Introducere…2 [306914]

Cuprins

Introducere………………………………………………………………………………………………………….2

1. Partea generală…………………………………………………………………………………………………4

1.1. Scurt istoric al uleiurilor volaitle………………………………………………………….4

1.2. Definiția uleiurilor volatile………………………………………………………………….4

1.3. Compoziția uleiurilor volatile……………………………………………………………..5

1.4. Biosinteza uleiurilor volatile……………………………………………………………….5

1.5. Stocarea uleiurilor volatile în plante……………………………………………………..6

1.6. Localizarea uleiurilor volatile……………………………………………………………..7

1.7. Răspândirea uleiurilor volatile…………………………………………………………….7

1.8. Metode de obținere a uleiurilor volatile…………………………………………………7

1.9. Aplicații ale uleiurilor volatile…………………………………………………………..11

1.10. Toxicitatea uleiurilor volatile…………………………………………………………..13

Introducere

Tema lucrării de licență este reprezentată de obținerea și caracterizarea unor uleiuri volatile din plante aromatice. Consider că tema abordată este una de actualitate în contextul rezistenței bacteriene în continuă creștere.

Odată cu descoperirea diferitelor clase de antibiotice (tetracicline, cefalosporine, aminoglicozide, macrolide) în anii '60, s-[anonimizat], când acești compuși revoluționari sunt în pericol de a-și pierde eficiența din cauza creșterii rezistenței bacteriene. [anonimizat], [anonimizat] o îngrijorare globală pentru sănătatea publică. 1

Una dintre soluțiile pentru combaterea rezistenței la antibiotice o reprezintă dezvoltarea de noi agenți antimicrobieni. [anonimizat], multe uleiuri esențiale au fost raportate ca având activitate antimicrobiană semnificativă. [anonimizat]. 2

Motivația alegerii temei de licența o reprezintă curiozitatea și dorința de cunoștere a unor soluții pentru rezolvarea problemelor legate de rezistența bacteriană la antibiotice.

Scopul prezentei lucrări îl reprezintă izolarea și analizarea unor uleiuri volatile din plante aromatice.

[anonimizat].

Lucrarea de față cuprinde două părți. Prima parte este reprezentată de un studiu bibliogrfic al literaturii de specialitate cu privire la uleiurile volatile. A doua parte a lucrării este un stidiu experimental care cuprinde izolarea și analiza microbiologică a [anonimizat] a acestora.

În această lucrare s-au extras și s-au analizat uleiurile esențiale de busuioc (Ocimum basilicum), cimbru (Thymus vulgaris), fenicul (Foeniculum vulgare), leuștean (Levisticum officinale), măghiran (Origanum majorana sin. Majorana hortensis) și mărar (Anethum graveolens). Uleiruile obținute au fost studiate din punct de vedere al activității antimicrobiene și antioxidante. Activitatea antimicrobiană a fost testată asupra unor specii bacteriene gram-negative (Escherichia coli, Salmonella anatum, Salmonella thyphimurium), respectiv gram-pozitive (Staphylococcus aureus, Bacillus cereus) și fungice (Aspergillus niger, Candida albicans).

1. Partea generală

1.1. Scurt istoric al uleiurilor esențiale

Uleiurile volatile au fost folosite de-a lungul istoriei de numeroase culturi, pentru proprietățile lor terapeutice. Ele au fost utilizate pentru prima dată în Egiptul Antic pentru tratarea diferitelor afecțiuni și a altor nevoi fizice și spirituale. Grecii, romanii, indienii, persanii și chinzii au perfecționat metodele de extracție a uleiurilor volatile prin distilare și au folosit uleiurile pentru îmbunătățirea stării de bine, igienă personală, masaj terapeutic și aromaterapie. Uleiurile volatile se foloseau, de asemenea, pentru tratamente de înfrumusețare, prepararea hranei sau în ceremonii religioase. 3

Unul dintre cele mai importante documente despre plantele aromatice, păstrat din Egiptul Antic este „Papyrus Ebers” și datează din 1550 î.H.. Este un papirus lung de 20 m și conține aproximativ 700 de formulări și remedii. În Grecia Antică, Hippocrates (460–377 î. H.), supranumit părintele medicinii, descrie în tratatul său „Corpus Hippocratium” aproximativ 200 de plante, printre care și plante aromatice. Medicul și botanistul de origine greacă, Discorides (cca. 40–90), care a practicat în Roma Antică descrie peste 500 de plante medicinale și remedii în lucrarea sa „De Materia Medica”. Paracelsus (1493–1541) considera că prin distilare se obține chintesența plantei – „quinta essentia”. Noțiunea de „ulei esențial” face referire la teoria lui Paracelsus. 4

1.2. Definiția uleiurilor volatile

Conform Ph. Eur. Ed. 7, uleiurile esențiale sunt definite ca „produse aromate, în general cu o compoziție complexă, obținute dintr-o materie primă vegetală, fie prin antrenare cu vapori de apă, fie prin distilare uscată, fie printr-o metodă adecvată fără căldură. Un ulei esențial este de obicei separat de faza apoasă printr-o metodă fizică ce nu duce la o schimbare semnificativă a compoziției chimice. Uleiurile esențiale pot fi supuse ulterior proceselor de deterpenizare sau desesquiterpenizare.” 5

Conform Farmacopeei Române Ediția a X-a, „uleiurile volatile sunt sustanțe volatile și lipofile, cu miros aromat, care aparțin diferitelor clase de compuși organici (mai ales terpene și derivații lor oxigenați). Se obțin prin antrenare cu vapori de apă, prin distilare cu apă sau prin alte procedee de extracție”. 6

1.3. Compoziția uleiurilor volatile

Uleiurile volatile conțin hidrocarburi de tipul terpenelor, derivați oxigenați ai acestora (numiți terpenoide) și derivați fenilpropanici. 7

Terpenele sunt molecule organice cu formula moleculară (C5H8)n, unde n este numărul de unități de izopren. Unitățile de izopren (2-metil-1,3-butadiena) sunt legate cap-coadă între ele. Terpenele se pot clasifica în funcție de numărul atomilor de carbon, respectiv a numărului de unități de izopren în: monoterpene (C10), sesquiterpene (C15), diterpene (C20), sesterpene (C25), triterpene (C30), tetraterpene (C40). 8 În compoziția uleiurilor volatile, cele mai abundente sunt monoterpenele, urmate de sesquiterpene. 7

Monoterpenele pot fi cilice sau aciclice. Monoterpenele cilcice pot fi monociclice (p-cimen, limonen, α-terpinen, β-terpinen, γ-terpinen, terpinolen, timol, carvacrol, pulegonă), bicilice (α-pinen, β-pinen, α-tuiona, β-tuionă, sabinenu, 1,8-cineol, 1,4-cineol, ascaridol) sau triciclice (triciclen). Monoterpenele aciclice sunt liniare (β-myrcen, β-ocimen). 7

Sesquiterpenele pot fi liniare, ramificate sau ciclice. Sesquiterpenele aciclice cuprind izomeri ai nerolidolului si ai farnesolului. Sesquiterpenele ciclice pot fi mono-, bi- sau triciclice. Sesquiterpenele monociclice cuprind: acidul abscisic, α-bisabolen și derivați oxigenați ai acestora, α- și β-bisabolol. Sesquiterpenele biciclice cuprind: eudesmol, widdrol, guaiol și azulene. Sesquiterpenele triciclice sunt: cedren și santalol. 7

Terpenoidele sunt derivați oxigenați ai terpenelor, precum: alcooli, aldehide, cetone, acizi, fenoli, eteri și esteri. 8

Derivații fenilpropanici conțin un inel aromatic format din șase atomi de carbon și o catenă laterală alcătuită din trei atomi de carbon. Fenilpropanoidele sunt sintetizate pe calea acidului shikimic. Această cale de biosinteză are loc doar la microorganisme și plante, niciodată la animale. Din clasa de fenilpropanoide fac parte: eugenolul, metil-eugenolul, anetolul, carvicolul, estragolul (meil-carvicol), myristicinul și apiolul. 7

1.4. Biosinteza uleiurilor volatile

În speciile de plante aromatice, biosinteza ueliurilor volatile are loc prin două căi biochimice complexe care implică diferite reacții enzimatice. Calea acidului mevalonic (MVA) se desfășoară în citosol pentru biosinteza IPP din acetil-coenzima A (CoA). Calea 2-C-metileritritol-4-fosfat (MEP), numită și calea 1-deoxi-D-xilulozo-5-fosfatului (DXP), se desfășoară în plastide pentru biosinteza IPP și DMAPP din gliceraldehid-3-fosfat și piruvat. Calea MVA este responsabilă și de biosinteza terpenoidelor în mitocondrie la plantele mai evoluate. 9

Structura de bază de la care pornește biosinteza uleiurilor volatile este izoprenul. Unitatea de izopren activată, izopentenil pirofosfat (IPP) și izomerul său dimetilalil pirofosfat (DMAPP) sunt precursorii universali ai tuturor terpenoidelor. Biosinteza terpenoidelor are loc sub acțiunea enzimei prenil difosfat sintetaza care realizează legarea cap-coadă a IPP cu DMAPP, pentru a forma prenil difosfat. Prenil difosfatul este un substrat pentru formarea geranil difosfatului (GPP, C10) sau fernesil difosfatului (FPP, C15) cu ajutorul enzimei terpen sintetaza (TPS). TPS este un grup mare de enzime responsabile de formarea terpenoidelor. 9

Sesquiterpenele și triterpenele se biosintetizează din FPP folosind ca precursor IPP citosolic. Mono-, di- și tetraterpenele sunt biosintetizate din geranil pirofosfat (GPP) și geranil-geranil difosfat (GGDP) folosind ca precursor IPP plastidic. 9

1.5. Stocarea uleiurilor volatile în plante

Uleiurile esențiale sunt biosintetizate, acumulate și stocate în structuri histologice specializate, numite glande secterotii. Există două tipuri de glande secretorii: cele localizate la suprafața plantei, cu secreție exogenă și cele localizate în interiorul plantei, în organele interne, cu secreție endogenă. Ele sunt, de asemenea, localizate în citoplasma unor celule secretorii, în unul sau mai multe organe ale plantei. 10

Țesuturi cu secreție exogenă:

– Papile epidermice: sunt celule epidermice conice care secretă esențe și se întâlnesc adesea în petalele florilor (ex. Rosa sp.) 10

– Peri glandulari (secretori): se dezvoltă din celulele epidermice. Ei sunt locul de biosinteză și acumulare a uleiurilor volatile și sunt caracteristici pentru familia Lamiaceae. Uleiul esențial sintetizat este acumulat într-un buzunar între celula secretoare și o cuticulă. Există mai multe tipuri de peri glandulari: sesili sau pedunculați. Cei din urmă pot fi: peltați, capitați, digitiformi. 10

Țesuturi cu secreție endogenă sunt: canale secretoare, buzunarele schizogene, celule cu secreție intracelulară 10

1.6. Localizarea uleiurilor volatile

Uleiurile volatile sunt localizate în diferite organe ale plantelor, precum: flori (iasomie, trandafir, violetă, lavandă), partea aeriană, muguri (cuișoare), frunze (cimbru, eucalipt, salvie), fructe (anason, anason stelat), crenguțe, scoarță (scorțișoară), coajă (citrice), semințe (cardamom), lemn (santal), rizomi și rădăcini (ghimbir). 10

1.7. Răspândirea uleiurilor volatile

Dintre familiile de plante, doar familiile Apiaceae (Umbelliferae), Asteraceae (Compositae), Cupressaceae, Hypericaceae, Lamiaceae, Lauraceae, Fabaceae, Liliaceae, Myrtaceae, Pinaceae, Piperaceae, Rosaceae, Rutaceae, Santalaceae, Zingiberaceae și Zygophyllaceae cuprid plante care conțin uleiuri volatile. 7

1.8. Metode de obținere a uleiurilor volatile

Există două categorii de metode de extracție a uleiurilor volatile: metode convenționale/ clasice și metode inovative. Metodele convenționale/ clasice se bazează pe distilarea apei prin încălzire pentru extragerea uleiurile volatile din plante. Metodele inovative sunt procese de extracție mult mai eficiente (reducerea timpului de extracție și a energiei consumate, creșterea randamentului de extracție și îmbunătățirea calității uleiurilor esențiale). 10

Metode convenționale/ clasice de extracție a uleiurilor volatile

1. Hidrodistilarea este cea mai simplă și cea mai veche metodă de extracție a uleiurilor volatile. Principiul hidrodistilării are la bază imersarea materiei prime (planta) în apă, în interiorul alambicului și fierberea compoziției. Aparatul de extracție (Figura 1.1) cuprinde o sursă de căldură peste care se află un vas (alambic) în care se pune materia primă și apa. Instalația mai conține un condensator și un decantor pentru a colecta și separa uleiul esențial de apă. Hidrodistilarea are unele dezavantaje: timp lung de extracție, artefacte și molecule terpenice modificate chimic prin contactul prelungit cu apa fierbinte (hidroliză, ciclizare, etc.) și supraîncălzirea și pierderea unor molecule polare în apa de extracție. 10

Figura 1.1. Schema aparatului folosit la hidrodistilare 11

2. Antrenarea cu vapori de apă este o metodă larg utilizată pentru extracția uleiurilor esențiale. Este bazată pe același principiu ca hidrodistilarea, cu diferența că nu există un contact direct între plantă și apă. (Figura 1.2) Durata extracției este mai scurtă, reducând astfel alterările chimice. 10

Figura 1.2. Schema aparatului folosit la antrenarea cu vapori de apă 11

Există mai multe variante de distilare cu vapori de apă:

Hidrodistilarea cu vapori se realizează tot în alambic, cu diferența că planta este suspendată pe o placă perforată sau pe un grătar deasupra apei și astfel se evită contactul direct dintre plantă și apă. Extracția se face prin injectarea vaporilor de apă care traversează planta de jos în sus și transportă materiile volatile. 10

Distilarea cu vapori (distilarea cu aburi) are același principiu ca hidrodistilarea cu vapori, cu diferența că generatorul de vapori se găsește în afara alambicului. Aburul poate fi saturat sau supraîncălzit; la puțin peste presiunea atmosferică, aburul este introdus prin partea inferioară a vasului în care se realizează extracția și apoi trece prin materia primă (planta). 10

Hidrodifuziunea este un caz particular de distilare cu vapori, în care fluxul de vapori are loc în jos. 10

3. Extracția cu solvent organic. (Figura 1.3.) Materia primă (planta) este macerată într-un solvent organic. Această metodă evită alterările și artefactele chimice, deoarece extracția are loc la rece. Extractele obținute cu solvenți organici conțin reziduuri care poluează mâncarea și parfumurile în care sunt adăugate, fapt ce compromite siguranța produselor extrase prin această tehnică. Prin urmare, este imposibilă folosirea lor pentru alimente sau produse farmaceutice. 10

Firuga 1.3. Extracția cu solvet organic 11

4. Extracția cu aparatul Soxhlet (Figura 1.4.) presupune contactul dintre un lichid și un solid pentru extragerea compușilor din faza solidă prin dizolvare în lichid. Aparatul Soxhlet conține o cavitate în care este plasată faza solidă (planta) care este umectată de către vaporii fazei lichide proveniți dintr-un flacon de distilare. Cavitatea este prevăzută cu un sifon care determină reîntoarcerea solventului în flaconul de distilare după atingerea unui anumit nivel. 11

Figura 1.4. Aparatul Soxhlet 11

5. Presarea la rece (Figura 1.4.) este metoda tradițională de extragere a uleiurilor esențiale. În timpul extracției, pungile de ulei se sparg și eliberează uleiurile volatile care se află în partea externă a mezocarpului. Acest ulei este îndepărtat mecanic prin presare la rece dând o emulsie apoasă. Uleiul este recuperat ulterior prin centrifugare. 10

Metode inovative de extracție a uleiurilor volatile

1. Extracția cu fluide în stare supercritică

Pentru fluide, starea supercritică este obținută în condiții bine definite: presiune critică (Pc) și temperatură critică (Tc). În această stare, fluidele capătă niște proprietăți interesante: vâscozitate scăzută, difuziune crescută, densitate apropiată de cea a lichidelor. 10 Dioxidul de carbon este cel mai folosit fluid pentru acest tip de extracție, datorită următoarelor avantaje: atingerea stării superctitice se face cu ușurință, este neinflamabil, inert și ieftin. 12 Extracția cu fluide în stare supercritică se bazează pe folosirea și reciclarea fluidului (CO2) în mod repetat prin compresie/extensie. Prin compresie puternică și încălzire, CO2 atinge starea supercritică. El trece prin materia primă (plantă) și se încarcă cu materiile volatile și extractele din plantă. Această etapă este urmată de extensie: extractul este direcționat spre unul sau mai multe separatoare, unde CO2 este decomprimat treptat (pierzând astfel proprietatea de solvent) pentru separarea extractului de fluid. Fluidul poate fi eliberat sub formă de gaz și apoi reciclat. 10

2. Extracția uleiurilor volatile cu ultrasunete facilitează extracția uleiurilor volatile prin accelerarea eliberării lor din materiile prime vegetale, atunci când sunt folosite în combinație cu alte tehnici (hidrodistilare sau extracție cu solvenți). Această tehnică induce vibrații mecanice asupra pereților și membranelor din plantă, producând eliberarea rapidă a uleiurilor volatile. 10

3. Extracția asistată cu microunde

Extracția asistată cu microunde fără solvent are loc la presiune atmosferică, folosind planta proaspătă și fără adaos de apă sau solvent. Încălzirea conținutului de apă din plantă, face ca țesuturile să se umfle, ceea ce duce la spargerea glandelor cu uleiuri volatile. Astfel, uleiurile volatile sunt eliberate și se evaporă spontan prin distilare azeotropică în prezența apei din plantă. 10

Hidrodifuziunea cu microunde sub acțiunea gravității este o tehnică ce combină căldura produsă de microunde cu forța de atracție a Pământrului, la presiune atmosferică. 11 Materia primă vegetală este pusă într-un reactor (așezat cu capul în jos) încâlzit cu microunde, fără să se adauge apă sau alt solvent. Prin încălzirea apei din interiorul plantei se produce umflarea și ruperea celulelor, cu eliberarea uleiurilor volatile. Sub acțiunea gravitației, extractul obținut este condus din reactor spre un sistem de răcire. 10

1.9. Aplicații ale uleiurilor volatile

Uleiurile volatile au o aplicabilitate extinsă, ele fiind utilizate în medicină datorită activităților terapeutice. De asemenea, uleiurile volatile se mai utilizează în industria cosmetică, industria alimentară și în agricultură (pentru proprietățile insecticide și antimicrobiene). 7

Aromaterapia este un tip de medicină alternativă care folosește uleiurile volatile ca agenți terapeutici. Uleiurile volatile pot fi administrate în cantități mici prin inhalare sau aplicare topică și sunt foarte rar administrate intern. Administrate extern, uleiurile volatile pot reduce stresul. În medicina tradițională, uleiurile volatile se utilizează împotriva bolii Alzheimer, bolilor cardiovasculare, cancerului, durerii din timpul travaliului, etc. 13

Uleiurile volatile au fost studiate și din punct de vedere farmacologic. Printre acțiunile farmacologice ale uleiurilor esențiale se numără: acțiunea antibacteriană, acțiunea antifungică, acțiunea antivirală, acțiunea antiinflamatoare, acțiune antitumorală, acțiunea antioxidantă, acțiune antispasmodică, acțiune hormonală. 13

Acțiunea antibacteriană a uleiurilor volatile a fost studiată asupra unor specii bacteriene gram-pozitive și gram-negative. Numeroase studii au un rezultat promițător, ceea ce face ca uleiurile volatile să poată fi folosite ca alternative ale antibioticelor. De exemplu, uleiul din semințe de mărar este activ împotriva bacteriilor intestinale dăunătoare, inclusiv Escherichia coli. Rezultatul studiului arată faptul că uleiul volatil obținut din semințe de mărar are efect antimicrobian comparativ cu cel al penicilinei G, cloramfenicolului, oxitetraciclinei și gentamicinei. 14 Într-un alt studiu, uleiului esențial de cimbru a prezentat zona de inhibiție a creșterii B.cereus similară cu dimensiunile obținute în cazul gentamicinei. 15

Mecanismul acțiunii antibacteriene a uleiurilor volatile este datorat compușilor fenolici. O caracteristică unică a uleiurilor volatile o reprezintă hidrofobicitatea, ceea ce le face capabile de a reacționa cu lipidele membranei celulare bacteriene. Acest lucru duce la creșterea permeabilității membranei bacteriene, perturbarea structurii celulare și a homeostaziei. Atunci când o cantitate substanțială din conținutul celulei este eliberat, celulele bacteriene sunt suscenptibile la fenomenul de moarte celulară. Prin urmare, membrana celulară bacteriană este principala țintă a uleiurilor volatile. Atât partea hidrofilă, cât și cea hidrofobă a fenolilor contribuie la acțiunea antimicrobiană. Partea hidrofilă interacționează cu partea polară a membranei, iar cea hidrofobă interacționează cu partea hidrofobă din interiorul membranei. Pe măsură ce mambrana celulară este distrusă, apar modificări aspura pH-ului, echilibrului ionic, sintezei acizilor nucleici și rezervelor de ATP. 16

Uleiul esențial de Foeniculi vulgare a dovedit o activitate antifungică semnificativă împotriva degradărilor alimentelor produse de Aspergillus niger. Astfel, uleiul esențial de fenicul poate avea aplicabilitate ca aditiv în produsele alimentare. 17 De asemenea, s-a demonstrat inducerea apoptozei folosind uleiul esențial extras din semințe de mărar în cazul Candida albicans. 18

Acțiunea antifungică a uleiurilor volatile se datorează unei leziuni în membrana celulară prin reducerea cantității de ergosterol. Ergosterolul este un component major al membranei celulare fungice, responsabil de integritatea și buna funcionare a acesteia. 16

Numeroase studii au evidențiat efectele antibacteriene ale uleiurilor volatile, chiar și asupra bacteriilor multi-rezistente. Mai mult decât atât, uleiurile volatile au fost folosite împotriva infecțiilor nosocomiale, pentru dezinfectarea echipamentului medicale și a suprafețelor sau ca aerosol în blocurile operatorii și în camerele de așteptare pentru curățarea aerului și limitarea contaminărilor. De asemenea, ele oferă o senzație plăcută și confort psihic pacienților datorită mirosului plăcut. Datorită compoziției chimice complexe, adesea conțin peste 100 de compuși terpenici diferiți, uleiurile esențiale au un spectru antimicrobian larg. 10

În domeniul farmaceutic, uleiurile volatile sunt incluse în compoziția multor forme farmaceutice (capsule, unguente, creme, siropuri, supozitoare, aerosoli și spray-uri). 10

În industria cosmetică, uleiurile volatile se utilizează pentru obținerea de parfumuri, detergenți, săpunuri, șampoane, etc. 19

Interesul industriei alimentare pentru uleiurile volatile este în creștere datorită importanței lor în conservarea alimentelor, inovației în ambalarea alimentelor și lupta impotriva patogenilor care determină intoxicații alimentare periculoase (Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Clostridium perfringens, Pseudomonas putida și Staphylococcus aureus). 10

1.10. Toxicitatea uleiurilor volatile

Uleiurile volatile, fiind poduse naturale, sunt în general considerate sigure pentru sanănătatea umană. Totuși, unii compuși din compoziția uleiurilor volatile pot prezenta anumite riscuri. Din cauza faptului că uleiurile volatile conțin foarte mulți compuși diferiți este greu de determinat care dintre acești compuși prezintă risc de toxicitate. S-au raportat foarte puține cazuri de toxicitate cauzate de uleiurile volatile, iar din acest motiv ele sunt considerate, în general, sigure. 20

Aplicate topic, uleiurile volatile pot produce iritații, alergii și fototoxicitate. 21 Responsabili de iritații sunt compușii fenolici de tipul: timol, carvacrol sau aldehidele aromatice (aldehida cinamică). Alergiile pot să apară în urma adiministrării topice de uleiuri volatile daca există o hipersensibilitate. Alergiile apar mai ales la persoanele care prezintă afecțiuni alergice de tipul astmului bronșic, eczemă sau febra fânului. Uleiurile de melisa, ienupăr, mușețel, etc pot provoca alergii. Fototoxicitatea poate să apară în cazul folosirii unor uleiuri volatile care conțin furanocumarine. Cele mai răspândite furanocumarine sunt bergaptenul și psoralenul, care sub acțiunea radiației solare determină pigmentare sau chiar arsuri solare. Uleiurile volatile pot provoca arsuri chimice (exemplu: uleiul volatil de mentă). 20

Toxicitatea după administrarea orală se poate manifesta prin senzație de arsură în gură și în gât, vomă, durere abdominală. Foarte rar s-au raportat reacții de nefrotoxicitate, neurotoxicitate, hepatotoxicitate. Toate aceste reacții sunt doză-dependente. 20

2. Partea specială

2.1. Introducere

Uleiurile volatile sunt cunoscute încă din Antichitate datorită proprietăților lor terapeutice. [3] Dintre activitățile bilogice ale uleiurilor volatile fac parte: activitatea antibacteriană, activitatea antifungică și activitatea antioxidantă. [22] Interesul industriei alimentare și al industriei farmaceutice în ceea ce privește uleiurile volatile este în continuă creștere. Datorită proprietăților antimicrobiene și antioxidante, uleiurile volatile pot fi utilizate în conservarea alimentelor, înlocuind conservanții sintetici. Astfel se pot preveni intoxicațiile alimetare provocate de diverși agenți patogeni. [23] Acțiunea antimicrobiană a uleiurilor volatile este exploatată și pentru combaterea problemelor de rezistență bacteriană la antibiotice. [24] Radicalii liberi se formează inevitabil în orice sistem biologic și sunt incriminați de producerea numeroaselor boli degenerative, precum mutageneza, carcinogeneza, tulburările cardiovasculare și îmbătrânirea. Antioxidanții sunt substanțe care contracarează acțiunea redicalilor liberi. 25

Motivația studiului este reprezentată de dorința de aprofundare a cunoștințelor cu privire la activitatea antimicrobiană și antioxidantă a uleiurilor volatile, precum și contribuția în combaterea rezistenței bacteriene la antibiotice prin folosirea compușilor de origine naturală. Problema rezistenței bacteriene este una de actualitate și de mare interes pentru sănătatea publică.

Lucrarea de licență are ca scop izolarea unor uleiuri volatile din plante aromatice, precum și investigarea proprietăților antimicrobiene și antioxidante ale acestora.

S-au luat în studiu șase uleiuri volatile: uleiul volatil de busuioc (Ocimum basilicum), uleiul volatil de cimbru (Thymus vulgaris), uleirul volatil de fenicul (Foeniculum vulgare), uleiul volatil de leuștean (Levisticum officinale), uleiul volatil de măghiran (Origanum majorana sin. Majorana hortensis) și uleiul volatil de mărar (Anethum graveolens). Testarea susceptibilității antimicrobiene a uleiurilor volatile s-a efectuat asupra unor specii bacteriene gram-negative (Escherichia coli, Salmonella anatum, Salmonella thyphimurium), respectiv gram-pozitive (Staphylococcus aureus, Bacillus cereus) și fungice (Aspergillus niger, Candida albicans). Activitatea antioxidantă a uleiurilor volatile extrase s-a pus în evidență prin testul DPPH.

2.2. Material și metodă

2.2.1. Materia primă vegelală

Materia primă vegetală este reprezentată de părțile aeriane ale plantelor de busuioc (Ocimum basilicum), cimbru (Thymus vulgaris), leuștean (Levisticum officinale) și măghiran (Majorana hortensis), semințele de mărar (Anethum graveolens) și semințele de fenicul (Foeniculum vulgare). Părțile aeriene de cimbru au fost recotate din aria locală a județului Sibiu și supuse uscării la umbră. Părțile aeriene uscate de busuioc, leuștean, măghiran, semințele de mărar și semințele de fenicul au fost achiziționate dintr-un magazin local. Produsele vegetale astfel obținute au fost folosite pentru extracția uleiurilor volatile.

Ocimum basilicum – busuiocul (Figura 2.1.) este o plantă din familia Lamiaceae. 26 Busuiocul este o plantă ierboasă, ramificată și glabră. Are o înalțimea între 0,6-0,9 m. Tulpinile sunt verzi. Frunzele ovate conțin pe fața inferioară numeroase glande secretoare de ulei volatil. Florile sunt mici, albe, roz sau purpurii. Fructul este reprezentat de 4 achene. 27

Figura 2.1. Ocimum basilicum – busuiocul 28

Pentru determinarea calitativă și cantitativă a compușilor din uleiul volatil de busuioc se folosește cromatografia de gaze cuplată cu spectrometria de masă și cromatografia de gaze cu detecție cu ionizare în flacără. În literatură se găsesc numeroase studii care descriu aceste metode. 26, 29, 30 Compoziția uleiului volatil de busuioc variază în funcție de condițiile în care s-a realizat metoda, dar și de factorii geografici și de mediu. Astfel, Elansary et al au identificat următorii compuși: metil chavicol (38,7%), linalool (29,1%), cineol (9,1%), -bergamoten (5%) și -cadinol (2,3%). 26 Piras et al au identificat: linalool (35,1%), eugenol (20,7%) și 1,8-cineol (9,9%). 29 În studiul condus de Ladwani et al sunt analizate uleiuri volatile de busuioc obținute de la plante din difertie orașe ale Regatului Arabiei Saudite. Rezultatele studiului arată că -linaloolul, metil charvicolul, metil eugenolul, metil cinamatul, trans-metil cinamatul, eugenolul, 1,8-cineol sunt cei mai abundenți compuși din uleiul volatil de busuioc. 30

Printre efectele uleiului esențiale de busuioc se numără: efectul antioxidant (datorat în mare parte conținutului de eugenol) și efectul antibacterian (asupra E. coli și S. aureus). Principalul constituent care dă acțiunea antimicrobiană este eugenolul. 31 Uleiul volatil de busuioc s-a dovedit a fi benefic pentru ameliorarea oboselii mentale, a răcelii, a spasmului, a rinitelor și pentru tratarea înțepăturilor de viespi și a mușcăturilor de șarpe. 27 Referitor la toxicitate, uleiul esențial de busuioc, din cauza conținutului de metil-eugenol și estragol, prezintă risc citotoxic și carcinogen. 32

Thymus vulgaris – cimbrul (Figura 2.2.) face parte din familia Lamiaceae. Cimbrul are o durată de viață de aproximativ 10-15 ani. Tulpinile devin lemnoase odată cu trecerea timpului. Planta poate atinge înalțimea de 25 cm. Tulpina și ramurile sunt cvadrangulare. Frunzele sunt sesile, ovale sau oblongate. Florile albe, galbene sau purpuii sunt grupate în inflorescențe. Semințele sunt rotunde și foarte mici. 33

Figura 2.2. Thymus vulgaris – cimbrul 34

Metodele de analiză a compoziției chimice a uleiului esențial de Thymus vulgaris descrise în literatura de specialitate sunt: cromatografia de gaze cuplată cu spectrometria de masă folosind detecție cu ionizare în flacără 35, 36, 37.

Compoziția chimică a uleiului volatil de cimbru variază mult. Nikolic et al au identificat timolul (49,1%) ca fiind principalul constituent al uleiului esențail de Thymus vulgaris. De asemenea, s-au mai identificat p-cimen (20%) și alți compuși în concentrații mai mici. 35 Un grup de cercetători români a identificat timolul (47,59%), -terpinenul (30,90%) și p-cimenul (8-41%) ca fiind principalii constituenți ai uleiului esențial de cimbru. 38

Speciile de plante aromatice din genul Thymus au importanță în medicină, fiind recomandate pentru proprietățile terapeutice ale uleiului volatil pe care îl conțin. Uleiul esențial de cimbru are următoarele acțiuni: antireumatică, antiseptică, antispasmodică, antimicrobiană, carminativă, diuretică și expectorantă. Uleiul volatil de cimbru mai este folosit și pentru stimularea sistemului imunitar, ajutând în lupta cu răceala și gripa, frisoanele și bolile infecțioase. Uleiul de cimbru mai este indicat ca antiseptic urinar în cistite și uretrite. Este folosit des în medicina populară pentru tratarea diferitelor boli gastrointestinale, bronhopulmonare, dar și pentru proprietățile antihelmintice, sedative și diaforetice. Uleiul volatil de cimbru are efecte antihelmintice și antioxidante. Corelația între activitatea antimicrobiană și compoziția chimică a uleiurilor esențiale de cimbru insinuează asocierea compusului fenolic timol cu acțiunea antimicrobiană a uleiurilor esențaile. 35

Thymus vulgaris este încadrat de către FDA ca fiind o plantă sigură pentru consumul uman. Uleiul de cimbru trebuie păstrat pentru aplicarea topică. La administrarea internă, pot apărea: amețeală, vărsături și dificultăți de respirație. Trebuie să fie restrictionată administrarea cimbrului în caz de hipertensiune arterială. 33

Feniculum vulgare – feniculul (Figura 2.3.) este o plantă medicinală și aromatică aparținând familiei Apiaceae (Umbelliferaceae). 39 Planta crește până la o înălțime de 2,5 m. Tulpinile sunt goale. Frunzele cresc până la 40 cm în lungime; ele sunt fin divizate în segmente filiforme de 0,5 mm lățime. Florile galbene sunt grupate în umbele. Fructul este o sămânță uscată de 4-10 mm lungime. 40

Figura 2.3. Feniculum vulgare – feniculul 41

Analiza calitativă și cantitativă a uleiurilor esențaile se poate efectua prin GC-MS 39 sau prin GC-FID. 42 Feniculul este bine cunoscut pentru uleiurile volatile pe care le conține. Uleiul volatil de fenicul este caracterizat de prezența unor componente majore, precum: trans-anetol, fenconă, metil carvicol, eugenol, limonen, p-anisaldehidă, -felandren, -pinen, 1,8-cineol, -terpinen și p-cimen. În concentrații mai mici s-au identificat: 3-metilbutanol, linalool, -pinen, camfor, cis-anetol, timol. 41

Uleiul esențial extras din fructe de Feniculum vulgare este utilizat pentru: inducerea menstruației și a lactației, stimularea motilității gastrointestinale, reducerea acumulării de gaze intestinale, îmbunătățirea vederii, ameliorarea tusei productive, diminuarea spasmelor, reducerea stresului. 43 Diferite studii clinice au pus în evidență efectele antibacteriene, antifungice, antitrombotice, antioxidante, antiinflamatoare, estrogenice, antidiabetice, gastro- și hepato-protective.

În ceea ce privește siguranța medicamentelor și a plantelor medicinale, acestea trebuie să fie lipsite de efecte cancerigene, mutagene sau teratogene. Estragolul, un component major al F. vulgare, stârnește controverse din cauza similitudinii structurale cu metileugenolul, un compus recent incriminat de efect carcinogen. S-a raportat că estragolul este asociat cu dezvoltarea tumorilor maligne la rozătoare, dar potențialul estragolului de a induce carcinogeneză la om rămâne neclar. Estragolul are efect carcinogen indirect. Carcinogeneza este posibilă prin activarea metabolică a estragoluli, care duce la formarea unor molecule instabile și radicali activi care formează aducți cu acizii nucleici, ceea ce duce la distrugerea ADN-ului. 40

Levisticum officinale – leușteanul (Figura 2.4.) este o plantă aromatică perenă, înaltă, robustă aparținând familiei Apiaceae. Leușteanul este o plantă cu înalțimea între 1,8-2,5 m, cu frunzele dispuse bazal în rozetă și câteva frunze pe tulpină. Florile sunt grupate în umbele la vârful tulpinii. Tulpinile și frunzele sunt glabre, luciase, de culoare verde sau galben-verzuie și cu miros de lămâie când sunt zdrobite. Frunzele bazale sunt mari, cu o lungime de 70 cm, tripenate, cu marginile zimțate. Frunzele de pe tulpină sunt mai mici și mai puțin divizate. Florile sunt galbene sau verzi-gălbui, cu un diametru de 2-3 mm și sunt grupate în umbele de 10-15 cm în diametru. Fructele, care ajung mature toamna (septembrie), sunt mici, de formă eliptică și curbate, de culoare galben-brună și foarte aromatice. 44

Figura 2.4. Levisticum officinale – leușteanul 45

Compușii din uleiul esențial de leuștean se pot identifica prin cromatografie gazoasă cuplată cu spectrometrie de masă. În compozia uleiului volatil predomină: terpenele, ftalidele, -felandrenul, acetatul de -terpenil și Z-ligustilida. 44

Uleiurile esențiale din frunze, rădăcini și semințe de leuștean sunt folosite în alimnete, băuturi, parfumerie și în industiria tutuului. 43 Uleiul esențial din semințe de leuștean are efect antibacterian împotriva bacteriilor gram-pozitive și gram-negative, precum Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa și Klebsiella pneumoniae. În ultimul timp s-au studiat proprietățile unor compuși din leuștean. Butilftalida și ligustilida au acțiuni antispasmodice și antiastmatice. Ftalidele au acțiune sedativă la șoareci, iar unele cumarine au efecte fototoxice la oameni, dar sunt utile în tratamentul psoriazisului. Uleiul esențial de leuștean are un puternic efect diuretic la șoareci și iepuri. Persoanele care suferă de afecțiuni renale nu trebuie să folosesască această plantă care din cauza efectului iritant, în doze mari poate să producă leziuni renale. 46

Origanum majorana sin. Majorana hortensis – măghiranul (Figura 2.5.) face parte din familia Lamiaceae. Este o plantă perenă care crește până la 30 cm înălțime. Ramurile măgiranului au patru laturi. Frunzele sunt mici, ovale, de culoare verde-gri. Florile albe, roz 47 sau liliachii sunt mici și grupate în inflorescențe. Fructul este constituit din patru nucule netede. 48

Figura 2.5. Origanum majorana sin. Majorana hortensis – măghiranul 47

Analiza uleiului volatil de măghiran se poate face prin cromatografie de gaze cuplată cu spectrometrie de masă. Componentele predominante din uleiul esențial de măghiran sunt: Z-sabinen hidrat (31,81%), terpinen-4-ol (22,02%), E-sabinen hidrat (9,16%), -terpineol (3,56%), p-cimen (5,15%) și sabinen (6,73%). Alți constituenți importanți identificați în uleiul de măghiran sunt: linalool (1,84%), -mircen (1,77%), -cariofilen (1,41%), limonen (1,30%), geraniol (1,13%) și -terpinen (1,09%). 49

1.8.4. Utilizările uleiului esențial de Origanum majorana

Uleiul de măghiran este folosit în parfumuri, săpunuri și detergenți, datorită notelor sale aromatice. De asemenea, uleiul de măghiran are proprietăți stomahice, antiseptice, sedative și se folosește în tratarea insomniei, reumatismului, migrenei, dismenoreei și diareei.

Uleiul esențial de măghiran prezintă acțiune antioxidantă moderată.

Rezultatele obținute în urma testării activității antimicrobiene a uleiuli estențial de măghiran au fost acealeași ca și în cazul gentamicinei și amfotericinei B. M. luteus și Candida albicans au fost cele mai sensibile microorganisme la acțiunea uleiului volatil de măghiran.

Datorită conținutului de terpinen-4-ol, uleiul de măghiran prezintă acțiune citotoxică. Terpinen-4-ol a dovedit acțiune antitumorală puternică împotriva cancetului de sân, cancerului de colon, celulelor canceroase gastrice și a liniilor celulare canceroase de la nivelul plămânilor, ovarelor și a laringelui.

Unele studii au evaluat acțiunea inhibitoare a uleiului de măghiran asupra acetilcolinesterazei, enzima responsabilă de biotransformarea acetilcolinei. Rezultatele au dovedit o acțiune inhibitoare mai puternică decât în cazul galantaminei. Aceste descoperiri explică abilitatea uleiului volatil de măghiran de îmbunătățire a memoriei și de ameliorare a simptomelor asociate bolii Alzheimer.

Uleiul de măghiran s-a raportat a fi lipsit de toxicitate, neiritant și nesensibilizant, dar se recomandă evitarea lui în timpul sarcinii. 50

Anethum graveolens L. – mărarul (Figura 2.6.) este o plană anuală din familia Apiaceae. 51 Mărarul atinge, de obicei, o înălțime de până la 40-120 cm. Are o tulpină cilindrică, subțire, goală, cu câteva ramuri. Pe tulpinile ramificate sunt dispuse frunze lucioase, albastre-verzi, alterne, multipenate. Florile mici, galbene, lipsite de sepale sunt grupate în inflorescențe numite umbele, care pot atinge 5-15 cm. Fructul brun este o achenă. 52

Figura 2.6. Anethum graveolens L. – mărarul 52

Se găsesc numeroase studii cu privire la compoziția uleiurilor esențiale extrase din frunze, flori și semințe de Anethum graveolens L.. Componentele majore ale uleiului sunt carvona, limonenul, dihidrocarvona, carvacrolul, p-cimenul, -felandrenul și apiolul. Rezultatele obținute în urma diferitelor studii nu corespund în totalitate. Aceste diferențe de compoziție ale uleiurilor esențiale depind de anotimp, climă, momentul recoltării, etc. 52

Uleiul esențial de mărar are activitate antifungică asupra Aspergillus flavus. Alți cercetători au dovedit efectul antimicrobian al uleiului extars din semințe de mărar asupra Staphylococcus aureus, E.coli, Bacillus subtilis și Salmonella typhi. 52 Uleiul esențial extras din semințe de mărar poate induce apoptoza în cazul Candida albicans. 53 . Uleiul estențial de mărar alină durerea, stimulează apetitul, reduce flatulența, stimulează digestia și previne ateroscleroza. 51

Efectele adverse sunt limitate, studiile au arătat că administrara de Anethum graveolens L. este sigură. Rar pot să apară reacții alergice, vărsături, diaree, prurit oral, urticarie a limbii, inflamarea gâtului; în plus, nu este recomandat în sarcină. 54

2.2.2. Izolarea uleiurilor volatile

Izolarea uleiurilor volatile de busuioc, cimbru, fenicul, leuștean, măghiran și mărar au fost extrase din produsele vegetale prin hidrodistilare. Instalația de hidrodistilare (Figura 2.7) cuprinde o sursă de căldură, peste care se găsește un vas de distilare în care materia primă este imersată în apă, un condensator, un decantor și un vas de colectare a uleiului volatil.

Figura 2.7. Instalația de hidrodistilare

Principiul hidrodistilării se bazează pe distilarea azeotropă. De fapt, la presiune atmosferică și în timpul procesului de extracție (la încălzire), apa și moleculele de ueliuri volatile formează un amestec heterogen care are punctul de fierbere sub 100ᴼC, în timp ce pentru componentele din uleiurile volatile punctul de fierbere este foarte ridicat. Amestecul ulei volatil/ apă este distilat simultan ca și când ar fi o singură componentă. Avantajul apei îl reprezintă faptul că este nemiscibilă cu majoritatea componentelor din uleiurile volatile. Astfel, în urma condensării, uleiurile volatile pot fi ușor separate de apă prin decantare. Sistemul Clevenger este recomandat de Ph. Eur. Ed. 3 pentru determinarea conținutului de ulei esențial. Hidrodistilarea are și unele dezavantaje: timp lung de extracție, artefacte și molecule terpenice modificate chimic prin contactul prelungit cu apa fierbinte (hidroliză, ciclizare, etc.) și supraîncălzirea și pierderea unor molecule polare în apa de extracție. 10

Pentru obținerea uleiurilor volatile din plantele aromatice luate în studiu s-au folosit:

62 g parte aeriană uscată de cimbru și 1,8 L apă, pentru uleiul volatil de cimbru;

217 g semințe de mărar și 2L apă, pentru uleiul volatil de mărar;

159,04 g parte aeriană uscată de leuștean și 2,6 L, pentru uleiul volatil de leștean;

105,02 g semințe de fenicul, pentru uleiul volatil de fenciul;

200 g parte aeriană de măghiran, pentru uleiul volatil de măghiran;

150 g parte aeriană de busuioc, pentru uleiul volatil de busuioc.

Uleiurile volatile astfel obținute au fost uscate pe sulfat de sodiu anhidru, iar apoi au fost depozitate la întuneric până în momentul utilizării lor în analizele efectuate. Randamentul extracției a fost calculat pentru fiecare ulei volatil în parte, cu ajutorul următoarei formule:

Bibliografie

Balouiri M, Sadiki M, Ibnsouda SK – Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review, Journal of Pharmaceutical Analysis, 2016, 6: 71-79.

Sakkas H, Papadopoulou C – Antimicrobial Activity of Basil, Oregano, and Thyme Essential Oils, Journal of Microbiology and Biotechnology, 2017, 27: 429-438.

Wu S, Patel KB, Booth LJ et al – Protective essential oil attenuates influenza virus infection: An in vitro study in MDCK cells, BMC Complementary and Alternative Medicine, 2010, 10: 69.

Bașer KHC, Buchbauer G – Handbook of Essential Oils Science, Technology, and Applications, Ediția a II-a, CRC Press, Boca Raton, 2016, 5-6.

European Pharmacopoeia Commission – European Pharmacopoeia, Ediția 7, Directorate for the Quality of Medicines & HealthCare of the Council of Europe, Strasbourg, France. 2010, 673.

Comisia Farmacopeei Române – Farmacopeea Română, Ediția a X-a, Editura Medicală, București, 1993, 97-98.

Thormar H – Lipids and Essential Oils as Antimicrobial Agents, John Wiley & Sons, Chichester, 2011, 204-223

Khayyat SA, Roselin LS – Recent progress in photochemical reaction on main components of some essential oils, Journal of Saudi Chemical Society, 2018, 22: 855-875.

Rehman R, Hanif MA, Mushtaq Z et al – Biosynthesis of essential oils in aromatic plants: A review, Food Reviews International, 2016, 32: 117-160.

El-Asbahani A, Miladi K, Badri W et al – Essential oils: From extraction to encapsulation, International Journal of Pharmaceutics, 2015, 483: 220-243.

Rassem HHA, Nour AH, Yunus RM – Techniques For Extraction of Essential Oils From Plants: A Review, Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 2016, 10: 117-127.

Meullemiestre A, Breil C, Abert-Vian M et al – Modern Techniques and Solvents for the Extraction of Microbial Oils, SpringerBriefs in Molecular Science, Jaipur, 2015, 29-30.

Ali B, Al-Wabel NA, Shams S et al – Essential oils used in aromatherapy: A systemic review, Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 2015, 5: 601-611.

Najaran ZT, Hassanzadeh MK, Nasery M et al – Essential Oils in Food Preservation, Flavor and Safety, 2016, 405-412.

Semeniuc CA, Pop CR, Rotar AM – Antibacterial activity and interactions of plant essential oil combinations against Gram-positive and Gram-negative bacteria, Journal Of Food And Drug Analysis, 2017, 25: 403-408.

Seow YX, Yeo CR, Chung HL et al – Plant Essential Oils as Active Antimicrobial Agents, Food Science and Nutrition, 2014, 54: 625-644.

Badgujar SB, Patel VV, Bandivdekar AH – Foeniculum vulgare Mill: A Review of Its Botany, Phytochemistry, Pharmacology, Contemporary Application, and Toxicology, BioMed Research International, 2014, 1-32.

Chen Y, Zeng H, Tian J et al – Dill (Anethum graveolens L.) seed essential oil induces Candida albicans apoptosis in a metacaspase-dependent manner, Fungal Biology, 2014, 118: 294-401.

Preedy VR – Essential Oils in Food Preservation, Flavor and Safety, Academic Press, Londra, 2016, 7-8.

Buckle J – Clinical Aromatherapy, ediția a III-a, Churchill Livingstone, Londra, 2015, 73-81.

Dreger M, Wielgus K – Application of essential oils as natural cosmetic preservatives, Herba Polonica, 2013, 59: 142-156.

Elshafie HS, Camele I – An Overview of the Biological Effects of Some Mediterranean Essential Oils on Human Health, BioMed Research International, 2017, 1-14.

Ebrahimi M, Khosravi-Darani K – Antimicrobials from Nature: Effective Control Agents for Drug Resistant Pathogens, ediția a I-a, Transworld Research Network, 2013, Kerala, 15-37.

Yap PSX, Yiap BC, Ping HC et al – Essential Oils, A New Horizon in Combating Bacterial Antibiotic Resistance, The Open Microbiology Journal, 2014, 8: 6-14.

Kedare SB, Singh RP – Genesis and development of DPPH method of antioxidant assay, Journal of Food Science and Technology, 2011, 48: 412–422.

Elansary HO, Yessoufou K, Shokralla S et al – Enhancing mint and basil oil composition and antibacterial activityusing seaweed extracts, Industrial Crops and Products, 2016, 92: 50-56.

Bilal A, Jahan N, Ahmed A et al – PHYTOCHEMICAL AND PHARMACOLOGICAL STUDIES ON OCIMUM BASILICUM LINN – A REVIEW, Int J Cur Res Rev, 2012, 04: 73-83.

Preedy VR – Essential Oils in Food Preservation, Flavor and Safety, Academic Press, Londra, 2016, 232.

Piras A, Gonçalves MJ, Alves J et al – Ocimum tenuiflorum L. and Ocimum basilicum L., two spices of Lamiaceae family with bioactive essential oils, Industrial Crops & Products, 2018, 113: 89-97.

Ladwani AMA, Salman M, Abdel HES – Chemical composition of Ocimum basilicum L. essential oil from different regions in the Kingdom of Saudi Arabia by using Gas chromatography mass spectrometer, Journal of Medicinal Plants Studies, 2018, 6: 14-19.

Koroch AR, Simon JE, Juliani HR – Essential oil composition of purple basils, their reverted green varieties (Ocimum basilicum) and their associated biological activity, Industrial Crops & Products, 2017, 107: 526-530.

Sakkas H, Papadopoulou C – Antimicrobial Activity of Basil, Oregano, and Thyme Essential Oils, Journal of Microbiology and Biotechnology, 2017, 27: 429-438.

Mandal S, DebMandal M – Essential Oils in Food Preservation, Flavor and Safety, 2016, 825-834.

Millan M, Rowe NP, Edelin C – Deciphering the growth form variation of the Mediterranean chamaephyte Thymus vulgaris L. using architectural traits and their relations with different habitats, Flora, 2019, 251: 1-10.

Nikolic M, Glamoclija J, Ferreira ICFR et al – Chemical composition, antimicrobial, antioxidant and antitumoractivity of Thymus serpyllum L., Thymus algeriensis Boiss. and Reut and Thymus vulgaris L. essential oils, Industrial Crops and Products, 2014, 52: 183-190.

Tohidi B, Rahimmalek M, Arzani A – Essential oil composition, total phenolic, flavonoid contents, and antioxidant activity of Thymus species collected from different regions of Iran, Food Chemistry, 2017, 220: 153-161.

Nezhadali A, Nabavi M, Rajabian M et al – Chemical variation of leaf essential oil at different stages of plant growth and in vitro antibacterial activity of Thymus vulgaris Lamiaceae, from Iran, Beni – Suef University Journal of Basic and Applied Sciences, 2014, 3: 87-92.

Borugă O, Jianu C, Mișcă C et al – Thymus vulgaris essential oil: chemical composition and antimicrobial activity, Journal of Medicine and Life, 2014, 7: 56-60.

Pavela R, Zabka M, Bednár J et al – New knowledge for yield, composition and insecticidal activity ofessential oils obtained from the aerial parts or seeds of fennel(Foeniculum vulgare Mill.), Industrial Crops and Products, 2016, 83: 275-282.

Rather MA, Dar BA, Sofi SN et al – Foeniculum vulgare: A comprehensive review of its traditional use, phytochemistry, pharmacology, and safety, Arabian Journal of Chemistry, 2016, 9: S1574-S1583.

He W, Huang B – A review of chemistry and bioactivities of a medicinal spice: Foeniculum vulgare, Journal of Medicinal Plants Research, 2011, 5: 3595-3600.

Cioanca O, Hancianu M, Mircea C et al – Essential oils from Apiaceae as valuable resources in neurologicaldisorders: Foeniculi vulgare aetheroleum, Industrial Crops and Products, 2016, 88: 51-57.

Mesfin M, Asres K, Shibeshi W – Evaluation of anxiolytic activity of the essential oil of the aerial part of Foeniculum vulgare Miller in mice, BMC Complementary and Alternative Medicine, 2014, 14: 310.

Venskutonis PR – Essential Oils in Food Preservation, Flavor and Safety, 2016, 539-549.

https://www.google.ro/search?q=leustean&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=0ahUKEwiW9_qT19veAhWNLFAKHWGWDXEQ_AUIDigB&biw=1366&bih=608#imgdii=bi4ugH0915jrCM:&imgrc=iBJ13wTdnN1kzM:

Mirjalili MH, Javanmardi J – Handbook of herbs and spices, 2006, 438-452.

Pimple BP, Patel AN, Kadam PV et al – Microscopic evaluation and physicochemical analysis of Origanum majorana Linn leaves, Asian Pacific Journal of Tropical Disease, 2012, S897-S903.

El-Moursi A, Talaat IM, Balbaa LK – Physiological effect of some antioxidant polyphenols on sweet marjoram (Majorana hortensis) plants, Nusantara Bioscience, 2012, 4: 11-15.

Verma RS, Sashidhara KV, Yadav A et al – Essential oil composition of Majorana hortensis (Moench) from subtropical India, Acta Pharmaceutica Sciencia, 2010, 52: 19-22.

Hajlaoui H, Mighri H, Aouni M et al – Chemical composition and in vitro evaluation of antioxidant, antimicrobial, cytotoxicity and anti-acetylcholinesterase properties of Tunisian Origanum majorana L. essential oil, Microb Pathog, 2016, 95: 86-94.

Sintim HY, Burkhardt A, Gawde A et al – Hydrodistillation time affects dill seed essential oil yield, composition, and bioactivity, Industrial Crops and Products, 2015, 63: 190-196.

Najaran ZT, Hassanzadeh MK, Nasery M et al – Essential Oils in Food Preservation, Flavor and Safety, 2016, 405-412.

Chen Y, Zeng H, Tian J et al – Dill (Anethum graveolens L.) seed essential oil induces Candida albicans apoptosis in a metacaspase-dependent manner, Fungal Biology, 2014, 118: 294-401.

Goodarzi MT, Khodadadi I, Tavilani H et al – The Role of Anethum graveolens L. (Dill) in the Management of Diabetes, Journal of Tropical Medicine, 2016, 1-11.