Introducere …5 [626311]

3Cuprins

Introducere ………………………………………………………………………………………….5
Capitolul I ……………………………………………………………………………………………7
Medii de cultur ă…………………………………………………………………………………..7
1.1. Pregătirea mediilor de cultur ă pentru ciupercile și bacteriile din sol ……7
1.1.1. Compozi ția chimică a mediilor de cultur ă pentru bacterii………..10
1.1.2. Compozi ția chimică a mediilor de cultur ă pentru ciuperci……….11
1.1.3. Sterilizarea mediilor de cultur ă și a recipientelor ……………………15
Capitolul II ………………………………………………………………………………………..19
Metode generale de izolare a microorganismelor …………………………………19
2.1. Izolarea direct ă prin metoda dilu țiilor ……………………………………………19
2.2. Insămânțarea microorganismelor pe medii lichide și solide ……………..23
2.2.1. Ins ămânțarea în plăci Petri în gazon sau profunzime ………………24
2.2.2. Ins ămânțarea în plăci Petri la suprafa ță…………………………………25
2. 3. Determinarea num ărului de bacterii dintr-un anumit produs ……………27
Capitolul III ……………………………………………………………………………………….33
3.1. Obținerea de culturi pure de bacterii și ciuperci izolate din sol …………33
Capitolul IV ……………………………………………………………………………………….38
Studiul caracterelor morfologice ale bacteriilor …………………………………..38
4.1. Clorarea Ziehl-Neelsen………………………………………………………………..38
4.2. Colorarea sporilor ……………………………………………………………………….42 4.2.1. Eviden țierea sporului bacterian – me toda Schaeffer – Fulton ……44
Capitolul V …………………………………………………………………………………………47
5.1. Studierea caracterelor biochimi ce ale bacteriilor din sol…………………..47
5.1.1. Eviden țierea propriet ăților bacteriilor de a degrada glucide……..55
5.1.2. Testul de hidroliz ă a amidonului – testul amilazei ………………….60
5.1.3. Testul de hidroliz ă a ureei……………………………………………………62

4 5.1.4. Eviden țierea produ șilor rezulta ți din descompunerea
aminoacizilor……………………………………………………………………….65 5.1.5. Eviden țierea producerii de H
2S……………………………………………68
5.1.6. Descompunerea celulozei …………………………………………………..73
5.1.7. Determinarea activit ății catalazice a solului ………………………….77
Capitolul VI ……………………………………………………………………………………….80
Circuitul azotului ……………………………………………………………………………….80
6.1. Determinarea puterii amonificatoare și nitrificatoare a solului …………84
6.1.1. Determinarea puterii amonificatoare ……………………………………84 6.1.2. Determinarea puterii nitrificatoare a solului ………………………….88
6.1.3. Determinarea puterii denitrificatoare a solului ………………………94 6.1.4. Eviden țierea bacteriilor din nodozit ățile radiculare ale plantelor
leguminoase ……………………………………………………………………..97
6.1.4.1. Studiul bacteriilor de nodozit ăți pe medii de cultur ă…………..100
6.2. Eviden țierea efectului de rizosfer ă……………………………………………..104
Bibliografie ………………………………………………………………………………………109

5
Introducere

Solul asigur ă microorganismelor condi ții optime pentru desf ășurarea
activităților vitale – nutri ție, creștere, înmul țire, prezen ța microorganismelor
fiind în strâns ă legătură cu sursele energetice și trofice existente sau ad ăugate
solului.
Intre activitatea biologic ă a microorganismelor din sol și fertilitatea
acestuia exist ă o relație direct propor țională, solul fiind cu atât mai fertil, cu
cât are o microbiostructur ă mai bogat ă.
Microbiostructura solului este reprezentat ă de bacterii, ciuperci,
actinomicete, alge, acestea reprezentând trei p ătrimi din biomasa vie a solului.
Activitatea biochimic ă a bacteriilor din sol const ă în:

– descompunerea sau mineralizarea celulozei , în condi ții aerobe
sau anaerobe cu formare de bioxid de carbon și apă, de către
bacteriile și ciupercile celulolitice;
– descompunerea substan țelor proteice și a altor compu și, atât în
condiții aerobe cât și anaerobe cu eliberarea azotului accesibil
plantelor sub form ă de amoniac;
– oxidarea amoniacului la acid azotic cu eliberare de energie
realizată de grupa bacteriilor nitrificatoare. Aceast ă sursă de
energie este utilizat ă pentru asimilarea bioxidului de carbon și
creșterea microorganismelor. Acidul azotic formeaz ă în sol săruri
care pot dizolva fosfa ții, contribuind astfel la asigurarea nutri ției cu
fosfor;
– reducerea azota ților la azot molecular;

6- fixarea azotului atmosferic ;
– formarea și descompunerea substan țelor humice ;
– oxidarea hidrocarburilor .

Lucrările de laborator sunt constitu ite din mai multe experimente care
constau în:
– izolarea de bacterii, drojdii sau mucegaiuri necunoscute din sol și
obținerea de culturi pure;
– identificarea acestora prin aplicarea tehnicilor de colorare și
examinarea microscopic ă;
– determinarea caracterelor morfologice;
– observarea la microscop a diferen țelor evidente dintre procariote și
eucariote;
– determinarea caracterelor culturale;
– determinarea unor caractere biochimice;
La finalul programului de studiu fi ecare student va avea posibilitatea s ă
întocmeasc ă un referat de sintez ă asupra bacteriei sau ciupercii analizate.
Acest referat va include o scurt ă introducere în care se va descrie scopul
experimentelor, tabele de sintez ă ale tuturor rezultatelor experimentale
obținute, identificarea provizorie a microorganismelor izolate și analizate.

7Capitolul I
Medii de cultur ă

1.1. Pregătirea mediilor de cultur ă pentru ciupercile și bacteriile din sol

Principii

Nutriția constituie o func ție principal ă a vieții microbiene, formând
baza sintezelor celulare care asigur ă atât men ținerea constant ă a integrit ății
structurale cât și capacitatea de func ționare a celulelor. Nutri ția asigură aportul
energetic necesar proceselor vitale, fiind important ă pentru cre șterea și
înmulțirea microorganismelor.
Nutrienții necesari pentru cre șterea microorganismelor sunt foarte
variați, dar este important ă asigurarea elementelor chimice de baz ă ale
structurii organice cum ar fi oxig enul, carbonul, azo tul, fosforul și sulful.
Aceaste elemente chimice sunt nece sare pentru sinteza protoplasmei și pentru
procesele vitale, fapt pentru care mediul de cultur ă trebuie s ă corespund ă cât
mai bine nevoilor de baz ă ale microorganismelor.
Cerințele nutritive ale bacteriilo r pot fi clasificate în dou ă grupe:
– necesități nutritive elementare de baz ă, reprezentate de o surs ă de
carbon, hidrogen, oxigen, azot – necesare în cantit ăți mari; surs ă de sulf,
fosfor, fier, calci u, magneziu, potasiu și sulf – necesare în cantit ăți mici și urme
de cobalt, cupru, zinc, molibden.
– necesități specifice necesare în special bacteriilor auxotrofe. Acestea
au nevoie suplimentar de compu și organici (factori de cre ștere) care nu pot fi
sintetizați, cum ar fi unii aminoacizi, baze purinice și pirimidinice sau

8vitamine. Ace ști compuși organici trebuie s ă fie prezen ți în mediile de cultur ă,
având în vedere c ă sunt indispensabili cre șterii acestor bacterii.
La bacterii nutri ția se realizeaz ă prin osmoza substanțelor hrănitoare
prin membrana celular ă, tipul de nutri ție fiind absorbtiv .
Cerințele de cre ștere pentru fungi pot varia de la o tulpin ă la alta, de și
culturile de ciuperci microscopice din aceea și specie și gen tind s ă crească cel
mai bine pe medii similare. In general, ciupercile cresc cel mai bine pe medii
care conțin substan țele nutritive din mediile din care au fost izolate. Datorit ă
diversității nutritive ale ciupercilor nu exist ă un mediu standard pentru toate
speciile. Astfel unele medii de cultur ă (Czapek-agar, cartof-dextroz ă-agar,
malț-agar etc.) permit dezvoltarea unui num ăr mare de ciuperci, în timp ce
altele pot fi specifi ce pentru un num ăr restrîns de specii sau chiar a unei
singure specii.
Mediile de cultur ă sunt substraturi nutritive folosite în laboratoare
pentru cre șterea microorganismelor. Pentru ob ținerea în cultur ă a unui anumit
microorganism este necesar s ă se cunoasc ă cerințele nutriționale și formularea
unui mediu de cultur ă adecvat care s ă permită aprovizionarea cu nutrien ții
esențiali în cantit ăți corespunz ătoare.
Astfel, compozi ția general ă a unui mediu de cultur ă poate fi
reprezentat ă de:
1. un donor și acceptor de hidrogen – aproximativ 1,0-15,0 g/l;
2. o sursă de carbon – aproximativ 1,0-20,0 g/l;
3. o sursă de azot – aproximativ 0,2-2,0 g/l;
4. nutrienți anorganici (sulf, fosfor) – aporoximativ 50,0 mg/l;
5. microelemente – 0,1-1,0 μg/l;
6. factori de cre ștere (aminoacizi, baze purinice, pirimidinice)
aproximativ 50,0 mg/l, vitamine 0,1 – 1,0 mg/l;
7. agent de gelificare – agar – 10,0 – 20,0 g/l;

98. solvent de obicei ap ă distilată.
Pentru ob ținerea culturilor de microorganisme sunt necesare medii
lichide și solide în care sau pe care micr ooganismele sunt concentrate prin
creștere. In mediile lichide microorganismele cresc în profunzime și le tulbur ă
uniform, în timp ce pe mediile so lide microorganismele vor cre ște la suprafa ță
și vor forma colonii.
O varietate mare de microorga nisme pot fi izolate din sol și cultivate
sau crescute pe medii de cultur ă în laborator. In func ție de mediul de cultur ă
utilizat se vor putea ob ține diferite tipuri de microor ganisme. Astfel, pentru a
izola microorganismele din sol vom utiliza mai multe variante de medii de cultură.
Bacteriile sunt microorganisme procariote care au o form ă de creștere
unicelular ă. Populațiile de bacterii din sol s unt dominate de specii de
Pseudomonas , Arthrobacter , Bacillus , Micrococcus , Clostridium , Rhizobium,
Azotobacter, Achromobacter și Flavobacterium .
Ciupercile sunt microorganisme eucariote care au o form ă de creștere
filamentoas ă. Cele mai frecvente ciuperci prezente în sol sunt cele din genul
Penicillium , Aspergillus , Mucor , Rhizopus, Trichoderma și levuri din genul
Saccharomyces , Thorula .

Materiale necesare

– Sol
– Medii de cultur ă:
– Nutrient agar – pentru bacteriile din sol – extract de sol – agar – pentru bacterii
– mediu cu extract de ca rtof – pentru fungi

10- mediu Czapek –Dox – pentru fungi.
– Soluție salină 0,9% pentru dilu ții
– Balanță analitică, tehnică
– Pipete sterile sau micropipete, tipsuri sterile – Eprubete – Cutii Petri
– Plită termostat ă sau cuptor cu microunde.

Notă:
Pentru a ob ține varianta de mediu lichid nu se va ad ăuga agar.
In mediul pentru cultiv area ciupercilor se poate ad ăuga un antibiotic,
de exemplu roz bengal sau streptomicin ă.

1.1.1. Compozi ția chimic ă a mediilor de cultur ă pentru bacterii

Nutrient agar:
– extract de carne 3,0 g/l
– peptonă 5,0 g/l
– clorură de sodiu 5,0 g/l
– agar 12,0 g/l – apă distilată 1000 ml.
Pentru a determina formarea endos porilor la tulpin i ale genului
Bacillus se recomand ă adăugarea în mediul de cultur ă a 10,0 mg/l sulfat de
mangan. pH-ul mediului se ajusteaz ă la 7,0, iar sterilizarea se va face prin
autoclavare timp de 15 minute la temperatura de 121
0C și presiunea de o
atmosferă.

11Mediul de cultur ă extract de sol – agar
– glucoză 1,0 g/l
– fosfat dipotasic 0,500 g/l
– extract de sol 17,750 ml/l
– agar 12,0 g/l
– apă distilată 1000 ml
pH-ul final al mediului se ajusteaz ă la 6,8, iar sterilizarea se va realiza
prin autoclavare la 1210C timp de 15 minute.
Pentru a ob ține extractul de sol se procedeaz ă în felul urm ător:
– se cântăresc 400,0 g de sol de gr ădină uscat la aer (sol care are
un conținut ridicat de materie organic ă)
– se adaugă 1000 ml de ap ă de robinet
– se sterilizeaz ă timp de o or ă prin autoclavare la 121
0C
– se lasă la sedimentat câteva ore la temperatura camerei dup ă
care se centrifugheaz ă și se colecteaz ă supernatantul care va fi o
soluție limpede.

1.1.2. Compozi ția chimic ă a mediilor de cultur ă pentru ciuperci

Mediul cu extract de cartof – PDA (Potato Dextrose Agar)
– infuzie de cartof 1000 ml
– glucoză 20,0 g/l
– agar 12,0 g/l

12Pentru a prepara infuzia de cart of, se fierb 200 g de cartofi t ăiați felii și
necurățați de coajă într-un litru de ap ă distilată timp de 30 de minute. Apoi se
filtrează prin tifon ob ținându-se infuzia de cartof.
pH-ul final al mediului trebuie s ă fie 5,6; sterilizarea se va realiza prin
autoclavare la 1210C, timp de 15 minute.

Mediul Czapek –Dox
– zaharoză 30,0 g/l
– fosfat dipotasic 1,0 g/l – azotat de sodiu 3,0 g/l – sulfat de magneziu 0,5 g/l – clorură de potasiu 0,5 g/l
– sulfat de fier 0,01 g/l – agar 12,0 g/l – apă distilată 1000 ml

pH-ul final al mediului trebuie s ă fie 7,3. Se sterilizeaz ă prin
autoclavare la 1210C, timp de 15 de minute.
Pentru toate variantele de mediu, ingredientele se dizolv ă în apă
distilată. Intr-un pahar Berzelius se m ăsoară circa 200 ml de ap ă distilată, se
cântăresc componentele mediului în ordinea formulei și se adugă pe rând, dar
numai dup ă completa dizolvare a celei anterioare. Dup ă dizolvarea
substanțelor se stabilie ște pH-ul mediul de cultur ă cu ajutorul unui pH metru
de laborator (fig. 1.1.)
Pentru corectarea pH-ului mediului se utilizeaz ă hidroxidul de sodiu
0,1 N sau acidul clorhidric 0,1 N.

13

Fig.1.1. pH metru de laborator (sursa original)

Tehnica de lucru:

Intr-un vas mai mare, respectiv un Erlenmayer de 1000 ml se m ăsoară
circa 700 ml de ap ă distilată și se adaug ă agarul. Acest vas va fi pus în
cuptorul cu microunde sau pe o plit ă termostat ă și se va fierbe con ținutul pân ă
la completa dizolvare a ag arului (lichidul trebuie s ă fie limpede, transparent,
fără granule de agar nedizolvate).
După completa dizolvare a agarului în vas se va ad ăuga soluția
minerală și se completeaz ă volumul final la 1000 ml cu ap ă distilată. Mediul
se va repartiza în eprubete sau în vase mari, caz în care repa rtizarea se va face
ulterior în cutii Petri.
Sterilizarea mediului este absolut obligatorie și se va realiza a șa cum
s-a arătat mai sus prin autoclavare, temperatura și durata fiind în func ție de
tipul de mediu.

14Pentru mediile lichide vom folosi acelea și variante de me diu dar nu se
va adăuga agar.
Pregătirea mediilor de cultur ă deshidratate și disponibile în comer ț este
mult mai simpl ă. Fiecare flacon cu mediu deshidratat având instruc țiunile de
preparare. In acest caz, se cânt ărește cantitatea de pulbere recomandat ă, se
dizolvă în apă distilată și se fierbe pân ă la dizolvarea agarului.
Mediul nutrient agar este un mediu ge neral, neselectiv utilizat pentru
cultivarea bacteriilor. Este constituit din compu și chimici stabili termic,
compuși care furnizeaz ă aminoacizi, minerale și alte elemente nutritive
utilizate de multe genuri de bacterii pentru cre ștere, fiind i ndicat pentru
scopuri demonstrative.
Mediul cu extract de sol este utilizat pentru izolarea bacteriilor din sol.
Solul este un mediu natural pentru multe grupe de microorganisme, acesta
oferind o surs ă abundent ă de materie organic ă și carbon, azot sub form ă de
nitrați și nitriți, diverse minerale și vitamine esen țiale pentru cre șterea lor.
Glucoza din mediul de cultur ă constituie o surs ă de carbon u șor
metabolizabil ă, în timp ce fosfatul dipotasic ac ționează ca agent de tamponare.
Mediul cu extract de cartof – PDA este recomandat pentru cultivarea
ciupercilor saprofite și parazite și a drojdiilor. Mediul asigur ă o creștere
luxuriantă a fungilor, stimuleaz ă sporularea, men ținerea culturilor stoc și
diferențierea unor tulpini pe baza produc ției de pigment.
Mediul Czapek-Dox este o formul ă combinat ă între Czapek (1902-
1903) și Dox (1910) modificat ă de Thorm și Church. Mediul con ține o surs ă
unică de carbon și nitrat, fiind recomandat pe ntru cultivarea ciupercilor
saprofite care sunt capabile s ă utilizeze azotul anorgani c, mediul favorizând o
creștere luxuriant ă.

151.1.3. Sterilizarea mediilor de cultur ă și a recipientelor

Sterilizarea reprezint ă procesul de distrugere a tuturor formelor de
viață, respectiv a microorganismel or dintr-un mediu de cultur ă, soluții,
suprafețe, sticlărie, etc.
Exist ă trei procedee de baz ă prin care se poate realiza sterilizarea
mediilor de cultur ă și a materialelor de laborator:
– sterilizarea umed ă – autoclavarea
– sterilizare uscat ă – curenți de aer calzi
– sterilizarea la r ece – filtrarea.

Cea mai util ă metodă de sterilizare o constituie autoclavarea, în care
produsele sunt sterilizate prin expune rea la abur la temperature de 1210C,
presiunea de o atmosfer ă, timp de 15-20 de minute sau mai mult, în func ție de
natura produsului (fig . 1.2). In aceste condi ții microorganismele, chiar și
endosporii sunt distru și, acestea nesupravie țuind mai mult de 12-13 minute la
acestă temperatur ă și presiune.

In cazul sticl ăriei de laborator, în special pipetele și plăcile Petri sunt în
general sterilizate prin c ăldură uscată, având în vedere c ă aburul care se
formează în autoclave poate l ăsa sticlăria umedă în interior. Sterilizarea prin
căldură uscată se realizeaz ă în etuve la temperaturi cuprinse între 160-2200C
(fig. 1.3.). Deoarece c ăldura uscat ă nu este la fel de eficient ă ca și căldura
umedă, sticlăria se men ține la aceste temperaturi tim p de 30 minute sau chiar
două ore.

16

Fig. 1.2. Autoclav (sursa original)

In cazul mediilor de cultur ă sau a solu țiilor a căror componente se
denatureaz ă la temperatura de autoclavare st erilizarea se face la rece, prin
filtrare. In acest sens se folosesc filtre bacteriologice care re țin fizic bacteriile
și alte microorganisme mai mari din solu ții și astfel se sterilizeaz ă fără

17utilizarea c ăldurii. Pentru filtrare se pot ut iliza membrane sterile de celuloz ă,
policarbonat, etc. (filtre Milipor), care au dimensiunea porilor de 0,22 μm.

Fig. 1.3. Sterilizarea sticl ăriei în etuv ă (sursa original)
Pentru sterilizarea unor volume mai mari se utilizeaz ă diferite tipuri de
vase prev ăzute cu membrane filtrante. Filtrele au în componen ță două vase un
vas filtrant și un vas colector. Solu ția care urmeaz ă să fie sterilizat ă prin
filtrare se introduce în vasul filtrant, lichidul trece prin membrane filtrant ă și
se colecteaz ă în vasul de jos, vasul colector. Pentru gr ăbirea filtr ării, vasul
colector se ata șează la o pomp ă de vid (fig. 1.4.).

18

Fig. 1.4. Vas filtrant ata șat la pompa de vid
(sursa original)

Aplicații practice

Se vor prepara cele patru va riante de mediu de cultur ă pentru izolarea
bacteriilor și ciupercilor din sol.
In acest sens studen ții vor efectua urm ătoarele opera ții:
– cântărirea la balan ța analitic ă a componentelor necesare, conform
fiecărei variante de mediu de cultur ă;
– dizolvarea substan țelor în ap ă distilată;
– reglarea corespunz ătoare a pH-ului;
– lichefierea agarului pe plit ă cu agitator sau în cuptorul cu microunde
– realizarea concentra ției finale;
– repartizarea mediilor în eprubete sau diferite flacoane. Etichetarea,
respectiv varianta de mediu, data, grupa;
– sterilizarea recipientelor cu mediile de cultur ă.

19Capitolul II

Metode generale de izolare a microorganismelor

2.1. Izolarea direct ă prin metoda dilu țiilor

Principii

Metodele generale de izolare a micr oorganismelor constau în principal
din izolarea direct ă prin metoda dilu țiilor seriale sau decimale. Utilizarea
diluțiilor seriale previne aglomerarea celulelor .
In funcție de grupa de microorganisme care se dore ște a fi studiat ă,
pentru îns ămânțarea pe medii se folosesc diferite dilu ții, iar pentru o corect ă
interpretare a datelor se îns ămânțează în trei repeti ții.
Astfel, în func ție de tipul de microorganisme care se urm ărește a se
dezvolta pe mediile de cultur ă se pot utiliza urm ătoarele dilu ții:
– pentru bacterii: 1/10000, 1/100.000 și 1/1.000.000
– formarea de spori la bacterii: 1/1000, 1/10.000 și 1/100.000
– pentu ciuperci: 1/100, 1/1000, și 1 / 10.000
– pentru actinomicete: 1/1000, 1/10.000 și 1/100.000
In general cele mai utilizate dilu ții sunt 1/10, 1/100 și 1/1000.
Prin metoda dilu țiilor seriale se calculeaz ă numărul de celule per
mililitru dintr-o prob ă de analizat. Aceste dilu ții sunt astfel concepute pentru a
facilita interpretarea matematic ă.
Prima dilu ție se obține prin amestecarea unui ml din proba e șantion cu
9 ml de ap ă sau cu o solu ție tampon steril ă. Astfel rezult ă următoarea
fracțiune:

20
Metodele alternative de ob ținere a dilu țiilor constau în utilizarea a 10
ml probă de analizat, 0,5 ml sau 0,1 ml , caz în care cantitatea de ap ă sau
soluția tampon se calculeaz ă în așa fel încât s ă se obțină diluții decimale. Ca
de exemplu:

In cazul în care proba de analizat nu este lichid ă, ca de exemplu
probele de sol se cânt ărește 1 gram. Se consider ă că 1 gram de prob ă este
echivalent ă cu 1 ml. 0,5 ml proba 1
0,5 ml proba +
4,5 ml solu ție
tampon 0,5 ml
5,0 ml10 1×10-1diluție 1:10 1 ml proba + 9 ml
soluție tampon 1 ml
10 ml 101×10-1diluție 1:10 1 ml proba 1
0,1 ml 1
0,1 ml proba +
0,9 ml solu ție
tampon 0,1 ml
1,0 ml10 1×10-1diluție 1:10 10 ml proba + 90 ml
soluție tampon 10 ml
100 ml 101×10-1diluție 1:10 10 ml proba 1

21Pentru experimentele noastre vom folosi metoda dilu țiilor seriale.
După realizarea dilu țiilor se vor face îns ămânțări pe medii de cultur ă, iar după
incubare se va determina num ărul total de bacterii din suspensia in țială prin
numărarea unit ăților formatoare de colonii și compararea cu factorul de dilu ție
utilizat.
Aceste dilu ții seriale se vor ob ține dintr-o prob ă de 10 g sol, suspensia
de sol con ținând un num ăr necunoscut de bacterii .

Materiale necesare:

– mediu de cultur ă lichid și solid
– probe de sol
– soluție salină 0,9%
– eprubete
– plăci Petri
– pipete sterile
– incubatoare

Mod de lucru

Realizarea dilu țiilor decimale din material ul de studiat (sol de gr ădină).
Pentru ob ținerea dilu țiilor decimale se va proceda în felul urm ător:
– se cântăresc 10,0 g de sol și se introduc într-un vas cu 90 ml solu ție
salină 0,9%. Se omogenizeaz ă foarte bine pentru a realiza dispersia celulelor.
In acest caz cultura a fost diluat ă de 10 ori, adic ă avem dilu ția 10-1;
– se lasă flaconul în repaus (circa cinc i minute) pentru sedimentare;
– se pregătesc șase eprubete cu câte 9 ml de solu ție salină și se
eticheteaz ă;

22- se transfer ă un ml din supernatantul dilu ției primare într-o eprubet ă
care conține 9 ml de solu ție salină și se omogenizeaz ă foarte bine. Se ob ține
astfel dilu ția 10-2;
– se omogenizeaz ă bine eprubeta cu dilu ția 10-2 și cu o pipet ă sterilă se
transferă un ml într-o alt ă eprubetă cu 9 ml de solu ție salină, cultura în acest
caz a fost diluat ă de 1000 de ori, având dilu ția 10-3;
– în continuare se procedeaz ă în mod asem ănător până se ajunge la
diluția 10-7, cultura fiind diluat ă de 10.000.000 ori.

Pe parcursul întregii proce duri se vor utiliz a pipete sterile. De asemenea,
se va utiliza o pipet ă nouă pentru fiecare dilu ție.
Diluțiile obținute se vor folosi pentru inocularea mediilor și
determinarea num ărului de microorganisme din proba de sol analizat ă.
Pentru o mai bun ă acuratețe a măsurătorilor de laborator se vor utiliza
micropipetele. Acestea sunt autoclavabile și permit m ăsurarea unor volume
exacte de material (fig. 2.1.).

Fig. 2.1. Micropipete (sursa original)

23 2.2. Insămânțarea microorganismelor pe medii lichide și solide

Pincipii

Insămânțarea sau inocularea constă în trecerea microorganismelor
provenite din diferite surse pe medii de cultur ă.
Insămânțarea se va executa în condi ții aseptice, în apropierea becului
de gaz sau în hota steril ă cu flux laminar. Având în vedere c ă tehnicile de
însămânțare au fost prezentate detailat în partea de microbiologie introductiv ă
vom face doar câteva referiri legate de acest aspect.
Izolarea bacteriilor și a ciupercilor din substrat ul pe care se dezvolt ă se
poate realiza prin metode generale și metode speciale.
Așa cum s-a mai men ționat însămânțarea se poate face atât pe medii
lichide cât și pe medii solide. Determinarea cantitativ ă este posibil ă pe medii
nutritive solide, pe acestea dezvoltându-se la suprafa ță colonii care pot fi
evaluate și numărate individual.
Insămânțarea pe medii solide se poate face pe agar înclinat sau în pant ă
în eprubete sau în pl ăci Petri .
In plăcile Petri mediul de cultur ă poate fi distribuit în dou ă variante:
– de la început, urmând ca îns ămânțarea să se facă după completa
solidificare;
– ulterior dup ă introducerea culturii microbiene.
O mai rapid ă distribuire a mediului în pl ăcile Petri se poate realiza cu
ajutorul unui distribuito r de medii (fig. 2.2.).
După însămânțarea plăcilor Petri și incubare se trece la num ărarea
bacteriilor vii, pentru a determina num ărul de bacterii dintr-o popula ție a
solului.

24

Fig. 2.2. Distribuitor automat pentru mediile de cultur ă
(sursa original)

2.2.1. Ins ămânțarea în pl ăci Petri în gazon sau profunzime

In fiecare plac ă Petri se introduce o prob ă exactă dintr-o dilu ție.
Probele se pipeteaz ă cu ajutorul pipetei Past eur sau a unei pipete obi șnuite
apoi se toarn ă agarul. Se omogenizeaz ă prin rotirea u șoară a cutiei Petri pentru
a realiza o distribu ție uniform ă a microorganismelor. Acest procedeu se repet ă
pentru toate dilu țiile. Pentru o interpretare corect ă a rezultatelor se
însămânțează câte trei cutii din fiecare dilu ție.

252.2.2. Ins ămânțarea în pl ăci Petri la suprafa ță

Tehnica îns ămânțării la suprafa ță în placa Petri constituie una din
metodele de cuantificare a microorganismelor pe mediu solid.
In acest caz îns ămânțarea se va face dup ă completa solidificare a
mediului de cultur ă, astfel microorgansimele nu se încorporeaz ă în agar ca și
în cazul metodei în gazon sau profunzime ci culturile sunt r ăspândite pe
surafața mediului. In general, se utilizeaz ă 0,1-1,0 ml din proba de dilu ție care
se întinde pe suprafa ța unei pl ăci cu mediu agarizat. Distribu ția uniform ă a
diluției se va face cu ajutorul uni dispersor steril de sticl ă sau cu spatula
Drigalski (fig. 2.3.).
Un avantaj al acestei tehnici de îns ămânțare const ă în faptul c ă
culturile microbiene nu sunt niciodat ă expuse la temperatura de 42-450C,
temperatur ă pe care o are agarul topit.
După însămânțare cutiile se pun la incubat pentru 24 sau 48 de ore la
temperatura de 25-370C, după care se trece la num ărarea coloniilor.

Fig. 2.3. Spatule pentru îns ămânțare
(sursa original)

26
După incubare se vor ob ține colonii indivi duale la suprafa ța mediului
de cultură ceea ce va permite determinarea unit ăților formatoare de colonii
(UFC). Coloniile pot fi diferen țiate între ele macroscopic și microscopic.

Aplicații practice

Insămânțarea mediilor de cultur ă prin diferite metode
1. Insămânțarea în gazon
– Mediul agarizat se tope ște pe baie marin ă sau la microunde. Pentru a
minimaliza cantitatea de condens care se poate forma pe capacele cultiilor
Petri, mediul se va turna dup ă o ușoară răcire, știiut fiind faptul c ă agarul se va
solidifica când temperatura va ajunge la aproximativ a 42
0C.
– In fiecare plac ă Petri se va introduce 0,1 ml din fiecare dilu ție
realizată, după care se toarn ă agarul.
– Se omogenizeaz ă prin rotirea u șoară a cutiei Petri pe ntru a realiza o
distribuție uniform ă a microorganismelor. Acest procedeu se repet ă pentru
toate dilu țiile. Pentru o interpretare corect ă a rezultatelor se îns ămânțează câte
trei cutii din fiecare dilu ție.
– Se eticheteaz ă corespunz ător toate cutiile Petri.
– Se pun pl ăcile în termostat la incubat cu capacul în jos, la temperaturi
între 25-370C.

27
2. Insămânțarea la suprafa ță

– pentru îns ămânțarea la suprafa ță, mediul de cultur ă se topește și se
repartizeaz ă în plăci Petri;
– din fiecare dilu ție aleasă se pipeteze 0,1 ml pe suprafa ța mediului cu
agar solidificat. Pentru repartizarea uniform ă a inoculului pe suprafa ța
mediului de cultur ă se va folosi o spatul ă Drigalscki;
– pentru fiecare dilu ție se va utiliza o alt ă spatulă sterilă;
– se eticheteaz ă fiecare cutie Petri notându-se varianta de mediu și
diluția utilizată;
– se pun plăcile în termostat la incubat cu capacul în jos, la temperaturi
între 25-370C.

2. 3. Determinarea num ărului de bacterii dintr-un anumit produs

Principii

In experien țele de caracterizare microbiologic ă un rol important îl are
cunoașterea num ărului de celule sau a concentra ției celulelor dintr-o anumit ă
probă.
In cercetare se folosesc o serie de metode pentru a determina num ărul
de microorganisme prezente într-o popula ție. Astfel se pot utiliza urm ătoarele
metode:

28- metoda spectofotometric ă, bazată pe măsurarea densit ății optice a
unei popula ții;
– numărarea direct ă cu ajutorul camerelor de num ărat;
– diluarea serial ă a bacteriilor și însămânțarea pe medii care s ă asigure
creșterea microorganismelor.
Aceast ă metodă este mai laborioas ă și necesită mai mult timp, dar
oferă rezultate statistice precise și repetabile. De asemenea, aceast ă metodă
este indicat ă pentru enumerarea microorganismelor, având în vedere c ă
identifică numai microorganismel e vii dintr-o popula ție.
Cuantificarea microbian ă este util ă și în studiile de fiziologie sau
biochimie. Astfel, dac ă se cunoa ște numărul de bacterii prezente într-o cultur ă,
se poate calcula cantitatea de protein ă sau de ADN care poate fi izolat ă din
populația analizat ă.
In microbiologia alimentar ă, microbiologii testeaz ă apa sau alimentele
(lapte, carne etc.) pentru a determina num ărul de agen ți patogeni și pentru a
stabili dac ă produsele respective sunt sigur e pentru consumul uman.
Erorile care apar în metoda dilu țiilor sunt asociate cu preg ătirea probei
de analizat din momentul în care a fost colectat e șantionul și până în momentul
în care organismele sunt fie num ărate, fie identificate. O prim ă eroare este dat ă
de mărimea inițială a eșantionului, apoi erorile pot fi de pipetare, erori care pot
să apară la toate dilu țiile efectuate. F ără o pregătire adecvat ă a probelor,
posibilitatea de apari ție a erorilor po ate fi substan țială.
In lucrarea de fa ță vom face referiri doar la metoda culturilor în pl ăci
Petri. Aceast ă metodă este aplicat ă în mod obi șnuit și cu rezultate
satisfăcătoare pentru estimarea popula țiilor bacteriene din soluri, ap ă, lapte,
alimente, culturi etc.
Prin aceast ă metodă numărul de bacterii se exprim ă ca unități
formatoare de colonii (UFC), respectiv num ărul de microorganisme viabile

29pe ml. Tehnica UFC presupune c ă fiecare colonie este rezultatul înmul țirii
unei singure celule, astfel se poate determina câte unit ăți formatoare de colonii
sunt prezente per ml de prob ă.
Se consider ă că fiecare unitate care formeaz ă o colonie reprezint ă o
bacterie care a fost prezent ă în proba diluat ă. Pentru a determina num ărul de
bacterii care a fost prezent în proba ini țială d e s o l , n u m ărul de unit ăți
formatoare de colonii – UFC – se va împ ărți la produsul dintre factorul de
diluție utilizat și volumul suspensiei cu care s-a f ăcut însămânțarea.
Dintre avantajele metodei enumer ăm:
– permite cunoa șterea înc ărcăturii microbiene sau gradul de
contaminare a unor probe de ap ă, sol, produse industriale, echipamente etc.;
– sensibilitatea metodei – te oretic putând fi detectat ă doar o singur ă
celulă; poate fi num ărat un num ăr mic de microorganisme.
– ușor de efectuat și poate fi adaptat ă și în cazul unor popula ții foarte
mari.
Ca dezavantaje enumer ăm:
– se cuantific ă numai celule vii care pot dezolta apoi colonii;
– coloniile se dezvolt ă din acele microorganisme pentru care condi țiile
culturale sunt adecvate pentru cre ștere.

Așa cum s-a mai men ționat dup ă însămânțare cutiile Petri se pun la
incubat în termostate. Coloniile microbiene încep s ă fie ușor vizibile dup ă una
două zile pentru bacterii și șapte zile pentru ciuperci. Actinomicetele necesit ă
în general, un timp mai îndelungat de incubare, respective 14 zile.
Contorizarea num ărului de colonii se va face pe fiecare plac ă și apoi se
calculează numărul mediu de ciuperci, bacterii și actinomicete din sol.
Determinarea unit ăților formatoare de colonii (UFC) presupune
numărarea coloniilor din pl ăci. După incubare, se analizeaz ă plăcile Petri care

30conțin între 30 și 300 de colonii. La un num ăr mai mic de 30 de colonii/plac ă
apar erori, care pot fi datorate unor contamin ări care influen țează negativ
dezvoltarea bacteriilor. La un num ăr mai mare de 300 colonii/plac ă numărarea
este mai dificil ă, coloniile fiind dese și greu de individualizat.
Se consider ă că fiecare unitate care formeaz ă o colonie reprezint ă o
bacterie care a fost prezent ă în proba diluat ă. Pentru a determina num ărul de
bacterii per ml care a fost prezent în proba ini țială de sol, num ărul de unit ăți
formatoare de colonii – UFC – se va împ ărți la produsul dintre factorul de
diluție utilizat și volumul suspensiei cu care s-a f ăcut însămânțarea.
Pentru ușurarea activit ății de cuantificare se poate utiliza aparatul de
numărat colonii, un aparat manual sau și mai rapid prin utilizarea unor
programe de calculator (fig. 2.4.).
Fig. 2.4. Num ărător de colonii
(sursa original)

31

Calculul num ărului de bacterii per ml din dilu țiile seriale

Pentru a calcula num ărul de bacterii per ml de prob ă de sol diluat ă se
aplică următoarea ecua ție:
Dacă de exemplu, îns ămânțarea s-a f ăcut cu 0,1 ml din suspensia
celulară diluată și s-au num ărat 230 de colonii, la dilu ția 10
-5, calculul va fi
următorul:
230/0,1 x 10-5, respectiv 230 x 106, ceea ce reprezint ă în final 2,3 x 108
celule sau bacterii per ml.

Aplicații practice

– se analizeaz ă macroscopic pl ăcile Petri îns ămânțate
– se vor elimina pl ăcile la care num ărul de colonii este sub 30 sau mai
mare de 300
– citirile se vor realiza cu ajutorul aparatului de num ărat colonii
– se notează numărul de colonii pentru fiecare plac ă și diluția utilizată
– se determin ă numărul de microorganisme/ml din proba ini țială
– se notează caracteristicile culturale ale coloniilor bine eviden țiate
– datele oținute se vor trece în tabele.
Numărul de UFC
Volumul inoculului (ml) x factorul
de diluție utilizatNumărul de UFC
ml

32

Varianta de mediu
de cultură/
Diluția
serială Nr. de
colonii Nr. de
celule/ml Media nr. de colonii
din plăcile Petri cu
aceeași diluție
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7

Caracteristici culturale
colonii Colonia analizat ă
Mărimea
Forma coloniei
Marginea
Profilul
Aspectul suprafe ței
Luciul
Relieful
Profilul
Prezența pigmenților
Consisten ța

33Capitolul III

3.1. Obținerea de culturi pure de bacterii și ciuperci izolate din sol

Principii

Identificarea bacteriilor este uneori dificil ă, având în vedere faptul c ă
multe bacterii apar ținând unor specii diferite au caractere morfologice
asemănătoare. Studiul caracteristicilor fiziol ogice, biochimice sau a ciclului de
dezvoltare a microor ganismelor, precum și posibilitatea de a determina specia
presupune ob ținerea unei culturi pure pe medii de cultur ă in vitro .
Cultura microbian ă este considerat ă rezultatul cre șterii și multiplic ării pe
medii nutritive.
Cultura pur ă definește o biomas ă de celule care rezult ă prin
multiplicarea unei singure celule într-un mediu nutritiv steril. De asemenea, se consideră cultură pură și colonia care rezult ă în urma izol ării unei celule pe
medii nutritive solide.
Pentru a ob ține o cultur ă pură dintr-o plac ă Petri în care s-au dezvoltat
mai multe tipuri de colonii, izolarea une i colonii de interes se va face prin
repicare sau pasare pe medii proaspete.
Practica de laborator prezint ă mai multe metode de separare a unei
singure celule dintr-un am estec de microorganisme crescute pe acela și mediu
de cultură.
Metodele de izolare a culturilor pure se pot clasifica în metode fizico-
mecanice și metode biologice.

34Metodele fizice de izolare cele mai ut ilizate sunt prin r ăspândire, care
presupun utilizarea diluțiilor sau diseminarea mecanic ă pe suprafa ța mediilor
de cultură și metoda striurilor când inocularea se face în pl ăci Petri, prin
trasarea de striuri la suprafa ța mediului de cultur ă.
Metodele biologice de obținere a culturilor pure se bazeaz ă pe unele
proprietăți fiziologice ale microorganismelor care pot diferen ția
microorganismele din acela și biotop.
Culturile pure au o mare importan ță practică, deoarece în acest fel se pot
studia propriet ățile morfologice , biochimice, culturale sau pot fi supuse unor
tratamente fizico-chimice pentru ob ținerea unor culturi mutante utilizate
ulterior în selec ția unor tulpini mai performante.
In cazul microorganismelor care cresc bine pe mediu cu agar, metoda de
însămânțare în striuri este alegerea cea mai bun ă pentru ob ținerea culturilor
pure. Scopul îns ămânțării în striuri este de a ob ține colonii izolate dintr-un
inocul. Fiecare colonie bine izolat ă se presupune c ă apare dintr-o singur ă
celulă și, prin urmare, reprezint ă o clonă a unei culturi pure (fig. 3.1.)

Fig. 3.1. Cultur ă pură în placă Petri (sursa original)

35Transferul sau repicarea unei colonii dintr-un amestec de cultur ă se
realizează cu ajutorul anselor microbiologice. Bucla ansei cu înc ărcătura
microbian ă prelevată din colonia care se dore ște a fi izolat ă se introduce în
placa Petri cu mediul de îns ămânțat și se traseaz ă striuri sau linii la suprafa ță,
având grij ă să nu se zgârie agarul. Astfel, se transfer ă o singură colonie într-un
mediu steril în care cultura pur ă se va dezvolta (fig. 3.2.).

Fig. 3.2. Selectare unei col onii cu ajutorul ansei și obținerea culturii pure
(sursa original, foto 2)

Materiale necesare

– Culturi de microorganisme
– Plăci Petri cu medii de cultur ă
– Anse – Bec de gaz – Ractivi colorare Gram – Lame de microscop – Microscop

36Aplicații practice

După determinarea num ărului total de microorganisme din pl ăcile Petri
analizate se vor selecta 4-5 co lonii reprezentative care difer ă macroscopic.
– se vor descrie și nota principalele caractere culturale ale coloniilor
selectate: form ă, margini, profil, pigmentare, m ărimea coloniei, aspectul
suprafeței etc.;
– se vor examina caracterele morfologice și tinctoriale ale
microorganismelor din coloniile selectate;
– se vor aplica metode de colorare selective pentru punerea în eviden ță a
endosporilor;
– cu ajutorul ansei sterile se va transfera în condi ții aseptice o mic ă
cantitate din colonia selectat ă pe un mediu de cultur ă proaspăt. Ansa
bacteriologic ă încărcată cu cultura microbian ă se descarc ă succesiv, pân ă la
epuizare, pe suprafa ța mediului solid, prin tras area de striuri pe suprafa ța
agarului;
– se eticheteaz ă fiecare plac ă și apoi se pune la incubat;
– pe parcursul incub ării se vor examina culturile pentru a stabili dac ă
avem o cultur ă pură.
Pentru experimentul legat de ciuperc ile izolate din sol se va proceda la
fel ca și în cazul descris pentru bacterii. Analizele microscopice se vor face cu
preponderen ță folosind tehnica preparatelor native între lam ă și lamelă și
aplicând colorantul albastrul lactofenol.
Observațiile se trec în tabel.

37
Colonia izolat ă
Caracterul
cultural 1 2 3 4 5 Gram +
sau – Endospor
Mărimea
Forma
Aspectul
suprafeței
Marginea
Profilul
Luciul
Relieful
Pigmenții
Consisten ța
Alte
observații

38Capitolul IV

Studiul caracterelor morfologice ale bacteriilor

4.1. Clorarea Ziehl-Neelsen
Colorarea diferen țială II

Principii

Majoritatea bacteriilor se coloreaz ă prin procedee simple sau prin
metoda Gram, dar sunt și unele specii ale genului Mycobacterium
(Mycobacterium tuberculosis , Mycobacterium leprae ), Nocardia ,
Rhodococcus etc., care sunt rezistente și pot fi vizualizate la microscop numai
prin colorarea diferen țială Ziehl – Neelson.
Metoda original ă a fost descris ă de Ziehl în 1882 și Neelsen în 1883,
în timp dezvoltându-se numero ase modificari ale metodei.
Aceste micobacterii con țin în peretele celular substan țe ceroase de tipul
acidului micolic, substan țe ce fac ca p ătrunderea colorantului s ă fie foarte
dificilă, fiind impermeabile la multe metode de colorare.
Bacteriile care rezist ă la decolorarea cu amestecul alcool-acid se
numesc bacterii alcoolo-acido rezistente , iar cele care se decoloreaz ă se
numesc bacterii ne alcoolo – neacido rezistente .
Realizarea frotiurilor dup ă această metodă de colorare se face utilizând
ca prim colorant fucsina, care datorit ă conținutului de fenol va ajuta la
solubilizarea peretelui celular. De asemenea pentru a cre ște capacitatea de
penetrare a colorantului în peretele cel ular, colorarea se va face la cald. In

39acest sens, frotiul se înc ălzește la flac ăra unui bec de gaz sau pe o plit ă
termostată, având grij ă să nu se evapore colorantul (fig. 4.1.). O metod ă
modificat ă utilizeaz ă căldura și adiția unei solu ții apoase – Turgitol care
reduce tensiunea superficial ă dintre peretele celular și colorant.
După aplicarea primului colorant, resp ectiv a fucsinei toate celulele se
vor colora în ro șu.

Fig. 4.1. Colorarea la cald a frotiului
(sursa original)

Decolorarea
Se realizeaz ă cu un amestec de acid și alcool – acid clorhidric 3% și
alcool etilic 95%. Se vor deco lora toate celule cu excep ția celor rezistente la
amestecul de alcool-acid. Celulele care sunt rezistente la aceast ă decolorare
rămân în continuare colorate în ro șu.

40Recolorarea
Se realizeaz ă cu albastru de metilen. Se vor colora numai celulele care
au pierdut primul colorant. Acestea la microscop vor avea culoarea albastru
închis. Celulele acido rezistente vor avea culoarea ro șie (fig. 4.2.).

Fig . 4.2. Schema color ării Ziehl-Neelsen
(sursa original)

Aplicații practice

Se vor realiza frotiuri dup ă metoda diferen țială Ziehl-Neelsen.

Materiale necesare

– culturi microbiene de 24-48 ore. bacterii alcoolo-acido rezistente
bacterii ne alcoolo – neacido
rezistente

Colorare cu fucsin ă la cald
Decolorare cu acid alcool
Recolorarea cu albastru de
metilen

41Reactivi
– fucsină;
– amestec alcool-acid clorhidric;
– albastru de metilen sau verde de malachit ;
– ulei de imersie.

Echipamente
– bec de gaz;
– anse;
– lame de microscop;
– microscop.

Protocol de lucru

1. Etalarea – întinderea materialului micr obian pe lama de microscop.
2. Uscarea frotiului la temperatura camerei.
3. Colorarea primar ă – adăugarea unei pic ături de fucsin ă și
încălzirea lamei pe plit ă circa 10 secunde sau pe baie de ap ă la abur
circa 3-5 minute. 4. Spălarea cu apă de robinet pentru îndep ărtarea surplusului de
colorant. 5. Decolorarea cu alcool – acid.
6. Spălarea cu ap ă de robinet pentru a opri ac țiunea decolorantului.
7. Colorarea secundar ă – cu albastru de metilen sau verde de
malachit dou ă minute.
8. Spălare cu apă de robinet.
9. Uscarea frotiului.
10. Studiul
microscopic.

42Preparare reactivi

1. Colorant fucsin ă
Fucsin ă bazică – 0,3 g
Alcool etilic (95%) – 10,0 ml
Fenol (cristale topite la cald) – 5,0 ml
Fucsina bazic ă se dizolv ă în alcool, iar fenolul în ap ă. Cele dou ă
componente se amestec ă bine și se păstrează câteva zile dup ă care se filtreaz ă.
2. Decolorant alcool-acid:
Alcool etilic (95%) – 97, 0 ml
Acid clorhidric concentrat – 3,0 ml
3. Colorant albastru de metilen 0,3 g care se dizolv ă în 100, 0 ml de
apă distilată.

4.2. Colorarea sporilor

Principii

Celulele vegetative ale bacteriilor se dezvolt ă activ, își desfășoară
procesele metabolice și sunt capabile de diviziune.
In condi ții neprielnice de mediu, în special lipsa nutrien ților,
majoritatea celulelor vegetative mor. Unele bacterii în astfel de condi ții
formează endospori.
Endosporii sunt forme inactive sau metabolic inactive produ și de către
unele bacterii ca o st rategie de supravie țuiere în condi ții nefavorabile de
mediu. Sporii bacterieni sunt deosebit de rezisten ți la temperaturi ridicate, la

43radiațiile ultraviolete sau la ac țiunea substan țelor chimice, structura celular ă
având în compozi ție o protein ă rezistentă numită keratină.
Sub form ă de spori, bacteriile r ămân perioade foarte lungi de timp pân ă
când condi țiile devin favorabile și pot să germineze și să revină la starea
vegetativă.
Endosporii pot fi localiza ți în centrul celulei bacteriene ( central ), la
unul din polii celulei ( terminal ) sau între un pol și centrul celulei bacteriei
(subterminal ). Ca form ă pot fi sferici sau eliptici.
Dacă condițiile de mediu continu ă să fie neprielnice, endosporul este
eliberat din celula vegetativ ă care degenereaz ă și este pus în li bertate devenind
independent, respectiv endospor liber.
Când endosporii ajung în medii prielnice de cre ștere, vor trece în form ă
vegetativă, proces numit germinare . Formarea endosporilor nu reprezint ă un
proces de reproducere, constituie doar un proces de diferen țiere, care ofer ă
bacteriilor un mecanism de supravie țuire. Altfel spus, sporogeneza și
germinația nu reprezint ă mijlocul de înmul țire pentru bacterii, ci doar un
mecanism care asigur ă supraviețuirea celulei la toate condi țiile de mediu.
Endosporii se formeaz ă la bacteriile Gram pozitive, reprezentative
fiind cele aerobe din genul Bacillus (Bacillus subtilis , Bacillus megaterium ,
Bacillus cereus , Bacillus anthracis etc.) și anaerobe din genul Clostridium
(Clostridium butiricum , Clostridium tetani , Clostridium perfringens ,
Clostridium. botulinum etc.).

Caracteristici de baz ă ale endosporilor :
– endosporul este cea mai rezistent ă formă de viață cunoscut ă omului –
supraviețuiește temperaturilor înalte, usc ăciunii, radia țiilor și dezinfectan ților;
– când celulele vegetative mor, un endospor bacterian r ămâne liber
asigurând astfel pe rpetuarea speciei;

44- endosporul face parte dintr-un ciclu de via ță doar al bacteriilor care
formează spori și se formeaz ă în special datorit ă unor schimb ări ale mediului
nutrițional.

4.2.1. Eviden țierea sporului bacterian – metoda Schaeffer – Fulton

Principii

Schaeffer – Fulton în 1933 au propus o metod ă modificat ă de colorare
a sporilor, metod ă care este mai u șoară și mai rapid ă. Metoda ini țială de
evidențiere a sporilor a apar ținut lui Dorner și a fost publicat ă în anul 1922.
În protocolul de colorare dup ă metoda Schaeffer-Fulton, colorantul
primar este verdele de malachit. Pentru a facilita p ătrunderea colorantului în
corpul microbian se aplic ă colorarea la cald, deoarece verdele de malachit este
solubil în ap ă și are o afinitate sc ăzută pentru materialul celular.
După colorarea primar ă aplicată la cald, celula vegetativ ă și sporul au
culoarea verde.
Decolorarea . Endosporul bacterian odat ă colorat cu verde de malachit
nu va mai fi decolorat cu ap ă de robinet. Coloranu tl neavând o afinitiate
strânsă pentru celula vegetativ ă se va îndep ărta ușor prin sp ălarea cu ap ă de
robinet.
Recolorarea . Cel de-al doilea colorant utilizat este safranina, care va
colora doar celulele decolorate, respectiv celulele vegetative.
In câmpul microscopic pot fi observa te celulele vegetative de culoare
roșie și endosporii de culoare verde (fig. 4.3.).

45

Fig. 4.3. Eviden țierea sporilor bacterieni
(sursa original)

Materiale necesare

– culturi microbiene de Bacillus sau Clostridium.
Reactivi
– verde de malachit solu ție apoasă 0,5%;
– safranină;
– ulei de imersie;
Echipamente
– bec de gaz;
– anse;
– lame de microscop;
– microscop.
Preparare reactivi
Colorant verde de malachit solu ție apoasă 0,5%:
– 0,5 g de verde malachit
– 100 ml de ap ă distilată
Colorant safranin ă – soluție alcoolic ă 2,5% (solu ție stoc):
– 2,5 g de safranin ă
– 100 ml alcool etilic 95%

46Aplicații practice

Se vor realiza frotiuri din culturi de bacterii sporogene și se vor pune în
evidență sporii și locul lor de localizare.

Protocol de lucru

1. Etalarea materialului microbian.
2. Uscarea frotiului.
3. Fixarea.
4. Acoperirea frotiului cu solu ție de verde de malachit și încălzirea
pentru circa 2-3 minute, pân ă la apariția vaporilor. In tot acest timp,
se are grij ă să nu se evapore colorantul. Inc ălzirea frotiului se poate
face pe o plit ă.
5. Indepărtarea frotiului de pe plit ă, răcirea lui și apoi spălarea cu ap ă
de robinet.
6. Recolorarea cu safranin ă circa 30 secunde
7. Spălarea cu ap ă de robinet.
8. Uscarea lamei și studiul microscopic.
Observațiile se vor nota în tabel.

Culoarea sporilor Culoarea celulei vegetative Poziția sporului

47Capitolul V

5.1. Studierea caracterelor biochimice ale bacteriilor din sol

Principii

Caracterele biochimice pun în eviden ță echipamentul enzimatic al
bacteriilor, constituind factori importan ți în identificarea acestora.
Echipamentul enzimatic se pune în eviden ță prin reac ții sau teste biochimice
specifice.
Evidențierea activit ății enzimatice a bacteriilor se realizeaz ă prin două
categorii de metode mai uzuale.
a) Metode care urm ăresc în mod direct ac țiunea bacteriei asupra unui
substrat, caz în care se observ ă modificări fizice sau chimice ale acestuia (de
exemplu, lichefierea gelatinei, lichefierea serului coagulat, etc).
b) Metode prin care nu se observ ă în mod direct modificarea
substratului, dar se pun în eviden ță metaboli ții rezulta ți din scindarea
substratului în urma ac țiunii enzimelor bacteriene cu ajutorul diferi ților
reactivi.
Se consider ă că fiecare specie de bacterii ar e un set bine definit de
activități metabolice considerate amprente biochimice controlate de enzime.
Enzimele bacteriene pot fi grupate în dou ă categorii: enzime intracelulare sau
endoenzime și enzime extracelulare sau exoenzime.
Enzimele intracelulare funcționează în interiorul celulelor. Acestea
au ca principal ă responsabilitate sinteza noilor substan țe protoplasmatice și
producerea energiei celulare din substan țe simple care p ătrund prin membrana

48celulară. Endoenzimele sunt necesare pentru supravie țuirea celular ă și
asigurarea func ției de baz ă, respectiv a metabolismului celular. In urma
proceselor de metabolism produ șii sunt excreta ți de către celulă în mediu.
Analiza produ șilor finali poate duce la identificarea bacteriilor.
Enzimele extracelulare sunt se cretate de celulele bacteriene și
hidrolizeaz ă compuși cu greutate molecular ă mare sau substan țele complexe
de tipul proteinelo r, polizaharidelor și grăsimilor. Astfel, proteinele sunt
hidrolizate în aminoacizi, polizaharidele, cum ar fi amidonul, în oligozaharide,
iar grăsimile în trigliceride, glicerol și acizi gra și.
Capacitatea unei bacterii de a produce aceste enzime extracelulare este
o caracteristic ă specifică fiecărei specii și, prin urmare, constituie un criteriu
pentru identificarea bacteriilor.
Enzimele bacteriene care pot hidr oliza majoritatea proteinelor se
numesc proteaze . Dintre microorganismele care produc enzime proteazice
importanță prezintă bacteriile din genul Bacillus – Bacillus subtilis, Bacillus
amyloliquefaciens, Bacillus stearotermophyllus , Bacillus pumillus , fungii:
Aspergillus oryzae, Aspegillus flavus , Aspergillus niger, Rhyzopus oryzae sau
actinomicete – Streptomyces griseus, St reptomyces lichefaciens .
O schem ă simplificat ă a procedurilor experimentale legate de
activitatea enzimatic ă intracelular ă și extracelular ă a microorganismelor poate
fi redată astfel:

Enzime extracelulare :
– hidroliza amidonului
– hidroliza lipidelor
– hidroliza cazeinei
– hidroliza gelatinei

49Enzime intracelulare :
– fermentarea carbohidra ților
– reacția laptelui la turnesol
– producerea de hidrogen sulfurat
– reducerea nitra ților
– reacția catalazei
– testul ureazei
– testul oxidazei
– testul de eviden țiere a indolului
– reacția la roșu de metil
– reacția Voges-Proskauer
– testul de asimilare a citratului de sodiu

Pentru studierea activit ății biochimice ale microorganismelor se
preapară medii de cultur ă specifice care con țin diveși compuși sau reactivi
care prin reac ții cantitative sau calita tive vor pune în eviden ță activitatea
enzimatic ă.
Metodele clasice presupun prepararea a diferite tipuri de medii, în
funcție de testul biochimic urm ărit. Mediile se îns ămânțează cu
microorganismele de analizat, iar apoi se fac interpret ările rezultatelor, fie
direct prin observare cu ochiul liber, fie se adaug ă diverși reactivi.
O metod ă modernă care are și o serie de avantaje const ă în utilizarea
sistemelor multitest de identificare, cum este sistemul API pentru bacterii,
fungi și stafilococi (API 20E, API 20C, API Staph-Ident System) și BIOLOG.
Comparativ cu metodele clasice, utilizarea sistemelor multitest de
identificare prezint ă o serie de avantaje, dintre care amintim:
– obținerea rezultatelor într -un timp fo arte scurt, în unele cazuri chiar
într-un interval de 5 ore;

50 – uniformitatea rezultatelor;
– precizia/siguran ța rezultatelor;
– simplitatea tehnicilor de lucru;
– un consum minim de materiale și medii de cultur ă.

Galeriile API sunt individualizate fi e pentru identificarea bacteriilor
Gram pozitive, fie pentru cele Gram negati ve sau pentru drojd ii. Galeriile sunt
constituite din 12-20 de microtuburi care con țin substraturi deshidratate și
permit realizarea a 12 sau 20 de test e de identificare. Microtuburile se
inoculeaz ă cu suspensia bacterian ă care va fi testat ă și se pun la incubat. Dup ă
termostatare se citesc micr otuburile, activitatea metabolic ă fiind eviden țiată
direct prin modific ări de culoare, fie indirect prin ad ăugarea unor reactivi (fig.
5.1.).

Fig. 5.1. Galerii API 20E

Activitatea metabolic ă se interpreteaz ă conform tabelului de citire, iar
identificarea speciilor se ob ține din Indexul profilulu i analitic sau utilizând
software-ul de identificare.

51Cu ajutorul sistemului de gale rii API 20 NE se pot determina
următoarele reac ții biochimice ale bacteriilor:
– reducerea nitra ților la nitri ți și reducerea nitra ților la nitrogen (NO 3)
– producerea indolului (TRP)
– fermenta ția glucozei (GLU )
– hidroliza argininei (ADH)
– hidroliza ureazei (URE)
– hidroliza esculinei ( β – glucozidazei) (ESC)
– hidroliza gelatinei (GEL)
– para – nitro – fenil – β – D – galactopiranozid (PNPG)
– asimilația glucozei (GLU)
– asimilația arabinozei (ARA)
– asimilația manozei (MNE)
– asimilația manitolului (MAN)
– asimilația N-aceti-glucozaminei (NAG)
– asimilația maltozei (MAL)
– asimilația gluconatului de potasiu (GNT)
– asimilația acidului capric (CAP)
– asimilația acidului adipic (ADI)
– asimilația acidului malic (MLT)
– asimilația citratului de trisodiu (CIT)
– asimilația acidului fenilacetic (PAC)
– testul oxidazei (OX). Testele conven ționale sunt inoculate cu o suspensie bacterian ă
preparată în soluție salină, care reconstituie mediul de cultur ă.

Pentru exemplificarea utiliz ării testelor de tip Api vom prezenta cele
două etape care se parcurg pentru a put ea identifica microorganismul studiat.

52Etapa I – Inocularea

– izolarea în cultur ă pură a microorganismului de testat;
– se realizeaz ă colorația Gram și testul oxidazei pentru a confirma faptul
că microorganismul testat este Gram-negativ și oxidază-negativ;
– se noteaz ă pe testul API num ărul microorganismului de testat și
numele lucr ătorului care efectueaz ă identificarea;
– toate opera țiile ulterioare se efectueaz ă respectându-se condi țiile de
manipulare aseptic ă, pentru a preveni contaminarea cu germeni din aer
sau de pe masa de lucru;
– se selecteaz ă o colonie microbian ă, care este transferat ă într-o solu ție
de 0,85% NaCl (ser fiziologic);
– soluția de ser fiziologic inoculat ă este bine omogenizat ă cu ajutorul
unui agitator tip Vortex;
– dispersarea solu ției de ser fiziologic inocul at în cele 20 de alveole ale
galeriei API, folosind o pipet ă Pasteur steril ă;
– se umplu par țial compartimentele notate: ADH, LDC, ODC, H 2S și
URE (aceste compartimente sunt subliniate);
– se umplu complet compartimentele CIT, VP și GEL (aceste
compartimente fiind marcate);
– se adaugă cu o alt ă pipetă Pasteur ulei mineral steril la suprafa ța
lichidului din compartimentele ADH, LDC, ODC, H 2S și URE, pentru
a asigura condi ții de anaerobioz ă.
– se acoper ă cu un capac din plas tic testul API 20E și se incubeaz ă la
termostat, la 370C, pentru 18-24 de ore.

53Etapa II – analiza rezultatelor

– citirea rezultatului din compartimentul GLU: dac ă rezultatul este
negativ (dup ă incubare 18-24 de ore), atunc i microorganismul testat nu
aparține familiei Enterobacteriaceae și pentru identificarea lui este
necesară o perioad ă suplimentar ă de incubare; dac ă testul GLU este
pozitiv (galben) și apar mai mult de trei reac ții pozitive pe plac ă atunci
testul se va continua;
– adaos de reactivi: în godeurile TDA (clorur ă ferică 10%), VP (solu ție
Barritt A sau B), IND (reactiv Kovacs) și GLU (pentru a observa
prezența bulelor de gaz care indic ă reducerea azotitului (NO 2-) și
formarea azotului gazos (N 2);
– în compartimentele MAN, INO și SOR se adaug ă câte o pic ătură de
peroxid de hidrogen (ap ă oxigenat ă) și se citește rezultatul dup ă 2
minute: reac ție pozitiv ă, care confirm ă producerea de catalaz ă (apar
bule) sau reac ție negativ ă. Cele mai bune rezultate vor fi ob ținute în
cazul în care nu s-a produs gaz prin fermenta ție.

Evaluarea final ă a testului presupune înregist rarea tuturor rezultatelor
și stabilirea unui num ăr caracteristic format din 7 cifre.
Pe foaia de observa ție testele sunt grupate câte trei, rezultând astfel 7
grupe. Pe baza consult ări foii de observa ție pentru fiecare test se noteaz ă
rezultatul cu
+ sau – (fig. 5.2.) .

54

Fig. 5.2. Identificarea microorganismelor cu ajutorul galeriilor API 20E
Sistemul BIOLOG este o variant ă mai sofisticat ă a sistemului API și
se bazeaz ă pe utilizarea unor micropl ăci cu 96 de godeuri înc ărcate cu o gam ă
variată de surse de carbon, astfel c ă prin inocularea cu o cultur ă pură de
microorganisme se ob ține o amprent ă specifică.
După incubare, se analizeaz ă micropl ăcile, iar rezultatele sunt
introduse într-un program care le va compara cu baza de date ale sistemului, astfel ca în final se va ajunge la iden tificarea microorganismului testat (fig.
5.3.).

Rezultatele ob ținute din fi șa de
identificare – cod din 7 cifre

55

Fig. 5.3. Sistem automat de id entificare microorganisme

5.1.1. Eviden țierea propriet ăților bacteriilor de a degrada glucide

Principii

Majoritatea microorganismelor î și obțin energia necesar ă printr-o serie
de reacții biochimice ordonate și integrate care cons tau în biooxidarea unui
substrat, cel mai adesea reprezentat de glucide. Microorganismele folosesc carbohidra ții în moduri diferite, în func ție de echipamentul lor enzimatic.
Astfel, unele microorganisme sunt capabile s ă fermenteze zaharurile (de
exemplu glucoza) numai în condi ții anaerobe sau numai aerobe. Bacteriile
facultativ anaerobe au activitate enzimatic ă atât în condi ții aerobe cât și

56anaerobe, iar altele neavând echipamentul enzimatic necesar nu au capacitatea
de a oxida glucoza. Pentru punerea în eviden ță a propiet ății bacteriilor de a descompune
glucidele se prepar ă medii de cultur ă lichide sau solide la care se adaug ă
glucide și un indicator al reac ției mediului. In urma descompunerii glucidelor
se formeaz ă acizi, gaze, aldehide și alcooli.
Un mediu uzual folosit pentru acest test este apa peptonat ă la care se
adaugă diferite tipuri de zah aruri. Testarea capacit ății bacteriilor de a degrada
carbohidra ții se poate demonstra prin utilizarea unor solu ții de monoglucide
sau poliglucide în concentra ții de 0,5-1%. Astfel, pot fi utilizate urm ătoarele
zaharuri:
– monozaharide: glucoza, fructoza, manoza, galactoza, arabinoza,
xiloza, ramnoza;
– dizaharide: zaharoza, maltoza, lactoza;
– trizaharide: rafinoza;
– polizaharide: amidon, inulin ă, glicogen;
– alcooli polihidroxilici: manitol, dulcitol, sorbitol, inozitol.
Punerea în eviden ță a activit ății metabolice se face cu ajutorul unui
indicator de pH. Acesta poate fi ro șu de fenol sau albastru de bromtimol.
Indicatorul ro șu de fenol are culoare ro șie la pH de 7 și își schimbă culoarea în
galben la un pH acid sub 6,8.
Albastrul de bromtimol are o culoare albastr ă la pH 7 și galbenă în
mediu acid (fig. 5.4.)
.

57

Fig. 5.4. Metabolizarea zaha rurilor (indicator albastru de bromtimol)
(sursa original)

Materiale necesare

– mediu de cultur ă apă peptonată
– soluții de glucide 10%: glucoz ă, zaharoză și fructoză
– indicator de pH – albastru de bromtimol sau ro șu de fenol
– culturi bacteriene izolate di n experimentele anterioare

Aplicații practice

Prepararea mediului ap ă peptonat ă:

– în 700 ml ap ă distilată se dizolv ă, la cald, 10,0 – 20,0 g pepton ă și
5,0 g de NaCl. Dup ă completa dizolavare se ajusteaz ă volumul
final la 1000 ml;

58- se ajusteaz ă pH-ul la 7,8 – 7,9;
– se repartizeaz ă în eprubete câte 9 ml de mediu de cultur ă;
– se sterilizeaz ă 20 de minute la 1210C.
Soluțiile de glucide se prepar ă în apă distilată, iar sterilizarea se va face
prin filtrare.
In condiții aseptice în fiecare eprubet ă se va introduce câte 1 ml din
soluția de glucide, realizând trei va riante, respectiv mediu de cultur ă cu
glucoză, un mediu nutritiv cu zaharoz ă și un mediu cu fructoz ă. Concentra ția
finală de glucid pentru fiecare variant ă de mediu de cultur ă va fi de 0,1%.
De asemenea se vor l ăsa câteva eprubete martor, care nu vor con ține
glucide.
Prepararea indicatorului de pH albastru de bromtimol de
concentra ție 0,04%:
– se dizolvă 0,1 g albastru de bromtimol în 8 ml hidroxid de sodiu
0,02 N și se completeaz ă apoi cu ap ă distilată până la 250 ml. Are
culoarea galben ă la pH 6 și albastră la pH 7,6.
Prepararea indicatorului de pH ro șu de fenol 0,04%:
– se dizolvă 0,1 g ro șu de fenol în 14,1 ml solu ție de hidroxid de
sodiu 0,02 N și se completeaz ă volumul final la 250 ml cu ap ă
distilată. Are culoarea galben ă la pH 6,8
și roșie la pH 7-8.
Se însămânțează eprubetele cu culturile bacteriene de testat și se pun la
incubat pentru 24-48 de or e la temperatura de 37
0C.
După incubare, în fiecare eprubet ă se adaug ă 0,5 ml indicator de pH,
fie albastru de bromtimol fie ro șu de fenol.

59In cazul în care în mediul de cultur ă s-a adăugat albastru de bromtimol
mediile cap ătă culoarea albastr ă. Virajul culorii în galben demonstreaz ă
metabolizarea zaharurilor ad ăugate cu formare de acizi.
Când se folose ște indicatorul ro șu de fenol mediul are ini țial culoarea
roșie, schimbarea culorii în galben demonstrând și în acest caz metabolizarea
zaharurilor.
In cazul în care reac ția se urm ărește mai mult timp, indicatorii se
adaugă în mediul de cultur ă înainte de sterilizarea mediului.
Rezultatele ob ținute se vor nota tabelar. In tabel se noteaz ă cu „+” când
proba este pozitiv ă sau cu „-” când proba este negativ ă. Dacă rezultatul nu este
foarte relevant se noteaz ă cu „+ -”.

Glucidul utilizat Cultura
microbian ă Glucoză Zaharoz ă Fructoz ă

605.1.2. Testul de hidroliz ă a amidonului – testul amilazei

Principii

Un alt test utilizat în identificarea microorganismelor este cel de
hidroliză al amidonului. Amidonul es te un polizaharid cu mas ă molecular ă
mare. Degradarea lui se realizeaz ă cu ajutorul unor en zime extracelulare
numite amilaze .
Pentru a demonstra activitatea hidrolitic ă a exoenzimelor se utilizeaz ă
un mediu nutritiv care va con ține amidon, acesta fiind sursa de polizaharide.
După dezvoltarea culturilor microbine pe mediu, detectarea activit ății
hidrolitice se eviden țiază prin prezen ța sau absen ța amidonului din mediul de
cultură. In prezen ța iodului, amidonul are o culoar e albastru violaceu, ceea ce
indică un test negativ. Dac ă în jurul coloniilor apare o zon ă clară, testul se
consideră pozitiv, deoarece indic ă faptul că microorganismele au hidrolizat
amidonul, acesta nemaifiind prezent în mediul de cultur ă (fig. 5.5).

Fig. 5.5. Testul de hidroliz ă al amidonului (plac ă de sus – test negativ,
placa de jos test pozitiv) (sursa original)

61Materiale necesare

– Mediul nutritiv cu amidon
– Soluție Lugol (7 g I 2 + 20 g KI, care se dizolv ă în 100 ml ap ă
distilată) sau solu ție saturată de iod (20 g I 2 + 100 ml alcool etilic de
500)
– Culturi bacteriene de testat
– Cutii Petri sterile Mediul nutritiv are urm ătoarea compozi ție (g/l):

Nr.
crt. Compoziția chimică Cantitate (g/l)
1 amidon 10,0
2 azotat de sodiu 2,0
3 fosfat dipotasic 0,5
4 sulfat de magneziu 0,5
5 sulfat de fier 0,01
6 agar 12,0
7 apă distilată Completare pentru 1000 ml

Mediul se sterilizeaz ă prin autoclavare la 1210C, timp de 20 de minute.

Aplicații practice

Se lichefiaz ă mediul pe baia de ap ă și se răcește apoi la circa 600 C. Se
toarnă în cutii Petri. Dup ă solidificare, se îns ămânțează cu bacteriile de
studiat. Incubarea se face la 280 C sau 370 C, timp de 48 ore. Dup ă dezvoltarea

62culturilor, suprafa ța mediului se acoper ă cu soluție Lugol sau solu ție saturată
de iod.
Mediul se coloreaz ă în albastru violaceu, datorit ă prezenței amidonului
cu excepția zonelor de mediu din jurul coloni ilor bacteriene car e au hidrolizat
amidonul și care rămân necolorate. În aceste zone s-a produs hidroliza
amidonului sub ac țiunea amilazelor bacteriene secretate în mediu.
Se vor analiza pl ăcile cu culturile microbiene, iar rezultatele se vor
nota în tabel.

Cultura bacterian ă Culoarea mediului de
cultură Hidroliza amidonului
+ sau –

5.1.3. Testul de hidroliz ă a ureei

Principii

Enzima care este capabil ă de hidroliza ureei se nume ște urează.
Ureaza catalizeaz ă reacția de hidroliz ă a ureei la amoniac și dioxid de carbon.
Această enzimă este prezent ă la unele bacterii, dar este o enzim ă deosebit de
utilă pentru identificarea speciei Proteus vulgaris. Cu toate c ă și alte

63microorganisme produc ureaz ă, acțiunea acestei enzime asupra ureei este mult
mai lentă decât în cazul speciilor din genul Proteus , testul servind la
identificarea rapid ă a speciilor din acest gen.
Prezența ureazei va fi pus ă în eviden ță prin cultivarea
microorganismelor pe un mediu care con ține uree și un indicator de pH ro șu
de fenol. In cazul în care substratul este hidrolizat, respectiv se produce
amoniac, se va crea un mediu alcalin, iar în mediul de cultur ă se va produce un
viraj de culoare de la glaben pai la ro șu, caz în care testul se consider ă pozitiv
(fig. 5.6.).

Fig. 5.6. Testul pozitiv de hidroliz ă a ureei (sursa original)

Materiale necesare

– mediul de cultur ă Christensen
– soluție de uree 20% steril ă
– culturi bacteriene
– anse de îns ămânțare

64Prepararea mediului de cultur ă Christensen

Compozi ție (g/l):
– glucoză 1,0 g
– peptonă 1,0 g
– clorură de sodiu 5,0 g
– fosfat dipotasic 2,0 g
– roșu de fenol 0,012 g
– agar 12,0 g
– apă distilată 1000 ml
– pH-ul mediul se ajusteaz ă la 6,8-7.

Se cântăresc componentele și se dizolv ă în apă distilată. Ajustarea pH-
ului se va face înainte de ad ăugarea agarului.
După preparare mediul se repartizeaz ă în eprubete, câte 5 ml/eprubet ă
și se sterilizeaz ă prin autoclavare la 1150C timp de 15 minute. Dup ă
autoclavare și răcirea mediului la circa 500C se adaug ă în fiecare eprubet ă câte
0,2 ml de solu ție de uree 20%. Se vor folosi pipete sterile și se va lucra în
condiții aseptice.
Eprubetele se las ă să se răcească în poziție oblică. Mediul are culoarea
alb-gălbuie datorit ă pH-ului de 6,8-7.
Se îns ămînțează eprubetele cu culturile bacteriene de testat, dup ă care
se pun la incubat la 280C sau 370C pentru 24-48 de ore.
Dup ă incubare se urm ărește schimbarea culorii mediului nutritiv. Dac ă
bacteria a produs hidroliza ureei mediul se coloreaz ă în roșu, mediul devenind
alcalin ca urmare a producerii amoniacului.
Rezultatele se vor trece în tabel.

65Cultura bacterian ă Culoarea mediului de
cultură Hidroliza ureei
+ sau –

5.1.4. Eviden țierea produ șilor rezulta ți din descompunerea aminoacizilor
Evidențierea indolului

Principii
Triptofanul este un aminoacid esen țial, care prin intermediul activit ății
enzimatice a unor bacterii poate fi oxidat la indol. Conversia triptofanului în
produsul metabolic indol este mediat ă de enzima numit ă triptofanaz ă.
Capacitatea de a hidroliza triptofa nul cu producere de indol nu este o
caracteristic ă a tuturor microorganismelor, ca at are acest test este considerat
un marcher biochimic.

66Formarea indolului se pune în eviden ță cu ajutorul reactivului Kovacs.
Acest reactiv are culoare galben ă și constă într-o solu ție de 5% p-dimetil-
amino-benzaldehid ă, butanol și acid clorhidric. Reactivul reac ționând cu
indolul va determina apari ția culorii ro șii la suprafa ța eprubetei, sub forma
unui inel, numit inelul indolic . Absența colorației demonstreaz ă că triptofanul
din substrat nu a fo st hidrolizat, reac ția considerându-se negativ ă (fig. 5.7.).

Fig. 5.7. Test negativ producere indol (sursa original)
Acest test este utilizat îndeos ebi pentru identificarea bacteriei
Escherichia coli .
Pentru punerea în eviden ță a capacit ății microorganismelor de a
hidroliza triptofanul se prepar ă medii de cultur ă care conțin triptofan, cum este
de exemplul mediul agar nutritiv sau SIM.

Materiale necesare
– Mediu de cultur ă: agar nutritiv sau SIM

67- Reactiv Kovacs
– Culturi bacteriene

Aplicații practice

Prepararea mediului de cultur ă agar nutritiv sau SIM agar

Având în vedere c ă a fost prezentat ă anterior compozi ția chimic ă a
mediului agar nutritiv, vom prezenta doar compozi ția mediul SIM. Pentru
acest test se vor folosi medii lichide, deci nu se va ad ăuga agar.
Mediul de cultur ă SIM are urm ătoarea compozi ție (g/l):

– pepton ă 30,0 g
– extract de carne 3,0 g – sulfat feros de amoniu 0,2 g
– tiosulfat de sodiu 0,0025 g

– Se dizolv ă ingredientele în ap ă distilată și se regleaz ă pH-ul la 7,3.
– Se repartizeaz ă mediul în eprubete câte 10 ml/eprubet ă și se
sterilizeaz ă prin autoclavare la 121
0C, timp de 20 de minute.
– Dup ă autoclavare, se îns ămânțează fiecare eprubet ă prin recoltarea
unei singure colonii microbiene cu ajutorul ansei sterile.
– Se incubeaz ă la 370C, timp de 2-3 zile.
Pentru eviden țierea form ării indolului în fiecare eprubet ă se vor ad ăuga
10 picături de reactiv Kovacs și se agită ușor. Se las ă în repaus circa 5-10
minute dup ă care se va observa schimbarea de culoare.

68 Formarea inelului de culoare ro șie indică un test pozitiv, în timp ce
neschimbarea culorii va fi considerat test negativ.
Datele se vor trece în tabel.

Cultura bacterian ă Culoarea mediului de
cultură Hidroliza triptofanului
+ sau –

5.1.5. Eviden țierea producerii de H 2S

Principii

Determinarea capacit ății microorganismelor de a produce hidrogen
sulfurat se poate realiza u tilizând un substat care con ține aminoacizi cu sulf,
cum sunt cisteina, cistina sau metionina. Exist ă două căi fermentative majore prin care unele microroganisme
sunt capabile s ă producă hidrogen sulfurat.
O prim ă cale const ă în reducerea sau hidroge narea sulfului organic
prezent în aminoacidul cistein ă, acesta g ăsindu-se în compozi ția peptonei din

69mediul de cultur ă. Peptona este degradat ă de enzimele microbiene la
aminoacizi cu sulf. Cea de a doua cale de ob ținere a hidrogenului sulfurat const ă în
reducerea compu șilor anorganici cu su lf cum sunt tiosulfa ții, sulfații sau
sulfiții. In acest sens se utilizeaz ă medii de cultur ă care au în compozi ție un
astfel de compus anorganic, compus pe care unele microorganisme vor avea
abilitatea s ă-l transforme și să pună în libertate hidr ogenul sulfurat.

Evidențierea producerii de H
2S se poate realiza pr in mai multe metode:
¾ Metoda cultiv ării pe mediu cu acetat de plumb
¾ Metoda benzilor cu acetat de plumb
¾ Metoda de identificare multitest TSI (Triple sugar, iron – triplu
zaharat, fier)

I. In cazul metodei de cultivare pe mediu cu acetat de plumb se
utilizează în general, mediul solid nutritiv geloz ă simplă, care con ține bulion
de carne la care se adaug ă acetat de plumb 1%. Mediul se repartizeaz ă în
plăci Petri sau eprubete unde se las ă să se solidifice în pozi ție oblică.
Insămânțarea bacteriilor de studiat se face la suprafa ța mediului. Dup ă
incubare la 28-300C timp de 48 de ore se analizeaz ă culturile. Dac ă bacteria
are capacitatea s ă producă hidrogen sulfurat atunci în jurul coloniilor apare o
zonă neagră datorită sulfatului de plumb format.
II. Pentru metoda benzilor cu acetat de plumb se poate utiliza mediul
nutritiv bulion lichid. Acesta se repartizeaz ă în eprubete, se sterilizeaz ă după
care se face îns ămânțarea cu bacteriile de te stat. In fiecare eprubet ă se
introduce în condi ții sterile o band ă de hârtie impregnat ă cu soluție de acetat
de plumb 10%. Se are grij ă ca banda de hârtie s ă fie la suprafa ța mediului de

70cultură. Formarea hidrogenului sulfurat este indicat ă de înnegrirea benzii de
hârtie.
III. Metoda de cultivare pe mediul multitest TSI permite eviden țierea
concomitent ă a ferment ării glucozei, a la ctozei, zaharozei și a producerii
hidrogenului sulfurat. Mediul TSI con ține trei zaharuri, respectiv glucoz ă, lactoză și zaharoză
precum și o sursă de sulf, pentru eviden țierea hidrogenului sulfurat și un
indicator de pH.
După preparare și sterilizare, mediul se solidific ă în poziție înclinat ă
astfel încât s ă rămână în partea inferioar ă a eprubetei o por țiune de circa 1-2
cm neînclinat ă. Insămânțarea se face prin în țepare în por țiunea dreapt ă și prin
trasarea de striuri în zona de pant ă.
In zona de agar înclinat se va diferen ția fermentarea lactozei și
zaharozei, în timp ce fermentarea glucozei se va observa în por țiunea de agar
drept. Acest mediu con ține de zece ori mai pu țină glucoză decât zaharoz ă și
lactoză și prin urmare metaboli
ții acizi rezulta ți din degradarea zaharurilor, vor
fi cantitativ, corespunz ători. De asemenea, glucoza va fi degradat ă în absența
oxigenului, cu formare de cataboli ți acizi, în timp ce celelalte dou ă zaharuri
vor fi transformate în prezen ța oxigenului.
In interpretarea rezultatelor se va urm ări hidroliza glucozei, a zaharozei
și lactozei, precum și punerea în eviden ță a hidrogenului sulfurat.
Interpretarea presupune analiza urm ătoarelor caracteristici:
– fermentarea glucozei este considerat ă pozitivă dacă în zona de agar
drept are loc virajul culorii roz ini țiale a mediului în galben. De
asemenea se poate observa și producerea de gaze, bulele fiind
vizibile;

71- dacă bacteriile nu degradeaz ă glucoza, mediul î și menține culoarea
roz, bacteriile fiind considerae glucozo – nefermentative ;
– fermentarea lactozei se consider ă pozitivă dacă în zona de agar în
pantă culoarea vireaz ă spre galben;
– producerea hidrogenului su lfurat se va eviden ția prin apari ția unor
zone negre atât în z ona de agar drept cât și în pantă;
– bacteriile lactozo – pozitive (+), degradeaz ă lactoza cu producere
de cataboli ți acizi, scade pH- ul mediului și are loc virarea culorii
de la roz la galben;
– bacteriile lactozo – negative (-) nu degradeaz ă lactoza din mediu,
panta ramâne roz;
– formarea hidrogenului sulfurat const ă în apariția unor zone negre în
jurul culturilor microbiene, în ambele zone de mediu.

Pentru experien țele practice de laborator vom aplica metoda multitest
TSI.
Materiale necesare

– Reactivi pentru prepararea mediul de cultur ă TSI sau mediu gata
preparat deshidratat
– Culturi bacteriene – Eprubete – Pipete sterile – Anse – Ace de îns ămânțat
– Bec de gaz

72Aplicații practice

Se va prepara mediul de cultur ă TSI.

Compoziția chimică a mediului TSI este urm ătoarea (g/l):

– extract de carne 3,0 g
– extract de drojdie 3,0 g
– peptonă 15, 0 g
– lactoză 10,0 g
– glucoză 1,0 g
– zaharoză 10,0 g
– sulfat de fier 0,2 g
– clorură de sodiu 5,0 g
– tiosulfat de sodiu 0,3 g
– roșu de fenol 0,024 g (indicator de pH)
– agar 12,0 g
pH-ul mediului se stabile ște la 7,4.

Mediul se repartizeaz ă în eprubete (7 ml/eprubet ă) după care se
sterilizeaz ă prin autoclavare la 1150C timp de 15 minute. Dup ă sterilizare,
mediul se lichefiaz ă și se lasă la răcit, asigurând o zon ă de circa 1-2 ml de agar
drept și restul zonei în pozi ție înclinat ă. Mediul are o culoare roz datorit ă pH-
ului de 7,4.
Se îns ămânțează cu bacteriile de analizat. In zona de agar drept se va
face însămânțarea prin în țepare, iar în zona de agar în pant ă se vor trasa striuri
la suprafa ța mediului cu ajutorul ansei.

73Eprubetele se pun la incubat în termostat la temperatura de 280C timp
de 1-3 zile, dup ă care se trece la in terpretarea datelor și notarea în tabel.

Cultura
bacteriană Hidroliza
glucozei
+ sau – Hidroliza
zaharozei
+ sau – Hidroliza
lactozei
+ sau – Producerea
H2S
+ sau – Producerea
de gaze

5.1.6. Descompunerea celulozei

Principii
Celuloza este un carbohidrat prezent în cantitate mare în resturile
vegetale sau materia organic ă din natur ă. Când celuloza este asociat ă cu xilanii
sau mananii este supus ă descompunerii rapide, în schimb când este asociat ă cu
lignina rata de descom punere este foarte lent ă. Descompunerea celulozei are
loc în dou ă etape:
– în prima etap ă celulaza se descompune în celobioză și apoi în glucoz ă
prin procesul de hidroliz ă în prezen ța enzimelor celulaz ă și celobiaz ă;
– a doua etap ă constă în oxidarea glucozei și transformarea ei în bioxid
de carbon și apă.

74Produsele intermediare formate și eliberate în timpul hidrolizei
enzimatice a celulozei sunt uti lizate de microorganisme ca surs ă de energie
pentru procesele biosinteti ce. Microorganismele celulo litice responsabile de
degradarea celulozei sunt reprezentate de bacterii, fungi și actinomicete.
Pentru a pune în eviden ță capacitatea unor mi croorganisme de a
degrada celuloza se pot aplica mai multe metode.

Metoda 1 – degradarea hârtiei de filtru

Hârtia de filtru utilizat ă este constituit ă aprope în totalitate din
celuloză. Degradarea acestui substrat care con ține celuloz ă cristalină și amorfă
indică procesul de celuloliz ă, deși acțiune enzimatic ă este mult mai complex ă
și nu poate fi determinat ă doar activitatea celulazic ă.
In acest sens se va utiliza un mediu nutritiv care con ține ca surs ă de
energie celuloza din benzile de hârtie de filtru. Hârtia de f iltru se va introduce
în condiții sterile în eprubetele îns ămânțate cu microorganisme. Dup ă incubare
se urmărește degradarea hârtiei de filtru de c ătre microorganismele celulolitice
mezofile aerobe.

Materiale necesare

– probe de sol
– eprubete
– benzi de hârtie de filtru de 25 x 5 mm
– soluție de eritrozin ă fenicată
– soluție apoasă de cristal violet 0,1%
– mediu nutritiv

75Aplicații practice

Se prepar ă mediul nutritiv pentru microor ganismele celulolitice care se
compune din (g/l):
– fosfat dipotasic 1,0 g
– azotat de sodiu 0,5 g
– sulfat de magneziu 0,5 g
– clorură de potasiu 0,5 g
– sulfat de fier 0,01 g
pH-ul mediului se stabile ște la 7,5. Mediul se repartizeaz ă în eprubete,
câte 9 ml/eprubet ă și apoi se introduce câte o band ă de hârtei de filtru. O
porțiune din banda de hârtie trebuie s ă fie la suprafa ța mediului de cultur ă.
Eprubetele se sterilizeaz ă la 121
0C timp de 20 de minute.
După sterilizare se îns ămânțează cu diluții de sol, volumul inoculului
fiind de 1 ml. Se vor l ăsa și eprubete martor care nu vor fi îns ămânțate.
Incubarea se va face pe o durat ă mai mare de timp, circa 10 zile, periodic
analizându-se cre șterea microorganismelor, modul de colorare a hârtiei și
regiunea unde apare dezintegrarea ei. Gradul de deteriorare a hîrtiei se va determina prin agitarea puternic ă a
fiecărei eprubete, stabilind stad iul de deteriorare a hârtiei. De asemenea, din
din porțiunile deteriorate ale hârtiei se vor prepara frotiuri, determinând tipul
de microorganisme și forma acestora.

76Metoda 2 – difuzia colorantului azur în mediu cu celuloz ă

Degradarea celulozei se va observa prin migrarea colorantului azur
celuloză în mediul de cultur ă.
Se va prepara mediul de cultur ă CBM care are urm ătoarea compozi ție
chimică (g/l):

– C 4HI2N206 (tartrat de diamoniu) 5,0 g
– KH 2P04 1,0 g
– MgS0 4· 7H 20 0,5 g
– extract de drojdie 0,1g – CaCl
2 .2H 20 0,001 g

Sau se poate prepara mediul cu urm ătoarea compozi ție (g/l):

– NH 4NO 3 – 2,0 g
– KCI – 2,0 g – KHPO
4 – 0,5 g
– MgSO 4.7H 2O – 1,0 g
– FeSO 4.7H 2O – 0,5 g
– celuloză – 0,01 g

Aplicații practice

Se vor prepara dou ă variante de mediu CBM notate cu a și respectiv cu
b. Diferența constă în faptul c ă la mediul b se va ad ăuga colorantul azuriu de
celuloză.
Se prepar ă mediul de cultur ă (a) CBM suplimentat cu 1,2% agar.

77Se transfer ă câte 10 ml în eprubete și se autoclaveaz ă.
Se prepar ă mediul b. CBM suplimentat cu 1% azuriu de celuloz ă și
1,2% agar. Se autoclaveaz ă și se răcește până devine vâscos.
In eprubetele cu mediul solid ificat (a) se introduce în condi ții aseptice
0,1 ml din mediul (b), realizând dou ă straturi.
Se inoculeaz ă cu microorganismele de testat, l ăsând și câteva eprubete
martor neinoculate.
Se incubeaz ă la 250C, la întuneric timp de 10 zile.
Migrarea colorantului în stratul inferior indic ă celuloliza substratului.

5.1.7. Determinarea activit ății catalazice a solului

Principii
Catalaza este o enzim ă prezentă în majoritatea bacteriilor. Aceast ă
enzimă are rolul de a cataliza descompune rea peroxidului de hidrogen (apa
oxigenată) în apă și oxigen. Apa oxigenat ă este toxic ă pentru celule, dar este
un produs secundar al unor reac ții metabolice care au loc în prezen ța apei și a
oxigenului. Principala func ție a catalazei const ă în prevenirea acumul ării la
niveluri toxice a peroxidului de hi drogen format ca produs secundar al
proceselor metabolice. Bacteri ile din genurile Streptococcus, Leuconostoc ,
Lactobacillus , Clostridium și Mycoplasma sunt considerate cu catalaz ă-
negativă.
In timpul respira ției aerobe microorganismele produc peroxid de
hidrogen și în unele cazuri un superoxid, extrem de to xic. Acumularea acestor
substanțe va duce la moartea organismului, cu excep ția cazului în care

78peroxizii pot fi degrada ți enzimatic. Organismele capabile s ă producă catalază
sau peroxidaz ă vor degrada rapid perhidrolul și vor supravie țui.
Producerea catalazei se poa te determina prin adi ția în substrat a apei
oxigenate. Dac ă catalaza este prezent ă, reacția chimic ă este indicat ă prin
formarea bulelor de gaz (oxigen liber). In acest caz, testul este considerat pozitiv în timp ce lipsa form ării bulelor constituie test ul negativ al catalazei.

Materiale necesare

– culturi microbiene
– mediul de cultur ă triptonă soia – agar (Tryptic Soy Agar
– TSA).
– soluție de 3% ap ă oxigenată.
Triptona este o peptid ă și constituie o surs ă de aminoacizi necesar ă
pentru cre șterea bacteriilor. Mediul con ține de asemenea, f ăină de soia și alte
substanțe azotate care vor constitui un mediu nutritiv pentru o mare varietate
de microorganisme. Glucoza reprezint ă sursa de energie, iar clorua de sodiu
are rolul de a men ține echilibrul osmotic, în timp ce fosfatul dipotasic
acționează ca tampon pentru men ținerea pH-ului mediului.

Aplicații practice

Se va prepara mediul de cultur ă cu tripton ă – soia agar (TSA).
Mediul TSA are urm ătoarea compozi ție (g/l):
– triptonă 17,0 g
– făină de soia 3,0 g
– NaCl 5,0 g – K
2HPO 4 2,5 g

79- glucoză 2,5 g
– agar 12,0 g
Peste culturile microbiene cultivate pe agar înclinat circa 24 de ore se
adaugă câteva pic ături de ap ă oxigenată. In cazul în care tulpina este catalazo-
pozitivă, se formeaz ă gaze care se acumuleaz ă sub forma de spum ă.
Rezultatele se vor nota în tabel.

Specia bacterian ă Prezența sau absen ța
bulelor de gaz Testul catalazei
(+) sau (-)

80Capitolul VI
Circuitul azotului

Principii

Creșterea și dezvoltarea microorganismelor în sol este limitat ă în
principal de sursa de energie. Plantele superioare, algele, dar și unele bacterii
pot utiliza ca surs ă de energie radia ția luminoas ă. Această capacitate se
datorează în principal pigmen ților asimilatori.
Majoritatea microorganismelor neavând astfel de pigmen ți utilizeaz ă
energia chimic ă înmagazinat ă în diferi ți compuși chimici. Dup ă sursa de
energie utilizat ă microorganismele se clasific ă în autotrofe, heterotrofe și
prototrofe.
Autotrofele fotosintetizante își procur ă energia necesar ă prin
fotosintez ă. Fotosinteza bacterian ă diferă de cea a plantelor, deoarece nu se
produce oxigen, neavând loc fotoliza ap ei, iar ca donator de hidrogen se
utilizează alte substan țe. Este cazul și bacteriilor nesulfuroase purpurii care
utilizează ca donator de hidrogen acizii gra și simpli și alcoolii. Aceste bacterii
fac trecerea de la autotr ofe la heterotrofe.
Autotrofele chimiotrofe își asigură energia necesar ă din surse simple
anorganice de carbon și azot cum ar fi bioxidul de carbon, amoniacul, nitri ții,
nitrații, hidrogenul suflurat , tiosulfatul etc.
Microorganismele heterotrofe își asigură energia prin oxidarea
compușilor organici. Compu șii utilizați sunt reprezenta ți de carbohidra ți

81(glucide, celuloze, hemi celuloze, lignine), gr ăsimi, acizi organici, compu și
azotați (proteine, aminoacizi).
Microorganismele prototrofe utilizeaz ă o sursă organică de carbon,
asemănător heterotrofelor, iar principala surs ă de azot este azotul molecular
din aer și uneori din amoniac, nitri ți și nitrați. Prototrofele alc ătuiesc grupul
fiziologic al bacteriilor fixatoare de azot, deosebit de importante în fertilizarea
solului.
Solul, consituie unul dintre cele mai importante medii naturale pentru
dezvoltarea unor popula ții mari și diverse de microorganisme. Se consider ă că
viața nu ar fi posibil ă în absența acestor microorganisme care populeaz ă solul.
Microflora este exen țială pentru degradarea substan țelor organice depozitate în
sol, cum ar fi resturile de țesuturi vegetale și animale. Prin hidroliza
enzimatic ă microbian ă a macromoleculelor se ob țin substan țe nutritive de baz ă
pe care plantelele le pot asimila, asigurându-se cre șterea și înmulțirea lor. La
rândul lor plantele vor servi ca surs ă de nutriție pentru animale. In acest fel
microorganismele joac ă un rol esen țial în circuitul materiei în natur ă,
incluzând circuitul carbonul ui, azotului, fosforului, pot asiului, calciului etc.
Având în vedere c ă circuitul azotului joac ă unul din rolurile cele mai
importante în circuitul materiei în natur ă vom face mai multe referi legate de
acest aspect (fig. 6.1.).
Circuitul azotului constă în transformarea sau conversia enzimatic ă a
compușilor azota ți din sol și a azotului molecular în compu și cu azot
anorganici care sunt utiliza ți de plantele superi oare pentru sinteza
macromoleculelor esen țiale cum sunt acizii nucleici și proteinele.
Circuitul azotului cuprinde urm ătoarele etape:
– amonificarea
– nitrificarea

82- denitrificarea
– fixarea simbiotic ă și nesimbiotic ă.

Amonificarea constă în procesul de mineralizare a substan țelor
organice cu azot, componente ale țesuturilor moarte (datorit ă microflorei
proteolitice și amonificatoare) și eliberarea azotului sub form ă de amoniac.
Procesul de amonificare a fost studiat la proteine, acizi nucleici, lipide
și glucide azot ate, creatin ă, acid hipuric, alcaloizi, uree etc.

Fig. 6.1. Schema circuitului azotului Azot organic
(N) Amonificare
Asimilatie Fixarea
azotului
Reducerea dezasimilatorie a azotului
NH 3 N2 Denitrificare
N2O NO 2-NO 3-
Nitrificare Nitrificare Reducerea asimilatorie a azotuoui
-3 0 +1 +3 +5
Numărulul de oxidare al azotului

83
Exoenzimele care transform ă compușii de natur ă proteică în
aminoacizi poart ă numele de proteaze . Acestea sunt eliberate în sol de
numeroase specii de bacterii, cum ar fi cele apar ținând genului Pseudomonas ,
Flavobacterium, Bacillus, Clostridium , Proteus , ca și de unele ciuperci din
genurile Trichoderma , Aspergillus, Penicillium, Mucor, Rhizopus ,
Streptomyces .
In urma proceselor de amonificare amoniacul și ionii de amoniu care
rezultă pot fi prelua ți și utilizați pentru sinteza aminoacizilor de c ătre alte
organisme (plante sau microor ganisme) sau sunt absorbi ți în sol și fixați de
complexele argilo-humice.
Azotul se g ăsește în plante și animale sub form ă de proteine. Cea mai
mare parte a azotului din sol se g ăsește sub form ă de molecule organice, în
special proteine care rezult ă din descompunerea plantelor și a țesuturilor
animale. Proteinele ajunse în sol sunt transformate de enzimele
microorganismelor, respectiv de pr oteaze, în polipeptide (peptone) și
aminoacizi. Grup ările amino din aminoacizi sunt eliberate prin procesul de
dezaminare și rezultă ammoniac (NH 3). In cele mai multe soluri amoniacul se
dizolvă în apă și se formeaz ă ionii de amoniu (NH 4+). Așadar, amonificarea
reprezintă procesul de formare a amoniacului din compu și organici. Procesul
de amonificare are loc și în cazul acizilor nucleici, a ureei și a acidului uric.

846.1. Determinarea puterii amonificatoare și nitrificatoare a solului

6.1.1. Determinarea puterii amonificatoare

In experien țele de laborator se poate dete rmina puterea amonificatoare
a solului, dar și capacitatea unor microorganisme de a hidroliza proteinele cu
producere de amoniac. Astfel vom realiza dou ă experimente.

Experimentul I – punerea în eviden ță a puterii amonificatoare a
solului
Principiul metodei const ă în determinarea cantit ății de amoniac care se
degajă prin activitatea microbian ă a solului. In acest sens, la sol se adaug ă
compuși organici cu azot, respectiv pepton ă și uree. Amoniacul care se degaj ă
este absorbit de o solu ție de acid sulfuric, de concentra ția 0,2 N.
Punerea în eviden ță a cantității de amoniac format ă se face prin titrarea
soluției de acid sulfuric cu solu ție de hidroxid de sodiu.

Materiale necesare

– sol la care se adaug ă compuși organici cu azot
– peptonă
– uree
– acid sulfuric 0,2 N
– hidroxid de sodiu 0,2 N
– roșu de metil
– 4 borcane de 800 ml/experiment
– 4 pahare Erlenmayer de 100 ml/experiment

85Aplicații practice

– Se cântăresc câte 50 g de sol formând trei variante:
varianta 1 – sol f ără adaus de compu și azotoși
varianta 2- sol cu 0,5 g pepton ă
varianta 3 – sol cu 0,25 g uree

– Se m ăsoară câte 20 ml de acid sulfuric 0,2 N și se introduc în patru
pahare Erlenmayer. In continuare se procedeaz ă în felul urm ător:
– se iau patru borcane de cir ca 800 ml care se pot închide etan ș și se
numeroteaz ă de la 1 la 4;
– în primul borcan se va introduce un pahar Erlenmayer cu 20 ml de acid sulfuric; – în cel de al doilea borcan se va pune solul și deasupra lui un alt pahar
Erlenmayer cu acid sulfuric; – în borcanul num ărul 3 se pune solul amestecat cu peptona și deasupra
vasul cu acid sulfuric; – în borcanul num ărul 4 se pune solul amestecat cu uree și apoi vasul
cu acid sulfuric; Borcanele se închid ermetic și se pun la incubat la 30
0 C timp de șapte
zile. Dup ă incubare, borcanele se scot din termostat. Din primul borcan se
scoate vasul Erlenmayer și se adaug ă 5 picături de ro șu de metil. Con ținutul
paharului cap ătă o culoare ro șie datorit ă acidului. In continuare se titreaz ă
conținutul paharului cu o solu ție NaOH 0,2 N pân ă la apariția culorii galben-
pai.

86 Se noteaz ă numărul de ml de NaOH consuma ți la neutralizarea
acidului din vas. In continuare, din borcane se scot toate paharele Erlenmayer și se face
titrarea, notându-se pentru fiecare can titatea de hidroxid de sodiu consumat ă.
In tabelul urm ător se va nota cantitatea de amoniac degajat ă în probele
experimentate, calculul f ăcându-se conform formulei:

P = (Q
1- Q n) x f x 3,406 mg NH 3, unde

P- reprezint ă cantitatea de amoniac degajat ă
Q1 – reprezint ă cantitatea de NaOH utilizat ă la titrarea vasului 1
Qn – reprezint ă cantitatea de NaOH utilizat ă la titrarea vaselor 2,3 și 4
f – este factorul solu ției de hidroxid de sodiu
3,406 mg NH 3 este echivalentului unui ml de hidroxid de sodiu.

Varianta Nr. ml NaOH 0,2 N
consumați la titrare Cantitatea de amoniac
degajată (mg/NH 3)
Fără sol
Numai cu sol
Sol + pepton ă
Sol + uree

Observații
Interpretarea rezultatelor ob ținute

87Experimentul II – capacitatea uno r microorganisme de a hidroliza
proteinele cu formare de amoniac

Pentru a demonstra capacitatea de a hi droliza proteinele cu formare de
amoniac, microorganismele vor fi cultivate pe medii de cultur ă care conțin o
sursă de azot organic. Dup ă incubarea culturilor, prezen ța amoniacului va fi
pusă în eviden ță cu ajutorul reactivului Nessler.

Materiale necesare

– Culturi microbiene
– Mediu de cultur ă: apă peptonată și mediu nuritiv cu uree
– reactiv Nessler
Aplicații practice

Pe mediul de cultur ă apă peptonat ă se inoculeaz ă bacteriile care
urmează să fie testate. Se eticheteaz ă fiecare eprubet ă și apoi se pun la incubat
la 28
0C timp de șapte zile. Pentru control se las ă 2-3 eprubete cu mediu
neinoculate.
Prezența amoniacului format se poate demonstra prin ad ăugarea în
eprubetă a 3-5 pic ături de reactiv Nessler. Reactivul Nessler este o solu ție
alcalina de tetraiodomercuriat de potasiu K 2(HgI 4).
Interpretarea rezultatel or, respectiv a cantit ății de amoniac care se
obține se face astfel:
– fără culoare – lipsa amoniacului
– culoare galben deschis – cantitate mic ă de amoniac, reac ție slab
pozitivă, se noteaz ă cu +

88- culoare portocalie – reac ție pozitiv ă, ceea ce denot ă formarea de
mai mult amoniac, se noteaz ă cu ++
– culoare brun ă și formarea unui preicipitat, reac ție puternic pozitiv ă
constând în formarea unor cantit ăți foarte mari de amoniac și se
notează cu +++.
Datele ob ținute se sintetizeaz ă în următorul tabel.

Formarea
amoniacului Mediu cu cultur ă microbian ă Mediu neinoculat

6.1.2. Determinarea puterii nitrificatoare a solului

Principii

Nitrificarea este un proces care se desf ășoară în două etape, atât din
punct de vedere chimic cât și biologic.
Prima etap ă constă în oxidarea amoniacului în nitrit (NO 2-), iar a
doua etap ă constă în oxidarea nitritului în nitrat (NO 3-). In condi ții aerobe,

89în sol sau în ap ă nu se acumuleaz ă amoniac. Amoniacul este asimilat de unele
bacterii care îl utilizeaz ă ca donor de electroni în diverse procese.
Aceste transform ări sunt realizate de bacterii chemolitoautotrofe din
genurile Nitrobacter , Nitrococcus , Nitrosococcus și Nitrosomonas , numite
bacterii nitrificatoare.
Procesul de nitrificare poate fi redat schematic astfel:

1. Formarea nitri ților
NH 4+ (ionul de amoniu) + O 2 __________ NO 2- (ionul nitrit) + H 2O
2. Formarea nitra ților
NO
2- (ionul nitrit) + O 2 ________________ NO 3- (ionul nitrat)

Oxidarea amoniacului (NH 3 în în acid azotos (HNO 2), respectiv nitrit
(NO2-) este realizat ă de nitritibacterii care sunt clasificate în patru genuri:
Nitrosomonas (N. europeae ), Nitrosospira (N. briensis ), Nitrosococcus (N.
nitrosus și N. oceanus ) și Nitrosolobus (N. multiformis ).
Oxidarea acidului azotos în acid azotic (HNO 3), respectiv formarea
nitraților (NO 3-) este realizat ă de nitratbacterii care apar țin la trei genuri:
Nitrobacter (N. winogradsky ), Nitrospina (N. gracilis ) și Nitrococcus (N.
mobilis ).
Nitriții pot fi prelua ți mai ușor de câtre plante decât amoniacul, cu toate
acestea, din cauza mobilit ății mai mari pot duce la deteriorarea calit ății solului
sau a apelor subfreatice. Azota ții eliberați în sol sunt foarte solubili și sunt
asimilați de plante și de către unele microorganisme pentru biosinteza
proteinelor celulare.

90Determinarea abilit ății unor microorganisme din sol de a oxida
amoniacul la acid nitros și apoi pe acesta la acid nitric este posibil ă în
laborator utilizând medii lichide, strict minerale, folosind metoda suspensiilor,
respectiv a dilu țiilor de sol.
Substratul îl constituie sulf atul de amoniu pentru eviden țierea
nitritbacteriilor și respectiv nitritul (azotit) de sodiu pentru eviden țierea
nitratbacteriilor. Analiza acidului nitros și respectiv a acidului nitric se
determină calitativ.
Mediul de cultur ă pentru nitrat bacterii va fi constituit dintr-o solu ție
salină Vinogradscki la care se adaug ă sulfatul de amoniu și nitritul de sodiu.
Soluția salină Vinogradski are urm ătoarea compozi ție (g/l):
– fosfat dipotasic 5,0 g
– sulfat de magneziu 2,5 g
– clorură de sodiu 2,5 g
– sulfat de fier 0,05 g
– sulfat de mangan 0,05 g.
După prepararea mediului acesta se sterilizeaz ă prin autoclavare la
121
0C timp de 20 de minute.
Această soluție va fi folosit ă atât pentru nitritbacterii cât și pentru
nitratbacterii.
Pentru nitritbacterii mediul final va avea urm ătoarea compozi ție
(cantități pentru prepararea unui litru de mediu):
– 100 ml solu ție salină Vinogradski 1:20
– sulfat de amoniu 0,05 g – carbonat de calciu 0,1 g

91Mediul se va repartiza în eprubete (câte 2ml/eprubet ă), urmând
sterilizarea la 1150C timp de 15 minute.
Mediul pentru nitratbacterii are umătoare formul ă:
– 100 ml solu ție salină Vinogradski 1:20
– nitrit (azotit) de sodiu 0,1g
– carbonat de calciu 0,1 g Mediul se va repartiza în eprubete, câte 2 ml și se sterilizeaz ă la fel ca
mediul pentru nitritbacterii.

Materiale necesare

– mediu de cultur ă pentru nitritbacterii
– mediu de cultur ă pentru nitratbacterii
– acid sulfuric concentrat
– reactiv cu difenilamin ă
– reactiv Trommsdorf
– pulbere de uree
– termostat

Aplicații practice
Testul 1. Analiza calitativ ă pentru nitritbacterii

Pentru a demonstra procesul de nitrificare, mediile de cultur ă se
inoculeaz ă cu diluții de sol, cantitatea de inocul fiind de 0,1 ml. Probele se pun

92la incubat timp de o s ăptămână după care se testeaz ă producerea nitri ților și a
nitraților.
Formarea nitri ților din amoniac se va pune în eviden ță cu reactivul
difenilamin ă. In acest sens, în fiecare eprubet ă inoculată se adaug ă 1 ml acid
sulfuric concentrat și 1 ml de reactiv cu difenilamin ă.
Pentru controlul reac ției, într-o eprubet ă se pun 3 ml de ap ă distilată la
care se adaug ă 1 ml de acid sulfuric concentrat și unul de reactiv cu
difenilamin ă. Nu trebuie s ă apară colorația albastră.
In prezen ța nitraților și nitriților va apare o colora ție albastr ă.
Intensitatea colora ției se apreciaz ă cu semnul „+” astfel:
– fără culoare – negativ
– albastru pal +
– albastru ++
– albastru închis +++.
Rezultatele ob ținute prin compararea probelor inoculate cu controlul
vor fi trecute în tabel.

Formarea
nitriților Mediu cu cultur ă microbian ă Mediu neinoculat

93
Pentru testarea prezen ței nitriților se poate utiliza și reactivul
Trommsdorf cu acid sulfuric.
Reactivul Trommsdorf se prepar ă astfel:

– se adaug ă încet 100 ml de solu ție apoasă 20% de clorur ă de zinc într-
un amestec de 4 g de amidon în ap ă. Se încălzește până când amidonul se
dizolvă cât de mult posibil, iar solu ția este aproape limpede. Se dilueaz ă cu o
mică cantitate de ap ă și se adaug ă 2 g de iodur ă de potasiu. Se dilueaz ă până la
1000 ml, se filtreaz ă și se păstrează într-o sticl ă brună.
Reacția se consider ă pozitivă dacă apare o colora ție albastru închis,
ceea ce indic ă prezența nitriților.

Testul 2. Analiza calitativ ă pentru nitratbacterii

Testul const ă în eviden țierea ionilor de nitra ți care se formeaz ă din
nitri
ți. Pentru a elimina reac ția dată de nitriții reziduali neoxida ți se va utiliza
ureea. Astfel, în fiecare eprubet ă se adugă o mică cantitate de uree, se agit ă
puternic și apoi se adaug ă 1 ml de acid sulfuric concentrat și unul de reactiv de
difenilamin ă. Testul se consider ă pozitiv dac ă apare colora ția albastr ă.
Intensitatea culorii este direct propor țională cu cantitatea nitra ților forma ți.
Rezultatele se trec în urm ătorul tabel.

94
Formarea
nitraților Mediu cu cultur ă microbian ă Mediu neinoculat

6.1.3. Determinarea puterii denitrificatoare a solului

Principii

Denitrificarea , în sens larg, reprezint ă toate procesele de reducere a
nitraților (NO 3-). Aceste procese constau în:
Reducerea asimilatorie a nitri ților până la N organic, realizat ă de un
număr mare de microorganisme, plante superioare și microorganisme care
utilizează NO3- ca sursă de azot.
Reducerea dezasimilatorie a nitra ților prin niri ți, când ace știa (NO 2)
servesc ca acceptori finali de electroni în locul O 2 și care poate consta în:
– reducerea nitra ților la nitri ți efectuată de 85% din bacteriile
chemoheterotrofe din sol, majoritatea actinomicetelor și unele
ciuperci.
– reducerea nitra ților la amoniac este realizat ă de aproape 45% din
bacteriile chemoheterotrofe din sol.

95In sens restrictiv denitrificarea reprezint ă procesul de reducere a
nitraților și nitriților la formele gazoase de azot, respectiv oxid de azot, dioxid
de azot și azot molecular (NO 2, N2O, N2).
Denitrificarea este un proces anae rob realizat de ba cterii heterotrofe
care au capacitatea de a reduce nitra ții din substan țe organice cu ajutorul
hidrogenului. Bacter iile care realizeaz ă procesul de denitirificare apar țin
genurilor Alcaligenes , Bacillus , Paracoccus , Pseudomonas . Specii intens
denitrificatoare sunt Pseudomonas denitrificans și Pseudomonas. Stutzari .
În procesul denitrific ării pot fi implicate și bacteriile obligat autotrofe,
ca de exemplu Thiobacillus denitrificans , care nu sunt obligat denitrificatoare.

Materiale necesare

– diluții de sol
– medii de cultur ă cu nitrat
– tubușoare Durham

Aplicații practice

Pentru a demonstra procesul de denitrificare vom inocula dilu țiile de
sol pe mediul de cultur ă utilizat și la testul pentru nitrat, repectiv mediul care
are următoarea compozi ție:
– 100 ml solu ție salină Vinogradski 1:20
– nitrit (azotit) de sodiu 0,1g – carbonat de calciu 0,1 g Pentru punerea în eviden ță a formării gazelor, în eprubete se introduc
tubușoare Durham. Pentru control se las ă câteva eprubete neinoculate.

96Tuburile Durham sunt tubu șoare de sticl ă, care se introduc cu gura în
jos, în mediul de cultur ă lichid, pentru a detecta formarea de gaze. (fig. 6.1.).
Gazul se acumuleaz ă în tubușorul Durham și determin ă ridicarea lui la
suprafața mediului de cultur ă.
Probele se pun la incubat la temperatura camerei pentru șapte zile,
după care se vor face observa țiile privind producerea gazelor azotoase.

Fig. 6.1. Tubu șor Durham și formarea de gaz în eprubet ă
Interpretarea prezen ței gazelor azotoase se noteaz ă cu „+” sau „-„
astfel:
– gaz prezent în flacon +
– nu exist ă gaz în flacon –
Rezultatele se centralizeaz ă în tabel.

97Formarea gazelor
azotoase Eprubete inoculate Ep rubete neinoculate

6.1.4. Evidentierea bacteriilor din nodozit ățile radiculare ale plantelor
leguminoase

Principii
O etapă important ă a circuitului azotului în natur ă o reprezint ă fixarea
azotului molecular atmosferic . Fixarea biologic ă a azotului se realizeaz ă de
către organisme procariote, care se împart în dou ă grupe principale: libere
fixatoare de azot și simbiotice.
Grupa bacteriilor libere fixatoare de azot cuprinde unele bacterii din
genul Azotobacter, Clostridium, Anabena, Nostoc .
Grupul bacteriilor simbiotice este format în principal de bacterii ale
genului Rhizobium , gen care este asociat cu plantele leguminoase (de exemplu,
mazăre, trifoi, lucern ă, fasole, soia, ghizdei, lupin).

98Fixarea azotului molecular de și nu este realizat ă doar de bacteriile
genului Rhizobium , datorită complexit ății interrrela țiilor bacterie – gazd ă care
se concretizeaz ă prin formarea unor organe noi – nodozit ățile fixatoare de azot
de pe rădăcinile plantei – face ca studiul acestei simbioze s ă prezinte cel mai
mare interes. Simbioza se consider ă că are un mare beneficiu economic,
estimat la 70 kg azot fixat per hectar per an. De asemenea, sistemul simbiotic
Rhizobium – plante leguminoase este cel mai perfec ționat, cel mai adaptat și
poate cel mai complex din întreaga lume vie.
Speciile de bacterii din genul Rhizobium sunt aerobe, ciliate și
heterotrofe. Bacteriile se pot de plasa liber în sol de unde vor p ătrunde în
țesutul meristematic al r ădicinilor prin peri șorii radiculari și apoi în
parenchimul scoar ței unde se vor înmul ți și vor forma colonii. In jurul
coloniilor, celulele r ădăcinii se înmul țesc foarte mult, țesutul își mărește
volumul și apare o umfl ătură, respectiv nodozitatea. Ba cteriile din interiorul
nodozității poartă numele de bacteroizi. Activita tea bacteroizilor se poate
pune în eviden ță prin observarea macroscopic ă a nodozit ăților. Când bacteriile
devin active în interiorul nodozit ății apare un pigment ro șu portocaliu care
constiuie o protein ă numită leghemoglobin ă.
S-a constatat c ă fixarea azotului de câtre bacteriile simbiotice este
într-o strâns ă corelație cu concentra ția de leghemoglobin ă din nodozit ăți. Spre
sfârșitul perioadei de vegeta ție a plantei-gazd ă, conținutul nodozit ăților devine
verzui, apoi se decoloreaz ă treptat, bacteriile î și schimbă aspectul morfologic.

Materiale necesare

– rădăcini de leguminoase cu nodozit ăți
– bisturiu
– lame de microscop

99- colorant albastru de metilen
– reactivi pentru colorarea Gram

Aplicații practice

Se vor analiza macroscopic nodozit ățile provenite de la diferite specii
de leguminoase, notându-se forma, m ărimea, num ărul nodozit ăților, prezen ța
leghemoglobinei.
Pentru studiul microscopic, re spectiv studierea caracterelor
morfologice și a propriet ăților tinctoriale ale bacteroizilor se va proceda în
felul următor:
– se detașează nodozitățile de pe r ădăcinile leguminoaselor cu
ajutorul unui bisturiu;
– se spală mai întâi cu ap ă de robinet, dup ă care se sterilizeaz ă cu o
soluție de HgCl 2 0,1%, timp de cinci minute. Indep ărtarea
agentului de sterilizar e se va face prin sp ălarea de 3-4 ori cu ap ă
distilată sterilă.
Obținerea suspensiilor celulare se realizeaz ă astfel:
– nodozitățile se suspend ă în cîțiva ml de ap ă distilată sterilă;
– se zdrobesc cu ajutorul unei pe nsete sau a unui bisturiu steril și se
omogenizeaz ă bine cu apa.
Din aceast ă suspensie se vor realiza preparate native între lam ă și
lamelă și frotiuri colorate dup ă metoda Gram.

1006.1.4.1. Studiul bacteriilor de nodozit ăți pe medii de cultur ă

Principii Izolarea culturilor pure de bacterii simbiotice
Cele mai reu șite izolări de culturi pure de bacterii simbiotice se
realizează prin extragerea lor din nodozitate. Izolarea lor din sol este mult mai
greoaie deoarece exist ă posibilitatea de a confunda la început bacteriile de
nodozități din genul Rhizobium cu bacteriile Agrobacterium tumefaciens și
Agrobacterium radiobacter , cu care morfologic și cultural se aseam ănă foarte
mult.
Izolarea speciilor de Rhizobium direct din nodozitate prezint ă și
avantajul cunoa șterii exacte a speciei și a eficien ței, datorit ă aspectului general
al nodozit ății și al plantei de la care s-a recoltat nodozitatea.
Pentru realizarea experien țelor noastre vom utiliza diferite specii de
leguminoase de la care se vor alege nodozit ățile cele mai reprezentative și care
în secțiune au culoare ro șie, ceea ce confirm ă eficacitatea lor
.
Un rol esen țial în reu șita unei culturi in vitro , îl constituie gradul de
îndepărtare a factorilor contaminan ți, de pe suprafa ța nodozităților ce urmeaz ă
a fi inoculate pe mediile de cultur ă.
Natura organelor, profunzimea țesuturilor, fine țea tegumentar ă a
epidermei (gradul de cerificare, cutinizare a acestora) constituie tot atâ ția
factori de care trebuie ținut seama. Permeabilitatea tegumentelor creeaz ă
probleme mai pu țin dificile, existând o gam ă largă de agenți dezinfectan ți care
permit o sterilizare bun ă a materialului biologic și obținerea de culturi de
rizobii cu un grad sc ăzut de infec ții.

101Dezinfectan ții trebuie s ă fie suficient de puternici, încât, în scurt timp
să distrugă microorganismele aderente la suprafa ța organelor, dar totodat ă, nu
trebuie să pătrundă în profunzimea nodozit ății. O altă condiție pe care trebuie
să o îndeplineasc ă dezinfectan ții este aceea de a putea fi îndep ărtați ușor de pe
materialul biologic, prin sp ălări succesive cu ap ă bidistilat ă sau distilat ă
sterilă.
În cazul nodozit ăților un dezinfectant frecvent utilizat cu ac țiune rapid ă
și eficientă este clorura de mercur (în concentra ție de 0,1%).
Pentru cultivarea bacteriilor de nodozit ăți se pot utiliza diferite variante
de mediu de cultur ă. In experien țele noastre vom utiliza mediul nutritiv
manitol – extract de drojdie și roșu de Congo care are urm ătoarea
compoziție:

Mediul nutritiv manitol – extract de drojdii și roșu de Congo

Compoziția chimică Cantiate (g/l)
Manitol 50,0
Extract de dojdii 0,2
K2HPO 4 0,5
MgSO 4 0,2
NaCl 0,1
CaCO 3 3,0
Roșu de Congo, solu ție apoasă 1% 2,5 ml
Agar-agar 15,0
Apă distilată 1000 ml

102Ingredientele mediului de cultur ă se dizolv ă în apă distilată la cald pe
plita cu agitator magnetic. pH-ul mediului se ajusteaz ă la 7,0. Dup ă
preparare mediul se sterilizeaz ă prin autoclavare la 1210C timp de 20 minute.

Materiale necesare

– mediu nutritiv
– nodozități
– clorură mercuric ă 0,1%
– apă distilată
– plăci Petri
– anse
– pipete
– incubator

Aplicații practice
Etapa I – preg ătirea suspensiilor celulare

Pentru cultivarea bacteroizilor pe medii de cultur ă este necesar ă
obținerea unei suspensii bacteriane din nodozit ățile prezente pe r ădăcinile
diferitelor leguminoase.
Pentru ob ținerea suspensiilor și însămânțarea bacteroizilor se va
proceda în felul urm ător:
Rădăcinile plantelor cu nodozit ăți se spal ă de pământ cu ap ă de
robinet, pentru a îndep ărta toate particulele de sol de pe nodozit ăți.
Se taie câteva nodozit ăți de pe rădăcină după
care se sterilizeaz ă într-o
placă Petri. Pentru sterilizarea nodozit ăților acestea se imerseaz ă într-o solu ție

103de clorură mercuric ă (HgCl 2) 0,1% și se mențin imersate timp de 5 minute.
Pentru a îndep ărta acțiunea dezinfectantului, nodozit ățile se spal ă cu apă
distilată și sterilă. In acest scop se utilizeaz ă o pensetă sterilă pentru a transfera
nodozitățile într-o alt ă cutie Petri ce con ține apă distilată și sterilă.
In continuare se proceceaz ă în felul urm ător:

– In mai multe cutii Petri sterile se pune câte 1 ml ap ă distilată sterilă.
Aceste cutii Petri vor servi pentru ob ținerea suspensiilor bacteriene.
– Nodozit ățile dezinfectate și spălate se introduc într-o cutie Petri.
– Nodozit ățile se zdrobesc cu ajutorul unei pensete sterile.
– Se amestec ă bine țesutul nodular cu apa.
– Se transfer ă apoi mai multe înc ărcături de ans ă într-o alt ă cutie Petri
și se clătește ansa în apa de robinet steril ă. Se omogenizeaz ă bine
suspensia. – Se repet ă apoi aceasta opera ție
și la următoarele cutii Petri.

Etapa II – îns ămânțarea mediilor de cultur ă

Mediul nutritiv cu manitol – extract de drojdii – ro șu de Congo- agar se
lichefiază pe baie marin ă și apoi se repartizeaz ă în plăci Petri în hota steril ă
pentru a evita contaminarea acestuia.
Insămânțarea se va face la suprafa ța mediului de cultur ă, după
completa solidificare a acestuia, utilizând suspensiile celulare ob ținute
anterior.
Când mediul este solidificat, inocularea se va face cu ajutorul ansei. In
acest sens, ansa sterilizat ă și încărcată cu materialul microbian se descarc ă pe
suprafața mediului trasând striuri în zig-zag.

104 După însămânțare, cutiile Petri se pun la incubat în termostat la
temperatura de 280C, urmând ca examinarea culturii s ă se facă la șapte zile.
Examinarea culturii va consta în studiul caracterelor morfologice și a
proprietăților tinctoriale ale bacteroizilor prin ob ținerea de preparate native și
fixe aplicând metoda Gram de colorare.

6.2. Eviden țierea efectului de rizosfer ă

Principii

Intre microorganisme și organismele superioare, plante sau animale se
stabilesc numeroase și complicate raporturi de interac țiune. Astfel, substan țele
care intră în alcătuirea unui organism superior, c onstituie un substrat favorabil
dezvoltării microorganismelor.
Rizosfera reprezint ă solul din jurul sistemului radicular. In rizosfer ă
există o serie de microorganisme cu activitate specific ă, predominând bacterii
din genurile Pseudomonas, Alcaligenes, Ac hromobacter, Flavobacterium,
Xantomonas etc.). In zona rizosferic ă din jurul r ădăcinilor, microflora
predominant ă este reprezentat ă de bacterii cu organizare simpl ă, cu o cre ștere
rapidă și care nu necesit ă pentru nutri ție aminoacizi sau factori de cre ștere.
Microflora care se dezvolt ă în apropierea sistemului radicular dar și pe
suprafața rădăcinilor este numit ă microflora rizosferei .
In zona îndep ărtată de rădăcini vor predomina bacteriile sporogene,
artrobacteriile, cocii, actinomicetele și ciupercile care au nevoie pentru
creștere de aminoacizi. Astfel, r ădăcinile plantelor constituie și asigură un

105mediu foarte favorabil pentru dezvoltar ea multor microorganisme, fiind foarte
bogat în substan țe nutritive organice.
Dezvoltarea microflorei specifice în jurul r ădăcinilor determin ă la
rândul său o influen ță favorabil ă asupra plantei prin îmbog ățirea zonei
rizosferice cu difer ite produse ale activit ății microbiene utile și necesare
plantei. Bacteriile pot avea și influențe inhibitoare asupra dezvolt ării plantelor,
când au loc leziuni ale țesturilor acestora.
Efectele de rizosfer ă pot fi calitative și cantitative, fiind produse la
diferite plante și chiar la aceea și plantă în diferite pe rioade de vegeta ție.
Localizarea microorganismelor în rizosfer ă se datoreaz ă, în primul rând,
exudației substan țelor organice de c ătre rădăcinile plantelor, dar r ădăcinile pot,
de asemenea, modifica compozi ția rizosferei, concentra ția nutrien ților minerali
și conținutul în umiditate a solului înconjur ător. Activitatea microbian ă intensă
din zona r ădăcinii influen țează planta. Astfel, unii produ și microbieni
stimuleaz ă, iar alții inhibă creșterea plantei, popula ția rizosferic ă putând afecta
respirația rădăcinilor și absorbția ionilor.
Efectului de rizosfer ă poate fi eviden țiat în laborator prin studierea
microorganismelor din sol rizosferic și nerizosferic. Solul rizosferic va fi
reprezentat de solul aderent pe r ădăcinile plantei, iar solul nerizosferic se
constituie din solul care se îndep ărtează de pe rădăcinile plantelor.
De asemenea, un rol important îl constituie utilizarea extractului de sol în mediul de cultur ă. Superioritatea extractului de sol se datoreaz ă unui factor
de creștere special denumit “f actor teragen”, în a c ărui compozi ție intră
vitamina B12 precum și o serie de factori de natur ă humică, necesari unor
microorganisme din sol.
Jensen (1963) afirm ă că extractul de sol constituie mediul care
corespunde cel mai bine condi țiilor cerute unui mediu de cultur ă pentru
studiile microbiologice ale solului, datorit ă următoarelor considerente:

106- universalitate pentru bacteriile din sol;
– selectivitate;
– nu permite cre șterea invadant ă a coloniilor.
Materiale necesare
– eprubete
– mediu de cultur ă – extract de sol agarizat
– pahare Berzelius – pipete sterile sau micr opipete cu vârfuri sterile
– apă sterilizată
– plăci Petri
– reactivi colorare Gram – numărător de colonii.

Mediul de cultur ă extract de sol agarizat are următoarea
compoziție (g/l):

Peptonă 1,0
Extract de drojdii 1,0
K2HPO 4 0,4
NH 4NO 3 0,5
MgSO 4x7H 2O 0,05
FeCl 2 0,01
CaCl 2 0,1
Agar – agar 15,0
Extract de sol 250 ml
Apă distilată 750 ml

107 Mediul de cultur ă – extractul de sol agarizat, trebuie s ă aibă un pH de
7,4; se sterilizeaz ă prin autoclavare la 1200C, timp de 15 minute.
Obținerea extractului de sol a fost explicat ă în Capitolul 1.
Aplicații practice

– se vor preleva probe de sol cu r ădăcinile unei plante
– se scutură cu grijă rădăcinile plantei pentru a îndep ărta particulele
de sol slab aderente
– se vor realiza dilu ții decimale din r ădăcinile cu sol aderent (sol
rizosferic)
– se vor realiza dilu ții decimale din solul îndep ărtat de pe r ădăcini
(sol nerizosferic)
– se va prepara mediul de cultur ă extract de sol agarizat
– se vor îns ămânța probele de sol rizosferic și nerizosferic
– probele se pun la incubat la 28°C, timp de 7 zile
– analiza culturilor ob ținute:
– se va determina num ărul de colonii
– examinarea caracterelor morfologice și tinctoriale ale
microorganismelor
– examinarea caracterelor culturale ale microorganismelor

Din rădăcinile cu sol rizosferic ata șat, precum și din solul îndep ărtat
după scuturarea r ădăcinilor (sol nerizosferic) se prepar ă diluții decimale de la
10-1 până la 10-7 în apă sterilă.
Din diluțiile obținute se fac îns ămânțări în plăci Petri. Volumul
inoculului va fi de 1 ml. Pentru c ă se urmărește obținerea de colonii
însămânțarea se va face în profunzime sau gazon. Astfel, în condi ții aseptice

108se va introduce mai întâi din fiecare dilu ție câte un ml de inocul în fiecare
placă Petri și apoi se toarn ă mediul de cultur ă lichefiat și răcit la circa 45 –
480C. Se eticheteaz ă corespunz ător fiecare plac ă.
Se omogenzizeaz ă prin rotirea u șoară a plăcii pentru o dispersie
uniformă a bacteriilor în mediul de cultur ă. După solidificarea mediului,
plăcile Petri se pun la incubat la 28°C, timp de 7 zile.
Pentru interpretarea datelor se vor analiza 3-4 colonii ob ținute care
macroscopic prezint ă diferențe, iar observa țiile se vor nota în tabel.

Proba de sol Sol rizosferic / sol nerizosferic
Cultura Colonia analizat ă
Nr. de colonii
/diluție
Caractere
culturale
Colorarea Gram
Forma bacteriilor
Formarea
endosporilor

Observații

109Bibliografie

1. Adejumo T.O. M.E. Coker, J.S. Ogundejim, D.O. Adejoro, 2015,
Qualitative Determination of Lignocellulolytic Enzymes in Eight Wood-Decomposing Fungi Journal of Natural Sciences Research, Vol.
5, No.14, ISSN 2224-3186 (Paper) ISSN 2225-0921 (Online).
2. Ayush Vikram Singh, 2016, Pure culture techniques, Technology.
3. Bassiri Eby, Pure Culture Tec hniques, Microbiology BIOL 275.
4. Bhuyan S.I, O.P. Tripathi, M.L Khan, 2014, Measurement of N-
mineralization, Nitrification and A mmonification Rates in Agricultural
Soils of Arunachal Pradesh, North East India, Interna tional Journal of
Research Studies in Science, Engineering and Technology
[IJRSSET],Volume 1, Issue 1, April 2014, pp 65-73.
5. Cappuccion James G., Natalie Sherman, 1992, Microbiology a
Laboratory Manual, Third Ed ition, ISBN 0-8053-1052-5, The
Benjamin/Cummings Publishing Co mpanz, Inc. 390 Bridge Parkway
Redwood City, California.
6. Conn H. J., J. W. Bright, 2014, Amm onification of Manure in Soil,
New York State Agricultural E xperiment Station, Journal of
Agricultural Research vol.xvi, nr. 12, p. 347-350.
7. Drăgan-Bularda M., 2000, Microbiologie general ă, Ed. A III-a, Cluj-
Napoca.
8. Eskin N., K. Vessey, L. Tian, 2014, Research Progress and
Perspectives of Nitrogen Fixi ng Bacterium, Gluconacetobacter
diazotrophicus, in Monocot Plant, International Journal of Agronomy
Volume (2014), Article ID 208383, 13 pagess.

1109. Lamb John A., Fabian G. Ferna ndez, and Daniel E. Kaiser, 2014,
Understanding nitrogen in soils, Ex tension Specialists in Nutrient
Management.
10. Padmavathi. T. et al., 2012, Qualitative methods for the determination
of lignocellulolytic, Euro. J. Exp. Bio., 2012, 2 (4):1161-1170.
11. Pamfil D., 1999, Microbiologie, Editur a Genesis, Cluj-Napoca, ISBN
973-97122-2-3.
12. Pop Rodica, 2006, Microbiologie general ă. Aplicații practice, Ed.
Todesco Cluj-Napoca.
13. Pop Rodica, D. Pamfil, 2017, Microbio logie, Manual didactic, Editura
AcademicPres, Cluj-Napoca, ISBN 978-973-744-598-8.
14. Ryzhakov A. V., Kukkonen N. A., P. A. Lozovik, 2010,
Determination of the rate of ammoni fication and nitrification in natural
water by kinetic method, Volu me 37, Issue 1, pp 70–74|, Water
Resources.
15. Severin Valeria, C ălina Petru ța Cornea, 2009, Ghid pentru diagnoya
bolilor plantelor, Ed. Ceres Bucure ști.
16. Stein Lisa Y., Martin G.Klotz , 2016, The nitrogen cycle, Current Biology, vol.
26, pg. 94-98.
17. Tóth Erika M., Andrea K. Borsodi, Ta más Felföldi, Balázs Vajna, Rita
Sipos, Csaba Romsics, Judit Makk, Ka talin Jáger, Márton Palatinszky,
Éva Ács, Károly Márialigeti, 2013, Practical Microbiology, Eötvös
Loránd University.
18. https://courses.lumenlearning.com /boundless…/chapter/microbial-
culture-methods/ fire.biol.
19. https://www.britannica.com/scie nce/denitrifying-bacteria.
20. https://www.britannica.co m/science/pure-culture.

11121. https://www.fda.gov/downloads/F ood/FoodScienceResearch/UCM088
745, Appendix E – SAWG Enclosure A – Measurement Error 8-8-06. Page 2 – 10.
22. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/V3000-VZ.
23. https://quizlet.com/6947161/microbi ology-lab-endospore-stain-flash-
cards
24. wwu.edu/cmoyer/zztemp_fire/biol 346_W06/labman_week 4. pdf.
25. www.Sas.Upenn.Edu/Labmanuals/Bio l275/Table_Of_Contents…/14-
Enumeration of Bacteria in a popul ation: Using serial dilutions and
plating to establish viab le bacterial cell count.
26. www. science.jrank.org/pages/295/A mmonification – Ammonification.
html.
27. www.bio.fsu.edu/courses/mcb4403L/dilution.pdf, Dilution Theory and
Problems.
28. www. Basic Practical Microbiology – A Manual, Published by the
Society for General Microbiology, Ma rlborough House, Basingstoke
Road, Spencers Wood, Reading RG 7 1AG, UK © 2006 Society for
General Microbiology.
29. www.liceogalvani.it/download_file. php?id=15326, Ammonification in
Soil – Liceo Galvani.
30. www.mikrobiologia.elte.hu/index.ph p?q=system/files/Practical%20
Guide, 2012.
31. www2.muw.edu/~lbrandon/ Micro/endospore.doc
32. www2.fiu.edu/~makemson/MCB3020Lab/API20neInstructions.pdf.