Istoricul dezvoltării enzimologiei [311203]

[anonimizat], proprietățile și schimbarea materiei. [anonimizat] o utilizare responsabilă și competentă.

Lucrarea de față își propune să prezinte principalele aspecte teoretice și practice cu privire la “Aplicațiile oxidoreductazelor în chimia analitică” având rolul de a evidenția principalele aspecte referitoare la importanța acestor aplicații. Conținutul lucrării este împărțit în mai multe capitole.

Capitolul 1 [anonimizat] “Enzimologie” [anonimizat] „Istoricul dezvoltării enzimologiei”, “Metode și tehnici utilizate în enzimologie“ și ”Enzimologia în zilele noastre“. În primul subcapitol „Istoricul dezvoltării enzimologiei” sunt prezentate informațiile referitoare la istoria conceptului de enzimă din antichitate până în prezent. Al doilea subcapitol numit “Metode și tehnici utilizate în enzimologie“ indică metodele utilizate la izolarea și purificarea enzimelor. Printre acestea pot fi menționate următoarele: purificarea ([anonimizat], ultrafiltrarea, centrifugarea, separarea cromatografică ș.a) și caracterizarea (compoziția/[anonimizat]/terțiară, structura cuaternară ș.a). Al treilea subcapitol ”Enzimologia în zilele noastre“ specifică diversele aplicații ale enzimelor precum: [anonimizat], și truse de curățare a lentilelor de contact. [anonimizat].

Capitolul 2 –“Chimia enzimelor” este împărțit în cinci subcapitole. Primul subcapitol denumit “Natura chimică a enzimelor” [anonimizat]. Al doilea subcapitol “Nomenclatura enzimelor” [anonimizat] 4 cifre separate între ele prin puncte ce au anumite semnificații. „Clasificarea enzimelor” poartă numele subcapitolului trei din acest capitol și prezintă cele șase clase în care sunt împărțite enzimele: [anonimizat], [anonimizat], clasa izomerazelor și clasa ligazelor (sintetazelor). Al patrulea subcapitol “Extracția enzimelor” presupune alegerea unei strategii cu privire la proveniența sursei enzimatice și totodată sunt prezentate etapele de alegere a unei sursei și metodele de extracție a enzimelor. “Metode spectrofotometrice de determinare a activității enzimatice” [anonimizat] E a [anonimizat].

Capitolul 3 „Aplicații ale oxidoreductazelor” este împărțit în trei subcapitole. Scopul primului subcapitol “Aplicații ale tirozinei și lacazei: biosenzori enzimatici electrochimici” este aducerea în prim plan a [anonimizat]. Al doilea subcapitol “Aplicații ale enzimelor imobilizate” cuprinde un spectru larg de domenii. Aceste domenii pot fi împărțite în trei categorii importante: domeniul analitic, domeniul terapeutic și domeniul industrial. Subcapitolul trei intitulat “Oxidoreductaze importante în biotehnologiile alimentare” are următoarea structură: Oxidoreductazele NAD+ sau NADP+ dependente, Oxidoreductazele FAD sau FMN dependente și Oxidazele.

Capitolul 4 “Metode de analiză spectrofotometrice” prezintă principalele metode de analiză fizico-chimice utilizate pentru identificarea și cuantificarea antioxidanților în mostre complexe. Primul subcapitol intitulat “Spectroscopia în domeniul infraroșu (IR)” subliniază faptul că spectroscopia este cea mai potrivită metodă de identificare a prezenței grupărilor funcționale polare din structura moleculelor compușilor organici. Al doilea subcapitol “Spectrometria UV-Vis” precizează faptul că absorbția luminii de către substanțe în domeniul vizibil și ultraviolet se datorează unor tranziții electronice între diferite nivele energetice ale moleculelor.” Cromatografia” este al treilea subcapitol al acestei lucrări. Aceasta este o metodă de separare și analiză a substanțelor chimice din amestecuri care se bazează pe interacțiunea diferențiată a doi sau mai mulți compuși cu două faze cromatografice. “Cinetica reacțiilor catalizate enzimatic: ecuația Michaelis – Menten” reprezintă subcapitolul patru. Acest subcapitolul pune accent pe prezentarea ecuației lui Michaelis-Menten, ecuație care exprimă relația matematică dintre viteza inițială a unei reacții catalizate enzimatic, concentrația substratului și anumite caracteristici ale enzimei.

Capitolul 5 “Materiale și metode„ prezentă principalele materiale, echipamente și instrumente utilizate pentru analiza acțiunii unor polifenolioxidaze din fructe asupra unor compuși polifenolici. Metodele de analiză au fost metoda spectrofotometrică în domeniul și spectrometria în domeniul IR.

Capitolul 6 Rezultate și discuții

Capitolul 1. Enzimologie

Considerată astăzi de mulți specialiști o știință, enzimologia are numeroase aplicații practice în diverse domenii ale activității umane: medicină, industrie (exemplu: alimentară, detergenților, textilor și cea a medicamentelor), chimie analitică și altele. Este cunoscut faptul că numeroase medicamente sunt de fapt inhibitori ai enzimelor.

În același timp studiul enzimelor prezintă o importanță deosebită din punct de vedere fundamental contribuind la înțelegerea mecanismelor moleculare ce stau la baza transformărilor metabolice din celula vie și la dezvoltarea altor științe moderne și domenii interdisciplinare, cum ar fi: biologia moleculară, genetica, microbiologia, fiziologia animalelor, plantelor și a microorganismelor, biotehnologia și altele.

Istoricul dezvoltării enzimologiei

Încă din antichitate se cunoșteau diverse procese de transformare/fermentație realizate de către organismele vii, în special microorganisme – surse enzimatice (exemplu: obținerea vinului, oțetului, pâinii, produselor lactate etc.). Mult timp însă, mecanismele moleculare care stau la baza acestor procese, precum și locul, rolul enzimelor în desfășurarea lor au rămas total necunoscute. Chiar și astăzi, multe mecanisme de acțiune ale enzimelor precum și unele procese biochimice rămân încă neelucidate.

Primele noțiuni științifice de enzimologie apar la începutul secolului al XIX-lea însă dezvoltarea acestei ramuri a biochimiei s-a realizat abia în ultimele decenii. Ținând cont de multitudinea proceselor biochimice neelucidate încă, precum și de importanța practică imensă a enzimelor, se poate afirma cu certitudine că și în secolul al XXI-lea enzimologia va cunoaște o dezvoltare spectaculoasă.

Primele date științifice ce au condus la definirea noțiunii de enzimă au apărut în 1833 când Persoz și Payen obțin un “principiu activ” din extractele apoase de germeni de orz, capabil să hidrolizeze amidonul. Prin precipitări repetate cu etanol, autorii reușesc să îl purifice sub forma unei pulberi, numind preparatul obținut diastază.

După formularea conceptului de cataliză de către Berzelius între anii 1834-1837, acesta sugerează că diferite fenomene biologice cum ar fi digestia și fermentația pot fi realizate de unii catalizatori specifici lumii vii. În perioada imediat următoare, această teorie a fost confirmată prin descoperirea pepsinei gastrice, a emulsiei din migdale, lipazei și tripsinei pancreatice, invertazei din drojdii și a altor enzime. Pentru toate aceste substanțe, Khun propune în 1877, denumirea de enzimă care în limba greacă înseamnă “în drojdii”.

În 1860 începe o dispută științifică între Pasteur și Liebig, în care, Pasteur susține noțiunea de fermenți organizați, atribuită celulelor microbiene integre capabile să realizeze procese fermentative, în timp ce Liebig utilizează noțiunea de ferment solubil pe care o atribuie principiului activ sintetizat de celulele vii și nu celulelor intacte. În final teoria lui Liebig având câștig de cauză.

La sfârșitul secolului al XIX-lea apare și prima teorie asupra mecanismului de acțiune a enzimelor și anume teoria lacătului și a cheii elaborată de Fischer, conform căreia, în procesul catalitic, enzima recunoaște substratul datorită unei similitudini structurale între molecula substratului și centrul activ al enzimei, această asemănare fiind comparată cu cea existentă între un lacăt și cheia lui.

În primii ani ai secolului XX se pun bazele cineticii enzimatice prin cercetările lui Henri și Brown, iar prima exprimare matematică a cineticii reacțiilor enzimatice cu un singur substrat se realizează în anul 1913, de către Michaelis și Menten. Studiile de cinetică enzimatică au fost ulterior dezvoltate prin cercetările unor biochimiști de frunte ai lumii: Haldane, Lineweaver, Burk, Chance, Theorel, Dixon, Webb și alții.

Studiul structurii chimice a enzimelor a fost posibil abia după elaborarea metodelor de izolare și purificare a proteinelor în general și a enzimelor în special din sursele biologice. Din acest punct de vedere o importanță deosebită o prezintă separarea, purificarea și cristalizarea ureazei de către Sumner în 1926 și demonstrarea structurii ei proteice. A urmat o perioadă de intense cercetări când au fost cristalizate pepsina, tripsina, chimotripsina etc. După 1940, în paralel cu cercetările de cinetică enzimatică, în aproape toate laboratoarele din lume s-au efectuat experimente privind separarea și purificarea enzimelor din cele mai diferite surse biologice, atât de natură microbiană, vegetală cât și animală.

Sfârșitul secolului al XX-lea este marcat de apariția și dezvoltarea unei noi direcții de cercetare în enzimologie cu largi implicații în biotehnologie – imobilizarea enzimelor, organitelor celulare și a celulelor întregi pe suporturi solide.

Biocatalizatorii heterogeni astfel obținuți și-au găsit deja aplicații în medicină, industria alimentară, industria medicamentelor, chimia analitică, epurarea apelor reziduale precum și în alte domenii ale activității umane.

Metode și tehnici utilizate în enzimologie

Datorită structurii lor chimice și rolului pe care-l îndeplinesc în organismele vii, enzimele prezintă unele caracteristici comune cu ale altor biomolecule, dar și unele proprietăți specifice. Fiind proteine enzimele prezintă toate proprietățile fizico-chimice și structurale ale acestora. Fiind biocatalizatori respectă toate legile catalizei chimice, iar faptul că acționează în organismele vii determină o serie de caracteristici specifice.

Un studiu complet și corect al enzimelor sub aspectul structurii lor chimice, cineticii reacțiilor enzimatice, specificității lor de acțiune presupune, în primul rând, izolarea lor din surse biologice și purificarea până la un grad de puritate cât mai înalt.

Metodele utilizate la izolarea și purificarea enzimelor sunt comune cu cele utilizate în studiul proteinelor în general. Printre aceste metode utilizate în studiul proteinelor în general, se pot enumera următoarele: purificarea: prepararea extractului, precipitarea, dializa, ultrafiltrarea, centrifugarea, separarea cromatografică, verificarea puritații; și caracterizarea: M, compoziția/structura primară, structura secundară/tertiară, structura cuaternară, stabilirea mecanismului de acțiune.

Spre deosebire însă de proteinele necatalitice, în cazul enzimelor trebuie evitată nu numai denaturarea, ci și inactivarea lor. Este cunoscut faptul că stabilitatea maximă a enzimelor se întâlnește in vivo, adică în mediul lor natural. Cu cât gradul lor de puritate crește cu atât stabilitatea enzimelor scade, fapt ce impune unele precauțiuni suplimentare pe parcursul procedurilor de separare și purificare. Principalii factori ce inactivează enzimele în timpul acestor proceduri sunt: temperatura și pH-ul mediului.

În afara temperaturilor ridicate și a valorilor extreme de pH, enzimele sunt puternic afectate și de modificările bruște ale acestor factori. De aceea, toate operațiunile se execută la rece (0÷4oC), iar separarea fazei insolubile se face utilizând centrifuga cu răcire. Sunt și operațiuni care se execută la temperaturi foarte joase. De exemplu precipitarea enzimelor cu diferiți solvenți (acetonă, alcool izopropilic etc.) se face la –15 0C sau chiar –20 0C.

Modificarea pH-ului într-un interval mic al valorilor acestui parametru determină o modificare mai mult sau mai puțin accentuată a activității enzimelor, iar valorile extreme (de regulă în afara intervalului de pH= 5-9) produc chiar denaturarea acestora. De aceea ajustarea pH-ului se face la pH-metru și nu cu ajutorul hârtiei indicatoare. Acest lucru se face sub agitare continuă, utilizând soluții acide sau alcaline, soluții diluate care se adaugă cu picătura pentru a evita o modificare prea puternică a pH-ului în zona de contact din jurul picăturii.

Și modificarea tăriei ionice a mediului are influență asupra capacității catalitice a enzimelor prin afectarea structurii chimice a biocatalizatorului. Acest lucru se explică prin faptul că enzimele au, în general, o structură compactă în care resturile polare sunt orientate spre exterior în marea lor majoritate interacționând cu dipolii apei. Forța ionică a mediului poate perturba stratul apos din imediata vecinătate a moleculei enzimatice. În mod similar pot acționa și unii agenți tensioactivi utilizați în scopul solubilizării enzimelor fixate în membranele biologice ale diferitelor structuri subcelulare. Și prezența în mediu, chiar în concentrații mici, a inhibitorilor și activatorilor influențează capacitatea catalitică a enzimelor.

Un factor extern ce poate influența puternic activitatea enzimelor îl reprezintă contaminarea microbiană, motiv pentru care operațiunile de separare și purificare trebuie efectuate cât mai repede posibil.

În cercetările de enzimologie se utilizează soluții preparate în apă distilată sau bidistilată (în funcție de enzimă), iar reactivii folosiți trebuie să aibă un grad de purificare cât mai înalt posibil. De regulă se folosesc reactivi din categoria chimic pur (c.p.) și reactiv pentru analiză (p.a.)

Enzimologia în zilele noastre

Multe întrebări referitoare la detaliile mecanismelor enzimatice și relațiile dintre activitatea și structura enzimelor sunt încă fără răspuns. Cristalografia cu raze X rămâne una dintre metodele de rutină pentru rezolvarea structurii enzimelor libere sau complexate. În plus, noile metode de rezonanță magnetică nucleară și metodele de transfer ale magnetizării fac posibilă determinarea structurii tridimensionale a enzimelor mai mici în soluție și a liganzilor care se leagă de acestea.

Aplicarea difracției Laue cu ajutorul surselor de radiație sincrotronice oferă noi perspective în determinarea structurii intermediarilor în timpul reacției enzimatice, conducând astfel la o imagine detaliată a pașilor individuali din cadrul actului catalitic. Alte metode biofizice – optice (dicroismul circular, spectroscopia în UV-vizibil sau de fluorescență) sau spectroscopia vibrațională (IR) sunt de asemenea folosite pentru clarificarea unor aspecte referitoare la structura enzimelor și reactivitatea lor în soluție. Îmbunătățirea acestor tehnici a determinat folosirea lor frecventă în enzimologie. Mai mult, tehnicile de biologie moleculară permit cercetătorilor să cloneze și să reprezinte enzimele cu eficiență ridicată în diverse organisme gazdă.

Cercetătorii pot să facă mutații genetice în lanțul de aminoacizi ai proteinei (sau în particular ai enzimei). Aceste mutații (a unui singur aminoacid sau a unui segment dintr-un lanț polipeptidic) permit cercetătorilor să localizeze grupările chimice care participă la legarea substratului și la diferitele etape din cadrul catalizei enzimatice. Enzimele sunt utilizate în zilele noastre la diverse aplicații ca: sinteza chimică, industria detergenților și truse de curățare a lentilelor de contact. Unul dintre cele mai importante aspecte ale enzimologiei moderne constă în utilizarea inhibitorilor enzimelor în industria farmaceutică drept medicamente pentru medicina umană și veterinară. Multe din aceste medicamente acționează asupra unor enzime care sunt asociate cu diferite boli. Aspirina, una dintre cele mai folosite medicamente pe plan mondial, este un antiinflamator care inhibă activitatea enzimatică a prostaglandin sintazelor. Enzimele sunt parte integrantă a patalogiei umane. Design-ul unor inhibitori a permis combaterea activității unor enzime (tabelul 1.1.). Acești inhibitori pot fi folosiți drept agenți terapeutici.

Tabel 1.1. Exemple de inhibitori folosiți drept medicamente

Sursă: Realizat de autor pe baza informațiilor disponibile pe site-ul online https://robi74ro.files.wordpress.com/2010/03/bd-curs91.pdf, accesat la data de 13.03.2016

!!! Concluzie de sfarsit de capitol

Capitolul 2. Chimia enzimelor

Datorită numărului crescut al enzimelor descoperite și caracterizate până în prezent precum și al confuziilor create prin denumirea arbitrară a multor enzime a apărut necesitatea elaborării unei terminologii unitare, unanim acceptate și utilizată de toți enzimologii.

În literatura de specialitate mai veche, se întâlnesc denumiri ale unor enzime care nu dau nici o informație asupra reacției catalizate, ca de exemplu: fermen glucozic, invertina, diaforaza, dublu-ferment, enzima de condensare etc. Pentru o singură enzimă apăreau, uneori, două sau mai multe denumiri, ceea ce în mod inevitabil crea confuzii. Astfel, se impunea realizarea unei clasificări raționale a enzimelor pe baza căreia să fie efectuată și nomenclatura lor.

Deși au existat o mulțime de încercări de clasificare a enzimelor (Parnas, 1942; Hoffman-Ostenhoff, 1948; Dixon și Webb, 1958) până în 1958 nu sa reușit obținerea unor scheme satisfăcătoare. Uniunea Internațională de Biochimie a decis la cel de-al III-lea Congres Internațional de Biochimie (Bruxelles, 1955) înființarea unei Comisii Internaționale de Enzimologie a cărei sarcină era elaborarea unei clasificări și nomenclaturi a enzimelor și coenzimelor, stabilirea de simboluri matematice pentru studiile de cinetică enzimatică și standardizarea unităților de exprimare a activităților enzimatice. În 1964 a fost adoptată oficial clasificarea și nomenclatura enzimelor.

Natura chimică a enzimelor

S-a presupus încă din secolul al XIX-lea că enzimele sunt substanțe proteice. Această presupunere se baza pe faptul că o serie de factori ca: temperatura, acizii, bazele, unele săruri și unele substanțe toxice care produceau denaturarea substanțelor proteice aveau efect și asupra activității enzimelor. După intensitatea sau concentrația lor, acești factori puteau să slăbească activitatea enzimelor sau să o distrugă complet. În afară de paralelismul constatat între denaturarea substanțelor proteice și inactivarea enzimelor prin diferiți factori arătați s-a stabilit că reacțiile de culoare caracteristice, date de substanțele proteice, erau date și de preparatele enzimatice.

Metodele de purificare a preparatelor enzimatice s-au perfecționat foarte mult în prima jumătate a secolului al XX-lea prin folosirea metodelor de absorție și eluție de către Willstatter și echipa sa. Aplicându-se tehnica absorbției și eluției pe diferiți absorbanți s-au obținut preparate enzimatice foarte active față de materialul de bază de la care s-a pornit. Lucrările cele mai importante au fost efectuate pentru purificarea invertazei din drojdie. S-a constatat faptul că în cazul unor preparate enzimatice pe măsură ce creștea gradul de purificare, creștea activitatea și slăbeau sau chiar dispăreau reacțiile specifice date de substanțele proteice. Aceste constatări l-au determinat pe Willstatter să nu admită natura proteică a enzimelor și să considere substantele proteice ca substanțe inerte, însoțitoare, ce se găsesc alături de enzime datorită modului de extracție a enzimelor. În perioada în care Willstatter combătea natura proteică a enzimelor (1920-1930), J. Summer a reușit să obțină ureaza în stare cristalizată (1926) din boabele unui soi de fasole (Canaxalia ensiformis).

După urează a doua enzimă obținută în stare cristalizată a fost pepsina. Pepsina a fost obținută în stare cristalizată de J, H. Northrop în anul 1930. Numărul enzimelor ce pot fi obținute în stare cristalizată a crescut apoi repede și până în anul 1952 numărul lor se ridica la 50. Toate enzimele obținute până acum în stare de puritate înaintată s-au dovedit a fi substanțe proteice. Părerea generală admisă azi este că toate substanțele produse de celula vie și care se comportă în acțiunea lor catalitică ca enzime sunt substanțe proteice.

Ipoteza lui Willstatter că enzimele nu sunt substanțe proteice a fost reexaminată cu enzimele cristalizate și de puritate foarte înaintată. S-a demostrat că cristalele enzimelor se diluează la concentrațiile corespunzătoare activităților preparatelor lui Willstatter, ele nu mai dau reacții de culoare specific proteinelor din cauza gradului de diluare foarte mare.

Enzimele fiind substanțe proteice, chimia lor este identică cu chimia substanțelor proteice. Reacțiile catalizate de enzime se pot trata din punct de vedere cinetic și termodinamic ca orice fenomen de cataliză neenzimatic anorganic sau organic.

Nomenclatura enzimelor

Dacă se urmărește istoric dezvoltarea unei științe se constată că problemele de clasificare și nomenclatură ocupă un loc de seamă. Prin studii și cercetări se acumulează treptat material experimental care devine cu timpul mult mai abundend și mai divers. Prezentarea acestui material în ordine cronologică, așa cum a fost el descoperit are nevoie de anumite reguli și de anumite criterii de sistematizare.

Criteriile de sistematizare și de nomenclatură se deduc și se aleg din studiul critic al materialului acumulat prin cercetare. Aceste criterii pun în evidență concepțiile cercetătorilor și nivelul lor științific față de respectiva etapă a dezvoltării științei în cauză.

Progresele chimiei organice, biochimiei, matematicii, fizicii în obținerea enzimelor și studiul reacțiilor catalizate de acestea au condus la un sistem de clasificare și numerotare a enzimelor și la o nouă nomenclatură sistematică. Acest lucru se impunea cu necesitate deoarece pentru aceeași enzimă se foloseau mai multe denumiri (amilaza=invertaza=diastaza=sucraza).

Criteriile folosite pentru nomenclatură fiind diferite și definiția era diferită de la autor la autor. Fiecare enzimă se caracterizează printr-un cod format din 4 cifre separate între ele prin puncte ce au anumite semnificații și care se scriu în fața numelui fiecărei enzime. Enzimele se structurează în mai multe clase:

E.C.1.-.-.- clasa oxidoreductazelor

E.C.2.-.-.- clasa transferazelor

E.C.3.-.-.- clasa hidrolazelor

E.C.4.-.-.- clasa liazelor

E.C.5.-.-.- clasa izomerazelor

E.C.6.-.-. clasa ligazelor.

EC A. B. C. D

Prima cifră indică clasa din care face parte enzima.

A doua cifră (B) se referă la subclasa din care face parte enzima (subclasa enzimatică). În clasa hidrolazelor spre exemplu, se pot menționa subclasele: esteraze, glicozidaze, amidaze.

A treia cifră (C) se referă la subdiviziuni din interiorul subclaselor și indică de obicei natura chimică a substratului, natura receptorului (numărul substratului specific sau al cofactorului enzimatic). În subclasa esterazelor există mai multe grupe de enzime ce acționează numai asupra anumitor substraturi (exemplu: fosfolipazele acționează numai asupra fosfolipidelor, tanazele asupra taninurilor).

A patra cifră (D) indică poziția sau numărul de ordine al enzimelor în diferite subclase și grupuri. În cazul în care unele subdiviziuni sau unele reacții chimice nu se pot defini precis se utilizează și altele, reprezentate în cod prin cifra 99.

Enzimele care catalizează reacții similare, dar nu identice, conțin în codul prin care sunt caracterizate primele 3 numere de cod identice, distincția între ele făcându-se prin al patrulea număr de cod.

IZOENZIMELE sunt enzime diferite care catalizează reacții identice, prezintă cele patru numere de cod identice.

Exemplu: LACTAT DEHIDROGENAZA : 5 izoenzime diferite care au același cod.

Numele sistematic al enzimelor indică natura substratului, cea a acceptorului și tipul reacției catalizate

Exemplu: EC 2.7.3.2.

NUME SISTEMATIC: ATP creatin fosfotransferaza, unde:

2- clasa enzimatică (transferaze);

7 –denumirea subclasei (fosfotransferaze);

3 –subclasa (fosfotransferaze cu o grupare acceptoare conținând azot);

2 – numărul de ordine al enzimei (creatin kinaza).

Când enzima provoacă două modificări în substrat atunci cea de a doua funcție se trece în paranteză.

Clasificarea enzimelor

Ținând seama de specificitatea de reacție enzimele cunoscute până în prezent se împart în șase clase și fiecare clasă în subclase care definesc mai precis caracterul reacției enzimatice respective . Clasificarea propusă în 1964 de către Comisia de Enzimologie a Uniunii Internaționale de Biochimie are la bază tipul și mecanismul reacției catalizate.

1) E.C.1.-.-.- clasa oxidoreductazelor – catalizează reacțiile de oxido-reducere implicând transfer de proton sau electron;

2) E.C.2.-.-.- clasa transferazelor – catalizează reacțiile de transfer ale unor grupări specifice, resturi de molecule de pe un substrat donor pe un substrat acceptor;

3) E.C.3.-.-.- clasa hidrolazelor – catalizează reacțiile de hidroliză a moleculelor de substrat;

4) E.C.4.-.-.- clasa liazelor – catalizează reacțiile de degradare în care nu intervin procesele de hidroliză sau oxido-reducere;

5) E.C.5.-.-.- clasa izomerazelor – catalizează reacțiile de izomerizare și racemizare (rearanjare intramoleculară a atomilor sau grupărilor funcționale din molecula substratului);

6) E.C.6.-.-. clasa ligazelor (sintetazelor) – catalizează reacțiile de sinteză prin condensarea a două molecule cuplate cu scindarea unei legături pirofosforice din ATP sau dintr-un nucleozid trifosfat similar. Deoarece are la bază tipul de reacție pe care îl catalizează o anumită enzimă, această clasificare are un caracter funcțional, nu unul structural.

În 1974, Penasse prezintă următoarea distribuție procentuală a enzimelor cunoscute până atunci între cele șase clase:

oxidoreductaze 25%

transferaze 30%

hidrolaze 24%

liaze 13%

izomeraze 3%

sintetaze 5%

Clasificarea enzimelor în funcție de reacția pe care o catalizează este prezentată în tabelul următor (tabelul 2.1.)

Tabelul 2.1. Clasificarea enzimelor

Sursa: Realizat de autor pe baza informațiilor disponibile online pe site-ul http://www.docfoc.com/enzime-5634f943970b1, accesat la data de 13.03.2016

Clasificarea clasei oxidoreductazelor

Din numărul total de enzime cunoscute până în prezent, aproximativ 25 % sunt enzime ce catalizează diferite reacții de oxidare și de reducere biologică aparținând clasei oxidoreductazelor. Acestea sunt implicate, în principal, în procesele de oxidare biologică și catalizează reacții bimoleculare:

Denumirea sistemică a oxidoreductazelor se alcătuiește prin includerea denumirii donorului și acceptorului de hidrogen urmate de termenul oxidoreductază (donor: acceptor – oxidoreductază). Atunci când acceptorul de hidrogen este oxigenul se folosește termenul de oxidază. Spre exemplu denumirea sistemică a alcooldehidrogenazei este alcool: NAD+ – oxidoreductază (EC 1.1.1.1), catalaza are denumirea sistemică H2O2:H2O2 – oxidoreductază (EC 1.11.1.6). În același timp, Uniunea Internațională de Biochimie permite și utilizarea așa-numitelor denumiri de lucru prescurtate: alcooldehidrogenaza, malat – dehidrogenaza etc.

O enzimă importantă din această clasă este lactat – dehidrogenaza (L-lactat: NAD+- oxidoreductaza (EC 1.1.1.27) ce catalizează reacția de conversie a acidului lactic în acid piruvic:

Figura 2.1. Reacția de conversie a acidului lactic în acid piruvic

Această reacție este implicată în fermentațiile lactice precum și în procesul anaerob de degradare a glucidelor prin glicoliză. Determinarea activității acestei enzime în sânge este utilizată în practica medicală pentru diagnosticul infarctului de miocard, a hepatitei virale, a anemiei pernicioase.

Reacțiile enzimatice catalizate de oxidoreductaze care posedă în calitate de coenzimă NAD+ sau NADP+ sunt de obicei reacții reversibile cuplate cu alte reacții de regenerare a coenzimei. În prima reacție coenzima, care are și rol de cosubstrat, se reduce, iar în reacția cuplată (conjugată) se regenerează forma oxidată a coenzimei:

Figura 2.2. Reacții enzimatice catalizate de oxidoreductaze

Aceste reacții conjugate prezintă o deosebită importanță pentru procesele redox ce au loc în celulele vii deoarece permit refacerea continuă a acceptorilor de hidrogen.

Caracterizarea clasei transferazelor

În transformările biochimice catalizate de enzimele aparținând acestei clase, are loc scindarea unei grupe de atomi R (ce poate fi și grupare funcțională) din structura substratului A-R și fixarea acesteia pe cel de-al doilea substrat:

Reacțiile catalizate de transferaze sunt prin urmare reacții bimoleculare, în care un substrat joacă rol de donor, iar celălalt joacă rol de acceptor al grupării transferate. Din această cauză denumirea sistemică a acestor enzime este de tipul donor: acceptor – transferază.

Dintre enzimele cunoscute până în prezent, aproximativ 30% sunt transferaze. Din această clasă de enzime fac parte (de exemplu aminotransferazele) enzime ce catalizează reacția unui α-aminoacid cu un α-cetoacid, conducând la formarea unui nou aminoacid și a unui nou cetoacid. Din punctul de vedere al mecanismului de reacție, această transformare poate fi considerată ca fiind o dezaminare oxidativă a donorului (aminoacidul) cuplată cu aminarea reductivă a acceptorului (cetoacidul), iar aminotransferazele ar putea fi considerate și ca oxidoreductaze:

Figura 2.3. Schema reacției generale catalizată de aminotransferază

Caracterizarea clasei hidrolazelor

Această clasă conține aproximativ 24% din enzimele cunoscute până în prezent, enzime ce catalizează reacția de scindare a substratului cu participarea apei:

S-R + H2O ↔ S-OH + R-H

Deși reacțiile sunt reversibile, in vivo echilibrele sunt deplasate în sensul hidrolizei, în timp ce procesele inverse au loc, de regulă, pe alte căi metabolice. Reacții hidrolitice se întâlnesc în aproape toate căile metabolice, hidrolazele participând atât la metabolismul glucidelor, lipidelor, proteinelor, cât și în metabolismul produșilor secundari.

Clasificarea hidrolazelor în subclase și subsubclase se face în funcție de natura legăturii chimice ce urmează a fi scindată. Pentru hidrolazele implicate în scindarea hidrolitică a diferitelor tipuri de esteri este intrată în uz denumirea generică de esteraze. O esterază foarte cunoscută este lipaza a cărei denumire sistemică este triacilglicerol-acil-hidrolaza (EC 3.1.1.3) și care este implicată în scindarea hidrolitică a triacilglicerolilor:

Figura 2.4. Scindarea hidrolitică a triacilglicerolilor în glicerol și acizi grași

Spre deosebire de celelalte enzime, lipaza prezintă o particularitate legată de natura substratului asupra căruia acționează, mai exact a lipidelor care sunt insolubile în apă. In vivo are loc mai întâi o emulsionare a grăsimilor (care în cazul animalelor se realizează cu ajutorul bilei secretată de ficat) și în felul acesta crește suprafața de contact dintre faza liposolubilă a substratului și cea hidrosolubilă a enzimei. Din această cauză viteza inițială de reacție este dependentă de numărul de molecule enzimatice absorbite la interfază. Ulterior, după formarea primelor molecule de acizi grași, viteza de reacție crește datorită emulsionării mai rapide a substratului, moleculele de acizi grași având zone cu proprietăți hidrofobe și hidrofile (R-COO–).

Din aceeași clasă fac parte cele două fosfomonoesteraze (fosfataze), alcalină și acidă cu denumirile sistemice ortofosfat-monoester-fosfohidrolaza (pH optim alcalin) (EC 3.1.3.1) și respectiv ortofosfat-monoester-fosfohidrolaza (pH optim acid) (EC 3.1.3.2). Fosfataza alcalină catalizează scindarea hidrolitică a esterilor acidului ortofosforic ai alcoolilor primari, secundari, ciclici și fenolilor dar nu și fosfodiesterii. Fosfataza acidă hidrolizează un mare număr de fosfomonoesteri, fosfoproteine și altele:

Figura 2.5. Scindarea hidrolitică a esterului β- glicerofosfat de către fosfatază în glicerol și acid fosforic

Aceste două enzime prezintă o importanță deosebită din punct de vedere medical, activitatea lor fiind determinată în sânge în scopul diagnosticării litiazelor biliare și a diferitelor afecțiuni hepatice, respectiv a unor boli ale prostatei.

Un rol extrem de important în procesul complex de reînnoire a proteinelor structurale îl joacă o serie de proteinaze tisulare reunite sub numele de catepsine. În prezent se cunosc mai multe catepsine notate cu majuscule ale alfabetului latin (exemplu A, B, C, D, E etc.) ce se deosebesc între ele după specificitatea de substrat, pH-ul optim de acțiune și alte criterii.

O grupă de enzime proteolitice extrem de intens studiată în ultima vreme este reprezentată de caspazele (cysteinil – aspartate – cleaving proteases), cistein-proteinase responsabile de distrugerea progresivă a celulei prin apoptoză. Moartea celulară programată este parte integrată a fiziologiei normale a unui organism. Astfel, în cursul numeroaselor mitoze și diferențieri celulare care permit crearea unui organism pornind de la stadiul de ou este necesară eliminarea celulelor inutile sau potențial periculoase. Acest fenomen de eliminare selectivă a celulelor este mediat printr-un proces denumit apoptoză (termenul provine de la grecescul , ce înseamnă „căderea frunzelor”).

Noțiunea de apoptoză a fost introdusă în 1972 într-un articol publicat în British Journal of Cancer de către John F. Kerr de la Universitatea din Queensland (Australia) împreună cu Andrew H. Wyllie și Alastair R. Currie de la Universitatea din Aberdeen (Scoția) pentru a indica o formă de moarte celulară total diferită de necroză, atât din punct de vedere morfologic, cât și din punct de vedere biochimic.

Apoptoza se întâlnește la toate tipurile de celule vegetale sau animale, uni- sau pluricelulare, până la nivelul mamiferelor superioare.

O dereglare de la moartea celulară programată poate sta la originea numeroaselor stări patologice; unele sunt legate de o inhibiție a apoptozei (cancer, sindrom limfoproliferativ), în timp ce altele sunt asociate cu o stimulare a acestui fenomen (SIDA, maladiile neurodegenerative, maladiile auto-imune).

În cursul apoptozei celulele pun în evidență un ”mecanism de sinucidere” care se traduce prin numeroase schimbări morfologice: membranele plasmatice se dezorganizează și exprimă semnale pro-fagocitare alcătuind corpii apoptotici, cromatina se condensează înainte de a fi degradată într-un profil caracteristic numit “treptele scării”. Corpii apoptotici formați sunt apoi rapid eliminați de către celulele adiacente. Această eliminare este primordială întrucât ea nu permite lăsarea nici unei urme în țesutul de unde provine apoptoza, în particular, prevenind toate necrozele secundare care vor avea drept consecință eliberarea aleatorie a conținutului celular și va permite astfel limitarea stabilirii unei reacții inflamatorii.

Necroza și apoptoza

Necroza este considerată ca o moarte celulară dezordonată. În fapt, în cursul necrozei celulele acumulează apă astfel încât antrenează liza membranei plasmatice. Această veritabilă explozie celulară conduce la redetașarea în mediul înconjurător a conținutului citoplasmatic. Organitele vor avea, de asemenea, tendința de a se umfla, iar ADN-ul nuclear va fi degradat în manieră „aleatorie” de endoglucanaze activate (mai ales serin-proteinaze). În opoziție cu necroza, apoptoza este considerată ca o moarte celulară „ordonată” acționând în diferite faze. Mai întâi celulele în apoptoză vor fi izolate de alte celule (dispare contactul între celule).

Unul din punctele morfologice caracteristice apoptozei este importanța condensării simultane a nucleului și a citoplasmei ce induce o diminuare semnificativă a volumului celular. Mitocondriile celulelor apoptotice vor suferi mai multe modificări majore, dintre acestea amintim detașarea citocromului c în citoplasmă, diminuarea potențialului membranar și modificarea permeabilității mitocondriale care permite deschiderea porilor specializați.

Nucleul se condensează, apoi cromatina este clivată în fragmente regulate de aproximativ 180 pb. Astfel, membrana plasmatică va înmuguri și va conduce la formarea corpilor apoptotici reînchizând o parte din citoplasmă în celulă. În scopul de a facilita recunoașterea corpilor apoptotici prin fagocitoză, celulele vor semnala starea lor apoptotică grație schimbărilor de localizare a moleculelor de fosfatidilserină care trec de la o orientare citoplasmatică la una extracelulară. Moartea celulară programată este un proces rapid de câteva ore. Unul din punctele majore ale apoptozei este integritatea membranei plasmatice care nu este niciodată alterată în cursul procesului, ceea ce permite evitarea deversării conținutului celular și astfel, prevenirea tuturor deteriorărilor țesuturilor din jur. Totuși, inflamarea nu este total absentă în timpul apoptozei (având în vedere externalizarea IL-1 și IL -18 în mediul înconjurător) însă este vorba de o inflamare regulată.

Caracterizarea clasei liazelor

Din această clasă fac parte enzimele ce catalizează reacții de rupere a unor legături carbon-carbon sau carbon-heteroatom din molecula substratului, fără participarea apei dar cu rearanjarea ulterioară a valențelor. Pentru majoritatea enzimelor din această clasă, denumirea sistemică se face prin adăugarea termenului liaza la numele substratului asupra căruia acționează enzima respectivă. Atunci când reacția inversă este mai importantă din punct de vedere metabolic sau atunci când s-a demonstrat doar existența acesteia, se poate utiliza și denumirea de sintază (dar nu sintetază). Pentru liazele ce catalizează unele reacții particulare sunt utilizate denumirile triviale: decarboxilază, aldolază, dehidratază etc.

Dintre enzimele cunoscute până în prezent, liazele reprezintă aproximativ 13%. Împărțirea liazelor în subclase se face în funcție de natura legăturii chimice pe care acestea o scindează. Astfel, subclasa 4.1. cuprinde enzimele ce catalizează ruperea legăturilor carbon-carbon: decarboxilazele (4.1.1), aldehid-liazele (4.1.2), hidroxiacid-liazele (4.1.3) etc. În mod similar, subclasa 4.2. conține carbon-oxigen-liazele, subclasa 4.3. – carbon-azot-liazele ș.a.m.d.

O categorie importantă de enzime din această clasă o reprezintă aldolazele, enzime ce catalizează diferite reacții de condensare aldolică. Astfel, fructozo-difosfat-aldolaza, a cărei denumire sistemică este D-fructozo – 1 , 6 – difosfat – D – gliceraldehid – 3 – fosfat – liaza (EC 4.1.2.13) catalizează o reacție importantă a căii glicolitice și a fotosintezei:

Figura 2.6. Cataliza scindării enzimatice a D-fructozo-1,6-difosfatului

Caracterizarea clasei izomerazelor

Această clasă reunește aproximativ 3% din enzimele cunoscute până în prezent, enzime ce catalizează diferite reacții de izomerizare. Procesul catalitic propriu-zis constă în inducerea unor rearanjări interne ale atomilor din molecula substratului în urma cărora au loc modificări geometrice sau structurale. În funcție de tipul reacției de izomerizare catalizată, izomerazele pot fi împărțite în racemaze, epimeraze, cis-trans-izomeraze, tautomeraze etc.

Este cunoscut faptul că marea majoritate a organismelor vii conțin monozaharide ce aparțin seriei D, respectiv L-aminoacizii, întrucât unele microorganisme conțin și antipozii optici, pentru acestea racemazele joacă un rol deosebit. Astfel, au fost descoperite și studiate alanin-racemaza (EC 5.1.1.1), metionin-racemaza (EC 5.1.1.2), glutamat-racemaza (EC 5.1.1.3) etc. Două izomeraze extrem de importante pentru participarea vitaminei A în procesul vederii sunt retinal-izomeraza cu denumirea sistemică all-trans-retinal-11-cis-trans-izomeraza (EC 5.2.1.3) și respectiv retinol-izomeraza, sau all-trans-retinol-11-cis-trans-izomeraza (EC 5.2.1.7) ce catalizează conversia formei trans a retinalului în izomerul 11-cis și respectiv izomerul trans al retinolului în forma 11-cis.

O etapă importantă a secvenței metabolice Embden-Meyerhof-Parnas o constituie izomerizarea reversibilă a celor două trioze fosforilate rezultate prin scindarea fructozo-1,6-difosfatului sub acțiunea aldolazei. Sub acțiunea triozo-fosfat-izomerazei are loc conversia permanentă a dihidroxiaceton-fosfatului în aldehida 3-fosfoglicerică. Denumirea sistemică a enzimei este D-gliceraldehid-3-fosfat-cetol-izomeraza (EC 5.3.1.1).

Figura 2.7. Conversia dihidroxiaceton-fosfatului în D-gliceraldehid-fosfat

Caracterizarea clasei ligazelor (sintetazelor)

Această clasă cuprinde aproximativ 5% din enzimele cunoscute până în prezent, liazele catalizând reacții de formare a unor noi legături carbon-carbon sau carbon-heteroatom. De regulă, aceste reacții au loc cu consum de energie, ele fiind cuplate cu reacții de hidroliză ale ATP-ului sau ale altor nucleozidtrifosfați. Denumirea sistemică se face prin adăugarea termenului ligaza la numele substratului, sau a termenului sintetaza la numele produsului de reacție.

O grupă importantă de enzime ce face parte din această clasă o constituie aminoacil-ARNt-sintetazele, enzime ce catalizează reacțiile de activare ale aminoacizilor din procesul de biosinteză a proteinelor. Aceste enzime prezintă o înaltă specificitate de substrat, existând câte o sintetază pentru fiecare aminoacid proteinogen: tirozil-ARNt-sintetaza sau L-tirozin-ARNttyr-ligaza (EC 6.1.11), triptofan-ARNt-sintetaza cu denumirea sistemică L-triptofanil-ARNttrp-ligaza (EC 6.1.1.2), treonin-ARNt-sintetaza sau L-treonil-ARNt- ligaza (EC 6.1.1.3) ș.a.m.d.

Formarea complexului aminoacil-ARNt este un proces complex ce se realizează în două etape catalizate de aceeași enzimă. Procesul debutează prin activarea aminoacidului cu ajutorul energiei din ATP:

Figura 2.8. Formarea enzimatică a complexului aminoacil-AMP

Se formează deci complexul hipereactiv dintre enzimă și două din cele trei substraturi, adică aminoacidul ce urmează a se activa și molecula de ATP. Acest complex interacționează în etapa următoare cu cel de-al treilea substrat care este ARNt –ul specific aminoacidului activat:

Figura 2.9. Formarea enzimatică a complexului aminoacil-ARNt

Extracția enzimelor

Pentru a înțelege comportarea enzimei, în detaliu, într-un sistem complex este necesară identificarea proprietăților enzimei în cel mai simplu sistem posibil. În cele mai multe cazuri enzimele se întâlnesc sub următoarele forme: enzime exocelulare (sistemul simplu este constituit dintr-o soluție enzimatică care conține și mici cantități de ioni, molecule tampon, cofactori etc.) și enzime endocelulare.

Extracția enzimelor presupune alegerea unei strategii cu privire la proveniența sursei enzimatice. Pentru studierea proprietăților structurale sau/și biochimice ale unei enzime trebuie aleasă sursa care răspunde cel mai bine cerințelor de izolare cu o activitate catalitică maximă adică, enzima prezentă să nu fie degradată sau inactivată și să fie de puritate maximă posibilă adică, nu trebuie să conțină alte enzime sau molecule mari. Dacă se urmărește și purificarea enzimei, scopul purificării trebuie să fie obținerea unui preparat cu un randament bun.

Strategia de alegere a unui material biologic pentru extragerea unei enzime utilizabile în diferite scopuri sau pentru studiul ei este necesar să se țină cont de o serie de factori cum sunt:

abundența enzimei;

disponibilitatea și prețul de cost;

localizarea intracelulară;

caracterizarea sursei;

studii comparative.

În toate etapele de alegere a sursei trebuie să se aibă în vedere și stabilitatea enzimei și posibilele dificultăți întâlnite în manipularea sursei.

Există numeroase metode de extracție a enzimelor. Alegerea metodei este în strânsă legatură cu natura țesutului, natura organismului sau natura mediului utilizat ca sursă enzimatică.

În cele mai multe cazuri materialele biologice folosite permit obținerea de soluții clare sau aproape clare de protein sau de enzime. Ele pot fi obținute prin simple procedee de filtrare sau centrifugare datorită faptului că enzimele sunt de cele mai multe ori libere în solventul apă, materialul biologic respectiv. Extracția și purificarea unei proteine particulare dintr-o sursă solidă implică cel mai adesea un compromis între gradul de recuperare și puritatea acesteia.

Dezintegrarea celulelor sau țesuturilor și eliberarea conținutului acestora în mediul de extracție se poate realiza printr-o serie de metode specifice. În anumite cazuri se preferă sau este necesară dezintegrarea țesuturilor și prepararea unor populații omogene de celule intacte înainte de ruperea membranelor celulare.

Alegerea metodei de dezintegrare depinde de sursa și de tipul de țesut sau organ utilizat ca sursă de izolare a enzimei.

Metode spectrofotometrice de determinare a activității enzimatice

Metodele spectrofotometrice se bazează pe proporționalitatea ce poate exista între extincția E (densitatea optică D.O. sau absorbanța A) a unei soluții, produsul dintre concentrația soluției respective (c) și drumul optic (d) adică, grosimea stratului de soluție pe care lumina o străbate:

E (sau D.O.) = ε·c·d

unde: ε este coeficientul de extincție molară, adică extincția substanței respective aflată în soluție într-o concentrație de 1 molar atunci când drumul optic este de 1 cm.

Cea mai mare sensibilitate în determinarea unui compus prin metode spectrofotometrice se situează la lungimea de undă corespunzătoare absorbției maxime. De aceea determinările se fac la lungimi de undă bine stabilite în funcție de spectrul de absorbție. Aceste metode pot fi pe deplin realizabile deoarece este practic imposibil ca atât substratul, cât și produsul de reacție să posede același spectru de absorbție. În foarte multe situații se determină direct extincția substratului sau a produsului de reacție la o lungime de undă bine determinată, acesta fiind situată în ultraviolet, domeniul vizibil sau chiar domeniul infraroșu.

De cele mai multe ori se folosesc metode în care substratul sau produsul de reacție formează complecși colorați cu reactivi specifici, iar intensitatea culorii este direct proporțională cu concentrația substanței respective. În asemenea situații se determină densitatea optică a acestui compus colorat la o lungime de undă din domeniul vizibil.

Calculul rezultatelor în toate metodele spectrofotometrice se face fie prin utilizarea unei soluții etalon (standard), fie prin trasarea unei curbe de etalonare.

Capitolul 3. Aplicații ale oxidoreductazelor

Acest capitol prezintă principalele aplicații ale tirozinazei și lacazei în diverse domenii, ale enzimelor imobilizate, precum și cele mai importante oxidoreductaze întâlnite în biotehnologiile alimentare.

3.1. Aplicații ale tirozinei și lacazei: biosenzori enzimatici electrochimici

Tirozinaza (EC 1.14.18.1) și lacaza (EC1.10.3.2) sunt enzime care se întâlnesc în bacterii, fungi, plante și animale. Acestea sunt fenol-oxidaze și necesită pentru oxidare oxigen molecular. Aplicabilitatea acestor enzime în vederea obținerii de biosenzori și bioreactoare enzimatice este de mare importanță în domeniul cercetării medicale și în special în biotehnologii, datorită combinării unor materiale la dimensiuni micrometrice sau nanometrice cu unele biomolecule.

Tirozinaza este o enzimă care posedă două situsuri catalitice: unul pentru hidroxilarea fenolilor (activitate cresolazică) și cel de-al doilea pentru oxidarea difenolilor până la chinone (activitate catecolazică), ambele situsuri fiind active în prezența oxigenului molecular. În figura 3.1. este prezentată oxidarea L-tirozinei până la L-DOPA chinonă în prezența tirozinazei.

Figura 3.1. Oxidarea L-tirozinei până la L-DOPA chinonă

în prezența tirozinazei

Tirozinaza este o metaloenzimă care posedă la nivelul situsului activ enzymatic doi ioni de cupru care sunt coordinați fiecare prin intermediul unui număr de trei resturi histidinice din lanțul polipeptidic enzimatic. Acțiunea oxidoreductazică a tirozinei este asigurată de transferul reversibil al electronilor prin intermediul ionilor de cupru (Cu+; Cu2+). În oxidarea tirozinei, în prezența tirozinazei se obțin doi intermediari metabolici (L-DOPA și L-DOPA-chinonă). În sistemele vii, L-DOPA-chinonă se transformă necatalitic în melanină, în urma unor reacții de condensare intramoleculară, oxidare și polimerizare.

Figura 3.2. Transformarea L-DOPA-chinonei în

melanină

Tirozinaza face parte din subclasa polifenol oxidazelor și prezintă specificitate față de substraturi derivate din fenol: catecoli, crezoli, dopamină, epinefrină etc. Datorită acestor caracteristici, tirozinaza poate fi utilizată pentru evidențierea analitică a fenolilor în alimente, mediu, probe clinice.

Studiile de specialitate au demonstrat importanța utilizării biosenzorilor pentru detectarea nivelului dopaminei din creier, și astfel diagnosticarea și prevenirea evoluției bolii Parkinson.

Lacaza este o oxidoreductază care posedă la nivelul situsului catalitic patru atomi de cupru (metaloenzimă). Enzima catalizează oxidarea fenolilor, aminelor aromatice, metoxifenolilor, aminofenolilor cuplată cu reducerea oxigenului molecular până la apă, în absența peroxidului de hidrogen. În figura 3.3 este prezentată oxidarea catecolului în prezența lacazei.

Figura 3.3. Oxidarea catecolului catalizată de lacază

Întrucât există mai multe surse de proveniență a lacazelor, acestea prezintă câteva deosebiri în ceea ce privește greutatea moleculară (dimeri sau tetrameri), capacitatea de oxidare, pH-ul specific de acțiune și substratul specific asupra căruia acționează.

Aplicațiile lacazei sunt variate: sinteza organică, albirea biologică, producerea vinului, industria farmaceutică, depoluarea apelor, mineralizarea unor coloranți sintetici.

O altă aplicație a lacazei este cea de generare de iod în situ prin oxidarea iodurilor și producerea de iod, care este un dezinfectant folosit pe scară largă. Imobilizarea lacazei poate oferi posibilitatea dezvoltării unor biosenzori, optimizarea metodelor de diagnosticare folosite în medicină și identificarea diverșilor poluanți din mediu.

Aplicațiile cel mai des întâlnite ale celor două enzime, tirozina și lacaza, în laboratoarele de analiză sunt: biosenzorii enzimatici și biosenzorii enzimatici electrochimici.

Biosenzorii enzimatici

O alternativă pentru a ușura analiza de rutină a produselor industriale sau în laboratoarele de analiză medicală este utilizarea senzorilor și a biosenzorilor. Senzorii sunt instrumente analitice versatile, bazate pe un traductor (electrochimic, optic, termic, piezoelectric), care traduce informațiile fizico-chimice printr-un semnal măsurabil.

Biosenzorii sunt instrumente analitice, bazate pe combinația unui compus biologic de recunoaștere și un traductor fizic (senzor). Elementul de recunoaștere biologică (cum sunt enzimele, anticorpii, microorganismele) este capabil să interacționze selectiv cu substratul său. Caracteristicile originale transformă tehnologia senzorilor într-o posibilă metodologie care se poate aplica în studiul probelor reale. Unele avantaje cum sunt selectivitatea și specificitatea mare, costul relativ redus de construcție și depozitare, potențialul de miniaturizare, facilitatea de automatizare și portabilitatea echipamentelor permit realizarea unei analize rapide și în afara laboratorului.

Dezvoltarea de biosenzori este descrisă în mai multe lucrări din diferite domenii de aplicații: medicină, mediu, agricultură și biotehnologie.

Modificările fizico-chimice ale compusului biologic activ care rezultă din interacțiunea cu substanța analizată, trebuie să fie transformate într-un semnal de ieșire măsurabil de un traductor adecvat. Pot fi utilizate traductoare general aplicabile, dar nespecifice, care indică parametrii generali, cum ar fi entalpia de reacție (termistor), modificarea de masă (cristal piezoelectric) sau grosimea stratului (reflectometrie). Pe de altă parte, o indicație specifică poate fi obținută cu electrozi electrochimici pentru specii ca H+, HO- , CO2 sau H2O2, sau prin metode optice ca fotometria și fluorimetria sau rezonanța plasmonilor de suprafață.

Biosenzorii enzimatici electrochimici

Un biosenzor electrochimic este un dispozitiv cu un traductor electrochimic, cum sunt senzorii enzimatici amperometrici și potențiometrici.

Biosenzorii enzimatici reprezintă cel mai vechi grup de biosenzori și sunt tot mai mult utilizați pentru testarea clinică a metaboliților, cum ar fi glucoza, creatinina și bilirubina. În prezent biosenzorii amperometrici mai utilizați pe scară largă sunt bazați pe oxidaze care generează H2O2, calea de transducție fiind oxidarea electrochimică a peroxidului format în reacția enzimatică. În acest caz răspunsul electrodului depinde de concentrația oxigenului din mediul de reacție.

În zilele noastre, biosenzorii electrochimici cu tirozinaza și lacaza constituie o tehnologie promițătoare pentru monitorizarea in situ a compușilor fenolici, din cauza avantajelor lor, cum ar fi o selectivitate ridicată, costuri de producție reduse, viteză de răspuns mare, potențial de miniaturizare și instrumentație simplă. În genere, senzorii electrochimici sunt obținuți folosind electrozi din materiale inerte din punct de vedere chimic, cum sunt platina sau aurul, dar și a unor materiale carbonice mult mai ieftine.

Tirozinaza a fost cel mai des folosită pentru obținerea biosenzorilor electrochimici în comparație cu lacaza.

În concluzie, biosenzorii electrochimici cu tirozinază și lacază constituie o tehnologie promițătoare pentru monitorizarea in situ a compușilor fenolici, din cauza avantajelor lor, cum ar fi o selectivitate ridicată, costuri de producție reduse, viteză de răspuns mare, potențial de miniaturizare și instrumentație simplă.

3.2. Aplicații ale enzimelor imobilizate

Aplicațiile practice ale enzimelor imobilizate cuprind un spectru larg de domenii. Aceste domenii pot fi împărțite în trei categorii importante:

domeniul analitic

domeniul terapeutic

domeniul industrial

Aplicațiile analitice pot fi împărțite în două arii: electrozii enzimatici și analizatorii automatici. Electrozii enzimatici sunt electrozi capabili să genereze un potențial electric ca rezultat al reacției catalizate de enzima imobilizată pe sau în jurul electrodului. Primul electrod enzimatic preparat este un electrod sensibil la glucoză. Acesta s-a realizat prin imobilizarea glucozoxidazei într-un gel de poliacrilamidă, fixat apoi în jurul unui electrod de oxigen cu acetat de celuloză. Principiul de funcționare este simplu: enzima catalizează eliminarea oxigenului din soluție cu o viteză dependentă de concentrația de glucoză.

Aplicațiile enzimelor în autoanaliză implică înlocuirea enzimelor solubile existente într-un sistem de autoanaliză cu acestea. Folosirea enzimelor solubile prezintă inconveniențe prin faptul că în fiecare probă de analizat se adaugă câte un solubilizat din enzima liberă, acesta pierzându-se. Alternativa este imobilizarea enzimei respective pe peretele unui tub de polimer prin care se trece proba de analizat. Este necesar totuși în acest caz calcularea dimensiunilor tubului în raport cu rata de curgere a probei. Un avantaj al acestui sistem este faptul că pe aceeași probă se pot face mai multe determinări.

Aplicații terapeutice – Există multe boli care sunt datorate absenței unei anumite enzime, de exemplu o malformație genetică care determină absența unei enzime lisosomale, substratul acesteia acumulându-se în celulă, cu rezultate dezastruoase pentru organism. Funcționarea defectuoasă a țesuturilor, în special a rinichiului și ficatului, poate determina acumularea în organism a unor substanțe toxice, cum este ureea.

Enzimele pot fi utilizate ca agenți terapeutici fie pentru a înlocui enzime proprii ale organismului care lipsesc din cauza unor malformații genetice sau tisulare, fie ca agenți de degradare specifici ai unor metaboliți nedoriți.

Prin injectarea unei enzime solubile de origine microbiană pentru a acoperi carența acestor enzime se poate face mai mult rău decât bine, deoarece enzima este ''non-self'' și determină o reacție alergică care poate fi fatală. Un alt inconvenient este instabilitatea enzimei solubile care va fi rapid dezactivată și eliminată din organism de către sistemul imun.

Imobilizarea enzimei înainte de administrare rezolvă ambele inconveniente prin prevenirea interacțiunii dintre enzimă și sistemul imun al organismului, precum și prin stabilizarea și protejarea enzimei. Cea mai bună metodă de imobilizare în acest caz este microencapsularea într-un material non-antigenic (nylon, coloidon etc.). Deși de cele mai multe ori înlocuirea enzimelor implică reacții simple hidrolitice sau oxidative (ureaza, catalaza etc.), unele deficiențe enzimatice implică enzime complexe (dehidrogenaza, kinaza etc.). În acest caz este necesară introducerea în preparatul enzimatic imobilizat, a sistemelor regenerative NAD / NADH sau ADP / ATP deoarece coenzimele în general nu sunt prezente în mediul extracelular.

În terapia enzimatică enzima ce va fi administrată nu se găsește în condiții normale în organism. Cel mai bun exemplu de terapie enzimatică este tratamentul cu asparaginază a anumitor forme de leucemie. Celulele normale au capacitatea de a sintetiza asparagina, dar unele celule canceroase nu, acestea bazându-se pe surse externe de asparagină pentru dezvoltare. Prin introducerea asparaginazei în fluxul sanguin, nivelul asparaginei este menținut la un nivel minim. Asfel celulele canceroase mor ca urmare a lipsei asparaginei. Asparaginaza trebuie imobilizată într-o formă biodegradabilă, de exemplu prin incluziune într-un liposom sau într-o capsulă de acid polilactic.

Aplicații industriale – În aplicațiile industriale pentru a transforma o substanță organică în produși de reacție utili există trei posibilități:

transformări chimice

fermentații cu celule microbiene întregi

reacții catalizate enzimatic

Unele transformări chimice sunt în practică fie prea costisitoare, fie prea dificil de realizat din punct de vedere tehnic. De exemplu sinteza chimică a antibioticelor este impracticabilă, la fel și extracția chimică a lactozei din lapte.

Fermentațiile celulare au avantajul de a asigura o oarecare specificitate a reacției, condiții de mediu normal și asigură un randament bun. În schimb apar și unele inconveniențe: apariția produșilor de reacție nedoriți datorită căilor metabolice alternative prezente în celulă, este necesară utilizarea unor condiții aseptice riguroase.

Folosirea enzimelor prezintă numeroase beneficii: reacția enzimatică este specifică atât față de substrat, cât și față de produsul de reacție, contaminarea microbiană are o importanță mai scazută, nu este necesar folosirea unui mediu nutritiv pentru dezvoltarea microorganismului, nu există membrană celulară care să împiedice interacțiunea dintre enzimă și substrat. Totuși folosirea enzimelor solubile în procese industriale poate ridica anumite probleme: enzima poate fi instabil, nu se poate reutiliza, este greu de automatizat. Unele sau chiar toate aceste inconveniente se pot elimina prin imobilizarea enzimelor.

Oxidoreductaze importante în biotehnologiile alimentare

Oxidoreductazele sunt enzimele participante în procesele de oxidare biologică care catalizează reacțiile de oxidoreducere printr-o serie de mecanisme: transfer de hidrogen (transhidrogenaze sau dehidrogenaze), transfer de electroni (transelectronaze), combinarea directă a unui substrat cu oxigenul molecular (oxidare) etc. Ele acționează asupra unei perechi de substraturi, A și B, dintre care cel redus se va oxida, iar cel oxidat se va reduce, după schema generală:

Ared + Boxid↔ Aoxid + Bred

În funcție de grupările chimice de substanțele donatoare de hidrogen asupra cărora acționează sau de substanțele care încorporează oxigenul, grupările se împart în 17 subclase, în cadrul cărora pot fi evidențiate diferite sub-subclase de oxidoreductaze. Aceste enzime își exercită acțiunea lor catalizatoare prin intermediul unor coenzime (nicotin-adenindinucleotidice NAD+, NADP+; flavinice ca flavinmononucleotidul FMN sau flavinadenindinucleotidul FAD, heminice, etc.), care se comportă ca acceptori intermediari între substratul donor, inițial, și cel acceptor, final .

Numeroase oxidoreductaze intervin în procesele metabolice, atât anaerobe cât și aerobe, ca, de exemplu, glicoliza și diferitele fermentații, ciclul acizilor tricarboxilici, catena de respirație celulară, care se desfășoară în diverse materii prime alimentare și în procesele fermentative de obținere a unor produse alimentare. Unele oxidoreductaze proprii materiilor prime, în special vegetale, folosite în industria alimentară sunt implicate în procese degradative ca de exemplu: în îmbrunarea enzimatică (polifenoloxidaze, peroxidaze etc.), în procesele de albire sau decolorare (lipooxigenaza), în degradarea acidului ascorbic (acid ascorbic oxidaza), deteriorarea oxidativă a unor produse (peroxidaze, catalaze) etc. De asemenea, unele preparate enzimatice cu activitate oxidoreductazică sunt folosite în diferite scopuri în industria alimentară ca, de exemplu- glucozoxidaza pentru protejarea unor alimente împotriva deteriorărilor oxidative și îmbrunarea Maillard sau catalaza pentru eliminarea H2O2 reziduale în “pasteurizarea” la rece a laptelui.

În continuare vor fi prezentate oxidoreductazele NAD+ sau NADP+ dependente și oxidoreductazele FAD sau FMN dependente.

3.3.1 Oxidoreductazele NAD+ sau NADP+ dependente

Aceste enzime catalizează procesele reversibile de oxidoreducere caracterizate prin transfer de hidrogen de pe un substrat donor pe altul acceptor și au caracter anaerob, deoarece acceptorul de hidrogen este altul decât oxigenul. Sunt denumite adesea dehidrogenaze, transhidrogenaze și dehidraze. Coenzimele lor NAD+ sau NADP+ care se comportă ca acceptori sau donori intermediari de hidrogen între substraturile participante în reacție se detașează ușor de apoenzimă, putând să își exercite acest rol pentru mai multe enzime. Oxidoreductazele NAD+ dependente intervin în numeroase procese catabolice oxidative ale alcoolilor, aldehidelor, aminoacizilor, iar cele NADP+ dependente catalizează, mai ales, procesele anabolice reductive. Ele sunt foarte răspândite în diverse organe, țesuturi animale și țesuturi vegetale, precum și în diferite microorganisme. Dehidrogenazele prezintă o importanță deosebită și în numeroase procese fermentative , în procesul de respirație care se desfașoară în diverse materii prime sau în procesele fermentative de obținere a unor produse alimentare.

Alcool dehidrogenaza (alcool: NAD+—oxidoreductaza) → Catalizează transformarea acetaldehidei rezultată din decarboxilarea acidului piruvic, în alcool etilic, după reacția:

Glucide → Acid piruvic → Aldehidă acetică → Alcool etilic

Această reacție prezintă o importanță deosebită în procesul de fermentație alcoolică; în condiții aerobe, enzima poate să catalizeze reacția de oxidare a alcoolului etilic în aldehidă acetică.

Lactat dehidrogenaza (L-lactat: NAD-oxidoreductaza) → Catalizează (în condiții anaerobe) reducerea acidului piruvic cu formare de acid lactic în prezență de NADH+ H+ conform reacției:

Figura 3.4. Reducerea acidului piruvic la acid lactic în prezență de

NADH + H+

Acidul lactic constituie etapa finală a glicolizei și a fermentației lactice. Lactat dehidrogenaza izolată din inimă și mușchii mamiferelor sau din unele bacterii ca, de exemplu, Bacillus subtilis, conduce la formarea de acid L-lactic, deosebindu-se de lactat dehidrogenaza obținută din Lactobacillus plantarum care duce la formarea de acid D-lactic.

În general, microorganismele care realizează fermentația lactică produc acid lactic racemic, deoarece acidul L-lactic rezultat este parțial izomerizat la acid D-lactic prin intervenția unei izomeraze.

Malicdehidrogenaza (L-malat: NAD+ -oxidoreductaza) → Catalizează reacția de oxidare a acidului malic în acid oxalilacetic, care mai departe este transformat în acid lactic.

Malatoxidaza denumită și enzimă malică (malat: NAD—oxidoreductaza), malatoxidaza catalizează reacția de transformare a acidului malic în acid piruvic, acesta fiind apoi transformat în acid lactic.

Aceste două enzime intervin în fermentația malolactică a vinurilor. Alături de aceste două oxidoreductaze în fermentația lactică a vinurilor intervine și enzima malolactică (L-malat: NAD-carboxiliaza) care catalizează reacția:

Figura 3.5. Transformarea enzimatică a ionului malat în lactat

Acetaldehiddehidrogenaza (Acetaldehida: NAD-oxidoreductaza) → Catalizează oxidarea aldehidei acetice în acid acetic, mai ales în procesul de otețire a vinurilor. În condiții aerobe, alcoolul etilic din vin sub influența alcooldehidrogenazei este transformat în aldehidă acetică, iar aceasta sub influența acetaldehid dehidrogenazei se oxidează în acid acetic.

Oxidoreductazele FAD sau FMN dependente

Aceste enzime cunoscute și sub denumirea de flavinenzime au drept coenzime FAD-ul sau FMN-ul care sunt derivați ai riboflavinei (vitamina B2). Unele flavinenzime conțin în molecula lor și ioni metalici ( MO, Fe), ioni care le conferă uneori și funcția de a transporta electroni. În general coenzimele flavinenzimelor sunt strâns asociate moleculelor de apoenzimă (deosebindu-se din acest punct de vedere de NAD+ și NADP+ care se pot detașa de apoenzimă). Unele flavinenzime acționează ca dehidrogenaze anaerobe, iar altele au caracter aerob, putând transfera hidrogenul direct de la substratul donor către oxigenul molecular cu formare de apă oxigenată.

În cadrul acestor din urmă enzime se încadrează glucozoxidaza, care își găsește multiple utilizări în industria alimentară.

Glucozoxidaza (Notatina, b-D-glucozo-O2-transhidrogenaza, b-D-gluco-oxigen-oxidoreductaza, EC 1.1.4) – este o flavoenzimă care conține 2 moli de flavinadenindinucleotid (FAD) ca grupare prostetică/mol enzimă. Se obține din Aspergillus niger (S.U.A.), Penicillium amagasakiense (Japonia) și Penicillium vitale (Rusia). Glucozoxidaza din Aspergillus este considerată enzimă intracelulară implicată în mecanismul metabolismului energetic. În practică tulpinile de Aspergillus niger sunt cultivate submers și miceliul respectiv, este separat de mediul de cultură; miceliul care conține enzima este dezintegrat și glucozoxidaza trece în soluție care este centrifugată pentru separarea pereților celulari. După purificări repetate, enzima este precipitată cu acetona sau alcoolul etilic, precipitatul fiind separat prin filtrare sau centrifugare, uscat, apoi extras cu soluție tampon. Enzima în soluție este standardizată și stabilizată, putând fi păstrată câțiva ani la temperatură de refrigerare.

Glocozoxidaza din Penicillium este purificată direct din mediul de cultură, fiind considerată o enzimă extracelulară, fapt care este în neconcordanță cu funcția sa în procesele bioenergetice ale celulei. De fapt, miceliul de Penicilliumse autolizează rapid, în comparație cu Aspergillus și enzima este trecută în mediul de biosinteză. Prin urmare, glucozoxidaza din Penicillium este tot o enzimă intracelulară

Transelectronaze sunt enzime care catalizează reacțiile de oxidoreducere prin transfer de electroni de pe un donor către un acceptor. În funcție de natura acceptorului, transelectronazele pot fi: anaerobe, când acceptorul este o altă substanță diferită față de oxigenul molecular, și aerobe, când acceptorul este oxigenul. Transelectronazele anaerobe sunt cunoscute și sub denumirea de citocromi, care sunt localizați la nivelul mitocondriilor, unde participă ca transportori de electroni în catena de respirație celulară.

Oxidaze

Sunt oxidoreductaze care catalizează reacțiile unor substraturi cu oxigen molecular sau al peroxizilor, reacții ce sunt caracterizate prin transfer de hidrogen de pe un donator pe un acceptor care are oxigen molecular. Ca produs de reacție se formează H2O2 .

În funcție de mecanismele de acțiune oxidazele pot fi:

oxigenaze: dioxigenaze și monooxigenaze;

oxidaze transportoare de electroni: citocromoxidaza, cupruoxidazele (tirozinaze, polifenoloxidazele, cateholoxidaza, ascorbatoxidaza etc.);

hidroxiperoxidaze (peroxidaze si catalaze).

Lipoxigenaza este o dioxigenază (lipoxidaza linoleat: oxigenoxidoreductaza, EC 1.11.13), fiind cunoscută și sub denumirea de carotenoxidază. Catalizează oxidarea acizilor grași polinesaturați care conțin legăturile cis, cis- 1,4 pentadienice cu ajutorul O2. Acizii grași polinesaturați oxidați sunt acidul linoleic (9, 12 octadecadienoic), linolenic (9, 12, 15 octadecatrienoic) și arahidonic (5,8, 11, 14 eicosatetraenoic). Acești acizi grași sunt denumiți esențiali. Sunt oxidate gliceridele și metilesterii acizilor grași menționați și se formează peroxizi.

Lipoxigenaza se găsește în mazăre, fasole, arahide, cartofi, ridichi, însă activitatea lipoxigenazică extrem de mare este prezentă în boabele de soia. Enzima este activă și la temperaturi scăzute, prin acțiunea ei se formează mirosuri nedorite în produsele vegetale respective.

Boabele de soia conțin două tipuri de lipoxigenaze, una activată de Ca2+ și cealaltă inhibată de Ca2+, vârful de activitate fiind suma efectelor pozitive și negative, în funcție de modificările concentrației de calciu. Lipoxigenaza din soia nu necesită activare cu metale sau grupare prostetică. Antioxidanții obișnuiți folosiți sunt inhibitori slabi ai lipoxigenazei, iar acidul ascorbic și tocoferolii accelerează reacțiile de oxidare.

Lipoxigenaza din soia se utilizează pentru albirea făinii de grâu prin distrugerea carotenilor.

Polifenoloxidazele (denumite cresolaze, catecholoxidaze, cateholaze, tirozinaza, fenolaza; denumire sistemică O-difenol: oxigenoxidoreductaza, EC 1.10.1) sunt enzime care transportă electronii la oxigen. Catalizează hidroxilarea monofenolilor cu formare de orto-difenoli, care sunt transformați în orto-chinone. Sunt larg răspândite în plante, găsindu-se în cantitate mai mare în ciuperci, în tuberculii de cartofi, în frunze de ceai și tutun, în boabe de cafea și în diferite fructe ca: mere, piersici, caise, banane etc.

Polifenoloxidazele din plante nu prezintă o specificitate deosebită, putând să acționeze asupra unor mari varietăți de compuși monofenolici și orto-difenolici. În schimb, polifenoloxidazele din țesuturile mamiferelor au o specificitate mult mai restrânsă, acționează doar asupra tirozinei și dihidroxifeni-L-alaninei.

Îmbrunarea materialelor vegetale (legume, fructe proaspete tăiate) în contact cu oxigenul din aer este datorată polimerizării sau polimerizării oxidative a chinonelor formate din mono- și difenoli, asupra cărora au acționat polifenoloxidazele. Prin folosirea unor tratamente termice ca, de exemplu: în cazul blanșării legumelor și fructelor are loc inactivarea polifenoloxidazelor. De asemenea, concentrații relativ mici de clorură de sodiu, de agenți de complexare a cuprului, de acid ascorbic,dioxid de sulf pot preveni sau minimaliza procesele de îmbrunare enzimatică a legumelor și fructelor cauzate de polifenoloxidaze.

Peroxidazele sunt enzime care catalizează reacții de oxidoreducere după reacția generală:

ROOH + AH2 → H2 + ROH + A

în care: ROOH poate fi peroxidul de hidrogen (H2O2) sau un alt peroxid organic.

Aceste enzime sunt larg distribuite în microorganisme (bacterii, drojdii), în plante ca de exemplu: napi, gulii, cartofi, smochine și diferite alte legume și fructe, în țesuturi și lichide biologice animale ca, de exemplu: lapte, saliva etc.

Din punct de vedere structural pot fi grupate în: peroxidaze feriprotoporfirice (cu grupare prostetică feriprotoporfirina III) prezente în plantele superioare (legume și fructe), în animale (ca, de exemplu, triptofan-pirolaza, tiroid-iodin-peroxidaza) și în microorganisme (citocrom c-peroxidaza din drojdii); verdo-peroxidaze (cu grupare prostetică porfirinică diferită de feri-porfirina III) de culoare verzuie, cum este lactoperoxidaza din lapte și flavo-protein-peroxidaza (cu FAD ca grupare prostetică) de felul celor găsite în diferiți streptococci, dar și în unele țesuturi animale. În general peroxidazele prezintă o mare stabilitate termică. Datorită termostabilității lor, determinarea activității peroxidazice din diferite legume și fructe este folosită ca un indice al eficienței tratamentelor termice aplicate în procesele de blansare, sterilizare etc. Determinarea activității lactoperoxidazei este folosită la urmărirea eficienței pasteurizării în industria laptelui.

Diferitele peroxidaze intervin în degradarea fructelor și legumelor, ele fiind implicate în modificarea mirosului și gustului (mai ales la mazăre, fasole etc.) în procesele de îmbrunare enzimatică.

Capitoul 4. Metode de analiză spectrofotometrice

În acest capitol se vor prezenta principalele metode de analiză fizico-chimice utilizate pentru identificarea și cuantificarea antioxidanților în mostre complexe.

Metodele instrumentale implică utilizarea unui echipament complex bazat pe principii electronice, optice sau termice. Fiecare categorie de metode prezintă avantaje și dezavantaje, alegerea metodei sau complexului de metode trebuie să se facă minimizând interferența dezavantajelor și maximizând influența avantajelor asupra cerințelor concrete ale analizei de efectuat.

Avantajele metodelor instrumentale sunt următoarele:

determinarea este foarte rapidă;

pot fi utilizate cantități mici de probă;

pot fi cercetate probe complexe;

prezintă o sensibilitate ridicată;

dau un grad mare de siguranță rezultatelor măsurătorilor.

Dezavantajele metodelor instrumentale sunt următoarele:

este necesară o etalonare inițială sau continuă a aparatului;

sensibilitatea și precizia depind de aparatura sau metoda chimică de etalonare;

precizia finală se află adesea în domeniul ±5 %;

costul inițial și cel pentru întreținerea echipamentului este ridicat;

intervalul de concentrație este limitat (măsurători relative).

Spectroscopia în domeniul infraroșu (IR)

Spectroscopia în domeniul infraroșu (IR) este cea mai potrivită metodă de identificare a prezenței grupărilor funcționale polare din structura moleculelor compușilor organici.

Radiația infraroșie (IR) reprezintă acea parte a spectrului electromagnetic, cuprinsă între regiunea vizibilă și cea de microunde, regiune ce este caracterizată prin lungimi de undă de ordinul a 10-5 m. Pentru înregistrarea spectrelor IR utilizate în determinarea structurii compușilor organici se folosește doar domeniul IR de mijloc, ce conține lungimi de undă situate în regiunea 2,5-25 μm.

Un spectru IR conține benzi de absorbție datorate vibrațiilor care au loc simultan cu participarea tuturor atomilor din structura moleculelor compusului organic analizat (vibrații normale). Poziția unei benzi de absorbție este bine precizată în spectru. Ea variază în limite restrânse odată cu ambianța grupării funcționale în cadrul moleculei. O bandă de absorbție caracteristică aceleiași grupări funcționale se regăsește la aproape aceeași valoare a numărului de undă în spectrul IR al oricărei molecule, fapt care permite identificarea elementelor structurale componente ale unei molecule, prin atribuirea benzilor de absorbție caracteristice din spectrul IR.

Poziția unei benzi de absorbție din spectrul IR depinde de mai mulți factori cum ar fi:

masele relative ale atomilor;

constantele de forță ale legăturilor implicate în excitarea vibrațională;

geometria moleculei.

Frecvența de oscilație a unui sistem format din două mase poate fi dedusă dintr-o aplicație a legii deformațiilor elastice (legea lui Hooke) la oscilatorul armonic:

unde: h – constanta lui Plank; v – numărul cuantic de vibrație cu valori întregi pozitive (0, 1, 2, 3, … n); ν – frecvența de oscilație dată de relația:

unde: k – constanta de forță a legăturii; μ – masa redusă dată de relația:

unde: m1, m2 – masele atomice.

Spectrul IR se reprezintă ca intensitate a benzilor de absorbție în funcție de numărul de undă (frecvența ν sau lungimea de undă λ) a radiației electromagnetice absorbite. Intensitățile benzilor pot fi exprimate fie ca transmitanță (T), fie ca absorbanță (A).

Transmitanța este raportul dintre puterea radiației transmise printr-o probă și puterea radiației incidente pe probă; se calculează cu formula:

T = I/I0

unde: I0 – intensitatea radiației incidente; I – intensitatea radiației emergente.

Absorbanța are următoarea formulă de calcul :

A = log(1/T)

Pentru a avea loc absorbția radiației IR vectorul electric al luminii trebuie să interacționeze cu momentul de dipol al moleculei și astfel se produc benzi de absorbție în domeniul IR.

În practică spectrele IR pot fi înregistrate utilizând două tipuri diferite de spectrometre IR, acestea sunt:

aparate clasice cu fascicul dublu de radiație electromagnetică și nul optic;

aparate moderne cu iradiere în pulsuri și transformata Fourier (FTIR).

Ambele tipuri de spectrometre IR se bazează pe același principiu de funcționare: radiația electromagnetică din domeniul IR emisă de o sursă luminoasă este trecută peste probă fiind apoi analizată radiația emergentă a cărei intensitate apare modificată de interacțiunea cu moleculele compusului organic. În figura 4.1 este prezentată schema generală a acestor două tipuri de aparate.

Figura 4.1. Schema de principiu a spectrometrului IR clasic și a spectrometrului FTIR

Spectrometrul IR clasic: Este un aparat în care radiația electromagnetică furnizată de o sursă este ramificată în două fascicule: un fascicul de referință și unul care trece prin probă.

Spectromerele IR cu transformata Fourier: Aceste aparate le-au înlocuit pe cele clasice abia după dezvoltarea tehnicilor informatice moderne capabile să înregistreze și să prelucreze mari cantități de date. Tehnica folosită se bazează pe operația matematică cunoscută sub numele de transformata Fourier prin care o funcție exprimată în domeniul de timp este transformată într-o funcție în domeniul de frecvențe.

Într-un aparat FTIR, radiația IR emisă de sursă este mai întâi trecută printr-un interferometru, apoi traversează alternativ proba sau referința și în final interferogramele astfel obținute sunt transformate în spectre IR cu ajutorul transformatei Fourier (care realizează transformarea domeniului de timp caracteristic interferogramei, în domeniul de frecvențe caracteristic unui spectru). Aparatul FTIR folosește un singur fascicul de lumină (monofascicol), spectrul referinței fiind scăzut numeric din cel al probei.

Această tehnică prezintă mai multe avantaje printre care ar fi de menționat următoarele:

durată mult mai scurtă necesară înregistrării spectrului;

precizie de citire a numerelor de undă caracteristice maximelor benzilor de absorbție.

În spectrele IR pot fi identificate două tipuri de vibrații ale grupărilor funcționale dintr-o moleculă și anume:

vibrații de alungire;

vibrații de deformare.

Vibrația de alungire (simbolizată prin ν) este o mișcare ritmică de-a lungul axei legăturii covalente, astfel încât are loc o variație a distanței interatomice; această vibrație se mai numește și vibrație de valență.

Vibrația de deformare constă într-o modificare a unghiului dintre două legături covalente având un atom comun.

Există o serie de factori structurali care însumați influențează valoarea frecvenței de vibrație a unei grupări funcționale dintr-o moleculă și anume:

cuplajului vibrațiilor;

asocierea prin legături de hidrogen;

efectele electronice.

Spectrometria UV-Vis

Absorbția luminii de către substanțe în domeniul vizibil și ultraviolet se datorează unor tranziții electronice între diferite nivele energetice ale moleculelor. Energiile necesare pentru excitarea electronilor variază între 30- 300 Kcal×mol-1. În spectrometria din domeniul vizibil și ultraviolet lungimile de undă se exprimă în mµ sau angstromi (1mµ=1nm=10Å= 10-7cm).

Pentru spectrul vizibil, în concordanță cu domeniul de sensibilitate al ochiului omenesc, lungimile de undă sunt cuprinse între 400 mµ și 800 mµ (4000-8000Å). Domeniul ultraviolet reprezintă radiațiile cu lungimi de undă mai mici decât 400 mµ, pentru care ochiul omenesc nu este sensibil, iar substanțele apar de cele mai multe ori incolore.

În funcție de domeniul spectral în care se absorb corpurile, respectiv substanțele chimice pot fi incolore sau pot avea diverse culori. Un corp are culoarea albă când reflectă sau permite să treacă toate culorile spectrului. El apare negru când absoarbe toate radiațiile luminoase. Corpurile colorate absorb radiațiile numai din anumite domenii ale spectrului vizibil (absorbție selectivă). Ochiul percepe numai radiațiile neabsorbite. Atunci când un corp absoarbe selectiv într-un anumit domeniu de lungime de undă radiațiile transmise neabsorbite au culoare complementară.

Tranzițiile electronice ce apar la absorbția unei cuante din vizibil sau ultraviolet diferă după natura orbitalilor pe care se găsesc electronii implicați în tranzițiile electronice respective.

Energia radiațiilor ce produc tranziții electronice este situată în domeniul valorilor de energie corespunzătoare legăturilor chimice. Spectrele moleculare au la bază tranziții ale electronilor din legăturile chimice, cât și ale electronilor neparticipanți de pe stratul de valență al atomilor.

Orbitalii legăturilor simple, denumiți orbitali σ, pot fi de legătură ocupați cu electroni în stare fundamentală și orbitali de antilegătură – neocupați cu electroni în stare fundamentală. Analog, orbitalii legăturilor duble, numiți orbitali π, pot fi de legătură notați π sau de antilegătură notați π* mai bogați în energie.

În figura 4.2 sunt redați orbitalii menționați în ordinea conținutului lor energetic și sunt figurate diferitele tranziții electronice care pot avea loc la absorbția unor cuante din domeniul vizibil sau ultraviolet.

Tipul de tranziție se redă notând tipul orbitalului de la care pornește electronul și cel excitat pe care ajunge acesta unind cele două nivele energetice printr-o săgeată.

Figura 4.2. Schema generală a orbitalilor moleculari pe baza căreia se definește tipul tranzițiilor electronice într-un sistem molecular

Așa cum rezultă din figura 4.2 tranzițiile de tip σ→σ* necesită cea mai mare energie, ca urmare a diferenței mari de energie dintre nivelele de plecare și cele de oprire ale electronului. Aceste tranziții sunt situate în domeniul cu lungimi de undă mai mici de200nm (λ<200 nm), deci în domeniul UV îndepărtat și sunt mai puțin semnificative în studiul structurii substanțelor. Tranzițiile n→π* și n→σ* situate în domeniul λ≈180- 370 nm sunt caracteristice sistemelor cu heteroatomi (N, O etc.) care conțin electroni neparticipanți.

În cazul moleculelor cu legături duble sunt caracteristice tranzițiile de tip π→π*. Lungimea de undă a benzii este cuprinsă între 170-250 nm. Poziția benzilor în aceste cazuri este puternic afectată de o serie de factori cum ar fi: conjugarea grupelor cromofore, geometria moleculară și natura grupelor cromofore. Compușii cu legături duble: >C=O, >C=C<, -N=N, -N=O se absorb la lungimi de undă mai mari prin tranziții π-π*. Uneori sunt importante și tranzițiile n→π*. Grupele de atomi dublu legate se numesc grupe cromofore și apar frecvent în compuși organici.

Legătura >C=C< este cea mai slab cromoforă. Când substanța analizată conține mai multe asemenea grupări ele dau o deplasare a benzii de absorbție spre lungimi de undă(λ) mai mari, ajungând până în domeniul vizibil.

Gruparea >C=O specifică aldehidelor și cetonelor prezintă două benzi de absorbție:

una situată în regiunea 1900-2000 Å datorată unei tranziții π→π* cu extincție;

una situată în regiunea 2700-2900 Å de intensitate medie datorată unei tranziții n→π*, tranziție de la dubletul neparticipant, n al oxigenului, pe orbitalul de antilegătură π*.

Absorbția luminii în regiunea vizibilă și ultravioletă a spectrului este datorată unor tranziții electronice între diferite nivele de energie pe care le pot ocupa electronii excitați. Atomii și moleculele absorb și emit energia sub formă de cuante de energie.

Tranziția electronică indicată de săgeata verticală pornește de la unul din nivelele stării fundamentale, de exemplu υ=0, dar poate implica mai multe nivele ale stării excitate. Energiile necesare pentru excitarea moleculelor variază între 30-300 Kcal/mol. Spectrele electronice cuprind lungimi de undă în intervalul 8000- 1000 Å.

Ochiul omenesc percepe numai o parte din tranzițiile electronice și anume pe acelea cu lungimi de undă mari și frecvețe mici în domeniul 8000- 4000 Å (380-780nm) specifice domeniului vizibil.

Cromatografie

Cromatografia este o metodă de separare și analiză a substanțelor chimice din amestecuri, care se bazează pe interacțiunea diferențiată a doi sau mai mulți compuși de separat cu două faze cromatografice: faza mobilă și faza staționară.

La ora actuală nu numai în chimia analitică, ci și în tehnologia chimică se manifestă o cerere din ce în ce mai mare de compuși cu puritate foarte avansată. Separarea amestecurilor în componente este o operație esențială care permite obținerea acestora într-o stare cât mai pură.

În prezent, există un mare număr de metode de separare care și-au găsit aplicații în chimie. Fiecare dintre aceste metode poate cuprinde mai multe tehnici de separare. Cele mai importante metode de separare sunt cele bazate pe echilibrul între faze, care valorifică diferența dintre proprietățile de distribuție ale componentelor unui amestec între doua faze nemiscibile aflate în contact. Ca metode de separare folosite întâlnim: distilarea, cristalizarea, precipitarea, sublimarea, extracția. Aceste metode, cunoscute și aplicate de multă vreme s-au dovedit a fi insuficiente atunci când s-a pus problema separării unor amestecuri foarte complexe și a fost nevoie de dezvoltarea unor noi metode, printre care s-au impus mai ales cele cromatografice.

Principalele avantaje pe care le prezintă cromatografia ca metodă de separare sunt:

permite separarea, identificarea și dozarea cantitativă simultană a componentelor unui amestec;

se poate aplica unui număr foarte mare de produse, practic orice compus organic putând fi separat printr-o metodă cromatografică;

sensibilitatea metodelor cromatografice este extrem de ridicată, ceea ce înseamnă că necesită doar cantitați mici de probă;

durata analizei este redusă, comparativ cu alte metode de analiză ale amestecurilor complexe.

Principiul de bază al separării cromatografice constă în distribuția inegală a componentelor unui amestec între faza mobilă și faza staționară. Acest amestec străbate sistemul cromatografic fiind antrenat de către faza mobilă. Distribuția inegală este determinată fie de afinitatea diferită a componentelor amestecului față de cele două faze, fie de capacitatea diferită de a difuza în acestea. Acest principiu este ilustrat în figura 4.3 pe un exemplu din cromatografia de gaze pe coloane capilare. Aceste coloane se caracterizează prin faptul că faza staționară se găsește depusă în strat foarte subțire pe pereții coloanei.

Figura 4.3. Principiul separarii cromatografice

Moleculele celor doi compuși, 1 și 2, care se găsesc în momentul inițial amestecate într-un volum restrâns vor avea tendința de a se transfera continuu din faza mobilă în faza staționară și invers, din cauza agitației termice. Deoarece moleculele compusului 2 au o afinitate mai mare față de faza staționară, ele vor fi mai puternic reținute în această fază. Drept urmare, după un anumit interval de timp se va înregistra o rămânere în urmă a acestei componente, comparativ cu componenta mai slab reținută 1. Trebuie remarcat faptul că această separare are loc în timpul deplasării în coloană, deci este un proces dinamic.

Figura 4.4. care reprezintă rezultatul analizei cromatografice se numește cromatogramă. Ea este înregistrată în general ca o funcție a intensității semnalului detectorului în raport cu timpul. Semnalul corespunzător fiecărei componente care apare în cromatogramă se numește pic cromatografic, iar aria picului este proporțională cu concentrația componentei respective. În cazul cromatografiei planare, cromatograma este chiar placa sau hârtia pe care a avut loc analiza, iar componentele sunt evidențiate sub forma unor spoturi. Un exemplu de cromatogramă este dată în figura următoare.

Figura 4.4. Analiza cromatografică a unui amestec de hidrocarburi

Cinetica reacțiilor catalizate enzimatic: ecuația Michaelis-Menten

Principiile generale ale cineticii reacțiilor chimice se aplică și la reacțiile catalizate de enzime, dar acestea au în plus o trăsătură proprie care nu se întâlnește la reacțiile neenzimatice, și anume saturarea cu substrat.

În 1913, L. Michaelis și M.L. Menten au dezvoltat o teorie generală asupra acțiunii și cineticii enzimatice, care mai târziu a fost extins de G.E. Briggs și J.B.S. Haldane [Lehninger, 1987]. Această teorie este fundamentală pentru analiza cantitativă a tuturor aspectelor cineticii și inhibiției enzimatice și este cel mai bine dezvoltată pentru cazul simplu de reacție cu un singur substrat. Teoria Michaelis- Menten presupune că enzima E se combină mai întâi cu substratul S pentru a forma complexul enzima-substrat, ES: aceasta se descompune într-o etapă următoare, formând enzima liberă și produsul P:

E + S→ ES

ES → E+P

Figura 4.5. Reprezentarea grafică a ecuației Michaelis – Menten

Ecuația Michaelis-Menten exprimă relația matematică dintre viteza inițială a unei reacții catalizate enzimatic, concentrația substratului și anumite caracteristici ale enzimei. Această ecuație este o ecuație de viteză pentru reacțiile catalizate enzimatic, cu un singur substrat.

,

unde: v0 =viteza inițiala; Vmax =viteza maximă; KM =constanta Michaelis;

[S] =concentrația substratului.

PARTEA EXPERIMENTALĂ

OBIECTIVELE LUCRĂRII DE LICENȚĂ

Cercetările care se vor realiza în această lucrare de licență sunt:

Studiul acțiunii enzimelor asupra compușilor fenolici (mono-, di- și trifenoli) prin spectrometrie FTIR;

Studiul acțiunii enzimelor asupra compușilor fenolici (mono-, di- și trifenoli) prin spectrofotometrie în domeniul vizibil;

Cinetica proceselor enzimatice cu scopul de a se determina care sursă naturală de enzime este mai bogată în polifenoloxidază și care este compusul fenolic cel mai susceptibil la oxidare enzimatică;

Determinarea cantitativă a catecolului printr-o metodă spectrofotometrică care folosește o sursă naturală de polifenoloxidaze.

Capitolul 5. Materiale și metode

În acest capitol se vor prezenta principalele materiale, echipamente și instrumente utilizate pentru analiza acțiunii unor polifenolioxidaze din fructe asupra unor compuși polifenolici. Metodele de analiză au fost metoda spectrofotometrică în domeniul vizibil (s-a înregistrat spectrul în domeniul 400-800nm și s-a înregistrat absorbanța la o lungime de undă în timp – cinetica procesului de oxidare) și spectrometria în domeniul IR.

Materiale utilizate

Sursele naturale de enzime

Pentru cercetările realizate în această lucrare de licență s-au utilizat următoarele fructe: banană, măr și pară. Ele sunt binecunoscute ca surse naturale de polifenoloxidaze. Aceste enzime, în prezența oxigenului și apei, oxidează compușii polifenolici la compuși galben-bruni de natură polimerică.

Figura 5.1. Imaginea fructelor utilizate ca surse naturale de polifenoloxidaze

Substanțe chimice utilizate

Acid vanilic (acid 4-hidroxi-3-metoxibenzoic): este un derivat al acidului dihidroxibenzoic utilizat ca agent aromatizant. Cea mai mare cantitate de acid vanilic cunoscută până în prezent se găsește în rădăcina plantelor.

Proprietăți fizice: este o substanță sub formă de pulbere, de culoare albă până la galben deschis sau sub formă de cristale.

Catecol: este un compus organic, toxic, cunoscut și sub numele pirocatehină sau 1,2-dihidroxibenzen. Acest compus incolor apare în mod natural în cantități infime. Proprietăți fizice: culoare albă până la cristale maro, miros fenolic, foarte solubil în piridină, solubil în cloroform, benzen, eter.

Acid galic: este un acid trihidroxibenzoic și se găsește liber în natură, răspândit în ceai, struguri, coajă de stejar și în gogoși de ristic de pe frunzele de stejar, cristalizat cu o moleculă de apă. Sub formă de derivați se găsește în taninuri, din care de altfel se poate obține pe calea hidrolizei acide sau enzimatice. Proprietăți fizice: este o substanță solidă cu aspect mătăsos și gust astringent, puțin solubil în apă la temperatura normală.

Figura 5.4. Structura chimică a acidului galic

Aparatura utilizată:

1. Spectrofotometrul Rayleigh UV-1601

Figura 5.5. Spectrofotometrul Rayleigh UV-1601

Caracteristici tehnice

Domeniul de lungimi de undă: 190-1100 nm;

Lățimea benzii spectrale: 2nm (5nm, 4nm, 1nm opțional);

Acuratețea lungimii de undă: ±0,3 nm;

Reproductibilitatea lungimii de undă: 0,15 nm;

Sistem fotometric: Autoscanare; Detectoare duale;

Acuratețea fotometrică: ±0,3%T (0-100%T); ±0,002A (0-0,5A); ±0,004A (0,5A-1A) ;

Reproductibilitatea fotometrică: 0,2%T;

Modul de lucru: T, A, C, E;

Domeniul fotometric: -0,3-3A;

Lumina împrăștiată: ≤0,1%T (NaI, 220nm, NaNO2 340nm) ;

Stabilitatea liniei de bază: ±0,002A;

Stabilitate: 0,001A/30min ( la 500nm, după încălzire) ;

Zgomot: ±0,001A ( la 500nm, după încălzire) ;

Detector: fotodiodă siliconică;

Alimentare: 220V/50Hz, 110V/60Hz, 180W;

Dimensiuni: 630×470 ×210mm;

Greutate: 26 kg;

Comanda aparatului: exclusiv prin software instalat în PC;

Programul pentru controlul aparatului și achiziția datelor: UV Software.

2. Spectrometrul FTIR (ALPHA – Bruker)

Figura 5.6. Spectrometrul FTIR (ALPHA – Bruker)

Unul dintre cele mai mici spectrometre FTIR din lume – ALPHA joacă un rol important în analizele fundamentale în infraroșu și permite utilizarea sa în aproape toate tipurile de laboratoare, oferind utilizatorilor mai mult spațiu pentru exploatare. Conexiunea plug&play, software-ul ușor de utilizat combinat cu sistemul de sampling QuickSnap asigură un FTIR puternic și fiabil pentru analize cu garanția Bruker.

Caracteristici:

Dimensiuni reduse/costuri reduse: 20cm x 30cm x 15 cm;

Sunt disponibile accesorii pentru analize în: transmisie, reflexie total atenuată (ATR), reflexie externă și difuză;

Performanță fără sacrificii: interferometrul spectrometrului ALPHA se bazează pe design-ul “RockSolid” – patent Bruker Optics care asigură imunitate la șocuri, stabilitate la vibrații și fluctuații de temperatură, oferind mobilitate maximă spectrometrului (poate fi montat în aproape orice loc fară a necesita operațiuni de aliniere);

Software ușor de utilizat: interfață intuitivă OPUS/Mentor ce va îndruma pas cu pas în analiza FTIR, și astfel, se va folosi timpul pentru cât mai multe analize , nu pentru a învăța software-ul;

Flexibilitate maximă: modulele de sampling QuickSnap permit analiza tuturor tipurilor de probe (solide, lichide, gaze, etc.).

3. Micropipetă semiautomată de 1000 microlitri

Figura 5.7. Micropipetă semiautomată 1000 microlitri Eppendorf

Micropipeta semiautomată este de fabricație AHN Germania și permite măsurarea unui volum reglabil între 100 și 1000 L. Pipetele Eppendorf se găsesc în nenumărate laboratoare din întreaga lume.

Specificații:

Acuratețe: ± 0,6%;

Volumul maxim (L): 1000;

Volumul minim (L): 100 ;

Precizie: ± 0,2% .

4. Aparat pentru ultrapurificarea apei

Figura 5.8. Aparat pentru ultrapurificarea apei

Apa ultrapură utilizată în experimente a fost obținută printr-un sistem de purificare Milli-Q, tip 1. Aparatul asigură obținerea unei ape de 18,2 M×cm, fără ioni, filtrată printr-un filtru de 0,2 mm. Apa ultrapură, obținută cu ajutorul aparatului prezintă calități mai bune decât cele prevăzute de standardele ASTM Tip 1 și IS09696 Grade 1. Aparatul este prevăzut cu alarmă acustică pentru situații neuzuale și cu display color pentru afișarea calității apei și a volumului distribuit. Prezintă interfață pentru conectare la calculator, program automat de curățare. Asigură monitorizarea continuă a calității apei, temperaturii, debitului și a presiunii. Pentru asigurarea menținerii calității apei purificate, recircularea se face în mod automat.Elmas

Figura 5.9. Baia de ultrasunete Elmasonic

Baia de ultrasunete Elmasonic se poate folosi pentru prepararea probelor: dizolvare, omogenizare, dispersie, degazare etc.

Seria de băi ultrasonice din seria Elmasonic P cuprinde echipamente ideale pentru aplicații din domeniul laboratoarelor analitice și medicale, precum și în industrie. Baile sunt ușor de manevrat și operat, prezintă un display care arată toți parametri de funcționare setați și actuali. Se folosește pentru prepararea probelor: dizolvare, omogenizare, dispersie, degazare. Toate unitățile sunt mai puternice decât unitațile de ultrasonare convenționale. Dacă energia se dovedește prea mare pentru probele în lucru atunci aceasta poate fi redusă electronic.

Operarea unitații la 80 kHz prelungește timpul de curațare și este ideal pentru tratarea probelor foarte mici și sensibile (de exemplu capilare, cuvete de sticlă).

Caracteristici:

Normal – pentru aplicații standard de laborator, de exemplu omogenizare, dizolvare și dispersare;

Pulse – se poate activa o creștere de putere cu aproximativ 20%;

Sweep – pentru distribuția uniformă a puterii de ultrasonicare în interiorul băii;

Degas – pentru degazarea rapidă a probelor și solvenților HPLC;

Controlul puterii – reglare optimizată a puterii pentru aplicații speciale.

Capitolul 6. Rezultate și discuții

6.1. Studiul acțiunii enzimatice prin spectrometrie de absorbție în domeniul IR

Principalul obiectiv al spectroscopiei în IR constă în determinarea grupărilor funcționale ale probei de analizat. Grupele funcționale absorb radiații IR la frecvențe caracteristice. Spectroscopia IR este o metodă uzuală în elucidarea structurii și identificarea unui compus chimic.

Spectroscopia IR oferă în același timp metode eficiente în controlul purității unor substanțe organice, precum și dozarea acestora. În analiza și interpretarea unui spectru IR nu există reguli rigide, dar înainte de a trece la acest deziderat trebuie să se țină seama de câteva cerințe generale cerute de scopul urmărit. Spectrul trebuie înregistrat cu un aparat de o rezoluție adecvată, care să permită o rezoluție corespunzătoare a benzilor de absorbție; intensitatea spectrului trebuie să fie și ea adecvată. Dacă este necesar spectrul va fi înregistrat pe regiuni folosind concentrații, precum și metode și condiții de înregistrare care să conducă la o intensitate corespunzătoare.

Spectrofotometrul trebuie să fie calibrat astfel ca poziționarea benzilor de absorbție să fie făcută corect. Această calibrare trebuie făcută periodic folosind standarde cum ar fi, pelicula de polistiren. Numai în acest fel deplasările observate pot fi puse pe seama structurii sau a unor interacțiuni specifice.

Se va indica metoda folosită în prepararea probelor, solventul, concentrația și grosimea celulei.

Pentru o analiză preliminară a unui spectru de infraroșu sunt importante două regiuni spectrale: regiunea peste 1300 cm-1 și cea cuprinsă între 650-909 cm-1. Prima regiune este numită regiunea grupărilor funcționale întrucât corespunde frecvențelor caracteristice vibrațiilor de valență ale principalelor grupări funcționale: -OH, -NH2, >C=O, -NO2, -CN. Absența absorbției într-o regiune caracteristică unei funcțiuni poate fi considerată o dovadă a absenței grupării funcționale respective dintr-o moleculă.

Astfel regiunea:

– 3200-3600 cm-1 corespunde legăturilor O-H și N-H din alcooli, fenoli, acizi carboxilici, amine, amide; aspectul benzilor pune în evidență asocierea prin legături de hidrogen;

– 2800-3300 cm-1 aparține benzilor caracteristice legăturilor C-H din radicali hidrocarbonați;

– 1600-1650 cm-1 corespunde vibrației dublei legături C=C;

– 1540-1850 cm-1 corespunde grupării carbonil din compușii carbonilici, acizi carboxilici și derivaților lor;

– 1585-1600 cm-1 și 1400-1500 cm-1 corespund vibrațiilor nucleului aromatic prezente prin benzi de cele mai multe ori cu caracter de dublet;

– 1300-1400 cm-1 sunt situate benzile datorate vibrațiilor de deformare ale grupărilor metil și metilen.

Prezența simultană în spectru a mai multor frecvențe caracteristice indică de cele mai multe ori, fără nici un dubiu, tipul compusului chimic prezent în proba de analizat.

Pentru analiza probelor s-a folosit spectrometrul FTIR Alpha, de la firma Bruker, dotat cu un sistem ATR de expunere a probei de analizat. Spectrul FTIR se înregistrează cu ajutorul programului OPUS instalat în Windows.

S-au preparat soluții apoase de acid vanilic, catecol și acid galic de concentrație 10-3M în apă ultrapură.

Calculul cantităților de acid vanilic, catecol și acid galic necesare pentru a prepara 100 mL soluție:

Acid vanilic: 0,1×10-3×168,14=0,0168 g

Catecol: 0,1×10-3×110,11=0,0110g

Acid galic: 0,1×10-3×188,14=0,0188g

Se cântărește la balanța analitică cantitatea calculată și se adaugă într-un balon cotat de 100 de mL adaugând apă ultrapură până la semn. Baloanele se introduc în baia ultrasonică și se ultrasonează timp de 5 minute pentru dizolvare și omogenizare.

Din fiecare balon se iau probe de 5 mL de soluție și se adaugă în eprubete curate și uscate. Apoi se adaugă câte un gram de fruct, conform tabelului de mai jos.

Tabelul 6.1. Prepararea probelor pentru reacțiile enzimatice

Primele nouă eprubete s-au păstrat la temperatura de 370C timp de 20 de minute pentru a favoriza desfășurarea reacției enzimatice. După cele 20 de minute eprubetele se scot din baia de apă și se introduc într-o baie de gheață pentru a se opri reacția enzimatică. Se separă soluțiile apoase de fruct și aceastea vor constitui probele care vor fi analizate prin spectrometrie în domeniul IR și prin spectrofotometrie în domeniul vizibil (400-800nm).

În prima etapă s-a înregistrat background-ul în domeniul IR. Datorită faptului că se vor folosi soluții apoase, background-ul a fost făcut față de apă ultrapură pentru a elimina benzile de vibrație ale apei, care absoarbe în IR. Compensarea nu este foarte bună însă, aceasta este unica opțiune pentru a putea pune în evidență benzile de vibrație ale substanțelor dizolvate în apă.

După înregistrarea background-ului se adaugă inițial o picatură din soluțiile de analizat (acid vanilic, catecol, acid galic), în care nu s-au adăugat fruct, pe cristalul de ZnSe și s-a înregistrat spectrul în domeniul IR. Ulterior s-au înregistrat spectrele soluțiilor de compuși fenolici după reacția enzimatică provocată de polifenoloxidazele din fructe.

Rezultatele obținute se prezintă în continuare.

Spectrul FTIR al soluției apoase de acid vanilic

Figura 6.1. Spectrul FTIR al soluției apoase de acid vanilic 10-3 mol/L

Prezența tuturor grupărilor funcționale din structura moleculară a acestui compus a fost pusă în evidență prin identificarea benzilor de absorbție caracteristice acestor grupări.

La înregistrarea spectrului FTIR al soluției apoase de acid vanilic, banda de vibrație a grupărilor OH se observă la valori mai mari ale lungimei de undă în domeniul 3648-3734 cm-1.

Legătura C-H prezentă în domeniul 2800-2926 cm-1 prezintă două frecvențe de vibrație de alungire.

În domeniul 1456-1716 cm-1 apar absorbții intense care corespund vibrațiilor nucleului aromatic, dar și vibrației de valență a legăturii duble C=O, parte componentă a acizilor carboxilici.

În conformitate cu datele FTIR prezente în diferite baze de date, se poate concluziona că majoritatea benzilor de vibrație apar la numere de undă similare.

Spectrul FTIR al soluției de catecol

Figura 6.2. Spectrul FTIR al soluției apoase de catecol 10-3 mol/L

Spectrul FTIR al soluției de catecol este complex, observându-se numeroase benzi de vibrație relaționate cu vibrațiile grupărilor funcționale din acest compus.

La înregistrarea spectrului FTIR banda de vibrație a grupărilor OH se observă la valori mari ale numerelor de undă (în domeniul 3690-3852 cm-1). Prezența benzilor în domeniul 3690-3264 cm-1 sugerează prezența unor grupări OH în compusul de analizat. Benzile de vibrație din domeniul 2850-2950 cm-1 corespund vibrațiilor grupărilor C-H, iar cele din domeniul 1457 și 1520 cm-1 pot fi atribuite vibrației caracteristice grupărilor C=C din ciclul benzenic.

Benzile de vibrație din domeniile 1585-1600 cm-1 și 1400-1500 cm-1 corespund vibrațiilor nucleului aromatic prezente prin benzi de cele mai multe ori cu caracter de dublet. Domeniul 1400-555cm-1 al spectrului IR conține numeroase benzi de absorție ce caracterizează structura moleculară în ansamblul ei (vibrații ale catenei: de deformare, combinare, armonice, benzi care nu pot fi atribuite unor vibrații normale).

În conformitate cu datele FTIR prezente în diferite baze de date, se poate concluziona că majoritatea benzilor de vibrație apar la numere de undă similare. Celelalte benzi de vibrație corespund interacțiunilor dintre grupările funcționale și moleculele de apă care interacționează cu catecolul prin forțe de tip Van der Waals și legături de hidrogen.

Spectrul FTIR al soluției apoase de acid galic

Figura 6.3. Spectrul FTIR al soluției apoase de acid galic 10-3 mol/L

Acidul galic este componenta unor specii de lemn de esență tare, cum este stejarul. El este cunoscut pentru proprietățile fungice și pentru afinitatea puternică de a forma complecși.

La înregistrarea spectrului FTIR banda de vibrație a grupărilor OH se observă în jurul valorii de 3648 cm-1. Grupările hidroxil din compusul acid galic apar în configurație coplanară, asemănătoare cu gruparea hidroxil din molecula de fenol.

Gruparea carboxilică din acidul galic se dovedește că face parte din planul ciclului de benzen. Benzile de vibrație din domeniul 2800-2927 cm-1 corespund vibrațiilor grupărilor C-H sp3.

În domeniul 1900-1450 cm-1 apar absorbții intense datorate în special vibrației de valență a legăturii duble heterogene C=O.

Vibrația de alungire a legăturilor O-H din structura acizilor carboxilici apare sub forma unei benzi largi situate în regiunea 2500-2800 cm-1. Aceasta bandă largă, ușor de identificat în spectrul IR, denotă că în structura analizată este prezentă și gruparea COOH.

Atribuirea benzilor celor trei soluții în literatura de specialitate

Spectrele celor trei compuși raportate în literatura de specialitate se prezintă în continuare.

Figura 6.4. Spectrul FTIR al acidului vanilic

Figura 6.5. Spectrul FTIR al catecolului

Figura 6.6. Spectru FTIR al acidului galic

Dacă se compară spectrele IR ale soluțiilor apoase de acid vanilic, catecol și acid galic cu cele din literatura de specialitate se poate afirma că se regăsesc vibrațiile principalelor grupări funcționale prezente în acești compuși. Diferențele observate se datorează interacțiunii dintre compușii fenolici și moleculele de apă.

Spectrele FTIR ale soluțiilor de compuși fenolici după reacția de oxidare enzimatică se prezintă în figurile următoare.

Spectrul FTIR al soluției de acid vanilic + măr

Figura 6.7. Spectrul FTIR al soluției de acid vanilic după acțiunea polifenoloxidazelor din măr

Spectrul FTIR al acestei probe este foarte complex, observându-se numeroase benzi de vibrație relaționate cu vibrațiile grupărilor funcționale. Față de spectrul inițial al acidului vanilic se observă multiplicarea benzilor de vibrație, fapt care indică că se formează un nou compus polimeric ca urmare a acțiunii enzimei în apă și în prezența oxigenului.

Spectrul FTIR al soluției de catecol + măr

Figura 6.8. Spectrul FTIR al soluției de catecol după acțiunea polifenoloxidazelor din măr

Benzile din domeniul 2927-2800 cm-1 în comparație cu soluția de catecol simplă sunt mai puțin intense, deoarece se amplifică intensitatea altor benzi de vibrație sub acțiunea polifenoloxidazei din măr. Benzile de la 2360 cm-1 sunt mult mai intense decât cele observate în soluția inițială. Toate diferențele observate sunt dovada că polifenoloxidaza din măr acționează eficient asupra catecolului și îl transformă într-un compus polimeric.

Spectrul FTIR al acidului galic + măr

Figura 6.9. Spectrul FTIR al soluției de acid galic după acțiunea polifenoloxidazelor din măr

În domeniul 2929-2800 cm-1 al spectrului FTIR al soluției de acid galic după acțiunea polifenoloxidazei din măr poate fi observată o serie de benzi de vibrație, acestea fiind mai puțin intense decât cele observate în spectrul soluției inițiale format din acid galic. De asemenea, în domeniul 2300-2400 cm-1 se observă o bandă de vibrație mai intensă decât în spectrul soluției de acid galic. În plus, se poate observa o creștere a intensității benzilor de vibrație din domeniul 1063-1400 cm-1.

Se poate afirma că sub acțiunea polifenoloxidazei se formează un nou compus polimeric, care conține aceleași grupări funcționale, însă vibrațiile acestora sunt modificate și amplificate.

Spectrul FTIR al acidului vanilic + pară

Figura 6.10. Spectrul FTIR al soluției de acid vanilic după acțiunea polifenoloxidazelor din pară

În cazul soluției rezultate prin acțiunea polifenoloxidazei din pară asupra acidului vanilic poate fi observată o multiplicare și o intensificare a benzilor din domeniul 3500-3900 cm-1 caracteristică grupării O-H. Și în domeniul 1700-1500 cm-1 se poate observa o bandă de absorbție intensă corespunzătoare frecvenței de vibrație a legăturii C=O. Benzile din domeniul 2900-3000 cm-1 sunt mai puțin intense față de cele observate în cazul soluției inițiale de acid vanilic.

Spectrul FTIR al catecolului + pară

Figura 6.11. Spectrul FTIR al soluției de catecol după acțiunea polifenoloxidazelor din pară

Spectrul FTIR al soluției de catecol după acțiunea polifenoloxidazelor din pară este mult mai complex decât cel al soluției inițiale de catecol putând fi observate numeroase benzi intense de vibrație. În acest spectru se pot evidenția mai ușor benzile de vibrație a grupărilor funcționale (OH, CH aromatice).

Spectrul FTIR al acidului galic + pară

Figura 6.12. Spectrul FTIR al soluției de acid galic după acțiunea polifenoloxidazelor din pară

În figura 6.12. este prezentat spectrul soluției de acid galic după acțiunea polifenoloxidazelor din pară care prezintă modificări importante față de spectrul inițial al catecolului. În domeniul 1700-1065 cm-1 se observă o multiplicare și o intensificare a benzilor relaționate cu gruparea carbonilică.

Spectrul FTIR al acidului vanilic + banană

Figura 6.13. Spectrul FTIR al soluției de acid vanilic după acțiunea polifenoloxidazelor din banană

Spectrul FTIR al soluției rezultate în urma reacției de oxidare enzimatică a acidului vanilic sub acțiunea polifenoloxidazei din banană prezintă modificări importante față de spectrul inițial evidențiindu-se gruparea carbonilică în domeniul 1400-1800 cm-1 și modificarea intensității benzilor din domeniul 2900-3000 cm-1.

Spectrul FTIR al catecolului + banană

Figura 6.14. Spectrul FTIR al soluției de catecol după acțiunea polifenoloxidazelor din banană

Soluția de catecol suferă și sub acțiunea polifenoloxidazelor din banană multiple modificări ale benzilor, această susceptibilitate la oxidare datorându-se grupărilor OH din poziția orto.

Spectrul FTIR al acidului galic + banană

Figura 6.15. Spectrul FTIR al soluției de acid galic după acțiunea polifenoloxidazelor din banană

Spectrul FTIR al soluției de acid galic după acțiunea polifenoloxidazelor din banană este mult mai complex față de cel al soluției de acid galic, benzile schimbându-și intensitatea. Banda de vibrație a legăturii OH se observă la valori mai mari ale numerelor de undă în domeniul 3566-3900 cm-1. Picurile din domeniul 2300-2500 cm-1 sunt mai intense și corespund vibrațiilor grupării C-H.

Se poate concluziona faptul că spectrele FTIR ale probelor sunt foarte complexe, observându-se numeroase benzi de vibrație relaționate cu vibrațiile tuturor grupărilor funcționale. Față de spectrele inițiale ale compușilor acid vanilic, catecol și acid galic se observă multiplicarea benzilor de vibrație și intensificarea acestora, fapt care indică că se formează noi compuși polimerici prin reacții de oxidare enzimatică.

6.2. Analiza activității enzimatice prin spectrometrie în domeniul vizibil

Modul de lucru

Din soluțiile stoc de compuși fenolici de concentrație 10-3 mol/L se măsoară cu ajutorul unei pipete 5 mL de soluție și se adaugă în eprubete curate și uscate. În fiecare soluție se adaugă un gram de fruct (măr, pară și banană) și se păstrează la temperatura de 370C timp de 20 de minute într-o baie de apă. După această perioadă de timp în care are loc reacția enzimatică eprubetele se scot din baia de apă și se introduc într-o baie de gheață cu scopul de a opri reacția și apoi se înregistrează spectrul de absorbție în domeniul vizibil (400-800 nm) față de apa ultrapură.

În primă etapă s-a verificat spectrofotometrul prin înregistrarea liniei de bază, în absența soluțiilor de analizat. În Figura 6.16. se prezintă linia de bază înregistrată cu spectrofotometrul.

Figura 6.16. Linia de bază în domeniul Vis (400-800nm)

Așa cum se observă în figură se obține o linie orizontală cu absorbanța A = 0 pentru tot domeniul de lungimi de undă ceea ce arată că spectrofotometrul este calibrat și poate fi folosit pentru înregistrarea datelor experimentale.

Spectrele soluțiilor de compuși fenolici după reacția enzimatică se prezintă în figurile următoare.

Figura 6.17. Spectrele de absorbție în domeniul Vis (400-800nm) al soluțiilor de acid vanilic, catecol și acid galic oxidate de polifenoloxidazele din măr

Așa cum se observă în figură nu se obține o bandă de absorbție bine definită. Acest lucru se datorează faptului că rezultatul reacției enzimatice este un amestec de compuși. Având în vedere că culoarea soluției de analizat este galbenă și în conformitate cu literatura de specialitate, care recomandă ca parametru măsurabil relaționat cu activitatea enzimatică absorbanța la 420 nm, din spectrele absorbție s-a determinat absorbanța la lungimea de undă de 420 nm. Valorile absorbanțelor măsurate pentru cele trei spectre se prezintă în figura de mai jos, sub forma unui grafic de coloane.

Figura 6.18. Absorbanțele soluțiilor după reacția enzimatică la 420 nm

(acid vanilic, catecol, acid galic la care s-a adăugat măr)

Valoarea cea mai mare a absorbanței este obținută în cazul soluției de catecol în care s-a adăugat măr, aceasta având valoarea de 0,34. Acest lucru s-a observat și vizual, soluția catecol+măr fiind cel mai intens colorată dintre cele trei soluții de analizat. Acest lucru se datorează faptului că reacția enzimatică este mai rapidă în cazul catecolului față de acid vanilic și acid galic. Cele două grupări hidroxil situate în poziția orto sunt oxidate, catecolul trece în orto-chinonă, un compus foarte reactiv care declanșează o reacție de polimerizare chimică. În cazul acidului vanilic, compusul orto-chinonic se formează după o etapă de hidroxilare, o etapă lentă, și din acest motiv reacția de îmbrunare este mai lentă. În cazul acidului galic cele trei grupări hidroxil sunt oxidate mai greu și reacția de îmbrunare este mai lentă decât cea în prezența catecolului, dar mai rapidă decât cea observată în cazul acidului vanilic.

Spectrele soluțiilor rezultate după acțiunea polifenoloxidazei din banană asupra acidului vanilic, catecolului și acidului galic se prezintă în Figura 6.19.

Figura 6.19. Spectrul de absorbție în domeniul Vis (400-800nm) al soluțiilor de acid vanilic, catecol și acid galic oxidate de polifenoloxidazele din banană

Așa cum se observă în figura 6.19 nu se obțin benzi de absorbție bine definite, acest lucru datorându-se faptului că rezultatul reacției enzimatice este un amestec de compuși cu niveluri de energie elecronice apropiate ca valoare. Pentru comparare se ia valoarea absorbanței la 420 nm care corespunde culorii galbene. Se obțin următoarele valori ale absorbanței (figura 6.20.) înregistrate pentru cei trei compuși la lungimea de undă de 420 nm.

Figura 6.20. Absorbanțele la 420 nm ale soluțiilor după reacția enzimatică (acid vanilic, catecol, acid galic la care s-a adăugat banană)

Valoarea cea mai mare a absorbanței este obținută în cazul soluției de catecol oxidat de polifenoloxidaza din banană, valoarea acesteia fiind de 0,777. Acest lucru este confirmat și vizual, soluția catecol+banană fiind cea mai intens colorată în galben dintre cele trei soluții supuse analizei. Și în acest caz catecolul se oxidează mai repede decât ceilalți compuși fenolici.

Spectrele soluțiilor rezultate după acțiunea polifenoloxidazei din pară asupra acidului vanilic, catecolului și acidului galic se prezintă în Figura 6.21.

Figura 6.21. Spectrele de absorbție în domeniul Vis (400-800nm) al soluțiilor de acid vanilic, catecol, acid galic după reacția enzimatică datorată polifenoloxidazei din pară

Așa cum se observă în figura 6.21. benzile de absorbție nu sunt bine definite. Absorbanțele au fost măsurate și în acest caz tot la lungimea de undă de 420 de nm. Astfel, cu atât culoarea este mai intensă cu atât valoarea absorbanței este mai mare. Valorile absorbanțelor măsurate pentru cele trei compuși se prezintă în figura de mai jos.

Figura 6.22. Absorbanțele soluțiilor după reacția enzimatică la 420 nm

(acid vanilic, catecol, acid galic la care s-a adăugat pară)

Cea mai mare valoare a absorbanței este obținută în cazul soluției de catecol în care s-a adăugat pară, aceasta fiind de 0,532. Se poate observa că din cele trei soluții analizate, catecolul se oxidează cel mai ușor datorită celor două grupări OH în poziție orto. Soluția catecol+pară este cea mai intens colorată dintre cele trei soluții de analizat. Pe locul doi se situează soluția obținută prin adăugarea unui gram de pară în soluție de acid galic, absorbanța măsurată fiind de 0,295 fapt ce se datorează celor trei grupări hidroxil care se oxidează mai greu.

6.3. Cinetica reacțiilor enzimatice

Pentru studiul cineticii reacției enzimatice s-a procedat astfel. În cuveta spectrofotometrului s-a introdus soluție de compus fenolic de concentrație 10-3 mol/L și un gram de fruct. Se înregistrează absorbanța la 420 nm timp de 15 minute pentru fiecare soluție, înregistrându-se absorbanța din 60 în 60 de secunde.

Evoluția absorbanței la 420 nm în cazul soluțiilor de acid vanilic în care s-au adăugat măr, pară sau banană se prezintă în figura 6.23.

Figura 6.23. Evoluția absorbanței la 420nm în timp a unei soluții de acid vanilic în care s-au adăugat măr, pară sau banană

În primele 120 de secunde se poate observa o creștere bruscă a absorbanței la 420 nm în cazul în care sursa de polifenoloxidaze este mărul. Această creștere rapidă se datorează acțiunii enzimei din măr care catalizează hidroxilarea acidului vanilic cu obținerea derivatului orto-dihidroxilic. Acest derivat este oxidat apoi cu obținerea polimerilor de culoare galbenă.

Creșterea absorbanței are loc exponențial până la 720 de secunde după care viteza de reacție scade ajungându-se la starea staționară a acțiunii enzimatice. În cazul utilizării perei sau bananei ca sursă de polifenoloxidază valorile absorbanței la 420 nm cresc mult mai lent. Acest lucru indică faptul că polifenoloxidazele din pară și banană au o acțiune oxidantă limitată asupra acidului vanilic, care este un compus monofenolic. În aceste cazuri acțiunea de hidroxilare a acidului vanilic este mult mai lentă.

Absorbanțele înregistrate după 900 de secunde sunt prezentate în figura 6.24. sub formă grafică.

Figura 6.24. Absorbanțele la 420 nm după un timp de reacție de 900s pentru soluția de acid vanilic în care s-a introdus măr, pară sau banană

Din aceste rezultate se poate afirma că polifenoloxidaza din măr este cea mai eficientă în reacția de oxidare a acidului vanilic.

Evoluția absorbanței la 420 nm în cazul soluțiilor de catecol în care s-au adăugat măr, pară sau banană se prezintă în Figura 6.25.

Figura 6.25. Evoluția absorbanței la 420nm în timp a unei soluții de catecol în care s-au adăugat măr, pară sau banană

Se poate observa ca în primele 50 de secunde se înregistrează o creștere foarte bruscă a absorbanței la 420nm când sursa de polifenoloxidaze este mărul. Creșterea absorbanței are loc exponențial până la 900 de secunde. În cazul utilizării fructelor pară sau banană ca sursă de polifenoloxidază valoarea absorbanței crește mai lent.

În cazul utilizării perei valoarea absorbanței crește treptat încă de la început, în timp ce în cazul bananei a înregistrat la t=0 secunde o absorbanță de 0,125. În cazul bananei după 550 de secunde se ajunge la un maxim de 0,500 și apoi valoarea rămâne constantă.

Absorbanțele înregistrate după 900 de secunde sunt prezentate în figura 6.26. sub formă grafică.

Figura 6.26. Absorbanțele la 420 nm după un timp de reacție de 900s pentru soluția de catecol în care s-a introdus măr, pară sau banană

În urma rezultatelor obținute se poate afirma că polifenoloxidaza din măr este cea mai eficientă în reacția de oxidare a catecolului, înregistrând o absorbanță de 0,8333 după 900 de secunde

Evoluția absorbanței la 420 nm în cazul soluțiilor de acid galic în care s-au adăugat măr, pară sau banană se prezintă în Figura 6.27.

Figura 6.27. Evoluția absorbanței la 420nm în timp a unei soluții de acid galic în care s-au adăugat măr, pară sau banană

Acidul galic se găsește liber în natură, răspândit fiind în ceaiuri, struguri, coaja de stejar etc. În figura anterior prezentată se observă că polifenoloxidaza din măr este cea mai activă observându-se o creștere rapidă a absorbanței la 420 nm, atingând un punct de maxim după 650 de secunde, urmat apoi fiind de o scădere rapidă până la valoarea de 0,325 la 720 de secunde, înregistrând în continuare o creștere lentă până la 900 de secunde. Soluția acid galic+pară înregistrează o absorbanță maximă de 0,160, creșterea fiind una exponențială. La soluția în care s-a folosit banana se înregistrează o creștere constantă cu mici deviații în primele 50 de secunde, fiind urmată apoi de o creștere lentă ajungându-se la valoarea de 0,100 la sfârșitul procesului (900 secunde).

Absorbanțele înregistrate după 900de secunde sunt prezentate în figura 6.28. sub formă grafică:

Figura 6.28. Absorbanțele la 420 nm după un timp de reacție de 900s pentru soluția de acid galic în care s-a introdus măr, pară sau banană

În urma rezultatelor obținute se poate afirma ca polifenoloxidaza din măr este cea mai eficientă în reacția de oxidare a acidului galic, înregistrând o absorbanță de 0.793 după un timp de reacție de 900 de secunde.

Se poate afirma că toate fructele sunt surse valoroase de polifenoloxidaze care acționează eficient asupra compușilor fenolici transformându-i în polimeri de culoare galbenă.

6.4. Determinarea cantitativă a catecolului prin metoda enzimatică

Catecolul este un compus organic, toxic cunoscut și sub numele pirocatehină sau 1,2-dihidroxibenzen. Cantități mici de catecol apar în mod natural în fructe și legume. Aproximativ 50% din catecolul sintetic este utilizat în producția de pesticide, restul fiind folosit ca precursor în chimia fină, cum sunt parfumurile și produsele farmaceutice.

Din studiile spectrofotometrice s-a determinat că polifenoloxidazele acționează cel mai eficient asupra catecolului. Dintre sursele de polifenoloxidaze folosite în această lucrare de licență s-a observat că polifenoloxidaza din banană are o acțiune rapidă și eficientă de oxidare enzimatică a catecolului.

În acest studiu s-a realizat o metodă de determinare cantitativă a catecolului printr-o metodă enzimatică înregistrând absorbanța la 420 nm.

S-a preparat o soluție stoc de catecol în apă de concentrație 0,01 mol/L. Din această soluție s-au preparat soluții de concentrații diferite conform tabelului de mai jos.

Tabelul 6.2 Prepararea soluțiilor de analizat

În fiecare soluție de analizat se adăugă câte un gram de banană. Pentru soluția martor se folosesc 10 mL apă ultra pură în care se adaugă un gram de banană. Eprubetele se păstrează timp de 20 minute la temperatura de 400C pentru ca reacția enzimatică să aibă loc. Apoi se separă 5 ml de soluție, se lasă 10 minute în repaos pe baie de gheață și se măsoară absorbanța la 420nm, lungimea de undă specifică culorii galben.

Imaginea cu probele de analizat se prezintă în figura următoare.

Figura 6.29. Eprubetele cu soluțiile de catecol + 1 g de banană

Rezultatele obținute în urma analizei spectrofotometrice se prezintă în tabelul următor:

Tabel 6.3. Valorile absorbanțelor la 420 nm

S-au reprezentat grafic, în sistemul de coordonate xOy, absorbanța în funcție de concentrație (dreapta de calibrare):

Figura 6.30. Dreapta de calibrare pentru catecol

Se observă că există o dependență liniară între absorbanță și concentrație cu un coeficient de determinare (R2) de 0,9886, ceea ce demonstrează că metoda realizată în acest studiu poate fi folosită în studii de cuantificare a probelor care conțin catecol.

Astfel, se prepară două probe de concentrație cunoscută pentru a verifica dacă dreapta de calibrare obținută experimental poate fi folosită pentru cuantificarea catecolului din probe reale și care este eroarea de determinare. Rezultatele obținute sunt prezentate în tabelul următor.

Tabel 6.4. Valorile absorbanțelor înregistrate în cazul probelor de concentrație cunoscută

Din ecuația dreptei de calibrare s-a calculat concentrațiile probelor analizate și s-au comparat rezultatele obținute cu concentrațiile exacte, cunoscute ale aceleiași probe.

Rezultatele se prezintă în tabelul următor:

Tabel 6.5. Rezultatele obținute la cuantificarea catecolului în probele folosite pentru verificarea calitații metodei

Se observă ca diferențele dintre concentrația teoretică și cea experimentală sunt foarte mici, eroarea de determinare fiind în domeniul 0,53 – 1,77%.

Eroarea de determinare s-a calculat cu relația:

eroarea=|ce-cc|/ce ×100

unde:

ce – concentrația exactă, mol/L;

cc – concentrația calculată, mol/L.

Deci, se poate afirma că metoda spectrofotometrică se poate aplica pentru determinarea catecolului din mostre reale cu o eroare mai mică de 2%.

CONCLUZII

Studiul acțiunii enzimelor asupra compușilor fenolici (mono-, di- și trifenoli) prin spectrometrie FTIR a arătat că polifenoloxidazele din fructe acționează cu formarea unor compuși de natură polimerică. Benzile de vibrație ale grupărilor funcționale sunt amplificate și multiplicate în cazul compușilor obținuți din reacția enzimatică în comparație cu spectrele compușilor inițiali.

Studiul acțiunii enzimelor asupra compușilor fenolici (mono-, di- și trifenoli) prin spectrofotometrie în domeniul vizibil a demonstrat că în toate cazurile se obțin pigmenți de culoare galbenă, iar catecolul este cel mai susceptibil la oxidare.

Cinetica proceselor enzimatice a arătat că sursa naturală cea mai bogată în polifenoloxidază este banana și că catecolul se oxidează cel mai rapid.

Catecolul s-a determinat cantitativ prin metoda spectrofotometrică folosind ca sursă naturală de polifenoloxidaze banana și măsurând absorbanța la 420 nm. Eroarea de determinare a catecolului prin această metodă este mai mică de 2%.

BIBLIOGRAFIE

Minim 40 referinte bibliografice