Laboratorul de Biotehnologie

Arthemisia dracunculus L. – Familia Compositae (Asteraceae)

Tarhon – română

Tarragon – engleză

Esdragon – germană

Estragon – franceză

Importanța culturii

De la tarhon se folosesc frunzele și tulpinile tinere, care au aromă caracteristică și un gust iute–răcoritor, pentru condimentarea și aromatizarea preparatelor culinare și a murăturilor. În industria alimentară se folosește la condimentarea unor conserve de carne și legume, la prepararea diferitelor marinate și a murăturilor de legume în oțet.

*Părțile aeriene ale plantei conțin ulei volatil (0,1–0,4%) format din metichavicol, felandrean și acimen, taninuri, substanțe amare, vitaminele B1 și C, săruri minerale, urme de iod.

Tarhonul are proprietăți terapeutice și este utilizat în medicină pentru tratarea unor afecțiuni ca: boli de ficat și rinichi, ascită, reumatism, dureri de cap și de dinți, ca și pentru simularea apetitului și a digestiei.

Origine și răspândire

Este o plantă originară din extremul orient, Siberia și Mongolia, cunoscută încă din antichitate și răspândită în principal în Europa (din secolul XVI) și Asia. În prezent, suprafețe mari se cultivă în Cuacaz și Siberia, iar în alte țări, mai reprezentative sunt culturile din aproprierea fabricilor de conserve. În țara noastră, tarhonul este mai bine cunoscut în Transilvania, și în general, se cultivă pe suprafețe restrânse, în localități rurale situate în bazinele legumicole și în jurul orașelor mari.

Particularități biologice

Tarhonul este o plantă perenă, semileguminoasă, viguroasă, cu aspect de tufă. Sistemul radicular se dezvoltă până la 70–90 cm adâncime, dar ponderea de peste 80% a rădăcinilor active se găsește în stratul superficial de 30–40 cm. Tulpina puternic ramificată, poate ajunge după anul al doilea de cultură, la 60–100 cm. Frunzele sunt mici, glabre, alterne, de 5–7 cm lungime și 4–7 mm lățime, linerar lanciolate, cu marginea întreagă, aspre, de culoare verde–gălbui. Frunzele tinere cresc pe lăsarii din primăvară și sunt puternic aromate datorită conținutului în uleiuri eterice.

Florile de culoare diferită în funcție de biotip (albă, galbenă, violacee), sunt mici și sunt grupate în inflorescențe de tip calatiudiu și înfloresc în august–septembrie. Multe flori sunt sterile, motive pentru care tarhonul se înmulțește, de obicei, pe cale vegetativă. Fructul este o achenă obovată, comprimată, de dimensiuni foarte mici (5000 bucăți/gram). Facultatea germinativă se menține 2–3 ani.

Exigențe ecologie

Tarhonul are pretenții foarte mici față de căldură. Rezistă la temperaturi coborâte de

–25..…–30 grade Celsius. Are pretenții mari față de lumină, de aceea se cultivă pe terenuri însorite, cu expoziție sudică. Față de umiditate are cerințe moderate, dar permanente, de aceea în timpul verii necesită irigarea prin aspersiune. În condiții de secetă și temperatură ridicată, producțiile scad, iar lăstarii își pierd din frăgezime, se lignifică și devin prea picanți, improprii pentru consum. Nu suportă însă excesul de umiditate din sol. Producții ridicate se obțin pe soluri cu textură mijlocie, profunde, fertile, cu pânză de apă freatică mai la suprafață, bine drenate.

(Ruxandra Ciofu – coordinator, Nistor Stan, Victor Popescu, Pelaghia Chilom, Siviu Apahidean, Arsenie Horgoș, Viorel Berar, Karl Fritz Lauer, Nicolae Atanasiu, Tratat de legumicultură, Editura Ceres, București, 2004

Specii înrudite

Tarhon franțuzesc (Artemisia Redowskii) este ruda sa cea mai apropiată. Totuși, gustul său este mult mai amar, și din această cauză este mai puțin folosit.

Mitologie

Traducerea cuvântului „dracunculus” se referă la semnificația sa mitologică „micul dragon”. În Evul Mediu oamenii credeau că este un bun anticorp impotriva muscăturilor de animale veninoase.

Uz medicinal Ceaiul din flori și frunze de tarhon stimulează funcțiile rinichiului.

Anne Iburg, Condimente: origine–gust–întrebuințări–rețete, Editura ALLFA, București, 2006, p. 40.

Medii de cultură

În procesele biotehnologice, mediile de cultură sunt constituite din suporturi nutritive sterilizate care permit dezvoltarea și studiul unui organism, în afara nișei ecologice naturale. Compoziția mediilor de cultură are o importanță asupra reproductibilității și eficienței tehnologiei respective.

În funcție de consistență, compoziție, scopul utilizării, mediile de cultură se clasifică astfel:

Capitolul II. Aspecte privind activitatea laboratorului de biotehnologii

2.1.Echipamente și utilități necesare laboratorului de culturi de țesuturi vegetale

Activitatea dintr-un laborator de culturi vegetale are ca scop cercetarea, producția sau domeniul didactic. Indiferent cât de elaborate și de diversificate ar fi activitățile desfășurate în laborator, acesta cuprinde spații dedicate selecționării preliminare a țesutului de plantă care urmează a fi luat în studiu, preparării mediului de cultură și sterilizării acestuia, transferului într-un mediu steril în vederea manipulării aseptice, camera de creștere a culturilor pasate, “in vitro”, un instrumentar adecvat care trebuie sterilizat, un spațiu rezervat curățirii și dezinfectării vaselor necesare laboratorului etc.

Orice laborator de culture de țesuturi trebuie să aibă un minim de condiții pentru a putea funcționa fără probleme:

Canalizare proprie;

Să aibă sursă de apă;

Să fie racordat la curentul electric;

Să fie amenajat într-un loc în care să lipsească pericolul igrasiei și al inundațiilor.

Laboratorul este format din două zone:

2.1.1. Sticlăria

Laboratorul de culturi de țesuturi, față de sticlăria, instrumentarul și dotările unui laboratorul obișnuit, conține o varietate mare din obiecte de sticlă, cu rezistență ridicată la autoclavare. O alternativă economică pentru asigurarea flacoanelor pentru cultura țesutului, sunt borcanele alimentare, recipiente ideale pentru mediu și pentru cultură întrucât ele rezistă la autoclavare și au transparența și compoziția corespunzătoare. Un minim de dotări necesare este prezentat în tabelul următor:

2.1.2. Zona de lucru și echipamentul specific

a) Hota cu flux laminar orizontal

Hotele orizontale sunt proiectate în așa fel încât aerul se mișcă direct spre operator, oferind cel mai înalt grad de protecție culturilor din interior. Hota are curent de aer continuu care trece printr-un filtru HEPA (eficiență 99,9995% pentru particule <0,3μm) care elimină particulele din aer. Hota este echipată cu o lampă bactericidă UV λ=254 nm care poate fi activată pentru câteva minute pentru a steriliza suprafețele hotei. Numai suprafețele expuse vor fi sterilizate, iar lampa UV la începerea lucrului la hotă va fi oprită deoarece radiația UV cu această lungime de undă poate provoca leziuni pe piele și în ochi. Hota trebuie pornită cu 10-20 minute înainte de începerea activității. Se vor șterge toate suprafețele cu etanol înainte și după folosire.

b) Microscoape și stereomicroscoape

Microscoapele și stereomicroscoapele sunt frecvent utilizate pentru vizualizarea celulelor. Pe durata nefuncționării se recomandă acoperirea microscoapelor și oprirea luminii lor.

Microscopul optic se compune dintr-un stativ pe care sunt montate un sistem de transmisie optică, o platină port-obiect și un sistem de iluminare.

Sistemul de transmisie optică este format din oculare cu o putere de mărime de 5x, 7x, 10x, 15x, 20x și chiar 30x. În lucrările curente cele mai des folosite sunt cele 7x și 10x. ocularele au rolul de a mări imagine preparatului, dar si de a aplatiza și lumina câmpului optic. Tot din acest sistem fac parte și obiectivele care sunt constituite din una sau mai mult lentile, centrate, destinate a forma o imagine reală a obiectului. Puterea lor de mărime invers proporțională cu distanța focală, adică distanța dintre obiect și lentila pe care se formează imaginea. Calitatea esențială a obiectivelor este puterea lor de rezoluție. Aceasta, la rândul ei depinde de mărimea unghiului pe care îl face conul de raze care intră în lentilă precum și de indicele de refracție al mediului dintre obiectiv și lentilă. Obiectivele sunt fixate prin înșurubare pe un revolver protobiectiv care permite selecționarea rapidă a unuia din ele, prin simpla rotire. Gama de obiective necesare se compune din trei obiective cu puterea de mărime de 10x, 20x, 40x și un obiectiv cu imersie cu grosistemul 90x. Acest obiectiv se folosește în cazul în care obiectivul ce trebuie examinat este mai mic sau dacă este necesar a se observa amănunte foarte fine. La obiectivul cu imersie este necesar a se interpune între obiect și lentila frontală a obiectivului un lichid transparent (ulei de cedru, ulei de parafină, balsam de Canada etc.)

Stereomicroscoapele sunt folosite în laboratorul de biotehnologii vegetale pentru a realiza secțiuni foarte mici cum sunt de exemplu (vârfurile meristematice prelevarea de ovare, ovule, grăuniciori de polen etc.)

c) Balanțe analitice

Balanțele analitice și semianalitice sunt destinate utilizării în procesele de cântărire a componentelor mediilor de cultură.

d) Distilatoare și bidistilatoare

Sunt destinate preparării apei distilate și bidistilate utilizate atât la limpezirea sticlăriei, cât și la prepararea mediilor de cultură.

e) Aparatele pentru sterilizare și tehnica sterilizării

Un produs este considerat steril când nu mai conține forme de microorganisme ce pot fi revitalizate. Există mai multe procedee de sterilizare ce trebuie tratate.

Autoclavarea este sterilizarea cu autoclavorul, ea implicând distrugerea completă a tuturor microorganismelor, inclusiv a sporilor lor. Principiul sterilizării cu abur sub presiune este de a expune fiecare articol la contact direct cu aburul și la temperatura și presiunea pentru timpul specificat. Aburul ideal pentru sterilizare este aburul uscat saturat 100% (absența condensului) la presiuni între 1,0 atm și 2,5 atm.

Autoclavul este un cazan cu pereți dublu, cazanul interior fiind în comunicare cu spațiul dintre cei doi pereți, printr-un număr de orificii situate în partea sa superioară. Spațiul dintre cei doi pereți comunică cu exteriorul prin niște robinete. Capacul autoclavului este străbătut de orificii la care sunt adaptate un manometru, un robinet pentru reglarea presiunii și o supapă de siguranță. În comunicare cu cazanul interior se mai găsește un robinet de purjare. Sursa de căldură poate fi reprezentată de un arzător cu gaze sau de o rezistență electrică.

Tot echipamentul trebuie sterilizat înainte de lucrul practic, pentru a se evita contaminarea. Culturile și materialele contaminate trebuie sterilizate după folosire pentru siguranță.

Autoclavarea este metoda preferată de sterilizare pentru medii de cultură, sticlărie și instrumentar. Procesul folosește aburi la înaltă presiune, de obicei la 1210C. microbii sunt uciși mai eficient de căldură umedă decât de căldura uscată, întrucât umezeala le descompune proteine. Autoclavarea poate fi realizată și o oală sub presiune. Oalele sub presiune pot fi folosite în școli și în laboratoare mici dar dimensiunile lor reduse constituie un dezavantaj.

Principiile autoclavării

Există doi factori cruciali în eficiența procesului de autoclavare:

2.3.Mediul de cultură (componentele lor)

Pentru programarea in vitro a speciilor de plante, este foarte importantă alegerea compoziției mediului de cultură, acesta fiind diferit în funcție de scopul urmărit. Mediul de cultură se alege fie în funcție de natura speciei sau de momentul în care materialul vegetal a fost prelevat și inoculat. Astfel, se pot întrebuința medii cu o utilitate mai largă, fie medii specifice, toate alese în funcție de scopul urmărit. Dar succesul propagării in vitro este în mare măsură influențat de compoziția amestecului nutritiv, care evident trebuie să corespundă necesității vitale ale țesutului, pentru a compensa factorii endogeni prezent în diferite proporții în celulele țesutului respectiv.

Compoziția mediului aseptic a constituit prima etapă și poate cea mai importantă încă de la începuturile acestui domeniu. Compoziția unor medii de cultură mai frecvent utilizate sunt legate de anii 1942-1956 apoi 1961-1971, urmând ultimele decenii ale secolului XX-lea când au apărut noi formulări de medii cu compoziții îmbunătățite și cu specificitatea aproape pentru fiecare grup sau familie de specie.

Specialiștii în domeniul nuțriției plantelor, care au întreprins o mulțime de testări privind reacția diferitelor tipuri de explante in vitro, au stabilit elementele chimice indispensabile culturii țesuturilor precum și forma sub care trebuie să fie prezente în mediul de cultură. În prezent s-a semnalat la unele plante cultivate in vitro, modificări metabolice, datorate excesului sau lipsei unor elemente în compoziția mediului de cultură.

Compușii anorganici

Din compușii organici care intră în compoziția mediilor de cultură, apa și substanțele organice sunt cei mai importanți.

Apa este importantă pe de o parte ca și componentă a mediului de cultură, dar și prin prezența obligatorie a ei în țesuturi. Apei trebuie să-i acordăm atenție, pentru a nu ajunge în situația ca țesutul inoculat să-și piardă turgescența cu o anume rapiditate, deci pentru a evita deshidratarea țesuturilor, mai ales a celor juvenile provenite din plăntuțele obținute prin germinarea semințelor, sau din inflorescențe foarte tinere. Plantele obținute in vitro transpiră, pierzând o parte din apă în spațiul vasului de cultură, o parte de apa pierdută prin transpirație însă revine în mediu, iar o alta se pierde prin evaporare. Descreșterea gradului de umiditate din recipientele de cultură, face ca substanțele din mediu să se concentreze iar substratul agarizat să scadă ca înălțime, ca în final să se usuce și să crape.

Mediile de cultură se prepară numai cu apă distilată sau bidistilată. Este preferată cea din urmă pentru că nu mai conține ioni (de Cu), care sunt toxici pentru plante. De acea distilarea se face în distilatoare de sticlă care nu conțin cupru. Apa distilată este de preferat a se păstra un timp, dar nu foarte îndelungat și de preferat în baloane de sticlă, Pirex sau plastic închise ermetic.

Sărurile minerale anorganice. Cele utilizate frecvent în prepararea mediilor aseptice sunt: azotați, cloruri, sulfați. Uzual aceste substanțe alcătuiesc macroelementele și microelementele. Macroelementele necesare în cantități de milimoli (mM) sunt: C, O, H, N, K, Ca, P, S, Mg, concentrația lor putând varia între 25-40 mM (N); 20 mM (K), iar celelalte de la 1-3 mM, până la 300-400 mg/l. Microelementele necesare în cantități mici de micromoli (cca. 0, 5-0, 01 mg/l) sunt: Fe, Mn, Zn, Al, B, Mo, Na, Co și I.

Atât macroelementele cât și microelementele sunt preparate în soluții stoc, care conțin cantități variabile. Astfel, primele formulări de mediu sunt cele concepute de: Gautheret (1942), White (1943 și 1963); Hildebrandt și Duggar (1946); Heller (1953); Nitsch (1956) Murashige și Skoog (1962); Erikson (1965); Gamborg-B5 (1968); Nagata și Takebe-NT (1971) etc. (tabel nr. 3).

Rolul fiecărui element variază în funcție de forma chimică în care se prezintă în mediu, de concentrația lor,de natura explantelor sau de tipul culturii(o cultură nou inițiată in vitro ori subculturi repetate). Lipsa unui element în mediu de cultură se manifestă în funcție de specie,iar de cele mai multe ori lipsa lui se resimte după două sau trei subculturi. Manifestarea carenței diferă funcție de elementul care este lipsă. Lipsa N duce la acumularea de antociani și în final la moartea țesutului .În cazul S,lipsa lui duce la clorozarea țesutului. Excesul unor elemente poate fi la fel de dăunătoare exemplu, S și P determină apariția de necroze și în final moartea țesutului (după Cachiță C. D. ,1987). Microelementele din mediu de cultură exercită rol diferit față de macroelementele din mediu, dar omiterea lor, după Heller 1953, duce la scăderea capacității de creștere a explantelor, cu până la 40%. Compoziția de microelemente stabilită de Heller, este cea mai des utilizată,chiar și acum în culturile de țesuturi (vezi tabel 3).

Studiile întreprinse de mulți cercetători încă de la început, au făcut să apară puncte de vedere diferite,cu privire la rolul și importanța elementelor chimice. Cu toate acestea au existat și multe puncte de vedere comune, încât s-au putut stabilii unele rețete de medii aproape clasice. Tabelul nr.3, prezintă câteva rețete în care constatăm că sunt un număr de substanțe care se găsesc aproape la toți autorii. Astfel, sărurile ca KNO3,MgSO4,Ca(NO3)2,MnSO4, NaH2PO4, ZnSO4, KI etc. sunt surse de macroelemente prezente în mediile de cultură aproximativ în aceleași concentrații. Dintre microelemente Fe, deși prezent în unele soluții stoc de microelemente el este adăugat și suplimentar în mediu sub formă de chelat de Fe.

Compușii organici

Plantele cultivate in vitro, au o nutriție heterotrofă sau mixotrofă, tot timpul cultivării in vitro, după trecerea pe substratul anorganic natural ex vitro, plantele revin la nutriția autotrofă.

Sursa de carbon necesară plantelor este corelată cu regimul de iluminat aplicat plantelor. Celulelor cultivate in vitro nu sunt capabile de a asigura fotosinteza, CO2 fiind foarte redus, singura sursă este respirația plantelor. Componentele organice utilizate cel mai des sunt redate în tabelul de mai jos:

Unde:

•MS = Murashige-Skoog

•B5 = Gamborg și colaboratorii

•NT = Nitsch-Takebe

Sursa de carbon organic in vitro, este asigurată de introducerea în mediul de cultură a zaharozei și glucozei. Concentrațiile optime ale acestora sunt de 2-3 %. După unii autori concentrația poate oscila intre 1, 2-8% procent, care variază funcție de natura țesutului inoculat. Altă sursă de asigurarea a carbonului organic în mediu de cultură, sunt acizii organici și alcoolii. Dacă glucidele îndeplinesc funcția metabolică importantă în mediile de cultură, alcoolii și acizii organici au un aport redus în asigurarea conținutului de carbon organic. Acizii au valoare energetică mică, față de zaharoză. Sunt și țesuturi, la care unii acizi cum ar fi; acidul citric, succinic, fumaric etc. au rol în procesul de creștere a acestor țesuturi. Și unii alcooli ca glicerolul ar putea fi utilizat ca sursă de carbon. Alții însă pot avea o valoare energetică insuficientă pentru țesuturile cultivare in vitro, iar monoalcooli (metanol, etanol etc.) sunt inutilizabili.

Este cunoscut că plantele sunt autotrofe față de azot, pe care-l preiau din substanțele organice. Pentru culturile in vitro sursa de azot organic este asigurată prin adăugarea aminoacizilor și a ureei, care în anumite situații determină creșterea și multiplicarea țesuturilor. Introducerea lor în mediu este bine să fie urmată de testări anticipate (de exemplu la aminoacizi), deoarece la unele țesuturi aminoacizii pot inhiba creșterea lor. Doza de administrare poate fi cuprinsă între 2-10 mg/l.

Vitaminele. Rolul lor în creșterea și dezvoltarea țesuturilor in vitro a fost semnalat încă de la începutul inițierii culturilor in vitro (White 1963) .Cercetările recente au dovedit prezența obligatorie a lor în mediile de cultură în concentrații
Rolul fiecărui element variază în funcție de forma chimică în care se prezintă în mediu, de concentrația lor,de natura explantelor sau de tipul culturii(o cultură nou inițiată in vitro ori subculturi repetate).Lipsa unui element în mediu de cultură se manifestă în funcție de specie,iar de cele mai multe ori lipsa lui se resimte după două sau trei subculturi. Manifestarea carenței diferă funcție de elementul care este lipsă. Lipsa N duce la acumularea de antociani și în final la moartea țesutului .În cazul S,lipsa lui duce la clorozarea țesutului. Excesul unor elemente poate fi la fel de dăunătoare exemplu,S și P determină apariția de necroze și în final moartea țesutului( după Cachiță C. D. ,1987).Microelementele din mediu de cultură exercită rol diferit față de macroelementele din mediu,dar omiterea lor,după Heller 1953,duce la scăderea capacității de creștere a explantelor,cu până la 40%.Compoziția de microelemente stabilită de Heller,este cea mai des utilizată,chiar și acum în culturile de țesuturi (vezi tabel 3).

Studiile întreprinse de mulți cercetători încă de la început,au făcut să apară puncte de vedere diferite,cu privire la rolul și importanța elementelor chimice. Cu toate acestea au existat și multe puncte de vedere comune, încât s-au putut stabilii unele rețete de medii aproape clasice. Tabelul nr.3,prezintă câteva rețete în care constatăm că sunt un număr de substanțe care se găsesc aproape la toți autorii. Astfel,sărurile ca KNO3,MgSO4,Ca(NO3)2,MnSO4, NaH2PO4,ZnSO4,KI etc. sunt surse de macroelemente prezente în mediile de cultură aproximativ în aceleași concentrații. Dintre microelemente Fe,deși prezent în unele soluții stoc de microelemente el este adăugat și suplimentar în mediu sub formă de chelat de Fe.

Compușii organici

Plantele cultivate in vitro,au o nutriție heterotrofă sau mixotrofă,tot timpul cultivării in vitro,după trecerea pe substratul anorganic natural ex vitro ,plantele revin la nutriția autotrofă Sursa de carbon necesară plantelor este corelată cu regimul de iluminat aplicat plantelor. Celulelor cultivate in vitro nu sunt capabile de a asigura fotosinteza,CO2 fiind foarte redus,singura sursă este respirația plantelor. Componentele organice utilizate cel mai des sunt redate în tabelul de mai jos,nr.4

Tabelu 4.Componentele organice frecvent utilizate în mediile de cultură(după Bhojwani și Razdab-1983)

Unde:

•MS=Murashige-Skoog

•B5=Gamborg și colaboratorii

•NT=Nitsch-Takebe

Sursa de carbon organic in vitro, este asigurată de întroducerea în mediul de cultură a zaharozei și glucozei .Concentrațiile optime ale acestora sunt de 2-3 %.După unii autori concentrația poate oscila intre 1, 2-8% procent, care variază funcție de natura țesutului inoculat. Altă sursă de asigurarea a carbonului organic în mediu de cultură, sunt acizii organici și alcoolii. Dacă glucidele îndeplinesc funcția metabolică importantă în mediile de cultură, alcoolii și acizii organici au un aport redus în asigurarea conținutului de carbon organic. Acizii au valoare energetică mică, față de zaharoză. Sunt și țesuturi, la care unii acizi cum ar fi; acidul citric, succinic, fumaric etc. au rol în procesul de creștere a acestor țesuturi. Și unii alcooli ca glicerolul ar putea fi utilizat ca sursă de carbon. Alții însă pot avea o valoare energetică insuficientă pentru țesuturile cultivare in vitro, iar monoalcooli (metanol, etanol etc.) sunt inutilizabili.

Este cunoscut că plantele sunt autotrofe față de azot, pe care-l preiau din substanțele organice. Pentru culturile in vitro sursa de azot organic este asigurată prin adăugarea aminoacizilor și a ureei, care în anumite situații determină creșterea și multiplicarea țesuturilor. Introducerea lor în mediu este bine să fie urmată de testări anticipate (de exemplu la aminoacizi), deoarece la unele țesuturi aminoacizii pot inhiba creșterea lor. Doza de administrare poate fi cuprinsă înre 2-10 mg/l

Vitaminele. Rolul lor în creșterea și dezvoltarea țesuturilor in vitro a fost semnalat încă de la începutul inițierii culturilor in vitro (White 1963). Cercetările recente au dovedit prezența obligatorie a lor în mediile de cultură în concentrații variate, funcție de natura țesutului, stabilind-se și implicația lor directă în procesele de multiplicare și creștere celulară. Dacă ținem cont de complexitatea mediului de cultură, de aportul ereditar a țesutului inoculat, de condițiilor de cultură a explantelor, de ineficiența unor vitamine, sau de adausul suplimentar de vitamine și implicațiile lor, aceasta este explicabilă.

Vitamina B1, (tiamina) în mediu de cultură stimulează creșterea si multiplicarea celulelor, vitamina B6 (piridoxina) ca și tiamina este indispensabilă mediului aseptic, fiind considerată precursor a unor enzime. Acidul nicotinic alături de celelalte două vitamine B1 și B6, este nelipsit în mediile de cultură. Concentrația vitaminelor poate varia între 0,01 până la 10 mg\l, funcție de rețeta de mediu și funcție de specia cultivată. Tabelul nr. 4 redă concentrația acestor 3 vitamine la mediile de cultură a câtorva autori, de asemenea și prezenta altor compuși organici indispensabili mediului aseptic. Alte vitamine recomandate pentru unele culturi in vitro sunt: B5 (acidul pantotenic), B12, vitamina H (Biotina), acidul folic (stimulează creșterea țesuturilor tumorale), vitamina C sau acidul ascorbic (recomandată ca agent antioxidant). Prezent aproape în toate mediile de cultură inozitolul (mezo-inozitol), constituie un caz aparte. Este folosit în concentrație de 100 mg/l, in toate rețetele dar nu se știe prea bine care-i rolul lui fiziologic. De unii autori este considerată vitamina, iar de alții glucid. Urmărind tabelul nr. 4 putem afirma că mediile de cultură au înregistrat o îmbunătățire substanțială în timp privind raportul componentelor organice. Dacă în 1953 mediul Heller era lipsit de unele substanțe, în anii 1969-1971 în mediile lui Nitsch și Nitsch si Takebe, constatăm îmbunătățirea substanțială a compoziției lor cu noi substanțe.

Hormonii de creștere

Conținutul endogen in hormoni de creștere al este bine cunoscut, precum și posibilitatea sintetizării din anumite specii a acestor hormoni, încă de la începutul secolului al XX-lea. Conținutului endogen însă nu este suficientă pentru face posibilă regenerarea speciilor in vitro. Deci suplimentarea mediului de cultură cu concentrații mai mici sau mai mari de substanțe de creștere sintetizate chimic, este nu numai necesară dar și obligatorie. Procesele fiziologice din planta- creșterea- dezvoltarea și înmulțirea se află sub controlul fitohormonilor endogeni care au o acțiune mai mult sau mai puțin specifică.

Grupele de hormoni cu rol specific în procesul de regenerare in vitro sunt: auxinele, citochininele, giberelinele, acidul abscisic și etilena. Fiecare dintre substanțele de creștere amintite are implicație exactă în anumite procese de creștere si dezvoltare a plantelor atât în condiții normale cât și în condiții de cultura in vitro. Astfel, auxinele sunt puternic implicate în procesul rizogenezei in ambele condiții de cultură, iar citochininele ele în cel al organogenezei, prin stimularea diferențierii mugurilor si a tulpinilor. Modul de acțiune a lor în mare este cunoscut, dar nu se cunosc procesele moleculare prin care ei pot interveni în obținerea reacțiilor specifice. Se cunosc doar căile metabolice de sinteză și de blocare a activității hormonilor prin descompunere enzimatică, dar și acestea cu aproximație. Fiecare grupă este exact implicată în anumite procese de creștere și dezvoltare, atât în condiții de cultură normală cât și în condiții de cultura in vitro. Alături de fitohormoni de natură endogenă se cunosc o mulțime substanțe sintetizate chimic cu acțiune fiziologică asemănătoare cu a acestora. Deci au o structură chimică variată, având comun efectul asupra proceselor de creștere și dezvoltare. Hormonii endogeni au o durată limitată de acțiune asupra celulelor, datorata faptului că ei sunt metabolizați endocelular. Cei sintetizați chimic sunt metabolizați mai lent dar au durată de acțiune prelungită și efect fiziologic mai puternic.

Prima grupă de fitohormoni sintetizată chimic au fost puternic auxinele. Acesta intervin într-o mulțime de procese fiziologice. Dintre acestea amintim: modificarea permeabilității membranei celulare pentru apă și pentru anumiți ionii, stimulează diviziunea celulară, sunt implicate în fenomenele de dominantă aplicată, au acțiune rizogenă, fiind astfel folosite în stimularea proceselor de înrădăcinare, acțiune lor asupra plasticității pereților celulari produce alungirea celulelor. Concentrația auxinelor si mai ales natura lor, induce formarea sistemului radicular. Dar sunt cazuri când procesul rizogenezei are loc si pe medii lipsite de hormoni, dar cu adaos de cărbune vegetal, acest lucru este posibil în primul rând datorită aportului endogen din țesut, iar adaosul suplimentar poate inhiba formarea rădăcinilor, rezerva endogenă fiind suficientă. Fenomenul formării sistemului radicular l-am întâlnit frecvent în experimentele noastre, dar este dependent de specie. Influențează procesul metabolic, prin sinteza proteică (sinteza ARN ribozomal). Auxinele având efect retardant în căderea frunzelor și fructelor arborilor fructiferi etc. Aceste efecte sunt deci determinate de:

natura auxinelor și concentrația lor;

de anumitele variante de auxine sau de combinațiile dintre auxine cu alți reglatori de creștere.

Dintre principalele auxine folosite atât în cultura clasică cât și in vitro amintim:

acidul indolilacetic (AIA);

acidul indolibutiric (AIB);

acidul alfa naftilacetic (ANA):

acidul 2,4 diclorfenoxiacetic (2,4D) etc.

Concentrațiile lor în mediu de cultură variază funcție de specie și de natura inoculului și de faza fiziologică în care se găsește planta mamă. În general concentrația acestor substanțe este cuprinsa între 0,001-10-15 mg/l.

Dacă auxinele sunt puternic implicate în procesele de rizogeneză în ambele condiții de cultură, citochininele, al doilea grup de substanțe de creștere sunt implicate doar în organogeneză, stimulând formarea mugurilor și a tulpinilor. Cele mai cunoscute efecte fiziologice ale citochininelor sunt:

inducerea diviziunii celulare, care este asigurată și de prezenta auxinelor care favorizează duplicarea ADN-ului, iar citochininele separarea cromozomilor;

stimularea sintezei proteic, exercitând efect invers auxinelor, anihilând dominanța aplicată a mugurelui terminal.

Deci stimulează formarea mugurilor și inhibă rizogeneza. In vitro ele mențin viabilitatea celulelor determinând diferențierea celulelor și stimulând multiplicarea acestora. Deci procesele de morfogeneză sunt stimulate spre formare de muguri și tulpini, deci spre caulogeneză. Efectul hormonilor în caulogeneză este diferit, funcție de natura și concentrația lui și mai ales de specia luată în studiu. Un amestec echilibrat de auxine și citochinine, a dus la regenerarea și multiplicarea in vitro, succes datorat în mare parte și naturii substratului aseptic din mediul de cultură. Esențială este așa numită balanță hormonală cu efecte în procesele fiziologice, aceasta înseamnă o combinație adecvată aceasta dintre auxine și citochinine, atât sub aspectul naturii lor, cât și sub aspectul concentrației. În general organogeneza completă se realizează, pe medii cu un anumit conținut de auxine și citochinine, fiecare dintre acestea având rol bine definit. Deci, citochininele în caulogeneză iar auxinele în formarea sistemului radicular. Stimularea procesului de organogeneză se poate realiza prin modificarea celor doi hormoni (auxinele și citochininele), în mediul de cultură. Pentru culturile de țesuturi mai frecvent sunt folosite următoarele citochinine: chinetina (K), izopentilladenina (2-iP) și zeatina (Z). Concentrațiile folosite în mediile de creștere sunt cuprinse între 0,1-20 mg/l. Dozele echilibrate de auxine și citochinine au dovedit eficiența maximă la culturile in vitro, citochinina având rol în catulogeneză iar auxina în rizogeneză.

Dintre regulatorii de creștere naturali, giberelinele au fost descoperite în număr mare de cca. 50 de gibereline. Dintre acestea acidul giberelic (GA3) sau giberelina este cea este activă și mai frecvent utilizată. Acțiunea lor fiziologică este cunoscută prin aceea că produc alungirea internodurilor înlăturând fenomenul de nanism, stimulează germinația semințelor, în scoaterea din latență a mugurilor sau a altor organe de rezervă; reglează nivelul endogen de auxine etc. In vitro giberelina se folosește în mică măsură dar în anumite cazuri, adaosul de GA3, face să se alungească internodul plantulelor crescute in vitro, la fel și meristemul apical, astfel multiplicarea speciilor. Din speciile de neoplantule formate in vitro poate fi mai ușor realizată, prin secționarea în porțiunile dorite (minibutași), multiplicându-se cu o rata sporită.

Etilena, este recent cunoscută ca fitohormon, fiind o hidrocarbură nesaturată, un gaz. A fost greu de identificat și de măsurat în plantă, stabilindu-se ca numai fructele în curs de coacere emană etilenă. Efectele fiziologice sunt incomplete cunoscute, dar amintim implicațiile ei în inducerea senescenței țesutului, implicare în transportul auxinelor, exercită control asupra creșterii permeabilității membranelor, și altele. În culturile de țesuturi in vitro este puțin folosită, existând dificultăți în administrarea ei în cantități controlabile, la toate acestea adăugându-se faptul că, mecanismul de acțiune al etilenei este încă necunoscut.

Dintre inhibitori, acidul abscisic este un fitohormon implicat în procesele de latență. Acesta în culturile de țesuturi in vitro este folosit în mică măsură, doar în inducerea intrării embrionilor în repaus și în procese de conservare in vitro.

Alte componenete

Extractele naturale. Încă de la primele experiențe de culturi de țesuturi in vitro, în medii s-au introdus o mulțime de extracte cum ar fi:

extract de drojdie de bere,

hidrolizat de cazeină,

suc de tomate,

fructe (citrice),

lapte din nucă de cocos,

extract de endosperm imatur de porumb,

orz etc.

Aceste extracte se folosesc în concentrații scăzute, în mediile de cultură dar cu rezultate remarcabile asupra organogenezei in vitro.

În Japonia s-au experimentat extractele naturale în regenerarea și multiplicarea in vito a meristemului de Cymbidium de către Sagawa K și Kunisaki J. T., (1982), care au uitilizat un mediu numai cu extracte naturale. De asemenea la câteva specii de Anthurium, Kunisaki J.T. -1998 obține regenerarea și multiplicarea in vitro pe mediu cu extract din lapte de cocos. Extractul de malț s-a utilizat în regenerarea de plante din calus la unele specii din familia Liliaceae, Iridaceae Amaryllidaceae (Meyer, 1976). La Institutul de Cercetări Biologice din Cluj-Napoca, Butiuc A.L., Zăpîrțan M, Deliu C. (1996) experimentează extractul de germeni de porumb la speciile Chrysanthenum și Leontopodium cu rezultate foarte bune în regenerarea și multiplicarea in vitro a celor doua specii. În general, compoziția acestor extracte este complexă si din păcate încă necunoscută. Efectul favorabil în organogeneza in vitro, este posibil să se datoreze hormonilor și vitaminelor naturale precum și altor compuși ușor asimilabili și foarte activi, existenți în aceste extracte.

Cele mai multe culturi in vitro se realizează pe medii solide. Agarul, cel mai frecvent utilizat în gelificarea mediilor de cultură, este o polizaharidă extrasă din algele roșii. Forma sub care se găsește este pulbere, fibre, solzi. El se dizolvă prin fierbere. Agarul cu denumirea de Difco Nobel Bacto-Agar, este cea mai pură și de cea mai înaltă calitate. Agarul se folosește adăugat în medii în concentrații de 6-10 g/l, funcție de natura inoculului

Cărbunele de lemn. Efectul favorabil al cărbunelui vegetal în unele procese de regenerare și organogeneză in vitro, a fost evidențiat de Johansson L. (1983) în inducerea androgenezei, apoi de Zaghmout O.M. și Torello W.A. (1988) în organogeneză și de către Buchheim J.A. si colab. (1989) în embriogeneză. Bizarri M. și colab. (1995), se preocupă de rolul cărbunelui vegetal în inducerea tuberizării in vitro la cartof. Nu se cunosc căile metabolice care sunt influențate, pentru a se obține aceste rezultate, dar se presupune că particulele de cărbune vegetal absoarbe la suprafața lor unii metaboliți celulari sau inhibitori ai creșterii, astfel anulând efectul inhibitor al acestora favorizăm creșterea. Johansson L., a demonstrat că anumiți compuși fenolici secretați în mediu de cultură de anumite specii (Papaver, Anemone, Clematis), pot fi absorbiți de particulele de cărbune vegetal. Deci are rol de-a absorbii unii compuși fenolici sau taninuri care duc la necrozarea țesutului vegetal cultivat in vitro, dar prezența lui în mediu de cultură are uneori efecte nedorite. Cărbunele absoarbe auxinele și citochininele aflate în mediu. După Margara J. (1982) prezența lui în mediu favorizează creșterea țesuturilor din apex și antere. Rolul esențial a cărbunelui activ în mediul de cultură este de-a stimula alungirea mugurilor formați in vitro. Din acest considerent se folosește în concentrații de 2-3% pentru stimularea creșterii în a explantelor și pentru germinarea semințelor. Datorită efectului de legare a hormonilor, nu se adaugă în general în mediu unde sunt prezente auxinele sau citochininele. Se adaugă în mediu prealabil, autoclavării, pentru a nu modifica pH-ul mediului, care trebuie reglat apoi corespunzător speciei experimentate.

Noi am utilizat aproape la toate speciile spontane experimentate, mediu de cultură cu conținut de cărbune vegetal, fie singur, fie combinat cu fitohormoni (acest lucru mai rar), pentru a dovedi dacă particulele de cărbune vegetal absoarbe sau nu fitohormonii din mediu.

c) Condiții de cultură

Pentru prepararea mediilor de cultură trebuie să ținem cont de indicațiile din literatura de specialitate. În general se pornește cu pregătirea unui mediu, așa numit mediu de bază (MB). Acesta conține macroelemente, microelemente, vitamine, mezo-inozitol și zaharoză, la acestea se adaugă balanța hormonală stabilită de autorul experimentului, în funcție de scopul urmărit și de specia luată în studiu. Valoarea pH-ului trebuie să fie ce-a recomandată de specialiști. Reglarea valorii pH-ului și adaosului de zahăr și agar în mediu, se face deci prealabil autoclavării. Pentru reglare, se adaugă soluții normale sau de 0, 1N de acid (HCl) sau de baze (NaOH sau KOH), prin picurare.

Mediile preparate se sterilizează prin autoclavare. Există hormoni, cum sunt giberelinele, care se distrug în urma autoclavării, din acest motiv se introduc în mediu cu ajutorul unui filtru special, după autoclavarea mediului. Mediile se sterilizează în aceeași zi în care au fost preparate, este indicat a fi sterilizate imediat după preparare, acest lucru este absolut necesar pentru că mediul fermentează și se degradează repede, schimbându-și calitatea. Folosirea mediilor în sensul inoculării explantului, trebuie făcută în cca. o săptămână, tot pentru a nu se degrada. Se recomandă ca mediile să fie păstrate dacă este posibil la frigider (sau într-un loc rece), și la întuneric.

După inocularea explantelor pe mediile de cultură, flacoanele trebuiesc menținute în camere de creștere, factorii de mediu, lumina, temperatura și umiditate sunt programați la valori optime necesare speciei. Inocularea materialului vegetal în funcție de natura lui și de faza de dezvoltare, se face la lumina sau la întuneric, ori la regim de lumină continuă sau alternativă. În general, durata de iluminare în camera de cultură este de 16 ore lumină/ 8 ore întuneric, aceasta fiind fotoperioada cel mai frecvent utilizată. Intensitatea luminii variază în funcție de scopul urmărit și de specia experimentată. Se poate utiliza de regula lumina fluorescentă difuză, cu o intensitate de 2-10 klux, în funcție de etapa de dezvoltare a culturii crescute in vitro. Se mai folosește lumina continuă sau amestecuri de lumină fluorescentă cu roșie necesară unor tipuri de explante pentru a induce organogeneza acestora.

Temperatura recomandată în camera de creștere este de 250C pana la 270C. Sunt specii care necesită perioade de incubare la un anume regim de temperatură, în acest caz se folosesc dulapuri climatizate capabile să asigure fotoperioada dorită, datorită condițiilor de regim programat, așa cum este și cazul camerelor de climatizare.

Umiditate din camera de creștere trebuie să fie altfel reglată încât, să nu producă deshidratarea mediilor. În general este de 50%, dar nu mai mare pentru a nu favoriza apariția mucegaiurilor. La mediile de cultură lichide trebuie urmărit schimbul de gaze care se poate face prin difuziune sau prin agitare, care se realizează prin mișcare rotativă, orizontală sau verticală.

Inițierea și incubarea culturilor, se realizează în perfectă sterilitate. Pentru început se va steriliza materialul prelevat de la planta mamă, iar apoi urmează manipularea acestui material, în așa fel încât inocularea lui să excludă orice recontaminare ulterior.

Sterilizarea țesutului vegetal se face cu ajutorul unor substanțe cum ar fi hipocloritul de calciu sau de sodiu. Aceste substanțe se folosesc într-o concentrație de 3-10% în funcție natura țesutului. Pentru țesutului matur (nod, internod etc.) și pentru țesutul acoperit cu ceară (cum este cazul coniferelor) sau pentru semințe, se folosesc concentrațiile cele mai ridicate. În cazul țesuturilor tinere și firave (embrioni, meristeme, inflorescențe etc.), concentrația este mult mai scăzută. Concentrația soluției de hipoclorit este corelată cu durata de tratament care poate fi 10-30 minute. Durata de tratament este de asemenea dependentă de natura țesutului. La unele țesuturi, operațiunea de sterilizare este precedată de clătiri cu alcool 70% (timp de 30 secunde până la 1 minut). După înlăturarea substanței sterilizante se fac câteva spălări ale materialului vegetal sau ale semințelor cu apă distilată sterilă.

Incubarea materialului vegetal se face sub hotă specială, unde aerul este filtrat și în acest fel sterilizat. Evoluția inoculilor vegetali cultivați pe medii aseptice depinde nu numai de compoziția mediului de cultură, ci și de regimul de lumină și temperatură pe care trebuie să-l asigurăm în camerele de creștere. Camerele de creștere unde sunt incubate culturile au un regim fotoperiodic reglabil. Regimul termic cel mai adesea utilizat este, cuprins între 25-270C, iar umiditatea atmosferică între 90-100%.