Investigarea Parametrilor de Detectare a Gamapatiilor Monoclonale

Cuprins

I. Structura si functia imunoglobulinelor

Imunoglobulina A

Imunoglobulina E

Imunoglobulina G

Imunoglobulina M

Imunoglobulina D

II. Rearanjamentele genetice ale imunoglobulinelor normale

III. Gamapatiile monoclonale

Mielomul multiplu,

Macroglobulinemia Waldenstrom,

Boala „lanțurilor grele”

 Gamapatii monoclonale cu semnificație nedeterminată

Amiloidoza sistemica primara

III. Metode imunochimice de detectare a gamapatiilor monoclonale

Electroforeza proteinelor serice

Imunofizarea proteinelor serice

Metoda nefelometrica – determinarea cantitativa a lanturilor usoare κ si λ

Introducere

Sistemul imunitar este un ansamblu de organe, țesuturi, celule și molecule complexe care au ca funcție apărarea organismului împotriva agenților străini, memorândui în vederea unei noi infecții, precum și recunoașterea și protejarea propriilor structuri. Anticorpii reprezinta proteinele produse de sistemulimunitar, in momentul in care organismul se confrunta cu prezenta unui antigen. Integritatea si sanatatea sistemului imunitar sunt vitale pentru organism, deoarece numai un sistem sanatos poate reprezenta o bariera eficace impotriva antigenelor endogene si exogene.

Anticorpii sunt reprezentati de imunoglobuline , acestea fiind proteine ce se gasesc in plasma, lichide extracelulare si secretiile organismului. Acestea se combina specific cu antigenele, declansand raspunsul imun. Ca structura sunt glicoproteine transmembranare, cu proprietatea de anticorpi, fiind capabile de a se lega specific de un epitop sau de un determinant antigenic. Sunt produse de plasmocite, celule derivate din limfocitele B. Dintr-un limfocit B va rezulta o imunoglobulina, care va recunoaste un singur determinant antigenic. Numarul de imunoglobuline pe care un adult le are, in mod normal, poate ajune fi de 10 la puterea 20 imnuoglobuline, ce sunt impartite in peste 109 specii moleculare diferite. Astfel imunoglobulinele au o heterogenitate extrem de mare si formeaza o familie biologica cu diverse proprietati.

Imunoglobulinele au un rol important atat in finalizarea raspunsului imun umoral, cat si in initierea raspunsului imun celular, avand in acest caz calitatea de opsonine, deoarece se combina specific cu antigenul facandu-l susceptibil la fagocitoza, prin favorizarea captarii antigenelor corpusculare de catre celulele fagocitare. Opsonizarea declanseaza raspunsul imun celular.

Structura imunoglobulinelor

Imunoglobulinele sunt glicoproteine cu functie de anticorpi. Efectori ai imunitatii mediate umoral, imunoglobulinele neutralizeaza antigenul actionand fie singure asupra acestora, fie in asociere cu alte molecule sau celule, cum este cazul citotoxicitatii mediate de catre complement sau a celei mediate celular-anticorp-dependente ( ADCC ). In camp electric migreaza spre zona catod, in regiunea gama ( γ ), de unde si denumirea lor initiala de gamaglobuline.

O molecula de imunoglobulina este alcatuita din doua lanturi lungi de glicoproteina, denumite si lanturi H ( heavy=greu ), si doua lanturi scurte sau L ( light=usor ), legate intre ele prin legaturi disulfidice -S-S-. Legaturile disulfidice leaga atat lanturi diferite cat si segmente diferite ale aceluiasi lant, pe care le apropie intre ele.

Pozitia reziduurilor de aminoaciziin lant este foarte variabila la extremitatealor NH2 terminala, anume, incepand cu reziduul numarul 1dar tot mai constanta catre cealalta etremitate, adica spre extremitatea COOH terminala. Ca rezultat a acestui fapt, un lant are domenii variabile V si constante C, denumite in cazul lantului usor VL si CL, iar al celui greu VH si CH . Domeniile variabile VL si VH formeaza portiunea de molecula prin care aceasta recunoaste antigenul, cunoscuta sub denumirea e situs combinative ( SC ). Acesta are o structura complementara epitopului, fapt care confera anticorpuilui stricta lui specificitate de recunoastere. Pozitia aminoacizilor in lant este cu atat mai variabila cu cat locul lor este mai aproape de inceputul lantului, deci de primul reziduu de aminoacid si cu atat mai constanta cu cat sunt mai aproape de sfarsitul lui, adica de ultimul reziduu de aminoacid. In primul caz , domeniul variabil Vare regiuni de determinare a complementaritatii ( CDR ), iar in cel de-al doilea caz , domenii constante. Un lant L sau H are trei CDR si un domeniu constant in cazul lanturilor usoare sau trei patru in cel al lanturilor grele.

In organism imunoglobulinele se pot gasi sub forma de molecule libere, molecule care fac parte integrate din membrane limfocitelor B si au rol de receptori pentru antigen, molecule care au fixat specific antigenul solubil si se gasesc in circulatie sub forma de complexe antigen-anticorp, molecule fixate specific la determinatii antigenici de pe suprafata celulelor, molecule fixate citofil la receptorii Fc.

Imunoglobulinele sunt sensibile la actiunea unor enzime care pot rupe molecula in diferite fragmente dintre care doua contin lanturile L intregi si o parte din lanturile H, la nivelul carora se gaseste situsul combinative, de unde si denumirea lor de Fab (fragment antigen binding). Un alt fragment este alcatuit din domeniile constante ale lanturilor H care cristalizeaza in vitro,motiv pentru care este denumit “ fragment cristalizabil” sau Fc.

Lanturile grele H confera imunoglobulinelor proprietati antigenice pe baza carora au fost impartite in cinci clase distincte care poarta denumiri corespunzatoare denumirilor lanturilor grele ce intra in coponenta lor si anume clasa IgG cu lantul γ, IgA cu α, IgM cu μ, IgD cu δ si IgE cu ε.

Aceste clase pe langa deosebirile antigenice, au si attribute functionale diferite. Spre exemplu, clasa IgM este sintetzata dupa primul contact al organismului cu un antigen, de unde si denumirea de “ anticorpi de raspuns primar “. Clasa IgG apare dupa doua sau ma multe contacte ale organismului cu acelasi antigen, fiind deci “ anticorpi de raspuns secundar”, IgA apara in special suprafetele mucoaselor intestinale si pulmonare, IgE este responsabila de declansarea unor reactii alergice din care cauza anticorpii sunt denumiti reagine. Trei dintre aceste clase si anume IgG, IgD, IgE sunt monomeri , adica moleculele lor sunt formate din doua lanturi L si doua lanturi H, iar doua pot fi dimere sau trimere, cum este cazul celor din clasa IgM aflate in circulatie ( cele fixate pe suprafata limfocitelor B sunt monomeri si au rolul de receptori pentru antigene )

Functiile biologice ale imunoglobulinelor

Declansarea cascadei complementului pe cale clasica prin factorul Cq1 al complementului se realizeaza doar in momentul in care anticorpul a recunoscut un determinant antigenic conformational. Acest fapt implica modificariin conformatia lanturilor H care se transmit de la capatul carboxi-terminal care capatul amino-terminal, si presupune exteriorizarea unei secvente de aminoacid care este capabil sa lege fractiunea Cq1 a complementului.

Imunoglobulinele au rolul de a facilita fagocitoza prin atasarea anticorpilor care au opsonizat antigenul corpuscular de pe suprafata macrofagelor, care vor realiza apoi captarea si endocitarea antigenelor respective, urmata de fagocitarealor.

Imunoglobulinele intervin in imuniarea pasiva a nou-nascutului prin transferul placentar al anticorpilor din clasa IgG de la mama la fat, prin traversarea de catre acestia a barierei placentare. Imunoglobulinele care trec fac parte din subcategoría IgG1.

Imunoglobulinele G sunt anticorpii care intervin in raspunsurile imune umorale secundare, ce survin dupa al doilea sau al treilea contact cu acelasi antigen. Dupa primul contact cu un antigen se poate activa memoria imunologica a limfocitelor, cu productia de anticorpi contra antigenului respectiv, care vor reactiona prompt si rapid la contactul cu acelasi antigen, fiind caracteristic raspunsului imun umoral secundar.

Imunoglobulina M (IgM)

IgM reprezinta aproximativ 5-10% din totalul imunoglobulinelor din ser, cu o concentratie medie in ser de 1.5 mg/ml. IgM monomerica cu o greutate moleculara de 180,000 se exprima ca un anticorp legat la membrana celulelor B. IgM este secretata de celulele plasmei ca un pentamer in care 5 unitati monomerice sunt legate prin punti disulfidice. Cele 5 subunitati monomerice sunt dispuse cu regiunea Fc inspre centrul pentamerului iar cele 10 situri de legare a antigenului sunt situate inspre periferia moleculei. Fiecare pentamer contine o polipeptida aditionala legata Fc numita lant J (Joining Chain). Lantul J este necesar pentru polimerizarea monomerilor in vederea formarii IgM pentamerica. ( Fig. 1 )

Fig.1 (Thomas J. Kindt, Richard A. Goldsby, Barbara A. Osborne, Janis Kuby, 2007)

IgM este prima imunoglobulina produsa ca raspuns prima la antigen si este prima imunoglobulina sintetizata de nou-nascuti. Datorita structurii sale pentamerice IgM are o valenta mai mare decat celelalte izotipuri. O molecula de IgM poate lega 10 haptene, insa, datorita obstuctiei serice, doar 5 molecule de antigen mai mare pot fi legate simultan.

Datorita valentei mari, IgM este mult mai eficienta decat alte izotipuri in legarea antigenilor cu numar crescut de repetari epitopice precum particulele virale sau celulele rosii ale sangelui. Spre exemplu, atunci cand celulele rosii ale sangelui sunt incubate cu un anticorp specific, ele se strang in agregate mari in timpul procesului de aglutinare. Sunt necesare de 100 pana la 1000 de molecule IgG decat de IgM pentru a obtine acelasi nivel de aglutinare. Un fenomen similar are loc si in cazul neutralizarii infectiei virale.

IgM este de asemenea mai eficienta decat IgG in activarea complementului, intrucat activarea acestuia necesita doua regiuni Fc in imediata apropiere, iar molecula pentamerica de IgM indeplineste aceasta conditie. Datorita dimensiunii mari, IgM nu difuzeaza bine, fiind gasita in concentratii mici in fluidele tesutului intercelular. Prezenta lantului J permite IgM sa se lege de receptorii celulelor secretoare, care le transporta prin tesutul epitelial astfel incat sa ajunga in secretiile externe care imbraca suprafetele mucoase. Desi IgA este izotipul predominant din secretiile externe, IgM joaca un rol accesoriu important ca imunoglobulina secretoarie.

Imunoglobulina A (IgA)

Desi IgA constituie 10-15% din totalul imunoglobulinelor serice, ea este imunoglobulina predominanta din secretiile externe precum laptele, saliva, lacrimile si mucusul. In ser IgA exista in principal sunt forma monomerica, insa pot fi descoperite si forme monomerice (dimeri, trimri si uneori tetrameri) care contin un lant J polipeptidic. IgA din secretiile externe, numita IgA secretorie, este formata dintr-un dimer sau tetramer, un lant J polipeptidic si un lant polipeptidic numit component secretoriu. Componentul secretoriu este derivat din receptorul care transporta IgA polimerica prin membrane. Lantul J polipeptidic din IgA este identic cu cel din IgM pentamerica si are o functie similara in facilitarea polimerizarii atat a IgA serica cat si a IgA secretorie. Componentul secretoriu al IgA este reprezentat de un polipeptid cu greutate moleculara de 70,000, produs de celulele epiteliale ale membranelor mucoase. Este alcatuit din 5 domenii imunoblobulin-like care leaga dimerii IgA de regiune Fc. Interactiunea este stabilizata de o legatura disulfidica intre componentul secretoriu si unul dintre lanturile dimerului IgA.

Productia zilnica de IgA secretorie este mai mare decat a oricarei alte clase de imunoglobuline. IgA secretoare de plasma sunt concentrate pe suprafata membranelor mucoase. Zilnic un om secreta intre 5 si 15 grame de IgA secretorie in secretiile mucoase. Celulele plasmei care produc IgA migreaza spre tesutul subepitelial, unde IgA secretata se leaga la un receptor pentru molecule polimerice de imunoglobulina. Acest receptor este exprimat pe suprafata basolaterala a majoritatii epiteliilor mucoase (ex. captuseala tractului digestiv, respirator si genital) si la nivelul epiteliilor glandulare (ex. glandele mamare, salivare si lacrimale). Dupa ce IgA polimerica se leaga de receptorul polipeptidic, complexul rezultat este transportat peste bariera epiteliala spre lumen. Transportul complexului IgA-receptor implica endocitoza mediata de receptor si transportul veziculelor peste celulele epiteliale spre membrana luminala, unde veziculele fuzioneaza cu membrana plasmatica. Receptorul poli-Ig este apoi clivat enzimatic de la nivelul membranei si devine component secretoriu care este legat la IgA polimerica si eliberat in secretiile mucoase. IgM pentamerica este transportata in secretiile mucoase prin acelasi mecanism, desi procentual are mult mai putin anti-corpi in secretiile mucoase decat IgA.

IgA secretorie serveste ca efector la nivelul suprafetelor membranelor mucoase care sunt principalele cai de intrare a majoritatii organismelor patogenice. Intrucat este polimerica, IgA ( fig.2) secretorie poate lega anticorpi de dimensiuni mari, cu epitopi multipli. Legarea IgA secretorie de antigenii virali si bacterieni previne atasarea patogenilor de celulele membranelor mucoase, inhiband astfel infectia virala si formarea de colonii bacteriene.

Studiile ar aratat ca IgA secretorie reprezinta o linie importanta de aparare impotriva bacteriilor precum Salmonella, Vibrio cholerae sau Neisseria gonorrhoeae precum si impotriva virusurilor precum polio, influenza si reovirus. Laptele matern contine IgA secretorie si numeroase alte molecule care protejeaza nou-nascutul in prima luna de viata.

Fig.2 (Thomas J. Kindt, Richard A. Goldsby, Barbara A. Osborne, Janis Kuby, 2007)

Imunoglobulina G ( IgG)

Imunoglubulina G este cea mai abundenta imunoglobulina din ser, constituind aproximativ 80% din totalul imunoglobulinelor prezente in ser. Molecula de IgG este formata fie din doua lanturi grele si doua usoare, fie din doua lanturi usoare (fig.3). La oameni exista 4 subclase ale IgG care se disting prin diferente in ceea ce priveste secventa lantului de aminoacizi si sunt notate in mod descrescator in functie de concentratia lor in ser dupa cum urmeaza: IgG1, IgG2, IgG3 si IgG4. Secventele de aminoacizi care disting cele 4 subclase de IgG sunt codificate de diferite gene CH a caror secventa de ADN este omoloaga in proportie de 90-95%. Caracteristicile structurale care disting cele 4 subclase sunt reprezentate de dimensiunea regiunii balama si de numarul si pozitia legaturilor disulfidice dintre lanturile grele. In functie de numarul de punti disulfidice si de pozitia lor pe lantul H, clasa imunoglobulinelor G a fost impartita in patru subclase diferite:

IgG1 alcatuita din 4 punti disulfurice, situate intre punctele de intersectie ale lanturilor H. Reprezinta cel mai mare procent dintre toate clasele de imunoglobuline G, avand rol in activarea complementului pe calea clasica si in transferul imunitatii in mod pasiv prin bariera feto-placentara, de la mama la fat.

IgG2 alcatuita din 4 punti disulfurice situate doua cate doua de o parte si de alta a punctelor de intersectie ale lanturilor H. Activeaza slab complementul.

IgG3 este alcatuita din 15 punti disulfurice situate intre punctele de intersectie ale lanturilor H. Este cel mai puternic activator al caii clasice a complementului.

IgG4 alcatuit din 2 punti disulfurice situate de o parte si de alta a punctelor de intersectie. Nu activeaza complementul.

Fig.3 (Thomas J. Kindt, Richard A. Goldsby, Barbara A. Osborne, Janis Kuby, 2007)

Diferentele dintre cele 4 subclase influenteaza activitatea moleculelor dupa cum urmeaza:

IgG1, IgG3 si IgG4 traverseaza cu usurinta placenta si au rolul de a proteja dezvoltarea fetusului

IgG3 este cea mai eficienta activatoare a complementului, urmata de IgG1. IgG2 este mai putin eficienta, in timp de IgG4 nu are capacitatea de a activa complementul.

IgG1 si IgG3 se leaga de receptorii Fc ai fagocitelor mediand astfel opsonizarea. IgG4 are o afinitate medie fata de receptorii Fc, in timp ce IgG2 are o afinitate foarte mica pentru receptorii Fc.

Imunoglobulina E ( IgE)

IgE are o concentratie in ser de 0,3 g/ml. Anticorpii IgE mediaza reactiile hipersensibile imediate care sunt responsabile pntru simptomele care apar in febra fanului, astm, urticarie si soc anafilactic. Prezenta unui component seric responsabil pentru reactiile alergice a fost demonstrat in 1912 de catre K. Prausnitz si H. Kustner care au injectat intradermal ser de la o persoana alergica unei persoane non-alergice. Ulterior au injectat antigenul potrivit in acelasi loc si au observat aparitia unei reactii cutanate asemanatoare urticariei. Aceasta reactie, denumita reactia P-K (dupa Prausnitz si Kustner) a pus bazele primului test biologic de identificare a IgE. Actuala motoda de identificare a IgE ( fig.4 ) a fost a fost realizata in anul 1966 de catre K. si T.Ishizaka. Acestia au obtinut ser de la o persoana alergica pe car ulterior l-au folosit pentru a imuzina iepurii in vederea prepararii unui antiser anti-izotip. Antiserul obtinut de la iepuri a fost apoi pus in reactie cu toate imunoglobulinele cunoscute pana la momentul respectiv (IgG, IgM, IgA si IgD), in acest mod fiind posibil ca fiecare anticorp anti-izotip cunoscut sa fie eliminat din anti-serumul iepurilor. Ceea ce a ramas a fost un anticorp anti-izotip specific pentru o clasa necunoscuta de anticorpi, denumita ulterior IgE.

Fig. 4 (Thomas J. Kindt, Richard A. Goldsby, Barbara A. Osborne, Janis Kuby, 2007)

IgE se leaga de membrana bazofilelor si a mastocitelor. Cross-link-ul moleculelor IgE legate de receptorii de antigen induce procesul de degranulare (bazofilele si mastocitele isi elibereaza granulele in membrana plasmatica si elibereaza continutul in spatiul extracelular). Degranularea localizata a mastocitelor poate elibera mediatori care faciliteaza aparitia celulelor necesare in apararea impotriva infectiilor parazitare.

Imunoglobulina D ( IgD)

IgD a fost descoperita atunci cand o proteina mielomica a unui pacient cu mielom multiplu nu a reactionat cu niciun antiser anti-izotip cunoscut la momentul respectiv (IgG, IgA si IgM). Atunci cand iepurii au fost imunizati cu aceasta proteina mielomica, antiserul rezultat a fost folosit pentru a identifica aceeasi clasa de anticorpi prezenta in cantitati mici in serul uman normal. Noua clasa descoperita, dnumita IgD are o concentratie in ser de 30 g/ml si reprezinta aproximativ 0,2% din totalul imunoglobulinelor serice. IgD, impreuna cu IgM este principala imunoglobulina care se leaga de membrana, exprimata de celulele B mature, iar rolul sau in fiziologia celulelor B este inca investigat. Pentru IgD nu a fost descoperita inca nicio functie biologica efectoare.

Analiza prin secventiere a devenit posibila odata cu descoperirea mielomului multiplu, care se manifesta ca un cancer al celulelor plasmatice producatoare de anticorpi. La persoanele sanatoase celulele plasmatice sunt celule in stadiu terminal care produc o singura specie moleculara de anticorpi pentru o perioada limitata de timp, apoi mor. In cazul persoanelor care sufera de mielom multiplu celulele plasmatice nu mai pot intra in apoptoza si se divid necontrolat, fara a mai avea nevoie de un antigen care sa induca proliferarea. Desi aceste celule canceroase sunt transformate, capacitatea lor secretorie nu se modifica, astfel incat celula continua sa produca anticorpi moleculari omogeni. Acesti anticorpi nu sunt diferiti de moleculele normale de anticorpi, insa sunt denumiti proteine mielomice pentru indicarea sursei. In cazul unui pacient care sufera de mielom multiplu, cantitatea de proteine mielomice poate ajunge pana la 95% din totalul imunoglobulinelor serice. La majoritatea pacientilor afectati, celulele mielomice pot de asemenea sa secrete o cantitate mare de lanturi usoare, care au fost descoperite pentru prima data in urina persoanelor care sufera de mielom multiplu si au fost denumite proteine Bence-Jones, dupa numele descoperitorului.

II. Gamapatiilor monoclonale

Tulburarile celulelor plasmatice includ gamopatii monoclonale cu semnificatie nedeterminata, mieloame inactive si mieloame active. Bolile asociate sunt reprezentate de macroglobulemia Waldenstrom, boala lanturilor grele si amiloidoza sistemica primara. Trasaturile caracteristice ale acestor boli sunt determinate de implicarea celulelor plasmatice sau a limfocitelor asemanatoare celulelor plasmatice ce conduc la producerea de imunoglobuline (cu lanturi grele sau usoare) monoclonale. Cele mai comune mieloame sunt IgG sau IgA κ sau λ precum si mieloamele Bence-Jones κ sau λ. Macroglobulemia Waldenstrom este determinata de unu nivel crescut de macroglubulina IgM de tip κ sau λ. Trasnformarea maligna in mieloamele multiple are loc intr-un stadiu tarziu al ontogeniei celulelor B care precede diferentierea acesteia in celula plasmatica. Spre exemplu, in macroglobulemia Waldenstrom, celula tinta pentru transformarea maligna a fost deja programata de antigen sa produca IgM monoclonala (κ sau λ). Rata recombinarii genetice in diferentierea clulelor B bazata pe antigen a fost estimata ca fiind de milioane de ori mai mare decat in celulele somatice. Studiile legate de plasmocitoame efectuate pe soareci au aratat ca pentru aparitia acestor transformari este necesara stimularea antigenica. Pana acum, tehnica majora de investigare a cauzelor transformarii celulelor plasmatice a fost reprezentata de epidemiologia traditionala.

Descoperirile recente in domeniul biologiei moleculare au permis analiza genelor imunoglobulinelor. Rearanjamentele genetice ale imunoglobulinelor apar in momente specifice in timpul maturarii celulelor B. Oncogeneza mieloamelor multiple are loc in celulele plasmatice diferentiate aproape complet. Locii genetici ai imunoglobulinelor par a fi responsabili pentru pentru proportia semnificativa de translocatii care au loc in celulele de mielom. Caracterizarea acestor translocatii a condus la identificarea unui numar de potentiale oncogene care pot juca un rol important in dezvoltarea bolii. Pentru a intelege pe deplin fiziopatologia mielomului este necesara cunoasterea rearanjamentelor genetice care au loc intr-o imunoglobulina normala.

1. Rearanjamentele genetice ale imunoglobulinelor normale

Anticorpii sunt proteine care se leaga de antigenii celulari, virali sau bacterieni semnalizand astfel sistemului imunitar nevoia de a-i inlatura. Structura normala a unui anticorp este reprezentata de un dimer compus dintr-un set de proteine cu lanturi grele si usoare. Data fiind gama larga de potentiale infectii, exista milioane de anticorpi unici creati pentru a proteja individul de contactarea unei boli. Cu toate acestea, fiecare anticorp producator de celule B produce o singura proteina. Pentru ca diversitatea anticorpilor sa fie prezenta, este necesara producerea a milioane de celule B unice, cele care produc un anticorp folositor urmand sa fie dieferentiate in celule plasmatice care vor secreta cantitatea necesara de proteine. Genele acestor anticorpi nu sunt direct codificate in genomul liniei germinale. Cantitatea de ADN necesara fiecarei celule pentru a produce milioane de anticorpi unici ar face imposibila dezvoltarea de proteine de anticorpi. In loc de asta, locii genetici ai imunoglobulinelor si ai anticorpilor sunt compusi din numeroase fragmente genetice care sunt rearanjate intr-o maniera aparent randomica pentru a genera structura initiala a anticorpilor. Molecula de imunoglobulina este compusa din proteine cu lant greu si protein cu lant usor. Lantul greu cuprinde cea mai mare parte a diversitatii si este compus, asemenea lantului usor, din doua regiuni: regiunea variabila, care leaga antigenul in mod direct si regiunea constanta care determina clasa si functia anticorpului.

In stadiile timpurii ale dezvoltarii celulelor B, rearanjarea a patru segmente genetice separate conduce la dezvoltarea portiunii de lant greu a unui anticorp functional unic. In codificarea regiunii variabile a lantului greu sunt implicate trei segmente genetice: segmentul variabil (VH), diversitatea (D) si segmentul “joining gene” (JH). Pentru a genera cantitatea extraordinara de anticorpi unici care este necesara, aceste segmente genetice sunt recombinate intr-o maniera aparent randomica pentru a crea o gena VHDJH initiala. Majoritatea regiunilor variabile ale lanturilor grele sunt codificate de aproximativ 50 de gene VH functionale. Acest segment genetic se juxtapune cu una dintre cele 30 de gene functionale D si cu 6 gene JH functionale. Aceasta alaturare este imprecisa, ceea ce conduce la diversitatea anticorpilor prin insertia nucleotidelor non-templated. In aceiasi perioada de timp, un proces similar are loc la nivelul lantului usor din interiorul celulei B. In acest caz, lantul usor κ (sau λ) trece printr-un rearanjament similar al genelor V, J si C. Dupa cum se poate suspecta, acest rearanjament genetic poate sa conduca initial la aparitia unui numar substantial de celule producatoare de anticorpi disfunctionale. Ulterior, un proces denumit selectie antigenica asigura selectarea limfocitelor care produc anticorpi folositori. Celulele pre-B migreaza de la nivelul maduvei osoase la nivelul germinal al nodulului limfatic, unde sunt expuse antigenului. In acest moment, moleculele de imunoglobulina produse de celulele B sunt prezente pe suprafata celulelor. Daca imunoglobulinele prezente pe suprafata celulara se leaga de un antigen prezent la nivelul nodulului limfatic, limfocitele primesc semnalul de a prolifera si a se divide. Limfocitele B care raman isi initiaza procesul de apoptoza. In timp ce celulele B care supravietuiesc se divid la nivelul centrului germinal, are loc un al doilea eveniment important care ajuta la generarea anticorpilor specifici necesari imunitatii. Are loc mutatia somatica ce este caracterizata de mutatii aditionale ce au loc in interiorul regiunii variabile a genelor imunoglobulinelor sau la nivelul centrului germinal proliferativ al celulelor B. Daca celula B rezultanta prezinta o mutatie care conduce la proprietati superioare de legare a antigenului, va primi semnale aditionale pentru initierea proliferarii. Celulele B care dobandesc mutatii somatice detrimentale sunt supuse procesului de apoptoza.

Odata ce anticorpul optim a fost produs, limfocitele B mature parasesc nodulul limfatic germinal si migreaza catre maduva osoasa. De-a lungul drumului, majoritatea celulelor B sufera schimbarea izotipului prin schimbarea clasei de anticorpi din IgM sau IgD in IgG, IgA sau IgE, prin excizia portiunii mijlocii a genei lantului greu. Odata cu schimbarea izotipului, numai are loc nicio mutatie, cel mai probabil datorita faptului ca la nivelul maduvei osoase nu sunt prezenti antigeni care sa conduca procesul de selectie.

2. Mielomul multiplu

Mielomul multiplu reprezinta prototipul gamapatiilor monoclonale, are o incidența în populație mult mai scăzută decât gamapatiile monoclonale cu seminificatie nedeterminata, apărând în special după 40 ani, predominant la bărbati. Mielomul multiplu este un neoplasm sever. Proliferarea plasmocitelor interfera cu productia normala de celule sanguine determinand leucopenie, trombocitopenie. Celulele pot forma mase de tesut moale plasmocitoame sau leziuni litice in schelet.

Mielomul multiplu este reprezentat de o proliferare a celulelor plasmocitare, care își pastrează capacitatea de a sintetiza Ig (cu structura chimică ce se incadrează în categoriile Ig normale, dar spre deosebire de acestea sunt alcătuite din același lanț greu și același lanț ușor) fie molecule complete cu lanțuri grele și ușoare, exces de lanțuri ușoare, fie numai lanțuri ușoare. Proliferarea celulelor caracteristice, mielomatoase (elemente plasmocitare transformate malign) produc în principal patru grupe de tulburări cu consecințe multiple: leziuni litice osoase responsabile de hipercalcemie, fracturi patologice, compresiuni nervoase radiculare și medulare;

Morfologia tipică a clonei de celule plasmocitare proliferate neoplazic în mielomul multiplu este cea a unui plasmocit matur care, în mod normal, reprezintă stadiul terminal al diferențierii liniei limfocitare B. Sub aspect fenotipic, aceste celule exprimă imunoglobuline citoplasmatice (cIg+ ), CD38+ (exprimarea intensă a acestui marker este o caracteristică a celulelor plasmocitare), CD19+ , PCA-1+ , CD56+ , CD45RO+ ; numai o minoritate dintre ele exprimă CD10(CALLA)+ , HLA-DR+ și CD20+ . Ca și alte neoplazii hematologice de joasă malignitate, MM reprezintă un proces malign cu evoluție în trepte, multistadială, de la un proces relativ benign spre o fază de înaltă malignitate [1,19,20].

Deficitul imun al pacienților cu MM se datorează coroborării mai multor factori: scăderea producției și deci, și a concentrației serice a Ig normale ( afectarea răspunsului imun humoral, mai ales cel primar ); deficit în diferențierea celulelor pre-B în formele mature ; deficit în diferențierea celulelor cu memorie în celule producătoare de anticorpi; scăderea numărului de celule T helper CD4+; deficit al funcției complementului și granulocitelor.

Aceste perturbări favorizează o incidență crescută a infecțiilor, cu diverse localizări, mai ales cu germeni încapsulați ca S. pneumoniae, H. influenzae. Odată cu evoluția bolii, crește incidența infecțiilor cu germeni Gram-negativi și S. aureus

3. Macroglobulinemia Wäldenstrom

Macroglobulinemia Wäldenstrom este o gamapatie monoclonala rara. Aceasta este caracterizata de prezenta unui nivel crescut al imunoglobulinei IgM, care conduce hipervascozitate serica si infiltrat limfoplasmocitar in madura osoasa. Macroglobulinemia Wäldenstrom este caracterizata citologic prin proliferarea monoclonala de elemente limfocitare si limfoplasmocitare secretoare de imunoglobulina M. Macroglobulina secretata este omogena, fiind formata din molecule IgM identice, alcatuite din lanturi grele µ, cuplate cu doar unul din cele doua tipuri usoare ( kapa sau lambda). Acest carácter sugereaza ca este produsul unei clone unice de celule linfoide angajate in proliferare.

Celulele limfoplasmocitare neoplazice infiltreaza madura osoasa, splina si nodulii limfatici. Mai rar aceste celule pot infiltra plamanii, ficatul, rinichii, pielea.IgM monoclonal are si activitate de factor reumatoid, activitate antimielinica care contribuie la neuropatia periferica si activitate anticoagulanta lupica. De asemeni poate conduce la crioglobuinemie de tip 1 si 2. Cele mai frecvente semne si simptome includ oboseala , sângerări nazale , amețeli , sângerări gingivale, pierderea in greutate , vanatai, dureri de cap , și amorțeală sau furnicături în mâini sau picioare.

4. Boala „lanțurilor grele”

Boala lanturilor grele este o tulburărare proliferativa a celulelor B, caracterizata prin producerea de imunoglobuline cu lanturi grele anormale , structural incomplete si fără lanțurile ușoare corespunzătoare . Aceasta anormalitate este rezultatul unei mutatii genetice, deletii sau insertii.

Aceasta disfunctie este clasificata in functie de clasele de imunoglobulinele implicate. Au fost descrise, cu o frecventa rara :γ HCD ( Heavi Chain Disease ) – IgG , μ HCD -IgM, α HCD – IgA . Nici un caz de ε HCD – IgE sau δ HCD -IgD nu a fost raportat pana in prezent. Boala lamturilor grele este considerata o varianta a limfomului MALT, datorita prezentei frecvente a unui limfom marginal extranodal asociat cu mucoasa tesutului limfoid. γ HCD este un limfom limfoplamocitoid și μ HCD seamănă clinic cu limfomul cu celule mici sau leucemie limfocitara cronica .(1α HCD este cel mai frecvent raportat la adultii tineri ( varsta medie la diagnostic , 30-40 ani) , în special de etnie arabă sau evrei din zona mediteraneană sau Orientul Mijlociu , γ HCD sau boala Franklin este cel mai adesea studiata și apare la pacientii de varsta mijlocie . De la prima descriere, facuta de catre Franklin în 1964 , aproximativ 130 de cazuri de γ HCD au fost raportate în întreaga lume . Pana la o treime din pacienții cu γ HCD au asociata o boala autoimuna ( de exemplu , artrita reumatoidă , sindromul Sjogren , lupus eritematos , și anemia hemolitică autoimună In γ HCD , o clonă celulară limfoplamocitoida mutanta sintetizează o proteină anormală IgG . Clona mutant implică alterări genetice , inclusiv mutatii , deleții sau inserții care afectează atât regiunea constanta cat si cea variabila . Modificările implică, de obicei domeniile V si CH1. În primul caz ”regiunea balama”, de obicei, rămâne intactă, al doilea tip de deletie cuprinde regiunea balama . In ambele cazuri ,lanțul γ rezultat este de obicei între o jumătate și trei sferturi lungime normală și are tendința de a polimeriza .(

Aproximativ 25% dintre pacientii cu γ HCD prezinta boala localizata, în timp ce la două treimi este prezenta difuz , inclusiv in zona medulara și extramedulară. Pacientii a caror boala este localizata difuz, prezinta deasemenea limfadenopatie, splenomegalie, hepatomegalie și adesea, implică slăbiciune progresivă, oboseala si febra. Hepatosplenomegalie este prezenta la 60% dintre pacienți. Limfadenopatie este prezenta la debut la aproximativ două treimi din pacienții care prezinta boală diseminat, deasemeni acestia au noduli toracici, abdominali, axilari, imflamati.Limfoadenopatia este mai pronuntata atunci cand boala progreseaza. Alte caracteristici pot include sensibilitate glandei parotide , dureri ale limbii, anemie hemolitică autoimună si purpura. Cei mai multi pacienti la care boala este progresiva, in cele din urma cedeaza la infectii bacteriene. Dintr-o serie de 23 de pacienti s-a raportat o supravietuire medie de 7.4 aniSimtomele γ HCD diseminat sunt variabile dar pot include: febra, stare generală de rău, care poate fi datorata stării de boală în sine sau poate fi cauzata de anemie . O ușoară anemie este intalnita adesea la pacientii cu γ HCD diseminată . Disfagia este de obicei cauzata de edemul al palatului moale. Acest edem poate conduce , de asemenea, la dureri ale limbii . Infecții ale tractului respirator superior recurente se dezvolta din cauza afectarii imunitatii umorale si celulare . la aceste infectii pot contribui alți factori precum, hiperplazia limfoidă de orofaringelui , care poate reduce clearance-ul de agenti patogeni respiratorii .Pot fi prezente dureri abdominale, datorita splenomegaliei , hepatomegalie , și / sau limfadenopatie abdominale.

5. Gamapatii monoclonale cu semnificație nedeterminată

Cele mai multe cazuri implica populatii de imunoglobuline IgG sau IgA. Circa 15-20% sunt compuse din imunoglobuline IgM monoclonale. Kyle si colab. au raportat că Mgus IgG și IgA provin dintr-o mutatie somatica a unei celule plasmatice.La aproximativ 50% din cazuri s-a evidentiat existenta uneitranslocari a lanț ului greu în regiunea 14q32. IgM MGUS este descris ca fiind generata de o mutatie somatica, in centru postgerminal al limfocitelor B care nu au fost supuse schimbarii izotipului și, prin urmare, nu au regiunea 14q32. Aceste translocari sunt considerate importante în inițierea și susținerea proliferarii clonale. Riscul de progresie catre MM sau alte tulburări limfoproliferative este prezent cu o rată constantă de-a lungul vieții unui pacient. Această observație sugerează că al doilea eveniment responsabil pentru progresie este un eveniment aleator și nu cumulativ.

6.Amiloidoza sistemica primara

Amiloidoza sistemică pot fi clasificata: amiloidoza sistemică primară, de obicei, cu nici o dovada a unui precedent de boală, amiloidoza asociata cu mielomul multiplu sau amiloidoza sistemică secundară cu, in conditiile unei inflamatii sau infectii cronice. Amiloidoza sistemică primară implică, in principal, elemente mezenchimale, iar modificari la nivel cutanat sunt observate la 30-40% dintre pacienți. Amiloidoza sistemică secundară nu implică pielea.

Amiloidoza sistemică primară presupune depunerea de imunoglobuline monoclonale insolubil, cu lanțuri usoare sau fragmente, în diferite țesuturi, inclusiv mușchi netezi și striați, tesuturi conjunctive, peretii vaselor de sange, si nervii periferici. Amiloidul este produs de celulele plasmatice din măduva osoasă. Aceste lanțuri usoare sunt secretate în ser. Spre deosebire de lanturile usoare observate la pacienții cu mielom, aceste lanțuri L sunt unice, deoarece ele sunt supuse proteoliză lizozomale parțiale in interiorul macrofagelor, iar acestea sunt depozitate extracelular ca filamente de amiloid insolubile atașate la o polizaharidă. Dezvoltarea amiloidozei consta in producerea de de fibrile de amiloid în matricea extracelulară. Procesul prin care proteinele precursoare conduc la producerea fibrilelor pare a fi multifactorială și difera in functie de tipul de amiloidoză . Fibrilele din cazul amiloidozei sistemice primare sunt constituite din fragmente (capatul amino terminal), dar si lanturi usoare intregi ale imunoglobulinelor. Diagnosticul depinde de depunerea de amiloid in tesut. Organele cel mai frecvent implicate sunt rinichii sau inima. Aproximativ 30-40 % dintre pacienții cu amiloidoză sistemică primară au leziuni cutanate . Pete , purpură , echimoze acestea apar spontan sau după traumatisme minore, si sunt cele mai frecvente semne ale pielii fiind intalnite la aproximativ 15-20 % dintre pacienți . Leziunile cutanate cele mai caracteristice constau in papule , noduli , și plăci cu aspect ceros si stralucitor. [ 6 ] implicarea la nivelul scalpului pot fi obserbvata datorita caderii parului . Apar modificări cutaneo-mucoase în cavitatea orală ( papule, pete și , echimoze). Xerostomia poate rezulta din infiltrarea glandelor salivare . Macroglosia este raportată în 19 % dintre pacienții cu amiloidoză sistemică primară

V. Metode imunochimice de detectare a gamapatiilor monoclonale

Electroforeza proteinelor serice

Electroforeza este metoda de separare a moleculelor proteice în funcție de sarcina electrică și de greutatea moleculară. Metoda electroforetică se aplică probelor de ser, urinii și lichidului cerebrospinal.

Viteza cu care proteina migreaza intr-un camp electric (mobilitatea electroforetica) este specifica fiecarei proteine in parte si depinde atât de proprietățile proteinei de separat cât și de proprietățile soluției în care se face separarea: pH, forța ionică a tamponului, temperatura și intensitatea curentului electric.

A. În mediu acid:

B. În mediu alcalin:

Materiale si metode

– aparatul semiautomat Hydrasys , SEBIA

– kit Hydragel β1–β2;

– cameră umedă furnizată cu sistemul HYDRASYS;

– pipete: 10 μL si 200 μL

– densitometru / scanner capabil să citească geluri de 82 x 51 mm sau 82 x 102 mm la o lungime de undă de 570 nm sau cu filtru galben ;

Conținutul kit-ului:

10 geluri de agaroză;-

10 pachete ce conțin fiecare câte doi bureți cu tampon (fiecare burete conține tampon tris-barbital pH 8.5 ± 0.3);

1 recipient (60 mL) ce conține diluant pentru colorant;

1 recipient (20 mL) ce conține colorant amidoblack;

1 pachet cu 10 aplicatoare (fiecare aplicator conține câte 7, 15 și respectiv 30 de poziții);

1 pachet cu 10 bucăți de hârtie de filtru;

1 recipient (100 mL) ce conține soluție de decolorare.

Fiecare gel conține: agaroză, 0.8 g/dL ; soluție tampon tris-barbital (pH 8.5 ± 0.1).

Bureții cu soluție tampon conțin: tampon tris-barbital (pH 8.5 ± 0.3); azida de sodiu.

Prezentarea si interpretarea rezultatelor

Rezultatele sunt prezentate sub 2 forme : scanare densitometrica si valori numerice pentru fiecare

fractiune (% si g/dl).

Proteinele identificate in cele 6 fractiuni majore separate prin electroforeza:

Modificarile ce pot aparea intr-o migrare electroforetica la nivelul fractiunilor majore

Hipoalbuminemia apare in: insuficienta aportului albuminelor in alimentatie (malnutritie cronica severa), diminuarea sintezei: insuficienta hepatica (ciroze, hepatite) si inflamatii,

pierderea lor accentuata pe cale urinara (sindrom nefrotic), digestiva (gastroenteropatie exudativa) sau cutanata(arsuri), precum si hipercatabolism: sindroame inflamatorii severe, endocrinopatii diverse (tireotoxicoza, sindrom Cushing).

Hiperalbuminemia fara semnificatie patologica importanta apare frecvent la pacientii cu hemoconcentratie locala sau sistemica sau in urma perfuziilor cu albumina.

Bisalbuminemia se poate datora unor mutatii ereditare fara sa aiba consecinte patologice sau poate fi dobandita (tranzitorie), datorata unei pancreatite sau tratamentului cu doze mari de β-lactam. ( fig. )

Fig.

Alfa-1 globulinele si Alfa-2 globulinele cresc in:

sindrom nefrotic

diabet zaharat

miocardoscleroza

endocardite bacteriene

arsuri

boli infectioase

reumatism

reactii inflamatorii

In reactii de faza acuta se intesifica atat banda alfa-1 cat si alfa-2.

Cresterea exclusiva a componentelor alfa-1 poate fi observata in:

hepatita cronica

reactii de faza acuta insotite de hemoliza

terapie cu estrogeni

sarcina

Cresterea predominanta a componentelor alfa-2 se intalneste in:

poliartrita reumatoida

boli cu complexe imune circulante

Scaderea alfa-1 globulinelor apare:

in urma unei insuficiente hepatocelulare, malnutritiei sau pierderii de proteine

in cazul deficitului congenital de alfa-1 antitripsina

Beta globulinele cresc in:

anemia feripriva

dislipidemii

boala Cushing

gamapatii monoclonale(Ig A, Ig G, lanturi usoare Kappa sau Lambda)

hepatite toxice

ciroze, inclusiv alcoolice

sindrom nefrotic ( fig.2 )

Scaderi ale beta globulinelor pot apare in:

insuficienta hepatica, malnutritie, pierderi proteice corelate cu diminuarea valorii transferinei in mobilitatea electroforetica in zona beta-1

scaderea fractiunii C3 a complementului, asociata cu o scadere a fractiunii beta-2

Gama globulinele cresc in:

infectii bacteriene

parazitoze

colagenoze

poliartrita reumatoida

obstructie biliara

hepatita acuta sau cronica

ciroza hepatica

leucemii

mielom multiplu

boli inflamatorii

Fig.

In ciroza alcoolica supraproductia de IgA si IgM duce la fuzionarea fractiilor β si γ creand un aspect al electroforegramei de bloc β – γ. ( fig.)

Fig.

Hipogamaglobulinemia apare in imunodeficienta primara sau in imunodeficienta secundara datorata tratamentului cu corticosteroizi, imunosupresoare, chimio si radioterapiei. Aspectul de hipogamaglobulinemie mai este prezent si in cazul mielomului multiplu micromolecular cand in urina se identifica proteine Bence Jones. ( fig.)

Hipergamaglobulinemia Aspectul este de crestere difuza a fractiunii gama datorata in principal bolilor hepatice, infectiilor bacteriene si parazitare sau bolilor autoimune. ( fig.)

Proteina M – se prezinta sub forma unei benzi bine delimitate iar aspectul pe electroforegrama este acela al unui pic ascutit cu baza ingusta. Apare in neoplaziile limfoproliferative ( mielom multiplu). (fig.6a, 6b, 6c, 6d)

Fig.

Fig.

Fig.

Fig.

Imunofixarea proteinelor serice

Principiul metodei

Imunofixarea proteinelor serice consta in doua etape:

A. Separarea electroforetica in mediu alcalin, la un pH de 9.1, a proteinelor serice;

B. Imunoprecipitarea folosind antiseruri monospecifice.

Imunoprecipitarea este rezultatul interactiunii antigenelor cu anticorpii specifici intr-un mediu suport care poate fi un gel de agaroza sau un mediu lichid. Factorul cel mai important in acest proces este natura bivalenta a moleculelor de anticorp care reactioneaza cu epitopii multipli ai antigenului solubil.

Materiale, echipamente și accesorii necesare:

– kit Hydragel 1IF, 2 IF, 4 IF sau 9 IF furnizate de SEBIA;

– sistem semiautomat HYDRASYS 2 SEBIA;

– cameră umedă furnizată cu sistemul HYDRASYS;

– pipete: 10 μL si 200 μL;

mască standard SEBIA;

Fiecare kit este însoțit de un set de antiseruri monospecifice: anti lanțuri grele γ,α,µ și anti lanțuri usoare

κ și λ care formează complexe imunoprecipitante cu proteinele anormale separate electroforetic.

Conținutul kit-ului:

-10 geluri de agaroză;

-10 pachete ce conțin fiecare câte doi bureți cu tampon (pH 9.1 ± 0.3);

-1 recipient (60 mL) ce conține diluant pentru colorant;

-1 recipient (20 mL) ce conține colorant amidoblack;

-1 recipient (32 mL) ce conține diluent (soluție alcalină pH 7.5 ± 0.3 și bromfenol albastru) și este utilizat pentru diluția

probelor;

-1pachet cu 10 aplicatoare (fiecare aplicator conține câte 7, 15 și respectiv 30 de poziții);

-1 pachet cu 10 bucăți de hartie de filtru fină;

-1 pachet cu 10 bucăți de hârtie de filtru pieptăn;

-1 recipient (100 mL) ce conține soluție de decolorare.

-1 recipient de 14,4 ml cu soluție de fixare;

-1 recipient de 8 ml cu antiser anti lanț greu gama;

-1 recipient de 8 ml cu antiser anti lanț greu miu;

-1 recipient de 8 ml cu antiser anti lanț greu alfa;

-1 recipient de 8 ml cu antiser anti lanț usor kappa;

-1 recipient de 8 ml cu antiser anti lanț usor lambda.

-1 pachet cu 10 bucăți de hartie de filtru groasă;

Pentru fiecare caz este necesar sa se aplice cate 10 μl de proba diluata in sase godeuri dupa cum urmeaza: ELF, IgG, IgA, IgM, κ si λ. Inainte de a se incepe separarea electroforetica a proteinelor, proba trebuie diluata, pentru fiecare tip de lant greu si lant usor existand o anumita dilutie standard prezentata in tabelul de mai jos.

Dilutii speciale: pentru valori ale IgG > 20 g/l se recomanda dublarea cantitatii de diluant pentru valori ale IgG < 5 g/ l se recomanda reducerea la jumatate a cantitatii de dilaunt.

Mod de lucru: Aplicarea probei: in decurs de 2 minute se pun cate 10 μl de ser diluat in cele 6 godeuri, primul godeu corespunde unei migrari electroforetice normale iar celelalte godeuri corespund celor trei tipuri de lant greu (α, γ si μ) si celor dou tipuri de lant usor κ si λ;

În cele 6 godeuri corespunzătoare unei singure probe sunt adăugate după cum urmează: soluție de fixare (40 μl), și câte 25 μl de antiser anti lanț γ, antiser anti lanț α, antiser anti lanț μ, antiser anti lanț κ, antiser anti lanț λ.

Interpretare: Rezultatele sunt calitative si permit identificarea tipului de lant greu (H) si lant usor (L) al unei proteine monoclonale.

Cuantificarea lanturilor libere usoare k si λ prin metoda nefelometrica

Principiul metodei:

Nefelometria masoara intensitatea luminii dispersate de catre un complex Ac-Ag. Fasciculul de lumina trece prin cuva de reactie in care se afla complexul Ac-Ag iar lumina

dispersata de acest complex este detectata de catre un fotodetector situat la un unghi < 900

fata de unghiul initial al fasciculului de lumina. Cantitatea de lumina dispersata este corelata cu concentratia proteinei de analizat. In timpul reactiei in vitro, lantul usor se leaga de anticorpul policlonal conjugat cu latex cu specificitate pentru epitopii expusi pe lanturile usoare libere.

Reactivi necesari:

Kitul FREELITE compatibil cu nefelometrul Dade-Behring BNProSpec care contine:

a) anticorpi policlonali anti k si λ uman conjugati cu latex;

b) Calibrator ( ser uman ce contine lant policlonal kapa si lambda )- pana in prezent nu exista un calibrator universal care sa permita realizarea unui control de calitate extern;

c)seruri control +/- (nivel scazut si ridicat).

Fiecare serie de reactivi are propriul calibrator si control.

Reactivi suplimentari: tampon de reactie, diluant.

Bibliografie

Wong CK. Mucocutaneous manifestations in systemic amyloidosis. Clin Dermatol. 1990 Apr-Jun. 8(2):7-12

Silverstein SR. Primary, systemic amyloidosis and the dermatologist: where classic skin lesions may provide the clue for early diagnosis. Dermatol Online J. 2005. 11(1):5

Hayman SR, Bailey RJ, Jalal SM, et al. Translocations involving the immunoglobulin heavy-chain locus are possible early genetic events in patients with primary systemic amyloidosis. Blood. 2001 Oct 1. 98(7):2266-8.

John Foerster, Plasma Cell Dyscrasias: General Considerations, în Wintrobe’s Clinical Hematology, 10 Ed., 1999, 2612-2621;

5. George Popa, Limfoproliferari reactive maligne și de granita. Probleme generale de etiopatogenie, în Tratat de Medicina Interna, sub redacția Radu Paun, coordonator Dan C oliță, Hematologie partea II, 1997, 258-261.

6. John Foerster and Frixos Paraskevas, Multiple Myeloma, în Wintrobe’s Clinical Hematology, 10 Ed., 1999, 2649.

7. Mariana Gociu, Mielomul Multiplu, în Tratat de Medicina Interna, sub redacția Radu Paun, coordonator Dan Coliță, Hematologie partea II, 1997, 472-486.

D. Coliță, Macroglobulinemia Waldenstrom, în Tratat de Medicina Interna, sub redactia Radu Paun, coordonator Dan Colita, Hematologie partea II, 1997,493-502.

Jaffe ES, Harris NL, Stein H, Vardiman JW. Pathology and genetics of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues. Lyon: IARC Press; 2001);

Husby G, Blichfeldt P, Brinch L, et al. Chronic arthritis and gamma heavy chain disease: coincidence or pathogenic link?. Scand J Rheumatol. 1998. 27(4):257-64

Husby G. Is there a pathogenic link between gamma heavy chain disease and chronic arthritis?. Curr Opin Rheumatol. 2000 Jan. 12(1):65-70

Seligmann M, Mihaesco E, Preud'homme JL, Danon F, Brouet JC. Heavy chain diseases: current findings and concepts. Immunol Rev. 1979. 48:145-67.

Wahner-Roedler DL, Witzig TE, Loehrer LL, Kyle RA. Gamma-heavy chain disease: review of 23 cases. Medicine (Baltimore). 2003 Jul. 82(4):236-50.

Kyle RA, Therneau TM, Rajkumar SV, et al. Long-term follow-up of IgM monoclonal gammopathy of undetermined significance. Blood. 2003 Nov 15. 102(10):3759-64.

1.Tricot G. Multiple myeloma and other plasma cell disorders. In: Hoffman R, ed. Hematology: basic principles and practice. 4th ed. New York: Elsevier Inc. 2005:1501-1536

19. Rajkumar SV, Kyle RA. Multiple myeloma: diagnosis and treatment. Mayo Clin Proc 2005; 80(10):1371- 1382.

20. Kyle RA, Rajkumar SV. Multiple myeloma. N Engl J Med 2004;351:1860-1873.