Laboratorul de Microbiologie Elisa

Contaminarea microbiologica a alimentelor si siguranta alimentara microbiana au constituit intotdeauna o preocupare pentru industria alimentara.

Alterararea senzoriala a alimentelor se datoreaza, in principal, activitatii microbiene, bacteriene si fungice.

Contaminarea fungica a alimentelor si a hranei cauzeaza pierderi economice considerabile, datorita deteriorarii directe a culturilor, decolorarii, disparitiei aromei si a valorii nutritive. Fapt mai important, contaminarea fungica a alimentelor poate fi asociata cu producerea de micotoxine, care are efecte toxice asupra ingerarii atat pentru oameni, cat si pentru animale. Detectarea si numararea microorganismelor din alimente si mediu ne ajuta sa pastram siguranta si stabilitatea alimentelor.

Metodele conventionale, de exemplu inocularea in placi, standard, de detectare si numarare a microorganismelor in alimente, sunt consumatoare de timp, necesitand intre 2 si 5 zile, si de munca intensiva; detectarea agentilor patogeni implica, in general o preimbogatire secventiala, imbogatire selectiva si etape de inoculare in placi, standard si confirmare biochimica si serologica. Astfel, exista o nevoie clara de tehnici rapide, robuste si flexibile, ca metode alternative pentru inlocuirea metodelor conventionale. Spre deosebire de metodele traditionale, metodele rapide, automatizate, in special in timp real vor fi adecvate chiar si pentru monitorizarea punctelor critice de control intr-un sistem HACCP.

In cadrul laboratorului de microbiologie ELISA am participat la analiza de detectare a aflatoxinelor dintr-un magiun de prune cu ajutorul metodei RIDASCREEN Aflatoxin Total si a deoxinivalenolului, prescurtat DON, cu ajutorul metodei RIDASCREEN DON. Acesta este un test imunologic bazat pe activitatea unei enzime si utilizat pentru analizele cantitative pentru detectarea DON-ului in cereare, malt, bere, must si furaje pentru animale. RIDASCREEN Aflatoxin Total este un test imunologic bazat pe o enzima competitiva pentru analizele cantitative a aflatoxinelor din cereale si furaje.

Magiunul de prune a fost analizat pentru detectarea aflatoxinelor si deoxinivalenol, prescutat DON. Pentru aceste analize au fost utilizate kituri complete care contineau toti reactivii necesari analizei, instructiunile de lucru si standardele, adica solutiile cu cantitati cunoscute de DON, si aflatoxine, pentru a se putea trasa curbele de calibrare, impreuna cu valorile limita admise ale acestor micotoxine din diverse grupe de alimente.

Deoxinivalenolul apartine grupului de micotoxine tricotecenelor si este format de catre fungi din genul Fusarium. Deoxinivalenolul adesea poate aparea la plante in mod special in cazul cerealelor. Se cunosc mai mult de 150 de tricotecene, iar micotoxinele deoxinivalenol, 3-acetil si 15-acetil-deoxinivalenol sunt toxinele cele mai raspandite in Europa si America de Nord. Concentratia de toxina gasita in culturile de grau, porumb sau orez sunt la nivelul de ppm. Dar datorita citotoxicitatii ridicate si proprietatilor imunosupresive aceste toxine prezinta un risc ridicat pentru sanatatea oamenilor si animalelor.

Apoi, mai sunt aflatoxinele care sunt metaboliti secundari ai speciilor de fungi Aspergillus flavus, parasiticus si nomius. Acesti fungi se intalnesc in zonele cu climat tropical umed si contaminarea legumelor are loc in tarile cultivatoare. Aflatoxinele apartin celor mai puternice substante naturale cancerigene.

Aflatoxina B1 care este cea mai des intalnita impreuna cu aflatoxinele B2, G1 si G2, este cea cu cea mai mare importanta din punct de vedere al toxicitatii. Toate cele de mai sus, se gasesc in porumb, alune, nuci braziliene, seminte de bumbac si fistic. In functie de toxicitatea acestor micotoxine in tarile din Uniunea Europeana se inregistreaza urmatoarele valori limita 2 ppb pentru aflatoxina B1 si 4 ppb pentru toate aflatoxinele in total.

Principiul testului RIDASCREEN Aflatoxin Total

Baza acestui test este reactia antigen-anticorp.Peretii godeurilor placii de microtitrare sunt captusiti cu anticorpi de captare directionati spre antigenii anti-aflatoxina. Standarde ale solutiilor proba, ale celor cu enzima conjugata aflatoxina si cu anticorpi anti-aflatoxina sunt adaugate. Aflatoxine libere si cu enzime conjugate concureaza pentru pozitiile de legatura cu anticorp aflatoxina ( testul imunoenzimatic competitiv). In acelasi timp, anticorpii anti-aflatoxina sunt de asemenea legati de catre anticorpii de legatura imobilizati. Orice enzima conjugata nelegata este apoi eliberata in etapa de spalare. Substratul/solutia cromogena este adaugat pe pereti si apoi incubat. Enzima conjugata legata converteste cromogenul intr-un produs albastru. Masuratoarea este facuta fotometric la 450nm; absorbanta este invers proportionala cu concentratia de aflatoxina din proba.

Si in cazul RIDASCREEN DON, principiul testului este acelasi ca si la testul descris anterior RIDASCREEN Aflatoxin Total.

Reactivi si materiale necesare pentru testul RIDASCREEN Aflatoxin Total

Un kit care contine:

o placa de microtitrare cu 96 de godeuri captusite cu anticorpi captati;

6x standarde de aflatoxina cu concentratiile 0ppb; 0.05 ppb; 0.15 ppb; 0.45 ppb;1.35 ppb, 4.05 ppb aflatoxina B1 metanol/apa gata de a fi utilizata

1 conjugat: aflatoxina B1 conjugata cu peroxidaza

1 anticorp anti-aflatoxina monoclonal

1 cromogen pro rosu ( substrat/solutie cromogena) colorat in rosu care contine tetrametilbenzidina

1 solutie stop care contine 1 N acid sulfuric

1 sare tampon ( tampon de spalare) pentru prepararea a 10 mM tampon fosfat ( pH 7.4) ce contine 0.05% Tween 20

Spectofotometru cu microplaci de titrare ( 450 nm)

Rasnita ( moara)

Agitator

Palnie si hartie de filtru

Pipete gradate

Micropipete de volume variabile de la 29 la 200 µL si de la 200-1000µL

4 Baloane Erlenmayer 250 mL cu dopuri

Reactivi

Metanol

Solutie 70% metanol: se amesteca 70 mL metanol 100% cu 30 mL apa distilata

Apa distilata

Reactivi si materiale necesare pentru testul RIDASCREEN DON

Un kit care contine:

o placa de microtitrare cu 96 de godeuri captusite cu anticorpi captati;

5x standarde de aflatoxina cu concentratiile 0ppb; 3.7 ppb; 11.1 ppb; 33.3 ppb;100 ppb, deoxinivalenol in apa gata de a fi utilizata

1 conjugat: deoxinivalenol conjugata cu peroxidaza

1 anticorp anti-deoxinivalenol monoclonal

1 substrat/cromogen pro rosu ( substrat/solutie cromogena) colorat in rosu care contine tetrametilbenzidina

1 solutie stop care contine 1 N acid sulfuric

1 sare tampon ( tampon de spalare) pentru prepararea a 10 mM tampon fosfat ( pH 7.4) ce contine 0.05% Tween 20

Spectofotometru cu microplaci de titrare ( 450 nm)

Cilindru gradat 100 mL, 1L

Pahar Berzelius pentru prepararea extractului din proba: palnie de filtrare si pahar de 50 mL

Rasnita ( moara)

Agitator

Palnie si hartie de filtru

Reactivi

Apa distilata sau deionizata

Pregatirea probelor

Probele trebuie pastrate la loc racoros si ferit de razele soarelui. Inainte de inceperea analizei reactivii sunt tinuti o perioada la temperatura camerei. Pasii pentru prelucrarea probei, constau in impartirea probei in cantitati mai mici pentru ca proba sa fie reprezentativa pentru lot, in acest caz in 2 pungi de 500g. O proba de magiun s-a impartit intre cele 2 pungi de 500g. Ulterior continutul cele doua pungi a fost strans intr-un mojar unde proba s-a omogenizat viguros timp de cateva minute, pana cand proba a ajuns la consistenta dorita. S-au cantarit 3 probe de cate 4 grame la balanta analitica. Se realizeaza extractia probei, extractie care in cazul analizei pentru DON se realizeaza in apa distilata, iat pentru analiza pentru Aflatoxina in solutie diluata de etanol. Probele se lasa la extractie in agitatorul orizontal timp de aproximativ 10 minute la temperatura camerei. Urneaza etapa de filtrare a intregului extract folosind hartie de filtru. Apoi se dilueaza 100 µL de filtrat in 600 µL de apa distilata. Se utilizeaza cate 50 µL pe godeu in test. Filtratul poate fi pastrat la 2-8 OC timp de 2 saptamani sau la -20 OC pentru 2 luni. Ca si tampon de spalare este nevoie de tampon PBS tween. Se utilizeaza sarea tampon din kit. Se dizolva intreaga cantitate de sare tampon din kit intr-un litru de apa distilata. Tamponul de spalare astfel obtinut poarte fi pastrat timp de 4-6 saptamani la 2-8 OC.

Procedura testului

Se introduc un numar suficient de godeuri in placa de godeuri pentru ca toate standardele si probele sa fie facute in duplicat. Se marcheaza pozitiile pentru standard si pentru proba.

Se adauga 50 µL de solutie standard sau proba preparata pentru a separa peretii dubli ai godeurilor;se utilizeaza un nou varf pentru fiecare standard sau proba

Se adauga 50 µL de enzima conjugata in fiecare godeu.

Se adauga 50 µL din solutia de anticorp in fiecare godeu. Se amesteca usor prin agitarea placii manual si se incubeaza pentru 30 min la temperatura camerei 20-25 OC la intuneric.

4*. Se adauga 50 µL din solutia de anticorp anti-deoxinivalenol in fiecare godeu. Se amesteca usor prin agitarea placii manual si se incubeaza pentru 30 min la temperatura camerei 20-25 OC la intuneric

Se toarna lichidul din afara godeurilor si se bate fundul placii de godeuri viguros deasupra unei hartii absorbante pentru a se asigura de eliminarea completa a lichidului din godeuri. Se umplu toate godeurile cu 250 µL de tampon de spalare si se toarna lichid din nou. Procedura de spalare se repeta de 2 ori.

Se adauga 100 µL de substrat/cromogen in fiecare godeu. Se amesteca usor prin agitarea placii manual si se incubeaza pentru 15 minute la temperatura camerei, la intuneric.

Se adauga 100 µL de solutie stop in fiecare godeu. Se amesteca usor placa manual si se masoara absorbanta la 450 nm. Se citeste pana in 30 de minute de la adaugarea solutiei stop. ( in cazul DON, timpul de citire maxim este de 10 minute de la adaugarea solutiei stop).

Rezultate

In cazul fructelor uscate si produselor prelucrate din acestea, adresate consumului uman, cum este cazul magiunului de prune analizat, concentratiile totale admise precum si cele obtinute in cadrul testarii se regasesc in tabelul de mai jos. ( Tabelul nr 2)

Prelucrarea datelor se poate face fie cu ajutorul unui software numit RIDASOFT Win, sau fara cu ajutorul formulei:

Tabelul nr 2- Valorile limita admise pentru concentratia de aflatoxina si DON:

Dupa cate se poate observa in urma analizei, magiunul de prune supus testarii este in limitele admise atata din punct de vedere al concentratiei de Aflatoxina totala cat si al concentratiei de DON.

Laboratorul de ambalaje

In laboratorul de ambalaje se realizeaza analize de determinare a stirenului din mase plastice, determinarea metalelor din bere sau determinarea metalelor grele Pb,Cd din faina si alte alimente precum si determinarea continutului de Na, Ca,Mg, Fe pentru produsele care contin sau sunt imbogatite cu aceste elemente.

Am participat la analiza stirenului din mase plastice pe cale spectrofotometrica. Pregatirea probei a constat in realizarea probei martor si prelucrarea pentru analiza a probei de analizat. Proba martor contine doar reactivii, adica acid acetic si hexan. Pentru prelucrarea probei de analizat, s-a studiat o proba de ambalaj de suprafata cunoscuta si s-a realizat o solutie cu acid acetic si alcool etilic 10%, solutia fiind pastrata la etuva la 40OC, timp de 10 zile. Din proba astfel prelucrata se face migrarea substantelor solutiei in acid acetic 1% si apoi in alcool etilic cu concentratie de 10% si 50%. Din aceasta solutie s-a determinat continutul de stiren prin spectrometrie moleculara UV/VIS. In urma analizei, continutul de stiren in proba de ambalaj din mase plastice analizat, a fost in limitele permise de lege.

Determinarea metalelor grele la o proba de bere

Analiza conținutului de metale grele presupune două faze: pregătirea probelor și dozarea propriu-zisă prin spectrometrie de absorbție atomică.

Pregătirea probelor s-a realizat prin mineralizare cu microunde conform SR EN 14084:2003 – „Produse alimentare. Determinarea microelementelor. Determinare plumb, cadmiu, zinc, cupru si fier prin spectrometrie de absorbție atomică după digestie cu microunde”.

S-a utilizat un cuptor cu microunde MWS-2 Berghof (Fig. 1.). Procesul de mineralizare s-a desfășurat conform programului descris în Tabelul 3.

Dozarea prin spectrometrie de absorbție atomică

Din soluția probei mineralizate s-a determinat conținutul de plumb (Pb), cadmiu (Cd), crom total (Cr) și arsen (As), utilizând un spectrofotometru de absorbție atomică cu cuptor de grafit (GF-AAS) AAnalyst 600 – Perkin Elmer (Fig. 2.), prevăzut cu corecție Zeeman a zgomotului de fond.

Fig. 2. Spectrofotometru GF-AAS AAnalyst 600 (Perkin Elmer)

Sursa de radiație este reprezentată de lămpi monoelement: lămpi cu catod cavitar (HCL – hallow cathode lamp) pentru plumb, cadmiu și crom și lampă cu descărcare în gaze (EDL – electrodeless discharge lamp) pentru arsen.

Pentru prepararea soluțiilor etalon utilizate în trasarea curbelor de calibrare s-au utilizat soluții de referință cu concentrația de 1000 mg/L, după cum urmează: pentru Pb – soluție Pb(NO3)2; pentru Cd – soluție Cd(NO3)2; pentru crom – soluție Cr(NO3)3, iar pentru As – soluție H3AsO4. Condițiile de lucru pentru fiecare element sunt precizate în Tabelul 4.

Tabelul nr 4- Condiții de lucru pentru determinarea conținutului de metale grele

Analize fizico-chimice

In cadrul laboratorului de analize fizico-chimice am participat la o analiza pentru determinarea aciditatii dintr-o proba de paine si la o analiza de deformare a aluatului.

Pentru analiza aciditatii din paine, s-au cantarit 25g de miez de paine din proba de paine aleasa pentru analiza, s-a maruntit si s-a dizolvat in 250 mL de apa. Dupa ce s-a obtinut solutia de paine dizolvata in apa, solutia s-a lasat la repaus pentru 30 de minute. Ulterior,s-au masurat 50 mL din amestecul de filtrat si s-a efectuat o titrare cu NaOH, in prezenta de 2 picaturi de fenoftaleina pana la aparitia culorii roz pal. Experimentul se realizeaza la dublu.

Valorile rezultate in urma titrarii, au fost prelucrate numeric tinand cont de factorul de titrare, a carui valoare este 2, si astfel s-au obtinut rezultatele din tabelul de mai jos. ( Tabelul nr 5)

Tabelul nr 5- Comparatie intre valori experimentale ale aciditatii unei probe de paine si standardele de aciditate la paine

Dupa cum se poate observa, valorile obtinute ale aciditatii sunt mult mai mici decat maximul de aciditate admisibil in paine, conform cu standardul 878, indiferent ca se face referire la paine alba, semialba, neagra sau dietetica. In cazul de fata analiza a fost efectuata cu o proba de paine alba, asadar painea analizata este conforma din punct de vedere al analizei de aciditate.

In cazul analizei gradului de deformare a glutenului cu sistemul glutomatic de la Perten, analiza s-a realizat pe o proba de faina, proba fiind dublata. Se cantaresc la balanta analitica doua probe de faina de cate 10g . Fiecare din ele se omogenizeaza foarte bine si se trec pe sitele sistemului. Sitele cu faina omogenizata sunt spalate cu cate 3.5 mL solutie salina 25%, procesarea probelor avand loc concomitent in cele doua camere paralele ale aparatului. Dupa aceasta, se preia glutenul din cele doua camere paralele si se formeaza cate o bila din aluat. Fiecare din cele doua bile formate se supun centrifugarii in camera de centrifugare timp de cateva minute. Apoi fiecare din cele doua probe se cantaresc in paralel si se noteaza suprafata ocupata de cele doua bile. In final, dupa aceste masuratori se introduc probele la etuva la 30OC pentru o ora dupa care se masoara inca o data deformarea.

Fig 3. Sistem glutomatic Perten

Tabelul nr 6- Analiza de deformare a glutenului

In urma procesarii numerice, prin scaderea din valorea medie a deformarii la momentul 2, valoarea media a deformarii la momentul 1, se obtine o deformare absoluta de 0.35, adica deformarea glutenului a fost de 3.5. Conform standardului SR877, indicele de deformare al glutenului pentru faina de grau pentru panificatie ia valori intre 5 si 12 pentru faina neagra si semialba, si intre 5 si 15 pentru faina neagra si dietetica. Asadar, pentru panificatie, valorile optime ale indicelui de deformare sunt cuprinse in intervalul 5-13 mm. Un indice de deformare mai mic de 5 mm, ne indica un gluten bun, dar puternic, scurt, care poate fi usor ameliorat. Un indice de deformare mai mare de 20 mm, ne indica un gluten slab, filant, care semnaleaza o degradare produsa de atacul de plosnita graului.

Laboratorul de cromatografie

Acrilamida este o substanță cunoscută încă de la sfârșitul secolul al XIX-lea.  În 1950 s-a reușit pentru prima dată polimerizarea acrilamidei, obținându-se în laborator poliacrilamida Până la începutul acestui secol, nimeni nu bănuia că acest compus toxic se găsește și în alimente.   În 2002 Institutul Național de Alimentație din Suedia descoperă că acrilamida se formează în timpul coacerii și prăjirii alimentelor bogate în amidon. Institutul sublinia încă de la publicarea descoperirii, că în alimentele analizate acrilamida nu apare ca un contaminat, ci ca substanță generată din aliment, în timpul preparării la temperaturi ridicate. Acrilamida se formeaza ca urmare a reactiei Maillard in alimentele procesate termic. Din amidonul care se descompune treptat dar rapid, rezultă compuși dicarbonilici, care se combină cu aspargina sau cu alți aminoacizi liberi, pierzînd molecule de apă. Se formează baza Schiff care reducându-se, trece în compuși intermediari, din care se generează apoi, pe 3 căi posibile, acrilamida.

Fig nr 4. Reactia Maillard

Acrilamida in alimente

Pentru a se genera acrilamidă în alimente este necesar să se întrunească 3 condiții majore:
  – prezența unor carbohidrați macromoleculari (mai ales amidon),
  – existența unor aminoacizi – mai ales aspargina, chiar și în cantități insignifiante (sunt prezenți întotdeauna în făină, cartofi și carne),
  – procesarea la temperaturi înalte (peste 120 ºC).
  Aceste condiții se întrunesc cel mai des în 2 situații:
  AMIDON (făină, cartofi) + COACERE → t ºC >120 => ACRILAMIDA
  AMIDON (făină, cartofi) + ULEI ÎNCINS → t ºC >120 => ACRILAMIDA + ACROLEINĂ

   Dar nu numai pe baza amidonului se formează acrilamida, ci și pe baza altor poliglucide, așa cum este glicogenul din produsele de origine animală (carne, oua). Totuși, cantitatea de glicogen, deci sursa inițilă de acrilamidă, este de aproximativ 100 de ori mai slab reprezentată în aceste alimente, în comparație cu amidonoasele vegetale.  În ultimii zece ani s-a demonstrat, că generarea de acrilamidă are loc întotdeauna când se supune un produs ce conține poliglucide cu lanțuri lungi (amidon, glicogen), la temperaturi mai mari de 120ºC, la coacere sau în prezența uleiului încins, sau în timpul prajirii in grasimi  a unor preparate culinare. Acrilamida se formează în crusta cartofilor prăjiți, în rântașuri, în coaja panificabilelor și chiar în carne, mai ales în cea pregătită tip pane.
   Motivul pentru care este atat de studiat concentratiile de acrilamida din diferite alimente, in conditii diferite, este deoarece acrilamida este o substanță citotoxică, neurotoxică, cancerigenă și mutagenă. Deoarece în ultimii 5 ani s-a demonstrat, de către numeroase instituții de prestigiu din lume, impactul dereglant al acrilamidei asupra materialului genetic (ADN, ARN), astăzi nimeni nu mai neaga acțiunea protumorală, formativă și proliferativă, exercitată de către acest compus.

In cadrul laboratorului de cromatografie de gaze am lucrat jumatate din perioada de practica, in principal pentru determinarea acrilamidei din diferite probe de paine sau biscuiti. Metoda de lucru pentru analiza concentratiei de acrilamida din diverse probe de paine sau biscuiti presupune ca inainte de analiza probelor sa se realizeze solutiile de calibrare pentru curba de calibrare pe solutii standard. Solutiile de calibrare pentru a se trasa curba de calibrare se repeta in fiecare luna, pentru a se putea detecta orice fel de schimbare atat din punct de vedere al functionarii aparaturii, cat si schimbari survenite probelor analizate deja, sau reactivilor.

Curba de calibrare se va realiza pe domeniul de lucru 100-7500 µg/l cu acrilamida marcata cu C13 cu diferite nivele de concentratii.

Tabelul nr. 7-Nivelele de calibrare pentru curba de calibrare pe solutii standard

Metoda de lucru pentru trasarea curbei de calibrare include urmatoarele etape:

Dozarea apei ultrapure in flacoane

Calculul cantitatii de acrilamida marcata cu C13, solutia de lucru I de acrilamida marcata avand concentratia de 10 µg/ml, folosindu-se de micropipeta de 20-200 µg/l

Calculul cantitatii de acrilamida nativa, solutia de lucru I de acrilamida nativa de concentratie 10 µg/mL si solutia de lucru II de acrilamida nativa de concentratie 1 µg/mL

Proba Blank va contine doar acrilamida marcata, solutia de lucru I, de concentratie 10 µg/ml

Derivatizarea extractului de acrilamida prin bromurarea extractului de acrilamida se petrece in aproximativ 12 ore la intuneric. Eliminarea excesului de brom, se realizeaza apoi prin adaugare de tiosulfat de sodiu 1M, pana la disparitia coloratiei galbene

Extractia derivatului dibromurat cu pastrarea fazei organice si indepartarea fazei apoase

Extractul de derivat dibromurat se concentreaza intai la rotavapor si apoi sub atmosfera de azot

Reconstituirea reziduului de 2,3-DBPA purificat de acizi grasi, sau alte resturi prin redizolvarea reziduului cu acetat de etil

Transformare a 2,3-DBPA in 2-BPA prin adaos de trietilamina

Filtrarea extractului 2-BPA, prin trecerea probei prin filtru, apoi in flacoane pentru autosampler cu insertie capilara

Capsare si etichetare flacoane

Procesare flacon in Soft X Calibur, softwarul pentru Gaz-Cromatograf( L=30m, diam=0,25; Gaz purtator He)

Ca si proba de analizat, am ales pentru a descrie aici mai amanuntit determinarea de acrilamida dintr-o proba de biscuiti sarati. Inainte de a se porni analiza biscuitilor este necesar a se cunoaste cateva valori orientative pentru diferite produse de panificatie sau similare. Concentratia standardului intern din curba de calibrare este de 1000 µg/L, concentratia standardului intern din probele imbogatite este de 2500 µg/L, iar factorul de corectie este de 2.5.

Tabelul nr. 8 -Valori orientative pentru produse de panificatie si similare

Biscuitii de acelasi fel, din mai multe pachete se macina cu moara de laborator pentru a se obtine un pesmet fin. Din macinisul obtinut, se cantaresc 3 g de proba pentru a fi luata in lucru, iar restul este pastrat pentru repetarea ulterioara a probei daca este nevoie sau pentru modificari in ameliorarea metodei de lucru.

In Tabelul nr. 9, se mentioneaza nivele de imbogatire cu acrilamida nativa a probei comparativ cu concentratiile standardelor interne de imbogatire.

Tabelul nr. 9 Probe de pesmet macinat imbogatit cu solutie de acrilamida nativa

Etapele analizei probei de biscuiti sunt descrise mai jos cu explicitarea fiecarei faze in parte, in tabelul nr 10.

Tabelul nr 10- Etapele si fazele analizei de determinare a acrilamidei din biscuiti

In final se obtine o concentratie masurata care se compara cu cea calculata. In urma acestei analize, s-a obtinut o concentratie de acrilamida in proba de biscuiti de 1205.65µg/L, ceea este peste valoarea orientativa expusa anterior. Depasirea valorii mentionate initial ca valoare orientativa, se poate datora atat fainii din care au fost obtinuti biscuitii, acestia fiind dintr-un amestec de faina de grau, secara, si cu tarate.

Laboratorul de RMN

In cadrul laboratorului de RMN, am realizat analiza a 9 uleiuri vegetale, 6 uleiuri de masline, extravirgine, obtinute prin procedee mecanice sau prin presare manuala,din masline sau din turte ori pasta, si 3 uleiuri de floarea soarelui. Analiza s-a realizat prin tehnica de rezonanta magnetica nucleara. In urma prelucrarii spectrelor H-RMN pe baza ecuatiilor chemometrice, care permit calcularea masei moleculare medii, si a indicilor de iod si de saponificare a uleiurilor vegetale, se deduce compozitia uleiului, si influenta regiunii geografice, a soiului, precum si a anului recoltei asupra proprietatilor pe care uleiul vegetal le detine, si de asemenea se poate observa ca in unele cazuri producatorii au utilizat stabilizatori sau alte ingrediente pentru a ameliora caracteristicile uleiului. Aceste rezultate pot fi ulterior comparate cu valorile obtinute prin metode standard de analiza si cel mai adesea se pot observa concordante intre acestea.

In cadrul analizei realizate se analizeaza continutul de acizi grasi mononesaturati, nesaturati, dinesaturati, trinesaturati. Prelucrarea probelor de ulei in acest caz este destul de simpla, deoarece proportia solutiei de analizat este 0.2 mL ulei si 0.8 mL cloroform deuterat, care se analizeaza cu aparatul Broker Ascend TM 400, la 9.4 Tesla. Schimburile chimice sunt raportate in ppm, folosind TMS ca si standard intern. O analiza completa a celor 9 probe, care consta in obtinerea spectrului de protoni, de carbon, DEPT, Cosy si HMQC se realizeaza in 12 ore.

Prelucrarea datelor se realizeaza cu urmatoarele ecuatii chemometrice.

In cele ce urmeaza k reprezinta o constanta spectrometrica, fiind un coeficient calculat care coreleaza integrala semnalului cu numarul de protoni de la care provine semnalul.

x reprezinta procentul molar al acidului linoleic

y reprezinta raportul molar al acidului linolic

z reprezinta raportul molar al acidului oleic

t reprezinta acizi grasi saturati

Fig 5. Exemplu Spectru H-NMR al unui ulei de soia

Spectrul H-RMN al uleiurilor vegetale au forme similare, iar atribuirea peak-urilor se poate vedea in tabelul nr 11.

Tabelul nr 11- Atribuirea peak-urilor a spectrului H-NMR al uleiurilor vegetale

In continuare, voi prezenta spectrele obtinute in cazul a doua uleiuri de masline, respectiv analiza componentelor acestor uleiuri dupa formulele si calculele expuse mai sus.

Fig 6. Spectrul de H-NMR al uleiului BIOALLGREEN

Fig 7. Spectrul de H-NMR al uleiului Costa D’Oro

Tabelul nr 12- Analiza componentelor a doua marci de uleiuri de masline

Laborator de nutritie

In cadrul laboratorului de nutritie se fac analize pentru determinarea micotoxinelor din cereale, legume si fructe, in special a patulinei.Am participat la analiza de determinare a patulinei din sucul de mere, prin cromatografie de lichide de inalta performanta, metoda pe care o detaliez mai jos.

Micotoxinele sunt produși metabolici ai fungilor, care sunt capabili să producă efecte toxice acute sau cronice (cancerigene, mutagene, teratogene) asupra animalelor și asupra oamenilor.

Fig 9. Reprezentarea schematica a etapelor elaborarii unei metode HPLC

Fig nr 10. Cromatograf de lichide de înaltă performanță cu detector UV-VIS cu șir de diode ,,DIODE ARRAY”, THERMO – Finingam

Analize senzoriale

Laboratorul de analize senzoriale este format din mai multe incaperi. Laboratorul propriu zis, in care exista o camera de pregatire probe cu aparate de masurare a volumelor, maselor, temperaturii, si frigider, si o camera pentru degustare izolata fonic si termic, in care sunt cateva cutii de forma patrata cu capac fix, instrumentar si pahare de diferite forme, impreuna cu chestionare corespunzatoare diferitelor tipuri de degustare. In aceasta camera are loc degustarea pentru cazul in care grupul de degustatori este unul redus ca si dimensiuni, dar in cazul in care se doreste o analiza senzoriala mai completa, cu raspunsuri de la mai multe persoane, se utilizeaza cantina, unde de asemenea se amenajeaza locuri de degustare indiviuale si specifice pentru fiecare produs de analizat in parte.

In cadrul laboratorului de analize senzoriale, am participat la analiza unor probe de biscuiti cu diferite tipuri de fainuri si tarate,impreuna cu seminte de mac, si chimen produs obtinut in scop de cercetare.

Am avut de analizat din punct de vedere al aspectului exterior, aspectului in sectiune, al formei, consistentei, gustului si aromei, 5 probe de biscuiti simpli, fara umplutura.

Biscuiții aveau suprafața granuloasa, fără urme de arsură, fără cu mici goluri in compozitiei si cu seminte intregi atat in compozitie cat si la suprafata. În secțiune biscuiții aveau un miezul copt, uniform, fara corpuri străine. Culoarea biscuiților varia de la o nuanță gălbuie deschis pana la o nuanta spre portocaliu.Gustul biscuiților a fost la unul din sortimente usor amar, iar senzatia la inghitire la un sortiment era destul de neplacuta, deoarece biscuitii erau foarte uscati. Mirosul biscuiților era unul placut, influentat

de semintele utilizate. Trei din cele cinci sortimente de biscuiti au fost tari, nu foarte fragede dau destul de sfaramicioase.

Pentru analiza calitatii biscuitilor supusi analizei senzoriale, s-a utilizat un chestionar similar celui de mai jos, utilizandu-se metoda scarii de punctaj. Degustarea a avut loc in grupuri de cate 4 degustatori, atat studenti cat si cercetatori din cadrul institutului. Dupa fiecare proba, s-a facut o mica pauza, si s-a clatita gura, sau baut apa, pentru a putea distinge toate caracteristicile individuale ale fiecarei probe in parte.

Datele din cadrul analizei, s-au strans intr-un tabel centralizator, facandu-se o medie a punctajului obtinut de fiecare proba in parte. Ulterior, rezultatele au fost interpretate din punct de vedere statistic rezultand atat preferintele consumatorilor cat si o ierarhie a produselor testate. Aceste rezultate au fost utilizate pentru a se ameliora biscuitii realizati in cadrul proiectului de cercetare si pentru a se vedea impactul variatiei proportiilor de fainuri din cereale diferite din biscuiti si amestecul de seminte.

Bilant de materiale pentru obtinerea biscuitilor

Ingredientele supuse procesarii in vederea obtinerii biscuitilor se gasesc enumerati cantitativ in tabelul de mai jos.

Tabelul nr. 14 – Ingredientele din reteta de fabricatie pentru obtinerea a ~37 kg biscuiti aglutenici

Reteta de fabricatie de mai sus este valabila pentru o productie de 92 caserole de biscuiti de 400g pe zi, intr-o unitate cu flux mic de biscuiti, valorile utilizate fiind orientative si obtinute in cadrul perioade de practica in sectia de panificatie a Institutului de Bioresurse Alimentare, Bucuresti.

Ridicarea la scara industriala, intr-o linie de fabricare automatizata a biscuitilor aglutenici, se obtin 350 kg de biscuiti pe ora. Calculele cantitatilor se vor efectua in continuare pentru aceasta valoare de 350 kg biscuiti, urmand ca in final sa se tina cont ca aceasta cantitate de biscuiti se realizeaza doar intr-o ora de productie.

37 kg biscuiti aglutenici…………………….30 kg faina aglutenica

350 kg biscuiti aglutenici ………………..a

a= 283,78 kg faina aglutenica;

37 kg biscuiti aglutenici ……………………8 kg zahar

350 kg biscuiti aglutenici …….………….b

b=75,68 kg zahar;

37 kg biscuiti aglutenici …………….8 kg margarina

350 kg biscuiti aglutenici ………c

c= 75,68 kg margarina;

37 kg biscuiti aglutenici …………..0,8 kg oua

350 kg biscuiti aglutenici ………..d

d= 7,57 kg oua;

37 kg biscuiti aglutenici …………….4 L apa

350 kg biscuiti aglutenici ………e

e= 37,84 L apa=> 37,84 kg apa

37 kg biscuiti aglutenici …………..0,57 kg afanatori

350 kg biscuiti aglutenici ………..f

f= 5,39 kg afanatori;

Capacitatea de productie =350kg/h=> 350*24=8400 kg/24 h

Consumuri specifice și randamente de fabricație

Deoarece faina, ca materie prima reprezinta aproximativ 85% din structura pretului de cost al biscuitilor, este important a se cunoaste norma de consum de faina, adica atat norma tehnologica cat si cea de aprovizionare. Din industrie, s-a observat ca norma tehnologica este mai mica decat cea de aprovizionare cu circa 15%, asadar cea mai importanta este norma tehnologica.

Pentru a se calcula consumurile specifice, este nevoie a se afla valoarea randamentului in biscuiti, adica cantitatea de produse( in kg) obtinute din 100kg faina, echivalentul raportului procentual dintre masa produsului rezultat si masa fainii consumate pentru obtinerea produsului rezultat.

Randamentul în biscuiti se calculează:

unde

M biscuiti – masa biscuitilor fabricati, kg

Mfaina – masa făinii utilizate, kg

Deoarece faina este ingredientul principal, pe baza randamentului in biscuiti se obtine consumul specific de faina (Cs), astfel :

Consumul specific de aprovizionare se obtine adaugand la Cs 0,15% din valoarea sa. Pierderile tehnologice care influenteaza randamentul in biscuiti sunt pierderi prin fermentatie, prin coacere si prin racire. Pierderile procentuala fata de masa initiala a aluatului si respectiv a biscuitilor din fiecare etapa de fabricatie, ceea ce inseamna ca pierderile de fermentatie se raporteaza fata de masa aluatului initial, pierderile prin coacere se raporteaza la aluatului dinainte de coacere, iar pierderile prin racire se raporteaza la biscuitii scosi din cuptor.

Pierderile din fermentatia aluatului variaza intre 1,5 si 2,5%, fiind influentate de catre calitatea fainii, consistenta aluatului si de controlul fermentatiei. In calcule se va utiliza o valoare medie a pierderilor din fermentatie de 2%.

Pierderile prin coacere au valori intre 5 si 20%, depinzand atat de marimea si forma produsului cat si de cuptor. Aceste pierderi constau in pierderi de apa si de substanta uscata. Umiditatea se pierde din straturile superficiale ale aluatului care este supus unor transformari multiple in timpul coacerii, iar pierderile de substanta uscata se refera la pierderi de substante volatile din aluat, ce rezulta in timpul fermentarii aluatului, si care sunt degajate in spatiul de coacere. La coacere se inregistreaza cele mai mare pierderi tehnologice. Acestea se calculeaza cu formula de mai jos, masele fiind exprimate in kg, iar pierderile de la coacere fiind procentuale :

Valori uzuale ale pierderilor la coacere :

La coacere este important sa se inspecteze starea cuptoarelor, temperatura de coacere, durata de coacere si incarcarea normala a cuptorului. Verificarile se realizeaza prin sondaj, prin cantarirea mai multor bucati de biscuiti din diverse locuri ale vetrei cuptorului, la scoaterea din cuptor. Greutatea lor se scade din greutatea bucăților de aluat, diferența exprimându-se în %.

La racire, pierderile variaza intre 2,5 si 3,5% valorile care depinde de parametrii aerului din spatiu de depozitare, dar si de forma si marimea biscuitilor. Valorile exacte se obtin prin cantarirea prin sondaj a biscuitilor dupa scoaterea din cuptor ( de obicei a celor utilizati anterior pentru determinarea pierderilor de la coacere) si se aseaza la racire, in spatiul de depozitare, conform cu conditiile de productie. Apoi, se cantaresc din nou biscuitii, si prin diferenta procentuala fata de masa biscuitilor calzi, se obtin pierderile procentuale de la racire.

Pierderile din timpul procesului de fabricatie sunt alcatuite din produsele rebut si se calculeaza procentual fata de productia obtinuta, fiind de circa 0,1%. Exista si deseuri de faina dar acestea nu depasesc 0,15%.

Pentru calculul bilantului de materiale se vor folosi urmatoarele valori ale pierderilor in functie de operatiile din cadrul procesului de fabricatie a biscuitilor aglutenici.

In urma procesarii termice, a racirii si ulterior a ambalarii se obtin 92 de caserole cu 400 grame de biscuiti (B).

=>

Asadar, cantitatea de aluat obtinuta dupa amestecare ingredientelor este de 51.37 Kg. Din acestea, in urma coacerii si racirii se obtin 36.8 Kg de biscuiti, adica 92 de caserole de 400grame cu biscuiti. Deci, pierderile suferite in timpul coacerii si racirii reprezinta 14.57 Kg, adica 28.36% pierderi in urma procesului de coacere si in urma racirii biscuitilor dupa coacere.

Pierderile din timpul coacerii se pot explica in principal din cauza scaderii umiditatii de la 16-27% la 4-7% in timpul coacerii, datorita evaporarii apei de la suprafata produsului.In timpul racirii, biscuitii calzi cedeaza caldura si umiditate.