Investigații Analitice A Componentelor Active DIN Fomes Fomentarius

DEPARTAMENT DE STUDII MASTERALE

PROGRAM MASTERAL:

FORMULAREA ȘI EVALUAREA PRODUSULUI DERMATO-COSMETIC

NUME ȘI PRENUME:

STANČU MONIKA

“INVESTIGAȚII ANALITICE A COMPONENTELOR ACTIVE DIN FOMES FOMENTARIUS”

CONDUCĂTOR ȘTIINȚIFIC:

PROF. UNIV. DR ȘIȘU EUGEN

TIMISOARA

2016

Cuprins

Introducere

Fomes Fomentarius sau iască este o ciupercă medicinală prevăzută și de Hippocrate în lucrările sale ca având efecte de oprire a sângerării și de cauterizare. Iasca se dezvoltă pe trunchiurile vii ale multor foiase, mai ales pe fagi și mesteceni. Este o specie des întâlnită în Europa, inclusiv în România.

Această ciupercă era utilizată în trecut de către bărbieri și frizeri, precum și în unele operații chirurgicale. În mod egal a fost folosită în tratarea afecțiunilor vezicii urinare și a hemoroizilor. În India, iasca avea succes în proprietățile sale calmante și laxative, iar faptul cel mai interesant și benefic este cercetarea demonstrării al eficacității acestei ciuperci în medicina chinezească asupra cancerului la gât, cancerului de uter și stomac. Fomes fomentarius are un efect prielnic și asupra sistemului imunitar.

Din aproape un milion de specii, subspecii, varietăți și forme ale acestor unități sistematice de plante existente, ciupercile populează Terra în măsură de 25%. Există 5 milioane de specii de ciuperci, din care se găsesc aproximativ 8700 numai în România. Se estimează că, din cele 10000 specii de ciuperci cunoscute, în mod curent sunt consumate vreo 700, iar mai mult de 200 pot avea valoare medicinală. Din motive diverse, numai 100 din ciupercile medicinale sunt cercetate și disponibile. De asemenea, trebuie menționat faptul că în fiecare an se descoperă noi specii care se adaugă la cele existente. Ciupercile benefice care prezintă proprietăți terapeutice sunt folosite de mii de ani pentru menținerea sănătății și totodată pentru creșterea longevității. Cercetările realizate în ultimele decenii scot în evidență existența unor extraordinare proprietăți antitumorale.

Datorită conținutului lor bogat în polizaharide, lipide, aminoacizi, proteine, vitamine, minerale și alte microelemente active, ciupercile cu proprietăți benefice constituie una dintre cele mai eficiente modalități de a stimula și de a întări imunitatea. Acestea sunt capabile să faciliteze declanșarea unor procese naturale de vindecare în cazul multor afecțiuni, printre care și cancerul.

Lucrarea de față investighează prezența și cantitatea componentelor active din Fomes Fomentarius prin metode analitice, atât prin extracții la cald cu solvenți diferiți, cât prin evidențierea acestor componente în TLC (Thin Layer Cromatography – Cromatografia în strat subțire) și densitometru.

În încheiere, sunt subliniate câteva concluzii legate de studiu efectuat.

I CONSIDERAȚII TEORETICE: IASCĂ

Istoric al ciupercilor medicinale

Un vechi proverb chinez spune că “Remediile și hrana (alimentele) au o origine comună.” Chinezii vechi au numit ciupercile “elixirul vieții”.

Cea mai veche scriere despre ciupercile medicinale este un tratat medical indian datând din 3000 î.H. Farmacopeea chineză oferă date despre proprietăți terapeutice a peste 100 de specii de ciuperci. De asemenea, în tratatul “Shen Noug Pen Ts’ao Jing (100-200 d.H.) sunt descrise Ganoderma lucidum, Poria cocos și multe altele. O lucrare medicinală chineză din 1575., denumită „Pen Ts’ao Kang Mu”, oferă date despre 20 de specii de ciuperci medicinale. Multe dintre ele prezintă baza a numeroase remedii japoneze, chineze și coreene. În aceste țări ciupercile se cresc de secole, iar cele medicinale se utilizez în naturopatia tradițională timp de peste 4000 de ani.

Un principiu fundamental al medicinei orientale este reglarea homeostaziei organismului privit ca întreg. Ciupercile medicinale sunt foarte benefice pentru atingerea acestui scop, datorită reechilibrării sistemului imun. Terapia Fu Zheng din medicina chineză, conține tratament cu ciuperci medicinale care sunt utilizate pentru a crește rezistența la orice tip de îmbolnăvire și pentru a normaliza funcțiile corpului. Ciupercile medicinale în China nu se folosesc doar la vindecarea bolilor, deci și ca un potențial în împiedicarea bolilor atunci când sunt administrative preventiv.

Egiptenii considerau ciupercile un dar al zeului Osiris, iar Romanii le-au numit “hrana zeilor” și credeau că ele apar datorită fulgerelor aruncate de Zeus pe pământ în timpul furtunilor. În Roma, ciupercile numite Amanita tuber, boletus și caesarea au fost reprezentate ca supremul delicatețelor și satisfațiilor, considerate atât de valoroase încât au fost echivalate în aur. În timpul respectiv, Romanii înca nu știau despre valoarea nutritivă și curativă a ciupercilor. La vremea respectivă, decisive erau gustul și mirosul. De asemenea, erau cunoscute și ciupercile otrăvitoare care erau folosite pentru a asasina adversarii politici nedoriți.

Cercetarea modernă confirmă acum știința antică legată de forța vindecătoare a ciupercilor. Multe rapoarte medicale sunt publicate conținând date pozitive legate de efectele și folosirea ciupercilor medicinale, atât în trecut, cât și în prezent, favorizând tradiția străveche a medicilor naturopați combinată cu medicina modernă.

Fomes fomentarius

Iasca este descoperită de prima dată în 1991., atunci când era descoperită cea mai veche mumie până acum la o altitudine de 3213 m, aproape de vârful Similaun, din Alpii Otztal. Acest om a dobândit un nume de omul din Similaun (omul din Hauslabjoch) sau Otzi. Analizele din laborator au confirmat ca acest om are o vechime de 5300 de ani. Printre un topor, un cuțit și altele, alături de el s-au găsit și câteva ciuperci înfășurate într-o bucată de piele, probabil pentru aprinderea focului (Fomes fomentarius) și/sau pentru uz medicinal (Piptoporus betulinus – având proprietatea de a distruge parazite din stomac și efect laxativ).

În Germania, oamenii au folosit buretele de iască în rituale, pentru aprinderea focului dar ca și medicament.

În medicina tradițională chineză, iasca s-a utilizat ca și tratament pentru ulcer bucal, afecțiuni gastroenterice, inflamații și cancere.

Clasificarea

Domeniu: Eucariote

Regn: Fungi

Diviziune: Basidiomycota

Clasă: Agaricomycetes

Ordin: Polyporales

Familie: Polyporaceae

Gen: Fomes Figura 1: Fomes fomentarius

Specie: Fomes fomentarius

Figura 2: Fomes fomentarius

Tabel 1: Sinonime

Generalități

Fomes fomentarius se mai numește: Iască, văcălie, burete de iască, văcălie de fag, iasca fagului, copită, babiță, copita calului.

Iasca are corpuri fructifere (bazidiocarp) perene, izolate sau etajate, în formă de copită, poliță sau pălărie, diametrul 10-40 cm, 2-25 cm înălțime. Suprafața este netedă, iar în cazul exemplarelor bătrâne este concentric-brăzdată. Corpul fructifer este crustos și gros. Culoarea aparatului fructifer variază. Poate fi albicios, galben deschis, mergând până la gri, negricios, brun-cenușiu, cenușiu, cu marginea brun-gălbuie, crem sau ocracee.

Carnea este uscată, tare, groasă, fibroasă, lemnoasă de culoare brun-gălbuie sau brun-ruginie; cu gust foarte amar și miros slab de fructe.

Tuburile sporifere sunt stratificate și foarte scurte, fiecare strat având 2-6 mm. Au culoare ruginie sau brună.

Porii sunt sferici, mici de 0,2-0,4 mm diametru. La început, partea inferioară a pălăriei este albicioasă, apoi brunie. Sporii sunt hialini, oblongi-elipsoidali..

Se dezvoltă pe trunchiuri vii sau moarte de la diferiți arbori foioși: fag, mesteacăn, ulm, carpen, frasin, stejar, plop, salcâm, castan, în trunchiul cărora pătrunde prin răni, mici fisuri sau ramuri rupte, producând o putrezire lentă și ducând copacul la ruină. Se va dezvolta în continuare și se va hrăni foarte bine pe acest substrat înca mulți ani.

Fructificațiile ciupercii apar pe trunchi, cu față inferioară plană.

Iasca este o ciupercă parazitară, saprofită și perenă întâlnită tot timpul anului (I-XII). Este foarte des întâlnită în Europa de Nord, în Europa Centrala și de Sud, mai ales la munte.

Această ciupercă nu are valoare alimentară. Fiind foarte tare și uscată, este necomestibilă.

Văcălia, de asemenea ca și restul ciupercilor din regnul Fungi, constituie o grupă aparte de organisme uni- și pluricelulare. Fungii dețin următoarele caractere:

aparatul vegetativ nediferențiat (tal)

talul menționat poate fi unicelular sau pluricelular, apoi microscopic sau macroscopic; poartă numele de miceliu

pot fi sexuați sau asexuați

se înmulțesc repede

având în vedere că nu conțin în celule organite care să realizeze fotosinteza, spre deosebire de plante, ciupercile sintetizează unele substanțe specifice regnului animal, cum ar fi chitină și glicogen

sintetizează glucide speciale, specifice numai lor, cum ar fi manitoza, trehaloza, ergotioneina.

Babițele au un rol esențial în ecosistemele naturale. Fără această ciupercă saprofită descompunătoare, omenirea ar sta îngropată sub un strat gros de deșeuri biologice (frunze, ramuri, alte resturi de origine vegetală sau animală, gunoi). Fungii saprofiți, din acest motiv, au fost numiți “gunoieri binevoitori ai naturii”. Pentru că suportă cantități mari de substanțe tanante, realizează degradarea resturilor vegetației lemnoase. Din acest motiv, fungile aduc o contribuție specială în formarea părții organice a solurilor, în același timp, având un rol în cadrul lanțurilor trofice.

Văcălia este:

macromicetă (are corpul de fructificație mare)

este un organism heterotrof parazitar (trăiește pe seama sintezelor altor organisme) și saprofit (își sintetizează substanțele proprii pe baza compușilor din substraturile nutritive neînzestrate cu viață)

produce slăbirea structurii trunchiului parazitat ducând frecvent la ruperea lui, dar ciuperca putând trăi mai departe ca saprofit pe trunchiul în putreficație

după gradul de comestibilitate sau toxicitate, se încadrează în ciuperci necomestibile și ciuperci suspecte

au fost considerate plante, până când s-a format un regn de sine stătător pe baza caracteristicelor specifice doar ciupercilor

facea parte din încrengătura Eumycota (ciuperci cu perete celular) până în anul 2002.

anul 2002. a adus schimbări importante în clasificarea ciupercilor, constituind 7 încrengături noi, în care se încadrează și văcălia (încrengătura (phylum) Basidiomycota).

Noțiuni generale despre ciupercile mari

Încrengătura Fungi este împărțită în cinci clase, printre care se găsesc atât ciuperci microscopice (micromicete), cât și ciuperci macroscopice (macromicete). Ciupercile cu corpurile fructifere de dimensiuni mari aparțin la clasele Ascomycetes și Basidiomycetes, babița încadrându-se în a doua clasă.

Clasa Basidiomycetes

Acestea sunt cele mai evoluate ciuperci. Organul caracteristic al fungilor din această clasă fiind bazida sau bazidiosporii.

Aparatul sau corpul vegetativ este reprezentat printr-un tal constituit din hife sau filamente miceliene. Există trei feluri de micelii:

Miceliul primar derivă din germinarea bazidiosporilor și este de același sex cu bauidiosporii din care provine. Miceliu menționat este alcătuit din filamente septate, uninucleate. Este un miceliu haploid, redus și de scurtă durată. Pe micelul primar nu se diferențiază organe de înmulțire sexuata, însă procesul sexual există și are loc între celulele miceliilor primare de sex deosebit, rezultate de bazidiosporii diferențiați sexual. În urma copulării miceliilor primare rezultă miceliul secundar.

Miceliul secundar este un corp vegetativ de lungă durată. Dacă miceliul se dezvoltă pe lemn, ciuperca este lignicolă, iar dacă se dezvoltă în sol, este tericolă. Filamentele miceliene sunt cilindrice, septate prin pereți transversali în celule binucleate – este un miceliu dicariotic. Culoarea hitelor este de obicei albă, dar poate fi și brună, galbenă sau roșie. Filamentele miceliene pot să constituie cordoane miceliene sau rizomorfe, prin asociere. Rizomorfele se alcătuiesc din împletirea strânsă a hifelor. Sunt de culoare albicioasă sau brună-negricioasă.

Miceliul persistă în substrat, sub o formă, crește și se dezvoltă, iar în condiții bune fructifică.

(http://www.scatiii.ro/mic_atlas_micologic/Foto/fig3.jpg)

Figura 3: Ciclul evolutiv al unei ciuperci (dupa R. Heim):

s și sp – spori;

mp – miceliu primar;

ms – miceliu secundar;

pr – primordiu.

Bazidia rezultă din celula terminală a unui filmanet dicariotic. Cei doi nuceli din bazidia tânără fuzionează și rezultă un nucleu diploid. Aceasta suferă apoi diviziunea reducătoare, urmată de cel puțin o diviziune. Odată cu formarea bazidiosporilor are loc și diferențierea lor sexuală.

Miceliul terțiar este miceliul de fructificare al Basidiomycetelor și acestea aparține tot dicariofazei, dar constituie bazidiofructele.

Corpurile fructifere pot avea forme variate dintre care există cinci corpuri diferite. Iasca are corpul fructifer în formă de pălărie semicirculară, sesile fixate cu o parte de substrat, este evidențiat un aspect unei copite sau console. Acest gen de fruct au și altele ciuperci din familiile Polyporaceae și unele Agaricaceae.

Figura 4: (http://www.scatiii.ro/mic_atlas_micologic/Foto/fig6.jpg)

Se disting mai multe părți principale ale corpurilor fructifere:

porțiunea care poartă suprafața fertilă (pălăria)

porțiunea sterilă (piciorul)

himenoforul sau himenul

carnea

Văcălia posedă un himenofor tubular, la care stratul himenial căptușește tuburile sporifere.

În familia Polyporaceae sunt grupate ciuperci coriacee sau suberoase, mai rar cărnoase, cu himenofor tubular. Tuburile sporifere sunt căptușite de stratul himenial și se deschid pe partea inferioară a fructificației. Bazidiile au patru spori hialini. Bazidiofructele pot fi anuale sau perene.

Importanța generală

Chiar și în perioada neolitică, babița a fost utilizată la aprinderea focului și implicit a luminii. În evul mediu, prepararea sa a mai evoluat, fiind fiartă, curățită de crustă și apoi îmbibată cu o soluție de nitrat de amoniu sau urină, apoi uscată. Rezultatul arăta că era suficientă numai o scânteie cu o bucată de cremene și un amnar pentru aprinderea ei. Stratul mijlociu al ciupercii este cel care se aprinde foarte ușor datorită texturii ușoare.

Până în secolul XIX s-a folosit în farmacii pentru oprirea hemoragiei, cunoscută sub o denumire de Fungus chirurgorum.

În Europa, babița se folosește în scop decorativ, adică în confecționarea pălăriilor, gențiilor sau altor obiecte de artizanat. De asemenea, se folosește și în florărie la confecționarea coroanelor funerare.

Importanța medicinală

efect antitumoral – esofag, laringe, stomac, uter, intestin, piele, plămâni (Kim, Jakhar, Kang, 2014.)

efect antimicrobien (variolă, MRSA – Methicilin-resistent Staphylococcus aureus)

efect hemostatic

efect antiinflamator (Choe, Zi, Lee, 2015.)

imunomodulator

efect antiviral

dezintoxicare

diminuă efectele negative din chemoterapie și radioterapie

laxativ, îmbunătățește digestia, diuretic

antidiabetic

Fomes fomentarius a prezentat rezultate excelente în tratarea următoarelor afecțiuni: artrită, artroză, cancer, cadidoză, cistită, constipație, disbioza florei intestinale, epuizare psihologică, boli de ficat, gripă, hemoroizi, hepatită, herpes, imunitate scăzută, infecții, inflamații, boli de intestin, ca și prevenție în metastază, poliartrită, reumatism, boli de stomac, tumori și Zona-Zoster. Iasca este mai puțin indicată în procesul de vitalitate, creștere și migrenă/dureri de cap, iar în boli de plămâni se utilizează doar în anumite cazuri. De asemenea, poate ajuta în complicațiile diabetice, prin scăderea glicemiei, colesterolului și trigliceridelor din sânge.

Acțiune imunomodulatoare

din β 1,3 / 1,6 D-Glucan, în combinație cu melanină și chitină

O mulțime de componente cu efect asupra sistemului imun se poate găsi în Fomes fomentarius: proteine, polizaharide (β-glucani: Mantovani, Bellini, Angeli, 2007.), complexe polizaharid-proteină, glicozide triterpene, lipide etc. Dintre acestea, polizaharidele sunt în general considerate exemplul clasic de substanță cu acțiune imunomodulatoare. Acest efect poate amplifica sau reduce activitatea sistemului imun în funcție de o serie de factori, cum ar fi doza, calea de administrare, frecvența administrării, mecanismul (Tzianabos, 2000.)

Văcălia indică rezultate bune și în boala Lyme.

Acțiune antimicrobiană

Polizaharidele cu această acțiune au fost descoperite în numeroase bacterii: Staphylococcus aureus și epidermidis, Micrococcus luteus, Bacillus subtilis, Enterococcus feacalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella abony, Helicobacter pylori. (JiangLi, 2011.; Kolundžić et al., 2015.)

Acțiune antioxidantă

Alături de efectele benefice pe care le are iasca asupra sistemului imunitar și asupra bacteriilor și virușilor, are și proprietăți puternic antioxidante, ajutând astfel la neutralizarea radicalilor liberi din organism și distrugând celulele responsabile de deteriorarea ADN-ului. În afară de a fi bogate în proteine, fibre, vitamina C, vitamine din complexul B, calciu și minerale, ciupercile sunt surse excelente de antioxidanți. Ele conțin polifenoli și seleniu, care sunt comune în lumea plantelor, precum și antioxidanți care sunt unici pentru ciuperci. Un astfel de antioxidant este ergotioneina, un metabolit unic cu rol protectant asupra celulelor umane. Se consideră un "maestru antioxidant."

Acțiune antioxidantă asupra pielii

Pielea oferă informații în legătură cu multe din procesele care au loc în interiorul organismului. Chiar și în cazurile unor afecțiuni cronice, cum ar fi insuficiența renală, psoriazis sau anemiile, manifestările tegumentare sunt foarte sugestive. Organismul transmite nevoile prin piele: îmbătrânirea, agresiunile toxice, deshidratarea, toate sunt semnele a necesităților organismului, iar aceasta este calea prin care ele sunt comunicate.

Mod de administrare

Cea mai eficientă modalitate de a administra una sau mai multe ciuperci medicinale este a le procura sub formă uscată și măcinată fin. În acest caz, pulberea fină obținută se poate administra și de 4 ori pe zi, sublingual, umezită cu puțină apă. Pulberea se ține sub limbă timp de 15 minute, apoi se înghite cu apă.

Efecte adverse

Nici unul dintre componentele active de tipul polizaharidelor care sunt prezente în ciupercile medicinale nu are efecte adverse notabile. Pot fi administrate în siguranță, chiar și în timpul sarcinii și alăptării. Singurul risc care se poate prezenta mai rar este la persoane foarte sensibile sau cei care au reacții alergice la ciuperci.

Merită menționat și faptul că în micoterapie pot apare anumite reacții secundare, de exemplu în cazul unei detoxifierii a rinichilor (erupții cutanate sau prurit), iar acestea fiind reacții de vindecare deoarece are loc curățirea corpului. În aceste cazuri, se reduce doza.

Importanța în medicina veterinară

Deoarece între fiziologia omulului și animalului deosebirile sunt nesemnificative, ciupercile medicinale pot servi ca medicament sau supliment alimentar, nu numai organismului uman, deci și organismului animal.

Fomes fomentarius este foarte indicat în următoarele afecțiuni al animalelor: artroză, degenerarea cartilajelor, cancer, cistită, constipație, extenuare, boli de ficat, imunitate, creștere, infecții virale, inflamații, boli inflamatorii al intestinului și răni cicatrizante; este indicat în congestie, afecțiuni al plămânilor, boli de piele și ochii.

II CONTRIBUȚII PERSONALE

Motivația cercetării

Scopul acestei lucrări este să testeze una dintre cele mai benefice ciupercii, Fomes fomentarius, cu o însemnătate relevantă în domeniul medicinal și farmaceutic. Această valoare se observă în prezența unei game largi de activități biologice utile cu efecte adverse mai puțin toxice. Proprietățile medicinale se pot găsi în componentele celulare diferite și în metaboliți secundari (polizaharide, lipide, steriozi, proteine și complexele acestora, glicozide triterpenice, esteri și lactone, aldehide și ketone, cumarine, acizi organici etc.), care s-au izolat și identificat prin cromatografia pe strat subțire. Unii dintre acești compuși au acțiune antioxidantă, antitumorală, antidiabetică, imunomodulatoare, antimicrobienă, antivirală, dislipidemică și altele care sunt în diferite stadii de dezvoltare.

Desfășurarea studiului: Investigațiile analitice s-au desfășurat în cadrul UMFT „Victor Babeș” Timișoara, iar procedeele de măcinare și pulverizare în cadrul Institutului de cercetare din Timișoara, în perioada martie-iulie, 2016.

Ciuperca analizată este colectată în Pădurea Verde, Timișoara, în ianuarie 2016.

Studiul: Investigații analitice a componentelor active din Fomes fomentarius

Măcinarea și pulverizarea

Având în vedere consistența corpului lemnos și tare al ciupercii, primul pas este spargerea ciupercilor. Mai întâi, iasca recoltată a stat timp de 20-30 de minute într-un vas de stiropor, care a fost semi-umplută cu azot lichid cu multă grijă, folosind manuși de protecție. La presiune atmosferică, azotul lichid fierbe la -196°C și este un fluid criogen care poate cauza înghețul rapid în contact cu ciuperca. Efectul răcitor pe care îl creează se explică prin faptul că fierbe imediat ce intră în contact cu un obiect mai cald, izolându-l într-un înveliș de azot. Acest efect este cunoscut sub numele de efect Leidenfrost și se aplică în cazul oricărui lichid care intră în contact cu un obiect cu o temperatură semnificativ mai mare decât cea a punctului său de fierbere.

Figura 5: Iasca colectată înainte de spargere și măcinare

După aceea, ciupercile s-au învelit într-un material subțire și s-au spart cu ciocane pentru a ușura măcinarea. Odată sparte și mărunțite în bucăți mai mici, s-a luat o parte din cantitate și s-au măcinat în mojare de dimensiuni mai mari cu ajutorul pistilului. Scopul era înmărunțirea cu cât mai mare.

Figura 6: Ciupercile colectate Figura 7: Ciuperca umectată în azot lichid

Figura 8: Procesul de mojarare

Pulverizarea s-a finalizat prin trecerea ciupercii măcinate și uscate prin sita electronică, procesul care era efectuat de mai multe ori în combinație cu mojarare repetată, până la obținerea pulberii fine. Pulberea obținută prin măcinare conține toate substanțele caracteristice ciupercii. Prin măcinare ultrafină crește biocompatibilitatea substanțelor active, mai ales a polizaharidelor care se găsesc în pereții celulari.

Figura 9: Trecerea prin sită

Extracția

Plecând de la o pulbere, într-un pas ulterior, cu ajutorul unei substanțe dizolvante cum ar fi alcoolul sau apa, se obțin extractele. Prin această metodă, se separă și purifică toți compușii activi și organici. În acest caz, extracțiile realizate sunt extracții solid-lichid (se mai numește și elutriere), datorită stării de agregare a ciupercii din care se face extracția.

Un solvent bun trebuie să fie selectiv, să solubilizeze cu ușurință substanța de extras și să asigure o îndepărtare facilă după extracție; nu trebuie să reacționeze cu substanța de separat și e preferabil să fie ieftin și disponibil comercial.

Materiale:

Ciuperca Fomes fomentarius (FF): 20 g

Ciclohexan (C6H12): 250 ml – EXTRACȚIA I

Diclorometan (CH2Cl2): 250 ml – EXTRACȚIA II

Metanol (CH3OH): 250 ml – EXTRACȚIA III

Extract apos (H2O d.): 250 ml – EXTRACȚIA IV

Cilindri gradați

Porțelan

Pipete

Hârtia de filtru

Pahar Erlenmeyer

pâlnie

Aparatura:

Extractorul Soxhlet

Rotavapor

Pompa de vid

Solvenții și ordinea extracțiilor sunt aleși în funcție de scădere a polarității (de la nepolar la polar). Substanța de Fomes fomentarius este o substanță nepolară.

Cu cât sunt solvenții mai polari, cu atât mai greu evaporă.

Trebuie respectate temperaturile de fierbere pentru fiecare solvent și aplicată această informație la extractorul Soxhlet și la Rotavapor.

Ciclohexan – 80,74°C

Diclorometan – 39,6°C

Metanol – 64,7°C

Extract apos – 100°C

Procedeul Soxhlet:

Această extracție este la cald, deoarece solventul proaspăt este furnizat prin fierberea extractului.

Înainte de a folosi aparatura, ea trebuie bine spălată, uscată și instalată.

Extractorul Soxhlet se compune dintr-un balon, un corp de extracție și un refrigerent ascendent, legate între ele. Substanța solidă – ciuperca, mărunțită în preleabil pentru ca solventul (ciclohexanul, diclorometanul, metanolul, respectiv extractul apos) să vină în contact cu o suprafață cât mai mare, se asează în spațiul de extracție, introdus într-un cartuș obținut din hârtie de filtru. 250 ml din fiecare solvent din balonul de fierbere distilă printr-un tub lateral, prevăzut cu o izolație termică și cu o bucată de porțelan pentru a păstra temperatura, iar vaporii condensați în refrigerentul de reflux picură peste cartuș în care este substanța Fomes fomentarius. Când spațiul de extracție se umple până la înălțimea stratului de preaplin, soluția cu extract (ciclohexan, diclorometan, metanol, respectiv extract apos) trece prin sifonare în balonul de fierbere și procesul se repetă. Având în vedere că substanța de Fomes fomentarius trece mai greu în soluție, pentru extracția completă fiecare dintre ele a stat pe baia de apă timp de 24 ore, cu agitare ocazională.

Factorii care influențează extracția sunt solubilitatea solidului în solvent, care poate fi manipulată din exterior prin alegerea unor solvenți adecvați, și viteza de transfer a solidului în faza lichidă, care este mai complexă și depinde de diverse noțiuni fizice (mărimea granulelor, sistemul cristalin, difuzia substanței solide în lichid, viteza de pătrundere a solventului în solid etc.). De asemenea, extracția se poate influența cu succes și prin mărirea suprafeței solide, prin extracție continuă cu solvent proaspăt, prin agitare, prin creșterea temperaturii. Prin ridicarea căldurii a sistemului, apar două fenomene: fenomen termodinamic (ca și consecința se mărește solubilitatea compusului) și fenomen cinetic (ca și consecința crește viteza sa de transfer în faza lichidă).

.

Figura 10: Extractorul Soxhlet

Unele amestecuri au fost filtrate, pentru a crește viteza separării substanței din Fomes fomentarius.

Figura 11: Filtrare

Rotavapor

Înainte de a pune extracțiile la Rotavapor, se lasă la o parte o cantitate din soluții în capsule pentru cromatografie, restul se evaporă și se usucă bine la vid.

În primul rând se verifică toate setările aparaturii, dacă e bine conectată cu robinet, presiunea, apoi se reglează temperatura și numărul de rotații. Se pornește de la un balon cotat mai mare în care e soluția de iască, apoi se transferă soluția în balon cotat din ce în ce mai mic, până la evaporarea ciclohexanului, diclorometanului, metanolului, respectiv extractului apos. Solvenții evaporați și colectați într-un balon separat se pot refolosi.

Odată evaporate, balonele cotate cu substanța Fomes fomentarius se usucă la vid câteva ore și se cântăreșc pe balanță, apoi se notează cantitatea de substanțe obținute din Fomes fomentarius.

Figura 12: Evaporare la rotavapor

S-au separat următoarele cantități de substanță după extracție și evaporare:

Extracția cu ciclohexan: 0,24 g

Extracția cu diclorometan: 0,8 g

Extracția cu metanol: 0,09 g

Extracția cu apă: 0,35 g

Concluzia este că Fomes fomentarius se extrage greu (din 20 g ciupercă).

Cromatografia în strat subțire

Cromatografia planară sau cromatografia în strat subțire este o cromatografie de partiție, în care compușii dintr-un amestec sunt separați pe baza solubilității lor într-un amestec de solvenți respectiv pe baza interacțiunilor acestora (forțe de tip London sau van der Waals, interacțiuni dipol-dipol, legături de hidrogen intermoleculare) cu faza staționară (suprafața cromatografic planară).

Faza staționară este constituită din silica gel și reprezintă suportul cromatografic. Această fază absoarbe apa.

Profilul separării în cromatografia planară poate fi modificat prin schimbarea compoziției fazei mobile (amestecului de solvenți). Alegerea eluantului este determinată de procesul de sorbție și de natura componenților din probă. Polaritatea solvenților poate fi obținută de seriile electropice în care acești solvenți sunt aranjați în ordinea creșterii polarității. În general, este de preferat o fază mobilă în care amestecul are polaritatea mai mică și conduce la o rezoluție bună a separării.

Avantaje CSS:

Rapiditate

Este o operație simplă

Rezoluție bună

Aplicabilitate la compuși care prezintă instabilitate termică, atât hidrosolubili cât și liposolubili

Cost redus

Posibilitatea analizării a mai multor probe în condiții identice

Posibilitatea separării “bidimensionale” a componentelor din probă

Reproductibilitatea rezultatelor

Literatura de specialitate conține multe informații privind condițiile de lucru

Dezavantaje CSS:

Necesitatea unei purificări mai avansate

Sensibilitate mai mică decât în cromatografia de lichid sau gaz

Afectat negativ în cazul unor temperaturi sau umidități ambientale ridicate

Materiale:

Proba 1 – FF:ciclohexan (3 picături)

Proba 2 – FF:diclorometan (3 picături)

Proba 3 – FF:metanol (3 picături)

metanol (pentru dizolvare)

capilare

capsule

baloane cotate

plăci pentru cromatografie în strat subțire

hârtie de filtru

sistem de eluție: Eter de petrol : Eter etilic = 8,7 : 1,3

Figura 13: Probe cu extracții pregătite pentru CSS

Aparatura:

Camere pentru developare (camere cromatografice)

Camera de vizalizare în lumina UV la 254 nm

uscător sau etuvă

balanța electronică

Spotare (aplicarea probei)

Mod de lucru: Mai întâi, se pregătește placa cromatografică și se așează pe o suprafață plană. Se folosește placa de silica gel de dimensiune 6,5 x 4 cm. Trebuie marcată linia de start la 0,5 cm de la margină. Se iau câteva picături cu un capilar din capsula cu amestec Fomes fomentarius și solvent (ciclohexan, diclorometan, respectiv metanol) și se aplică pe placa cromatografică sub formă de spoturi rotunde. Se lasă spațiu între spoturi, în felul în care nu o să se atingă. După fiecare aplicare, se asteaptă puțin să se usuce spotul. În timpul aplicării probelor, este foarte important să se păstreze calmul și să se aplice spoturile de aceeași mărime.

În poziția 1 se aplică 3 picături din proba 1 (extracția FF:ciclohexan), în poziția 2 se aplică 3 picături din proba 2 (extracția FF:diclorometan) și în poziția 3 se aplică 3 picături din proba 3 (extracția FF:metanol). S-au pus trei probe diferite pe o placă pentru a le compara între ele.

În cazul în care un amestec este prea concentrat, se observă că se înfundă capilarul și se aplică mai greu pe placă, se adaugă câteva picături de o soluție alcoolică (substanța Fomes fomentarius find nepolară, este solubilă în alcool și soluții alcoolice), acestea fiind metanol, ciclohexan, diclorometan, cloroform, acetonă etc.

Developare

Mod de lucru: Se imersează placa într-un vas cu închidere etanșă în care atmosfera este saturată de vapori ai solventului sau ai amestecului de solvenți utilizați pentru separare.

Partea interioară a camerei s-a căptușit cu hârtie de filtru și s-a acoperit cu un capac de sticlă pentru a asigura o atmosferă saturată în solvent. Tancul rămâne închis până la saturarea atmosferei cu vapori timp de circa 5-7 minute, timp ce are loc un proces de migrare al componentelor fazei mobile printe particolele fazei staționare. Componentele amestecului migrează diferit, în funcție de modul de distribuție între cele două faze. Atunci când frontul developantului ajunge la 0,5 cm distanță de marginea plăcii, este momentul în care se scoate placa din tanc repede și precis, și se marchează cu creonul linia de urcare. Dupa aceea, se lasă la uscat la etuvă sau se usucă cu ajutorul foenului timp de câteva minute.

În timpul developării plăcilor, atenție la curent, vapori, lumină. Acești factori externi influențează developarea în mod negativ.

Figura 14: Developare (http://goo.gl/FK4Kox)

Evidențierea

Unii compuși pot fi vizalizați cu ochiul gol imediat după uscare, alții se examinează la lampa UV. De asemenea, pot fi evidențiați prin stropire cu reactivii de culoare (de exemplu acid sulfuric sau molibdat) sau prin răzuirea spotului, urmată de extracția componentei și identificarea prin metode fizico-chimice, prin mărimile Rf, Rm, prin modificarea fluorescenței stratului subțire, etc.

Metoda de stropire cu reactivi se efectuează în nișă, folosind o mănușă și cu evitarea inhalării acestor reactivi. Prezența unelor substanțe este confirmată prin stropirea cu acid sulfuric atunci când substanțele se colorează în maro sau prin stropirea cu molibdat, atunci când se colorează substanțele în albastru. După stropire, se lasă placă în etuvă pentru uscare.

În acest caz, nu s-a folosit niciun reactiv.

S-a examinat placa la lumina UV la lungimea de undă de 254 nm și s-au marchat zonele cu fluorescență.

Plăcile reușite se pot analiza în continuare prin metoda densitometrică.

Densitometrie

Această metodă calitativă se efectuează prin valoarea Rf (retardation factor) care măsoară viteza de deplasare pe placă a componentelor față de frontul developantului.

Rf-ul se definește ca raportul între distanța de la start până în punctul de concentrație maximă a unei zone de substanță, și distanța parcursă de frontul developantului, în același timp. Măsurarea se face în cm sau mm, iar valorile obținute sunt cuprinse între limitele 0≤Rf≤1.

Rf este o mărime pozitivă, subunitară, adimensională. Valoarea Rf depinde de polaritatea componentelor.

Tabel 2: Dependența valorii Rf unei componente de polaritatea ei

FS – faza staționară

FM – faza mobilă

În cazul cromatografiei realizate în această lucrare, sunt prezentate o cromatografie cu fază directă și o componentă nepolară (Fomes fomentarius).

În cazul petelor simetrice, se măsoară distanța până la centrul petei, iar atunci când petele sunt asimetrice, se măsoară distanța până la punctul de concentrație maximă.

Valorile Rf în cromatografia în strat subțire depind de:

Calitatea adsorbantului sau suportului folosit

Mărimea particulelor adsorbantului

Gradul de activare al stratului. Umiditatea

Grosimea stratului

Calitatea dizolvanților

Saturarea atmosferei din vasul cromatografic

Tehnica de developare folosită

Cantitatea de substanță

Temperatura

Prezența impurităților

Orice componentă are Rf-ul său specific pentru fiecare solvent în parte și Rf specific în funcție de concentrația solventului. Valorile Rf-ului sunt foarte utile pentru identificare pentru că se pot compara valorile Rf componetelor cunoscute cu valorile Rf componentelor necunoscute. Două componente pot avea același Rf pentru un solvent sau un amestec de solvenți, dar nu pot avea Rf identic pentru mai mulți solvenți.

Figura 15: Densitometru utilizat în laborator

Densitometru utilizat pentru detectarea substanțelor de pe placă este CAMAG TLC SCANNER 3, iar programul folosit pe calculator este winCATS.

CSS densitograma: TRACK 1

Figura 16: CSS densitograma la 254 nm;

TRACK 1= Amestec ciclohexan:Fomes fomentarius pe faza staționară – silica gel;

Sistem de eluție: Eter de petrol:eter etilic (8,7:1,3)

Tabel 3: Tabelul cu picuri

TRACK 1= Amestec ciclohexan:Fomes fomentarius pe faza staționară – silica gel

Densitograma cu soluția de ciclohexan și Fomes fomentarius este prezentată cu 9 picuri. În acest tabel se poate evidenția unde începe spotul, unde se termină și în ce punct este cel mai concentrat.

CSS densitograma: TRACK 2

Figura 17: CSS densitograma la 254 nm;

TRACK 2= Amestec diclorometan:Fomes fomentarius pe faza staționară – silica gel;

Sistem de eluție: Eter de petrol:eter etilic (8,7:1,3)

Tabel 4: Tabelul cu picuri

TRACK 2= Amestec diclorometan:Fomes fomentarius pe faza staționară – silica gel

Densitograma cu soluția de diclorometan și Fomes fomentarius este prezentată cu 6 picuri. În acest tabel se poate evidenția unde începe spotul, unde se termină și în ce punct este cel mai concentrat.

CSS densitograma: TRACK 3

Figura 18: CSS densitograma la 254 nm;

TRACK 3= Amestec metanol:Fomes fomentarius pe faza staționară – silica gel;

Sistem de eluție: Eter de petrol:eter etilic (8,7:1,3)

Tabel 5: Tabelul cu picuri

TRACK 3= Amestec metanol:Fomes fomentarius pe faza staționară – silica gel

Densitograma cu soluția de metanol și Fomes fomentarius este prezentată cu 9 picuri. În acest tabel se poate evidenția unde începe spotul, unde se termină și în ce punct este cel mai concentrat.

CSS densitograma: All tracks

Figura 19: CSS densitograma la 254 nm;

Toate track-urile= Amestec ciclohexan/diclorometan/metanol:Fomes fomentarius

pe faza staționară – silica gel;

Sistem de eluție: Eter de petrol:eter etilic (8,7:1,3)

CSS densitograma 3D: All tracks

Figura 20: CSS densitograma 3D la 254 nm;

Toate track-urile= Amestec ciclohexan/diclorometan/metanol:Fomes fomentarius

pe faza staționară – silica gel;

Sistem de eluție: Eter de petrol:eter etilic (8,7:1,3)

CONCLUZII

Iasca este o ciupercă necomestibilă din genul Fomes, familia Polyporaceae, care crește pe trunchiurile arborilor.

În perioada neolitica, s-a utilizat la aprinderea focului și implicit a luminii, iar în Europa se folosește și în scop decorativ.

Din punct de vedere al medicinei, până în secolul XIX s-a folosit pentru oprirea hemoragiei, având efect hemostatic.

Multiple cercetări au descoperit componente antioxidante în ciuperca Fomes fomentarius, acestea având efecte benefice antitumorale asupra pielii, intestinului, uterului, stomacului, laringelor și esofagului.

Altele efecte importante sunt efectul antimicrobian, efectul antiviral și imunomodulator.

De asemenea, a prezentat rezultate bune și asupra diabetului și asupra unelor afecțiuni la nivelul articulațiilor.

Această lucrare este doar una dintre investigații asupra ciupercilor medicinale care se desfășoară în ziua de azi. O lucrare de genul necesită multă muncă și timp îndelungat pentru a ajunge la rezultate inovative.

Cercetarea obținută a avut loc timp de câteva luni în care s-au încadrat fie procesele fizice (culegerea ciupercilor, spargerea lor, măcinarea și pulverizarea repetată până la obținerea pulberii fine), fie munca din laborator (extracții alcoolice și apoase care pot dura câteva zile, evaporarea la Rotavapor și uscarea la vid, după care a urmat metoda de cromatografie în strat subțire – CSS, mai întâi experimentând cu amestecul sistemelor de eluție și raportul lor, concentrația și dizolvarea soluțiilor de iască; compararea sistemelor de developare, extracțiilor pe plăci, utilizarea diferitelor metode de evidențiere; după care am ales o placă reușită care conține soluția de iască cu 3 extracții diferite de ciclohexan, diclorometan și metanol, iar sistemul de eluție ales este eter de petrol: eter etilic cu raportul de 8,7:1,3; după care s-a pus placa la analiză densitometrică, vizalizând rezultatele cu ajutorul programului winCATS, de pe care am citit pozițiile spoturilor, în ce puncte sunt cel mai concentrate respectiv Rf-urile lor).

Această investigație obținută cu multă plăcere poate fi continuată și analizată mai departe.

BIBLIOGRAFIE

Kolundzic Marina, Grozdanic Dj. Nadja, Dodevska Margarita – “Antibacterial and cytotoxic activities of wild mushroom Fomes fomentarius (L.) Fr., Polyporaceae”, 2015.

Kim S.H., Jakhar R., Kang S.C. – „Apoptotic properties of polysaccharide isolated from fruiting bodies of medicinal mushroom Fomes fomentarius in human lung carcinoma cell line”

Wei Chen, Zhao Zhao, Shi-Fei Chen, Yong-Quan Li – “Optimization for the production of exopolysaccharide from Fomes fomentarius in submerged culture and its antitumor effect in vitro”, 2007.

Lee J.S. – “Effects of Fomes fomentarius supplementation on antioxidant enzyme activities, blood glucose, and lipid profile in streptozotocin-induced diabetic rats”, 2005.

Hitoshi Ito, Mamoru Sugiura, Toshio Miyazaki – “Antitumor Polysaccharide Fraction from the Culture Filtrate of Fomes fomentarius”, 1976.

Young-Mi Park, In-Tae Kim, Hee-Juhn Park – “Antiinflamatory and antinociceptive effects of the menthanol extract of Fomes fomentarius”, 2004.

Gao HL, Lei LS, Yu CL – “Immunomodulatory effects of Fomes fomentarius polysaccharides: an experimental study in mice”, 2009.

Vetrovsky Tomas, Baldrian Petr, Gabriel Jiri – “Extracellular enzymes of the white-rot fungus Fomes fomentarius and purification of 1.4-beta-glucosidase”, 2012.

Seo SW, Yi YJ, Lee MS – “Differential Modulation of Lipopolysaccharide-Induced inflammatory cytokine production by and antioxidant activity of fomentariol in RAW264.7 cells”, 2015.

Tzianabos AO – “Polysaccharide immunomodulators as therapeutic agents: structural aspects and biologic function”, 2000.

JiangLi – “Study on chemical constituent and pharmacological activity of Fomes fomentarius”, 2011.

Aoki M., Tan M., Fukushima A. – “Antiviral substances wih systemic effects produced by Basidiomycetes such as Fomes fomentarius”, 1993.

HeXiaoYi – “The study of extraction process and antitumor active component of compoud Fomes fomentarius”, 2013.

Choe J.H., Yi Y.J., Lee M.S. – “Methyl 9-Oxo-(10E,12E)-octadecadienoate isolated from Fomes fomentarius attenuates lipopolysaccharide-induced inflammatory response by blocking phosphorylation of STAT3 in murine macrophages”, 2015.

McCormick M.A., Post J.B., Cubeta M.A. – “Phylogenetic and phenotypic characterization of Fomes fasciatus and Fomes fomentarius in the United States”, 2013.

Mantovani M.S., Bellini M.F., Angeli J.P.F. – “Beta-glucans in promoting health: Prevention against mutation and cancer”, 2008.

Kral J., Voltr J., Proska J. – “PIXE determination of element distribution in Fomes fomentarius”, 2004.

Karaman M., Stahl M., Vulic J. – “Wild-growing lignicolous mushroom species as sources of novel agents with antioxidative and antibacterial potentials”, 2014.

Vetrovsky T., Voriskova J., Snajdr J. – “Ecology of coarse wood decomposition of saprotrophic fungus Fomes fomentarius”, 2011.

Hoffmeister Dirk – “The Mycota: A comprehensive treatise of fungi as experimental systems for basic and applied research”, 2016.

Weete D. John – “Lipid biochemistry of fungi and other organisms”, 2012.

Nowacka N., Nowak R., Drozd M. – „Antibacterial, antiradical potential and phenolic compounds of thirty-one polish mushrooms”, 2015.

Csaba Locsmandi, Vasas Gizella – „Ghidul culegătorului de ciuperci”, 2013.

Tamaș-Pelloni Viorica, Iohan Francisca – „Cromatografia în strat subțire”. 1971.

Georgescu C. Constantin – „Bolile și dăunătorii pădurilor”, 1957.

Pârvu Constantin – „Universul plantelor: Unica enciclopedie”, 1991.

Morariu Iuliu – „Botanică generală și sistematică cu noțiuni de geobotanică”, 1965.

Szabadai, Z. – “Bazele fizico-chimice ale metodelor de control analitic al medicamentelor, vol. I.”, 2004.

Udrescu L., Szabadai Z. – “Analiza medicamentului. Îndrumător de lucrări practice”, 2009.

Szabadai, Z. – “Analiza medicamentului”, 2011.

Dhaneshwar R. Sunil – “Pharmaceutical applications of high performance thin layer cromatography”, 2015.

Fried B, Sherma J – “Thin layer chromatography – tehniques and applications”, 1999.

Fried B, Sherma J – “Practical thin layer chromatography: a multidisciplinary approach”, 1996.

Poole CF – “The essence of chromatography”, 2003.

Tudor Daniela – “Fungal pigment formation in wood substrate”, 2013.

Harding Patrick – “Mushroom Miscellany”, 2008.

Schmidt Olaf – “Wood and tree fungi: Biology, Damage, Protection and Use”, 2006.

Schwarze Francis W.M.R., Engels Julia, Mattheck Claus – “Fungal Strategies of Wood Decay in Trees”, 2000.

Stamets Paul – “Mycellium Running”, 2005.

Rogers R., – “Fungal pharmacy”, 2011.

Șesan Tatiana Eugenia, Tănase Cătălin – „Fungi cu importanță în agricultură, medicină și patrimoniu”, 2009.

Stamets P. – “MycoMedicinals An informal treatise on mushrooms”, 2002.

Guthmann Jurgen – “Catalogul ciupercilor medicinale”, 2015.

Cazes Jack – “Encyclopedia of Chromatography, volume 2”, 2005.

Komsta L., Waksmundzka-Hajnos M., Sherma J., – “Thin layer chromatography in drug analysis”

Roman L., Sandulescu R., Muntean D., – “Validarea metodelor analitice”, 2007.

Fried B., Sherma J., – “Thin-Layer Chromatography, Revised and expanded”, 1999.

Bojita M., Roman L., Sandulescu R. – “Analiza și controlul medicamentelor”, 2002.

Elisashvili V., – “Submerged cultivation of medicinal mushrooms: Bioprocesses and products”, 2012.

Olsen L., Choffnes R.E., Relman A.D. – “Fungal diseases: An emerging threat to human, animal, and plant health”, 2011.

Singh J., Aneja K.R. – “From ethnomycology to fungal biotechnology: Exploiting fungi from natural resources for novel products”, 2012.

Stamets Paul – “Novel antimicrobials from mushrooms”, 2001.

Georgescu C. – “Bolile și dăunătorii pădurilor: Biologie și combatere”, 1957.

Marley G. – „Mushrooms for health: Medicinal Secrets of Northeastern Fungi”, 2009.

Ostry M.E., O’Brien J.G., Anderson N.A. – „Field guide to common macrofungi in eastern forests and their ecosystem functions”, 2011.

Gupta V.K. – „Biotechnology of bioactive compounds: Sources and applications”, 2015.

Meuninck J. – „Basic illustrated edible and medicinal mushrooms”, 2015.

Kuo M., Methven A. – „100 Cool Mushrooms”, 2010.

Ryvarden Leif – „Type studies in Polyporaceae 27. Species described by P.Ch.Hennings”, 2012.

Stamets Paul- „Growing gourmet and medicinal mushrooms” – 1993.

Gutierrez N.A., Calvo J.A.C., Fajardo J., Verde A. – „Etnobiology sheet: Tinder fungus”, 2016.

Rolfe R.T., Rolfe F.W. – „The romance of the fungus world”, 2014.