Lect. univ. dr. Predan Gențiana Mihaela Iulia [307920]

UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI

FACULTATEA DE BIOLOGIE

LUCRARE DE LICENȚĂ

COORDONATOR ȘTIINȚIFIC:

Lect. univ. dr. Predan Gențiana Mihaela Iulia

ABSOLVENT: [anonimizat]

2017

UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI

FACULTATEA DE BIOLOGIE

Ciclul de viață la Diplocarpon rosae Wolf în colecția de trandafiri a Grădinii Botanice "Dimitrie Brândză" din București

COORDONATOR ȘTIINȚIFIC:

Lect. univ. dr. Predan Gențiana Mihaela Iulia

ABSOLVENT: [anonimizat]

2017

CUPRINS

INTRODUCERE…………………………………………………………………………………………………………….2CAPITOLUL I.

CAPITOLUL II. CARACTERIZAREA CIUPERCII FITOPATOGENE

II.1. Agentul patogen…………………………………………………………………………………………………..

II.2. Simptome…………………………………………………………………………………………………………..

II.3. Ciclul de viață……………………………………………………………………………………………………..

II.4. Epidemiologie……………………………………………………………………………………………………….

II.5. Combatere……………………………………………………………………………………………………………

CAPITOLUL III. MATERIALE ȘI METODE……………………………………………………………….

CAPITOLUL IV.ASPECTE EXPERIMENTALE DIN LITERATURĂ

IV.1. Inocularea patogenului……………………………………………………………………………………….

IV.1.1. Umiditate și temperatură………………………………………………………………………………….

IV.1.2. Lumină………………………………………………………………………………………………………….

IV.2. Prepararea mediilor de creștere…………………………………………………………………………

IV.2.1. Prelevarea probelor…………………………………………………………………………………………

IV.2.2. Secționarea…………………………………………………………………………………………………….

IV.3. Tehnici de colorare……………………………………………………………………………………………

IV.4. Rata germinării…………………………………………………………………………………………………..

CAPITOLUL V. STUDII MICROSCOPICE ALE PROCESULUI DE INFECȚIE

V.1. Germinarea conidiei și formarea apresorului…………………………………………………………

V.2. Penetrarea cuticulei și dezvoltarea patogenului în țesuturile plantei gazdă……………..

V.3. Formarea haustorilor și a hifelor intracelulare………………………………………………………

V.4. Fructificarea………………………………………………………………………………………………………….

V.5. Vernalizarea………………………………………………………………………………………………………….

CONCLUZII…………………………………………………………………………………………………………………..

BIBLIOGRAFIE…………………………………………………………………………………………………………….

INTRODUCERE

CAPITOLUL I

Trandafirii aparțin familiei Rosaceae, genul Rosa.

++ morfologia frunzei, specii din gr bot

++FAM DERMATACEAE SAU ORD. Helotiales…de scris despre Fungi

++Gr. Botanică condiții de mediu, sol, climă

ISTORICUL BOLII

Pătarea neagră este o boală comună, răspândită la nivel global pe speciile genului Rosa și este cauzată de agentul patogen fungic cu stadiul perfect (sexuat) -Diplocarpon rosae(Wolf) și stadiul imperfect (asexuat) -Marssonina rosae(Lib.)

În Europa, boala a fost descrisă pentru prima oară în Suedia,1815, apoi în America de Nord în 1831, în America de Sud în 1880, în Australia în 1892, în Africa în 1920, în Asia în 1910. (Baker, 1948).

În România, boala a fost raportată în anul 1853, în județul Sibiu de către M. Fuss pe Rosa spinosissima L.

Wolf descoperă în 1912 stadiul perfect al parazitului și propune numele de Diplocarpon rosae Wolf. Prin inoculări artificiale începând cu ascoporii a conectat ambele stadii ale ciupercii. Se accentuează importanța stadiului ascosporic în purtarea ciupercii peste iarnă. Acesta a subliniat faptul că ascosporii nu germinează decât în contact cu frunza de trandafir.

În timpul verilor cu precipitații abundente, atacul este puternic, mai ales în regiunile de deal și de câmpie, iar boala se manifestă de la sfârșitul lunii mai sau începutul lui iunie.

CAPITOLUL II. CARACTERIZAREA CIUPERCII FITOPATOGENE

II.1. Agentul patogen

Ciupeca Diplocarpon rosae Wolf face parte din regnul Fungi, filum Ascomycota, clasa Leotiomycetes, ordinul Helotiales, familia Dermataceae, genul Diplocarpon. Diplocarpon rosae Wolf (sin. Fabraea rosae (Wolf), Maubl.) este responsabilă de pătarea neagră a trandafirului. Anamorfa ciupercii este reprezentată de Marssonina rosae (Lib.) Died. (sin. Actinonema rosae Fr., Asteroma rosae Lib., Marssonia rosae Trail.) din familia Dermataceae. Aceasta a fost descrisă pentru prima oară în Franța, în 1827. În regiunile temperate, primele infecții din primăvară sunt cauzate de conidii sau ascospori găsiți în materialul vegetal de peste iarnă. Ciuperca iernează pe tulpini latente, spini, frunze căzute și boboci (Lyle 1943, Gatiti 1981). Conidiile sunt răspândite de vânt, stopi de ploaie și prin vectori de animale, inclusiv insecte și arahnide. (Palmer și colab., 1978).

Miceliul parazit de M. rosae este la început subcuticular cu hife miceliene grupate în fascicule. Hifele tinere sunt hialine, dar se întunecă odată cu vârsta. Din acestea se formează haustori care pătrund în celulele epidermale și palisadice ale plantei-gazdă. Sub cuticula de la nivelul petelor se formează strome de dimensiuni mici. Din strome iau naștere conidiile amplasate pe filamente miceliene scurte, formând acervuli subcutilari cu dimensiuni cuprinse între 50-400 μ. Ulterior, cuticula se rupe, iar conidiile devin libere. Conidiile sunt formate din 2 celule inegale:apicală și bazală, despărțite de un perete transversal la nivelul căruia se observă o sugrumare pronunțată. Celula apicală este mai mare și rotunjită superior față de cea bazală care se îngustează la bază.

Vara, boala se răspândește cu ajutorul conidiilor prin intermediul vântului.Rar, la nivelul frunzelor atacate, se formează apoteciile cu asce cu 8 ascospori hialini, bicelulari. Primăvara următoare, ascosporii ajung la maturitate și sunt evacuați forțat din asce.

II.2.Simptome

Boala se manifestă, de obicei, pe fața superioară a frunzelor, rar pe stipele, sepale, petale. Aceasta debutează cu apariția unor pete violacee-negricioase, mici și circulare cu margine difuză, care se măresc în timp, ducând la căderea foliolelor. Forma petelor este dată de extinderea miceliului în sens radiar din punctul infecției. Caracteristicile petelor depind de tipul de trandafir și de intensitatea atacului. La trandafirii sensibili, petele sunt extinse și cu margine difuză. Țesutul din jurul leziunilor devine galben, iar cloroza se extinde până cand are loc căderea frunzelor. (Săvulescu, 1969)

Patogenul este prezent doar in leziunile propriu-zise. Îngălbenirea țesutului este cauzată de metaboliții patogenului și prezintă un nivel ridicat de activitate metabolică care este exprimată prin acumularea de fenoli, orto-dihidroxifenoli și amino acizi, precum și printr-un nivel ridicat al activității enzimatice. Petele se măresc încet, durând câteva săptămâni să atingă diametrul de 12 mm. În soiuri rezistente sau în condiții nefavorabile de mediu, se formează mici puncte negre, nefiind urmate de cloroza sau căderea frunzelor.
Ingălbenirea și căderea frunzelor sunt asociate cu etilena. Frunzele afectate de pătarea neagră produc cantități mari de etilenă; producția scade pe măsură ce frunzele devin galbene și încetează atunci când frunzele devin maronii. Frunzele infectate conțin mai puține auxine decât cele sănătoase. Patogenul degradează auxinele care întârzie defolierea, grăbind astfel căderea frunzelor.

Fig. Simptome pe frunze afectate de Diplocarpon rosae

Fig. Apariția petelor brun-negricioase pe fața superioară a frunzei (imagine realizată la stereomicroscop, mărită de 1.3 x)

Fig. Înnegrirea petelor urmată de formarea acervulilor subcuticulari cu conidii (imagine realizată la stereomicroscop mărită de 2 x)

Fig. Stadiu avansat al bolii manifestat prin îngălbenirea frunzelor și creșterea numărului de pete (după Horst și Cloyd, 2007)

Pe lemnul soiurilor sensibile apar pete roșii-violacee, neregulate. Mai târziu, petele se innegresc și prezintă bășici, iar la nivelul lor se găsesc acervuli subcuticulari care ulterior rup cuticula. Leziunile sunt mici și rareori omoară ramurile, dar sunt foarte importante în supraviețuirea patogenului peste iarnă. Pețiolurile și stipelele pot prezenta puncte negre, neobservabile similare cu cele de pe frunze. Pendunculii și sepalele pot avea simptome similare, iar petalele să fie afectate de pete roșii insoțite de deformare moderată. Tufele de trandafiri rămân desfrunzite pe timpul verii, iar spre toamnă, are loc o sinteză de foliole care obosește planta și duce la o rezistență mai scăzută la geruri în anotimpul friguros. Astfel, în vara următoare, înflorirea este minimă sau nu se produce deloc.

Ramuri infectate cu Diplocarpon rosae Wolf (după Horst și Cloyd, 2007)

II.3. Ciclul de viață

Patogenul rezistă peste iarnă prin miceliul de rezistență de pe lăstari sau prin conidiile și apoteciile de pe frunzele căzute. Frunzele sunt cele mai susceptibile infecției când sunt în creștere (la 6-14 zile). Primăvara, miceliul din lăstari produce conidii sau sporii de pe frunzele căzute sunt răspândiți de vânt sau de picăturile de ploaie, ajung pe frunze, ducând la infecția primară a frunzelor. O conidie germinează în 9-18 ore pe o frunză umedă la temperaturi cuprinse între 22-26 °C. Conidiile emit tuburi germinale din celula apicală și rar din ambele celule. Tuburile germinale penetrează cuticula frunzei și cresc între cuticulă și celulele epidermice, producând hife hialine, ulterior brun-negricioase ce se extind radiar de la punctul infecției și pătrund în peretele celulelor epidermice formând haustori. Aceștia se pot forma în celulele gazdă la 15 ore după infecție. Vara, infecția se răspândește cu ajutorul vântului și stropilor de ploaie prin conidii. Miceliul matur formează strome între cuticulă și celulele epidermice ce produc conidiile dispuse în acervuli rezultând infecția secundară (toamna). Prin proces sexual, ciuperca produce apotecii în frunzele căzute.

Infecțiile pe suprafața inferioară a frunzelor seamănă cu cele de pe suprafața superioară, exceptând faptul că hifele cresc rapid prin mezofil, dezvoltându-se pe ambele fețe ale frunzei. Simptomele apar în 3-16 zile, în funcție de temperatură. Acervulii se formează în 11 zile pe fața superioară și într-o lună pe fața inferioară. Când umiditatea relativă scade, la locul acervului în creștere, cuticula se rupe expunând o masă mucilaginoasă de conidii. Acestea se produc la 10-18 zile de la infecție. Unele conidii aderă la fragmente de cuticulă ruptă, dar majoritatea sunt dispersate în apa de ploaie sau condensate. Conidiile sunt diseminate prin stropirea cu apă, de către oameni în timpul cultivării, sau prin contactul cu corpul lipicios al insectelor. Frunzele căzute suflate de vânt, pot dispersa local patogenul, dar conidiile sunt, de obicei în aer numai în picăturile de apă. Ascosporii se găsesc atât de rar, încât sunt neimportanți în dispersare. (Horst și Cloyd, 2007)

Ciuperca nu supraviețuiește în sol, iar conidiile care aderă de unelte, rămân viabile nu mai mult de o lună. În zonele cu climat blând și în sere, ciuperca rămâne activă în plantă gazdă pe tot parcursul anului.

Târziu în toamnă, după defoliere, miceliul invadează straturile profunde ale frunzei moarte și formează o stromă între epidermă și parenchimul palisadic. Wolf precizează că ascocarpii sunt formați în abundență pe parcursul lunii octombrie și au fost observați de către acesta și în lunile noiembrie și decembrie. Aparent, dacă toate condițiile pentru dezvoltarea ascocarpilor sunt asigurate, apoteciile cu asce pot fi așteptate primăvara. Apotecia se deschide prin ruperea cuticulei. Ascosporii sunt răspândiți de vânt și ploaie. V Corectat!

Ciclul de viață- Diplocarpon rosae Wolf.

A, Diplocarpon rosae rezistă peste iarnă în tulpinile infectate sau în mugurii sau frunzele căzute. B, noii lăstari sunt infectați prin miceliul iernat sau prin conidii și ascospori produși pe frunzele căzute. C, Frunzele și tulpinile sunt infectate în timpul verii cu ascospori răspândiți prin aer sau conidii propagate prin stropi de ploaie (adaptat după Horst și Cloyd, 2007)

++Ascosporii sunt endospori tipici ciupercilor din Încreng ASCOMYCOTA ce se formează în organe speciale numite asce, iar formarea lor este precedată întotdeauna de meioză. Ascele sunt protejate de peritecii sau apotecii. ++Conidiile sau conidiosporii sunt spori exogeni care se formează la exterior pe suporturi speciale, diferențiate de miceliu numite conidiofori,ASCOMYCOTA DEUTEROMYCOTA?(Fungi imperfecți) Ei sunt asociați în acervuli

II.4. Epidemiologie

Marssonina rosae tolerează o gamă largă de temperaturi (15-27° C). Germinarea conidiilor este optimă la 18° C; la această temperatură, germinația începe după 9 ore și atinge 96% în 36 de ore. Patogenul este sensibil la temperaturi ridicate. Conidiile sunt omorâte fără germinație la 33° C, în timp ce la 30° C pot germina, dar nu reușesc să se dezvolte în continuare. Creșterea miceliană este optimă la 21° C și este oprită după 8 săptămâni la 33° C. Infecția conidială a frunzelor este optimă la 19-21° C, iar simptomele pot apărea în 3-4 zile la 22-30° C. Dezvoltarea bolii este optimă la 24° C. Nicio infecție nu are loc dacă suprafețele frunzelor sunt uscate în termen de 7 ore de la incoulare și incubate la 15-24° C. Probabilitatea infecției crește dacă frunzele rămân umede timp de 24 de ore înainte de uscare. Nicio infecție nu are loc în aer uscat. Chiar și la 100% umiditate relativă, germinația nu are loc în cazul în care conidiile nu au fost udate, iar la o umiditate relativă sub 90%, conidiile mature trebuie imersate în apă pentru cel puțin 7 ore înainte de a cauza infecția.

Buna circulație a aerului în jurul trandafirilor din sere sau din câmp, grăbește uscarea și reduce probabilitatea infecției cu Diplocarpon rosae Wolf. Totuși, vânturile oceanice, reci și umede în regiunile de coastă sau irigarea aerienă favorizează infecția. Evoluția bolii este restricționată în zonele cu climat arid sau în serele cu umiditate scăzută unde plantele irigate se usucă rapid. Căldura de vară și gerul limitează dezvoltarea epidemiilor în regiunile ploioase.

În urma observațiilor efectuate în mai multe localități din țară, soiurile de trandafiri de cultură cu rezistență sporită la Diplocarpon rosae Wolf sunt: Radianee, Eclipse, New Dawn, Perle d’Or, Frau Berta Gurtler, Viridiflora, Etoile de Holande, Leni Neuss, Mrs. Niel, Luis Brinas, Marie Adelaide, Mrs. Franklin Dr. Roosevelt. Soiurile de trandafiri susceptibile infecției cu Diplocarpon rosae Wolf sunt: Charles K. Douglas, Johana Hill, Mary Hart, Golden Dawn, Belvedere, Kardinal, Locarno, Orleans Rosae, Yvone Rabier, Raymond Privat, Ellen Poulsen, Ferdinand Mayer, Freiburg II. (Săvulescu, 1969)

Majoritatea speciilor sălbatice de Rosa sunt rezistente în fața atacului: Rosa acicularis Lindl., Rosa blanda Ait., Rosa cinnamomea L., Rosa eglanteria L., Rosa jundzilli Bess., Rosa pendulina L., Rosa rubiginosa L., Rosa sericea Lindl., Rosa setigera Michx., Rosa watsoniana Crep. O mică parte din speciile sălbatice de Rosa sunt slab atacate: Rosa canina L., Rosa carolina L., Rosa gallica var. muscosa bifera Salet, Rosa nitida Willd.

II.5. Combatere

Pentru a stopa infecția, respectiv iernarea patogenului, trebuie efectuată o curățenie generală prin înlăturarea frunzelor afectate căzute. Primăvara se va face o tăiere a lăstarilor la care boala s-a extins la nivelul ramurilor. În vederea cultivării trandafirilor se aleg locuri însorite, ferite de umbră și umiditate. Se aleg, de preferință, soluri de tip cernoziom, aplicându-se îngrășăminte organo-minerale și se evită solurile argiloase.

Frunzelor nu le este permis sa rămână umede sau la o umiditate crescută mai mult de 7-12 ore. Udarea excesivă ar trebui evitată pe timp de vreme închisă și umedă. Irigarea trandafirilor trebuie evitată, dar poate fi realizată dimineața pentru a permite foliolelor să se usuce în timpul zilei. Spray-ruile fungicide ar trebui aplicate în perioadele în care condițiile sunt favorabile dezvoltării ciupercii. Se pot aplica tratemente chimice prin stropiri, folosind produse de tipul: Polyram combi 0,2%, Orthophaltan și Liromaneb 0,3%. (V. Barbu, 1965) ++

Tabelul 1 :Fungicide pentru controlul pătării negre

CAPITOLUL III. MATERIALE ȘI METODE

Când a fost colectat D. rosae pentru aceste probe?

Medii de cultură: PDA, YPG

MARTOR=fragmente de frunze în YPG

R1=fragmente de tulpină în PDA

R2=fragmente de frunze în YPG

R3=fragmente de frunze în YPG

26 aprilie- 24 h de la inoculare

3 mai 2017-8 zile de la inoculare

Martorul cu fragmente de frunze neafectate de boală prezintă 5 colonii de drojdie, 2 colonii de Saccharomyces cerevisiae, 2 colonii de Alternaria sp, 1 colonie mare de Penicillium și o colonie mică de Fusarium roseum.

R1(pe tulpină) prezintă 1 colonie de Penicillium, o colonie mare de Aspergillus (90%) și urme de Trichoderma viridae.

R2 (pe frunză) prezintă 2 colonii de Penicillium care s-au extins peste o colonie de Alternaria, o colonie mare de Fusarium gălbuie (75%) și o colonie mică de Fusarium alb, pitic.

R3 (pe frunză) prezintă 2 colonii de Aspergillus niger, o colonie de Penicillium, 3 colonii de Alternaria, 1-2 colonii de Fusarium roseum și o colonie de Saccharomyces cerevisiae.

12 mai -17 zile de la inoculare

3.4 EFECTUL MEDIULUI NUTRITIV ASUPRA DEZVOLTĂRII CIUPERCII

3.4.1 DEZVOLTAREA D. ROSAE PE MEDII ARTIFICIALE DE CREȘTERE

Conidiile de Diplocarpon rosae au germinat la 9 ore de la inoculare pe toate mediile de creștere artificială utilizate.
Agar-agar: ciupercile coloniilor nu au fost vizibile cu ochiul liber chiar și după 3 săptămâni de creștere. S-au format foarte puține hife, iar formarea conidiilor a inceput la 8 zile de creștere (Figura 19a).

Potato Dextrose Agar (PDA-agar cu cartof-dextroză): Creșterea pe PDA și ½ PDA a fost foarte similară. Masa de miceliu a putut fi văzută ca o pată mică cu ochiul liber în a 14-a zi de creștere. Partea de sus și marginea coloniei de ciuperci era reprezentată de miceliu alb,dar partea de jos a coloniei și în profunzime prezenta miceliu galben-portocaliu. Ciuperca a format o rețea extinsă de hife pe aceste suport de creștere și primele conidii au fost identificate în a 10-a zi de creștere. Cu toate acestea, după 3 săptămâni de creștere, raportul conidii la hife era încă foarte scăzut, adică ciuperca a format o masă extinsă de hife, dar foarte puține conidii (Figura 19d).

Agar cu extract de malț(MEA): Modelul de creștere a ciupercilor pe agar cu extract de malț și ½ MEA a fost foarte similar. Miceliul ciupercii a putut fi văzut cu ochiul liber de la a 14-a zi de creștere ca mici puncte albe împrăștiate pe suprafața mediului de creștere. Partea de sus și de jos a coloniei ciupercilor erau albe. S-a observat o rețea mică de hife,iar conidiile s-au format din miceliu în centrul coloniei. Formarea conidiilor a început în a 8-a zi de creștere pe coloniile de ciuperci cu hife foarte scurte. Câteva conidii și hife s-au format (Figura 19b).

Biomalț: Ciuperca a arătat modele de creștere similare pe biomalț și ½ biomalț agar. Colonia ciupercii s-a putut vedea cu ochiul liber ca puncte albicioase împrăștiate pe mediul de creștere din a 14-a zi, dar atunci când coloniile au crescut împreună , miceliul de sus era de culoare albă, iar cel de jos era gălbui-portocaliu. Ciuperca a format o rețea extinsă de hife și la fel de multe conidii. Formarea conidiilor a început în a 7-a zi pe hifele scurte. S-a format o masă abundentă de conidii și raportul dintre conidii și hife a fost relativ ridicat. Conidiile s-au format chiar și pe 2 celule hifale adiacente (Figura 19c). După 4 săptămâni de creștere,toate coloniile erau maro deschis pe toate mediile de creștere.

Figura 19: Fotografii la microscopul optic cu Diplocarpon rosae pe medii artificiale de creștere: (a) 10 de zile de creștere a ciupercii pe agar-agar, (b) 10 de zile de creștere a ciupercii pe agar cu extract de malț (c) 10 de zile de creștere a ciupercii pe biomalț agar (d) 10 zile de creștere a ciupercii pe PDA . (după Gachomo, 2005)

IV.ASPECTE EXPERIMENTALE DIN LITERATURĂ

IV.1.INOCULAREA PATOGENULUI

Frank (1896) a încercat inoculările artificiale cu conidii și a raportat pete în a 10-a zi. Infecțiile din ascospori au fost obținute de Wolf (1912). A observat că germinarea acestor spori are loc în 24 de ore, dar doar pe frunză. La 17 zile de la inoculare, au apărut acervuli maturi. S-au folosit plante din ghiveci care au fost stimulate să crească rapid adăugând îngrășăminte cu câteva săptămâni înainte de începerea experimentelor. Varietățile alese au fost majoritatea Radiance și Red Radiance, Felicity, Charles K. Douglas, Mrs. F. R Pierson, Henry Ford, Flammenrose. Frunzele tinere au fost selectate pentru infecție, cu toate că frunzele bătrâne au fost și ele inoculate pentru rezultate comparative. De la 2 până la 6 inele au fost marcate pe fiecare lamină cu cerneală India. Cu ajutorul unei tije de sticlă, picături de suspensie de spori obținute din acervuli sau culturi artificiale, au fost plasate în interiorul fiecărui inel. Plantele inoculate au fost mutate în “frigiderul fără gheață” descris de Hunt (1919) care prevedea o atmosferă saturată pentru plante.

În cazul în care ciuperca penetrează țesutul frunzei în loc să patrundă prin deschiderile stomatale, are loc un proces mult mai complicat. Sunt mulți factori care lucrează împreună și fac posibilă penetrarea ciupercii prin peretele extern al epidermei.

Pentru ca infiltrarea să fie posibilă, este necesar un contact intim între hife și planta gazdă. Acest lucru este posibil, în majoritatea cazurilor, cu ajutorul unui apresor. Primul care a observat funcția acestor organe a fost Frank, care le a numit “Haftorgane” (1883) și a arătat că nu sunt “spori secundari” așa cum ii considera Fisch (1882), Scribner (1887), Halsted (1892) și alții. De Bary (1886), în studiul bolii cauzată de Sclerotinia, este de părere că sunt necesare două condiții pentru formarea acestor organe. Trebuie să fie un stimul mecanic produs de contactul dintre hifă și unele substanțe dure cum ar fi sticla din camera de cultură sau cuticula gazdei și că ciuperca trebuie să crească într-un film de apă și nu într-un mediu nutritiv. Dacă sporii sunt germinați în soluții nutritive, penetrarea are loc, dar apresorul nu se formează. Explicația lui pentru această situație este că soluția favorizează formarea unei cantități mari de substanțe toxice care permit penetrarea imediată după ce hifa a atins epiderma. Cea mai eficientă metodă pentru studiul fazelor timpurii ale penetrării este examinarea porțiunii de frunză la microscopul optic cu ulei de imersie. Metoda următoare a dat cele mai bune rezultate.

Picăturile de suspensie de spori au fost plasate pe frunze, iar după intervale diferite de timp, frunzele au fost colectate și fierte în alcool 95% , timp de 15 minute pentru a elimina clorofila. Au fost apoi lăsate în alcool 70% pentru a-și recăpăta frăgezimea. Partea frunzei acoperită de picături de suspensie a fost tăiată și colorată în blue cotton dizolvat în lactofenol. Ciuperca preia vopseaua albastră, în timp ce țesuturile frunzei rămân necolorate. Câteva ore în colorant sunt suficiente pentru a arăta stadiile timpurii de penetrare. Pentru etapele ulterioare, hifele paralele sunt deja prezente, sunt obținute rezultate mai bune dacă bucățile sunt lăsate în colorant pentru 48 sau chiar 72 de ore, deoarece difuzia colorantului cotton blue are loc doar prin crăpăturile cuticulei și prin marginile tăiate ale frunzei. Bucățile de frunză au fost montate în lactofenol. Difuzia colorantului continuă încet , în câteva zile observându-se detalii mult mai clare. Marele avantaj al acestei metode este că durează foarte puțin timp pentru a pregăti un număr de preparate, iar fiecare preparat arată multe stadii de penetrare care pot fi observate în detaliu și în toate fazele. Studiind anumite detalii citologice ale formării haustorului și ale stadiilor ulterioare de penetrare descrise în serie s-au folosit secțiuni colorate cu Flemming’s triple stain .

Un altă serie de cercetărtori au folosit Diplocarpon rosae Wolf, care este stadiul perfect, sexuat al ciupercii. Au fost colectate 2 izolate din Germania(G1) și 20 de izolate din Kenya(K1). S-au utilizat folosit următoarele soiuri de trandafiri: trandafirul Floribunda ‘Frensham’și 2 trandafiri Hybrid teas var. Claudia și var. Rosita. Aceste soiuri s-au plantat în ghivece de cel puțin 17 cm diametru și 25 cm înălțime. Pământul a fost compus din “mixul special Klasmann” : pământ de câmp : compost în raport de 2:2:1 și 5 g îngrășământ “PlantoSan” (pentru trandafirul Floribunda ‘Frensham’), iar trandafirii Hybrid teas au fost plantați în ghivece de 10.5 cm și în același mix, dar au fost adăugate doar 2 g de îngrășământ. Plantele în ghiveci au fost menținute la o temperatură minimă de 20°C. Frunzele bolnave cu simptomele pătării negre care au fost prelevate din diferite locații au fost incubate în camere umede la temperatura camerei (20-25 °C) pentru 3 zile. Frunzele din fiecare locație au fost incubate separat. Frunzele au fost spălate apoi cu apă sterilă, iar concentrația conidiilor în suspensie a fost de 1 x 10^5 conidii/ml. Inoculul din fiecare locație a fost considerat ca un izolat pentru acea regiune. Inoculările au fost făcute pe trandafirii intacți din ghiveci și pe frunze detașate. Plante intacte: Trandafrii în ghiveci au fost plasați peste noapte într-o cameră de incubare cu aproape 100% umiditate relativă și o temperatură de 20°C. Plantele au fost apoi pulverizate cu o suspensie de conidii (1 x 10^5 conidii/ml) și plasate la loc în camera de incubare pentru încă 2 zile. Plantele au fost scoase din camera de incubare și mutate în seră. Plantele de control netratate au fost pulverizate cu apă sterilă, distilată. Frunze detașate: Au fost detașate cele mai tinere frunze de la plante și spălate cu apă de robinet timp de 10 minute și apoi sterilizate cu 3% hipoclorit de sodiu pentru 3 minute. Frunzele au fost clătite în 3 rânduri cu apă distilată și plasate în hârtie de filtru sterilă, umezită în vase Petri de 90 mm cu partea adaxială expusă așa cum descrie Palmer și colab. (1966) Frunzele au fost perforate, obținându-se discuri de 1 cm diametru și plasate pe hârtie de filtru. Discurile au fost inoculate cu 5 μL picături de suspensie de conidii (5 x 10^4 conidii/ml) și incubate la 20°C. Plantele de control au fost inoculate cu 5μL picături de apă distilată,sterilă.

Suspensia de conidii a diferitelor izolate, a fost folosită pentru a inocula 2 trandafiri Hybrid teas. Trandafirii au fost în evaluare bolii cu scopul de a caracteriza izolatele, datorită abilității lor de a produce noi frunzee într-un timp scurt. Modelul de creștere al izolatelor pe plante a fost comparat cu privire la rata germinării și severitatea bolii. Procentul germinării pentru fiecare izolat a fost calculat, folosindu-se o scală de 0-100% pentru a determina severitatea bolii. Scala bolii a fost divizată în 5 clase de severitate a bolii:

0%-fără simptome

1-20%-pete mai mici de 5 mm, fără îngălbenire și fără defoliere

20-40%- pete mai mici de 5 mm, îngălbenire și/sau defoliere

40-60%-pete de 5-10 mm, fără îngălbenire și fără defoliere

60-80%-pete de 5-10 mm, îngălbenire și/sau defoliere

80-100%-pete mai mari de 10 mm, îngălbenire și/sau defoliere

Rezultatele au fost folosite pentru a selecta izolate cu diferențe notabile în rata germinării și severitatea bolii. Aceeași scală a bolii a fost folosită pentru a compara rata de creștere a izolatelor reprezentative pe ambele plante intacte și frunze detașate, și la temperaturi de incubare diferite, 10-15-20-25°C. Numărul de zile necesare pentru exprimarea simptomelor pe frunzele detașate și plantele intacte au fost înregistrate.. Pe frunzele detașate, 10 picături de inocul au fost puse pe fiecare frunză, iar numărul de pete negre dezvoltate pe ele, a fost înregistrat. Frunzele bolnave cu simptomele pătării negre au fost incubate într-o cameră umedă timp de 3 zile și apoi păstrate la -20° C, pentru stocare pe termen lung. Pentru a forma o suspensie de conidii, frunzele au fost decongelate apoi spălate cu apă distilată, sterilă, rezultând o suspensie cu concentrație 1 x 10^5 conidii/ml înainte de a fi folosite pentru inocularea plantelor sănătoase. Pentru a multiplica inoculul, frunzele detașate au fost inoculate, iar frunzele cu simptome complet dezvoltate au fost stocate la -20°C.

IV.1.1.UMIDITATE ȘI TEMPERATURĂ

Primele experimente de inoculare au fost începute cu scopul de a afla dacă ciuperca este heterotalică. În acest experiment, un număr mare de frunze de diferite vârste și varietăți au fost inoculate și au fost făcute observații pentru a determina timpul necesar apariției primului semn de infecție. Numărarea a fost făcută pentru numărul petelor, pentru numărul frunzelor afectate în funcție de vârstă și varietate.

Nu au fost observate diferențe importante când Red Radiance, Felicity, Radiance, Charles K. Douglas și Mrs. F. R. Pierson au fost inoculate. În cazul speciilor Flammenrose și Henry Ford, infecțiile au apărut o zi-două mai târziu. În general, 92% dintre inoculări au avut succes. Frunzele tinere au prezentat 100% infecție.

Un al 2 lea set de experimente a fost început pentru a determina relația dintre umiditate și temperatură și rapiditatea infecției. Inoculările au fost făcute pe un număr mai mic de frunze în perioade ploioase la o temperatură de 72-92 F. A fost înregistrată 100% infecție și pete ce au apărut în a 3-a zi în majoritatea cazurilor sau în a 4-a.

O altă serie de experimente a fost realizată pe 4 plante pentru a determina dacă este suficientă asigurarea unei atmosfere umede sau dacă sporii trebuie să fie în apă. O plantă a fost lăsată în seră astfel încât picăturile s-au uscat la o oră după inoculare; alta a fost lăsată în seră până când picăturile s-au uscat, apoi a fost plasată în camera de inoculare; a 3-a plantă a fost lăsată 20 de ore în camera umedă și apoi scoasă; a 4-a plantă a fost ținută în camera umedă 3 zile. În cazul primei plante unde sporii trebuie să fi germinat în atmosfera umedă a serei, petele au apărut in zilele 5 si 6. Celelalte 3 plante au prezentat infecții din ziua 3. Din aceste serii de experimente este evident că umiditatea atmosferică la o temperatură favorabilă este suficientă pentru germinarea sporilor și apariția infecției. (Aronescu, 1934)

Frunzele detașate inoculate cu izolatele G1 și K1 au fost incubate la temperaturi diferite, în scopul de a monitoriza efectul temperaturii asupra dezvoltării simptomelor bolii. La 25 ° C, primele simptome au apărut la 4 dpi pe frunzele inoculate cu oricare dintre izolate (tabelul 3). Aceste simptome au fost mici pete negre si un acervul a fost vizibil când pată a fost privită sub o lentilă de mână. Pe al 5-lea dpi spoturile au fost aproximativ medii 1-2 mm, iar numărul de acervuli per pată a crescut de asemenea. Pe al 7-lea dpi, o masă de conidii albe au putut fi observate pe petele de pe frunzele inoculate cu oricare dintre izolate și frunzele au început să se îngălbenească (tabelul 3). Pe frunzele inoculate cu oricare dintre izolate, petele negre, cu un diametru mediu de 10 mm la al 9-lea dpi. Frunzele s-au îngălbenit, de asemenea, cu exceptia zonelor cu petele (tabelul 3).

La 20 ° C, au fost observate primele simptome de boală, în al 5-lea dpi pe frunzișoarele inoculate cu oricare dintre izolate. 16 din cele 20 (80%) de frunzișoare inoculate cu izolatul K1 au avut mai mult de 5 pete per frunzișoară, în timp ce pe cele inoculate cu izolatul G1, toate cele 20 de frunzișoare au avut mai puțin de 5 pete per frunzișoară. Pe frunzele inoculate cu oricare dintre izolate, toate petele au avut un diametru mediu mai mic de 1 mm. Pe al 7-lea dpi, toate frunzișoarele inoculate cu izolat K1 au avut mai mult de 5 pete negre cu acervuli per frunzișoară și pe al 9-lea dpi, diametrul mediu al petelor a fost de aproximativ 10 mm, iar îngălbenirea a început. Pe frunzișoarele inoculate cu izolat G1, 12 din cele 20 (60%) frunzișoare au avut mai mult de 5 pete per frunzișoară, dar nu au fost observați acervulila al 8-lea dpi. Pe al 9-lea dpi petele au un diametru de 7-8 mm, cu câțiva acervuli și a fost observată doar o ușoară îngălbenire. Pe al 11-lea dpi, multe dintre pete au crescut unele în altele , făcând petele brusc mai mari.(Tabelul 3)

La 15 ° C, apariții slabe ale simptomelor au fost observate la 7 dpi când vasele Petri conținând frunzișoarele au fost ținute departe de lumină. La 9 dpi, 10 frunzișoare per izolat au avut cel puțin o pată neagră fiecare. Nici una dintre frunzișoare nu au avut 5 sau mai multe pete per frunzișoară, chiar și după 20 dpi. Nu au fost observate simptome de boală pe frunzele desprinse inoculate cu oricare dintre izolate și incubate la 10 ° C, chiar și după 20 dpi. Aceste informații sunt prezentate pe scurt în tabelul 3.

Tabelul 3: Dezvoltarea simptomelor pe frunze de trandafir detașate, inoculate cu izolate G1 și K1 de Diplocarpon rosae, incubate la temperaturi diferite (n = 20). (Gachomo, 2005)

IV.1.2.LUMINA

Alte experimente au fost făcute pentru a determina dacă plantele ținute în întuneric total pot fi infectate. O plantă inoculată a fost mutată într-o cameră întunecată și o alta, de control(martor), a fost plasată în lumină. 3 serii de experimente au fost făcute. În primele 2 serii, plantele au fost scoase din camera întunecată la 3 zile după inoculare împreună cu planta de control si duse în seră. Infecția a apărut în a 5-a zi la planta de control și în a 6-a zi la plantele ținute în întuneric. În al 3-lea experiment, plantele au fost lăsate 7 zile în camera întunecată. Plantele au prezentat pete și acervuli dezvoltați după intervalul obișnuit de timp. Prin urmare, lumina nu influențează foarte mult procesul de infecție.

Experimentele de inoculare, sugerează că cele mai bune condiții pentru infecție sunt: o atmosferă saturată și o temperatură medie de 75-80 F. În aceste cazuri, petele apar la 3 zile după inoculare.

IV.2. PREPARAREA MEDIILOR DE CREȘTERE

S-au fost folosite 3 tipuri de medii artificiale de creștere: PDA (agar cu cartof-dextroză), BMA (biomalț agar) și MEA (agar cu extract de malț).

PDA (agar cu cartof-dextroză): 39 g PDA preparat industrial în 1000 ml H2O sau pulpa din 200 g cuburi de cartofi, 15 g dextroză și 20 g agar, în 1000 ml H2O.

Biomalț agar: 20 g biomalț și 20 g agar în 1000 ml H2O

Agar cu extracț de malț: 30 g malt extract, 3 g peptone din boabe de soia meal și 15 g agar în 1000 ml H2O

La un litru de mediu artificial autoclavat și răcit au fost adăugate 50 mg din fiecare antibiotic: sulfat de streptomicină, penicilină G, clorhidrat de clortetraciclină. 10-15 ml din fiecare mediu artificial au fost turnați în vase Petri. Vasele Petri au fost marcate pe partea inferioară cu 4 puncte de marker permanent, iar mediul de creștere de deasupra acestor puncte a fost însămânțat cu 10 μL de suspensie conidială ce conține 1 x 10^4 conidii/ml. Vasele Petri însămânțate au fost apoi incubate la 20°C. S-a tăiat mediul de cultură și plasat pe lame microscopice în 10 μL de dietanol. Lama a fost apoi observată sub lumină UV. Pentru a investiga modelul de creștere al Diplocarpon rosae pe speciile genului Rosa, au fost folosite diferite tehnici microscopice și histochimice. Evaluările microscopice au fost realizate cu ajutorul microscopului optic și al unui microscop electronic.

IV.2.1. PRELEVAREA PROBELOR

Au fost prelevate probe la intervale de 4 h în primele 72 de ore de la inoculare pentru observarea structurilor fungice post-germinare și pre-penetrare găsite pe suprafața frunzei și pe mediul artificial de creștere. Au fost tăiate bucăți de frunză de 1 cm² de o parte și de alta a nervurii principale și montate pe lame microscopice în 10 μL din 0.05% dietanol cu partea adaxială pe lama de sticlă. Specimenele au fost evaluate fără decolorarea țesutului frunzei sau fixarea țesutului fungic. Porțiuni de 1 cm² de mediu artificial de creștere a fost tratat în același mod. Eșantioanele de frunze de la plante sau frunze detașate au fost prelevate la intervale de 4 h în primele 72 de ore de la inoculare. După a 3-a zi de la inoculare, s-au prelevat eșantioane în fiecare zi. Aceste probe au fost fixate în cloralhidrat și colorate înainte observațiile la microscopul optic. Au fost tăiate bucăți de frunză de 1 cm² de o parte și de alta a nervurii principale și montate pe lame microscopice. Aceeași metodă a fost folosită pentru a pregăti frunzele căzute pentru observațiile microscopice.

FIXAREA CU CLORALHIDRAT

A fost înlăturată clorofila din frunze pentru a putea observa și descrie strucuturile fungice din interiorul țesutului frunzelor, apoi probele au fost colorate. Structurile frunzeei au fost fixate pe suprafața, iar frunzele au fost decolorate în cloralhidrat saturat (250 g/100 ml H2O) la 60°C pentru cel puțin 3 zile. După ce clorofila a fost eliminată din frunze, probele au fost folosite pentru evaluări microscopice.

ÎNCORPORAREA ÎN RĂȘINĂ

Mostrele colectate de la frunzele inoculate la intervale de 4 ore în 48-72 de ore de la inoculare, și apoi zi de zi până la apariția simptomelor, au fost tăiate în bucăți mai mici de 2 x 4 mm². Acestea au fost plasate imediat în soluție fixatoare de 8% formaldehidă : 8% glutaraldehidă : 0.2 M agent de tamponare-acid cacodilic și 0.005 g clorură de calciu (Karnovsky, 1965) pentru minim 2 ore la temperatura camerei. Tuburile eppendorf care conțineau fragmentele tăiate în soluție fixatoare, au fost plasate într-un borcan etanș de sticlă conectat la o pomă de apă pentru a permite soluției fixatoare să pătrundă rapid și să fixeze structurile din secțiunile de frunză și pentru a înlătura excesul de aer din fragmentele de frunză. Mostrele au fost apoi sălate de 10 ori în acic cacodilic și apoi fixate în 2% tetraoxid de osmiu pentru 1-2 ore, potrivit lui Dalton (1955). Acesta crește absorbția electronilor și duce la un contrast mai bun. Mostrele au fost apoi spălate de 8 ori în acid cacodilic pentru 20 de minute per clătire urmate de deshidratare prin creșterea concentrației de etanol. La final, mostrele au fost clătite de 2 ori cu oxid de propilenă pentru 10 minute fiecare. Aceste spălări au fost urmate de infiltrarea mostrelor în rășină și apoi polimerizate.

IV.2.2. SECȚIONAREA

SECȚIUNI SEMI ȘI ULTRA-SUBȚIRI

S-au tăiat secțiuni semi-subțiri de 500 nm grosime cu ajutorul unui cuțit de sticlă 45° și apoi suspendate direct în apă distilată. Secțiunile semi-subțiri au fost ulterior suspendate în apă distilată pe o lamă de sticlă, se usucă pe o placă electrică la 70 ° C și se colorează în albastru de toluidină 0,05% în tampon fosfat 0,01 M (pH 7,4). Secțiunile au fost clătite cu apă de la robinet pentru a îndepărta excesul de colorant, urmată de o clătire în apă demineralizată și în xilen timp de 5 minute fiecare. Secțiunile au fost montate și sigilate în medii Entellan (Merck) și lăsate să se usuce peste noapte într-o cameră de fum înainte de a fi privite sub câmpul luminos al unui microscop optic.V

Când observațiile sub microscopul optic au confirmat prezența structurilor dorite în secțiunile semi-subtiri, secțiuni ultra-subțiri au fost tăiate din același capăt al blocului precum secțiunile semi-subțiri. Secțiunile ultra-subțiri (70-75 nm grosime) au fost tăiate cu un Reichert-Jung ultramicrotom Ultracut E de 70-72 nm grosime cu ajutorul unui cuțit de diamant (Sitte 1982, 1985) și plasate pe grile de cupru sau nichel.V

CONTRASTĂRI

Secțiunile ultra-subțiri au fost apoi contrastate. Intensificarea contrastului înaintea observațiilor sub microscopul electronic a fost realizat prin utilizarea materialului dens de electroni sub formă de săruri de metale grele. Contrastarea a fost realizată în conformitate cu Geyer (1973). Grilele au fost puse în picături de 2% acetat de uranil saturat timp de 8 min și apoi se clătite de două ori în aqua apă bidistilată, apoi puse în picături de soluție de acetat de plumb (Reynolds 1963) timp de 2 min și clătite în 2 schimburi de apa bidistilată. Grilele au fost lăsate să se usuce la aer înainte de a fi stocate într-o cutie de grilă, la temperatura camerei. Contrastarea a fost realizată într-un vas Petri întunecat, căptușit cu parafilm. Grilele au fost apoi observate la un microscop cu transmisie de electroni Zeiss EM 109. V

IV.3. TEHNICI DE COLORARE

BLANKOPHOR

Germinarea conidiei și formarea structurilor de pre-penetrare au fost confirmate prin colorarea specimenului cu colorantul fluorescent blankophor. Același colorant a fost folosit pentru a colora structurile fungice pe medii artificiale de creștere. Blankophorul se leagă de polizaharide cu legături  β-glicozidice. Aceast colorant nu pătrunde în cuticula plantei, leagă peretele celular al agentului patogen de suprafața plantelor, astfel încât conidiile, tuburile germinative și apresorul sunt fluorescente sub lumină UV. Mici blocuri de mediu artificial pe care a crescut ciuperca au fost montate în 10 μl de soluție 0.1% blankophor în 10% etanol înainte de a fi observate. Proba a fost acoperită cu o lamelă de acoperire și observată la microscopul Leitz. V

DIETANOL (Uvitex 2B)

Pentru a determina rata de germinare și pentru a descrie structurile fungice de pre-penetrare găsite pe suprafața frunzelor, probe de frunze proaspete precum blocuri de mediu artificial au fost colorate în 10 μl de 0,05% diethanol. Dietanolul se leagă de polizaharide cu legături  β-glicozidice. Colorantul nu pătrunde cuticula plantelor; de aceea colorează peretele celular al agentului patogen de pe suprafața plantelor, astfel încât conidiile, tuburile germinative și apresorul de pe suprafața plantei sunt fluorescente sub lumină UV. Probele proaspete au fost montate în 10 μl de 0,05% diethanol înainte de a fi observate. Proba a fost acoperită cu o lamelă și observată la microscopul Leitz. V

ACID FUCSINIC

Dezvoltarea agentului patogen în țesutul vegetal precum și reacția de apărare a plantelor la invazia patogenilor la diferite intervale după inoculare au fost descrise după observarea frunzișoarelor fixate și decolorate cu cloral hidrat și apoi colorate cu acid fucsinic. Acid fucsinul se leaga de carbohidrati. Colorează conținutul celulei patogene si mezofilul deteriorat al celulelor plantei. Acidul fucsinic colorează carbohidrații și structurile fungice în roz. Probele care au fost fixatee și decolorate cu cloral hidrat au fost colorate timp de 12 ore în acid fucsinic 0,01% (Merck) în lactofenol. Probele care au fost colorate foarte întunecat au fost lăsate în soluție de cloral hidrat până când au obținut nuanța dorită.  Bucăți mici de 1 cm² au fost tăiate din frunzulițe și montate în lactofenol. Lama microscopică a fost apoi sigilată cu lac de unghii. Piesele de frunze au fost observate la microscopul de contrast prin interferență.

ALBASTRU DE ANILINĂ

Anilina fluorocrom se leagă la diferiți glucani de origine vegetală și fungică (Nicholas și colab 1994, Van Sengbusch și colab, 1983) și la polizaharidele plantelor (Smith și McCully, 1978). Asocierea sa puternica cu  β -1,3-glucani, cum ar fi caloza se datorează împachetării slabe ale acestui polimer, oferind astfel o mai mare accesibilitate a fluorcromului la aceștia. A fost utilizată o modificare a metodei de preparare descrisă de către Hood și Shew (1996). Frunzișoarele care au fost fixate și decolorate în cloralhidrat saturat au fost lăsate să stea timp de 1-2 ore în 1 M KOH. Frunzișoarele au fost apoi clătite de două ori în apă și o dată în soluție 0,067 M K2HPO4 la pH 9,0 (tampon). În mod normal, nu este necesară ajustarea pH-ului. Frunzișoarele au fost lăsate să rămână peste noapte în soluție tampon și apoi au fost colorate timp de 10-20 min în 0,05% albastru de anilină (Serva) în 0,067 M K2HPO4. Ele au fost apoi montate în tampon sau în glicerol 50% în tampon la pH 9,0 cu suprafața abaxială pe sticlă. Soluțiile de colorare au fost depozitate în sticle de culoare maro la temperatura camerei nu mai mult de câteva luni. V

ALBASTRU DE TOLUIDINĂ

Albastrul de toluidină este un colorant metacromatic care colorează fenolii, papile?, polizaharidele precum și alte macromolecule, oferind tonuri de culoare diferită. Deoarece aproape toate structurile plantei și patogenului preiau colorantul, efectele metacromatice precum colorarea verde – albastru a structurilor care conțin fenoli pot fi diferențiate numai pe preparatele secționate.

Sectiuni semi-subtiri au fost preparate așa cum s-a descris deja, au fost colorate cu 0,1% (g / v) albastru de toluidină în tampon fosfat 0,01 M (pH 7) timp de 1 minut, apoi clătite o dată în apă de la robinet și de două ori în H2Odemin. Datorită proprietăților metacromatice ale acestui colorant, celulele plantei și structurile fungice se colorează violet și pot fi ușor diferențiate sub microscopul optic. Secțiunile au fost apoi montate și sigilate în Entellan (Sigma). Lamelele microscopice au fost lăsate să se usuce peste noapte într-o cameră de fum, înainte de evaluările microscopice. V

IV.4. REZULTATE

RATA GERMINĂRII

La 20 ° C, izolatul G1 a avut o rată medie de germinare de 78,3%.  Dintre toate conidiile germinate, 14,07% au format mai mult de un tub germinativ per conidie, iar 7,36% au format tuburile germinative din ambele celule ale conidiei (Figura 4). Izolatul K1 a avut o rată de germinare medie de 57,9%, iar 20,83% din conidiile germinate au format mai mult de un tub germinativ per conidie. O medie de 7,86% din conidiile germinate au germinat din ambele celule (MSTAT, teste multiple Gama Duncan)

Figura 4: Rata de germinare (%) a conidiilor de Diplocarpon rosae din izolatele G1 și K1 pe frunze de trandafir: Procentul de conidii care au format mai mult de un tub germinativ (TG) și cele care au format tuburi germinative din ambele celule ale unei conidii, ( datele reprezintă valorile medii ± deviația standard a 3 repetări n = 50, p <0,05, test multiplu Gama Duncan).

CAPITOLUL V. STUDII MICROSCOPICE ALE PROCESULUI DE INFECȚIE

V.1. GERMINAREA CONIDIEI ȘI FORMAREA APRESORULUI

Inoculul a fost compus din două celule conidiale. Cele două celule conidiale au germinat rezultând unul sau mai mulți tubi germinativi (Figura 8 a și b), la 9 de ore de la inoculare. Tubul germinativ a fost uneori separat de conidie printr-un perete despartitor (Figura 8a). Lungimea tubului germinativ a variat de la foarte scurt la foarte lung. In cazul in care tubul germinativ era foarte scurt, la nivelul conidiei a fost vazută o extensie a peretelui celular (Figura 8e și 9b) sau a fost găsit direct sub conidium (Figura. 8c și 9a). Astfel de tuburi germinative au fost dificil de observat la un microscop optic. Germinatia a avut loc în orice loc de pe suprafața conidiei. Capătul distal al tubului germinativ a devenit lărgit și rotunjit pentru a forma apresorul (Figura 8a) sau tubul germinativ a pătruns direct în cuticulă (Figura 8b și 9b), adică apresorul nu a fost întotdeauna format. Unde a fost constituit un apresor, era uneori separat de tubul germinativ de către un sept. Pe suprafața apresorului care a fost în contact cu cuticula, un cui penetrant cu un diametru foarte mic a fost format. Pe Figura 8f se poate vedea porul prin care cuiul penetrant crește. Ciuperca a penetrat gazda cu ajutorul cuiului penetrant. Peretele apresorului în contact cu suprafața frunzei și cel al porului sunt mai groși decât peretele celular al conidiei. Peretii conidiei și ai apresorului s-au colorat cu acid fucsinic (0,05%), dar unde a avut loc penetrarea, conidia nu s-a colorat cu acid fucsinic (figura 9c). Inelele de culoare maro au fost observate în jurul porului (Figura 8c și d). Grosimea cuticulei de la site-ul de penetrare a fost retezata curatcleanly severed (Figura 9f). Numai germinarea conidiei, creșterea tuburilor germinative și formarea apresorului au avut loc pe suprafața frunzei,creșterea ciupercilor ulterioare după penetrarea cuticulei a survenit între cuticula inferioară și superioară a frunzei. Nu au fost găsite hife pe suprafața frunzei.

V.2. PENETRAREA CUTICULEI ȘI CREȘTEREA ÎN ȚESUTUL PLANTEI GAZDĂ

După penetrare, cuiul penetrant gave way la o veziculă de infecție (Figura 9b-d). Vezicula de infecție a fost găsită în spațiul subcuticular și parțial trecea pe perete periclinal al celulei epidermice de mai jos. La punctul de penetrare, peretele celulei epidermice de mai jos a reacționat prin formarea unei papile pe partea interioară a peretelui celular. La site-ul de penetrare a fost retezata curatcleanly severed fără deformare interioară, iar peretele din jurul porului de penetrare a fost diferit de restul peretelui celular al plantei gazdă. (Figura 9f). Peretele periclinal al celule epidermice de bază a fost dizolvat inainte de structura ciupercilor, dar membrana plasmatică părea intactă. Efectele cuiului penetrant pe peretele periclinal al celulei au fost amândouă laterală și verticală așa cum pot fi observate în Figura 9f. Straturile opace de electroni au fost observate între apresor și cuticulă, în straturile superioare ale peretelui celular al gazdei mai jos de punctul de penetrare, și în straturile joase ale peretelui celular al gazdei chiar deasupra membranei plasmatice a celulei epidermice (Figura 9f). Peretele celular al gazdei de sub punctul de penetrare a crescut în diametru și și-a modificat proprietățile de colorare (Figura 9e). Hifele au crescut din vezicula de infecție. A crescut în spațiul subcuticular și unele ramuri din regiunea intercelulară dntre celulele epidermice și rar în peretele periclinal al celulelor epidermice.

Majoritatea hifelor primare au crescut în spațiul subcuticular și în straturile superioare ale peretelui periclinal al celulei epidermice, în timp ce unii au crescut în spațiile intercelulare dintre celulele epidermice. Hifele subcuticulare s-au multiplicat si răspândit rapid radiar de la punctul de penetrare spre periferia frunzei. Aceste hife subcuticulare, s-au răspândit inițial lateral fără a invada celulele epidermice ele. Peretele periclinal celular sau în apropierea lui unde miceliul a crescut, este mai larg și colorat în violet descchis, spre deosebire de părțile neinfectate ale plantei unde peretele celular s-a colorat în violet închis când a fost colorat cu albastru de toluidină (Figura 9e). Cuticula de deasupra fiecărui rând de hife subcuticulare primare a fost împinsă ușor în sus.

Hifele subcuticulare primare au crescut în strânsă asociere cu celelalte în perechi sau grupuri de trei sau mai multe hife paralele care au fost puternic apăsate împreună (Figura 10a). Deși firele hifale au grescut în directie radiară din punctul de penetrare, s-au întâlnit în mai multe puncte pentru a forma ceea ce părea a fi o rețea de hife subcuticulare. 2 fascicule se întâlnesc, pentru a forma un fascicul mai mare adică un fascicul și-a schimbat direcția de crestere prin separarea hifelor sale constituente. Aceste hife s-au separat pentru a se dezvolta în două direcții opuse dar paralele și în strânsă cooperare cu celelalte fascicule care au aderat (Figura 10c). O nouă ramură hifală a apărut prin subdivizarea celulei parentale de la capătul distal al hifei pentru a produce 2 noi hife, care au continuat să crească împreună alăturate, în timp ce noi fascicule au apărut din hife care inițial creșteau una lângă cealaltă și care s-au separat pentru a crește la un unghi ascuțit una de cealaltă și față de fasciculul principal(Figura 10a). Fiecare hifă dintr-un fascicul s-a ramificat independent.

Cât hifele subcuticulare s-au răspândit de la punctul de penetrare, au dat naștere la noi hife intercelulare la câteva intervale pe lungimea lor. Aceste hife intercelulare au crescut în părțile inferioare ale țesutului gazdă. Peretele Hifelor subcuticulare a fost initial neted pe toată lungimea lui când au fost observate la microscopul optic, dar pe măsură ce boala avansa, peretele se pliază sau se curbează în mai multe puncte de-a lungul pereților externi ai hifelor. În aceste puncte, diametrul hifelor a crescut, și rezultând o celulă mare a Hifelor subcuticulare, s-a format o hifă îngustă (Figura 10f)Aceasta a penetrat peretele periclinal al celulei epidermice, fie pătrunzând în celula epidermică direct sub ea pentru a forma un haustor (Figura 11b) sau crescând ca o hifă în peretele celular periclinal (Figura 10f). O hifă îngustă s-a format dintr-o hifă subcuticulară care s-a lărgit în afara peretelui celulelor epidermice și apoi a penetrat peretele celular (Figura 10d) pentru a forma un haustor pe partea interioară. Prin urmare, miceliul subcuticular a invadat direct celulele epidermice pentru a forma haustori. Mulți haustori au apărut dint-un punct al hifei dintr-un fascicul și s-au format într-o singuă celulă epidermică (Figura 11a).

La punctul de penetrare, unele hife primare care au apărut din vezicula de infecție, au crescut în lamela mijlocie între celulele epidermice (Figura 11c și d). Aceste hife intercelulare au fost septate. Peretii despartitori au fost observați cu woronin bodies. Hifele intercelulare au crescut în jos către partea inferioară a țesutului frunzei ,dar și lateral între celulele epidermice, astfel că o celulă epidermică era aproape închisă de hifele intercelulare. Creșterea hifelor intercelulare a fost asociată cu dizolvarea totală sau parțială a pereților anticlinali prin creșterea progresivă spre părțile inferioare ale țesutului frunzei (Figura 11c). Din când în când o ramură din hifele intercelulare invadează peretele adiacent al celulei epidermica pentru a forma haustori (Figura 11e, f și 12a) sau a continuat să crească ca o hifă pe partea interioară a peretelui celular, dar la exterior de membrana plasmatică (Figura 13a).Hifele intercelulare și cele ce cresc pe partea interioară a peretelui celulei epidermice a crescut treptat spre celulele palisadice din mezofil pentru a forma o haustori (Figura 13a și b).

La punctul de invazie a celulelor din mezofil, diametrul peretelui celulei gazdă în jurul punctului de penetrare a fost mai mic decât cel al peretelui înconjurător (Figura 12f). Hifa ce crește pe partea interioară a peretelui celulei epidermice a pătruns în peretele dublu al celulei (pererele celular epidermic și palisadic) pentru a forma haustori pe partea interioară celulei palisadice (Figura 13a). La punctul de invadare a celulei, hifa penetrantă s-a redus drastic în diametru, iar peretele celular al gazdei din jurul hifei penetrante a devenit foarte subțire.Secțiunea de hifă penetrantă care a crescut pe partea interioară a peretelui a format gâtul haustorului. Celula palisadică a reactionat la această invazie prin formarea unei caloze groase (Figura 12b și f) prin care hifa penetrantă a crescut înainte de a se extinde la corupul haustorului la capătul distal.

Într-un stadiu avansat al bolii unde stratul palisadic din mezofil a fost invadat și miceliul subcuticular s-a răspândit în mare masură, ramurile hifelor intramurale au fost formate din hifele subcuticulare în pereții periclinali ai celuleor epidermice (Figura 13c). Celula hifei subcuticulare din care a fost formată hifa intramurală s-a lărgit înainte de invadarea peretele intramural pentru a forma hifa intramurală (Figura 10d). Aceste hife intramurale au formate la intervale de-a lungul hifei subcuticulare. Inițial, Hifele intramurale au fost observate in pereții unor celule epidermice, dar la două zile după ce au inceput să se formeze, au fost observate în aproape toți pereții periclinali ai celulelor din zona acoperită de miceliul subcuticular. Creșterea fiecărei hife intramurale a fost limitată la regiunea dintre pereții anticlinali ai unei singure celule, adică fiecare hifă intramurală s-a extins numai peste o singură celulă. La intrarea în contact cu peretele anticlinal, formează haustori în fiecare celulă epidermică adiacentă (Figura 13E). Rareori, haustorii s-au întins sub celula epidermică din hifele intramurale ce crește în peretele periclinal înainte de a veni în contact cu peretele anticlinal (Figura 13d). Celula terminală a hifei intramurale s-a mărit în afara peretelui celulei gazdă înainte de penetrare (Figura 13f).

V.3. FORMAREA HAUSTORILOR ȘI A HIFELOR INTRACELULARE

Structurile asemănătoare cu un haustor au fost formate în celulele epidermice și palisadice invadate de ciupercă, aceste structuri sunt menționate ca haustori în studiu. Haustorii inițiali au fost formați în celulele epidermice din miceliul intercelular. Aceștia au formați foarte devreme în dezvoltarea bolii, adică în primele 24 de ore de la inoculare. Hifele subcuticulare care creșteau progresiv de la punctul de penetrare, au format următoarea serie de haustori în celulele epidermice. Miceliul subcuticular a format haustori la intervale, pe lungimea hifelor în celulele epidermice de sub ele. Hifele unui singur fascicul, în cele mai multe cazuri,a format haustori aproape în același timp, într-o singură celulă epidermică de sub ele. Prin urmare, într- singură celulă epidermică se pot găsi haustori de diferite mărimi și forme (Figura12a).

La un stadiu avansat al bolii, haustorii s-au format în celulele epidermice din miceliul intramural care crește în perete periclinal al celulelor epidermice. Această serie de haustori din hifele intramurale a fost formată inainte de începerea procesului de reproducere. Un haustor a fost închis de o parte a membranei plasmatice a gazdei, care s-a curbat în jurul acestuia. Această parte a membranei a fost numită membrană extrahaustorială (EHM) (Figura 12c). Între corpul haustorului și EHM se află o matrice extrahaustorială (EHX). Unii haustori au fost foarte lungi (> 30 µm) ce au aspect de hife intracelulare, dar cele două ar putea fi diferențiate unele de altele prin faptul că hifele intercelulare nu au regiuni de gât. Haustorii tineri erau mici în dimensiune, dar mai tarziu s-au mărit pentru a ocupa întreaga lungime a celulei gazdă.

În timpul stadiului avansat al dezvoltării bolii, hifele cu diametru mic au fost formate din miceliul intercelular și au crescut prin lumenul celulei. Aceste hife intracelulare se disting de celelalte hife prin faptul că au un diametru mult mai mic .Acestea nu au regiune de gât specifică haustorilor și prin urmare nu se confund cu aceștia. Hifele intracelulare inițiale formate într-o celulă, au fost închise într-o teacă de caloză (Figura 14c), dar cele formate mai târziu erau înconjurate de un strat opac de electroni (Figura 14d). Aceste hife intracelulare se întind de la un capăt al celulei spre celălalt și câteva hife intracelulare au fost găsite într-o singură celulă (Figura 14b). De asemenea, hifele intracelulare au crescut de la o celulă la alta (Figura 14d). În punctul în care penetrează celula invecinată, vârful hifei de penetrare a fost mult redus în diametru,iar peretele celulei gazdă a fost local degradat. Secțiunile longitudinale au arătat că în aceste stadii avansate ale bolii, celulele gazdă își pierd integritatea pe măsură ce sunt invadate de hifele intracelulare. Atunci când o celulă epidermică a fost complet ocupată de hifele intracelulare,organitele celulare nu mai erau vizibile. Celula a redusa la o simplă schiță cu peretele celular începând să se dezintegreze ușor (Figura 16f). Hifele intracelulare erau găsite în principal în celulele epidermice si foarte puține au ajută găsite în celulele palisadice. În infecții mai vechi , au fost găsite mai multe hife subepidermale intracelulare. În frunzele căzute, numărul de hife intracelulare per celulă gazdă au crescut (Figura 16d).

V.4. FRUCTIFICAREA

În stadiul avansat al bolii, după începerea formării hifelor intracelulare, s-au format prelungiri în formă de degete la intervale de-a lungul hifelor subcuticulare (Figura 14E). Aceste prelungiri au avut celule mai scurte decât hifele, au crescut radiar de la un punct al hifei, și s-au ramificat dichotomic pentru a da aspectul unui ventilator(evantai) .Această structură în formă de evantai a devenit baza unui acervul. Vârful fiecărei prelungiri în formă de degete s-a curbat în sus și a devenit conidiogeneous cutting off a două sau a unei celule conidiale (Figura 15c și f). Conidiua cu două celule a fost separată de conidiofor printr-un sept. Celula îngustă și cu vârf ascuțit a conidiei era atașată de conidiofor, pe când celula cu un vârf mai rotunjit era orientată în sus (Figura 15c). Conidiforul a fost foarte scurt și numai o singură conidie a fost tăiată de la fiecare conidiofor. În citoplasma conidiilor cu 2 celule, se observă vacuole (Figura 15c și f). În același acervul ce conține conidii formte din 2 celule, au fost găsite microconidii formate dintr-o singură celulă.(Figura 15c și f).Microconidiile sunt mai scurte și mai înguste decât conidiile formate din 2 celule și se găsesc pe conidiofori diferiți de cei pe care se găsesc conidiile. Microconidia se deosebea de celelalte celule rotunde care au fost de asemenea găsite în fiecare acervul. Aceste celule rotunde nu au fost suportate pe conidiofori și formarea lor a precedat formarea condiilor.

Acoperișul acervulilor era cuticula plantei. La formarea conidiilor, în acervuli, cuticula a fost împinsă în sus pentru a forma o structură în formă de cupolă care era mai mult sau mai puțin simetrică (figura 15a)Acervulii aveau un aspect de mici puncte negre când au fost observate cu ochiul liber. Sub pavilionul acervulului au fost găsite conidiile și conidioforii, baza acervulului era formată din prelungirile miceliene în formă de deget și o parte din hifele subcuticulare din care s-a format stroma acervulului. Imediat după formarea conidiilor, stromat acervulilor a devenit maro inchis (Figura 15d). Această brunificare a fost responsabilă pentru înnegrirea locului infectat care dă aspectul de pete negre specifice bolii. Când acoperișul acervulului se rupe, masa de conidii mature iese la exterior(Figura 15E și 16a)

Microfotografiile TEM ale acestor frunze au arătat că ciuperca a penetrat cuticula inferioară a frunzei și a ajuns în celulele epidermice. În jurul hifelor s-a format un perete gros de caloză, astfel ca nu au reușit să treacă dincolo de celulele epidermice (Figura 17d)

V.5. VERNALIZAREA

Frunzele de trandafir infectate cad relativ ușor cu o ușoară atingere de deget sau adiere de vânt. Unele frunze bolnave au rămas atașate de plantă în timpul iernii. S-a observat anastomozarea hifelor subcuticulare și acervuli subcuticulari care conțin conidii. Pereții hifali subcuticulari erau de culoare maro și mai groași decât pereții hifelor normale, adică au fost puternic melanizați (Figura 17E). Structuri rotunde spre ovale, închise la culoare, cu suprafața exterioară ornamentată, s-au format pereții groși ai miceliului subcuticular și din miceliul prezent în celulele epidermice. Aceste structuri păreau goale și aveau pereți groși care au fost dificil de zdrobit(Figura 18a).

În unele cazuri, hifele subcuticulare melanizate puternic au tăiat 2 celule asemănătoare cu structura conidiei(Figura 17f). Secțiunile semi-subțiri au arătat că țesuturile plantei au fost puternic degenerate,iar în celulele epidermice au fost găsite multe structuri rotunde ornamentate. Aceste structuri erau umplute cu celule mici (Figura 18b). În alte secțiuni structuri cu formă de apotecii au fost observate sub epidermă (Figura 18c).

Pe tulpină au fost observate conidii germinate, hife subcuticulare (Figura 18E), haustori în celule și acervuli deschiși din care au ieșit conidii (Figura 18f).

Figura 8: Fotografii cu Diplocarpon rosae în frunze de trandafir la microscopul optic, (a) o conidie care germinează (C), un tub germinativ (TG), un sept (S) și un apresor (A), (b) o conidie (C) și un tub germinativ scurt (TG) care pătrund gazda fără a forma un apresor, (c) un inel de culoare maro (IM) format la punctul de penetrare, (d) un inel de culoare maro (săgeată) format la punctul de penetrare unde este se formează un tub germinativ extrem de scurt, (e) un tub germinativ foarte scurt format direct sub conidie și pereții consolidați ai apresorului(săgeata), (f) un site de penetrare care prezintă showing print of an appresorium (AP) și un por de penetrare (PP) (după Gachomo, 2005)

Figura 9: Fotografii cu Diplocarpon rosae în frunze de trandafir la microscopul optic și o microfotografie la microscopul electronic(f): (a) punct de penetrare (săgeata) chiar sub conidie, (b) o conidie (C) și o penetrare directă a gazdei fără apresor bine definit, pereții tubului germinativ scurt și porul de penetrare (PTG) sunt întăriți și colorați cu acid fucsinic, o veziculă este (V) formată la penetrare, (c) un site de penetrare mai jos de conidie, cu un por de penetrare (PP), veziculă de infecție (V) și hifa primară(HP) formată din aceasta (e) un site de penetrare cu hifa penetrantă (SP) peretele periclinal al celulei, cu schimbarea grosimii peretelui celulei gazdă și proprietățile sale de colorare, (f) un site de penetrare cu dizolvarea cuticulei (săgeată) și dezintegrarea peretelui celular în jurul hifei de penetrare. (după Gachomo, 2005)

Figura 10: Fotografii cu Diplocarpon rosae în frunze de trandafir la microscopul optic:
(a) hifă subcuticulară crescând într-un fascicul de hife paralele, (b) celulele lărgite formate chiar înainte de penetrarea celulelor epidermice de sub hifele subcuticulare de la (a), (c) două fascicule care trec unul peste altul (săgeata), (d) o hifă (H) formată de hifele subcuticulare în peretele periclinal care se mărește chiar înainte de a pătrunde în peretele celulei epidermice, (e) cele 2 fascicule se unesc formând un fascicul mai mare, (f) o hifă subcuticulară invadând peretele periclinal, celula terminală se extinde în afara peretelui celular. (după Gachomo, 2005)

Figura 11. Fotografii cu Diplocarpon rosae în frunze de trandafir la microscopul optic și microfotografii cu Diplocarpon rosae la microscopul electronic: (a) haustorii formați dintr-un fascicul de hife subcuticulare în celulele epidermice de sub ele, (b) un haustor format de hifele subcuticulare în celulele epidermice de sub el, corpul haustorului (CH), gâtul haustorului (GH) acoperit de caloză, (c) o hifă intercelulară (HI) crescând între două celule epidermice, dizolvarea parțială a celulei (săgeți), (d) haustorii (H) formați într-o celulă epidermică și o celulă din mezofil din hife intercelulare (HI), (e), hife intercelulare (HI), care au format haustorii, (H), în celule epidermice, (f) un haustor format într-o celulă epidermicădin hifele intercelulare,se observă forma corpului haustorului (CH). (după Gachomo, 2005)

Figura 12. Fotografie cu Diplocarpon rosae în frunze de trandafir la microscopul optic(a) și microfotografii de Diplocarpon rosae la microscopul electronic(b,c,d,e,f) : (a) haustorii de diferite forme și mărimi formați în celulele epidermice de hife ce cresc în diferite părți ale gazdei, (b) gâtul haustorului înconjurat de caloză (C), (c) corpul haustorului (H) înconjurat de o matrice extrahaustorială (XEH) care este inclusă în matricea extrahaustorială(MEH), (d) MEH se află în apropiere de capătul proximal al haustorului (H), (e) o hifă intracelulară crescând prin celula epidermică, (f) haustor format într-o celulă din mezofil de hifele intracelulare în (e), gâtul haustorului este închis de un dop calozic (C). (după Gachomo, 2005)

Figura 13: Fotografii cu Diplocarpon rosae în frunze de trandafir la microscopul optic(c,d,e) și microfotografii cu Diplocarpon rosae la microscopul electronic(a,b,f) ce prezintă (a) o hifă (HY) crescând în interiorul peretelui celular epidermal,dar la exterior de membrana plasmatică invadează mezofilul celului subadiacente, haustori (H), (b) o hifă intercelulară, (HI) ce invadează mezofilul, (c) hifă intramurală (săgeata) formată din hufele subcuticulare, (d) hifele intramurale formează haustori în celulele epidermice subadiacente, (e) hifele intramurale formează haustori într-o celulă epidermică care vine in contact cu peretele anticlinal, (f) o hifă intramurală (IM), își mărește dimensiunea înainte de a forma un haustor(H), în celula epidermică de jos, se observă dizolvarea peretelui celular. (după Gachomo, 2005)

Figura 14: : Fotografii cu Diplocarpon rosae în frunze de trandafir la microscopul optic(a,b,e,f) și microfotografii cu Diplocarpon rosae la microscopul electronic(c,d) ce prezintă :(a) înnegrirea unor celule din mezofil la invazia ciupercii, (b) hife intracelulare într-o celulă epidermică, (c) una dintre hifele intracelulare inițiale din celulele epidermice închise într-un dop calozic, (d) o hifă intracelulară într-o celulă epidermică pătrunde prin peretele celular dublu pentru a invada mezofilul celulei subadiacente, (e), prelungiri în formă de degete crescând de la hifele subcuticulare pentru a forma baza acervulilor, (f) stroma acervulilor. (după Gachomo, 2005)

Figura 15: Fotografii cu Diplocarpon rosae în frunze de trandafir la microscopul optic și o microfotografie cu Diplocarpon rosae la microscopul electronic(f) ce prezintă: (a) un acervul în creștere cu cuticula de deasupra ușor împinsă în sus, (b) conidii în acervul, (c) un acervul matur cu microconidii și conidii, structuri rotunde pot fi văzute în fiecare dintre celulele conidiale, (d) înnegrirea aceervulului, (e) un acervul matur deschis la partea apicală, (f) conidii mature cu un perete despartitor între celulele conidiale, conidiile unicelulare se dezvoltă dintr-un conidiofor diferit. (după Gachomo, 2005)

Figura 16: Fotografii cu Diplocarpon rosae în frunze de trandafir la microscopul optic și o microfotografie cu Diplocarpon rosae la microscopul electronic(f) ce prezintă: (a) un acervul matur care s-a deschis la partea apicală, (b) doi acervuli goi care s-au deschis în diferite puncte (săgeți), (c) un acervul gol cu stroma în creștere, (d) miceliul intracelular, subepidermal format la sit-uri vechi de infecție, (e) hife intracelulare într-o celulă epidermică, (f) hife intracelulare într-o celulă epidermică cu o ușoară dizolvare a peretelui celular (săgeata). (după Gachomo, 2005)

Figura 17: Fotografii cu Diplocarpon rosae în frunze de trandafir la microscopul optic și o microfotografie cu Diplocarpon rosae la microscopul electronic(d) ce prezintă: (a) un miceliu subcuticular crescând în jurul unei stomata pe suprafața inferioară a frunzei, (b) haustorii (H) în celulele de garda stomatal, (c) un acervul deschis (AC) în apropierea stoma (S) pe partea inferioară a frunzei, (d) dopul calozic închizând hifele în celule epidermice, (e)înnegrirea miceliului subcuticular, (f) structuri asemănătoare conidiilor tăiate din miceliul înnegrit pe frunzele vernalizate. (după Gachomo, 2005)

Figura 18: Fotografii cu Diplocarpon rosae în frunze de trandafir la microscopul optic, (a) o structură puternic ornamentată găsită în frunzele vernalizate, (b) structurile ciupercii(FT), (c) o structură subepidermică formată în frunze vernalizate (d) structura puternic ornamentată cu o deschizătură la un capăt (săgeata), (e)hife paralele formate sub cuticula tulpinii de trandafir, (f) cuticula (C) expune un acervul (AC) format pe tulpină. (după Gachomo, 2005)

CONCLUZII

BIBLIOGRAFIE

1–Gachomo W. Emma, 2005, Studies of the life cycle of Diplocarpon rosae Wolf on roses and the effectiveness of fungicides on pathogenesis. Inaugural-Dissertation, Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität zu Bonn.

2–Săvulescu O., 1969; Bolile plantelor ornamentale din România, Ed. Academiei Republicii Socialiste România.

3– Horst Ralph Kenneth, Cloyd Raymond A., 2007, Compendium of Rose Diseases and Pests, Second Edition, APS Press.

4– Aronescu A., 1934, Diplocarpon rosae: from spore germination to haustorium formation, Bulletin of the Torrey Botanical Club 61: 291-329, pls. 16-20.

5–Wolf FA 1912. The perfect stage of Actinonema Rosae. Bot. Gaz. 54: 218-234.

6–Wolf FA 1926. Leaf scorch disease of strawberries. N.C. Agr. Exp. Sta. Tech. Bull. 28:

1-16.

7–Agrios N. G., 2005. Plant pathology. Fifth edition, Academic press, London, New York

8– Nicholas RO, Williams DW and Hunter PA 1994. Investigation of the value of β- glucan-specific fluorochromes for predicting the β-glucan content of the cell walls of zoopathogenic fungi. Mycol. Res. 98: 694-698.

9– Van Sengbush P, Hechler J and Muller U 1983. Molecular architecture of fungal cell walls. An approach by use of fluorescent markers. Eur. J. Cell. Biol. 30: 305-312.

10– Hood ME and Shew HD 1996. Applications of KOH-analine blue fluorescence in study of plant-fungal interactions. Phytopathol. 86: 704-708.

11– Baker JC, Harmon GL, Glazener AJ and Orlandi EW 1995. A non-invasive technique for monitoring peroxidative and H2O2 scavenging activities during interactions between bacterial plant pathogens and suspension cells. Plant Physiol. 108: 353-359.

12–Baker KF 1948. The history, distribution and nomenclature of the Rose black spot fungus. Plant Dis. Rep. 32: 260-274,

13–Popescu Gh., 1993; Fitopatologie , Edit. Tehnica, București

14–Barbu Valeria, 1965, Cercetări asupra ruginii și pătării negre a trandafirului, Teză de doctorat, Universitatea București.

15—Gherghinescu Sorina Maria, 2014, Boli ale unor soiuri de trandafiri din colecția Grădinii Botanice “Dimitrie Brândză” din București.

16– Bruce A. Watt, 2013. . Black Spot of Rose, Pest Management Fact Sheet #5097, University of Maine

17–Palmer JG, Sachs IB, and Semeniuk P 1978. The leafspot caused by Marssonina rosae

observed in scanning electron and light microscopy. Scanning Electron Microscopy 2:

1019-1026.

18–Palmer JG, Semeniuk P and Stewart R N 1966. Roses and blackspot. I. Pathogenicity

to excised leaflets of Diplocarpon rosae from seven geographical locations. Phytopathol.

56: 1277-1282.

19–Palmer JG, Semeniuk P and Stewart RN 1966. Roses and blackspot. II. Seasonal

variation in host susceptibility and decline of virulence in culture of conidia from

Diplocarpon rosae. Phytoplathol. 56: 1283-1286.

20–Lyle EW 1943. Black spot on rose canes. Am. Rose Annu. 155-156

21– Frank B.,1896. Die pilzparasitären Krankheiten der Pflanzen, 2, 574 p

22—Cook R.T.A, 1981, Overwintering of Diplocarpon rosae , Wisley, England. Trans. Br. Mycol. Soc.

23–Dalton AJ 1955. A chrome-osmium fixative for electron microscopy. Anat. Rec. 121:

281

24–Karnovsky MJ 1965. A formaldehyde-glutaraldehydehyde fixative of high osmolarity

for use in electron microscopy. J. Cell Biol. 27: 137-138.