Lect . univ. Dr. ing. Marcela -Elisabeta Bărbînță -Pătrașcu [619869]

UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI , FACULTATEA DE FIZICĂ
SPECIALIZARE A: BIOFIZICĂ

LUCRARE DE LICENȚĂ

Aspecte biofizice privind prepararea unor hibrizi
utilizați ca adjuvanț i in terapia cancerului

Coordonator științific:
Lect . univ. Dr. ing. Marcela -Elisabeta Bărbînță -Pătrașcu
CSIII Dr. Mihaela Bacalum

Absolvent: [anonimizat]-Elena Lepădatu

București ,
Iunie 2018

2

Mulțumiri

Doresc să adresez mulțumirile cuvenite tuturor celor care, direct sau indirect, au
contribuit la realizarea acestei lucrări.
Pe parcursul acest or studii , am avut sprijinul permanent al doamnei Lect. univ. Dr. ing.
Marcela -Elisabeta Bărbînță -Pătrașcu, Facultatea de Fizică, Departamentul de Electricitate,
Fizica stării solide și Biofizică, căruia țin sa îi mulțumesc pentru îndrumarea, încrederea și
sfaturil e oferite pe perioada realizării acestei lucrări.
De asem enea, doresc să îi aduc pe această cale , sincere mulțumiri domnișoarei CSIII
Dr. Mihaela Bacalum, Institutul Național de Fizică și Inginerie Nucleară “Horia Hulubei”
(IFIN -HH), Departamentul de Fizic a Vieții și Mediului, pentru bunăvoința acordată,
îndrumarea, punerea la dispoziție a laboratorului și a materialelor necesare în vederea
realizării experimentelor.
Nu în ultimul rând, aș dori să mulțumesc atât familiei mele , cât și familiei spirituale
pentru îndrumarea în alegerea acestei facultăți, aprecierea, încrederea și suportul moral oferite
pe tot parcursul anilor de studiu.

3
Contents
Introducere ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………… 4
Capitolul I: Cancer.Generalități ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………. 6
I.1.Celula tumorală vs celula sanatoasă. Structura celulei tumorale ………………………….. ……………. 6
I.2. Factorii care determină apariția cancerului ………………………….. ………………………….. ………………. 7
I.2.1 Factorii exogeni ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………… 7
I.2.2. Factorii endogeni ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………. 10
I.2.3. Factorii modificabili ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………… 10
I.2.4. Factorii nemodificabili ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……….. 11
Capitolul II. Cancerul de colon. Particularități ………………………….. ………………………….. …………………… 12
II.1 Colonul ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……… 12
II.2. Bacteriile din intestin. R ol și exemple ………………………….. ………………………….. ……………………. 14
II.3. Simptomele cancerului de colon și manifestarile clinice într -o etapă avansată ……………………. 15
II.4. Statistica cancerului de colon în lume ………………………….. ………………………….. ……………………. 17
Capitolul III. Metode util izate în terapia cancerului de colon ………………………….. ………………………….. 21
III.1 Metode clasice ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………. 21
III.2 Metode modern ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………….. 22
Capitolul IV. Prezentarea detaliată a metodelor specifice de rezolvare a problematicii abordate ……. 28
IV.1 Fitosinteza nanoparticulelor de argint ………………………….. ………………………….. …………………… 28
IV.2 Metode de caracterizare spectrală a AgNPs ………………………….. ………………………….. …………… 31
IV.3 Efectul nanoparticulelor de argint asupra adenocarcinomului de colon ………………………….. … 33
IV.3.1 Culturile celulare și mediile utilizate ………………………….. ………………………….. ……………….. 33
IV.3.2 Determinarea viabilității celulare ………………………….. ………………………….. …………………… 33
IV.3.3 Rezultate și discuții ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………….. 35
Concluzii ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………….. 41
Bibliografie ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………. 42

4
Introducere

Robert Hook este marele om de știință care în anul 1665, în cartea sa intitulată
“Micrographia” , a descris pentru prima dată celula, unitatea de bază structurală și
fundamentală a tuturor organismelor vii. “Acest bloc de viață” poate scăpa de sub controlul
mecanismului de autoreglare suferind multiplicări dezordonate , ceea ce duce la apariția
canceru lui, cea mai cruntă boală a secolului, care nu ține cont de vârstă, sex sau naționalitate.
Cancerul de colon este al treilea cel mai frecvent tip de cancer care apare la bărbați și
al doilea ca frecvență la femei [Ferlay și colab., 2014].
De-a lung ul timpului, oamenii de știință au dezvoltat mai multe metode de tratare a
cancerului. Metodele clasice sunt chimioterapia și radioterapia . Tratamentul chimioterapeutic
este unul invaziv, care deși a adus beneficii în rândul pacienților tratați, s -a dovedi t că a
afectat și alte țesuturi sănătoase din organism. Acest aspect important, a dus la investigarea
unor noi metode de terapi e, astfel a luat naștere nanomedicina .
Cheia pentru progresul tehnologiei, a fost sugerată de fizicianul Feynman, în anul
1959, când a afirmat, la unul din cursurile sale de la Cal Tech, că: “Exist ă o mulțime de spații
în partea inferioară a camer ei”, preconizând apariția nanomaterialelor. Această știință descrisă
de Feynman, a fost numită în anul 1974, nanotehnologie , de profes orul Taniguchi Nario, unul
dintre studenții săi [Appenzeller , 1991].
În ultimii 50 de ani, mai multe tipuri de nanoparticule metalice sub diferite forme,
mărimi și naturi chimice, au demonstrat o eficacitate ridicată în transportul medicamentelor
antic anceroase, antibiotice și chimioterapeutice. În cazul cancerului de colon, nanoparticule le
ajung pasiv la nivelul țesutului tumoral, profitând de efectul îmbunătățit de pătrundere și
fixare, oferit de drenajul vascular și limfatic al tumorilor [Morones și colab., 2005].
Sinteza nanoparticulelor metalice cu ajutorul extractelor vegetale, este o ramură
importantă a nanotehnologiei, deoarece plantele acționează atât ca agenți reducători, cât și ca
agenți de stabilizare a nanoparticulelor metalice rezultate , datorită diverșilor metaboliți
secundari din extractele vegetale.
Lucrarea de față are ca scop fitosinte za nanoparticulelor de argint pentru utilizarea lor
ca adjuvanți în terapia cancerului de colon.
Lucrarea prezentată este structurată pe 5 capi tole cu subcapitolele aferente:

5
În Capitolul I, intitulat “Cancer. Generalită ți”, este prezentată definiția cancerului și
factorii de risc care determină apariția lui.
În Capitolul al II-lea, intitulat “ Cancerul de colon. Particularităț i” este prezentat ă
structura colonului, particularitatea de a avea cea mai bogată microbiotă, simptomele
cancerului de colon, complicații și satistici în lume.
În al III-lea capitol, intitulat “Metodele utilizate în terapia cancerului de colon” sunt
prezentate atât metode le clasice de tratare a cancerului de colon, cât și metodele moderne,
bazate pe nanomedicin ă.
În Capitolul al IV-lea, intitulat “Prezentarea detaliată a modelelor specifice de
rezolvare a problematicii abordate”, este prezentată fitosinte za nanoparticulel or de argint,
metodele de caracterizar e și evaluare a biocompatibilităț ii și efectul nanoparticulelor de argint
asupra adenocarcinomului de colon.
Lucrarea se încheie cu punctarea “Concluzii lor” ce se desprind în urma interpretări i
rezultatelor experiment ale.

6
Capitolul I: Cancer.Generalităț i

Cancerul reprezintă un grup de afecțiuni inițiate de modificări cumulative a unei celule
sau a unui grup de celule. Acestea invadează țesuturile din apropiere și se pot răspândi prin
intermediul sâng elui sau al sistemului limfatic la distanță de locul inițial, existând posibilitatea
de a afecta alte organe sau țesuturi. Există foarte multe tipuri de cancer care apar sub influența
unor factori d iferiț i, prin urmare comportamentul, simptomele generate ș i răspunsul la
tratament sunt diferite [Stephens și colab., 2009].
Oncologul Willis, în anul 1951, definește cancerul ca “ o masă anormală de țesut a
cărei creștere se produce în exces faț ă de normal, este necontrolată și neconcordantă cu cea a
țesuturilo r normale și persistă în același mod excesiv după încetarea stimulului care a provocat
schimbarea” [Willis, 1960]. Willis subliniază factorul de independență, caracteristică esențială
a tumorilor maligne, chiar dacă celulele tumorale rămân dependente de ga zdă prin aport
sanguin și prin nutriție.

I.1.Celula tumorală vs celula sanatoasă . Structura celulei tumorale

Între cele doua tipu ri de celule tumorale (maligne și benigne) există numeroase
diferențe majore prin intermediul cărora se explică modul î n care tumorile maligne (gr up de
celule tumorale) afectează organismul mult m ai agresiv decâ t tumorile benigne (grup de celule
necanceroase).
Cea mai cunoscută diferență este modalitatea prin care acestea se dezvoltă. Celulele
sănătoase se opresc din reproduc ere atunci când sunt prezente destule celule pentru
funcționarea organismului în condiții optime, spre deosebire de celulele tumorale care prezintă
o creștere continuă, deseori ducând la formarea unei tumori. Comunicarea și repararea sunt
alte diferențe im portante, celulele tumorale nu pot interacționa cu alte celule și nu sunt
capabile să se repare [Fig. I.1]. Celulele sănătoase răspund la semnalele transmise de alte
celule din apropiere și sunt reparate sau intră în procesul de auto -distrugere, doar dacă sunt
deteriorate sau îmbătrânite. Acest rol de detecție îl deține o proteină numită p53. Dacă această
proteină este afectată printr -o mutație a genei p53, celulele deteriorate nu mai intră în procesul
de auto -distrugere și continuă să se reproducă [Eldridg e, 2018].

7

Figura I .1 Procesul de pierdere a controlului creș terii normale a celulelor tumorale – adaptată
după “National Cancer Institute”.
În figura I.1 se observă atât diviziunea anormală a celulelor tumorale, cât și aspectul
diferit al acestora. Dimensiunea celulei tumorale este mult mai mare spre deosebire de celula
sănătoasă adoptând o formă anormală atât a celulei, cât și a nucleului. Nu cleul celulei
canceroase este mai mare față de cel al celulei sănătoase, deoarece conține un exces de ADN
[National Cancer Institut] .
I.2. Factorii care determină apariț ia cancerului

Eficacitatea prevenirii cancerului necesită cunoașterea factorilor de risc care
declanșează modificări la nivel celular. Factorul de risc reprezintă un eveniment cert care are
ca efect creșterea ratei de îmbolnăvire. Abilitatea celulelor canceroase de a se forma și a
răspunde la propriul factor de creștere depinde de următor ii factori: exogeni, endogeni,
modificabili, nemodificabili [Rizzo ș i colab., 2008].
I.2.1 Factorii exogeni

Cauzele exogene includ un număr mare de agenți și stimuli ce prezintă riscuri
semnificative în apariția modificărilor celulare care inițiază boala malignă. Factorii exogeni
sunt: fumatul, dieta, consumul excesiv de alcool, obezitatea, sedentarismul, factor ii
reproductivi, radiațiile solare, anumite substanțe chimice, medicamente sau virusuri. Conform

8
studiilor recente se consideră ca factorii exogeni sunt responsabili în proporție de 90 % de
apariția tumorilor maligne [Ruddon, 2007].
Conform t abelului I.1, f umatul, alimentația și obezitatea, sunt co relate cu cel mai mare
procentaj de deces, de 30%.

Tabel I.1. Procentajul numarului total de decese atribuite fac torilor de risc ai cancerului
(conform Harvard Center for Cancer Prevention)

Factori i de risc Procen taj
Fumatul 30%
Alimentația (dieta) ș i obezitatea 30%
Sedentarismul 5%
Factorii ocupaț ionali 5%
Ereditatea 5%
Virusurile si alți agenț i biologici 5%
Factorii de creș tere 5%
Factorii reproductivi 3%
Alcoolul 3%
Statutul socio -economic 3%
Factorii geofizici 3%
Poluarea mediului 2%
Radiaț iile ionizante 2%
Medicaț iile și procedurile
medicale 1%
Sarea ș i aditivii alimentari 1%

9

Figura I .2. Numarul de țigă ri consumate pe cap de locuitor î n anul 2016 (adaptat ă după
“World Health Organization ”).
Conform unui studiu realizat de WHO (organizatia mondiala de sanatate), Andora ș i
Luxemburg (Figura I.2. [World Health Organization]) sunt țările cu cel mai mare consum de
țigări în anul 2016 în raport cu celelalte țări, prin urmare riscul de inițiere a bolilor maligne
este mai mare în aceste zone. La polul opus se află India care are un consum pe cap de
locuitor de aproximativ 70 de ori mai puțin. România ocupă poziția 11 în această statistică,
având un factor de risc mediu.
Fumatul este asociat cu următoarele tipuri de cancer: cancerul pulmonar, laringian,
esofagian, renal, de stomac, oro -faringian, al vezicii urinare, leucemia mieloidă, cancerul de
colon sau hepatic. Riscul de a iniția o tumoare malignă este de aproximativ 10 ori mai crescut
în rândul fumătorilor decât în rândul nefumătorilor. Conform studiilor efectuate pe celule în
vitro, fumul de țigară și constituenții din tabac duc la transformarea celulelor normale în celule
maligne [Hecht ș i colab., 2008].

Tabel I.2. Tipurile de cancer care se pot iniția în funcție de alimentaț ie [Carmichael și colab.,
2008].
Alimente Tip de cancer
Consum ridicat de gră simi Colon, sân, uter, prostată
Consum ridicat de carne prăjită Colo -rectal, sâ n, stomac, pancreas 01000200030004000500060007000
Andora
Luxemburg
Belarus
Belgia
Rusia
Grecia
China
Bulgaria
Germania
Spania
Romania
USA
UK
Congo
Peru
IndiaNumarul de țigări consumate pe
cap de locuitor în anul 2016

10
Dietă cu un aport caloric mare Colon, prostată, sân, uter, vezică biliară
Carne roș ie Colon, sâ n
Alcool Faringe, cavitate orală , ficat, stomac, esofag
Sare si alimente afumate Stomac, esofag
Nitriți ș i aditivi alimentari Intestinul subț ire

Din tabelul I.2. reiese că o dietă dezechilibrată favorizează apariția cancerului, iar cel
mai afectat este colonul. Alimentația neadecvată poate duce la apariția obezității [Carmichael
și colab., 2008] care favorizează apariția cancerului esofagian, de co lon și uterin. .

I.2.2. Factorii endogeni

Cauzele endogene sunt caracterizate de factorii endocrini, de imunologie si de genetica
a individului.
Orice dereglare la nivel endocrin poate stimul a aparitia tumorilor maligne la nivelul
sanului, prostatei sau a uterului. Hormonul estrogen este caracteristic femeilor, iar
dezechilibrul sau poate duce la cancerul de san sau uterin, la fel cum hormonul testosteron
este caracteristic barbatilor si dezechilibrul acestuia duce la aparitia cancerului de prostata
[Pepcolino, 2005].
Deficitele imune pot fi atat dobandite , cat si de origine genetica, iar acestea pot initia
aparitia leucemiei, o alta forma a cancerului. Imunitatea este un factor foarte important, iar
deficitul sau poate afecta orice organ din corp favorizand diviziunea anormala a celulelor
[Hecht, 2008].
In conclu zie, atat factorii exogeni , cat si factorii endogeni pot afecta diviziunea
normala a celulelor si pot provoca mutatii . Intre aceste doua tipuri de cauze exista o legatura
foarte stransa , astfel incat contributia acestora este greu de individualizat.

I.2.3. Factorii modificabili

Factorii modificabili sunt legați de profesie și stres.
Stresul psihologic descrie ceea ce simt oamenii când sunt sub presiune mentală, fizică
sau emoțională. Deși este normal să apară acest factor, persoanele care se confruntă cu un
nivel ridicat de stres sau care experimentează în mod repetat pe o perioadă l ungă de timp, pot
dezvolta afecțiuni psihice și/sau fizice. Legăturile dintre stres și cancer pot apărea sub forma

11
comportamentala a persoanei în cauză. Acesta poate duce la supraalimentare, consum de
alcool, fumat, factori care duc la apariția cancerului, așa cum am menționat în capitolele I.2.1
și I.2.2 [National Cancer Institute]. Factorii de risc datorați profesiei includ: expunerea la
gaze chimice, substanțe radioactive, pulberi sau alte aspecte ale locului de muncă. Oamenii de
știință estimează că acesti factori cauzează 4% din cazurile de cancer în Marea Britanie. De
asemenea, profesia care presupune expunerea îndelungată la soare, poate iniția tumori maligne
precum cancerul de piele [Cancer Research UK].

I.2.4. Factorii nemodificabili

Vârsta și sexul sunt doi dintre factorii nemodificabili care constituie posibilitatea
dezvoltării tumorilor maligne.
Îmbătrânirea este partea cea mai puțin evitabilă din viață și constituie un factor de risc
ridicat pentru cancer. Cu excepția câto rva boli maligne care apar exclusiv în rândul copiilor,
persoanele cu vârstă înaintată sunt cele mai predispuse la cancer spre deosebire de persoanele
mai tinere. Comparațiile grupurilor de vârstă la americanii diagnosticați cu cancer între anii
1978 -1981 ilustrează acest fapt. Printre cei cu vârsta cuprinsă între 30 -34 de ani, rata a fost de
71 la 100.000; printre cei cu vârsta cuprinsă între 50 -54 de ani, rata a fost de 501 la100.000,
iar printre cei cu vârsta cuprinsă între 70 -74 de ani, au fost 1772 la 100.000.
În cazul cancerului de colon, s -a observat o creștere de 50% a îmbolnăvirii în ultimii 20 de
ani [University of California Press].
Cancerul este o boală care afectează ambele sexe în mod egal. Deși unele forme de
cancer sunt strict legate d e sex, incidența cancerului este considera tă în general ca fiind
similiară la ambele sexe [Iliana, 2013].

12

Capitolul II. Cancerul de colon. Particularităț i

Cancerul de colon este o afecțiune a colonului și poate debuta ca proliferări benigne de
celule, sub forma polipilor colonici, sau prin transformarea malignă a acestor polipi.
Factorii cei mai importanți care determină apariția cancerului sunt: vârsta, d ieta și informația
genetică (istoricul medical al familiei) [Basil, 1974].

II.1 Colonul

Colonul este în esență un termen folosit pentru intestinul gros. La nivelul acestuia, se
realizează absorbția apei și a mineralelor și depozitează materiile fecale, până la eliminare.
Colonul constituie o parte distală a tractului gastrointestinal, care se extinde de la
cecum (prima parte a intestinului gros) până la canalul anal (Figură II.1). Din punct de vedere
anatomic, colonul poate fi împărțit în patru părți: ascendent, transversal, descendent și
sigmoid. Aceste secțiuni formează un arc care înconjo ară intestinul subțire. Lungimea medie a
colonului este de 1,6 metri, având diametrul de aproximativ 7 cm care descrește până la 3 cm,
pe măsură ce se apropie de anus.
Colonul primește alimentele digerate din intestinul subțire, din care absoarbe apa și ionii, iar
cu ajutorul bacteriilor caracteristice, acestea se descompun și resturile sunt transferate în rect
[Mahmound, 2004].
Din punct de vedere funcțional, prima parte a colonului este responsabilă de absorbția
fluidelor și a sărurilor dizolvate, numite și electroliți, în timp ce cealaltă jumătate are rol de
depozitare și eliminare a reziduurilor.
Mucoasa intestinului gros are un produs de secreție redus cantitativ, dar foarte vâscos, cu un
pH alcalin și lipsit de enzime. Rolul mucoasei este de a favoriza transportul resturilor
alimentare și de a proteja pereții colonului de traumatisme mecanice, substanțe acide sau
toxice [Vinay și colab., 2016] .

13

Figura II. 1. Structura colonului (adaptată după „ASCRS – American Society of Colon and
Rectal Surg eons”).

Polipii care se formează pe mucoasa colonului, sunt de obicei asimptotici și pot
fi: non -neoplazici și neoplazici. Polipii non -neoplazici sunt de dimensiuni mici și în
majoritatea cazurilor, nu devin maligni. Polipii neoplazici, includ adenomii ș i tipurile zimțate,
au dimensiuni mari și, în general, aceștia cresc riscul de apariție a cancerului. Se constată o
relație de directă proporționalitate între dimensiunile polipilor și creșterea riscului de apariție a
cancerului [Basil, 1974].

Figura II.2. Polipi colonici (adaptată după ”NIH – National Cancer Institute”).

14
II.2. Bacteriile din intestin. Rol ș i exemple

Bacteriile care colonizează colonul au o importantă vitală și reprezintă un ecosistem
complex care se dezvoltă în paralel cu gazdele, depinzând de mediul fiziologic al gazdei.
Intestinul gr os are cea mai bogată microbiotă , de aproximativ 10 miliarde de bacterii pe gram.
Populația bacter iană intestinală se stabilizează în primii ani de viață și apoi rămâne stabilă pe
toată durată vieții, dacă nu intervin factori ce pot produce afecțiuni.
Bacteriile “bune“ din intestin, numite și probiotice, sunt bacterii vii care se găsesc în
stare naturală în colon sau în unele alimente. Acestea au rolul de a menține mucoasa
intestin ală în condiții optime, de a proteja intestinul de infecții prin stabilizarea sistemului
imunitar, extrag o cantitate mare de energie din alimente și ajută la metabolizarea
medicamentelor [Geraldine și colab., 2008].
În secolul al XIX -lea, Rudolf Vir chow a afirmat că inflamația declanșată de infecțiile
bacteriene poate favoriza apariția cancerului. Curând după aceea, Robert Koch și Louis
Pasteur au găsit bacterii în tumori.
Mai multe bacterii au fost legate de apariția cancerului prin intermediul i nflamației:
Helicobacter pylori care produce cancerul de stomac, Salmonella typhi -cancerul vezicii biliare
sau Streptococcus bovis -cancerul intestinal [Sun și Kato, 2016].

Figura II.3. Mecanisme generale pentru bacterii asoc iate cu cancerul de colon [Sun și Kato ,
2016].

In figura II.3 este re prezentat mecanismul de disbioză, care rezultă î n urma unui
dezechilibru bacterian. Ca ncerul de colon, apare atunci când disbioza produce o inflamație
cronică , deoarece are loc proliferarea celulelor.

15
II.3. Simptomele cancerului de colon și manifestarile clinice într -o
etapă avansată

Multe dintre simptomele cancerului de col on poti fi cauzate de alte afecțiuni precum:
infecț ii, hemoroizi, sindromul colonului iritabil sau o boala inf lamatorie intestinala [Ke nneth
și colab., 1974].
Principalele simptome ale cancerului de colon sunt:
– Hemoragia rectală (sângele poate fi de culoare maro închis sau roș u deschis);
– Dureri abdominale – acestea poti fi sub forma de crampe sau dureri ascuțite și rezultă
în urma unei fisuri ale mucoasei intestinale sau a unui blocaj provocat de o tumoare.
Dure rile abdominale pot provoca grețuri și vărsă turi;
– Anemi a prin deficit de fier – se află în strânsă legatură cu hemoragia rectală, deoarece
pierderea sângelui implică o pierdere a fieru lui din organism. An emia se manifestă
printr -o stare constantă de oboseală și ameț eli;
– Constipaț ia – eliminarea resturilor alimenta re din organism poate fi blocată de o
tumoare;
– Scăderea inexplicabilă î n greutate – acest simptom se poate manifesta chi ar daca dieta
este sanato asă și neschimbată de-a lungul timpului, deoarece în prezența cancerului de
colon, absorbț ia corecta a substantelor nutriti ve se poate deregla [McDermott ș i colab.,
1981].

Unul dintre cei mai importanți factori nemodificabili în apariț ia cancerului de co lon
este vârsta. Î n tabelul II.1 este prezentată inciden ta cancerului de colon la barbați cu vârste
între 0 ș i 70 de ani, la diferite intervale de timp. Î n tabelul II.2 este prezentat ă aceeași situaț ie
pentru femei .

Tabel II.1 . Procentul de bărbaț i din SU A care dezvoltă cancer de colon la intervale de 10, 20,
30 de ani în funcție de vârsta lor actuală , 2003 -2005 [Haggar, 2009].

Vârsta curentă 10 ani 20 ani 30 ani
30 0.06 0.29 0.96
40 0.23 0.92 2.29
50 0.71 2.14 4.06
60 1.55 3.64 5.06
70 2.51 4.22 Nu sunt date disponibile

16
Tabel II.2 . Procentu l de femei din SUA care dezvoltă cancer de colon la intervale de 10, 20,
30 de ani în funcție de vâ rsta lor actuală , 2003 -2005 [ Haggar, 2009 ].

Vârsta curentă 10 ani 20 ani 30 ani
30 0.06 0.26 0.78
40 0.20 0.72 1.74
50 0.54 1.58 3.16
60 1.10 2.76 4.29
70 1.88 3.61 Nu sunt date disponibile

Probabilitatea de diagnost icare a cancerului de colon crește progresiv după vârsta de
40 de ani și brusc după vâ rsta de 50 de ani. Mai mult de 90% din cazurile de cancer d e colon
apar la persoanele cu vâ rsta de peste 50 de ani [Haggar, 2009].

Cancerul de colon î ntr-un stadiu avansat poate declanșa diverse afecțiuni: ocluzia
intestinală, perforaț ia intestinului sau hemoragia masivă . Toate ace stea pot provoca decesul.
Ocluzia intestinală are cea mai mare pondere de apariție ca urmare a unei complicaț ii a
cancerului de colon. De butul acesteia este de obicei fără manifestări simptomatice și se
dezvoltă prin agravarea constipației, progresiv până la oprirea completă a proce sului de
defecație, provocând dureri acute. Metoda clasică de tratare este de ordin chirurgical, dacă
această procedură implică extirparea parțială a intestinului, se aplică procedura numită
colostomie ( pe o perioadă de timp li mitată sau permanentă colost omia implică aducerea unui
capăt al colonului la nive lul peretelui abdominal astfel î ncat eliminarea reziduurilor alimentare
se va face cu aj utorul unei aplicatoare de stomă) [Fainsinger ș i colab., 1994].

Figura II.4 C olostomia – aplicatoare de stomă [site -“Cancer la colon”]

17
Perforația intestinului poate să apară prin moartea unui ț esut sau a une i celule, proces
denumit necroză , la nivelul tumorii. Aceasta apare în urma creș terii presiunii din interio rul
organului, d in cauza acumulă rii reziduurilor fecale [Jame ș i colab., 2010].

Hemoragia masivă se manifestă prin sângeră ri abundente sau grabirea t ranzitului
intestinal (impiedicând digestia completă ). Această afecțiune este o complicație a cancerului
de colon, rară, și are ca soluție metoda chirurgicală la nivelul tumorii [Jame ș i colab., 2010].
Cancerul necesită diagnosticare promptă și tratare adecvată, în absența acestora apar
complicații care mă resc riscu l de metastazare sau de deces. Î n cazul cancerului de colon pot
apărea suprainfecții, perforaț ii, hemoragii sau supuraț ii ale tumorii . Metastazarea se poate face
atât din aproape în aproape, cât și la distanță atât pe cale sanguină, cât și pe cale limfatică .

II.4. Statistica cancerului de colon î n lume

Cancerul de colon este al treilea cel mai fre cvent tip de cancer apărut la bărbați și al
doilea cel mai frecvent apărut la femei. Există variații geografice ale incidenței, cu rate care
variază de 10 ori la ambele sexe, la nivel mondial. Aproximativ 2/3 din ca zurile de cancer de
colon apar în ță rile cu indici de dezvoltare mari. Aproximativ 95% din cazurile de cancer de
colon sunt adenocarcinoame [Ferlay ș i colab., 2014] .
În tabelele II.3 și II.4 sunt raportate la ță rile cu cele mai multe cazuri de cancer de
colon la bărbați ș i respectiv la femei.

Tabel II.3. Țările cu cele mai mule inciden te ale cancerului de colon la bărbați (î n anul 2012)
[Ferlay ș i colab., 2014].

Nr.crt Țara Rata în funcție de vârstă standard (la 100’000
locuitori)
1 Slovacia 61.6
2 Ungaria 58.9
3 Coreea 58.7
4 Republica Ceha 54.0
5 Slovenia 49.7
6 Olanda 47.5
7 Danemarca 45.9
8 Australia 45.5

18
9 Belgia 45.2
10 Croatia 44.2
11 Spania 43.9
12 Serbia 43.4
13 Irlanda 43.1
14 Israel 43.0
15 Norvegia 42.6
16 Canada 42.6
17 Japonia 42.1
18 Luxemburg 42.1
19 Portugalia 41.8
20 Italia 41.5

Astfel, î n anul 2012, S lovacia a avut cea mai mare rată de incidență a cancerului de
colon în rândul bărbaților, urmată de Ungaria ș i Coreea. Aproximativ 53% din cazurile de
cancer de colon au avut loc în ță rile mai dezvoltate. Cel e mai multe cazuri au fost în Oceania
și Europa și cele mai puține în America Latină ș i Caraibe.

Tabel II. 4. Țările cu cele mai multe incidente ale cancerului de colon la femei (î n anul 2012)
[Ferlay ș i cola b., 2014].

Nr.crt Țara Rata în functie de vâ rsta standard (la 100’000
locuitori)
1 Norvegia 35.8
2 Danemarca 35.7
3 Olanda 33.9
4 Noua Zeelanda 33.5
5 Coreea 33.3
6 Australia 32.0
7 Ungaria 30.5
8 Israel 30.3
9 Belgia 29.5
10 Slovacia 29.3
11 Canada 28.5
12 Islanda 28.2

19
13 Singapore 28.0
14 Irlanda 27.7
15 Italia 27.5
16 Republica Ceha 27.1
17 Slovenia 27.0
18 Sudan 26.5
19 Barbados 26.1
20 Uruguai 25.4

În anul 2012, la femei, N orvegia a avut cea mai mare rată de apariț ie a cancerulu i de
colon, urmată de Danemarca ș i Olanda. Aproximativ 55% dintre cazurile de cancer de colon
au avut loc în ță rile mai dezvoltate. Cea mai mare incident a a cancerului de colon a fost în
Oceania și Europa și cea mai mica incidență în Africa ș i Asi a.

În anul 2012, Coreea a avut cea mai mare ra tă de apa riție a cancerului de colon
însumat atât pentru femei, cât și pentru bărbaț i, urmată fiind de Slovacia ș i Ungaria (Tabel
II.5). Aproximativ 54% din cazurile de cancer de colon au avut loc în ță rile m ai dezvoltate.
Cea mai mare incidență a fost î n Oceania și Europa și cea mai mică incidență în Africa ș i
Asia.

Tabel II. 5. Țările cu cele mai mul te incidente ale cance rului de colon la ambele sexe (în anul
2012) [Ferlay ș i colab., 2014].
Nr.crt Țara Rata în funcție de vâ rsta standard (la 100’000
locuitori)
1 Coreea 45.0
2 Slovacia 42.7
3 Ungaria 42.3
4 Danemarca 40.5
5 Olanda 40.2
6 Republica Ceha 38.9
7 Norvegia 38.9
8 Australia 38.9
9 Noua Zeelanda 38.4
10 Slovenia 37.3
11 Belgia 37.0
12 Istrael 36.7

20
13 Canada 35.9
14 Irlanda 35.2
15 Italia 34.9
16 Singapore 33.9
17 Spania 33.7
18 Croatia 33.1
19 Serbia 32.6
20 Japonia 32.2

21
Capitolul III. Metode utilizate î n terap ia cancerului de colon

De-a lungul timpului, oamenii de știință au dezvoltat mai multe metode de tratare a
cancerului. O metodă clasică de inhibare a celulelor cancero ase este chimioterapia, care deși a
adus beneficii în rândul pacienților tratați, s -a dovedit că afectează și țesuturile săn ătoase din
organism. Din acest motiv, nu se poate numi o metodă universală de tratare a cancerului.
Acest aspec t a condus la necesitatea apariț iei metodelor modern e de tratament care au ca scop
țintirea exactă a tumorii, astfel încât să omoare celulele tum orale și în același timp să mențină
viabilitatea celulelor sănă toase.

III.1 Metode clasice

Chimiotera pia are ca scop estomparea sau încetinirea înmulț irii celulelor canceroase.
Această terapie constă în injectarea intravenoasă sau administrar ea pe cale orala a unor
substanț e chimice, denumite citostatice.
Există trei modalităț i de utilizare a tratamentului cu chimioterapie pentru tratarea
cancerului de colon:
– administrarea î nainte de tratamentul chirurgical în combinație cu ședințe de radioterapie
pentru a micșora tumoarea î nainte de extirpare;
– administrarea după tratamentul chirurgical pen tru a diminua riscul de recidivă a cancerului
de colon;
– administrare a pentru a controla simptomele și pentru a î ncetini metastazarea.
În primele doua metode de adminis trare, chimioterapia este numită tratament adjuvant.
[Cancer Research UK].
Aceasta metodă, s -a dovedit a fi eficientă din punct de vedere al distrugerii celulelor
tumoral e, dar fiind o terapie sistemică – ce intervine asupra î ntregului organism, po ate afecta și
viabilitatea ceulelor sănătoase sau poate afecta ș i alte organ e ale corpului, determinând o
toxicitate generală .
Chimioterapia, denumită popular și “leacul care lasă urme”, prezintă numeroase efecte
secundare: căderea pă rului, a unghiilor, a nemie, infertilitate etc. De asemenea, administrarea
acestui tip de tratamen t, duce la slă birea sistemului imunitar, implic it la vulnerabilitatea la
infecții. De exemplu, î n tratarea cancerului prin intermediul chimioterapiei, dacă sistemul
imunitar este s lăbit, administrarea citostaticelor poate afecta plămâ nii, ficatul sau rectul
[Nygren, 2009].

22

Figura III.1 Stadiile cancerului de colon [Dragulin, 2013]

Terap ia cancerului de colon depinde în mod direct de stadiul și de gradul evoluției
cancerului. Deș i fiecare pacient beneficiază de un tratament personalizat, studiile arat ă că
stadiul 1 nu necesită chimioterapie. În stadiile 2 și 3, chimioterapia este folosită ca adjuvant
pentru chirurgie sau radioterapie. Î n stadiul 4 al cancerului de col on, chimioterapia este
utilizată pentru a crește durata de viață sau pentru ameliorarea simptomelor [Schrag, 2002].
Timp de mulț i ani, singurul medicament citostatic utilizat în chimioterapia adjuvantă
pentru tratamentul cancerului de colon, a fost fluoropiri midina 5 -fluorouracil, un analog al
timinei care inhibă replicarea ADN -ului ( acidul dezoxiribonucleic ) [Noordhuis, 2004].

III.2 Metode modern

Necesitatea dezvoltă rii unor noi metode de terapie a cancerului de colon este dată de
statistica mortalității î n lume. Astfel, î n Statele Unite, cancerul de co lon este a doua cauza
principală de deces. Decesul unui pac ient bolnav de cancer de colon întervine atunci când
tumoarea metastazează la alte organe, î n special la ficat. Din a cest motiv, detectarea precoce ș i
inițierea terapiei, sunt cruciale [Ki ș i colab., 2012].

23
Nanomedicina constă î n apli carea nanotehnologiei, în domeniul medicinei, având ca
scop menținerea sau îmbunătățirea stării de sănătate a pacienț ilor, la nivel molecular. Această
știință este o meto dă modernă de tratar e a cancerului de colon [Farok ș i Langer, 2006].
Cheia pentru progr esul tehnologiei a fost sugerată de fizicianul Feynman, în anul 1959,
când a afirmat, la unul din c ursurile sale de la Cal Tech, că: “Există o mulțime de spații în
partea inferioară a camerei” preconizând apariț ia nanomaterialelor . Această știință , descr isă
de Feynman, a fost numită î n anul 1974, nanotehnologie , de profesorul Tani guchi Nario, unul
dintre studenții să i [Appenzeller , 1991].
Nanotehnologia se referă la ramura științei și a ingineriei dedicată materialelor cu
dimensiuni de ordinul sutelor de nanometri (nm) sau mai puțin.
Nanopartic ula este componenta fundamentală î n fabricarea unei na nostructuri, fiind
mult mai mică decâ t obiectele descrise de legile de miș care a le lui Newton, dar mult mai mare
decât un atom sau o molecula simplă care este guvernată de mecanica cuantică .
Nanoparticulele metalice sunt de mare interes științific, deoarece sunt văzute ca o
punte de legatură înt re materialele brute și structurile atomice și moleculare. Proprietătile
materialelor se schimbă atunci când mărimea lor se apropie de scală nanometrică [Mody și
colab, 2010].
Cele mai utilizate nanoparticule metalice sunt cele obținute din metale nob ile: platină,
aur și argint, deoarece, datorită proprietăților optoelectronice și fizico -chimice, acestea au o
aplicabilitate mare în diferite domenii: medicină, mecanică, optică, electronică, catalizatori,
medicamente etc [Popă și colab., 2015].
În ultimii 50 de ani, mai multe tipuri de nanoparticule metalice sub diferite forme,
mărimi și naturi chimice, au demonstrat o eficacitate ridicată în transportul medicamentelor
anticanceroase, antibiotice și chimioterapeutice. În cazul cancerului de colon, na noparticulele
ajung pasiv la nivelul țesutului tumoral, profitând de efectul îmbunătățit de pătrundere și
fixare, oferit de drenajul vascular și limfatic al tumorilor. Acest lucru permite trecerea plasmei
sanguine din vase în spațiile interstițiale și acum ularea nanoparticulelor în celulele canceroase,
îmbunătățind astfel, eficacitatea terapiei.
Sinteză nanoparticulelor de argint se poate efectua prin metode fizice, chimice și
biologice (sau ecologice), însă primele două metode s -au dovedit destul de c ostisitoare și
nocive pentru mediul înconjurător, în timp ce metodele biologice sunt mai puțin costisitoare,
simple și se obțin într -o manieră ecologică, fără a produce deșeuri toxice.
Sinteza nanoparticulelor metalice, cu ajutorul extractelor vegetale, este o ramură
importantă a nanotehnologiei, deoarece plantele, acționează atât ca agenți reducători, cât și ca
agenți de stabilizare a nanoparticulelor metalice, datorită diverșilor meta boliți secundari din
extractele vegetale.

24
Nanoparticulele metalice pot fi fitosintetizate fie intracelular, implicând cultivarea
plantelor în medii optime, fie extracelular, implicând utilizarea extractelor din diverse părți ale
plantelor: frunze, tul pini, rădăcini, flori, scoarțe sau semințe. Extractele vegetale acționează ca
un potențial precursor în fitosinteza, datorită compușilor naturali abundenți, cum ar fi
alcaloizii, flavonoidele, steroizii și alți compuși nutriționali [Kuppusamy și colab., 20 14].
Diferitele fitochimicale din plante reduc și stabilizează ionii de argint. Aceste
substanțe au proprietăți medicinale și sunt ecologice. Metoda de fitosinteză implică mai inati
prepararea extractului vegetal. Materialele vegetale pot fi folosite în stare proaspătă sau
uscată. Extractele din plante sunt utilizate ca agenți reducători pentru sinteza nanoparticulelor
metalice [Bipinchandra și colab., 2017].
Nanoparticulele de argint pot îmbunătăți efectul chimioterapiei, deoarece au un
potențial foarte mare de a localiza și ucide celulele canceroase, fără să afecteze țesuturile
aflate în apropierea acestora, astfel încât efectele secundare ale chimioterapiei pot fi reduse
semnificativ. Din acest motiv, dozele de citostatice pot fi mult mai mari, astfel accelerând
procesul de vindecare, fără ca alte țesuturi sau organe să fie afectate.
Nanoparticulele de argint sunt des utilizate în medicină, datorită proprietăților
antibacteriene și antiinflamatorii. Utilizarea lor ca adjuvant în terapia canc erului de colon este
importantă, deoarece inflamațiile declanșate de infecțiile bacteriene pot iniția apariția
cancerului și s -a dovedi t că foarte multe tipuri de bac terii p atogene au dezvoltat o rezistență la
medicamentele antibiotice [Rai ș i colab., 2008 ].

25

Figura III.2 Fitosinteza nanoparticul elor de argint (AgNPs) [adaptată după Bipinchandra ș i
colab., 2017].

În figura III.2 este reprezentată schema de fitosinteză a nanoparticulelor de argint pentru
aplicații biologice. Pentru sinteza AgNPs, pornim de la un anumit sistem biologic (de exemplu
o plantă), care reprezintă o sursă de agenți reducători, apoi folosim ca precursor o soluție de
azotat de argint (AgNO3). Dacă amestecul obținut este păstrat în condiții optime, atunci
rezultă nanoparticulele de argint, care pot fi folosite în bioaplicatii precum tratamentul
oncologic, sau ca agenți antibacterieni etc.
Exemple de plante care pot sintetiza nanoparticule de argint:
Pălămida (Cirsium arvense) este o plantă care trăiește în sudul și estul României,
având o tulpină de peste 1.5 metri înălțime, cu o pătrundere de aproximativ 3 -4 metri. Florile
acesteia sunt de culoare roz și unisexuate, frunzele sunt alungite și prezintă o margine sinoasă.

26
Germinarea acesteia are loc primăvară și înflorește pe timp de vară (iunie -august), având un
număr de semințe cuprins între 3000 -5000. Partea superioară a plantei, recoltat ă în perioada șa
de înflorire, se utilizează în fitoterapie datorită proprietăților sale diuretice, hepatice, emetice
și acțiunii tonice [Gordon, 2010]. Sinteza AgNPs cu ajutorul extractului de pălămidă poate fi
benefică în tratarea cancerului de colon, da torită proprietății diuretice care ajută la menținerea,
în condiții optime, a microbiotei colonului.
Menta (Mentha) este o plantă ierboasă cu o înălțime cuprinsă în intervalul 30 -100cm,
puternic ramificată, cu un miros aromatic și un gust înțepător. Î n scop medicinal, se folosesc
doar frunzele proaspete sau uscate. Acestea conțin substanțe polifenolice, flavonoizi, taninuri
și uleiuri volatile în cantități mari. Frecvent, este folosită în medicină tradițională, ca remediu
pentru problemele respiratorii și gastro -intestinale. Sintetizarea nanoparticulelor de argint cu
extract de mentă reprezintă un foarte bun adjuvant în terapia cancerului de colon, deoarece:
aroma de mentă stimulează secreția enzimelor digestive, care ajută la stabilizarea tranzitului
intestinal; uleiurile volatile au rol antibacterian și extractul din frunze s -a dovedit a fi un bun
calmant pentru sindromul colonului iritabil [Cirlini și colab., 2017].
Știrul (Amaranthus retroflexus) este o plantă cu o înălțime de aproximativ 100 cm , ce
prezintă flori de dimensiuni mici, tulpină ramificată sau simplă și frunze lungi de culoare
verde -albăstrui. Perioadă de germinare este vară și se înmulțește prin semințe, fiind foarte
răspândită în solurile permeabile, bogate în azot. Știrul are prop rietăți antibacteriene și este
benefic în combaterea infecțiilor, obezității, diabetului, ulcerului, tulburărilor gastro –
intestinale, anemiei și poate fi folosit ca adjuvant în tratarea bolilor de inimă și de ficat. Pe
lângă aceste proprietăți, știrul are în compoziția să un compus puternic antioxidant, numit
scualen, care ajută la prevenirea cancerului de colon, inhibând creșterea răspândirea celulelor
tumorale. Uleiul din compoziția stirului, la resorbția celulelor canceroase reduce nivelul de
colester ol din sânge [Aruna colab., 2013]. Scualenul se găsește măsline, trestie de , germeni
de , la oameni (sintetizat de ficat, dar cantitai mici) ficatul de rechin cantități [Spanggord
colab., 2002].
În urma sintezei nanoparticulelor de argint prin in termediul unei plante, acestea pot fi
învelite în pectină pentru a eficientiza și mai mult procesul de tratare a cancerului de colon.
Pectina este o substanță organică aflată în pereții celulelor primare ale plantelor nelemnoase.
Cea mai mare cantitate de pectină se găsește în cojile și pulpa citricelor, în mere, în morcovi
etc. Se poate obține fie în stare sintetică, fie în stare naturală, prin fierberea cojilor de citrice
până se ajunge la o soluție de vâscozitatea mierii. Această polizaharidă este folosi tă atât în
industria alimentară, spre exemplu în fabricarea gemurilor sau a jeleurilor, cât și în scop
terapeutic, ca adjuvant în tratarea problemelor digestive sau scăderea colesterolului. Pectină
obținută în mod natural, datorită conținutului ridicat de fibre, are efect probiotic, nu poate fi

27
digerată de organism, dar stimulează dezvoltarea unor bacterii benefice colonului, astfel
îmbunătățind digestia [Willats, 2001].

28
Capitolul IV. Prezentarea detaliată a metodelor specifice de
rezolvare a problematicii abordate

În acest capitol vo r fi prezenta te fitosinteza, caracterizarea și evaluarea î n vitro (teste
realizate pe culturi de celule î n laborator) a proprietăților nanoparticulelor de argint.

IV.1 Fitosinteza nanoparticulelor de argint

Obținerea nanoparticulelor de argint s -a efectuat conform procedurii prezentate în figura III.2,
folosindu -se ca sistem de agenți reducători, extracte apoase din următoarele plante: pălămidă,
mentă și știr (Fig.IV.1 și Fig. IV.2).
Materiale necesare: Sol uție stoc de azotat de argint (AgNO3), pălămidă, mentă, știr, apă
distilată.
Extractele de pălămidă, mentă și știr s -au obținut prin metoda infuziei -materialele biologice
au fost fierte, apoi strecurate cu ajutorul unui tifon, după un timp de infuzare de 5 minute.
Raportul dintre materialul biologic și apă a fost de: 1:5 pentru pălămidă, 1:5 pentru mentă și
1:20 pentru știr (raportul a fost mai mare în cazul stirului, deoarece a fost singurul material
biologic folosit în stare uscată, celelalte materia le biologice au fost în stare proaspătă).
Masa azotatului de argint a fost de 0.033 g, iar cantitatea de apă a fost de 200 ml, concentrația
soluției obținute fiind de 0.165 g/L.
În recipiente sterilizate, au fost puse diferite rapoarte de extracte și s oluție de azotat de argint:
– pentru extractul de pălămidă am avut un raport de 1:100 și un raport de 1:1;
– pentru extractul de mentă am avut două rapoarte de 1:1;
– pentru extractul de știr am avut două rapoarte de 1:100.
Recipientele au fost înv elite în folie de aluminiu, pentru a evita contactul cu lumina și s -au
păstrat la temperatura camerei. Suspensia de nanoparticule a fost lăsată în aceste condiții timp
de 48 de ore, cu agitare termicatimp de 12 ore, apoi au fost depozitate în frigider.
Datorită efectului benefic al pectinei asupra colonului, se poate efectua încapsularea
nanoparticulelor de argint, în pectină [Zahran, 2014].
Obținerea pectinei s -a realizat prin fierberea unei cantități de 1kg de lămâi, în 10 L de apă.
Timpul de fierbere a fost de 6 ore, conținutul a fost lăsat la filtrat, prin intermediul unui tifon,
timp de 12 ore; procesul a fost repetat până când soluția obținută a căpătat o vâscozitate
asemănătoare mierii. La sfârșitul procesului, s -a obținut o cantitate de 100 ml de pectină. În
recipiente sterilizate, au fost puse rapoarte de 1:1:1 (extract: soluție de azotat de argint:
pectină).

29

Figura IV.1 a Fitosint eza nanoparticulelor de argint și pregă tirea probelor pentru testare.

30

Figura IV.1b Probele observate după 7 zile

31
IV.2 Metode de caracterizare spectrală a AgNPs

Spectroscopia UV -Vis (ultraviolet -vizibil) este o tehnică de spectroscopie care implică
fotoni ale căror lungimi de undă se află în domeniul ultraviolet (100 nm -400 nm),
vizibil (400 nm – 750 nm) sau infraroșu (IR) apropiat (750 nm – 1400 nm). Când sunt
supuse radiațiilor din aceste domenii de lungimi de undă, moleculele, ionii sau
complecsii pot suferi una sau mai multe tranziții electonice.
Acest tip de analiză este o metodă de spectroscopie optică. Spectrul de absorbție este
o funcție care reprezintă intensitatea luminii absorbite de probă ca o funcție de lungimi
de undă, astfel se poate reprezenta grafic coeficientul molar de extincție în funcție de
lungimile de undă. Această tehnică este complementară cu spectroscopia de
fluorescență, care măsoară in tensitatea luminii emise de probă, atunci când probă este
iluminata la o lungime de undă în care aceasta absoarbe. Fluorescența implică tranziții
de la starea excitata la starea fundamentală, în timp ce spectroscopia de absorbție
implică tranziții de la st area de bază la starea excitată [Haiss și colab., 2007].

Figura IV.2 Absorbanța nanoparticulelor de argint în funcție de lungimea de undă

32
Absorbanța maximă caracteristică metalelor nobile are loc în intervalul
lungimilor de undă de 400 -450 nm. Pentru nanoparticulele de argint obținute prin
fitosinteză cu extract de palamidă, absorban ța maximă a fost observată la lungimea de
undă de 450 nm. Studiile anterioare arată că n anoparticulele de argint, căpăta o formă
sferică, în urma absorbanț ei maxime cuprin să între 430 -450 nm. În cazul fitosintezei
nanoparticulelor de argint cu extract de pălămidă învelite în pectină, absorbanța scade
cu creșterea lungimii de undă, iar valoarea maximă a absorbanț ei este la 350 nm .

33
IV.3 Efectul nanoparticulelor de argint asupra adenocarcinomului de colon

IV.3.1 Culturile celulare ș i mediile utilizate

Mediile și substanțele utilizate pentru pregătirea culturilor celulare au fost
achiziționate de la Biochrom -Merck (Germania). MTT -ul (bromură de 3 -(4,5-
dimetiltiazol -2-il)-2,5- difeniltetrazoliu) utilizat în realizarea testelor de viabilitate
celulară a fo st achiziționat de la Serva. Solvenții, DMSO și etanol, au fost achiziționați
de la Sigma -Aldrich (Germania).
Celulele utilizate în acest studiu au fost L929 și HT -29.
Celulele L929 (ATCC CCL -1) sunt celule fibroblaste, prelevate din țesutul
conjuctiv subcutanat, adipos și areolar al șoarecelui de casă (Mus musculus). Pe
parcursul studiilor, acestea au fost cultivate în Mimimal Essential Medium (MEM)
suplimentat cu 2 mm L -glutamină, 10% ser fetal de vițel (FCS), 100 unități/ml
penicilină și 100 g/ml de streptomicină. Prezintă un timp de dublare între 12 -14h și o
morfologie fusiformă.
Celulele tumorale HT -29, adenocarcinom colorectal, (ATCC HTB -38) au fost
cultivate în DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) suplimentat cu 2 mm L –
glutamină, 10% FCS, 100 unități/ml penicilină și 100 g/ml de streptomicină. Celulele
HT-29 (adenocarcinom colorectal) au o formă sferică și au fost prelevate din colon
uman. Acestea sunt celule aderențe, prezintă o morfologie sferică cu tendința de
aglomerare și un timp de d ublare între 20 -24h.
Pentru studiile de viabilitate, celulele au fost insămantate în plăci cu 96 de
godeuri (L929 -8000 celule/godeu; HT -29 – 15000 celule/godeu) și cultivate inițial
timp de 24 de ore doar în mediu. După aceasta, celulele au fost tratate cu diferite
concentrații de NP timp de 24 h. Că și control negativ, în toate cazurile s -au folosit
celule netratate, doar în mediu. După timpul dorit de tratament, celulele au fost folosite
pentru determinarea viabilității celulare, conform protocolului p rezentat în continuare.

IV.3.2 Determinare a viabilităț ii celulare

Determinarea viabilității celulare, care permite evaluarea metabolismului oxidativ și a
răspunsului celulelor la factorii externi studiați, s -a realizat utilizând testul pe baz ă de sare de
tetrazoliu MTT conform specificațiilor oferite de producător și adaptate. Astfel, după perioada
de tratament cu NPs, mediul a fost îndepărtat de pe celule și s -a adăugat 100 µL mediu nou,

34
suplimentat cu 5% FCS, 2 mm L -glutamină, 100 unităti/ml penicilină și 100 μg/ml de
streptomicină și 20 µL de soluție MTT (aflată într -o concentrație stoc de 5 mg/ml).
Celulele au fost incubate cu soluția de MTT pentru încă 3 – 4h, timp neccesar pentru ca
celulele viabile să reducă sarea de tetrazoliu la un p rodus colorat și insolubil în soluții apoase,
numit formazan. În final, mediul a fost aruncat și cristalele au fost dizolvate în DMSO. După
15 minute, absorbantă compusului obținut a fost inregistrată la 570 nm folosind un cititor de
plăci, Mithras 940 de la Berthold. Datele înregistrate au fost corectate pentru fundal și s -a
calculat procentul de celule viabile conform formulei:
% Celule viabile = (Ap/Ac)*100%
Unde:
Ap este absorbanța măsuarată la 570 nm și corectată pentru blanck a celulelor tratate
cu diferite concentrații de NP și
Ac este absorbanța măsurată la 570 nm și corectată pentru blanck a celulelor netratate.
Valorile obținute au fost utilizate pentru reprezentarea curbelor de viabilitate. Acestea
au fost fitate cu o funcție de tip sigmoidal pentru a determina parametrul IC50 (concentrația la
care viabilitatea celulară a fost inhibată cu 50%). Prelucrarea date lor s-a realizat cu ajutorul
programului Origin 8.

35

IV.3.3 Rezultate și discuț ii

În Figura IV.3 se observă că viabilitatea celulelor L929 este de 99.8% la o
concentrație de aproximativ 0.34 g/L de nanoparticule de argint sintetizate cu extract
de pălămidă, aceasta fiind aproximativ egală cu viabilitateta controlului. O dublare a
concentrației, reprezintă o înjumătățire a viabilității celulare (aproximativ 44.85%). La
concentrații mai mari de nanoparticule de argint sintetizate cu extract de pălămidă,
viabilitatea scade semnificativ, ajungând până la valoarea de doar 0.11%.

Figura IV.3 Reprezentarea grafică a viabilității celulelor L929, în funcție de
concentraț iile nanoparticulel or de arg int sintetizate cu extract de pălămidă și
concentraț ia nanoparticulel or de argint învelite în pectină, sintetizate cu extract de
pălămidă .

Pentru celulele L929 tratate cu nanoparticule de argint învelite în pectină, viabilitatea
acestora nu este afectată la concentrații mici, sub 1 g/L. La concen trații mai mari, însă,
viabilitatea celulelor L929 începe să scadă, până la 7.51% pentru o concentrație de ~ 3g/L. Se
observă astfel, că învelirea nanoparticulelor de argint în pectină a îmbunătățit considerabil

36
biocompatibilitatea acestora, în raport cu n anoparticulele care nu au fost învelite în pectină,
mai ales la concentrații mai mici de 3 g/L.
În Figura IV.4 sunt prezentate rezultatele obținute pentru nanoparticulele sintetizate
cu extract de mentă și aplicate pe celulele L929. Se observă că în cazu l tratamentului cu
acestea, viabilitatea este de 76.67% la concentrația cea mai mică de 0.034 g/L, apoi aceasta
descrește până la 4.68% la concentrația de ~ 0.5 g/L. În cazul tratamentului cu nanoparticule
de argint, învelite în pectină, sintetizate cu ext ract de mentă, viabilitatea celulelor este de
96.46% la o concentrație de 0.034 g/L, apoi viabilitatea celulelor descrește până la valoarea de
13.89 % la o concentrație de 0.13 g/L.

Figura IV.4 Reprezentarea grafică a viabilității celulelor L929, în fu nctie de
concentraț iile nanoparticulel or de argint sintetizate cu extract de mentă și
concentraț ia nanoparticulel or de argint învelite în pectină , sintetizate cu extract de
mentă .

Din figura IV.4 se constată o creștere a biocompatibilitatii celulelor învelite în
pectină, la concentrații mai mici de 0.03g/L.

37
În Figura IV.5 sunt prezentate rezultatele obținute pentru nanoparticulele
sintetizate cu extract de știr și aplicate pe ce lulele L929. Se observă că în cazul acestui
tratament, viabilitatea nu este afectată la concentrații mai mici de 2 g/L, dar aceasta
descrește până la 3.28% la concentrația de 5.5 g/L.
În cazul tratamentului cu nanoparticule de argint învelite în pectină, sintetizate
cu extract de știr, viabilitatea celulelor este de 90.09% la o concentrație de 0.34 g/L,
apoi viabilitatea celulelor descrește până la valoarea de 3.07 % la o concentrație de 5.5
g/L.

Figura IV.5 Reprezentarea grafică a viabilității cel ulelor L929, în functie de
concentraț iile nanoparticulel or de argint sintetizate cu extract de știr și concentraț ia
nanoparticulel or de argint învelite în pectină , sintetizate cu extract de știr .

Din figura IV.5 se constată că nanoparticulele învelite în pectină devin mai
toxice pentru celulele L929 comparativ cu cele fără pectină.
În Figura IV.6 sunt prezentate rezultatele obținute pentru nanoparticulele
sintetizate cu extract de pălămidă și ap licate pe celulele HT -29. Se observă că în cazul
tratamentului pentru celulele HT -29, viabilitatea este de 83.51% la concentrația cea

38
mai mică de 0.34 g/L, apoi aceasta descrește până la 3.73% la concentrația de 1.37
g/L. În cazul tratamentului cu nanopart icule de argint învelite în pectină, sintetizate cu
extract de pălămidă, viabilitatea celulelor este de 105.24% la o concentrație de 0.17
g/L, apoi viabilitatea celulelor descrește până la valoarea de 28.77 % la o concentrație
de 2.75 g/L.

Figura IV.6 Reprezentarea grafică a viabilitătii celulelor HT -29, în funcț ie de
concentra țiile nanoparticulel or de arg int sintetizate cu extract de pălămidă și
concentraț ia nanoparticulel or de argint învelite în pectină, sintetizate cu extract de
pălămidă .

Din figura IV.6 se constată o eficiență mai mare în cazul tratamentului
celulelor HT -29, cu nanoparticule de argint neînvelite, scopul fiind de reducerea
procentului de viabilitatea, decât tratamentul cu nanoparticule de argint învelite cu
pectină, diferența de viab ilitate fiind de 21.73% la concentrațiile mici și de 25.01% la
concentrațiile mari.
În Figura IV.7 sunt prezentate rezultatele obținute pentru nanoparticulele
sintetizate cu extract de mentă și aplicate pe celulele HT -29. Se observă că în cazul

39
tratamen tului, pentru celulele HT -29, viabilitatea este de 99.96% la concentrația cea
mai mică de 0.34 g/L, apoi aceasta descrește până la 7.28% la concentrația de 0.55
g/L. În cazul tratamentului cu nanoparticule de argint învelite în pectină, sintetizate cu
extract de mentă, tratamentul prezintă aceeași tendința ca și în cazul celui fără pectină.

Figura IV.7 Reprezentarea grafică a viabilitătii celulelor HT -29, în funcț ie de
concentra țiile nanoparticulel or de arg int sintetizate cu extract de mentă și
concentraț ia nanoparticulel or de argint învelite în pectină, sintetizate cu extract de
mentă .

Din figura IV.7 se constată că învelirea nanoparticulelor cu pectină nu modifică
eficiență acestora comparativ cu cele neînvelite.
În Figura IV.7 sunt prezen tate rezultatele obținute pentru nanoparticulele
sintetizate cu extract de știr și aplicate pe celulele HT -29. Se observă că în cazul
tratamentului pentru celulele HT -29, viabilitatea este de 99.29% la concentrația cea
mai mică de 0.68 g/L, apoi această de screște până la 6.55% la concentrația de 5.5 g/L.
În cazul tratamentului cu nanoparticule de argint învelite în pectină, sintetizate cu
extract de mentă, viabilitatea celulelor este de 107.76% la o concentrație de 2.75g/L,

40
apoi viabilitatea celulelor descr ește până la valoarea de 34.98 % la o concentrație de
5.5 g/L.

Figura IV.8 Reprezentarea grafică a viabilitătii celulelor HT -29, în funcț ie de
concentra țiile nanoparticulel or de arg int sintetizate cu extract de știr și concentraț ia
nanoparticulel or de argint învelite în pectină, sintetizate cu extract de știr .

Din figura IV.8 se constată o efic iența mai mare î n cazul tratamentului celulelor HT –
29, cu nan oparticule de argint neî nvelite .

41

Concluzii

Această lucrare prezintă studiul efectelor anti -tumorale produse de
nanoparticulele de argint fitosintetizate cu diferite extracte și învelite în pectină.
Partea experimentală s -a efectuat pe linia tumorală HT -29 caracteristice
cancerului de colon și pe o linie de celule sănătoase L929.
S-a observat o eficiență antitiumorala mai mare, în cazul tratamenului pe
celulele HT -29, cu nanoparticule de argint fitosintetizate din pălămidă, adică
viabilitatea celulelor canceroase a fost mult afectată.
S-a obser vat o îmbunătățire a biocompatibilitatii, în cazul tratamentului pe
celule L929, cu nanoparticule de argint învelite în pectină, sintetizate din extract
de mentă, adică acestea sunt cele mai puțin toxice, în raport cu celelalte tipuri și
afectează mai puți n viabilitatea celulelor sănătoase.
În urmă acestor date experimentale și a analizării acestora, s -a ajuns la
concluzia că fitosinteza nanoparticulelor de argint constituie o metodă viabilă de
tratare a cancerului de colon.
Pentru nanoparticulele de a rgint obținute prin fitosinteză cu extract de
palamidă, absorbanța maximă a fost observată la lungimea de undă de 450 nm.

În cazul fitosintezei nanoparticulelor de argint cu extract de pălămidă învelite în
pectină, absorbanța scade cu creșterea lungimii de undă, iar valoarea maximă a
absorbanței este la 350 nm.
În perspectivă, se dorește testarea mai multor tipuri de nano particule
metalice, pe diferite linii tumorale.

42
Bibliografie

1. Abraham Jame, Gulley L. James, Allegra Carmen “Bethesda Handbook of Clinical
Oncology 3rd Edition Lippincot Williams & Wilkins Philadelphia, 2010.
2. Appenzeller T. The man who dared to think smal l, 1991.
3. Aruna A., S.Karthick, Raja Namasivayam and P. Sarath Chandu “Evaluation of
Phytotoxicity of metallic nanoparticles agains amarathus retroflexus”, 2013.
4. Basil Morson, MD, „The polyp -cancer Sequence in the LArge Bowel” Volumul 67,
Iunie 1974.
5. Bipinc handra K. Salunke, Ezhaveni Sathiyamoorthi, Kiet Tuan TranBeom Soo Kim
“Phyto -synthesized silver nanoparticles for biological applications ”, 2017.
6. Carmichael R. “Obesity and exercising”. In Scrijvers D, Senn HJ, Mellstedt H,
Zakotnk B (eds) European Society of Medical Oncology Handbook of Cancer
Prevention. Informa Healthcare 2008.
7. Dagulin Oana “Cancerul de colon”, 2013.
8. F. T. McDermott, E. S. R. Hughes, E. Pihl, B. J. Milne, A. B. Price, “Prognosis in
relation to symptom duration in colon cancer”, 19 81.
9. Fatima A. Haggar, M.P.H si Robin P.Boushey, M.D., Ph.D. “Colorectal Cancer
Epidemiology: Incidence, Mortality, Survival, and Risk Factors”, 2009.
10. Ferlay J, Soerjomataram I, Ervik M, Dikshit R, Eser S, Mathers C, Rebelo M, Parkin
DM, Forman D, Bray, F. GLOBOCAN 2012 v1.1, Cancer Incidence and Mortality
Worldwide: IARC CancerBase No. 11 [Internet]. Lyon, France: International Agency
for Research on Cancer; 2014.
11. Geraldine o. Canny and Beth A. McCormick, “Bacteria in the Intestine, Helpful
Residence or Ene mies From Within”, 2008.
12. Gordon E. D. Tiley “Biological Flora of the British Isles: Cirsium arvense “, 2010.
13. Harvard Center for Cancer Preven tion “Harvard report on cancer prevention : Volume
3: Prevention of colon cancer in the United States, 1999:167 -170 .
14. Hecht SS. Etiology of cancer: tabaco. In DeVita Jr, VT, Lawrence TS, Rosnberg SA,
DePinho RA, Weinberg RA, DeVita, Hellman,and Rosenberg’ s “Cancer -principles
and practice of oncology.”8th edition, Wolter Kluwer/Lippincott Williams& Wilkins,
Philadelphia, 2008.
15. http://www.cancerlacolon.ro/2013/07/
16. http://www.cancerresearchuk.org/about -cancer/cancer -in-
general/treatment/chemotherapy/what -chemotherapy -is
17. http://www.cancerresearchuk.org/about -cancer/causes -of-cancer/cancer -risks -in-the-
workplace

43
18. https://publishing.cdlib.org/ucpressebooks/view?docId=ft9b69p365&chunk.id=d 0e29
&toc.depth=1&toc.id=&brand=ucpress
19. https://www.cancer.gov/about -cancer/coping/feelings/stress -fact-sheet
20. https://www.cancer.gov/about -cancer/understanding/what -is-cancer ( Fig. 1.1.1)
21. https://www.cancer.gov/publications/dictionaries/cancer -terms/def/colon -polyp
22. https://www.fascrs.org/patients/disease -condition/colon -what -it-what -it-does (ASCRS –
Amer ican Society of Colon and Rectal Surgeons)
23. Ilana Lowy, “The gender of cancer, When medicine meets gender“, 2013:1
24. Ionel POPA, Ioana -Maria NICOLA, Victoria CEARĂ, Cristian BOBOC, Cristiana
Alexandra DANEȘ, “ Silver Nanoparticles Synthesis and Applications ”, Vol. 64, Nr.2,
Articolul 15, 2015:12 -13.
25. Jun Sun si Ikuko Kato “ Gut microbia, inflammation and colorectal cancer” a
Department of Medicine , Division of Gastroenterology & Hepatology, University of
Illinois at Chicago , Chicago , IL , USA ., 2016:1 -12.
26. Kenneth W. Falterman MD Charles B. Hill MD John C. Markey MD James W. Fox
MD Isidore Cohn MD Jr. “Cancer of the colon, rectum and anus: A review of 2313
cases”, Volume 34, September 1974: 2 -9.
27. Ki Young Choi, Eun Jung Jeon, Hong Yeol Yoona, Beom Suk Lee, Ji n Hee Na,
Kyung, Hyun Min, Sang Yoon Kim, Seung -Jae Myung, Seulki Lee, Xiaoyuan Chen,
Ick Chan Kwon, Kuiwon Choia, Seo Young Jeong, Kwangmeyung Kima, Jae Hyung
Park “Theranostic nanoparticles based on PEGylated hyaluronic acid for the diagnosis,
therapy a nd monitoring of colon cancer”, Volume 33, 2012:18 -22.
28. Lynne Eldridge, MD “Reviewed by Grant Hughes, MD” 2018.
29. M.K.Zahran , Hanan B.Ahmed , M.H.El -Rafie , “Facile size -regulated synthesis of
silver nanoparticles using pectin” ,2014:11 -20.
30. Mahendra Rai ,AlkaYadav, Aniket Gade “Silver nanoparticles as a new generation of
antimicrobials ” Vol.27, 2008:27.
31. Mahmound N., Rombeau J., Ross HM, Fry RD., “Colon and rectum”, 17 -th edition;
editura Elsevier, 2004:1401 -1481.
32. Martina Cirlini, Pedro Mena, Michele Tassotti, Kelli A. Herrlinger, Kristin M.
Nieman, Chiara D all’Asta and Daniele Del Rio, “Phenolic and Volatile Composition
of a Dry Spearmint ( Mentha spicata L.) Extract”, 2017:3.
33. Morones J.R, Elechiguerra J.L, Camacho A., Holt K., Kouri, J.B, Ramirez J.T,
Yacaman M.J., “The bactericidal effect of silver nanopart icles”, 2005:3 -7.
34. Noordhuis P, Holwerda U, Van Der Wilt CL, et al. “5 -Fluorouracil incorporation into
RNA and DNA in relation to thymidylate synthase inhibition of human colorectal
cancers”. Ann. Oncol. 2004;15(7):1025 –1032.

44
35. Nygren Peter, “What is cancer c hemotherapy”, Vol.40 08 Jul.2009:169 -171.
36. Omid C.Farokhzad , Robert Langer, “Nanomedicine: “Developing smarter therapeutic
and diagnostic modalities”, Vol.58 2006:1457.
37. Palaniselvam Kuppusamy , Mashitah M.Yusoff Gaanty, Praga Maniam ,
Natanamurugaraj Govindan , “Biosynthesis of metallic nanoparticles using plant
deriva tives and their new avenues in pharmacological applications – An updated
report”, 2014:358.
38. Pecolino L. “Molecular biology of cancer -mecanisms, targets and therapeutics”,
Oxford University Press, 2005.
39. Rizzo F, Toma “Related risk factors” In Scrijvers D, S enn HJ, Mellstedt H, Zakotnk
B.European Society of Medical Oncology Handbook of Cancer Prevention. Informa
Healthcare, 2008.
40. Robert Hooke, “Micrographia, or some physiological descriptions of minute bodies by
magnifytin glasses, with observations and inquiries thereupon”, 1665.
41. Robin L. Fainsinger MD, Kathy Spachynski BScN, John Hanson MSc, Eduardo
Bruera MD” Symptom control in terminally ill patients with malignant bowel
obstruction (MBO)”, Vol.9, 1994:12 -18.
42. Ronald J. Spanggord , Benjamin Wu, Meg Sun, Peter Lim, William Y Ellis,
“Develo pment and application of an analytical method for the determination of
squalene in formulations of anthrax vaccine adsorbed”, 2002:5 -7.
43. Ruddon RW, “Causes of cancer”. In Ruddon RW. Cancer biology. Fourth edition,
Oxford University Press, New York, 2007.
44. Schrag D, Rifas -Shiman S, Saltz L, Bach PB, Begg CB. Adjuvant chemotherapy use
for medicare beneficiaries with stage II colon cancer. J. Clin. Oncol.
2002;20(19):3999 –4005.
45. Stephens FO, Aigner KR “Basics of oncology. Springer -Verlag Berlin Heidelberg
London New York”, 2009:49 -64.
46. Vicky V. Mody, Rodney Siwale, Ajay Singh, and – Hardik R. Mody, “Introduction to
metallic nanoparticles”, 2010:9.
47. Vinay Kumar Kapoor, MBBS, MS, FRCS, FAMS Professor of Surgical
Gastroenterology, Sanjay Gandhi Post Graduate Institute o f Medical Sciences, India, “
Colon Anatomy”, 2016.
48. William G.T. Willats, Lesley McCartney, William Mackie J., Paul Knox “Pectin: cell
biology and prospects for functional analysis”, 2001:9 -27.
49. Willis, R. A., “Pathology of Tumors ” Butterworth, Washington, D.C, Vol.15,
1990:303 -322.

45
50. Wolfgang Haiss, Nguyen T. K. Thanh, Jenny Aveyard, and David G. Fernig
“Determination of Size and Concentration of Gold Nanoparticles from UV−Vis
Spectra Centre for Nanoscale Science, Department of Chemistry, University of
Liverp ool, Crown Street L69 7ZD, U.K., and School of Biological Sciences,
University of Liverpool, Crown Street L69 7ZB, U.K. ”, 2007:4215.
51. World Health Organization “Tobacco is the single most preventable cause of death in
the world today”, 2017:8 .