Iulia Vladoiu Licenta 2 [618939]

UNIVERSITATEA DIN PITEȘTI
FACULTATEA DE ȘTIINȚE , EDU CAȚIE
FIZIC Ă ȘI INFORMATIC Ă

2 Cuprins
INTRODUCERE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ..3
Capitolul I. CONSIDERAȚII TEORETICE ………………………….. ………………………….. ………………………. 6
I.1. GENUL BORRELIA ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………… 6
I.1.1. Habitat vectori – Particularități epidemiologice ale vectorilor ………………………….. …………… 7
I.1.2. Taxonomie și nomenclatură ………………………….. ………………………….. ………………………….. ….9
I.1.3. Caractere morfologice și structură ………………………….. ………………………….. …………………… 11
I.1.4. Caractere antigenenice și de patogenitate ………………………….. ………………………….. …………. 14
I.2. BORRELIOZA ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………. 18
I.2.1. Istoricul borreliozei ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………… 18
I.2.2. Epidemiologia borreliozei ………………………….. ………………………….. ………………………….. ….. 21
I.2.3. Manifestări clinice ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………. 26
I.2.3.1. Manifestări cutanate ………………………….. ………………………….. ………………………….. …….26
I.2.3.2. Manifestări musculo -scheletice ………………………….. ………………………….. …………………. 27
I.2.3.3. Manifestări neurologice ………………………….. ………………………….. ………………………….. 27
I.2.3.4. Manifestări cardiace ………………………….. ………………………….. ………………………….. …….28
I.2.3.5. Alte sisteme ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………….. 28
I.2.4. Prognoză și tratament. Diagnostic de laborator ………………………….. ………………………….. …. 28
Capitolul II. CERCETARE PERSONALĂ ………………………….. ………………………….. ………………………. 36
II.1. Scopul și obiectivele cercetării ………………………….. ………………………….. ………………………….. … 36
II.2. Materiale și metode ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………….. 37
II.2.1. Loturi de pacienți ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………….. 37
II.2.2. Metode folosite ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………….. 37
II.2.2.1. Metoda Western -Blot ………………………….. ………………………….. ………………………….. …37
II.2.2.1. Reacția de imunoflorescență ………………………….. ………………………….. ……………………. 44
II.3. Rezultate și discuții ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………… 51
II.3.1. Incidența infecțiilor cu borrelia în lotul de pacienți studiat ………………………….. …………….. 51
II.3.2. Incidența infecțiilor cu borrelia în funcție de regiunile din care provin pacienții …………… 52
II.3.3. Incidența infecțiilor cu borrelia în funcție de sexul pacienților ………………………….. ……….. 53
II.3.4. Incidența infecțiilor cu borrelia în funcție de vârsta pacienților ………………………….. ………. 54
II.3.5. Incidența infecțiilor cu Borrelia afzelii , garinii și burgdorferi determinată cu testul
recombinat RN -AT ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………. 55
CONCLUZII ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………. 57
Bibliografie ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………… 59

3 INTRODUCERE
În Uniunea Europeană (UE), prin programul European Concerted Action
on Lyme Borreliosis (EUCALB), s -a luat o opțiune importantă pentru
diagn osticarea si tratamentul Boreliozei – Lyme. Acest program finanțat de UE
își propune sa finanțeze și să promoveze programe de cercetare și diagnosticare a
bolii Lyme bazate pe dovezile clinice rezultate din activitatea practică de
laborator, cât și pe baza colaborării multidisciplinare extrem de apreciate în cadrul
programelor de cercetare.
Începând cu anul 2006 ghidul director al diagnosticării, terapiei și
tratamentului cu antibiotice pentru Borelioză – Boala Lyme este actualizat astfel
încât să existe o corelație între tratamentele utilizate de către Societatea de Boli
infecțioase din America de Nord și cele din Europa, accentul punându -se, cu
predilecție, pe pacienții care prezintă simptome ce persistă și după tratamentul
standard. A existat o activitat e importată din partea grupurilor de sprijin pentru
pacienți și a unor medici pentru promovarea curelor prelungite sau multiple de
antibiotice utilizate în cazul pacienților ce prezintă simptome persistente ale bolii
Lyme, atât în SUA cât și în Europa. În plus, nu au existat critici cu privire la
utilizarea liniilor directoare stabilite în SUA si utilizate în cazul pacienților din
Europa . Acest fapt a determinat o evaluare a recomandărilor din Europa
comparativ cu cele din SUA.
Boala Lyme are o complexitat e ce depășește caracteristicile enunțate de
Munderloh și Kurtti[1], având mai mult de 1500 de secvențe de gene. Dintre
acestea, Borrelia burgdorferi conține cel puțin 132 de gene funcționale . Prin
comparație, Treponema pallidum , agentul spirochetal al sifi lisului, conține doar
22 de gene funcționale. Totodată, Borrelia conține 21 de plasmide, 9 circulare și
12 liniare, adică cel mai mare număr de plasmide găsite în orice baterie cunoscută.
Numărul mare de gene plasmide se presupune că oferă o reacție rapid ă care
permite spirochetei să circule eficient între căpușe și mamifere, iar schimbul de

4 gene și de plasmide între tulpinile de Borrelia determină o creștere a
patogenității[2].
Pentru a penetra bariera hemato -encefalică și pentru a accesa sistemul
nervos central, Borrelia burgdorferi se folosește de sistemul fibrinoltic al
mamiferelor gazdă și de un mecanism complex de acțiune bazat pe adezine și
hemolizne care contribuie la acce ntuarea proprietăților i nvazive ale organismului
străin[3]. Spirochetele intră în celulele fibroblaste, sinoviale ori endoteliale, sau în
celulele macrofage, capătă rezistență la tratament în aceste celule, fie datorită
celulelor „camuflate” produse de Borrelia burgdorferi , fie sunt absorbite de celulă
și spirocheta își modifică morfologia într -o forma defensivă în care acestea nu se
înmulțesc, formă cunoscuta și sub denumirea de sferoplast. Această strategie de
camuflare a Borrelia burgdorferi în fața sis temului imunitar este similară cu cea
utilizată de agenții microbieni ce provoacă tuberculoza, de exemplu. De
asemenea, organismele pot exista și sub formă de granuloame sau chisturi ce sunt
resuscitate de autostimularea celulei producătoare a citochinelor (acțiunea
autocrină a acestora) după ce au fost în stare latentă o perioadă mare de timp[4].
Studiile au indicat că Borrelia burgdorferi utilizează gena numită luxS pentru a
regla înmulțirea, genă care este utilizată și de alte bacterii în același scop. Este
prima dată când acest proces a fost identificat la o spirochetă[5].
Prin urmare, combinația genetică atât de complexă, localizarea
intracelulară, evitarea sistemului imunitar și autoreglarea face din Borrelia
burgdorferi un agent infecțios formidabil. Cu toate aceste informații complexe
despre Borrelia burgdorferi indicate până în prezent, există în mediul clinic o
apreciere des întâln ită că boala Lyme se poate trata și vindeca în 2 -4 săptămâni,
utilizând antibiotice. Această percepție poate fi adevărată în cazul infecțiilor acute
tratate prompt. Însă, în cazul afecțiunilor cronice care permit mecanismelor
fiziopatologice complexe ale Borrelia burgdorferi să acționeze și care conduc la
o invazie perseverentă a țesuturilor , tratamentul și eradicarea bolii este extrem de
dificilă[6].

5 Pentru a îmbunătăți abordarea clinică a bolii Lyme de către medicii din
România, trebuie să existe o înțel egere mai bună a complexității fiziopatologice a
Borrelia burgdorferi . Astfel, trebuie să fie înțeleasă importanța existenței unui
protocol de diagnostic și de analiză în laboratoare specifice, utilizând metodele
Western Blot și Imunofluorescența, metode utilizate atat în fazele incipiente cat
și cele cronice ale ale bolii, urmate de un tratament adecvat.

6 CONSIDERAȚII TEORETICE

I.1. GENUL BORRELIA
Borrelia burgdorferi aparține genului Borrelia, familia Spirochetaceae.
Această bacterie a fost izolată atât de la pacienți (sânge și țesuturi), de la căpușe
vector, cât și de la o multitudine de animale și păsări ce constituie o sursă de
infecție. Alte borrelii sunt incrimin ate în etiologia altor îmbolnăviri (febre
recurente)[7].
Studiile epidemiologice au arătat că răspândirea borreliil or în lume s-a
realizat de pe continentul nord -american , în special prin migrația păsărilor și altor
animale parazitate de căpușe[8]. Totod ată, s -a demonstrat existența unor diferențe
de tropism tisular între diferite genospecii de Borrelia burgdorferi . Astfel,
Borrelia burgdorferi determină frecvent artropatii, Borrelia garinii determină
frecvent neuropatii, iar Borrelia afzelii determină f recvent acrodermatită cronică
atrofiantă[8].
Heterogenitatea Borrelia burgdorferi din regiuni diferite ale lumii poate
explica anumite diferențe observate în prezentarea clinică a Borreliozei Lyme în
SUA și Europa.
Ordinul Spirochetales are două familii:
1. Spirochetaceae
2. Leptospiraceae
și numai 6 genuri:
1. Serpulina
2. Spirochaeta
3. Cristispira CAPITOLUL I.

7 4. Treponema
5. Borrelia
6. Leptospira
Specii patogene pentru om și animale se cuprind în g enurile Borrelia,
Leptospira și Treponema[9].
I.1.1. Habitat vectori – Particularități epidemiologice ale vectorilor
Borrelia burgdorferi este un endoparazit care nu poate trăi decât în
interiorul unui organism. Borrelia burgdorferi este transmisă de căpușele din
genul Ixodes ricinus , figura 1. Aceste căpușe sunt artropode parazite temporar,
parazitism datorat modului de hrănire realizat pe seama animalelor[12].
În partea de NV și centrală a SUA, vectorul de transmitere al Borrelia
burgdorferi este Ixodes dammini , iar în partea de V a SUA, vectorul de
transmitere este Ixodes pacificus[7].
În Europa, Ixodes ricinus este principalul vector de transmitere a bolii. Doar
căpușele Ixodes sunt implicate în transmiterea bolii la oameni[4]. Aceste căpușele
se hrănesc o sigură dată în fiecare dintre cele 3 etape ale ciclului lor de viață de 2
ani de zile. În SUA, nimfele și larvele de Ixodes dammini se hrănesc din șoareci,
Figura 1 . Căpușe aparținând genului Ixodes ricinus în diferite stadii de viață. ( URL 1)
(

8 iar căpușele adulte se hrănesc din mamiferele mari, în special căprio arele și urși
(de aceea ele se mai numesc și căpușe de căprioară sau căpușe de urs). La șoareci
spirochetele nu determină niciun fel de condiție patologică, aceștia prezentând
spirochetemie pe parcursul verii. Cum larvele de căpușă se hrănesc din șoarecii
care sunt infectați, ele sunt infectate la rândul. Aceste spirochetele rămân în
tractul digestiv al căpușei până vara care urmează, atunci când, ajunsă la stadiul
de nimfă se atașează pe o altă gazde. Din acest moment, se produce o migrare a
spirochetelor către glandele salivare ale căpușei, fiind inoculate gazdei în
momentul hrănirii din aceasta. Prin urmare, căpușele aflate în stadiul de nimfă
sunt responsabile de majoritatea transmiterilor. În urma studiilor realizate s -a
observat că transmiterea experi mentală la rozătoare implică o perioadă de minim
24 de ore de la momentul de atașării căpușei până la transmiterea eficientă a
spirochetelor[13].
În acest ciclu de viață, persistența spirochetelor este dependentă major de
gazdă ( de mamifere mici), în tim p ce căprioarele par a avea un rol important doar
în supraviețuirea formei adulte și la menținerea ciclului de viață al căpușelor[7].
Din punct de vedere al patologiei umane doar 3 specii de Borrelia – burgdoferi
sensu stricto , garinii și afzelli sunt imp ortante. Celelalte specii întâlnite frecvent,
Borrelia valaisiana , Borrelia lusitanea și Borrelia japonica nu par a avea o
importanță clinică la fel de accentuată. Căpușele din genul Argas și Boophilus
transmit borelioza aviară și bovină. Speciile de Borre lia sunt de asemenea
asociate cu febra recurentă la oameni. Astfel, căpușele moi aparținând genului
Ornithodorus transmit Borrelia hermsii , iar Borrelia recurrentis este transmisă
de către păduchi[9].
Speciile de căpușe europene Ixodes pot adăposti simul tan chiar și patru
specii diferite de Borrelia . În general, cea mai prezentă formă este Borrelia afzelii ,
în Marea Britanie și Irlanda cea mai întâlnită este Borrelia valaisiana . În unele
zone din Europa și Asia apare și Borrelia garinii . Trebuie menționat că, chiar și
atunci când un anumit genotip de Borrelia predomină, pot apărea infecții cu alte

9 tulpini de patogenitate variată[5].
Căpușele din genul Ixodes ricinus transmit Borrelia burgdorferi . Vectorii
primari sunt Ixodes scapularis (dammini) , (N-V SUA), Ixodes pacificus (V SUA)
și Ixodes ricinus (Europa)[7]. Este puțin probabil ca alte artrop ode să aibă un rol
în transmiterea spirochetei la gazdele animale, iar transmiterea non -vectorială nu
a fost pe deplin lămurită, la fel ca și cea a transmiterii transplacentare[4].
I.1.2. Taxonomie și nomenclatură
Genul Borrelia aparține familiei Spirochaetaceae , tabelul 1., și are
aproximativ 20 de specii. Acestea sunt asociate cu febra recurentă și sunt
transmise de căpușe moi aparținând speciilor Ornithodoros sau Argas , sau de
păduchi ce transmit Borrelia recurrentis . Începând din anii 1980 a ex istat un mare
interes față de Borrelia burgdorferi , agentul cauzal primar al Boreliozei Lyme,
agent patogen care este transmis prin căpușe dure aparținând genului Ixodes[10]. Tabel 1. Spirochaetaceae și bolile produse de acestea[5]
Gen Specie (boala produsă)
Treponema Treponema pallidum (Sifilis/Bejel, Yaws)
Treponema carateum (Pinta)
Treponema denticola (afecțiuni periodontale)
Borrelia Borrelia burgdorferi/Borrelia afzelii / Borrelia garinii /
Borrelia japonica (boala Lyme, Erythema chronicum migrans,
Neuroborrelioza)
Borrelia recurrentis (febra recurenta transmisibila prin
păduchi).
Borrelia hermsii/Borrelia duttoni/Borrelia parkeri (febra
recurentă transmisibilă prin căpușe)
Leptospira Leptospira interrogans (Leptospiroza)
Spirillum Spirillum minus (febra mușcăturii de șobolan/Sodoku)

10 Atunci când a fost descrisă inițial, Borrelia Burdorferi a fost asociată ca
fiind singura cauza a bolii Lyme. Însă, în ultimii ani, datorită hibridizării reciproce
a unui număr foarte mare de tulpini, s -a demonstrat ca diversitatea genetică a
acestei specii este mai mare decât se credea. De aceea, astăzi se men ționează ca
sursă a bolii Borrelia burgdorferi sensu lato (sl) , care este formată din mai multe
genospecii[10].
Borrelia burgdorferi sensu lato se po ate împărți în 17 genospecii: Borrelia
burgdorferi sensu stricto (ss) , care este prezenta în Europa, SUA, Rusia (rar) și
aparent absentă în Asia; Borrelia afzelli , Borrelia bavarensis, Borrelia garinii,
Borrelia valaisiana, Borrelia spielmanii, Borrelia lusitaniae și Borrelia bissettii
în Eurasia ; Borrelia japonica, Borrelia. tanukii și Borrelia turdae limita t la
Japonia ; Borrelia sinica în China, și Borrelia andersonii, Borrelia californiensi
și Borrelia carolinensis în SUA. Această clasificare este prezentata în tabelul 2.
Prima tulpină izolată de Borrelia burgdorferi a fost denumită B31 și are
două proteine de suprafață externă dominante având greutățile moleculare 31 𝑘Da
și 34 𝑘Da (1Da = 1,66053886 ×10−27kg). Aceste proteine de suprafață
externă se mai numesc și proteine A și B sau OspA și OspB. Proteinele de
supra față exterioară a Borrelia burgdorferi ajută, cel mai probabil, la adaptarea
spirochetei pentru a supraviețui în medii semnificativ diferite, de exemplu
căpușele și mamiferele cu sânge rece[11].
Au mai fost identificate și alte antigene imunodominante. D e aceea, exista
o dependență între testarea serologică și modul de detectare a legării anticorpilor
specifici. În continuare se fac eforturi pentru a se identifica și alte componente
antigenice ale Borrelia burgdorferi[7].

11 Tabel 2. Borrelia burgdorferi sensu lato genospecii și răspândirea globală[5]
Genospecii Distribuție Genospecii Distribuție
Borrelia afzelii * Europa Borrelia
kurtenbachii SUA
Borrelia americana SUA Borrelia
lusitaniae Europa
Borrelia andersonii SUA Borrelia japonica Japonia
Borrelia bavariensis * Europa Borrelia sinica China
Borrelia bissettii Europa, SUA Borrelia
spielmanii * Europa
Borrelia burgdorferi * Europa, SUA Borrelia tanukii Japonia
Borrelia californiensis SUA Borrelia turdi Japonia
Borrelia carolinensis SUA Borrelia.
valaisiana Europa, Asia
Borrelia finlandensis Europa Borrelia yangzte Asia
Borrelia garinii * Europa, Asia * recunoscut patogene
I.1.3. Caractere morfologice și structură
La baz ă Borrelia are un cilindru protoplasmic alcătuit dintr -un strat de
peptidoglicani, membrană citoplasmatică, prezentând flageli periplasmici între
cilindrul protoplasmaic și cilindrul extern. Flagelii periplasmici sunt atașați
subterminal la fiecare extremitate a cilindr ului protoplasmic și se extind către
extremitatea opusă a celulei , figura 2 a, b și c.
Aceasta are o lungime de 10 -30 µm, având 3 -10 spire laxe, cu helixul de
stânga (se rotește antiorar). Pasul spiralei este de 2 -4 µm, iar celulele se deplasează
prin miș cări de rotație și torsiune. Aceste bacterii sunt Gram -negative,
chemoheterotrofe, mobile, spiralate, fine[14]. Mobilitatea stil „tirbușon” este
conferită de endoflageli, fiind o adaptare la mișcarea în medii vâscoase (de
exemplu, mucoasa bucală, gastroi ntestinală, sedimente, etc.). În medii solide,
endoflageli determină mișcări de flexare și îndoire a celulei bacteriene ce au ca

12
rezultat o deplasare prin alunecare. În plus, sunt capabile de staționare în mediu
lichid, deși mediul curge[14]. Acestea sunt evidențiate foarte bine cu ajutorul
microscopului în câmp întunecat[11].
Borrelia se poate cultiva pe medii fluide cu sânge, ser sau fragmente de
țesut și în oul embrionat. După trecerea repetată in vitro, aceasta își pierde repede
virulența si este foarte sensibilă la uscăciune, fiind complet dependente de
gazdă[14]. În vitro Borreliile se tapetează cu un strat mucos amorf, alcătuit din
componente ale gazdei. Proteinele majore ale membranei externe asigură
Nucleoid
Ribosomi
Filamente
axiale
Teacă
periplasmică
Protoplast
Perete
celular
Teacă
exterioară
Figura 2 . a. Secțiune transversală printr -o spirochetă. b. Structurile superficiale ale
unei bacterii spiralate: FA – filamente axiale, P – protoplast, TE – teaca externă, PFA
– punctul de inserție al filamentelor axiale. c. Borrelia burgdorferi Microscopie
electron ică, mărire 7 -10.000X (URL 2)
a
FA
p
PFA
TE
b
c

13 variabilitatea antigenică a agentului patogen,
dar aceste proteine de suprafață diferă în
funcție de me diul în care se găsește bacteria.
Multipli carea in vitro este lentă, având
o durată de 8 – 15 ore, iar pasajele repetate
pe mediul artificial modifică structura
antigenică și celulele își pierd
infecțiozitatea[14]. Fiecare multiplicare
induce populații distincte antigenic,
deoarece acestea induc sinteza anticorpilor
specifici neutralizanți. Întotdeauna rămâne o
populație mică de celule bacteriene viabile,
rezistente la acțiunea anticorpilor, deoarece
sunt variante antigenice distincte de
populația parentală[4]. Aceasta este cauza
inexactității te stelor serologice, care pot fi
atât fals -pozitive (prin interfețe) cât și fals -negative.
Antigenul major al celulelor de Borrelia este o proteină majoră a
membranei cu caracter variabil (VMP), codificată de o familie de gene.
Comutarea expresiei genelor acestei familii permite apariția, în timpul infecției, a
unei mici populații de celule, care prin multiplicare va reface noua variantă
antigenică – serotipică de Borrelia , rezistentă la efectul anticorpilor[4]. Proteina
majoră a membranei are un rol important în localizarea tisulară a bacteriilor, de
exemplu , Borrelia hermsii având potențialul de a genera 40 de serotipuri diferite
de VMP.
Proteina majoră de virulență prezintă variante distribuite î n clase de
molecule mari ( 37−40 𝑘Da) și mici ( 19 –22 𝑘Da)[4].
Figura 3 . Imagine la Microscopul
electronic de transmisie a B.
burgdorferi care arată flageli
periplasmici eliberați din
membrana exterioară secundară în
urmă expunerii germenului la acid
fosfotungstic. (URL3)

14 Borrelia burgdorferi este un germen gram -negativ cu dimensiuni cuprinse
între 4 − 30 µ𝑚, cu diametrul de 0,3 µ𝑚. Flagelii de la extremități îi asigură
mobilitatea, iar flageli pliați sub membrana exter nă generează contorsiunile din
timpul deplasării[8]. Analiza Borrelia burgdorferi la microscopul electronic a
relevat că aceasta este alcătuită dintr -o membrană externă trilaminară care
înconjoară spațiul periplasmatic în care se găsesc 7 -11 flageli și cilindrul
periplasmatic, figura 3. In vi tro, celula este tapetată de un strat mucos amorf,
acesta fiind alcătuit din componente ale gazdei. Membrana externă care are o
structură trilaminară este alcătuită din proteine, lipide și glucide. In vitro în
prezen ța anticorpilor specifici și a complementului, membrana externă formează
vezicule[10].
Flagelii sunt așezați paralel cu axul lung, au inserție subterminală, bipolară
la cilindrul protoplasmatic al Borrelia . burgdorferi și se suprapun în zona de
mijloc a celulei. Flagelina este singurul tip de moleculă proteică care alcătuiește
filamentele flagelare de B. burgdorferi . În toate stadiile infecției anticorpii
antiflagelină au titru crescut, dar nu sunt protectori[14].
I.1.4. Caractere antigenenice și de patogenitate
În cazurile clinice ale Bolii Lyme sunt implicate Borrelia burgdorferi ss ,
Borrelia garinii , Borrelia bavariensis (o rudă apropiată a Borrelia garinii ),
Borrelia afzelii și Borrelia spielmanii (o rudă apropiată a lui Borrelia afzelii ).
Rezultatele oferite de PCR și din rezultatele serologice de la pacienți se obțin
dovezi considerabile că Borrelia burgdorferi sensu lato (s.l) are o implicație
majoră în patogenitate pentru om și mamifere cu implicații clinice majore. Astfel,
Borrelia burgdorferi sensu stricto (s.s.) este cel mai adesea asociată cu artrita, în
special în America de Nord, caz în care aceasta a și fost denumită Boala Lyme, în
urma manifestărilor clinice din ținutul Lyme . Borrelia garinii este asociat ă cu
simptome neurologice și Borrelia afzelii cu acrodermatita cronică atrofică
cutanată (ACA)[6].

15 Datorită s uprapuner ii acestor specii patogene s-a produs o varietate bogată
a manifestărilor clinice, iar la debutul inf ecției apare eritem migrans (EM), de
intensități diferite, ce poate fi considerat un simptom precoce patognomonic. În
Europa, există dovezi că acest simptom precoce apare mai frecvent în infecțiile
cu Borrelia afzelii , mai ales la femei, decât în cele cauz ate de Borrelia garinii , la
care apare un eritem migrans non -inelar și sunt mai frecvente simptomele
sistemice[15].
În lista agenților patogeni care nu generează boala Lyme se găsește Borrelia
valaisiana , și Borrelia lusitaniae . Însă, Borrelia valaisiana a fost detectată în
lichidul cefalorahidian prin PCR și Borrelia lusitaniae a fost izolat de la un caz
de vasculită[6].
Informațiile disponibile despre Borrelia bissettii , o specie întâlnită în
California, arată că o tulpin ă aparținând acestei specii a f ost izolată de la un
pacient uman în SUA, iar în Europa a fost raportat recent un caz în care Borrelia
bissettii a fost izolat din țesutul endotelial al valvulei cardiace la om[13].
Progrese le în identificarea patotipurilor în cadrul genospeciilor au
înregistrat progrese mici până în prezent . Cu toate acestea subgrupuri mici, de
Borrelia burgdorferi s.s . și Borrelia afzelii , au fost raportate a fi deosebit de
invazive pentru om[13].
Momentan, p atogeneza B olii Lyme este puțin cunoscută. Rolul activ al
căpușelor a fost demonstrat , convenindu -se că aceasta este modalitatea uzuală de
transmitere . Astfel, acestea au rol și în multiplicarea agenților patogeni, pe lângă
vehicularea lor de la animalul bolnav la unul sănătos. Boreliile traversează
peretele intestinal al căpușelor și ajung în hemolimfă. De aici acestea ajung în
glandele salivare ale parazitului, după care sunt injectate împreună cu saliva
virulentă în dermul și subdermul celui parazitat. Cercetătorii consideră că
multiplicarea boreliilor cont inuă la locul de inoculare și apoi la locurile de elecție
spre care migrează[16].
Borrelia burgdorferi nu produce toxine, dar este un imunomodulator
puternic. Efectele Borrelia burgdorferi asupra celul elor locale poate duce la

16 supresia răspunsului imun local. Leziunile sunt rezultatul interacțiunii complexe
a celulelor sistemului imun și a factorilor umorali, cum ar fi interleukinele, factori
imuni circulanți, prostaglandinele sau colagenazele[15].
După penetrarea structuril or pielii, spirochetele se r ăspând esc local și
produc eritem migrator . În plus, acestea vor disemina pe calea sângelui și vor
afecta alte organe. Plasminogenul și urokinaza din sângele gazdei vor favoriza
diseminarea hematogenă, iar boreliile au capacitatea de a adera la suprafața
celulelor organismului infectat, prin legarea de anumiți receptori de suprafață.
Boreliile care produc B oala Lyme prezintă afinitate atât pentru celulele de la
nivelul tegumentului , cât și pentru celulele de la nivelul sistemului nervos, sau
pentru celulele de la nivelul articulațiilor . În foarte multe situații, ADN -ul
bacterian a fost detectat în produsele biologice prelevate din zonele pentru care
patogenii prezintă afinitate[6]. În anumite zone endemice ale Bolii Lyme, 70-
90% din populația de animale sensibile la infecția cu Borrelia burgdorferi este
seropozitivă[17]. Însă, doar un mic procent dintre aceste animale suferă modificări
morfofuncționale suficient de importante pentru a determina man ifestări clinice,
respectiv starea de boală[16].
Manifestările cronice cât și cele tardive diseminate ale bolii pot fi
considerate rezultatul unei combinații a patologiei infecțioase și autoimune, sau
numai a mecanismelor autoimune. Interacțiunea complexă dintre celulele
sistemului imun și factorii umorali, ca de exemplu inteleukinele, factorii imuni
circulanți, prostaglandinele sau c olagenozele, po t fi răspunzătoare pentru leziunile
tisulare și manifestările clinice ale bolii. Leziunile viscerale apar datorită
inflamației produse de interacțiunea factorilor celulari și umorali ca răspuns la
componentele antigenice ale boreliilor[9]. Prin urmare, starea de boală este mai
curând consecința reacției inflamatorii a organismului la prezența și activitatea
germenului, decât rezultatul acțiunii directe a microorganismului[16].
Deoarece l imfocitele T și B proliferează într -o mare varietate d e organe,
infiltrarea limfocitară p oate fi asociată cu acumularea de macrofage, celule imune
dendritice și mastocite tisulare. Leziunile viscerale se datorează inflamației

17 produse de interacțiunea factorilor celulari și umorali ca răspuns la componentele
antigenice ale spirochetelor[6]. Diminuarea hematogenă poate fi corelată cu
activarea specifică a plasminogenului în plasmină, care la rândul ei lizează
fibronectina și alte proteine structurale membranoase și activează colageneza
latentă[6].
Borrelia burg dorferi aderă la receptorii de membrană și apoi penetrează
unele celule . Acest proces este urmat de lezarea celulei direct și indirect prin două
mecanisme aparent distincte: stimularea mecanismelor de apărare ale gazdei (dar
Borrelia Burgdorferi este rezis tentă la acțiunea anticorpilor specifici); un răspuns
imun la autoantigene cross -reacting cu unele antigene spirochetale (reacția
încrucișată cu mielina perioscanală normală). Răspunsul imun al gazdei împotriva
acestei infecții se produce progresiv . Astfel, după câteva săptămâni de la infecție ,
se constată o creștere a imunoglobulinelor serice de clasa IgM , sintetizate specific
împotriva antigenelor bacteriene . Tot în această perioadă se poate evidenț ia și
creșterea concentrației complexelor imune circu lante (legătura dintre antigen și
anticorp). După 21 de zile de la declanșarea infecției concentrația de anticorpi
specifici circulanți este maximă. După câteva luni de la producerea infecției apar
în circulație anticorpii de clasă IgG , iar creșterea titr ului acestor anticorpi, este
corel ată cu apariția simptomelor de artrită. Boreliile au capacitatea de a stimula
puternic producerea de factori proinflamatori – interleukina beta și factorul alpha
de necroză tumorală . Prezența unui infiltrat inflamator form at din limfocite și
plasmocite este relevat la analiza histologică a țesuturilor infectate. De asemenea,
mai pot fi decelate leziuni locale de vasculită[6].
Spirochetele nu sunt distruse de s istemul imunitar al organismului gazdă,
acestea persist ând un timp îndelungat în țesutul epitelial, articulații, sistem nervos,
celulele sistemului de apărare și chiar în sânge și urină[5].
Având în vedere persistența clinică a Borrelia burgdorferi la pacienții cu
Boala Lyme în ciuda tratamentului adecvat cu an tibiotice, investigațiile in vitro
ale variantelor morfologice și ale formelor atipice de Borrelia burgdorferi , au fost
întreprinse într -o încercare de a afla mai multe despre variația acesteia și rolul

18 formelor atipice în Boala Lyme . S-au izolat borrelii de la pacienți tratați sau
netratați, cu diagnosticul de Boala Lyme confirmat . În plus , a fost analizată
degenerarea borreliilor izolate în timpul expunerii la penicilina G, in vitro[15].
Analiza morfologică de câmp întunecat și scanare prin microscopie
electronică a relevat modificări diverse. Bacteriile „supraviețuitoare” de la un
număr mare de pacienți (60 -80%), după tratamentul cu antibiotice au dezvoltat o
formă atipică[15]. Astfel, a u fost descrise modificări m orfologice ale Borrelia
burgdorferi în culturile cu penicilina G ce s -au dezvoltat treptat pe durata
perioadei de incubație. Pleomorfismul, prezența de forme alungite și structuri
sferice, incapacitatea celulelor de a se reproduce, perioada lungă de adap tare și
coloniile asemănătoare celor de Mycoplasma sugerează faptul că Borrelia
burgdorferi produce forme de sferoplaste[15]. Aceste forme care nu au perete
celular pot fi un posibil motiv pentru care borrelia supraviețuieste în organism
pentru o perioadă lungă de timp și titrurile anticorpilor dispar și emerg după
revenirea la forma inițială[18].
I.2. BORRELIOZA
I.2.1. Istoricul borreliozei
Determinarea exactă a origini i unei boli este dificilă, mai ales în situația în
care aceasta ne -a însoțit de milenii, cum sunt de exemplu, sifilisul sau ciuma. De
aceea, descoperirea exactă a originii Boreliozei – Boala Lyme este dificilă.
În anul 1883, doctorul german Alfred Buchwald , din Breslau, descrie o
afecțiune a pielii similară cu cea produsă de Boala Lyme. În prezent, această boală
este denumită „dermatită atrof ică cronică”. Un medic suedez, Arvid Afzelius, în
anul 1920, a raportat Societății De Dermatologie din Suedia despre o iritație a
pielii care se extinde , despre care a presupus că este cauzată de căpușa unei oi, din
genul Ixodes[20].

19
Între anii 1920 și 1930 au fost raportate din nou situații în care sau observat
iritații roșii are se extind, numite eritem migrant (EM) , însoțită de apariția unor
simptome care, mai târziu, vor fi asociate Boreliozei. Însă, La momentul
respectiv, aceste simptome observate nu erau atât de evidente încât sa poată fi
asociate unei noi boli. În plus, numărul de cazuri observate a fost foarte mic.
În jurul anului 1940, cazuri de umflare a genunchilor au fost raportate În
Long Island, New York, SUA, foarte mulți dintre pacienți fiind din regiunea
Montauk Point. De aceea, acest fenomen a fost numit „Montauk knee”. În anul
1960 un medic din Wisc onsin a recunoscut un caz de eritem migrant la un pacient,
pe care l -a tratat cu succes utilizând penicilină. Totuși, nimeni nu a presupus că
este vorba de o boală nouă.
În anul 1975, Judith Mench din localitatea Old Lyme, Connecticut, figura
4, și-a dus fiica de 8 ani la medic, deoarece aceasta prezenta simptom de genunchi
umflat. Doctorii au presupus că este osteomielită, o infecție bacteriană a oaselor.
Copilul a început un tratament cu antibiotice, însă testele de laborator nu au
indicat nici o infecție virală, astfel încât tratamentul a fost întrerupt. Medici i-au
prescris aspirină, recomandată în tratamentul artritei reumatoide la copii. Părinții
copilei au pus la îndoiala acest diagnostic deoarece nu exista în istoria medicală a
Figura 4 . Poziționarea pe hartă a orașului Old Lyme din Connecticut, localitate ce a dat
denumirea actuală a bolii Lyme. (URL 4)

20
familiei această afecțiune, în plus aceleași simptome mai existau și la alți c opii.
din vecinătate și cunoșteau că artrita nu este o boala contagioasă. Astăzi, se
cunoaște că boala de care suferea copilul este Borelioză – Boala Lyme.
În anul 1975, Departamentul de sănătate Publică din Connecticut, a primit
sesizări de la mai mulți pacienți, în majoritatea cazurilor copii din localitatea Old
Lyme, care aveau simptome asociate artritei și iritații endemice roșii.
Epidemiologii s -au concentrat pe zona orașelor Lyme, Old Ly me și East Haddam,
Connecticut, unde era localizată boala, pentru a studia mai în detaliu aceste cazuri.
Au studiat similaritatea dintre cazuri, adică perioada de raportare a bolii, figura 5,
vârsta și sexul persoanelor afectate, precum și factorii ereditari. În plus, aceștia au
investigat și flora și fauna zonei de interes, precum si topografia zonei.
Descoperirile făcute în perioada 1975 – 1976 pot fi asociate cu descoperirea
Boreliozei – Boala Lyme. Însă, în această perioada nu a fost identificat nici un
agent infecțios are sa producă aceasta boală. În Europa, unii medici au reușit cu
succes s ă trateze pacienții ce prezentau eritem migrator, utilizând anumite
antibiotice. Cercetările realizate pentru identificarea bacteriei ca te cauzează boala
s-au intensificat și, la începutul anilor 1980, Willy Burgdorfer, un expert de
renume în studiul căpușelor, cerceta febra pătată din zona Rocky Mountain, care
Figura 5 . Cazuri de Boala Lyme înregistrate în regiunea Old Lyme,
Connecticut[19].

21 la momentul respectiv era pe primul loc în bolile cauzate de mușcătura de căpu șe
în SUA. În anul 1981, acesta a primit pentru studiu căpușe din zona New York pe
care, analizându -le la microscop, a observat bacterii răsucite, lungi și zvelte, din
categoria spirochetelor. Burgdorfer cunoștea că spirochetele nu au fost niciodată
asocia te cu căpușele din genul Ixodes scapularis . În plus, cunoștea că responsabilă
pentru febra pătată era bacteria Rickettsia , care nu era o spirochetă. De asemenea,
acesta era la curent cu epidemia de artrită care a apărut in zona de unde au fost
prelevate că pușele și că antibioticele erau, în general, eficiente împotriva
spirochetelor. La puțin timp după descoperirile lui Burgdorfer, Allen Steere, un
cercetător de la Universitatea Yale, a reușit să izoleze același tip de bacterie de la
pacienții cu artrită di n zona Lyme. Spirochetele, agenți etiologici pentru artrita
Lyme, au fost denumite Borrelia burgdorferi în onoarea lui Willy Burgdorfer.
I.2.2. Epidemiologia borreliozei
Metodele științifice utilizate de epidemiologi au avut un rol important în
descoperirea Bolii Lyme. Epidemiologia reprezintă studiul incidenței, transmiterii
și răspândii bolii. Aceasta disciplină are în continuare un rol important în
monitorizarea Bolii Lyme în lume. Atunci când este implementata o soluție are
sa împiedice la r ăspândirea bolii, ca de exemplu vaccinarea sau ingineria genetică,
epidemiologii sunt chemați pentru a găsi soluția cu cea mai mare eficiență.
Boala Lyme a fost raportată pe toate continentele, cu excepția Antarctici i.
Aceste date au fost obținute din cul turile de sânge pozitive sau din rezultatele
clinice medicale, din testele pozitive ale anticorpilor sau din analiza păsărilor
purtătoare ale bolii. Totuși, Boala Lyme are o incidență mai m are în zonele
temperate, pe când în zonele tropicale sau deșertice nu s-a Cazuri anuale de Boala
Lyme în Europa Cazuri anuale de Boala Lyme în Europa evidențiat existența Bolii
Lyme. Incidența cea mai mare a bolii este în SUA (Coasta de Est și de Vest),
respectiv în Nordul Europ a ei și Asiei, figura 6.

22 În figura 7 sunt prezentate datele raportate în SUA , datele fiind furnizate de
Centrul de Control și Prevenire al Bolilor din SUA, pentru fiecare stat și regine,
pe perioada 19 82-2012. În figura 8 sunt prezentate datele pentru Europa, datele
fiind furnizate de Organi zația Mondială a Sănătății . Deși datele curente sunt
importante, epidemiologi utilizează date mai vechi deoarece acestea au fost
analizate un timp mai îndelungat și, prin urmare, sunt mai precise.
Din punct de vedere epidemiologic este important să se găsească o definiție
standard pentru Boala Lyme, definiție care să poată fi utilizată oriunde în lume.
Definiția clinica utilizată de Centrul de Control și Prevenire al Bolilor din SUA
este următoarea: 1. fie eritem migrant (EM) sau cel puțin o manifestare
cardiovasculară sau musculo -scheletală; 2. infecția trebuie confirmată de un
laborator clinic, inclusiv izolarea bacteri ei Borrelia burgdorferi de la pacienți
clinici, detecția anticorpilor specifici în ser sau fluidul cerebral, ori testul de
determinare al anticorpilor prin imunoflorescența sau imunotestare cu ajutorul
enzimelor senzitive, urmate de un test Western Blot ca re poate identifica cu
precizie bateria Borrelia burgdorferi în sistemul pacientului .
Utilizând aceasta definiție a Bolii Lyme, aceasta poate fi raportată cu
precizie. Din anul 1982, în SUA au fost raportate peste 145000 de cazuri, ceea ce
Figura 6 . Răspândirea Bolii Lyme este mai mare în zonel e temperate. Harta indică zonele
unde incidența bolii este ridicată.[19]

23 face ca această boală să devină un vector important în bolile din SUA și cuprinde
mai mult de 95% din toți vectorii de boală din aceasta țară.
În Europa p uține țări au făcut publice rezultatele investigațiilor privind
prevalența B olii Lyme, boală cu notificare obligatorie . Prin urmare, este posibil
să se facă doar estimări legate de incidența acesteia în Europa , deoarece este
realizată o raportare cu privire la numărul de pacienți identificați a fi pozitivi la
testări, de regulă, prin intermedi ul laboratoarelor de diagnostic. Această metodă
implică mai multe neajunsuri pentru estimarea incidenței B olii Lyme în Europa ,
Figura 8 . Cazuri anuale de Boală Lyme în Europa pe perioada 1990 – 2010 .
(URL 6) 0500010000150002000025000300003500040000
1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002 2004 2006 2008 2010Cazuri anuale de Boala Lyme în Europa050000100000150000200000250000300000350000400000
1982
1983
1984
1985
1986
1987
1988
1989
1990
1991
1992
1993
1994
1995
1996
1997
1998
1999
2000
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
2009
2010
2011
2012Cazuri anuale de Boala Lyme in SUA
Figura 7 . Cazuri anuale de Boală Lyme în SUA pe perioada 1982 -2012. (URL 5)

24 existând un pericol de sub -raportare datorată mai multor cauze : modele diferite
de referințe de testare, diferite criterii de serodiagnostic și seropozitivitate legate
de expunerea realizată în trecut. Pentru a obține informații utile și real e de la
sistemele individuale ale țărilor europene și realizarea de comparații anuale , în
termen de țări și de date , este necesar să se găsească o practică unitara de
raportare[13].
Studiile estimative care au ca punct de plecare datele clinice dau
informațiile cele mai exacte asupra incidenței bolii. Însă , acestea sunt mult mai
costisitoare ca resurse și timp decât metodele indirecte, care pot reprezenta
singurele mijloace de desfășura re a anchete lor în anumite domenii. Aceste me tode
indirecte pot să includ ă: măsurarea abundenței într -un areal a căpușelor Ixodes
ricinus , prevalența Borrelia burgdorferi în căpușe infectate și studii de
seroprevalență. Toate aceste măsurători indirecte au puncte slabe ca indicatori de
Boala Lyme, dar în prezent studiile de seroprevalență pentru populația umană
reprezintă, probabil, cea mai bună metodă de a obține date epidemiologice în
Europ a. Daca se ia în considerare limitările metodelor de seroprevalență, este clar
că BL prezintă un gradient de incidență în creștere de la Vest la Est, cele mai
frecvente cazuri regăsindu -se în Europa Centrală și de Est . De asemenea, a fost
remarcat un gradient de descreștere a incidenței de la Sud la Nord, în Scandinavia
și de la Nord la Sud, în Italia, Spania și Grecia[13].
Prezența Boreliozei Lyme și ratele de incidență au crescut în anumite
grupuri profesionale, de exemplu, în cazul lucrători lor forestieri, a grupuri lor de
recreere (cercetași și turiști ) aflați în zonele endemice. Totuși , identificarea
grupuri lor cu risc ridicat nu este întotdeauna corect realizată și există factori de
confuzie . De exemplu, ghizii turistici din Suedia, care se presupune a fi expuși
regulat la mușcături de căpușe, s -au dovedit a avea seroprevalențe similare cu cele
ale populație i în general . Acest fapt se petrece deși prevalenț a bolii în această țară
este relativ ridicată[6].
Și genul pare să influențeze seroprevalența și ratele de incidență a bolii . De
exemplu, mai multe studii raportează rate mai ridicate de pozitivitate în cazul

25 pentru bărbaților. Acest lucru se presupune a fi datorat riscurilor profesionale și
activităților de agrement în aer liber. Însă, este interesant de remarcat faptul că
într-un studiu suedez recent privind reapariția eritem ului migrant (4% din toate
cazurile), majoritatea au fost înregistrate la femeile de vârstă mijlocie[15]. Unele
rapoarte sugerează că incidența B oreliozei Lyme este, în general , mai mare la
copii decât la adulți , în zonele endemice Lyme . Acest fapt este dator at tendinței
crescute a copiilor de a fi în contact cu căpușele în habitatul lor natural[13].
În România prevalențe semnificative crescute au fost observate la lucrătorii
silvici precum și diagnosticate prin metode de examinare directe prin microscopie
la exam enul direct al sângelui recoltat de la donatorii onorifici . În figura 9 este
prezentată o hartă explicativă a incidenței borreliozei Lyme în țara noastră[8].

Figura 9 . Seroprevalența Borrelia burgdorferi în România până în anul 2011. (URL 7)

26 I.2.3. Manifestări clinice
Din cele spuse până în prezent, Boala Lyme prezintă mai multe manifestări
specifice care se regăsesc la nivelul pielii (eritem migrator), la nivel musculo –
scheletic sau manifestări cardiovasculare sau neurologice. în cele ce urmează, sunt
prezentate aceste manifest ări clinice ale Boreliozei – Boala Lyme.
I.2.3.1. Manifestări cutanate
Eritemul migrator (EM), figura 10 este cel mai ușor de asociat cu Boala
Lyme EM apare în jurul zonei unde s -a produs mușcătura căpușei și este cel mai
adesea lipsită de dureri[16]. Această leziunea debutează normal ca o papulă (o
leziune superficială a pielii, caracterizată printr -o mică ridicătură roșiatică sau
neagră, dură, care apare în unele boli de piele) și ca o zonă de expansiune a
eritemului, pe o perioadă de câteva zile. De cele mai multe ori leziunea este plată
și lipsită de algii sau de senzația de mâncărime, însă prezintă caracter hipertermic
la atingere. Cele mai frecvent afectate regiuni sunt zona inghinală, coapsele și
axilele , însă leziunea se poate manifesta pe tot corpul, dispare , de regulă, după 3-
4 săptămâni, d ar există și cazuri în care această perioadă este mai mare.
Figura 10 . Eritemul migrator asociat cu boala Lyme poate apare în diverse forme. (URL 8)
Ochi de taur
Leziune purulentă
Leziune uniformă roșie
Leziune uniform albăstrui – roșie
Leziuni diseminate

27 Diagnosticul diferențial se face față de infecția fungică superficială, afecțiuni
cutana te medicamentoase și eritemul anular .
Acrodermatita cronică atrofic ă este l eziunea cutanată cronică asociată cu
Borrelia burgdorferi , această patologie fiind mai frecvent observată în Europa
decât în SUA . Această b oală debutează cu o leziune roșu -albăstruie care devine
sclerotică și atrofică. S -au înregistrat cazuri în care Borrelia burgdorferi a fost
izolată din această manifestare cutanată cronică chiar și la 10 ani după debutul
acesteia[4].
I.2.3.2. Manifestări musc ulo-scheletice
Manifestările musculo -scheletice sunt raportate la 2 săptămâni sau chiar
după câțiva ani de la infecție. Crizele de artritice pot dura câteva săptămâni, după
care se remit pentru a recidiva. Odată cu trecerea timpului, chiar și în absența
terapiei instituite, doar 10% dintre pacienții care manifestă artrită vor intra în faza
cronică a acesteia și sub 5% din cazuri vor dezvolta artrită erozivă. Aspiratul de
lichid sinovial arată între 500 −110 .000 leucocite /mm3, în care predomină
leucocite po limorfonucleare (leucocitele polimorfonucleare din sânge sunt un
indicator al stării de apărare a organismului). Sunt prezente complexele imune și
Borrelia burgdorferi a fost izolată din lichidul sinovial[9].
I.2.3.3. Manifestări neurologice
Simptome asemănătoare unei iritații meningeale apar frecvent în perioada
timpurie a infecției cu Borrelia burgdorferi . În această etapă a bolii, nu există
niciun deficit neurologic și LCR se prezintă normal[6].
Una dintre cele mai frecvente manifestari neurologie a borreliozei Lyme în
Europa este sindromul Bannwarth . Acesta se manifestă prin pleiocitoză
limfocitară, fără migrene, fără dureri nevritice și uneori paralizii ale nervilor
cranieni. LCR tipic prezintă limfocite, o sinteză elevată a anticorpilor pentru
Borrelia burgdorferi și uneori benzi oligoclonale. Studiile recente au asociat și

28 alte sindroame nervoase cu evoluția Borrelia burgdorferi : encefalomielita
progresivă, encefalita subacută, demența și cele de demielinizare. Gradul de
implicare al acestor si ndroame nu este pe deplin cunoscut si necesită cercetări în
continuare[6].
I.2.3.4. Manifestări cardiace
Aproximativ 80% dintre pacienții cu diagnosticați cu borelioză Lyme în
SUA manifestă afecțiuni cardiace, care apar l a câteva săptămâni de la debutul
infecției. Formă comuna de anormalitate cardiacă este sub forma unui blocaj
atrioventricular, fluctuant și de diverse grade , cel mai adesea de scurtă durată . Pot
apare și blocaj e cardiac e complet e, însă acestea rar persistă mai mult de 7 zile.
Utilizarea unui pacemaker permanent nu este implicit necesară, chiar și în situația
în care problema cardiacă poate reveni. Un număr mic de pacienți manifestă
miopericardită, disfuncții ventriculare sau cardiomegalie[4].
I.2.3.5. Alte sisteme
Deși borelioza Lyme se manifestă cel mai frecvent la nivelul pielii, al
nervi lor, al articulațiil or sau asupra cordul ui, și alte sisteme de organe pot fi
implicate. De exemplu, p entru ochi s -au raportat cazuri de conjunctivită, iritită
sau panoftalmie[6].
I.2.4. Prognoză și tratament . Diagnostic de laborator
Diagnosticul se stabilește pe baza datelor anamnetice și a manifestărilor
clinice , iar confirmarea acestuia se realizează prin teste complexe de laborator.
.[20]. Detecția bacteriei prin culturi, citologie sau PCR pot fi dificile, costisitoare
și greu implementabile în practic ă. Organismul patogen este rar descoperit în
urină, sânge, lichid sinovial sau lichid cefalo -rahidian fiind mai frecvent
descoperit în țesutul conjunctiv, sinov ial, piele sau fibroblaste. Acesta este dificil
de pus în cultură și sunt necesare colorații speciale sau microscopie în câmp

29 întunecat pentru vizualizare. ADN -ul plasmidic sau cel genomic cromozomial al
B. burgdorferi poate fi amplificat prin tehnica PCR[21].
Rezultatele pozitive la PCR nu demonstrează faptul că Borrelia burgdorferi
este viabil a în organism și poate fi un rezultat al r esturilor neviabile ale acesteia[21].
De asemenea, Borrelia burgdorferi poate exista și sub alte forme (sferoplaști)[4].
Serodiagnosticul este cea mai practică si uzuala metodă de a oferi un
diagnostic clinic, dar nu este încă pe deplin standardizat[15]. În diagnosticul
serologic s unt folosite teste ELISA și IFA (immunofluorescence assay). Insa,
problematica rezultatelor f als-pozitive când se folosesc ambele metode (IFA și
ELISA), în special la pacienții care manifestă semne clinice atipice, din zone
neclasificate ca fiind endemice pentru B oala Lyme, a avansat necesitatea
dezvoltării unui test serologic mult mai specific, Western -blot-ul. Acest test, deși
este mai costisito r, are specificitatea cea mai mare[4]. Dacă analiza este e fectuată
corespunzător, rezultatele negative de la testarea Western blot (nu la un pacient
proaspăt infectat) par să excludă prezența anticorpilor anti – Borrelia burgdorferi ,
cu un grad înalt de fiabilitate. Determinarea a ceea ce constituie un rezultat pozitiv
al testului rămâne încă în dezbatere, un consens în acest sens nefiind prezent.
Rezultate fals -negative pot apărea timpuriu în cursul infec ției, atunci când nu s-
au format niveluri detectabile de anticorpi. Terapia cu antibiotice instituită
timpuriu poate , de asemenea , să întârzi e sau să elimin e un răspuns în anticorpi.
Nu există modificări hematologice sau biochimice specifice B olii Lyme,
dar pot apărea modificări inflamatorii în lichidul cefalorahidian, lichidul sinovial
sau în urină[7].
Metodele de diagnostic de laborator sunt de două tipuri:
1. Metodele directe:
– cultura din sânge, lichid cefalorahidian, lichid sinovial, piele;
– deter minarea antigenelor specifice prin imunohistologie (pe fragmente de țesut)
sau metode de „captură” a antigenelor;
– detectarea ADN prin PCR, hibridizare, etc.
2. Metodele indirecte:

30 – serologia – imunofluorescență, ELISA, Western blot
– stadiul proliferării l imfocitelor T[8].
Serologia nu are valoare diagnostică absolută și nici valoare prognostică
din cauza persistenței anticorpilor la pacienții vindecați prin tratament corect și a
multitudinii de antigene ale bo rreliei. Există riscul unor rezultate fals poz itive sau
fals negative ce nu țin de calitatea reactivilor, ci de particularitățile imunologice
ale pacienților.
Diagnosticul serologic atinge trei mari limite:
1. D iagnosticarea infecției precoce poate avea o sensibilitate redusă d atorită
răspunsului umo ral lent;
2. Din cauza reacțiilor încrucișate cu alte bacterii, testele pot avea o specificitate
redusa ;
3. Pot apărea dificultăți în deosebirea infecțiilor recente fa ță de cele cronice din
cauza persisten ței anticorpilor, atât în cazurile tratate c ât și în cele evolutive. [8].
Din aceste motive se recurge la aprecierea valorii predictive a testelor
serologice (pozitivă sau negativă), adică la aprecierea șanselor ca rezultatele de
laborator să coincidă sau nu cu datele sugestive clinic (epidemiologice,
anamnetice și clinice propriu -zise). Din punct de vedere epidemiologic este
semnificativă frecvența testelor pozitive în populația din zona respectivă;
anamnetic trebuie să se evite cercetarea de laborator în absența unei expuneri la
înțepătura de căpușă sau a manifestărilor precoce; iar din punct de vedere clinic
să se recurgă la cercetarea serologică doar pornind de la o simptomatologie cu
mare probabilitate diagnostică[8].
Studiul diferențelor antigenice dintre tulpinile izolate în America și Europa
a permis recunoașterea implicării în patologie a trei genospecii care alcătuiesc
complexul Borrelia burgdorferi sensu lato : Borrelia . burgdorferi sensu stricto (ce
cuprinde toate tulpinile izolate în America de Nord), Borrelia . garinii și Borrelia
afzelii . În Europa circulă toate cele trei genospecii, dar predomina Borrelia garinii
și Borrelia afzelii[6].

31 Diagnosticul B oreliozei Lyme este stabilit prin recunoașterea clinică a
eritemului migrator în timpul primului stadiu al infecției , corelata cu testele de
laborator. [2].
Diagnosticul de laborator al B olii Lyme, tabelul 3, se realizează prin:
• Microscopia directă pe secțiuni tisulare
• Microscopia în câmp întunecat (MCÎ) pe probe proaspăt recoltate
• Culturi bacteriene
• Tehnici moleculare
• Reacții s erologice ce pun în evidență răspunsul imun –Western Blot (W.B.),
Imunofluorescență indirectă (I.F.)
• Testul de transformare limfoblastică (LTT)

Microscopia directă este o metodă folosită mai frecvent în depistarea
speciilor de Borrelia ce determină Febra recurentă ( Borrelia recurrentis, Borrelia
hispanica, Borrelia caucasica ). Borrelia burgdorferi poate fi vizualizată pe
Tabel 3. Diagnosticul de laborator al BL
Manifestări clinice Detecție directă Detecție indirectă
prin anticorpi
STADIUL I (câteva zile –
săptămâni de la mușcătura
căpușei) EM – Biopsie piele,
Microscopie
în câmp întunecat Ser
STADIUL II (câteva
săptămâni – luni de la
mușcătura căpușei) Cardită – Biopsie
endomiocard
Neuroborelioză – LCR Ser
Pereche ser/ LCR
STADIUL III (câteva luni –
ani de la mușcătura căpușei) Artrita – Lichid sinovial
ACA – Biopsie piele
Neuroborelioza cronică –
LCR Ser
Ser
Pereche ser/ LCR
EM- eritem migrator; ACA – acromodermatită cronică atrofică

32 secțiuni tisulare după col orare prin impregnație argentică. Numărul de spirochete
în sânge la pacienții cu BL este în general sub limita de detecție microscopică[11].
Culturile bacteriene : sunt laborioase și costisitoare, frecvent de
competența laboratoarelor de referință. Produse le patologice cultivabile sunt:
sânge, piele, LCR, lichid sinovial sau chiar căpușa care a determinat mușcătura.
Mediul de cultură mai frecvent folosit este mediul Barbour – Stoenner -Kelly
(BSK ) II cu incubare la 30 -33°C, în microaerofilie, pozitivitatea ur mărindu -se
prin microscopie în câmp întunecat, cel puțin 4 -6 săptămâni[22].
Microscopia în câmp întunecat este o metodă folosită în screening -ul
probelor de sânge recoltate de la pacienți aflați în prima fază a evoluției bolii, fiind
însă dificilă chiar i mposibil ă uneori diferențierea diferitelor tipuri de spirochete,
iar numărul acestora în sânge la pacienții cu BL este în general redus.
Produsele patologice recomandate în diagnosticul de laborator al bolii Lyme sunt
diferite, în funcție de stadiul bolii[11].
Tehnicile moleculare se bazează pe amplificarea unei regiuni specifice a
genomului bacterian.
Au o sensibilitate mai mare decât cultura în cazul preleva nțelor bioptice, a
sângelui și a lichidului articular, spre deosebire de LCR și urină unde rezult atele
studiilor nu au fost satisfăcătoare , tabelul 4[22].
Există laboratoare care folosesc această tehnică pentru extrage rea
materialul genetic al Borreliei direct din căpușa care a dete rminat mușcătura,
precizând dacă aceasta a fost infectată sau nu. Un rezultat negativ nu exclude
infecția cu Borrelia , în timp ce un rezultat pozitiv în afara contextului clinic, nu
confirmă diagnosticul[22].
Tabel 4. Sensibilitatea testelor prin tehnicile moleculare în funcție de produsul patologic folosit[22]
PRODUS PATOLOGIC SENSIBILITATE (%)
Biopsie piele (EM și ACA) 50-70
LCR Stadiul I 60 Stadiul II 30
Biopsie articulară 50-70
Sânge < 10

33 Reacțiile serologice detectează anticorpii specifici anti -Borrelia de tip
IgM și Ig G și sunt cele mai folosite teste în diagnosticul B olii Lyme. Pentru a
crește acuratețea rezultatelor serologice, CDC (Centers for Disease Control and
Prevention) a propus încă din 1994 un algoritm de diagnostic comp us din doua
etape[11]:
1. În prima etapă se folosește un test IFA (immunofluorescence assay). Aceste
teste au o sensibilitate crescută, ceea ce conferă siguranță ca la un rezultat negativ
probabilitatea ca pacientul să fie afectat este foarte mică. La pacienții suspecți de
Boala Lyme în faza inițială a bolii cu serologie negativă, evidențierea infecției se
poate obține prin testarea în pereche a serurilor din perioada acută și de
convalescență a bolii prin test IFA[22]. Dacă rezultatul acestei etape est e pozitiv
sau echivoc, se continuă cu etapa a doua, pentru confirmarea rezultatului.
2. Etapa a doua constă în efectuarea testului Western Blot. Acest test are o
specificitate mare , tabelul 5, ceea ce înseamnă că va fi pozitiv doar la persoanele
care sunt într-adevăr infectate.
Rezu ltatele la Western Blot sunt co municate pozitiv sau negativ. În cazul în care
rezultatul este negativ dar există suspiciune de boală se recomandă repetarea
recoltării după câteva săptămâni.
Pentru diagnosticul neuroboreliozei se recomandă detecția producerii
intratecale de anticorpi anti Borrelia . Acest lucru se realizează prin testarea în
pereche a LCR -ului și serului obținute prin recoltarea în aceeași zi. Prezența unui
titru de anticorpi mai mare în LCR decât în ser se stabile ște calculând un index și
certifică diagnosticul de neuroborelioză[11].
Tabel 5. Sensibilitatea metodei Western Blot în detectarea anticorpilor de tip IgM și IgG în
funcție de stadiul bolii[22]
STADIUL BOLII SENSIBILITATE ANTICORPI
I 20-50 % Predomina IgM
II 70-90 % Prezente ambele clase Ig M și Ig G
III 90-100 % Frecvent doar IgG

34
Limitele și interferențele testelor serologice:
Rezultate fals negative pot fi obținute când testarea se efectuează la debutul
bolii, iar titrul de anticorpi este încă redus. Antibioticoterapia administrată în
primul stadiu al infecției, timpuriu, poate supresa producerea de anticorpi[22]. La
pacienții cu imunosupresie imun odeprimate rezultatele obținute sunt dificil de
interpretat.
Rezultate fals pozitive pot fi obținute la pacienții cu alte boli produse de
spirochete (febra recurentă, leptospiroză), boli autoimune[23].
Rezultatele pozitive ale pacienților care au primit transfuzii de sânge în
ultimele lun i se recomandă a fi interpretate cu prudență[22]. În B oala Lyme
diagnosticul de laborator trebuie folosit pentru a sprijini diagnosticul clinic, care
se bazează pe date clinice și anamneză , figura 1 1.
Diagnosticul B oala Lyme rămâne o provocare în cazuri le ambigue clinic,
cu serologie indeterminată și PCR negativ. Aceste cazuri au suscitat interesul
cercetătorilor care, în decursul anilor ’90 au pus la punct o nouă metodă folosind
răspunsul imun specific al organismului:
Testul de transformare limfoblasti că (LTT). Metoda a fost validată în Europa
și este folosită cu aplicații în diagnosticul agenților infecțioși, alergii
medicamentoase sau alimentare. Testul se bazează pe principiul diviziunii
celulare limfocitare induse de contactul cu antigenul „specific”. O reacție pozitivă
la LTT demonstrează existența limfocitelor antigen -specifice (celule cu memorie)
în sângele pacientului. Intensitatea reacției LTT este evaluată cu ajutorul
indexului de stimulare (SI)[34].
Un test LTT pozitiv arată expunerea actuală a sistemului imun la patogeni
și prin aceasta o infecție activă. După tratament antibiotic valorile scad, sau reacția
LTT devine negativă reprezentând astfel un instrument important în
monitorizarea eficienței t erapiei[34].

35

Figura 11 . a. Protocolul de diagnostic în BL. (URL 9) . b. Reperele care conduc către un
diagnostic pozitiv în BL . (URL 10)
a
b

36 CERCETARE PERSONALĂ

II.1. Scopul și obiectivele cercetării
Scopul acestei lucrări este acela de a evidenția incidența infecțiilor cu
borrelia provocate de speciile Borrelia burgdorferi , Borrelia . garinii și Borrelia
afzelii în România, în perioada 01.01.2016 – 31.01.2017 .
Boala Lyme (infecția cu Borrelia) a devenit supravegheată de Sistemul de
Sănătate Publică din cauza numărului de cazuri raportate și a numărului crescut
de vectori. Se presupune că încălzirea globală și migrarea vectorilor din Nord –
Vest-ul Europei către Est Europei au contribuit la răspândir ea Bolii Lyme în
România[35]. S-a observat că Boala Lyme este din ce în ce mai răspândită în
România, fapt rezultat din raportarea obligatorie a bolii.
Este important să fie relevate către Autoritățile de Sănătate Publică și
Epidemiologie a cunoștințelor și măsurilor care sunt necesare pentru determinarea
cât mai exactă a răspândirii și incidenței bolii Lyme.
Principalul obie ctiv al studiului realizat este s tabilirea incidentei infecțiilor
cu Borrelia prin studiul efectuat în cadrul Laboratorului Borrelia Centrum din
București , în perioada 1.01.2016 – 31.01.2017 , care a urmărit:
 incidența infecției cu borrelia în lotul de pacienți studiat ;
 incidența în funcție de specie ( Borrelia burgdorferi , Borrelia . garinii și
Borrelia afzelii );
 incidența în funcție de sexul pacienților;
 incidența în funcție de vârsta pacienților;
 incidența în funcție de regiunea din care provin pacienții.
CAPITOLUL II.

37 II.2. Materiale și metode
II.2.1. Loturi de pacienți
În studiul realizat, rezultatele au fost obținute în urma analizei a 5 95
pacienți de sex feminin și masculin, cu domiciliul în mediul urban sau rural, având
vârstele cuprinse în intervalul (0 ani)÷(>75ani ), tabelul 12.
Pentru prelucrarea statistică a datelor, pacienții au fost grupați în 5 grupe
de vârstă, conform tabelului 12.
Tabelul 12. Loturi de pacienți
Grupa de
vârsta Pacienți de sex
feminine Pacienți de gen
masculin Numărul total de
cazuri investigate
0 – 16 21 13 34
17 – 35 91 63 154
36 – 55 185 139 324
56 – 70 46 31 77
>75 3 3 6
TOTAL 346 249 595

II.2.2. Metode folosite
II.2.2. 1. Metoda Western -Blot
Principiul testului
Testul utilizează benzi de membrană care conțin extracte de antigen
separate prin electroforeză în gel de poliacrilamidă în prezență de sodium dodecil
sulfat (SDS) și transferate ulterior electroforetic pe o membrană de nitroceluloză.
Poziția antigenelor pe benzi depin de de masele lor moleculare. Situsurile de legare
libere de pe o membrană sunt saturate cu o soluție de proteine, după care matricea
este spălată și tăiată în stripuri.

38 Antigenele și masele lor moleculare, fixate pe un strip de Borrelia
burgdorferi , sunt prezentate în tabelul 13. (Poziționarea antigenelor pe strip poate fi
observată în figura 18.)
Tabelul 13 Specificitatea anti genelor pe stripur i*
Banda Antigen Specificitate
83 kDa p83 Produs de degradare a proteinei p100 înalt specifică
75 kDa p75 Nespecifică
62 kDa p62 Nespecifică
57/59 kDa P57 si p59 Nespecifică
50 kDa p50 Nespecifică
47 kDa p47 Genul probabil specific
43 kDa p43 Nespecific ă
41 kDa Flagelin, p39 Gen specific, Reacții încrucișate cu alte spirochete și
bacterii care au flageli nă
39 kDa Bmp A, p39 Înalt specific ă
36 kDa p36 Specific ă nuclear
34 kDa OspB, p34 Protein ă de suprafa ța B înalt specifică
32 kDa p32 Nespecific ă
31 kDa Osp B, p31 Proteină de suprafața B înalt specifică
29 kDa p29 Posibil specific ă insuficient investigat ă
28 kDa p28 Nespecific ă
25 kDa Osp C, p25 Proteina de suprafață C, înalt specific ă
21/22 kDa p21/22 Specificitate ridicat ă
18 kDa p18 Posibil specific ă
17 kDa p17 Insuficient investigat ă

39 Materiale și mod de lucru
1. Proba de sânge recoltat în eprubetă cu gel separator pentru ser, figura 12 .

2. Kit pentru detectarea anticorpilor anti -Borrelia Burgdorferi (imunoglobulina
IgG) din ser sau plasma , figura 13 . Componentele kitului de lucru sunt prezentate
în tabelul 14

Figura 12. Probe de sânge [ Laborator Borrelia Centrum ]
Figura 13. Kit de lucru [ Laborator Borrelia Centrum ]

40 Tabel. 14 Componentele k itului*
Componente Format Format
1. Stripuri test cu antigene Borrelia burgdorferi
separate electroforetic 16 x1 30 x1
2. Conjugatul enzima IgG, 10x concentrat 1 x3 ml 2 x 3 ml
4. Buffer universal 10 x concentrat 1 x 50 ml 1 x 50 ml
5. Soluția Substrat NBT/BCIP, gata de folosire 1 x 30 ml 1 x 50 ml
6. Protocol de evaluare 1 bucat ă 2 bucăți
7. Tăviță de incubare 2 x 8 canale ……
8. Folie de plastic 1 bucat ă 2 bucăți
9. Folie adeziv ă ….. ……
10. Instrucțiuni de utilizare 1 bucat ă 1 bucat ă

3. Aparat EURO Blot Mas ter, prezentat în figura 14.

Figura 14 . Aparat EURO Blot Mas ter. [Laborator Borrelia Centrum ]

41 4. Modul de lucru
Pentru detectarea anticorpilor anti -borrelia burgdorferi , stripul pe care sunt
fixate antigenele, într -o primă etapă a testului, este incubat împreună cu serul
diluat al pacientului , figura 15.
Dacă în ser sunt prezenți anticorpi specifici, aceștia se vor lega de antigenele
corespunzătoare de pe strip.
După o etapă de spălare, stripul este incubat cu un conjugat anti -IgG sau anti – IgM
marcat cu peroxidază , în funcție de clasa de anticorpi testat ă. Conjugatul se va
atașa la complexul antigen -anticorp format în prima etapă.
Urmează o etapă de spălare pentru îndepărtarea conjugatului nelegat.
În ultima etapă se adaugă o soluție de substrat care este capabilă să genereze
o reacție de culoare. Rea cția enzimatică va genera un produs colorat albastru
închis la nivelul benzilor ocupate de anticorpii specifici, figura 16.

Figura 15 . Incubarea stripurilor [Laborator Borrelia Centrum ]

42
5. Evaluarea și interpretarea rezultatelor
Pentru evaluarea stripurilor incubate se folosește software -ul Euro Line
Scan . După stoparea reacției cu apă deionizată, stripurile se fixează pe o folie
adezivă de pe protocolul de lucru, figura 17 a. După uscare, stripurile sunt scanate
și evaluate de soft, figura 17 b.
Figura 16 . Colorația benzilor după reacția cu substrat. [Laborator
Borrelia Centrum]
Figura 17. Interpretarea rezultatelor. [ Laborator Borrelia Centrum ]

43 Fiecare strip conține în partea superioară
două benzi de control:
 banda controlului de reacție;
 banda pentru controlul conjugatului
IgG/IgM care servește drept control
pentru clasa de anticorpi testată.
Pentru validarea testului trebuie să fie
îndeplinite următoarele condiții:
 banda controlului de reacție trebuie să
aibă o culoare închisă, intensă;
 banda pentru controlul conjugatului
corespunzător clasei de anticorpi testate
trebuie să prezinte o reacție de culoare
clară , figura 18.
Antigenele impregnate pe strip pot fi divizate în trei categorii, conform
tabelului 15.
Tabelul. 15 Clasificarea antigenilor *
Categorie Antigeni
1 Antigene nespecifice și insuficient investigate cu masele moleculare:
17 kDa, 28 kDa, 32 kDa , 36 kDa, 43 kDa, 47 kDa, 50 kDa, 57 kDa, 59 kDa,
62 kDa si 75 kDa
2 Flagelină comună spirochetelor cu masa moleculară 41 kDa
3 Antigene specifice și înalt specifice cu masele moleculare: 18kDa 21/22kDa
25kDa 31kDa 34kDa 39kDa si 83kDa
Rezultatele testelor Western Blot pentru Borrelia burgdorferi pot fi
împărțite în teste negative, teste pozitive și borderline (la limită):
Figura 18 . Poziția antigenelor pe strip
[Matrice kit de lucru ]

44  Negative – atunci când nicio bandă nu este colorată sau există semnale slabe
pentru anumite antigene din categoriile 1 și 2;
 Borderline – atunci când apare o bandă distinctivă din categoria 3 și mai
multe semnale distinctive pentru categoriile 1 și 2. În cazul rezultatului
borderline, este recomandat să se preleveze o nouă mostră și testul să fie
repetat după câteva săptămâni;
 Pozitiv – atunci când apare mai mult de o bandă distinctivă din categoria.
Suplimentar, și particular în cazul pacienților care se află într -o fază avansata
a bolii, benzi distinctive din categoriile 1 și 2 pot fi observate în număr mare.
II.2.2.1. Reacția de imunofl orescență
Metoda se bazează pe evidențierea anticorpilor anti -borrelia ( Borrelia
burgdorferi, Borrelia afzelii, Borrelia garinii ) utilizând o lamă cu godeuri tapetate
cu borrelii ca substrat standard și vizualizarea lor cu un pattern
fluorescent. …………………………….……………………
Exist ă două modalități de lucru : prin determinări calitativ e și cantitativ e.
Pentru determinarea calitativă care oferă un rezultat pozitiv /negativ, proba se
lucrează la diluție 1/100.
Pentru determinarea cantitativă se realizea ză dil uții succesive începând cu
1/100, 1/1000, până la 1/10 000, valori ce oferă informații asupra mărimii
infecției.
Titrul de anticorpi este dat de diluția cea mai mare la care se obține
fluorescență. Determinarea cantitativă este utilizată în monitorizarea
tratamentului.
În diagnosticul neurobor reliozelor determinarea titrului de anticorpi din
LCR împreună cu cel sanguin este de o importanță crucială, determinarea
indexului de anticorpi face diferența dintre derivații din sânge și derivații
patologici spec ifici ai creierului.

45 Materiale și mod de lucru
1. Proba de sânge recoltat în eprubetă cu gel separator pentru ser, figura 1 9.

2. Kit pentru detectarea anticorpilor anti – Borrelia burgdorferi, afzelii, garinii
(imunoglobulina IgG) din ser sau plasmă , figura 20 . Componentele kitului de
lucru sunt prezentate în tabelul 16

Figura 19 . Probe de sânge [Laborator Borrelia Centrum]
Figura 20 . Kit de lucru . [Laborator Borrelia Centrum]

46

3. Microscop EURO star II Plus , prezentat în figura 21.

Tabel 16. Componentele Kitului *
Componente Format
1. Lame , fiecare conținând 4 biochipuri impregnate cu B. afzelii , B.
burgdorferi (USA) , B. burgd orferi (CH) și B. garrini 10 lame
2. Conjugat cu fluoresceină IgG, gata de utilizare 1 x 1.5 ml
3. Control pozitiv: anticorpi anti B. afzelii/B. burgdorferi/B. garinii /, gata
de utilizare 1 x 0.1 ml
4. Control negativ, gata de utilizare 1x 0.1 ml
5. PBS, pH 7.2 pachete
6. Tween 20 2 x 2.0 ml
7. Glicerol, gata de utilizare 1 x 3.0 ml
8. Lamela de acoperire (62 mm x 23 mm) 12 bucăți
9. Manual de instrucțiuni 1 bucată
Figura 21 . Microscop EURO star II Plus . [Laborator Borrelia Centrum]

47 4. Modul de lucru
1. Se numerotează tuburile de diluție de la 1 la 3 ;
2. Se adaugă în fiecare tub de diluție 100 0 μl soluție PBS pentru IgG ;
3. În tubul notat cu cifra 1 se pun 11.1 μl din proba de analizat pentru IgG ;
4. Se fac diluții seriale și am obținut diluțiile 1/100; 1/1000; 1 /10000 pentru IgG ;
5 Se pun câte30 μl din fi ecare diluție în fiecare godeu cu antigen, apoi se adaugă
martorul pozitiv și martorul negativ ;
6. Lama cu godeuri se incubează timp de 30 de minute la temperatura camerei ;
7. După cele 30 minute urmează 5 minute de spălare în cuva cu tampon fosfat
salin;
8. În fiecare godeu se pipetează 25 μl de soluție conjugat (flurocrom), după care
lama se incubează alte 30 minute în absenta luminii ;
9. Urmează din nou o etapa de spălare
10. Se adaugă 2 picături de glicerol pe lamela de acoperire , iar peste aceasta se
poziționează lama, după care se examinează la microscop.
Câteva din etapele de lucru sunt prezentate în figura 2 2.

48
5. Evaluarea și interpretarea rezultatelor
Dacă în probă sunt prezenți anticorpi anti – B. burgdorferi, afzelii, garinii ,
se observă o fluorescență marcată a boreliilor , ca în figurile următoare.

Figura 2 2 . Etape de lucru. [Laborator Borrelia Centrum]

49

Borrelia afzelii – Pozitiv
Borrelia burgdorferi (USA) – Pozitiv

50

Borrelia burgdorferi (CH) – Pozitiv
Borrelia garinii – Pozitiv

51 Evaluarea calitativă a rezultatelor obținute se realizează conform
indicațiilor din tabelul 17.
Tabel 17. Evaluare calitativă *
Reactivitate IgG Evaluare
Lipsa reacției la 1/100 Negativ – infecție neevidențiată
Prezența la 1/100 Pozitiv – marker d e infecție cronică cu
Borrelia

Titrul de anticorpi este dat de diluția cea mai mare la care se obține
fluorescența evidentă , tabelul 18 .
Tabel 18. Evaluare ca ntitativă *
FLUORESCENȚĂ POZITIVĂ
1:10 1: 100 1: 1000 1: 10 000 Titru anticorpi
Slab Negativ Negativ Negativ 1:10
Moderat Negativ Negativ Negativ 1:32
Intens Slab Negativ Negativ 1:100
Intens Moderat Negativ Negativ 1:320
Intens Intens Slab Negativ 1:1 000
Intens Intens Moderat Negativ 1:3 200
Intens Intens Intens Slab 1:10 000
II.3. Rezultate și discuții
II.3.1. Incidența infecțiilor cu borrelia în lotul de pacienți studiat
Dintre cele 595 teste de b orrelia efectuate în perioada 01.01.2016 –
31.01.201 6 în cadrul Laboratorului Borrelia Centrum București , 77 (13% ) au fost
pozitive , figura 23 .
Testele de confirmare Western Blot și testele de Imunofluorescență au evidențiat
prezen ța tulpinilor de B. afzelii, burgdorferi și garinii .

52 Testele Western Blot au evidențiat faptul c ă antigenul OspC, este asociat cu
răspunsul imun de tip IgM, în timp ce antigenele p18, p31,p83, p21/22 sunt
markeri asociați cu răspunsul imun de tip IgG. Producerea de anticorpi fa ță de
VlsE, antigen prezent pe stripul RN -AT, este detectat ă tot ca un răspuns de tip
IgG.
II.3.2. Incidența infecțiilor cu borrelia în funcție de regiunile din care provin
pacienți i
În figur a 24 sunt prezentate rezultatele privind incidența infecțiilor cu B.
afzelii, burgdorferi și garinii , în funcție de regiunea de unde au provenit pacienții
investigați .
Din figura 24 a, se observă că incidența infecțiilor cu B. afzelii determinată
prin evidențierea anticorpilor IgG a fost înregistrată într -un procent mai mare ,
23.77% , în regiunea Transilvania, fiind urmată de regiunea Moldova cu un
procent de 5.20% . De asemenea, se observă un procent scăzut în regiunile
Dobrogea (2.60% ), Banat (2.60% ) și Muntenia (1.30% ). Analizând figura 24 b,
se observă că în regiunea Transilvania, incidența infecțiilor cu B. garinii scade la
un procent de 2.60% . În regiunea Moldova procentul rămâne de 5.20% . De
Figura 2 3. Numărul cazurilor pozitive din numărul total de cazuri investigate
în perioada 01.01.2016 -31.01.2017 .

53 asemenea, din figura 24 c, se observă o scădere a infecției cu B. Burgdorferi tot
în regiunea Transilvania ( 3.40% ) ca și în cazul infecției cu B. garinii .
II.3.3. Incidența infecțiilor cu borrelia în funcție de sexul pacienților
În figura 2 5 a, b și c sunt prezentate rezultatele privind incidența infecțiilor
cu B. afzelii, burgdorferi și garinii , în funcție de sexul pacienți lor investigați.
Repartizarea pe sexe a indicat faptul că majoritatea pacienților infectați cu
borrelia au fost de sex feminin ( 62.33% ), însumând 42 de cazuri pozitive din
totalul de 77.
Totodată, se observă că incidența cea mai mare a infecțiilor este dată de B.
afzelii , care a fost prezentă în proporție de 23.37% la femei, respectiv 16.88% la
bărbați.
Figura 24 . Incidența infecțiilor cu a. Borrelia afzelii , b. Borrelia garinii și c. Borrelia
burgdoferi în funcție de proveniența pacienților din lotul studiat.
b.
c.
a.

54
Infecțiile cu B. garinii au fost, de asemenea, mai frecvent întâlnite la femei,
9.09% , respectiv 2.60% la bărbați.
În cazul infecțiilor cu B. burgdorferi, a fost mai frecvent întâlnită în cazul
pacienților de sex masculin, 5.19% , respectiv 3.90% în cazul pacienților de sex
feminin.
II.3.4. Incidența infecțiilor cu borrelia în funcție de vârsta pacienților
Pacienții cu testele de Borrelia pozitive au fost încadrați în cinci grupe de
vârste: 0 -16 ani, 17 -35 ani, 36 -55 ani, 56 -70 ani și >70 ani. Din cele 77 de infecții
cu Borrelia confirmate, 36.36% au provenit de la pacienții cu vârsta cuprinsă între
Figura 2 5. Incidența infecțiilor cu a. Borrelia afzelii , b. Borrelia garinii și c. Borrelia
burgdoferi în funcție de sexul pacienților din lotul studiat.
b
.
c
.
a
.

55 36-55 ani, urmată de 14.28% pentru categoria 17 -35 ani, 6.49% la grupa 56 -70
ani, 5.20% pentru pacienții din grupa 0 -16 ani, respectiv 2.60% pacienții cu vârsta
mai mare de 70 ani, figura 26 a, b și c.
Incidența cea mai mare de infecție cu borrelia a fost înregistrată la pacienții
cu vârsta cuprinsă între 36 -55 ani.
Incidența cea mai mica a infecției cu borrelia s-a înregistrat la pacienții cu
vârsta mai mare de 70 de ani și la pacienții din grup de vârstă 0 -16 ani.
II.3.5. Incidența infecțiilor cu Borrelia afzelii , garinii și burgdorferi
determinat ă cu testul recombinat RN-AT
Seroprevalența pentru infecția cu Borrel ia afzelii , garinii și burgdorferi
determinat ă cu ajutorul testului recombinat RN-AT, a fost de 5% din numărul
total de pacienți testați.
Figura 2 6. Incidența infecțiilor cu a. Borrelia afzelii , b. Borrelia garinii și c.
Borrelia burgdoferi în funcție de vârsta pacienților din lotul studiat.
b.
c.
a.

56 Dacă se raportează la numărul total de cazuri pozitive (77 de cazuri) , testul
recombinat RN-AT a indicat o seroprevalență pentru infecția cu borrelia de
37.66% . Acest procent relativ ridicat față de procentele testelor pe specii, ar putea
fi datorat prezenței pe stripul RN -AT a proteinelor de suprafață VlsE afzelii ,
garinii , burgdorferi .

Figura 23. Incidența infecțiilor cu B. afzelii, garinii și burgdorferi determinată cu testul
recombinat RN-AT.

57 CONCLUZII
1. Studiul s -a realizat în perioada 2016 -2017 pe 595 de pacienți, dintre care 249
pacienți de sex masculin și 346 de pacienți de sex feminin, încadrați în cinci
grupe de vârste: 0 -16 ani, 17 -35 ani, 36 -55 ani, 56 -70 ani și >70 ani;
2. Investigarea probelor s -a realizat prin două metode: metoda Western -Blot,
respectiv, metoda imunoflorescenței;
3. Dintre cele 595 teste d e borrelia efectuate în această perioadă, în cadrul
Laboratorului Borrelia Centrum București, 13% au fost pozitive (77 de
pacienți );
4. Studiul a relevat că incidența infecțiilor cu B. afzelii a fost înregistrată într -un
procent mai mare în regiunea Transilvania (23.77%) și într-un un procent
scăzut în regiun ea Muntenia (1.30%);
5. Incidența infecțiilor cu B. garinii în regiunea Transilvania se reduce până la
2.60% , în regiunea Moldova procentul rămâne de identic cu cel obținut în
cazul infecțiilor cu B. afzelii (5.20% );
6. Se observă o scădere a infecției cu B. Burgdorferi în regiunea Transilvania
(3.40%) ca și în cazul infecției cu B. garinii .
7. Repartizarea pe sexe a indicat faptul că majoritatea pacienților infectați cu
borrelia au fost de sex feminin (62.33%), însumând 42 de ca zuri pozitive din
totalul de 77;
8. Incidența cea mai mare a infecțiilor este dată de B. afzelii , care a fost prezentă
în proporție de 23.37% la fem ei, respectiv 16.88% la bărbați;
9. Infecțiile cu B. garinii au fost mai frecvent întâlnite la femei, 9.09%, respectiv
2.60% la bărbați;
10. Infecțiilor cu B. burgdorferi au fost mai frecvent întâlnit e în cazul pacienților
de sex masculin, 5.19%, compara tiv cu 3.90% în c azul pacienților de sex
feminin;

58 11. Din cele 77 de i nfecții cu Borrelia confirmate, cele mai multe cazuri (36.36%)
au provenit de la pacienții cu vârsta cuprinsă între 36 -55 ani, iar cele mai
puține ( 2.60% ) la pacienții cu vârsta mai mare de 70 ani ;
12. Seroprevalența pentru infecția cu Borrelia afzelii , garinii și burgdorferi
determinată cu ajutorul testului recombinat RN -AT, a fost de 5% din număru l
total de pacienți testați;
13. Testul recombinat RN -AT a indicat o seroprevalență pentru infecția cu borrelia
de 37.66% din numărul total de cazuri pozitive (77 de cazuri) ..

59 Bibliografie
1. U.G. Munderloh, T.J. Kurtti – The ABCs of Lyme disease spirochaetes in ticks,
Lancet, 366:962 – 4 2005
2. P. R. Murray; E. J. Baron – Manual of clinical microbiology, ASM Press,
Washington, D.C, 2007
3. Craig Greene – Infectious Diseases of the Dog and Cat, 4th Edition, Elsevier
Health Sciences, 2013
4. D. S. Samuels, Justin D. Radolf – Borrelia: Molecular Biology, Host Interaction
and Pathogenesis, Caister Academic Press, Norfolk, UK, 2010
5. European Concerted Action on Lyme Borreliosis (EUCALB). An information
resource of the ESCMID study group, ESGBOR. Available at:
http://meduni09.edis.at/eucalb .
6. J. Sjöwall – Clinical and Immunological Aspects of Lyme Borreliosis, LiU –
Tryck, Linkoping, Sweden, 2011
7. C.E. Green – Infectious Diseases of the Dog and Cat, 4 -th edition, Elsevier,
Missouri, U.S.A., 2012
8. M. Chiotan – Boli infecțioase, Editura Național, Bucureș ti, 2011
9. S.R. Palmer, Lord Soulsby, D.I.H. Simpson – Zoonoze, Editura Științelor
Medicale, București, 2005
10. J.S. Gray, O. Kahl, R.S. Lane, G. Stanek – Lyme Borreliosis –Biology,
Epidemiology and Control, CABI Publishing, Wallingford, Oxon, UK, 2004
11. B. Wilske, B. J. B. Johnson, M. E. Schriefer. Borrelia – In:Patrick R. Murray
et al. – Manual of Clinical Microbiology, 9th ed., p.971 – 986 2007
12. I.L. Mitrea – Parazitologie și boli parazitare, Editura Ceres, București, 2011

60 13. J. Piesman , T.N. Mather, G.J. Dammin, S.R. Telford III, C. Lastavica, A.
Spielman – Seasonal Variation of Transmission Risk of Lyme Disease and Human
Babesiosis, American Journal of Epidemiology, Vol 126 (6): p.1187 -1189, 1987
14. M. C. Chifiriuc, Gr. Mihăescu, V. Lazăr – Microbiologie și virologie medicală,
Editura Universității din București 2011
15. L. Bennet, L. Stjernberg, J. Berglund – Effect of Gender on Clinical And
Epidemiologic Features of Lyme Borreliosis, Vector -Borne and Zoonotic
Diseases. Vol 7(1): 34 -41 2007
16. R.M. Mânzat – Boli infecțioase ale animalelor: bacterioze, Editura Brumar,
Timișoara 2001
17. M.P. Littman, R.E. Goldstein, M.A. Labato, M.R. Lappin, G.E. Moore –
ACVIM Small Animal Consensus Statement on Lyme Disease in Dogs:
Diagnosis, Treatment, and Prevention, J Vet Intern Med ; 20:422 –434 2006
18. D. Lipsker, B. Jaulhac – Lyme Borreliosis Biological and Clinical Aspects,
Karger, 2009
19. L. Yannielli – Deadly Diseases and Epidemics: Lyme Disease, Chelsea House
Publisher, Philadelphia, SUA 2004
20. T. Perianu – Tratat de boli infecțioase ale animalelor: bacterioze, Vol. 1,
Editura Universității XXI, Iași 2011
21. Y.F. Chang, V. Novosel , C.F. Chang, B. Summers, W.M. Acree, S. Shin.,
D.H. Lein – Experimental induction of chronic borreliosis in adult dogs exposed
to Borrelia burgdorferi -infected ticks and treated with dexamethasone, American
Journal of Veterinary Research vol . 62(7): 1104 – 1112 2001
22. E. V. Thon, Ilsemann K., M. Sandkamp – A novel lymphocyte transformation
test (LTT -MELISA) for Lyme borreliosis, Diagnostic Microbiology and
Infectious Disease, vol 57(1) 27 -34 2007

61 23. E.C. Coipan, A.F. Vladimirescu – Ixodes ricinus ticks (Acari: Ixodidae):
vectors for Lyme disease spirochetes in Romania. Exp . Appl . Acarol, 54(3), 293 –
300, 2011

24. URL 1
[http://www.nhc.ed.ac.uk/index.php?page=24.25.119 ]
25. URL 2
[http://accessmedicine.mhmedical.com/content.aspx?bookid=375& sectionid=40
299165&jumpsectionID=40306167]
26. URL 3
[C.E. Green – Infectious Diseases of the Dog and Cat, 2012]
27. URL 4
[http://www.bestplaces.net/compare -cities/old_saybrook_ct/old_lyme_ct ]
28. URL 5
[http://www.businessinsider.com/lyme -disease -ticks -may-cost-billions -with-no-
vaccine -2015 -7]
29. URL 6
[http://www.businessinsider.com/lyme -disease -ticks -may-cost-billions -with-no-
vaccine -2015 -7]
30. URL 7
[http://www.doctorulzilei.ro/record -de-romani -cu-boala-lyme -in-2012 -atenti –
capusele -ies-la-atac-dupa -ploaie]
31. URL 8
[http://www.bayarealyme.org/blog/lyme -disease -bullseye -rash/]
32. URL 9
[http://www.cdc.gov]
33. URL 10
[http://www.umfiasi.ro/Rezidenti/suporturidecurs/, 27]
34. URL 11
http://www.synevo.ro/diagnosticul -de-laborator -al-bolii-lyme

62 35. URL 12
http://www.mayomedicallaboratories.com

*Protocol kit de lucru EUROIMMUN