Lect. univ. dr. Predan Gențiana Mihaela Iulia [623382]

FACULTATEA DE BIOLOGIE

LUCRARE DE LICENȚĂ

COORDONATOR ȘTIINȚIFIC:
Lect. univ. dr. Predan Gențiana Mihaela Iulia

ABSOLVENT: [anonimizat]
2017

UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI
FACULTATEA DE BIOLOGIE

Ciclul de viață la Diplocarpon r osae Wolf
în colecția de trandafiri a Grădinii
Botanice "Dimitrie Brândză" din
București

COORDONATOR ȘTIINȚIFIC:
Lect. univ. dr. Predan Gențiana Mihaela Iulia

ABSOLVENT: [anonimizat]
2017

3
CUPRINS

INTRODUCERE……………………….. ……………………………………………………… …………………………. 4
CAPITOLUL I. CARACTERIZAREA CIUPERCII FITOPATOGENE
I.1. Istoricul bolii………………………………………………………………………….. ………………………….. ..5
I.2. Agentul patogen……………………………………………………………………………………………… …….5
I.3. Simptome…………………………………………………….. …………………………………………………… ….6
I.4. Ciclul de viață……………………………………………………………………………………………… …….. …9
I.5. Epidemiologie………………….. ……………………………………………………… …………………………. 13
I.6. Combatere………………………………………………………………………………. ………………………….14
CAPITOLUL II . ASPECTE EXPERIMENTALE ALE CICLULUI DE VIA ȚĂ DIN
LITERATUR A DE SPECIALITATE
II.1. Inocularea patogenului………………………………………………………………………………………. 17
II.1.1. Metoda inoculării patogenului pe plante…………………………. ………………………………. 19
II.1.2. Umiditate și temperatură…………………………………………………….. ………………………….20
II.1.3. Lumină………………………………………………… ………………………….. ………………………….22
II.2. Prepararea mediilor de creștere………………………………………………………………………… 23
II.2.1. Prelevarea probelor…………………….. ……………………………………. …………………………. .24
II.2.2. Secționarea……………………………………………………………………….. ………………………….25
II.3. Tehnici de colorare….. ………………………………………………………………………………………. .26
II.4. Rata germinării……………………………………………………………………… ………………………….28
CAPITOLUL III. STUDII MICROSCOPICE ALE PROCESULUI DE INFECȚIE
III.1. Germinarea conidiei și formarea apresorului……………………………. ……………………….29
III.2. Penetrarea cuticulei și dezvoltarea patogenului în țesuturile plantei gazdă. …………29
III.3. Formarea haustorilor și a hifelor intracelulare…………………………. ……………………….32
III.4. Sporularea ………………………………………….. …………………………. ………………. ……………….33
III.5. Vernalizarea………. ………………………………………………………………….. ……………………… ..34
CAPITOLUL IV. MATERIALE ȘI METODE DE LUCRU. ……………………………… …………. .46
CONCLUZII……………………………………………………………………………………… …………………………58
BIBLIOGRAFIE……………………………………………………………………………………… …………………..59

4
INTRODUCERE
Prezenta lucrare are ca scop descrierea detaliată a ciclului de viață al ciupercii –
Diplocarpon rosae (Wolf) și identificarea unor stadii din dezvoltarea acestei ciuperci
fitopatogene, de pe unele soiuri de trandafiri din colecția Grădinii Botanice „D imitrie Brândză”
din București.
Pentru început vom urmări prezentarea bolii și a agentului fitopatogen corespunzător
acesteia, a simptomelor, descrierea amănunțită a ciclului de viață și a unor măsuri de
prevenire și combatere.
Ne propunem să consemnăm observ ații privind c âteva date experimentale ale
ciclului de viață și aspecte microscopice ale procesului de infecție.
De asemenea , ne propunem s ă evidențiem diferența dintre țesutul foliar sănătos și
cel bolnav prin realizarea unor prepararate histoanatomice și analiza acestora la
microscopul optic , precum și cultivarea agentului fitopatogen pe medii de cultură artificiale
și analiza microscopică a acestuia.
În final , vom încerca introducerea metodei inoculării pe plante test în cadrul
Facultății de Biologie, la lucrările practice de la Fitopatologie, întrucât se pot efectua studii
și asocieri între ciclul de viață al agenților fitopatogeni și efectul produselor fungicide pe
plante.
Mulțumesc doamnei lector dr. Gențiana Mihaela Iulia Predan pentru amabilitatea cu
care mi -a pus la dispoziție literatura de specialitate, citirea și interpretarea rezultatelor
obținute, pentru sfaturi și îndrumări.
Mulțumesc domnului dr. ing. Marius Negulici pentru că mi -a prezentat colecția de
trandafiri și m-a ajutat la recoltarea pr obelor și observarea în evoluție simptomelor bolilor
la nivel foliar .
Mulțumesc doamnei tehnician Maria Răducanu care m -a inițiat în însușirea
protocolului privind realizarea mediilor de cultură și a citirii rezultatelor.

5
CAPITOLUL I . CARACTERIZAREA CI UPERCII FITOPATOGENE
I.1. ISTORICUL BOLII
Pătarea neagră este o boală comună, răspândită la nivel global pe speciile genului Rosa și
este cauzată de agentul patogen fungic cu stadiul perfect (sexuat) – Diplocarpon rosae (Wolf ) și
stadiul imperfect (asexu at) – Marssonina rosae (Lib.). În Europa, boala a fost descrisă pentru
prima oară în Suedia, în 1815, apoi în America de Nord în 1831, în America de Sud în 1880, în
Australia în 1892, în Africa în 1920, în Asia în 1910. (Baker, 1948). În România, boala a f ost
raportată în anul 1853, în județul Sibiu de către M. Fuss pe Rosa spinosissima L.
Wolf descoperă în 1912 stadiul perfect al parazitului și propune numele de Diplocarpon
rosae Wolf. Prin inoculări artificiale , începând cu ascoporii a conectat ambele sta dii ale ciupercii.
Se accentuează importanța stadiului ascosporic în purtarea ciupercii peste iarnă. Acesta a
subliniat faptul că ascosporii nu germinează decât în contact cu frunza de trandafir. În timpul
verilor cu precipitații abundente, atacul este put ernic, mai ales în regiunile de deal și de câmpie,
iar boala se manifestă de la sfârșitul lunii mai sau începutul lui iunie.

I.2. AGENTUL PATOGEN
Ciupeca Diplocarpon rosae Wolf face parte din regnul Fungi, filum Ascomycota, clasa
Leotiomycetes, ordinul He lotiales, familia Dermataceae, genul Diplocarpon. Diplocarpon rosae
Wolf (sin. Fabraea rosae (Wolf), Maubl.)
Ea este responsabilă de boala numită pătarea neagră a trandafirului.
Anamorfa ciupercii este reprezentată de Marssonina rosae (Lib.) Died. (sin. Actinonema
rosae Fr., Asteroma rosae Lib., Marssonia rosae Trail.) din familia Dermataceae . Aceasta a fost
descrisă pentru prima oară în Franța, în 1827 .
În regiunile temperate, primele infecții din primăvară sunt cauzate de conidii sau
ascospori găsiți în materialul vegetal de peste iarnă. Ciuperca iernează pe tulpini latente, spini,
frunze căzute și boboci (Lyle 1943, Gatiti 1981).
Conidiile sunt răspândite de vânt, stropi de ploaie și prin vectori de animale, inclusiv
insecte și arahnide (Pa lmer și colab., 1978).
Miceliul parazit de Marssonina rosae (Lib.) Died. este la început subcuticular cu hife
miceliene grupate în fascicule. Hifele tinere sunt hialine, dar se întunecă odată cu vârsta. Din

6
acestea se formează haustori care pătru nd în celulele epidermale și palisadice ale plantei -gazdă.
Sub cuticula de la nivelul petelor se formează strome de dimensiuni mici. Din strome iau
naștere conidiile amplasate pe filamente miceliene scurte, formând acervuli subcutilari cu
dimensiuni cupri nse între 50 -400 μ. Ulterior, cuticula se rupe, iar conidiile devin libere.
Conidiile sunt formate din 2 celule inegale: apicală și bazală, despărțite de un perete
transversal la nivelul căruia se observă o sugrumare pronunțată. Celula apicală este mai m are și
rotunjită superior față de cea bazală care se îngustează la bază.
Vara, boala se răspândește cu ajutorul conidiilor prin intermediul vântului. Rar, la nivelul
frunzelor atacate, se formează apoteciile cu asce cu 8 ascospori hialini, bicelulari. Pr imăvara
următoare, ascosporii ajung la maturitate și sunt evacuați forțat din asce.

I.3. SIMPTOME

Boala se manifestă, de obicei, pe fața superioară a frunzelor, rar pe stipele, sepale, petale.
Aceasta debutează cu apariția unor pete violacee -negricioas e, mici și circulare cu margine
difuză, care se măresc în timp, ducând la căderea foliolelor.
Forma petelor este dată de extinderea miceliului în sens radiar din punctul infecției.
Caracteristicile petelor depind de tipul de trandafir și de intensitatea atacului.
La trandafirii sensibili, petele sunt extinse și cu margine difuză. Țesutul din jurul
leziunilor devine galben, iar cloroza se extinde până cand are loc căderea frunzelor (Săvulescu,
1969).
Patogenul este prezent doar în leziunile p ropriu -zise. Îngălbenirea țesutului este cauzată de
metaboliții patogenului și prezintă un nivel ridicat de activitate metabolică care este exprimată
prin acumularea de fenoli , orto -dihidroxifenoli și amino acizi, precum și printr -un nivel ridicat al
activi tății enzimatice.
Petele se măresc încet, durând câteva săptămâni să atingă diametrul de 12 mm.
La soiurile rezistente sau în condiții nefavorabile de mediu, se formează mici puncte
negre, nefiind urmate de cloroza sau căderea frunzelor.
Îngălbenirea și căderea frunzelor sunt asociate cu etilena. Frunzele afectate de pătarea
neagră produc cantități mari de etilenă; producția scade pe măsură ce frunzele devin galbene și
încetează atunci când frunzele devin maronii.

7
Frunzele infectate conțin mai puține a uxine decât cele sănătoase. Patogenul degradează
auxinele (întârzie defolierea), grăbind astfel căderea frunzelor.

Figura 1: Simptome pe frunză infectată cu Diplocarpon rosae Wolf (orig.)

Figura 2. Apariția petelor brun -negricioase , difuze (5 mm) p e fața superioară a frunzei ,
început de mai ( Oc. 2x, Amp 1.3) (orig.)

8

Figura 3. Înnegrirea petelor (3 mm) urmată de formarea acervulilor subcuticulari cu
conidii, luna mai (Oc. 2x , Amp. 2) (orig.)

Figura 4. Stadiu avansat al bolii manifestat prin îng ălbenirea frunzelor și creșterea
numărului de pete (după Horst și Cloyd, 2007)
Pe lemnul soiurilor sensibile apar pete roșii -violacee, neregulate. Mai târziu, petele se
înnegresc și prezintă bășici, iar la nivelul lor se găsesc acervuli subcutic ulari care ulterior rup
cuticula.
Leziunile sunt mici și rareori omoară ramurile, dar sunt foarte importante în
supraviețuirea patogenului peste iarnă. (Agrios, 2005)
Pețiolurile și stipelele pot prezenta puncte negre, neobservabile, similare cu cele de pe
frunze.

9
Pendunculii florali și sepalele pot avea simptome similare, iar petalele pot fi afectate de
pete roșii însoțite de deformare moderată.
Tufele de trandafiri rămân desfrunzite pe timpul verii, iar spre toamnă, are loc o sinteză de
foliole car e obosește planta și duce la o rezistență mai scăzută la geruri în anotimpul friguros.
Astfel, în vara următoare, înflorirea este minimă sau nu se produce deloc.

Figura 5. Ramuri infectate cu Diplocarpon rosae Wolf ( după Horst și Cloyd , 2007)

I.4. CICLUL DE VIAȚĂ

Patogenul rezistă peste iarnă prin miceliul de rezistență de pe lăstari sau prin conidiile și
apoteciile de pe frunzele căzute. Frunzele sunt cele mai susceptibile infecției când sunt în creștere
(la 6-14 zile). (Cook, 1981)
Primă vara , miceliul din lăstari produce conidii. Acestea sau sporii de pe frunzele căzute
sunt răspândiți de vânt sau de picăturile de ploaie, ajung pe frunzele tinere, ducând la infecția
primară a frunzelor din anul curent.
O conidie germinează în 9 -18 ore p e o frunză umedă la t emperaturi cuprinse între 22 –
26°C. Conidiile emit tuburi germinale din celula apicală și rar din ambele celule.
Tuburile germinale penetrează cuticula frunzei și cresc între cuticulă și celulele
epidermice, produc ând hife hialine, ul terior brun -negricioase ce se extind radiar de la punctul

10
infecției și pătrund în peretele celulelor epidermice formând haustori. Aceștia se pot forma în
celulele gazdă la 15 ore după infecție.
Vara , infecția se răspândește cu ajutorul vântului și stropi lor de ploaie prin conidii.
Miceliul matur formează strome între cuticulă și celulele epidermice ce produc conidiile
dispuse în acervuli rezultând infecția secundară ( toamna ).
Prin procesul sexual, ciuperca produce apotecii în frunzele căzute.
Infecțiile pe suprafața inferioară a frunzelor seamănă cu cele de pe suprafața superioară,
exceptând faptul că hifele cresc rapid prin mezofil, dezvoltându -se pe ambele fețe ale frunzei.
Simptomele apar în 3 -16 zile, în funcție de temperatură. Acervuli i se formează în 11 zile
pe fața superioară și într -o lună pe fața inferioară.
Când umiditatea relativă scade, la locul acervului în creștere, cuticula se rupe expunând o
masă mucilaginoasă de conidii. Acestea se produc la 10 -18 zile de la infecție. Unel e conidii aderă
la fragmente de cuticulă ruptă, dar majoritatea sunt dispersate în apa de ploaie sau condensate.
Conidiile sunt diseminate prin stropirea cu apă, de către oameni în timpul cultivării, sau
prin contactul cu corpul lipicios al insectelor.
Frunzele căzute suflate de vânt, pot dispersa local patogenul, dar conidiile sunt, de obicei
în aer numai în picăturile de apă. Ascosporii se găsesc atât de rar, încât sunt neimportanți în
dispersare . (Horst și Cloyd, 2007)
Ciuperca nu supraviețuiește în sol, iar conidiile care aderă de unelte, rămân viabile nu mai
mult de o lună.
În zonele cu climat blând și în sere, ciuperca rămâne activă în pl antă gazdă pe tot
parcursul anului.
Târziu în toamnă, după defoliere, miceliul invadează straturile profunde ale frunzei
moarte și formează o stromă între epidermă și parenchimul palisadic. Wolf precizează că
ascocarpii sunt formați în abundență pe parc ursul lunii octombrie și au fost observați de către
acesta și în lunile noiembrie și decembrie. (Eliade, 1990)
Aparent, dacă toate condițiile pentru dezvoltarea ascocarpilor sunt asigurate, apoteciile cu
asce pot fi așteptate primăvara. Apotecia se deschi de prin ruperea cuticulei. Ascosporii sunt
răspândiți de vânt și ploaie.

11

Figura 6. Ciclul de viață – Diplocarpon rosae Wolf.
A, Diplocarpon rosae Wolf rezistă peste iarnă în tulpinile infectate sau în mugurii sau frunzele
căzute. B, noii lăstari sunt infectați prin miceliul iernat sau prin conidii și ascospori produși pe
frunzele căzute. C, Frunzele și tulpinile sunt infectate în timpul verii cu ascospori răspândiți prin
aer sau conidii propagate prin stropi de ploaie (adaptat după Horst și Cloyd, 2007)

12

Fig.7. Ciclul de viață al Diplocarpon rosae Wolf (original):
P=primăvară, V=vară, T=toamnă, I=iarnă

13
I.5. EPIDEMIOLOGIE

Marssonina rosae (Lib.) Died. tolerează o ga mă largă de temperaturi (15 -27°C).
Germinare a conidiilor este optimă la 18° C; la această temperatură, germinația începe
după 9 ore și atinge 96% în 36 de ore.
Patogenul este sensibil la temperaturi ridicate. Conidiile sunt omo râte fără germinaț ie la
33°C, în timp ce la 30° C pot germina, dar nu reușesc să se dezvolte în continuare.
Creșter ea miceliană este optimă la 21° C și este oprită după 8 săptămâni la 33° C.
Infecția conidială a frunzelor este optimă la 19 -21°C, iar simpt omele p ot apărea în 3 -4
zile la 22 -30°C.
Dezvo ltarea bolii este optimă la 24° C. Nici o infecție nu are loc dacă suprafețele frunzelor
sunt uscate în termen de 7 ore de la inoculare și incubate la 15 -24°C. Probabilitatea infecției
crește dacă frunzele răm ân umede timp de 24 de ore înainte de uscare. Nici o infecție nu are loc
în aer uscat.
Chiar și la 100% umiditate relativă, germinația nu are loc în cazul în care conidiile nu au
fost udate, iar la o umiditate relativă sub 90%, conidiile mature trebuie i mersate în apă pentru cel
puțin 7 ore înainte de a cauza infecția.
Buna circulație a aerului în jurul trandafirilor din sere sau din câmp, grăbește uscarea și
reduce probabilitatea infecției cu Diplocarpon rosae Wolf.
Totuși, vânturile oceanice, reci ș i umede în regiunile de coastă sau irigarea aerienă
favorizează infecția.
Evoluția bolii este restricționată în zonele cu climat arid sau în serele cu umiditate scăzută
unde plantele irigate se usucă rapid.
Căldura de vară și gerul limitează dezvoltarea epidemiilor în regiunile ploioase.
În urma observațiilor efectuate în mai multe localități din țară, soiurile de trandafiri de
cultură cu rezistență sporită la Diplocarpon rosae Wolf sunt: Radianee, Eclipse, New Dawn,
Perle d’Or, Frau Berta G urtler, Viridiflora, Etoile de Holande, Leni Neuss, Mrs. Niel, Luis
Brinas, Marie Adelaide, Mrs. Franklin Dr. Roosevelt. Soiurile de trandafiri susceptibile infecției
cu Diplocarpon rosae Wolf sunt: Charles K. Douglas, Johana Hill, Mary Hart, Golden Dawn,
Belvedere, Kardinal, Locarno, Orleans Rosae, Yvone Rabier, Raymond Privat, Ellen Poulsen,
Ferdinand Mayer, Freiburg II. (Săvulescu, 1969)

14
Majoritatea speciilor sălbatice de Rosa sunt rezistente în fața atacului: Rosa acicularis
Lindl., Rosa blan da Ait., Rosa cinnamomea L., Rosa eglanteria L., Rosa jundzilli Bess., Rosa
pendulina L., Rosa rubiginosa L., Rosa sericea Lindl., Rosa setigera Michx., Rosa watsoniana
Crep. O mică parte din speciile sălbatice de Rosa sunt slab atacate: Rosa canina L., Rosa
carolina L., Rosa gallica var. muscosa bifera Salet, Rosa nitida Willd.

I.6. PREVENIRE ȘI COMBATERE

Pentru a stopa infecția, respectiv iernarea patogenului, trebuie efectuată o curățenie
generală prin înlăturarea frunzelor afectate căzute.
Primăva ra se va face o tăiere a lăstarilor la care boala s -a extins la nivelul ramurilor.
În vederea cultivării trandafirilor se aleg locuri însorite, ferite de umbră și umiditate.
Se aleg, de preferință, soluri de tip cernoziom, aplicându -se îngrășăminte organo -minerale
și se evită solurile argiloase.
Frunzelor nu le este permis sa rămână umede sau la o umiditate crescută mai mult de 7 -12
ore. Udarea excesivă ar trebui evitată pe timp de vreme închisă și umedă. Irigarea trandafirilor
trebuie evita tă, dar poate fi realizată dimineața pentru a permite foliolelor să se usuce în timpul
zilei. Spray -ruile fungicide ar trebui aplicate în perioadele în care condițiile sunt favorabile
dezvoltării ciupercii . (Barbu, 1965)
Tratamentele se aplică în funcție de specia de trandafir și de necesitățile ei. Culturile de
trandafiri din parcuri, alei, grădini trebuie udate în mod rațional, evitându -se excesul de
umidititate care asigură condiții favorabile agentului patogen. Se evită excesul de îngrășământ cu
azot, care predispune planta la boli prin scăderea rezistenței. (Popescu, 1993)
Iarna, plantele se protejează de îngheț prin acoperirea lor cu paie sau prin îngropare și
încălzirea atmosferei prin fum. Se evită plantarea trandafirilor la distan țe mici, deoarece crește
umiditatea, iar răspândirea infecței poate fi foarte rapidă.
Plantele din grădini, parcuri pot fi infectate prin intermediul buruienilor care cresc în
culturi, pe lângă ele, de aceea este necesară plivirea buruienilor. Ac estea reprezintă o sursă
continuă de infecție, deoarece ele pot fi atacate de paraziți, care trec pe trandafiri prin intermediul
vectorilor de insecte. (Lazăr și colab ., 1977)

15
Trandafirii cu simptome timpurii, trebuie adunați si arși, pentru a se evita îmb olnăvirea
întregii culturi. Frunzele căzute la sfârșitul perioadei de vegetație, se strâng și se ard.

Substanță activă Nume fungicid
Cupru Coppermaxx, Funguran
Ziram Ziram
Ulei de neem Mayam
Sulf Sulphur 80 WG, KUMULUS DF, Sulfomat
Clorotalonil Rover 500 SC, Bravo 500 SC, Daconil, Echo
Miclobutanil Systhane Forte, Eagle
Propiconazol TILT 250 EC, Banner Maxx
Triticonazol Alios
Zineb Aspor, Lirotan, Dithan Z
Captan Orthocid 50, Permidin
Faltan Faltan
Propineb Antracol
Sulfat de cupru Zeama bor deleză
Mertiram de zinc Polyram combi
Tabelul 1 : Fungicide folosite în controlul pătării negre (orig.)

Tratamente folosite pentru combatarea pătării negre

I. Tratamentul cu Zineb (etilen -bis-ditiocarbamat). Acesta este o pulbere cristalină de
culoare a lbă sau cenușie. Produsele din comerț prezintă concentrații de 30 -70% Zineb. Pentru
combatarea pătării negre se utilizează sub formă de pulbere muiabilă , în concentrație de 0.15 –
0.3%. În amestec cu sulf, este posibilă combaterea concomitentă a pătărilor și a făinărilor.
Tratamentul nu este toxic.
II. Tratament cu Ziram (dimetilditiocarbamat). Acesta se folosește în concentrație de
0.2-0.25%.
III. Tratamentul cu Captan (N-triclormetil -tio-tetra-hidro -ftalimidă) se aplică prin
stropiri cu pulbere muiab ilă în concentrație de 0.2 -0.3%. Poate înlocui zeama bordeleză în
floricultură, deoarece nu prezintă fitotoxicitate.
IV. Tratament cu Faltan (N-tricoretil -tio-ftalimidă). Acesta este o pulbere muiabilă, de
culoare albă cu efecte toxice slabe pentru om și animale , care este administrat prin st ropiri în
concentrație 0.1 -0.3% . Tratementul este folosit în combaterea în special pentru combaterea

16
pătării negre, dar și altor agenți patogeni care produc pătări la nivelul frunzelor ( Septoria,
Ascochyta, Phyllosticta ).
V. Tratament cu Propineb (propilen -bis-ditiocarbamat de zinc). Acesta este o pulbere
muiabil ă cu peste 50% substanță activă , aplicat în concentrație de 0.2%.
VI. Tratament cu Sulfat de cupru . Acesta este o pulbere cristalină, albastră care se
dizolvă în apă . Pe bază de sulfat de cupru, se prepară zeama bordeleză cu o fitotoxicitate
moderată care pătează frunzele tratate, dar cu randament bun în tratarea plantelor ornamentale. Se
aplică prin stropiri în concentrație de 0.75 -1% în combinație cu alaun, albumină, detersin 0.2%,
etc.
VII. Tratament cu Metiram de zinc . Este o pulbere umectabilă de culoare galbenă,
folosit în concentrație 0.2% pentru combaterea concomitentă a pătării negre și a ruginii
trandafirului provocată de Phragmidium disciflorum. Metiramul de z inc nu prezintă toxicitate
pentru om și animale.

Perioadele de aplicare a tratamentelor (Sandu, 2001)

Tratamentul I : la sfârșitul lunii aprilie, pentru a distruge miceliul de rezistență și
apoteciile de pe resturile de frunze și ramuri, din toamna preced entă.
Tratamentul II : la cel mult 3 zile de la aparația simptomelor .
Tratamentul III : la 2 săptămâni de la tratamentul II , în momentul apariției petelor mici și
negre pe frunze.
Tratamentul IV : la 3 săptămâni de la tratamentul III, în momentul înfloririi.
Tratamentul V : la mijlocul lunii iunie .
Tratamentul VI : la începutul lunii iulie, prin care este inhibată infecția secundară
utilizând fungicide de contact.
Tratamentul VII : la sfârșitul lunii iulie, se folosesc fungicide care combat atât pătarea,
cât și făinarea .
Tratamentul VIII : la mijlocul lunii august .

17
CAPITOLUL II. ASPECTE EXPERIMENTALE ALE CICLULUI DE
VIAȚĂ DIN LITERATUR A DE SPECIALITATE

II.1. INOCULAREA PATOGENULUI

Frank (1896) a încercat inoculările artificiale cu conidii și a raport at pete în a 10 -a zi.
Infecțiile din ascospori au fost obținute de Wolf (1912); el a observat că germinarea
acestor spori are loc în 24 de ore, dar doar pe frunză.
La 17 zile de la inocula re, au apărut acervuli maturi.
S-au folos it plante din ghiveci care au fost stimulate să crească rapid adăugând
îngrășăminte cu câteva săptămâni înainte de începerea experimentelor. Varietățile alese au fost
majoritatea Radiance și Red Radiance, Felicity, Charles K. Douglas, Mrs. F. R Pierson, He nry
Ford, Flammenrose.
Frunzele tinere au fost selectate pentru infecție, cu toate că frunzele bătrâne au fost și ele
inoculate pentru rezultate comparative. De la 2 până la 6 inele au fost marcate pe fiecare lamină
cu cerneală India.
Cu ajutorul unei tije de sticlă, picături de suspensie de spori obținute din acervuli sau
culturi artificiale, au fost plasate în interiorul fiecărui inel. Plantele inoculate au fost mutate în
“frigiderul fără gheață” descris de Hunt (1919) care prevedea o atmosferă saturată pentru plante.
În cazul în care ciuperca penetrează țesutul frunzei în loc să patrundă prin ostiolele
stomatelor, are loc un proces mult mai complicat. Sunt mulți factori care lucrează împreună și fac
posibilă penetrarea ciupe rcii prin peretele extern al epidermei.
Pentru ca infiltrarea să fie posibilă, este necesar un contact intim între hife și planta gazdă.
Acest lucru este posibil, în majoritatea cazurilor, cu ajutorul unui apresor.
Primul care a observ at funcția acestor organe a fost Frank, care le a numit “Haftorgane”
(1883) și a arătat că nu sunt “spori secundari” așa cum îi considera Fisch (1882), Scribner (1887),
Halsted (1892) și alții.
De Bary (1886), în studiul bolii cauzată de Sclerot inia, este de părere că sunt necesare
două condiții pentru formarea acestor organe: trebuie să fie un stimul mecanic produs de
contactul dintre hifă și unele substanțe dure cum ar fi sticla din camera de cultură sau cuticula
gazdei și că ciuperca trebuie s ă crească într -un film de apă și nu într -un mediu nutritiv.

18
Dacă sporii sunt germinați în soluții nutritive, penetrarea are loc, dar apresorul nu se
formează.
Explicația lui pentru această situație este că soluția favorizează formarea unei cantități
mari de substanțe toxice care permit penetrarea imediată după ce hifa a atins epiderma. Cea mai
eficientă metodă pentru studiul fazelor timpurii ale penetrării este examinarea porțiunii de frunză
la microscopul optic cu ulei de imersie. Metoda următoare a dat cele mai bune rezultate.
Picăturile de suspensie de spori au fost plasate pe frunze, iar după intervale diferite de
timp, frunzele au fost co lectate și fierte în alcool 95% , timp de 15 minute pentru a elimina
clorofila.
Au fost apoi lăsate în alcool 70% pentru a -și recăpăta frăgezimea.
Partea frunzei acoperită de picături de suspensie a fost tăiată și colorată în blue cotton
dizolvat în lactofenol.
Ciuperca preia vopseaua albastră, în timp ce țe suturile frunzei rămân necolorate. Câteva
ore în colorant sunt suficiente pentru a arăta stadiile timpurii de penetrare. Pentru etapele
ulterioare, hifele paralele sunt deja prezente, sunt obținute rezultate mai bune dacă bucățile sunt
lăsate în colorant p entru 48 sau chiar 72 de ore, deoarece difuzia colorantului cotton blue are loc
doar prin crăpăturile cuticulei și prin marginile tăiate ale frunzei. Bucățile de frunză au fost
montate în lactofenol. Difuzia colorantului continuă încet, în câteva zile obse rvându -se detalii
mult mai clare. Marele avantaj al acestei metode este că durează foarte puțin timp pentru a pregăti
un număr de preparate, iar fiecare preparat arată multe stadii de penetrare care pot fi observate în
detaliu și în toate fazele. Studiind anumite detalii citologice ale formării haustorului și ale
stadiilor ulterioare de penetrare descrise în serie s -au folosit secțiuni colorate cu Flemming’s
triple stain.
O altă serie de cercetărtori au folosit Diplocarpon rosae Wolf, care este stadiul perfect,
sexuat al ciupercii. Au fost colectate 2 izolate din Germania (G1) și 20 de izolate din Kenya (K1).
S-au utilizat folosit următoarele soiuri de trandafiri: trandafirul Floribunda ‘Fren sham’și 2
trandafiri Hybrid tea var. Claudia și var. R osita. Aceste soiuri s -au plantat în ghivece de cel puțin
17 cm diametru și 25 cm înălțime.
Pământul a fost compus din “mixul sp ecial Klasmann”: pământ de câmp : compost în
raport de 2:2:1 și 5 g îngrășământ “PlantoSan” (pentru trandafirul Floribunda ‘Fre nsham’), iar

19
trandafirii Hybrid tea au fost plantați în ghivece de 10.5 cm și în același mix, dar au fost adăugate
doar 2 g de îngrășământ.
Frunzele bolnave cu simptomele pătării negre care au fost prelevate din diferite locații au
fost incubate în came re umed e la temperatura camerei (20 -25°C) pentru 3 zile. Frunzele din
fiecare locație au fost incubate separat. Frunzele au fost spălate apoi cu apă sterilă, iar
concentrația conidiilor în suspensie a fost de 1 x 10-5 conidii/ml. Inoculul din fiecare locaț ie a fost
considerat un izolat pentru acea regiune.
Inoculările au fost făcute pe trandafirii intacți din ghivece și pe frunze detașate.

II.1.1. METODA INOCULĂRII PATOGENULUI PE PLANTE
 Plante intacte:
-trandaf irii în ghiveci au fost plasați peste noapte într -o cameră de incubare cu aproape
100% umiditate relativă și o temperatură de 20°C.
-plantele au fost apoi pulverizate cu o suspensie de conidii (1 x 10-5 conidii/ml) și
plasate la loc în camera de incubare pentru încă 2 zile.
-plantele au fost scoase din camera de incubare și mutate în seră.
-plantele de control netratate au fost pulverizate cu apă sterilă, distilată.
 Frunze detașate:
-au fost detașate cele mai tinere frunze de la plante și spă late cu apă de robinet timp de
10 minute și apoi sterilizate cu 3% hipoclorit de sodiu pentru 3 minute.
-frunzele au fost clătite în 3 rânduri cu apă distilată și plasate în hârtie de filtru sterilă,
umezită în vase Petri de 90 mm cu partea adaxi ală expusă așa cum descriu Palmer și colab.
(1966)
-frunzele au fost perforate, obținându -se discuri de 1 cm diametru și plasate pe hârtie de
filtru. Discurile au fost inoculate cu 5 μL picături de suspensie de conidii (5 x 10-4 conidii/ml) și
incubate la 20°C.
-plantele de control au fost inoculate cu 5 μL picături de apă distilată, sterilă.
Suspensia de conidii a diferitelor izolate, a fost folosită pentru a inocula 2 trandafiri
Hybrid tea . Modelul de creștere al izolatelor pe plante a fost comparat cu privire la rata

20
germinării și severitatea bolii. Procentul germinării pentru fiecare izolat a fost calculat,
folosindu -se o scală de 0 -100% pentru a determina severitatea bolii.

Scala a fost divizată în 5 clase de s everitate a bolii:
 0% -fără simptome
 1-20% -pete mai mici de 5 mm, fără îngălbenire și fără defoliere
 20-40% – pete mai mici de 5 mm, îngălbenire și/sau defoliere
 40-60% -pete de 5 -10 mm, fără îngălbenire și fără defoliere
 60-80% -pete de 5 -10 mm, îngălben ire și/sau defoliere
 80-100% -pete mai mari de 10 mm, îngălbenire și/sau defoliere
Rezultatele au fost folosite pentru a selecta izolate cu diferențe notabile în rata germinării
și severitatea bolii. Aceeași scală a bolii a fost folosită pentru a compara rata de creștere a
izolatelor reprezentative pe ambele plante intacte și frunze detașate, și la temperaturi de incubare
diferite, 10 -15-20-25°C. Numărul de zile necesare pentru exprimarea simptomelor pe frunzele
detașate și plantele intacte au fos t înregistrate. Pe frunzele detașate, 10 picături de inocul au fost
puse pe fiecare frunză, iar numărul de pete negre dezvoltate pe ele, a fost înregistrat. Frunzele
bolnave cu simptomele pătării negre au fost incubate într -o cameră umedă timp de 3 zile și apoi
păstrate la -20°C, pentru stocare pe termen lung. Pentru a forma o suspensie de conidii, frunzele
au fost decongelate apoi spălate cu apă distilată, sterilă, rezultând o suspensie cu concentrație 1 x
105 conidii/ml înainte de a fi folosite pentru ino cularea plantelor sănătoase. Pentru a multiplica
inoculul, frunzele detașate au fost inoculate, iar frunzele cu simptome complet dezvoltate au fost
stocate la -20°C.

II.1.2. UMIDITATE ȘI TEMPERATURĂ

Primele experimente de inoculare au fost încep ute cu scopul de a afla dacă ciuperca este
heterotalică . În acest experiment, un număr mare de frunze de diferite vârste și varietăți au fost
inoculate și au fost făcute observații pentru a determina timpul necesar apariției primului semn de
infecție. Numă rarea a fost făcută pentru numărul petelor, pentru numărul frunzelor afectate în
funcție de vârstă și varietate. Nu au fost observate diferențe importante la inocularea următoarelor

21
soiuri de trandafiri Red Radiance, Felicity, Radiance, Charles K. Douglas și Mrs. F. R. Pierson.
În cazul soiurilor Flammenrose și Henry Ford, infecțiile au apărut o zi -două mai târziu. În
general, 92% dintre inoculări au avut succes. Frunzele tinere au prezentat 100% infecție.
Un al 2 lea set de experimente a fost înc eput pentru a determina relația dintre umiditate și
temperatură și rapiditatea infecției. Inoculările au fost făcute pe un număr mai mic de frunze în
perioade ploioase la o temperatură de 22 -33°C. A fost înregistrată 100% infecție și pete ce au
apărut în a 3-a zi în majoritatea cazurilor sau în a 4 -a.
O altă serie de experimente a fost realizată pe 4 plante pentru a determina dacă este
suficientă asigurarea unei atmosfere umede sau dacă sporii trebuie să fie în apă. O plantă a fost
lăsată în seră a stfel încât picăturile s -au uscat la o oră după inoculare; alta a fost lăsată în seră
până când picăturile s -au uscat, apoi a fost plasată în camera de inoculare; a 3 -a plantă a fost
lăsată 20 de ore în camera umedă și apoi scoasă; a 4 -a plantă a fost ținu tă în camera umedă 3 zile.
În cazul primei plante unde sporii trebuie să fi germinat în atmosfera umedă a serei, petele au
apărut in zilele 5 si 6. Celelalte 3 plante au prezentat infecții din ziua 3. Din aceste serii de
experimente este evident că umidita tea atmosferică la o temperatură favorabilă este suficientă
pentru germinarea sporilor și apariția infecției. (Aronescu, 1934)
Frunzele detașate inoculate cu izolatele G1 și K1 au fost incubate la temperaturi diferite,
în scopul de a monitoriza efectul temperaturii asupra dezvol tării simptomelor bolii.
La 25° C, primele simptome au apărut la 4 zile pe frunzele inoculate cu oricare dintre
izolate (tabelul 2). Aceste simptome au fost: pete mici, negre si un acervul. La 5 zile de la
inocu lare, pe frunze au fost vizibile pete de aproximativ 1 -2 mm, iar numărul de acervuli per pată
a crescut. La 7 zile de la inoculare, o masă de conidii albe au putut fi observate pe petele de pe
frunzele inoculate cu oricare dintre izolate și frunzele au înc eput să se îngălbenească (tabelul
2). La 9 zile de la inoculare, s -au observat pete negre cu un diametru mediu de 10 mm. Frunzele
s-au îngălbenit, de asemenea, cu excepția zonelor cu pete (tabelul 2).
La 20° C, au fost vizibile primele simptome de boală, în a 5 a zi de la inoculare, pe
frunzișoarele inoculate cu oricare dintre izolate. 16 din cele 20 (80%) de frunzișoare inoculate cu
izolatul K1 au avut mai mult de 5 pete per frunzișoară, în timp ce pe cele inoculate cu izolatul
G1, toate cele 20 d e frunzișoare au avut mai puțin de 5 pete per frunzișoară. Pe frunzele
inoculate cu oricare dintre izolate, toate petele au avut un diametru mediu mai mic de 1 mm. În a
7-a zi de la inoculare, toate frunzișoarele inoculate cu izolat K1 au avut mai mult de 5 pete negre

22
cu acervuli per frunzișoară și în a 9 -a zi, diametrul mediu al petelor a fost de aproximativ 10 mm,
iar îngălbenirea a început să apară.
La 15° C, apariții slabe ale simptomelor au fost observate în a 7 -a zi când vasele Petri
conținâ nd frunzișoarele au fost ținute departe de lumină. În a 9 -a zi, 10 frunzișoare per izolat au
avut fiecare cel puțin o pată neagră. Nici una dintre frunzișoare nu a avut 5 sau mai multe pete
per frunzișoară , chiar și după 20 de zile de la inoculare. Nu au f ost observate simptome de boală
pe frunzele desprinse inoculate cu oricare d intre izolate și incubate la 10 °C, chiar și după 20 de
zile. Aceste informații sunt prezentate pe scurt în tabelul 2.

zpi Caractere
observate 10°C 15°C 20°C 25°C
Izolatul
G1 Izolatul
K1 Izolatul
G1 Izolatul
K1 Izolatul
G1 Izolatul
K1 Izolatul
G1
5 Diametrul
mediu al
leziunilor Fără
simptome Fără
simptome Fără
simptome Fără
simptome 1 mm 1 mm 1-2 mm
7 Formare
acervul Fără
simptome Fără
simptome Fără
simptome Fără
simptome Niciunul format format
9 Diametrul
mediu al
leziunilor Fără
simptome Fără
simptome 1 mm 1 mm 7 mm 10 mm 10 mm
Îngălbenirea
frunzei Fără
simptome Fără
simptome Fără
simptome Fără
simptome Da Da Da
20 Suprafața de
frunză
afectată(%) Fără
simptome Fără
simpto me <1 <1 60% 60% 60%
Tabelul 2: Dezvoltarea simptomelor pe frunze de trandafir detașate, inoculate cu izolate G1 și
K1 de Diplocarpon rosae , incubate la temperaturi diferite ( după Gachomo, 2005)

II.1.3. LUMINA

Alte experimente au fost făcute pe ntru a determina dacă plantele ținute în întuneric total
pot fi infectate. O plantă inoculată a fost mutată într -o cameră întunecată și o alta, de control
(martor), a fost plasată în lumină. Trei serii de experimente au fost făcute. În primele 2 serii,
plantele au fost scoase din camera întunecată la 3 zile după inoculare împreună cu planta de
control si duse în seră. Infecția a apărut în a 5 -a zi la planta de control și în a 6 -a zi la plantele
ținute în întuneric. În al 3 -lea experiment, plantele au fost lăsate 7 zile în camera întunecată.

23
Plantele au prezentat pete și acervuli dezvoltați după intervalul obișnuit de timp. Prin urmare,
lumina nu influențează foarte mult procesul de infecție.
Experimentele de inoculare, sugerează că cele mai bune con diții pentru infecție sunt: o
atmosferă saturată ș i o temperatură medie de 23 -26°C. În aceste cazuri, petele apar la 3 zile după
inoculare.

II.2. PREPARAREA MEDIILOR DE CREȘTERE

În cadrul experimentelor, s -au fost folosite 3 tipuri de medii art ificiale de creștere: PDA
(agar cu cartof -dextroză), BMA (biomalț agar) și MEA (agar cu extract de malț).
 PDA (agar cu cartof -dextroză) : 39 g PDA preparat industrial în 1000 ml H 2O sau pulpa
din 200 g cuburi de cartofi, 15 g dextroză și 20 g agar, în 1000 ml H 2O.
 Biomalț agar: 20 g biomalț și 20 g agar în 1000 ml H 2O.
 Agar cu extracț de malț: 30 g malt extract, 3 g peptone din boabe de soia și 15 g agar în
1000 ml H 2O.
La un litru de mediu artificial autoclavat și răcit au fost adăugate 50 mg din fiecare
antibiotic: sulfat de streptomicină, penicilină G, clorhidrat de clortetraciclină. 10 -15 ml din
fiecare mediu artificial au fost turnați în vase Petri. Vasele Petri au fost marcate pe partea
inferioară cu 4 puncte de marker permanent, iar mediul d e creștere de deasupra acestor puncte a
fost însămânțat cu 10 μL de suspensie conidială ce conține 1 x 104 conidii/ml. Vasele Petri
însămânțate au fost apoi incubate la 20°C. S -a tăiat mediul de cultură și s -a plasat pe lame
microscopice în 10 μL de dietan ol.
Lama a fost apoi observată sub lumină UV. Pentru a investiga modelul de creștere al
Diplocarpon rosae pe speciile genului Rosa, au fost folosite diferite tehnici microscopice și
histochimice. Evaluările microscopice au fost realizate cu ajuto rul microscopului optic și al unui
microscop electronic.

24
II.2.1. PRELEVAREA PROBELOR

Au fost prelevate probe la intervale de 4 h în primele 72 de ore de la inoculare pentru
observarea structurilor fungice post -germinare și pre -penetrare găsite pe suprafața frunzei și pe
mediul artificial de creștere. Au fost tăiate bucăți de frunză de 1 cm² de o parte și de alta a
nervurii principale și montate pe lame microscopice în 10 μL din 0.05% dietanol cu partea
adaxială pe lama de sticlă. Specimenele au fost evaluate fără decolorarea țesutului frunzei sau
fixarea țesutului fungic. Porțiuni de 1 cm² de mediu artificial de creștere a fost tratat în același
mod.
Eșantioanele de frunze de la plante sau frunze detașate au fost prelevate la intervale de 4 h
în primele 72 de ore de la inoculare. După a 3 -a zi de la inoculare, s -au prelevat eșantioane în
fiecare zi. Aceste probe au fost fixate în cloralhidrat și colorate înainte observațiile la
microscopul optic. Au fost tăiate bucăți de frunză de 1 cm² de o parte și de alta a nervurii
principale și montate pe lame microscopice. Aceeași metodă a fost folosită pentru a pregăti
frunzele căzute pentru observațiile microscopice.
 FIXAREA CU CLORALHIDRAT
A fost înlăturată clorofila din frunze pentru a putea observa și descrie strucuturile fungice
din interiorul țesutului frunzelor, apoi probele au fost colorate. Structurile frunzei au fost fixate
pe suprafața, iar frunzele au fost decolorate în cloralhidrat saturat (250 g/100 ml H2O) la 60°C
pentru cel puțin 3 zile. După ce clorofila a fost eliminată din frunze, probele au fost folosite
pentru evaluări microscopice.
 ÎNCORPORAREA ÎN RĂȘINĂ
Mostrele colectate de la frunzele inoculate la intervale de 4 ore în 48 -72 de ore de la
inoculare, și apoi zi de zi până la apariția simptomelor, au fost tăiate în bucăți mai mici de 2 x 4
mm². Acestea au fost plasate în soluție fixatoare de 8% formaldehidă : 8% glutaraldehidă : 0.2 M
agent de tamponare -acid cacodilic și 0.005 g clorură de calciu (Karnovsky, 1 965) pentru minim 2
ore la temperatura camerei. Tuburile eppendorf care conțineau fragmentele tăiate în soluție

25
fixatoare, au fost plasate într -un borcan etanș de sticlă conectat la o pompă de apă pentru a
permite soluției fixatoare să pătrundă rapid și să fixeze structurile din secțiunile de frunză și
pentru a înlătura excesul de aer din fragmentele de frunză.
Mostrele au fost apoi spălate de 10 ori în acid cacodilic și apoi fixate în 2% tetraoxid de
osmiu pentru 1 -2 ore, potrivit lui Dalton ( 1955). Acesta crește absorbția electronilor și duce la un
contrast mai bun. Mostrele au fost apoi spălate de 8 ori în acid cacodilic pentru 20 de minute per
clătire urmate de deshidratare prin creșterea concentrației de etanol. La final, mostrele au fost
clătite de 2 ori cu oxid de propilenă pentru 10 minute fiecare. Aceste spălări au fost urmate de
infiltrarea mostrelor în rășină și apoi polimerizate.

II.2.2. SECȚIONAREA
 SECȚIUNI SEMI ȘI ULTRA -SUBȚIRI
S-au tăiat secțiuni semi -subțiri de 500 nm grosime cu ajutorul unui cuțit de sticlă 45° și
apoi suspendate direct în apă distilată. Secțiunile semi -subțiri au fost ulterior suspendate în apă
distilată pe o lamă de sticlă, se u sucă pe o placă electrică la 70° C și se colorează în albastru de
toluidină 0,05% în tampon fosfat 0,01 M (pH 7,4). Secțiunile au fost clătite cu apă de la robinet
pentru a îndepărta excesul de colorant, urmată de o clătire în apă demineralizată și în xilen timp
de 5 minute fiecare. Secțiunile au fost montate și sigilate în medii Entellan (Merck) și lăsate să se
usuce peste noapte într -o cameră de fum înainte de a fi privite sub câmpul luminos al unui
microscop optic.
Când observațiile sub microscopul optic au confirmat prezența structurilor dorite în
secțiunile semi -subtiri, secțiuni ultra -subțiri au fost tăiate din același capăt al blocului precum
secțiunile semi -subțiri. Secțiunile ultra -subțiri (70 -75 nm grosime) au fost tăiate cu un Reichert –
Jung ultramicrotom Ultracut E de 70 -72 nm grosime cu ajutorul unui cuțit de diamant (Sitte
1982, 1985) și plasate pe grile de cupru sau nichel.

 CONTRASTĂRI
Secțiunile ultra -subțiri au fost apoi contrastate. Intensific area contrastului înaintea
observațiilor sub microscopul electronic a fost realizat prin utilizarea materialului dens de

26
electroni sub formă de săruri de metale grele. Contrastarea a fost realizată în conformitate cu
Geyer (1973). Grilele au fost puse în p icături de 2% acetat de uranil, saturat, timp de 8 minute și
apoi clătite de două ori în apă bidistilată, apoi puse în picături de soluție de acetat de plumb
(Reynolds 1963) timp de 2 minute și clătite în 2 schimburi de apă bidistilată. Grilele au fost lăs ate
să se usuce la aer înainte de a fi stocate într -o cutie de grilă, la temperatura camerei. Contrastarea
a fost realizată într -un vas Petri întunecat, căptușit cu parafilm. Grilele au fost apoi observate la
un microscop electronic cu transmisie, Zeiss EM 109.

II.3. TEHNICI DE COLORARE

 BLANKOPHOR
Germinarea conidiei și formarea structurilor de pre -penetrare au fost confirmate prin
colorarea specimenului cu colorantul fluorescent blankophor. Același colorant a fost folosit
pentru a colora stru cturile fungice pe medii artificiale de creștere. Blankophorul se leagă de
polizaharide cu legături β-glicozidice. Aceast colorant nu pătrunde în cuticula plantei, leagă
peretele celular al agentului patogen de suprafața plantelor, astfel încât conidiile , tuburile
germinative și apresorul sunt fluorescente sub lumină UV. Mici blocuri de mediu artificial pe
care a crescut ciuperca au fost montate în 10 μl de soluție 0.1% blankophor în 10% etanol înainte
de a fi observate. Proba a fost acoperită cu o lamelă și observată la microscopul Leitz.

 DIETANOL (Uvitex 2B)
Pentru a determina rata de germinare și pentru a descrie structurile fungice de pre –
penetrare găsite pe suprafața frunzelor, probe de frunze proaspete precum blocuri de mediu
artificial au fost colorate în 10 μl de 0,05% diethanol. Dietanolul se leagă de polizaharide cu
legături β-glicozidice. Colorantul nu pătrunde cuticula plantelor, de aceea colorează peretele
celular al agentului patogen de pe suprafața plantelor, astfel încât conidi ile, tuburile germinative
și apresorul de pe suprafața plantei sunt fluorescente sub lumină UV. Probele proaspete au fost
montate în 10 μl de 0,05% dietanol înainte de a fi observate. Proba a fost acoperită cu o lamelă și
observată la microscopul Leitz.

27

 ACID FUCSINIC
Dezvoltarea agentului patogen în țesutul vegetal și reacția de apărare a plantelor la invazia
patogenilor după diferite intervale de timp de la inoculare au fost descrise după observarea
frunzișoarelor fixate și decolorate cu clor alhidrat și apoi colorate cu acid fucsinic. Acidul fucsinic
se leagă de carbohidrați. Colorează conținutul celulei patogene si mezofilul deteriorat al celulelor
plantei.
Acidul fucsinic colorează carbohidrații și structurile fungice în roz. Probel e care au fost
fixate și decolorate cu cloralhidrat au fost colorate timp de 12 ore în acid fucsinic 0,01% (Merck)
în lactofenol. Probele care au fost colorate foarte intens au fost lăsate în soluție de cloralhidrat
până când s -a obținut nuanța dorită. Bucăți mici de 1 cm² au fost tăiate din frunzulițe și montate
în lactofenol . Piesele de frunze au fost observate la microscopul de contrast prin interferență.

 ALBASTRU DE ANILINĂ
Anilina se leagă la diferiți glucani de origine vegetală și fungic ă (Nicholas și colab 1994,
Van Sengbusch și colab, 1983) și la polizaharidele plantelor (Smith și McCully, 1978). Asocierea
sa puternica cu β-1,3-glucani, cum ar fi caloza se datorează împachetării slabe ale acestui
polimer, oferind astfel o mai mare acce sibilitate a fluorocromului la aceștia. A fost utilizată o
modificare a metodei de preparare descrisă de către Hood și Shew (1996).
Frunzișoarele care au fost fixate și decolorate în cloralhidrat saturat au fost lăsate să stea
timp de 1 -2 ore în 1 M KOH. Frunzișoarele au fost apoi clătite de două ori în apă și o dată în
soluție 0,067 M K2HPO 4 la pH 9,0 (tampon). Frunzișoarele au fost lăsate să rămână peste noapte
în soluție tampon și apoi au fost colorate timp de 10 -20 min în 0,05% albastru de anilină (Serva)
în 0,067 M K2HPO 4. Ele au fost apoi montate în tampon sau în glicerol 50% în tampon la pH 9,0
cu suprafața abaxială pe sticlă. (Baker și colab., 1995)

 ALBASTRU DE TOLUIDINĂ
Albastrul de toluidină este un colorant metacromatic c are colorează fenolii, polizaharidele
precum și alte macromolecule, oferind tonuri de culoare diferită. Deoarece aproape toate
structurile plantei și patogenului preiau colorantul, efectele metacromatice precum colorarea

28
verde -albastru a structurilor care conțin fenoli pot fi diferențiate numai pe preparatele
secționate. Secțiunile semi -subtiri au fost colorate cu 0,1% (g / v) albastru de toluidi nă în tampon
fosfat 0,01 M (pH= 7) timp de 1 minut, apoi clătite o dată în apă de la robinet și de două ori în
H2O demineralizat. Celulele plantei și structurile fungice se colorează violet și pot fi ușor
diferențiate sub microscopul optic. Secțiunile au fost apoi montate și sigilate în Entellan (Sigma).

II.4. RATA GERMINĂRII

La 20° C, izolatul G1 a avut o rată medie de germinare de 78,3%. Dintre toate conidiile
germinate, 14,07% au format mai mult de un tub germinativ per conidie, iar 7,36% au format
tuburile germinative din ambel e celule ale conidiei (Figura 7 ). Izolatul K1 a avut o rată de
germinare medie de 57,9%, iar 20,83% din conidiile germinate au format mai mult de un tub
germinativ per conidie. O medie de 7,86% din conidiile germinate au germinat din ambele celule
(MSTAT, teste multiple Gama Duncan) .

Figura 8 : Rata de germinare ( %) a conidiilor de Diplocarpon rosae din izolatele G1 și K1 pe
frunze de trandafir: Procentul de conidii care au format mai mult de un tub germinativ (TG) și
cele care au format tuburi germinative din ambele celule ale unei conidii. (după Gachomo, 2005)
0102030405060708090
Germinare Mai mult de un TG TG din ambele celuleNumăr de conidii (% )
G1 K1

29
CAPITOLUL III . STUDII MICROSCOPICE ALE PROCESULUI DE
INFECȚIE

III.1. GERMINAREA CONIDIEI ȘI FORMAREA APRESORULUI

Inoculul a fost compus din două celule conidiale. Cele două celule conidiale au germinat,
rezultând unul sau mai mul te tuburi germinat ive (Figur a 9a și b), la 9 de ore de la inoculare.
Tubul germinativ a fost uneori separat de conidie printr -un perete despărțitor (Figura 9 a).
Lungimea tubului germinativ a variat de la foarte scurt la foarte lung. În cazul in care tubul
germinativ era foa rte scurt, la nivelul conidiei a fost observată o extensi e a peretelui celular
(Figura 9e și 10 b) sau a fost găsi t direct sub conidie (Figura. 9c și 10 a). Germinația a avut loc în
orice loc de pe suprafața conidiei. Capătul distal al tubului germinativ a d evenit lărgit și rotunjit
pentru a forma apresorul (Figura 9 a) sau tubul germinativ a pătru ns direct în cuticulă (Figura 9b
și 10 b), adică apresorul nu a fost întotdeauna format. Unde a fost constituit un apresor, era uneori
separat de tubul germinativ de către un sept. Pe suprafața apresorului care a fost în contact cu
cuticula, un cui penetrant cu un diametru foarte mic a fost format. Pe Figura 9f se poate vedea
porul prin care cuiul penetrant crește. Ciuperca a penetrat gazda cu ajutorul cuiului penetran t.
Peretele apresorului în contact cu suprafața frunzei și cel al porului sunt mai groși decât per etele
celular al conidiei. Pereț ii conidiei și ai apresorului s -au colorat cu acid fucsinic (0,05%), dar
unde a avut loc penetrarea, conidia nu s -a col orat cu acid fucsin ic (Figura 10 c). Inelele de culoare
maro au fost obser vate în jurul porului (Figura 9 c și d). Numai germinarea conidiei, creșterea
tuburilor germinative și formarea apresorului au avut loc pe suprafața frunzei, creșterea
ciupercilor ulterioare după penetrarea cuticulei a survenit între cuticula inferioară și superioară a
frunzei. Nu au fost găsite hife pe suprafața frunzei.

III.2. PENETRAREA CUTICULEI ȘI CREȘTEREA ÎN ȚESUTUL PLANTEI GAZDĂ

După penetrare, cuiul penetrant a format o veziculă de infecție ( Figura 10 b-d) vizibilă în
spațiul subcuticular și parțial trecută prin peretele periclinal al celulei epidermice de mai jos. La
punctul de penetrare, peretele celulei epidermice de mai jos a reacționat prin formarea unei papile
pe pa rtea interioară a peretelui celular. La site -ul de penetrare, peretele a fost retezat fără

30
deformare interioară, iar peretele din jurul porului de penetrare a fost diferit de restul peretelui
celular al plantei gazdă (Figura 10 f). Peretele periclinal al ce lule epidermice de bază a fost
dizolvat înainte de structura ciupercilor, dar membrana plasmatică părea intactă. Efectele cuiului
penetrant pe peretele periclinal al celulei au laterale și verticale așa c um pot fi observate în Figura
9f. Straturile opace d e electroni au fost observate între apresor și cuticulă, în straturile superioare
ale peretelui celular al gazdei mai jos de punctul de penetrare, și în straturile joase ale peretelui
celular al gazdei chiar deasupra membranei plasmatice a celulei epidermi ce (Figura 10 f). Peretele
celular al gazdei de sub punctul de penetrare a crescut în diametru și și -a modificat prop rietățile
de colorare (Figura 10 e). Hifele au crescut din vezicula de infecție. A crescut în spațiul
subcuticular și unele ramuri din regiun ea intercelulară dntre celulele epidermice și rar în peretele
periclinal al celulelor epidermice. (Aronescu, 1934)
Majoritatea hifelor primare au crescut în spațiul subcuticular și în straturile superioare ale
peretelui periclinal al celulei epi dermice, în timp ce unele au crescut în spațiile intercelulare
dintre celulele epidermice. Hifele subcuticulare s -au multiplicat si răspândit rapid, radiar de la
punctul de penetrare spre periferia frunzei. Aceste hife subcuticulare, s -au răspândit inițial lateral
fără a invada celulele epidermice de sub ele. Peretele periclinal celular sau în apropierea lui unde
miceliul a crescut, este mai larg și colorat în violet descchis, spre deosebire de părțile neinfectate
ale plantei unde peretele celular s -a color at în violet închis când a fost colorat cu albastru de
toluidină (Figura 10 e). Cuticula de deasupra fiecărui rând de hife subcuticulare primare a fost
împinsă ușor în sus.
Hifele subcuticulare primare au crescut în strânsă asociere cu celelalte î n perechi sau
grupuri de trei sau mai multe hife paralele care au fost pute rnic apăsate împreună (Figura 10 a).
Deși hifele au grescut în direcție radiară din punctul de penetrare, s -au întâlnit în mai multe
puncte pentru a forma ceea ce părea a fi o rețea de hife subcuticulare. 2 fascicule se întâlnesc,
pentru a forma un fascicul mai mare adică un fascicul și -a schimbat direcția de creștere prin
separarea hifelor sale constituente. Aceste hife s -au separat pentru a se dezvolta în două direcții
opuse dar par alele și în strânsă cooperare cu celelalte fas cicule care au aderat (Figura 11 c). O
nouă ramură hifală a apărut prin subdivizarea celulei parentale de la capătul distal al hifei pentru
a produce 2 noi hife, care au continuat să crească împreună alăturate, în timp ce noi fascicule au
apărut din hife care inițial creșteau una lângă cealaltă și care s -au separat pentru a crește la un
unghi ascuțit una de cealaltă și față de fasciculul principa l (Figura 11 a). Fiecare hifă dintr -un

31
fascicul s -a ramificat indepe ndent. (Gachomo, 2005)
Cât hifele subcuticulare s -au răspândit de la punctul de penetrare, dând naștere unor noi
hife intercelulare la câteva intervale pe lungimea lor. Aceste hife intercelulare au crescut în părțile
inferioare ale țesutului gazdă. Peretele hifelor subcuticulare a fost inițial neted pe toată lungimea
lui când au fost observate la microscopul optic, dar pe măsură ce boala avansa, peretele se pliază
sau se curbează în mai multe puncte de -a lungul pereților externi ai hifelor. În acest e puncte,
diametrul hifelor a crescut, și a rezultat o celulă mare a hifelor subcuticulare, formâ ndu-se o hifă
îngustă (Figura 11 f). Aceasta a penetrat peretele periclinal al celulei epidermice, fie pătrunzând în
celula epidermică de sub ea pent ru a forma un haustor (Figura 12 b), fie crescând ca o hifă în
perete le celular periclinal (Figura 11 f). O hifă îngustă s -a format dintr -o hifă subcuticulară care s –
a lărgit în afara peretelui celulelor epidermice și apoi a pene trat peretele celular (Figura 11 d)
pentr u a forma un haustor pe partea interioară. Prin urmare, miceliul subcuticular a invadat direct
celulele epidermice pentru a forma haustori. Mulți haustori au apărut dint -un punct al hifei dintr –
un fascicul și s -au format într -o sin guă celulă epidermică (Fi gura 12 a).
La punctul de penetrare, unele hife primare care au apărut din vezicula de infec ție, au
crescut în lamela mijlocie într e celulele epidermice (Figura 12 c și d). Aceste hife intercelulare au
fost septate. Hifele intercelulare au crescu t în jos către partea inferioară a țesutului frunzei ,dar și
lateral între celulele epidermice, astfel că o celulă epidermică era aproape închisă de hifele
intercelulare. Creșterea hifelor intercelulare a fost asociată cu dizolvarea totală sau parțială a
pereților anticlinali prin creșterea progresivă spre părțile inferioare ale țesutului frunzei (Figura
12c). Din când în când, o ramură din hifele intercelulare invadează peretele adiacent al celulei
epidermice pe ntru a forma haustori (Figura 12e, f și 13 a) sau a continuat să crească ca o hifă pe
partea interioară a peretelui celular, dar la exterior d e membrana plasmatică (Figura 14 a). Hifele
intercelulare și cele care cresc pe partea interioară a peretelui celulei epidermice, au crescut
treptat spre celulel e palisadice din mezofil pent ru a forma o haustori (F igura 14 a și b).
La punctul de invazie a celulelor din mezofil, diametrul peretelui celulei gazdă în jurul
punctului de penetrare a fost mai mic decât cel al p eretelui înconjurător (Figura 13 f). Hifa ce
crește pe partea interioară a peretelui celulei epidermice a pătruns în peretele dublu al celulei
(peretele celular epidermic și palisadic) pentru a forma haustori pe partea interioară celulei
palisadice (Figura 14 a). La punctul de invadare al celu lei, hifa penetrantă s -a redus drastic în
diametru, iar peretele celular al gazdei din jurul hifei penetrante a devenit foarte subțire.

32
Secțiunea de hifă penetrantă care a crescut pe partea interioară a peretelui a format gâtul
haustorului. Celula palisadi că a reacționat la această invazie prin formar ea unei caloze groase
(Figura 13 b și f) prin care hifa penetrantă a crescut înainte de a se extinde la corpul haustorului la
capătul distal.
Într-un stadiu avansat al bolii, unde stratul palisadic din mezofil a fost invadat și miceliul
subcuticular s -a răspândit în mare masură, ramurile hifelor intramurale au fost formate din hifele
subcuticulare în pereții periclinali a i celuleor epidermice (Figura 14 c). Celula hifei subcuticulare
din care a fost form ată hifa intramurală s -a lărgit înainte de invadarea peretele intramural pentru a
forma hifa intramurală (Figura 11 d). Inițial, hifele intramurale au fost observate în pereții unor
celule epidermice, dar la două zile după ce au inceput să se formeze, au fo st observate în aproape
toți pereții periclinali ai celulelor din zona acoperită de miceliul subcuticular. Creșterea fiecărei
hife intramurale a fost limitată la regiunea dintre pereții anticlinali ai unei singure celule, adică
fiecare hifă intramurală s -a extins numai peste o singură celulă. La intrarea în contact cu peretele
anticlinal, formează haustori în fiecare celulă epidermică adiacentă (Figura 14 e). Rareori,
haustorii s -au întins sub celula epidermică din hifele intramurale ce crește în peretele p ericlinal
înainte de a veni în contact c u peretele anti clinal (Figura 14 d). Celula terminală a hifei
intramurale s -a mărit în afara peretelui celulei gazdă înainte de penetrare (Figura 14 f).

III.3. FORMAREA HAUSTORILOR ȘI A HIFELOR INTRACELULARE

Structurile asemănătoare cu un haustor au fost formate în celulele epidermice și palisadice
invadate de ciupercă, aceste structuri sunt menționate ca haustori în studiu. Haustorii inițiali au
fost formați în celulele epidermice din miceliul intercelu lar. Aceștia au fost formați foarte
devreme în dezvoltarea bolii, adică în primele 24 de ore de la inoculare. Hifele subcuticulare care
creșteau progresiv de la punctul de penetrare, au format următoarea serie de haustori în celulele
epidermice. Miceliul s ubcuticular a format haustori la intervale de timp, pe lungimea hifelor în
celulele epidermice de sub ele. Hifele unui singur fascicul, în cele mai multe cazuri,a format
haustori aproape în același timp, într -o singură celulă epidermică de sub ele. Prin ur mare, într -o
singură celulă epidermică se pot găsi haustori de di ferite mărimi și forme (Figura 13a).
La un stadiu avansat al bolii, haustorii s -au format în celulele epidermice din miceliul
intramural care crește în perete periclinal al celul elor epidermice. Această serie de haustori din

33
hifele intramurale a fost formată înainte de începerea procesului de reproducere. Un haustor a fost
închis de o parte a membranei plasmatice a gazdei, care s -a curbat în jurul acesteia. Această parte
a membran ei a fost numită membrană e xtrahaustorială (MEH) (Figur a 13 c). Între corpul
haustorului și MEH se află o matrice extrahaustorială (XEH). Unii haustori au fost foarte lungi
(> 30 µm) cu aspect de hife intracelulare, dar cele două ar putea fi diferențiate u nele de altele prin
faptul că hifele intercelulare nu au regiuni de gât. Haustorii tineri erau mici în dimensiune, dar
mai tarziu s -au mărit pentru a ocupa întreaga lungime a celulei gazdă.
În timpul stadiului avansat al dezvoltării bolii, hif ele cu diametru mic au fost formate din
miceliul intercelular și au crescut prin lumenul celulei. Aceste hife intracelulare se disting de
celelalte hife prin faptul că au un diametru mult mai mic . Acestea nu au regiune de gât specifică
haustorilor și prin urmare nu se confund cu aceștia. Hifele intracelulare inițiale formate într -o
celulă, au fost închise î ntr-o teacă de caloză (Figura 15 c), dar cele formate mai târziu erau
înconjurate de un strat opac de ele ctroni (Figura 15 d). Aceste hife intracelulare s e întind de la un
capăt al celulei spre celălalt și câteva hife intracelulare au fost găsite într-o singură celulă (Figura
15b). De asemenea, hifele intracelulare au crescut d e la o celulă la alta (Figura 15 d). În punctul în
care penetrează celula învecina tă, vârful hifei de penetrare a fost mult redus în diametru,iar
peretele celulei gazdă a fost local degradat. Secțiunile longitudinale au arătat că în aceste stadii
avansate ale bolii, celulele gazdă își pierd integritatea pe măsură ce sunt invadate de hif ele
intracelulare. Atunci când o celulă epidermică a fost complet ocupată de hifele
intracelulare,organitele celulare nu mai erau vizibile. Celula a fost redusă la o simplă schiță cu
peretele celular începând să se dezintegreze ușor (Figura 17 f). Hifele i ntracelulare erau găsite în
principal în celulele epidermice si foarte puține au fost găsite în celulele palisadice. În infecții
mai vechi, au fost găsite mai multe hife subepidermale intracelulare. În frunzele căzute, numărul
de hife intracelulare per ce lulă gazdă au crescut (Figura 17 d).

III.4. SPORULAREA

În stadiul avansat al bolii, după începerea formării hifelor intracelulare, s -au format
prelungiri în formă de degete la intervale diferite de timp, de -a lungul hifelor subcuticulare
(Figu ra 15 e). Aceste prelungiri au avut celule mai scurte decât hifele, au crescut radiar de la un
punct al hifei, și s -au ramificat dichotomic pentru a da aspectul unui evantai .Această structură în

34
formă de evantai a devenit baza unui acervul (Figura 16 c și f). Conidia cu două celule a fost
separată de conidiofor printr -un sept. Celula îngustă și cu vârf ascuțit a conidiei era atașată de
conidiofor, pe când celula cu vârf mai rotunjit era orientată în sus (Figur a 16c). Conidiforul a
fost foarte scurt și numa i o singură conidie a fost tăiată de la fiecare conidiofor. În citoplasma
conidiilor cu 2 celul e, se observă vacuole (Figura 16 c și f). În același acervul ce conține conidii
formate din 2 celule, au fost găsite microconidii formate dintr-o singură celulă (Figura 16 c și f).
Microconidiile sunt mai scurte și mai înguste decât conidiile formate din 2 celule și se găsesc pe
conidiofori diferiți de cei pe care se găsesc conidiile. Microconidia se deosebea de celelalte celule
rotunde care au fost de asemenea găs ite în fiecare acervul.
Acoperișul acervulilor era cuticula plantei. La formarea conidiilor, în acervuli, cuticula a
fost împinsă în sus pentru a forma o structură în formă de cupolă care era mai mult sa u mai puțin
simetrică (F igura 16 a). Acervulii aveau un aspect de mici puncte negre când au fost observate cu
ochiul liber. Sub pavilionul acervulului au fost găsite conidiile și conidioforii, baza acervulului
era formată din prelungirile miceliene în formă de deget și o parte din hifele subcuticulare din
care s -a format stroma acervulului. Imediat după formarea conidiilor, stroma acervulilor a devenit
maro închis (Figura 16 d). Această brunificare a fost responsabilă pentru înnegrirea locului
infectat care dă aspectul de pete negre specifice bolii. Când acoperișul acervulului se rupe, masa
de conidii m ature i ese la exterior (Figura 16e și 17 a). Microfotografiile MET ale acestor frunze
au arătat că ciuperca a penetrat cuticula inferioară a frunzei și a ajuns în celulele epidermice. În
jurul hifelor s -a format un perete gros de caloză, astfel că nu au reușit să treacă dincolo d e
celulele epidermice (Figura 18 d).

III.5. VERNALIZAREA

Frunzele de trandafir infectate cad relativ ușor cu o ușoară atingere de deget sau adiere de
vânt. Unele frunze bol nave au rămas atașate de plantă în timpul iernii. S -a observat
anastomozarea hifelor subcuticulare și acervuli subcuticulari care conțin conidii. Pereții hifali
subcuticulari erau de culoare maro și mai groși decât pereții hifelor normale, adică au fos t
puternic melanizați (Figura 18 e). Structuri rotunde spre ovale, închise la culoare, cu suprafața
exterioară ornamentată, s -au format din pereții groși ai miceliului subcuticular și din miceliul
prezent în celulele epidermice. Aceste structuri păreau goale ș i aveau pereți groși care au f ost

35
dificil de zdrobit (Figura 1 9a). În unele cazuri, hifele subcuticulare melanizate puternic, au tăiat 2
celule asemănătoare cu structura conidiei (Figura 18 f). Secțiunile semi -subțiri au arătat că
țesuturile plantei au fost puternic degenerate,iar în celulele epidermice au fost găsite multe
structuri rotunde ornamentate. Aceste structuri erau u mplute cu celule mici (Figura 19 b). În alte
secțiuni , structuri cu formă de apotecii au fost o bservate sub epidermă (Figura 19 c). Pe tulpină au
fost observate conidii germinat e, hife subcuticular e (Figura 19e ), haustori în celule și acervuli
deschiși din care au ieșit conidii (Figura 19f ).

Figura 9 : Imagini cu Diplocarpon rosae la microscopul optic – C=conidie, TG= tub germinat iv,
S=sept, A=apresor, IM=inel de culoare maro, PP=por de penetrare (după Gachomo, 2005)

36

Figura 10 : Imagini cu Diplocarpon rosae la microscopul optic și electronic – C=conidie,
PTG= pereții tubului germinativ, V=veziculă, PP=por de penetrare, HP= hifa primară, SP=site de
penetrare (după Gachomo, 2005)

37

Figura 11 : Imagini cu Diplocarpon rosae la microscopul optic și electronic : (a)- hife
subcuticulare , (b)- celulele lărgite formate înainte de penetrarea celulelor epidermice de sub
hifele subcut iculare, (c)-fascicule de hife subcuticulare, (d) H=hifă formată de hifele
subcuticulare, (e) unirea fasciculelor de hife, (f) invadarea peretelui de hifa subcuticulară (după
Gachomo, 2005)

38

Figura 12 . Imagini cu Diplocarpon rosae la microscopul optic și electronic – CH= corpul
haustorului, GH= gâtul haustorului, HI=hifă intercelulară, H=haustori (după Gachomo, 2005)

39

Figura 13 . Imagini cu Diplocarpon rosae la microscopul optic și electronic – C=caloză,
H=haustor XEH= matrice extrahaustorială (XEH ), MEH= membrana extrahaustorială, IC=hifă
intracelulară (după Gachomo, 2005)

40

Figura 14 . Imagini cu Diplocarpon rosae la microscopul optic și electronic – HY= hifă,
H=haustori HI=hifă intercelulară , IM= hifă intramurală (după Gachomo, 2005)

41

Figu ra 15 . Imagini cu Diplocarpon rosae la microscopul optic și electronic :(a)- înnegrirea unor
celule din mezofil la invazia ciupercii , (b)- hife intracelulare în celula epidermică, (c)- hife
intracelulare inițiale din celule epidermice închise în dop calozic , (d)- hifă intracelulară în celula
epidermică invadează mezofilul celulei subadiacente, (e)- prelungiri în formă de degete crescând
de la hifele subcuticulare pentru a forma baza acervulilor, (f)- stroma acervulilor. (după
Gachomo, 2005)

42

Figura 16 . Imagini cu Diplocarpon rosae la microscopul optic și electronic : (a)-acervul în
creștere , (b)-conidii în acervul, (c)-acervul matur cu microconidii și conidii, (d)-înnegrirea
acervulului, (e)-acervul matur deschis la partea apicală, (f)-conidii mature cu p erete despărțitor
între celulele conidiale (după Gachomo, 2005)

43

Figura 17 . Imagini cu Diplocarpon rosae la microscopul optic și electronic : (a)-acervul matur
deschis la partea apicală, (b)-acervuli deschiși în diferite puncte, (c)-acervul cu stroma î n
creștere, (d)- miceliu intracelular, (e)-hife intracelulare în celulă epidermică, (f)-hife intracelulare
în celulă epidermică cu o ușoară dizolvare a peretelui celular (săgeată). (după Gachomo, 2005)

44

Figura 18 . Imagini cu Diplocarpon rosae la micro scopul optic și electronic: (a)-miceliu
subcuticular crescând în jurul unei stomate pe suprafața inferioară a frunzei, (b)-H=haustori în
celulele stomatice, (c)-Ac=acervul, S=stomată, (d)-închiderea hifelor cu dop calozic în celule
epidermice, (e)-înnegrir ea miceliului subcuticular, (f)-structuri asemănătoare conidiilor (după
Gachomo, 2005)

45

Figura 19 . Imagini cu Diplocarpon rosae la microscopul optic : (a)-structură puternic
ornamentată în frunzele vernalizate, (b)-SF=structuri fungale, (c)-structură sub epidermică
formată în frunze vernalizate, (d)-structur ă puternic ornamentată cu o deschizătură la un capăt
(săgeata), (e)-hife paralele formate sub cuticula tulpinii de trandafir, (f)-C=cuticulă, Ac=acervul
format pe tulpină. (după Gachomo, 2005)

46
CAPITOLU L IV . MATERIALE ȘI METODE DE LUCRU

MATERIALUL BIOLOGIC

Cercetările noastre s-au axat pe observarea structurilor fungice specifice ciclului de via ță
al lui Diplocarpon rosae Wolf din colecția de trandafiri a Grădinii Botanice “Dimitrie Brândză”
din București.
Colectarea materialului biologic s -a realizat în vara anului 2016 și 2017. S -au recoltat
frunze și tulpini de pe 2 soiuri de trandafir: Golden Gates și Queen Elizabeth care prezentau
simptomatologia specifică pătării negre.
În urma prelucrării prin metode fitopatologice și micologice, s -au efectuat lame
microscopice cât și medii artificiale de creștere. (Tuite, 1969; Rapilly, 1968)

Fig. 20. Queen Elizabeth (după Gherghinescu, 2014)

47

Fig. 21. Golden Gates (https://www.edmundsroses.com/C/8/ClimbingRoses )

Alte materiale :

 Vase Petri cu diametru de 7 cm
 Balon Erlenmeyer
 Ansă
 Lame și lamele din sticlă
 Cilindrii gradați
 Pipetă

Aparat ură:

 Preparatele microscopice au fost analizate cu ajutorul microscopului fotonic
Belphotonics Bio 1B
 Cameră foto digitală DSLR Canon 400D
 Stereomicroscop (Optika SZM -1);
 Microscop optic
 Lupă

48
PREPARAREA MEDIILOR DE CULTURĂ

 Mediul PDA (Cartof -dextroză -agar)

A B C D E F G H
Cartofi 200
g 200 g 22 g 40 g 200 g 200 g 200 g 200 g
Dextroză 20 g 20 g 10-20 g 5 g 20 g 20 g 5 g 20 g
CaCO 3 – 0,2 g – – – – – –
MgSO 4 7H₂O – 0,2 g – – – – – –
Actidionă – – – – 200
ppm – – –
Streptomicină – – – – 10 ppm 100 µg/ml – 35 ppm
Aureomicină – – – – – – 30 ppm 35 ppm
Vancomicină – – – – – 50µg/ml – –
Tergitol – – – – – – 200
ppm 100
ppm
Agar 20g 20 g 15-17 g 17 g 20 g 20 g 20 g 20 g
Apă 1000 ml
Tabel 3 . Prepararea mediul ui de cultură PDA (după Consta ntinescu, 1974)

Mod de preparare : cartofii sunt spălați șu curățați, apoi sunt tăiați în cuburi de 12 mm. Se
cântăresc 200 g, se fierb timp de o oră și pe urmă sunt sfărâmați. Pulpa obținută este strecurată
prin intermediul unei site sau tifon, s e adaugă agarul împreună cu care se fierbe până la dizolvare.
Se completează cu dextroză și 1000 ml apă distilată, se amestecă bine, după care este turnat în
vasele Petri. Mediul se acidifiează cu 3 -5 picături de acid lactic 25%.

49
 Mediul YPG (drojdii -peptonă-glucoză)

A B C D E F
Extract
drojdii 4 g 3g 4 g 3 g 10 ml (sol. 1%) 10 g
Extract malț 10 g 3 g – 3 g – –
Peptonă – 5 g – 5 g – 20 g
Glucoză – 200 g 20 g 10 g – 20 g
Dextroză 4 g – – – – –
K2HPO 4 – – 1 g – 10 ml (sol. 0,1%M) –
MgSO 4 7H2O – – 0,5 g – 3 ml (sol. 10%) –
NH 4NO 3 – – – – 10 ml (sol. 10%) –
NaOH – – – – 2-4 ml (sol.
0,1%M) –
Agar 10 g 20 g – 20 g – –
Apă distilată 1000 ml
Tabel 4 . Prepararea mediului de cultură YPG (după Constantinescu O., 1974)

METODE DE LUCRU

1) Metode mi cologice și fitopatologice
– colectarea materialului biologic
– examinarea zonelor afectate la stereomicroscop
– izolarea agentului fitopatogen de pe aparatul foliar și tulpini
– inocularea agentului fitopatogen pe medii le de cultură
– conservarea în alcool 70%

50
– examinarea și analiza microscopică a ciupercii
– identificarea speciilor izolate
Pentru început, am urmat un protocol de dezinfectare a eșantioanelor din ramurile
bolnave de la trandaf irii studiați ( Queen Elizabeth, Golden Gates ):
 spălare cu apă curentă (10 secunde);
 spălare cu 100 ml apă distilată sterilă în c are au fost puse 3 picături de D omestos
(3 secunde);
 3 picături dezinfectant Twine 20 în 100 ml apă distilată sterilă (3 secunde );
 alcool etilic 70% (3 secunde);
 clătiri repetate cu apă distilată sterilă (30 secunde).

Însămânțările s -au efectuat pe plăci Petri cu mediu PDA pentru fragmentele de tulpină
(10 eșantioane plantă/ placă Petri) și mediu YPG pentru fragmentele d e frunză ( 10 eșantioane
plantă/ placă Petri). Însămânțarea a avut loc la data de 25 aprilie 2017 pe medii de culturuă
PDA și YPG. Primele observații s -au efectuat la 8 zile după însămânțare (3 mai 2017), când a
avut loc numărătoarea coloniilor de ciuperci cu ochiul l iber. Următoarele observații s-au făcut
la 17 zile după însămânțare (12 mai 2017). În urma observațiilor, am identificat fungi ce
aparțin genurilor: Rhizopus, Fusarium , Aspergillus niger , Alternaria, Penicillium ,
Trichoderma, Saccharomyces cerevisiae .

51

Figura 22 . 25.04.2017 -Diplocarpon rosae, 24 h de la însămânțare (R1=fragmente de tulpină în
mediu PDA , R2=fragmente de frunze în mediu YPG, R3=fragmente de frunze în mediu YPG ,
Martor =fragmente de frunze în mediu YPG )

Figura 2 3. 03.05.2017 – Diplocar pon rosae, 8 zile de la însămânțare (R1 =fragmente de tulpină
în mediu PDA , R2=fragmente de frunze în mediu YPG, R3=fragmente de frunze în mediu YPG,
Martor =fragmente de frunze în mediu YPG )

52
REZULTATE
 Martorul cu fragmente de frunze neinfectate prezintă 5 c olonii de drojdie, 2 colonii
de Saccharomyces cerevisiae, 2 colonii de Alternaria sp, 1 colonie mare de
Penicillium și o colonie mică de Fusarium roseum.
 R1 (pe tulpină) prezintă 1 colonie de Penicillium, o colonie mare de Aspergillus
(90%) și urme de Trichoderma viridae.
 R2 (pe frunză) prezintă 2 colonii de Penicillium care s -au extins peste o colonie de
Alternaria , o colonie mare de Fusarium gălbuie (75%) și o colonie mică de
Fusarium alb, pitic.
 R3 (pe frunză) prezintă 2 colonii de Aspergillus niger , o colonie de Penicillium , 3
colonii de Alternaria, 1-2 colonii de Fusarium roseum și o colonie de
Saccharomyces cerevisiae.

Figura 24 . 12.05.2017 – Diplocarpon rosae , 17 zile de la însămânțare (R1=fragmente de tulpină
în mediu PDA , R2=fragmente de frunz e în mediu YPG, R3=fragmente de frunze în mediu YPG,
Martor =fragmente de frunze în mediu YPG)

53
2) Metode de analiză morfologică și histoanatomică

Morfologia și anatomia frunzei de trandafir
Frunzele plantelor din genul Rosa sunt imparipe nat compuse, cu 5 foliole, dispuse altern
pe tulpină și cu margine serată. Anatomic, acestea sunt alcătuite din epidermă, mezofil și țesut
conducător. Frunza de trandafir are o structură dorsi -ventrală.Atât fața superioară, cât și cea
inferioară sunt delim itate de epidermă cu un număr variabil de stomate, iar suprafața ei este
protejată de cu cuticulă. Mezofilul frunzei este cuprins între cele 2 epiderme și este reprezentat de
țesut parenchimatic: țesut palisadic în partea superioară a frunzei și țesut lacu nos în partea
inferioară. (Andrei, 1978)

Au fost prelevate probe de frunze și tulpini de la trandafirii infectați, în luna mai, apoi au
fost analizate și fotografiate la stereomicroscopul Optika SZM1. Ulterior, materialul biologic a
fost fixat în alcool 7 0%. ( Tarnavschi I. și colab, 1974)
După secționarea transversală , materialul a fost colorat conform tehnicii dublei colorații
cu Verde de Io d și Carmin alaunat sau cu Bleu Cotton. Secțiunile s -au montat pe lamă ș i au fost
observate la microscopul fotonic Belphotonics Bio 1B și fotografiate cu Camera foto digitală
DSLR Canon 400D.

Tehnica dublei colorații
 Colorare cu Verde de Iod (2 -3 secunde).
 Spălare cu alcool 70% (2-3 băi)
 Spălare cu apă distilată (2-3 băi)
 Colorare cu Carmin alaunat (20-30 min ute)
 Spălare cu apă distilată (2 -3 băi)

54

Fig. 25. Secțiune transversală prin frunză sănătoasă
(https://www.researchgate.net/figure/272489723_fig5_Fig -5-Hypostomatic -lamina -up-and-
palisadic -cells-down -in-B2-ecotype -orig)

Fig. 26 . Secțiune transvers ală prin frunză infectată cu Diplocarpon rosae Wolf , miceliu
subcuticular de culoare brună (x20), (original)

55

Fig. 27 . Secțiune transversală prin frunză infectată cu Diplocarpon rosae Wolf, extinderea
infecției în celule le palisadice și țesutul lacunar prin germinarea conidiilor , (x20) , colorație :
Verde de Iod & Carmin A launat (original)

Fig. 28 . Vedere apicală prin frunză infectată cu Diplocarpon rosae Wolf , conidiofori cu conidii
în acervul, (x40) , colorație : Bleu Cotton (original)

56

Fig. 29 . Veder e apicală prin frunză infectată cu Diplocarpon rosae Wolf, celule epidermal e și
conidii bicelulare, (x40) , colorație : Bleu Cotton

Fig. 30 . Vedere apicală prin frunză infectată cu Diplocarpon rosae Wolf, celule epidermale și
conidii bicelulare, detaliu , (x100), colorație : Bleu Cotton

57

Fig. 31 . Secțiune transversală prin frunză infectată cu Diplocarpon rosae Wolf , distrugerea
celulelor plantei gazdă și r ăspândirea infecției, detaliu, (x40) , colorație : Verde de Iod & Carmin
Alaunat

58
CONCL UZII

În urma consultării literaturii de specialitate, a fost posibilă evidențierea ciclului de viață a
ciupercii, dar și observarea în detaliu a structurilor fungice caracteristice fiecărei etape din
procesul de infecție.
La probele din luna mai 2017, am identificat acervuli subcuticulari și conidii bicelulare.
Analiza comparativă asupra preparatelor histoantomice relizate din secțiuni transversale
prin frunze sănătoase și bolnave de trandafir , ne-a permis să observăm impactul atacului de
Diplocarpon rosa e Wolf asupra țesuturilor vegetale.
În cazul mediilor artificiale inoculate cu fragmente de frunză și tulpină infectate cu
Diplocarpon rosae , am observat creșterea semnificativă a diferite colonii de ciuperci care, în să au
inhibat dezvoltarea acestu ia și nu au dat rezultate concludente în studiul pătării negre pe frunzele
de trandafir :
 pe mediul PDA -colonii de Penicillium, Aspergillus , Trichoderma viridae
 pe mediul YPG –colonii de Rhizopus, Fusarium , Aspergillus niger , Alternaria,
Penicillium , Saccharo myces cerevisiae
În urma studiului asupra Diplocarpon rosae Wolf, am constatat că metoda inoculării pe
plante a dat rezultatele cele mai bune, comparativ cu metoda inoculării agentului patogen pe
medii artificiale de creștere.
După înțelegerea aspectelor experimentale din literatură descrise în lucrare, am dori
introducerea acestei metode în cadrul Facultății de Biologie, la lucrările practice de la
Fitopatologie, întrucât se pot efectua studii și asocieri între ciclul de viață al agenților fitopatogeni
și efectul produselor fungicide pe plante.
Prin urmare, combaterea dăunătorilor biologici este și rămâne un aspect important în
Grădina Botanică “Dimitrie Brândză” din București, care poate fi îmbunătățit doar prin
aprofundarea studiilor relației dintre age ntul fitopatogen și planta gazdă.

59
BIBLIOGRAFIE

1. Agrios N. G., 2005. Plant pathology. Fifth edition, Academic press, London, New York
2. Andrei M., 1978. Anatomia plantelor. Editura Didactică și Pedagogică București.
3. Aronescu A., 1934. Diplocarpo n rosae : from spore germination to haustorium formation,
Bulletin of the Torrey Botanical Club 61: 291 -329.
4. Baker J.C., Harmon G.L., Gla zener A.J., Orlandi E.W., 1995. A non -invasive technique for
monitoring peroxidative and H 2O2 scavenging activities d uring interactions between bacterial
plant pathogens and suspension cells. Plant Physiol . 108: 353 -359.
5. Baker K.F., 1948. The history, distribution and nomenclature of the Rose black spot fungus.
Plant Dis. Rep . 32: 260 -274.
6. Barbu Valeria, 1965. Cercetări asupra ruginii ș i pătării negre a trandafirului. Teză de doctorat,
Universitatea București.
7. Constantinescu O., 1969. Metode și tehnici în micologie. Ed. Ceres, București
8. Cook R.T.A. , 1981. Overwintering of Diplocarpon rosae. Wisley, England. Trans. Br. Mycol.
Soc.
9. Dalton A.J., 1955 . A chrome -osmium fixative for electron microscopy. Anat. Rec . 121:
281
10. Eliade Eugenia, 1990. Fitopatologie. Ediția a 2 -a, Tipografia Universității București
11. Frank B.,1896. Die pilzparasitären Krankheiten der Pflanzen, 2, 574 p
12. Gachomo W. Emma, 2005. Studies of the life cycle of Diplocarpon rosae Wolf on roses and
the effectiveness of fungicides on pathogenesis. Inaugural -Dissertation, Rheinischen Friedrich –
Wilhelms -Universität zu Bonn.
13. Geyer G., 1 973. Ultrahistochemie . Gustav Fisher Verlag , Stuttgart.
14. Gherghinescu Sorina Maria, 2014 . Boli ale unor soiuri de trandafiri din colecția Grădinii
Botanice “ Dimitrie Brândză” din București. Lucrare de licență
15. Hood M.E., Shew H.D., 1996. Applications of KOH -analine blue fluorescence in study of
plant -fungal interactions . Phytopathol . 86: 704 -708.
16. Horst Ralph Kenneth, Cloyd Raymond A., 2007. Compend ium of Rose Diseases and Pests.
Second Edition, APS Press.

60
17. Karnovsky M.J., 1965. A formaldehyde -glutaraldehydehyde fixative of high osmolarity for
use in electron microscopy . J. Cell Biol . 27: 137 -138.
18. Lazăr L., Babeș I., Comes I., Drăcea A., Hatman M., 1977. Fitopatologie. Ed. Didactică și
Pedagogică, București
19. Lyle E.W., 1943. Black spot o n rose canes. Am. Rose Annu. 155-156
20. Nicholas R.O., Williams D.W. and Hunter P.A., 1994. Investigation of the value of β- glucan –
specific fluorochromes for predicting the β-glucan content of the ce ll walls of zoopathogenic
fungi. Mycol. Res . 98: 694 -698.
21. Palmer J.G., Sa chs I.B., and Semeniuk P., 1978. The leafspot caused by Marssonina rosae
observed in scanning electron and light microscopy, Scanning Electron Microscopy 2 :
1019 -1026.
22. Palmer J.G., Semeniuk P. and Stewart R.N., 1966 . Roses and blackspot. I. Pathogenicity
to excised leaflets of Diplocarpon rosae from seven geographical locations, Phytopathol .
56: 1277 -1282.
23. Palmer J.G., Sem eniuk P. and Stewart R.N., 1966. Roses and blackspot. II. Seasonal
variation in host susceptibilit y and decline of virulence in culture of conidia from
Diplocarpon rosae , Phytoplathol. 56: 1283 -1286.
24. Popescu Gh., 1993. Fitopatologie. Edit. Tehnica, București
25. Rapilly F., 1986. Les techniques de m ycologie en pathologie vegetale. Anales des epi phytees ,
Vol.19.
26. Reynolds E.S., 1963 . The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron
microscopy , J. Cell Biol. , 17: 208 -212.
27. Sandu T., 2001. Contribuții la îmbunătățirea tehnologiei de luptă integrată împotriva agenț ilor
patogeni ai trandafirului. Teză de doctorat, USAMV Iași
28. Săvulescu O., 1967. Patologie vegetală. Ed. Didactică și pedagogică, București
29. Săvulescu O., Barbu V., Eliade E., Năgler M., Tudorescu -Bănescu V., 1969. Bolile pl antelor
ornamentale din Român ia. Ed. Academiei Republicii Socialiste România.
30. Smith M.M., McCully M.E., 1978. A critical evaluation of the specificity of aniline blue
induced fluorescence. Protoplasma 95: 229 -254
31. Șerbanescu -Jitariu G., Andrei M., Rădulescu -Mitroiu N., Petria E . 1983. Practicum de
biologie vegetală. Editura Ceres, București

61
32. Șesan T.E., Tănase C., 2007. Ciuperci anamorfe fitopatogene, Ed. Universității d in București
33.Tarnavschi I., Șerbănescu -Jitariu G., Rădulescu -Mitroiu N., Rădulescu D., 1974. Practicum de
morfologie și anatomie vegetală. Editura Universității din București
34. Tănase C., Mititiuc M., 2001. Micologie, Ed. Universității ”Alexandru Ioan Cuza”
35. Tuite J., 1969. Plant Pathological Methods, Fungi and Bacteria, Burgess Publishing
Company, Min neapolis.
36. Wolf F.A., 1912. The perfect stage of Actinonema Rosae . Bot. Gaz. 54: 218 -234.
37. Wolf F.A., 1926. Leaf scorch disease of strawberries, N.C. Agr. Exp. Sta. Tech. Bull . 28:1 -16.
38. Van Sengbush P., Hechler J., Muller U. ,1983. Molecular arch itecture of fungal cell walls. An
approach by use of fluorescent markers, Eur. J. Cell. Biol. 30: 305 -312.

Pagini Web:
 https://www.edmundsroses.com/C/8/ClimbingRoses
 http://www.indexfungorum.org/names/Names.asp
 https://www.researchgate.net/figure/272489723_fig5_Fig -5-Hypostomatic -lamina -up-
and-palisadic -cells-down -in-B2-ecotype -orig