Introducere (autosaved) [301788]

INTRODUCERE

Hipertensiunea arterială este o [anonimizat], deși uneori asimptomatică și cu o evoluție de cele mai multe ori “tăcută”, ea prezintă unele consecințe severe asupra stării de sănătate. [anonimizat], adevărata importanță a hipertensiunii arteriale nu a fost recunoscută decât câteva secole mai târziu.

[anonimizat] 2025 procentul populației suferinde de hipertensiune va crește cu aproximativ 30%. Astfel, putem afirma că medicamentele antihipertensive se numără printre cele mai utilizate medicamente. [anonimizat], încă de la introducerea lor în terapie. [anonimizat] 1, 4-dihidropiridină (1,4-DHP) datorită proprietăților remarcabile ale acestora de a [anonimizat].

[anonimizat], [anonimizat].

[anonimizat], a căror enantiomeri diferă în proprietățile lor farmacologice. Termenul general de chiral se referă la faptul că un obiect este nonsuperpozabil cu imaginea lui în oglindă și derivă din cuvântul grecesc mână (kheir).

[anonimizat], precum și a [anonimizat].

Este dovedit prin studii clinice faptul că blocantele canalelor de calciu (BCC) prezintă unele reacții adverse caracteristice cum ar fi: tahicardie, [anonimizat], [anonimizat], crampe musculare și că există diferențe substanțiale în ceea ce privește efectele terapeutice ale enantiomerilor blocantelor canalelor de calciu. [anonimizat], ceea ce reprezintă o povară în plus pentru organism. [anonimizat], derivat 1, 4-dihidropiridinic prezintă un interes sporit în studiul separării chirale.

Efectuarea unui studiu experimental care să urmărească separarea chirală a enantiomerilor amlodipinei este un subiect larg discutat în domeniul farmaceutic și analitic.

Metoda penru care am optat în cazul separării chirale a amlodipinei este reprezentată de electroforeză capilară (EC), instrument eficient și tot mai des utilizat în studii de separare chirală. Electroforeza capilară este considerată o metodă alternativă cromatografiei de lichide de înaltă performanță (HPLC), fiind oficinală în Farmacopeea Europeană ediția a 8-a. Printre avantajele EC se regăsesc rapiditatea, simplitatea metodei, timpul scurt de analiză, consum scăzut de reactivi, putere de rezoluție mare. Un alt avantaj extrem de importat este varietatea mare de selectori chirali disponibili în vederea separării chirale. Tehnica separării este foarte simplă, se bazează pe adăugarea selectorului chiral în soluția tampon.

Scopul nostru a fost conceperea unei metode de separare chirală a enantiomerilor amlodipinei care să fie simplă, eficientă și cât mai rapidă, utilizând diferite ciclodextrine (CD) ca și selectori chirali adăugați în soluția electrolitului, apoi modificarea parametrilor analitici pentru a îmbunătăți rezoliția chirală și pentru a obține un timp de migrare cât mai scurt al enantiomerilor. În final am verificat aplicabilitatea metodei analitice pentru a determina enantiomerii amlodipinei din diferite forme farmaceutice existente pe piață.

PARTEA GENERALĂ

Hipertensiunea arterială

Conform Ghidului Organizației Mondiale a Sănătății și a Societății Internationale de

Hipertensiune (ISH,1999), hipertensiunea arterială este creșterea constantă a tensiunii arteriale sistolice (TAs) și/sau diastolice (TAd), la pacienți fără tratament antihipertensiv, respectiv TAs ≥ 140 mmHg și/sau TAd ≥ 90 mmHg. [TRATAT]

Această boală afectează o proporție substanțială din populația adultă din întreaga lume și un număr tot mai crescut de adolescenți. Numeroși factori genetici, de mediu și comportamentali influențează dezvoltarea hipertensiunii arteriale. [chapter 1]

HTA constituie o problemă de sănătate publică majoră, fiind cea mai frecventă boală cardiovasculară. Prevalența HTA variază între 5-10% în țările subdezvoltate și între 10-20% în țările industrializate. Apariția bolii este influențată de anumiți factori precum: mediul geografic, condițiile socio-economice, compoziția solului și a apei potabile. [2]

HTA este rezultatul creșterii tonusului vascular periferic, care duce la creșterea rezistenței arteriolare și reducerea capacității sistemului venos. În cele mai multe cazuri, cauza creșterii tonusului vascular este necunoscută. Deși mulți pacienți nu prezintă niciun simptom, hipertensiunea cronică poate duce la boli cardiovasculare și infarct, două dintre cauzele cele mai frecvente de deces din lume. HTA reprezintă de asemenea și un factor de risc important în dezvoltarea bolii cronice de rinichi și insuficiența cardiacă. Indicența morbidității și a mortalității scade semnificativ atunci când hipertensiunea este diagnosticată din timp și tratată în mod corespunzător. [LIPPINCOTT’S]

Clasificarea hipertensiunii arteriale

De-a lungul timpului, s-a pus mai mult accent pe tensiunea arterială diastolică

comparativ cu tensiunea arterială sistolică, ca factor predictiv al morbidității cardiovasculare și a evenimentelor fatale.

Hipertensiunea arterială este în mod normal definită ca și usoară când tensiunea diastolică este cuprinsă între 90 și 104 mmHg, moderată între 105 și 114 mmHg și severă când depășește valoarea de 115 mmHg. [WILSON]

Cu toate că hipertensiunea arterială poate să apară și secundar altor boli, mai mult de 90% dintre pacienți suferă de hipertensiunea esențială (hipertensiune primară; idiopatică). Hipertensiunea esențială este cea mai comună formă de hipertensiune, debutul acesteia depinde de reactivitatea individuală și poate să apară între 25-55 ani. Cu toate că de-a lungul timpului s-au făcut multe progrese în ceea ce privește identificarea și controlul hipertensiunii esențiale, etiologia acestei forme de hipertensiune nu a fost încă cunoscută.

Hipertensiunea secundară (10-15% din cazuri) este sugerată de o creștere severă a valorilor presiunii arteriale, instalarea bruscă a hipertensiunii și răspunsul modest la tratamentul medicamentos. Printre cauzele hipertensiunii secundare se numără: boala renală parenchimatoasă, hipertensiunea renovasculară, feocromocitomul, hiperaldosteronismul primar, sindromul Cushing sau unele medicamente (corticosteroizi, AINS, estrogeni, anticoncepționale). Apare mai ales la copii și adolescenți. Hipertensiune renală – poate fi indusă la animalele de experiență prin stenoză de arteră renală. Stenoza renală arterială poate să apară și în alte condiții patologice ale rinichiului cum ar fi nefrita, tromboza renală arterială, sau alte situații în care curgerea sângelui de-a lungul arterei renale este obstrucționată.

O altă cauză de hipertensiune arterială secundară poate fi reprezentată de anumite stări patologice ale sistemului nervos central, spre exemplu tumorile maligne. Tumori de la nivelul medulosuprarenalei ce cauzează eliberarea de cantități exagerate de catecolamine (noradrenalină, adrenalină), creează o stare de hipertensiune, cunoscută sub denumirea de feocromocitom. Feocromocitomul este o formă rară de hipertensiune secundară. Secreția excesivă de aldosteron (hiperaldosteronism primar) de către corticosuprarenală, adeseori datorită adenoamelor, produce de asemenea tulburări hipertensive.

Un istoric familial de hipertensiune arterială, crește probabilitatea ca un individ să manifeste aceiași boală. Prevalența acesteia crește odată cu vârsta, dar descrește cu nivelul de educație și statut. Persoanele care suferă de diabet zaharat, obezitate sau alte dizabilități sunt mult mai predispuse la a manifesta hipertensiune decât cele care nu prezintă acești factori predispozanți. Factorii de mediu, cum ar fi un stil de viață stresant, dieta bogată în sodiu,precum și fumatul poate predispune un individ la creșterea cronică a presiunii arteriale. [WILSON, apoi LIPPINCOT]

Istoric hipertensiune arterială

J.H. Hay, Paul Dudley White și altii au afirmat că presiunea arterială crescută poate fi un fenomen natural și compensator necesar care ar trebui sa fie lăsat deoparte, chiar dacă există tratamente eficiente. Studii clinice și epidemiologice vaste au demonstrat pe urmă însă contrariul. Presiunea arterială crescută este în mod evident un factor de risc cardiovascular și acum putem afirma cu certitudine că tratarea hipertensiunii reduce morbiditatea și mortalitatea cardiovasculară. Istoria managementului hipertensiunii arteriale este o poveste de un real succes în medicină.

Hipertensiunea arterială constituie un factor de risc major de boală cardiovasculară, riscul cardiovascular al unui pacient hipertensiv fiind în strânsă legătură cu severitatea hipertensiunii, asociat și cu alți factori de risc.

Un caz medical istoric de hipertensiune arterială netratată este acela al președintelui Franklin Delano Roosevelt, care a manifestat o presiune arterială de 162/98 mmHg în 1937 la vârsta de 54 de ani, dar potrivit cunoștințelor medicale și opiniilor potrivit perioadei, nu a beneficiat de tratament pentru reducerea tensiunii. În 1940 tensiunea acestuia atingea 180/88 mmHg, iar în 1941 188/105 mmHg. La data de 12 aprilie 1945, Roosevelt a decedat la vârsta de 63 de ani datorită unei presiuni arteriale >300/190 mmHg ce a dus la o hemoragie cerebrală.

Roosevelt reprezintă un caz specific de hipertensiune arterială netratată care progresează spre insuficiența de organ și moarte prin infarct.

Hipertensiunea în anii 1950

Se afirma că tratamentul hipertensiunii arteriale ar trebui să fie bazat pe simptomele dificultăților coronariene. Aceia care prezintă dureri în piept sau alte semne cardiovasculare caracteristice ar trebui să aibă hipertensiunea tratată, restul nu. La începutul anilor 1950, se credea că hipertensiunea nu este o boală până nu prezintă niște simptome. S-au descoperit antihipertensive ca: fenoxibenzamina, mecamilamina și guanetidina (inhibitor adrenergic periferic), eficiente în reducerea tensiunii arteriale, dar dezavantajele majore ale acestora sunt reprezentate de efectele secundare semnificative. Se utilizează și diureticele care reduc eficient tensiunea arterială, acestea sunt bine tolerate și prelungesc semnificativ durata de viață a pacienților hipertensivi.

Hipertensiunea între anii 1960-1990

Disponibilitatea unor medicamente excelente, eficiente și sigure, cum ar fi blocantele canalelor de calciu (BCC), inhibitorii enzimei de conversie a angiotensinei (IECA), diureticele și β-blocantele, a făcut posibilă reducerea tensiunii arteriale până la atingerea valorii normale la mai mult de 50% dintre pacienți.

Hipertensiunea în secolul 21

Se cunoaște faptul că hipertensiunea arterială, precum focul, este cel mai bine să fie stopată din timp sau chiar și mai bine să fie prevenită. Există terapii farmacologice bine tolerate și eficiente care reduc riscul evenimentelor cardiovasculare nedorite. Managementul modern al hipertensiunii arteriale reprezintă astăzi un succes major în medicina preventivă. Aproape fiecare studiu clinic larg a demonstrat faptul că, cu cât tensiunea arterială este mai mică, cu atât rezultatul obținut este mai rapid și mai eficient. Cu toate astea rămân o serie de întrebări: când ar trebui să fie introdus tratamentul farmacologic? Care este cea mai bună strategie de tratare a hipertensiunii? etc. [3]

Complicațiile hipertensiunii arteriale

Acestea pot fi:

de natură cardiacă (insuficiența cardiacă)

coronariene (boala arterială coronariană)

cerebrovasculare (AVC)

renale (insuficiență renală)

vasculare (anevrism, accidente aterotrombotice).

Clasificarea medicației antihipertesive

Medicația antihipertensivă reduce valorile crescute ale presiunii arteriale, până la valorile fiziologice prin scăderea debitului cardiac, scăderea rezistenței periferice.

În mod tradițional, blocantele canalelor de calciu sunt clasificate conform structurii lor chimice. Alte metode de clasificare sunt realizate conform subtipurilor canalelor de calciu pe care le blochează și efectului lor asupra miocardului.

-Clasificare după structura chimică:

Dihidropiridine: acționează asupra canalelor de tip L ("long lasting”=lente). Ele prezintă o selectivitate mai mare pentru mușchii netezi vasculari decât pentru miocard, și astfel efectul lor principal este vasodilatația. Efectul inotrop negativ este rar observat la doze terapeutice, prezintă acțiune slabă sau chiar absentă asupra nodului sinoatrial (SA) sau atrioventricular (AV).

Benzotiazepine (diltiazem)

Fenilalchilamine (verapamil), cele două clase acționează de asemenea asupra canalelor de tip L, dar prezintă o acțiune mai puțin selectivă asupra vaselor decât dihidropiridinele. Prezintă acțiune directă asupra miocardului, producând efecte deprimante asupra nodului SA și AV. Sunt folosite datorită proprietăților lor antiaritmice, antianginoase și antihipertensive. [MARTINDALE].

-BCC pot fi clasificate și după durata lor de acțiune, astfel distingem:

Agenți cu durată scurtă: nifedipina (capsulă cu lichid), nicardipina, isradipina, verapamil, diltiazem;

Agenți cu durată lungă și eliberare modificată: nifedipina – sistem terapeutic gastrointestinal (GITS-gastrointestinal therapeutic system), verapamil – eliberare susținută;

Agenți cu durată lungă de acțiune: amlodipina, lacidipina, lercanidipina.

Majoritatea DHP cu durată scurtă de acțiune nu au fost aprobați niciodată în terapie și nici recomandați pentru tratamentul hipertensiunii, fiind asociați cu o activare reflexă a sistemului nervos simpatic, ce poate cauza tahicardie și creșterea riscului de evenimente cardiovasculare nedorite. [the role of existing]

Ca un rezultat al evoluției lor continue, mai mulți autori au propus o altă clasificare a blocantelor canalelor de calciu ce conține trei generații, clasificare folosită și recunoscută în mai multe țări. Tabelul 2.1.

Tabelul 2.1. Clasificarea blocantelor canalelor de calciu

[Classification of Ca antagonists, selection in HT]

DHP de generația I au un debut rapid al acțiunii, durata de acțiune este scurtă, deci necesită o administrare multiplă într-o zi. Efectul inotrop și dromotrop negativ este evident mai ales în cazul verapamilului și al diltiazemului, și studiat pentru nifedipina chiar dacă este mascat de activarea simpatică reflexa indusă de vasodilatația periferică.

DHP generația a II-a sunt divizate în 2 subclase, IIa compuși cu eliberare modificată și IIb derivați noi de dihidropiridină care posedă proprietăți farmacocinetice și farmacodinamice îmbunătățite. Generația a II-a prezintă unele îmbunătățiri în ceea ce privește farmacocinetica compușilor și/sau o selectivitate vasculară crescută, deci acești compusi au o durată mai lungă de acțiune și reacții adverse legate de vasodilatație mai puține.

Dezvoltarea de noi molecule unice, caracterizate printr-o afinitate crescută față de situsurile de legare a BCC și de o durată mult mai lungă de acțiune au dus la cei doi reprezentanți ai generației a III-a, amlodipina și lacidipina. Amlodipina are o durată de acțiune de 40-50 de ore, lacidipina este o moleculă foarte lipofilă, aceste proprietăți le conferă compușilor un debut al acțiunii gradual și un efect prelungit.[Classification of Ca antagonists, selection in HT].

Clasificarea, funcție de mecanismele fiziopatogenice implicate în HTA, la nivelul cărora acționează:

-Inhibitoare ale sistemului nervos vegetativ simpatic (Simpatolitice);

-Vasodilatatoare;

-Substanțe care interferă cu sistemul renină-angiotensină-aldosteron;

-Diuretice;

-Alte mecanisme.

A. Inhibitoare ale sistemului nervos vegetativ simpatic (Simpatolitice);

-Centrale:

-agoniști ai receptorilor α-2 presinaptici și/sau imidazolici I-1 presinaptici (clonidina, guanfacina, guanabenz, moxonidina, rilmenidina);

-neurosimpatolitice și cu acțiune centrală: reserpina, alfa-metildopa;

-β-adrenolitice: neselective (Propranolol, oxprenolol, sotalol, tertatolol, nadolol) si selective beta-1 (atenolol, metoprolol, acebutolol, betaxolol, bisoprolol, celiprolol, talinolol etc);

-α-adrenolitice: prazosin, doxazosin, terazosin, trimazosin, urapidil;

-Neurosimpatolitice: reserpina; alfa-metildopa; de tip guanetidina (guanetidina, betanidina, guanadrel);

-Ganglioplegice: trimetafan.

B. Vasodilatatoare

-Blocante ale canalelor de calciu: tip nifedipina, prototipul (nifedipina, nimodipina, nisoldipina, nitrendipina, felodipina, nicardipina, lacidipina, lecarnidipina, isradipina, amlodipina, fendilina), tip diltiazem (diltiazem), tip verapamil (verapamil, galopamil);

-Musculotrope: hidralazine (hidralazina, dihidralazina), papaverina, minozidil, diazoxid, nitroprusiat de sodiu.

C. Substanțe care interferă cu sistemul renină-angiotensină-aldosteron

– Inhibitoare ale enzimei de conversie a angiotensinei (IECA): captopril, lisinopril si prodroguri (enalapril, fosinopril, perindopril, quinapril, ramipril, trandolapril);

– Antagonisti ai receptorilor AT-1 ai angiotensinei II: candesartan, eprosartan, valsartan, irbesartan, losartan, telmisartan, salsartan, saralazina.

D. Diuretice: tiazide și similare farmacologic (hidroclorotiazida, clortalidon, indapamid); de ansa (furosemid, bumetanid, acid etacrinic); antialdosteronice (spironolactona, amilorid, triamtere).

E. Alte mecanisme: antagoniști ai serotoninei (ketanserin).[TRATAT]

Protocoale de tratament în hipertensiunea arterială

Scopul terapiei antihipertensive este acela de a reduce morbiditatea și mortalitatea cardiovasculară și renală, prin inițiarea terapiei medicamentoase în mod gradat, urmărindu-se atingerea valorilor țintă ale tensiunii arteriale în aproximativ câteva săptămâni. Legătura dintre presiunea arterială și riscul evenimentelor cardiovasculare este strânsă și continuă, și astfel scăzând chiar și moderat presiunea arterială crescută, se reduce semnificativ apariția evenimentelor cardiovasculare. Pentru majoritatea pacienților hipertensivi, scopul valorii presiunii arteriale este o TAs mai mică de 140 mmHg și o TAd mai mică de 90 mmHg. Hipertensiunea ușoară poate fi tratată de multe ori cu ajutorul monoterapiei, se face inițierea tratamentului cu doze minime eficace (pentru reducerea reacțiilor adverse ale “primei doze”).

{ Avantajul începerii tratamentului cu un singur antihipertensiv în doze mici este acela că, în cazul în care acesta nu este bine tolerat se poate trece la un alt medicament, iar în acest scop urmărirea reacțiilor adverse este foarte importantă. JOURNAL OF HT }

Cei mai mulți dintre pacienți necesită mai mult decât un singur medicament antihipertensiv pentru a asigura reducerea presiunii arteriale până la valoarea optimă, astfel că farmacoterapia combinată (cu 2 sau 3 antihipertensive în doze mici, de exemplu combinațiile fixe de antihipertensive în doze mici) este de preferat monoterapiei cu doze eficace mari. Un principiu mai modern de tratament antihipertensiv combină triterapia, aceasta fiind recomandată cu doze reduse la jumătate din dozele standard.

Recomandările curente se bazează pe inițierea tratamentului cu diuretic tiazidic, inhibitor al enzimei de conversie a angiotensinei, antagonist al receptorilor angiotensinei II sau blocant al canalelor de calciu. În cazul în care presiunea arterială nu este controlată adecvat astfel, ar trebui să se introducă în terapie un al doilea medicament antihipertensiv, cu condiția ca alegerea să fie cât mai avantajoasă din punctul de vedere al apariției reacțiilor adverse. Pacienții cu valori ale TAs mai mari de 160 mmHg sau TAd mai mari de 100 mmHg ar trebui să înceapă tratamentul direct cu două antihipertensive simultan. [TRATAT, LIPPINCOTTS]

În cazul acelor pacienți cu presiunea arterială foarte crescută, este necesar tratamentul cu trei sau chiar mai multe medicamente antihipertensive. Conform unui studiu asupra hipertensiunii arteriale sistolice la vârstnici s-a observat o reducere semnificativă a riscului de infarct și a evenimentelor cardiovasculare în timpul tratamentul cu blocante ale canalelor de calciu de tipul dihidropiridinelor.

Inițierea terapiei cu mai mult decât un antihipertensiv crește probabilitatea atingerii valorii țintă a presunii arteriale, în timp ce folosirea combinațiilor fixe este mult mai convenabilă și simplifică în acelasi timp și schema tratamentului, și de asemenea poate să coste mai puțin decât componenții individuati prescriși separat. [AMERICAN HEART ASSOCIATION; JOURNAL OF HT]

Hipertensiunea arterială poate să existe în paralel și cu alte boli, și aceasta poate fi agravată de unele medicamente antihipertensive dacă asocierea acestora nu este potrivită și individualizată pentru fiecare pacient în parte. Din această cauză este extrem de importantă o alegere judicioasă și particularizată a tratamentului. În tabelul 3.1. este evidențiată medicația în cazul existenței altei patologii.

Tabel 3.1. Alegerea medicației antihipertensive

Tabel 3.2. Exemple de combinații fixe ce conțin blocante ale canalelor de calciu

[LIPPINCOTTS; AMERICAN HEART ASSOCIATION]

În ghidurile publicate despre managementul hipertensiunii, blocantele canalelor de calciu sunt sugerate a fi candidați ideali pentru terapia de primă linie în monoterapie sau în combinație cu alți agenți antihipertensivi. Cel de-al 7-lea Raport al Comitetului Național de Prevenție, Detecție, Evaluare și Tratament asupra Presiunii Arteriale Crescute recomandă BCC ca și terapie de primă linie atunci când există o indicație convingătoare, de exemplu risc crescut de boală coronariană și/sau diabet. Pentru toți ceilalți pacienți diureticele tiazidice sunt recomandate de primă alegere, în monoterapie sau în alte combinații de tratament. [6]

În tratamentul HTA se preferă compușii cu durată lungă de acțiune, cei cu acțiune rapidă și de scurtă durată trebuie evitați în doze mari datorită riscului crescut de infarct miocardic ce poate să apară din cauza vasodilatației excesive și stimulării cardiace reflexe.

Dihidropiridinele au avantajul că nu prezintă decât o minimă interacțiune cu alte medicamente, cum ar fi digoxina sau warfarina, care sunt frecvent folosite împreună cu blocantele canalelor de calciu.

[LIPPINCOTT’S]

Blocantele canalelor de calciu(BCC)

Prima observație legată de importanța ionului de Ca pentru menținerea activității celulare a fost raportată de către Ringer în anul 1883, în cadrul unor experimente pe cord la broaște. El a demonstrat capacitatea de contractibilitate a cordului care a fost cu mult redusă într-o soluție de calciu, dar care a revenit la normal la adăugarea ionilor de calciu. [31.J.Psysiol.]

La sfârșitul anului 1960, Fleckenstein și Godfraind au început niște studii de laborator modificând funcția calciului în excitație-contracție prin cuplarea liganzilor farmacologici. În 1962 Haas și Hartfelder au descris verapamilul ca fiind un vasodilatator coronarian, iar mai apoi Fleckenstein și Grun au dovedit faptul că proprietățile vasodilatatoare se datorează antagonizării acțiunii calciului. În 1972, Fleckenstein și alții au descoperit că 1,4-DHP și derivații săi acționează prin blocarea influxului de calciu în mușchii netezi și cardiaci. Nifedipina a fost introdusă în practica medicală sub denumirea comercială de Adalat în anul 1975. [Fused 1,4 DHP].

Blocantele canalelor de calciu (antagoniștii calciului, inhibitorii calcici) sunt un grup de medicamente diversificat din punct de vedere chimic, dar ele au în comun mecanismul de acțiune specific. Toate blocantele canalelor de calciu acționează asupra vaselor de sânge, unde produc vasodilatație, și/sau asupra miocardului unde descresc variabil contractilitatea cardiacă.

Cu toate astea, ele sunt clasificate în două categorii, dihidropiridine (DHP) : amlodipină, nifedipină, nicardipină și felodipină și non-dihidropiridine (non-DHP): verapamil, diltiazem. Deși DHP au o selectivitate vasculară mai mare decât non-DHP, non-DHP au efecte cronotrop și inotrop negative mai puternice, având capacitatea mai mare de reducere a pulsului. [6].

Sunt incluse în această clasă medicamente care blochează intrarea ionului de Ca în celule, acesta având rol declanșator în mecanismul excitație-contracție, în mușchii striați, netezi și cardiaci, dar Ca este implicat și în activarea altor mecanisme celulare precum: exocitoza, reglarea permeabilității membranelor fără de alți ioni, agregare celulară etc.

Rolul calciului în funcțiile celulare la nivelul vaselor sanguine și a mușchiului cardiac este esențial în a înțelege efectele farmacologice și terapeutice ale antagoniștilor canalelor de calciu.

Schimbul ionilor de calciu se realizează prin canalele de calciu de la nivelul membranei celulare, care se deschid prin variația potențialului de membrană și se deschid prin variația potențialului de membrană și activarea receptorilor membranari. [MEDICATIA IN BOLILE CVS]

Toate blocantele canalelor de calciu utilizate în terapia cardiovasculară acționează asupra canalelor de tip L (long lasting=lente), în mod special pe subunitatea α1, dar altele blochează canalele de tip T (mibefradil, manidipina, benidipina, efornidipina) sau cele de tip N (cilnidipina). [CHAPTR22 ]

Calciul este un mesager secund omniprezent care joacă un rol cheie în numeroase funcții fiziologice. Intrarea calciului în citosol este mediată de numeroase tipuri de canale de calciu, fiecare cu un rol distinct. Cel puțin cinci canale de calciu voltaj-dependente diferite există în celulele excitabile, care au un rol major în funcționarea normală și în patologii afectând celulele neuronale, neurosecretorii și musculare. A devenit evident că în diferite țesuturi, cum ar fi celulele musculare cardiace, neuronii și alte celule excitabile există două tipuri de curent de calciu. Un canal de calciu este activat de depolarizări mici cu inactivare voltaj-dependentă rapidă. Al doilea e activat de o depolarizare largă si este numit “high-voltage activated” HVA, clasificat în N, L, P, Q, și tipurile R. Canalele L sau lente sunt foarte sensibile la DHP.[4]

Derivați de 1,4-dihidropiridină (DHP)

Dihidropiridinele (DHP) au un domeniu larg de acțiuni farmacologice ca agenți utilizați în vasodilatație, bronhodilatație, hepatoprotecție și geroprotecție și ca antiaterosclerotice, antidiabetice, antitumorale, antioxidante, anticonvulsivante și agenți antiradicali. [4]

DHP sunt o clasă cunoscută de antagoniști de calciu, care se numără printre cele mai utilizate medicamente în tratamentul bolilor cardiovasculare. Asemănător cu alte blocante ale canalelor de calciu, efectele farmacologice predominante ale DHP sunt vasodilatația coronariană, periferică și cerebrală, efectul inotrop negativ și inhibarea excitației nodului sinoatrial și atrioventricular. Aceste efecte explică valoarea lor terapeutică în hipertensiune, angină pectorală, vasospasm cerebral posthemoragic și tahicardia supraventriculară.[5]

Deși DHP sunt printre cele mai potente blocante ale canalelor de calciu, multe dintre ele se află sub investigații clinice.

Cu toate că dihidropiridinele au fost dezvoltate ca agenți folosiți în medicația aparatului cardiovascular, mai multe dintre ele au fost utilizate și pentru alte aplicații medicale. De exemplu, nimodipina este folosită ca agent antiischemic în boala Alzheimer și alte demențe deoarece traversează bariera hematoencefalică, în migrenă și vasospasm posthemoragic. Nifedipina este de asemenea utilizată în tratamentul migrenei, cardiomiopatiei hipertrofice și a sindromului Raynaud. Ar putea de asemenea să fie utilizată și în tratamentul neuropatiei diabetice. Este clar faptul că noua generație a derivaților de dihidropiridină reprezintă o sursă de candidați veritabili cu potențiale remarcabile.[4]

Caracterizare structurală

Ciclul dihidropiridinic – este fundamental pentru activitatea farmacologică. Gruparea NH din poziția 1 are rol important pentru efectul de blocare a canalelor lente de calciu, prin formarea unei legături de hidrogen. Substituția în poziția N1 sau înlocuirea ciclului dihidropiridinic cu piridină sau piperidină, scade puternic sau chiar anulează activitatea. [4]

Substituentul R2: gruparea metil CH3-, care rămâne neschimbată la toți compușii.

Substituentul R6: -CH3, -NH2, -amino-eteri.

Substituentul R’: substituent atrăgător de electroni (-NO2, Cl), orto> meta> para.

Substituenții R3 și R5 modulează activitatea și selectivitatea tisulară, astfel că substituenții diferiți duc la o modificare a acțiunii.

Acțiunea vasodilatatoare este mai potentă în cazul esterilor asimetrici (Amlodipină), decât în cazul celor simetrici (Nifedipină).

Când substituenții R3 și R5 sunt diferiți, carbonul din poziția 4 devine chiral și putem observa stereoselectivitarea dintre enantiomeri.

Reprezentanți: Amlodipina, Nifedipina, Nitrendipina, Felodipina, Nisoldipina, Nicardipina, Lercarnidipina.

Amlodipina

Figura 5.1.2. Structura amlodipinei (* reprezintă carbonul asimetric)

Introducerea în poziția 6 a unui substituent amino-etoxi-metil mai voluminos favorizează legarea de receptori, ceea ce duce la o creștere a intensității acțiunii.

Gruparea aminică bazică din poziția 1 este ionizată la pH-ul fiziologic și ii conferă amlodipinei proprietăți hidrosolubile.

Substituenții R3 si R5 sunt diferiți, ceea ce influențează intensitatea acțiunii vasodilatatoare, esterii asimetrici au o acțiune mai puternică decât esterii simetrici (Nifedipină). 4 +CVS.

Figura 5.1.3. Structura enantiomerilor amlodipinei

Figura5.1.2. Structura unor blocante ale canalelor de calciu (*=carbonul asimetric)PHARMKIN

Proprietăți fizico-chimice

Amlodipina se prezintă sub forma unei pulberi albe sau aproape albe. Ușor solubilă în apă și 2-propanol, foarte ușor solubilă în metanol, puțin solubilă în etanol anhidru. Se condiționează în spații ferite de lumină. [European Pharmacopeia]

Prezintă o absorbție bună după administrare orală a dozelor terapeutice, absorbția duce la apariția unui pic plasmatic între 6-12 ore. Biodisponibilitatea orală a amlodipinei variază, între 65 si 90%, fiind superioară în comparație cu alte dihidropiridine. Biodisponibilitatea comprimatelor de amlodipină besilat nu este influențată de prezența alimentelor. Legarea de proteinele plasmatice este mare, aproximativ 95%, concentrațiile la steady-state nu sunt atinse decât după 7-8 zile de tratament.

Timpul de înjumătățire este de aproximativ 35-50 de ore, fapt ce constituie un avantaj la pacienții cu o funcție renală normală, spre deosebire de cei vârstnici sau cu o funcție renală afectată unde poate apare o acumulare cu fenomene de hipotensiune, necesitând o scădere a dozei. Amlodipina este în mare parte metabolizată în ficat, metaboliții inactivi fiind excretați în urină împreună cu 10% metaboliți inactivi.[MEMOMED, MEDICATIA IN BOLILE CVS]FDA

Proprietăți farmacocinetice

O mai bună cunoaștere a farmacocineticii medicamentelor antihipertensive și a factorilor implicați în metabolizarea acestora, legătura lor cu scăderea presiunii arteriale a sângelui pot contribui la o îmbunătățire semnificativă a eficacității terapiei antihipertensive.

Datorită centrelor chirale pe care le conțin în moleculă, BCC la interacțiunea celor doi enantiomeri cu enzime sau receptori din organism, enantiomerii S- sau R- prezintă proprietăți farmacocinetice și farmacodinamice diferite.

[VEZI R,S enantiomeri]

Proprietățile farmacocinetice ale blocantelor canalelor de calciu au fost descrise în 1986 de către Echizen și Eichelbaum. Acestea prezintă proprietăți similare, cu excepția amlodipinei. Majoritatea dihidropiridinelor au o eliminare mare, volum de distribuție (Vd) intermediar și timpul de injumătățire mai mic de 10 ore. În cealaltă extremă se află amlodipina, cu o eliminare mai redusă, dar un Vd mult mai larg ceea ce duce la prelungirea timpului de înjumătățire a acesteia. [pharmacokinetics]

Problemele de farmacocinetică sunt legate de biotransformarea hepatică intensă cu efectul înalt al primului pasaj hepatic și variabilitatea mare a concentrației plasmatice datorită biodisponibilității reduse a dihidropiridinelor. [Comparative pharmacokinetics pp among CCB]

Numeroase medicamente antihipertensive, printre care și blocantele canalelor de calciu, suferă metabolizare hepatică mai ales pe calea izoenzimelor CYP, de unde rezultă și o largă varietate interindividuală datorită activității diferite a acestor enzime.

Tabel 5.3.1. Calea de metabolizare a blocantelor canalelor de calciu

În ceea ce privește interacțiunile medicamentoase, deoarece majoritatea blocantelor canalelor de calciu se metabolizează pe calea CYP3A au fost descrise următoarele interacțiuni. Astfel că inhibiția enzimatică produce modificări asupra efectelor cardiovasculare, crescând riscul de bradicardie și hipotensiune posturală. [VEZI R,S]

Administrarea concomitentă a blocantelor canalelor de calciu cu suc de grapefruit scade viteza de metabolizare a antihipertensivelor și crește semntificativ concentrația plasmatică a acestora, datorită inhibiției ireversibile a CYP 3A4 localizată în intestinul subțire. Această interacțiune este puternic influențată de biodisponibilitatea antihipertensivelor. În timp ce biodisponibilitatea BCC cu efectul primului pasaj hepatic intens, cum ar fi nisoldipina, nimodipina, și felodipina a fost puternic crescută de sucul de grapefruit, efectul farmacocineticii BCC de tip amlodipina, diltiazem a fost minim. [VEZI BIBLIO 81,82]

Alți inhibitori enzimatici ar fi azolii antifungici, eritromicina și inhibitorii de protează HIV care duc în final la creșterea concentrației plasmatice a antihipertensivelor printr-un mecanism farmacocinetic.

Scăderea concentrației plasmatice rezultă în urma administrării concomitente a blocanteloc canalelor de calciu cu barbiturice sau fenitoină. [VEZI R,S]

Proprietăți farmacologice

Blocantele canalelor de calciu sunt recunoscute ca și agenți potenți utilizați în terapia hipertensiunii arteriale, cu o reducere substanțială a presiunii arteriale la toate grupele de vârstă și toate rasele. BCC îmbunătățesc funcția endotelială, pot influența în mod favorabil procesul de ateroscleroza în arterele carotide, reduc hipertrofia ventriculară stângă și cea a venelor rezistente. De asemenea, nu afectează profilul lipidic și nivelul glucozei. Conform unor studii controlate randomizate s-a demonstrat o reducere semnificativă a infarctului la pacienții vârstnici cu hipertensiune sistolică izolată comparativ cu cei tratați cu placebo, și nici o diferență semnificativă în mortalitatea cardiovasculară. [differential therapy with calcium antagonists.]

Un studiu pe amlodipină, efectuat la pacienții cu insuficiență cardiacă în stadiu avansat (IC), a demonstrat că substanța nu crește mortalitatea și morbiditatea la acești pacienți, ci chiar faptul că reduce riscul la pacienții la care IC nu este de etiologie ischemică. Astfel s-au obținut informații valoroase legate de eficacitatea și siguranța amlodipinei în prevenția decesului și a dizabilităților la pacienții hipertensivi care prezintă concomitent și IC avansată. [Long-term morbidity/mortality]

Totuși, antagoniștii calcici par să fie mai puțin eficienți decât inhibitorii enzimei de conversie a angiotensinei și diureticele în prevenția IC și infarctul miocardic. [role of existing]

Blocantele canalelor de calciu prezintă o serie de acțiuni farmacologice, care le face să fie o alegere adecvată pentru inițierea tratamentului antihipertensiv. Printre acestea se numără: vasodilatație coronariană urmată de creșterea debitului sanguin coronarian, efectul fiind mai evident la nivelui vaselor integre în dauna celor aterosclerotice. Reducerea ischemiei miocardice prin creșterea aportului de oxigen cu un efect antianginos. Arteriolodilatație cu scăderea rezistenței vasculare periferice și deci scăderea tensiunii arteriale. Creșterea circulației cerebrale. Efect inotrop negativ la nivelul miocardului, cu scăderea debitului în timp ce frecvența cardiacă este puțin influențată, datorită intervenției simpaticului ca reflex la hipotensiune (cronotrop negativ). Efect dromotrop negativ, este scăzută conducerea la nivelul nodului atrio-ventricular (AV). Scăderea pre- și post-sarcinii, urmată de diminuarea travaliului cardiac și a consumului de oxigen. [MEMOMED;TRATAT]

Deci, blocantele canalelor de calciu reprezintă agenții potriviți pentru terapia de primă linie a hipertensiunii, în monoterapie sau cu alți agenți antihipertensivi. Mai mult, aceștia se pot asocia cu diureticele, inhibitorii enzimei de conversie a angiotensinei și blocanții receptorilor angiotensinei II. În mod inerent, dihidropiridinele cu durată lungă de acțiune mai noi cum ar fi lacidipina, lercanidipina par să aibă cam aceeași eficacitate cu cei de generație mai veche, dar este îmbunătățită tolerabilitatea acestora, în special în cazul edemului periferic. [THE ROLE O EXISTING..]

Proprietăți farmacotoxicologice

În vederea alegerii tratamentului optim potrivit fiecărui pacient în parte, s-au realizat studii care s-au concentrat pe demonstrarea eficacității și tolerabilității compușilor.

Conform unor studii retrospective realizate în anul 1995, a fost sugerat faptul că tratamentul cu BCC de durată scurtă a fost asociat cu creșterea incidenței evenimentelor coronariene cât și a mortalității, iar altele au sugerat riscul crescut de cancer și hemoragii gastrointestinale. [THE ROLE OF EXISTING]

Este cunoscut faptul că boala canceroasă se devzoltă atunci când modificări la nivelul ADN-ului cauzează anormalități în proliferarea și dezvoltarea celulară. O celulă canceroasă se caracterizează prin următoarele proprietăți: clonalitate (la origine se află o singură celulă), autonomia (celulele nu mai răspund la stimuli), anaplazia (lipsa diferențierii celulare; cancerul este cu atât mai agresiv cu cât diferențierea celulară este mai redusă), metastazarea (proliferare la distanță). Blocantele canalelor de calciu pot altera apoptoza, un mecanism eficient responsabil de distrugerea celulelor cu leziuni genetice, a celulelor canceroase și deci responsabil de prevenția cancerului. Apoptoza mai este de asemenea implicată în alte procese fiziologice și patologice inclusiv embriogeneză, schimbări degenerative legate de îmbătrânire, boli autoimune, ischemie și ateroscleroza.

Se cunoaște foarte bine faptul că dozele mici de BCC se folosesc pentru tratarea bolilor cardiovasculare , care tind să reducă calciul citosolic în țesuturile cardiovasculare și altele, precum și să interfere cu semnalele de calciu transmembranare. Doze mari de BCC au fost utilizate pentru a potența efectul antitumoral al unor medicamente antineoplazice. Cu toate astea, studii pe pacienți nu au demonstrat o creștere a supraviețuirii în acest caz. S-a sugerat faptul că posibilul efect antitumoral al acestor antihipertensive nu se bazează pe antagonizarea calciului, ci beneficiul este bazat pe creșterea calciului intracelular. BCC inhibă apoptoza în diferite modele experimentale prin interferarea cu semnalele de calciu. Pentru a stabili dacă BCC sunt responsabile de apariția sau proliferarea riscului de cancer, s-a realizat un studiu pe 750 de pacienți hipertensivi cu vârsta peste 71 de ani, care nu prezentau niciun istoric de cancer. Pacienții au fost tratați cu β-blocante, inhibitorii enzimei de conversie a angiotensinei sau blocante ale canalelor de calciu, în principal cu durată scurtă. Rezultatele obținute au scos în evidență faptul că terapia cu BCC poate crește riscul de cancer, dar cu toate astea datele nu pot fi cu totul extrapolate în cazul BCC cu durată lungă de acțiune și de generație mai nouă. [RISK OF CANCER; CC BLOCKADE..]

Pe lângă efectele lor cardiovasculare, blocantele canalelor de calciu inhibă și agregarea plachetară, de aceea s-a efectuat și un studiu pentru evaluarea riscului de hemoragie gastrointestinală la pacienți hipertensivi cu vârsta peste 67 de ani, care au fost tratați cu β-blocante, inhibitorii enzimei de conversie a angiotensinei sau antagoniști calcici. Concluzia obținută în urma studiului a fost aceea că BCC au fost asociați cu un risc crescut de hemoragii gastrointestinale la această categorie de vârstă, prin urmare prescrierea acestora în cazul vârstnicilor care prezintă deja un factor de sângerare trebuie să se facă cu precauție sau chiar deloc. Cu toate astea datele obținute nu sunt suficiente, iar acestea ar trebui să stimuleze alte studii clinice experimentale asupra efectelor pe termen lung a blocanților canalelor de calciu. [GASTROINTESTINAL HAEMORRHAGE]

Reacții adverse comune pentru non-dihidropiridine precum verapamil și diltiazem sunt blocul atrio-ventricular de gradul I și constipația, deci ar trebui evitate la pacienți cu insuficiență cardiacă sau cu bloc atrio-ventricular, datorită efectului lor inotrop și dromotrop negativ.

Printre reacțiile adverse comune dihidropiridinelor și datorate vasodilatației amintim: amețeală, înroșire a feței, durere de cap, hipotensiune ceea ce duce la o stare de oboseală, astenie, palpitații și edem periferic. Potrivit unui studiu pe amlodipină, lercanidipină si lacidipină, edemul periferic și simptomele înrudite cu acesta apar mult mai frecvent la grupurile tratate cu amlodipină comparativ cu cele tratate cu lercanidipină si lacidipină, antagoniști ai calciului de generație mai nouă. Nifedipina, prototipul dihidropiridinelor si alte dihidropiridine pot cauza hiperplazie gingivală. [LIPPINCOTTS; ]

Tahicardia reflexă care poate rezulta în urma administrării de nifedipină poate fi oprită prin administrare concomitentă de β-blocant.

Alte reacții adverse includ ginecomastia și reacții adverse cutanate. S-a dovedit de curând faptul că blocantele canalelor de calciu produc ginecomastie, cu toate că mecanismul de producere nu este încă cunoscut. Reacțiile cutanate includ înroșiri ale pielii și au fost observate la pacienți tratați cu verapamil sau diltiazem, necesitând în unele cazuri întreruperea tratamentului. [BCC in HT]

Utilizări

Principalele indicații terapeutice ale blocantelor canalelor de calciu de tip dihidropiridină sunt hipertensiunea arterială, angina cronică și vasospastică. În terapia hipertensiunii arteriale, BCC sunt indicate și potrivite în toate etapele bolii, pot fi folosite în monoterapie de primă intenție fiind de elecție la vârstnici sau în terapia combinată cu alte antihipertensive (diuretice, α-blocante, inhibitorii enzimei de conversie a angiotensinei).

În tratamentul hipertensiunii doza de antihipertensiv dihidropiridinic depinde de generația aleasă, compușii de generația I administrându-se de 2 până la 4 ori pe zi, în timp ce la cei de generația a II-a și a III-a este suficientă o administrare pe zi.

Sunt de elecție în terapia hipertensiunii asociată cu angină pectorală stabilă, insuficiențe circulatorii periferice, vasospasm, astm bronșic pentru că favorizează bronhodilatația, diabet zaharat pentru că spre deosebire de β-blocante, blocantele canalelor de calciu nu afectează aceste condiții. [TRATAT, LIPPINCOTTS]

Preparate farmaceutice

În industria farmaceutică există diferite produse farmaceutice care conțin amlodipină, prezentate în tabelul 5.7.1.

Tabel 5.7.1. Forme farmaceutice cu amlodipină MEMOMED

PARTEA EXPERIMENTALĂ

OBIECTIVE

Având în vedere că hipertensiunea arterială este o boală cronică tot mai frecvent întâlnită, ea trebuie strict monitorizată și tratată corespunzător. Astfel, este foarte important să cunoaștem toate proprietățile farmacocinetice, farmacodinamice, farmacotoxicologice ale substanțelor active responsabile de tratarea hipertensiunii.

În ultimii ani chiralitatea substanțelor ocupă un rol tot mai important în industria farmaceutică, din moment ce unul dintre enantiomeri este cel responsabil de efectul farmacologic, iar celălalt de o activitate biologică diferită, inactivă sau chiar toxică. Dezvoltarea și alegerea unei tehnici analitice potrivite pentru separarea enantiomerilor este extrem de importantă și valoroasă în domeniul medicamentelor, aflat în permanentă dezvoltare.

Alegerea electroforezei capilare (EC) ca și metodă de separare chirală s-a dovedit a fi o tehnică eficientă, probabil și datorită caracteristicilor pe care le posedă: simplitate, eficiență ridicată, este o metodă rapidă de analiză comparativ cu alte tehnici, versatilitatea acesteia, volumele mici de analiți și nu în ultimul rând costul redus.

Obiectivul studiului nostru a fost conceperea unei tehnici analitice cât mai simple și mai rapide pentru enantiosepararea amlodipinei, utilizând ciclodextrine ca și selectori chirali, urmată de optimizarea condițiilor analitice experimentale în vederea obținerii unor rezultate cât mai eficiente și precise.

Caracterizarea substanțelor model

Amlodipina

Amlodipina a fost introdusă în terapie în urmă cu câțiva ani, (Clavijo et al., 1944) și s-a remarcat prin proprietățile sale farmacologice unice față de alte dihidropiridine.

Dezvoltarea de noi molecule, denumite ca fiind generația a III-a a derivaților de dihidropiridină, a depășit majoritatea inconveniențelor manifestate de generațiile I-a și a II-a.

Amlodipina este administrată oral sub formă de comprimate de amlodipină besilat. Doza inițială de amlodipină pentru tratamentul hipertensiunii arteriale este de 5 mg/zi, într-o priză,care se poate crește în caz de nevoie la 10 mg/zi. Doze similare se administrează și în tratamentul anginei stabile și al anginei Prinzmetal.

În tratamentul hipertrofiei ventriculare stângi, amlodipina pare să inducă o regresie a acesteia, similară cu cea obținută cu compuși din generația a II-a. Poate fi utilizată și în cazul pacienților cu afectare renală.

A fost studiat și documentat faptul că amlodipina traversează bariera hematoencefalică după o administrare periferică.

Amlodipina, împreună cu lacidipina sunt printre singurele medicamente a căror siguranță a fost documentată în studii clinice. [classification of ca antagonists, selection in HT; MARTINDALE; MEMOMED]

Felodipina

Este un derivat dihidropiridinic de generația a II-a, cu acțiuni similare cu cele ale nifedipinei. Frecvent utilizată în tratamentul hipertensiunii arteriale și al anginei pectorale. Se administrează oral sub formă de comprimate cu eliberare modificată (comprimate retard- 2,5 mg, 5 mg, 10 mg în preparatele Plendil și Auronal), în doze mai reduse comparativ cu nifedipina.

Doza inițială pentru terapia hipertensiunii este de 5 mg/zi, fiind ajustată la nevoie. În tratamentul anginei, doza uzuală este de 5 mg/zi care se poate crește la nevoie până la 10 mg/zi. Reducerea dozelor poate fi necesară în cazul pacienților cu afectare hepatică sau a celor vârstnici.

Fiind un compus disubstituit în poziția 2 și 3, felodipina prezintă o selectivitate vasculară crescută.

Felodipina se absoarbe aproape în totalitate după administrare orală din tractul gastrointestinal, dar prezintă un efect al primului pasaj hepatic intens, cu o biodisponibilitate de aproximativ 15%. Metabolizarea hepatică este intensă, eliminarea se face sub formă de metaboliți, 70% în urină și restul în fecale. Se leagă în proporție de 99% de proteinele plasmatice (mai ales de albumină). [MARTINDALE; MEMOMED]

Nifedipina

Reprezentatul dihidropiridinelor, nifedipina, a fost introdusă în terapie în Germania la începutul anilor 1975 sub forma preparatului Adalat®. Sinteza nifedipinei a fost realizată printr-o reacție de condensare Hantzsch a două molecule de ester metilic al acidului acetil acetic cu amoniac și o-nitro-benzaldehida.

Are o absorbție orală de 90%, cu apariția picului plasmatic după 30-60 de minute, metabolizare hepatică intensă și o eliminare urinară în proporție de 70-80%. Biodisponibilitatea acesteia este între 45 și 75%, fiind mai scăzută în cazul preparatelor cu acțiune modificată.

Legarea de proteinele plasmatice se face în proporție de 92-98%. Se distribuie in laptele matern. Timpul de înjumătățire este între 2 și 5 ore după administrate intravenoasă sau per os.

Este o substanță fotosensibilă, trebuie păstrată ferit de lumină în timpul conservării, condiționării și dozării, dar cu toate astea anumite studii realizate pe produși de incluziune ai nifedipinei cu ciclodextrine au demonstrat o creștere a stabilității față de lumină.

Pentru tratamentul hipertensiunii arteriale se administrează preparat cu durată lungă de acțiune în doze de 10 până la 40 mg de două ori pe zi, sau de 20 mg pana la 90 mg/zi, în funcție de preparatul utilizat.

În angina pectorală, nifedipina poate fi administrată ca și preparat de lungă durată în doze de 10 până la 40 mg de două ori pe zi sau 30 mg până la 90 mg o dată pe zi, în funcție de preparat. S-au utilizat și capsule în doze de 5 până la 20 mg de câte trei ori pe zi, dar preparatele de durată mai lungă sunt preferate.

În doze de 5 până la 20 mg de trei ori pe zi sub formă de capsule, nifedipina se folosește și în tratamentul sindromului Raynaud. [1.4 DHP chirality, martindale, memomed, medicatia bolilor CVS]

Este necesară reducerea dozelor de nifedipină în caz de insuficiență hepatică sau renală, sau în cazul asocierii cu cimetidină (inhibitor enzimatic, scade epurarea hepatică).[ TRATAT]

Electroforeza capilară în analiza chirală

Separările chirale reprezintă un topic promițător și larg studiat în domeniul electroforezei capilare. Electroforeza capilară este o metodă analitică versatilă și larg răspândită în diferite domenii de cercetare cum ar fi domeniul farmaceutic, biologic, de mediu. Cu toate că în ultimii ani unele metode de separare chirală precum gaz cromatografia (GC) și cromatografia de lichide de înaltă performanță (HPLC) au ocupat un loc important, electroforeza capilară (EC) s-a remarcat ca fiind o metodă eficientă și selectivă pentru separarea chirală.

Când vine vorba de EC ne gândim la mai multe metode de separare printre care și electroforeza capilară pe gel-ECG, electroforeza capilară zonală-ECZ, electroforeza capilară micelară-ECM, electroforeza prin focalizare izoelectrică-CIF, și electrocromatografia capilară-ECC, o îmbinare între EC și HPLC. Luând în considerare toate aceste tehnici de separare și multitudinea de selectori chirali ce se pot utiliza în EC, aceasta este considerată o metodă foarte importantă și de actualitate în aria farmaceutică.[CLASIFICARE EC]

În comparație cu metoda HPLC, se consideră faptul că EC prezintă avantaje în ce privește simplitatea, rapiditatea și eficiența analizei, automatizarea și costul redus, diferitele mecanisme de separare, cantitățile reduse de analiți și reactivi folosiți precum și timpul scăzut de analiză. EC permite și observarea interacțiunilor intermoleculare slabe și până chiar și efectele stereoselective foarte slabe a acestor interacțiuni. FANALI1996, ultima prop din charged selectors]

Un alt avantaj important al EC este faptul că această tehnică functionează în soluții libere, care nu necesită imobilizarea selectorului chiral. Obținerea separărilor chirale cu ajutorul EC se poate realiza cu diferiți selectori chirali. Aceștia au prezentat un val de creștere important în ultimii ani. Printre selectorii chirali utilizați în EC sunt incluși: CD și derivații, antibioticele macrolide, eterii de coroană, micelele chirale, proteinele, polizaharidele. [chargedselectors97 + FANALI 2000]

Separarea chirală se poate realiză în mod direct și indirect, metoda indirectă deși folosită în mod frecvent în HPLC și GC, este cu greu aplicată în EC. Metoda directă aplicată cu succes în EC se bazează pe adăugarea directă a selectorului chiral în soluția tamponului sau legarea acestuia de peretele capilarului, cu scopul de a creea un mediu propice interacțiunii chirale a CD cu cei doi enantiomeri. . [33.chiral separation methods si FANALI1996]

Ciclodextrinele ca și selectori chirali în electroforeza capilară

Printre primele utilizări ale ciclodextrinelor pentru separări chirale prin metoda EC au fost raportate de grupul Smolkova, folosing principiul isotacoforezei.[26 Snopek]

Guttman et al. au descoperit întrebuințarea CD încorporate în gel, în timp ce Fanali a publicat primul articol legat de aplicarea CD în electroforeza capilară zonală-ECZ, investigând și separările chirale a mai multor medicamente simpatomimetice.

CD sunt printre cei mai utilizați compuși ca și selectori chirali, peste 700 de compuși farmaceutici fiind separați folosind CD: β-blocante, simpatomimetice, antipsihotice, antidepresive, hipnotice, barbiturice, blocante ale canalelor de calciu, anestezice locale, bronhodilatatoare, antiinflamatoare nesteroidiene, antiastmatice, anticoagulante, antiepileptice, antihipertensive, antimalarice, medicamente antibacteriene, antivirale, antifungice, etc. [FANALI 2000]

Deoarece sunt printre cei mai folosiți selectori chirali, CD și-au găsit numeroase aplicații în HPLC, GC, SFC, TLC, ECC și nu în ultimul rând în EC. Ele sunt oligozaharide compuse din diferite unități de glucoză (șase α-CD, șapte β-CD sau opt γ-CD) legate între ele prin intermediul legăturilor 1,4 α–glucozidice și formează un inel sub forma unui trunchi de con. Ciclodextrinele prezintă o cavitate cu caracter hidrofob și o suprafață cu caracter hidrofil, datorită faptului că prezintă niște grupări hidroxil (în pozițiile 2,3 sau 6) care pot fi supuse unor modificări/derivatizări, ducând astfel la creșterea solubilității CD și a substanței de incluziune. Mecanismul de acțiune specific separării chirale constă în incluziunea grupărilor hidrofobe ale analitului, în special grupările aromatice, în cavitatea hidrofobă a CD. O altă metodă ar putea fi formarea legăturilor de hidrogen între CD și enantiomerii substanței de separat sau interacțiuni de tipul dipol-dipol. [33.chiral separation methods si FANALI1996]

În procesul de incluziune-complexare, analitul este inclus în cavitatea CD în totalitate sau doar parțial cu componenta hidrofobă, proces cunoscut sub numele de “gazdă-oaspete”, dând naștere unui complex enantioselectiv între enantiomerii analitului și selectorii chirali care duc la diferențe în mobilitatea electroforetică a enantiomerilor. Grupările hidrofile de la exteriorul CD pot fi derivatizate prin intermediul reacțiilor chimice, cu scopul de a obține derivați de CD cu grade diferite de subtituție: CD derivatizate.

După injectarea analiților care are loc la capătul anodic al capilarului de silice, aceștia se mișcă spre detector datorită fluxului electroosmotic (FEO).

Enantiosepararea cu CD și parametrii influențând rezoluția chirală [din fanali2000 dar pun 146]

Pentru obținerea unei rezoluții eficiente a enantioseparării în EC, datorită faptului că cei doi enantiomeri posedă proprietăți fizico-chimice asemănătoare, este necesară modificarea mobilităților celor doi analiți. Acest lucru poate fi obținut prin formarea de complexe stereoselective care implică interacțiuni hidrofobe, legături de hidrogen, dipol-dipol, sau interacțiuni van der Waals.

În procesul de EC, separarea chirală se realizează prin metoda directă, prin adăugarea selectorului chiral în soluția tampon sau legarea acestuia ori de peretele capilarului ori de faza staționară. Diferiți parametri, cum ar fi: tipul și concentrația CD, pH-ul și compoziția soluției tampon, temperatura capilarului, voltajul aplicat, adăugarea altor aditivi, etc s-au dovedit a avea influențe importante asupra rezoluției chirale[CAPP_ELL]. [FANALI2000]

Ce ne rămâne de făcut este să găsim CD potrivite separării pe care dorim să o efectuăm și concentrația optimă a acesteia. Nu putem afirma că există o metodă de alegere a selectorului chiral, de aceea în studiul experimental efectuat pe amlodipină am recurs la încercarea fiecărei CD în parte, până la găsirea celei adecvate. Ținând cont și de numărul mare de CD disponibile, este foarte dificil să găsim o regulă general valabilă pentru selecția parametrilor experimentali optimi. În alegerea CD potrivite trebuie să ținem cont și de structura chimică a analitului, forma și mărimea acestuia. Astfel, se poate spune că analiții cu structură liniară pot fi incluși în CD cu cea mai mică deschidere a cavității, de exemplu α-CD, în timp de β-CD s-au dovedit a fi foarte eficiente când analiții prezintă unul sau mai multe inele aromatice. Structurile mai complexe de tipul trei sau patru inele aromatice pot fi complexate cu ajutorul γ-CD.

În vederea optimizării metodei este la fel de importantă și alegerea condițiilor experimentale. Cunoașterea solubilității analitului este importantă pentru a putea alege solventul organic potrivit, în timp ce alegerea pH-ului tamponului poate fi făcută pe seama acidității sau bazicității analitului ( verificarea pKa-ului sau observarea mobilității efective la diferite nivele de pH). [146]

Separarea chirală a 1,4-DHP – studiu bibliografic

Printre studiile de specialitate studiate legate de enantiosepararea 1,4-dihidropiridinelor și respectiv a amlodipinei, metodele predominante sunt HPLC-ul și EC. Am găsit studii în care separarea a cinci DHP (amlodipina, nitrendipina, nimodipina, isradipina si nisoldipina) s-a bazat pe CD, atât naturale cât si derivatizate cuplate cu HPLC și EC. Unele dintre ele au fost separate și cu ajutorul polizaharidelor sau proteinelor. Astfel că, pentru separarea substanțelor neutre/neîncărcate de tipul BCC, s-a dovedit faptul că CD încărcate/ionizabile sau amestecuri de CD ionice și neutre sunt mult mai benefice și eficiente. PROF 1996

Alt studiu în vederea separării amlodipinei s-a efectuat prin studierea efectului a cinci CD neutre (α-CD, β-CD, γ-CD, HP-β-CD, HE-β-CD) și CD anionice (CM-β-CD, SBE-β-CD) în cromatografia de lichide și EC. În cazul cromatografiei de lichide, la adăugarea de CD neutre nu s-a detectat nici o separare a enantiomerilor. În schimb, a fost posibilă separarea enantiomerilor prin adăugarea de SBE-β-CD, care a fost defapt prima separare realizată cu ajutorul CD anionice în cromatografia de lichide. Mai mult decât atât, concentrații mai mari de SBE-β-CD au dus în mod semnificativ la rezultate mai bune în ce privește robustețea metodei.

În cadrul aceluiași experiment, dar aplicând metoda EC s-a demonstrat faptul că deși a fost posibilă o separare completă a enantiomerilor amlodipinei cu CD neutre (de exemplu HP-β-CD) și CD anionice, separarea obținuă cu cele anionice a fost mult mai bună. PROF1998 CHARGED/UNCHARGED.

Alți autori au recurs la cromatografie micelară electrocinetică (CME) pentru screeningul a șase antagoniști calcici, printre care și amlodipina. CME reprezintă defapt o adaptare a EC, concepută inițial pentru analiza compușilor neutri din punct de vedere chimic, dar fiind eficientă și în cazul separării compușilor care au aceleași mobilități electroforetice. CME constă în adiția surfactanților încărcați electric la soluția de electrolit, la o concentrație mai mare decât concentrația micelară critică (CMC). CME s-a dovedit a fi o metodă adecvată pentru screeningul BCC, conferind o separare rapidă a acestora și o bună reproductibilitate, fiind o tehnică potentă și o alternativă a HPLC-ului. [1999 MEKC]

Într-un studiu experimental bazat pe screeningul mai multor dihidropiridine, am constatat faptul că separarea acestora, și în special a amlodipinei se realizează eficient cu α-CD, care prezintă cea mai mică cavitate dintre toate CD. Este recunoscută ipoteza conform căreia inelul dihidropiridinic al blocantelor canalelor de calciu este responsabil de recunoașterea chirală în cazul α-CD. PROF RESOLUTION …..

Un alt studiu mai recent a fost realizat pe isradipină, derivat DHP, care datorită substituenților asimetrici are un atom de carbon asimetric în poziția 4 a inelului dihidropiridinic. Se găsește sub formă comercială ca și amestec racemic, de aceea este necesară dezvoltarea unei metode de separare chirală. Ca și metodă de separare s-a folosit HPLC-ul cu faze staționare bazate pe α1-acid glicoproteină, sistem tetrahidrofenantren, celuloză 4-terț-butilfenilcarbamat și derivați polizaharidici. Pe lângă HPLC, a fost dezvoltată și o metodă de LC/MS. Deoarece metoda HPLC utilizeaază cantități mari de selectori chirali adăugați fazei mobile, sau folosește coloane chirale scumpe, s-a încercat separarea chirala a isradipinei cu ajutorul EC. În urma optimizării rezultatelor analitice, cele mai bune rezultate s-au obținut cu o soluție tampon borat de pH 9,3 și concentrație 15 mM, cu SBE-β-CD ca și selector chiral, la un voltaj de +30 kV și a putut fi observată o separare completă a enantiomerilor isradipinei în mai puțin de 7 minute. Deviația standard relativă obținută în studiile intra-day și inter-day a fost mai mică de 5%, de unde rezultă că metoda electroforezei capilare folosită este eficientă și potrivită pentru controlul formelor farmaceutice. [ISRADIPINE_CE]

Pentru cuantificarea amlodipinei din diferite lichide biologice (plasmă) s-au realizat diferite alte metode cum ar fi gaz cromatografia (GC) sau cromatografia de lichide de înaltă performanță. Datorită faptului că în GC, amlodipina este supusă unor condiții termice instabile s-a recurs pentru o separare mai selectivă la metoda HPLC, care este caracterizată prin sensibilitate și specificitate. Metoda implică o extracție simplă a amlodipinei, pe lângă care mai utilizează și coloane chirale, lungimea de undă a fost setată la 239 nm. Faza mobilă a fost alcătuită dintr-un amestec de fosfat monosodic și acetonitril, la un pH de 3,5 și un debit de 1,5 ml min–1.

Prin intermediul acestui studiu s-a demonstrat că metoda HPLC este suficient de sensibilă încât să fie folosită în studiul monitorizării medicamentelor și în studiile farmacocinetice și farmacodinamice pe amlodipină la oameni. [zarghi2005]

Materiale si metode

În vederea separării chirale, am avut la dispoziție un amestec racemic de amlodipină besilat (Barcelona, Moehs), de calitate farmaceutică. Ca și reactivi am beneficiat de: acid fosforic 85%, hidrogenofosfat monosodic, hidrogenofosfat disodic (achiziționate din cadrul firmei Merck, Darmstadt-Germania), hidroxid de sodiu (firma Lach Ner, Noratovice-Cehia), metanol (Chemical, Romania). Reactivii utilizați au fost de puritate farmaceutică.

Apa deionizată a fost preparată cu un sistem Mili Q Pure (Milipore, SUA).

Ciclodextrine utilizate ca și selectori chirali: CD naturale neutre (α-CD, β-CD, γ-CD), CD derivatizate neutre (Hidroxipropil-β-CD HP-β-CD, β-CD metilată aleator – RAMEB, Heptakis(2,6-di-O-metil)-β-CD DIMEB, Heptakis(2,3,6-tri-O-metil)-β-CD TRIMEB) și CD derivatizate ionizabile-anionice (Carboximetil-β-CD CM-β-CD, sulfobutileter-β-CD SBE-β-CD). Ciclodextrinele utilizate au fost achiziționate de la Cyclolab, Budapesta-Ungaria, cu excepția SBE-β-CD (denumire comercială Captisol) care a fost procurată de la Cydex Corp (SUA).

Pentru a determina concentrația enantiomerilor din forme farmaceutice, am folosit produsul original Norvasc® (Pfizer Europe, Marea Britanie), respectiv Amlohexal® (Hexal, Germania), care au fost achiziționate de la o farmacie localaă.

Separarea chirală a fost realizată pe un sistem de electroforeză capilară Agilent 1600 CE (Agilent Technologies, Waldbronn, Germania), cu un detector UV cu șir de diode (DAD), fiind realizate cu un capilar de silice cu lungime de 48 cm (lungimea efectivă = 40 cm ), cu diametrul intern de 50 de μm (Agilent, Germania). Injectarea probelor s-a făcut la anod prin injectare hidrodinamică, în timp ce detectarea s-a realizat la catodul capilarului. Înregistrarea electroferogramelor s-a realizat cu ajutorul softului Chemstation 7,01 (Agilent, Germania).

pH-ul soluției tampon s-a ajustat cu pH-metru Terminal 740 (Inolab, Germania).

Înainte de prima utilizare capilarul de silice a fost condiționat cu o soluție de NaOH 0,1 M timp de 30 de minute, apoi l-am spălat cu apa deionizată timp de 15 minute, apoi cu soluția tampon timp de încă 15 minute. Între fiecare măsuratori, capilarul a mai fost precondiționat cu soluție de NaOH 0,1 M, apă deionizată și soluție tampon, câte 2 minute fiecare.

Soluțiile tampon s-au preparat prin dizolvarea cantității corespunzătoare a constituenților acesteia în apă purificată, apoi ajustarea pH-ului cu o soluție de hidroxid de sodiu 1 M sau acid fosforic 1 M.

Soluția stoc de amlodipină besilat a fost preparată prin dizolvare în metanol, și ulterior diluate la concentrațiile adecvate cu același solvent până la concentrația potrivită. Toate soluțiile au fost degazate cu ajutorul băii de ultrasunete, timp de 5 minute. De asemenea, toate soluțiile probelor și soluția tampon au fost filtrate printr-o membrană cu diametrul porilor de 0,45 μm, și păstrate la frigider când acestea nu erau utilizate.

Prepararea probelor din forme farmaceutice

Conținutul a 10 comprimate a fost cântărit, triturat și omogenizat în mojar. O cantitate corespunzătoare a 5, respectiv 10 mg amestec racemic amlodipină besilat a fost dizolvată în 10 ml metanol, omogenizată cu ajutorul băii de ultrasunete, apoi diluată cu 100 ml metanol într-un balon cotat. Soluțiile au fost apoi diluate cu metanol pentru a obține concentrațiile potrivite înainte de a le introduce în sistem în vederea separării chirale.

Analiza electroforetică preliminară

Lungimea de undă aleasă pentru detecția amlodipinei este de 230 nm, pe lângă care am mai ales și 210 nm ca și lungime de undă de control, deoarece majoritatea moleculelor organice absorb la această lungime de undă. Amlodipina, conform structurii chimice este o amină primară, cu o valoare pKa de 9,4, prin urmare amlodipina prezintă sarcină pozitivă pe un domeniu larg de pH (acid, neutru si bazic). [sau este protonata]

Am început prin a urmări comportamentul electroforetic al amlodipinei în mediu achiral, în diferite soluții tampon (figura 5.1). Prima etapă a fost alegerea soluției tampon, etapă extrem de importantă pentru obținerea unei separări eficiente în EC, deoarece aceasta trebuie să producă separarea dorită de noi.

Pentru o separare eficientă a analitului, un rol important îl are pH-ul soluției tampon deoarece determină gradul de ionizare al analitului. Se recomandă ca pH-ul tamponului să fie apropiat de pKa-ul soluției de analizat.

Astfel, am realizat niște studii preliminare și am variat intervalul de pH al soluției tampon fosfat (concentrație 25 mM) între 2,5 si 9,3 și am observat că amlodipina poate fi detectată pe un interval de pH cuprins între 3 si 9. Cele mai bune rezultate s-au obținut însă la un pH de 9, astfel că am ales tamponul fosfat pH=9, de concentrație 25 mM.

Condițiile electroforetice inițiale au fost următoarele: voltaj +20 kV, temperatura din capilar de 25 0C, lungimea de undă la care s-au făcut determinările a fost de 230 nm, concentrația probei de 25 μg mL-1, iar presiunea de injectare de 50 mbar/secundă.

În figura 5.1. se observă comportamentul electroforetic al amlodipinei în mediu achiral, odată cu creșterea pH-ului scade timpul de migrare al analitului, îmbunătățindu-se și forma picului.

Figura 5.1. Comportamentul electroforetic al amlodipinei în mediu achiral-diferite valori de pH

În continuare, o altă etapă în analiza preliminară este reprezentată de screeningul complex al selectorilor chirali pe care i-am avut la dispoziție. Am procedat prin adăugarea în soluția tampon de ciclodextrine ionizabile-anionice în concentrație de 5 mM și ciclodextrine naturale, derivatizate neutre în concentrație de 10 mM, evitând astfel generarea unui curent prea crescut la nivelul capilarului ce ar putea duce în final la instabilitatea sistemului electroforetic.

Am efectuat screening-ul CD cu diferite tipuri de CD naturale, derivatizate neutre și derivatizate ionizabile-anionice. S-a observat faptul că amlodipina a prezentat interacțiuni chirale cu α-CD, HP-β-CD, RAMEB, însă datorită faptului că mai există unele studii publicate privind separarea amlodipinei cu aceste CD am continuat încercările cu alte CD, pentru a evalua dacă într-adevăr amlodipina mai interacționează și cu altele.

Am mai observat interacțiuni chirale ale analitului la valori de pH 7,0 și 9,0, însă cele mai bune fiind la pH 9,0, cu CM-β-CD și CAPTISOL. Pentru a evalua interacțiunile chirale am urmărit parametri analitici cum ar fi, factorul de separare α și rezoluția chirală. Factorul de separare α reprezintă raportul timpilor de migrare a celor doi enantiomeri fiind o măsură a selectivității, iar rezoluția este reprezentată prin formula R=2(t2-t1)/(w1+w2), t1 și t2 reprezentând timpii de migrare ai celor doi enantiomeri, iar w1 și w2 lățimea picurilor celor doi izomeri optici. Având în vedere cei doi parametri urmăriți, cea mai bună separare s-a obținut utilizând ca și selector chiral CM-β-CD, pe care am și ales-o pentru studiul nostru nemaifiind publicate alte studii cu aceasta. CM-β-CD este o CD anionică, aceștia fiind selectori chirali mult mai eficienți decât CD neutre. În figura 5.2, structura CM-β-CD:

Figura 5.2 Structura CM-β-CD

Optimizarea condițiilor analitice

În continuare am efectuat un studiu complex asupra eficienței separării chirale a amlodipinei prin optimizarea diverșilor parametri analitici, pentru a îmbunătăți rezoluția chirală și a scădea timpul de migrare al compușilor. Astfel am stabilit rolul concentrației soluției tampon, concentrației CD, temperaturii, voltajului aplicat și parametrilor de injectare asupra separării chirale.

Creșterea concentrației soluției tampon, deși a dus la o scădere a timpilor de migrare, separarea este mai bună în cazul unei concentrații de 25 mM tampon fosfat la un pH de 9,0 (figura 6.1.).

Influența concentrației CD este la fel de importantă pentru o separare eficientă a enantiomerilor, astfel că o concentrație prea mică duce la scăderea rezoluției chirale. Multe articole au demonstrat faptul că odată cu creșterea concentrației CD, crește și rezoluția, fapt care se datorează numărului mare de interacțiuni care au loc între analit și CD. De asemenea, odată cu creșterea concentrației CD, crește și vâscozitatea tamponului și scade fluxul electroosmotic (FEO), ducând la prelungirea timpului de migrare[SAZ2016]. În această situație am ales o concentrație a CD de 15 mM, deoarece separarea celor doi enantiomeri este mult mai eficientă la această valoare (figura 6.2.).

Am continuat prin a varia voltajului la valori de +20, +25 și +30 kV. Am observat că o dată cu creșterea voltajului aplicat scad timpii de migrare, dar mai scad și rezoluția separării și selectivitatea sistemului. În această situație am ales un voltaj de + 25 kV (figura 6.3.).

Influența temperaturii are de asemenea un rol major, deoarece ea poate modifica consistența probei (vâscozitatea) și implicit mobilitatea solutului. În această situație am ales temperatura de 15 0C (figura 6.4.).

În ceea ce privește parametri de injectare, am variat presiunea de injectare între valori de 3 și 50 mbar/1 secundă. Odată cu creșterea presiunii, s-a observat o scădere a rezoluției chirale, astfel în această situație am ales o presiune de injectare de 30 mbar/1 secundă, valoare la care separarea picurilor este mai eficientă (figura 6.5.).

În urma acestor studii experimentale detaliate mai sus, am obținut niște condiții analitice optimizate la care separarea amlodipinei este optimă: concentrația soluției tampon fosfat de 25 mM, pH-ul soluției tampon de 9,0, concentrația selectorului chiral de 15 mM CM-β-CD, voltajul aplicat de +25 kV, la o temperatura de 15 0C, iar presiunea de injectare fiind de 30 mbar/1 secundă. Ordinea de separare a enantiomerilor amlodipinei nu a putut fi cuantificată deoarece nu am avut la dispoziție enantiomeri optici puri. Separarea în condiții optimizate este prezentată în figura 6.6.

Figura 6.1. Influența concentrației soluției tampon

(Condiții analitice: pH=9,0, voltaj +20 kV, presiunea de injectare 50 mbar/1secundă,

temperatura 20 0C)

Figura 6.2. Influența concentrației CD asupra separării chirale a amlodipinei

(Condiții analitice: 25 mM tampon fosfat, pH9,0, voltaj +20 kV, presiunea de injectare 50 mbar/1 secundă, temperatura 20 0C)

Figura 6.3. Influența voltajului aplicat asupra separării chirale a amlodipinei

(Condiții analitice: 25 mM tampon fosfat, pH=9,0, 15 mM CM-β-CD, presiunea de injectare 50 mbar/1 secundă, temperatura 20 0C)

Figura6.4. Influența temperaturii aplicate asupra separării chirale a amlodipinei.

(Condiții analitice: : 25 mM tampon fosfat, pH=9,0, 15 mM CM-β-CD, voltajul +25 kV, presiunea de injectare 50 mbar/1 secundă )

Figura 6.5. Influența parametrilor de injectare asupra separării chirale a amlodipinei

(Condiții analitice: 25 mM tampon fosfat, 15 mM CM-β-CD, pH=9,0, voltajul +25 kV, temperatura 15 0C)

Figura 6.6. Separarea în condiții optimizate.

(Condiții analitice: 25 mM tampon fosfat, 15 mM CM-β-CD, pH=9,0, voltajul +25 kV, presiunea de injectare 30 mbar/1 secundă, temperatura 15 0C)

Verificarea performanțelor analitice ale metodei

Performanțele analitice ale metodei optimizate de separare chirală a amlodipinei au fost evaluate prin prisma preciziei, repetabilității (intra-day și inter-day), liniarității, robusteței și al exactității.

Precizia, conform literaturii de specialitate reprezintă gradul de împrăștiere a unei

serii de măsurători ce provin dintr-o analiză multiplă a unei probe omogene. Ea poate fi

exprimată prin repetabilitate în aceeași zi (precizie intra-day – tabelul 7.1.) și prin repetabilitatea în diferite zile (precizie inter-day – tabelul 7.2.). [47]

Am evaluat precizia intra-day prin injectarea unui amestec racemic de amlodipină de concentrație 5 mg/mL de câte șase ori în aceeași zi. Am calculat timpii de migrare medii, iar apoi am determinat deviația standard relativă RSD pentru timpii de migrare, aria picului și înălțimea acestuia. Valorile RSD pe care le-am obținut au fost sub 1% pentru timpii de migrare și înălțimea picului, ceea ce afirmă o precizie bună a metodei. În cazul RSD pentru aria picurilor, valorile sunt puțin mai mari peste 1%, dar acest lucru este frecvent întâlnit în cazul acestor determinări.

În continuare am determinat și precizia în zile diferite (inter-day), injectând amestec racemic de amlodipină de șase ori, în trei zile consecutive. Astfel am calculat deviațiile standard relative la aceste valori, pentru timpii de migrare a celor doi enantiomeri, aria picului acestora și înălțimea picului. (tabelul x)

7.1. Repetabilitate intra-day (n = 6, concentrația probei = 5 mg/mL)

7.2. Repetabilitate inter-day (n=18, concentrația probei = 5 mg/mL)

Pentru verificarea liniarității metodei, am trasat curbele de calibrare calculând ecuațiile de regresie și coeficienții de corelație (tabelul 7.3.), prin injectarea a zece soluții de concentrații diferite de amlodipină, pe un domeniu de concentrații bine cunoscut cu valori cuprinse între 0,5 si 10 mg/ml. Soluțiile au fost preparate prin diluarea probei de amlodipină cu metanol.

Se consideră faptul că linearitatea metodei este acceptată în cazul în care se lucrează cu minim cinci niveluri de concentrație diferite, fiecare concentrație să fie reprodusă de trei ori, iar coeficientul de regresie să fie cuprins între 0,99 și 1,00. [Silvia imre]

Tabelul 7.3. Curbele de calibrare, valorile limitelor de detecție (LOD) și de cuantificare (LOQ) pentru separarea chirală a amlodipinei (n = 3, concentrații: 0.5-10 mg/mL)

Limita de detecție (LOD) și limita de cuantificare (LOQ) reprezintă raportul dintre deviația standard a ecuației de regresie și panta acesteia, înmulțită cu 3,3 pentru LOD, respectiv cu 10 pentru LOQ. Coeficienții de corelație (R) obținuti au fost peste 0,99, fapt ce explică o linearitate foarte bună a metodei pe domeniul de concentrații ales.

Figura 7.4. Curba de calibrare pentru enantiomerul 1

Figura 7.5. Curba de calibrare pentru enantiomerul

Verificarea aplicabilității metodei analitice

Aplicabilitatea metodei optimizate a fost verificată pe forme farmaceutice existente în România: Norvasc® 10 mg, 5 mg (Pfizer), respectiv Amlohexal® 10 mg, 5 mg (Hexal).

Conținutul a 10 comprimate din fiecare medicament analizat a fost cântărit, triturat și omogenizat într-un mojar, apoi am prelevat cantitatea corespunzătoare a 5 mg, respectiv 10 mg amlodipină și am dizolvat-o în 10 ml metanol. Am pus probele timp de 3 minute pe baia de ultrasunete, iar apoi le-am diluat la 100 ml tot cu metanol într-un balon cotat, pentru a putea fi introduse in sistemul de EC în vederea separării.

În urma determinărilor din formele farmaceutice, prin metoda electroforetică a fost

determinată concentrația celor doi enantiomeri din acestea. Cantitățile găsite au fost

conforme cu cele declarate de producători, raportul enantiomerilor fiind 1:1.

Tabel 8.1. Regăsirea din forme farmaceutice

In figura de mai jos avem separarea amlodipinei din forme farmaceutice:

Figura 8.2. Separarea amlodipinei din forme farmaceutice

CONCLUZII

BIBLIOGRAFIE