Lector Doctor Pojoga Daniela Maria Absolvent Băndică Evelina – Alexandra București 2019 UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI FACULTATEA DE BIOLOGIE EFECTUL… [305291]

UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI

FACULTATEA DE BIOLOGIE

LUCRARE DE DISERTAȚIE

Coordonator științific

Lector Doctor Pojoga Daniela Maria

Absolvent: [anonimizat]

2019

UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI

FACULTATEA DE BIOLOGIE

EFECTUL TRATAMENTULUI CU CITOSTATICE ASUPRA MATERIALULUI GENETIC UMAN: INVESTIGAȚII DE CITOGENETICĂ CLASICĂ ȘI MOLECULARĂ

Coordonator științific

Lector Doctor Pojoga Daniela Maria

Absolvent: [anonimizat]

2019

[anonimizat], există mai multe strategii administrarea citostaticelor. [anonimizat] a prelungi viața.

Astfel, a [anonimizat], precum și identificarea mecanismelor celulare și moleculare prin care organismele răspund la acțiunea acestor factori chimici.

[anonimizat]. [anonimizat].

[anonimizat], însă efectul lor asupra acestora este mai puțin studiat. [anonimizat]. Pierderea până la un anumit nivel, a [anonimizat]. [anonimizat], telomerele mai scurte acționând ca un ceas mitotic.

[anonimizat]. [anonimizat], fiind activă în timpul dezvoltării și reactivată în procesul de neoplazie. [anonimizat] a telomerelor.

[anonimizat]. [anonimizat], cum ar fi: [anonimizat]-FISH, [anonimizat], PRINS etc.

Alegerea temei acestei lucrări de disertație a [anonimizat], dar și de la cantitatea redusă de informații referitoare la acest subiect în literatura de specialitate. Primul pas în elaborarea studiului a fost reprezentat de stabilirea cu precizie a [anonimizat] s-a organizat, ulterior, programul de cercetare.

Scopul tezei de disertație este determinarea efectului tratamentului cu citostatice asupra materialului genetic uman prin investigații citogenetice clasice și moleculare.

Obiective generale:

Lucrarea a fost redactată în 6 capitole. În partea teoretică (primele 3 capitole) sunt prezentate informații cu privire laipurile de citostatice ca agenți chimioterapici anticanceroși, cu accent pe doxorubicină ca citostatic ce a fost utilizat în realizarea etapelor experimentele; sunt evidențiate rolul și structura telomerelor și telomerazei și sunt enunțate și caracterizate pe scurt principalele tehnici ce pot fi utilizate pentru studiul efectelor citostaticelor

Partea de rezultate personale prezintă materialele și metodele utilizate precum

Lucrarea a fost realizată în cadrul Departamentului de Genetică al Facultății de Biologie.

CAPITOLUL I – CITOSTATICELE

Citostaticele sunt medicamente cu efect anticancerigen, fiind întalnite și sub denumirile de chimioterapice anticanceroase, antineoplazice, citotoxice, oncostatice, antitumorale și acționează prin distrugerea selectivă a celulelor canceroase. Această selectivitate este datorată faptului că celulele canceroase se multiplică cu o viteză mai mare decât celulele normale ale organismului.

Deoarece multiplicarea celulară este o proprietate atât a celulelor tumorale, cât și a celulelor normale, medicamentele citostatice afectează și celulele normale cu rată crescută de diviziuneși anume: celulele hematopoietice, celulele tubului digestiv, celulele gonadelor, celulele germinative ale părului, etc., ducând la apariția numeroaselor efecte secundare:oboseală, căderea părului, dureri, deshidratare, probleme cognitive și de memorie, etc(Casero, 2000).

Din punct de vedere molecular, medicamentele citostatice acționează asupra ADN-ului, împiedicând, direct sau indirect, replicarea acizilor nucleici.

Există citostatice dependente de faza de diviziune și anume analogi ai bazelor azotate, ce determin sinteza de acizi nucleici nefuncționali. Analogii bazelor azotate în timpul replicării, iau locul bazelor azotate normale sau inhibă sinteza de baze azotate prin diferite mecanisme. În cazul administrării acestui tip de citostatice, celulele canceroase sunt distruse în faza S a ciclului celular, când are loc sinteza ADN.

De asemenea, există și citostatice care alterează tubulina și implicit formarea fusului de diviziune ceea ce duce la blocarea diviziunii celulare în metafaza.

Pe lng aceste tipuri de medicamente antitumorale enunțate anterior, există și citostatice independente de faza de diviziune. În acest caz, citostaticele altereazăADN-ul tuturor celulelor în afara fazei S a ciclului celular. Acest tip de medicamente acționează numai asupra celulelor aflate în diviziune celulară.

Administrarea medicamentelor anticanceroase poate determina apariția fenomenului de rezistență. Aceasta se dezvoltă prin apariția unor mutații genetice care fac celulele canceroase să fie mai puțin inf1uenate de citostatice.

Pentru creșterea eficienței chimioterapiei, mai multe tipuri de medicamente citotoxicesunt utilizate împreună, fiecare având un mod de acțiune diferit(Ion Fulga, 2015, http://www.creeaza.com/familie/medicina/Medicatia-citostatica867.php).

I.1 Tipuri de agenți chimioterapici anticancerigeni

Există peste 100 de tipuri de citostatice, împarțite în următoarele clase:

Agenți alchilanți sunt compuși capabili săatașeze grupări alchil la ADN, fie la nivelul bazelor azotate, fie la nivelul grupărilor fosfat. Aceste tipuri de medicamente acționează în toate fazele ciclului celular. Cel mai frecvent întâlnit necanism este alchilarea guaninei.

Reprezentanții agenților alchilanți includ:

Etilenimine: tiotepa și hexametilmelamina.

Azotiperite:ciclofosfamida, clormetina, melfalanul, clorambucilul, etc.

Nitrozuree: carmustine, lomustine și streptozocin.

Triazene: altretamina, procarbazina, dacarbazina și temozolomida.

Saruri de platina: carboplatina, cisplatina, oxaliplatina.

Alchil sulfonati:busulfan.

Agenții alchilanți sunt utilizați pentru a trata: leucemia, limfomul Hodgkin, mielomul multiplu, sarcoamele, cancerul pulmonar, cancerul ovarian, cancerul mamar(https://en.wikipedia.org/wiki/Alkylating_antineoplastic_agent#cite_note-takimoto-7, Lind și colb., 2008).

Alcaloizii vegetali acționează asupra celulelor aflate în diferite faze de diviziune și sunt citostatice derivate din diferite tipuri de plante:

Alcaliozii de Vinca: Vincristină, Vinblastină și Vinorelbină.

Taxanii: Paclitaxel și Docetaxel.

Alcaloizii de Vinca și taxanii se mai numesc și antimitotice sau toxine ale fusului de diviziune, acționând în faza M a ciclului celular.

Camptotecine (antitopoizomerazele I): Irinotecan și Topotecan.

Podofilotoxinele (antitopoizomerazele II): Etopozidul și Tenisopida.

Inhibitorii de topoizomeraze I și II sunt adesea utilizați pentru tratarea cancerelor pulmonare, ovariene, leucemiilor, etc (https://www.news-medical.net/health/Chemotherapy-Types.aspx)

Antibioticele antitumorale sunt derivate din microorganisme (Streptomyces spp.). Aceste medicamente acționează în mai multe faze ale ciclului celular și sunt considerate specifice ciclului celular. Există mai multe tipuri de antibiotice antitumorale:

Antracicline: Doxorubicina, Daunorubicina, Epirubicina, Mitoxantrona, Idarubicina.

Cromomicine (Chromomycins): Dactinomicina și Plicamicina.

Alte tipuri de antibiotice antitumorale: Mitomicinași Bleomicina.

(Galm U și colab., 2015, http://chemocare.com/chemotherapy/what-is-chemotherapy/types-of-chemotherapy.aspx)

Antimetaboliții reprezintă o clasă de chimioterapice care au structură chimicăasemanatoare cu a unor metaboliți precursori ai acizilor nucleici. Antimetaboliții acționează împotriva celulelor tumorale în timpul ciclului celular, astfel încât celulele nu se mai pot divide. Antimetaboliții sunt clasificați în funcție de substanțele cu care interferă:

Analogii pirimidinici: fluorouracilul, citarabina/citozinarabinozida.

Analogii purinici: mecaptopurina, azatiopurina, tioguanina.

Substanțele care interferă metabolismul acidului folic: metotrexatul

Alte tipuri de antimetaboliți: hidroxicarbamida, hidroxiureea.

Antimetaboliții sunt utilizați pentru a trata: leucemia, cancerul tractului intestinal, cancerul mamar i ovarian.

(https://en.wikipedia.org/wiki/Antimetabolite#cite_note-3)

Alte tipuri de antineoplazice:

Enzime: asparaginaza, pegaspargază.

Retinoizi: bexaroten, izotretinoin, tretinoin (ATRA)

Agent antimicrotubuli: estramustină, etc. (http://chemocare.com/chemotherapy/what-is-chemotherapy/types-of-chemotherapy.aspx).

I.2 Doxorubicina

Doxorubicina este un puternic agent antitumoral activ împotriva unui spectru larg de procese maligne, incluzând leucemii, sarcoame, neuroblastoame, cancer de sân, de ovar, testicul, cancer osos, tiroid, cap și gât, splină, stomac, cancer pulmonar cu celule mici, boala Hodgkin´s, etc. Face parte din categoria antibioticelor antitumorale și a medicamentelor antracicline (Thorn și colab., 2011).

Doxorubicina poate fi întâlnită și sub denumirile de adrimedac, adriamicină, hidroxdaunorubicină, hidroxidunomicin (www.cancer.gov/publications/dictionaries/cancer-drug/def/doxorubicin-hydrochloride).

Căutarea compușilor anticancerigeni ce fac parte din clasa antracilinelor a început în anii 1950, când o echipă de cercetători, Farmitalia Research Laboratories, a descoperit căo tulpină de Streptomyces peucetiusproduce un pigment roșu cu proprietăți antimicrobiene. Tulpina a fost izolată dintr-o prob de sol colectată din jurul Castelului Monte și un antibiotic nou a fost produs din această bacterie care s-a dovedit a avea o bună activitate împotriva tumorilor la șoarece. Noul compus a fost numit daunorubicină și a fost utilizat cu succes în tratamentul leucemiei și limfomului acut (Arcamone, 1981). Cu toate acestea, în cercetările desfășuratepână în 1967, s-a descoperit că daunorubicina poate produce toxicitate cardiacă fatală (Tan și colab., 1967).Cu scopul reducerii acestei toxicități, cercetătorii de la Farmitalia, au modificat genetic o tulpina de Streptomyces spp. utilizând N-nitroso-N-metil uretan pentru a produce un compus, Adriamicina, care mai târziu a fost numită doxorubicină.Doxorubicina fiind varianta 14-hidroxilată a daunorubicinei, atât daunorubicina, cât și doxorubicina au fost prototipuri pentru cercetările ulterioare astfel încât astăzi există aproximativ mai mult de 2000 de analogi cunoscuți ai doxorubicinei (Arcamone, 1981).

Deși doxorubicina a avut un index terapeutic mai mare, cardiotoxicitatea a continuat să fie o problemă majoră. Cel mai periculos efect secundar al doxorubicinei este cardiomiopatia dilatativă, care duce la insuficiență cardiacă congestivă.Cardiotoxicitatea datorată doxorubicinei este acutăși apare în decurs de 2-3 zile de la administrarea acesteia. Incidența cardiotoxicității acute este de aproximativ 11%. Manifestările sunt, de obicei, dureri în piept și/sau palpitații. Afectarea ventriculului stâng este o manifestare rară de cardiotoxicitate acută, dar este reversibilă cu tratamente adecvate. În schimb, cardiotoxicitatea cronică datorată doxorubicinei are o incidențămult mai scazută, de doar 1,7% și este de obicei evidentă în 30 de zile de la administrarea ultimei sale doze, dar poate să apară chiar și după 6-10 ani de la administrarea acesteia. Rata cardiomiopatiei depinde de doza cumulativă a doxorubicinei, cu o incidență de aproximativ 4% atunci când doza de doxorubicină este de 500-550 mg / m², 18% atunci când doza este de 551-600 mg / m² și de 36% atunci când doza depășește 600 mg / m2 (Chatterjee și colab.,2010).

O altă complicație comună și potențial letală a doxorubicinei este tiflita (cecita), o infecție acută a intestinului. Doxorubicina și alte câteva medicamente chimioterapeutice (inclusiv ciclofosfamida) cauzează depigmentarea pielii.Alte grupuri de medicamente care cauzează această problemă includ antimalarice, amiodaronă, metale grele (dar nu fier), tetracicline și antipsihotice (Kaczmarek și colab., 2012).

Mecanismul de acțiune al doxorubicinei

Există 2 mecanisme de acțiune a doxorubicinei:

Interacțiunea cu ADN-ul prin intercalare și inhibarea biosintezei macromoleculareformând complexe cu guanina.

Figura 1 – Mecanismul de acțiune al doxorubicinei

(modificat după:https://www.researchgate.net/figure/Doxorubicin-intercalation-into-DNA-A-TOP2b-relaxes-DNA-supercoil-to-facilitate_fig1_319852887)

În mod normal, enzima topoizomeraza II (TOP2) relaxează ADN-ulși astfel este facilitată replicarea și sinteza ADN. În cazul administrării doxorubicinei, complexele formate la nivelul guanineiblochează acțiunea enzimei TOP 2 și sinteza ADN.Ca rezultat general al acțiunii doxorubicinei procesele reparatorii ADN, epigenomul și transcriptomul sunt dereglate (Pang și colab., 2013).

Generarea de radicali liberi – doxorubicina este oxidată la semichinonă, unmetabolit

instabil, care este transformat înapoi în doxorubicină printr-un proces care eliberează specii reactive de oxigen. Acestea pot duce la peroxidarea lipidelor și la deteriorarea membranei, la deteriorarea ADN-ului, la stresul oxidativ și la moartea celulară.Genele candidat care pot modula această cale sunt cele capabile de reacția de oxidare (NADH dehidrogenaze, sintza de oxid nitric, xantin oxidaza) precum și cele capabile să dezactiveze radicalii liberi, cum sunt peroxidaza, catalază și superoxid dismutaza (Mobaraki si colb., 2017).

Principalul mecanism propus pentru cardiotoxicitatea doxorubicinei constă într-o combinație a celor două mecanisme generată de faptul că antraciclinele acționează prin vizarea topoizomerazelor și determină producerea speciilor reactive de oxigen (ROS).Mai multe enzime mitocondriale, cum ar fi NADH dehidrogenaza, reductaza citocromului P-450 și xantin oxidaza sunt implicate în generarea speciilor reactive de oxigen(Thorn și colab., 2011).

Doxorubicina pare să inducă leziuni toxice mitocondriilor cardiomiocitelor.Formarea peroxidului de hidrogen și a superoxidului a fost implicată în toxicitatea cardiomiocitelor indusă de doxorubicină. Acești oxidanți intracelulari induc activarea p53, iar p53 activată promovează apoptoza cardiomiocitelor.

Au fost realizate numeroase studii care sa evidențieze modul în care doxorubicina acționează la nivel mitocondrial pe ADN-ul deteriorat și a fost demonstrat că șoarecii transgenici lipsiți de topoizomeraza mitocondrială I (Top1mt) au fost mult mai sensibili la cardiotoxicitatea doxorubicinei, decât au fost cei care au exprimat această enzimă (Zhang și colab. 2012).

Deși utilizarea doxorubicinei convenționale a fost oarecum limitată de efectele sale adverse, eforturile recente au îmbunătățit considerabil siguranța și tolerabilitatea acesteia. Până în prezent, cea mai reușită strategie de îmbunătățire a indicelui terapeutic al formulelor convenționale de doxorubicină a fost încapsularea lipozomală, care are ca rezultat acumularea preferențială a medicamentului în situsul tumoral pentru a maximiza eficacitatea și pentru a minimiza toxicitatea.Doxorubicina lipozomală pegilată (doxorubicina în lipozomi învetiți în polietilen glicol)și-a demonstrat eficacitatea la pacienții cu cancer ovarian la care au eșuat terapiile cu platină și paclitaxel, precum și în cancerul de sân metastatic (Rivankar,2014).

I.3 Efectele mutagene ale administrării de citostatice

Mutațiile reprezintă cea mai importantă sursă a variabilității organsimelor, apărute în urma interacțiunii cu diferiți factori mutageni (fizici, chimici, biologici) sau în urma erorilor de replicare.

Citostaticele ca agenți mutageni chimici acționează în mod direct sau indirect asupra materialului genetic determinând diferite tipuri de mutații.

Clasificarea mutațiilor

În funcție de cantitatea materialului genetic afectat, mutațiile se clasifică în:

Mutații genice –mutații care afectează structura ADN-ului.

Mutații cromozomiale –mutații care modifică structura cromozomului prin adiția, deleția sau translocarea unui segment cromozomial.

Mutații genomice – sunt modificări ale setului diploid de cromozomi, fiind reprezentate de aneuploidii și poliploidii.

În funcție de tipul de genom afectat:

Mutații nucleare;

Mutații extranucleare.

În funcție de tipul de celulă în care se produc mutațiile, acestea se clasifică în:

Mutații gametice (germinale) – afectează materialul genetic din celulele germinale, producând gameți anormali, care transmit mutația generațiilor următoare.

Mutații somatice – afectează celulele corpului, formând o clonă celulară anormală; nu sunt ereditare.

În funcție de mărimea efectului fenotipic, mutațiile pot fi:

Micromutații;

Macromutații.

Mutațiile care afectează variabilitatea pot fi clasificate ca:

Letale – duc la moartea individului în momentul apariției (mutații interzise);

Subletale – sunt mutații compatibile cu viața în stare hemizigotă;

Viabile – permit supraviețuirea individului.

În funcție de modul de manifestare în fenotip, mutațiile se clasifică în:

Dominante – se manifestă ori de câte ori există, indiferent de prezența (starea heterozigotă Aa) sau absența (starea homozigotă AA ) a alelei recesive;

Semidominante – alelele ce constituie perechea de factori ereditari se exprimă deopotrivă într-o proporție mai mult sau mai puțin egală;

Recesive – se manifestă numai în condiție homozigotă, adică atunci când alela recesivă este în dublu exemplar – aa, respectiv în absența alelei dominante A (a+).

După sensul modificării genelor, mutațiile pot fi:

înainte (forward m.) – caz în care alela de tip salbatic devine alela nouă;

înapoi (back m.) – caz în care sensul mutației este de la alela nouă la alela de tip salbatic (Gavrila, 2003).

I.3.1. Cariotipul uman normal

Cariotipul reprezintă un sistem de aranjare al cromozomilor în funcție de forma, dimensiunea sau orice altă caracteristică distinctivă prezentă la cromozomii unei singure celule.

Cariotipul la Homo sapiens este alcătuit din 23 de perechi de cromozomi dintre care 22 perechi sunt autozomi și o pereche heterozomi sau cromozomi ai sexului. În cadrul speciei umane, o celulă diploidă este reprezentatăde 2n=46. În cazul în care ne referim la celulele liniei germinale se folosește termenul de haploid și notarea este n=23, deoarece aceste celule conțin doar jumătate din materialul genetic, respectiv doar câte un cromozom din fiecare pereche (Gavrilă, 200).

Cromozomii au fost observați pentru prima dată în anii 1840 de către botanistul elvețian Carl Nägeli, dar importanța lor a fost înțeleasă mult mai târziu. Au primit această denumire abia în anul 1888 de către Heinrich Waldeyer, denumire provenită din limba greacă care înseamnă„corpuri colorate” [gr. chroma= culoare; soma= corp] (Gavrilă, 200).

În perioada imediat următoare, a luat naștere o nouă ramură a geneticii și anume citogenetica. Cu ajutorul tehnicilor citogenetice se identifică în ciclul celular două faze majore, interfaza, în care materialul genetic este decondensat, dispersat în întreg nucleul și mitoza, stadiul în care materialul genetic se condensează sub forma cromozomilor, vizibili.(Gavrilă, 200).

La începutul secolului XX, Theophilus Painter, în urma studiilor pe cromozomii metafazici, ajunge la concluzia căHomo sapiens conține în complementul diploid 48 de cromozomi (Gavrilă, 200).În 1950, Tao-Chiuh Hsu descoperă efectele aplicării soluției hipotone asupra celulelor. Acestea în urma hipotoniei se umflă și se sparg, permiând evidențierea mai bun a cromozomiilor. Astfel, în anul 1956, Joe Hin Tjio și Albert Levan pe baza acestei descoperiri, adăugând și tehnica colchicinizării celulelor, au publicat o lucrare în care au concluzionat că numărul de cromozomi pentru specia umanăeste 46 și nu 48.

Cromozomii sunt cel mai ușor de analizat în metafază, pentru că: se găsesc în același plan, sunt condensați și bicromatidici, putând fi ușor individualizați.

Un cromozom metafazic este alcătuit din 2 cromatide surori, identice din punct de vedere genetic, care rezultă prin replicarea ADN-ului cromozomial în timpul fazei S a ciclului celular. Cele două cromatide surori sunt unite cu ajutorul centromerului.Centromerul reprezintăo secvență ADN specifică asociată cu histone ce unește cromatidele surori, împărțind astfel fiecare cromatidă în două brațe:

Brațul proximal p (brațul scurt) situat deasupra centromerului;

Brațul distal q (brațul lung) situat sub centromer (Gavrilă, 2003).

De asemenea, centromerul îndeplinește și alte funcții importante:

controlează formarea kinetocorilor în vederea fixării cromatidelorla fibrele fusului de diviziune;

asigură clivarea și desparțirea egală a celor două cromatide surori, formându-se 2 cromozomi monocromatidici;

asigură distribuția egală și identică a materialului genetic în timpul diviziunii de la celula mamă la cele dou celule fiice.

Telomerele sunt structuri specifice de ADN localizate la extremitățile cromatidelor,

având rolul de a împiedica fuziunea cromozomilor, menținând integritatea și individualitatea acestora(Gavrilă, 2003) (fig. 1).

Figura 2 – Structura cromozomului metafazic

(modificat după: https://www.semanticscholar.org/paper/A-Review-of-the-Different-Staining-Techniques-for-Estandarte/98f4608a60d818696af5a9a5c5ebdf2d7abf04b7/figure/1)

Clasificarea cromozomilor se realizeazăpe baza indicelui centromeric. Acesta reprezintă raportul dintre lungimea brațului scurt și lungimea totală a cromozomului:

IC=p/(p+g)*100

unde p=lungimea brațului scurt; q=lungimea brațului lung.

În funcție de acest indice, cromozomi se clasifică în (fig. 2):

cromozomi metacentrici – au brațul p aproximativ egal cu brațul q;

cromozomi submetacentrici – prezintă brațul p mai scurt decât brațul q;

cromozomi acrocentrici – au brațe p foarte scurte și pot prezenta la nivelul acestor brațe constricții secundare și segmente satelit;

cromozomi telocentrici – nu prezintă brațe scurte și au centromerul dispus terminal.

Figura 3 – Tipuri morfologice de cromozomi

(modificat după http://www.nature.com/scitable/content/eukaryotic-chromosomes-exist-in-four-major-types-45867)

Cariotipul uman dispune cele 23 de perechi de cromozomi în 7 grupe notate de la A-G, astfel:

Grupa A – este alcatuită din perechile 1-3; aceștia sunt cromozomi de mari dimensiuni dintre care perechile 1 si 3 sunt metacentrici, iar perechea 2 sunt submetacentrici;

Grupa B – conține perechile 4 și 5, fiind cromozomi submetacentrici mari;

Grupa C –cuprinde perechile 6,7,8 și 11 – cromozomi metacentrici și perechile 9, 10 și 12 – cromozomi submetacentrici, cromozomi de talie medie;

Grupa D – include perechile 13-15 în cadrul cărora cromozomii sunt acrocentrici, mijlocii, și prezintăsateliți;

Grupa E – este rerezentată de perechia 16 metacentrică și perechile 17 și 18 cu cromozomi submetacentrici de talie mijlocie;

Grupa F – este constituită din perechile 19 și 20, cromozomii fiind metacentrici mici;

Grupa G – reprezentată de perechile 21 și 22 conținând acrocetrici mici cu sateliți:

Cromozomul X este asemănător cu cei din grupa C și este metacentric;

Cromozomul Y este similar cu cei din grupa G, fiindacrocentric mic (Gavrilă, 2003) (fig. 3).

I.3.2 Cariotipul patologic

De-a lungul timpului, citogenetica a dezvoltat metode de studiu ale structurii și proprietăților cromozomilor, făcând posibilă vizualizarea aberațiilor cromozomiale structurale și a celor numerice.

Există 2 categorii principale de aberații stucturale:

Echilibrate– când nu are loc modificarea cantității de material genetic;

Dezechilibrate – caz în care are loc modificarea cantității de material genetic.

Din categoria aberațiilor structurale echilibrate fac parte:

Inversiile–rezultă prin ruperea unui cromozom în două puncte, urmată de inversarea și reunirea fragmentelor cromozomiale. Există două tipuri de inversii: paracentrice, caz în care cele două puncte de rupere sunt situate pe același braț, iar segmentul inversat nu conține centromerul și inversii pericentrice, caz în care cele dou puncte de rupere sunt situate pe brațe diferite, iar segmentul rotit conține centromerul.

Translocații reciproce – reprezintă schimbul de material genetic între cromozomii neomologi, fiecare cromozom având un singur punct de rupere. Purtătorii de translocații reciproce au simptome precumautismul, dizabilități intelectuale sau anomalii congenitale.

Exemple de translocatii reciproce: leucemia mieloidă cronică – cromozomul Philadelphia.

Translocații Robertsoniene – sunt un tip particular de translocații reciproce cauzate de rupturi lângă centromer la doi cromozomi acrocentrici ale căror brațe lungi rămân intacte, dar se pierde un segment de la nivelul brațelor scurte. Purtătorii acestor aberații structurale nu prezintă anomalii fizice, dar există riscul de a avea gameți neechilibrați care duc la avort sau copii anomali.

Exemple de translocații Robertsoniene: limfom Burkit – t(8,14), schizofrenie – t(1,11), etc.

Interschimburi –sunt datorate unor translocații telomeră la telomeră, dar și sinapselor somatice ale cromatidelor cromozomilor omologi sau neomologi (fig. 5) (https://www.britannica.com/science/heredity-genetics/Chromosomal-aberrations, Gavrilă și colab., 2003).

Figura 5 – Tipuri de aberații structurale echilibrate

(modificat după: http://atlasgeneticsoncology.org/Educ/PolyMecaEng.html )

În categoria aberațiilor structurale dezechilibrate sunt incluse:

Deleții – reprezintă ruperea sau pierderea unui segment dintr-un cromozom. Există mai multe tipuri de delețiile: interstițiale – apar în interiorul cromozomului și terminale – apar la capetele cromozomului. De asemenea, mai există și microdeleții având o dimensiune de până la 5kb, care sunt regăsite la copii cu anomalii fizice.

Exemple: sindromul Cri du chat – deleția unei părți a brațului scurt al cromozomului 5, atrofia musculară spinală – deleția genelor SMN1 (Survival Motor Neuron 1), etc.

Duplicații – anomalii reprezentate de apariția unei copii suplimentare a unui segment cromozomal. Aceste anomalii pot duce la afeciuni neurologice precum sindromul Rett-like i boala Pelizaeus–Merzbacher. De asemenea, duplicațiile oncogenelor reprezintăo cauză comună a multor tipuri de cancere, cum ar fi: cancerul de sn, ovarian, esofagian, colorectal, gastric, neuroblastom, glioblastom, etc.

Cromozomii dicentrici – iau naștere prin pierderea telomerelor a doi cromozomi și unirea celor două fragmente cromozomiale.Se caracterizează prin prezența în același cromozom a doi centromeri.

Cromozomi inelari –aceștia apar prin ruperea unui cromozom în două puncte urmată de pierderea structurilor terminale și reunirea capetelor segmentului într-o structură inelară.

Izocromozomi – apar în urma diviziunii greșite a centromerului, având ca urmare duplicația unui braț cromozomal, celălalt lipsind (http://atlasgeneticsoncology.org/Educ/PolyMecaEng.html, Gavrilă și colab, 2003) (fig. 6).

Figura 6 – Tipuri de aberații structurale dezechilibrate (modificat după:http://atlasgeneticsoncology.org/Educ/PolyMecaEng.html )

Aceste tipuri de aberații cromozomale sunt definite conform ISCN (International System for Human Cytogenetic Nomenclature) prin prescurtări caracteristice (Mitelman, 1995):

del – deletion

ins – insertion

r – ring

t – translocation

dic – dicentric

i – isochromosome

inv – inversion

dup – duplication

De asemenea, la nivelulcromozomilor pot apărea și aberații numerice:

Aneuploidiile – se caracterizeazăprin absența sau prezența în plus față de complementul diploid normal a 1-2 cromozomi. Se clasifică în :

Monosomiile reprezintă absența unui cromozom (2n-1). La specia umană, singura monosomie viabila este monosomia X (sindromul Turner) – individul are un singur cromozom sexual, X.

Trisomiile reprezintă prezența unui cromozom suplimentar (2n+1). La om, viabile sunt trisomiile 8,13,18,21 producând multiple anomalii de dezvoltare: sindromul Patau (trisomia 13), sindromul Edwards(trisomia 18), sindromul Down (trisomia 21). Trisomiile cromozomilor mari nu sunt viabile, eliminandu-se ca produși de avort în trimestrul I de sarcină.

Tetrasomiile constau în prezența a doi cromozomi suplimentari (2n+2).

Poliploidiile– reprezintă adiția unuia sau a mai multor seturi cromozomale haploide complete (Gavrilă, 2003).

CAPITOLUL II – TELOMERE ȘI TELOMERAZ

II.1 Telomere

Telomerele sunt complexe nucleoproteice specializate localizate la capetele cromozomilor, menținându-le stabilitatea și integritatea acestora.

Telomerele au fost identificate pentru prima dată în 1938 de către Herman Muller și apoi în 1940 de către Barbara McClintock. Denumirea provine din limba greacă, unde telos=capăt și meros=parte. În urma unor studii efectuate după acțiunea unor agenți mutageni, Muller a observat cum cromozomii își modifică structura aflată la capetele brațelor și cromozomii devin instabili (McClintock 1941).

La începutul anilor 1970, teoreticianul Alexei Olovnikov a descoperit că cromozomii nu își pot replica complet capetele. Pe baza acestei descoperiri, adăugând și ideea lui Leonard Hayflick despre diviziunea limitată a celulelor somatice (limita lui Hayflick), Olovnikov a observat că se pierd secvențe ADN cu fiecare replicare, iar după un anumit număr de replicări se atinge un nivel critic, moment în care celula va înceta să se dividă, va deveni senescentă și ulterior va intra în apoptoză sau moarte celulară programată. Cercetările lui Olovnikov au întărit ideea că celulele utilizează o enzimă (telomeraza) care ar putea prelungi capetele cromozomilor (Mender și colab., 2015). În 1989, Elizabeth Blackburn și Carol Greider au publicat prima lucrare care elucidează funcția telomerazei, aceasta fiind o revers transcriptază, enzimă ce pe baza matriței interne ARN adăugă secvențe repetate la sfârșitul telomerelor (https://www.teloyears.com/html/pdf/TY4_ShortHistory.pdf).

Telomerele joacă un rol important în ceea ce privește protejarea materialului genetic de degradare intracelulară, de pierderea de informație genetică vitală sau de unirea cromozomilor, fapt ce poate avea consecințe severe asupra parcurgerii ciclului celular.

Pentru evoluția normală a celulei este vitală menținerea integrității cromozomilor și a funcției lor normale. Datorită instabilității cromozomilor, aceștia tind să formeze structuri inelare sau dicentrice, într-o ultimă încercare de protejare a materialului genetic (Gavrilă și colab., 2003).

Lungimea telomerelor este menținută printr-un proces dinamic de scurtare și alungire a telomerelor. Telomerele sunt pierdute progresiv cu fiecare rundă de diviziune celulară, pierzând aproximativ 20-300 bp de secvențe datorită „problemei terminalizării replicării” reprezentată de incapacitatea ADN polimerazei de a replica ADN-ul de la capetele cromozomilor liniari. Diferitele organisme au dobândit metode diverse pentru a preveni pierderea ADN-ului de la capetele cromozomilor lor; majoritatea mamiferelor utilizând telomeraza (Bolzán, 2016).

De-a lungul timpului au fost dezvoltate tehnici de evidențiere a telomerelor:

tehnici citogenetice – bandarea T în care capetele telomerelor sunt colorate cu Giemsa (Vosa, 1975).

tehnici de citogenetică moleculară – FISH care utilizează sonde ADN marcate fluorescent ce sunt complementare secvenței telomerice (Hacia, 1999).

Structura telomerelor

În cazul tuturor vertebratelor, inclusiv la om, telomerele constau în secvențe repetitive hexanucleotidice conservate, bogate în G și T, asociate cu proteine non-histonice (Cech, 1993).În cadrul speciei umane, repetiția telomerică este TTAGGG, este orientată 5´→3´ și repetată de până la 2500 de ori. Lungimea medie a telomerelor scade de la aproximativ 11 kilobaze la naștere la mai puțin de 4 kilobaze la bătrânețe, rata medie de scădere fiind mai mare la bărbați decât la femei (Dalgård și colab., 2015).

O mare parte din porțiunea finală a telomerelor formează o buclă prin împachetarea monocatenei bogate în guanină până ce ajunge cu capătul terminal perpendicular pe regiunea bicatenară. Această structură poartă și denumirea de T-loop. Ulterior, regiunea terminală va străpunge dublul-helix ADN și se va insera între catene. Această structură poartă numele de D-loop. Această formă de împachetare permite o protecție suplimentară a cromozomului (Bernadotte și colab., 2016).

Figura 7 – Reprezentarea împachetări de tip T-loop și D-loop din cadrul structurii telomerei la vertebratele superioare (modificat după Greider, 1999)

Telomerele sunt alcătuite din două regiuni distincte:

eutelomera – situată la interiorul cromatidei, prin tehnici citogenetice, aceasta prezintând o colorație slabă;

protelomera – poziționată spre capătul terminal al cromozomului. Este puternic colorată prin tehnici de citogenetică clasică. Terminal, prezintă o prelungire monocatenară de aproximativ 30 până la 600 nucleotide bogată în resturi de guanină (Gomes și colab, 2011).

Din punct de vedere al conținutului genetic, secvența telomerică este redundantă, lucru extrem de important deoarece nu se pierde material genetic necesar celulelor atunci când telomerele suferă procesul de scurtare pe măsura parcurgerii ciclului celular. Telomerele rămâm stabile atât timp cât repetiția are o lungime de câteva mii de perechi de baze (Gavrilă și colab., 2003).

Marea majoritate a organsimelor procariote au materialul genetic condensat sub form de cromozomi circulari, lipsiți de telomere.

La marea majoritate a speciilor de eucariote, secvența de ADN telomeric este simplă, similară și repetată în tandem (tabel nr. 1).

Tabel nr. 1 Secvența repetiției telomerice la diferite grupe de organisme

(modificat după: Telomerase Database-http://telomerase.asu.edu/sequences_telomere.html)

Funcția unei telomere poate fi iremediabil alterată dacă din structura acesteia se pierd mai multe repetiții, depășindu-de un nivel critic. La vertebrate, stabilitatea unei telomere este asigurată de mii de perechi de nucleotide (O’Sullivan și colab., 2010).

Deși funcția telomerelor este conservată la diferite organisme, arhitectura și compoziția proteinelor asociate telomerelor este remarcabil de variată și pare să se fi schimbat rapid de-a lungul evoluției. La om, telomerele sunt legate de un complex format din șase proteine numit complex shelterin, compus din TRF1 și TRF2, care la rândul lor recrutează RAP1, TIN2, TPP1 și POT1 care interacționează cu ADN-ul telomeric. Acest complex protejează capetele cromozomilor față de repararea necorespunzătoare a ADN-ului atunci când telomerele nu sunt alungite și facilitează la nevoie alungirea telomerelor sub acțiunea telomerazei (Gomez și colab., 2012).

TRF1 și TRF2 (TRF=Telomeric Repeat binding Factor)sunt factori de reglare în sens negativ al lungimii telomerelor. Secvența C-terminală a proteinei TRF1, denumită și telobox, recunoaște în mod specific un fragment de ADN telomeric. Cu toate acestea, TRF1 necesită o dimerizare la capătul N-terminal pentru a se lega ferm la ADN(Gomez și colab., 2012).

Proteina TRF2 îndeplinește funcții unice ca stabilizator al secvenței bogate în G și este capabilă să împiedice fuziunile telomerice. Supraexpresia unui mutant negativ dominant al TRF2 poate provoca senescență prematură și activarea cascadei apoptotice mediată de protein-kinaza ATM și p53. TRF2 poate interacționa și cu alți factori precum Apollo (SNM1B), ERCC1/XRF, complexul MRN implicat în repararea ADN-ului, WRN, și FEN1 (Bilaud și colab., 1997).

TIN2 (TIN2=TRF1 Interacting Nuclear factor 2) – interacționează direct cu TRF1, TRF2 și TPP1, acționând ca un centru pentru complexul proteic format (Liu și colab., 2004).

POT1 (POT1=Protector of Telomeres 1)–reglează lungimea telomerică acționând ca un activator sau inhibitor al telomerazei în funcție de poziția sa față de capătul 3´.

RAP1 (RAP1=Repressor/Activator Protein 1) – proteină stabilizatoare captată de către TRF2. RAP1 este codificată de către gena TERF2IP, localizată în cromozomul 16 cu pseudogene în cromozomii 5 și 22, iar supraexprimarea ei determină alungirea telomerelor.

TPP1 – la om, este codificată de către gena ADC în cromozomul 16q22.1. Are 544 aminoacizi și o greutate moleculară de 57,7 kDa. Recent, s-a demonstrat că această proteină este necesară pentru recrutarea telomerazei in vivo (Tejera și colab., 2010).

Figura 8- Complexul proteic asociat telomerelor în cazul mamiferelor.

(modificat după:Gomez și colab., 2012)

Ambele catene ale ADN-ului telomeric sunt legate de TRF1 și TRF2, iar POT1 se atașează doar la nivelul catenei lungi. Între acestea se stabilește o punte prin intermediul proteinelor TPP1 și TIN2, etapă esențială în procesul de protecție a cromozomilor și în reglarea lungimii telomerelor. Factorii TRF1 și TRF2 sunt în permanență prezenți la nivelul ADN-ului telomeric, iar gradul de asociere a acestora cu telomerele reprezintă un element esențial în reglarea lungimii telomerelor (Gomez și colab.,2012)

De asemenea, telomerele conțin secvențe de ARN necodificator (UUAGGG)n (TElomeric Repeat-containing RNA=TERRA), care este transcris din ADN telomeric prin ARN polimeraza II. TERRA a fost implicată în mai multe procese legate de funcția telomerelor, incluzând reglarea telomerazei,formarea heterocromatinei telomericeși protecția telomerelor (Bolzán, 2016).

Studii recente au permis identificarea a 210 proteine ce interacționează cu ADN-ul telomeric în cadrul unui singur ciclu celular (Gilmore, 2008).

II.2 Telomeraza

Primele studii relevante în care se atestă existența unei enzime cu rol în sinteza și mentenanța telomerelor au fost realizate pe baza experimentelor asupra organismului Tetrahymena thermophila. Rezultatele obținute au fost extinse, ulterior, și în cazul altor organisme, prezența telomerazei fiind remarcată la nivelul aproape orcărui organism (Blackburn, 2004).

Telomeraza, numită și „telomer-terminal-transferază”, este o enzimă responsabilă pentru menținerea lungimii telomerelor prin adăugarea de secvențe repetitive bogate în guanină (TTAGGG) la capătul cromozomilor.

Telomeraza este activă în țesuturile fetale, în celulele germinale adulte și, de asemenea, în celulele tumorale. În celulele somatice umane, potențialul de proliferare al celulelor este strict limitat și după aproximativ 50-70 de diviziuni celulare se instalează senescența. În schimb, în celulele tumorale, potențialul de replicare este nelimitat (Gomez și colab., 2012).

Telomeraza este alcătuită din 2 subunități:subunitatea polipeptidică (TERT) și subunitatea ARN (TERC).

Figura 9 Componentele aparatului enzimatic al telomerazei: reverstranscriptaza (TERT) și matrita ARN (TERC). (modificat după https://sussexdrugdiscovery.wordpress.com/2015/12/)

TERC este o proteină relativ mare (127 kDa), are o lungime de 445 nucleotide, cu o secvență de 11 nucleotide (59-CUAACCCUAAC-39) codificatoare pentru repetițiile telomerice (TTAGGG)n. La om, gena hTR/hTERC este localizată pe cromozomul 3 în regiunea 3q26.

Regiunea TERC este organizată sub forma a două domenii conservate din punct de vedere structural: primul domeniu identificat este miezul catalitic caracterizat printr-o organizare secundară la nivelul căreia se găsesc cel putin două motive de tipul stem-loop, iar jumătate din primul motiv este integrat la nivelul celui de-al doilea motiv- organizare pseudoknot.Cel de-al doilea domeniu este denumit CR4-CR5 în cazul vertebratelor și este reprezentat de un singur motiv stem-loop.

Gena hTERT se găsește pe brațul scurt al cromozomului 5 în regiunea 5p15.33, fiind alcătuită din 16 exoni și 15 introni și are peste 40 kb (Bryce și colab., 2000).

Regiunea TERT prezintă un domeniu catalitic puternic conservat atât în ceea ce privește dimensiunile, cât și organizarea. Aceasta prezintă o structurare pe 4 domenii: domeniul N-terminal (TEN), domeniul central revers-transcriptazic (RT), domeniul de legare a ARN-ului (TRBD) și domeniul C-terminal.Domeniul N-terminal este esențial în funcția de legare a ADN-ului monocatenar, prezintă o mare afinitate pentru acesta și are rolul de a interacționa cu TPP1 și TIN2, două dintre proteinele asociate telomerelor.Domeniul central are rolul principal în funcționarea telomerazei, la nivelul acestuia desfășurându-se elongarea propriu-zisă a secvențelor telomerice. Acesta este asemănător din punct de vedere structural și funcțional cu revers-transcriptaza virală. Domeniul N-terminal este conectat cu domeniul de legare aARN-ului prin intermediul unui linker. Domeniul de legare a ARN-ului interacționează cu regiunea CR4-CR5 a domeniului TERC (Sandin și Rhodes, 2014).

În mod normal, în celulele diploide umane hTERT este componenta limitatoare esențială pentru restabilirea activității telomerazei.

Pe masură ce studiile asupra telomerelor și telomerazei s-au aprofundat, s-au evidențiat conexiuni între procesele de alungire/scurtare a telomerelor și anumite stări mai mult sau mai puțin patologice ale organismelor. Astfel, se cunosc boli ce au ca punct de pornire disfuncții ale aparatului de elongare a telomerelor: diverse telomeropatii (ex. Dyskeratosis congenita), o predispoziție mai ridicată la cancer atât în cazul scurtării telomerelor cât și în cazul alungirii excesive a acestora, precum și rolul telomerelor ca markeri ai senescenței celulare.Recent, au fost detectate mutații ale telomerazei în contextul anemiei aplastice, al sindromului Hoyeraal-Hreidarsson și al fibrozei pulmonare idiopatice (Gomez și colab.,2012).

Hiperactivarea telomerazei precum și alungirea extremă a telomerelor reprezint un proces potențial tumoral. Acest lucru are loc deoarece prin funcționarea excesivă determină așa-numitul fenomen de „imortalitate celulară”. Prin acest fenomen, celulele nu mai intră în apoptoză și se pot produce acumulări de rearanjamente cromozomiale (ex. în leucemia mieloidă acută, sindromul Louis-Bar, sindromul Revesz) (Calado și Young, 2012).

II.3 Efectele doxorubicinei asupra telomerelor și a telomerazei

S-a constatat că doxorubicina inhibă activitatea telomerazei și scurtează lungimea medie a telomerelor în cancerul hepatocelular. Astfel, s-a propus ca inhibarea telomerazei și scurtarea telomerelor prin administrarea doxorubicinei să contribuie la eficiența acestui medicament în tratamentul carcinomului hepatocelular.

Cu toate acestea, doxorubicina nu a arătat niciun efect asupra activității telomerazei sau a lungimii telomerelor în cancerul ovarian. De asemenea, doxorubicina scade activitatea telomerazei în mai multe linii celulare de cancer mamar și de stomac. Astfel, s-a constat că efectul doxorubicinei asupra telomerelor depinde de tipul celulei (Bolzán, 2016).

Mai mult, s-a arătat că doxorubicina induce senescența și apoptoza în cardiomiocitele neonatale de șobolan prin reglarea nivelelor de expresie ale factorilor de reglare TRF1 și TRF2, astfel:

o doză mare de doxorubicină reduce puternic expresia TRF2 în timp ce crește expresia factorului TRF1 și aceasta determină apoptoza timpurie;

o doză mică de doxorubicină reglează negativ atât factorului TRF1, cât și a factorului TRF 2 (Spallarossa și colab., 2009).

Recent, a fost raportat că doxorubicina și etopozidulinduc scurtarea progresivă a telomerelor în celulele stem mezenchimale umane (Bolzán,2016).

CAPITOLUL III – TEHNICI DE CITOGENETICĂ CLASICĂ ȘI MOLECULARĂ DE ANALIZĂ A EFECTELOR ADMINISTRĂRII DE CITOSTATICE ASUPRA GENOMULUI UMAN

III.1 Tehnici de citogenetică clasică aplicate pentru studiul aberaiilor cromozomiale

De-a lungul timpului, citogenetica a dezvoltat tehnici de evidențiere a diferitelor zone cromozomiale, bandarea fiind una dintre acestea. Benzile apar datorită organizării biochimice diferite a cromozomilor(AT/GC) și a condensării diferite a cromatinei. S-a determinat faptul că heterocromatina, care prezintă o condensare mai puternică, apare mai intens colorată (benzi pozitive), pe când eucromatina, care este mai puțin condensată apare mai slab colorată (benzi negative).

Benzile sunt denumite în funcție de colorantul folosit sau după segmentul cromozomial evidențiat. Metodele cele mai comune de bandare sunt:

bandarea G (Giemsa);

bandarea C (Centromer);

bandarea R (Reverse);

bandarea Q (Quinacrina);

bandareaT (Telomere).

Bandările sunt utilizate atât în identificarea cromozomilor și obținerea cariotipului, cât și pentru identificarea anomaliilor cromozomiale (legate de numărul sau structuracromozomilor).

Bandarea G – presupune utilizarea colorantului Giemsa. Pentru a avea loc bandarea, preparatele cromozomiale sunt tratate specific cu o enzimă proteolitică (de regulă tripsina) care este capabilă să inducă digestia parțială a cromozomilor și îndepartarea proteinelor asociate, iar ulterior lamele sunt colorate cu soluție Giemsa. Zonele heterocromatinice, care tind să fie bogate în adenină și timină vor genera benzi pozitive/întunecate, iar zonele bogate în guanină și citozină vor da benzi negative/slab colorate.

Bandarea G poate fi utilizată pentru a identifica anomaliile cromozomiale, cum ar fi translocațiile, pe baza modelului unic de benzi luminoase și întunecate specifice fiecărui cromozom (Estandarte, 2012).

Bandarea C – presupune tratamente cu mai multe soluții: HCl pentru depurinarea ADN și eliminarea proteinelor; Ba(OH)2 pentru denaturarea ADN și SSC pentru spălarea și înlăturarea ADN-ului denaturat. Bandarea C este utilizată pentru evidențierea heterocromatinei constitutive centromerice, a heterocromatinei din regiunile terminale, interstițiale, dar i a heterocromatinei de la nivelul constricțiilor secundare. Acest lucru este posibil deoarece ADN-ul din aceste zone este înalt repetitiv și condensat și ca atare mult mai greu de degradat.

Prin aceast tehnică sunt evidențiate aberațiile cromozomiale structurale de tip: translocație robertsoniană, cromozomi inelari sau dicentrici, precum și fragmente acentrice (Coman și Dordea, 1991).

Bandarea R – este inversul bandarii G. Regiunile întunecate sunt eucromatinice (regiuni bogate în guanină-citozină), iar regiunile slab colorate sunt heterocromatinice (regiuni bogate în adenină-timina).

Bandarea R este obținută prin incubarea cromozomilor într-o soluție ionică la o temperatură ridicată (~ 87°C) urmată de colorarea cu Giemsa. Procesul de incubare provoacă denaturarea regiunilor AT ale cromozomilor datorită punctului de topire scăzut al acestor regiuni (~ 65°C) comparativ cu regiunile GC (~ 105°C) (Estandarte, 2012).

Bandarea Q – a fost realizată pentru prima dată de către Caspersson în 1970 și utilizeaz colorantul Quinacrina (fluorescent). Prin această tehnică, se obin benzi intens colorate în zonele bogate în adenină-timină și benzi slab fluorescente în zonele bogate în guanină-citozină. Acest tip de bandare este asemanator bandării G. Pentru vizualizare este utilizat un microscop cu fluorescență.

Bandarea Q este o colorație utilă pentru observarea unor polimorfisme centromerice (aparținând cromozomilor 1, 16, 19) sau pentru diferite variații ale cromozomului Y (Coman și Dordea, 1991).

Bandarea T – presupune denaturarea termică urmată de utilizarea a două tampoane unul de acid citric și unul fosfat. Se realizează o denaturare a materialului genetic, ce afecteaz integral cromozomul, mai puțin la capetele (zona telomerică). Lamele sunt apoi colorate cu soluție Giemsa sau cu acridine-orange. Se obține astfel o colorare doar a telomerelor, restul rămânând slab colorat.

Bandarea Nucleolar Organizer Regions (NOR)– presupune tratarea preparatelor cu azotat de argint, soluție cu mare afinitate pentru regiunile organizator nucleolare ale cromozomilor acrocentricice conțin informația genetică pentru ARNr18S și ARNr28S (Coman și Dordea, 1991).

III.2 Tehnici de citogenetică moleculară aplicate pentru evidențierea și cuantificarea lungimii telomerelor – FISH

FISH (Fluorescent in situ hibridization- hibridizare fluorescentă in situ)este o tehnică de citogenetică moleculară utilizată pentru a detecta și localiza prezența sau absența secvențelor ADNspecifice din structuracromozomilor, în special pentru detectarea anomaliilor cromozomiale precum duplicații, deleții, translocații, dar și altfel de structuri care pot fi utilizate pentru sfatul genetic sau în domeniul medical (Amann si colab., 2008).

În anii 1960, cercetătorii Joseph Gall și Mary Lou Pardue au observat că hibridizarea moleculară ar putea fi utilizată pentru a identifica poziția secvențelor ADN in situ. În 1969, cei doi cercetători au pus în aplicare pentru prima dată tehnica FISH, utilizând sonde nucleotidice marcate cu agenți radioactivi, iar vizualizarea s-a realizat prin autoradiografiere. Ulterior, sondele marcate radioactiv au fost înlocuite cu cele fluorescente datorită siguranței lor mai mari, stabilității și ușurinței de detecție (O'Connor, 2008).

Tehnica FISH folosește sonde ADN/ARN marcate fluorescent complementare regiunilor cromozomilor individuali. Aceste segmente ADN/ARN marcate hibridizează cu țintele din probă și pot fi vizualizate utilizând microscopia de fluorescenă în nucleii interfazici sau pe cromozomi metafazici (Decordier, 2013).

Sunt posibile trei tipuri de hibridizări: ADN-ADN, ADN-ARN și ARN-ARN (Jensen, 2014).

Sondele pot fi de tip ADNdc, ADNmc sau ARN. Acestea trebuie să fie suficient de mari pentru a hibridiza specific cu secvența țintă, dar nu foarte mari pentru a nu împiedica procesul de hibridizare.

Cele mai utilizate sunt sondele ADNdc, care sunt sintetizate și marcate prin mai multe metode: PCR, Nick translation sau Random priming ( Ratan și colab., 2017).

Pot fi utilizate două modalități de marcare a sondelor: directă și indirectă. În cazul marcării directe, sondele sunt sintetizate din nucleotide ce au atașat un fluorocrom, în timp ce în cea indirectă, sondele conțin nucleotide modificate care au incluse haptene, cum ar fi biotina și digoxigenina (Ratan și colab., 2017, Beliveau și colab., 2012).

Sondele se pot clasifica în funcție de regiunea cromozomală vizată:

Sonde centromerice (CEP) – sunt reprezentate de secvențe repetitive de ADN α satelit ce sunt utilizate pentru a cuantifica numărul de cromozomi, în special în detecția aneuploidiilor sau a poliploidiilor.

Sonde telomerice –au specificitate pentru un locus poziționat la aproximativ 300 kb de capătul cromozomal (TTAGGG) și sunt folosite pentru a evidenția restructurările terminale ale cromozomilor și pentru cuantificarea numărului repetițiilor telomerice.

Sonde WCP (whole chromosome paint) – permit colorarea individuală a întregului cromozom. Aceste sonde sunt utilizate pentru identificarea și studierea aberațiilor greu de identificat din punct de vedere citogenetic.

Sonde LSI (Locus specifice) – hibridizează doar cu o anumită secvență unică în genomul uman. Cu ajutorul acestor sonde sunt identificate diferite anomalii cromozomiale de tipul delețiilor, translocațiilor, amplificare genică etc.

(https://en.wikipedia.org/wiki/Fluorescence_in_situ_hybridization)

Figura 10 – Tipuri de sonde utilizate în tehnica FISH (modificat după: https://www.researchgate.net/figure/Examples-of-different-types-of-fluorescence-in-situ-hybridisation-FISH-probes-a_fig1_9035148)

Analiza FISH tradițională utilizează cel mult două tipuri de fluorocromi: un tippentru evidențierea zonei de interes și un alt tip ce va fi utilizat drept element de contrast, colorând cromozomii în întregime. Îmbunătățirile în imagistica fluorescentă și dezvoltarea fluorocromilor au permis cercetătorilor să utilizeze mai multe sonde diferite de ADN într-un singur experiment (Bayani și colab., 2004).

Tabel nr. 2 Tipuri de fluorocromi folosiți pentru marcarea sondelor FISH (original)

Etapele ce trebuiesc urmărite în cadrul tehnicii FISH cuprind: pretratarea lamelor ce conțin preparatul biologic urmată de denaturarea ADN-ului cromozomal de la forma dublu catenară la cea monocatenară și de denaturarea sondei tot la forma monocatenară. Ulterior are loc hibridizarea sondă – țintă, contramarcarea i examinarea lamelor la microscopul cu fluorescență.

Figura 11 -Tehnica FISH (modificat după: http://www.abnova.com/support/resources.asp?switchfunctionid={B4285500-DB85-435D-BE02-2BF420D5C70D})

Tehnica FISH prezintă o serie de avataje i anume: este o tehnică rapidă care permite marcarea unui număr mare de celule într-o perioadă scurtă de timp; eficiența hibridizării este mare; prezintă senzitivitate și specificitate mari, tehnica a fost adaptată pentru sisteme automatizate iar informațiile citogenetice pot fi obținute și din probe care conțin prea puține celule pentru analiza citogenetică de rutină (Gozzetti și Beau, 2006).

La polul opus se regsește faptul c FISH-ul are i o serie de limitări: se evidențiază acele anomalii care pot fi detectate cu sonde disponibile în prezent pe piață; permite detectarea uneia sau doar a câtorva anomalii în simultan, este sensibilă pentru detectarea trisomiilor, dar mai puțin sensibil în cazul detectării pierderilor sau delețiilor cromozomiale iar datele citogenetice pot fi obținute numai pentru cromozomii țintă, ca urmare FISH-ul nu este un instrument bun de screening pentru bolile heterogene (Gozzetti și Beau, 2006).

Quantitative-FISH (Q-FISH)

Cuantificarea efectivă a lungimii telomerelor se realizează prin tehnica denumită Q-FISH (quantitative FISH). Tehnica a fost implementată de Lansdorp și colab., în 1996 și presupune hibridizarea unei sonde sintetice denumită PNA (peptide nucleic acid) la nivelul secvenței telomerice. Datorită faptului că sondele PNA nu conțin grupări fosfat încărcate electric, legătura dintre PNA și ADN este mai puternică decât cea ADN-ADN sau ADN-ARN (Jackson-Cook și colab., 2015).

Tehnica Q-FISH poate utiliza atât cromozomi metafazici cât și nuclei interfazici.

Q-FISH realizată pe cromozomii metafazici oferă informații despre variația lungimii telomerelor între diferiți cromozomi, dar și o perspectivă asupra frecvenței instabilității cromozomiale. Un avantaj al acestei metode îl reprezintă faptul că permite estimarea dimensiunilor tuturor celor 92 de repetiții telomerice aflate la capetele fiecărui braț cromatidic existent în complementul uman. Cel mai mare dezavantaj al acestei metode constă în faptul că nu poate fi utilizată în celule ce nu sunt active din punct de vedere mitotic și este destul de limitată pentru liniile celulare cu rată scazută de proliferare. De asemenea, este o metodă costisitoare și laborioasă astfel că nu poate fi folosită în cazul studiilor pe grupuri mari de indivizi (Jackson-Cook și colab., 2015).

Q-FISH-ul desfășurat în interfază a fost dezvoltat pentru a depăși anumite limitări ale FISH-ului clasic, putând fi aplicat pe mai multe tipuri celulare, inclusiv pe cele conservate prin înghețare, împarafinare, fixare chimică, etc. Un avantaj clar al utilizării metodologiei Q-FISH pe nuclei interfazici constă în faptul că permite colectarea simultană a informațiilor privind lungimea telomerelor și informațiile histologice, având potențialul de a o combina cu diverse tehnici de marcare imunologică (Vera și Blasco, 2012). Dezavantajul constă în faptul că datele sunt doar estimative deoarece în interfază există riscul ca materialul genetic aflat în stare decondensată să prezinte regiuni suprapuse, și astfel pot apărea erori în detectare (Canela și colab., 2007).

Tehnici derivate din FISH

De la primele experimente de hibridizare in situ în 1969, au fost dezvoltate numeroase variații ale procedurii FISH, iar sensibilitatea sa a crescut enorm. Astăzi, cele mai multe proceduri de hibridizare in situ utilizează sonde fluorescente pentru a detecta secvențele ADN (O'Connor, 2008).

ACM-FISH – este un tip particular de FISH multicolor utilizat pentru detectarea simultană a anomaliilor cromozomiale numerice și structurale în celulele spermatice (Volpi și Bridger, 2008).

ArmFISH – este o variantă a M-FISH-ului, utilizând 42 de culori, care permite detectarea anomaliilor cromozomiale la nivelul brațelor cromozomiale, exceptând brațele scurte ale cromozomului Y și cromozomii acrocentrici. Tehnica ArmFISH a fost aplicată cu succes pentru a descoperi instabilitatea cromozomilor pe scară largă în liniile celulare de gliom (Ratan și colab., 2017).

CO-FISH (Chromosome orientation) – este o tehnică FISH care utilizează sonde ADNmc pentru a produce hibridizarea specifică monocatenelor (utilizază monocatene pentru a realiza hibridizările specifice). Inițial, CO-FISH a fost proiectat pentru a determina orientarea repetițiilor în tandem la nivelul regiunilor centromerice ale cromozomilor, fiind utilizată pentru detectarea inversiilor și a translocațiilor în general, și a translocațiilor Robertsoniene în particular (Volpi și Bridger, 2008).

D-FISH – este utilizată pentru detectarea fuziunii BCR / ABL în leucemia mieloidă cronică (Ratan și colab., 2017).

Flow-FISH – în această tehnică așa cum a fost descrisă de Lansdorp și colab., în 1998, sunt utilizate sondele telomerice marcate cu PNA (peptide nucleic acid) pentru vizualizarea și măsurarea lungimii repetițiilor telomerelor, dar analiza combină hibridizarea in situ cu citometria în flux pentru măsurarea semnalelor telomerice din celulele în suspensie (Volpi și Bridger, 2008).

Immuno-FISH – este o combinație a două tehnici, una fiind FISH-ul standard, fie pe preparatele cromozomiale aplatizate (FISH 2-D), fie pe nucleele conservate tridimensional (FISH 3-D), iar cealaltă fiind o tehnică de imunofluorescență indirectă sau directă. Ultima tehnică permite vizualizarea antigenelor din eșantion, astfel încât atât ADN-ul cât și proteinele pot fi analizate pe aceași probă(Volpi și Bridger, 2008).

Reverse-FISH este utilizat pentru identificarea unor probe de ADN necunoscut, dar care pot să prezinte o restructurare cromozomală sau o amplificare cromozomală specifică celulelor maligne (Volpi și Bridger, 2008).

M-FISH (Multi Color FISH) – permite obținerea de informații privind rearanjamentele cromozomiale pe cromozomii metafazici la care bandările clasice nu au dat rezultate.

ML-FISH – permite identificarea microdelețiilor cromozomiale (Ratan și colab., 2017).

Single-molecule RNA FISH – este o metodă de detectare și cuantificare a ARNm și a altor molecule lungi de ARN într-un strat subțire de țesut (https://en.wikipedia.org/wiki/Fluorescence_in_situ_hybridization).

CAPITOLUL IV MATERIALE ȘI METODE

IV.1 Material biologic

Material biologic uman: culturi de celule din sânge periferic.

Recoltarea s-a efectuat de la o persoana sanătoasă, nefumătoare, care nu a urmat nici un fel de tratament care să producă modificări la nivelul cromozomilor și care să nu fi consumat alcool. Subiectul a fost informat despre scopul și etapele studiului și și-a dat consimțământul în scris pentru a participa la acesta.

Cultură a fost supusă la 48 h de la inițiere la acțiunea agenților mutageni chimici (doxorubicina în concentrație inițială 2mg/ml) conform tabelului nr.

Tabel nr. 3 – Dozele de doxorubicină administrate culturii de limfocite

IV.2 Citogenetică clasică

Cultivarea in vitro a limfocitelor din sânge periferic uman

Pentru evidențierea complementului cromozomal, am realizat cultivarea in vitro a limfocitelor din sânge periferic. Pentru realizarea culturii din sânge total am folosit mediu: PB-MAX suplimentat (ser fetal bovin; L-glutamină, soluție N16, antibiotice, fitohemaglutamină). Fitohemaglutina se adaugă pentru stimularea transformării blastice a limfocitelor, mai ales a limfocitelor T.

Mediul de cultură astfel pregătit, se repartizează în flacoane sterile de 15 ml, câte 4,5 ml/flacon. Ulterior, am adăugat în fiecare flacon câte 0,5 ml sânge total. După agitarea ușoară a flacoanelor (pentru ca celulele sanguine să se disperseze în mediul de cultură), acestea au fost introduse în termostat, la temperatura de 37°C. După 72 de ore de la cultivare (când se consideră că în cultură se află numărul maxim de limfocite în diviziune) cultura se “sacrifică”, procedându-se la prelucrarea materialului obținut.

Cu două ore înainte de sacrificarea culturii de sânge, s-a adăugat în fiecare flacon de cultură, soluție de colchicină 0,02% (10 µl), pentru blocarea limfocitelor în metafază (etapă a mitozei în care cromozomii sunt bine individualizați, cu gradul maxim de contractare a fibrei de cromatină, prezentând morfologie și dimensiuni caracteristice și constante).

După cele două ore de colchicinizare, cultura de sânge se centrifughează 10 min. la 1000 rpm pentru separarea celulelor de mediul de cultură.

S-a îndepărtat supernatantul (mediul de cultură), reținându-se sedimentul celular pe care l-am resuspendat în 5ml soluție salină hipotonă de clorură de potasiu 0,075M. Hipotonizarea s-a realizat pentru mărirea volumului celular și dispersia mai bună a cromozomilor în acest volum. Temperatura de hipotonizare este de 37°C, iar durata de 35 min. După scurgerea acestui interval de timp, se centrifughează 10 min. la 1000 rpm și se reține sedimentul celular.

Urmează o serie de 3 fixări ale materialului celular, folosind un amestec de 4 ml alcool metilic absolut:acid acetic glacial în proporție de 3:1, realizată extemporaneu utilizată de la temperatura de 4°C. Trecerea celulelor din soluția fixatoare veche în cea proaspătă am realizat-o printr-o centrifugare la 1000 rpm, timp de 10 min., îndepărtarea fixatorului vechi și adăugarea celui nou.

După ultima fixare, se face o nouă centrifugare în aceleași condiții ca mai sus, iar sedimentul celular se resuspendă într-un volum mic de soluție fixatoare (3 ml). Din această suspensie am realizat preparate microscopice, prin picurare pe o lamă cu o pipetă Pasteur, de la o înălțime de câțiva centrimetri.

Lamele cu preparatele microscopice sunt lăsate să se usuce la aer 24 ore.

SOLUȚII NECESARE: mediu: PB-MAX, colchicină 0,02%; KCl 0,075M; metanol:acid acetic glacial (3:1). soluție Giemsa 5%.

Colorare convențională

În paharele Berzelius s-au așazat lamele câte două, spate în spate și s-a adăugat soluție Giemsa până ce s-au acoperit preparatele complet.

S-au lăsat minute la colorat, după care s-au spălat cu apă de robinet, s-au uscat și s-au vizualizat la microscop.

SOLUȚII: soluție Giemsa 5%; apă distilată

IV.3 Citogenetică moleculară

IV.3.1 Evidențierea repetițiilor telomerice prin tehnica FISH

Sonde:

Telomere PNA FISH/FITC (fluorescență verde) – DakoCytomation;

Etapele tehnicii FISH:

Pretratamentul preparatelor microscopice – eliminarea debriurilor de pe lamă:

Lamele au fost supuse unui tratament de 2 minute cu TBS (Tampon Tris Salin);

Apoi le-am introdus 2 minute în soluție TBS cu 3,7% formaldehidă;

A urmat spălarea lamelor în TBS1 și în TBS2 – 2 x 5 minute;

Am pretratat lamele timp de 10 minute cu proteinaza K diluată în TBS;

Spălarea lamelor în TBS3 și TBS4 –2 x 5minute;

Îndepărtarea tamponului TBS4 de pe lame am realizat-o prin introducerea acestora timp de 2 minute, în băi succesive de 70%, 85%, 95% etanol rece;

Am uscat lamele la aer.

Denaturarea și hibridizarea lamelor și a sondei:

Am adăugat 10 µl Telomere PNA Probe/FITC pe lamă și am acoperit-o cu lamela;

Lamele au fost introduse în incubatorul de hibridizare 5 minute la 80°C;

Au fost incubate la întuneric, la temperatura camerei timp de 2 h;

Lamela a fost îndepărtată prin introducerea în soluția de clătire timp de 1minut.

Spălari post-hibridizare – îndepărtarea excesului de sondă:

Lamele au fost introduse în soluția de spălare timp de 5 minute la 650C;

Soluția de spălare de pe lame a fost îndepărtată prin introducereaacestora timp de 2 minute, în băi succesive de 70%, 85%, 95% etanol rece;

Preparatele au fost uscate la aer.

Evidențierea cuplării sondă/probă:

Pe lame am aplicat 20 µl DAPI și apoi am acoperit cu lamela;

Prin presare am eliminat excesul de DAPI;

Am lăsat lamele 15 minute la întuneric înainte de a le analiza.

Vizualizarea și fotografierea metafazelor: Analizarea preparatelor am efectuat-o la microscopul de fluorescență Olympus BX 40 (obiective: 20x-100x), fotografierea fiind realizată cu camera foto Olympus E-330.

SOLUȚII NECESARE: kit Telomere PNA FISH Kit/FITC si PNA FISH Kit/Cy3 (DakoCytomation): Tampon TBS (Tampon Tris Salin, pH 7.5) – la 1000ml soluție de lucru: Tris-Base 1.4 g, Tris/HCl 6.0 g, NaCl 8.75 g; soluție de pretratare; proteinază K (2000x) diluată în TBS; soluție de clătire (50X); soluție de spălare (50X), sonda Telomere PNA /FITC; etanol 70%, 85%, 95%; DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole).

IV.3.2 Evidențierea genelor care codifică pentru componentele telomerazei prin tehnica FISH

Sonde:

Sondă pentru evidențierea componentei ARN a telomerazei umane – sonda hTERC (3q26) / 3q11 – KREATECH. Sonda duală cu regiunea (3q26) specifică genei hTR marcată direct cu PlatinumBright550 (fluorescență roșie), iar regiunea control 3q11 pentru cromozomul 3 marcată direct cu PlatinumBright495 (fluorescență verde).

Sondă pentru evidențierea componentei hTERT a telomerazei umane – sonda hTERT (5p15) / EGR (5q31) – KREATECH. Sonda duală cu regiunea (5p15) specifică genei hTERT marcată direct cu PlatinumBright550 (fluorescenta roșie), iar regiunea control 5q31pentru cromozomul 5 marcată direct cu PlatinumBright495 (fluorescența verde).

Etape:

Pretratamentul preparatelor microscopice – eliminarea rezidurilor de pe lamă

Am incubat lamele la 370C pentru 30 min. în 2xSSC (SSC=Salt sodium citrate) (pH= 7.0) și 0,5% Igepal (detergent ce ajută la eliminarea rezidurilor de pe lamă);

Deshidratarea succesivă a lamelor pentru 2 min. în 70%, 85%, 100% etanol, la temperatura camerei.

Denaturarea probelor – separarea catenelor ADN cromozomial de pe lamă la formă monocatenară

Menținerea lamelor pe baia de apă pentru 2 min. la 720C în formamidă 70% în 2xSSC (pH= 7.0);

Deshidratarea succesivă a lamelor pentru 2 min. în 70%, 85%, 100% etanol rece

(-200C);

Lamele au fost uscate la aer.

Denaturarea sondelor – separarea catenelor ADN sondă la ADN monocatenar

Am introdus sonda în tuburi PCR de 0,2 l și s-a denaturat în termocicler la 750C pentru 10 min. (câte 10l sondă/lamă);

Am plasat tuburile pe gheață pentru 30 secunde.

Hibridizarea

Am adăugat uniform 10l sondă/lamă;

Am acoperit-o cu lamela (22x22mm);

Am sigilat lama cu Fixogum Rubber Cement-Kreatech:

Am incubat peste noapte în camera umedă de hibridizare la 370C (termostat).

Spalări post-hibridizare – pentru îndepartarea excesului de sondă

Am îndepărtat lamela de lamă;

Am spălat lama în tampon de spălare posthibridizare I (0,4xSSC/0,3% Igepal) pentru 2 min la temperatura camerei:

Am spălat lama în tampon de spălare posthibridizare I (0,4xSSC/0,3% Igepal) pentru 2 min la 72o C fără agitare;

Am spălat lama în tampon de spălare posthibridizare II (2xSSC/0,1% Igepal) pentru 1 min la temperaturea camerei fără agitare;

Am deshidratat lamele în etanol 70%, 85% și 100% timp de 1 min în fiecare baie;

Am uscat lamele la temperatura camerei.

Evidențierea legării sondă/probă

Am aplicat 15 l DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole se atașează la ADN și relevă semnalul sondei)/Antifade (inhibă pierderea semnalului) și apoi am aplicat lamela;

Am eliminat excesul de DAPI.

Vizualizarea și fotografierea metafazelor: Analizarea preparatelor am efectuat-o la microscopulcu fluorescență Olympus BX 40 (obiective: 20x-100x), fotografierea fiind realizată cu camera foto Olympus E-330.

SOLUȚII NECESARE: sonde hTERC (3q26) / 3q11 și hTERT (5p15) / EGR (5q31) – KREATECH, 2xSSC, 0,5% Igepal, 70%, 85%, 100% etanol, formamidă 70%, 0,4xSSC/0,3% Igepal, 0,4xSSC/0,3% Igepal, 2xSSC/0,1% Igepal, DAPI

V.2 Evidențierea prin tehnica FISH a telomerelor în celulele umane normale și în cele supuse tratamentului cu doxorubicină

Instabilitatea cromozomială moștenită sau cea indusă reprezintă o punte fragilă între mecanismele de integritate genomică și tumorigeneză telomerele jucând un rol important în ambele procese.

Evidențierea telomerelor prin tehnica FISH reprezintă metodpentru studiul integrității terminațiilor cromozomiale. Aceste studii sunt foarte importante atât din punct de vedere teoretic cât și al aspectelor practicii medicale.

V.2.1 Evidențierea prin tehnica FISH a telomerelor în celule normale umane

utilizat sonde fluorescente complementare cu repetiția telomerică (TTAGGG)n, iar marcarea fluorescentă a acestora s-a realizat cu FITC (fluorescență verde).

n urma analizei la microscopul cu fluorescență s-a identificat prezența semnalului fluorescent în celulele normale la aproximativ 98% din metafaze (2 semnale/cromatidă – 4 semnale/cromozom).

Figura 2 – FISH pentru evidențierea telomerelor cromozomilor metafazici în celulele umane normale, marcați cu FITC (sonda Dako) (00x)

V.2.2 Evidențierea prin tehnica FISH a telomerelor în celule umane tratate cu doxorubicină în cultură

Una dintre regiunile importante în care acționează cromozomi este reprezentată de telomere. Ca urmare, ne-am propus să testăm dacă tehnica FISH este suficient de sensibilă astfel încât să permită decelarea de diferențe la nivel telomeric între probele tratate cu doxorubicină vs probele martor.

Figura 2 – Cromozomi metafazici tratați cu doxorubicină evidențiați prin tehnica FISH. Se observă absența semnalului telomeric la cromozomii inelari rezultați în urma expunerii la doxorubicină

Marcare cu FITC, sonda Dako (100x).

Figura 2 – FISH pentru evidențierea telomerelor cromozomilor metafazici implicați în restructurări cromozomiale de tipul fragmentelor acentrice apărute în urma tratamentului cu doxorubicină.

Marcare cu FITC, sonda Dako (100x)

Figura 2 – FISH pentru evidențierea semnalelor telomerice în cazul fenomenului de rezultat în urma tratamentului cu doxorubicină. Marcare cu FITC, sonda Dako (100x)

V.2.3 Analiza componentelor telomerazei (hTERC și hTERT) prin FISH în vederea identificării prezeței sau absenței copiilor multiple ale hTERC și hTERT în genom în urma tratamentului cu doxorubicină

În condiții normalecât și în cadrul procesului de reparare al ADN-ului, telomeraza reprezintă una dintre enzimele de bază implicate în menținerea numărului de repetiții telomerice (Ayouaz și colab., 2008). Studiile de specialitate au demonstrat că activitatea telomerazică este aproape absentă în celulele somatice umane. Totuși, un nivel redus al telomerazei a fost detectat în celulele mitotic active (celule din piele, limfocite și celule endometriale). Celulele stem exprimă telomeraza în vederea menținerii lungimii telomerelor în decursul întregului ciclu de viață. Aproximativ 90% din celulele canceroase conțin telomere scurte și activitate telomerazic ridicată (Belair și colab., 1997).

Scopul prezentului studiu a fost determinarea eventualelor amplificări ale componentelor genelor pentru telomerază, decelabile la nivel cromozomial prin tehnica FISH.

Pentru evidențierea componenei ARN a genei care codifică telomeraza (hTERC) s-a utilizat o sondă dublă, care generează fluorescență la nivelul cromozomului 3 în regiunea centromerică (verde turcoaz) și pe brațul q la nivelul genei hTERC (roșu).

Componenta polipeptidică a fost detectată utilizând, de asemenea, o sondă dublă care se atașează la nivelul cromozomului 5 în regiunea corespunzătoare genei EGR1 (verde turcoaz) și pe brațul p, la nivelul genei hTERT (roș).

Pentru ambele gene, în cazul culturilor netratare cu doxorubicină, s-au decelat câte 4 semnale roșii/metafază, corespunzătoare ca localizare cu poziția genelor pe cromozomi (hTERC pe cromozomul 3q, respectiv hTERT pe cromozomul 5p).

n cazul expunerii la doxorubicină, fost detectat fenomen de amplificare genică pentru

La ora actuală sunt disponibile pe piață o serie de protocoale de detectare prin FISH a numărului de copii ale componentei hTERC a telomerazei pentru diferite tipuri de cancere (epiteliale sau invazive). Un rezultat pozitiv, în aceste cazuri, este de prezența în extra copii a hTERC, generată fie prin amplificarea locus specifică a regiunii 3q26, fie prin polisomia cromozomului 3 (https://www.questdiagnostics.com; http://www. kreatech.com etc.)

reșterea activității telomerazice presupusă a avea loc în urma amplificării genei responsabilepulmonar sau cancer de sân) (Zhu C-Q, 2006; Bièche I, 2000).