Istoricul cercetarilor [309806]

Introducere

Tehnologia CRISPR ([anonimizat]) a fost identificată în natură. Bacteriile o folosesc pentru a-și edita propriul ADN de milioane de ani.

[anonimizat] (CRISPR) între care sunt memorate secvențe de virusuri. În momentul în care o bacterie este infectată cu un virus care a [anonimizat]-ul acesteia. CRISPR este sistemul imunitar adaptiv al bacteriilor.

În ultimii 20 de ani cercetătorii au exploatat sistemul CRISPR, l-[anonimizat] a detecta orice secvență ADN de interes și o [anonimizat].

Descoperit la începutul anilor '90 [anonimizat] a [anonimizat].

[anonimizat]. [anonimizat] ([anonimizat]-Cas9) [anonimizat], ușor de utilizat și remarcabil de puternic.

Istoricul cercetarilor

Dezvoltarea tehnologiei ADN recombinant în anul 1970 a marcat începutul unei noi ere pentru biologie. Pentru prima oara biologii au dobandit capacitatea de a [anonimizat] a facut posibila studierea genelor astfel aducand insemnate contributii in medicina si biotehnologii.

Descoperirea CRISPR a aparut independet in trei parti ale lumii. Prima descoperire a [anonimizat] 1987 (Fig.1.). Ei au clonat accidental o parte a unei secvente CRISPR impreuna cu o [anonimizat]. (Patrick si colab., 2014)

In anul 1993, in Olanda un grup de cercetatori au publicat doua articole despre un grup de „repetitii directe intrerupte’’ la Mycobacterium tuberculosis.

[anonimizat], Spania, studiind doua organisme din Archaea (Haloferax si Haloarcula), a obervat deasemena prezenta acestor secvente repetitive.

Pana in anul 2000, Mojica si elevii sai au realizat un studiu al literaturii stiintifice descoperind ca secventele de interes au fost identificate la 20 de specii de microbi apartinand aceleiasi familii. In 2001, [anonimizat] – structuri genetice de palindromuri interspatiate regulat.

O perspectivă esențială a venit în 2005 cu observația că multe secvențele de separare din cadrul CRISPR derivă din plasmide și au origini virale.

In 2007, s-a [anonimizat]. Aceasta a fost o prima aplicatie de succes a CRISPR-Cas in scopuri biotehnoloice.

In 2008, s-a [anonimizat] (crARN) serveste drept ghid pentru complexul de proteine Cas in cazul infestarii virale a E. coli. Aceeasi activitate a fost raportanta ultrerior si in cazul Staphylococcus epidermidis (Doudna si Charpentier, 2014).

Fig.1. Istoricul cercetarilor dupa Patrick si colab. 2014

Editarea genetică este un proces vechi și important pentru dezvoltarea umanității. La început aceasta se făcea fără a cunoaște detalii despre genotip și se efectua doar pe baza fenotipului, reprezentând încă de acum câteva mii de ani soluția ideală pentru supraviețuire. Primele „modificări” genetice s-au efectuat în domeniul agriculturii prin selecția celor mai bune soiuri de plante și clonarea acestora, lucru ce a mărit cantitatea de producție a plantelor cultivate. Un proces asemănător a transformat diferite specii de lupi în speciile canine de astăzi; însă aceste modificări au fost făcute în mare parte neintenționat, fără cunoașterea implicațiilor pe care le vor avea.

Următorul pas a fost simpla descoperire a codului vieții, limbajul genetic format din patru „litere” care reprezintă bazele acidului dezoxi-ribonucleic: A (adenină), C (citozină), G (guarină) și T (timină). Aceste 4 litere codifică toate informațiile unui anumit organism într-o structură spiralată numită ADN. Odată cu această descoperire a apărut și dorința de a putea modifica codul genetic; dacă ADN-ul este „cartea de instrucțiuni” a fiecărui organism.

Înainte de a îmbunătățirea codului genetic uman, preocuparea principală ar fi repararea atunci când este cazul. Știm deja că există boli cauzate de defecțiuni ale acestor instrucțiuni; de exemplu, există o multitudine de defecțiuni care provoacă cancer, o boală incurabilă care a existat dintotdeauna. În realitate șansele sunt ca însăși îmbătrânirea să fie o măsură de protecție a naturii împotriva cancerului. Astfel au apărut diferite tehnologii de modificare a ADN-ului în mod direct, nu numai prin selecție naturală. Modificarea unui cod atât de complex nu este o sarcină simplă, motiv pentru care s-au făcut prea puține îmbunătățiri cu costuri mult prea mari.

Tehnici avansate de studiu ale ADN-ului

II.1. Ingineria genetică

Ingineria genetică reprezintă un ansamblu de metode de lucru prin care se manipulează materialul genetic la nivel molecular și celular. Astfel se obțin microorganisme, plante și animale reprogramate genetic, în al căror genom sunt incluse gene străine, utile, exprimabile și transmisibile stabil la descendenți.

II.1.1. Tehnici utilizate în ingineria genetică

Ingineria genetică utilizează metode de cultură in vitro a celulelor și țesuturilor animale și vegetale și tehnologia ADN-ului recombinat. Pe aceste metode se bazează hibridarea somatică la plante și animale, haploidia prin androgeneză și ginogeneză experimentală, precum și clonarea

Hibridarea somatică la plante se realizează cu ajutorul protoplaștilor, celule în care s-a distrus peretele celular prin tratamente enzimatice (exemple: celulaza, pectinaza). Drept urmare, fiecare celulă va fi perfect izolată de celelalte, permițând efectuarea experimentelor.

Protoplaștii pot fi izolați din orice organ al plantei. Ei manifestă totipotență, având capacitatea să regenereze plante întregi, prin cultivarea pe mediul artificial in vitro (exemplu mediu solid de agar-agar).

Fiind lipsiți de perete celular, protoplaștii pot fuziona spontan sub influența anumitor substanțe (nitrat de sodiu, polietilenglicol, ioni de calciu). După fuzionarea celulelor, fuzionează nucleii, se reface peretele celular și începe diviziunea celulară. După circa trei săptămâni se formează calusuri de culoare verde, care încep să crească. Pentru a regenera plantele, calusurile se transferă în medii speciale de diferențiere.

În urma hibridării somatice rezultă hibrizi interspecifici asemănători cu cei obținuți prin hibridarea sexuată.

Avantajul hibridării este acela că se pot obține hibrizi celulari între specii diferite care în mod normal nu se pot încrucișa sexuat. Un exemplu este cazul amfiploizilor de tutun (2n = 42 cromozomi) obținuți din două specii de tutun: Nicotiana glauca (2n = 24 cromozomi) și Nicotiana langsdorfii (2n = 18 cromozomi). Hibrizii obținuți înglobează numărul de cromozomi ai celor doi părinți.

Alte avantaje ale utilizării protoplaștilor sunt: înmulțirea vegetativă foarte rapidă în urma căreia rezultă clone; obținerea unor forme poliploide ce vor fi utilizate în ameliorare; inducerea de mutante; transferul de gene sau cromozomi în protoplaști; transferul de cloroplaste în protoplaști; obținerea unor plante rezistente la viroze, etc.

Haploidia prin androgeneză și ginogeneză experimentală este o altă metodă de cultură in vitro.

Androgeneza constă în reprogramarea inormației genetice a microsporilor (grăunciorilor de polen), în culturi in vitro. Ulterior, prin diviziuni repetate, rezultă plante haploide (conțin doar jumătate din numărul de cromozomi ai speciei).

Există două tipuri de androgeneză:

directă, care se realizează prin embriogeneză (din microspori se obțin embrioizi, care prin diviziuni repetate formează plante haploide);

indirectă, care se realizează prin organogeneză (din calus, prin diferențiere, se formează țesuturi și organe, și ulterior, plante haploide).

Factorii cu o importanță deosebită în reușita androgenezei experimentale sunt: vârsta anterelor, mediul de cultură, hormonii, temperatura și lumina.

Plantele haploide obținute prin androgeneză prezintă următoarele avantaje: sunt pure genetic, sunt folosite pentru obținerea liniilor izogene (sunt homozigote pentru toate genele), sunt utilizate pentru producerea de soiuri noi și de hibrizi ce manifestă fenomenul heterozis; ajută la identificarea rapidă a mutațiilor recesive și la inducerea unor mutații artificiale.

Ginogeneza constă în reprogramarea informației genetice a macrosporilor (sacilor embrionari) în culturi in vitro. Astfel, dintr-un nucleu haploid, prin diviziuni repetate, se vor forma plante haploide.

Deoarece plantele haploide astfel obținute sunt sterile, ele sunt diploidizate (prin tratamente cu colchicină) și apoi utilizate în diverse experimente.

II.1.2. Hibridarea somatică la animale

Primele încercări au fost făcute folosind celule de șoarece, aparținând la două linii diferite, cultivate în amestec; ei au descoperit că acestea pot fuziona și forma celule hibride. Aceste celule prezintă caracteristici morfologice, fiziologice și biochimice diferite de cele ale celulelor fuzionate, dar înglobează numărul total de cromozomi ai genitorilor. Hibridarea celulară, la animale, reușește dacă sunt rezolvate două impedimente:

– găsirea unui agent inducător care să grăbească fuzionarea celulelor; este utilizat virusul Sendai inactivant;

– selectarea celulelor hibride din cultură.

S-au găsit medii de cultură selective în care celulele hibride se multiplică, iar celulele genitorilor sunt eliminate.

O dată îndeplinite aceste condiții, are loc fuzionarea celulelor somatice diferite și formarea heterocarionului.

Ulterior, are loc fuzionarea nucleilor, urmată de diviziuni mitotice succesive. În final, se formează celulele hibride somatice. Aceste celule nu pot regenera organisme animale hibride. Ele formează clone celulare hibride, la care sunt eliminați preferențial cromozomii uneia dintre speciile genitoare. Astfel, în culturile celulare hibride om-șoarece, se elimină o parte din cromozomii umani. Drept urmare, în descendența hibridă există o variație semnificativă a numărului de cromozomi.

Importanța practică a acestui fenomen constă în faptul că pot fi realizate hărți cromozomale umane, care permit o identificare precisă a genelor normale și mutante pe cromozomi.

Celulele hibride care conțin restructurări cromozomale sunt testate ulterior, pentru prezența sau absența enzimelor specifice. Astfel, sunt identificate cu precizie genele ce determină apariția maladiilor ereditare umane.

În prezent, se produc cibrizi, hibrizi celulare rezultați din formarea enucleate cu o celulă nucleată.

Clonarea organismelor reprezintă un ansamblu de procedee prin care se cultivă o singură celulă și se obține o colonie de celule identice. În urma clonării rezultă clone (celule și organisme pure, identice, ce provin dintr-un singur părinte).

La plante (care prezintă fenomenul de totipotență), clonarea se realizează prin androgeneză și ginogeneză. La animale, se realizează transplantul de nuclei străini în ovule la care s-au îndepărtat nuclei.

Metoda clonării prezintă avantajul că, de la un singur organism adult, se pot obține copii perfect identice, din punct de vedere genetic, ale organismului donator.

II.1.3. Tehnologia ADN-ului recombinat

Această tehnologie grupează tehnicile care permit sinteza chimică sau izolarea genelor unor organisme, urmată de inserția acestora în genomul unor celule aparținând altei specii. Gazda va copia ADN-ul străin inserat artificial și-l va transmite descendenței. Rezultă astfel organisme reprogramate genetic.

Avantajul acestei tehnici constă în faptul că toate depăși barierele de specie (poate transfera ADN-ul de la o specie la alta).

Etapele acestei tehnologii sunt: izolarea ADN-ului corespunzător unei anumite gene; multiplicarea sa; construirea unor molecule de ADN hibride; transferul de la o specie la alta.

Pentru a obține ADN recombinat se folosesc microorganisme (colibacili, drojdie de bere, Argobacterium sp.), enzime specifice și vectori.

Fig.. Ilustrație a diferitelor aplicații ale tehnologiei ADN recombinant.

II.1.4. Reacția PCR (Polymerase Chain Reaction )

Reacția PCR (Polymerase Chain Reaction = Reacția de Polimerizare în Lanț) este o metodă de amplificare enzimatică a unei anumite secvențe de ADN pe care dorim să o analizăm. Într-un timp foarte scurt tehnica s-a transformat într-o unealtă atât de analiză a genelor cât și a tehnicilor de recombinare, permițând detectarea ADN din celule individuale și determinarea secvențelor provenite chiar și de la speciile dispărute. Aceasta se datorează sensibilitații extrem de ridicate a acestei metode, capabilă de a detecta chiar și o singură moleculă de ADN dintr-o secvență specifică, în prezența unui exces de secvențe de ADN de 10.000.000 ori mai mare.

Această metodă a fost mai întâi folostiă pentru amplificarea ADN codificant pentru β-globină și pentru diagnosticul prenatal al siclemiei. La început pentru extinderea primerilor atașați s-au folosit fragmente Klenow din ADN polimeraza I de la Escherichia coli, însă enzima a fost inactivată de temperaturile ridicate necesare pentru denaturarea ADN bicatenar. De aceea în timpul fiecărui ciclu trebuia adăugat enzimă proaspătă. În ceea ce privește polimeraza utilizată în prezent, ea are o caracteristică specială ce o face superioară enzimelor utilizate la început și anume faptul că este stabilă la temperaturi mari. Datorită acestui aspect, nu mai trebuie adăugată în fiecare ciclu de amplificare deoarece enzima nu este inactivată. Această polimerază a fost izolată dintr-o bacterie, Thermophilus aquaticus care trăiește în izvoarele calde. De aici ea a primit și numele de Taq-polimeraza.

Tehnica PCR se bazează pe de-o parte pe capacitatea organismelor de a-și replica propriul ADN, iar pe de altă parte, pe comportamentul specific al majorității polimerazelor de a recunoaște și a se atașa temporar la ADN monocatenar într-un punct adiacent unei porțiuni bicatenare. Odată atașate, aceste polimeraze utilizează deoxi-nucleotid-trifosfații adăugați în mediul de reacție precum și energia stocată în legăturile fosforice pentru atașarea nucleotidelor la catena de ADN, sintetizând astfel un nou lanț bicatenar. Întregul proces implică de asemenea repetarea unor cicluri termice, fiecare ciclu fiind alcătuit din 3 pași: primul pas constă în denaturarea ADN-ului dublu catenar la o temperatură de 90 oC, urmat de o scădere a temperaturii pentru atașarea primerilor, ultimul pas constând în creșterea ușoară a temperaturii pentru extinderea catenei de ADN cu ajutorul polimerazei și a deoxi-nucleotid-trifosfaților.

Orice genă, chiar și din genomurile cele mai complexe poate fi amplificată în mod specific prin această metodă atâta timp cât secvențele de nucleotide care flanchează regiunea țintă sunt cunoscute.

Primerii constituie perechi de secvențe nucleotidice de dimensiuni mici (cu o lungime cuprinsă între 18-30 de perechi de baze), sintetizate artificial, complementare fiecărei regiuni care flanchează gena de interes, unul dintre ei fiind complementar catenei directe, iar celălalt fiind complementar catenei reverse.

Pentru realizarea reacției PCR, mici cantități de ADN sunt combinate cu primerii, deoxinucleotid trifosfații, tampon de reacție, Taq-polimeraza, precum și co-factori pentru polimerază, cum este magneziul, în general adăugat sub formă de clorură de magneziu. Tot acest amestec funcționează în mod repetat, copiind secvența de ADN dintre primeri la o viteză de reacție și specificitate determinate în special de temperatură, iar rezultatul amplificărilor va depinde de interacțiunile eficiente dintre toți acești compuși.

Deci, un ciclu de amplificare este alcătuit din 3 pași: denaturarea ADN, atașarea primerilor și elongarea.

Denaturarea

În această fază, ADN-ul bicatenar este denaturat la ADN monocatenar datorită temperaturii ridicate (Fig.2) fiind de asemenea oprită toată activitatea enzimatică, precum și reacția de elongare ce a avut loc în etapa precedentă. Trebuie folosită o temperatură de peste , în general preferându-se temperatura de . Încălzirea insuficientă sau exagerată pe parcursul etapei de denaturare duce la imposibilitatea desfășurării reacției de polimerizare. De asemenea și timpul de denaturare este foarte important deoarece o denaturare prelungită poate reduce activitatea enzimei Taq-polimeraza. Spre exemplu, după 30 de cicluri de denaturare a câte 60 de secunde fiecare, Taq-polimeraza își pierde aproape jumătate din activitate. În general, echilibrul optim între temperatură și durată, este de 30 de secunde la 94°C. Este foarte important însă și reacția să atingă o temperatură și durată la care să se producă complet separarea lanțurilor, astfel că de multe ori este recomandată o durată de 60-120 de secunde pentru temperatura de 94-95°C.

Fig.2. Etapa de denaturare a ADN din timpul reacției PCR (sursa: https://www.btci.org/k12/bft/pcr/pcr_geneticscreening.html)

b. Atașarea primerilor la ADN

Acest proces se realizează prin scăderea temperaturii soluției la 50-60 oC timp de 15 secunde până la 2 minute. Temperatura la care are loc atașarea se calculează în funcție de structura primerilor. Expunerea limitată la temperaturi înalte ajută la menținerea activității polimerazei la cote maxime pe parcursul reacției. Atașarea primerilor poate depinde de concentrația acestora, disponibilitatea locurilor de atașare sau prezența unor poziții de atașare non-ideale. În timpul în care temperatura este coborâtă de la etapa de denaturare, primerii se mișcă aleator în mediul de reacție, conduși de mișcarea browniană (Fig.3). Dacă temperatura de aliniere este prea mare nu toate moleculele de primer se vor atașa de ADN, iar dacă este prea mică pot avea loc alinieri nespecifice, generând astfel produși de PCR nedoriți.

Fig.3. Atașarea primerilor la matrița de ADN (sursa: https://www.btci.org/k12/bft/pcr/pcr_geneticscreening.html)

c. Extensia (elongarea)

Fiecare ciclu se termină cu câteva minute (15 secunde până la 3 minute), la 68 oC, în cursul cărora ADN polimeraza specială alungește secvența primerilor, sintetizând replicile catenelor ADN țintă, adăugând deoxiribonucleotide la capătul 3ʼ al fiecărui primer (Fig.4). În ceea ce privește temperatura, polimeraza Taq funcționează bine la 72°C.

Fig.4. Extensia ADN-ului (sursa: https://www.btci.org/k12/bft/pcr/pcr_geneticscreening.html)

Taq polimeraza se leagă atât de matrița de ADN monocatenar cât și de deoxi-nucleotid-trifosfații care se găsesc în mediul de reacție și utilizează energia stocată în legăturile trifosfat pentru a cataliza reacția de atașare a nucleotidelor la a doua catenă a ADN. Enzima mută apoi noul capăt dublu-catenar, procesul fiind repetat de sute și chiar mii de ori pe secundă. ADN polimeraza este unidirecțională. Începe prin a sintetiza capătul 3' al molecului dublu catenare și sintetizează ADN nou în direcția 5'-3'. Cu toate acestea, natura bipolară a celor două catene complementare ale helixului standard face posibil ca o polimerază să sintetizeze oricare din catene.

Cele mai multe reacții PCR au între 20 – 40 asemenea cicluri. Termocycler-ul ridică și coboară ciclic temperatura amestecului de reacție, sub coordonarea riguroasă a unui computer. De obicei rata de încălzire este de 0,3°C pe secundă și cea de răcire de 1°C pe secundă, pentru un singur ciclu de aproximativ 3,55 minute. Teoretic, după 30 de cicluri, fiecare genă țintă este amplificată de 230 ori.

II.1.5. Realizări și perspective ale ingineriei genetice

Sinteza artificială a genelor

Prima realizare în domeniu a fost sintetizarea artificiala a drojdiei de bere, gena care determină sinteza de ARN-t ce transferă aminoacidul alanina la locul sintezei proteice.

Ulterior, s-au realizat sinteze artificiale de gene atât la procariote cât și la eucariote. Astfel, s-au sintetizat artificial genele care intervin în producerea hemoglobinei la iepure, ovalbuminei la găină, insulinei, hormonului de creștere, somatostatinei și interferonului la om.

În prezent, pentru a sintetiza artificial gene, se pornește de la ARN-m folosit ca matriță pentru sinteza ADN-ului. De exemplu, pentru artificială a genei ce determină producerea hormonului de creștere uman s-a extras ARN-m din hipofiză și s-a introdus în Escherichia coli care s-a cultivat industrial. Aceasta a produs cantități crescute de hormon.

Prin programare genetică se obțin substanțe antitumorale eficiente în terapia cancerului.

Fig.2. Aplicatiile ingineriei genetice (dupa Patrick, 2014).

CRISPR – Sistem imun adaptativ al bacteriilor

Fig.3. Sistemul CRISPR-Cas9 (Sursa: https://en.wikipedia.org/wiki/CRISPR)

Studierea unei secvențe mai ciudate în codul genetic al unor bacterii a dus la dezvoltarea unei tehnologii noi de modificare a genotipului, prima tehnologie cu potențialul unei rate de succes de 100%.

Această secvență de ADN a primit numele CRISPR , iar împreună cu genele și cu proteinele Cas (CRISPR associated) formează un sistem de protecție avansat împotriva virușilor și a plasmidelor.

Fig.4. Mecanismul imunității CRISPR în diferite tipuri de clasificări CRISPR / Cas.

CRISPR este o familie de secvențe ADN din bacterii. Secvențele conțin fragmente de ADN din viruși care au atacat bacteria. Aceste fragmente sunt folosite de bacterii pentru a detecta și a distruge ADN-ul de la virusuri similare în timpul atacurilor ulterioare. Aceste secvențe joacă un rol-cheie într-un sistem de apărare bacteriană și formează baza unei tehnologii cunoscute sub numele de CRISPR – Cas9 care modifică în mod eficient și specific genele din cadrul organismelor.

Sistemul CRISPR este un sistem imunitar procariotic care conferă rezistență la elemente genetice străine, cum ar fi cele prezente în plasmide și fagi care oferă o formă de imunitate dobândită. ARN-ul care conține secvența de distanțare ajută proteinele Cas (CRISPR-asociate) să recunoască și să taie ADN exogen. Alte proteine Cas ghidate de ARN taie ARN-ul străin.

Imunizarea împotriva unui anumit virus se dobândește în urma unei infecții, astfel: în cazul în care organismul infectat de virus supraviețuiește atacului, acesta copiază și stochează o porțiune din ADN-ul virusului în regiunea CRISPR locus. Diferitele coduri genetice stocate au primit denumirea de „spațiatoare” (din engleză, spacers) care sunt delimitate de secvențe de ADN denumite repetatoare (din engleză repeats). În cazul unei viitoare invazii a aceluiași virus, sistemul imunitar al bacteriei va folosi spațiatorul respectiv pentru a „încărca” o proteină Cas cu molecule ghid-ARN (gARN) care caută o potrivire cu ADN-ul virusului în cauză. Atunci când găsește o potrivire, gARN va distruge secvența respectivă (Horvath, 2010).

Virușii sunt entități care sunt reprezentate de obicei de o capsulă proteică (capsidă) în care se află genomul viral reprezentat de o moleculă de ADN sau o moleculă de ARN. Datorită dimensiunilor incredibil de mici (8nm-500nm) acestea pot trece prin filtrele construite împotriva patogenilor. Nu pot fi considerate organisme vii datorită faptului că nu au nici un fel de metabolism, dar cu toate acestea au o modalitate de reproducere, infectand o celulă gazdă prin injectarea propriului genom care va începe crearea de copii ale virusului folosind resursele celulei infectate, iar în final virușii noi apăruți părăsesc victima distrugându-i membrana celulară.

Fiind totuși entități extrem de simple putem obține viruși cu genom artificial al cărui comportament poate fi manipulat. Rezultatul a fost inventarea unei noi metode de modificare a codului genetic prin folosirea unui virus pentru injectarea unei anumite secvențe de ADN. Cu toate că virușii sunt construiți pentru injectarea propriului genom viral într-o celulă astfel încât să poată transforma celula infectată într-o fabrică de alți viruși, nu se poate ști unde se va introduce secvența de ADN în cauză; astfel de modificări aveau deci o rată de eșec foarte mare.

Probabil cea mai intuitivă metodă primitivă de modificare genetică este efectiv injectarea de ADN în nucleul unei celule. Totuși, introducerea genelor direct în nucleul celulelor are o rată de eșec chiar mai mare decât metoda virușilor modificați.

O alta opțiune referitor la tipurile de modificări genetice posibile este tăierea lanțului genetic, lucru care a oferit rezultate surprinzătoare datorită modului în care celulele afectate pot răspunde pagubelor aduse genomului. Astfel, există două moduri în care o celulă eucariotă ar putea răspunde la o porțiune de ADN lipsă:

Sistemul de reparare a ADN-ului va lua cele 2 capete ale ADN-ului tăiat și le va lipi, ignorând complet genele care au fost tăiate; acest răspuns din partea celulelor ne permite să dezactivăm anumite gene definitiv.

În locul rămas liber, celula încearcă să repare ADN-ul iar acest lucru se întâmplă adesea copiind o genă asemănătoare pe care o are deja; de exemplu, în cazul genomului uman unde avem două copii ale aceleași gene (de la cei 2 părinți) se va utiliza gena rămasă neatinsă. Acest sistem poate fi păcălit totuși dacă, o dată cu tăierea secvenței țintă se pune la dispoziție o genă injectată care are capetele identice cu secvența ce urmează a fi copiată din cromozomul pereche; acest lucru permite introducerea de gene noi dezvoltate în laborator.

Una din metodele de modificare genetică bazată pe întreruperea lanțului dezoxiribo- nucleic o reprezintă nucleaza “Zinc-Finger”. ADN-ul lezat se poate modifica prin procesul de „recombinare omogenă” în urma căruia celula va folosi gene asemănătoare ce pot fi introduse artificial. Dezavantajul este reprezentat de crearea unui design complicat, pentru o anumită proteină care afectează o anumită zonă de ADN, cu alte cuvinte pentru fiecare modificare genetică dorită este necesară crearea unei noi proteine. Un astfel de proces poate dura ani pentru obținerea rezultatului dorit. Cu toate acestea, această metodă ne-a oferit tehnologia necesară de a folosi recombinarea omogenă în avantajul nostru.

Fig.5. Diagrama mecanismului de apărare antivirală procariot – CRISPR (Sursa: https://en.wikipedia.org/wiki/CRISPR)

Fig.6. Locusul genetic CRISPR ofera bacteriilor un mecanism de aparare pentru a le proteja împotriva infecțiilor repetate cu fagi (Sursa: https://en.wikipedia.org/wiki/CRISPR)

Fig.7. Mecanismele naturale de aparare ale microbianilor (CRISPR) dupa Patrick si colab. 2014.

CRISPR – Cas9 oferă un grad ridicat de fidelitate și o construcție relativ simplă. Aceasta depinde de doi factori pentru specificitatea sa: secvența țintă și PAM. Secvența țintă are 20 de baze lungi ca parte a fiecărui loc CRISPR din matricea crRNA. O matrice tipică crRNA are mai multe secvențe țintă unice. Proteinele Cas9 selectează locația corectă pe genomul gazdei utilizând secvența de legare a perechilor de bază de ADN-ul gazdă.

Secvența PAM din genomul gazdei este recunoscută de Cas9. Cas9 nu poate fi ușor modificat pentru a recunoaște o secvență PAM diferită. Totuși, acest lucru nu este limitator, deoarece este o secvență scurtă și nespecifică (de exemplu, secvența PAM SpCas9 este 5'-NGG-3 ', iar în genomul uman apare la aproximativ fiecare pereche de la 8 la 12).

Odată ce acestea au fost asamblate într-o plasmidă și transfectate în celule, proteina Cas9 cu ajutorul crRNA găsește secvența corectă în ADN-ul celulei gazdă și – în funcție de varianta Cas9 – creează o ruptură unică sau dublă în ADN.

Secventele CRISPR au fost utilizate pentru a reduce cinci până la 62 de gene simultan: celulele de porc au fost proiectate pentru a inactiva toate cele 62 de retrovirusuri endogene porcine din genomul porcului, care au eliminat transinfecția de la porc la celulele umane în cultură. Costul redus al CRISPR comparativ cu alternativele este considerat revoluționar.

Mai multe variante ale CRISPR – Cas9 permit activarea genei sau editarea genomului cu un declanșator extern, cum ar fi moleculele ușoare sau mici. Acestea includ sistemele CRISPR fotoactivabile dezvoltate prin fuzionarea partenerilor de proteine sensibili la lumină cu un domeniu activator și un dCas9 pentru activarea genei sau fuzionarea unor domenii receptive la lumină asemănătoare cu două construcții de diviziune Cas9, sau prin încorporarea aminoacizilor nenaturați în cuști în Cas9, sau prin modificarea ARN-urilor ghidate cu complementări fotocupabile pentru editarea genomului.

Fig.8. Interfernta si activarea CRISPR (dupa Ahmad si colab., 2018).

În 2017, cercetătorii au utilizat cu succes CRISPR-Cas9 ca tratament într-un model de șoarece de surditate genetică umană, prin editarea genetică a ADN-ului în unele celule din urechile șoarecilor vii.

Fig.9. Functiile si organizarea sistemului CRISPR. (dupa Wright, 2016)

Sistemul CRISPR a fost divizat in doua mari categorii:

Clasa I – tipul I, III si IV;

Clasa II – tipul II si V.

Tabel.1. Tipuri majore – CRISPR

Grupurile mici de gene de Cas sunt adesea localizate lângă seturile CRISPR. În mod colectiv, există 93 de gene Cas care sunt grupate în 35 de familii pe baza similitudinii de secvență a proteinelor codificate. 11 din cele 35 de familii formează nucleul de Cas, care include familiile de proteine Cas1 până la Cas9 (Tabel.1.).

Sistemele CRISPR-Cas se încadrează în două clase. Sistemele din clasa 1 utilizează un complex de proteine Cas multiple pentru a degrada acizii nucleici străini. Sistemele din clasa 2 utilizează o singură proteină Cas mare în același scop. Clasa 1 este împărțită în tipurile I, III și IV; clasa 2 este împărțită în tipurile II, V și VI. Cele 6 tipuri de sisteme sunt împărțite în 19 subtipuri. Fiecare tip și majoritatea subtipurilor se caracterizează printr-o "gena de semnătură" găsită aproape exclusiv în categorie. Clasificarea se bazează și pe completarea genelor Cas care sunt prezente. Cele mai multe sisteme CRISPR-Cas au o proteină Cas1. Filogenia proteinelor Cas1 este, în general, de acord cu sistemul de clasificare. Multe organisme conțin sisteme CRISPR-Cas multiple care sugerează că acestea sunt compatibile și pot împărți componente. Distribuția sporadică a subtipurilor CRISPR – Cas sugerează că sistemul CRISPR – Cas este supus transferului de gene orizontal în timpul evoluției microbiene.

Sistemul CRISPR – Cas 9

Cas9 este o endonuclează descoperită în sistemul CRISPR al bacteriei Streptococcus pyogenes, acest sistem fiind mult mai ușor de studiat ca alte sisteme de acest gen.

Cas9 funcționează utilizând două molecule de ARN: CRISPR ARN (crARN) și un trans-activ ARN (tracrARN) ce formează împreună un ghid duplex ARN (Deltcheva si colab. 2011).

În 2012 Jennifer Doudna și Emmanuelle Charpentier au reușit să modifice sistemul Cas9, astfel încât acesta să funcționeze utilizând o singură moleculă gARN obținută prin fuziunea crARN și tracrARN. Acesta a fost un avantaj tehnologic imens care a dus la dezvoltarea unei noi metode de modificare genetică intitulată, intuitiv, CRISPR-Cas9 (Deltcheva si colab. 2011).

O altă utilitate oferită de Cas9 este faptul că se poate folosi pentru a dezactiva anumite gene. Astfel, dacă Cas9 este modificată pentru a nu putea tăia secvențe de ADN, aceasta doar se va lipi de ADN-ul țintă dezactivând genele respective, acestea putând fi reactivate mai târziu. Aceasta s-a dovedit astfel a fi metoda ideală pentru a studia modul în care genotipul afectează fenotipul unui organism.

Sistemului CRISPR – Cas, CRISPR – Cas9, a fost modificat pentru a edita genomul. Prin livrarea in complex a Cas9 cu un ARN de ghidare sintetic (gARN) într-o celulă, genomul celulei poate fi tăiat într-o locație dorită, permițând eliminarea genelor existente și / sau adăugarea unor noi gene.

Tehnicile de editare a genomului CRISPR – Cas au numeroase aplicații potențiale. Utilizarea complexului CRISPR / Cas9-gARN pentru editarea genomului a fost alegerea AAAS pentru descoperirea anului în 2015. Preocupările bioetice au fost ridicate cu privire la perspectiva utilizării CRISPR pentru editarea liniei germinale.

Utilizarea versiunilor "moarte" a lui Cas9 (dCas9) elimină capacitatea de tăiere a ADN-ului CRISPR, păstrându-și în același timp capacitatea de a viza secvențele dorite. Grupuri multiple au adăugat diverși factori de reglementare la dCas9, permițându-i să activeze sau să dezactiveze aproape orice genă sau să își ajusteze nivelul de activitate. Ca ARNi, interferența CRISPR (CRISPRi) oprește genele într-o manieră reversibilă prin direcționarea, dar fără tăierea unui sit. Sit-ul vizat este metilat, modificând epigenetic gena. Această modificare inhibă transcripția. În schimb, activarea mediată de CRISPR (CRISPRa) promovează transcripția genetică. Cas9 este o metodă eficientă de direcționare și taiere a genelor specifice la nivelul ADN-ului. În bacterii, prezența de Cas9 în monoterapie este suficientă pentru a bloca transcripția. Pentru aplicațiile la mamifere, se adaugă o secțiune de proteină. ARN-ul său de orientare vizează secvențele ADN de reglare numite promotori care preced imediat gena țintă.

Cas9 a fost utilizat pentru a purta factori de transcripție sintetici care au activat gene umane specifice. Tehnica a atins un efect puternic prin direcționarea mai multor constructe CRISPR către poziții ușor diferite de pe promotorul genei.

Apărarea CRISPR-Cas poate fi descrisă în trei etape:

Adaptarea – adaptare implică recunoașterea și integrarea distanțierelor între două secvente repetitive adiacente în locusul CRISPR. "Protospacer" se referă la secvența pe genomul viral care corespunde distanțierului. O scurtă întindere de nucleotide conservate există proximal cu protopacerul, care se numește motivul adiacent al protospacerului (PAM). PAM este un motiv de recunoaștere folosit pentru a obține fragmentul ADN. În cazul tipului II, Cas9 recunoaște PAM în timpul adaptării pentru a asigura achiziționarea distanțierelor funcționale.

Procesarea CRISPR – expresia CRISPR include transcripția unui transcript primar numit ARN CRISPR (pre-cRNA), care este transcris din locusul CRISPR prin polimeraza ARN. Endoribonucleazele specifice apoi creează ARN-urile pre-crRNA în ARN-uri CRISPR mici (crRNAs).

Interferența (sau "imunitatea") – Interferența implică cRNA-urile în cadrul unui complex multiplu de proteine numit CASCADE, care poate recunoaște și în mod specific pot să cupleze cu regiuni de inserție a ADN-ului străin complementar. Complexul de acid nucleic crRNA-străin este apoi scindat, totuși dacă există neconcordanțe între distanțier și ADN-ul țintă sau dacă există mutații în PAM, atunci nu va fi inițiată clivarea. În cel de-al doilea scenariu, ADN-ul străin nu este vizat pentru atac de către celulă, astfel replicarea virusului continuă și gazda nu este imună la infecția virală. Stadiul de interferență poate fi mecanic și temporal diferit de achiziția și expresia CRISPR, totuși pentru funcția completă ca sistem de apărare, toate cele trei faze trebuie să fie funcționale.

Etapa 1: Integrarea cu CRISPR spacer. Protospacers și motive asociate cu protospacer sunt obținute la capătul "leader" al unei serii CRISPR în ADN gazdă. Matricea CRISPR este alcătuită din secvențe de distanțiere flancate de repetiții. Acest proces necesită Cas1 și Cas2 (și Cas9 în tipul II ), care sunt codificate în locusul cas, care sunt de obicei situate în apropierea matricei CRISPR.

Etapa 2: Expresia CRISPR. Ante-cRNA este transcrisă pornind de la regiunea de lider prin polimeraza ARN gazdă și apoi clivată de proteinele Cas în crRNA, mai mici conținând un singur distanțier și o repetare parțială.

Etapa 3: Interferența CRISPR. crRNA cu un distanțier care are o complementaritate puternică cu ADN-ul străin, care intră si începe un eveniment de clivare, care necesită proteine Cas. Clivarea ADN interferează cu replicarea virală și oferă imunitate gazdei. Stadiul de interferență poate fi distinct funcțional și temporar de achiziția și expresia CRISPR.

În comparație cu metodele predecesoare, CRISPR-Cas9 oferă o metodă eficientă și rapidă de a modifica codul genetic, reducând timpul de cercetare pentru o anumită genă la câteva săptămâni, permițând și modificări multiple de gene (multiplex).

În prezent, cele mai relevante domenii de studiu sunt reprezentate de aplicarea modificărilor genetice pentru tratarea cancerului, crearea medicamentelor împotriva virușilor pentru care nu există încă tratament și rezolvarea majorităților bolilor genetice. Toate acestea sunt posibile mai ales datorită posibilității de a face multiplexări.

Fig.10. Etapele Crisper (Sursa: https://en.wikipedia.org/wiki/Cas9).

IV.1. Cas 9 – Proteina ascociată

Cas9 (proteina asociată CRISPR ) este o enzimă de endonuclează ADN-ghidată de ARN, asociată cu sistemul de imunitate adaptivă CRISPR din Streptococcus pyogenes, acesta utilizează Cas9 pentru memorarea și ulterior interogarea și scindarea ADN străin, cum ar fi ADN-ul bacteriofagului invadator sau ADN-ul plasmidic. Cas9 efectuează acest interogatoriu prin îndepărtarea ADN-ului străin și verificarea siturilor complementare regiunii spatiatoare de bază a ARN-ului de ghidare. Dacă substratul ADN este complementar cu ARN-ul de ghidare, Cas9 scindeaza ADN-ul invadator. În acest sens, mecanismul CRISPR-Cas9 are un număr de paralele cu mecanismul de interferență a ARN-ului (RNAi) în celulele eucariote.

În afară de funcția sa inițială în imunitatea bacteriană, proteina Cas9 a fost folosită ca un instrument de inginerie genomică pentru a induce pătrunderea dublă a catenei în ADN. Aceste rupturi pot duce la inactivarea genei sau la introducerea de gene heterologice prin îmbinarea finală neomologică și respectiv prin recombinarea omoloagă în multe organisme de model de laborator. Alaturi de nucleazele “zinc” si de proteine TALEN, Cas9 devine un instrument proeminent in domeniul editarii genomului.

Cas9 a câștigat teren în ultimii ani, deoarece poate desprinde aproape orice secvență complementară ARN-ului ghid.

Cas9 nativ necesita un Sistem ARN de ghidare compus din doua ARN-uri care se asociaza:

– CRISPR ARN (crRNA);

– ARN-ul transactivator (tracrRNA).

Directia Cas9 a fost simplificata prin ingineria unui chimeric ARN de ghidare unică (chiRNA). Oamenii de știință au sugerat că unitățile genetice bazate pe Cas9 pot fi capabile să editeze genomul întregii populații de organisme. În 2015, oamenii de știință au folosit Cas9 pentru a modifica genomul embrionilor umani pentru prima dată.

Proteinele Cas prezintă o arhitectură bi-lobată (Fig.11) cu ARN-ul de ghidare asezat între lobul alfa-elicoidal și lobul nucleului. Acești doi lobi sunt conectați printr-o singură punte helix. Există două domenii de nuclează localizate în lobul nucleazei cu mai multe domenii, RuvC care scindează lanțul ADN nețintă, și domeniul nuclează HNH care scindează lanțul țintă al ADN-ului. Interesant este că domeniul RuvC este codificat de situsuri care interacționează în structura terțiară pentru a forma domeniul de scindare RuvC (Fig.12).

Fig.11. Strucura bilobata a proteinei Cas 9 (Sursa: https://en.wikipedia.org/wiki/Cas9).

O caracteristică-cheie a ADN-ului țintă este că trebuie să conțină un motiv adiacent al protospacerului (PAM) constând din secvența de trei nucleotide – NGG. Acest PAM este recunoscut de domeniul care interacționează cu PAM (domeniul PI) situat în apropierea capătului C-terminal al lui Cas9.

Cas9 recunoaște arhitectura buclei stem înerente locusului CRISPR, care mediază maturarea complexului ribonucleoproteic crRNA-tracRNA. Cas9 în complex cu ARN CRISPR (crRNA) și crRNA de trans-activare (tracRNA) recunoaște și degradează ADNc țintă. În structura de co-cristal, complexul crRNA-tracrRNA este înlocuit cu un ARN himeric cu un singur ghid (sgARN), care s-a dovedit a avea aceeași funcție ca complexul ARN natural. Baza sgARN asociată cu ssADN țintă este ancorată de Cas9 ca o arhitectură în formă de T. Această structură cristalină a enzimei Cas9 legată de ADN evidențiază modificări conformaționale distincte în lobul alfa-elicoidal în raport cu lobul nucleazei, precum și locația merge în domeniul HNH. Proteina constă dintr-un lob de recunoaștere (REC) și un lob de nuclează (NUC). Trebuie remarcat faptul că toate regiunile, cu excepția HNH, formează interacțiuni strânse între ele și complexul sgARN-ssDNA, în timp ce domeniul HNH formează puține contacte cu restul proteinei. Într-o altă conformație a complexului Cas9 observată în cristal, domeniul HNH nu este vizibil. Aceste structuri sugerează flexibilitatea conformatională a domeniului HNH.

Fig.12. Structura Cas 9 (Sursa: https://en.wikipedia.org/wiki/Cas9).

Datorită capacității unice a lui Cas9 de a se lega în esență în orice secvență de complement în orice genom, cercetătorii au dorit să folosească această enzimă pentru a reprima transcripția gene. Pentru a realiza acest lucru, cele două reziduuri catalitice esențiale ale domeniului RuvC și HNH pot fi mutate la alanină eliminând toată activitatea endonucleazică a Cas9. Proteina rezultată (dCas9) se poate lega în continuare strâns la dsADN. Această variantă Cas9 inactivă catalitic a fost utilizată pentru ambele studii mecanistice în legarea ADN-ului Cas9 ca un complex ARN-proteină legat de ADN-ul general.

Interacțiunea dCas9 cu dsDNA țintă este atât de strânsă încât denaturatorul de proteină nu poate disocia pe deplin complexul de proteină ARN dCas9 din ținta dsDNA. dCas9 a fost vizată cu ARN-uri de ghidare unificate, construite la locurile de inițiere a transcrierii oricărui loc unde dCas9 poate concura cu ARN polimeraza la promotori pentru a opri transcripția. De asemenea, dCas9 poate fi orientat spre regiunea de codificare a loci-lor astfel incat inhibarea ARN polimerazei sa apara in timpul fazei de alungire a transcriptiei. În eucariote, tăcerea expresiei genei poate fi extinsă prin direcționarea dCas9 către secvențe de amplificator, unde dCas9 poate bloca asamblarea factorilor de transcripție care conduc la tăcerea expresiei genice specifice. Mai mult decât atât, ARN-urile ghidate furnizate dCas9 pot fi proiectate astfel încât să includă neconcordanțe specifice secvenței sale complementare care să slăbească cantitativ interacțiunea dCas9 cu secvența sa.

Această tehnologie este similară în principiu cu ARNi, astfel încât expresia genică este modulată la nivelul ARN. Cu toate acestea, abordarea dCas9 a câștigat multă notorietate deoarece există mai puține efecte în afara țintei și, în general, efecte de tăiere mai mari și mai reproductibile prin utilizarea dCas9 în comparație cu ARNi. Mai mult, pentru că abordarea dCas9 poate fi controlată cantitativ, cercetătorul poate controla cu precizie exact măsura în care o genă de interes este reprimată, permițând să se răspundă la mai multe întrebări despre reglarea genelor și stoichiometria genei.

Dincolo de legarea directă a dCas9 la pozițiile sensibile transcripțional ale loci-lor, dCas9 poate fi fuzionat la o varietate de domenii de proteină modulativă pentru a realiza o multitudine de funcții. Recent, dCas9 a fost fuzionat cu proteine de remodelare a cromatinei (HDACs / HATs) pentru a reorganiza structura cromatinei în jurul diferitilor loci. Acest lucru este important în direcționarea diferitelor gene eucariote de interes, deoarece structurile heterocromatice împiedică legarea Cas9. Mai mult decât atât, deoarece Cas9 poate reacționa la heterocromatină, se presupune că această enzimă poate fi aplicată în continuare la studiul structurii cromatinei din diferiti loci.

O altă metodă de tăiere a transcrierii cu Cas9 este aceea de a ceda direct produsele ARNm cu enzima Cas9 activă catalitic. Această abordare este posibilă prin hibridizarea ssDNA cu o secvență de completare PAM la ssARN care permite un situs PAM al ARN-ului dsDNA pentru legarea Cas9. Această tehnologie pune la dispoziție capacitatea de a izola transcriptele endogene de ARN în celule, fără a fi nevoie să se induca modificări chimice la metodele de marcare a ARN sau ARN.

IV.2. CRISPR/Cpf1

Un alt sistem CRISPR descoperit mai recent este Cpf1 prezent în bacteria Francisella novicida.

Spre deosebire de Cas9, Cpf1 oferă flexibilitate mărită prin folosirea în mod natural a unui singur gARN; o metodă de tăiere mai eficientă, deoarece, spre deosebire de Cas9 care taie complet o anumită secvență de ADN, Cpf1 poate tăia doar o jumătate de spirală. Datorită acestui lucru Cpf1 este mult mai eficientă în cazul adăugării secvențelor genetice (în timp ce Cas9 rămâne ce-a mai bună opțiune pentru tăierea unor gene) iar un ultim avantaj este posibilitatea multiplexării folosind o singură proteină, Cpf1 oferind posibilitatea de a tăia diferite secvențe de ADN ( Zetsche si colab. 2015).

Cu toate acestea cercetările referitoare la Cpf1 sunt necesare iar, cel mai probabil, cele 2 metode vor putea fi folosite împreună astfel Cas9 este mult mai eficient atunci când vine vorba de precizie în tăiere și de viteză, oferind soluția potrivită pentru modificarea la timp a celulelor ce se divid rapid (celule canceroase) iar Cpf1 oferă mai multe posibilități de editare permițând editarea cu succes a celulelor care nu se pot diviza (incluzând celulele nervoase) și introducerea pe viitor a unor însușiri care pot, de exemplu, îmbunătăți sistemul imunitar.

Spre deosebire de genele de silentiozitate, dCas9 poate fi de asemenea folosit pentru a activa gene atunci cand este fuzionat cu factori de activare a transcriptiei. Acești factori includ subunitățile de polimerază II ARN bacteriană și factorii tradiționali de transcripție în eucariote.

Aplicatii ale sistemului CRISPR – Cas 9

Până la sfârșitul anului 2014 au fost publicate circa 1000 de lucrări de cercetare care menționau CRISPR. Tehnologia a fost utilizată pentru inactivarea funcțională a genelor în liniile celulare și celulele umane, pentru a studia „Candida albicans””, pentru a modifica drojdiile utilizate pentru a produce biocombustibili și pentru a modifica genetic tulpinile de recoltă. CRISPR poate fi, de asemenea, utilizat pentru a schimba țânțarii, astfel încât să nu poată transmite boli ca malaria.

O multitudine de aplicatii au fost si vor si dezvoltate pe baza sistemului CRISPR-Cas 9. Cele mai multe dintre acestea sunt in domenii precum cercetarea biomedicala si terapii.

CRISPR simplifică crearea de animale pentru cercetare care imită boala sau arată ce se întâmplă atunci când o genă este lovită sau mutată. CRISPR poate fi utilizat la nivelul liniei germinale pentru a crea animale în care gena este schimbată peste tot sau poate fi vizată la celulele non-germinale.

Sistemul de editare a genelor Cas9 mediat a fost utilizat pe larg în studiile de genetică pentru a înțelege rolul unor gene specifice, pentru modelarea bolilor si pentru a demonstra noi scheme terapeutice într-o serie de modele de boli genetice și infecțioase.

CRISPR poate fi utilizat pentru a crea modele celulare umane ale bolii. De exemplu, aplicat celulelor stem pluripotente umane, CRISPR a introdus mutații vizate în gene relevante pentru boala renală policistă (PKD) și glomeruloscleroza segmentală focală (FSGS). Aceste celule stem pluripotente modificate cu CRISPR au fost ulterior cultivate în organoide de rinichi umane care au prezentat fenotipuri specifice bolii. Organoidele din rinichi din celulele stem cu mutații PKD au format structuri mari, translucide, din tubulii renale. Chisturile au fost capabile să atingă dimensiuni macroscopice, cu un diametru de până la un centimetru. Organoidele din rinichi cu mutații au dezvoltat defecte joncționale între podocite, celulele de filtrare afectate de această boală. Aceasta a fost urmărită până la imposibilitatea capacității podocitelor de a forma microvilli între celule adiacente. Foarte important, aceste fenotipuri de boală au fost absente în organoidele de control de fond genetic identic, dar fără modificările CRISPR.

Cercetările sugerează că Sistemul CRISPR- Cas este o modalitate eficientă de a limita replicarea mai multor virusuri herpetice. A fost capabil de a eradica ADN-ul viral în cazul virusului Epstein-Barr (EBV).

Sistemul Cas9 are de asemenea un potențial ridicat de a vindeca sau trata multe boli, inclusiv HIV, boli genetice, sau cancer.

In plus, multe studii au raportat ca fiind folosind sistemul de editare a genomului Cas9 mediat pentru corectarea bolilor legate de mutatii somatice animale și celule de linie germinala , precum si in celulele stem umane și pluripotente induse celulele stem.

V.1.Utilizarea responsabilă a Cas9

Progresul rapid al Cas9 ca instrument de editare a genomului are potential pentru utilizare în aplicații de la tratamente clinice pentru producția agricolă sau pentru controlul populației de specii de insecte purtătoare de boli.

Progresele tehnologice rapide Cas9 au adus provocări în ceea ce privește controalele de reglementare care guvernează aplicațiile sale în condiții sigure și etice.

Preocupările în cadrul comunității au izbucnit după ce s-a raportat că un grup a folosit Cas9 pentru a edita o genă în embrionii umani, cu toate că acest lucru a fost făcut în zigoti, neviabili.

Există multe dezbateri în rândul oamenilor de știință, factorilor de decizie politică, și a publicului, cu privire la modul de utilizare etic și responsabil al tehnologiei de editare a genelor într-un mod care nu împiedică cercetarea științifică benefică și descoperirile. Pe măsură ce ritmul rapid al descoperirilor biologice continuă, discuția va fi necesară pentru a se asigura că tehnologiile de editare ale genomului, cum ar fi Cas9, vor fi utilizate într-o manieră sigură și responsabilă.

Unitățile genetice pot oferi un instrument puternic pentru a restabili echilibrul ecosistemelor prin eliminarea speciilor invazive. Preocupările legate de eficacitate, consecințele neintenționate asupra speciilor țintă, precum și a speciilor nevizate au fost ridicate în special în ceea ce privește potențialul de eliberare accidentală din laboratoare în sălbăticie. Oamenii de știință au propus mai multe măsuri de siguranță pentru a asigura izolarea genelor experimentale, inclusiv moleculare, reproductive și ecologice. Mulți recomandă ca imunizările și dispozitivele de inversare să fie dezvoltate în tandem cu transmisiile genetice pentru a suprascrie efectele lor, dacă este necesar.

Există un consens asupra faptului că efectele pe termen lung trebuie studiate mai detaliat, în special în ceea ce privește potențialul de perturbare ecologică, care nu poate fi corectat cu dispozitive de inversare.

Concluzii si perspective

Desi nu am valorificat încă întregul potențial al CRISPR – Cas9, această tehnologie a adus schimbări revoluționare în cercetarile genomice, inclusiv de editare a genomului, reglare și imagistica.

Pe măsură ce privim spre viitor, ne putem imagina progresele pe care tehnologia CRISPR – Cas9 le va aduce cercetatorilor de baza si celor clinice. Oamenii de stiinta de baza fac deja pasi importanti in intelegerea si manipularea biologiei folosind tehnologia CRISPR – Cas9.

CRISPR poate revigora conceptul de transplant de organe de la animale îla oameni. Retrovirusurile prezente în genomul animal ar putea dăuna beneficiarilor de transplant.

In clinica, ne putem aștepta la noi terapii pentru boli genetice (folosind Cas9 de editare a genomului) și noi tehnici de diagnosticare (folosind imagistica dCas9-based).

CRISPR poate avea aplicații în ingineria țesuturilor și în medicina regenerativă, cum ar fi crearea vaselor de sânge uman care nu prezintă expresia proteinelor MHC clasa II, care de multe ori determină respingerea transplantului.

Sistemele CRISPR – Cas bazate pe "nucleaze ale ARN-ului" pot fi utilizate pentru a viza factorii de virulență, genele care codifică rezistența la antibiotice și alte secvențe relevante din punct de vedere medical.

Această tehnologie reprezintă astfel o nouă formă de terapie antimicrobiană și o strategie prin care să se manipuleze populațiile bacteriene. Studiile recente au sugerat o corelație între interferența locusului CRISPR – Cas și obținerea rezistenței la antibiotice. Acest sistem asigură protecția bacteriilor împotriva ADN-ului străin, cum ar fi transpozonii, bacteriofagii și plasmidele. Acest sistem s-a dovedit a fi o presiune selectivă puternică pentru obținerea rezistenței la antibiotice și a factorului de virulență în patogenii bacterieni. Unele dintre genele afectate sunt legate de bolile umane, inclusiv cele implicate în diferențierea musculară, cancerul, inflamația și hemoglobina fetală.

Deși cele mai multe cercetari de până acum s-au concentrat pe tipul II proteine ​​Cas9, există multe altele care vor fi descoperite cu privire la sistemele mai largi CRISPR din alte specii diferite de bacterii si Archaea.

Noile sisteme CRISPR, ascunse la vedere in genomul organismelor din jurul nostru, pot continua să ne surprindă în viitor, cu mecanismele lor elegante și funcția lor, oferind tehnologii puternice și inovatoare (Wright, 2016).