INTRODUCERE Infecția tractului urinar (ITU) este un termen colectiv care descrie orice infecție care implică orice parte a tractului urinar, și anume… [309267]

INTRODUCERE

Infecția tractului urinar (ITU) este un termen colectiv care descrie orice infecție care implică orice parte a [anonimizat], ureterele, vezica urinară sau uretra. Aceasta s-a dovedit a [anonimizat], [anonimizat]. Aproximativ 50% dintre femei vor experimenta cel puțin o dată un episod de infecție urinară în timpul vieții lor (Al-[anonimizat], 2013). [anonimizat] (Rowe și Juthani, 2013).
Cea mai frecventă cauză a infecțiilor urinare rămân bacteriile enterice (în special Escherichia coli), deși distribuția agenților patogeni responsabili de infecțiile urinare se schimbă periodic. [anonimizat], diabetul zaharat sau obezitatea. [anonimizat] (disurie), [anonimizat], frisoane (Al-[anonimizat], 2013).
Infecțiile tractului urinar ridică o [anonimizat]. Examinarea de laborator a [anonimizat], [anonimizat] 40% (Wilson și Gaido, 2004).
[anonimizat], [anonimizat]. Cultura urinei este necesară pentru cei ce prezintă infecții recurente sau cu un eșec al antibioticoterapiei (Foxman, 2002).
Scopul lucrării de față a [anonimizat] a rezistenței la antibiotice manifestată de acestea.

Obiective:
Izolarea și identificarea tulpinilor bacteriene patogene izolate din probe de urină primate în ambulatorul laboratorului clinic.
Determinarea spectrului de sensibilitate la antibiotice a tulpinilor izolate și interpretarea acestuia conform standardului CLSI.
Interpretarea statistică a rezultatelor obținute.

CAPITOL I
NOȚIUNI GENERALE DESPRE INFECȚIILE URINARE

Infecțiile tractului urinar (ITU) [anonimizat]. [anonimizat]. Sunt întâlnite la aproximativ 150 [anonimizat], afectând toate grupele de vârstă și sex. Incidența reală a [anonimizat],comparativ cu bărbații. [anonimizat]. [anonimizat], [anonimizat] (Rosen și colab., 2007). Nu se poate stabili o incidență exactă deoarece foarte multe infecții urinare sunt asimptomatice sau evoluează cu o simptomatologie redusă(Stammși Norrby, 2001). În primele luni de viață, incidența infecțiilor de tract urinar este mai mare la băieți (2,7%) decât la fete (0,7%) (Wettergren șicolab, 1985). Începând cu vârsta de 1 an, incidența începe să crească la fete (1,4%) și să scadă destul de mult la băieți (0,2%) și rămâne ridicată la fete, ajungând la o incidență de 10,8% (Foxman și colab, 2000).
Aceste afecțiuni sunt cauzate de o serie de agenți patogeni și reprezintă o problemă severă de sănătate care afectează orice parte a tractului urinar, de la vezica urinară până la rinichi. Printre factorii favorizanți ai infecțiilor urinare se numără consumul redus de lichide, vârsta înaintată, litiaza renală, amânarea micțiunii când apare nevoia de a urina, constipația sau menopauza (Tan și Chlebicki, 2016).

I.1. Clasificarea infecțiilor urinare

Criteriu 1. Diagnosticul este bazat pe analizele de laborator si semnele clinice pe care persoana le prezintă. Acesta este destul de greu de stabilit datorită simptomatologiei atipice și uneori absente. Astfel, infecțiile tractului urinar se clasifică în:
Infecții necomplicate ale tractului urinar – sunt infecții ce apar la pacienți sănătoși cu un sistem urinar normal, atât din punct de vedere structural cât și funcțional. Sunt întâlnite mai des la femei, cu precădere la cele aflate la menopauză și au o incidență mai mare în a doua partea a vieții. Aceste includ uretrita, cistita, pielonefrita și bacteriuria asimptomatică.
Etiologie:Agenții etiologici bacterieni sunt: Escherichia coli, Proteus mirabilis, Klebsiella spp., și Enterobacter.

Infecții complicate ale tractului urinar – apar la nivelul unui tract urinar anormal din punct de vedere structural sau funcțional sau la pacienți cu diferite boli precum diabet zaharat și insuficiență renală. Sunt întâlnite preponderent la nou-născuți și la vârstnici peste 60 de ani.
Etiologie: Escherichia coli este cea mai întâlnită specie microbiană, urmată de Klebsiella pneumoniae, Enterobacter, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Serratia, Staphylococcus aureus (Foxman, 2002).

Infecțiile recurenteale tractului urinar – sunt întâlnite la pacienți ce prezintă episoade simptomatice ce alternează cu episoade asimptomatice în decurs de 6 luni. Acestea apar după o infecție antecedentă ce a fost tratată. Cauza recurenței poate fi reinfecția cu o bacterie diferită sau persistența bacteriei care a generat infecția inițială, dar din altă sursă a tractului urinar (Dason și colab., 2011).

Criteriu 2. Este foarte important să se determine localizarea infecției deoarece in funcție de aceasta se stabilește de către clinician conduita terapeutică. Astfel, după localizare, infecțiile urinare au fost clasificate în:
Infecții ale tractului urinar inferior – sunt reprezentate in majoritatea cazurilor de cistite și sunt întâlnite mai des în cazul femeilor decât al bărbaților. Cistita presupune inflamarea peretelui vezicii urinare ca urmare a unei infecții. Acestea pot fi primare și secundarea unor afecțiuni imunologice, parazitare, endocrine sau chiar neoplazice.
Etiologie:Escherichia coli este bacteria responsabilă demai mult de 80% din cazuri, de restul fiind responsabil Staphylococcus saprophyticus. Rar, se mai pot izola Proteus mirabilis și Klebsiella. Tulpini aparținând genurilor Pseudomonas aeruginosa, Serratia și Candida reprezintă cauzele unei mari proporția infecțiilor nosocomiale.
Simptomatologia implică piurie, disurie (usturimi sau dureri micționale), hipourie (eliminarea unei cantități mici de urină) și durere subpubiană. Examenul clinic este nespecific.
Diagnosticul cistitei acute necomplicate se realizează pe baza datelor de laborator. În urma examenului de urină se observă piurie, bacteriurie, nitriți pozitivi și hematurie. Urocultura reprezintă examinarea standard pentru obiectivarea bacteriuriei semnificative, însă nu este obligatorie în cazul cistitelor deoarece sedimentul urinar este suficient pentru a documenta ITU.

Infecții ale tractului urinar superior sunt reprezentateîn general de Pielonefrita acută ce este o inflamație acută la nivelul țesutului interstițial renal și este întâlnită cu precădere la femei.
Simptomatologie: Febră, dureri lombare, stare generală afectată.
Etiologie: Bacteriile Gram-negative sunt cele mai întâlnite (E.coli, Proteus, Pseudomonas, Klebsiella), dar apar și infecții cu coci Gram-pozitivi precum Streptococcus faecalis și Staphylococcus saprophyticus. Candida este responsabilă de infecțiile nosocomiale. Rar, în pielonefritele hematogene apar bacterii precum Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa și chiar unele salmonele. Rareori, speciile anaerobe produc pielonefrite. Pielonefrita acuta se produce prin mecanism ascendent. După ce vezica urinară și ureterul sunt invadate, Escherichia coli produce o endotoxină, ceea ce favorizează staza urinară, ajutând astfel urcarea și pătrunderea bacteriilor în medula renală unde are loc inflamația.
Diagnostic de laborator:În urma examenului de urină se observă piurie, bacteriurie, proteinurie moderată, scăderea densității urinii. Urocultura este semnificativă (peste 100.000 germeni/ml) (Medina și Castillo-Pino, 2019).

CAPITOL II
NOȚIUNI DE ANATOMIE ȘI FIZIOLOGIE ALE APARATULUI URINAR

Aparatul urinar este un sistem continuu a cărei funcție principală este de a colecta, transporta, depozita și elimina urina periodic, intr-o manieră extrem de coordonată. In acest fel, sistemul urinar asigură homeostazia mediului intern prin diferite procese de filtrare, absorbție și secreție, dar și eliminarea produselor metabolice și a deșeurilor toxice generate la nivelul rinichilor.

I.1. Anatomia aparatului urinar
Sistemul urinar este principalul sistem excretor, ce este format din punct de vedere anatomic din 2 rinichi, 2 uretere, vezică urinară și uretră (figura 1).Rinichii produc urină ce conține produsele metabolice ale organismului. Urina este transportată prin uretere la vezică pentru a fi depozitată, apoi este excretată cu ajutorul procesului de micțiune prin uretră.

/Fig. 1. Anatomia sistemului urinar (www.newsmed.ro)
Rinichiul este un organ pereche, în formă de fasole, ce constituie partea esențială a sistemului urinar. Are o dimensiune cuprinsă între 10 și 12 cm, o lățime de 5 până la 7 cm și cântărește între 120 si 200g (fiecare rinichi are dimensiunea unui pumn închis). Sunt localizați la nivelul cavității abdominale, retroperitoneal, de o parte și de a alta a coloanei vertebrale și au culoare brun-roșcată. Mai mult, rinichiul stâng este de obicei orientat superior în opoziție față de rinichiul drept (Bowdino și Shaw, 2019).Porțiunea ocupată de rinichi poartă denumirea de lojă renală și sunt fixați într-un înveliș conjunctiv denumit fascie renală. Între rinichi și fascia renală se află grăsimea perirenală.
Învelișul extern al rinichiului îl constituie capsula fibroasă, ce este formată dintr-un strat intern (alcătuit din fibre elastice și fibre musculare netede) și un strat extern (alcătuit din fibre de colagen și fibre elastice). Parenchimul renal este alcătuit dintr-o zonă corticală (cortexul renal) și o zonă medulară (medula renală) de culoare roșie ce conține piramidele renale (Malpighi). Piramidele Malpighi se deschid în papilele renale, fiind așezate cu baza spre periferie și vârful spre sinusul renal. Acestea se deschid în canalele mici care se împreunează alcătuind calicele mari, urmat de pelvisul renal. Pelvisul renal este continuat de ureter (Tortora și Derrickson, 2011).
Ureterele sunt tuburi fibromusculare bilaterale care au rolul de a trece urina de la pelvisul renal la vezică. Acestea au în general 22-30 cm lungime și un parcurs prin retroperitoneu. Au originea la nivelul joncțiunii uretropelvice și pe parcurs ce ureterele intră în cavitatea pelvină, acestea se întorc medial și se încrucișează în fața bifurcației iliace comune (Deshmukhși Wong, 2009).
Zona corticală a parenchimului renal are o culoare brun-gălbuie și este situată către exterior. Aceasta are aspectul granular. Între piramidele Ferrein ( care se găsesc deasupra și în continuarea piramidelor Malpighi) există substanța corticală. Aceasta formează labirintul cortical ce este alcătuit din tubii contorți, corpusculi Malpighi și vase. Astfel, un lob renal corespunde unei piramide Malpighi, împreună cu o piramidă Ferrein și labirintele corticale care o flanchează. Lobii și lobulii renali prezintă ca element central nefronul (Tortora și Derrickson, 2011).
Unitatea funcțională și structurală de bază a rinichiului este nefronul, fiecare rinichi fiind format din peste un milion de nefroni. Acesta este alcătuit din glomerul și tubul renal (tub contort proximal, ansa lui Henle și tubul contort distal). Glomerulul este alcătuit dintr-un ghem de capilare arteriale încolăcite, așezate între două arteriole. Acesta se află într-o capsulă de forma unei cupe cu pereți dublii, denumită capsula Bowman (Porth 2011).
Vezica urinară este un organ cavitar al aparatului urinar la nivelul căreia se depozitează urina și este situată la nivelul lojei vezicale. Aceasta când este plină are forma ovoidă, iar când este goală este turtită.
Uretra reprezintă canalul de evacuare al urinii de la nivelul vezicii urinare. Alcătuirea acesteia diferă în funcție de sex. La bărbați, uretra este reprezentată de un canal lung de 15-20 ce se împarte în 3 porțiuni: prostatică, membranoasă și peniană. În cazul femeilor, uretra este reprezentată de un canal scurt, de 4-5 cm care se deschide în vestibulul vaginului (Tortora și Derrickson 2013).

II.2. Fiziologia aparatului urinar
Principalul rol al aparatului urinar este de a forma și de a elimina urina. Aceasta se formează la nivelul rinichilor și este eliminată prin căile urinare. Nefronul este sediul formării urinii și are capacitatea de a filtra din sânge substanțele reziduale de care organismul nu mai are nevoie,pe care le elimină dizolvate într-o cantitate de lichid numit urină (Hickling și colab., 2015).
Urina se formează în trei etape: filtrarea glomerulară, reabsorbția tubulară și secreția tubulară. Filtrarea glomerulară se realizează la nivelul glomerulului Malpigh unde, endoteliul capilarelor glomerulare alături de foița viscerală a capsulei Bowman alcătuiesc filtrul renal. Acest filtru are pori de dimensiuni mici prin care pot trece componentele plasmei, mai puțin proteinele. În urma filtrării rezultă filtratul glomerular. Un rol foarte important îl joacă presiunea hidrostatică a sângelui din capilarele glomerulare deoarece reprezintă forța ce determină trecerea plasmei sangvine prin peretele capsulei. Debitul urinii primare este direct proporțional cu mărimea presiunii de filtrare (dacă presiunea scade sub 40 mHg, urina nu se mai formează).
În cea de-a doua etapă, reabsorbția tubulară, urina primară formată anterior ajunge din capsulă la nivelul tubului contort proximal, în ansa lui Henle și în tubul contort distal. Celulele prin pereții tubilor uriniferi conțin microvilozități care selectează și rețin din urina primară anumite substanțe și permite trecerea substanțelor dăunătoare și neutilizabile precum creatinină, acid uric, uree). Apa este reabsorbită în procent de 98-99%, urmată de glucoză în mare parte, apoi de lipide, aminoacizi, săruri minerale, vitamine, etc (Hickling și colab., 2015).
Secreția tubulară completează compoziția finală a urinii și are lor în tubii contorți distali. În această etapă, celulele tubilor uriniferi au capacitatea de a secreta substanțe (acidul hipuric, renina, hidrogen, potasiu) pe care le varsă în lumenul acestora. Acestea se amestecă cu filtratul din tubul urinifer rezultând astfel urina finală (proces denumit și diureză). Din tubul urinifer, urina finală ajunge la nivelul tubului colector. Un individ sănătos produce in 24h în jur de 1,5L de urină (Ogobuiro și Tuma, 2019).

CAPITOL III
CARACTERISTICI GENERALE ALE BACTERIILOR IMPLICATE ÎN PATOLOGIA INFECȚILOR URINARE

Între 70% și 90% din infecțiile tractului urinar sunt cauzate de Escherichia coli. Alți agenți patogeni implicați în infecțiile tractului urinar sunt Pseudomonas aeruginosa, Streptococii beta hemolitici de grup B, specii aparținând genului Proteus,  și specii aparținând genului Enterococcus.

III.1. Bacterii implicate în patologia infecțiilor urinare
III.1.1 Escherichia coli (Migula, 1895)
Escherichia coli (figura 2) este un bacil Gram negativ, ce face parte din genul Escherichia. Bacteriile acestui gen au fost observate prima dată în anul 1885 de către germanul Theodor Escheric la nivelul intestinului gros. Inițial se considera că bacteriile ce aparțin acestui gen sunt comensale intestinului gros, însă in 1935 s-a demonstrat rolul etiologic al unei tulpini de E.coli implicată în cazul unui episod de diaree la nou-născuți (Roos și colab., 2006).
Fig.2. Aspectul microscopic al celulelor de E.coli și modul de dispunere
colorație Gram (wwww.microbenotes.com)

Principalele afecțiuni in care acesta poate fi implicat sunt boala diareică, infecțiile urinare sau infecțiile extraintestinale (meningite, bacteriemii, speticemii, infecții respiratorii, plăgi, leziuni posttraumatic, șmd).
Din punct de vederea al caracterelor morfotinctoriale, Escherichia coli este o specie nesporulată, necapsulată și mobilă. Există însă și tulpini imobile, unele prezentând chiar și capsulă. Este o specie nepretențioasă ce se dezvoltă pe medii simple în care glucoza este unicul constituient organic. E.coli este aerob, facultativ anaerob, prezentând deopotrivă metabolism respirator sau fermentativ. În cazul mediilor solide, acesta se dezvoltă sub forma unor colonii de tip „R”. În cazul mediilor lichide (figura 3) se observă o tulburare uniformă (Allocati și colab., 2013).

/
Fig.3. Aspectul macroscopic al culturii de E.coli în mediu lichid (www.microbenotes.com)

Din punct de vederea al caracterelor biochimice, Escherichia coli fermentează glucoza și alți carbohidrați cu eliberare de acid și gaz. Aceste tulpini au capacitatea de a reduce nitriții în nitrați, descompun lactoza cu eliberare de acid, descompun proteinele cu obținere de indol și dau reacția roșu-metil pozitivă. Nu descompun proteinele cu formarea de H2S și nu produc urează. Pe geloză sânge, anumite tipuri de tulpini întâlnite în infecțiile urinare dau beta hemoliză (figura 4) (Foxman, 2014).
Tulpinile de E.coli au structuri antigenice precum:
Antigenul „O” ( antigen somatic) are specificitate de grup care corespunde poliozidelor fixate pe lipopolizaharidele peretelui bacterian. Au fost evidențiate 180 de serogrupe;
Antigenul „H” ( antigenul flagelar) este format din flagelină, are specificitate de tip și este prezent la tulpinile ciliate. Au fost identificate 56 de serogrupuri;
Antigenul „K” (antigenul capsular) are specificitate de tip și determină O-inaglutinabilitatea tulpinilor care-l conțin. Au fost descoperite 103 serogrupuri;
Antigenul „B” este un antigen de suprafață;
Moleculele de aderență denumite adezine, de tip pili și fimbrii care sunt de natură proteică (Kaper și colab., 2004).
/
Fig.4. Aspectul macroscopic al coloniilor beta-hemolitice de E.coli dezvoltate pe mediu geloză sânge(www.wikipedia.com).

În ceea ce privește strict infecțiile urinare, tulpinile uropatogene care sunt implicate aparțin serotipurilor O 1,2,4,6,7,16,18,75 și serotipurilor K 1,2,3,12,13 ce au adezine care facilitează aderarea de epiteliul urinar.
Principalii factori de virulență pe care Escherichia coli îi posedă sunt:
Adezinele;
Hemolizina;
Aerobactina;
Factorul citotoxic necrozant I ( CNF I)
Antigenele „O”;
Antigenele capsulare (Sobel, 1991).
Adezinele au rolul de a ajuta bacteriile să adere la celulele uroepiteliale și este foarte importantă în producerea ITU. Această aderență este rezultatul interacțiunii între o adezină ce se află pe suprafața bacteriei și un receptor al celulei-gazdă. Capacitatea de aderență a tulpinilor de Escherichia coli sunt asociate cu existența unor formațiuni filamentoase denumite pili, aflate la suprafața bacteriei. Hemolizina aparține familiei RTX de citotoxine și are capacitatea de a media liza calciu-dependență a eritrocitelor. Aerobactina este implicată în multiplicarea tulpinilor de E.coli în condițiile unei concentrații scăzute de fier ale epiteliului urinar. CNFI are rol în răspândirea bilaterală a tulpinilor uropatogene din tractul urinar spre și din torentul sanguin. Antigenele „O” ajută la persistența celulelor bacteriene în tractul urinar. Capsula are capacitatea de a mări patogenitatea și este implicată și in activitatea antifagocitară ce împiedică acțiunea antibioticelor. Din punct de vedere patogenic, prima etapă a infecției cu E.coli constă în aderența la epitelii (etapă completată de fimbrii), urmată de pătrunderea bacteriei în interiorul celulei epiteliale (Buiuc și Negruț, 2008)
Diagnosticul de laborator al tulpinilor de Escherichia coli este bacteriologic și presupune cultivarea pe diferite medii. Uroculturile se izolează pe cel puțin 2 medii: geloză sânge 5% și mediu selectiv MacConkey. Pe geloză sânge majoritatea coloniilor sunt netede, circulare, cu margine întreagă , de tip „R” (figura 5). Pe mediul MacConkey bacilul dezvoltă colonii rotunde, lucioase de tip „S” , lactozo-pozitive de culoare roz și cu diametrul de 2-3mm ( figura 6).

/
Fig.5. Cultură de E.coli dezvoltată pe mediu pe geloză sânge (5% sânge de berbec)
( foto original)

/
Fig.6. Cultură de E.coli dezvoltată pe mediu selectiv MacConkey (foto original)

Identificarea speciei se face pe baza caracterelor biochimice: galactazo-pozitiv (G+), lactazo-pozitiv (L+), sulfat de hidrogen-negativ (H2S -), citrat negativ.

III.1.2. Klebsiella pneumoniae (Schroeter 1886)
Speciile din genul Klebsiella fac parte din familia Enterobacteriaceae. Klebsiella pneumoniae este cea mai întâlnită specie în patologia umană și are capacitatea de a provoca infecții grave nosocomiale precum suprainfecția plăgilor chirurgicale, pneumonii, infecții urinare sau septicemii. Este o bacterie Gram negativă cu bacili scurți și groși, imobili, capsulați, nesporulați ce se găsesc dispuși în diplo ( figura 7). Tulpinile de K. pneumoniae sunt condiționat-patogene, fiind componente ale microbioteiintestinale la om. Sunt răspândite în natură și se pot izola din sol, ape de suprafață sau plante (Podschun și Ullmann, 1998).
Pe geloză-sânge (cu 5% sânge de berbec) bacteria se dezvoltă prin incubare la 37(C timp de 24 de ore. Se observă colonii bombate, mari, de culoare alb-cenușii, lucioase, de tipul M (mucos) (figura 8). Atunci când îmbătrânesc, coloniile îți modifică culoarea în cafeniu. Nu întotdeauna coloniile sunt de tip M, ci pot fi de tipul S sau R ( colonii plate și uscate). Pe mediul MacConkey, după o incubare la 37(C timp de 24 de ore se observă colonii rotunde, lactozo-fermentative,de culoare roz (figura 9).
/
Fig.7. Aspectul microscopic al coloniilor de Klebsiella pneumoniae și modul de
dispunere colorație Gram

Din punct de vedere al caracterelor biochimice, tulpinile de K. pneumoniae fermentează lactoza, zaharoza și glucoza eliberând acid și gaz. Este o bacterie facultativ anaerobă, nu produce indol, nu descompune proteinele cu producere de H2S (H2S-) și folosește citratul ca unică sursă de carbon (C-) (Ashurst și Dawson, 2020).
Tulpinile de Klebsiellapneumoniae sunt rezistente la antiseptice și dezinfectante și pot supraviețui luni de zile la întuneric și temperatura camerei, însă pot fi distruse de căldura umedă, la 55( timp de 30 de minute (Bengoechea și colab., 2019).
Virulența bacteriei este asigurată de o gamă largă de factori care pot conduce la infecție și rezistență la antibiotice. Capsula polizaharidică este cel mai important factor de virulență și permite bacteriilor să se sustragă fagocitozei opsonizante. Până în prezent au fost 77 se tipuri de capsule diferite au fost studiate și s-a observat că tulpinile fără capsulă tind să fie mai puțin virulente. Un alt factor de virulență este reprezentat de lipopolizaharidele care acoperă suprafața exterioară a bacteriei Gram-negative. Detectarea lipopolizaharidelor declanșează o cascadă inflamatorie în organismul gazdă. Fimbriile au proprietăți de adezine, ajută bacteria să se atașeze de celulele gazdă, iar sideroforii provoacă infecții (Ronning și colab., 2019).
/
Fig.8. Aspectul macroscopic al coloniilor de Klebsiella pneumoniae pe mediu geloză sânge
(5% sânge de berbec) (www.microbenotes.com)

/
Fig.9. Aspectul macroscopic al coloniilor de Klebsiella pneumoniae pe mediu MacConkey (www.microbiologyinpictures.com)
III.1.3. Proteus mirabilis (Hauser, 1885)
Speciile din genul Proteus fac parte din familia Enterobacteriaceae și sunt foarte răspândite în natură, întâlnindu-se în ape reziduale sau de suprafață, în sol sau chiar în materii organice aflate în putrefacție. În patologia umană se întâlnesc 3 din cele 8 specii ale genului: Proteus vulgaris, Proteus mirabilis şi Proteus. penneri. Proteus mirabilis este un bacil Gram-negativ (figura 10) fiind frecvent un agent patogen al tractului urinar, în special la pacienții supuși cateterismului pe termen lung. Din punct de vedere al caracterelor morfotinctoriale, sunt bacili scurți, cu capete rotunjite, cu diferite forme (de la bastonașe scurte până la forme filamentoase), nesporulați, necapsulați și foarte mobili (cili peritrichi sau lofotrichi). (O’Hara și colab., 2000).

/
Fig. 10. Aspectul microscopic al celulelor de Proteus mirabilis și modul de
dispunere colorație Gram (www.microbenotes.com)

Pe mediile de geloză sânge, bacilii Proteus sunt ușor de recunoscut prin caracteristica unică de a invada mediul (figura 11), fenomen denumit „fenomen de invazie sau cățărare” și prin mirosul de putrefacție pe care-l degajă. Din locul inoculării, el crește sub forma unor valuri concentrice succesive până la marginea mediului său sau până la întâlnirea cu vălul migrator al altei colonii (Van Asten și colab., 1999).
/
Fig. 11. Aspectul macroscopic al coloniilor de Proteus mirabilis pe mediu geloză sânge
(5% sânge de berbec) – fenomenul de invazie (www.microbenotes.com)

Dacă tulpinile aparțin aceluiași serotip, valurile de invazie se suprapun, însă dacă tulpinile sunt diferite, migrarea încetează la o distanță de 1-2mm, între ele apărând o linie de demarcație (denumit „fenomen Dienes”) (figura 12). Este necesară însămânțarea pe medii selective, pentru a obliga bacilii să crească în colonii izolate. Astfel, aceștia apar sub forma unor colonii de tip „S” , rotunde, de culoare mediului, netede, translucide și lactozo-negative (figura 13) (Van Asten și colab., 1999).
Din punct de vedere al caracterelor biochimice, tulpinile de Proteus mirabilis sunt anaerobe, facultativ aerobe și au capacitatea ce a fermenta glucoza cu formare de acid și gaz. Astfel, teste biochimice descriu genul: G+, L -, H2S-, Mobilitate + , Uree + , citrat +. Tulpinile de Proteus mirabilis sunt rezistente, putând să reziste timp îndelungat în detergenți, soluții antiseptice sau în soluții perfuzabile, fapt ce explică existența acestora în mediile spitalicești (O’Hara și colab., 2000).

/
Fig. 12. Aspectul macroscopic al coloniilor de Proteus mirabilis pe geloză sânge (5% sânge de berbec) – fenomenul Dienes (www.microbenotes.com)

/
Fig. 13. Aspectul macroscopic al coloniilor de Proteus mirabilis pe mediu MacConkey (www.hardydiagnostics.com)

Factorii de virulență ce determină patogenitatea tulpinilor de P. mirabilis sunt:
Pili de tip 1 – rol în colonizarea tractului gastro-intestinal;
Pili de tip 2 – rol de a determina afecțiuni în alte zone ale organismului, în care nu se află în mod normal
Pili de sex – rol în transferul genetic și mediază factorii de virulență;
Factori fimbrilari de colonizare – rol în colonizarea bacteriilor;
Ureaza.

Ureaza citoplasmatică a metaloenzimei de nichel acționează prin hidrolizarea ureei în amoniac și CO2. Amoniacul ce rezultă este sursa preferată de azot pentru multe specii bacteriene. Un rezultat direct al activității ureazei și a generării amoniacului este o creșterea a pH-ului local. Astfel, în tractul urinar, pH-ul alcalin conduce la precipitarea ionilor de calciu și magneziu și la formarea de pietre urinare. Pietrele urinare pot bloca fluxul urinar și pot provoca leziuni tisulare (Mobley, 1996).

III.1.4. Preudomonas aeruginosa (Schröter 1872)
Preudomonas aeruginosa denumit și „bacilul piocianic” face parte din genul Pseudomonas și este un bacil Gram negativ (figura 14) A fost izolat din sol, apă, aer și în ultimul timp, din ce în ce mai izolat din mediile spitalicești de pe diverse echipamente sau suprafețe, fiind considerat responsabil de producerea unor infecții nosocomiale grave. Mortalitatea ridicată asociată cu aceste infecții se datorează unei combinații de apărare a gazdei slăbite, a rezistenței bacteriene la antibiotice și producției de enzime și toxine bacteriene extracelulare (Iglewshi, 1996).

/
Fig.14. Aspectul microscopic al celulelor de Pseudomonas aeruginosa și
modul de dispunere colorație gram (www.wikipedia.com)

Bacilul este dispus izolat în perechi sau lanțuri scurte, este mobil (se deplasează cu ajutorul unui singur flagel) și nesporulat. Datorită faptului că nu este o bacterie pretențioasă, se poate dezvolta pe orice mediu de cultură. Metabolismul activ pe care îl posedă îi conferă posibilitatea de a crește chiar și în apă distilată (Vasil, 1986).
Pseudomonas aeruginosa crește bine pe majoritatea mediilor de laborator și de obicei este izolată pe plăci de agar cu sânge de berbec 5%. Temperatura la care se poate dezvolta variază între 5 și 42(C. În urma dezvoltării pe geloză sânge, după o incubare de 24h la 37(C, se observă colonii mari, de tip „S”, transparente ce sunt pigmentate în verde-albăstrui, uneori cu luciu metalic și zone de autoliză (figura 15). Se poate observa un miros al coloniilor de flori de tei sau salcâm datorită degajării de aminoacetofenonă. Pe medii lactozate, coloniile sunt lactozo-negative.

/
Fig.15.Cultură de Pseudomonas aeruginosa dezvoltată pe mediu geloză sânge
(5% sânge de berbec) (foto original)

În cazul mediilor lichide, Pseudomonas aeruginosa se dezvoltă la suprafața mediului sub forma unei pelicule deoarece este strict aerob, sub care se formează un strat de pigment (figura 16).
Din punct de vedere al caracterelor biochimice, bacilul piocianic este incapabil de a fermenta lactoza, este oxidazo-pozitiv determinând acidifierea mediului și nu formează urează, H2S și indol. Pigmentul pe care îl produce este format din piocianină (de culoare verde-albăstrui) și pioverdină (de culoare galben-verzui). Totuși, 10% din tulpini, nu formează pigment sau 1% formează pigment roșu fluorescent ( piorubină) (Buiuc și Negruț, 2008).
P.aeruginosa este o bacterie foarte rezistentă, având capacitatea de a rezista la unele dezinfectante și antiseptice. De asemenea, se poate dezvolta chiar și la temperaturi de 42(C. Produce bacteriocine cu rol bacteriostatic față de alte tulpini și este deosebit de rezistentă la antibiotice datorită impermeabilității membranei externe și formării unei beta-lactamaze inductibile (Frank, 2012).

/
Fig.16. Aspectul macroscopic al culturii de Pseudomonas aeruginosa în mediu lichid (www.wikipedia.com)

Pseudomonas aeruginosa este patogen și produce o multitudine de factori care pot contribui la virulența sa. Virulența este asigurată de capsulă, ce prezintă rol de adezină, are rol fagocitar și are capacitatea de a împiedica intrarea antibioticelor în celula bacteriană. De asemenea, pilii au rolul de a facilita adeziunea de substratul specific, iar lipopolizaharidul din peretele bacterian are rol de endotoxină.
Pe lângă acești factori de virulență, tulpinile patogene au capacitatea de a sintetiza substanțe cu efect toxic. Aceste substanțe sunt:
Hemolizine – toxice pentru macrofagele alveolare;
Fosfolipaza C – produce hidroliza lecitinei;
Citotoxina alterează leucocitele;
Proteazele, elastazele, colagenazele – lezează țesuturile ;
Exotoxina A – este cea mai toxică proteină extracelulară cunoscută a Pseudomonas aeruginosa și prezintă structură și mod de acțiune asemănător cu cel al toxinei difterice având capacitatea de a inhiba sinteza proteică în celulele sensibile și leza țesuturile.
Exotoxina S – prezentă la tulpini cu afinitate mare pentru țesutul pulmonar cu rol de a inhiba sinteza proteică (Iglewshi, 1996).

III.1.5. Enterococcus faecalis (Andrewes and Horder, 1906)
Enterococcus faecalis este o bacterie Gram-pozitivă care poate provoca o varietate de infecții nosocomiale, dintre care cele mai frecvente sunt infecții ale tractului urinar. În urma colorației Gram, pe frotiu se observă coci ovali, dispuși izolați, în perechi sau lanțuri scurte (figura 17). Sunt necapsulați, nesporulați și imobili (Kau și colab., 2005).

/
Fig.17. Aspectul microscopic al celulelor de E. faecalis și modul de dispunere
colorație Gram (wwww.wikipedia.com)
Enterococii au fost clasificați inițial ca fiind coci Gram pozitivi ce aparțin grupului D a genului Steptococcus. Ulterior, pe baza diferențelor genetice, genul Enterococcus a fost separat de genul Streptococcus și cuprinde 19 specii. Cea mai frecventă specie implicată în patologia umană este Enterococcus faecalis (Lancefield, 1933).
Pe mediile de geloză sânge ( cu 5% sânge de berbec), E. faecalis se dezvoltă la temperaturi cuprinse intre 10(C și 45(C, iar coloniile sunt mici, de tip S, cu hemoliză variabilă ( α-, β- sau nehemolitice) (figura 18). Pentru izolarea coloniilor din probe contaminate, se folosesc medii selective precum agar bilă-esculină-azid. Pe acest mediu coloniile sunt de culoare alb-cenușiu și de jur împrejur formează un halou negru (figura 19) (Wellinghausen și colab., 2009).
Din punct de vedere al caracterelor biochimice, Enterococcus faecalis sunt coci catalazo- și oxidazo-negativi și au capacitatea de a hidroliza esculina în prezența a 40% bilă. Următoarele reacții pozitive ajută la identificarea corectă:
Testul la bilă-esculină;
Toleranța la 6,5% NaCl;
Producerea de pyrolidonyl-arylamidază
Sensibilitate la vancomicină (Lebreton și colab., 2014).

/
Fig. 18. Aspectul macroscopic al coloniilor de Enterococcus faecalis pe mediu geloză
sânge (5% sânge de berbec) (www.flickriver.com)

Factorii de virulență implicați în patogenitatea tulpinilor de Enterococcus faecalis sunt:
Hemolizina – este o proteină ce lizează hematiile umane și acționează ca o bacteriocină asupra altor coci Gram pozitivi.
Factorul de agregare – este o proteină cu rol în agregarea enterococilor și mediază aderența acestora la nivelul epiteliului urinar cu scopul de a determina infecții urinare
Gelatinaza – este o peptidază asemănătoare elastazei produsă de Pseudomonas aeruginosa și a fost descoperită în tulpini izolate de la pacienți cu endocardită.
Acidul lipoteichoic – cu rol de a determina un puternic răspuns inflamator (Fiore și colab., 2019).

/
Fig. 19. Aspectul macroscopic al coloniilor de Enterococcus faecalis pe mediu agar
bilă-esculină-azid (www.condalab.com)

III.2. Determinarea rezistenței la antibiotice a microorganismelor
Antibiograma este o metodă bacteriologică de detecție a sensibilității/rezistenței microorganismelor la antibiotice. De corectitudinea și acuratețea ei depinde deseori viața pacientului. În laboratorul clinic, în urma antibiogramelor, bacteria infectantă este clasificată într-o categorie de sensibilitate: sensibilă, rezistentă sau intermediară. Reșația dintre bacterie și antibiotic se exprimă prin concentrația minimă inhibitorie (CMI) ce reprezintă concentrația minimă (exprimată in mg/L) care previne dezvoltarea bacteriilor intr-un interval de timp.
Astfel, pentru necesitățile terapeutice, o bacterie poate fi definită ca fiind:
Sensibilă – când CMI este de 2-4 ori mai mică decât nivelul mediu al substanței antimicrobiene și răspunde unui regim terapeutic standard;
Intermediară (sau moderat sensibilă) – când CMI este apropiat de concentrația medie a substanței antimicrobiene în focar și răspunde variabil la substanțe antimicrobiene;
Rezistentă – când CMI este mai mare decât nivelul mediu a substanței antimicrobiene în focar și nu răspunde, chiar și la doze maxime la un anume antibiotic (Buiuc și Negruț, 2008).
Rezistența bacteriilor la antibiotice este împărțită în două categorii:
Bacterii rezistente natural – face referire la un caracter de specie;
Bacterii cu rezistență dobândită – apare doar la un număr de tulpini din cadrul unei specii natural sensibile la un anume antibiotic.
În ceea ce privește rezistența bacteriilor, aceasta diferă de la o specie bacteriană la alta. Microorganismele din genul Enterococcus sunt foarte rezistente la antibiotice, ceea ce ridică probleme grave n mediile intraspitalicești. Sunt rezistenți în mod natural la cefalosporine, sulfamide, lincosamide, aztreonam, clindamicină și trimetoprim-sulfametoxal, și pot dobândi rezistență la aminoglicozide, penicilină și vancomicină. Escherichia coli este o bacterie ce are capacitatea de a forma enzime care hidrolizează betalactamazele, precum penicilinaze și cefalosporinaze, ceea ce îi oferă rezistență. Poate dezvolta rezistență față de aminozide prin mutații ce distrug porinele. Speciile genului Klebsiella sunt sensibile la cefalosporinele de generația a III-a, floxacine, colimicină și gentamicină.Pseudomonas aeruginosa este rezistentă natural la antibiotice datorită faptului că membrana externă este impermeabilă, dar și datorită faptului că poate produce beta-lactamaze inductibile. Este sensibilă la actiunea unui număr mare de bacteriofagi (Maugeri și colab, 2019).

CAPITOL IV
PATOLOGIA MICROBIANĂ ÎN INFECȚIILE URINARE

IV.1. INTRODUCERE
Infecțiile urinare sunt considerate cele mai frecvente infecții bacteriene dobândite atât în comunitate cât și în spitale, ce afectează 150 de milioane de oameni în fiecare an la nivel mondial. Uropatogenii au caracteristici de specialitate, cum ar fi producerea de adezine și toxine care le permit să colonizeze și să invadeze tractul urinar, apoi sunt transmiși între indivizi atât prin contact, de la o persoană la alta, cât și posibil prin alimente și apă. În ceea ce privește infecțiile tractului urinar joase, Uretrocistitele sunt cele mai întâlnite forme de manifestare, determinate în peste 90% din cazuri de Escherichia coli. Infecțiile tractului urinar înalte se manifestă prin prielonefrite datorită infectării cu tulpini de E.coli uropatogene , dar și a altor enterobacteriaceae (Stamm și Norrby, 2001).
Este foarte importantă diagnosticarea infecțiilor urinare deoarece, netratate la timp, acestea pot duce la cancer de vezică urinară sau de rinichi.

Scopul lucrării de față a fost reprezentat de screening-ul tulpinilor bacteriene frecvent implicate în etiologia infecțiilor urinare în populația Județului Vrancea și a rezistenței la antibiotice manifestată de acestea.

Obiective:
Izolarea și identificarea tulpinilor bacteriene patogene izolate din probe de urină primate în ambulatorul laboratorului clinic.
Determinarea spectrului de sensibilitate la antibiotice a tulpinilor izolate și interpretarea acestuia conform stabdardului CLSI.
Interpretarea statistică a rezultatelor obținute.

IV.2. MATERIALE ȘI METODE

Studiul de față se bazează pe rezultatele obținute dintr-un număr de 100 de probe de urină, primite de la pacienții care s-au prezentat la laboratorul de analize S.C. Medical Gisana S.R.L din Focșani, județul Vrancea, în vederea diagnosticării unei presupuse infecții urinare.

IV.2.1. Metode de recoltare
Proba de urină folosită pentru urocultură a fost prelevată fie la domiciliul pacientului fie în unitatea medicală, intr-un recipient steril, denumit urocultor cu capac etanș și steril (figura. 20) pentru a opri contaminarea probei.

/
Fig.20. Sistemul de recoltare și transport al probei de urină – urocultor (foto original)

Recoltarea probei de urină se face din prima urină de dimineață sau la cel puțin 4 ore de la ultima micțiune, dar după ce are loc o toaletă riguroasă a regiunii urogenitale cu apă și săpun. Se recomandă colectarea unirii din jetul urinar mijlociu, fără a întrerupe fluxul și fără a atinge interiorul recipientul sau zona genitală, deoarece primul jet are olul de a spăla uretra de flora existentă la acest nivel. Cateterismul se face doar în cazul pacienților ce nu pot urina spontan și ere realizat doar de medicul urolog. Volumul de urină necesar pentru urocultură este de 20 ml. De asemenea, este foarte important ca recoltarea să se efectueze înaintea începerii tratamentului cu antibiotic.
Transportul probei de urină către laborator trebuie să fie efectuat în cel mult 2 ore de la recoltare. În cazuri excepționale, se poate păstra la frigider (2-8(C), timp de maxim 8 ore.

IV.2.2. Metode de însămânțare
După primirea probelor de urină în laborator, acestea sunt înregistrate în registrul de lucru, li se atribuie un număr de ordine din ziua respectivă și sunt trimise în departamentul de Microbiologie.
Însămânțarea presupune depunerea unei probe sau a unui inocul într-un mediu de cultură cu scopul cultivării bacteriilor. Urina este un produs biologic steril, iar mediile pe care se însămânțează sunt geloză sânge (figura 21) și MacConkey (figura 22) (mediu lactozat semiselectiv favorabil bacililor Gram-negativi). Pentru însămânțări se folosește ansa bacteriologică de unică folosință. Plăcile Petri în care se află mediul de cultură se depozitează în frigider, iar înainte de însămânțare se introduc în termostat la 37(C pentru ca suprafața mediului să se usuce.
/

Probele de urină necentrifugate se omogenizează prin agitare lentă, după care se ridică placa cu mâna stângă, iar cu mâna dreaptă se imersează ansa de 10µL în proba de urină, realizându-se câteva mișcări circulare. Însămânțarea unor cantități fixe de probă este necesară pentru a putea aprecia numărul de bacterii per ml de urină. Uroculturile pozitive au peste 100.000 de bacterii/ml.
Se scoate ansa din lichid și se descarcă în striu pe unul dintre diametrele plăcii, epuizându-se inoculul in striuri strânse, perpendiculare pe striul de descărcare (figura 23). Diseminarea probei se realizează prin tehnica epuizării ansei.

/
Fig. 23. Modul de însămânțare al probelor de urină (foto original)

După însămânțarea probei pe mediu, plăcile sunt incubate la o temperatură de 35 – 37(C, în condiții de aerobioză, timp de 18-24 de ore.

IV.2.3. Metode de identificare a bacteriilor
Mediu geloză-sânge asigură dezvoltarea unei game largi de bacterii, mai ales cele Gram-pozitive, inhibate pe mediul slab selectiv pentru bacilii Gram-negativi. Plăcile cu mediul slab diferențial permite diferențieri între coloniile bacililor Gram-negativi (Buiuc și Negruț, 2008).
Identificarea preliminară a bacteriilor se face în funcție de:
Caractere de cultură;
Caractere biochimice;
Reacții Antigen-Anticorp.
După timpul de incubare, se citesc culturile, notându-se în registrul de lucru aspectul coloniilor și numărul lor. Bacteriuria se calculează după formula:
𝑋=N x
1
volumul însămânțat
,

Unde X = numărul de UFC/ml urină;
N = numărul de colonii existente pe placă.
Uroculturile sunt pozitive în momentul în care un singur izolat de pe placa cu geloză sânge depășește concentrația de 105 UFC/ml urină. Astfel, coloniile care sunt bine izolate și au aspect sugestiv pentru microorganismele cu semnificație patogenă, se supun identificării de gen și specie. În cazul în care sunt mai multe tipuri de izolate pe placa de geloză sânge ce depășesc concentrația de 105 UFC/ml de urină, se consideră că proba este contaminată. Este recomandată prelevarea altei probe.

Identificarea bacteriilor pe baza caracterelor de cultură
Pentru a putea identifica genul și specia bacteriei izolate, se ține cont de urătoarele caractere de cultură:
Dimensiunea coloniilor:
Mari ( enterobacterii sau stafilococi);
Mici (enterococi);
Pulverulente(streptococi).
Forma coloniilor:
Rotunde (stafilococi, streptococi, bacilul piocianic)
Neregulate.
Marginile:
Regulate (streptococi, stafilococi, E.coli)
Neregulate
Suprafața coloniilor:
Colonii de tip „S” cu suprafață netedă, umedă și lucioasă;
Colonii de tip „R” cu suprafață mată, uscată și rugoasă;
Pufoasă;
Prăfoasă.
Relieful:
Bombat;
Mamelonat;
Ombilicat;
Aplatizat.
Densitatea optică
Transparente (bacilul piocianic);
Semitransparente;
Opace (colonii mucoide de stafilococi).
Culoarea coloniilor
Albă
Galbenă
Aurie
Neagră, etc.
Prezența de pigment
Auriu ( S. aureus)
Verzui (P.aeruginosa)
Consistența
Apoasă;
Mucoasă (Klebsiella spp.)
Mirosul
Flori de tei (P. aeruginosa)
Fetid (Proteus)
Drojdie de bere (Candida sp.)
Modificarea mediului
Prin hemoliză dacă mediul conține sânge (streptococi și S. aureus)
Prin virarea culorii mediului prin fermentarea unor zaharuri din conținutul acestuia (colonii lactozo-pozitive – E.coli)

Identificarea bacteriilor pe baza testelor biochimice
Identificarea pe baza testelor biochimice pune în evidență echipamentul enzimatic al bacteriilor, care este diferit de la o specie la alta. Pentru realizarea acestor teste se utilizează diferite medii ce au substraturile față de care se dorește investigarea activității enzimatice.
În reacțiile biochimice trebuie să se urmărească:
Secreția unor enzime, ca de exemplu coagulaza, catalaza sau oxidaza;
Capacitatea de metabolizarea a zaharurilor ( prin mecanism oxidativ sau fermentativ). În identificarea bacteriilor gram-negative este importantă diferențierea bacteriilor fermentative de cele nefermentative;
Utilizarea ca sursă de carbon (citrat);
Producerea de hidrogen sulfurat.
Principiul metodei are la bază realizarea concomitentă a mai multor teste de identificare pentru o singură specie microbiană pentru identificarea corectă a acesteia. În practica de laborator se recomandă folosirea asociației de medii TSI (Triple sugar iron), MIU ( Mobilitate-Indol-Urează) și Simmons. Aceste teste prin unică însămânțare pe un singur mediu sunt capabile să detecteze specia bacteriană.
Mediu TSI(Triple sugar iron) este un mediu agarizat, în coloană și pantă de culoare roșie (figura 24) care testează capacitatea microorganismelor de a fermenta zaharurile și de a produce hidrogen sulfurat. Forma înclinată a acestui mediu oferă o serie de suprafețe care sunt expuse la oxigen în diferite grade (mediu aerob sau mediu anaerob). Este format dintr-o bază nutrivită, glucoză, lactoză, zaharoză, o sursă de sulf, indicator de pH și indicator de hidrogen sulfurat.
/
Fig.24. Mediu TSI (foto original)

Fermentarea zaharurilor este indicată prin producerea de gaz și o schimbare a culorii indicatorului de pH de la roșu la galben. Panta este cea care diferențiază fermentarea lactozei și zaharozei de fermentarea glucozei. Pentru a facilita detectarea microorganismelor care fermentează doar glucoza, concentrația acesteia este o zecime din concentrația de lactoză sau zaharoză. Astfel, metaboliții rezultați din fermentarea glucozei vor fi în cantitate mai mică și vor da reacție acidă doar coloanei în care O2 nu poate ajunge. La nivelul curbei vor fi degradați în continuare oxidativ cu neutralizarea cantității minime de acizi prin metaboliții alcalini rezultați din peptone. În cazul fermentării lactozei și zaharozei, cantitatea de acizi rezultată nu este neutralizată, astfel panta rămâne acidă (Buiuc și Negruț, 2008).
Însămânțarea se face cu ansa bacteriologică. Se ia o porțiune dintr-o colonie, se înțeapă coloana cât mai adânc și se retrage ansa cu etalare în striu pe suprafața pantei. Mediul se incubează la 37(C timp de 24 de ore. Trebuie citit după o incubare de maxim 24 de ore deoarece un timp de incubare îndelungat poate duce la rezultate fals pozitive.
Interpretarea se face pe baza virajului culorii mediului. Fermentarea glucozei este pozitivă dacă în porțiunea dreaptă, culoarea virează în galben. Fermentarea lactozei este pozitivă dacă în porțiunea înclinată culoarea virează spre galben. Dacă fermentarea a avut loc cu producere de gaz, se observă bule care fragmentează coloana mediului. Producerea de H2S este pozitivă dacă între porțiunea dreaptă și cea înclinată apare o zonă neagră.
Mediu MIU (Mobilitate-Indol-Uree) este un mediu utilizat pentru selecția biochimică a enterobacteriaceelor de culoare galben (figura 25). Trei teste într-un singur mediu ajută la diferențierea microorganismelor pe baza mobilității și producerii de urează și indol.
Mediul este format din uree, peptonă cu triptofan, roșu fenol ca indicator de pH. Triptofanul are rolul de a furniza aminoacizi și alte substanțe azotate, iar indicatorul de pH devine roz-roșu în condiții alcaline. Microorganismele care utilizează uree, produc amoniac care face mediul alcalin, ceea ce duce la virajul culorii de la roșu în roz-roșu. Indolul produs din triptofan se combină cu aldehida din reactivul Kovacs pentru a forma un complex roșu. (Ewing, 1986).

/
Fig.25. Mediu MIU (foto original)

Însămânțarea se face cu ansa bacteriologică. Se prelevă dintr-o porțiune de colonie și se înțeapă coloana de mediu. Deasupra coloanei de mediu se fixează prin capac o bandă de hârtie indicator îmbibată în reactiv Kovacs. Se incubează la 37(C timp de 24 de ore.
Testul pentru mobilitate se pozitivează dacă mediul devine opalescent uniform, și se negativează dacă cultura este crescută doar pe linia de însămânțare. Testul ureazic este pozitiv atunci când culoarea mediului este virată de la galben la roșu, iar testul indol este pozitiv atunci când culoarea reactivului Kovacs adăugat la suprafața mediului virează în roșu/violet.

Mediul Simmons este utilizat pentru diferențierea Enterobacteriaceae-lor dar și pentru identificarea altor bacterii. Datorită unor permeaze și a unei citrat-liaze, unele enterobacteriacee permit pătrunderea citratului în celulă și îl utilizează ca unică sursă de carbon, ducând la alcalinizarea mediului (Buiuc și Negruț, 2008). Înainte de însămânțare, mediul este de culoare verde, iar în urma pozitivării devine albastru (figura 26).

/
Fig.26. Mediu Simmons (foto original)

Microorganismele care utilizează citratul se vor dezvolta pe acest mediu, iar albastru de bromtimol, care acționează ca indicator de pH, determină schimbarea culorii mediului de la verde (neutru) la albastru (alcalin). Culoarea mediului rămâne verde dacă microorganismele nu sunt capabile să metabolizeze citratul de sodiu (Bailey și Scott,2013).

IV.2.4 .Determinarea rezistenței la antibiotice. Antibiograma
Antibiograma este cea mai importantă etapă a diagnosticului bacteriologic și implică determinarea sensibilității sau rezistenței bacteriilor la substanțele antimicrobiene. Aceasta se obține prin cultivarea microorganismului în prezenta unei cantități cunoscute de antibiotic.
Metoda difuzimetrică este tehnica cea mai utilizată și presupune însămânțarea tulpinii pe un mediu solid și aplicarea de microcomprimate de antibiotice pe suprafața mediului.
/
Fig.27. Aspectul culturii și a zonelor de inhibiție a creșterii prin tehnica Antibiogramei (foto original)

Se utilizează mediu Muller Hinton sau Muller Hinton + 5% sânge de berbec un mediu neselectiv, nediferențial, pe care aproape toate microorganismele se dezvoltă. Microorganismele se vor dezvolta „în pânză” pe suprafața mediului până în zona unde, în momentul multiplicării lor, antibioticele vor atinge o concentrație corespunzătoare CMI ( concentrația minimă inhibitorie). După o perioadă de incubare de 18 ore la 37(C, se observă sensibilitatea/rezistența tulpinei măsurând diametrul zonei ce apare în jurul microcomprimatului de antibiotic (figura 27).

Mod de lucru
Se scot din frigider microcomprimatele cu antibiotic și se țin la temperatura camerei pentru aclimatizare;
Se usucă, de asemenea, suprafața mediului de cultură ținând mediul în incubator pentru circa 15 minute;
Se pregătește inoculul și se măsoară turbiditatea cu ajutorul densiometrului la 0,5 McFarland; se modifică după caz cu ser fiziologic steril sau cultură
Se imersează un tampon steril în suspensia bacteriană;
Se scurge excesul de lichid de pe tampon prin presare de pereții tubului;
Se descarcă tamponul în 3 direcții până la acoperirea întregii suprafețe, rotind placa la 60(;
Se trece la final cu tamponul pe toată circumferința mediului, la limita cu placa pentru a obține un inocul uniform;
Se lasă 5 minute placa la temperatura camerei pentru absorbția inoculului;
Se aleg microcomprimatele de antibiotic și se așează pe mediu cu ajutorul dispenser-ului la o distanță de 30mm între microcomprimate și 15mm față de marginea plăci;
Se introduce placa în incubator, timp de 18-24 de ore.
Microcomprimatele de antibiotic folosite sunt:
– Acid Nalidixic (NA)
– Amikacin (AK)
– Amoxicilina/Acid Clavulanic (AUG)
– Ampicilina (AMP)
– Ceftazidim (CAZ)
– Ciprofloxacin (CIP)
– Gentamicin (CN)
– Ceftriaxon (CRO)
– Cefuroxim (CXM)
– Imipenem (IMP)
– Meropenem (MEM)
– Nitrofurantoin (F)
– Norfloxacin (NOR)
– Tetraciclina (TE)
– Tobramicin (TOB)
– Trimetoprim – Sulfametoxazol (SXT)
– Piperacilin/Tazobactam (TZP)

Interpretarea rezultatelor se realizează prin măsurarea cu ajutorul unei rigle, a diametrelor zonelor de inhibiție (în cazul mediilor cu sânge, se face abstracție de zona de hemoliză). Diametrul zonelor de inhibiție determinat de fiecare antibiotic se raportează la tabelul interpretativ al discurilor de antibiotice, pentru a le transforma în categorii de sensibilitate (sensibil, intermediar sau rezistent). Se iau în considerare coloniile bine dezvoltate apărute în interiorul zonei de inhibiție.
În cazul zonei duble sau zonei cu margini în ferăstrău se citește distanța între marginile interioare ale zonei de creștere, iar dacă apar colonii în aria de inhibiție, se raportează ca fiind colonii rezistente. Nu se iau în considerare coloniile punctiforme.
În urma testării sensibilității la antibiotice, tulpina poate fi raportată ca fiind:
Sensibilă (S)
Intermediară (I)
Rezistentă (R)
Tulpina este considerată ca fiind sensibilă la un antibiotic când infecția pe care o determină nu răspunde la tratamentul cu antibioticul respectiv sau doza recomandată.
Tulpina este considerată intermediară la un antibiotic atunci când se poate administra ca tratament, dar în doze mult mai mari, fie din cauza toxicității scăzute, fie pentru că oferă o concentrație mai bună la nivelul focarului infecțios.
Tulpina este considerată rezistentă la antibiotic când aceasta nu va răspunde la tratament, indiferent de doza sau de locul infecției.
În registrul de lucru,pentru fiecare antibiogramă, se notează diametrul din jurul fiecărui microcomprimat și se precizează interacțiunile antibioticelor. Antibiograma pentru bacteriile gram-negative (Tabelul 3) trebuie să cuprindă o penicilină cu inhibitor de beta-lactamază și minim două cefalosporine de generația a II-a și a III-a în apropiere. Dacă apar modificări specifice, la specia identificată se precizează BLSE (tulpină producătoare de beta-lactamază cu spectru extins).

REZULTATE ȘI DISCUȚII

Analiza microbiologică a celor 100 de probe de urină prelevate de la pacienți de vârste și sexe diferite a permis evaluarea speciilor bacteriene implicate în etiologia infecțiilor urinare precum și incidența acestor infecții în populație, în funcție de vârstă și sex.
Identificarea pe baza caracterelor biochimice a tulpinilor bacteriene izolate a confirmat datele din literatură care susțin implicarea enterobacteriilor în declanșarea infecțiilor urinare, mai ales la femei. Astfel, așa cum se poate observa și in figura 28, 74% dintre cazurile de infecții înregistrate la femei au fost determinate de tulpini de E. coli. Alți agenti etiologici implicați în infecțiile urinare la femei sunt Streptococcus agalactie, în procent de 8% cu 4 tulpini, la egalitate cu Enterococcus faecalis în procent de 8% cu 4 tulpini, de asemenea. Ulterior se află Proteus mirabilis și Streptocoul β-hemolitic de grup B, în procent de 4% cu câte 2 tulpini fiecare, iar Klebsiella pneumoniae în procent de 2% cu 1 tulpină.
/
Fig.28. Repartiția procentuală a cazurilor de ITU în funcție de principalii agenți etiologici la femei.

Aceeași situație a fost regăsită și în cazul probelor prelevate de la bărbați, E. coli fiind identificată în 60 % din cazuri, dar s-a înregistrat o implicare mai mare a speciei Proteus mirabilis identificată în 20% din cazuri (figura 29).

/

Fig.29. Repartiția procentuală a cazurilor de ITU în funcție de principalii agenți etiologici la bărbați

De asemenea, se poate observa în etiologia infecțiilor urinare la bărbați, implicarea non-enterobacteriilor aparținând speciei Pseudomonas aeruginosa, în 10% din cazuri. În acest caz, o posibilă explicație ar fi cateterizarea urinară a pacienților de sex masculin, Pseudomanas aeruginosa fiind cunoscut pentru capacitatea de colonizare a sondelor urinare, mai ales la pacienții imunocompromiși (figura 30). Mai puțin frecvent au fost izolate tulpini de Enterococcus faecalis în procent de 6% și Streptocoul β-hemolitic de grup B alături de Klebsiella pneumonie în procent de 2%.
/
Fig.30. Analiza comparativă a agenților etiologici implicați în ITU în funcție de sex.

Analizând figura 33, se observă că, atât la sexul feminin, cât și la cel masculin, riscul de a dezvolta o infecție urinară crește de la un interval de vârstă la altul. Cel mai mic risc au pacienții cuprinși în intervalul 0-3 ani, cu 0 cazuri pozitive pentru ambele sexe, dar și cei cuprinși în intervalul 4-18 ani, având doar 5 cazuri pozitive,respectiv 4 caz pozitiv pentru sexul feminin și 1 cazuri pozitive pentru sexul masculin (reprezentând 8%, respectiv 2% din totalul probelor – figurile 33 și 34). Intervalul de vârstă 19-30 ani prezintă 12 cazuri pozitive pentru femei (24%) și 2 cazuri pozitive pentru bărbați (4%).
Odată cu creșterea intervalului de vârstă, crește și numărul cazurilor pozitive, astfel, intervalul de vârstă 31-55 de ani prezintă 13 cazuri pozitive pentru femei (26%) și 11 cazuri pozitive pentru bărbați (22%). Ultimul interval de vârstă, cel peste 56 de ani prezintă 21 de cazuri pozitive pentru femei (42%) și 26 de cazuri pozitive pentru bărbați (72%), fapt ce confirmă faptul că riscul dezvoltării unei infecții urinare crește o dată cu vârsta.
Din figura 31 și figura 32, se poate observa o creștere netă a infecției urinare la adulți și mai ales la vârstnici. Astfel, putem trage concluzia că riscul dezvoltării unei infecții urinare crește o dată cu vârsta, în special la persoanele de peste 50 de ani.

/
Fig.31. Repartiția procentuală pe grupe de vârste a pacienților de sex feminin cu uroculturi pozitive

Fig.32. Repartiția procentuală pe grupe de vârste a pacienților de sex masculin cu uroculturi pozitive

De asemenea, graficul de mai jos confirmă incidența mai mare a infecțiilor urinare la femei cu vârsta mai mare de 50 de ani, comparative cu bărbații aflați în același interval de vârstă (figura 33).
/
Fig.33. Repartiția comparativă pe grupe de vârstă și sex a uroculturilor pozitive

CONCLUZII

Infecția tractului urinar este una dintre cele mai frecvente condiții patogene cu o apariție frecventă la femei, comparativ cu incidența acestora asupra populației;

Esherichia coli a predominant în izolatele urinare, atât în cazul femeilor, cât și în cazul bărbaților;

Agenții patogeni implicați în majoritatea cazurilor au fost Escherichia coli, urmată de Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Enterococcusfaecalis și Streptococul β-hemolitic de grup B;

S-a observat că riscul de a dezvolta o infecție urinară este direct proporțional cu vârsta pacienților;

Prezența bacteriilor în urină poate fi consecința contaminării probelor cu microbiota uretrei distale sau vulvo-vaginale, a infecției căilor urinare sau a colonizării urinii vezicale cu contaminanți ocazionali.