Introducere necesitatea clinică a utilizării tehnicilor de CGH [303018]

Introducere – necesitatea clinică a utilizării tehnicilor de CGH

Celulele eucariote sunt formate din două compartimente separate: citoplasmă și nucleu. Materialul genetic sau cromatina din interiorul nucleului este separat de componentele citoplasmei prin intermediul membranei nucleare. Cromatina este un material care se colorează intens fiind format din fibre pliate de cromatină. Este o structură complexă formată din aproximativ 60% proteine (histone), 35% acid deoxiribonucleic (ADN) și 5% acid ribonucleic (ARN).

Atunci când o celulă începe diviziunea fibrele pliate de cromatină se condensează pentru a forma cromozomi. Fibrele de cromatină sunt formate la rândul lor din complexe numite nucleosomi. [anonimizat]. Materialul genetic este compus din perechi de cromozomi de aceeași lungime numiți cromozomi omologi.

Etapele ciclului celular constau din diviziunea mitotică și interfază. Diviziunea mitotică este un proces care asigură transferarea exactă a copiilor ADN de la celula mamă la celula fiică. Interfaza este stadiul dintre două diviziuni mitotice succesive și este formată la rândul ei din trei faze: faza G1 (prima fază gap), faza S (de sinteză) și faza G2 (a doua fază gap). În faza G1, [anonimizat]. În a doua fază a interfazei, faza S, [anonimizat]. [anonimizat]-ului. În a doua fază gap (faza G2) celula se pregătește pentru următoarea diviziune celulară (mitoza). Celulele își cresc sinteza proteică necesară în timpul diviziunii celulare.

Diviziunea mitotică este o diviziune nucleară în care celulele eucariote își divid materialul genetic rezultând două seturi identice de cromozomi organizați în doi nuclei.

Diviziunea mitotică este formată din următoarele patru faze succesive: profaza, metafaza, anafaza și telofaza. În prima fază a mitozei, profaza, fibrele de cromatină a substanței genetice se condensează pentru a forma cromozomii. [anonimizat]. [anonimizat]. În metafază cromozomii apar atașați la fusul de diviziune și migrează către planul ecuatorial al celulei. Datorită bunei delimitări a cromozomilor, această etapă este cea mai potrivită pentru analiza cariotipului uman. La începutul anafazei cele două cromatide surori se separă una de cealaltă și acum fiecare cromatidă reprezintă un cromozom. La sfârșitul anafazei fiecare pol celular primește un set nou format de cromozomi. Fiecare set este format din același număr original de cromozomi care poartă același material genetic a celulei mamă. Telofaza începe în momentul în care fiecare grup de cromozomi ajunge la polul celular respectiv și încep refacerea nucleului. [anonimizat], iar cromozomii se alungesc și se transformă în fibre de cromatină.

În prezent există diverse metode utilizate pentru analiza cromozomilor și depistarea anomaliilor cromozomice. În funcție de scopul propus, cromozomii pot fi analizați atât în interfază cât și în timpul diviziunii. Studiul cromozomilor metafazici este facilitat de marcajul în benzi (G, R, C, T). Analiza cromozomii interfazici se poare realiza cu ajutorul hibridizării fluorescente in situ (FISH), FISH multicolor, cariotipare spectrală (SKY) și hibridizare genomică comparată (CGH).

1. Cariotip –definiție, istoric, principiul metodei, tehnici de colorare

Analiza cromozomilor este ajutată de construirea unui cariotip, o hartă în care cromozomii unei celule obținuți în timpul metafazei, sunt aliniați în perechi, în general de la cei mai mari la cei mai mici, având brațele mici orientate în sus. Constituția cromozomială a unui individ este referită ca fiind cariotipul ei/lui.

Numărul corect de cromozomi pentru om a fost identificat după aplicarea tehnicilor de citogenetică la culturi tisulare. Înainte de 1956, numărul cromozomilor umani la om s-a crezut a fi 48. Tijo și Levan (1956), analizând culturi de fibroblaști embrionici din plămâni umani, au găsit un număr constant de 46 de cromozomi. În același timp și independent, Ford și Hamerton (1956), folosind celule meiotice obținute din material biopsic testicular, au găsit doar 23 de perechi de cromozomi. Celule mitotice din aceleași specimene conțineau 46 de cromozomi. Aceste descoperiri marchează începutul citogeneticii umane moderne. Perioada de 15 ani dintre 1956 și 1971 a fost marcată de dezvoltarea unui sistem de nomenclatură standardizat care a devenit mai rafinat pe măsură ce identificarea cromozomilor a devenit mai precisă.

Un pas înainte decisiv pentru citogenetica umană a fost descoperirea tehnicilor de bandare cromozomială care relevă modele distincte și reproductibile ale benzilor cromozomiale. Aceste tehnici permit identificarea cu acuratețe a tuturor cromozomilor, recunoașterea rearanjamentelor structurale și identificarea punctelor de ruptură. Benzile cromozomiale au o mare importanță teoretică și practică. Au făcut posibile identificarea rapidă a unei game enorme de anomalii cariotipice și a condus la formarea unor hărți nomenclatoare cromozomiale detaliate.

1.a). Marcaj G

Bandarea G a fost descoperită accidental în timpul încercărilor de a îmbunătăți bandarea C. Benzile G sunt obținute atunci când cromozomii sunt pretratați cu o soluție salină la 60° C sau cu o enzimă proteolitică, cum ar fi tripsina, înaintea colorării cu Giemsa sau cu o colorație comparabilă care pune în evidență cromatina. Bandarea G aduce în general aceleași informații ca și bandarea Q (Fig. 1). Benzile care sunt fluorescente cu quinacrină se colorează intens cu colorație Giemsa (sunt G-închise), pe când regiunile Q șterse sunt G-deschise. Fiecare metodă are avantajele sale. Bandarea G este permanentă și prin urmare mai potrivită pentru munca de rutină decât efemera bandare Q. Prin oricare tehnică, câte 300 de benzi sunt ușor de distins în metafază (Conferința de la Paris: 1971[1972]) în genomul haploid și 850-1250 în prometafază și profază (ISCN, 1995).

1.b). Marcaj C

Bandarea C a fost descoperită accidental când au fost încălzite pentru a denatura ADN-ul în vederea realizării hibridizării în situ. Colorația Giemsa a cromozomilor a fost redusă considerabil, exceptând regiunile centromerice ale majorității cromozomilor și partea distală a cromozomului Y (Fig. 4). Bandarea C se poate efectua în multiple feluri. Cel mai comun este tratarea pentru scurt timp a cromozomilor cu acid apoi cu o substanță alcalină cum ar fi hidroxidul de bariu, anterior colorării cu Giemsa. Benzi C proeminente se găsesc pe cromozomii 1, 9 ,16 și porțiunea distală a lui Y (Fig. 1).

Benzile C variază considerabil în mărime în rândul populației. Cea mai mare variabilitate este demonstrată la nivelul sateliților și pe brațele scurte ale cromozomilor acrocentrici. Aceste variații sunt în general numite heteromorfisme, deoarece termenul de polimorfism este limitat de geneticieni la o variantă care se transmite ereditar și care are o frecevență de cel puțin 1% în populație. Heteromorfismele cromozomiale au fost folosite ca markeri în cartografierea genelor, testele de paternitate și în distingerea gemenilor monozigotici de cei dizigotici sau al părintelui care poartă trisomii sau triploidii. Acestea au ajutat la înțelegerea molelor hidatiforme și a originii diferitelor linii celulare în himere, inclusiv la persoane care au transplant de măduvă osoasă. Cu toate acestea, cele mai multe din aceste aplicații au fost suplinite de către metode mai precise de citogenetică moleculară.

Fig. 1. Cariotip prin bandare-C a unei celule XY.

1.c). Marcaj R și T

Bandarea inversă sau bandarea R (reverse banding) a fost descoperită de către Dutrillaux și Lejeune (1971). Tehnica lor implica pretratarea cu substanțe alcaline încălzite (80-90° C) urmată de colorația cu Giemsa sau cu fluorocromul acridin-oranj. După cum indică și numele, modelul bandării R este inversul modelului bandării Q sau G, cu alte cuvinte, benzile care sunt colorate intens prin bandare R sunt stinse prin bandare Q sau G și vice versa.

Bandarea R colorează capetele cromozomilor mai pronunțat și este adesea folositoare în studiul schimbărilor structurale care implică capetele cromozomilor și care ar putea rămâne nedetectate de bandarea Q sau G. O modificare a bandării R, numită bandare T, colorează în principal regiunile situate aproape de vârfurile cromozomilor (Dutrillaux, 1973).

Toate benzile G și R, fie că sunt fluorescente fie că se colorează puternic sau slab, conțin ADN și gene în abundență și toate benzile sunt numărate pentru a determina numărul total de benzi. Termenii de bandă G, R, T și C se referă în mod obișnuit la benzi care sunt colorate mai intens sau fluorescente în funcție de metoda particulară folosită.

2. Hibridizare fluorescentă in situ (FISH)

Citogenetica convențională permite identificarea schimbărilor ADN de dimensiuni mari (cel puțin 1 milion perechi de baze) care sunt vizibile pe un cromozom, fie că anomalia genetică este echilibrată sau nu. Reprezintă în continuare metoda preferată pentru multe tipuri de indicații de testare genetică, cum ar fi diagnosticul și prognosticul cancerului, istoric de avorturi spontane, dismorfologie neonatală, diagnostic prenatal și tulburări endocrinologice. Există limitări ale citogeneticii convenționale, dintre care una din ele este imposibilitatea de a vizualiza anomalii mici la microscop, mai mici de 1-5 milioane perechi de baze (pb), eliminând posibilitatea identificării anomaliilor genetice submicroscopice. Această limitare a condus la dezvoltarea de noi tehnologii, ce include hibridizarea fluorescentă in situ (FISH) care permite identificarea schimbărilor genetice mai mici și nu depinde de morfologia sau nivelul bandării cromozomiale. Această analiză utilizează markeri fluorescenți atașați la un segment mic de ADN, lung de sute până la mii de pb, care este specific regiunilor cromozomiale de interes. Hibridizarea fluorescentă in situ (FISH) este foarte folositoare pentru identificarea schimbărilor ADN pe cromozomul care este specific unei regiuni care determină boala, o regiune locus-specifică sau o parte a unui cromozom care este folosită pentru identificarea cromozomială, cum ar fi probele marcate centromerice, subtelomerice sau a cromozomului întreg. FISH este foarte utilă pentru identificarea delețiilor, duplicațiilor și rearanjărilor unor regiuni mici care determină boala unde pot fi făcute sonde ADN, sau pentru identificarea cromozomilor, atunci când prezența unui cromozom nu poate fi identificată prin analiza cromozomială standard. Analiza FISH prezintă de asemenea și limitări, datorită dimensiunii mici de ADN care suportă o probă pentru hibridizare. Altă limitare o reprezintă nevoia de a cunoaște care regiune a cromozomului cu care să probeze.

Hibridizarea fluorescentă in situ implică, de regulă, denaturarea unui fragment ADN clonat și marcarea sa cu un trasor fluorescent și hibridizarea sa la ADN denaturat în cromozomi metafazici fixați.

Bromodeoxiuracil, digoxigenin, dinitrofenol și alte subcategorii pot fi folosite pentru a marca probele de ADN, iar site-urile de hibridizare pot fi detectate de către anticorpi fluorescenți sau complexe enzimă-anticorp înalt specifice. Puterea și frumusețea acestor noi tehnici este reflectată de folosirea lor tot mai vastă și ilustrate în figurile 2 (a, b, c, d).

Fig. 2. Hibridizare fluorescentă in situ – tehnică utilizată în diagnosticul prenatal al aneuploidiilor cromosomiale cele mai frecvente: a). Se evidențiază trei semnale fluorescente pentru cromosomul 21 și două semnale fluorescente pentru cromosomul 13. b). Făt de sex feminin. c). Făt de sex feminin cu trisomie 18. d). Făt de sex masculin

Fig. 3. FISH metafazic cu utilizarea sondelor pentru sindromul VCF specifice cromosomului 22 (verde – sonda de control, roșu – sonda de investigat) a). test FISH negativ pentru VCF, b). test FISH pozitiv pentru VCF

Fragmente foarte lungi de ADN pot fi folosite ca probe pentru hibridizare după blocarea hibridizării repetărilor amestecate, astfelt reducând considerabil zgomotul de fundal generat de o astfel de hibridizare. Acest lucru este folositor deoarece probele lungi dau semnale fluorescente puternice care sunt ușor detectabile în microscopie fluorescentă. Rezultatele nu necesită o analiză statistică a distribuției semnalelor în cuprinsul genomului integral, deoarece fundalul este atât de scăzut încât, practic, fiecare semnal fluorescent contează (Fig. 3)

Camere digitale CCD (charge-coupled device) foarte sensibile și metode de achiziționare și procesare a datelor computer asistate permit detectarea de rutină chiar și a semnalelor fluorescente slabe. Cu ajutorul lor FISH poate detecta hibridizarea secvențelor scurte de 1 kb.

Probe pentru secvențe telomerice înalt repetitive (TTAGGG)n sunt cele mai frecvent utilizate în cele mai variate scopuri. Ele au fost folosite pentru a arăta că delețiile terminale aparente au fost stabilizate prin captura repetițiilor TTAGGG. Inversiile pericentrice pot fi detectate printr-o metodă fascinantă numită Chromosome Orientation and Direction FISH sau COD-FISH.

Fig. 4. Cromozomi în metafază (sus) și un cariotip (jos) după hibridizare in situ și detectarea probelor multiplex. Benzile roșii și verzi reprezintă regiuni care au hibridizat în fragmente într-o singură probă, iar benzile galbene reprezintă regiuni care au hibridizat egal în fragmente în ambele probe. Culorile amestecate apar datorită suprareprezentării fragmentelor dintr-un eșantion. Regiuni care eșuează în a hibridiza în fragmente din oricare eșantion prezintă fluorescență albastră DAPI.

Această metodă beneficiază de faptul că repetițiile telomerice (TTAGGG în lanțul bogat în guanină, CCCTAA în lanțul bogat în citozină) au aceeași orientare respectând capetele cromozomilor, la fel cum o fac și secvențele α-satelit centromerice. Celulele cresc pentru un ciclu în prezența BrdU (bromodeoxiuridina), acesta fiind încorporat în locul timinei în fiecare lanț nou replicat al ADN-ului. Lumina ultravioletă fragmentează selectiv ADN-ul BrdU substituit, iar exonucleaza III poate distruge pe urmă tot lanțul afectat, lăsând un singur lanț de ADN în fiecare cromatidă. Proba cu un singur lanț complementar cu un lanț de ADN centromeric sau telomeric va găsi astfel o secevență hibridizabilă (complementară) în una din cele două cromatide surori. Proba cu un singur lanț telomeric va hibridiza la brațul telomeric scurt al unei cromatide și la brațul lung telomeric al celeilalte cromatide; proba centromerică va hibridiza doar la una din aceste cromatide. Însă, dacă a avut loc o inversiune pericentrică, proba centromerică va hibridiza la cealaltă cromatidă.

3. FISH multicolor , cariotipare spectrală

Detectarea simultană a fiecărui cromozom într-un preparat cromozomial folosind fie FISH multicolor (M-FISH) fie cariotiparea spectrală (SKY) este de rutină. Aceste metode folosesc 24 de probe de colorare cromozomială și cinci fluorocromi într-o schemă de etichetare combinată care etichetează fiecare din cei 22 de autosomi și cromozomii X și Y separat. M-FISH necesită o serie de achiziții imagistice cu o schimbare a filtrelor optice, în timp ce SKY folosește spectroscopia Fourier și un interferometru pentru a evalua modele de emisie fluorescentă intr-o singură achiziție lungă a imaginii (Fig. 4). Nici una din metode nu detectează rearanjamente intracromozomiale cum ar fi delețiile, duplicații sau inversii, dar ele sunt foarte utile pentru a detecta alte schimbări structurale precum si numerice (Fig. 5). Folosind M-FISH cu probe de colorare cromozomială specifică pot fi detectate chiar și rearanjamente cromozomiale minore.

Fig. 5. (A) Bandare C parțială și cariotipare spectrală a tatălui unui copil cu retard mental, ce prezintă o transolcație criptică t(1;11). (B) Bandare G parțială a unui pacient ataxic, se notează materialul în plus pe cromozomul 11, cariotiparea spectrală arată originea sa de pe cromozomul 4. (C) Șase markeri cromozomiali de la o linie celulară de cancer mamar, cariotiparea spectrală arată cromozomii implicați în aceste rearanjări complexe.

4. Hibridizare genomică comparată

Hibridizarea genomică comparată (CGH) este o abordare a citogeneticii moleculare ce efectuează screening-ul întregului genom a diferențelor numărului de copii de la oricare secvență ADN al unui individ și care necesită doar câteva nanograme de ADN ca probe FISH.

CGH a fost introdusă pentru a identifica alterări segmentare cromozomiale în celule tumorale solide fără a fi necesară prepararea celulelor canceroase în metafază după realizarea culturii.

Fig. 6. Analiza schimbărilor cromozomiale într-un cancer mamar prin hibridizare genomică comparată (CGH). Regiunile care apar verzi reprezintă câștiguri de ADN și amplificări în tumoră (de ex. 8q, 14, 17q22-q24 și 20q). Regiunile care apar roșii reprezintă pierderi de ADN și deleții (de ex. 1p21-p31, 8p, 11q14-qter și 116q12-q21).

Cantități egale de ADN marcate diferit de la individul de testat (verde) și ADN de referință (roșu) sunt cohibridizate la frotiuri metafazice normale. Diferențe ale numărului de copii apar ca și alterări ale proporției intensității fluorescente verde-roșu (Fig. 6). Această proporție este calculată de-alungul fiecărui cromozom de către un sistem digital de analiză a imaginilor. O creștere a numărului de copii determină creșterea proporției, în timp ce pierderile sau delețiile determină o scădere a proporției. Levy et al. (1997) au folosit CGH pentru a determina originea unei translocații de novo la un nou născut cu anomalii congenitale multiple și un cariotip instabil (Fig. 7). Această metodă a fost aplicată pe mai mult de 1500 mostre de ADN tumoral și a arătat șase amplificări genice necunoscute până în prezent.

Fig. 7. (a) Cariotip parțial și ideograma a doi cromozomi 5, unul cu material în plus pe el. (b) Ideogramele și profilurile CGH (hibridizare genomică comparativă) indică originea materialului în plus de la 11q23-qter. (c) Confirmarea FISH folosind o probă marcată cromozom 11-specifică.

Istoric – evoluția temporală a tehnicilor de cariotipare și apariția tehnicilor de cariotipare moleculară

Primele descoperiri

Primul om de știință care a descris în detaliu procesul de mitoză și implicarea "figurii cromatice nucleare" (cromozomii) a fost zoologul german Anton Schenider în 1873 (Zacharias, 2001). Descrieri clare și detaliate ale cromozomilor mitotici la plante și animale au fost publicate de către Strasburger în 1875 și respectiv, Flemming în 1879-1882. Descoperirile lor au pus bazele tehnicilor moderne de studiu a cromozomilor. Cromozomii au fost descoperiți după ce Gregor Mendel a publicat legile eredității, dar s-a realizat că acestea erau necesare pentru a explica distribuția factorilor ereditari (genele) la celulele fiice.

În 1868, Miescher in Basel a izolat ceea ce el a numit nucleină, care aparent era o formă impură de ADN. Această descoperire a marcat începutul studiilor acizilor nucleici. Flemming a speculat că substanța colorabilă a nucleului (prin urmare a cromozomilor), cromatina, ar putea fi asemănătoare cu nucleina descoperită de Miescher. Prezența ADN-ului în cromozomi și în nucleu a fost stabilită în mod echivoc când Feulgen a introdus metoda sa histochimică pentru detectarea ADN-ului (Feulgen și Rossenbeck, 1924), care mai târziu a devenit o cale pentru măsurarea conținutului de ADN al nucleilor și cromozomilor.

Modelul ADN propus de Watson și Crick în 1953, care arăta că acesta era un dublu helix complementar, a pus bazele înțelegerii mecanismelor de replicare a materialului genetic. Acest model reprezentând structura ADN-ului poate fi considerat începutul erei biologiei moleculare.

Cromozomii rămân importanți nu numai pentru că ei poartă genele, dar și deoarece comportamentul lor determină mecanismul eredității. Distribuția genelor la celulele fiice în timpul mitozei și meiozei este o consecință directă a comportamentului cromozomilor.

Comportamentul ADN-ului și al genelor este constrâns de faptul că aceștia sunt încorporați în cromozomi și cromatină (care reprezintă, de fapt, cromozomi interfazici). ADN-ul poate funcționa în replicare și transcripție deoarece este asociat cu proteine care controlează și catalizează aceste procese. Expresia genică este controlată prin modificări ale histonelor și prin complexe cromatinice modelatoare. Chiar și un lucru aparent banal precum poziția unei gene în cromozom poate avea un impact major asupra comportamentului acelui cromozom. Heterocromatina constă din segmente cromozomiale care nu reușesc să se decondenseze la sfârșitul mitozei și care sunt genetic inactive și reprezintă secvențe de ADN înalt repetitive incapabile de a codifica proteine. Plasarea unei gene în apropierea heterocromatinei ar putea inactiva acea genă, producând efectul cunoscut sub numele de variabilitatea efectului de poziție, în care o genă particulară poate fi activată în anumite celule și dezactivată în altele. Asemenea efecte s-au dovedit a fi surprinzător de răspândite.

Erori ale comportamentului cromozomilor constituie o cauză importantă de boală. La oameni, o proporție substanțială din avorturi se datorează anomaliilor cromozomiale, în special trisomiile și alte aneuploidii. Trisomia 21 (sindromul Down) și aneuploidii legate de cromozomii sexuali dau naștere unor indivizi care ajung la maturitate dar care prezintă o serie de anomalii. Dezvoltarea unor anomalii cromozomiale este comună în cancere, iar o anomalie cromozomială specifică reprezintă deseori una din primele evenimente din dezvoltarea unui cancer.

Cromozomii sunt determinanții supremi ai organizării tuturor organismelor vii, studierea lor este așadar imperativă.

Cariotip, tehnici de bandare

Cromozomii sunt analizați prin recoltarea de țesut viu (de regulă sânge), cultivarea țesutului pentru câteva ore/zile (48 până la 72 de ore pentru limfocite periferice), adăugând colchicină pentru a produce oprirea diviziunii celulare în metafază, recoltarea celulelor, plasarea sedimentului celular pe un frotiu, producerea rupturii nucleului celular cu ajutorul unei soluții saline hipotone, colorarea cu un colorant desemnat, și fotografierea cromozomilor metafazici de pe frotiu. Imaginile cu cei 22 de autosomi sunt aranjate în funcție de lungime, cromozomii sexuali fiind plasați în colțul din dreapta. Această dispunere ordonată a cromozomilor se numește cariogramă sau cariotip (termenul de cariotip se referă la numărul și tipul de cromozomi prezenți la un individ, iar cariograma este acum folosită pentru a desemna expunerea printată a cromozomilor). În prezent, analiza imagistică computerizată este de regulă folosită pentru a afișa cromozomii.

Primele cariotipuri făcute au fost utile pentru numărarea cromozomilor, dar anomaliile structurale cum ar fi rearanjări cromozomiale echilibrate sau mici deleții cromozomiale rămâneau adesea nedetectabile.

Tehnicile de bandare cromozomială au apărut prin anul 1970, pentru a produce benzile cromozomiale caracteristice cariotipurilor moderne. Bandarea cromozomială ajută prin detectarea delețiilor, duplicațiilor, și a altor anomalii cromozomiale și facilitează identificarea corectă și individuală a cromozomilor.

Multiple tehnici de bandare cromozomială sunt folosite în prezent în laboratoarele de citogenetică. Bandarea cu quinacrină (bandare Q) a fost prima metodă folosită pentru a obține un șablon specific de benzi cromozomiale. Această metodă necesită un microscop cu fluorescență și nu mai este la fel de folosită ca bandarea cu Giemsa (bandare G). Pentru a produce benzi G, colorația cu Giemsa se aplică după ce proteinele cromozomiale sunt parțial digerate de tripsină. Bandarea inversă (bandare R) necesită tratament termic și inversează modelul normal alb-negru prezent în benzile G și benzile Q. Această metodă este utilă în mod particular pentru colorarea capetelor distale a cromozomilor. Alte tehnici de bandare includ bandarea C și evidențierea regiunilor de organizare nucleară (colorația NOR). Aceste metode colorează în mod specific anumite porțiuni ale cromozomilor. Bandarea C colorează heterocromatina constitutivă, care este situată de regulă în apropierea centromerului, iar colorația NOR evidențiază sateliții și coada cromozomilor acrocentrici.

Bandarea de înaltă rezoluție implică colorarea cromozomilor în timpul profazei sau metafazei timpurii (prometafază), înainte de a ajunge la condensarea maximă. Cromozomii din profază și prometafază sunt mai lungi decât cei din metafază, de aceea numărul de benzi observabile pentru toți cromozomii poate crește de la 300-450 până la 800. Detecția unor anomalii mai puțin evidente, care de regulă nu sunt vizualizate prin bandare convențională este astfel posibilă.

FISH

În tehnica de hibridizare fluorescentă in situ (FISH) un segment marcat de ADN mono-catenar (proba) este expus cromozomilor denaturați din metafază, profază sau interfază. Proba suferă o cuplare a bazelor complementare doar la secvența ADN complementară într-un loc specific la unul din cromozomii denaturați. Deoarece proba este marcată cu un marker fluorescent locația la care hibridizează cu cromozomul pacientului poate fi vizualizată cu ajutorul microscopiei fluorescente. FISH este frecvent utilizată pentru a determina dacă există deleții ale unor porțiuni cromozomiale la pacienți. La o persoană normală o probă hibridizează în două locuri, reflectând prezența a doi cromozomi omologi în nucleul celulei somatice. Dacă o probă din segmentul cromozomial în discuție hibridizează la doar unul din cromozomii pacientului atunci acesta are, probabil, o deleție a copiei cromozomului la care proba nu hibridizează. FISH oferă o rezoluție mai bună decât tehnicile de bandare de înaltă rezoluție, putând detecta deleții mici de 1 milion de perechi de baze (1 Mb).

Copii în plus a unei regiuni cromozomiale pot de asemenea fi detectate utilizând FISH. În acest caz proba hibridizează în trei sau mai multe locuri în loc de două. Combinații de probe FISH pot fi de asemenea folosite pentru a detecta rearanjări cromozomiale cum ar fi translocațiile. Deoarece detecția FISH a cromozomilor lipsă sau în plus, poate fi efectuată cu cromozomi interfazici, nu este necesară stimularea celulelor pentru a se divide pentru a obține cromozomi metafazici (procedură consumatoare de timp necesară în abordările microscopice tradiționale). Acest lucru permite completarea analizelor si diagnosticelor într-un timp mai scurt. Analiza FISH a cromozomilor interfazici permite detectarea prenatală a anomaliilor cromozomiale fetale și a rearanjărilor cromozomiale din celule tumorale.

Tehnica FISH a fost extinsă prin folosirea mai multor probe, fiecare marcată cu o culoare diferită, astfel încât câteva dintre cele mai comune anomalii de număr (spre exemplu cele ale cromozomilor 13, 18, 21, X și Y) pot fi testate simultan în aceeași celulă. În plus, tehnici precum cariotiparea spectrală folosesc combinații variabile a cinci probe fluorescente diferite care cu ajutorul camerelor speciale și a software-ului de procesare a imaginilor fiecare cromozom are astfel o culoare unică în scopul identificării rapide. Astfel de imagini sunt în mod special folositoare pentru identificarea rearanjărilor cromozomiale.

Hibridizarea genomică comparată

Dezvoltarea tehnologiei microarray la începutul anilor 1990 la Universitatea Stanford (Schena et al., 1995) s-a desprins din șase discipline majore: biologie, chimie, fizică, inginerie, matematică și informatică. Pe lângă faptul că nici o altă tehnologie nu a implicat vreodată o așa mare complexitate tehnologică, combinând expertiza din atât de multe discipline, aceasta a adus o perspectivă cantitativă și sistematică asupra unui sistem biologic.

Această știință nouă și revoluționară folosește matrici de sticlă microscopice (micromatrici) pentru analiza cantitativă a genelor (sau părți din ele) și produșii genelor. Își are rădăcinile în progresele făcute în perioada dintre descoperirea ADN-ului din anii 1950 și Proiectul Genomului Uman în anii 1990.

Primele experimente de hibridizare pe sticlă au avut loc între sfârșitul anilor 1980 și începutul anilor 1990 (Khrapko et al., 1989, Fodor et al., 1991, Maskos and Southern, 1992, Lamture et al., 1994, Guo et al., 1994).

O limitare importantă a CGH când sunt folosiți cromozomii metafazici este aceea că delețiile sau duplicațiile mai mici de 5 până la 10 Mb nu pot fi detectate microscopic. Array CGH oferă o rezoluție mai înaltă, în care ADN test și de control este hibridizat cu ajutorul unui microarray care conține probe a căror secvențe ADN corespund unor regiuni specifice din genom. Un microarray CGH folosit în mod curent conține aproximativ 3000 de probe de cromozomi bacterieni artificiali (BAC) și fiecare probă conține inserții ADN de aproximativ 150 kb. Deoarece probele BAC sunt de regulă la 1Mb distanță unele de altele, această versiune de array CGH poate detecta duplicații sau deleții de aproximativ 1 Mb (rezoluție de 5 până la 10 ori mai bună decât CGH clasic). Alte microarray BAC sunt țintite, astfel încât rezoluții mai mari să fie obținute în regiuni în care duplicațiile sau delețiile sunt cunoscute ca fiind asociate cu anumite boli (microdeleții cum ar fi în sindromul Williams). O limitare a microarray BAC este aceea că alterări mai mici decât insertul BAC în sine (150 kb) nu pot fi detectate cu ușurință.

Recent însă, CGH a fost elaborat folosind microarray care conțin sute de mii de probe oligonucleotidice mici. Aceste microarray oferă o rezoluție de 50 până la 100 kb sau chiar mai puțin, permițând detectarea duplicațiilor și delețiilor care pot afecta o singură genă.

În plus față de o rezoluție mai bună, array CGH oferă o multitudine de alte avantaje față de tradiționala analiză a cariotipului. Întregul proces este automatizat, necesitând mai puțin timp din partea personalului de laborator. Diviziunea celulară nu este necesară (în contrast cu analiza cromozomilor metafazici), și o cantitate minimă de ADN este suficientă pentru analiza întregului genom. Array CGh, pentru aceste motive, devine una din tehnicile cele mai folosite în laboratoarele de citogenetică. Dezavantajul principal al CGH este că nu poate detecta rearanjări balansate la nivelul cromozomilor.

Citogenetica clasică – definiție, principiu, indicații, limite

Definiție

Citogenetica reprezintă studiul cromozomilor, a structurii și eredității lor fiind utilizată în identificarea anomaliilor generatoare de boală. Pe lângă precizarea diagnosticului clinic, citogenetica a fost de asemenea folosită în cercetarea genomică de bază. Unii autori consideră că este mai bine ca citogenetica să fie inclusă în termenul "citomică", ceea ce înseamnă că informația structurală și funcțională este obținută prin analiza moleculară a fenotipului celular al țesuturilor, organelor și organismelor la nivel de celulă unică prin citometrie în flux în combinație cu extracția cunoștințelor de bioinformatică în ceea ce privește acizii nucleici, proteine și metaboliți (genomică celulară, proteomică, și metabolomică), precum și parametrii de funcționare celulară cum ar fi ph-ul intracelular, potențiale transmembranare și gradiente ionice.)

Principiu

Cromozomii sunt vizualizați, cel mai frecvent, din limfocite obținute din sângele periferic. Acestea sunt puse în culturi și forțate să se dividă și apoi sunt blocate în metafază. Odată intrate în metafază, microtubulii fusului de diviziune sunt opriți, celulele sunt lizate și etalate pe lamă. Metafazele obținute pe lamă pot fi colorate cu Giemsa, care reprezintă bandarea G clasică găsită în majoritatea protocoalelor de cariotipare. În funcție de poziția centromerului, pot fi distinse trei tipuri de cromozomi: cromozomi metacentrici, cu un centromer situat aproximativ în mijloc; cromozomi submetacentrici, având două brațe de lungime inegală și cromozomi acrocentrici cu centromeri la sau aproape de capete. Fiecare cromozom are un braț lung, numit braț q și un braț scurt numit braț p. Benzile vizibile după bandarea G caracterizează fiecare cromozom individual ceea ce permite clasificarea și numerotarea cromozomilor și în consecință identificarea posibilelor rearanjări.

Citogenetica clasică a evoluat de la imagini în alb negru la imagini color a cromozomilor ca rezultat al progresului tehnicilor FISH, numită acum citogenetică clasică. Îmbunătățirile în calitatea și diversitatea probelor potrivite pentru FISH, împreună cu progresul analizei computerizate a imaginilor, permit analizarea în detaliu pe lamă a genomului sau a țesutului de interes. Este evident că lista crescătoare de opțiuni pentru analiza citogenetică a îmbunătățit înțelegerea schimbărilor cromozomiale implicate în inițierea bolii, progresia și răspunsul la tratament.

Arhitectura genomului uman, destăinuit de proiectul de secvențiere a genomului uman, explică recurența microdelețiilor și microduplicațiilor cauzate de o recombinare homologă non-alelică care implică duplicații segmentare create în timpul evoluției primatelor. Citogenetica moleculară va permite evaluarea mai departe a fundamentelor moleculare implicate în apariția anomaliilor cromozomiale structurale.

Indicații

Citogenetica constituie o unealtă de diagnostic importantă pentru a determina și/sau a confirma sindroame specifice, utilitatea acesteia este îndreptată către selectarea tratamentelor și monitorizarea pacienților folosind proceduri diferite. Aceste proceduri sunt realizate pentru a obține un cariotip din sânge periferic sau câteva biopsii tisulare (spre exemplu pacienți cu melanom, cancer de sân, biopsii de piele, ș.a). Cu toate acestea, studiul anomaliilor cromozomiale în culturi celulare este limitat de procese complexe cum ar fi obținerea creșterii celulare și a unui număr suficient de metafaze, care în schimb împiedică șansa de a obține un număr practic de împrăștieri metafazice pentru a putea desfășura o analiză citogenetică adecvată, care trebuie să prezinte o morfologie bună, o dispersie adecvată și bandare corectă.

Având în vedere importanța modelului folosit pentru a examina și manipula procese moleculare și celulare potențial relevante care stau la baza neoplaziilor, este necesară obținerea unui cariotip precis și cuprinzător pentru culturile diferitelor linii celulare. În schimb, cariotiparea oferă o înțelegere a mecanismelor moleculare care duc la transformare celulară și permite clarificarea posibilelor aberații citogenetice asociate cu expunerea la droguri și dezvoltarea și progresia diferitelor tipuri de cancer. Creșterea rapidă observată în incidența cancerului a forțat realizarea a numeroase studii de identificare a biomarkerilor citogenetici asociați dezvoltării acestei boli, care ar putea contribui la o înțelegere mai bună a procesului carcinogenic și care ar putea de asemenea avea implicații enorme în ceea ce privește dezvoltarea terapiilor eficace antitumorale.

Obținerea celulelor metafazice pentru analiza cromozomială necesită folosirea unor serii de reactivi, protocoale, și condiții de mediu, pe lângă altele, care vor permite adunarea cromozomilor. Celulele metafazice trebuie cultivate în anumite condiții pentru a putea obține un număr corespunzător de celule în diviziune, care trebuie să crească și să se dividă rapid în acest mediu. Luând în considerare toate aceste probleme, cunoștințele exacte referitoare la mediul de cultură și condițiile sale, precum și tehnicile și protocoalele necesare în general, vor permite o bună creștere celulară în cultură și colectarea cromozomilor pentru desfășurarea caracterizării citogenetice și identificarea anomaliilor cromozomiale prezente în celulele studiate.

Aplicarea studiilor de citogenetică pe linii celulare tisulare sau canceroase a devenit importantă în ultimii ani, deoarece prezența unor anomalii cromozomiale indică prognosticul bolii și răspunsul la terapie. Cele mai comune aplicații ale studiilor citogenetice pe linii celulare sunt: stabilirea tipului de anomalii cromozomiale și frecvența acesteia; identificarea genelor localizate în regiunile cromozomiale afectate, posibil implicate în dezvoltarea neoplaziilor; studierea proceselor tumorigene și metastatice, apoptozei și funcționalității celulare; identificarea mecanismelor de acțiune al hormonilor; elaborarea modelelor pentru studii de rezistență la medicamente; determinarea potențialelor terapeutice ale diferitelor tratamente; permiterea cercetărilor ulterioare.

Cunoștințele în legătură cu noile rearanjări și puncte de ruptură cromozomiale identificate ar putea fi folositoare pentru studiile moleculare, genetice și epigenetice ulterioare asupra cancerului și care ar putea ajuta în înțelegerea mecanismelor implicate în dezvoltarea și progresia acestei boli.

Limite

Obținerea celulelor metafazice în vederea analizei cromozomilor necesită folosirea unor reactivi care vor permite adunarea cromozomilor. Celulele metafazice trebuie crescute in vitro în anumite condiții pentru a putea obține un număr adecvat de celule în diviziune. Celulele utilizate pentru captarea cromozomilor trebuie să fie capabile de creștere și diviziune rapidă în mediul de cultură. Diferite tipuri de celule pot necesita factori de creștere specifici, odată ce necesitățile de bază pentru fiecare tip de celulă sunt cunoscute, este selectat mediul de cultură potrivit și verificată sterilitatea. După ce cultura a atins 80% din confluență, celulele sunt culese și fixate pentru a obține o suspensie citogenetică. Culturile sunt oprite în metafază sau prometafază prin inhibarea polimerizării tubulinei, astfel fiind prevenită formarea fusului mitotic (folosind colcemid sau velbe). După expunerea la colcemid sau velbe, celulele sunt tratate cu o soluție hipotonică pentru a facilita dispersia cromozomilor și ulterior fixate cu acid acetic. Celulele fixate sunt răspândite pe lamă și uscate la aer, pentru ca în final să fie folosite tehnici de bandare în scopul identificării corecte a cromozomilor. Numărul de metafaze obținut este câteodată inadecvat pentru analiza cromozomială, astfel că este necesară creșterea continuă a liniei celulare.

Pentru a asigura creșterea celulelor obținute din mostre de țesut tumoral și obținerea celulelor în metafază este important să se țină cont de toate condițiile de prelevare. Mostre sterile de țesut tumoral non-necrotic sunt colectate într-un recipient de transport folosind condiții optime de sterilitate; de exemplu, un tub steril ce conține mediu de cultură steril, un antimicotic și o concentrație dublă de antibiotice, ce va fi transportată la laborator în condiții de temperatură controlată.

Mostra de țesut tumoral trebuie să fie reprezentativă, sterilă și viabilă. În vederea asigurării creșterii celulare rapide și prevenirea contaminării cu alte tipuri celulare, culturile vor fi incubate într-un flacon mic de cultură sau direct pe lame montate în camere multi-well. Atașarea celulară, proliferarea și rata mitotică trebuie monitorizate prin examinare zilnică cu ajutorul unui microscop inversat.

Pentru a obține preparatele metafazice, culturile pot fi tratate cu Colcemid sau Velbe, tripsinizate, centrifugate, balonizate în mediu hipoton și fixate. Lamele sunt pe urmă gata pentru analiză citogenetică convențională sau moleculară.

Aplicația citogeneticii în domeniul oncologiei a dobândit în ultimele două decade o importanță mare nu numai ca o unealtă de diagnostic inestimabilă dar și ca o puternică unealtă de cercetare. Ca unealtă de diagnostic a permis identificarea și înțelegerea aberațiilor cromozomiale printre multe altele, a transformărilor maligne în multe cancere, lucru care a adus informații importante despre biologia cancerului. Ca unealtă de cercetare citogenetica aduce informații despre aberații specifice ale unui nou tip de oncogene posibil implicate în transformarea malignă, ce poate fi analizat în detaliu cu ajutorul cercetărilor moleculare, astfel permițând o înțelegere mai bună a mecanismelor moleculare implicate în carcinogeneză.

Date fiind cele de mai sus, cunoștințele și utilizarea tehnicilor de citogenetică permit aplicarea corectă atât în domeniul diagnosticului cât și cercetării direcționate către îmbunătățirea cunoștințelor noastre a diferitelor patologii asociate cu anomalii cromozomiale.

CGH convențional – definiție, principiu, indicații, limite

Definiție

Hibridizarea genomică comparată (CGH) a fost o metodă dezvoltată pentru a realiza o scanare completă a genomului uman, într-o tentativă de a identifica modificări ale numărului de copii ADN, mai precis instabilitatea genomică. Dezvoltată în 1992, tehnica CGH reprezintă hibridizarea competitivă a unui ADN test și a unui ADN normal, marcați cu diferiți fluorocromi. Tehnica originală folosea metafaze normale pe lamă fixă și este cunoscută ca CGH metafazică, cromozomială sau convențională.

Deleții sau duplicații ale unor regiuni cromozomiale specifice sau a întregului cromozom pot fi detectate cu ajutorul unei tehnici numite hibridizare genomică comparată (CGH). ADN este extras dintr-o sursă de testat, cum ar fi celulele dintr-o tumoră sau celulele din sângele unui pacient. ADN-ul astfel obținut este marcat cu o substanță care văzută prin microscopie fluorescentă emite o culoare (roșu); ADN-ul obținut din celule normale de control este marcat cu altă culoare (verde). În prima versiune de CGH, ambele seturi de ADN sunt hibridizate la cromozomi metafazici normali pe un frotiu. Dacă oricare regiune cromozomială este duplicată în celula tumorală, atunci regiunea corespunzătoare a cromozomului metafazic va hibridiza cu cantități excesive de ADN marcat cu roșu. Această regiune va apărea roșie privită la microscop. Pe de altă parte, dacă o regiune este deletată în celula tumorală, atunci regiunea corespunzătoare cromozomului metafazic va hibridiza doar cu ADN-ul de control marcat cu verde, iar regiunea va apărea verde la microscop. CGH este folositoare în special pentru scanarea delețiilor și duplicațiilor materialului cromozomial în celulele canceroase, unde detecția unor asemenea alterații pot ajuta la aprecierea tipului și/sau severității cancerului.

Principiu

Prin această tehnică, cantități egale de ADN de testat (de regulă marcat cu un fluorocrom verde) și ADN normal de referință (marcat cu fluorocrom roșu) sunt co-hibridizate pe preparate de cromozomi umani obținuți în metafază. În timpul procesului de hibridizare, cele două populații ADN concurează pentru secvențele lor echivalente pe substratul cromozomilor. Cantitatea relativă de ADN test și de referință atașată de o regiune cromozomială dată reflectă relativa abundență a acestor secvențe în ambele probe. Prin urmare, semnalele fluorescente diferențiale emise de cromozomii metafazici indică câștig sau pierdere de material genetic (modificări ale numărului de copii) în ADN-ul testat relativ cu ADN-ul de referință. Semnalele sunt citite cu ajutorul microscopului cu fluorescență și cuantificate prin analiză imagistică pentru a genera profilul raportului verde-roșu.

Intensitatea crescută a fluorescenței verzi sau proporția verde-roșu crescută (>1.0) reprezintă câștig de ADN pe un locus particular în proba test, în timp ce intensitatea crescută a fluorescenței roșii sau proporția verde-roșu scăzută (<1.0) indică deleție ADN pe un locus particular în proba test (Fig. 8). O regiune cromozomială fără modificări ale numărului de copii (proporție 1.0) se va colora în mod egal pentru verde și roșu, producând un semnal galben fluorescent.

În tehnica CGH convențională folosind ADN extras din sute sau mii de celule, dezechilibrele cromozomiale sunt detectate doar dacă sunt prezente în majoritatea celulelor din specimen. Astfel că informația despre heterogenitate poate fi pierdută. În plus, evenimente celulare rare, cum ar fi boala reziduală minimală, unde o singură celulă sau puține celule sunt valabile pentru studiu, nu au putut fi inițial analizate prin tehnica CGH convențională.

Cu toate acestea, au fost dezvoltate protocoale pentru analiza CGH monocelulară. O premisă pentru analiza CGH monocelulară sunt metodele pentru amplificarea ADN monocelulară care dau produși de amplificare ce rețin diferențele numărului de copii al genomului original. Astfel de abordări au fost aplicate pentru facilitarea diagnosticului prenatal sau pentru analiza bolii reziduale minime.

Fig. 8. Reprezentare schematică a tehnicii CGH. ADN test și de referință sunt etichetate direfențial (verde, respectiv roșu) și co-hibridizate la preparate metafazice umane normale. Vizualizarea cromozomilor cu ajutorul miscroscopiei fluorescente relevă diferențe ale semnalelor fluorescente în rândul cromozomilor, reprezentată de abundența secvențelor de ADN test comparativ cu secvențele de referință. Analiza imaginilor capturate oferă un profil al proporției culorilor indicativ al schimbărilor numărului de copii în ADN-ul test comparativ cu cel de referință.

Indicații

Tehnica CGH metafazică își are aplicabilitatea principală în domeniul geneticii oncologice (Albertson and Pinkel, 2003, Weiss et al., 2003a, Weiss et al., 2003b). Au fost de asemenea testate și alte aplicații clinice cum ar fi dismorfologia, dizabilitățile intelectuale și de învățare, demonstrând o creștere în diagnosticarea delețiilor sau duplicațiilor neidentificate de bandarea G (Kirchhoff et al., 2001, Ness et al., 2002). Pentru diagnosticul prenatal, studiind fetuși cunoscuți ca fiind purtători de aneuploidii, tehnica a fost validată retrospectiv ca fiind echivalentă cu tehnici citogenetice de înaltă rezoluție, dar cu avantajul de a nu necesita culturi celulare. Un alt studiu a demonstrat utilitatea acesteia ca unealtă complementară la cariotiparea convențională la un grup de fetuși cu defecte de perete abdominal. Cu toate acestea delimitarea regiunilor și benzilor specifice în tehnica CGH convențională este limitată de rezoluția cromozomilor metafazici și este estimată a fi între 3 și 10 Mb, fiind cea mai limitată (Kallioniemi et al., 1992, Bryndorf et al., 1995, Kirchhoff et al., 1999).

Aplicațiile CGH în domeniul cercetării oncologice include screening-ul tumorilor pentru detectarea aberațiilor genetice, cercetarea genelor implicate în carcinogeneza unui subset particular de cancere, analiza tumorilor în modele experimentale pentru facilitarea înțelegerii progresiei tumorale, clasificarea diagnosticului și stabilirea prognosticului. În prezent CGH este efectuat într-un număr mare de laboratoare și o varietate mare de tumori au fost analizate. Pe lângă aplicațiile oncologice, analiza CGH a fost de asemenea utilizată pentru studierea aberațiilor cromozomiale în genomul fetal și neonatal.

Tehnica CGH a fost utilizată pentru a defini regiuni cromozomale câștigate sau pierdute într-o varietate de specimene tumorale, linii celulare derivate și specimene arhivate. În cazul specimenelor tumorale primare, raporturi recente au documentat schimbări ale numărului de copii cromozomale în carcinoame mamare, carcinoame pulmonare cu celule mici, glioame maligne și melanoame uveale. Pentru cancerul mamar, un studiu a efectuat analiza CGH a 33 de specimene tumorale primare din care 28 au prezentat creșteri ale numărului de copii ale cromozomilor în întregime, brațelor cromozomilor și/sau regiuni. Câteva din aceste câștiguri cromozomale (1q, 8q) au fost găsite anterior ca fiind anomalii citogenetice recurente în cancerul mamar, iar studii de genetică moleculară au documentat amplificări ale anumitor gene și anume: ERBB2 (17q12), MYC (8q24), PAD1/CCND1 (11q13), FLG (8p12) și IGFR-I/FES (15q25). Totuși, multe dintre câștigurile identificate prin analiza CGH au fost de novo și au inlcus o amplificare de nivel înalt, observată frecvent, a secvențelor ADN derivate din 17q22-24 și 20q13. Identitatea genelor amplificate din această regiune rămâne a fi determinată. De asemenea, aceste regiuni au fost raportate a fi suprareprezentate într-o serie de linii celulare ale cancerului mamar. Pentru a confirma aceste amplificări (17q22-24, 20q13), a fost efectuată hibridizarea fluorescentă in situ (FISH) a nucleilor interfazici din liniile ceululare tumorale folosind ca probe cosmide obținute din librării de cosmide cromozom-specifice. În fiecare caz, au fost identificate două cosmide amplificate. Acest studiu asupra cancerului mamar s-a concentrat în primul rând pe câștigurile de secvențe ADN în ADN-ul test.

Studii CGH recente efectuate pe ADN-ul obținut din carcinoame pulmonare cu celule mici (SCLC), glioame maligne și melanoame uveale, au identificat, fiecare, loci noi cromozomali din care provin secvențele ADN amplificate. Pentru 13 cazuri de SCLC, banda cea mai frecvent implicată în evenimente de amplificare de nivel înalt a fost 19q13.1, în timp ce câștiguri ale brațelor întregi ale cromozomilor au fost observate pentru 3p, 5p, 8q și 17q. Acest studiu a identificat de asemenea pierderi ale brațelor cromozomale (3p, 5q, 10q, 13q, 17p) cu situsurile 13q și 17p posibil reprezentând pierderea genelor supresoare tumorale RB1 și respectiv TP53. Glioamele maligne, după analiza CGH, au prezentat amplificarea secvențelor ADN derivate din 7p12 (EGFR), precum și al altor situsuri care nu se cunoșteau a purta gene amplificate. Pierderi ale unor regiuni cromozomiale au fost de asemenea detectate, iar în câteva cazuri rezultatele CGH au fost confirmate fie prin FISH a nucleilor tumorali interfazici cu YAC (Yeast Artificial Chromosomes, folosit ca un sistem vector pentru clonarea fragmentelor de ADN) marcați adecvat, FISH a cromozomilor metafazici tumorali cu probe colorante cromozom-specifice și/sau analiza amprentei ADN. Analiza CGH a 11 melanoame uveale, a indicat că cele mai comune alterații genetice în aceste tumori sunt pierderea cromozomilor 3 și 6q, precum și câștigul secvențelor ADN provenind din 6p și 8q.

Pe lângă utilizarea tehnicii CGH pentru a scana complemente genomice tumorale pentru câștiguri sau pierderi, au existat trei rapoarte a utilizării tehnicii pentru a identifica originea unor secvențe ADN implicate în mod specific într-o anomalie citogenetică raportată. Într-un raport, au fost observate dmins (double minutes, fragmente mici de ADN extracromozomal, marca citogenetică a amplificărilor genomice în cancer) după analiza cariotipului unei leucemii acute mieloide, dar gena amplificată nu a fost cunoscută. Aplicația CGH la ADN-ul tumoral a demonstrat un semnal fluorescent crescut al ADN-ului test pe 8q24. Ulterior, un test PCR semi-cantitativ a fost utilizat pentru a confirma că gena candidată (MYC) cartată pe 8q24, a fost într-adevăr amplificată în această leucemie. CGH a identificat amplificarea secvențelor ADN provenind din doi loci ai cromozomului 12 (în loc de cel așteptat) în cromozomii inelari supranumerari caracteristici liposarcoamelor bine diferențiate. Un alt studiu pe specimene de cancer mamar primar a modificat tehnica CGH astfel încât doar câștigurile să fie detectate. În această serie de 17 specimene, după analiza cariotipului, prezența dmins și HRSs (regiuni colorate omogen) au reprezentat dovada amplificărilor genice. Câștiguri similare de material cromozomal au fost detectate după descrierea de mai sus, pentru cele 33 de carcinoame mamare, cu puține diferențe. Aplicarea unui test CGH modificat similar la o serie de tumori ale celulelor germinale masculine, a condus la identificarea derivației cromozomale HRSs și a cromozomilor marker neidentificați până atunci. În toate cazurile, copii în plus ale cromozomului 12p au fost detectate de CGH, iar regiunile cromozomale 16p, 20q și 1p 32-36 și benzile cromozomale 11q13 și 12q24 au fost găsite suprareprezentate în aceste tumori.

Întrucât analiza CGH a specimenelor tumorale solide identifică derivate câștigate și pierdute ale secvențelor ADN în celulele tumorale, strategii de genetică moleculară pot fi folosite pentru a izola noi secvențe genice din acești loci cromozomali. Un număr de regiuni găsite a fi câștigate/pierdute în tipurile tumorale descrise mai sus (de exemplu amplificarea 8q24 în cancerul mamar și pierderile 13q, 17p în SCLC) sunt locații ale genelor cunoscute deja ca fiind implicate într-o măsură în carcinogeneză și progresie tumorală (MYC, RB1 și respectiv TP53). Totuși analiza CGH a identificat schimbări în numărul de copii a multor loci cromozomali noi ale tumorilor studiate până în prezent. Este evident că celulele tumorale prezintă multiple câștiguri și pierderi de material genetic care au rămas nedetectate de către tehnicile citogenetice tradiționale. CGH, însă, nu este capabil să detecteze cea mai comună anomalie cromozomală nealeatorie identificată citogenetic, și anume rearanjarea. Prin urmare, nu sunt testate prin CGH o clasă de perturbări cromozomale, care, cel puțin în tumorile hematopoietice și mezenchimale, sunt cunoscute a fi asociate cu anumite etiologii tumorale.

De departe, cea mai importantă informație care a fost obținută prin analiza CGH, a fost identificarea regiunilor cromozomale amplificate în tumori. Multe regiuni noi s-au demonstrat a fi câștigate în mod frecvent în tumori și justifică analize suplimentare. Corelațiile regiunilor câștigate (și posibil a altor anomalii cromozomale) cu trăsăturile clinice ale tumorii pot dezvălui situsuri genice implicate în progresia tumorală care pot oferi indicatori de prognostic clinic a bolii. Astfel de regiuni cromozomale reprezintă ținta studiilor suplimentare de genetică moleculară. Caracterizarea moleculară a genelor implicate în aceste locații cromozomale poate implica testarea alterațiilor genelor candidate cartate în tumora respectivă, FISH a cosmidelor cartate și YAC a cromozomilor metafazici tumorali sau a nucleilor interfazici pentru a testa schimbările în numărul de copii, precum și aplicarea unor tehnici variate de genetică moleculară pentru izolarea și caraterizarea secvențelor de ADN alterat din cosmide și YAC. În cancerul mamar, două cosmide au fost deja identificate a fi conținute în ampliconii derivați din 17q22-24 și 20q13. Studii suplimentare sunt în derulare în scopul folosirii acestor cosmide pentru a defini regiunea amplificată în detaliu și pentru a identifica secvențele exprimate. Capacitatea CGH de a efectua o scanare globală a complementului genomic aparținând unei tumori pentru depistarea secvențelor ADN câștigate a mărit în mod considerabil lungimea complementului ce poate fi testat pentru amplificare, care anterior era limitat la gene cunoscute ce puteau fi folosite ca probe în hibridizarea Southern.

Deleții ale regiunilor cromozomale sunt mai dificil de detectat de analiza CGH decât câștiguri de material genetic. După cum a fost descris mai sus, abilitatea de a detecta pierderile de secvențe ADN depinde foarte mult de mărimea regiunii implicate. În Figura 11, este vizibilă o deleție pe 9p13, corelată cu studii recente ce indică pierderea heterozigozității pentru markeri din această regiune în LNH (limfoame non-Hodgkin) difuze cu celule mari. Detectarea celor mai des întâlnite regiuni deletate în rândul tumorilor prin analiza CGH semnalează regiuni cromozomale care trebuie analizate prin studii ale pierderii heterozigozității ce utilizează probe polimorfice cartate fie pin analiza polimorfismului lungimii fragmentelor restricționate sau testarea polimorfismului di- sau trinucleotidelor bazată pe PCR. Foarte probabil, specimene din cadrul acelui tip tumoral ce nu prezintă o pierdere a secvențelor ADN după analiza CGH vor fi ținta acestor studii pentru a defini o regiune deletată minimal și potențial rezultând în izolarea unor noi gene supresoare tumorale.

Limite

CGH este o tehnică relativ dificilă și consumatoarea de timp cu o serie de limitări. Aceasta nu poate detecta aberații cromozomiale structurale fără schimbări ale numărului de copii, cum ar fi translocații cromozomiale echilibrate, inversiuni sau cromozomi inelari și nu oferă informații referitoare la arhitectura tisulară. CGH detectează câștigurile și pierderile de material genetic în relație cu nivelul de ploidie. Are de asemenea dezavantajul de a fi mai puțin sensibilă în detectarea delețiilor decât metodele bazate pe PCR (Polymerase Chain Reaction). Rezultatele CGH nu sunt distribuite linear. Teoretic, din câștigul sau pierderea unei copii a unui cromozom anume într-un genom diploid ar trebui să rezulte o proporție fluorescentă de 0.5 sau 1.5. Cu toate acestea, în experimente ce compară ADN-ul feminin cu cel masculin, unde proporția fluorescentă pentru cromozomul X ar trebui să fie 0.5 sau 2.0, aceste proporții nu sunt găsite în practică.

Sensibilitatea tehnicii CGH poate fi afectată prin contaminerea materialului tumoral cu celule normale, în plus sensibilitatea CGH depinde de nivelul și dimensiunea variațiilor numărului de copii. Pe baza simulărilor experimentale, o creștere cu 50% a numărului de copii ar fi detectabilă dacă regiunea este de 2 perechi de megabaze sau mai mare, iar o regiune amplificată (amplicon) de 25 perechi de kilobaze ar avea nevoie de o creștere cu 400% a numărului de copii. Limita minimă de detecție este determinată de produsul excesului numărului de copii și dimensiunea regiunii amplificate. Atunci când deleția este 100% (nu este prezentă nici o copie), poate fi obținută o rezoluție de 1-2 Mb. În urma experimentelor CGH dimensiunea critică de detecție a fost estimată a fi între 10-20 Mb.

Prepararea cromozomilor metafazici, în concordanță cu protocoalele standard, se face folosind limfocitele obținute din sângele periferic stimulat cu fitohemaglutinină de la un bărbat sau o femeie normali cariotipic. Deoarece femeile au doi cromozomi X, iar cromozomul Y nu conține prea multă informație genetică, se preferă folosirea preparatelor obținute de la femeie. Preparatele de înaltă calitate pentru analiza CGH este ideal să prezinte citoplasmă puțină (citoplasma abundentă previne denaturarea optimă), suprapunere minimă a cromozomilor (cromozomii ce se suprapun trebuie excluși din analiza CGH) precum și o densitate celulară scăzută cuplată cu un index mitotic crecut. Pe lângă acestea, cromozomii trebuie să prezinte o lungime adecvată (400-500 benzi) fără să conțină cromatide separate. În final pentru a obține o bandare bună, cromozomii trebuie să apară întunecați și nu strălucitori priviți la microscopul în contrast de fază.

Pe scurt, 1 ml de ser heparinat este adăugat la 10 ml mediu de cultură Ham F10 ce conține ser de vițel (10%), L-glutamină (1%), penicilină și streptomicină (1%) și fitohemaglutinină (1.5% în apă distilată) ce este apoi incubat la 37șC în atmosferă 5% CO₂ pentru 72 de ore. Celulele sunt blocate în metafază prin adăugare de colchicină la o concentrație finală recoltată de 0,01 µg/ml, sunt apoi recoltate, tratate cu KCl hipotonă și fixate în metanol/acid acetic 3:1. O etapă esențială a procedurii este picurarea pe lamă a suspensiei celulare fixate. Succesul acestei etape depinde de numeroși factori (cum ar fi temperatura, calitatea suspensiei celulare și condțiile de laborator), iar picurarea suspensiei celulare este cel mai bine să se facă de la o distanță de aproximativ 30 cm pe lame curățate cu etanol. De obicei, o picătură de suspensie celulară este de ajuns pentru a obține preparate metafazice pentru un experiment CGH. Este de preferat ca lamele să fie evaluate cu un microscop în contrast de fază. Dacă pe lame încă sunt vizibile cantități mari de citoplasmă reziduală, este indicat ca etapa de fixare (3:1 metanol/acid acetic) să fie repetată de câteva ori. În pregătirea experimentelor CGH este importantă testarea mai multor loturi de preparate metafazice de la donatori diferiți, deoarece comportamentul acestora poate varia în timpul hibridizării. Ca o alternativă, preparate metafazice complete gata pregătite sunt comercial valabile. Dar chiar și acestea trebuie testate înainte de folosire, iar calitatea nu este neapărat mai bună decăt cea a preparatelor realizate în laboratorul propriu.

Calitatea ADN-ului reprezintă o problemă importantă în efectuarea analizei CGH. ADN-ul extras din țesut proaspăt sau înghețat este de regulă de mărime moleculară mare (nedegradat) și de cea mai bună calitatea în scopul etichetării. În timpul procesului de etichetare, prin intermediul translației crestăturii (deschiderea ADN prin producerea de crestături și substituirea nucleotidelor neetichetate cu digoxigenină, biotină sau nucleotide marcate cu fluorocrom), ADN-ul devine mai scurt, iar în cazul materialelor fixate în formol, fragmentele ADN devin prea mici pentru analiza CGH optimă. Legarea încrucișată a ADN-ului cauzată de agentul fixator poate împiedica funcționarea normală a enzimelor, ADN polimeraza și ADN-aza, rezultând în încorporarea defectuoasă a nucleotidelor modificate. Acest lucru va conduce la un model neregulat de hibridizare a cromozomilor metafazici. În consecință, diferențele de intensitate a semnalului dintre ADN-ul test și de referință vor fi mai puțin pronunțate.

Contaminarea (sau diluția) ADN-ului tumoral cu ADN normal (spre exemplu din celule stromale și inflamatorii) preprezintă o problemă nedorită dar inevitabilă întâmpinată în analiza tumorilor. Efectul asupra rezultatelor CGH va fi schimbarea proporției verde-roșu către 1.0, astfel încât, dacă mostra tumorală conține prea mult ADN normal, aberațiile cromozomiale pot rămâne nedetectate. Într-o tumoră triploidă, câștigul (4:3) sau pierderea (2:3) unei singure copii devine nedectabilă la un procent de 50% contaminare, în timp ce într-o tumoră diploidă câștigul (3:2) sau pierderea (1:2) unei singure copii rămânde nedectată la 75% contaminare. Prin urmare, atunci când peste 75% din celule sunt neoplazice, pot fi procesate secțiuni întregi. În cazurile ce prezintă mai puțin de 75% conținut tumoral, se pot realiza microdisecții din secțiunile realizate din țesutul tumoral, prin demarcarea limitelor cu un marker, raclarea cu un cuțit chirurgical și recoltarea în tuburi Eppendorf. În plus, echipament avansat de microdisecție cu laser poate fi folosit, dar acesta este scump și adesea nu este necesar. Celulele inflamatorii sunt în mod particular mai greu de secționat, deoarece de multe ori acestea au infiltrat țesutul tumoral. Tehnici de sortare celulară (de exemplu anticorpi atașați la bile magnetice sau sortarea citometrică în flux) permit selectarea (și extracția) celulelor tumorale sau eliminarea celulelor inflamatorii, pentru a produce o mostră mai pură de ADN tumoral.

Sunt necesare aproximativ 0.5-1 µg de ADN pentru o analiză CGH. În cazul carcinoamelor aceasta nu reprezintă de obicei o problemă. Mostre mici, în schimb,de exemplu biopsii din leziuni premaligne ar putea să nu conțină ADN suficient. În această situație DOP-PCR și alte tehnici au fost folosite în scopul amplificării ADN-ului. Datorită modului nealeatoriu în care DOP-PCR poate amplifica ADN-ul acesta ar putea da rezultate nefiabile. Prin urmare tehnici de control adiționale (cum ar fi experimente CGH repetate cu probe marcate invers) trebuie inluse în fiecare experiment CGH.

O metodă standard, translația incizurii este folosită pentru a eticheta și digera ADN-ul la fragmente de dimensiunea optimă de 500-1500 pb. O cantitate mică de ADN (0.5-1.0 µg) este suficientă. Când deoxinucleotide (dTUP) biotinilate și digoxigenin conjugate sunt încorporate ADN-ului (etichetare indirectă) după hibridizare, este necesară o etapă de detectare cu anticorpi fluorocrom conjugați – avidin-fluorescein izotiocianat (FITC) și antidigoxigenin de oaie – tetrametil rodamină izotiocianat (TRITC). Deoxinucleotidele care au fost conjugate direct cu fluorocromi dau o hibridizare mai ușoară dar cu un semnal mai slab în rândul cromozomilor. Este important ca fragmentele ADN marcate atât test cât și de referință să fie de aceeași lungime și cu limite între 500-1500 pb. Acest lucru poate fi verificat prin electroforeză pe gel de agaroză 1% colorat cu bromură de etil.

Regiuni cromozomale cu secvențe ADN scurte și repetitive apar la nivelul întregului genom, dar în număr mai mare la nivelul centromerilor, telomerilor și în câteva regiuni specifice (brațele 1p și 16p ale cromozomilor și cromozomii 19 și 22). Dimensiunea acestor regiuni variază mult cu fiecare individ (și în concluzie între ADN-ul test și cel de referință), iar acest lucru poate interfera cu analiza CGH. Așadar, regiunile ADN repetitive sunt blocate cu ADN Cot-1 (ADN placentar de 50-100 pb, care este îmbogățit pentru secvențe ADN repetitive). Blocarea suboptimală poate duce la o amplitudine redusă a proporției verde-roșu, iar câștigurile sau pierderile de material genetic pot rămâne nedetectate. Ca o alternativă la blocare, îndepărtarea secvențelor repetitive din probă poate fi o altă soluție pentru acestă problemă.

Alicoturi de 300-350 ng de ADN tumoral și de referință marcate (probele) sunt amestecate cu 100 de ori cantitatea de ADN Cot-1 uman necesară, precipitată și solvită într-un mix de hibridizare de 6 µl ce conține 50% formamidă (care scade temperatura de topire a ADN-ului) și 10% dextran sulfat (ce crește concentrația efectivă a probei) în 2x citrat de sodiu, pH 7.0. Potrivirea pe sexe a ADN-ului test și de referință nu este necesar. De fapt, proporția fluorescentă inegală rezultată pentru cromozomul X poate funcționa ca un control în plus a calității experimentului. Totuși, potrivirea pe sexe ar trebui luată în vedere în analiza cromozomului X. Proba și preparatele metafazice normale sunt denaturate separat: preparatele în 70% formamidă/2x citrat de sodiu la 72șC pentru 5-10 minute, ia probele în baie de apă la 80șC pentru 10 minute. Hibridizarea are loc într-un incubator cu umiditate la 40șC pentru două până la patru zile. După hibridizare lamele sunt spălate și colorate cu DAPI (0.35 µg/ml în soluție anti-decolorare) pentru a produce un model de banding ce permite identificarea cromozomilor și cariotiparea.

Pe scurt, analiza preparatelor CGH cuprinde următoarele etape.

Vizualizarea fluorescenței unei metafaze pentru DAPI (albastru; pentru identificarea cromozomilor), TRITC (roșu, ADN normal de referință) si FITC (ADN test, tumoral) se face folosind un microscop cu fluorescență. Sursele de lumină tip lampă cu arc de mercur sunt adecvate dacă sunt stabile și pot fi aliniate pentru a ilumina uniform fără a determina variații cromatice. Obiectivul trebuie să fie de tip plan, apocromatic, cu puterea de mărire x65 sau x100, în funcție de rezoluția camerei. Obiectivul trebuie să poată transmite lumina UV și nu trebuie să existe autofluorescență a lentilelor. Filtrele folosite trebuie să minimizeze întrepătrunderea celor trei fluorocromi, ceea ce înseamnă că filtrele cu benzi înguste sunt necesare pentru excitare și emisie. Totuși, pe măsură ce banda filtrului devine mai îngustă, luminozitatea semnalelor restante diminuă, ceea ce poate rezulta în timpi lungi de expunere. Așadar, filtrele asigură cel mai bun compromis dintre întrepătrunderea semnalelor și luminozitate. Deplasarea laterală cauzată de schimbarea filtrelor trebuie să fie minimă, o roată de filtru automată sau corectarea software pot rezolva această problemă. Camera ar trebui să ofere o rezoluție spațială de 0.01 µm la nivel de specimen, pentru a da o imagine de aproximativ 600×600 pixeli pentru o metafază obișnuită. Un ecran color de înaltă calitate de dimensiuni suficiente (17 inci) este necesar pentru afișarea adecvată a imaginilor color și a interfeței grafice a sistemului. În selectarea metafazelor pentru captură, trebuie luate în considerare următoarele criterii: semnalele de hibridizare trebuie să fie puternice și omogene, și nu granulare; fundalul trebuie să fie minim (fără citoplasmă reziduală); cromozomii tuturor metfazelor trebuie să fie de aceeași lungime (nu prea lungi sau prea scurți). Captura poate fi făcută atât automat cât și manual în cele mai multe programe software. Software-ul dedicat analizei CGH permite efectuarea următoarelor etape: (1) ștergerea fundalului; (2) segmentarea și ștergerea obiectelor non-cromozomiale; (3) normalizarea proporției FITC:TRITC pentru întreaga metafază; (4) cariotipare interactivă; (5) scalarea cromozomilor la o lungime standard, fie pentru întregul cromozom, fie independent pentru fiecare braț.

Proporția medie a metafazelor bine selectate sunt reprezentate pe ideograme (arătând schematic modelul de bandare G) a cromozomilor corespunzători într-un așa numit cariotip a numărului de copii, prezentând regiuni cromozomiale pierdute (deleții) sau câștigate (amplificări). Interpretarea profilului rapoartelor poate fi realizată folosind praguri fixe sau statistice. Limite fixate de 0.75 și 1.25 sau 0.85 și 1.15 pot fi folosite pentru a detecta pierderile sau câștigurile, în timp ce alții folosesc limitele intervalul de confidență (CI) de 95% a profilului. În ultima situație, deviațiile de la normal sunt interpretate ca pierderi sau câștiguri când CI de 95% a raportului fluorescent nu conține 1.0. Regiunile cromozomale 1p32-pter, 16p și 19p trebuie interpretate cu multă grijă și pentru a confirma descoperirile CGH în aceste regiuni, este recomandată repetarea experimentului cu probe marcate invers. Această instabilitate este determinată de cantitatea mare de secvențe repetitive în aceste regiuni, care sunt variabile la fiecare individ. ADN-ul Cot-1 ar trebui să blocheze aceste secvențe, dar de multe ori această abordare nu este încununată de succes.

Figura 9 ilustrează un model fluorescent de hibridizare obținut după ce ADN obținut dintr-un limfom non-Hodgkin (LNH) marcat cu fluorocrom portocaliu (test) a hibridizat competitiv cu ADN uman placentar marcat cu fluorocrom verde (referință). În acest caz câștigurile de material genetic de către tumoră comparativ cu ADN-ul de referință sunt detectate ca fluorescență roșie crescută și delețiile ca fluorescență verde crescută.

În cazul ilustrat în Fig. 9, singura anomalie citogenetică nealeatorie raportată, pe lângă o translocație t(14;18)(q32;q21) caracteristică limfoamelor foliculare, a fost prezența dmins (double minutes – echivalentul citogenetic al amplificărilor genice). Prin analiza vizuală, s-au găsit a fi suprareprezentate secvențe ADN derivate din 2p 13-15, 6p, 7, 11q13, 11q 24-25, 12q24, 16, 17q, 19 și 20 q și secvențe din 9p13 deletate în această tumoră.

Păstrând același principiu de comparare al ADN-ului test (mostră) și ADN-ului normal (de referință) și cuplarea cu tehnologia microarray, a fost dezvoltată o nouă tehnică de analiză genomică comparată care se bazează pe micromatrici (microarrays) și cunoscută ca array CGH. Ca principiu tehnica folosește fragmente multiple de ADN pre-selectat și atașat la o suprafață de sticlă cu un locus specific (lamă de microscop). ADN-ul atașat poate fi fragmente de ADN clonat ce provine de la bacterii (BAC – Bacterial Artificial Chromosomes) sau P1 (PAC – P1 Artificial Chromosomes), cDNA, oligonucleotide sintetice sau fragmente PCR.

Tipul de ADN folosit și cantitatea ariilor măsurate variază între diferitele protocoale sau platforme valabile. Alegerea regiunilor incluse în observație definește clasificarea acestora în două categorii: array CGH reprezentativ al întregului genom și array CGH țintit pe anumite regiuni specifice, de regulă implicate în aranjările cromozomiale deja descrise. Rezoluția obținută prin diferitele tipuri de array CGH depinde de numărul și dimensiunea clonelor studiate precum și de distanța dintre clone consecutive. Cele construite din clone BAC au rezoluția între 50-150 Kb, iar matricile oligonucleotidice pot avea o rezoluție de 25 pb până la 85 pb.

Fig. 9. Analiza CGH a unui limfom non-Hodgkin. Aplicația CGH la ADN-ul unui LNH, unde regiuni câștigate prezintă fluorescență roșie și regiuni pierdute prezintă fluorescență verde. Ambele omologe cromozomale sunt denotate pentru fiecare pierdere/câștig detectat, cu excepția cromozomului 20q .

Tehnic, cantități identice de ADN test și de referință sunt marcate cu fluorocromi (cianină) și după co-hibridizare, diferența dintre intensitățile emise de cianină pentru fiecare arie observată este măsurată. Atunci când intensitatea fluorescentă este mai scăzută în intensitate în AND-ul test comparativ cu ADN-ul de referință, deducem că există o pierdere în zona genomică respectivă (deleție) iar în situația opusă există un câștig genomic (dublură).

Limitarea acestei tehnici constă în inabilitiatea acesteia de a identifica anomalii cromozomiale care nu determină schimbări în numărul total de copii al unui segment ADN din genom, cum ar fi translocări echilibrate și inversiuni. În plus, CGH nu oferă informații privind felul în care sunt aranjate segmentele cromozomiale implicate în pierderile sau câștigurile de material genetic.

De asemenea normalizarea intensității fluorescente dublate generate în euploidie determină dificultăți de identificare. Tehnica are de asemenea utilizare limitată în cazurile de mozaicism. Această ultimă limitare a fost depășită prin creșterea experienței în interpretarea rezultatelor și este considerată posibilitatea detectării rearanjărilor cromozomiale prezente în cel puțin 20% (Vermeesch et al., 2005) sau 50% din celule (Shaw and Lupski, 2004). Există dovezi recente că tehnica array CGH poate diagnostica cazuri de mozaicism care nu au putut fi detectate de cariotiparea convențională. (Ballif et al., 2006, Cheung et al., 2007, Shinawi et al., 2008, Wood et al., 2008).

BAC-CGH – definiție, principiu, indicații, limite

Definiție

Progresul cheie către o metodă de citogenetică moleculară a genomului integral a venit în 1998, când Pinkel și asociații au demonstrat abilitatea de a efectua CGH folosind micromatrici conținând clone genomice mari pentru detectarea precisă a pierderilor sau câștigurilor de mono-copii. Această descoperire a dus la dezvoltarea rapidă a matricilor BAC țintite, în care sute sau mii de clone BAC corespunzătoare regiunilor cunoscute de microdeleție/microduplicație, regiunilor telomerice, regiunilor pericentromerice și altor regiuni clinic relevante pot fi simultan testate pentru variații ale numărului de copii.

Utilizarea pentru testări clinice a micromatricilor țintite a tranziționat rapid la modele de matrici ce acoperă întregul genom uman. Deși au existat îngrijorări în ceea ce privește modul interpretării dezechilibrelor detectate din analiza întregului genom care nu includea regiuni implicate anterior în sindroame clinice, beneficiul diagnostic al matricilor întregului genom a fost anticipat să depășească cu mult abordarea țintită, mai conservatoare.

Matricile timpurii ale întregului genom au început cu plasarea clonelor BAC la intervale de aproximativ 1 Mb la nivelul genomului. Lacunele interpuse fără acoperirea clonelor au devenit din ce în ce mai mici, fiind cuprinse în mod continuu de o acoperire mai densă a bazei genomice.

Principiu

Cromozomi artificiali bacterieni (Bacterial Artificial Chromosomes/BACs) împreună cu cromozomi artificiali P1-derivați (PACs) și cromozomi artificiali de drojdie (YACs) sunt clone genice cu inserție mare ce au fost folosiți pe larg în studii aCGH (CGH cu matrici). Matricile BAC sunt platforme punctate cu canal dual, unde ADN test (tumoral) și de referință sunt marcate diferențial înaintea hibridizării pe micromatrice. Probele BAC variază în lungime de la 100 la 200 kb, iar rezoluția fiecărei matrici BAC este definită de numărul de probe unice pe care le conține. Conținutul de probe al matricilor BAC variază de la câteva sute până la 32000 de elemente unice (matrice cu suprapuneri). Matricile cu suprapuneri (matrici în care fiecare BAC se suprapune peste BAC-ul alăturat) oferă o rezoluție de până la 50 kb, dat fiind faptul că o schimbare genomică poate fi detectată doar dacă este suficient de mare pentru a schimba semnificativ intensitatea hibridizării pe unul din canale (de exemplu schimbarea raportului roșu:verde) (Fig. 11). Aceste platforme oferă semnale suficient de intense pentru detectarea variațiilor numărului de copii sunt și sunt capabile să definească cu acuratețe limitele aberațiilor genomice și de asemenea, pot fi aplicate ADN-ului extras din țesut inclus la parafină și fixat în formol. Unul din cele mai mari inconveniente ale matricilor BAC este acela că disponibilitatea acestora din surse comerciale este limitată, iar producerea lor în laboratorul propriu presupune muncă intensivă și este de asemenea costisitoare. În plus, cum probele BAC sunt reprezentative genomului uman, acestea vor conține de asemenea și secvențe repetitive, ce poate rezulta în hibridizare nonspecifică. Pentru a preveni hibridizarea nonspecifică la aceste secvențe repetitive, ADN Cot-1 este frecvent adăugat la reacția de hibridizare, crescând costul total al testului.

Sistemele de clonare BAC și PAC (cromozom artificial P1-derivat) au fost dezvoltate folosind replicarea plasmidului F-factor al E. coli, respectiv al plasmidei P1 bacteriofage pentru a menține dimensiunea (100-250 kb).

În prezent sunt cunoscute mai mult de 8800 clone, cu cel puțin o clonă valabilă pe fiecare cromozom în medie per megabază. Această resursă permite oportunitatea de a genera o matrice ordonată de secvențe ADN la o rezoluție înaltă și de a înlocui preparatele metafazice cu un șablon de hibridizare. Astfel de CGH bazate pe micromatrici (array CGH/ aCGH) ocolește limitările considerabile asociate folosirii preparatelor cromozomiale (Fig. 10).

Un scaner fluorescent de înaltă rezoluție este folosit pentru a captura intensitatea fluorescentă a fiecărui punct în matrice și le convertește într-o proporție de intensitate. Proporția fluorescentă a celor două culori poate fi comparată printre puncte diferite reprezintând regiuni genomice diferite. Aceasta oferă un profil molecular al genomului integral al probei, inclusiv regiuni ale genomului care sunt șterse sau amplificate. Rezoluția acestei abordări depinde de o combinație dintre numărul, dimensiunea și poziția pe hartă a elementelor ADN în matrice. Matricile BAC oferă oportunitatea de a efectua scanări de înaltă rezoluție ale genomului integral într-un mod rapid și complet reproductibil.

Fig. 10. Principiul array-CGH. ADN test și de referință marcate diferit (sfere verzi, respectiv roșii) sunt cohibridizate pe o matrice cu spoturi ADN printate pe o lamă de sticlă. În cazul delețiilor în ADN-ul test, mai puțin ADN test se va atașa la spoturile corespunzătoare, iar eticheta roșie a ADN-ului de referință va predomina; câștigurile în genomul test pot fi identificate prin predominanța etichetei verzi a ADN-ului test. Spoturile ce prezintă secvențe cu același număr de copii în genomul test comparativ cu genomul de referință apar galbene. Pentru matricile BAC, un exces de ADN Cot-1 repetitiv (sfere albastre) trebuie adăugat pentru a suprima secvențe repetitive care se atașează nespecific.

Indicații

Intensitatea semnalelor oferite de BAC a permis explorarea neoplasmelor umane în numeroase studii de la descrierea sa originală de Pinkel et al. În studii recente, aceste matrici au fost folosite pentru a identifica alterații genomice importante ale numărului de copii într-o varietate de neoplasme, ce cuprind cancerul de sân, cancer gastric, glioblastom multiform, neuroblastom, rabdomiosarcom, carcinom nazofaringial, osteosarcom, tumori adrenocorticale precum și cancer ovarian, de prostată și vezică urinară.

Rezoluția aCGH s-a îmbunătățit considerabil în ultima decadă. Abbot Molecular a produs o matrice ce conține 300 BACs, ce oferă o rezoluție destul de scăzută, dar reprezintă o abordare mai standardizată pentru clasificarea datelor folosind scaner și pachet software brevetate. Spectral Genomics a produs o matrice BAC de 2500 clone capabilă de o rezoluție de aproximativ 1 Mb, ce a fost folosită cu succes pentru analiza alterațiilor numărului de copii ADN într-o varietate de studii. Institutul Oncologic Roswell Park și Centrul Oncologic de Cercetare Fred Hutchinson au construit matrici BAC de 6000 și 20000 de clone cu rezoluții de 500 kb, respectiv 200 kb, demonstrate a identifica pierderi caracteristice de material a cromozomilor 1p și 19 q în oligodendroglioame. O matrice BAC de 32000 clone, cu o rezoluție de 45 kb a demonstrat identificarea de alterații ale numărului de copii în carcinoame scuamoase orale.

Un avantaj al acestei metode constă în faptul că matrici BAC există deja pentru multe organisme și pot fi adaptate ușor la studii de metilare. BAC oferă de asemenea acoperirea regiunilor din genom unde este dificil să proiectezi probe mai mici din cauza conținutului de secvențe repetitive. În plus, datorită lungimii probelor, expunerea asociată cu datele BAC este scăzută comparativ cu alte tehnologii microarray.

Limite

Atașarea multiplelor fragmente de ADN distincte din regiuni cromozomale adiacente, reduce influența artefactelor care pot apărea în timpul amplificării întregului genom. Artefactele de anplificare sunt comune atunci când sunt folosite celule unice care au potențialul de a produce pierderi și câștiguri false de material genetic. Însă, în cazul probelor BAC, fiecare spot pe micromatrice oferă un rezultat mediu pentru sutele de fragmente amplificate care au hibridizat, diluând influența oricărui fragment individual cu anomalii ale caracteristicilor de amplificare. În plus, diagnosticele celulelor unice nu sunt niciodată bazate pe rezultatele unui singur BAC, ci depind de raportul fluorescent mediu obținut pentru câteva probe vecine, determinând reducerea suplimentară a efectelor oricărui artefact al amplificării întregului genom. Această nevoie de a combina rezultatele de la mai multe probe limitează rezoluția potențială a matricilor BAC aplicate celulelor unice, împiedicând detectarea anomaliilor submicroscopice (de exemplu microdelețiile).

Figura 11. Matrice BAC (Bacterial Artificial Chromosome). Fiecare spot pe o matrice BAC reprezintă partea specifică din genom care este conținută în BAC. O matrice BAC cu suprapuneri a întregului genom cuprinde atât de multe clone BAC pe cât este necesar pentru a acoperi întregul genom într-o manieră care se suprapune (32,400 pentru genomul uman). Partea de sus a imaginii reprezintă un instantaneu de ecran a Browser-ului UCSC al Genomului Uman. Liniile roșii ilustrează selecția de clone ce se suprapun, dintr-o bibliotecă BAC cuprinzătoare.

Folosind o matrice BAC cu 6000 de clone și o rezoluție de 750 Mb, cercetătorii au identificat deleții de 32 până la 64 Mb în gena esterazei D (ESD) la pacienți cu retinoblastom. Gena ESD în mod normal este localizată centromeric la 650 de kb de gena RB1. Dimensiunea deleției și genotipul (homozigozitate) au fost asociate cu reducerea activității enzimei ESD și severitatea trăsăturilor fenotipice.

După elaborarea profilurilor genomice prin intermediul matricilor, anomaliile descoperite pot fi validate de alte tehnici de genetică moleculară. PCR cantitativ și hibridizarea fluorescentă in situ (FISH) sunt două metode folosite frecvent pentru atingerea acestui scop. FISH este o tehnologie simplă și directă ce poate fi efectuată în majoritatea laboratoarelor de citogenetică. Una dintre cele mai mari provocări în validarea prin FISH este disponibilitatea (sau lipsa ei) probelor de bună calitate pentru regiuni de interes, folosite în experimentele de validare prin FISH.

Pentru a efectua o validare cu succes, trebuie obținută o clonă BAC corectă, iar ADN-ul trebuie extras din această clonă. Rezultatul aCGH este definit de alterațiile genomice (amplificare sau deleție) observate într-un BAC dat. Browsere ale genomului uman oferă o expunere rapidă și sigură a oricărei porțiuni din genomul uman la scara dorită. În plus, ele dezvăluie o mulțime de piste adnotate ce conțin informații în legătură cu gene cunoscute, secvențe etichetă exprimate, ARN mesager, insule CpG, goluri de assamblare și poziția exactă a unei clonei pe un cromozom la o locație corespunzătoare pe o bandă cromozomală. După care se poate comanda un BAC adecvat de interes pentru validarea suplimentară a descoperirilor A-CGH. BAC-ul achiziționat poate fi recuperat prin creșterea clonei într-o placă agar adecvată și propagarea într-un mediu. ADN-ul poate fi extras cu ajutorul unui kit de extracție proiectat special pentru lucrul cu BAC. Deși acest proces necesită muncă intensă, producția este mare (în jur de 100 mg de ADN din 1 L de mediu de cultură lăsat peste noapte), iar calitatea este pură, oferind o cantitate suficientă de ADN de specificitate înaltă pentru prepararea probelor FISH. O serie de metode de etichetare sunt valabile în prezent, dar translația incizurii reprezintă abordarea cea mai practică pentru etichetarea ADN-ului BAC.

Microrețele oligonucleotidice (cu densitate mică și cu densitate mare) – definiție, principiu, indicații, limite

Definiție

CGH bazat pe micromatrici (microarrays) este o metodă puternică de a detecta și analiza modificări genomice care se află cu mult sub posibilitatea de detecție a analizei cariotipului prin tehnici de bandare de înaltă rezoluție, oferind oportunități mai bune pentru corelarea genotip/fenotip la alți indivizi cu afecțuni similare. Aplicația clinică a array CGH ca metodă de diagnostic la pacienți cu dizabilități mentale și de învățare asociate cu trăsături dismorfice a fost îndelung studiată (Bejjani et al., 2005, Cheung et al., 2005 Jul-Aug, Shaffer et al., 2006, Lu et al., 2007, Stankiewicz and Beaudet, 2007) și s-a dovedit utilă și reproductibilă pentru diagnosticarea și caracterizarea moleculară a acestui grup. Aceste studii au arătat că tehnica array CGH poate crește rata diagnosticării cu 20% până la 30% comparativ cu studiile de citogenetică convențională, culminând cu includerea sa în diagramele de cercetare genetică a acestui grup de pacienți. Analiza genomică a numărului de copii bazată pe micromatrici este acum un test genetic solicitat frecvent pentru pacienți cu diagnostice ce includ întârziere inexplicabilă în dezvoltarea/dizabilitate intelectuală, dizabilități din spectrul autismului, și multiple anomalii congenitale. Această tehnică mai este cunoscută și sub numele de micromatrice cromozomală (CMA) și cariotipare moleculară.

Creșterea acoperirii regiunilor genomice în platformele array CGH reprezentative întregului genom este responsabilă de o creștere adițională cu 5% în detecția micromatricilor cromozomale comparativ cu platformele array CGH țintite pe regiuni specifice. Cu toate acestea, în timp ce analiza de înaltă rezoluție poate identifica anomaliile patologice, acestea prezintă problema identificării pierderilor și a câștigurilor de material genetic în regiuni cu semnificație necunoscută clinic. În acest sens intervine balanța delicată dintre rezoluția metodei, potențialul diagnosticului clinic și abilitatea de a interpreta rezultatele. Aceasta reprezintă principala problemă în determinarea întrebuințării microarray CGH în scop diagnostic în practica medicală.

Variația numărului de copii (CNV) poate fi dificil de evaluat și interpretat. O varietate de metodologii folosite în generarea informației valabile electronic care constituie bazele de date în cercetarea CNV face imposibilă distingerea dimensiunii exacte a fiecărei CNV găsite. Lipsa uniformității metodologice derutează interpretarea corectă a descoperirii cromozomilor anormali prezenți la un individ anormal fenotipic, mai puțin suprapunerea unei părți sau unei regiuni întregi cu CNV descrisă. Altă problemă este reprezentată de găsirea unui câștig de material genetic într-o regiune care este descrisă ca fiind deleție sau pierdere CNV și vice versa. În astfel de situații nu putem deduce că rearanjarea este o descoperire benignă.

Identificarea CNV-urilor poate varia în funcție de platforma CGH array folosită. Un studiu a demonstrat că folosind tehnica array CGH ce conțin clone BAC numărul de CNV găsite a fost mai mare comparativ cu cele găsite după aplicarea tehnicii array CGH cu oligonucleotide. Această discrepanță poate fi explicată prin următorul fenomen: clonele generate din bacterie conține fragmente mai mari comparativ cu probele oligonucleotidice. În plus clonele BAC pot cuprinde regiuni de ADN repetitiv, cunoscut a fi asociate cu variații ale numărului de copii.

Cu toate acestea, în prezent, matrici ale întregului genom detectează multiple variații ale numărului de copii cu semnificație clinică necunoscută. Experiența clinică în creștere cu ajutorul matricilor precum și dezvoltarea bazelor de date a variațiilor numărului de copii atât a indivizilor sănătoși cât și bolnavi vor reduce numărul de CNV cu semnificație clinică necunoscută și vor face matricile mai folositoare în practica clinică.

Secvențierea recentă a genomului uman a deschis o nouă eră a cercetării biomedicale. Însă, energia creativă alocată completării acestei sarcini a fost acum reorientată pe o întrebare centrală și esențială, și anume cum se poate converti secvența lineară de date generate de Proiectul Genomul Uman în scop practic, de exemplu pentru înțelegerea funcțiilor celulare, cum ar fi caracterizarea rolului genelor în fiziologie și patologie.

Dezvoltate inițial prin date obținute prin Proiectul Genomul Uman, micromatricile ADN au apărut ca o tehnologie cheie, puternică ce a legat informația secvențelor genelor de perspectivele funcționale în mecanismele biologice. Matrici cu probe ADN de densitate mare transformă rapid cercetarea biomedicală a genelor și devin unelte de rutină pentru analiza cu rată crescută a expresiei genelor într-o varietate mare de sisteme biologice.

Tehnologia microrețelelor a trecut prin câteva generații caracterizate prin îmbunătățiri în multe arii, care includ o acoperire mai mare a transcriptomului, o cartografiere mai bună și informații ale secvențelor de înaltă calitate, adnotări îmbunătățite a structurii genelor și a limitelor exonilor, precum și îmbunătățiri software și a modelelor fizice pentru designul probelor. Datorită acestor îmbunătățiri, sunt așteptate ca matrici de generație nouă să ofere o acoperire și o acuratețe a genomului mai ridicate.

Principiu

BACs nu sunt singurele platforme folosite pentru construcția matricilor CGH. Similar utilității lor în studierea expresiei genelor, matricile ADN complementare (cADN) pot servi, de asemenea, drept șabloane pentru hibridizarea genomică comparată. Micromatricile cADN dispuse sub forma secvențelor individuale mai lungi de 100 de nucleotide oferă avantajul de a fi mai disponibile pentru construirea unor asemenea matrici prin secvențierea produșilor PCR. Bazate pe experiențele acestor matrici în literatura de specialitate, ar putea permite studierea delețiilor și amplificărilor de mici dimensiuni (rezoluție înaltă). Totuși, matricile cADN sunt limitate de inabilitatea acestora de a măsura eficient delețiile din cauza zgomotului de fundal care apare în cazul folosirii probelor unice. Matricile cADN au fost recent folosite pentru studierea carcinoamelor mamare bilaterale și a osteosarcoamelor pediatrice, precum și pentru detectarea alterațiilor numărului de copii ADN, alături de anomaliile de metilare (Fig. 12).

Fig. 12. Analiza cADN microarray. ARN-ul total a fost extras dintr-o cultură de celule tumorale, transcrisă în cADN și hibridizată cu o micromatrice cADN particularizată. Expresia genică a fost măsurată prin detectarea chemiluminescenței și normalizată împotriva genelor house-keeping pe micromatrice.

O probă de ADN genomic sau cADN marcat cu o etichetă fluorescentă sau chemiluminescentă este hibridizată pe matrice. Prezența ADN-ului legat este afișată prin fluorescență sau chemiluminescență. Matricea este scanată cu un laser, iar imaginea este analizată pentru pattern-ul și intensitatea semnalului. Intensitatea fluorescentă sau chemiluminescentă este afișată drept un punct colorat per locație genică, un singur experiment fiind capabil de profilarea simultană a sute până la mii de gene. Micromatricile sunt folosite pentru a evalua modele ale expresiei genelor cu scopul de a extrage semnale asociate bolii și de a identifica ținte terapeutice posibile.

Melanomul a fost unul din primele cancere de piele analizat folosind tehnologia micromatricilor ADN. Tumori non-melanocite, cum ar fi carcinomul bazocelular și cel scuamocelular, precum și limfomul cutanat cu celule T, au fost de asemenea studiate. Micromatricile ADN au fost folosite pentru a ilustra diferențe în elaborarea citokinelor într-o serie de boli inflamatorii ale pielii (de exemplu psoriazis și dermatită atopică) și corelează aceste schimbări cu disproporții în patofiziologia și predispoziția pentru infecțiie microbiene între aceste boli.

Fig. 13. Schema matricii cu oligonucleotide. Pentru această abordare este crucială folosirea a multiple oligonucleotide cu secvențe diferite proiectate pentru a hibridiza la regiuni diferite ale aceluiași ARN. Pentru fiecare genă monitorizată, o serie de oligonucleotide sunt sintetizate folosind fotolitografie direct pe cip. Oligonucleotidele sunt aranjate ca perechi: fiecare pereche include o potrivire perfectă de 25-mer care este complementară secvenței genice, și o nucleotidă control care diferă de oligonucleotidele potrivite perfect la a treisprezecea bază. Intensitatea hibridizării raportată este o adunare a diferențelor potrivire perfectă-nepotrivire per genă.

Matricile oligonucleotidice sunt similare matricilor cADN cu excepția că șabloanele acestora de hibridizare sunt scurte, compuse tipic din 25 de nucleotide. Avantajul matricilor oligonucleotidice constă în faptul că un număr infinit de oligonucleotide pot fi sintetizate pentru o regiune specifică de interes, în timp ce rezoluția BAC este limitată de dimensiunea acestora. Modelul oligonucleotidelor oferă specificitate și sensibilitate crescute chiar și când sunt folosite drept probe oligonucleotidice mai lungi. Pe lângă potențialul lor de a atinge o densitate mare a probelor pe matrice, oferă și flexibilitate în alegerea și aranjarea probelor ce poate fi particularizată (Fig. 13).

Indicații

Oligonucleotidele nu numai că sunt capabile să detecteze alterații ale numărului de copii, sunt de asemenea folosite pentru a detecta polimorfisme mononucleotidice (SNPs), determinând expansiunea utilității lor viitoare. Matricile SNP au fost folosite pentru a detecta 14 mutații pe exonul 11 a genei BRCA1 sau pentru studierea pierderii heterozigozității în carcinomul de prostată. O matrice SNP oligonucleotidică cu 1500 de probe a fost comparată favorabil cu PCR microsatelit convențional într-un studiu al carcinoamelor cu celule tranziționale concentrat pe detectarea pierderii heterozigozității pe 9p și 9q. În plus, abordarea bazată pe matrici a fost demonstrată a oferi avantaje distincte pe lângă analiza convențională a microsateliților în acest studiu.

Tehnologia microarray a fost folosită cu succes în multiple studii privind vascularizația, inclusiv identificarea transcriptelor celulare îmbogățite, baza patologică a bolilor, și răspunsul extern la stimuli într-o manieră specific celulară.

De exemplu, tehnologia microarray a fost folosită cu succes în investigarea mecanismului rezistenței celulare la efectele apoptotice ale bolii fatale: purpura trombotică trombocitopenică idiopatică (TTP). TTP este o boală caraterizată prin injuria apoptotică a tuturor celulelor endoteliale microvasculare (MVEC) cu excepția celor de origine pulmonară. Tehnologia cipurilor genice oligonucleotidice a identificat gene supraexprimate diferențial în MVEC TTP-rezistente (plămân) comparativ cu MVEC TTP-sensibile (piele) și prin urmare care pot contribui la rezistența la apoptoză indusă de plasma TTP a MVEC pulmonare. Acest studiu a arătat că expunerea celulelor la plasma TTP a obținut 157 de gene care erau supraexprimate în MVEC pulmonare, inclusiv semnale specifice pro-supraviețuire cum ar fi antagonistul TRAIL (ligandul inductor al apoptozei asociat cu factorul de necroză tumorală), osteoprogerina și factorii de creștere vasculară endotelială, VEGF/VPF și VEGF-C și receptorii săi VEGFR-2 (KDR) și VEGFR-3 (Flt4).

Studii similare au identificat gene supraexprimate în angiogeneză. Angiogeneza este un proces cheie într-o varietate de boli, inclusiv în cancer. Abilitatea de a ținti selectiv vascularizația tumorală este utilă pentru diagnoticul și tratamentul cancerului. Celule endoteliale tumorale (TEC), în contrast cu celule endoteliale normale, sunt rezistente la apoptoză, sunt proadezive pentru celule carcinomatoase renale, și sunt capabile de creștere și organizare în absența serului în structuri persistente capilar-like. A fost utilizată recent tehnologia cADN array pentru a identifica markeri specifici pentru TEC. Într-un studiu, IGFBP-3 a fost găsită a fi resticționată exclusiv celulelor endoteliale, care indică IGFBP-3 ca un potențial marker nou pentru angiogeneză. Într-un alt studiu, expresia angiopoietinei-1 și factorului de creștere vasculară endotelială (VEGF)-D și căii de supraviețuire Akt au fost găsite marcat reglate pozitiv în TEC. Aceste rezultate sugerează posibilitatea utilizării IGFBP-3, VEGF-D sau calea Akt drept ținte terapeutice pentru strategii angiogenice. Tehnologia matricilor ADN a fost utilizată recent pentru a stabili o legătură moleculară între hiperhomocisteinemia (HHCy) și ateroscleroză. Analiza microarray a arătat că homocisteina (Hcy) este legată de probleme în reglarea colesterolemiei prin demonstrarea că tratamentul Hcy a celulelor endoteliale ale venei ombilicale a rezultat în reglarea pozitivă a 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A reductaza, o enzimă implicată în sinteza colesterolului. Analize biochimice suplimentare efectuate în acest studiu, au confirmat că Hcy a rezultat într-o creștere celulară a nivelului de colesterol, ceea ce sugerează o explicație nouă solidă a efectului proaterogenic observat al homocisteinei.

În plus, sisteme array genice au fost folosite pentru a studia răspunsul celular a celulelor endoteliale la stimuli externi. Într-un studiu, a fost analizat răspunsul culturilor de celule endoteliale dermale microvasculare umane la infecția cu herpes virus asociat cu sarcomul Kaposi. A fost observată dereglarea semnificativă a unor gene sau receptori citokin-legate, precum și markeri celulari endoteliali și macrofage și alte gene asociate cu angiogeneză sau transformare. Microrețelele au fost utilizate de asemenea pentru analiza schimbărilor în expresia genelor după stimularea celulelor endometriale miometriale microvasculare cu factor de creștere vasculară endotelială (VEGF). În acest studiu, un total de 110 gene au fost identificate ca reglate pozitiv de către VEGF, din care marea majoritate (81%) nu au fost raportate anterior ca fiind reglate pozitiv de către VEGF sau angiogeneză.

Alterările moleculare critice în terapeutica cancerului include alterări ale numărului de copii (CNA) cum ar fi amplificările genice și delețiile precum și rearanjările genomice ce rezultă în fuziuni genice. Amplificările ADN au fost demonstrate să conțină oncongene importante, cum ar fi gene ce codifică receptorii HER2 și EGF. Descoperirea translocărilor cromozomiale în tumori solide, cum ar fi cea care implică gena ALK rezultând într-o nouă proteină oncogenică de fuziune în adenocarcinomul pulmonar, a condus de asemenea la noi terapii țintite împotriva acestor schimbări.

Array CGH (aCGH) este o tehnologie a genomului integral folosită pentru a detecta CNA asociate cancerului. Array CGH permite caracterizarea cu acuratețe a numărului de copii genice folosind doar 0.5 µg de ADN genomic.

În prezent, microrețele cu densitate mare conțin 200,000 de probe și interoghează genomul cu o rezoluție medie de 10-50 kb. Rezoluția înaltă permite demarcarea mai bună a punctelor de rupere ADN în regiuni ale CNA precum și identificarea CNA foarte mici, focale în plus față de regiuni cromozomale mari implicând câteva Mb, ce umple astfel golul dintre tehnologiile de citogenetică convențională care se adresează aberațiilor cromozomiale microscopice grosiere (>1 Mb) și tehnologiile de secvențiere care detectează variații la nivelul unei singure nucleotide.

Progresele recente făcute în înțelegerea biologiei leucemiei mieloide cronice (LMC) au dus la dezvoltarea unor terapii remarcabil de efective împotriva acestei boli a celulelor clonale stem. Din punct de vedere citogenetic LMC este caraterizată de o translocație cromozomială specifică t(9;22)(q34;q11), care rezultă într-un cromozom 22 mai scurt, numit cromozomul Philadelphia (Ph). Pentru 90% din pacienții cu LMC, apariția cromozomului Ph rezultă în dezvoltarea unei secvențe genice noi compusă din regiunea cluster a punctelor de rupere (regiune cluster de ruptură-BCR) a cromozomului 22 și c-Abl (omologul oncogenei virale de leucemie murină Abelson I) a cromozomului 9. Prin urmare, gena de fuziune BCR-ABL1 reprezintă marca LMC, iar produsul său reprezintă o țintă terapeutică.

Într-un grup de studiu de 45 pacienți care au fost înscriși într-un test de escaladare a dozei de imatinib pentru răspunsurile slabe la terapia de primă linie în doze standard, s-a efectuat screening-ul genomului integral pentru regiuni cu câștig sau pierderi de material genetic folosind array-CGH. Răspunsul molecular rapid (EMR) definit ca o reducere cu peste 50% a proporției BCR-ABL1 la ABL1 în 6 luni de la creșterea dozei a reprezentat un punct major al analizei. Douăzeci și nouă de regiuni alterate în mod recurent au fost găsite: 23 cu câștiguri și 6 cu pierderi. Au fost comparate modificări regionale ale numărului de copii între pacienții cu EMR și cei fără și trei regiuni alterate în mod recurent au fost găsite cu valoarea P <0.1. Câștig al numărului de copii pe 16p11.2 a fost observat predominant la pacienții cu EMR, comparativ cu pacienții fără EMR (P=0.034). A fost observată o tendință pentru creșterea numărului de copii pe 12q11.23 la pacienții fără EMR și o scădere a numărului de copii pe 17q12 la pacienți cu EMR, deși descoperirile nu sunt semnificative din punct de vedere statistic (P=0.072 și respectiv 0.070).

După analiza array-CGH, a fost efectuată o recenzie a literaturii folosind hărți genomice aprovizionate de Centrul Național de Informație Biotehnologică US. Genele din regiunile cu alterări ale numărului de copii au fost identificate, iar cele raportate a fi implicate în dezvoltarea sau progresia cancerului au fost selectate printre ele. Această procedură a raportat patru gene candidate: glutation S-transferaza theta 1 (GSTT1); sulfotransferaza 1A1 (SULT1A1); domeniile conținătoare PYD și CARD (PYCARD) și adaptorul transcripțional 2A (TADA2A).

Studii de validare pentru aceste patru gene au fost efectuate folosind test PCR cantitativ în timp real la 52 de pacienți ale căror probe de bază au fost valabile, dintre care 44 au fost supuse analizei array-CGH. Câștig al numărului de copii a GSTT1 pe 22q11.23, a fost corelat cu câștig al numărului de copii pe 22q11.23 (P <0.001). Câștig al numărului de copii GSTT1 a prezis de asemenea timp median scurt pentru eșecul tratamentului (TTFx). Când analiza a fost efectuată pentru 24 de pacienții fără mutația genei BCR-ABL1, TTFx a fost semnificativ mai scurtă la pacienți cu câștig al numărului de copii GSTT1 (10.6 luni vs. 18.0 luni; P=0.007).

În LMC, analiza array-CGH este folositoare în cel puțin două grupuri de pacienți. Primul grup de pacienți la care se așteaptă să prezinte alterări importante ale numărului de copii este cel al pacienților cu rezistență la ABL1 TKI (inhibitorii tirozin kinazici). Mecanismele care stau la baza rezistenței celulelor LMC la ABL1 TKI nu sunt pe deplin înțelese. S-a propus că aproximativ 50% din pacienți cu rezistență dobândită la imatinib au mutații punctiforme în domeniul kinazelor BRC-ABL1. Cu toate acestea, pentru restul de 50% de pacienți care prezintă rezistență dobândtiă la imatinib, mecanismul nu este clar elucidat. Au fost sugerate pentru acești pacienți defectele în transportul drogurilor și activarea altor căi cum ar fi calea Lyn, dar fără dovezi definitive. Prezența mutațiilor în kinaza BCR-ABL1 a fost asociată cu o evoluție citogenetică clonală, care ar putea facilita progresia bolii. În concordanță, prezența mutațiilor în kinaza BCR-ABL1 a fost asociată cu o posibilitate mai mare de progresie către faza de blast, fapt ce sugerează instabilitatea genomică crescută în aceste celule. Luând în considerare cele de mai sus, se poate afirma că celulele LMC cu rezistență la TKI ar putea prezenta instabilități genetice profunde. Aceste instabilități genetice pot duce la formarea mutațiilor în kinaza BCR-ABL1 și acumularea de leziuni genetice adiționale. Leziunile genetice adiționale pot include mutații punctiforme, amplificări genice, pierderi genice și translocații cromozomiale care sunt crezute a conduce procesul malign. Prin urmare, identificarea acestor alterări și elucidarea genelor implicate în aceste regiuni ar oferi o înțelegere suplimentară a TKI și rezultate îmbunătățite pentru pacienții cu LMC.

Array-CGH poate juca un rol important în căutarea modificărilor genetice potențiale responsabile de rezistența la TKI.

S-a efectuat analiza array-CGH la pacienți LMC care urmau să primească doze crescute de imatinib pentru rezistența lor la doza standard (400 mz/zi) de imatinib. În acest studiu, câștig în numărul de copii pe 16p11.2 a fost mai frecevnt observat la pacienți care au avut răspuns favorabil la dozele crescute de imatinib. De asemenea, a fost observată o tendință pentru creșteri frecvente în numărul de copii pe 17q12 la pacienți care au avut răspuns slab la dozele crescute de imatinib. A putut fi demonstrat de asemenea creșterea numărului de copii GSTT1 pe 22q11.23 observată frecvent la pacienți care nu au răspuns favorabil la dozele crescute de imatinib prin test PCR cantitativ în timp real pentru validarea rezultatelor array-CGH. Câștig în numărul de copii GSTT1 a fos un factor predictiv indenpendent pentru supraviețuirea scurtă fără progresie la acești pacienți.

Al doilea grup de pacienți este a celor cu LMC-AP (faza accelerată) sau LMC-BC (criza blastică). Analiza recentă array-CGH de înaltă rezoluție cu probe extrem de dense a genomului integral a detectat aberații genetice multiple la pacienți cu LMC-CP (faza cronică). Pacienții cu LMC-BC prezintă cariotipuri mult mai complexe. Așadar, instabilitatea genomică este un eveniment timpuriu la pacienții cu LMC-CP, care evoluează în LMC-BC. Totuși, încă nu se cunosc prea multe despre modificările genetice care stau la baza LMC-AP și LMC-BC. Cercetările anterioare folosind array-CGH la acești pacienți au dezvăluit următoarele. La pacienții cu LMC-AP tratați cu imatinib, alterări ce flanchează genele ABL1 și BCR pe cromozomii 9 și respectiv 22, au reprezentat leziunile cele mai comune identificate. Cinci pacienți din 15 au prezentat pierderea porțiunilor variabile a 9q34.11, proximal de ABL1. Pierderile ce implică 1p36, 5q31, 17q25, Y și câștigurile pe 3q21, 8q24, 22q11, Xp11 au fost printre alte leziuni recurente identificate. De asemenea, folosind array-CGH, Nacheva et al. au studiat mecanismul care determină transformarea LMC-CP la LMC-BC. Cercetătorii au descoperit o semnătură unică de deleții genomice în regiunea receptorilor imunoglobulinelor cu lanț greu și a receptorilor celulelor T, însoțite frecvent de pierderea concomitentă a secvențelor în regiunile de pe brațul scurt al cromozomilor 7 și 9, inclusiv genele IKZF1, HOXA7, CDKN2A/2B, MLLT3, IFNA/B, RNF38, PAX5, JMJD2C și PDCD1LG2.

Cancerul pulmonar este principala cauză de mortalitate legată de cancer în lume la bărbați și a doua cauză la femei. Sunt recunoscute două tipuri histologice majore cu biologie și răspuns terapeutic diferit: cancer pulmonar microcelular (SCLC) și cancer pulmonar non-microcelular (NSCLC). SCLC este un cancer foarte agresiv în care aproape toții pacienții se prezintă cu metastaze în momentul diagnosticului. Prin urmare, pacienții cu SCLC sunt tratați prin chemoterapie, la care este înalt sensibilă. În contrast, aproximativ o treime din pacienții cu NSCLC sunt diagnosticați cu tumora localizată strict la nivel pulmonar și cu posibilitatea rezecției chirurgicale. Prin urmare, cel mai mare potențial de reducere a mortalității cancerului pulmonar este dat de un program screening eficace, pentru a descoperi cancerul în stadiul cât mai incipient.

Similar altor malignități epiteliale, cariotipul NSCLC prezintă poliploidie (în spectrul de 58-102 cromozomi per celulă) și multiple aberații cromozomiale complexe, rezultând în câștig sau pierdere netă de material genetic ce indică instabilitate genomică. Cancerul pulmonar este o boală înalt heterogenă, și totuși profilurile CNA (alterări ale numărului de copii) a subtipurilor histologice majore de NSCLC sunt remarcabil de similare, cu frecvente câștiguri ce implică 5p, 8q, 3q, și 1q, pierderi frecvente pe 3p, 8p, 9p, 13q și 17p. Amplificările sunt observate frecvent în forma double minutes (dmins). Cunoașterea ordinii sau progresiei acestor aberații ramân preliminare; câțiva cercetători au speculat că evenimentele incipiente inlcud trisomia 7, pierderea pe 3p și trisomia 12.

Array-CGH a permis cercetătorilor să identifice și să prezinte CNA în cancerul pulmonar în detaliu. Rezoluția înaltă a acestei tehnici clarifică amplificările și delețiile genomice în regiuni care adesea conțin doar câteva gene, și identifică de asemenea aberații mici nedetectate anterior. Drept rezultat, lista genelor implicate în patobiologia NSCLC crește rapid. Tonon et al. a identificat 93 regiuni comune minimale (MCR) de aberație în 44 tumori NSCLC și linii celulare, dintre care 21 cuprindeau mai puțin de 0.5 Mb cu o medie de 5 gene în fiecare, cu aproape toate genele implicate anterior în patogeneza NSCLC prezente în aceste regiuni, precum și multe gene candidate noi. Într-un studiu mare, 371 de adenocarcinoame au fost analizate folosind SNP array-CGH, Weir et al. a identificat 26 evenimente recurente de scară mare ce implică câștigul sau pierderea a cel puțin jumătate de cromozom, împreună formând mai mult de jumătate din genomul uman. În plus, au fost identificate 31 de amplificări focale și deleții homozigote, inclusiv multiple gene noi. Cele mai comune regiuni amplificate în cancerul pulmonar includ MYC, TERT, CCND1 și EGFR, dar multe alte ținte de amplificare au fost identificate într-un procent mai mic de cazuri. Figura 14 prezintă frecvența câștigurilor și pierderilor în genomul NSCLC.

Multe studii aCGH au axat analiza pe detectarea diferențelor în profilul genomic al numărului de copii între tipuri histologice diferite de cancer pulmonar. Majoritatea studiilor au examinat specific carcinomul cu celule scuamoase și adenocarcinomul, cele două tipuri mai comune de NSCLC. În total, structura aberațiilor a fost similară între adenocarcinom (ADC) și carcinomul cu celule scuamoase (SCC); metodele de grupare supervizate sau nesupervizate nu au putut face diferența dintre cele două. Cu toate acestea, un număr distinct de asocieri au fost identificate.

De departe ceea mai frapantă diferență a fost câștigul de material genetic pe brațul lung al cromozomului 3 ce se întinde pe o regiune largă de 30 Mb, inclusiv benzile q25 până la q29. Pe lângă faptul că sunt destul de specifice pentru SCC, câștigurile pe 3q au loc cel mai probabil în stadiile incipiente ale cancerului.

Fig. 14. Variații ale numărului de copii ADN comune în NSCLC. Frecvența câștigurilor și a pierderilor sunt plasate la dreapta și respectiv la stânga locației cromozomului.

Asocierea câștigului pe 3q cu SCC a fost recunoscută anterior de CGH cromozomal clasic și de alte experimente de citogenetică moleculară. Studiile microarray au confirmat aceste descoperiri, și în plus, au permis cercetătorilor să definească segmentele implicate la o rezoluție suficient de înaltă pentru a începe identificarea cu încredere a oncogenelor individuale care reprezintă țintele cele mai probabile ale amplificării. Oncogene candidate în această regiune includ PIK3CA, TP63, SOX2, DCUN1D1, EV11, MDS1, TP73L, FGF12, SST, TGFA și GLUT2. Totuși, pentru multe dintre acestea, rolul oncogenic rămâne a fi determinat.

O regiune a 8p12 a fost raportată ca fiind amplificată în 10-15% din SCC, în timp ce, în contrast, probe ADC prezintă frecvent pierderi ce implică 8p. Alte variații ale numărului de copii raportate de mai multe studii ca fiind asociate semnificativ cu SCC, includ câștig 2q, pierdere 3p și câștig 12q.

Pentru ADC, principala CNA specifică tipului histologic descrisă, a fost recent recunoscută cu ajutorul tehnologiei aCGH de către două studii mari concomitente și cuprinzătoare. Weir et al. a descoperit, prin analiza aCGH, amplificări 14q13.3 ce conțineau NKX2-1 (TITF1) în 6-12% din 528 de probe ADC, și 12% dintr-un set separat de 330 ADC prin analiza FISH. Kwei et al. a găsit o proporție similară, 11% din 36 ADC, în timp ce numai 1 din 40 SCC prezentau această amplificare prin aCGH. Remarcabil, acestă amplificare nu a fost identificată într-un total de 385 cancere mamare, de prostată, colon și pancreas, oferind dovezi suplimentare în ceea ce privește specificitatea sa pentru ADC pulmonar.

Kang et al. a aplicat o matrice BAC țintită la 36 NSCLC primare și a găsit alterări în următorii loci a fi semnficativ asociate cu histologia ADC: câștig pe 1q, 6p și 7q; și pierderi pe 9q, 10p și 15q. Garnis et al. a folosit matrici BAC SMRT de 32 k pentru a studia 28 de linii celulare NSCLC. Alterările specifice liniilor ADC-derivate identificate includ câștiguri pe 3q22 (proximal de regiunea SCC-asociată pe 3q26-29), 12 și 14; și pierderi pe 2q și 13q. Newnham et al. au studiat 69 eșantioane NSCLC înghețate din leziuni în stadiile I-IIIA excizate cu intenție curativă, folosind matrici BAC. Alterațiile numărului de copii găsite asociate semnificativ cu ADC în setul lor de date au fost câștig pe 6p21.31-25.1, și pierderi pe 6q13-27. În plus, au găsit o tendință semnificativă la schimbări de magnitudine mare în câteva regiuni cu alterări comune cu SCC: câștiguri pe 7p, 7q și 8q; și pierderi pe 9p, 13q, 17p, 18q, 19p, 19q și 22q.

Au fost folosite de asemenea metode statistice avansate în analiza variațiilor numărului de copii între subtipurile histologice. Massion et al. a aplicat gruparea aglomerată ierarhizată folosind 100 din cele mai informative elemente array pentru a discrimina cu acuratețe între ADC și SCC. Shibata et al. a aplicat gruparea ierarhizată nesupravegheată la date aCGH de la o serie de 55 mostre ADC în diferite stadii (I-III), microsecționate, fixate cu metanol și incluse la parafină și au descoperit trei subcategorii distincte de ADC. Una dintre acestea a prezentat semnificativ mai puține aberații ale numărului de cromozomi (CNA), dar câștiguri mai frecvente pe 19q13.1 și pierderi pe 22q12.2. Celelalte două grupuri au prezentat multe aberații ale numărului de copii suprapuse, dar unul a prezentat câștiguri mai frecvente pe 1p25-32, 4p16.3, 11p.15, 12q13-14, 16p11.2-13.3, 17q11.1-25, 19q13.2, 20p11, 20q11.2, și 22q12.2 și pierderi pe 1p22, 6q26, 10q24-26, 13q22.1-34, 15q21-25, și 18p11.2; iar celălalt grup a prezentat câștiguri mai frecvente pe 5p12-14.3, 7p12.3-21.1, 7q22, 7q31, 8q12-21 și 4q11-24, și pierderi pe 1q23.3-41, 10q22.1 și Xq. Aceste grupuri au fost semnificativ asociate cu fumatul dar nu și cu alte aspecte clinicopatologice, inclusiv histologice, stadiu sau supraviețuire. Validarea acestor grupuri pe un set de date separat nu a fost efectuată în nici una din studiile menționate anterior.

Boelens et al. a interogat mostre tumorale microsecționate cu laser de la 34 de pacienți ce prezentau SCC localizat central, care au fost urmăriți cel puțin 5 ani, inclusiv 15 pacienți fără metastaze, 8 cu metastaze strict în ganglionii limfatici regionali și 11 cu metastaze exclusiv în organe la distanță la 2 ani de la operație. Folosind o matrice BAC UMCG 65 K, au găsit asocieri semnificative cu metastaze la distanță pentru câștiguri 8q, pierderi 8p și 13q. Câștiguri în loci diferiți ale regiunii 8q22-q24 se găseau în 50 până la 60% din pacienți cu metastaze la distanță, și la doar 7-20% din pacienți fără metastaze. Genele candidate pe 8q comentate de autori, fundamentate de genele supraexprimate raportate anterior au inclus CDH17, SPAG1, RAD21, MTBP, HAS2 și ANGPT1, în timp ce MYC a fost menționat a fi localizat înafara regiunii semnificative. Prezența metstazelor în ganglionii limfatici a fost asociată cu câștiguri pe 7q, 8p, 10q și 12p și pierderi pe 4p și 4q. Tumorile fără metastaze la 5 ani au prezentat asocieri cu câștiguri pe 2p și pierderi pe 11p.

Oferind sprijin suplimentar pentru valoarea prognosticului câștigurilor 8q, Iwakawa et al. au demonstrat o asociere a unui amplicon 8q, inclusiv MYC și PVT1, cu prognostic prost la 105 pacienți cu ADC de dimensiuni mici în stadiile I-III. Ei au continuat validarea acestei descoperiri pe un alt set mare de 162 ADC pulmonare stadiul I, și au găsit o asociere între câștigul 8q și supraviețuirea fără recurențe scăzută.

Peng et al. au folosit o matrice BAC particularizată MCG țintită cu 800 de clone pentru a studia 41 carcinoame neuroendocrine de grad înalt în stadiile I-III (10 SCLC și 31 LCNEC) și au găsit 10 loci a căror aberații prezentau asocieri semnificative cu prognosticul pacienților, inclusiv câștigurile pe 8q. Alte alterări cu asocieri semnificative au fost localizate pe 10q, 18q, 20p și 20q. O analiză multivariabilă ce include sexul, vârsta, mărimea tumorală, metastazele la nivelul ganglionilor limfatici și stadiul, a dezvăluit asocierea pierderii 10q cu prognosticul prost în aceste tumori.

În concordanță cu descoperirea unei asocieri între pierderile 4q și metastazele ganglionilor limfatici în SCC, Wrage et al. a raportat dovezi ce sprijină utilitatea prognostică a pierderilor 4q prin studierea tumorilor NSCLC primare de la 30 de pacienți folosind matrici oligonucleotidice umane VUMC și MACF 30 K. Aceștia au găsit asocierea între pierderi pe 4q21, 10p, 10q și câștiguri pe 17q și 20q cu prezența celulelor tumorale diseminate la nivelul măduvei osoase și au validat asocierea pierderilor 4q prin FISH pe 29 tumori NSCLC adiționale și 36 metastaze cerebrale. Pierderea 4q a fost găsită de FISH în 50% din pacienții cu măduva osoasă pozitivă comparativ cu 6% din pacienții cu măduva osoasă negativă. Pierderile pe 4q au fost asociate cu histologia SCC și stadiul tumoral, iar în analize multivariabile doar statusul măduvei osoase și stadiul tumoral au rămas drept factori independenți. Studiul nu a identificat o genă supresoare tumorală specifică în această locație, dar a marcat că gene exprimate diferit erau grupate în această regiune în cinci hot-spot-uri diferite în regiune. Genele candidate în această regiune remarcate de Weiss et al. includ MAPK10, GPR103, PCDH18, RAPGEF2 și FSTL5.

Kang et al. au folosit un cip BAC MacArray™ Karyo4000K pentru a realiza profilul ADN extras din 22 preparate SCC în stadiile I-III, și au găsit asocierea puternică a pierderilor pe 9p, în aproximativ 35% din tumori cu metastaze la nivelul ganglionilor limfatici, histologie slab diferențiată și stadiu avansat. Platforma array le-a permis definirea a două regiuni distincte recurente de deleție homozigotă pe 9p: una ce se întinde pe o regiune de 128 kb pe 9p21.2 ce conține genele supresoare tumorale presupuse CDKN2A/p16, MTAP și TEK, iar cealaltă cuprinde o regiune de 200 kb pe 9p24.3 ce conține 18 ținte posibile inclusiv genele tumorale presupuse DOCK8, DMRT1 și DMRT3.

Aplicațiile aCGH ca marker predictiv pentru cancerul pulmonar sunt limitate în prezent; totuși acest lucru se va schimba cel mai probabil în viitorul apropiat, pe măsură ce din ce în ce mai multe terapii moleculare țintite sunt dezvoltate pentru eficacitatea crescută a acestora împotriva leziunilor genetice specifice. Aceste terapii includ activarea mutațiilor și/sau amplificărilor ce implică oncogene care redau dependența celulelor tumorale la aceste aberații. Exemplele următoare ilustrează felul în care amplificările focale pot expune oncogene specifice care determină creșterea unui anumit cancer pulmonar și cum prin înlăturarea determinantului folosind terapie țintită poate determina un răspuns impresionant la tratament.

Mutațiile și amplificările EGFR în ADC pulmonar au fost stabilite drept predictive pentru rata mai crescută a răspunsului la tratament de către inhibitorii tirozin kinazei EGFR (TKI). Atât mutațiile cât și amplificările sunt asociate cu o demografie specifică: asiaticii de est, femei, nefumătoare, cu adenocarcinoame care prezintă un model histologic bronhioloalveolar. Cele mai multe studii ale numărului de copii au recurs la FISH pentru a detecta prezența amplificărilor.

Li et al. au testat abilitatea aCGH de a detecta amplificări EGFR în 77 de pacienți cu ADC, folosind micromatrici Affymetrix Genome-Wide Human SNP array 6.0. Ei au raportat că atât amplificările detectate de FISH cât și de aCGH erau puternic corelate cu prezența mutației EGFR în domeniul tirozin kinazei (exonii 18-21) prin secvențierea directă (p=0.001 și respectiv p< 0.001), demonstrând că aCGH este o metodă validă în detectarea amplificărilor EGFR. Câștig al numărului de copii a fost detectat de aCGH în 42/50 (80%) din cazurile cu mutații EGFR, iar 7/24 (29%) din cazurile cu tip sălbatic, sugerând că detecția doar a mutațiilor EGFR comune poate scăpa un subset de pacienți care ar putea răspunde la terapia TKI.

Limite

Tehnica array CGH oferă avantaje importante comparativ cu alte metode citogenetice de diagnostic. În primul rând pentru că nu este necesar obținerea de metafaze și permite analiza ADN-ului extras din diferite țesuturi, inclusiv țesuturi inluse în parafină. Alte avantaje includ abilitatea de a căuta sute de regiuni cromozomiale într-o singura analiză, într-o perioadă scurtă de timp și cu rezoluție înaltă, depășind limitările cariotipării convenționale și CGH metafazic. Alte avantaje ale acestei metode moleculare include faptul că nu este necesară cunoașterea în avans a regiunii genomice implicate și în plus abilitatea de a studia cazuri în care este valabil doar ADN-ul, fără a putea obține cromozomi. Metoda poate fi reprodusă din punct de vedere clinic, cu rezultate fiabile în 48 de ore.

Microrețelele oligonucleotidice au înlocuit în mare parte matricile cADN pentru studierea genomului uman și a organismelor model, deoarece ele permit definirea flexibilă a unei platforme de hibridizare controlate și atent proiectate. Acuratețea în designul rețelelor oligonucleotidice a fost îmbunătățită considerabil de la completarea secvențierii genomului uman în 2003. A devenit astfel valabilă o secvență cartografiată de înaltă calitate pentru întreg transcriptomul, iar o bază de date bine adnotată a structurii genelor a fost dezvoltată.

Progresul în ceeea ce privește eficacitatea și nivelul sintezei chimice de ADN, a creat o metodă economică pentru producerea pe scară largă a probelor oligonucleotidice. Sinteza chimică depinde de adăugarea etapizată a nucleotidelor protejate la catene ADN emergente, care sunt de regulă ancorate la un suport solid de către primul nucleotid. Nucleotidul protejat previne adăugarea grupurilor subsecvente, iar la fiecare pas catenele emergente trebuie deprotejate înainte ca nucleotide suplimentare să poată fi atașate. Așadar, la fiecare pas catenele emergente sunt mai întâi deprotejate, apoi sunt scăldate într-o soluție ce conține nu mai speciile de nucleotide dorite. Secvențele dorite pentru probe sunt construite literă cu literă în această manieră etapizată.

Affymetrix Technologies este un furnizor de top de microrețele oligonucleotidice comerciale, iar compania oferă o metodă care este cea mai precisă spațial pentru depunerea probei pe bine-cunoscutele sale matrici GeneChip™. Affymetrix sintetizează probe oligonucleotidice 25-mer direct pe substraturi de silicon căptușite folosind microfotolitografie pentru a deproteja catenele oligonucleotidice în locații definite precis. Probele sunt sintetizate in situ înăuntrul probelor celulare la concentrații ce variază de la 100,000 la 1 milion de oligonucleotide per probă celulară.

Strategia designului Affymetrix postulează specificitate crescută folosind probe scurte oligonucleotidice de 25-mer, care include o probă nepotrivită utilizată drept control pentru fiecare potrivire perfectă. Proba nepotrivită este diferită prin prezența unei singure baze în poziția celui de-al 13-lea nucleotid. Unsprezece probe potrivite perfect sunt oferite în puncte diferite în regiunea 3´ a fiecărei genă, care sunt referite colectiv ca set de probe.

Limitarea importantă a acestui design include variația afinităților de hibridizare folosind probe 25-mer, care de regulă nu pot fi potrivite la aceeași temperatură de topire. Așadar, sensibilitatea probei poate varia larg în rândul seturilor de probe. În plus, un model satisfăcător a strategiei de nepotrivire a fost greu de dezvoltat, o modelare statistică extensivă este necesară pentru a putea interpreta rezultatele acestei platforme.

Argumente pro și contra folosirii probelor oligonucleotidice mai lungi s-au acumulat după ani de experiență cu matrici Affymetrix, cu multe alte grupuri preconizând probe de lungimi între 60 și 70 perechi de baze. Agilent Technologies, un alt producător de top, sintetizează oligonucleotide in situ folosind tehnologie ink-jet pentru a distribui nucleotidele în poziții precise pe matricile sale. Oligonucleotidele de 60-mer astfel rezultate pot fi modificate folosind algoritmi software pentru a satisface cerințele teoretice pentru temperaturi de topire echivalente, unicitatea secvenței, și lipsa elementelor repetitve și a structurii secundare. Totuși, acești algoritmi nu sunt perfecți, așa că Agilent raportează validarea și selectarea empirică pentru majoritatea probelor sale.

Agilent a efectuat comparații una lângă alta pe platforma sa și raportează că oligonucleotidele 60-mer sunt la fel de specifice dar de cinci până la opt ori mai sensibile comparate cu probe-control de oligonucleotide 25-mer. În contrast, Affymetrix a indicat că sunt necesare probe multiple per transcript pentru a implementa matrici cu oligonucleotide scurte și a oferit date proprii pentru a susține această strategie.

Toate matricile sunt folosite drept unelte pentru a determina interacțiunile dintre molecule imobilizate la o suprafață solidă și molecule care sunt într-o mixtură complexă într-o soluție, care se află în contact cu matricea. Aceste interacțiuni care se petrec sunt pe urmă detectate și cuantificate. Toate matricile ADN, în condiții favorabile, prezintă abilitatea de a hibridiza între ei acizii nucleici cu secvențe complementare. În matricile ADN, un acid nucleic este imobilizat pe o suprafață solidă, iar acidul nucleic din soluția de hibridizare este marcat cu un izotop radioactiv, cu o moleculă chimică sau de culoare, care poate fi detectată cantitativ. Acidul nucleic legat de suprafața solidă a micromatricii este numită probă, iar acidul nucleic care este marcată de o moleculă reporter cum ar fi izotop sau de culoare va fi numită țintă. Teoria în spatele acestei nomenclaturi constă în faptul că acizii nucleici probă imobilizați pe suprafața matricii sunt folosiți pentru a interoga mixtura complexă de acizi nucleici marcați pentru acizi nucleici din soluția de hibridizare care sunt complementari cu și care se vor asocia cu proba imobilizată (legată).

Cheia tehnologiei micromatricilor ADN o reprezintă hibridizarea acizilor nucleici, care apare când acizi nucleici mono-catenari (denaturați) sunt incubați împreună în condiții care promovează formarea de molecule perechi de baze duplex prin cuplarea bazelor C:G sau A:T. Acizii nucleici hibrizi dublu-catenari sunt, prin urmare, compuși din secvențe care sunt complementare una cu alta. Condiții care favorizează hibridizarea acizilor nucleici pot fi promovate prin manipularea timpului, temperaturii și puterii ionice a amortizorului de hibridizare (stringență) și va fi afectată de concentrația și complexitatea probei. Hibridizările sunt efectuate de obicei la stringență scăzută (concentrație crescută de săruri), frecvent în prezența formamidei, deoarece formamida permite efectuarea hibridizării la temperaturi relativ scăzute (42șC). Stabilitatea hibrizilor ADN depinde de existența unor nepotriviri ale duplexului de acizi nucleici, aceasta scăzând pe măsură ce numărul de nepotriviri crește. Stabilitatea duplexului de acizi nucleici determină cât de puternic este atașat ADN-ul țintă la acidul nucleic probă imobilizat, și cât de ușoară sau dificilă este spălarea ADN-ului țintă marcat din legarea nonspecifică la probele atașate. Spălările pentru a destabiliza și, în consecință, pentru a înlătura hibrizii nepotriviți, sunt efectuate în condiții de stringență crescută (în scop practic, în general înseamnă scăderea concentrației de săruri și/sau creșterea temperaturii), astfel că hibridizarea nonspecifică este minimizată.

Macromatricile Panorama® (macroarrays) comercializate de Sigma-Genosys constau în produși PCR imobilizați pe membrane de nailon, unde fiecare produs PCR reprezintă o parte dintr-o genă sau o singură genă în totalitate. În experimente transcriptomice, acești produși PCR imobilizați sunt hibridizați cu produși cADN marcați radioactiv și spălați, iar membrana rezultată este scanată folosind un sistem de imagerie cu fosfor. Pentru macromatrici, trebuie condusă compararea între două probe folosind două hibridizări separate, deoarece probele test și control sunt marcate cu aceeași moleculă reporter. Pe lângă miniaturizare, diferența cheie dintre un experiment ADN microarray standard pe lamă de sticlă și experimentele conduse folosind sisteme cum sunt macromatricile Panorama®, este accea că matricile pe lamă de sticlă folosesc hibridizarea competitivă dintre cADN-urile derivate din două surse și proba ADN imobilizată. În aceste experimente, fiecare cADN din surse diferite este marcat cu o culoare fluorescentă diferită. Hibridizarea competitivă are mai multe avantaje: permite compararea directă între două probe, de exemplu tip sălbatic (control) și un mutant (test) pe aceeași matrice, iar din punct de vedere al fiabilității și al reproductibilității, hibridizarea competitivă învinge iregularitățile proprietăților spoturilor probei sau ale condițiilor locale de hibridizare pe matrice, care ar putea afecta în mod negativ intensitățile semnalelor de hibridizare. În hibridizarea competitivă, semnalul din fiecare spot de pe matrice este, așadar, o proporție a semnalelor atât a probelor control cât și a probelor test, unde probele control și test au suferit condiții de potrivire. Acest lucru înseamnă că indiferent dacă depunerea probelor sau condițiile de hibridizare sunt neregulate, proporții ale intensității semnalelor pot fi obținute cu acuratețe.

Modurile majore de folosire a micromatricilor ADN sunt: profilarea expresiei genelor, detecția și caracterizarea patogenilor, hibridizarea genomică comparativă (CGH), genotiparea, resecvențierea genomului integral.

Micromatricile ADN sunt o unealtă puternică pentru monitorizarea simultană a sute de nivele transcript. Însă, multe transcripte importante în funcții au nivele de expresie scăzute sau sunt exprimate în relativ puține celule, fiind astfel dificil de detectat în fundalul complex al țesutului întreg. Așadar, rezultate mai fiabile pot fi obținute folosind celule cultivate decât probe de țesut. În plus, cipurile genice, în general detectează fiabil numai transcripte cu abundență medie-crescută, deoarece detecția transcriptelor cu abundență scăzută, din care multe au relevanță importantă pentru funcția biologică, este inconsistentă. Este esențială confirmarea concluziilor experimentale derivate din datele generate de analiza array folosind metode suplimentare mai sensibile, cum ar fi tehnologia PCR.

Utilizarea metodelor de CGH în diagnosticul prenatal (etiologia avorturilor spontane, etiologia morții in utero, anomaliilor fetale)

Aproximativ 2% până la 5% din nou născuții vii au cel puțin o anomalie congenitală identificabilă la naștere, clasificându-se de la anomalii ușoare la cele severe ce compromit supraviețuirea. Malformațiile congenitale sunt de o importanță în creștere fiind cauze de suferință și daună a sănătății populației, reprezentând un procentaj mare din morbiditatea și mortalitatea perinatală.

Introducerea ultrasonografiei în îngrijirea prenatală a permis identificarea malformațiilor congenitale chiar din mediul intrauterin. Identificarea malformațiilor se realizează direct prin detectarea schimbărilor morfologice sau indirect prin semne cum ar fi întârziere în creșterea intrauterină și schimbările de volum ale fluidului amniotic. Progresele tehnologice în ultrasonografie, experiența crescută în serviciile specializate și accesul mai facil la serviciile de ecografie au contribuit la o creștere semnificativă a detecției fetușilor cu malformații congenitale în populații cu risc scăzut, devenind o rutină în îngrijirea prenatală. Ultrasonografia pentu a detecta feții cu anomalii cromozomiale este o metodă cu valoare predictivă negativă mare, ceea ce înseamnă că în absența defectelor detectate, posibilitatea ca fătul să prezinte o anomalie cromozomială este mică.

Cauzele genetice, singure sau impreună cu cele de mediu, sunt implicate în cel puțin o treime din malformațiile congenitale. Printre cauzele genetice, anomaliile cromozomiale numerice sau structurale sunt prezente în aproximativ 0.9% din grupuri neselectate de nou-născuți și în mai mult de 10% din nașterile cu feți morți. Frecvența totală a anomaliilor citogenetice în fetușii cu malformații este de aproximativ 10% până la 15%. Dintre acestea, aproximativ 80% sunt trisomii ale cromozomilor 13, 18 sau 21. Restul anomaliilor implică schimbări numerice în cromozomii sexuali și rearanjări cromozomiale structurale. În concluzie, este justificabilă conduita de a indica analiza cromozomială la toate nașterile cu feți morți și în morți neonatale, cu sau fără fenotipuri dismorfice, și la toți feții cu malformații, în special când sunt prezente mai mult de o anomalie sau când există istoric familial de malformații congenitale.

Dezvoltarea tehnicilor moleculare moderne a permis analiza genomului uman la rezoluție înaltă, fiind folositoarea în mod special în identificarea noilor schimbări genomice, neidentificate anterior de analiza cromozomială de rutină.

Folosind tehnica CGH în 2004, Schaeffer et al. a observat o creștere a ratei de detecție a anomaliilor cromozomiale care nu au fost identificate de analiza cromozomială convențională în 9.8% din 41 de cazuri de avorturi spontane. În țesutul pulmonar criogenat obținut de la 49 de fetuși cu malformații multiple și cariotip normal care au suferit avort spontan sau terminarea electivă a sarcinii, Le Caignec et al. a identificat o rată crescută de 16.3% folosind tehnica array CGH. Alt studiu retrospectiv a validat două platforme array CGH în 30 de eșantioane de fluid amniotic și vilozități coriale.

După ce studiile inițiale au introdus validarea retrospectivă a tehnicii array CGH pentru diagnosticul prenatal, au apărut și primele studii prospective. În publicații recente, Van den Veyner et al. au găsit 4.8% anomalii descoperite în 84 de fetuși cu malformații evidențiate la ultrasonografie, iar Kleeman et al. au descoperit procentul de 8%, considerând doar feții ce prezentau cariotip normal, demonstrând astfel că tehnica array CGH este o unealtă promițătoare utilă în diagnosticul prenatal.

În primul studiu prospectiv în diagnosticul prenatal, Sahoo et al. au raportat o rată de detecție a anomaliilor cromozomiale de 43% din cei 98 de feți studiați. Într-un grup neselectat de 50 de feți malformați cu cariotip normal, Kleeman et al. au găsit 4 fetuși (8%) cu rezultate array anormale. Studiind un număr comparabil de cazuri folosind o matrice țintită de 287 clone, prin includerea exclusiv a feților cu cel puțin trei anomalii, Le Caignec et al. au descoperit anomalii în 16.3% din cei 49 de feți investigați. Utilizând aceeași matrice CGH țintită pentru a studia retrospectiv 37 de malformații fetale cu cel puțin două anomalii și cariotip normal, Vialard et al. au găsit rezultate anormale în 4 feți, ce corespunde la un procent de 10.8%. În studiul lui Machado et al., deși numărul de fetuși cu variații ale numărului de copii era mult mai mare decât în alte rapoarte, numărul fetușilor cu CNV descrise printre dezechilibrele genomice detectate nu a putut arăta o asemenea diferență (Tabel I).

*Considerând doar specimenele prenatale

**Considerând doar fetușii cu cariotip normal

NL= nelistate

Tabel I. Numărul de fetuși cu anomalii ale numărului de copii și variații ale numărului de copii (CNV) în studii array CGH prenatale recente.

Indiferent că tehnicile array CGH au un principiu teoretic și abordări moleculare comune, studiile publicate au o metodologie diferită în selecția fetușilor; de asemenea designul studiului, platformele array CGH, analiza bioinformatică și interpretarea rezultatelor diferă, astfel că realizarea unei comparații între diferitele lucrări nu este în totalitate lipsită de erori. Acest lucru poate explica diferența între ratele de detecție observate în diferitele studii.

O diferență cu impact semnificativ pe compararea rezultatelor este prezentată de selecția feților, cuprinzând feți care au murit cu mai mult de trei malformații indicate în diagnosticul prenatal, cum ar anxietatea maternă. Un studiu a inclus 367 de indicații diferite pentru analiza moleculară, inclusiv 20 de cazuri în care indicația nu a fost specificată. Machado et al. a selectat doar feții cu malformații congenitale ce prezentau un teren genetic puternic și feți cu multiple malformații congenitale. În ambele situații este așteptată o prevalență crescută a anomaliilor genetice și acest lucru poate explica rata crescută de detecție a feților cu variații ale numărului de copii în acel studiu.

Încă nu există un consens între grupurile de cercetători în privința interpretării rezultatelor. Definiția "rezultatelor cu semnificație neprecizată" nu este clară în metodologia adoptată de unele studii. Acest lucru se poate întâmpla datorită faptului că există puține cunoștințe în ceea ce privește istoria naturală și spectrul variabilității clinice asociate cu delețiile si duplicațiile submicroscopice descrise recent, detectate de array CGH. Merită menționat faptul că prezența doar a unei deleții sau duplicații nu înseamnă neapărat că alterări ale numărului de copii cauzează fenotipul observat, de asemenea, nu se poate considera un dezechilibru al numărului de copii ca fiind patogenic doar pe baza asocierii cu malformații fetale identificate prin analiza ecografică. Însă, fetusul ce prezintă o anomalie structurală semnificativă are un risc a priori crescut de a avea o anomalie genetică patogenă, iar după cum este adevărat pentru orice test, dezechilibrul numărului de copii găsit este cel mai probabil unul cu adevărat patogenic.

În evaluarea domeniilor și a conținutului regiunilor afectate de alterări genomice, Machado et al. au indentificat în 13 din 48 de fetuși (27%) studiați prin CGH, amplificări sau deleții genomice care ar putea conduce la modificări ale rezultatelor citogenetice inițiale cu impact clinic. Pentru aceste cazuri, consecințele diagnosticului molecular implică experți de referință la intervenții terapeutice pentru sindroame specifice. Consecințele se extind de asemenea spre reducerea numărului de proceduri diagnostice la care pacientul ar putea fi supus. Pentru familie, diagnosticul poate reduce anxietatea si permite o consiliere adecvată a riscurilor și planificarea pentru a avea un copil. Schimbările citogenetice considerate clinic semnificative sunt cuprinse între 80Kb-30Mb și sunt cel mai frecvent pierderi genomice.

Aplicabilitatea clinică a tehnicii array CGH în diagnosticul prenatal este bine stabilită pentru rafinarea diagnosticului în cazurile cu diagnostic suspicios sau neconcluziv al schimbărilor structurale cromozomiale. În literatura recentă, există un număr crescut de cazuri descrise care întăresc acestă aplicabilitate clinică a array CGH în diagnosticul prenatal. Alte situații includ studiul translocațiilor echilibrate prin cariotipare convențională, dar care au dovedit a avea un model neechilibrat după analiza CGH, cu specificarea dimensiunilor exacte și locația anomaliilor cromozomiale structurale.

Alte aplicații clinice pot fi verificate selectând feții în funcție de un defect specific, după cum a fost demonstrată pentru caracterizarea moleculară a feților cu holoprozencefalie și hernie diafragmatică congenitală. Tehnica array CGH poate contribui la cunoașterea și caracterizarea instabilității genomice submicroscopice a anomaliilor congenitale specifice. Sunt susținute regiunile cromozomiale semnificative indicate când se consideră că un dezechilibru al numărului de copii într-o astfel de regiune este recurent în feți cu același fenotip și când a fost descrisă aceeași corelare genotip-fenotip. În acest mod, pot fi identificate câteva clone cu semnificație necunoscută dar presupusă care au oferit o listă a regiunilor cromozomiale de interes clinic pentru evaluarea moleculară suplimentară. Cercetări adiționale și de confirmare sunt necesare pentru a stabili în continuare rolul genelor din acea regiune cromozomială în patogeneza fiecărui defect congenital specific.

Identificarea CNV poate complica foarte mult interpretarea rezultatelor tehnicii array CGH. Printre feții cu schimbări în numărul de copii, 70% până la 87% au avut cel puțin o clonă ce conținea o regiune cromozomială alterată cu CNV, descrisă în bazele de date valabile. Această problemă este în mod particular critică pentru diagnosticul prenatal, unde obținerea unui rezultat "normal" sau nu, definește abordarea perinatală. Discriminarea adecvată dintre aberațiile inofensive și cele reale este esențială pentru consilierea potrivită.

Tabel II. Recomandările ACOG pentru array CGH în diagnosticul prenatal.

Luând în considerare cele de mai sus și bazate pe Declarația Colegiului American de Obstetrică și Ginecologie publicat în 2009 (ACOG, 2009), tehnica array CGH nu poate substitui citogenetica clasică în diagnosticul prenatal. Conform opiniei ACOG, utilitatea tehnicii array CGH ca unealtă de primă linie în detectarea anomaliilor cromozomiale în toate mostrele de amniocenteză sau vilozități coriale este încă necunoscută. Rata adițională de detecție a anomaliilor cromozomiale folosind array CGH, comparativ cu cariotiparea convenționlă pentru analiza de rutină a cromozomilor fetali, așteaptă un studiu pe o populație mai mare (Tabel II).

Un grup internațional de experți în domeniul array CGH, Consorțiul ISCA (International Standard Cytogenomic Array), a ținut două seminare internaționale și a condus o recenzie de literatură a 33 de studii, ce a inclus 21,698 de pacienți testați prin tehnica micromatricilor cromozomiale (CMA). Aceștia au furnizat un rezumat bazat pe dovezi a testărilor clinice citogenetice ce au comparat CMA cu cariotiparea prin bandarea G, respectând avantajele și limitările tehnice, diagnosticul oferit pentru variate tipuri de aberații cromozomiale și problemele care afectează interpretarea testului. Au conclus că dovezile valabile sprijină puternic folosirea CMA în locul cariotipării G-banded drept testul citogenetic diagnostic de primă linie pentru pacienți cu întârziere de creștere/dizabilități intelectuale, tulburări din spectrul autismului sau multiple anomalii congenitale (MCA). Însă, Consorțiul ISCA recunoaște că dovezile actuale nu sunt suficiente pentru a permite recomandări privind anomaliile congenitale multiple prenatale, iar metodele citogenetice tradiționale, cum ar fi cariotiparea prin bandare G și hibridizarea fluorescentă in situ sunt încă standarde pentru diagnosticul prenatal.

Este recunoscut că aray CGH poate detecta schimbări submiscroscopice care pot fi ratate de analiza cromozomială de rutină, în special în mostrele prenatale unde rezoluția benzilor este compromisă. Cu toate acestea, rolul exact al array CGH în diagrama diagnosticului prenatal nu a fost stabilit. Sunt necesare studii multicentrice care să realizeze o comparare directă a tehnicii array CGH la analiza citogenetică convențională într-un cadru prenatal. Până acum nu există nici o dovadă că ar putea substitui analiza convențională a cariotipului prin bandare G, dar poate completa și extinde metodele actuale pentru un diagnostic prenatal și o caracterizare a sindroamelor precise.

Disponibilitatea platformelor array CGH recente pentru investigarea cromozomială fetală, inclusiv matricile oligonucleotidice, a adus alte provocări controversate în privința testării genetice ideale pentru diagnosticul prenatal. Până acum, matricile oligonucleotidice nu au fost dovedite benefice în conformitate cu protocoale ale clonelor BAC pentru diagnosticul prenatal. Multe dintre tulburările genetice cunoscute care pot fi detectate pe matrici țintite nu determină anomalii fetale detectabile la examinarea ecografică fetală. Solicitarea array CGH doar în prezența anomaliilor ecografice limitează potențialul diagnostic al acestui test. În plus, sunt necesare cercetări suplimentare pentru a ajunge la un consens asupra unei platforme array optime pentru practica clinică în diagnosticul prenatal. Se dorește ca, în viitor, să se proiecteze cipuri particularizate cu markeri peste loci pentru diagnosticul prenatal.

De asemenea, sunt necesare studii complementare pentru a valida aplicabilitatea clinică a matricilor CGH pentru diferite situații clinice ale diagnosticului prenatal, cum ar fi vârsta maternă avansată, screening biochimic modificat, markeri ecografici de prim trimestru și în situații de anxietate familială în prezența screening-ului biochimic sau ecografic normale.

Altă provocare de învins este proiectare unei strategii uniforme și eficiente pentru interpretarea rezultatelor ce implică variantele numărului de copii. Timpul și efortul necesar pentru a distinge descoperirile patogenice de cele benigne cresc pe măsură ce rezoluția array CGH crește, dar rezultate neinterpretabile apar la toate platformele array CGH.

În ciuda provocărilor rămase de învins, este clar că CGH reprezintă o unealtă valoroasă în identificarea și caracterizarea moleculară a anomaliilor cromozomiale în feții cu defecte la naștere, ce deschide un nou capitol în interfața istorică dintre citogenetică și medicina fetală.

Nu există bariere tehnice în efectuarea array CGH ca test prenatal. Într-un experiment care dovedește principiul, Rickman et al. au demonstrat fiabilitatea efectuării array CGH pentru diagnosticul prenatal pe ADN extras din celulele lichidului amniotic. Cu excepția unei triploidii, 29/30 din rezultate erau în conformitate completă cu cariotipul. A fost mai departe ilustrată fiabilitatea utilizării matricilor CGH BAC și matricilor oligonucleotidice pe amniocite necultivate pentru detectarea dezechilibrelor cromozomiale.

Aplicarea array CGH la diagnosticul prenatal oferă câteva avantaje. Deoarece array CGH poate fi automatizată și nu necesită culturi celulare, rezultă un timp mai rapid de completare a procesului. Rezoluția crescută permite detectarea majorității dezechilibrelor cromozomiale, inclusiv aneuploidii și toate dezechilibrele genomice recurente cunoscute cauzatoare de anomalii congenitale multiple/retard mental, care sunt testate actual în diagnosticul prenatal. Nu este suprinzător că tehnologia este implementată în câteva centre de diagnostic și diferite rapoarte au sugerat că este pregătită pentru utilizarea curentă.

Inerent tehnicii, nu poate detecta rearanjări cromozomiale echilibrate (inversiuni și translocații echilibrate). Când sunt detectate prenatal rearanjări echilibrate pe cariotip, părinții sunt de obicei testați, iar dacă un părinte "normal" poarăt aceaași rearanjare, translocația este considerată benignă. Dacă rearanjarea este de novo, consilierea este mai dificilă, iar riscul pentru anomalii de creștere este estimat a fi de 6%. Analiza array CGH a pacienților cu anomalii de creștere și translocații de novo a dezvăluit că aproximativ 45% din acestea sunt de fapt neechilibrate. Considerând că translocațiile de novo apar la aproximatv 1/1,000 de nașteri, din care 6% prezintă fenotip anormal, iar jumătate dintre aceștia pot fi detectați prin array CGH, ar rămâne 0.003% translocații patogene nedectate fără efectuarea cariotipului. 94

Array CGH nu detectează nici triploidiile (69,XXX și 69,XXY) și nici tetraploidiile. Totuși, folosirea ADN-ului unui pacient cu sindrom Klinefelter (47,XXY) pentru analiza CGH, rezultă în proporții aberante ale cromozomilor X și Y. O excepție o reprezintă folosirea matricilor SNP care ar permite detectarea poliploidiilor.

În plus față de valoarea predictivă limitată a câtorva dezechilibre recurente noi, alte povocări împiedică introducerea rapidă a acestei tehnologii noi într-un cadru de diagnostic clinic.

Prima provocare este dată de stabilirea cărei platforme este optimă sau ce rezoluție să fie folosite în dianosticul prenatal. Pe de o parte, diferite grupuri sugerează folosirea matricilor genomului integral, în timp ce alții sugerează că matricile țintite sunt cele mai bune pentru diagnosticul prenatal. Matricile genomului integral oferă beneficiul de a detecta toate dezechilibrele posibile și substituie matricile țintite mai vechi în practica clinică postnatală. Într-un studiu care a folosit matrici oligonucleotidice de 500K, a fost observată o medie de 30 CNV per individ. Matricile țintite ce includ doar loci cunoscuți a fi cauza anomaliilor de creștere acoperă mai puțin din genom dar pot rezulta în mai puține dezechilibre de semnificație necunoscută. În plus, pentru câteva deleții cunoscute a fi cauza anomaliilor de creștere, consecințele duplicațiilor pot fi mai puțin severe. De exemplu, duplicația 22q11 este mai puțin penetrantă decât microdeleția 22q11. Atât pentru matricile țintite cât și pentru cele ale genomului integral, estimarea consecințelor fenotipice după detectarea unui dezechilibru cu penetranță și expresivitate variabile la făt este, în prezent, o sarcină imposibilă.

A doua provocare a introducerii array CGH se bazează pe descoperirea rezultatelor "nedorite/neașteptate". Rezultatele array CGH oferă o bogăție de informații și aceste descoperiri pot fi clasificate în diferite categorii: diagnostic prenatal al condițiilor ce vor debuta la vârsta adultă; dezechilibre ce cauzează anomalii congenitale care pot fi tratate eficient sau sunt relativ ușoare vor fi identificate.

Un studiu efectuat de Universitatea Națională din Taiwan a evaluat valoarea clinică a tehnicii array CGH drept unealtă de screening prenatal pentru dezechilibre genomice submicroscopice. Între 2008 și 2011, 3171 de femei au fost supuse testării array CGH și cariotipării într-un centru din Taiwan. Indicațiile pentru diagnotic prenatal invaziv au inclus vârsta maternă avansată, anxietatea părinților, ecografie și caritotip anormale.

Fig. 15. Caz cu deleție de 1.58 Mb pe 17p.12. a) Rezultat dat de array CGH BAC. Au fost evidențiate semnale reduse de trei clone BAC. b) Rezultat dat de matrice oligonucleotidică 105K. c) Rezultate mărite ale matricii oligonucleotidice. Regiunea ștearsă a inclus și gena PMP22. d) Rezultatele au fost confirmate de metoda amplificării simultane a sondelor ligaturate (MLPA).

Din 3171 de feți, 2497 de mostre au fost examinate cu array CGH BAC de 1 Mb și 674 cu matrici oligonucleotidice de 60K. Principalul rezultat al studiului măsurat a fost CNV. Array CGH a identificat cu succes 84 de feți cu anomalii patologice, inclusiv 37 (1.2%) cu anomalii cromozomiale numerice, din care 18 cu trisomie 21, cinci cu trisomie 13, doi cu 45,X, patru cu 47,XXY, unul cu 47,XXX și unul cu trisomie 2 în mozaic. Array CGH a detectat microdeleții și microduplicații în 34 (1.1%) feți și deleții/duplicații mari în 13 (0.4%) feți. Modificări benigne ale numărului de copii au fost identificate în 13 feți (0.4%) și variații cu semnificație clinică necunoscută în 5 feți (0.2%). Array CGH a detectat dezechilibre genomice submicroscopice în 2 (1.8%) din 17 feți cu translocații echilibrate de novo, 3 (50%) din 6 feți cu cromozomi markeri supranumerari și 33 (17%) din 194 feți cu rezultate anormale la ecografia prenatală. Din cei 972 feți fără factori de risc prenatali demonstrabili, array CGH a detectat anomalii cromozomiale numerice la șase feți, microdeleții și microduplicații la 3, respectiv 2 feți și anomalii cu semnificație necunoscută la 2 feți. Microdelețiile au interesat regiuni de 1.58 Mb pe 17p12, de 0.94 Mb pe Xp22.3 și de 4.35 Mb pe Xp21.1. Primul caz a prezentat o deleție interstițială pe 17p12 ce implică gena PMP22 (Fig. 15). Această deleție poate determina neuropatie ereditară cu predispoziție la paralizii de presiune. Mama purta de asemenea această microdeleție, deși nu a fost notată nici o modificare fenotipică. După consiliere genetică, cuplul a decis continuarea sarcinii; nu au fost observate nici un dismorfism facial sau neuropatie la naștere sau la controlul după un an. Ultimul caz de microdeleție, a fost un făt de sex masculin cu o deleție parțială a genei distrofinei, extinsă de la regiunea promotoare la cel de-al 44-lea exon, o descoperire compatibilă cu distrofia musculară Duchenne. Sarcina a fost terminată în urma consilierii genetice.

În studiul de cohortă, trei feți au moștenit o deleție interstițială de 0.94 Mb pe Xp22.3, ce include gena steroid sulfatazei (STS) de la mamele non-consanguine (Fig. 16). Microdeleția Xp22.3 poate determina ihtioză X-linkată. Toți trei nou-născuții prezentau piele cu aspect solzos la naștere, deși toți au ajuns la dezvoltarea corectă conform vârstei observată la controlul după un an.

În acest studiu, doi feți neînrudiți prezentau sindromul microduplicațiilor 22q11.2, o tulburare extrem de variabilă, cu un fenotip ce poate fi normal sau care poate prezenta dizabilități de învățare și cu defecte congenitale asociate. Însă, cele două cupluri au decis terminarea sarcinii în urma consilierii genetice.

Array CGH a identificat câștig de material genetic în trei din șase feți (50%) cu cromozomi marker supranumerari, iar variații la doi din aceștia au fost clasificate drept variații cu semnificcație necunoscută (VOUS). Array CGH poate asista la identificarea originii și conținutlui genetic a cromozomilor marker, în funcție de mărime, implicarea eucromatinei și acoperirea array. Tehnica poate îmbunătăți acuratețea diagnostică a cromozomilor markeri, pentru care originea cromozomală este definită de citogenetică, iar prognosticul bazat doar pe literatura de specialitate și datele obținute la ecografie.

Fig. 16. Caz cu deleție de 0.94 Mb pe Xp22.31. a) Rezultat BAC array CGH. Au fost evidențiate semnale reduse de trei clone BAC. b) Rezultat dat de matrice oligonucleotidică 105K. c) Rezultat mărit al array CGH oligonucleotidic. Regiunea ștearsă includ genele VCX, HDHD1A, STS, PNLPA4. d) Rezultatul a fost confirmat de PCR multiplex. Genele FGFR2 și KRIT1 au fost folosite drept control. Exonul 1 al genei STS (STSE1) a fost deletat la băiatul afectat.

Cariotiparea prenatală necesită culturi de lichid amniotic. În acest studiu, au fost identificați doi feți cu duplicații mari raportate de array CGH dar nu și de cariotiparea convențională. Spre exemplu, un caz prezenta cariotip normal dar era mic pentru vârsta gestațională. Analiza lichidului amniotic necultivat de către array CGH a dezvăluit o trisomie 2 în mozaic. Examinarea suplimentară de către FISH interfazic a demonstrat de asemenea mos 47,XY, +2 [15]/46,XY, [35]. La 26 de săptămâni de gestație, s-a născut un făt de 448 g cu urechi joc implantate, macroglosie, mâini încleștate și mort.

Un alt caz prezenta multiple anomalii detectate de ecografia prenatală. Cariotipul fetal a fost 46,XX; însă analiza array CGH atât a sângelui din cordonul ombilical cât și a lichidului amniotic necultivat a arătat duplicația brațului scurt al cromozomului 12.

Fig. 17. a) Imaginile prenatale de rezonanță magnetică cerebrală a unui caz au dezvăluit o suprafață cerebrală netedă, fără șanțuri și o joncțiune materie cenușie-materie albă în emisferele cerebrale frontale și parietale. b) O deleție de 2.4 Mb pe 22q11.21 a fost identificată de BAC și array CGH oligonucleotidic.

Aceste cazuri au oferit dovezi în ceea ce privește discrepanța în diagnosticul citogenetic a trisomiei în mozaic dintre amniocite cultivate și necultivate. Cariotiparea convențională necesită cultivarea amniocitelor, dar celulele anormale pot dispărea după cultivarea pe termen lung. Așadar, analiza array CGH a ADN-ului din celule necultivate oferă un avantaj față de cariotipare în condiții similare.

Rata la care array CGH poate detecta alterații ale numărului de copii semnificative clinic în feți cu anomalii ecografice variază de la 2% la 16%. Într-un studiu al feților cu anomalii ecografice majore și cariotipuri normale, s-a demonstrat că rata de detecție a fost de 10.5% la feții cu o singură anomalie și de 15.4% la feții care prezentau anomalii care implicau două sau mai multe sisteme de organe. Un diagnostic genetic specific facilitează îngrijirea medicală completă și consilierea precisă a riscului de recurență pentru familie. Anomaliile fizice izolate pot fi corectate chirurgical după naștere, dar anomaliile structurale ce rezultă din dezechilibrele genetice pot fi acompaniate de o funcție cognitivă anormală, întârziere psihomotorie sau alte defecte de sistem nedetectabile de ecografia prenatală. Doi feți dintr-un studiu au fost diagnosticați cu lissencefalie. Un caz prezenta o microdeleție de 2.1 Mb pe 17p13.3, compatibilă cu sindromul Miller-Dieker, iar cel de-al doilea avea o deleție 22q11.2. În ultimul făt, imagistica cerebrală prin rezonanță magnetică prenatală a dezvăluit o suprafață cerebrală netedă, fără șanțuri și o joncțiune materie cenușie-materie albă în emisferele cerebrale frontale cât și parietale (Fig. 17). Dovezile sugerează că sindromul microdeleției 22q11.2 se asociază cu disfuncție cognitivă. Schaer et al. au raportat că feții cu microdeleție 22q11.2 și defecte cardiace congenitale aveau girificarea redusă în joncțiunea parieto-temporo-occipitală. În feți cu dovadă ecografică de lisencefalie, rezultatele unui studiu FISH ar putea diagnostica sidromul Miller-Dieker; totuși studiul a demonstrat că pentru cei doi feți cu lissencefalie, analiza genomului integral folosind array CGH a oferit un diagnostic precis pentru fiecare.

Array CGH prenatal este o unealtă valoroasă pentru screening-ul microdelețiilor și microduplicațiilor cromozomiale, în special la feți cu cariotip normal și rezultate ecografice anormale. În plus, datele studiului arată că există un risc de 0.52% de a avea dezechilibre genomice submicroscopice, chiar și la femei cu cu examinare prenatală normală. Prin urmare, cercetătorii recomandă includerea array CGH în examinarea prenatală de rutină drept unealtă de screening. O altă recomandare constă în efectuarea analizei CGH la toate femeile ale căror făt prezintă anomalii ecografice sau anomalii cromozomiale de novo.

Într-un studiu, Chih-Ping Chen et al. au prezentat diagnosticul prenatal al unui caz cu sindrom de deleție 1p32-p31 cu haploinsuficiență NFIA (factor nuclear 1 A), ventriculomegalie, hipogeneza corpului calos, organe genitale externe anormale și limitarea creșterii intrauterine.

O femeie de 26 de ani, primigestă a efectuat amniocenteză la 30 de săptămâni în urma descoperirii hidrocefaliei și a membrelor scurte la ecografie. Nu exista istoric familial de malformații congenitale. Ecografia efectuată la 30 de săptamâni a evidențiat de asemenea o frunte proeminentă, micrognație, ambiguitatea organelor genitale externe, ventriculomegalie și hipogeneza corpului calos (Fig. 18).

Fig. 18. (A) Ventriculomegalie; (B) Macrocefalie cu frunte proeminentă și micrognație; (C) Hipogeneza corpului calos cu absența cavum septum pellucidum pe ecografia la 30 săptămâni de gestație.

Fluidul amniotic extras prin amniocenteză a fost supus analizei array CGH folosind amniocite necultivate și analizei citogenetice convenționale folosind amniocite cultivate. Analiza aCGH a dezvăluit o deleție de 22.2 Mb pe 1p32.3-p31.1, ce cuprinde genele NFIA, GPR177 și 89 de gene adiționale (Fig. 19). Analiza FISH folosită drept control a arătat absența semnlului roșu în cromozomul del(1) (p31.1p32.3). Rezultatul FISH a fost compatibil cu haploinsuficiența genei NFIA. La 33 de săptămâni de gestație, s-a născut un făt mort cu o greutate de 1536 g; macrocefalie; o față lată; frunte proeminentă; hipertelorism; narine anteversate; micrognație; urechi jos implantate și organe genitale externe ambigui cu fuziunea labiilor, hipertrofie labială, absența orificiului vaginal și hipertrofia clitorisului. Analiza markerului ADN polimorfic a determinat originea paternă a deleției (Fig. 20).

Deleția de novo ce cuprinde 22,2 Mb pe 1p32.3-p31.1 în cazul acesta, afectează în principal regiunea proximală pe 1p32.3, regiuni întregi ale 1p32.2, 1p32.1, 1p31.3 și 1p31.2 și regiunea distală pe 1p31.1.

Fig. 19. aCGH oligonucleotidic arată o deleție de 22.2 Mb de la 1p32.3 la 1p31.1.

Cazul prezenta haploinsuficiența genei NFIA. Sunt patru gene NFIA independente la mamifere: NFIA, NFIB, NFIC și NFIX. Proteinele NFI se comportă precum factori de transcripție/replicare celulară și joacă un rol major în dezvoltarea sistemului nervos central, inclusiv în creșterea axonală precum și în ghidarea și diferențierea celulelor gliale și neuronale. S-a arătat că NFIA este foarte exprimată la nivelul cordului, ficatului, în creier, plămân, ovar, mușchi scheletal, rinichi, testicule, pancreas, splină și la nivelul ficatului și creierului fetal. Deneen et al. au descoperit că NFIA reglează gliogeneza și diferențierea oligodendrocitelor la nivelul măduvei spinării în dezvoltare. Plachez et al. au descoperit că pe lângă reglarea formării substratelor pentru ghidarea axonală, NFIA are un rol celular-autonom în dezvoltarea corticală. Lu et al. au descoperit în plus că haploinsuficiența NFIA poate cauze malformații ale sistemului nervos central și defecte ale tractului urinar.

Cazul prezenta de asemenea haploinsuficiența genei GPR177, care este necesară pentru formarea axei embrionare. Fu et al. au descoperit că pierderea GPR177 cauzează anomalii cerebrale și defecte craniofaciale.

Fig. 20. Electroforetograme reprezentative analizei PCR cantitativă fluorescentă (QF-PCR). Markerul D1S1195 arată doar o alelă maternă (136 bp) la făt ce indică originea paternă a deleției.

În acest caz, deleția cromozomului 1p32-p31 cu haploinsuficiența genei NFIA a fost rapid diagnosticată de aCGH folosind amniocite necultivate obținute prin amniocenteza târzie în al treilea trimestru. Aplicația aCGH în sarcina avansată, cum a fost demonstrată în acest caz, este mai puțin invazivă și mai eficientă în diagnosticarea rapidă a aneuploidiilor și aberațiilor cromozomiale subtile precum și în identificarea genei candidate responsabile de fenotipul specific.

Alt studiu efectuat demonstrează utilitatea aCGH în diagnosticul prenatal al unei deleții terminale 2q și a unei duplicații distale. Cazul unei femei de 35 de ani, 3 gestă, 2 pară, trimisă la spital la 18 săptămâni de gestație pentru efectuarea unei amniocenteze din cauza vârstei materne avansate și istoricului familial de translocații cromozomiale echilibrate și neechilibrate. Cariotipul femeii era normal. Ecografia prenatală efectuată în cursul sarcinii nu a arătat nici o anomalie structurală. Analiza aCGH cu clone BAC efectuată pe amniocite necultivate obținute prin amniocenteză a demonstrat o monosomie 2q parțială și trisomie 15q parțială (Fig. 21). Analiza citogenetică convențională a dezvăluit cariotipul 46,XX,der(2)t;(2;15)(q37.3;q24.3)pat. Analiza aCGH oligonucleotidică a demonstrat mai departe monosomie 2q parțială (2q37.3 → qter) și trisomie parțială 15q (15q24.3 → qter).

Acest caz a demonstrat că aCGH poate fi folosit pentru diagnosticul prenatal a anomaliilor cromozomiale folosind o procedură standard reproductibilă care poate da rezultate fiabile într-o perioadă scurtă de timp.

Fig. 21. BAC array CGH arată o deleție terminală 2q și o duplicație distală 15q.

Un alt studiu efectuat în scopul diagnosticării rapide a aneuploidiilor folosind aCGH subliniază utilitatea acesteia în sarcinile din ultima jumătate a trimestrului doi și trimestrul trei cu rezultate ecografice anormale. Primul caz este al unei femei de 32 de ani, 2 gestă, 1 pară, care a fost trimisă la spital la vârsta de gestație de 23 săptămâni în urma detectării ecografice de anomalii cardiace. Ambii părinți erau sănătoși și non-consanguini, de asemenea nu exista nici un istoric familial de anomalii cardiace congenitale. Mama avea un văr care suferea de retard mental și sindrom Down. A fost efectuată amniocenteza pentru prelevarea de lichid amniotic folosit pentru analiza citogenetică convențională și array CGH. Array CGH BAC a arătat o trisomie 21 (Fig. 22.A). La 8 zile după efectuarea amniocentezei analiza citogenetică convențională a dezvăluit un cariotip 47,XX,+21. Analiza markerului ADN polimorfic prin QF-PCR a arătat că trisomia 21 din acel fetus a fost cel mai probabil cauza nondisjuncției paterne a meiozei II sau nondisjuncției mitotice postzigotice.

Al doilea caz din studiu, o femeie de 33 de ani, 2 gestă, 1 pară, a fost trimisă la spital la vărsta de gestație de 30 de săptămâni din cauza anomaliilor cerebrale detectate la ecografie. Ambii părinți erau sănătoși și non-consanguini, de asemenea nu exista nici un istoric familial de anomalii congenitale. După efectuarea amniocentezei și analiza amniocitelor prin aCGH folosind clone BAC, aceasta a dezvăluit o trisomie 21 (Fig. 22.B). La 13 zile după amniocenteză, analiza citogenetică convențională arăta un cariotip 47,XX+21. Conform analizei markerului ADN polimorfic, trisomia 21 la acel făt a fost cel mai probabil cauzată de nondisjuncția meiozei I.

Fig. 22. Analiza array CGH BAC. (A) Cazul 1 și (B) Cazul 2 prezintă duplicația cromozomului 21 compatibilă cu diagnosticul de trisomie 21 (Sindrom Down).

Cele două cazuri demonstrează că amniocenteza pentru analiza întregului genom folosind amniocite necultivate și aCGH reprezintă o alternativă utilă la cordonocenteză pentru un diagnostic rapid al aneuploidiilor în sarcinile cu rezultate anormale la ecografie detectate în timpul ultimei jumătăți a trimestrului doi și trimestrului trei.

Alt studiu efectuat de Universitatea Națională din Taiwan evidențiază utilitatea analizei aCGH în cazul unui făt diagnosticat cu sindrom Wolf-Hirschhorn asociat cu microduplicații pe 8p și 10p și cu o deleție 4p aparent pură.

Mama în vârstă de 35 de ani, 2 gestă, 1 pară a fost trimisă pentru a efectua amniocenteză la 18 săptămâni de gestație din cauza vârstei materne avansate. Amniocenteza a dezvăluit un cariotip 46,XY,del(4p16.1). Cariotipurile ambilor părinți erau normale. Amniocenteza a fost repetată la 21 săptămâni de gestație, iar analiza aCGH a arătat o deleție de 6.5 Mb pe 4p16.3-p16.1, o microduplicație de 1.2 Mb pe 8p22-21.3 și o microduplicație de 1.1 Mb pe 10p15.3 (Fig. 23). Amaliza markerului ADN polimorfic a confirmat originea paternă a deleției. Ecografia prenatală a evidențiat hipoplazia feței mijlocii, micrognație, hipertelorism și hipospadias. Analiza aCGH a părinților nu a evidențiat nici o anomalie genomică.

Regiunea critică WHS pe 4p16.3 include genele candidate WHSC1 (gena candidată WHS 1), WHSC2 (gena candidată WHS 2) și LETM1 (proteina transmembranară 1 ce conține fermoarul leucinei/brațul EF). WHSC 1 funcționează în reglarea transcripțională împreună cu factorii transcripționali de dezvoltare pentru a preveni transcripția nepotrivită și patofiziologia rezultată.

Cazul din studiu prezenta o deleție de 6.5 Mb pe 4p16.3-p16.1 de origine paternă și haploinsuficiența genelor WHSC1, WHSC2 și LETM1. Descoperirile ecografice ale WHS includ restricția de creștere intrauterină (IUGR), dismorfism facial al hipoplaziei feței mijlocii și aspectul nasului în "cască de războinic grec", defecte ale fuziunii liniei mediene cum ar fi despicătura facială, hipospadias, agenezia corpului calos și defecte septale cardiace, hernie diafragmatică congenitală, hipoplazie renală, deformări ale piciorului, translucență nucală mare și higrome chistice. Cazul prezenta dismorfism facial și hipospadias la ecografia prenatală. Aspectul particular al cazului este dat de asocierea cu o microduplicație 8p de 1.2 Mb pe 8p22-p21.3, o microduplicație 10p de 1.1 Mb pe 10p15.3 și o translocație reciprocă neechilibrată între cromozomii 4 și 10 pe benzile 4p16.1 și 10p15.3. Translocațiile neechilibrate sunt responsabile de 22% din cazurile de WHS.

Fig. 23. Analiza aCGH cu matrici oligonucleotidice arată o deleție de 6.5 Mb pe 4p16.3-p16.1, o microduplicație de 1.2Mb pe 8p22-p21.3 și o microduplicație de 1.5 Mb pe10p15.3.

În cazurile translocațiilor neechilibrate asociate WHS, aberațiile își au originea în meioza paternă și trisomia 8p parțială cauzată de t(4;8)(p16;p23) este cea mai frecventă aneuploidie concomitentă.

Apariția frecventă a translocației t(4;8)(p16;p23) s-a presupus a fi datorită locației grupurilor de gene ale receptorilor olfactivi (OR) pe 4p16 și 8p23, recombinarării omologe non-alelice dintre grupurile de gene OR și variația normală extensivă a numărului de copii a unui grup de gene β-defensin antimicrobian DEFB4, DEFB103, DEFB104 pe 8p23.1. Cazul din studiu a dovedit că o deleție 4p aparent pură de origine paternă poate fi asociată cu dezechilibre cromozomiale subtile ale altor cromozomi. De asemenea studiul subliniază utilitatea aCGH în analiza genetică a aberațiilor cromozomiale detectate prenatal.

Utilizarea metodelor de CGH în diagnosticul postnatal (sindroamelor plurimalformative, dizabilităților intelectuale și întârzierilor în dezvoltare, bolilor neuropsihice, tumori, bolilor mendeliene)

Organizația Mondială a Sănătății definește retardul mental ca o dezvoltare a minții oprită în evoluție sau incompletă, caracterizată prin compromiterea abilităților intelectuale care sunt manifestate în timpul etapei de dezvoltare și care contribuie la nivelul general al inteligenței. Întârzierea în dezvoltare este un termen folosit frecvent înainte de vârsta de cinci ani, iar întârzierea poate implica funcția motorie, abilități cognitive, limbaj sau combinări ale acestora. Poate fi util de determinat dacă aceste dizabilități sunt asociate cu malformații sau anomalii congenitale multiple și/sau aspecte dismorfice deoarece câteodată poate sugera un diagnostic clinic al unui sindrom și poate ghida selectarea testelor diagnostice de efectuat. Retardul mental este estimat că afectează 2-3% din populație.

Anomaliile genetice sunt cele mai comune cauze identificabile de întârziere în dezvoltare-retard mental. Însă, există o discrepanță considerabilă în estimarea procentului de cazuri cu întârziere în dezvoltare-retard mental în care un diagnostic etiologic poate fi stabilit. Raportul unei Conferințe a Institutului Național de Sănătate (NIH) din 1995 a concluzionat că un diagnostic sau o cauză a retardului mental poate fi identificat în 40-60% din pacienții supuși evaluării, deși un studiu a raportat un diagnostic genetic/de sindrom specific în doar 19.9% din cazuri.

Diferite noi descoperiri și metode cum ar fi secvențierea genelor X-linkate ce determină retard mental și hibridizarea genomică comparată folosind matrici (aCGH), actual permit identificarea unei cauze moleculare specifice ce determină întârziere în dezvoltare-retard mental, cu cel puțin 10% mai frecvent decât a fost cazul pe timpul Conferinței NIH acum 12 ani.

În ultimii 7-8 ani diagnosticul întârzierii în dezvoltare-retardului mental a fost îmbunătățit de folosirea FISH multi-subtelomeric și metode specifice de amplificare cum ar fi amplificarea simultană a sondelor ligaturate (MLPA) pentru a căuta în primul rând dezechilibre subtelomerice. Aceste teste și dezvoltarea metodei de hibridizare genomică comparată a cromozomilor metafazici au servit drept pietre de temelie în evoluția array CGH.

Frecvența cu care sunt detectate anomaliile cromozomiale și/sau rearanjările genomice la pacienții cu întârziere în dezvoltare-retard mental este mai crescută în prezența malformațiilor sau caracterelor dismorfice și se asociază de regulă cu un retard mai sever. Conform unei recenzii a literaturii, van Karnebeek et al. au calculat rezultatul mediu al aberațiilor cromozomiale de 9.5%. Shevell et al. au estimat rata de detecție a anomaliilor cromozomiale vizibile în pacienții cu retard mental ca fiind 3.7%. Analiza regiunii subtelomerice la pacienții cu retard mental și trăsături dismorfice folosind FISH sau alte tehnici moleculare au detectat anomalii cromozomiale în 5-6% din cazuri. Așadar, analiza combinată a cariotipului și a regiunilor subtelomerice pot identifica anomaliile cromozomiale în aproximativ 8-10% din pacienții cu întârziere în dezvoltare-retard mental. Conform informațiilor anterioare, altor rapoarte și a datelelor din Tabelul 1, se estimează folosind toate analizele că rata generală de detecție a anomaliilor genetice la sugari și copii mici cu multiple anomalii congenitale și/sau întârziere în dezvoltare-retard mental este 12-18%, din care 3-5% detectate de cariotipare prin bandare, 5-6% detectate de FISH subtelomeric dau nu și de cariotip și 4-7% detectate de array CGH (mai crescut pentru matricile suprapuse decât pentru matricile țintite) dar nu și de carriotip sau FISH subtelomeric. Aceasta ar echivala cu 9-13% detectate de array CGH dar nu de cariotip deoarece aCGH este superior metodei FISH subtelomerice pentru detectarea anomaliilor telomerice. Folosind matrici cu acoperire de 1-3 Mb a brațelor cromozomiale se observă rar o anomalie cauzatoare de boală care este detectată de cariotip și nu de matrice, dar translocațiile sau inversiunile echilibrate care perturbă o genă sensibilă la dozaj sunt atfel de exemple.

Sharp et al. au folosit analiza bioinformatică a duplicațiilor segementale din genom pentru a proiecta o micromatrice cu 2007 clone specifice pentru 130 regiuni genomice care au fost găsite flancate de repetări low-copy orientate direct (LCR). Folosind această micromatrice, autorii au investigat 290 de indivizi cu retard mental. Aceștia au identificat 16 rearanjări patogene care includ cinci dezechilibre noi pe cromozomii 1q21.1, 15q13, 15q24, 17q12 și 17q21.31. Microdeleția 17q21.31 de aproximativ 1.5 Mb a fost identificată independent de alte două grupuri care au folosit micromatrici a întregului genom cu rețele suprapuse pentru a studia mai mult de 360 de pacienți cu retard mental idiopatic. Fenotipul acestei noi tulburări genetice poate rezulta din expresia redusă a genelor MAPT și/sau CRHR1 și este definită prin hipotonie, comportament prietenos, anomalii cerebrale (lărgirea ventriculilor la IRM) și trăsături dismorfice faciale caracteristice. S-a estimat că microdeleția 17q21.31 ar putea fi responsabilă de până la 1% din cazurile cu retard mental. Array CGH a identificat o deleție rară care a dus la descoperirea că sindromul CHARGE (colobom, tulburări cardiace, atrezie coanală, întârziere în dezvoltare, defecte genitale, anomalii ale urechii) este cel mai frecvent cauzat de mutații punctiforme ale genei CHD7.

Delețiile subtelomerice pe 22q13 sunt comune și asociate cu întârziere globală în dezvoltare, limbaj absent sau întârziat, hipotonie și comportamente autistice; acestea sunt detectate în mod fiabil de array CGH. Gena SHANK3 din această regiune codifică o proteină sinaptică, aceasta fiind suspectată a fi o genă sensibilă la dozaj. Un raport recent a descoperit că mutațiile punctiforme ale SHANK3 sunt asociate cu întârziere în dezvoltare-retard mental și tulburări din spectrul autismului. O duplicație reciprocă ce corespunde sindromului Williams-Beuren a fost raportată pentru prima dată în 2005 și este detectată frecvent folosind aray CGH. Duplicații ale genei MECP2 la băieți se dovedesc a fi destul de comune, la fel și duplicațiile reciproce DSG1 a sindromului DiGeorge și regiunile Smith-Magensis.

Treisprezece studii au fost identificate, care au efectuat array CGH pe 40 până la 3600 de pacienți cu întârziere în dezvoltare-retard mental idiopatic. Aceste studii includ un raport care a folosit matrici Affymetrix oligonucleotidice 100K și doisprezece studii care au folosit matrici BAC. Dintre studiile care au folosit matrici BAC, cinci au folosit BAC la intervale de aproximativ 1 Mb de-alungul genomului (aproximativ 3000 clone BAC), una a folosit o matrice țintită pentru regiuni genomice susceptibile la rearanjări (aproximativ 2000 clone BAC), două au folosit matrici suprapuse cu 32447 clone BAC, iar trei au folosit o matrice țintită de aproximativ 200 până la 3000 clone BAC care au sondat telomerii și alte regiuni susceptibile la rearanjări. Interpretarea căror pierderi sau câștiguri sunt cauzative este complexă, dar un standard mai util și folosit mai pe larg este de a presupune că pierderile și câștigurile de novo sunt cauzative. Interpretarea este și mai dificilă dacă nu sunt disponibile mostre de la părinți sau când câștigurile și pierderile sunt familale și nu este clar dacă există anomalii fenotipice asociate modificării genomice în familii diferite. Luând în considerare toți acești factori, și datele din studii s-a putut deduce că anomaliile cauzative au fost detectate în aproximativ 10% din cazuri cu praguri de la 4.2% la 17%. Aceste numere sunt compatibile în general cu experiența nepublicată a laboratoarelor de diagnostic din Colegiul de Medicină Baylor, cu peste 6500 mostre neselectate în care matrici țintite de 356, 853 și 1475 clone BAC au dat rate de detecție de 4.2%, 6.5%, respectiv 8%. Aceste rate de detecție sunt de asemenea imprecise deoarece pacienții incluși au avut realizate anterior studii diagnostice variate și o serie de fenotipuri variate. Însă, o estimare generală ar fi că matricile țintite detectează o modificare cauzativă în 6-10% din pacienții cu întârziere în dezvoltare-retard mental idiopatic și un cariotip normal și că matricile suprapuse sau de 1 Mb pot detecta modificări cauzative în 10-15% din pacienți. Printre cele mai comune anomalii raportate au fost deleții și duplicații ale regiunilor deja identificate cu tulburări genetice cum ar fi regiunea DSG1 din sindromul DiGeorge, regiunea PWS/AS a sindroamelor Prader-Willi/Angelman și regiunea WBS; deleții ale cromozomului 1p36 și duplicații ale MECP2 și regiunii adiacente la băieți.

Au fost raportate un spectru larg de anomalii cromozomiale în autism, după recenzia făcută de Vorstman et al. Diversitatea regiunilor implicate dovedește că efectuarea testelor FISH este nepractică. Cele mai comune anomalii în recenzia Vorstman et al. au fost delețiile 2qter, deleții 22qter și duplicații ale regiunii PWS/AS pe 15q11-q13. De asemenea, două rapoarte separate care au folosit array CGH au descoperit aceste trei anomalii ca fiind cele mai comune. Duplicațiile 15q11-q13 sunt cele mai comune anomalii, iar abilitatea de a le detecta prin cariotipare diferă în funcție de natura câștigului, unde cromozomii extra dicentrici sunt ușor detectați de această tehnică, în timp ce duplicațiile interstițiale sunt aproape niciodată detectate. Până a devenit disponibilă aCGH, duplicațiile interstițiale au fost ratate probabil în marea majoritate a cazurilor chiar și când a fost efectuat FISH metafazic pentru regiunea PWS/AS, deoarece este necesară pentru detecție analiza FISH minuțioasă a cromozomilor interfazici.

În rezumat, multiple studii recente au demonstrat că array CGH este o metodă puternică și eficientă pentru diagnosticul și în cercetarea retardului mental. S-a demonstrat că array CGH are o rată generală de detecție a anomaliilor genomice de 10-15%, în principal a delețiilor și duplicațiilor interstițiale, la pacienții cu retard mental. Micromatrici de înaltă rezoluție a întregului genom cu mai mult de 300.000 de probe oligonucleotidice, valabile comercial, probabil că vor substitui matricile BAC în laboratoarele clinice.

Un studiu a utilizat array CGH drept test de diagnostic postnatal de primă linie în locul cariotipării convenționale, iar rezutatele obținute prin aplicațiile clinice la peste 8,700 de pacienți pe o perioadă de patru ani au demonstrat că aCGH este o alternativă robustă și rentabilă a cariotipării prin bandare G. Pacienții primiți în studiu făceau parte din populații pediatrice, neonatale și adulți cu dizabilități, din aria regională NHS din jurul Departamentului de Citogenetică din Londra, precum și din alte centre din UK dar și din afara țării; motivele trimiterii erau pentru întârziere în dezvoltare, neurodizabilități specifice (autism, ADHD), anomalii congenitale, dismorfism sau alte fenotipuri specifice (pete café au lait).

Analiza ADN-ului genomic extras din sângele periferic sau salivă a fost efectuată folosind inițial o platformă array oligonucleotidică 4x44K, care a fost înlocuită ulterior cu o platformă 8x60K care a inclus probe adiționale în regiunile de interes clinic și regiunile pseudoautosomale.

Toți indivizii ce prezentau trăsături sugestive pentru sindroamele Down, Edwards, Patau sau Turner au fost testați mai întâi cu QF-PCR, iar cei cu rezultat pozitiv nu au continuat cu analiza aCGH; prin urmare, prevalența acestor sindroame poate apărea mai mică în acest grup de pacienți comparativ cu alte rapoarte. 25% din pacienți prezentau CNV fie în regiuni patogene cunoscute, fie în alte regiuni în care dezechilibrele nu au fost raportate în populația normală. Din aceste CNV, 46% au fost deleții sau nulisomii, 53% au fost duplicații sau triplicații, iar dezechilibrele în mozaic alcătuiau restul; 87% au fost mai mici de 5Mb și cel mai probabil nu puteau fi detectatate de cariotiparea tradițională. Pentru cazurile cu studii ereditare completate, 20% din dezechilibre au fost de novo.

Cele mai comune descoperiri în setul de date al studiului au fost dezechilibre în regiunea sindromului de deleție 22q11.2 și deleția sau duplicația în locusul de susceptibilitate la autism 16p11.2. Dimensiunile dezechilibrelor variau de la <25 Kb la cromozomi întregi, cu cele mai multe dezechilibre patogene, sindromice și ale locusurilor de susceptibilitate fiind submicroscopice, în timp ce dezechilibrele "private" variau de la <25 Kb la 105 Mb (69% <5 Mb).

Mărimea dezechilibrelor cu semnificație clinică potențială a fost corelată, în general, cu severitatea fenotipului, cu toate că au existat excepții. De exemplu, a fost găsită o duplicație de aproximativ 7 Mb, în doi frați, din care doar unul prezenta un fenotipic clinic. Așadar, pare puțin probabil că numai duplicația a fost cauzativă în fratele afectat. La capătul celălalt al scarei de mărimi, a fost găsită o deleție de 157 Kb care a inclus o parte a genei SALL1 la un sugar cu microcefalie, malformații ale urechii externe și anus imperforat; mutația SALL1 este asociată cu sindromul Townes-Brocks.

Studiul a reușit completarea studiilor de ereditate pentru 50% din pacienții cu dezechilibre; 20% prezentau dezechilibre apărute de novo. Dintre descoperirile de novo, 8% (21/226) nu păreau a fi asociate cu trăsăturile clinice ale pacientului; câteva dintre ele nu au inclus nici o genă sau elemente reglatoare fiind, așadar, puțin probabil semnificative clinic. Pe altă parte, cel puțin 20% din dezechilibrele moștenite au prezentat loci susceptibili, fiind, prin urmare, considerate semnificative clinic; statusul clinic al părintelui purtător nu a fost cunoscut. Penetranța fenotipului asociată acestor loci susceptibili este frecvent variabilă; spre exemplu, dezechilibrul sindromul de deleție 15q13.3 a fost raportat cu diferite prezentări clinice în cadrul aceleași familii.

Analiza aCGH nu oferă informații asupra locației în genom a regiunilor duplicate sau asupra structurii cromozomilor. Însă, tipare ale dezechilibrelor pot fi folosite pentru a deduce această informație în unele cazuri; spre exemplu, deleția terminală a unui cromozom cu duplicația materialului terminal de pe alt cromozom demonstrează existența unui cromozom derivat, iar analiza cromozomilor prin bandare G și/sau FISH a părinților este recomandată în aceste cazuri. Inversiuni, duplicații și deleții pot fi de asemenea deduse, precum și cromozomii inelari, cromozomi inelari supranumerari și inversiuni recombinante. Când aCGH este folosită ca test de primă linie, este posibil ca material cultivat obținut de la pacienți să nu fie valabil pentru confirmarea imediată a oricărei rearanjări structurale suspectate de cariotipare sau FISH. Așadar, este critică interpretarea corectă a descoperirilor făcute de array, de vreme ce aceasta va oferi informații ajutătoare în privința celor mai adecvate studii ulterioare de efectuat. Pentru dezechilibrele interstițiale non-LCR mediate aparent de novo, este necesară analiza cariotipului sau FISH a părinților pentru a exclude o translocație inserțională echilibrată, a cărei prezență ar reprezenta un risc de 50% pentru părinți în sarcinile viitoare. Nowakowska et al. au raportat o frecvență de aproximativ 2.1% a translocațiilor inserționale în rândul familiilor pacienților cu CNV de novo. În experiența celor care au realizat studiul, sunt obținute rareori eșantioane ale părinților pentru studii ale rearanjărilor cromozomiale; au fost capabili să termine studii FISH doar la 12/226 (5%) din familii cu descoperiri de novo și au găsit o translocație inserțională parentală.

Descoperirile întâmplătoare sunt inevitabile pentru orice test al întreg genomului și pot dificil de rezolvat din punct de vedere clinic, în special în ceea ce privește condițiile de debut tardiv și genele cu susceptibilitare la cancer, unde se cunosc puține despre prevalența sau penetranța trăsăturilor clinice asociate cu dezechilibre. În ciuda rezoluției și randamentului diagnostic crescut asociate analizei aCGH, pot exista preocupări legate de faptul că în absența vizualizării cromozomilor prin tehnici tradiționale de citogenetică, rearanjările echilibrate nu vor fi detectate. Aceste rearanjări pot perturba funcția genei fără a determina pierderea materialului de codare, și ar putea fi importante din punct de vedere diagnostic. Însă, prevalența rearanjărilor echilibrate aparent de novo asociate cu un fenotip anormal detectat de analiza cromozomilor prin bandare B este foarte scăzută, iar câteva dintre ele ar putea fi de fapt neechilibrate la nivel submicroscopic; testarea aCGH poate dezvălui un astfel de dezechilibru fără a mai fi nevoie de analiza cariotipului în prealabil. Creșterea randamentului diagnostic prin folosirea aCGH reprezintă un beneficiu pentru pacient mult mai mare decât numărul extrem de mic de cazuri în care o rearanjare echilibrată poate perturba o genă importantă. Rezultatele acestui raport demonstrează că aCGH poate înlocui cariotiparea prin bandare G, fiind o metodă puternică și rentabilă și care oferă o rată crescută de diagnostic.

Schizofrenia (SZ) este o boală mentală cronică cu un risc aferent duratei de viață de aproximativ 1%. Prezintă o componentă genetică puternică cu o capacitate ereditară de până la 85% și un risc de recurență ce crește de zece ori la rudele de gradul I. Au fost raportate diferite anomalii cromozomiale la pacienții cu SZ, dar relevanța etiologică a multor dintre acestea este neclară. Descoperirea cea mai bine consacrată implică sindromul de deleție a cromozomului 22q11, cunoscută și ca sindromul DiGeorge/velocardiofacial, care este asociată cu SZ în 20-30% din purtătorii adulți și găsită în 0.6% din pacienții cu SZ. Aceasta sugerează că variații ale numărului de copii în genomul uman ar putea avea o relevanță etiologică mai mare în această boală.

SZ prezintă anumite trăsături care sugereză o etiologie ce se suprapune parțial cu retardul mental (MR) și autismul, inclusiv o tendință de a prezenta întârziere în dezvoltare și un IQ scăzut, probleme de limbaj și comunicare și o rată mai crescută de anomalii fizice minore. Pacienții cu retard mental prezintă un risc crescut de a dezvolta boli psihice, iar pacienții cu sindrom de deleție 22q11 prezintă mai frecvent autism și retard mental, precum și SZ.

Kirov et al. au căutat variații ale numărului de copii în 93 de pacienți cu SZ, folosind matrici BAC de înaltă rezoluție și au comparat rezultatele cu cele ale pacienților cu boli neînrudite obținute folosind aceeașă platformă. Două aberații detectate în studiu sunt foarte probabil patogene: una apărută de novo, iar cealaltă se segregă cu boala în familie. În plus, cele două aberații cuprind gene care codifică proteine sinaptice ce interacționează direct, din care nici una nu a fost implicată anterior în patogeneza SZ. Aceste noi descoperiri au implicații importante în înțelegerea patogenezei SZ și sugerează mecanisme patogene comune cu autismul și retardul mental.

În studiu au fost selectați 93 din aproximativ 600 de pacienți recrutați cu SZ. Au fost selectate intenționat cazuri sporadice severe (n=51) și cazuri cu o rudă de gradul I afectată (n=42, din care 22 au avut un frate cu SZ) în scopul creșterii șanselor de a detecta aberații de novo și respectiv recurente. Pentru a estima relevanța oricărei aberații detectate cu schizofrenia a fost folosit un eșantion de control mare de 372 de pacienți cu tulburări neînrudite cu schizofrenia care a fost studiat folosind aceeași metodologie. În total, array CGH a descoperit 13 CNV corelate cu SZ care au fost ulterior validate cu o platformă array SNP de 250K.

Două modificări prezintă cel mai probabil relevanță din punct de vedere etiologic. Prima este o duplicație de 1.4 Mb pe cromozomul 15q13.1. Această modificare a fost confirmată cu matrici Affymetrix și Agilent și a fost absentă la părinții neafectați, însemnând că a apărut de novo. Cantitatea realtiv redusă de aberații apărute de novo în shizofrenie nu ar trebui să fie surprinzătoare, conderând că aberațiile mari, în speciale cele de novo sunt asociate cu fenotipuri mai severe din punct de vedere a dezvoltării neurologice cum ar fi cel al retardului mental și autismului și sunt frecvent acompaniate de o varietate de anomalii fizice mai pronunțate. Au fost excluși din studiu pacienți cu IQ <70, pentru a putea stabili asocieri cu schizofrenia care sunt indenpendente de retardul mental.

Prima aberație potențial patogenă este o deleție de 0.25 Mb pe 2p16.3. Cuprinde promotorul și primul exon al genei neurexin 1 (NRXN1). Se crede că neurexinele joacă un rol important în eliberarea neurotransmițătorilor din veziculele presinaptice, iar împreună cu neuroliginele sunt implicate în formarea sinapselor și validarea circuitelor neuronale prin care este determinată proporția neurotransmisiei excitatorii-inhibitorii. Deleții suprapuse parțial care perturbă aceeași genă au fost identificate anterior la un pacient cu retard mental și doi frați cu autism. Nu au identificate alte deleții sau duplicații ce implică această genă în populația de control a studiului.

A doua anomalie considerată patogenă este duplicația de novo pe 15q13.1. Această regiune este situată telomeric față de HERC2 și distal față de regiunea critică Prader-Willi și față de duplicațiile 15q11-q13 care pot fi de asemenea observate în 1-3% din cazurile cu autism. Intervalul duplicat descoperit conține trei gene: gena proteinei de legare a precursorului amiloidului A2 (APBA2), gena Needin-like 2 (NDNL2) și gena proteinei joncțiunilor strânse 1 (TJP1). Această regiune se suprapune parțial peste o deleție de 3.95 Mb, identificată de Sharp et al. ca fiind un determinant al retardului mental. În mod remarcabil, APBA2 interacționează direct cu neurexine prin legarea directă la acestea, funcționând ca un mediator în neurotransmisia prin fuzionarea veziculelor sinaptice. Există multiple dovezi și date din studii genetice care indică că schizofrenia este o boală a sinapselor.

Trei aberații (toate duplicații) pe 3q22.3, 9q21.22 și 22q11.23 nu au apărut la frații schizofrenici ale cazurilor, astfel sunt puțin probabil patogene. Duplicațiile pe 4q35.2 și 15q26.1 și deleția pe 17q22 nu conțin gene cunoscute sau elemente ultra-conservate. Un pacient purta o deleție de 480 Kb a cromozomului 16p12.2. Această regiune conține două gene candidate, EEF2K și CDR2 care sunt implicate în semnalizarea intracelulară în creier și respectiv neuroimunologie.

Schizofrenia, autismul și retardul mental împărtășesc un număr de trăsături fenotipice și toate trei au o bază neurologică comună. Similar, sindromul de deleție 22q11 este de asemenea asociat cu un risc crescut de retard mental, schizofrenie și autism, fapt ce demonstrează că aceeași deleție poate cauza fenotipuri distincte care împărtășesc anumite trăsături. Rezultatele studiului aduc și mai multe dovezi în susținerea existenței unei baze comune în etiologia și patogeneza acestor tulburări și sugerează că aceasta ar putea implica perturbarea neurexinelor și a proteinelor asociate cu consecințe asupra dezvoltării și funcției sinaptice.

Descoperirile studiului sugerează necesitatea efectuării unor studii mai ample în scopul descoperirii altor CNV în schizofrenie. Descoperirea suplimentară a variantelor de novo bazată pe disponibilitatea recentă a matricilor de > 1 milion de probe ar trebui să permită identificarea unor aberații patogene mai mici. Este foarte probabil că aceste vor identifica mai departe gene cu relevanță patogenă potențială. Este de asemenea posibil că polimorfismul numărului de copii să dovedească a juca un rol în conferirea susceptibilității la schizofrenie precum o fac și în alte condiții. Aceste studii vor necesita dezvoltarea unor platforme noi capabile de genotiparea de calitate înalt rentabilă, precum și de folosirea eșantioanelor mari de pacienți și populație control.

Bolile mendeliene reprezintă o extremă a spectrului arhitecturii genetice posibile. Alelele responsabile de bolile mendeliene se regăsesc într-un număr redus de gene, sunt rare (<1:1000), sunt înalt penetrante și urmează modele simple de moștenire dominantă, recesivă sau X-linkată. Sunt considerate monogenice, în sensul că mutația unei singure gene determină boala într-un individ sau familie.

Majoritatea mutațiilor din bolile mendeliene sunt detectate prin secvențiere ADN. Însă, în ultimii ani semnificația și frecvența delețiilor sau duplcațiilor patogene intragenice (mutații ale numărului de copii) au devenit tot mai evidente. Hibridizarea genomică comparată s-a dovedit a fi o unealtă puternică pentru analiza numărului de copii dar a fost folosită mai mult pentru analiza citogenetică în scopul detectării delețiilor și duplicațiilor genomice mari care se întind pe sute de kilobaze până la megabaze. Swaroop et al. au construit o matrice oligonucleotidică particularizată de înaltă densitate cu probe țintite către exonii individuali a 589 de gene asociate cu tulburări genetice cunoscute pentru a identifica deleții sau duplicații genice întregi și parțiale. Rezultatele studiului în urma testării a 3,018 pacienți cu ajutorul acestei matrici au demonstrat că array CGH a exonilor completează secvențierea ADN și crește rata de detecție a mutațiilor în diagnosticul molecular a bolilor mendeliene autosomale și X-linkate.

Exon array CGH a fost folosită pentru a examina 3,018 pacienți pentru deleții și duplicații în 219 gene. Au fost analizate mai multe gene în 307 indivizi afectați de o tulburare heterogenă genetic. Prin urmare, un total de 4,354 de gene au fost analizate în 3,018 indivizi. Exon array CGH a identificat 98 deleții parțiale sau ale genomului în întregime și două duplicații, ce corespunde unei rate de detecție de 3.3% în indivizii testați. QF-PCR, MLPA sau array CGH a întregului genom au confirmat variațiile numărului de copii detectate de exon array CGH. Mutații ale numărului de copii au fost identificate în 53 din 219 gene testate. Nici o deleție sau duplicație nu au fost găsite în restul de 166 gene, deși multe dintre aceastea au fost evaluate în 10 cazuri sau mai puține. Patruzeci la sută din cele 3,018 cazuri au fost trimise pentru a efectua testarea pseudogenei PTEN (proteină omologă a fosfatazei și tensinei). Rata generală de detecție a mutațiilor numărului de copii prin exon array CGH pentru bolile mendeliene din studiu, după excluderea cazurilor PTEN a fost de 5.3%.

Un total de 2,567 de pacienți au fost testați pentru tulburări autosomale dominante, multe dintre ele determinate de o haploinsuficiență. Aproape jumătate din toți acești indivizi (n=1,231) au fost trimiși special pentru a face testarea PTEN. Cei 1,336 de indivizi rămași diagnosticați cu alte tulburări autosomale dominante au fost testați pentru mutații ale numărului de copii într-o varietate de gene. Pentru 13 din aceste gene, testarea array a fost efectuată concomitent cu secvențierea ADN, în timp ce alte gene au fost testate după excluderea unei mutații prin secvențiere. Șaizeci și nouă din cei 1,336 indivizi purtau o deleție a unei gene, determinând o rată pozitivă de 5.2% pentru acest grup de tulbuări dominante. Majoritatea indivizilor care au obținut un test pozitiv prezentau deleții parțiale ale genelor care implică unul sau mai mulți exoni; deleții ale genei în întregime au fost responsabile de 34% din toate mutațiile observate.

Frecvența delețiilor și duplicațiilor întregi sau parțiale la pacienții trimiși pentru analiza PTEN cu indicații pentru sindromul Bannayan-Riley-Ruvalcaba (BRRS), sindromul Cowden (CS), macrocefalie și/sau tulburări din spectrul autismului a fost de 0.5%. Deleții ale genei PTEN au fost observate în trei pacienți cu BRRS, CS sau creștere excesivă sindromSotos-like. Un pacient cu întârziere în dezvoltare și lipoame multiple prezenta o deleție genică parțială care a inclus exonii 3-9, iar doi pacienți cu CS suspectat prezentau mozaicism pentru o deleție parțială a exonilor 6-9 și o duplicație parțială a genei PTEN ce implica exonii 1-5 (Fig. 24).

O rată crescută a delețiilor genice patogene a fost identificată în multiple tulburări autosomal dominante din setul de date a stiudiului. Pentru sindromul Peutz-Jeghers, 10 din 31 de pacienți (32%) cu rezultate de secvențiere negative, purtau o deleție detectată de exon array CGH în gena STK11. Au fost observate două deleții întregi și opt deleții parțiale ale genei STK11, inclusiv patru cazuri cu o deleție aparent recurentă a exonului 1. Rata pozitivă de 9.3% pentru delețiile intragenice CREBBP la 75 de pacienți cu sindrom Rubinstein-Taybi și de 7.3% pentru delețiile EXT1 și EXT2 la 55 de pacienți cu multiple exostoze este compatibilă cu variațiile raportate de alte studii.

Fig. 24. Exemple din date a patru gene diferite obținute prin exon CGH. Săgețile marchează probele care au identificat deleții sau duplicații. (a) O deleție heterozigotă a exonului 5 pe NSD1 la un pacient cu sindrom Sotos. (b) O duplicație genică parțială ce include exonii 3-4 în MECP2 la o pacientă cu sindromul Rett. (c) O deleție heterozigotă a exonului 31 în VPS13B (COH1) la un pacient cu sindrom Cohen. (d) O duplicație genică parțială ce include exonii 1-5 în PTEN la un pacient cu sindrom Cowden.

Au fost de asemenea identificate șapte deleții ale genei PTCH1, inclusiv două mutații în mozaic la 128 de pacienți diagnosticați cu sindrom Gorlin. Incidența delețiilor PTCH1 a fost peste 5%, iar multe dintre acestea au fost mutații private. Acesta reprezintă cel mai mare număr de pacienți testați concomitent prin secvențiere și pentru mutații ale numărului de copii ale genei PTCH1.

Pentru câteva tulburări rata pozitivă în setul de date a studiului a fost mai scăzută decât cea publicată de alte studii. De exeplu, doar 3 din 116 pacienți (2.6%) cu sindrom von Hippel-Lindau prezentau o deleție a genei VHL, în timp ce rata de deleție publicată este de până la 30%. Această discrepanță este cel mai probabil atribuită faptului că testarea moleculară este necesară după excluderea unei deleții genice prin hibridizarea fluorescentă in situ. De asemenea, doar 3 din 204 pacienți (1.5%) cu sindrom Alagille testați prin secvențiere și exon array CGH, prezentau o deleție genică, în timp ce analiza FISH din alt studiu a evidențiat deleții brute, inclusiv JAG1 șa 5.7% din pacienți.

Au fost de asemenea identificate deleții unice în multe alte tulburări autosomal dominante după ce secvențierea ADN a eșuat să dezvăluie o mutație patogenă. Testări pentru tulburări ale dezvoltării oculare au evidențiat patru deleții exonice ce cuprind genele SOX2 și OTX2 la 26 de indivizi (15.4%) cu anoftalmie sau microftalmie și două deleții FOXC1 la 12 pacienți (17%) cu sindrom Axenfeld-Riger. De asemenea, 7 din 36 de pacienți (19%) cu indicație clinică de aniridie prezentau o deleție în gena PAX6. Remarcabil, mai mult de jumătate din delețiile PAX6 descoperite sau extins până la gena vecină ELP4 dar fără să includă și gena WT1. Au fost detectate deleții la indivizi cu sindrom Birt-Hogg-Dube (FLCN: 1/15 sau 6.7%), sindrom Holt-Oram (TBX5: 1/21 sau 4.5%) sau sindrom de QT lung (KCNQ1: 2/71 SAU 2.8%) și neoplazii endocrine multiple (MEN1: 1/43 sau 2.3%). Delețiile patogene în tulburările menționate anterior sunt rare, iar testarea lor nu este efectuată de rutină.

Au fost testați 138 de indivizi prin analiza exon array CGH pentru tulburări autosomal recesive și identificate 14 deleții a unui sau mai multor exoni. Nu a fost identificată nici o duplicație. Cincizeci și cinci de cazuri au fost trimise cu indicație de eroare înnăscută de metabolism (IEM). Șapte din aceste cazuri au pozitive pentru o deleție și au reprezentat o rată pozitivă de 13%, comparativ cu 5.3% pentru alte indicații.

Majoritatea din cele 138 de cazuri au avut efectuate secvențierea ADN-ului anterior sau concomitent cu testarea pentru deleții/duplicații. Din 93 de indivizi cu o mutație patogenă unică indentificată prin secvențiere, au fost identificați 10 cu deleții genice întregi sau parțiale, care a corespuns cu o rată pozitivă de 10.8%. În 45 de cazuri cu eroare înnăscută de metabolism cu o singură mutație descoperită de secvențiere, au fost identificate 7 deleții (15.6%). Din cele 48 de cazuri trimise pentru alte indicații, numai trei au fost pozitive (6.3%). Patruzeci și cinci de indivizi care nu au efectuat secvențierea anterior sau cu rezultate de secvențiere negative au fost testați pentru deleții/duplicații, au fost descoperiți patru (10.1%) homozigoți pentru deleții intragenice.

Exon array CGH a fost efectuat în 313 indivizi pentru detectarea delețiilor sau duplicațiilor în gene X-linkate. Unsprezece pacienți au prezentat o mutație a numărului de copii patogenă, reprezentând o rată pozitivă de 3.5%. Un pacient prezenta o duplicație genică parțială, iar restul erau purtători de deleții genice întregi sau parțiale. Opt din cei 11 indivizi cu un rezultat exon array CGH pozitiv erau fete diagnosticate cu una din următoarele condiții: displazie ectodermală hipohidrotică, hipoplazie dermală focală, retinoschizis juvenil, sindrom Rett, sindrom Coffin-Lowry și deficiența ornitin transcarbamilazei. Cele trei deleții rămase au fost găsite la băieții cu agamaglobulinemie, cardiomiopatie dilatativă sau boală Norrie.

Rezultatele studiului ilustrează utilitatea unei metode exon array CGH robuste pentru detectarea mutațiilor intragenice ale numărului de copii în bolile mendeliene. Datele prezentate în studiu subliniază sensibilitatea crescută a testării pentru bolile mendeliene efectuată concomitent sau după secvențiere. Aceste date sugerează că exon array CGH ar trebui folosită de rutină pentru tulburările autosomal recesive, în mod particular pentru IEM care prezintă doar o mutație identificată de secvențiere sau pentru condiții în care mutațiile cu pierdere a funcției genice sau dosaj genic anormal explică fenotipul asociat. Deși studiul a țintit doar 589 de gene cu semnificație clinică cunoscută și a examinat doar o singură genă sau un panou mic de gene în fiecare individ, array CGH la nivel de exoni poate fi de asemenea fabricat ca o testare screening. De asemenea, este rentabilă și relativ necostisitoare efectuarea analizei whole-exome a numărului de copii prin array CGH pentru a completa secvențierea exomilor până când devin disponibili algoritmi puternici pentru calcularea numărului de copii din date de secvențiere de ultimă generație.

Avantajele și dezavantajele metodelor de hibridizare genomică comparată

Principalele avantaje ale CGH sunt: (1) cartografiază modificări ale numărului de copii la nivelul unui genom complex pe un genom de referință normal pentru ca aberațiile să poată fi ușor raportate la hărți existente, gene și secvențe ADN genomice, și (2) folosește ADN genomic, astfel că nu sunt necesare culturi celulare. Ultimul aspect este în mod particular util în patologia endocrină, din moment ce multe tumori neuroendocrine sunt dificil de cultivat. Înlocuirea cromozomilor metafazici drept substratul pe care sunt cartografiate aberațiile cu matrici ale secvențelor de acizi nucleici clonate și bine cartografiate poate elimina câteva dintre aceste limitări.

Analiza CGH face posibilă detectarea și cartografierea creșterilor și scăderilor numărului de copii a secvențelor ADN oriunde în genom, oferind informații generale asupra frecvenței câștigurilor și pierderilor de material genetic, oricărei grupări ale acestor modificări în sub-regiuni cromozomale și asupra mărimii și numărului de regiuni afectate în orice eșantion tumoral dat. Abilitatea de a studia genomul în întregime într-un singur experiment este un avantaj important pentru studierea pierderilor alelice, care țintesc un locus pe rând. CGH nu necesită efectuarea de preparate metafazice din celule pentru a fi analizate, lucru care se dovedește a fi dificil în analiza cromozomilor prin bandare a tumorilor solide, așadar CGH este ideală pentru analiza tumorilor solide, mai ales de când tehnicile de extracție ADN îmbunătățite și amplificarea PCR permit achiziționarea de cantități mai mari de ADN din aproape orice tip de specimen, chiar și țesuturi fixate în formol și incluse în parafină.

Din moment ce nu necesită probe specifice și cunoștințe anterioare ale alterațiilor genetice, CGH este foarte potrivită pentru identificarea și cartografierea aberațiilor necunoscute până în prezent, lucru care a condus la descoperirea locațiilor unor gene importante.

Principalele limitări ale CGH sunt: (1) are o rezoluție limitată de 10-20 Mb, (2) nu oferă informații cantitative despre dozajul genic, iar (3) nu este sensibilă la aberații structurale care nu rezultă în modificări ale numărului de copii ale secvenței ADN.

CGH se dovedește a fi o unealtă importantă; însă, nu este o tehnică perfectă. În primul rând, poate detecta doar câștiguri și pierderi de copii. Nu poate detecta nici o modificare cromozomală structurală care nu implică pierderi sau câștiguri de copii, de exemplu translocații sau inversiuni echilibrate. Așadar, este mai potrivită pentru analiza tumorilor epiteliale, în care tipurile majore de instabilitate genetică sunt dezechilibrele cromozomale, în timp ce în analiza tumorilor hematologice sau mezenchimale nu este la fel de utilă. În al doilea rând, din cauză că ADN-ul țintă a cromozomului este super-compactat, dimensiunea minimă a aberației ADN care poate fi detectată prezintă o problemă și anume rezoluția pentru pierderi este de 10 Mb, iar din cauză că aceste nivel de detectare este o funcție atât a mărimii aberațiilor cât și a numărului de copii în exces, rezoluția pentru câștiguri este de 2 Mb. Această limitare împiedică localizarea precisă a secvențelor de interes. O altă observație demnă de menționat este că în analiza tumorilor solide este dificil de a detecta modificări mici ale numărului de copii din cauza contaminării celulelor tumorale cu celule normale. Este recomandată izolarea populațiilor celulare pure prin microdisecție pentru a reduce contaminarea și pentru a crește astfel sensibilitatea detectării.

CGH oferă avantaje față de multe tehnici comune folosite. Folosirea ADN-ului genomic al celulelor tumorale drept probe pe preparate metafazice normale în CGH elimină nevoia pentru probe și secvențe ADN specifice care sunt necesare pentru tehnici cum ar fi hibridizarea fluorescentă in situ, metode bazate pe reacția în lanț a polimerazei și polimorfismul lungimii fragmentelor de restricție. Aceste avantaje fac ca tehnica CGH să fie potrivită pentru analiza liniilor celulare tumorale care prezintă rearanjări cromozomiale complexe.

Regiunile pericentromerice, telomerice și heterocromatice nu pot fi evaluate deoarece hibridizarea CGH implică blocarea secvențelor repetitive. Câteva regiuni specifice ale cromozomilor 1p32-pter, 16p, 19 și 22 sunt în mod special conflictuale, determinând frecvent rezultate fals-pozitive. În plus, deoarece CGH folosește ADN-ul tuturor celulelor din specimen, rezultatele nu pot fi sigure în cazul polisomiilor, clonelor diferite genetic și celulelor normale prezente în specimen într-un procent de până la 50%.

Îmbunătățiri ale tehnicii CGH a condus la apariția diferitelor subtipuri de CGH cum ar fi CGH cu micromatrici. CGH cu micromatrici (microarrays) sunt un subset a tehnologiei CGH care permite screening rapid al cromozomilor și funcționează similar tehnicii CGH convenționale. Micromatricile prezintă avantaje față de CGH metafazic deoarece necesită mai puțin timp pentru hibridizare (< 48 ore sau doar 24 de ore în unele cazuri), iar evaluarea proporției fluorescente este simplă și poate fi automatizată. Experimente preliminare au arătat că rezultatele CGH pot fi obținute în 10 ore de la primirea probelor, existând astfel posibilitatea efectuării screening-ului la embrioni în stadii mai avansate (biopsie din celulele trophectoderm a blastocistului). Microarray CGH poate fi împărțită mai departe în funcție de cipul ADN fixat pe lama microscopului. Aceste subseturi diferite de microarray CGH include probe BAC, biblioteci ADN și probe oligonucleotidice. Deși fiecare din aceste subtipuri prezintă avatanje specifice, toate subtipurile au avantaje clare asupra tehnicilor de analiză FISH. Un astfel de avantaj este acela că CGH permite evaluarea exactă a tuturor celor 24 de cromozomi fără a necesita ture multiple de hibridizare.

O limitare a tehnicii aCGH constă în complexitatea metodei. Tehnica aCGH necesită expertiza în metode citogenetică și metode de genetică moleculară, aplicația clinică este realizată în centre înalt specializate care efectuează analiza aCGH.

Micromatricea țintită este un cip prin care probele genomice cuprind arii de anomalii cromozomiale cunoscute și includ de asemenea probe ce scanează genomul la o rezoluție mai mare decât o matrice oligonucleotidică. Această matrice țintită este preferată pentru analiza prenatală în prezența anomaliilor congenitale multiple la ecografie sau a unui istoric familial care poate suspecta un sindrom de deleție submicroscopică (22q11.2). Avantajul unei abordări țintite este acela că scade probabilitatea de a identifica o variantă a numărului de copii cu semnificație necunoscută.

O matrice oligonucleotidică de înaltă rezoluție este matricea aleasă pentru analiza postnatală, dar nu reprezintă prima linie de analiză cromozomială în diagnosticul prenatal, decât dacă există o anomalie cromozomială specifică identificată în familie (translocație aparent echilibrată) sau un cariotip anormal (cromozom marker, rearanjare neechilibrată) care a fost identificat și se dorește obținerea mai multor informații. Micromatricea este capabilă să identifice deleții și duplicații submicroscopice pe care analiza convențională a cromozomilor nu le poate identifica. Comparativ cu cariotiparea convențională, timpul de terminare a procesului este mai rapid. Micromatricilor le este necesar câteva zile și nu săptămâni pentru a da rezultate.

Avantajul micromaticilor CGH asupra CGH normal este rezoluția și viteza mult mai mare. Matricile CGH au o rezoluție mai mare de aproximativ 1,000 de ori și generează informație mult mai rapid.

Cele mai obișnuite micromatrici utilizate conțin aproximativ 3000 de probe cromozomi bacterieni artificiali (BAC) care conțin fiecare inserții ADN de aproximativ 150 Kb. Deoarece probele BAC se află la o distanță de aproximativ 1 Mb între ele, această versiune de array CGH poate detecta duplicații și deleții de aproximativ 100 Kb (o rezoluție de 5 până la 10 ori mai bună decât CGH cu cromozomi metafazici). Alte micromatrici BAC sunt țintite, astfel încât să fie realizată o rezoluție mai mare în regiuni în care duplicații și deleții se cunosc a fi asociate cu boli specifice. O limitare a matricilor BAC este aceea că alterațiile mai mici decât insertul BAC în sine (aproximativ 150 Kb) nu pot fi ușor detectate.

Recent, o altă metodă CGH a fost dezvoltată folosind micromatrici care conțin sute de mii de probe oligonucleotidice mici. Aceste micromatrici oferă o rezoluție de 50 până la 100 Kb sau chiar mai puțin, fapt care permite detectarea duplicațiilor și delețiilor care afectează doar o singură genă.

Pe lângă rezoluția foarte bună, array CGH oferă alte nenumărate avantaje față de analiza tradițională a cariotipului. Procesul este înalt automatizat, necesitând mai puțin timp din partea personalului de laborator. Nu sunt necesare celule în diviziune (în contrast cu analiza cromozomilor metafazici), iar o cantitate infimă de ADN este suficientă pentru analiza întregului genom. Din aceste motive, array CGH devin rapid una dintre cele mai folosite tehnici în laboratoarele de citogenetică.

Starea actuală și perspectivele deschise de metodele de hibridizare genomică comparată

Hibridizarea genomică comparată este o metodă proiectată pentru a identifica segmente cromozomale cu aberații ale numărului de copii, descrisă pentru prima oară în 1992 de Kallioniemi et al. În această tehnologie, mostre de ADN genomic marcate diferit și denaturate sunt hibridizate simultan la cromozomi metafazici imobilizați și denaturați. După hibridizare, proporția fluorescentă este măsurată în lungul axei fiecărui cromozom, cu realizarea unui profil a întregului genom ale numărului relativ de copii în mostrele ADN.

Avantajul principal al CGH este acela că poate interoga întreg genomul pentru modificări ale numărului de copii ADN într-un singur experiment. După analizarea unui număr mare de tumori, pot fi definite regiuni recurente cu alterații ale numărului de copii, așadar pot fi identificate regiunile ce conțin gene implicate în dezvoltarea cancerului. Un dezavantaj al CGH metafazic este rezoluția limitată la care aberațiile numărului de copii ADN pot fi identificate. De obicei, limita de detecție pentru pierderi ale numărului de copii este de 10 Mb, dar poate fi mai mică pentru câștiguri ale numărului de copii, în funcție de mărimea regiunii implicate și nivelul creșterii numărului de copii. Aplicarea metodelor statistice pentru corectarea variației în profilul CGH poate oferi de asemenea o rezoluție mai bună.

Aplicația diagnostică a metodelor de hibridizare genomică comparată a transformat domeniul citogeneticii clinice. Utilizarea CGH în cercetare a accelerat ritmul descoperirilor genice în genetica umană, a aprofundat înțelegerea schimbărilor genomice din cancer și a grăbit studiul conceptelor fundamentale legate de conformația cromozomilor, metilarea ADN, acetilarea histonelor, silențierea genelor, timpul de replicare și multe alte mecanisme de bază referitoare la structura și funcția ADN-ului.

CGH s-a dovedit utilă deoarece oferă profiluri specifice ale numărului de copii ADN pentru o varietate de cancere. Multe cancere sunt asociate cu o varietate de câștiguri și pierderi cromozomiale și ale segmentelor cromozomiale. Date fiind dificultățile asociate cu obținerea culturilor și a cromozomilor metafazici de calitate din majoritatea tumorilor solide, abordările dorite sunt cele care examinează direct conținutul ADN și care leagă orice modificare de dozaj de anomaliile cromozomiale. CGH a fost aplicată unui număr mare de studii ale cancerelor cu rezultate reproductibile.

CGH prezintă multiple utlizări în cercetare inclusiv elaborarea profilurilor tumorale, descoperirea genelor și înțelegerea modificărilor epigenetice și a conformației cromatinei. Rezultatele unor astfel de investigații pot fi corelate direct cu locații genomice și expresia genică. Așadar, ca unealtă de cercetare, CGH are un potențial mare.

Pentru aplicații diagnostice, CGH ar trebui abordată dintr-o altă perspectivă. Deoarece fiecare eșantion clinic nu trebuie văzut ca un proiect de cercetare, metodele de diagnostic trebuie construite într-o manieră în care maximizează capacitatea de diagnostic în timp ce minimizează rezultatele fals-pozitive pentru a putea oferi clinicienilor diagnosticele și informațiile de care au nevoie pentru a putea ghida îngrijirea clinică a indivizilor cu anomalii cromozomiale identificate.

Alternativa la metodele CGH și anume experimentele FISH multiple este prohibitivă în costuri și resurse. Așadar, CGH cu potențialul său de a identifica cele mai multe rearanjări neechilibrate microscopice și submicroscopice, va deveni cel mai probabil prima abordare în testarea citogenetică și va înlocui majoritatea analizelor cromozomiale prin bandare și FISH în laboratoarele clinice în viitorul apropiat.

Metodele de hibridizare genomică comparată ce folosesc tehnologia micromatricilor este folosită de câțiva ani pentru diagnosticul clinic al copiilor și adulților suspectați cu sindroame genetice de etiologie necunoscută. Mai mult de 70 de tulburări sunt cunoscute ca fiind asociate cu defecte la naștere sau probleme de dezvoltare care sunt cauzate de duplicația sau deleția de material genetic, numite variații ale numărului de copii (CNV). Hibridizarea genomică comparată a crescut rezoluția cromozomială pentru detectarea CNV, și ca rezultat a crescut randamentul diagnostic și detaliile genomice peste cele obținute prin metode convenționale. Acest lucru a condus la dianosticarea mai multor pacienți și la identificarea unor noi sindroame de microdeleție și microduplicație.

Dezvoltarea tehnologiei micromatricilor (microarray) a deschis o cale pentru depășirea multor limitări ale CGH, deoarece preparatele metafazice au putut fi înlocuite de clone ADN cartografiate, care a oferit o cale de conecta aberațiile direct la secvența genomică. Multiple abordări au fost întreprinse pentru a implementa CGH bazat pe micromatrici. Diferitele abordări pot fi categorisite în funcție de proprietățile ADN-ului depozitat pe substrat și de proprietățile genomului care urmează a fi interogat de matrice.

Micromatricile sunt de obicei create de robotică de înaltă precizie, care depozitează și imobilizează cantități mici de ADN (spoturi) spațiate strâns pe un substrat (de obicei o suprafață de sticlă) într-o manieră uniformă și/sau ordonată. Mostrele ADN sunt marcate in vitro prin încorporarea de nucleotide marcate fluorescent, de regulă Cy3 și Cy5. După hibridizare, pot fi obținute imagini digitale a fiecărui fluorocrom hibridizat folosind diferite tipuri de sisteme de obținere a imaginii. Rezoluția genomică la care pot fi detectate aberațiile este determinată de trei factori majori: distanța genomică dintre elementele ADN analizate; dimensiunea elementelor; iar dacă proporțiile obținute din media datelor aparținând clonelor vecine, atunci numărul clonelor folosite vor afecta și ele rezoluția.

Pentru ca micromatricile CGH să fie utile din punct de vedere clinc ca unelte de diagnostic/prognostic, este necesar un sistem robust cu sensibilitatea de a detecta cantitativ un spectru mare de modificări ale numărului de copii, de la deleții homozigote și aberații ale numărului de copii de nivel jos, la amplificări de nivel înalt.

Array CGH este o tehnologie relativ nouă utilizată în scopul diagnosticării sindroamelor genetice, atât postnatal cât și prenatal. Aceasta poate fi efectuată folosind o matrice țintită care evaluează loci cunoscuți a fi asociați cu o condiție sau fenotipuri specifice, sau poate fi efectuată cu o matrice a genomului întreg, având clone cu o densitate specificată localizate de-alungul genomului. Array CGH a fost de asemenea folosită pentru a detecta mozaicismul de nivel jos și pentru a caracteriza cariotipuri neclare sau aparent echilibrate.

Array CGH a fost validată în nenumărate studii care au folosit eșantioane cu dezechilibre cromozomale cunoscute. Această tehnică demonstrează în mod constant sensibilitate și specificitate înalte în aproape toate dezechilibrele segmentare sau ale cromozomului în întregime existente. Array CGH poate de asemenea caracteriza anomalii neclare identificate de citogenetica convențională, cum ar fi identificarea originii unei SMC (mentenanța structurală a cromozomilor) sau definirea punctelor de rupere a unei rearanjări.

Studii în privința utilității clinice a tehnicii aCGH sugerează că diagnosticul unui dezechilibru cromozomal folosind această tehnică poate conduce la schimbări în managementul medical al pacientului, inclusiv trimiterea la alți specialiști, inițierea protocoalelor de screening, evitarea testelor de diagnostic adiționale și îmbunătățirea accesului la servicii. În plus, stabilirea unui diagnostic specific permite consilierea genetică și estimarea riscului de recurență cu mai multă acuratețe și luarea unor decizii mai informate în ceea ce privește reproducerea.

Array CGH a întregului genom poate fi folosit pentru a cartografia regiuni recurente cu aberații ale numărului de copii când sunt analizate un număr mare de mostre tumorale. Ulterior, asamblarea matricilor cu acoperire de înaltă densitate a clonelor de-alungul unei regiuni permite definirea aberațiilor recurente. De exemplu, Albertson et al. a folosit array CGH pentru a cartografia cantitativ și precis structuri amplicon în tumori, care au ajutat la identificarea oncogenelor. În plus, datorită preciziei și sensibilității, folosirea array CGH permite nu numai clasificarea tumorilor în funcție de tip și numărul de aberații ale numărului de copii, permite de asemenea și elaborarea unor întrebări specifice în legătură cu defectele genetice de fond care permit selectarea acestor aberații. În plus, din cauză că multe anomalii de dezvoltare sunt caracterizate de prezența dezechilibrelor genomice de nivel jos, multe dintre care rezultă în alterații ale numărului de copii, array CGH poate fi folosită pentru a detecta mărimea și locația acestor aberații și corelarea lor cu fenotipul clinic observat. Veltman et al. a descris utilitatea array CGH în detectarea aberațiilor genomice în regiuni (sub)-telomerice, care sunt adesea șterse la pacienții cu retard mental. La ora actuală, aceste aberații sunt detectate în laboratoarele clinice prin teste de hibridizare fluorescentă in situ cu probe telomerice individuale. În viitor, rezultatele acestor teste pot fi îmbunătățite prin aplicarea array CGH pentru a testa toți telomerii simultan.

Formatul array CGH a fost de asemenea aplicat împreună cu alte teste pentru a realiza profilul schimbărilor epigenetice. De exemplu, Zardo et al. a folosit array CGH în combinație cu scanarea genomică a punctelor de restricție pentru evaluarea statusului numărului de copii ADN cât și a statusului de metilare în scopul identificării genelor inactivate de deleția unei singure copii și metilarea copiei rămase. Într-o altă abordare, Shi et al. a asamblat matrici ce conțin clone CpG islands și ulterior a hibridizat specimene ADN tumorale tratate cu bisulfit și specimene de ADN normal pentru a dezvălui diferențele în statusul de metilare la acei loci. Alte studii au folosit array CGH pentru a cartografia situsuri de legare a proteinelor în genom. În această tehnologie, ADN genomic este imunoprecipitat folosind anticorpi specifici pentru proteine de legare la ADN. Prin hibridizarea competitivă a două eșantioane de ADN genomic imunoprecipitate și marcate diferit, pot fi identificate regiuni de legare la ADN din genom și pot fi comparate modele de situsuri de legare proteine-ADN în, de exemplu, ADN tumoral și normal.

Duplicațiile și delețiile segmentale au fost bine documentate în tulburările moștenite. Progresele făcute de array CGH au facilitat descoperirea unor astfel de alterații genetice. Matrici genomice la interval de megabaze a fost un mijloc folosit pentru stabilirea regiunilor afectate într-o varietate de boli genetice. Deleții și duplicații cromozomiale submicroscopice au fost identificate la pacienți normal din punct de vedere citogenetic care prezentau retard mental și dismorfisme. În plus, modificări ale numărului de copii au fost definite în sindromul Cri-du-Chat, hernia diafragmatică congenitală și sindromul Prader-Willi folosind array CGH. Aceste exemple ilustrează valoarea tehnicii array CGH în identificarea aberațiilor care au scăpat analizei citogenetice tradiționale și în rafinarea aberațiilor caracterizate anterior în variate boli.

Tehnologia array CGH a avansat foarte mult în ultima decadă, prin dezvoltarea unei multitudini de platforme array, mărind aplicabilitatea sa la multe aspecte ale cercetării genetice. Noi designuri de matrici vor continua să îmbunătățească rezoluția și sensibilitatea detecției, în timp ce strategiile de producție mai eficiente și protocoalele experimentale raționale vor reduce costurile și eforturile necesare. În plus, apariția de noi programe software care țintesc automatizarea detecției punctelor de rupere și analizei statistice, vor simplifica sarcina dificilă de a interpreta seturi de date array CGH. Progresele tehnice continue și creșterea bazelor de date a profilurilor specifice de boală, vor lărgi aplicabilitatea array CGH atât în domeniul cercetării cât și clinic.