae (toxina difterică). Această exotoxină reprezintă un factor de virulență foarte important, deoarece inhibă biosinteza proteinelor și are efecte toxice asupra macrofagelor (Wu și Li, 2015; Chifiriuc și colab., 2011). Exoenzima S alături de fimbriile de tip IV și exopolizaharidele ajută bacteria să adere la diverse suprafețe (Chifiriuc și colab., 2011). Pseudomonas aeruginosa este un agent patogen oportunist implicat în numeroase patologii, printre care fibroza chistică și infecțiile nosocomiale (Verma și colab., 2018). Această bacterie a fost izolată din pneumonii nosocomiale, infecții ale fluxului sangvin, infectii de tract urinar și leziuni chirurgicale (Wieland și colab., 2017).

Klebsiella pneumoniae este un bacil Gram negativ capsulat, imobil, care aparține familiei Enterobacteriaceae, alături de Escherichia coli, Proteus mirabillis și alte specii bacteriene de importanță medicală (Chifiriuc și colab., 2011). Bacilul provoacă septicemie, infecții ale tractului urinar și respirator pe perioada spitalizării, mai ales la pacienții imunocompromiși (Wu și Li, 2015; Tadesse și Alem, 2006).

Pe mediul geloză sânge coloniile sunt opace, albicioase, mucoide (Fig. 4)(Sharma și colab., 2015; Chifiriuc și colab., 2011). În ceea ce privește caracterele biochimice, Klebsiella pneumoniae are capacitatea de a fermenta malonatul și lactoza, produce urează, accentuând severitatea infecțiile tractului urinar (Dorobăț, 2006; Wu și Li, 2015).

Factorii de virulență pe care îi posedă contribuie la severitatea infecțiilor produse, precum și la formarea de biofilme cu multirezistență la antibiotice. Principalii factori de virulență pe care Klebsiella pneumoniae îi posedă sunt: capsula de natură polizaharidică ce prezintă antigenul K, antigenul somatic O, siderofori, două tipuri de fimbrii (Dorobăț, 2006; Vuotto și colab., 2014). Capsula joacă un rol foarte important în procesele de patogenitate și virulență, întrucât are capacitatea de a proteja celula bacteriană de acțiunea fagocitelor și îi conferă rezistență la substanțele antibacteriene (Podschun și Ullmann, 1998). Cele două tipuri de fimbrii sau pili, de tip 1 și de tip 3, joacă rol de adezine deoarece ajută celula bacteriană să adere la epiteliile colonizate (Podschun și Ullmann, 1998). Atât antigenul O, cât și antigenul K se întâlnesc la reprezentanții familiei Enterobacteriaceae (Chifiriuc și colab., 2011). Klebsiella pneumoniae concurează pentru ionii de fier cu proteinele organismului pe care l-a infectat, prin sinteza de siderofori. Sideroforii sunt molecule de dimensiuni mici care au rolul de a capta fierul feric atunci când aceste resurse se diminuează (Chifiriuc și colab., 2011).

Escherichia coli este un bacil Gram-negativ care se regăsește în microbiota intestinală a omului și a animalelor (Chifiriuc și colab., 2011). În condiții de aerobioză, uneori și de anaerobioză, precum și la temperaturi de până la 45 °C, Escherichia coli (Fig. 5) se dezvoltă pe mediile de cultură formând colonii nevâscoase, neieșite în relief (Chifiriuc și colab., 2011l; Doborăț, 2006).

Din punct de vedere biochimic, Escherichia coli fermentează lactoza (Chifiriuc și colab., 2011). Această bacterie este implicată în etiologia a numeroase boli, printre care infecții ale tractului urinar, peritonită, pneumonie, meningită la copii (Khan și colab., 2015). Escherichia coli este considerată o specie cu mai multe patovaruri deoarece prezintă șase tipuri de tulpini implicate în infecțiile intestinale asociate cu diaree: ”ETEC (tulpini enterotoxigene), EPEC (tulpini enteropatogene), EHEC (tulpini enterohemoragice), EIEC (tulpini enteroinvazive), EAEC (tulpini enteroaderente), DAEC (tulpini difuz-aderente)” (Chifiriuc și colab., 2011). De asemenea, Escherichia coli mai prezintă două tipuri de tulpini care acționează la nivel extraintestinal, una care este implicată în producerea infecțiilor urinare (UPEC), iar cealaltă determină șoc septic (SEC) (Chifiriuc și colab., 2011). Tulpinile de Escherichia coli posedă o serie de factori de virulență reprezentați de adezine (fimbrii), flageli cu rol în motilitate, hemolizine, LPS, capsulă și trei antigene importante: O, H, K (Emödy și colab., 2003; Kayser și colab., 2005). De asemenea, Escherichia coli prezintă două enterotoxine, enterotoxina termostabilă și enterotoxina termolabilă, aceasta din urmă fiind asemănătoare cu toxina produsă de Vibrio cholerae (Chifiriuc și colab., 2011). Escherichia coli este o specie bacteriană mobilă, având flageli ce exprimă antigenul H, dispuși pe toată suprafața celulei (Chifiriuc și colab., 2011; Kayser și colab., 2005). Fimbriile pe care le posedă Escherichia coli sunt de tip 1, acestea jucând un rol important în procesele de aderare și colonizare a substratului, precum și în formarea de biofilme (Emödy și colab., 2003). Tulpinile de Escherichia coli care determină infecții ale tractului urinar posedă capsulă, un factor de virulență important care protejează celulele bacteriene de acțiunea fagocitelor (Emödy și colab., 2003). O altă bacterie implicată în infecțiile nosocomiale este Proteus mirabilis. Acesta este un bacil Gram-negativ care nu fermentează lactoza, nu produce indol, însă produce urează (Chifiriuc și colab., 2011; Dorobăț, 2006). Pe medii de cultură solide care conțin agar (Fig. 6), Proteus mirabilis se dezvoltă prin mișcări circulare, iar coloniile au aspectului un roi (”swarming”)(Schaffer și Pearson, 2015). S-a constatat că în formarea acestui aspect de ”swarming” flagelii joacă un rol important (Coker și colab., 2000).

Tulpinile acestei specii posedă o serie de factori de virulență cum ar fi: urează, flageli, hemolizină, fimbrii (Coker și colab., 2000). Asemenea celorlalți membri ai familiei Enterobacteriaceae, Proteus mirabilis formează biofilme pe diverse suprafețe, mai ales la nivelul cateterelor urinare și la nivelul epiteliului tractului urinar (Jacobsen și Shirtliff, 2011). Fimbriile fac parte din categoria adezinelor și ajută bacteria să adere la suprafața epiteliului tractului urinar sau a suprafeței cateterului (Baldo și Rocha, 2014). Hemolizinele sunt toxine care joacă un rol important în răspândirea infecției la nivelul rinichilor (Coker și colab., 2000). Proteus mirabilis este implicat în infecțiile nosocomiale – infecții ale tractului urinar asociate cu cateter (Jacobsen și Shirtliff, 2011). Această specie bacteriană produce și alte tipuri de afecțiuni printre care osteomielită, meningoencefalită la copiii nou-născuți (Schaffer și Pearson, 2015) și pielonefrită (Coker și colab., 2000). Clostridium difficile este un bacil Gram-pozitiv ce se dezvoltă în condiții de anaerobioză și are capacitatea de a produce spori (Khan și colab., 2015). Deși face parte din microbiota normală a intestinului, Clostridium difficile este un agent important al infecțiilor nosocomiale, infectii de tract gastro-intestinal asociate cu diaree, mai ales la copii (Chifiriuc și colab., 2011; Langley și colab., 2002). Spre deosebire de celelalte specii ale genului Clostridium, Clostridium difficile nu produce beta hemoliză (Chifiriuc și colab., 2011). Această specie are capacitatea de a fermenta glucoza și alte glucide precum manoza și fructoza, însă nu produce lipaze și leticinaze (Chifiriuc și colab., 2011). Pe mediul de cultură cromogen (Fig. 7), Clostridium difficile formează colonii netede cu margini neregulate, care au culoare neagră (Yang și colab., 2013). Tulpinile acestei specii sunt mobile și se deplasează cu ajutorul flagelilor care sunt dispuși peritrich, pe toată suprafața celulei (Vedantam și colab., 2012).

Speciile bacteriene care aparțin genului Clostridium au capacitatea de a produce o serie de toxine, majoritatea letale (Chifiriuc și colab., 2011). Astfel, Clostridium difficile produce două toxine care reprezintă factorii de virulență majori ai acestei specii: enterotoxina A și citotoxina B (Poxton și colab., 2001). Pe lângă cele două toxine, Clostridium difficile prezintă și flageli, proteine de legare a fibronectinei, fimbrii (la unele tulpini), care joacă un rol important în aderarea și colonizarea bacteriei la nivelul substratului (Awad și colab., 2014). Cele două toxine determină moartea celulelor și declanșează răspunsul imun al gazdei (Poxton și colab., 2001). Clostridium difficile formeaza spori în condiții de stres, care pot fi distruși la temperaturi ridicate (Awad și colab., 2014; Rupnik și colab., 2009). În infecțiile nosocomiale au fost implicați și reprezentanți ai genului Enterococcus, mai ales Enterococcus faecalis și enterococi rezistenți la vancomicină (VRE). Aceștia sunt coci Gram-pozitivi izolați frecvent din infecțiile nosocomiale asociate tractului urinar și cateterelor vasculare, dar se găsesc și în microbiota intestinală normală (Chifiriuc și colab., 2011). Enterococcus faecalis a fost izolat adesea din infecțiile nosocomiale și face parte din microbiota intestinală normală (Kristich și colab., 2004). Se dezvoltă în condiții de aerobioză formând colonii de culoare gri, uneori galbenă (Fig. 8) (Chifiriuc și colab., 2011). Din punct de vedere biochimic, Enterococcus faecalis sunt catalază-negativi, PYR (pirolidonil arilamidază) pozitivi și esculină-pozitivi (Chifiriuc și colab., 2011; Dorobăț, 2006).

Factorii de virulență pe care Enterococcus faecalis îi posedă sunt reprezentați de adezine (substanța de agregare, acizi lipoteichoici, adezine de suprafață), citolizină, hialuronidază, gelatinază, feromoni de sex (Chifiriuc și colab., 2011). De asemenea, Enterococcus faecalis formează biofilme bacteriene (Kristich și colab., 2014). Exceptând rolul lor în aderare și colonizare, adezinele acestei specii pot forma abcese la nivelul țesuturilor. Citolizina inhibă alte specii de bacterii și lizează hematiile (Chifiriuc și colab., 2011). Stenotrophomonas maltophilia este o bacterie Gram-negativă care aparține genului Stenotrophomonas și este implicată în infecții nosocomiale ale plăgilor și fluxului sangvin, ale tractului urinar și respirator, dar și în fibroză chistică (Chang și colab., 2013; Chifiriuc și colab., 2011; Looney și colab., 2009). Acest bacil crește obligatoriu în condiții de aerobioză, la temperaturi de până la 37 grade C, pe mediul de cultură formând colonii mici, de culoare gălbui sau gri (Fig. 9) (Brooke, 2012; Nyc și Matejkova, 2010).

Factorii de virulență pe care tulpinile de Stenotrophomonas maltophilia le posedă sunt reprezentați de flageli, fimbrii, lipopolizaharide membranare, exoenzime, precum hemolizinele, DNAze, lipaze, gelatinază, dar și capacitatea de a forma biofilme (Abbott și colab., 2011; Senol, 2004). În ceea ce privește testele biochimice, Stenotrophomonas maltophilia nu fermentează lactoza, testul oxidazei este negativ, nu produce indol, iar testele DNAzei, lizin-decarboxilazei, esculinei sunt pozitive (Abbott și colab., 2011; Denton și Kerr, 1998).

1.3. Biofilme bacteriene în infecțiile nosocomiale și opțiuni terapeutice

Administrarea abuzivă a antibioticelor în ultimii ani a condus la dezvoltarea mecanismelor de rezistență la antibiotice a tulpinilor bacteriene, ceea ce îngreunează tratarea afecțiunilor determinate de aceste tulpini.

Multirezistența la antibiotice reprezintă o problemă serioasă, dat fiind faptul că majoritatea tulpinilor izolate din infecțiile nosocomiale prezintă gene ce codifică diferite enzime care degradează antibiotice (Gillespie și Bamford, 2012). Spre exemplu, tulpinile de Staphylococcus aureus sunt rezistente la antibioticele beta-lactamice deoarece produc o enzimă numită beta-lactamază (Gillespie și Bamford, 2012).

Pe de altă parte, numeroase tulpini izolate din infecțiile nosocomiale formează biofilme care le protejează de efectul substanțelor antimicrobiene (Donlan și Costerton, 2002). „Biofilmul este o comunitate microbiană sesilă alcătuită din celule atașate ireversibil la un substrat, la o interfață sau între ele, încorporate într-o matrice de substanțe polimerice extracelulare pe care le-au produs și manifestă un fenotip modificat cu privire la rata de creștere și de transcriere a genelor” (Donlan și Costerton, 2002). Formarea biofilmului presupune mai multe etape: aderare, colonizare, maturizare și detașare (Tremblay și colab., 2014). Inițial, bacteria aderă la diferite substraturi cu ajutorul unor structuri numite adezine, cum ar fi capsula, fimbriile, pilii, flagelii, lipopolizaharide, în acest stadiu aderarea fiind reversibilă (Lazăr și Chifiriuc, 2010; Tremblay și colab., 2014). Ulterior, după ce bacteria a aderat ireversibil la substrat prin intermediul receptorilor specifici, aceasta se multiplică și formează microcolonii care se vor desprinde într-un final, ceea ce face posibilă răspândirea infecției (Tremblay și colab., 2014). Celulele bacteriene care alcătuiesc biofilmul nu sunt legate între ele, iar acestea comunică între ele prin semnale chimice (Chifiriuc și colab., 2011). De-a lungul timpului, cercetătorii au studiat biofilmele produse de diverse specii bacteriene și au ajuns la concluzia că acestea exercită mecanisme rezistență la antibiotice din mai multe motive. În primul rând, matricea care protejează biofilmul este greu permeabilă pentru substanțele antibacteriene, astfel că celulele bacteriene nu sunt afectate de aceste substanțe (Donlan și Costerton, 2002). Pe de altă parte, dacă antibioticul difuzează prin matricea biofilmului, acesta este îndepărtat de pompele de eflux pe care celulele din biofilm pe posedă (Chifiriuc și colab., 2011). În al doilea rând, celulele bacteriene care formează biofilmul au o rată diferită de creștere, lucru observat mai ales la biofilmele mature (Kaur și colab., 2017; Donlan și Costerton, 2002).

Staphylococcus aureus are capacitatea de a forma biofilme acoperite de un strat de glicocalix ceea ce îi permite să persiste la nivelul dispozitivelor medicale invizive sau a altui substrat (Archer și colab., 2011). Primul pas în formarea biofilmului este reprezentat de aderarea bacteriei la nivelul substratului specific, care se realizează cu ajutorul a două categorii de adezine: ”adezinele asociate suprafeței celulare” și ”adezinele secretate” (Chifiriuc și colab., 2011). Din prima categorie de adezine fac parte proteinele de legare a fibronectinei (FnbpA, FnbpB), proteina de legare a sialoproteinei osului, proteina de legare a colagenului, proteina A, cei doi clumping factori (ClfA, ClfB) (Chifiriuc și colab., 2011). Din a doua categorie de adezine fac parte coagulaza, proteina de aderență extracelulară (Eap), proteina de legare a matricei extracelulare (Emp), proteina extracelulară de legare a fibrinogenului (Efb) (Chifiriuc și colab., 2011). În a doua etapă are loc colonizarea și formarea matricei extracelulare care protejează biofilmul. Matricea extracelulară se sintetizează ca urmare a expresiei genelor specifice (Tong și colab., 2015). Un rol important în această etapă o are proteina de legare a elastinei deoarece ajută celulele să colonizeze țesuturile gazdei sau alte materiale (Chifiriuc și colab., 2011). Formarea microcoloniilor reprezintă al treilea pas în formarea biofilmului. S-a constatat că celulele bacteriene din cadrul microcoloniei sunt legate între ele prin intermediul poli-N-acetilglucozaminei, ceea ce conferă o virulență mai mare comparativ cu biofilmele produse de tulpinile de Staphylococcus aureus rezistente la meticilină (Tong și colab., 2015). Întrucât tulpinile de Staphylococcus aureus au capacitatea de a secreta penicilinaze, acestea prezintă rezistență la antibioticele beta-lactamice (Brooks și colab., 2013). Cu toate acestea, infecțiile provocate de aceste tulpini se pot trata prin administrarea eritromicinei, clindamicinei, aminoglicozidelor, tetraciclinei și acidului fusidic (Gillescpie și Bamford, 2012). Tulpinile de Staphylococcus aureus rezistente la meticilină (MRSA) sunt sensibile la vancomicină, linezolid și într-o proporție mai mică la cloramfenicol (Kaur K. Și colab., 2017). Acinetobacter baumannii prezintă numeroși factori de virulență care îi conferă capacitatea de a forma biofilme și, implicit, multirezistența la antibiotice. Biofilmele se pot forma atât la nivelul țesuturilor, cât și la nivelul substraturilor abiotice, cum ar fi materialele plastice și sticla (Reena și colab., 2017). Principalii factori de virulență pe care îi posedă sunt capsula polizaharidică, porinele, pilii și lipazele pe care le secretă (Chifiriuc și colab., 2011; Lee și colab., 2017). Invazia și aderarea bacteriilor la substrat se realizează cu ajutorul porinelor, a capsulei și pililor. Porinele sunt reprezentate de proteine atașate la exteriorul membranei celulare, facilitând permeabilitatea celulară. Cea mai importantă porină pe care o posedă Acinetobacter baumannii este OmpA (Lee și colab., 2017).

Acinetobacter baumannii este cunoscut pentru multirezistența sa la antibiotice. În acest sens, tulpinile acestei specii și-au dezvoltat o serie de mecanisme de rezistență la antibiotice. Cele mai cunoscute mecanisme sunt reprezentate de producerea de beta-lactamaze, existența pompelor de eflux, precum și existența unor enzime care conferă rezistență la carbapenemi, peniciline, aminoglicozide, quinolone, cefalosporine, tetraciclină, polimixine (Gordon și Wareham, 2010; Urban și colab., 2003; Perez și colab., 2007). Pe de altă parte, studiile au demonstrat sensibilitatea tulpinilor de Acinetobacter baumannii la ureidopeniciline, cum ar fi piperacilina și mezlocilina, dar și la carbpenicilină și ticarcilină, care sunt carboxipeniciline (Chifiriuc și colab., 2011).

Pseudomonas aeruginosa formează biofilme bacteriene acoperite de o matrice extracelulară, ceea ce îi conferă o multirezistență la diverse clase de antibiotice (Ochoa și colab., 2013). Biofilmele se formează pe diferite substraturi, de la țesuturile organismului până la suporturi din plastic și metal, ceea ce explică prezența acestora la nivelul cateterelor venoase și urinare (Taylor și colab., 2014). Aderarea bacteriei la aceste substraturi se realizează cu ajutorul fimbriilor, a exoenzimei S și a exopolizaharidului mucoid (în cazul tulpinilor mucoide)(Chifiriuc și colab., 2011). Infecțiile produse de Pseudomonas aeruginosa se pot trata folosind combinații de antibiotice. Astfel, o variantă de tratament o reprezintă combinarea tobramicinei, care este un aminoglicozid cu piperacilina, care face parte din clasa penicilinelor (Brooks și colab., 2013). Tulpinile de Pseudomonas aeruginosa sunt sensibile la antibiotice din clasa fluorochinolonelor, a carbapenemelor (de exemplu, meropenem și imipenem), dar și a cefalosporinelor, cum ar fi ceftazidimul (Brooks și colab., 2013).

Klebsiella pneumoniae formează biofilme bacteriene la nivelul epiteliilor tracturilor urinare și respiratorii, dar și la nivelul cateterelor urinare și venoase (Wu și Li, 2015). Formarea biofilmelor bacteriene se realizează cu ajutorul capsulei, a fimbriilor de tip 1 și 3 și a LPS (Vuotto și colab., 2014). S-a constatat că Klebsiella pneumoniae are capacitatea de a forma biofilme cu diverse specii bacteriene, printre care Proteus mirabilis și Pseudomonas aeruginosa, aceste biofilme mixte având o rezistență extrem de mare la substanțele antimicrobiene și detergenți (Vuotto și colab., 2014). Există tulpini de Klebsiella pneumoniae care produc beta-lactamaze de spectru larg, ceea ce complică foarte mult tratamentul infecțiilor provocate de această bacterie (Murphy și Clegg, 2012). Printre antibioticele la care este rezistent biofilmul produs de Klebsiella pneumoniae se numără piperacilina, amikacina, gentamicina, ciprofloxacina, antibioticele beta-lactamice (Vuotto și colab., 2014;Wu și Li, 2015). Pentru tratarea infectiilor produse de Klebsiella pneumoniae se recomandă administrarea de tetraciclină sau ampicilină (Brooks și colab., 2013).

Proteus mirabilis formează biofilme bacteriene la nivelul epiteliului tractului urinar și la nivelul cateterelor urinare (Jacobsen și Shirtliff, 2011). După aderarea inițială la substrat, Proteus mirabilis produce o toxină numită urează care determina scăderea pH-ului și hidroliza ureei în amoniac și dioxid de carbon, fapt care conduce la acumularea de calculi care blocheaza ureterele și cateterele urinare (Baldo și Rocha, 2014; Gillespie și Bamford, 2012). Infecțiile produse de Proteus mirabilis sunt greu de tratat deoarece acestea au dezvoltat rezistență la antibioticele beta-lactamice, la gentamicină precum și la un dezinfectant numit clorhexidină (Chifiriuc și colab., 2011; Coker și colab., 2000). Cu toate acestea, în literatura de specialitate au fost identificate tulpini sensibile la penicilină (Brooks și colab., 2013). De asemenea, eficiente pentru tratarea infecțiilor produse de această bacterie sunt generația a II-a de cefalosporine (Chifiriuc și colab., 2011).

Escherichia coli formează biofilme bacteriene la nivelul tractului urinar, intestinal, precum și la nivelul dispozitivelor medicale, cum ar fi cateterul urinar (Sharma și colab., 2016). În acest proces sunt implicați mai mulți factori de virulență cum ar fi pilii sau fimbriile de tip 1, flagelii, antigenul K asociat capsulei polizaharidice, antigenul O, cele două antigene contribuind la interacția dintre mediul în care s-a format biofilmul și celulele bacteriene (Sharma și colab., 2016). Odată ajunsă la nivelul substratului (cateter urinar, epiteliu) cu ajutorul flagelilor, Escherichia coli se fixează ireversibil cu ajutorul fimbriilor de tip 1. Ulterior, are loc producerea matricei extracelulare care va conferi biofilmului rezistență la factorii de stress externi și interni, în același timp exprimându-se si gene care conferă rezistență biofilmului la acești factori (Sharma și colab., 2016). Răspândirea infecției se realizează drept urmare a desprinderii biofilmului de pe suprafața unde s-a format inițial și a migrării acestuia către alt situs care oferă condiții nutritive mai bune (Sharma și colab., 2016). Escherichia coli este rezistentă la mai multe tipuri de antibiotice după cum urmează: amplicilină, amoxicilină, cefuroximă, ceftiaxonă, acid clavulanic, cotrimoxazol (Sharma și colab., 2016, pag. 313). De asemenea, s-a constatat că tulpinile care au format biofilme sunt mai rezistente la acid nalidixic și cefotaxim (Sharma și colab., 2016). Infecțiile tractului urinar determinate de Escherichia coli pot fi tratate cu nitrofurantoin, iar cele nosocomiale asociate cu cateter urinar se tratează cu antibiotice din clasa carbapenemelor (Bean și colab., 2008).

Clostridium difficile, un agent nosocomial important, formează biofilme bacteriene în intestinul oamenilor și capata rezistență la antibiotice (Dapa și Unnikrishnan, 2013). La formarea biofilmului participă flageli, pili, proteine fiecare având rolul său bine stabilit. Flagelii, pe lângă faptul că ajută bacteria să se deplaseze și să invadeze țesuturile gazdei mai sunt implicați și în procese de aderare și colonizare (Awad și colab., 2014). Biofilmul format este protejat de o matrice (Vuotto și colab., 2018). La câteva zile după formarea biofilmului, coloniile de Clostridium difficile eliberează spori și cele două toxine (Vuotto și colab., 2018). Biofilmele produse de Clostridium difficile au o rezistență ridicată la metronidazol (Hargreaves și Clokie, 2014; Vuotto și colab., 2018). Clostridium difficile este sensibil la o serie de antibiotice cum ar fi amplicilina, cefalosporinele, fluorochinolonele, dar și clindamicina (Khan și colab., 2015).

Asemenea speciilor izolate din infecțiile nosocomiale menționate anterior, Enterococcus faecalis formează biofilme bacteriene la nivelul dispozitivelor medicale (Kristich și colab., 2004). Formarea biofilmului de către Enterococcus faecalis este un proces complex care implică proteinele de suprafață, citolizina, gelatinaza și hialuronidaza, precum și numeroase gene care se exprimă (Fisher și Phillips, 2009). Enterococii, în general și Enterococcus faecalis, în special, prezintă rezistență la vancomicină și la alte tipuri de antibiotice cum ar fi lincosamidele, cefalosporinele, sulfonamidele, monobactamii (Chifiriuc și colab., 2011). Infecțiile produse de Enterococcus faecalis se pot trata utilizând antibioticele din clasa aminoglicozidelor, respectiv gentamicină, kanamicină și streptomicină (Chifiriuc și colab., 2011). Stenotrophomonas maltophilia formează biofilme la nivelul unor substraturi diverse, inclusiv sticlă și materiale plastice, la o temperatură optimă de până la 37°C (Brooke, 2012).

Tulpinile acestei specii prezintă rezistență la majoritatea claselor de antibiotice cum ar fi cele beta-lactamice, tetraciclinelor, cefalosporinelor generația a III-a, quinolonelor, carbapenemilor și aminoglicozidelor (Looney și colab., 2009; Senol, 2004). Rezistența se datorează existenței pompelor de eflux și a unor enzime, precum și a producției de beta-lactamaze (Looney și colab., 2009). În ceea ce privește aspectele terapeutice, infecțiile produse de Stenotrophomonas maltophilia pot fi tratate utilizând acidul clavulanic în combinație cu ticarcilina, cloramfenicolul, trimetoprim în combinație cu sulfametoxazol, cefalosporinele de generație IV, precum și unele fluorochinolone cum ar fi clinafloxacina, sitafloxacina (Abbott și colab., 2011).

CAPITOLUL 2 – PARTEA PRACTICĂ. CARACTERIZAREA UNOR TULPINI BACTERIENE IMPLICATE ÎN INFECȚII NOSOCOMIALE: Acinetobacter sp. și Stenotrophomonas maltophilia

2.1. Scop și obiective

Frecvența infecțiilor dobândite în spitale, mai ales în secțiile de terapie intensivă, precum și dificultatea tratării acestora din cauza multirezistenței bacteriilor la antibiotice reprezintă o problemă majoră întâlnită la nivel mondial. Adesea, agenții patogeni implicați în infecțiile nosocomiale prezintă o serie de factori de virulență care ridică gradul de severitate al infecțiilor, iar împreună cu multirezistența la antibiotice îngreunează tratarea eficientă a acestora. Cele două specii bacteriene Gram-negative, Acinetobacter sp. și Stenotrophomonas maltophilia sunt cunoscute atât pentru frecvența cu care sunt izolate din infecțiile nosocomiale, dar și pentru rezistența acestora la cel puțin 3 clase de antibiotice diferite (multirezistență la antibiotice).

Scopul acestei lucrari a fost reprezentat de caracterizarea unor tulpini implicate frecvent in infectii nozocomiale, in vederea identificarii factorilor de virulenta ai acestora si a patternului de antibiorezistenta.

În vederea realizării acestui scop au fost urmate 3 obiective principale:

Studiul factorilor enzimatici de virulență a tulpinilor de Acinetobacter sp. și Stenotrophomonas maltophilia;

Determinarea gradului de aderență la substrat și a formării de biofilm a tulpinilor bacteriene analizate;

Testarea și determinarea spectrului de sensibilitate la antibiotice al tulpinilor analizate.

2.2. Materiale și metode

Materialul biologic a fost reprezentat de 16 tulpini bacteriene, dintre care 13 tulpini de Acinetobacter sp. și 3 tulpini de Stenotrophomonas maltophilia, care au fost izolate din diverse probe biologice. ………………………..O altă categorie de materiale este reprezentată de:

Instrumente de laborator și alte materiale: eprubete, ansă, pipete, vârfuri, tampoane sterile, placă pentru biofilm

Soluții, medii de cultură, antibiotice: apă fiziologică sterilă (AFS), soluție cristal violet 1%, acid acetic glacial 33%, metanol, mediu cu bullion, mediu geloză-sânge, mediu cu ADN și albastru de toluidină, mediu cu cazeină, mediu cu lipide, mediu cu esculină, mediu Muller-Hinton

Aparatură: termostat, spectrofotometru, hotă, bec de gaz.

Metodele de lucru au fost grupate în 3 categorii, după cum urmează:

1. Evidențierea expresiei fenotipice a factorilor enzimatici solubili implicați în virulența tulpinilor bacteriene

Această metodă presupune realizarea unor teste biochimice cantitative, pentru a evidenția producerea de enzime care conferă virulență tulpinilor bacteriene: hemolizine, DN-ază, cazeinază, lipază, si enzime implicate in hidroliza esculinei.

Producerea de hemolizine

Evidențierea producerii de hemolizine presupune însămânțarea tulpinilor bacteriene pe geloză cu adaos de 5% sânge de oaie și incubarea acestora la 37o C. După 24 de ore se constată că tulpinile producătoare de hemolizine vor forma un halou în jurul culturii, ceea ce evidențiază producerea hemolizei.

Producerea de DN-ază

DN-azele produse de tulpinile bacteriene se evidențiază prin formarea unui halou roz în jurul culturii bacteriene, care a fost însămânțată în prealabil pe mediu de cultură cu ADN și albastru de toluidină. DN-azele bacteriene acționează asupra DNA bacterian eliberând mono- sau dinucleotidele.

Producerea de cazeinază

Tulpinile care produc cazeinaza se evidențiază pe mediu de cultură cu 15% adaos de lapte; după ce au fost însămânțate și lăsate la incubat 24 de ore, la 37o C, reacția pozitivă pentru acest factor de virulență s-a evidențiat fie prin formarea unui halou transparent în jurul culturii bacteriene, fie prin formarea unei zone de precipitare datorită formării paracazeinatului de calciu.

Producerea de lipază

Tulpinile bacteriene au fost însămânțate în spot pe agar cu adaos de 1% Tween 80 (monooleat de sorbitol) și incubate 72 de ore la 37oC. Prezența unei zone opace de precipitare în jurul spotului de cultură, dată de formarea cristalelor de oleat de Ca insolubile (cristale formate între acizii grași eliberați și Ca2+), a fost considerată o reacție pozitivă.

Hidroliza esculinei

Esculina este hidrolizată la glucoză și esculetol. În prezența citratului de Fe (FeC6H5O7) (Fe3+) din mediu, esculetolul eliberat sub acțiunea unei beta-galactozidaze generează formarea unui precipitat negru de esculetină ferică, compus de Fe fenolic cu structură chimică incertă. Tulpinile au fost însămânțate în spot pe mediu cu adaos de 1% esculină și cu citrat de fier. După incubare la 37oC timp de 72 de ore, în urma hidrolizei esculinei, se formează esculetolul care combinându-se cu sărurile de fier din mediu (citrat feric amoniacal 1%) determină înnegrirea mediului.

2. Evidențierea aderenței la substrat inert a tulpinilor bacteriene și formarea de biofilm

În 16 eprubete pe care s-au notat codurile tulpinilor se prepară suspensii 0,5 McFarland, utilizând AFS și cultură bacteriană de Acinetobacter sp. și Stenotrophomonas maltophilia de 18-24 de ore. În 32 de godeuri ale plăcii în care se realizează aderența la substrat (16 godeuri pentru aderența la 24 de ore, 16 godeuri dupa aderența la 48 de ore) se distribuie o cantitate de 180 l de mediu lichid, peste care se adaugă 20 l de suspensie bacteriană proaspăt obținută (Fig. 10). După 24h de incubare la 37°C, lichidul din godeuri a fost indepartat si placa fost spalata de 2 ori cu AFS. In biofilmul de 24 h, s-a adaugt 200 l de metanol rece timp de 5 minute pentru fixarea bacteriilor aderate. Ulterior, s-a realizat colorarea cu cristal violet 1% timp de 15 minute, apoi spălarea cu apă de robinet și resuspendarea cu acid acetic glacial 33%. Pentru biofilmul de 48 ore, dupa spalare s-a adaugat 200µl mediu proaspat si placa a fost incubata inca 24h. La expirarea timpului, s-a procedat conform etapei descrise anterior. Capacitatea tulpinilor de a adera la substrat s-a evidențiat prin citirea absorbanței la 492 nm (Chifiriuc și colab., 2011).

Testarea sensibilității la antibiotice prin metoda Kirby-Bauer (disc-difuzimetrică)

Spectrul de sensibilitate la antibiotice a tulpinilor analizate s-a efectuat utilizând metoda Kirby-Bauer, disc-difuzimetrică, respectând recomandările standardului Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), ediția 2017. Inoculul, reprezentat de suspensie bacteriană realizată în apă fiziologică sterilă, cu o densitate de 0.5 McFarland = 1.5×108 UFC/mL, a fost însămânțat pe mediu Muller-Hinton. Însămânțarea”în pânză” s-a realizat utilizând tampoane de vată sterile. Discurile impregnate cu antibiotic au fost distribuite, cu ajutorul unei pense sterile, la o distanță de cel puțin 30 mm între centrele a două discuri vecine și la 15 mm de marginea plăcii. După dispunere, discul a fost presat ușor cu pensa pentru a face contact intim cu suprafața mediului. Plăcile au fost incubate cu capacul în jos, la 37C, timp de 16-18 ore. Citirea rezultatelor s-a realizat prin măsurarea diametrelor zonelor de inhibiție generate de diferite antibiotice, cu ajutorul unei rigle gradate. Interpretarea rezultatelor a fost realizată în funcție de dimensiunea zonelor de inhibiție, exprimând rezultatul cu termenii de sensibil (S), rezistent (R) sau intermediar (I), conform tabelelor cu puncte critice standardizate și corespunzătoare metodei de lucru. Termenii S, I, R definesc de fapt categoriile clinice de antibiotice, după cum urmează:

categoria S, înseamnă că există o mare probabilitate ca antibioticul respectiv, administrat în doze obișnuite, să elimine infecția (C.M.I. are valori net inferioare celor ale concentrațiilor umorale obținute în urma administrării unei doze obișnuite);

categoria I, înseamnă că există probabilitatea ca antibioticul respectiv să fie eficient in vivo prin administrare locală sau prin realizarea de concentrații active mari la nivelul unor organe sau țesuturi (rinichi, ficat, căi biliare) la nivelul cărora a apărut procesul infecțios;

categoria R înseamnă că, cel mai probabil, administrarea antibioticului respectiv nu va determină eliminarea agentului infecțios din organism (Lazăr și colab., 2004).

Antibioticele utilizatein acest studiu pentru testarea sensibilității se împart în 3 mari categorii (Chifiriuc și colab., 2011):

Antibiotice beta-lactamice:

peniciline: ampicilină (SAM 20), piperacilină (PIP, PIR 100), piperacilină-tazobactam (TZP 110)

cefalosporine:

generația a III-a: cefotaxim (CTX 30), ceftazidim (CAZ 30)

generația a IV-a: cefepim (FEP 30)

carbapenemi: imipenem (IPM), meropenem (MEM 10)

Aminoglicozide: gentamicină (CN 120), amikacină (AK 30)

Tetracicline: tetraciclină (TE 10)

De asemenea, pe lângă aceste antibiotice s-a mai testat sensibilitatea la trimetoprim-sulfametoxazol (STX), antagonist al acidului folic.

2.3. Rezultate și discuții

Studiul a fost realizat pe 16 tulpini bacteriene de Acinetobacter sp. și Stenotrophomonas maltophilia, izolate din surse diverse, fiecare tulpină prezentând un cod caracteristic ce este specificat în tabelul 2. Din totalul tulpinilor izolate, 35% dintre acestea provin din secreție traheo-bronșică, 18% din urină, 17% de la nivelul plăgii, 12% din secreția nazală și 18% de la nivelul cateterelor.

2.3.1. Expresia factorilor de virulență la tulpinile analizate

Analizând figura 11 și tabelul nr. 3, s-a constatat că lipaza este factorul de virulență cel mai frecvent exprimat (68.75%),. Producerea de lipaze este dependentă de sursa din care provin tulpinile, astfel că, toate tulpinile izolate din secrețiile traheo-bronșice și din urină produc lipaze., in timp ce tulpinile izolate de la nivelul cateterelor.

Cazeinaza se exprimă în proporție de 31.25%, fiind secretată atât de unele tulpinile de Acinetobacter sp., cât și de Stenotrophomonas maltophilia. Se constată că tulpinile de Acinetobacter sp. și Stenotrophomonas maltophilia izolate din secreția nazală nu au capacitatea de a sintetiza cazeinaze. Producerea de lipaze și cazeinaze de către tulpinile de Stenotrophomonas maltophilia a fost observata și de către Looney și colab. (Looney și colab., 2009). Conform figurii 11, se observă că 25% dintre tulpinile analizate produc hemolizine, DNaze și esculinaze. În ceea ce privește hidroliza esculinei și producerea de hemolizine, se constată că profilul secretor diferă în funcție de sursa izolării. Astfel, tulpinile bacteriene izolate din secreția nazală și cea a plăgii nu produc hemolizine, pe când tulpinile izolate din urină și de la nivelul cateterelor nu hidrolizează esculina. În literatura de specialitate existe date conform cărora tulpinile Acinetobacter sp. izolate din secreție traheo-bronșică, sânge și urină produc lipaze și hemolizine (Tektook, 2018). Cu toate acestea, Constantiniu și colab. au identificat tulpini de Acinetobacter sp. care nu hidrolizează esculina.

În ceea ce privește tulpinile de Stenotrophomonas maltophilia, datele prezente în literatura de specialitate (Abbott și colab., 2011; Denton și Kerr, 1998; Senol, 2004) se confirmă din punct de vedere al reacției pozitive a hidrolizei esculinei, a producerii de lipază și de DNaze. De asemenea, în urma unui studiu efectuat asupra tulpinilor de Stenotrophomonas maltophilia, Brooke confirmă că acestea produc DNaze și hidrolizează esculina (Brooke, 2012). Diferența dintre rezultatul acestui studiu și literatura de specialitate este reprezentată de producerea de hemolizine. Astfel, Abbott și colab. susțin că tulpinile de Stenotrophomonas maltophilia produc hemolizine, însă tulpinile de Stenotrophomonas maltophilia din acest studiu nu au produs acești factori de virulență (Abbott și colab., 2011). Dintre tulpinile analizate, tulpinile de Acinetobacter sp. 2603 și 20584 nu exprimă niciun factor de virulență.

De adaugat

2.3.2. Aderența la substrat și formarea de biofilm al tulpinilor analizate

Aderarea celulelor bacteriene la substrat reprezintă o etapă importantă în formarea biofilmelor bacteriene. Observând figura 13, se constată că toate tulpinile bacteriene, indiferent de proba din care au fost izolate, au aderat la substrat și au avut capacitatea dea a forma biofilm. După 48 de ore se observă un grad mai crescut de aderenta in cazul tuturor tulpinilor analizate.

…………………………………………..

Rezultatele acestui studiu au fosst observate și de către alți autori, atât in cazul tulpinilor de Acinetobacter sp. cât și a elor de Stenotrophomonas maltophilia. Într-un studiu realizat de Kaur și colab. asupra unor tulpini de Acinetobacter, 50% dintre acestea au produs biofilme (Kaur și colab., 2017). Un alt studiu pe tulpini de Acinetobacter sp. izolate din probe clinice a demonstrat că intre 84-100% dintre tulpinile izolate din hemocultura și secreție traheo-bronșică au produs biofilme (Nahar și colab., 2012). Brooke confirmă formarea biofilmelor bacteriene si de către Stenotrophomonas maltophilia (Brooke, 2012).

2.3.3. Profilul de antibiorezistență al tulpinilor analizate

Dupa identificarea factorilor de virulența ai tulpinilor bacteriene, studiul a urmarit determinarea profilului de antibiorezistență. Rezultatele antibiogramei sunt prezentate în tabelul nr. 4 și figura nr. 14, unde se observă că 73.33% dintre tulpinile bacteriene analizate sunt rezistente la cel puțin 3 clase de antibiotice, deci sunt tulpini multirezistente la antibiotice.

Tulpinile analizate, atât cele de Acinetobacter sp. cât și cele de Stenotrophomonas maltophilia s-au dovedit a avea rate crescute de rezistenta la antibioticele beta-lactamice de tipul carbapenemilor (meropenem, 93,33%), cefalosporinelor de generație III (cefotaxim- 73,33%, ceftazidim- 80%) și generație IV (cefepim- 86,67%), și penicilinelor (piperacilină, 73,33%), cu excepția ampicilinei (20%). De asemenea, tulpinile prezintă rezistență ridicată și la tetraciclină (73,33%) și trimetoprim-sulfmetoxazol (73,33%).

Rezistența la cefalosporinele de generație III, atât a tulpinilor de Acinetobacter, cât și a celor de Stenotrophomonas maltophilia, au fost confirmate și de alți cercetători. Astfel, realizând un studiu asupra tulpinilor de Acinetobacter din sânge și spută, Nahar și colab. au ajuns la concluzia că toate tulpinile analizate au fost rezistente la ceftazidim și cefotaxim. Cu toate acestea, Nahar și colab. au constatat o rezistență mare și gentamicină, care în cazul de față este infirmată (Nahar și colab., 2012). Spre deosebire de Constantiniu și colab., care au obținut un procent de 66,3% de sensibilitate la gentamicină a tulpinilor de Acinetobacter, Tektook a constatat că 79,5% dintre tulpinile analizate sunt rezistente la gentamicină, iar Lone și colab. au confirmat rezistența mare a tulpinilor la gentamicină și cefotaxim (Lone și colab., 2009).

Rezistența tulpinilor de Acinetobacter sp. la cefalosporinele de generație III este confirmată de către Constantiniu și colab., dar și de către Tektook (Constantiniu și colab., 2004; Tektook, 2018). Tulpinile de Stenotrophomonas maltophilia analizate s-au dovedit a fi rezistente la cefalosporinele de generație III și tetracicline, fapt confirmat și de către Looney și colab., și Senol (Looney și colab., 2008; Senol, 2004). De asemenea, sensibilitatea acestor tulpini la trimetoprim-sulfmetoxazol este confirmată și de către Looney și colab. și Senol. Atât Tektook, cât și Constantiniu au confirmat o rată ridicată de sensibilitate la imipenem, care se constată și în cadrul acestui studiu. Spre deosebire de Tektook, care a sesizat o rezistență scăzută la piperacilină, Gupta și colab. au obținut un procent ridicat de rezistență a tulpinilor la acest antibiotic. Tulpinile din cadrul prezentului studiu s-au dovedit a avea un grad foarte ridicat de rezistență la piperacilină.

2.4. CONCLUZII

În prezenta lucrare s-au analizat 16 tulpini bacteriene de Acinetobacter sp. și Stenotrophomonas maltophilia provenind din diverse surse clinice. În urma studiului s-au observat următoarele:

Cu excepția a două tulpini de Acinetobacter sp., celelalte tulpini analizate au sintetizat factori de virulență enzimatici, în special lipaze………………………. Secreția factorilor enzimatici a fost independentă de sursa de proveniență a tulpinilor.

Toate tulpinile analizate au aderat la substratul inert, avand capacitatea de a forma biofilm, indiferent de sursa de izolare.

Tulpinile analizate au prezentat rate crescute de rezistenta la antibioticele testate, inclusiv la cefalosporine de ultima generatie. Mai mult, 73,3% dintre tulpinile bacteriene analizate au fost rezistente la cel puțin 3 antibiotice din clase de diferite (tulpini multirezistente), consecinta a presiunii selective exercitate de administrarea antibioticelor, tulpinile fiind izolate de la pacienti spitalizati.

Cunoașterea capacității de aderență, a factorilor de virulență exprimați și a profilului de antibiorezistență al diferitelor specii bacteriene permite o mai bună înțelegere a microorganismelor și a interacției dintre acesta și gazdă, ceea ce face posibilă alegerea unor modalități optime de tratament pentru combaterea infecțiilor produse de microorganisme.

Bibliografie

Abbott I. J., Slavin M. A., Turnidge J. D., Thursky K.A., Worth L. J., 2011. Stenotrophomonas maltophilia: emerging disease patterns and challenges for treatment. Expert Rev. Anti Infect. Ther. Vol. 9. Pag. 472, 474, 478, 480

Anaissie J. E., Penzak R. S., Dignani C., 2002. The Hospital Water Supply as a Source of Nosocomial Infections. Arch intern med. Vol. 162. Pag. 1483, 1484, 1488

Archer K. N., Mazaitis J. M., Costerton W., Leid G. J., Powers E. M., Shirtliff M., 2011. Staphylococcus aureus biofilms. Properties, regulation and roles in human disease. Landes Bioscience. Vol. 2. Pag. 446

Awad M.M., Johansen A.P., Carter G.P., Rose E., Lyras D., 2014. Clostridium difficile virulence factors: Insights into an anaerobic spore-forming pathogen. Gut Microbes. Vol. 5. Pag. 583, 587, 588

Baldo C., Rocha S.P.D., 2014. Virulence Factors Of Uropathogenic Proteus mirabilis – A Mini Review. IJSTR. Vol. 3. Pag. 24, 25

Bean D.C., Krahe D., Wareham D.W., 2008. Antimicrobial resistance in community and nosocomial Escherichia coli urinary tract isolates, London 2005-2006. Ann Clin Microbiol Antimicrob. Vol. 7. Pag. 3

Bearman M.L. G., Munro C., Sessler N. C., Wenzel P. R., 2006. Infection Control and the Prevention of Nosocomial Infections in the Intensive Care Unit. Semin respir crit care med. Vol. 27. Pag. 313

Brooke J.S., 2012. Stenotrophomonas maltophilia: an Emerging Global Opportunistic Pathogen. Clin Microbiol. Vol. 25. Pag. 4, 13, 14

Brooks G. F., Carroll K. C., Butel J. S., Morse S. A., Mietzner T. A., 2013. Medical Microbiology. McGraw Hill. Ediția26. Pag. 199, 201, 205, 235, 246, 247, 248, 253

Chang J.S., Flynn H.W.J., Miller D., Smiddy W.E., 2013. Stenotrophomonas maltophilia endophthalmitis following cataract surgery: clinical and microbiological results. Clinical Ophthalmology. Vol. 7. Pag. 771, 773

Chifiriuc C., Mihăescu G., Lazăr V., 2011. Microbiologie și virologie medicală. Edit. Universității din București. Pag. 101, 102, 147, 148, 149, 150, 153, 154, 156, 189, 191, 194-198, 220, 221, 222, 228, 229, 260

Coker C., Poore A.C., Li X., Mobley H.L.T., 2000. Pathogenesis of Proteus mirabilis urinary tract infection. Microbes and Infection. Vol. 2. Pag. 1500, 1501, 1502, 1503

Constantiniu S., Romaniuc A., Iancu L.S., Filimon R., Tarași I., 2004. Cultural and biochemical characteristics of Acinetobacter ssp. Strains isolated from hospital units. The Journal of Preventive Medicine. Vol. 12. Pag. 38, 40

Costa A.R., Batistão D. W. F., Ribas R. M., Sousa A. M., Pereira M. O., Botelho C. M., 2013. Staphylococcus aureus virulence factors and disease. Pag. 703

Dalhoff K., Ewig S., 2013. Adult Patients With Nosocomial Pneumonia. Dtsch Arztebl Int. Vol. 110. Pag. 635-636

Dapa T., Unnikrishnan M., 2013. Biofilm formation by Clostridium difficile. Gut Microbes. Vol. 4. Pag. 397

Denton M., Kerr K. G., 1998. Microbiological and Clinical Aspects of Infection Associated with Stenotrophomonas maltophilia. Clin. Microbiol. Rev. Vol. 11. Pag. 59

Donlan M. R., Costerton W. J., 2002. Biofilms: Survival Mechanism of Clinically Relevant Microorganisms. Clin. Microbiol. Rev. Vol. 15. Pag. 168, 172

Dorobăț O.M., 2006. Bacteriologie medicală. Edit. Universității ”Titu Maiorescu”. Pag. 177, 263, 274, 275, 280-281, 318

Emödy L., Kerényi M., Nagy G., 2003. Virulence factors of uropathogenic Escherichia coli. IJAA. Vol. 22. Pag. 31

Essien-Baidoo S., Agyei A. B., Benjamin H. A., Mensah B. B. L., Afrifa J., 2018. Nosocomial infections are still a major concern in periurban polyclinics in Ghana. African Journal of Microbiology Research. Vol. 12. Pag. 86

Fang Y., Quan J., Xiaoting H., Feng Y., Li X., Wang J., Ruan Z., Shang S., Yu Y., 2015. Complete genome sequence of Acinetobacter baumannii XH386 (ST208), a multidrug resistant bacteria isolated from pediatric hospital in China. Genomics data. Pag. 20

Fisher K., Phillips C., 2009. The ecology, epidemiology and virulence of Enterococcus. Microbiology. Vol. 155. Pag. 1754

Garner S. J., Jarvis R. W., Emori G. T., Horan C. T., Hughes M. J., 1988. CDC definitions for nosocomial infections. American Journal of Infection Control. Vol. 16. Pag. 130, 131, 137

Ghanpur D. A., Nayak R. D., Chawla K., Shashidhar V., Singh R., 2017. Comparison of Microbiological Flora in The External Audito Canal of Normal Ear and an Ear with Acute Otitis Externa. JCDR. Vol. 11. Pag. 2

Gillespie H. S., Bamford B. K., 2012. Medical Microbiology and Infection at a Glance. Wiley-Blackwell. Pag. 21, 33, 55, 58

Gordon J.R., Lowy D. F., 2008. Pathogenesis of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Infection. CID. Vol. 46. Pag. 351, 356

Gordon N. C., Wareham D. W., 2010. Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii: mechanism of virulence and resistance. International Journal of Antimicrobial Agents. Vol. 35. Pag. 221

Gupta N., Gandham N., Jadhav S., Mishra R.N., 2015. Isolation and identification of Acinetobacter species with special reference to antibiotic resistance. Journal of Natural Science, Biology and Medicine. Vol. 6. Pag. 160, 161.

Hargreaves K.R., Clokie M.R.J., 2014. Clostridium difficile phages: still difficult? Frontiers in Microbiology. Vol. 5. Pag. 2

Jacobsen M.S., Shirtliff E.M., 2011. Proteus mirabilis biofilms and catheter-associated urinary tract infections. Landes Bioscience. Vol. 2. Pag. 406, 460, 461

Jacobsen M.S., Stickler D.J., Mobley H.L.T., Shirtliff M.E., 2008. Complicated Catheter-Associated Urinary Tract Infections Due to Escherichia coli and Proteus mirabilis. CMR. Vol. 21. Pag. 35

Karabay O., Koçoglu E., Tahtaci M., 2007. The role of mobile phones in the spread of bacteria associated with nosocomial infections. J Infect Developing Countries. Vol. 1. Pag.

Kaur K., Gill K. A., Gill K. P., Heyar K. A., 2017. Antibiotic resistance and biofilm formation among nosocomial pathogens in a tertiary care hospital. JEMDS. Vol. 6. Pag. 5835, 5837, 5838

Kayser F.H., Bienz K.A., Eckert J., Zinkernagel R.M., 2005. Medical Microbiology. Thieme. Pag. 292, 295

Khan H. A., Ahmad A., Mehboob R., 2015. Nosocomial infections and their control strategies. Asian Pac J Trop Biomed. Vol. 5. Pag. 506, 510, 511

Khan A. H., Baig K. F., Mehboob R., 2016. Nosocomial infections: epidemiology, prevention, control and surveillance. Asian Pac J Trop Biomed. Pag. 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10. 11

Khazaei S., Khazaei S., Ayubi E., 2018. Importance of Prevention and Control of Nosocomial Infecions in Iran. Iran J Public Health. Vol. 47. Pag. 307

Koraichi El S., Arfaoui A., Kafsaui S., Janah H., Sbayi A., Mrabet M., Siah S., Quyou A., 2017. Analysis of Risk Factors Related to Severity and Mortality Due to Nosocomial Infections in Burn Patients of the Military Hospital Mohamed V, Rabat, Morocco. Annual Research & Review in Biology. Vol. 20. Pag. 2, 5

Kristich C. J., Li Y-H., Cvitkovitch D. G., Dunny G. M., 2004. Esp-Independent Biofilm Formation by Enterococcus faecalis. Journal of Bacteriology. Vol. 186. Pag. 154, 155

Langley M.J., LeBlanc J., Hanakowski M., Goloubeva O., 2002. The Role of Clostridium difficile and Viruses as Causes of Nosocomial Diarrhea in Children. SHEA. Vol. 23. Pag. 662

Lazăr V., Chifiriuc M.C., 2010. Architecture and physiology of microbial biofilms. RAMI. Vol. 69. Pag. 96

Lazăr V., Herlea V., Cernat R., Balotescu M.C., Bulai D., Moraru A., 2004. Microbiologie generală-Manual de lucrări practice. Edit. Universității din București

Lee C-R., Lee J-H., Park M., Park K. S., Bae I. K., Kim Y. B., Cha C-J., Jeong B C., Lee S. H., 2017. Biology of Acinetobacter baumannii: Pathogenesis, Antibiotic Resistance Mechanisms, and Prospective Treatment Options. Front. Cell. Infect. Microbiol. Vol. 7. Pag. 3

Looney W. J., Narita M., Muhlemann K., 2009. Stenotrophomonas maltophilia: an emerging opportunist human pathogen. Lancet Infect Dis. Vol. 9. Pag. 312, 313, 314, 315

Lone R., Shah A., SM K., Lone S., Faisal S., 2009. Nosocomial Multi-Drug Resistant Acinetobacter Infections- Clinical Findings, Risk Factors and Demographic Characteristics. Bangladesh J Med Microbiol. Vol. 3. Pag. 35, 37

Munoz-Price L.S., Weinstein R.A., 2008. Acinetobacter Infection. N Engl J Med. Vol. 358. Pag. 1276, 1277

Murphy N.C., Clegg S., 2012. Klebsiella pneumoniae and type 3 fimbriae: nosocomial infection, regulation and biofilm formation. Future Microbiol. Vol. 7. Pag. 991, 992

Nahar A., Anwar S., Saleh A.A., Miah M. R. A., 2012. Virulence factors and antibiotic susceptibility pattern of Acinetobacter species in a tertiary care hospital in Bangladesh. Ibrahim Med. Coll. J. Vol. 6. Pag. 27

Nyc O., Matejkova J., 2010. Stenotrophomonas maltophilia: Significant Contemporary Hospital Pathogen-review. Folia Microbiol. Vol. 55. Pag. 287

Ochoa A. S., Lopez-Montiel F., Escalona G., Cruz-Cordova A., Davila B. L., Lopez-Martinez B., Jimenez-Tapia Y., Giono S., Eslava C., Hernandez-Castro R., Xicohtencatl-Cortes J., 2013. Pathogenic characteristics of Pseudomonas aeruginosa strains resistant to carbapenems associated with biofilm formation. Bol Med Hosp Infant Mex. Vol 70. Pag. 134

Owens C.D., Stoessel K., 2008. Surgical site infections: epidemiology, microbiology and prevention. Journal of Hospital Infection. Vol. 70. Pag. 3

Peleg A. Y., Seifert H., Paterson D. L., 2008. Acinetobacter baumanii: Emergence of a Successful Pathogen. Clinical Microbiology reviews. Vol. 21. Pag. 540, 542

Perez F., Hujer A.M., Hujer M.K., Brooke K.D., Rather N.P., Bonomo R.A., 2007. Global Challenge of Multidrug-Resistant Acinetobacter baumannii. Antimicrob. Agents Chemother. Vol. 51. Pag. 3475, 3476

Podschun R., Ullmann U., 1998. Klebsiella ssp. As Nosocomial Pathogens: Epidemiology, Taxonomy, Typing Methods, and Pathogenicity Factors. Clin. Microbiol. Rev. Vol. 11. Pag. 593, 594, 599

Poirel L., Nordmann P., 2006. Carbapenem reistance in Acinetobacter baumannii: mechanisms and epidemiology. Clin Microbiol Infect. Vol. 12. Pag. 826

Polec A., Walaszek M., Gniadek A., Kolpa M., Wolak Z., Dobros W., 2017. Assessment of the occurrence of nosocomial infections in the intensive care unit in the St. Lukas district hospital in Tarnow in 2012-2016. Przegl epidemiol. Vol. 71. Pag. 520, 527

Poxton I. R., McCoubrey J., Blair G., 2001. The pathogenicity of Clostridium difficile. Clinical Microbiology and Infectious Diseases. Vol. 7. Pag. 421, 422

Prisacari V., Zueva L., Bucov V., Cazacov V., 2008. Ghid de supraveghere și control în infecțiile nosocomiale.Pag. 58

Rafique K., Shoaib M. R., Haq E. M, Mahmood S., Khalid A. M., Shahid S., 2017. Nosocomial Infections and its Prevention. PJMHS. Vol. 11. Pag. 850, 853

Rath S., Padhy R. N., 2014. Monitoring in vitro antibacterial efficacy of 26 Indian species against multidrug resistant urinary tract infecting bacteria. Integr Med Res. Vol. 3. Pag. 134

Reena A.A.A., Subramaniyan A., Kanungo R., 2017. Biofilm formation as a virulence factor of Acinetobacter baumannii: An emerging pathogen in critical care units. Journal of Current Research in Scientific Medicine. Vol. 3. Pag. 17, 75

Richards M., Edwards R. J., Culver H. D., Gaynes R. R., 2000. Nosocomial infections in combined medical-surgical intensive care units in the United States. Infection Control and Hospital Epidemiology. Vol. 21. Pag. 511, 512

Rosenthal V.D., Maki D. G., Salomao R., Alvarez-Moreno C., Mehta Y., Higuera F., Cuellar L. E., Arikan O. A., Abouqal R., Leblebicioglu H., 2006. Device-Associated Nosocomial Infections in 55 Intensive Care Units of 8 Developing Countries. Ann Intern Med. Vol. 145. Pag. 585

Rupnik M., Wilcox M. H., Gerding D. N., 2009. Clostridium difficile infection: new developments in epidemiology and pathigenesis. Nature Reviews. Vol. 7. Pag. 532

Sang Y., Guo M., Huang J., 2017. Analysis on distribution of pathogenic bacteria and risk factors for nosocomial infection in patients in department of urology. Biomed Res. Vol. 28. Pag. 9154

Schaffer N.J., Pearson M.M., 2015. Proteus mirabilis and Urinary Tract Infections. Microbiol Spectr. Vol. 3. Pag. 2, 6

Scharma G., Sharma S., Sharma P., Chandola D., Dang S., Gupta S., Gabrani R., 2016. Escherichia coli biofilm: development and therapeutic strategies. Pag. 309

Sharma K. S., Mudgal K. N., Sharma P., Shrngi N.B., 2015. Comparison of Phenotypic Characteristics and Virulence Traits of Klebsiella pneumoniae Obtained from Pneumonic and Healthy Camels (Camelus dromedarius). Advances in Animal and Veterinary Sciences. Vol. 3. Pag. 118, 309, 310, 311, 312, 313

Senol E., 2004. Stenotrophomonas maltophilia: the significance and role as a nosocomial pathogen. Journal of Hospital Infection. Vol. 57. Pag. 2, 5

Sethy R., Rout K. P., 2017. Clinical and Microbiological Profile of Nosocomial Infections in the Patients Admitted to Intensive Care Unit of a Tertiary Care Hospital. AIMDR. Vol. 4. Pag. 6

Stamm E. W., 1991, Catheter-Associated Urinary Tract Infections: Epidemiology, Pathogenesis, and Prevention. The American Journal of Medicine. Vol. 91. Pag. 65, 67

Tadesse A., Alem M., 2006. Medical Bacteriology. Ephti. Pag. 253

Taylor K.P., Yeung A.T.Y., Hancock E.W.R., 2014. Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms: Towards the development of novel anti-biofilm therapies. J. Biotechnol. Pag. 2

Tektook N. K., 2018. Study the virulence factors and patterns of antibiotics resistance in Acinetobacter baumannii isolated from hospitalized patients in Baghdad city. Pak. J. Biotechnol. Vol. 15. Pag. 21, 22

Tong C. Y. S., Davis S. J., Eichenberger E., Holland L. T., Fowler G. V. 2015. Staphylococcus aureus Infections: Epidemiology, Pathophysiology, Clinical Manifestations, and Management. CMR. Vol. 28. Pag. 627, 630, 635

Tremblay Y.D.N., Hathroubi S., Jacques M., 2014. Les biofilms bactériens: leur importance en santé animale et an santé publique. CVMA. Vol. 78. Pag. 111, 112

Urban C., Segal-Maurer S., Rahal J.J., 2003. Consideration in Control and Treatment of Nosocomial Infections Due to Multidrug-Resistant Acinetobacter baumannii. CID. Vol. 36. Pag. 1269

Vedantam G., Clark A., Chu M., McQuade R., Mallozzi M., Viswanathan V. K., 2012. Clostridium difficile infection. Gut Microbes. Vol. 3. Pag. 127

Verma U., Kulshreshtha S., Khatri P.K., 2018. MDR Pseudomonas aeruginosa in Nosocomial Infection: Burden in ICU and Burn Units of a Tertiary Care Hospital. Int. J. Curr. Microbiol. App. Sci. Vol. 7. Pag. 1267

Vincent J-L., 2003. Nosocomial infections in adult intensive-care units. The Lancet. Vol. 361. Pag. 2069, 2069, 2072

Vuotto C., Donelli G., Buckley A., Chilton C., 2018. Clostridium difficile biofilm. Springer International Publishing AG. Pag. 100, 110, 744, 749, 750

Vuotto C., Longo F., Balice P.M., Donelli G., Varaldo E.P., 2014. Antibiotic Resistance Related to Biofilm Formation in Klebsiella pneumoniae. MDPI. Vol. 3. Pag. 744, 748

Wieland K., Chhatwal P., Vonberg R-P, 2017. Nosocomial outbreaks caused by Acinetobacter baumanii and Pseudomonas aeruginosa: Results of a systematic review. AJIC. Pag. 4

Wu M., Li X., 2015. Klebsiella pneumoniae and Pseudomonas aeruginosa. Molecular Medical Microbiology. Pag. 1547, 1554, 1557

Yang J.J., Nam Y.S., Kim M.J., Cho S.Y., You E., Soh Y.S., Lee H.J., 2013. Evaluation of a Chromogenic Culture Medium of the Detection of Clostridium difficile. Yonsei Med J. Vol. 55. Pag. 995, 996

http://www.bacteriainphotos.com/bacteria%20under%20microscope/enterococcus%20faecalis%20microscopy.html#

Standard de referință pentru efectuarea antibiogramei “Clinical and Laboratory Standards Institute” (CLSI), 2017