Investigatii Citogenetice la Specii de Pesti din Bazinul Siretului

Cuprins

Introducere

Argument

Poluarea apelor

Diviziunea celulara mitotica

Mutatii cromosomiale in ana-telofaza mitozei

Material si metoda

Rezultate si discutii

Concluzii

Bibliografie

Introducere

Genetica este știința biologică a cărei obiect de studiu îl constituie ereditatea și variabilitatea organismelor, stabilind mecanismele care asigură conservarea informației genetice precum și cele ale modificării ereditare.

Anul apariției geneticii ca știință este 1865, când GREGOR MENDEL a emis primele legi ale eredității, redescoperite în 1900 de HUGO de VRIES, CORRENS și TSCHERMACK (BOTEZ, 1991).

Denumirea de genetică a fost introdusă de BATESON la Congresul de genetică din anul 1906.

Ereditatea, ca obiect de studiu a geneticii reprezintă însușirea descendenților de a moșteni de la părinți caracteristici asemănătoare. Această însușire asigură stabilitatea caracterelor de-a lungul generațiilor, continuitatea biologică a indivizilor în cadrul speciei de la o generație la alta. Potențialitatea realizării acestui caracter se face prin intermediul genelor. Gena este definită ca particula materială a eredității localizată în cromozom și care condiționează formarea uneia sau mai multor caractere sau însușiri. Totalitatea genelor unui organism viu (cele nucleare) reprezintă genotipul. Totalitatea genelor din cadrul unui set haploid de cromozomi, transmise ca o unitate de la unul din părinți reprezintă genomul.

Felul de a fi a unui individ ca mod de manifestare a genotipului, în interacțiune cu condițiile de mediu reprezintă fenotipul. Noțiunile de genotip și fenotip au fost introduse de JOHANSEN în 1909 (PANFIL, 1980).

Variabilitatea ca cel de al doilea obiect de studiu a geneticii, reprezintă însușirea organismelor vii, cu diferite grade de înrudire, de a se deosebi între ele. În natură nu există doi indivizi identici. Chiar și gemenii uniovulari nu sunt identici din punct de vedere genetic, ei manifestând profile imunologice diferite, constituite în primele șase luni de viață (BOTEZ, 1991).

Scopul și importanța geneticii

Variabilitatea genotipică sau ereditară are cel mai important rol în evoluție precum și în munca de ameliorare. Diversitatea genetică a organismelor vii a permis ca prin intermediul selecției naturale sau artificiale să fie promovate, în generațiile succesive, doar genotipurile cel mai bine adaptate condițiilor de mediu, sau a celor ce răspund obiectivelor ameliorării.

Datorită dezideratelor prezentate, genetica este considerată o adevărată placă turnantă în cadrul științelor biologice, fiind esențială pentru toți cei care studiază viața plantelor, a animalelor sau microorganismelor. Ea ocupă o poziție centrală în diverse sectoare ale activității umane (agricultură, alimentație, medicină, ecologie ș.a.) (Elena TĂMAȘ, 2000).

Pentru creșterea producției agricole apare necesitatea ameliorării materialului biologic existent. Orice program de ameliorare necesită un studiu a determinismului genetic a materialului inițial pentru stabilirea metodei de ameliorare. Genetica constituie de fapt baza teoretică a ameliorării plantelor.

Descoperirile din domeniul geneticii moleculare și a ingineriei genetice sunt în prezent tot mai utile, fiind utilizate în elucidarea unor probleme de interes major. Obiectivul principal al ingineriei genetice constă în modificarea genomului unor plante sau animale prin introducerea unor gene sau a unor fragmente de ADN de la o celulă donatoare la una receptoare, obținându-se specii transgenice.

Pe această cale, la plante s-au obținut genotipuri rezistente la boli și dăunători, la ierbicide, pesticide, stresuri climatice ș.a.

Prin intermediul ingineriei genetice au fost obținute surse bacteriene capabile de a produce proteine specifice mamiferelor, cum ar fi insulina, interferonul, hormonul de creștere ș.a. De asemenea prin aplicarea metodelor genetice se pot contracara acumulărilor tarelor genetice (caractere nefavorabile patogenetice ș.a.).

În ceea ce privește genetica forestieră, ea se individualizează în primul rând datorită naturii aparte a plantelor lemnoase din păduri, cu deosebire, arborii. Ca plante sălbatice, extrem de vechi, policarpice, foarte longevive, de dimensiuni mari, arborii dețin un grad avansat de heterozigoție și mari rezerve de variabilitate genetică, se diferențiază prin ponderea mare a caracterelor cantitative supuse unui control poligenic aditiv, conviețuind adeseori în întinse comunități (populații) naturale, politipice, polimorfe, în care panmixia se manifestă cu deosebită intensitate, iar mecanismele generale de homeostazie genetică sunt extrem de perfecționate (STĂNESU, 1982).

Scurt istoric a dezvoltării geneticii

Dintre realizările spectaculoase, în acest domeniu, din ultima jumătate a secolului 20, merită menționate:

1951 – primul transfer de embrioni la o vacă;

1952 – primul vițel născut prin însămânțare artificială;

1952 – prima clonare la amfibieni;

1952 – prima plantă regenerată in vitro;

1970 – prima plantă regenerată pornind de la protoplaști;

1972 – primul hibrid interspecific obținut prin fuziune de protoplaști (la tutun);

1973 – identificarea plasmidului Ti (tumor inducting);

1978 – identificarea primei gene umane;

1983 – obținerea primei plante transgenice;

1984 – prima naștere umană, pornind de la un embrion congelat;

1985 – prima plantă transgenică rezistentă la o insectă;

1986 – prima clonare la mamifere, utilizând celule embrionare;

1987 – prima plantă transgenică rezistentă la ierbicid;

1983 – prima cereală transgenică;

1991 – prima utilizare a unui segment de ADN ca medicament;

1995 – primul copil pornind de la fecundarea in vitro a unui ovocit;

1997 – prima clonare somatică in vitro la mamifere (oaia Dolly);

2001 – descifrarea genomului uman (după Mihaela CORNEANU, 2001).

La noi în țară primele cercetări de genetică au fost efectuate încă înainte de 1900. C. VASILESCU (1840-1902) a urmărit în experiențele hibridologice modul de transmitere a unor caractere la suine, semnalând fenomenul de dominanță și recesivitate precum și segregare în generația F2 (după RAICU, 1980).

C. SANDU-ALDEA (1874-1927), a publicat în 1915 primul manual de ameliorarea plantelor fundamentat pe principii genetice.

E. RACOVIȚĂ (1868-1947), a dezvoltat teoria legăturii dintre ereditate și mediu.

Gh. IONESCU SISEȘTI (1885-1963) s-a afirmat prin realizări remarcabile de crearea unor soiuri de grâu.

Traian SĂVULESCU (1889-1963), fondatorul școlii moderne de fitopatologie la baza căreia stă conceptul evoluției conjugate gazdă-parazit și al modificărilor ereditare în urma interacțiunilor bilaterale.

N. SĂULESCU (1898-1977), are contribuții remarcabile în domeniul geneticii cantitative.

Argument

Protecția mediului ambiant constituie problema majoră a societății contemporane. Cunoașterea influienței activității umane asupra ecosistemelor naturale ,cu menționarea surselor de poluare și a efectelor lor fizice ,este de strictă actualitate .Ea este impusă mai ales de implicațiile nefaste ale deteriorării mediului asupra calității vieții oamenilor .Desi sunetele puternice sau inspaimantatoare fac parte din natura, în ultimele doua secole zonele urbane și industriale au devenit extrem de zgomotoase.

Poluarea apelor

Poluarea apei reprezinta contaminarea izvoarelor, lacurilor, apelor subterane, a marilor și oceanelor cu substante daunatoare mediului inconjurator.

Apa este elementul care intretine viata pe Pământ. Toate organismele o contin; unele traiesc în ea; unele o consuma. Plantele și animalele au nevoie de apa pura, și nu pot supravietui daca apa este infectata cu chimicale toxice care dauneaza microorganismelor. Daca este extrem de grava, poluarea apei poate ucide un numar mare de pesti, pasari și alte animale, iar în unele cazuri poate ucide toti membrii speciei din zona afectata. Poluarea face ca paraurile, lacurile și toate acumularile de apa sa aiba un aspect și un miros neplacut. Nu este recomandat sa se consume pestele și crustaceele care traiesc în apa infestata. Oamenii care beau apa poluat se pot imbolnavi grav, iar expunerea indelungata poate produce cancer iar la femei pot aparea sarcini cu probleme.

Principalii poluanți

Principalii poluanți sunt materialele chimice, biologice sau fizice care avariaza calitatea apei. Poluanții pot fi clasificati în opt categorii, fiecare avand diferite actiuni:

a. Poduse petroliere

Petrolul și chimicalele obtinute pe baza de petrol sunt folositi drept combustibili, lubrifianti, în industria plasticului și în multe alte scopuri. Aceste produse petroliere ajung în apa în mare parte accidental, prin esuarea navelor sau prin sparturile conductelor. În mare parte acesti produsi sunt otravitori pentru animale, sau se depun pe blana animalelor și penele pasarilor facandu-le permeabile si astfel animalele mor de frig, sau impiedicandu-le sa se deplaseze.

b. Pesticide și ierbicide

        Chimicalele, folosite de fermieri din belsug pentru indepartarea daunatorilor, sunt preluate de precipitatii și astfel apa infestata se scurge în apa paraurilor și a raurilor. Unele din aceste chimicale sunt biodegradabile și se descompun repede în substante inofensive sau mai putin nocive, dar cele mai des intalnite sunt cele nedegradabile care persista pentru o lunga perioada de timp.

O mare parte din cantitatea de apa potabila este contaminata cu pesticide. Mai mult de 14 milioane de americani beau apa contaminata, și Agentia de Protectie a Mediului estimeaza ca mai bine de 30% din sursele de apa suntr infestate. Azotatii, poluanți derivati din insecticide, pot produce o forma foarte grava de anemie la copii, boală de cele mai multe ori mortala.

c. Metalele

Metale precum cuprul, plumbul, mercurul, seleniul ajung în apa din mai multe surse, inclusiv industria masura ce sunt consumate prin intermediul hranei de catre animale, care la randul lor sunt consumate de catre alte animale, și asa mai departe, pâna cand ajung la nivele inalte ale lantului trofic devenind extrem de toxice. În cantitati mari sunt otravitoare, și pot da nastere unor boli grave. Cadmiu, povine din ingrasaminte, recoltele tratate cu astfel de ingrasaminte și consumate în cantitati mari de catre oameni pot produce diaree și în timp pot afecta rinichii și ficatul. Plumbul poate ajunge și el în apa fie prin intermediul unor scurgeri din conducte fie pentru ca intra în componenta unor sisteme de apa mai vechi. La copii, plumbul poate produce boli mentale.

d. Deseurile

Deseurile cele mai periculoase sunt deseurile chimice care pot fi toxice (otravitoare), reactive (capabile sa produca gaze toxice sau explozive) sau infamabile.Daca nu sunt tratate și depozitate cu grija aceste deseuri pot polua sursele de apa cele mai aproape de locul depozitarii. în 1969 raul Cuyahoga din Cleveland, Ohio a fost atat de poluat incat a luat foc și a ars timp de cateva ore. Chimicale folosite în industria echipamentelor electrice, pot ajunge în mediu prin deversari și pot atinge niveluri toxice foarte ridicate prin intermediul lantului trofic.

e. Cantitatile excesive de materie organica

Ingrasamintele și alti nutrienti folositi pentru cultivarea plantelor în ferme și gradini pot ajunge foarte usor în apa. Odata ajunse în apa, aceste produse incurajeaza cresterea platelor și algelor. Cand aceste plate mor se depun pe fundul apei și microorganismele le descompun. în timpul procesului de descompunere aceste microorganisme consuma o mare parte din oxigenul dizolvat în apa, și astfel nivelul oxigenului din apa scade în asa masura incat vietatile dependente de oxigen din apa, cum ar fi pestii, mor.

f. Sedimentele

Sedimentele sunt particulele de sol deplasate de catre curentii de apa, pot deveni un pericol daca sunt prezente în cantitati mari. Eroziunea solului, produsa fie de apa, vant sau precipitatii, inundatiile și caderile de teren pot fi foarte daunatoare pentru ca introduc în apa foarte multe nutrimente, aparand astfel poluare prin canitati mari de materifie de apa, vant sau precipitatii, inundatiile și caderile de teren pot fi foarte daunatoare pentru ca introduc în apa foarte multe nutrimente, aparand astfel poluare prin canitati mari de materie organica.

g.   Organismele infectioase 

Un studiu efectuat în 1994 de Centrul de Prevenire și Control al Bolilor a descoperit ca mai bine de 900000 de oameni se imbolnavesc annual din cauza organismelor din apa potabila, și dintre acestia mai bine de 900 mor. Multe din organismele care se gasesc în numar mic în majoritatea surselor de apa, sunt considerate poluanți atunci cand ajung în apa potabila. Paraziti precum Giardia lamblia și Cryptosporidium parvum ajung deseori în sursele de apa potabila. Ei pot provoca boli grave copiilor, batranilor și oamenilor care sufera deja de alte boli.

h. Poluarea termala

Apa este deseori luata din rauri, lacuri, oceane sau mari pentru a fi folosita drept racitor în fabrici și centrale și apoi este adusa inapoi la sursa mai calda decat atunci cand a fost luata. Insa chiar și cele mai mici schimbari de temperatura în apa vor indeparta speciile care vietuiau acolo și vor atrage specii noi. Poluarea termala poate grabi procesul biologic la plante și animale sau poate reduce cantitatea de oxigen din apa. rezultatul poate fi acela moarte speciilor care nu sunt adaptate vietii în ape calde, sau în cazul raurilor poate duce la disparitia vegetatiei din zona poluata.

Combaterea poluarii apei

Sunt multe de facut pentru a impiedica poluarea apelor, dar toate acestea

necesita timp, bani și putin efort din partea oamenilor, lucruri pe care majoritatea dintre acestia nu sunt dispusi sa le irosesca “doar pentru a salva planeta”.

Depozitarea deseurilor în locuri special amenajate;

Reciclarea tuturor materiilor reciclabile;

Incetarea folosirii pesticidelor, insecticidelor și a ingrasamintelor;

Incetarea folosirii substantelor chimice în apropierea surselor de apa;

Pentru spalarea automobilelor sa se foloseasca locuri special amenajate;

Resturile menajere, apa rezultata în urma spalarii hainelor și a obiectelor

de uz casnic sa fie aruncate direct la canalizare;

Folosirea pe cat posibila a materialelor biodegradabile și ale celor

reciclabile;

Verificarea starii automobilului pentru a evita scurgerile nedorite de

benzina și ulei;

Calitatea apelor de suprafață în România

Calitatea apei este dată de către indicatorii de calitate ai acesteia.Numărul de elemente din cadrul fiecărei categorii de indicatori fiind stabilit în funcție de condițiile specifice și scopul urmărit, precum și de natura surselor de poluare. Având în vedere că indicatorii sunt mărimi variabile în timp și spațiu,una dintre cele mai importante probleme care apare la aprecierea calității apei se referă la stabilirea sau alegerea valorilor celor mai reprezentative pentru oanumită situație cum ar fi valorile minime sau valorile maxime admisibile.În România calitatea apei este urmărită conform structurii și principiilor metodologice ale Sistemului de Monitoring Integrat al Apelor din România(S.M.I.A.R), restructurat în con-formitate cu cerințele Directivelor Europene.S.M.I.A.R. cuprinde șase componente: cinci se referă la sursele naturale: apecurgătoare de suprafață, lacuri (naturale și artificiale), ape tran-zitorii (fluvii șilacustre),ape costiere și ape subterane; ultima componentă se referă lasursele de poluare și anume ape uzate .Pentru categoriile de ape de suprafață clasificarea stării ecologice și apotențialului ecologic se face pe baza parametrilor obținuți ca rezultat almonitoringului biologic și fizico – chimic, rezultatele fiind prezentate pe o hartă ca cea din figura 1.

. Caracterizarea stării ecologice se bazează pe un sistemde clasificare în cinci clase: I – foarte bună, II – bună, III – moderată, IV – slabă șiV – proastă, definite și reprezentate în tabelul 1.

Tabelul 1 .Clasificarea și caracterizarea stării ecologice a apelor de suprafață

Prevenirea poluării apelor 

Schemele actuale de epurare se bazează aproape în întregime pe imitarea unor procese din natură, iar apele uzate prezintă concentrații tot mai mari de poluanți, cu o structură chimică extrem de variabilă, iar randamentul stațiilor de epurare nu mai poate statisface cerințele impuse de realizarea gradelor de epurare necesare. În mod inevitabil se impune o perfecționare a tehnologiilor de epurare, după ce în prealabil au fost luate măsurile de prevenire sau de limitare a fenomenului de poluare a apelor. Limitarea fenomenului de plouare a apelor poate fi caracterizat astfel:

 – micșorarea evacuării specifice de poluanți antrenați de apă, raportate la unitatea de activitate sau de produs. Este specific unităților industriale unde se constată, fie din cauza folosirii unei tehnologii necorespunzătoare, fie din lipsa respectării unei discipline tehnologice,evacuarea unor cantități importante de substanțe poluante;

 – colectarea și tratarea reziduurilor apoase într-o formă cât mai concentrată. Trebuie combătută mentalitatea destul de răspândită precum că diluarea atenuează poluarea. Pentru obținerea de ape uzate cât mai concentrate trebuie adoptatea practici de reducere a consumului de apă și aplicarea procedeului de recirculare a apelor;

 – renunțarea la sistemele de îndepărtare pe cale hidraulică a materialelor și deșeurilor solide rezultate de la locurile de desfășurare a activităților sociale și economice. Este mai eficientă fărâmițarea cu ajutorul tocătoarelor a acestor materiale pentru a le face transportabile hidraulic ca materiale grosiere care vor fi reținute în stația de epurare;

 – uniformizarea debitelor și compoziției poluanților evacuați cu ajutorul apei, constituie o condiție de bază pentru stabilitatea performanțelor stațiilor de epurare și pentru protecția vieții acvatice din receptor;

 – folosirea, transportul, manipularea și depozitarea, în interiorul așezărilor omenești și în jurul acestora a substanțelor radioactive și acelor puternic toxice, nu pot fi efectuate decât cu asigurarea unor condiții speciale de prevenire a poluării mediului înconjurător stabilite de organele de specialitate;

 –  folosirea la irigații a apelor uzate urbane, în special pentru localitățile mici, conduce la reducerea mărimii stației de epurare și la creșterea producției agricole;

 – reducerea și valorificarea substanțelor utile din ape și din reziduri apoase, în special în cazul apelor industriale, conduc la reducerea capacității stației de epurarea și deci a cheltuielilor de investiții,precum și la posibilitatea de micșorare a durate de amortizare ainvestițiilor pe seama valorificării substanțelor utile extrase.Problemele actuale de epurare sunt legate de tratarea și eliminarea nămolurilor rezultate în urma procedeelor de epurare, dat fiind complexitatea structurii și compoziției lor.

Diviziunea celulara mitotica

Diviziunea nucleului a fost observată pentru prima dată în 1832, de către Dumortier, la alga Conferva aurea. Prin diviziunea nucleului se asigură distribuția egală a genelor la cele două celule fiice, aceasta fiind condiționată de existența ADN dublu catenar și de mecanismul semiconservativ de replicare a acestuia.

În diviziunea celulară se disting două categorii de evenimente: evenimente reproductive, prin care sunt dublate structurile funcționale ale celulei, esențială fiind dublarea cromosomilor, și evenimente distributive, prin care materialul rezultat în urma replicației este repartizat celulelor fiice (Tudose, 1992).

Celulele fiice rezultate în urma diviziunii celulare, pot urma un proces de diferențiere sau pot da naștere, în urma repetării diviziunii, la alte celule noi. Posibilitatea de a se divide este păstrată și de către celulele diferențiate, dar ea se realizează în fapt, foarte rar, și numai atunci când este indusă secundar. Celulele nediferențiate, meristematice, păstrează însă permanent această capacitate de a se divide.

Diviziunea mitotică a fost pentru prima dată, descrisă în anul 1879, la celula animală, de către Flemming și în 1884 la celula vegetală, de către Strasburger (Lewin, 1994, Snustad și colab., 1997).

Mitoza (gr. mitosis = fir) sau diviziunea ecvațională, este modalitatea de diviziune celulară prin care, dintr-o celulă somatică rezultă două celule fiice cu număr egal de cromosomi, atât între ele, cât și cu celula mamă. Mitoza este diviziunea celulară care are loc în celule somatice și asigură transmiterea fidelă a caracterelor la celulele fiice; ea poate suferi însă, diferite influențe care adaugă aparentei stabilități a caracterelor, noi valențe. În reproducerea celulelor, apar “greșeli”- fenomene mutaționale – pe care evoluția le poate perpetua sau nu.

Caracteristica principală a diviziunii celulare este diviziunea nucleului, urmată de și diviziunea citoplasmei. Relația nucleu – citoplasmă (evidențiată încă din 1893, de către Strasburger) prezintă implicații majore în determinarea momentului diviziunii.

Ciclul celular mitotic, la plante și animale, cuprinde în principal următoarele procese: duplicarea cromosomilor unicromatidici (și a centrozomului la animale) și deplasarea spre poli a cromosomilor fii, după care, urmează diviziunea citoplasmei. În procesul mitozei se organizează aparatul mitotic alcătuit din structuri cromatice și acromatice, care este complet în metafază. Pentru realizarea acestuia, sunt necesare proteine specifice, a căror sinteză necesită un mare consum de energie.

Totalitatea proceselor prin care trece celula somatică de la formare și până la scindarea ei în două celule fiice, cu număr de cromosomi egal cu numărul de cromosomi al celulei din care au provenit, alcătuiesc ciclul celular.

Ciclul mitotic (Fig.1) cuprinde: interfaza (perioada dintre două diviziuni succesive) și cele patru faze ale diviziunii mitotice propriu-zise – profaza, metafaza, anafaza și telofaza având o durată variabilă, în funcție de specie, tipul de celule, temperatură etc., de la câteva ore, la zeci și sute de ore.

Interfaza

Interfaza are cea mai mare durată în timp în ciclul mitotic și este caracterizată de procese de biosinteză. Durata interfazei este variabilă, de la câteva ore până la zile. La plante, la un ciclu tipic de 20-24 de ore, mitoza durează 70-110 minute (profaza = 30 – 45 min., metafaza = 5 – 10 min., anafaza = 15 – 20 min. și telofaza = 20 – 30 min.) (Toma și Niță, 1995). La celula animală, un ciclu tipic durează 18 – 24 de ore, din care durata fazei G1 este de aproximativ 6 ore (în general variază cel mai mult), faza S (timpul necesar replicării genomului) durează 6 – 8 ore, iar faza G2 este, de regulă, cea mai scurtă (mai ales când mitozele se succed rapid). Mitoza, de obicei durează mai puțin de o oră (Lewin, 1994).

După Essad (1964, cf. Raicu, 1973) ciclul mitotic la Vicia faba L. durează 18 ore din care mitoza cuprinde 1,5 ore, restul revenind interfazei.

Cercetările microfotografice și microradiografice au demonstrat că interfaza este foarte puțin activă din punct de vedere morfologic, dar este cea mai activă din punct de vedere metabolic; cantitatea de ADN se dublează de la 2C la 4C. Pe baza acestor observații, Howard și Pelc, în 1953 au împărțit interfaza în trei perioade:

– perioada G1 (engl. gap = gol) – perioadă presintetică, în care nu are loc sinteza de ADN, ci doar o activare a enzimelor. Cromosomii sunt monocromatidici; se sintetizează ARN (în special ARNm) și proteine;

– perioada S (engl. synthesis = sinteză) – perioada de sinteză a ADN; până la sfârșitul fazei S toată cantitatea de ADN se replică (pe parcursul fazei S cantitatea totală de ADN crește de la 2C la 4C). La sfârșitul acestei perioade, cromosomii sunt alcătuiți din două cromatide foarte lungi și subțiri;

– perioada G2 – perioadă postsintetică, când sinteza ADN se oprește; are loc biosinteza proteinelor și a ARN, care se desfășoară și în celelalte perioade ale interfazei. Celula conține cromosomi bicromatidici.

Fig. 1 Ciclul celular mitotic (după Alberts și colab., 1994)

Pe parcursul interfazei (Fig.2), cromosomii sunt hidratați, despiralizați și nu se observă la microscopul optic (Watson, 1974).

Fig. 2 Aspectul nucleului în interfază, în celulele meristemului radicular la Allium cepa L. (2n=16) (după Hartl și Jones, 1998)

În afară de celulele la care ciclul mitotic se desfășoară în mod normal, există celule în repaus sau în perioada G0, asemănătoare fazei G1, dar diferită prin faptul că celulele nu pot intra în faza S. În faza G0 intră celulele neproliferative. Uneori, celulele se pot afla în repaus în faza 4C (exemplu: celulele embrionare din semințe), astfel încât, intră direct din G0 în G2; alteori, din G0 pot intra în G1 timpuriu (Lewin, 1994).

În explicarea cauzelor ce determină intrarea celulei în diviziune mitotică (trecerea din G2 în mitoză) există diferite ipoteze. Se pare că declanșarea mitozei este determinată de modificarea raportului nucleu / citoplasmă.

Schmucker, Dean și Hinshelwood consideră că declanșarea mitozei este determinată de modificarea raporturilor între conținutul nucleului și membrana sa. După Haberlandt, diviziunea poate fi declanșată introducând în celulele sănătoase anumiți necrohormoni proveniți din celulele rănite. Schmucker presupune că mitoza este indusă de o radiație specifică a razelor mitotice (cu intensitate foarte redusă și lungime scurtă de undă) emise de celulele vii; ele acționează asupra celulelor care au atins un anumit stadiu pregătitor. În ultimul timp, este susținută cauzalitatea chimică a diviziunii celulare; declanșarea mitozei este produsă de anumite substanțe organice (stimulatoare de creștere în concentrație mare) și substanțe anorganice (de exemplu cobaltul inhibă trecerea celulelor din interfază în profază). Se pare că intervine o kinază (proteină preexistentă cu două subunități: una ce se activează la modificările de la începutul mitozei și o ciclină ce se acumulează în interfază și este distrusă în mitoză) (Lewin, 1994).

Profaza

În profază au loc procesele: mărirea volumului nucleului, condensarea cromosomilor, stabilirea polilor pentru diviziune, dezorganizarea membranei nucleare, dispariția nucleolilor și formarea fusului acromatic.

La începutul acestei faze, cromosomii se prezintă sub formă de filamente subțiri, lungi, alcătuind un spirem. În profaza timpurie (Fig.3) ei se dispun în tot spațiul nuclear (în celulele vii se observă ușor, având indicele de refracție 1,50 față de cel al carioplasmei de 1,37). În profaza târzie (Fig.4), gradul de spiralizare al cromosomilor crește și ei devin mai scurți și mai compacți, apărând formați din două cromatide, foarte apropiate între ele și înfășurate una în jurul celeilalte. La începutul profazei, are loc o primă spiralizare a cromosomilor denumită “spiralizarea mică”, ce se realizează prin micșorarea numărului de spire și mărirea diametrului lor. Spre sfârșitul profazei, are loc a doua spiralizare denumită “spiralizare somatică”, în care numărul de spire continuă să scadă, ele apropiindu-se tot mai mult. Se admite și existența celei de a treia spiralizări. Semnificația funcțională a acestor procese este aceea de a facilita deplasarea cromosomilor și de a păstra integritatea acestora.

În profază, distanța dintre cromosomi crește treptat și are loc dezorganizarea nucleului și a membranei nucleare, dispariția nucleolilor și formarea fusului mitotic.

Centriolii migrează spre polii celulei, plasându-se în două puncte opuse. Între centrioli se organizează fusul de diviziune (fus acromatic, fus mitotic sau fus nuclear), alcătuit dintr-un număr mare de filamente, cu extremitățile inserate pe centrioli. Fusul nuclear este un organit tranzitoriu, cu ajutorul căruia se realizează distribuirea egală a cromosomilor în cele două celule fiice. Filamentele fusului de diviziune sunt de două tipuri: filamente fusoriale de sprijin (continue) de la un centriol la altul ce condiționează structura fusului și filamente cromosomiale (kinetice), care sunt sintetizate și pleacă de la centromerul fiecărui cromosom și înaintează simultan, cu aceeași viteză, spre cei doi poli ai celulei.

Fig. 3 Aspect al nucleului unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflată în profază timpurie (după Hartl și Jones, 1998)

Fig. 4 Aspect al nucleului unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflată în profază târzie (după Hartl și Jones, 1998)

La plantele superioare, centriolii lipsesc din celulă, rolul lor fiind preluat de calotele polare ce se alungesc în formă de conuri, atingând polii celulei în timp ce bazele lor se confundă. Calotele polare sunt reprezentate de citoplasma perinucleară diferențiată într-o zonă clară, care crește treptat spre polii viitorului fus acromatic. Mitoza ce se desfășoară în aceste condiții se numește mitoză anastrală (Toma și Niță, 1995).

Stadiul final al profazei – prometafaza, se caracterizează prin totala dezorganizare a membranei nucleare, care se fragmentează în porțiuni relativ mari, ce păstrează infrastructura de membrană dublă și rămân, în parte, în interiorul fusului de diviziune, participând mai târziu la formarea membranelor nucleilor fii. Cromosomii exercită mișcări neregulate între polii celulei și planul ecuatorial al acesteia.

Metafaza

În această fază are loc desăvârșirea aparatului mitotic, iar cromosomii, spiralizați la maxim, se dispun în placa ecuatorială metafazică (Fig.5). Mișcarea de dispunere a cromosomilor în placa ecuatorială, la distanță egală de polii fusului de diviziune prezintă, după Darlington, trei componente:

adunarea cromosomilor într-o poziție de echilibru între cei doi poli, mișcare datorată interacțiunii între polii fusului și centromeri;

orientarea cromosomilor în placa ecuatorială astfel ca, centromerii să fie situați în axul longitudinal al fusului de diviziune, cromatidele fiind orientate lateral;

distribuirea cromosomilor în placa metafazică se realizează în jurul unui fus central gol (în secțiune transversală apare ca un halo), cromosomii fiind dispuși la periferia fusului, cu brațele orientate în afară.

Forma plăcii metafazice este variabilă de la un tip celular la altul, dar constantă pentru același tip de celule. La organismele cu cromosomi scurți și celule mari, întregul cromosom poate fi încadrat în placa metafazică, în același plan cu centromerii. La alte tipuri de celule, se remarcă tendința cromosomilor mici de a se dispune în axa centrală a fusului, iar a celor mari, periferic. Când cromosomii sunt lungi, brațele lor se orientează, de regulă, spre unul din cei doi poli, uneori chiar spre ambii poli.

Anumiți factori influențează configurația plăcii ecuatoriale, determinând modificări în diviziune. Distrugerea experimentală a fusului duce la desprinderea cromosomilor din placa ecuatorială; menținerea lor în placa ecuatorială se datorează unei forțe alternative de repulsie și de atracție dintre poli și centromeri. După Ostergren, există un echilibru al acestor forțe; aceleași forțe care țin cromosomii în placa ecuatorială, cât timp centromerul este nedivizat, sunt responsabile de atracția centromerilor fii spre polii opuși. După Darlington, separarea cromosomilor fii în anafază se datorează unei forțe de repulsie apărute imediat după diviziunea centromerului.

Morfologia cromosomilor se studiază în metafază, deoarece în această fază ei sunt condensați în cel mai înalt grad. Fiecare cromosom este alcătuit din două cromatide și prezintă în lungul acestora, spre sfârșitul metafazei, o fisură longitudinală, care reprezintă spațiul dintre cele două cromatide surori. La sfârșitul metafazei (Fig.6), cromatidele surori încep să se separe (clivarea longitudinală), făcându-se trecerea spre anafază.

Fig. 5 Aspect al cromosomilor unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflată în metafază timpurie (după Hartl și Jones, 1998)

Fig. 6 Aspect al cromosomilor unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflată în metafază târzie(după Hartl și Jones, 1998)

Anafaza

Anafaza se caracterizează prin formarea, din cromatidele surori, a cromosomilor fii și migrarea lor spre cei doi poli ai celulei. Formarea cromosomilor fii debutează în anafaza timpurie, când are loc clivarea centromerilor, cromatidele rămânând încă apropiate unele de altele. O dată terminată clivarea centromerilor, începe separarea cromatidelor în lungul fisurii longitudinale evidențiate în metafază (Fig.7). După Lewin (1994), la celulele animale, în anafază, centromerul este duplicat funcțional. Când și acest proces se încheie, cromatidele fiice, fiecare cu câte un centromer propriu, încep migrarea spre poli (Fig.8), devenind cromosomi fii.

Se admite că mișcarea cromosomilor spre poli este o consecință a scurtării filamentelor fusoriale de sprijin, care leagă polii fusului (prin pierderea sau adiția de tubulină din microtubuli). Alungirea determină stabilitatea fusului, iar scurtarea este mecanismul implicat în mișcarea cromosomilor spre poli. Această mișcare este posibilă datorită existenței în structura fusului mitotic a unor proteine de natură actinică. Cromosomii se pot deplasa la perioade diferite de timp și cu viteze diferite; de regulă, mișcarea anafazică începe simultan la toți cromosomii, indiferent de mărimea lor. Mișcarea cromosomilor este continuă, liniară. Fragmentele acentrice (lipsite de centromer) ale cromosomilor, nu pot migra la poli, dar ajung aici datorită curenților citoplasmatici. Viteza de migrare a cromosomilor este de 0,2-5μm / min. În cazul în care setul de cromosomi migrează aproape perfect sincron, se formează “placa anafazică” sau “dublul aster”. Chiar dacă mișcarea cromosomilor nu este sincronă, ea nu începe decât după ce toți cromosomii sunt plasați în placa ecuatorială.

În celulele animale, de regulă, autosomii migrează concomitent, iar heterosomii au o viteză de migrare diferită. În celulele plantelor, spre sfârșitul anafazei, fusul mitotic se mărește în volum în regiunea ecuatorială și ia formă de butoiaș, formând ulterior fragmoplastul.

Pentru a explica mecanismul mișcării anafazice a cromosomilor au fost emise și alte ipoteze. Astfel, Lillie, Bernstein, Kuwada și Darlington, explică această mișcare prin existența unor forțe electrice și magnetice. Metz, susține idea că, cromosomii ar poseda forțe proprii de locomoție, putând migra independent spre poli. Mazia a emis în 1961, ipoteza că mișcarea anafazică a cromosomilor s-ar datora unor forțe de atracție și de repulsie între cromosomi și polii fusului; cromosomii fiind încărcați electric pozitiv, se resping între ei, în același timp fiind atrași de poli, care sunt încărcați electric negativ.

Fig. 7 Aspect al cromosomilor unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflată în anafază timpurie (după Hartl și Jones, 1998)

Milovidov și Perakis au arătat că celulele aflate în diviziune și supuse acțiunii unui câmp magnetic, nu sunt influențate de acesta, deci interacțiunea cromosom – pol nu implică forțe de atracție sau respingere electromagnetică. Schaede, Burton și Haynes consideră că mișcarea anafazică a cromosomilor este determinată de curenții citoplasmatici, direcționarea fiind realizată de aparatul mitotic.

Fig.8 Aspect al cromosomilor unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflată în anafază târzie (după Hartl și Jones, 1998)

O altă ipoteză este aceea susținută de Szent-Gyorgyi și Hoffman- Berling, după care, aparatul mitotic este un gel în care funcționează filamente de tip actomiozinic, ce implică contractilitatea fibrelor cromosomiale, ca urmare a modificării gradului de hidratare a aparatului mitotic. Chimic însă, proteinele izolate din aparatul mitotic au puține asemănări cu actomiozina.

Telofaza

Telofaza este ultima fază a mitozei, caracterizată prin prezența fenomenelor opuse celor din profază. Cromosomii suferă un proces de despiralizare și revin la aspectul interfazic. Fragmentele de membrană nucleară migrează spre periferia fusului de diviziune; numărul lor crește printr-o sinteză suplimentară. Aceste vezicule se agregă în jurul masei cromosomiale, se turtesc, înconjoară nucleul interfazic și formează noua membrană nucleară. O parte din veziculele membranoase ajung la nivelul liniei de demarcație dintre cele două celule fiice. Are loc și reorganizarea nucleolilor la nivelul regiunilor ce îndeplinesc funcția de organizatori nucleolari (Fig.9 și Fig.10).

Fig.9 Celulă din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflată în telofază timpurie (după Hartl și Jones, 1998)

Fig.10 Aspect al nucleilor fii, aparținând unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflată în telofază târzie (după Hartl și Jones, 1998)

Citochineza

În cazul creșterii plasmodiale, diviziunile nucleare pot să nu fie urmate de citochineză (de exemplu: diviziunea celulelor la plantele inferioare – alge – Siphonales, la unele ciuperci, sau la formarea endospermului în sacul embrionar). În mod obișnuit însă, diviziunea nucleară este urmată de citochineză (plasmodiereză, citodiereză sau plasmotomie).

Citochineza poate avea loc centripet – la plantele inferioare (Cladophora, Spirogyra), când membrana ce separă cele două celule fiice apare sub forma unui inel ce crește centripetal, asemănător unei diafragme ()Toma și Niță, 1995).

La plantele superioare, citochineza are loc centrifug. După Buvat, în zona ecuatorială a fragmoplastului, se dispun vezicule proteice, printre care se intercalează fragmente ale reticulului endoplasmic, ce migrează în această regiune dinspre poli. Împreună cu elementele microtubulare, se formează o structură fibrilară. În jurul fibrelor microtubulare se aglomerează vezicule mici golgiene (Fig.11a,b). Veziculele se măresc, se contopesc și vin în contact cu pereții celulei mame, formând lamela mediană (Fig.11c). Celulele fiice formate, elaborează membrana primară, străbătută de plasmodesme (Fig.11d,e). La animale, separarea celulelor fiice se face prin formarea unui inel contractil, deci prin ștrangulare(Fig.12 a, b).

Fig. 11 Formarea peretelui despărțitor, între celulele-fiice, consecutiv diviziunii mitotice la plantele superioare (după De Robertis și De Robertis,1983)

Fig.12 Separarea celulelor-fiice, prin intermediul formării inelului contractil, consecutiv diviziunii mitotice, la organismele animale (după De Robertis și De Robertis,1983)

Poziția aparatului mitotic determină desfășurarea egală sau inegală a citochinezei. Doar la Spirogyra, la care în mod normal nucleul este situat în mijlocul celulei, deplasarea nucleului are drept consecință o diviziune inegală a citoplasmei. Prin experiențe de micromanipulare, Kawamura a stabilit că există o relație riguroasă între aparatul mitotic și planul citochinezei, aceasta realizându-se perpendicular pe ecuatorul fusului de diviziune.

În celulele normale, mitoza și citochineza sunt riguros coordonate. Dacă are loc blocarea citochinezei, mitoza se desfășoară normal, producându-se o celulă binucleată.

Odată cu replicarea cromosomilor, are loc și replicarea organitelor citoplasmatice sau separarea lor din celula mamă în celulele fiice, după care acestea își completează, prin noi sinteze, setul de organite intracitoplasmatice. În profază, reticulul endoplasmic este transformat într-un sistem discontinuu de vezicule sferice, dispuse în special în regiunile periferice ale citoplasmei. În metafază, mitocondriile se adună în jurul fusului; în anafază, ele se grupează în jurul regiunii ecuatoriale, odată cu separarea celulelor fiice având loc și repartizarea acestora. În interfaza celulelor fiice, el revine la forma tipică.

În diviziunea mitotică, metafaza și anafaza sunt fazele cele mai scurte ale diviziunii, în timp ce profaza, uneori și telofaza, sunt cele mai lungi. Desfășurarea în timp a mitozei depinde și de tipul celulei, vârstă, starea fiziologică, condiții de mediu (mai ales temperatura). Influența temperaturii asupra ciclului mitotic a fost demonstrată de către Brown, la meristemul rădăcinilor de mazăre – Pisum sativum L., unde viteza ciclului mitotic crește proporțional cu temperatura (la 15°C durează 177 min., iar la 30°C doar 65,5 min.). Mitoza poate fi blocată prin acțiunea șocurilor de temperatură, narcoticelor, otrăvurilor etc. (Raicu și colab., 1973)

Durata fazelor ciclului mitotic (în minute), în funcție de tipul celulei, după Lobașev (1963) (cf. Raicu și colab., 1973) este:

Mutațiile și mutageneza

Omul a fost întotdeauna supus acțiunii compușilor chimici, atât naturali, care apar în mediu, cât și introduși în urma dezvoltării industriei. La lista de peste 2 milioane de compuși chimici cunoscuți, în fiecare an se adaugă cca. 25000, dintre care cca. 500 se află în comerț. Reziduurile multora dintre aceștia poluează apele, aerul, solul, precum și indirect sau direct, alimentele.

Pe parcursul timpului au fost formulate mai multe definiții ale mutației. În 1838, referinduse la mutații, Spring considera că aceasta constituie o schimbare față de “tip” întrun sens mai mult sau mai puțin genetic. Puțin mai târziu, Waagen (1869) utilizează termenul de mutație întro manieră mai mult sau mai puțin formală, pentru a desemna schimbările bruște care se petrec în filogenie. Hugo de Vries (1901) ignoră termenul folosit de Waagen, adoptând termenul de mutație pentru schimbări genetice bruște; în acest înțeles genetic, termenul a devenit deosebit de important, el fiind aplicat pe sacră largă în biologie. Hugo de Vries poate fi considerat părintele mutagenezei. Pe baza observațiilor efectuate la Oenothera lamarckiana seringae, la care a observat numeroase modificări denumite de el mutații, a publicat în 1901 lucrarea “Teoria mutaționistă”, în care a acordat mutațiilor rolul preponderent în evoluția speciilor.

În 1904, Hugo de Vries propune chiar folosirea radiațiilor pentru inducerea mutațiilor, iar în 1909 scria: “mutageneza trebuie să fi stăpânită de om în măsura în care acesta stăpânește variabilitatea prin intermediul încrucișărilor”.

Erwin Bauer (1919) arată că prin mutație se înțelege orice variație ereditară care nu este rezultatul unei încrucișări, iar E. Guyenot susține că mutația este o variație bruscă de amplitudine diferită, total și imediat ereditară, care poate apărea spontan sau ca rezultat al unei acțiuni experimentale.

Cea mai completă definiție a mutației a fost formulată de I. H. Herskowitz (1965), conform căreia mutația este o schimbare detectabilă și ereditară, care afectează constituția chimică sau fizică a materialului genetic, o alterare a mesajului genetic al ADNului, care poate avea loc prin adăugarea, deleția, substituția sau inversia nucleotidelor, sau prin transferul lor în noi poziții și care nu se datorează recombinărilor genetice inter și intracromosomiale [Butnaru Gallia, 1985].

Cercetările pentru inducerea artificială a mutațiilor la plantele de cultură datează din perioada 19281935 și au fost întreprinse de Stadler în SUA, NilssonEhle și Gustafsson în Suedia, Didus, Sapeghin și Delone în URSS, Stubbe și E. Bauer în RFG. Primele mutații valoroase au fost obținute în Suedia la orz de către NilssonEhle și Gustafsson (1939), la muștarul alb de către Andersson (1950), la mazăre de către Gelin (1954) și la alunele de pământ de către Gregory (1959).

Utilizarea substanțelor chimice în inducerea mutațiilor a urmat la puțin timp după descoperirea rolului mutagen al radiațiilor X de către I. H. Müller (1927). Primele rezultate în acest sens datează din anul 1939, când Thorn și Steinberg au tratat cu acid nitros ciuperci din genul Aspergillus, determinând creșterea. În 1943, Öenlkers publică rezultatele sale despre acțiunea uretanului asupra dezintegrării cromosomilor de Oenethera lamarckiana.[67]. În perioada celui deal doilea război mondial, în Anglia, cercetătoarea Ch. Auerbach a pus în evidență capacitatea mutagenă a unor substanțe chimice. Ulterior, cercetările sau intensificat considerabil, descoperinduse capacitatea mutagenă a numeroși agenți chimici și modul lor de acțiune la nivel celular și molecular. Sau elaborat teste eficiente pentru estimarea capacității mutagene a diverselor substanțe chimice și sau indus mutații utile pentru procesul de ameliorare [Raicu P., 1997].

Numai în agricultură, din 1950 până în 1984 au fost create peste 157 de noi soiuri mutante (73 obținute pe calea iradierii cu raze X, 38 prin iradiere cu raze gamma, 12 prin tratare cu neutroni, iar 34 prin mutageneză chimică) [Butnaru Gallia, 1985].

În natură, mutațiile favorabile se păstrează prin selecție naturală. În comparație cu mutațiile naturale, rata mutațiilor induse cu diferiți agenți mutageni poate să crească până la 150 de ori, demonstrând astfel eficacitatea agenților mutageni artificiali. Cu toate acestea, spectrul mutațiilor induse este, în general, același. Sau constatat unele mici diferențe în spectrul mutațional al unor agenți mutageni chimici, care se pot atribui penetrației diferite în nucleu a substanțelor chimice și a capacității lor specifice de a acționa asupra materialului genetic din nucleu. Întotdeauna mutațiile apar brusc la nivelul materialului genetic, dar manifestarea lor se poate evidenția mai devreme sau mai târziu în mod direct (prin analize biometrice, observații etc.) sau indirect (prin analize biochimice, citogenetice, fiziologice etc.), în funcție de numeroși factori, printre care menționăm structura genetică a indivizilor, organul sau organele supuse agentului mutagen, tipul de mutație indus, agentul mutagen folosit etc.

Mutațiile apar la toate organismele și reprezintă o sursă importantă de variații ereditare. Amploarea manifestării mutațiilor depinde de momentul producerii lor. Nu demult, sa dovedit că mutațiile pot apărea în orice stadiu al dezvoltării organismului, în cursul vieții embrionare, în celulele somatice sau în gameți. Cu cât mutațiile somatice apar întro fază mai timpurie a ontogenezei, cu atât suprafața afectată este mai mare. Mutațiile și recombinările constituie sursa variabilității organismelor, prin modificările induse în materialul genetic, dar în același timp pot cauza apariția leziunilor moleculare genetice, atunci când sunt provocate.

Mecanismele lezionării ADN au la bază erori de biosinteză și de reparare a moleculei.

Agenții mutageni din ecosistemele animale și umane sunt la originea alterărilor moleculare gametice și apariției de boli genetice cu frecvență crescândă. Studiile genetice experimentale au evidențiat acțiunea mutagenă a numeroși agenți fizici, chimici sau biologici, din natură, sau produși de către om. Diversificarea produselor medicamentoase de sinteză, utilizarea în agricultură a numeroase pesticide, în alimentație a conservanților, a coloranților sintetici sau utilizarea radiațiilor x și a izotopilor în scop de diagnostic sau terapeutic, au atins în prezent niveluri îngrijorătoare, care pot furniza creșteri ale frecvenței mutațiilor. Dinamica genealogică și ontogenetică a mutațiilor în populațiile umane este lentă, iar etapele de dezvoltare și instalare a efectelor fenotipice sunt lungi, astfel încât consecințele negative nu sunt încă relevante în populația umană prezentă [Socaciu Carmen, 1996].

Procesele biomoleculare legate de un eveniment mutațional includ trei stadii majore:

– stadiul fizico-chimic, cu durată minimă (10-15 secunde), care constă în lezionarea primară a ADN cu agent mutagen;

– stadiul molecular de declanșare a mutației: propagarea erorii inițiale ce declanșează procese reparatorii în ADN-ul purtător de mutație, stadiu cu durată medie (1-3 minute);

– etapa biomoleculară exprimată prin fenotipul generat în succesiunea generațiilor și expresia sa evoluționistă, cu durată de ore, până la ani.

Întrucât marea majoritate a mutațiilor sunt recesive, exprimarea lor nu se realizează decât în starea homozigotă a genei mutante. Pentru manifestarea unei mutații recesive este nevoie uneori să treacă mai multe generații până când întâmplarea face ca în zigot să se unească doi gameți care posedă aceeași mutantă recesivă.

Braun (1953) consideră că apariția întârziată a unor mutații sub acțiunea agenților mutageni se datorează duratei sintetizării și acumulării unor produși în citoplasmă, ce preced mutația genei. Este necesar deci să treacă un anumit timp până când produsele mesajului genei inițiale să fie înlocuite cu produsele genei mutante [Nicolae I., 1978].

Sporirea producției agricole se poate realiza, pe de o parte, prin folosirea dozelor mici de agenți mutageni, care stimulează creșterea și dezvoltarea plantelor, iar pe de altă parte, prin folosirea dozelor mai mari, care între anumite limite au efecte mutagene și pot determina obținerea de mutații valoroase.

Rezultatele pozitive din ultimele decenii au încurajat considerabil cercetările privind folosirea agenților mutageni fizici și chimici în scopul obținerii de forme noi cu însușiri ereditare valoroase, care prin selecție sau asociate cu alte metode de ameliorare să ducă la obținerea unor soiuri cu valoare practică superioară formelor inițiale. Cu ajutorul mutațiilor, amelioratorii de plante realizează următoarele scopuri: obținerea de forme noi de plante cultivate rezistente la boli și dăunători; obținerea de soiuri bogate în boabe și masă vegetativă rezistente la cădere, cu paiul gros și bine dezvoltat; obținerea de forme precoce și cu cerințe modificate față de factorii temperatură, lumină, îngrășăminte etc.; modificări în conținutul biochimic al plantelor; obținerea de forme noi somatice sau vegetative, în deosebi la plantele cu înmulțire vegetativă; obținerea de micromutații în interiorul liniilor pure ale plantelor autogame și selecția celor mai valoroase din punct de vedere practic [Potlog A., Velican V., 1971].

Numeroase cercetări, efectuate mai ales în culturi de celule “in vitro”, au evidențiat faptul că, spre deosebire de rezistența plantelor la boli și dăunători și la alte stresuri din mediu, care implică mai multe gene sau sisteme de gene, rezistența plantelor cultivate la unele pesticide sau toxine este frecvent controlată de o singură genă. Or, transferul caracteristicilor controlate monogenic și digenic este practic și tehnic posibil prin metode convenționale, cât și “in vitro”.

Toate plantele cultivate ar trebui să posede rezistență la substanțele active din erbicide, pentru a putea supraviețui fără reducerea potențialităților productive în cazul administrării accidentale a unor cantități mai mari decât cele prescrise; astfel încât, o deosebită importanță în practică se acordă transferului la plantele dicotiledonate a rezistenței la erbicide atrazinice, în vederea asigurării rotației porumbsoia, fasole, rapița colza, floareasoarelui ș.a. Genele de rezistență la unele erbicide sunt plasate în genomul cloroplastelor (în timp ce sterilitatea masculină și rezistența la unele boli este controlată de gene mitocondriale). Descoperirea localizării rezistenței la erbicide în cloroplaste ia permis lui G. Pelletier (1983) să creeze “in vitro” genotipuri de rapiță colza și de varză prin transferare în acestea, prin intermediul hibrizilor, a cloroplastelor cu rezistență la atrazină de la rapița naveta. Prin regenerare sau obținut plante de colza și varză rezistente la atrazină. Experiențe de manipulare a genei rezistenței la erbicide au fost efectuate și la Universitatea Harvard, SUA, fiind utilizată o genă de rezistență la atrazină ușor transferabilă.

Un colectiv de cercetători de la societatea “Calgene” SUA a raportat introducerea întro plantă de tutun a unei gene bacteriene ce conferă rezistență la erbicidul glifosfat, iar cercetători de la Monsanto și Universitatea Rockefeller au transferat o genă de rezistență la același erbicid, originară din plante, în celule de tomate, tutun și petunia. Glifosfatul este un erbicid nediscriminatoriu (universal), care distruge atât plantele de cultură cât și buruienile. Această proprietate a erbicidului poate avea urmări favorabile în cazul creării de “cultivare” rezistente, atât la plantele monocotiledonate (porumb, grâu), cât și la cele dicotiledonate (leguminoase, floareasoarelui etc.) [Crăciun T., 1987].

Clasificarea mutațiilor

O dată cu descoperirea fenomenului mutațional sa pus și problema clasificării mutațiilor. La început au fost recunoscute doar mutațiile însoțite de efecte fenotipice vizibile. Ulterior sa dovedit că aceste tipuri reprezintă doar o parte neînsemnată din totalul mutațiilor care apar. Clasificarea diferitelor tipuri de mutații are un caracter destul de relativ din cauza complexității acestui fenomen.

Toate categoriile de mutații pot fi naturale (mutațiile care apar spontan) și artificiale (mutațiile induse experimental), între acestea neexistând deosebiri de ordin calitativ, deoarece sunt produse de agenți mutageni [Nicolae I., 1978].

După cantitatea de material genetic implicat în mutație, mutațiile pot fi:

1. mutații genice

2. mutații cromosomiale (restructurări sau aberații cromosomiale)

3. mutații genomice

1. Mutațiile genice pot afecta gena în întregime sau numai anumite segmente sau perechi de nucleotide din gena dată, clasificânduse după:

● modul de exprimare fenotipică:

– dominante

– semidominante

– codominante

– recesive

● sensul în care are loc schimbarea genei:

– directe, înainte sau de progresie

– înapoi sau de reversie

● tipul de celule în care apar:

– gametice

– somatice

● cromosomii în care sunt localizate

– autosomale

– heterosomale

● efectul mutațiilor asupra organismului

– folositoare

– dăunătoare

– subvitale

– semiletale

– letale

● calitatea genelor afectate

– mutații ale genelor structurale

– mutații ale genelor operatoare

– mutații ale genelor reglatoare

● cantitatea de material genetic implicat în mutație

– mutații intragenice

– mutații punctiforme

● localizarea genelor în materialul genetic al celulei

– nucleare

– extranucleare (citoplasmatice)

– de plastidom

– de condriom

– de citoplasmon

● frecvența de mutație a genelor

– gene stabile

– gene mutabile

– gene mutatoare

2. Mutațiile cromosomiale constau în ruperea unor segmente cromosomiale sau cromatidice prin acțiunea factorilor mutageni; segmentele se pot realipi în interiorul cromosomului de unde sau rupt, sau la alt cromosom neomolog.

● mutații intracromosomiale

– deleții

– terminale

– intercalare

– paracentrice

– pericentrice

– duplicații în tandem direct și în tandem invers

– terminale

– intercalare

– paracentrice

– pericentrice

– inversii

– intercalare

– paracentrice

– pericentrice

– egale

– inegale

– translocații directe (transpoziții)

– intraradiale

– interradiale

● mutații intercromosomiale între cromosomi omologi

– duplicații intercalare

– paracentrice

– pericentrice

● mutații intercromosomiale între cromosomi neomologi

– translocații extraradiale directe sau transpoziții extraradiale

– intercalare

– paracentrice

– pericentrice

– translocații extraradiale reciproce

– terminale

– intercalare

– paracentrice

– pericentrice

– fuzionarea centromerilor cromosomilor telocentrici

3. Mutații genomice reprezintă variații ale numărului de cromosomi sau variația numărului de genomuri.

● haploidia

● poliploidia

– autopoliploidia

– alopoliploidia

● aneuploidia

● pseudoaneuploidia

Anomaliile de structură sunt evidențiate de modificările morfologiei cromosomilor, însoțite de modificări cantitative ale materialului genetic sau de modificări ale pozițiilor genelor în cromosomi. Ele apar fie ca urmare a lezionării cromosomului în faza G1 prereplicativă a ciclului celular (aberații de tip cromosomial), fie în urma lezionării cromatidelor surori în faza S și G2 (aberații de tip cromatidic).

Micronucleele sunt formațiuni citoplasmatice, asemănătoare ca formă, structură și proprietăți cu nucleul celular și reprezintă fragmente cromosomiale acentrice care în anafază nu se pot deplasa spre nucleii-fii în formare (Almassy, 1987) sau cromosomi întregi neincluși nucleilor fii datorită retardării anafazice produse prin degradarea aparatului mitotic (Schmidt, 1975; Nito, 1986,1988) [ citați de Socaciu Carmen, 1996]. Există o corelație strânsă între formarea micronucleelor și aberațiile cromosomiale, de aceea testul micronucleelor reprezintă o metodă alternativă de testare a mutagenicității pe celule mamifere, fiind utilizat pentru detectarea agenților genotoxici cu efect clastogen și/sau de inhibare a mitozei.

Criterii și recomandări pentru identificarea corectă a micronucleelor (după Alder,1984, citat de Socaciu C, 1996):

• micronucleele au forme regulate și rotunde, rar ovale sau de semilună:

• au întotdeauna diametru mai mic cu cel puțin 1/3 din diametrul nucleului principal;

• au aceeași culoare sau sunt mai decolorați decât nucleul principal;

• sunt separați de nucleul principal și plasați la distanțe mai mici decât diametrul acestuia;

• sunt considerate artefacte celulele cu mai mult de două micronuclee. Ele se depistează și prin focalizare diferită a imaginii.

Anomalii structurale ale cromosomilor și cauzele lor [Socaciu, 1996].

Fig. 32 Principalele tipuri de aberații cromosomiale(modificat după Scott și colab., 1983 și Gavrilă,1986)

Metode pentru inducerea și identificarea aberațiilor cromosomiale la plante

Pentru inducerea mutațiilor la plante se utilizează tehnici variate de tratament, modelarea lor realizându-se funcție de mutagenul folosit, de specie, de soi, de momentul aplicării tratamentului etc.

Există câteva condiții obligatorii de îndeplinit în efectuarea unui tratament mutagenic:

– tratamentul, în general, de scurtă durată, dar în concordanță cu durata ciclului celular (interfaza cu fazele G1, G2 sau S și fazele de diviziune);

– doza utilizată să fie aleasă de așa manieră încât să nu inhibe puternic diviziunea celulară;

– să se țină cont de factori ce pot influența efectul agenților mutageni: pH, temperatură, etc.;

– aplicarea tratamentului să se efectueze pe soiuri valoroase în scopul ameliorării unor deficiențe de tipul: rezistență scăzută la ger, la cădere, la secetă, la boli și dăunători.

– tratamentele pot viza și stabilirea gradului în care un factor chimic, fizic sau biologic este mutagen și are efecte negative asupra materialului genetic (monitoring genetic);

– studiul aberațiilor cromosomiale să se efectueze în interfază, în metafază (caz în care este necesar un tratament prealabil cu colchicină) sau în ana-telofaza mitozei, stabilindu-se și tipurile de aberații apărute.

Studiul aberațiilor cromosomiale se poate realiza – în interfază – testul micronucleelor. Micronucleele reprezintă nuclee de dimensiuni mici, ce coexistă alături de nucleul celulei interfazice. Micronucleul rezultă din unul sau mai multe fragmente centrice și/sau acentrice, aglomerate. Testul micronucleelor se utilizează în analiza citogenetică, în vederea determinării rapide a existenței restructurărilor cromosomiale.

în metafază – analiza metafazică

în ana-telofază – analiza ana-telofazică

Studiul aberațiilor cromosomiale în ana-telofaza mitozei la unele plante de cultură

Ca rezultat al delețiilor cromosomiale apar în ana-telofaza mitozei aberații cromosomiale, vizibile la microscopul optic (colorând materialul biologic mutagenizat cu un colorant specific nuclear), de tipul:

– fragmente acentrice (lipsite de centromer) – nu migrează spre poli, se pierd în cursul diviziunilor succesive, fiind metabolizate. Se produce astfel un dezechilibru în doza genelor, ceea ce, în general conduce la moartea celulei respective.

– fragmente centrice (cromosomi inelari, inele centrice) – formate în urma a două deleții terminale la nivelul unui cromosom, ca urmare a reunirii capetelor fără telomeri. Fragmentele centrice, deoarece posedă centromerul cromosomului, pot participa la diviziune.

– inele acentrice – rezultate în urma reunirii capetelor unor fragmente acentrice mari, în cazul în care deleția a fost produsă în așa fel încât nici un capăt al fragmentului nu posedă telomer.

– punți (cromosomi dicentrici sau policentrici)- de regulă sunt rezultatul reunirii a doi cromosomi ce au suferit deleții terminale. Respectivii cromosomi formează una sau mai multe punți, vizibile între cele două mase cromatidice separate la polii celulei.

– micronuclee

Există și alte tipuri de aberații ce se pot evidenția în ana-telofaza mitozei, la microscopul optic:

– cromosomi retardartari – sunt cromosomi la care centromerul și-a pierdut capacitatea de cuplare la fibra fusorială. Ei nu pot participa la diviziune, nu pot migra spre polii celulei, dezechilibrând repartiția cromosomilor între cele două celule fiice.

– ana-telofaze tripolare, tetrapolare, multipolare – provocate de formarea defectuoasă a fusului de diviziune. Apar fusuri de diviziune cu 3, 4 sau mai mulți poli. Cromatidele cromosomilor, după clivare, migrează în 3, 4 sau mai multe direcții, ceea ce va conduce la repartizarea inegală a cromatidelor între celulele fiice rezultate.

Frecvent, multe dintre aberațiile cromosomiale descrise se pot asocia. Cele mai frecvente asocieri sunt de tipul: punți + fragmente, punți + cromosomi retardatari, punți + micronuclee etc.

Material biologic:

– cariopse de grâu-Triticum aestivum L.(2n=42)

– boabe de bob -Vicia faba L. (2n=12)

Reactivi:

– soluții de cafeină de diferite concentrații (0,01%; 0,05%; 0,1%; 0,5%)

– soluții de nicotină de diferite concentrații (0,01%; 0,05%; 0,1%; 0,5%)

– apă distilată

– fixator (alcool-acid acetic 3/1 sau Battaglia)

– HCl 1N

– HCl 50%

– acid acetic 45%

– reactiv Schiff

Instrumentar, sticlărie:

– cutii Petri

– hârtie de filtru

– pensete

– lame

– lame și lamele pentru microscop

Mod de lucru:

1. Germinarea

– în cutii Petri tapetate cu hârtie de filtru, umectată cu apă distilată. Germinarea se va desfășura la întuneric, la 23-240C, până în momentul în care rădăcinițele vor avea cca. 10 mm lungime.

2. Tratamentul mutagen

– prin imersia materialului în soluțiile de mutagen, timp de expunere 3 ore.

3. Spălare

-în apă distilată, de trei ori, câte 10 minute

4. Fixarea

-detașarea rădăcinițelor de pe cariopse și fixare în fixator Battaglia pentru 25 minute, la temperatura camerei

5. Spălare

– cu HCl 1N timp de 5 minute, la temperatura camerei

6. Hidroliză

– cu HCl 50%, cca. 30 minute, la temperatura camerei

7. Colorare

– cu reactiv Schiff, 15-30 minute, la temperatura camerei

8. Efectuarea preparatelor microscopice

– radăcinița la bob, sau rădăcinițele unei cariopse de grâu se plasează pe o lamă de microscop, într-o picătură de acid acetic 45%. Preparatul microscopic se realizează prin tehnica squash

9. Studiul preparatelor

– se studiază ana-telofazele normale și aberante, notâdu-se tipurile de aberații și numărul aberațiilor cromosomiale

10. Efectuarea preparatelor permanente

– dacă materialul prezintă frecvente aberații, preparatele respective se efectuează permanent.

În Fig. 33 – 36 sunt prezentate aspecte ale aberațiilor cromosomiale în ana-telofaza mitozei la bob, induse prin tratamente cu mutageni chimici.

Fig. 33 Ana-telofază cu punte (original)

Fig. 34 Ana-telofază cu punte și fragment (original)

Fig. 35 Ana-telofază cu punți (original)

Fig. 36 Interfază cu micronucleu (original)

Protocol general (indiferent de specie și de mutagen) pentru tratamentul scurt

Etape de lucru

1.germinarea – la t0 camerei, în cutii Petri, pe hârtie de filtru umectată cu apă distilată. Umectarea va fi repetată, până când rădăcinițele ajung la 1 – 1,5cm;

2. tratamentul mutagen – la t0 camerei, timp de 2 ore. Martorul va fi supus aceluiași tratament, dar în loc de soluție de mutagen se va folosi apă distilată; variantele experimentale vor fi tratate cu mutagenii sub formă de soluție, de diferite concentrații. Tratamentul propriu-zis se efectuează prin scufundarea rădăcinițelor în soluțiile de mutagen, respectiv în apă distilată, în cazul martorilor (cca. 15 – 20 semințe germinate pentru fiecare probă);

3. spălarea – la t0 camerei, timp de 2 ore, în apă distilată. Se înlocuiesc soluțiile de mutagen cu apă distilată;

4. fixare – în fixator alcool etilic absolut : acid acetic glacial (3:1), 24 ore la t0 camerei, sau în frigider;

5. păstrare în alcool etilic 700, la frigider, până la prelucrare. Semințele germinate sau doar rădăcinițele (în cazul în care semințele au dimensiuni prea mari) se trec în sticluțe cu alcool 700, se notează pe fiecare sticluță varianta experimentală și se păstrează la frigider;

6. spălarea – cu HCl 1N, 5 min. Se trec câteva rădăcinițe în sticluțe curate, se acoperă cu acid. Etapa are rolul de a îndepărta alcoolul etilic;

hidroliza – în HCl 50%, timp variabil pentru fiecare specie. Se îndepărtează acidul 1N și materialul se acoperă cu acid clorhidric 50%. Pentru stabilirea timpului necesar pentru hidroliză se lucrează mai întâi pe radăcinițe aparținând martorului. Se trece câte 1-2 în câte o sticluță, se adaugă acidul și se lasă un anumit timp pentru hidroliză (de ex., 8min., 10 min. și 12 min., pentru tomate). Se alege varianta la care colorarea realizată ulterior este cea mai bună. Doar după stabilirea timpului de hidroliză se va trece la colorarea materialului provenit din variantele mutagenizate, în alte condiții existând riscul compromiterii întregului experiment;

7. colorarea – cu colorantul Carr (carbol-fuxină). Se îndepărtează HCl 50% din sticluțe; se lasă sticluțele cu gura în jos pe hârtie de filtru, pentru a se scurge foarte bine, apoi se adaugă colorantul, doar atât cât să cuprindă rădăcinițele. Dacă se constată o virare de culoare de la violet la albastru, colorantul se schimbă. Se lasă la frigider apoi 24 – 48 ore (sau chiar mai mult), pentru realizarea colorării;

8. efectuarea preparatelor microscopice – pe lame de microscop foarte curate, într-o picătură de acid acetic 45%, prin tehnica squash;

Examinarea preparatelor la microscop:

a) pentru indicele mitotic (atât pentru martor cât și pentru variantele experimentale): se citesc câte 5 – 10 preparate, pentru fiecare variantă.

Pe fiecare preparat se citesc câte 10 câmpuri microscopice. În fiecare câmp se numără celulele în diviziune (în P, M, A și T) și celulele în interfază. Se notează totul în tabelul preliminar. Cele 10 câmpuri microscopice se aleg aleator pe preparat., însă trebuie să aibă o densitate bună de celule, iar acestea să nu fie suprapuse. Nu se citesc decât celulele întregi; celulele de pe marginea câmpului, care se văd pe jumătate, nu se iau în calcul;

b) pentru aberațiile cromosomiale în ana-telofaza mitozei: pe aceleași preparate pe care se fac citirile pentru indicele mitotic, în paralel se citesc câte 50 ana-telofaze (toate de pe un preparat în cazul în care sunt puține). Se notează în tabelul preliminar cele normale și cele cu aberații, precum și tipul de aberații.

Tabel preliminar pentru înregistrarea indicelui mitotic

Tabel Preliminar pentru înregistrarea aberațiilor cromosomiale în A-T mitozei

Tabel indice mitotic

Tabel aberații cromosomiale

Bibliografie

1 http://biblioteca.regielive.ro/cursuri/biologie/genetica-anatomie-127221.html

2 http://ro.scribd.com/doc/19475537/-Probleme-Generale-Privind-Poluarea-Apelor

3 http://www.referat.ro/referate/download/Poluarea_apei_6ad7b.html

4 Poluarea și protecția mediului ;Dr. Matei Bornea ;Ing. Cornelia Papadopol ,Editura Științifică și eniclopedică , București 1975

5 Poluarea apei ;Virgil Spulber; Editura Ștințifică ;București 1984

6 Negut S. – “Un singur Pământ”, Editura Albatros , Bucurest, 1978;

7 Brown L. – “Probleme globale ale omenirii”, Editura Tehnica, Bucuresti,1992 .

8

Bibliografie

1 http://biblioteca.regielive.ro/cursuri/biologie/genetica-anatomie-127221.html

2 http://ro.scribd.com/doc/19475537/-Probleme-Generale-Privind-Poluarea-Apelor

3 http://www.referat.ro/referate/download/Poluarea_apei_6ad7b.html

4 Poluarea și protecția mediului ;Dr. Matei Bornea ;Ing. Cornelia Papadopol ,Editura Științifică și eniclopedică , București 1975

5 Poluarea apei ;Virgil Spulber; Editura Ștințifică ;București 1984

6 Negut S. – “Un singur Pământ”, Editura Albatros , Bucurest, 1978;

7 Brown L. – “Probleme globale ale omenirii”, Editura Tehnica, Bucuresti,1992 .

8

Tabel preliminar pentru înregistrarea indicelui mitotic

Tabel Preliminar pentru înregistrarea aberațiilor cromosomiale în A-T mitozei

Tabel indice mitotic

Tabel aberații cromosomiale