Introducere ________________________________ ______________________________ 4 [606988]

1
CUPRINS

Introducere ________________________________ ______________________________ 4
I. Morfogeneza dentară ________________________________ ___________________ 6
A. Formarea și dezvoltarea aparatului dento -maxilar __________________________ 6
B. Formarea și dezvoltarea sistemului dentar ________________________________ 6
1. Histodiferențierea la nivelul organului adamantin _________________________ 8
2. Histodiferențierea la nivelul papilei dentare _____________________________ 8
3. Histodiferențierea la nivelul sacului dentar ______________________________ 9
C. Amelogeneza. Dentinogeneza. Cementogeneza ____________________________ 9
1. Formarea dentinei ________________________________ ________________ 10
2. Mantaua dentinară ________________________________ ________________ 10
3. Formarea dentinei circumpulpare ________________________________ ____ 10
4. Dentina peritubulară ________________________________ _______________ 11
5. Cementogeneza ________________________________ __________________ 11
II. Histologia pulpei dentare ________________________________ ______________ 12
A. Histoarhitectonica pulpară ________________________________ ____________ 12
B. Teritorii celulare în arhitectonica pulpei dentare ___________________________ 12
1. Zona odontoblaștilor ________________________________ ______________ 12
2. Zona săracă în celule – acelulară ________________________________ _____ 13
3. Zona bogată în celule ________________________________ ______________ 13
4. Zona centrală – pulpa propriu -zisă________________________________ ____ 13
C. Celulele pulpei dentare ________________________________ ______________ 13
1. Odontoblastul – structură ________________________________ ___________ 13
2. Fibroblastul ________________________________ _____________________ 14
3. Celulele mezenchimale, macrofagele, limfocitul, celulele polimorfonucleare,
mastocitul și plasmocitul ________________________________ _______________ 15
D. Matricea extracelulară – componență și funcții: proteoglicani, glicoproteine,
fibronectina ________________________________ ___________________________ 16
E. Fibrele conjunctive pulpare – componență și funcții: fibre de colagen, fibre de
reticulină, fibrele de elastină ________________________________ ______________ 17
F. Circulația pulpară ________________________________ __________________ 17
1. Arteriolele pulpare. Capilarele pulpare. Venulele pulpare. Limfaticele pulpare _ 17
2. Pericitele ________________________________ _______________________ 19

2
G. Inervația p ulpei dentare. Plexul Raschkow. Plexul Bradlaw __________________ 22
III. Celulele si nișele stem adulte ________________________________ __________ 24
A. Ciclul celular ________________________________ ______________________ 24
1. Celula – definiție, structură și morfologie ______________________________ 24
B. Celulele stem și celulele progenitoare. Nișele stem pulpare. _________________ 25
1. Celulele stem embrionare. ________________________________ __________ 29
2. Celulele stem adulte ________________________________ _______________ 30
3. Celulele stem hematopoietice ________________________________ _______ 31
C. Funcțiile celulelor stem și caracteristicile acestora _________________________ 32
1. Potența celulară ________________________________ __________________ 32
2. Celulele stem mezenchimale: potențialul de auto -reînnoire și menținere ______ 34
3. Potențialul de diferențiere al celulelor stem mezenchimale _________________ 35
4. Condrogeneza. Osteogeneza. Miogeneza. Tendogeneza. Adipogeneza _______ 35
D. Surse de celule stem de la nivelul feței ________________________________ __ 37
1. Celule stem de origine conjunctivă ________________________________ ___ 38
2. Celulele stem de la nivelul ligamentului periodontal ______________________ 38
3. Celulele stem de la nivelul mucoasei orale _____________________________ 39
4. Celulele stem epiteliale oro -faciale: dintele ca model _____________________ 39
IV. Material și metodă de studiu ________________________________ __________ 40
A. Material biologic ________________________________ ___________________ 40
B. Metod a de prelevare a țesuturilor ________________________________ ______ 40
C. Metoda imunohistochimică ________________________________ ___________ 40
1. Pregătirea lamelor de microscopie ________________________________ ____ 40
2. Anticorpii primari utilizați ________________________________ __________ 40
3. Metoda imunohistochimică ________________________________ _________ 41
4. Documentarea rezultatelor ________________________________ __________ 42
V. Rezultate ________________________________ ___________________________ 43
VI. Discuții ________________________________ ___________________________ 53
A. Întrebuințări ale celulelor stem ________________________________ ________ 54
B. Celulele stem orale ________________________________ _________________ 55
C. Nișa stem a pulpei dentare ________________________________ ____________ 57
1. Caracteristici ultrastructurale și imunofenotipice ale celulelor stem __________ 57
D. Studiu comparativ între două subpopulații stem utilizând markerii CD3, STRO -1 și
c-kit62

3
E. Utilizările celulelor stem de la nivelul pulpei dentare. Medicina regenerativă și
ingineria tisulară ________________________________ _______________________ 68
Concluzii ________________________________ _______________________________ 70
Bibliografie ________________________________ _____________________________ 72
Index de figuri în text ________________________________ _____________________ 75

4
Introducere
În lucrarea de față mi -am propus să abordez un subiect de actu alitate în medicina
modernă și anume: celulele stem și proprietățile regenerative ale acestora.
Celulele stem reprezintă o populație de celule heterogene care se găsesc în aproape
toate țesuturile organismului uman: măduvă osoasă, creier, ficat, țesut adipos, mușchi
scheletic , epiteliu ovarian, testicul, pulpă dentară, sac folicular etc. Aceste celul e au atras
atenția cercetătorilor d atorită proprietăților pe care l e posedă și anume: potențial de
difer ențiere în alte tipuri celulare și capacitate de auto -reînnoire.
În ultimii 100 de ani s -au făcut eforturi masive în a înțelege mecanismele
biochimice, moleculare și morfologice ale celulelor stem și se mai fac și în prezent,
deoarece aceste celule pot oferi o sursă valoroasă pentru numeroase tratamente medicale în
medicina regenerativă . În fiecare țesut menționat mai sus există o nișă de celule stem, un
mediu ideal în care celulele stem își au reședința.
O serie de populații celulare stem au fost izolate de la nivelul țesuturilor orale:
pulpa dentară, dinți incluși, ligament periodontal, sac folicular, delta apicală, glande
salivare ceea ce face ca acest e celule stem să fie atractive, atât prin proprietățile pe care le
posedă, cât și pentru accesul facil la sursă.
În medicina dentară, diferențierea celulelor stem în alte tipuri celulare, inclusiv
osteoblaste, condrocite, adipocite, celule musculare le fac e să fi e deosebit de atr active
pentru folosirea în regene rarea parodonțiului, corectarea defectelor osoase maxilo -faciale,
pentru refacerea țesuturilor dentare afectate c um ar fi dentina, ligamentul peri odontal și
pulpa dentară. Endodonția regenerativă reprezintă o nouă modalitate de tratament, care
urmărește restabilirea vitalității pulpei dentare și continuarea dezvoltării rădăcinii pe baza
celulelor stem . Prin tehnici de bioinginerie medicală, în labor ator s -a putut realiza un
germene dentar care poate să genereze un dinte corect structurat ce poate îndeplini cu
succe s dup ă transplantarea în cavitatea bucală toate funcțiile fiziologice normale. În afara
utilizărilor în sfera stomatologică, pe baza celulelor stem se pot genera și alte celule din
organism cum ar fi hepatocite, precursori neuronali, epiteliu cornean, celule pancreatice
etc.
Celulele stem dentare oferă oportunități imense de explo atare în medicina
regenerativă și de aceea e ste nevoie de studii pe termen lung care să evalueze diferitele
populaț ii de celele stem orale pentru a se folosi în contexte clinice specifice.
Scopul acestui studiu a fos t de a explora imunohistochimic pulpa dentară adultă ,
pentru a obține date fundamentale asupra potențialului stem/progenitor la acest nivel.

5
Aduc mulțumiri Dl. Prof. Dr. Med. Dr. Biol. Dr. Hab. Mugurel Constantin Rusu
pentru suportul acordat în interpretarea rezultatelor și coordonarea Lucrării mele de
Licență.

6
I. Morfogeneza dentară
A. Formarea și dezvoltarea aparatului dento -maxilar
În urma unirii celor doi gameți, masculin și feminin, rezultă oul -zigotul. În
primele faze, diviziunea zigotului se va face prin segmentație totală și egală, apoi pr in
segmentație totală, dar inegală. Prin diviziunea succesivă, crește numărul de celule, apare o
specializare structurală și funcțională a acestora, cu apariția în final de țesuturi, organe,
aparate și sisteme, acest ea alcătuind unitatea morfofuncț ională – organismul uman 1.
Între săptămânile 3 și 8 de viață intrauterină are loc dezvoltarea structurală a
capului și gâtului, din cele 5 perechi de arcuri faringiene, ce apar din ziua 22 aproximativ
și reprezintă baza embriologică a diferențierii tuturor structurilor capului și gâtului. Fiecare
arc va conține artera sa proprie, ne rvul său, o bară cartilaginoasă (scheletul arcului
faringian) și un blastem muscular striat 1.
Arcurile branhiale sunt numerotate de la 1 la 6 în sens cranio -caudal. Primul arc
branhial, arcul m andibular dă naștere mandibulei în totalitate, maxilarului, cea mai mare
parte a lui și parților moi ale aparatului dento -maxilar. Arcul 2 – hioidian și arcul 3 –
tiroidian, dau naștere părților moi și scheletului anterior al gâtului. Arcurile 4, 5 și 6
formează părțile inferioare ale g âtului și p ărțile superioare ale toracelui 1.

B. Formarea și dezvoltarea sistemului dentar
În cursul dezvoltării sale, organul dentar trece printr -o succesiune d e etape, după
cum urmează:
1. Creșt erea și diferențierea celulară, ce cuprinde: proliferarea epitelială,
diferențierea tisulară, organogeneza (diferențierea morfologică)
2. Mineralizarea țesuturilor dentare;
3. Erupția dentară, însoțită de creșterea radiculară;
4. Uzura dentară ș i atrofia orizontală a parodonțiului.

Din punct de vedere al dentației, omul este difiodont, adică prezintă 2 seturi de
dinți: dentiția primară (dinții temporari, deciduali sau de lapte) și dentiția secundară (dinții
permanenți, sau definitivi). Fiecare arcadă conține câte 10 dinți temporari: incisiv central,
incisiv lateral, canin, molar prim și molar secund. Acestora le succed d inți definitivi:
incisivii, caninii și premolarii (dinți succesionali) în timp ce molarii definitivi nu au
precursori pe arcadă (dinți accesionali). Dinții accesionali (molarul 1, molarul 2 și molarul
3) apar dis tal de dinții arcadei temporare 2. Dezvoltarea dintelui și a structurii sale de

7
suport urmează o schemă generală, comună, dar care nu respectă aceeași cronologie pentru
toți dinții (grupele dentare se dezvoltă într -o anumită perioadă de timp, specifică grupei
respective). Formarea dinților este un proces de lungă durată care începe din săptămâna 6,
dar se încheie după naștere, în jurul vârstei de 14 – 15 ani, odată cu formarea apexului
molarului de 12 ani. Fiind un proces lung, procesul de odontogeneză poate fi afectat de
factori de mediu și se pot produce astfel anomalii de dezvoltare dentară 1.
Dezvoltarea dinților începe printr -o fază de proliferare din saptămâna a 6 -a de viață
intrauterină, când celulele mucoasei stomodeumul ui suferă o intensă multiplicare, dând
naștere lamei dentare primare, viitorul organ odontogen. Din lama dentară primitivă vor
lua naștere dinții temporari. Apoi, printr -o proliferare în interior și în profunzime față de ea
însăși, va da naștere lamei dent are secundare, din care se vor forma, începand cu
săptămâna 20, mugurii dinților de înlocuire, implicit dentiția secundară 1.
Partea profundă a lamei dentare, de la nivelul unor centri ectodermali proliferează
selectiv în zece locuri ce vor căpăta aspect bulbos, zece formațiuni rotund – ovalare,
mugurii dinților temporari, aceasta fiind prima formă de reprezentare a odontonului.
Procesul de proliferare al mugurilor nu este simultan pentru toți dinții ci începe dinspre
anterior spre posterior, între săptămânile 6 – 8. Mugurii incisivilor și caninilor se dezvoltă
aproximativ la sfârșitul săptămânii 7 , mugurii molarilor primi – în săptămâna 8 , iar
mugurii molarilor secunzi în săptămâna 10 2.
Mugurii dinților permanenți se vor forma mai târziu, cu diferențe cronologice între
formarea mugurilor permanenți ai dinților succesionali și cei ai dinților accesionali.
Mugurii dinților succesionali provin dintr -o prelungire linguală a lamei dentare, și
evoluează din luna 5 de viață intrauterină, în sens antero -posterior, până în luna 10
postnatal. Mugurii dinților accesionali se formează din prelungirea distală a lamei dentare
(mugurele M 1 apare în luna 4 de viață intrauterină, mugurele M 2 apare post natal, după unii
autori la 4 luni, după alți autori în primul an, iar mugurele M 3 apare apro ximativ la 4 ani
după naștere). În cursul evoluției morfologice, odontonul trece prin urmatoarele stadii:
inițial mugure dentar, cupă dentară și în final, clopot de ntar 3.
În linii mari, succesiunea fazelor este identică pentru toți dinții, atât pentru cei
temporari, cât și pentru cei definitivi, particularitățile fiind legate în special de forma
viitoare i coroane și de numărul rădăcinilor 1.
În săptămâna a 8 -a, prin invadare mezenchimală, mugurele dentar va da naștere
papilei dentare , ce va fi acoperită de componenta ectodermală, sub forma unei cupe. Pe
măsură ce cupele cresc dimensional, se vor apropia de lama dentară, scurtându -se distanța

8
față de acestea. În cursul săptămânilor 8 -12, cupa va lua forma de clopot, papila
delimitându -se clar de mezenchimul adiacent. În stadiul de clopot celulele ectodermale se
diferențiază între ele, cele de la nivelul convexității clopotului se aplatizează și vor forma
epiteliul adamantin extern, iar celulele de la nivelul concavității clopotului capă tă formă
cilindrică și vor fo rma epiteliul adamantin intern 1.
Etapele de histodiferențiere și proliferare se suprapun, făcând ca în stadiile de cupă
și clopot să poată fi decelate 3 populații celulare: epitelial – ectodermală (va forma organul
adamantin), ectomezenchim condensat sub forma papilei dentare, în interiorul cupei /
clopotului și ectome zenchim de înveliș al primelor două structuri histologice, ce constituie
sacul dentar sau folicular. Ectodermul va evolua în continuare către formarea smalțului, în
timp ce din ectomezenchim vor deriva toate celelalte structuri ale dintelui și ap aratului d e
suport al acestuia 1.

1. Histodiferențierea la nivelul organului adamantin
Organul adamantin cuprinde de la periferie spre interior 4 straturi: epiteliul
adamantin extern, epiteliul adamantin intern, reticulul stelat și stratul inte rmediar. Locul de
unire al EAE ș i EAI este reprezentat de bucla cervicală, cu rol de protecție pentr u organul
smalțului. Celulele EAE au morfologie neuniformă: celulele epiteliale încă nediferențiate
în ameloblaste sunt cuboidale sau prismatice, iar cele de la nivelul ameloblastelor sunt
aplatizate și cu dispoziție neregulată. 1,3
Celulele stratului reticular au formă stelată, cu prelungiri citoplasmatice lungi și
dau vo lumul organului adamantin. Stratul intermediar conține celule dispuse pe 3 -4
straturi, aș ezate direct pe celulele EAI. Epiteliul adamantin intern cuprinde celule
cilindrice, cu nuclei ovalari și organite dispersate în citoplasmă, așezate pe un singur rând.
Din EAI se vor diferenția a meloblastele (adamantoblastele) 1.
După proliferarea și configurarea celor 4 straturi ale organului adamantin se
prefigurează doar o mică porțiune, incizală sau ocluzală a viitoarei coroane dentare.
Creșterea continuă, formarea smalțului si a dentinei avansează apical, organu l adamantin
se măreș te formându -se coroana dentară 3.

2. Histodiferențierea la nivelul papilei dentare
În stadiul de clopot dentar, celulele ectomezenchimale se vor dispune sub forma
unui strat de celule alungite în aproprierea membranei bazale care le separă de epiteliul
adamantin intern. Între celulele acestui strat și membrana bazală rămân e un spațiu acelular

9
ce va facilita creșterea în înălțime ulterioară a celulelor. Aceste celule vor da naștere
ulterior dentinei coronare. Celulele miezului mezenchimal al papilei dentare sunt
responsab ile de formarea pulpei dentare 1 4.

3. Histodiferențierea la nivelul sacului dentar
Sacul folicular, de origine ectomezenchimală, înconjoară mugurele dentar și cupa
dentar ă. Concomitent histodiferențiererii organului adamantin și papilei dentare, celulele
sacului folicular devin mai concentrate și separă papila dentară de o zona mezench imală
nediferențiată, mai laxă 1.
Celulele nediferențiate ale sacului folicular vor da naștere cemetoblaștilor (care vor
realiza procesul de cementogeneză), osteoblaștilor, care vor forma osul alveolar , iar
fibroblaști i vor realiza forma rea ligamentului dentoalveolar 1.
Organul adamantin, papila dentară și sacu l dentar sunt componente esențiale ale
formării dintelui și aparatului său de susținere. În lipsa oricăruia dintre cele trei elemente s –
ar produce dezechilibre, cu afectarea ulterioară a dintelui 1.

C. Amelogeneza. D entinogeneza . Cementogeneza
După epuizarea celor două stadii principale ale histodiferențierii: formarea
ameloblastelor si a odontoblastelor, urmează ultimele două și anume: formarea dentinei și
formarea smalțului 1.
Deși ameloblastele preced apariția odontoblastelor, în ceea ce privește
diferențierea celulară raportul se inversează, formându -se în primul rând dentină, iar după
ce aceasta a atins o anumită dimensiune se va forma și smalțul. Această etapă constă în
formarea tramei organice – matricea organică și ulterior în depunerea sărurilor –
mineralizarea. Amelogeneza își are debutul la nivelul ma rginii incizale sau a vârfului
cuspidian al viitorului dinte, după ce, în urma morfodiferențierii, joncțiunea
amelodentinară a prefigurat forma dintelui. În prima fază are loc diferențierea citologică a
ameloblastelor, unde celulele epiteliale interne își pierd potențialul mitotic, devin
preameloblaste, iar acestea la rândul lor suferă modificări ce le dau în final potențial
secretor, devenind ameloblaste. Urmează a doua fază, cea de mineralizare a matricei
primare a smalțului, fază ce începe de la marginea incizală/vârful cuspidului și se continuă
spre colet, iar subiacent acestui strat există deja strat de predentină mineralizată. În
matricea secretată de ameloblaste apar nucl ee de cristale de apatită, care ulterior încep să
se încarce cu săruri minerale de tipul hidroxi -/fluoro -/carbon -apatită, cristale dispuse

10
regulat, perpendicular pe membrana ameloblastului sau a procesului Tomes. În momentul
formării complete a coroanei, prin depunerea succesivă a straturilor de smalț , pulpa
acestuia se reduce în dime nsiuni, epiteliul adamantin intern se alipește cu epiteliul
adamantin extern, rezultând cuticula Nasmith, fără a cărui protecție smalțul ar fi supus
resorbției 1.

1. Formarea dentinei
Morfogeneza dentinei se realizează similar la nivelul coroanei și a rădăcinii. La
nivel radicular, pe lângă formarea dentinei radiculare are loc și formarea aparatului de
susținere al dintelui 1, 5.
Odontoblastele, celulele răspunzătoare de formarea dentinei vor sintetiza colagen
de tip I, glicoproteine si glicozaminoglicani, rezultând un produs primar – predentina.
Astfel, formarea dentinei în cepe cu secreția predentinei și mineralizarea ulterioară a
acesteia 1.
Topografic, predentina apare inițial la nivelul marginilor incizale sau la nivelul
vârfului cuspizilor; deoarece formarea odontoblastelor înaintează în direcție apicală, și
depunerea matricii organice va avansa la fel. În timp ce frontul de predentină înaintează
apical , dentina se îngroașă coronar. Pe parcursul formării dentinei, la nivelul celulelor
mezenchimale răspunzătoare de proce s au loc modificări: diferențierea celulelor
mezenchimale în preodontoblaste, preodontoblastele devin ulterior odontoblaste tinere, ca
în final să aibă loc diferențierea odontoblastelor tinere în odontoblaste mature 1, 5.

Mantaua dentinară
Dentina dispusă la perfierie poartă numele de manta dentinară și se formează
printr -un mecanism diferit de cel implicat în formarea dentinei circumpulpare. Mantaua
dentinară reprezintă un strat de 10 – 30 μm dispus sub joncțiunea amelodentinară. În r est,
în jurul camerei pulpare, se găsește dentină circumpulpară 6.

Formarea dentinei circumpulpare
Între spațiul pulpar și mantaua dentinară se afl ă dentina circumpulpară produsă
exclusiv de odontoblastele mature. Dentina circumpulpară apare după formarea mantalei
dentinare 6. La nivelul predentinei circumpulpare se găsesc fibrile β de colagen și substanță
fundamentală mucopolizaharidi că, disp use perpendicular față de procesele odontoblastice.

11
Pentru a se mineraliza, matricea dentinară trebuie să parcurgă mai multe etape
(transformarea stratificată a preden tinei, maturarea predentinei), în care au loc reacții
histochimice diferite. În timpul a cestui proces se formează predentină crudă, predentină
tânără și în final predentină matură, mineralizabilă 1.

Dentina peritubulară
La nivelul dentinei există spații tubulare la nivelul cărora se vor plasa procesele
odontoblastice și terminațiile nervoase. Dentina peritubulară este formată prin
mineralizarea organică a matricei, produsă de odontoblaste, proces ce se desfășoară rapid,
omogen, de către cristalele de hidroxiapatită 1.

2. Cementogeneza
Prin proliferarea celulelor ectomezenchimale ia naștere o parte a cementului
radicular. Cementoblastele, celulele responsabile de procesul de cementogeneză sunt
asemănătoare o dontoblastelor și sunt localizat e doar la joncțiunea dintre suprafața dentară
și ligamentul periodontal. Ele produc un reticul matricial fin și fibrile de colagen.
Cementoblastele sunt dispuse în contact cu peretele dentinar, sub forma unui singur rând
celular, configurând astfel cementul celular și fibrilar intrinsec. Fibrele lui Sharpey, fibre
scurte de colagen orientate perpendiculat pe matricea odontoblastică, reprezintă
precursorul cementului acelular sau a cementului fibrilar extrinsec 1.
La fel ca în cazul dentinei, cementul continuă să fie depus și după terminarea
creșterii dintelui.

12
II. Histologia pulpei dentare
A. Histoarhitectoni ca pulpară
Pulpa dentară reprezintă componenta centrală a dintelui și este constituită dintr -un
țesut conjunctiv moale, lax, nemineralizat, bine vascularizat și inervat. Are multe trăsături
comune țesutului conjunctiv: conținut ul în apă reprezintă 75% din propria greutate, față de
numai 25% componentă organică, cu elemente celulare, fibroblaști î nglobați într -o matrice
extracelulară, alcătuită din substanță fundamentală și fibre de colagen. Tipul, aranjamentul
și structura eleme ntelor pulpei dentare sunt similare atât în dentiția tempo rară, cât și în cea
permanent ă 5.
Pulpa dentară ocupă spațiul pulpar și este împărțită în două compartimente
individualizate: porțiunea co ronară, denumită cameră pulpară, pulpă coronară și porțiunea
radic ulară, denumită canal radicular, pulpă radiculară 1.
Organul pulpar este înconjurat de dentină, țesut dur, mineralizat, care are rol de
protecție și de susținere spațială. Deși ritmul de formare al dentinei primare este unul
rapid, formarea dentinei secundare este mai lentă, procesul continuând atât timp c ât pulpa
își menține vitalitatea 1.
Printre funcțiile pulpei dentare se numără: funcția inductivă – cu formarea
organului smalțului; funcția formativă, cu rol în formarea dentinei; asigură nutriția și
protecția pulpei dentare prin limfa dentinară ce irigă canaliculele dentinare și prin inervația
ce răspunde stimulilor negativi prin procese va somotorii. O altă funcție a pulpei dentare
este cea imunologică, activată de procesele inflamatorii, procese patologice 6, 5.

B. Teritorii celulare î n arhitectoni ca pulpei dentare
De la periferie spre centru se descriu patru z one: zona odontoblastică; zona
acelulară W eil (stratul subodontoblastic); zona bogat celulară și zona centrală, miezul
pulpei.
1. Zona odontoblaștilor
Se localizează la periferia organului pulpar și este reprezentată de un strat de
celule, plasat imediat subiacent predentinei și în contact cu aceasta. În pulpa coronară
densitatea odontoblaștilor este maximă, atingând 30 000 -75 000/mm2. În aproprierea
coletului și mai ales la nivel radicular, densitatea odontoblaștilor se reduce. Această zonă
este formată preponderent din corpurile odontoblaștilor, vase capilare și terminații
nervoase libere 6.

13
2. Zona săracă în celule – acelulară
Această zonă este denumită și stratul bazal Weil. Este plasată imediat subiacent
odontoblaștilor, cu localizare predominant în pulpa coronară, lipsind de obicei în pulpa
radiculară. În această zonă celulele lipsesc, este traversată de numeroase prelungiri ale
fibroblaștilor provenite din zona pulpară subiacentă și conține un plex capilar și fibre
nervoase amielinice, c are alcătuiesc plexul Raschkow 6.
3. Zona bogată în celule
Această zonă poartă și numele de zona Hohl și este delimitată la exterior de zonă
acelulară și spre interior se întrepătrunde treptat cu zona centrală a pulpei. Conține o
densitate celulară crescută, cu o proporție mare de fibroblaști, dar și macrofage și limfocite
6. Diviziunile celulare sunt rare î n pulpa normală. Ori de câte ori apar odontoblaști
mortificați, se declanșează mitoze ale celulelor stem care pun la dispoziție celule capabile
să înlocuiască odontoblaștii distruși 6.
4. Zona centrală – pulpa propriu -zisă
Reprezintă un amestec dispersat de fibre conjunctive, celule, vase sanguin e și
fascicule nervoase pulpare, ce vor fi descrise separat, în rândurile ce urmează.

C. Celulele pulpei dentare
1. Odontoblastul – structură
Ocupă al doilea loc ca frecvență, după fibroblast și este celulă caracteristică pulpei
dentare. Odontoblastul este alcătuit din: corp celular, gât și prelungirea sa citoplasmatică,
fibra Tomes.
Corpul celular
Forma corpului celular este în relație directă cu starea de activitate sau de repaus
funcțional al odontoblastului. Odontoblastul în activitate are un nucleu mare, ovalar, situat
la polul bazal al celulei, cu cromatină abundentă și 1 -4 nucleoli. Conține or ganite celulare
bine diferențiate: reticul endoplasmatic, ribozomi, aparat Golgi, lizozomi, mitocondrii
distribuite uniform în citoplasmă. Odontoblastul în repaus este, de fapt, o celulă cu
activitatea mult încetinită, dar nu oprită 6.
Gâtul odontoblastului
Reprezintă elementul de legătură ce unește corpul celular de prelungirea
citoplasmatică. Conține microtubuli cu rol în transportul diverselor substanțe între cele 2
compartimente celulare. Prelungirile citoplasmatice sunt de 2 tipuri: majore, periferice –

14
fibra Tomes și minore, care unesc odontoblastul cu fibroblști sau celule vecine 6. Fibra
Tomes imprimă dentinei caracterul de țesut viu, deoarece rămâne inclusă în țesutul
mineralizat. Conține numeroase filamente, organite, vezicule, mitocondrii și ocazional
granule asemănătoare lizozo milor. Prelungirea periferică ajunge până la joncțiunea
dentino -adamantină, unde își etalează arborizațiile terminale 6.
Printre f uncțiile odontoblastului se numără: realiz area procesului de dentinogeneză ,
sinteza glicopro teinelor și a proteoglicanilor, sinteza colagenului tip 1, s ecreția fosfatazei
alcaline , fosfatazei acide, fosforinei, f uncție nutritivă, de susținere a predentiei și funcție
senzitivă 6. Un rol special îl are în declanșarea răspunsurilor pulpare, prin localizarea mai
aproape de mediul extern este prima celulă lezată de agenții vulneranți, d eclanșând
mecanisme de protecție ale complexului pulpodentinar: depunerea de dentină secundară,
de reparație 6.

Variante ale odontoblastului
Odontoblastul secretor
Își are originea în crestele neurale, cu rol în sinteză activă, a lternând cu perioade
de repaus. La microscopul electronic de baleiaj, de transmisie, IHC (cu anticorpi
monoclonali antiproteine de citoschelet) se observă unele prelungiri odontoblastice ce
traversează în totalitat e dentina, iar altele numai parț ial. Conține numeroase filamente,
organite , vezicule, mitocondrii și ocazional granule asemănătoare lizozomilor 6.
Odontoblastul tranzițional
Acest stadiu celular este identificabil doar în microscopia electronică , observându –
se: celula se îngustează, nucleul apare migrat de la polul bazal, cu cromatina condensată,
reticulul endoplasmatic rugos diminuă și apar vacuole autof agice – markeri de
reorganizare citoplasmatică 6.
Odontoblastul în repaus/bătrân
Este o celulă mai puțin înaltă, cu citoplasma redusă, nucleul intens bazofil, situat
spre polul apical, iar la microscopul electronic se observă organite celulare reduse
cantitativ, aglomerate, constituind o regiune subnucleară proeminentă și citoplasma
supranucleară – lipsită de organite celulare ș i granule secretorii 6.

2. Fibroblastul
Ocupând întregul teritoriu al pulpei dentare, fibroblastul este cea mai numeroasă
celulă, din punct de vedere cantitativ. Fibroblastele sunt celule mezenchimale, pulpoblaste

15
sau pulp ocite, cu un nivel progresiv de diferențiere. Fibroblastele pulpare sunt celule cu
nucleu ovoid, celule care sintetizează și secretă colagenul și substanța fundamentală
6. Printre func țiile fibroblastului se numără: f ormează substanța fundamentală din pulpa
dentară; controlează metabolismul colagenului; sunt celule odontoformatoare, fiind
capabile să dea naștere unor noi odontoblaști 6.

Fibroblastul există sub două forme: f ibroblastul activ, distribuit uniform în
substanța fundamentală, cu citoplasmă cla ră, omogenă și cu nucleu palid și f ibroblastul în
repaus, citoplasmă redusă cantitativ și localizată în jurul nucleului și nucleu l închis la
culoare.

3. Celulele mezenchimale , macrofagele, limfocitul, celulele polimorfonucleare,
mastocitul și plasmocitul
Pulpa dentară conține celule mezenchimale nediferențiate, celule multipotente care
au capacitatea de a se diferenția în majoritatea tipurilor de celule mature. Ca localizare,
acestea se găsesc sub stratul de odontoblaste, în zona bogat celulară, c u legături
citoplasmatice între odontoblaste și celulele mezenchimale subiacente 6. Datorită
conexiunii dintre acestea, în timpul lezării odontoblastelor, se trimit stimuli către celulele
mezenchimale nediferențiate, stimuli care le pot determina să se dividă și să se diferențieze
în odontoblaste sau în alte tipuri celulare, în funcție de necesitate 6. O altă localizare a
celulelor mezenchimale este în toată pulpa dentară, dispersate, în juxtapoziție față de
vasele sanguine. La fel și aici, stimulate, acestea au capacitatea de a se divide și a se
diferenția în alte tipuri celulare mature ca de exemplu, mastocitele, odontoclastele etc 6.

Macrofagele
Reprezintă principalele celule defensive ale pulpei dentare, mobile și cu o activitate
intensă. Sunt localizate în zona centrală pulpară și perivascular. Macrofagele sunt celule
mari, de formă neregulată, prezintă prelungiri scur te, nucleu rotun d și excentric. Există
numeroase similitudini între macrofag și fibroblast, de multe ori putând fi greu de deosebit.
În caz de inflamație, macrofagele se deplasează rapid spre locul respectiv 6.
Rolurile ma crofagelor: e limină detritusurile celulare, bacteriile în inflamații ; au rol
în apărare: fagocitarea specifică sau nespecifică a particulelor străine  opsonizare la
nivel tisular și receptori la nivel celular ; participă în procesul imun mediat celular,

16
procesează antigen ul și îl prezintă limfocitelor; s intetizează monokine, interferon, lizozim,
fracțiuni ale complementului, secretă interleukina -1, cito kine 6.

Limfocitul
Este cea mai mică celulă mobilă, are formă rotundă și nucleu rotund sau ovalar,
hipercro m. Apare rar în pulpa dentară sănătoasă, de obicei se întâlnește în inflamațiile
cronice. Limfocitele sunt precursoare ale plasmocitelor și au rol în mec anismele imune
mediate celular 6.

Celulele polimorfonuclear e
În inflamația pulpară se găsesc nume roase neutrofile, eozinofilele ș i bazofilele sunt
uneori și ele prezente. Este important de știut că, deși neutrofilele nu sunt în mod normal
prezente în pulpa dentară sănătoasă, odată cu lezarea și moartea celulară ele migrează
rapid în zonele din proximitatea capilarelor și a venulelor. Au rol important în distrugerea
și fagocitoza bacteriilor sau a celulelor moarte 6.

Plasmocitul
Provine din limfocitul B, are formă ovalară, nucleu excentric, hiper crom, fără
nucleol și citoplasma este bazofilă. Se găsește rar în pulpa dentară sănătoasă, dar n umărul
lor crește în cursul inflamației. Funcția plasmocitului: sinteză de anticorpi 6.

Mastocitul
Are formă rotundă sau ovalară, cu nucleul situat central, heterocromatic.
Membrana are prelungiri scurte, groase și neramificate, conține receptori pentru IgE , iar
citoplasma prezintă numeroase granulații specifice, rotun de, egale, cu dublă membrană.
Mastocitul se găsește rar în pulpa dentară sănătoasă, numărul lor crește în inflamația
pulpară cronică. Rolul lui principal este în răspunsurile inflamatorii, în care histamina este
principalul mediator chimic 6.

D. Matricea extracelulară – componență și funcț ii: proteoglicani, glicoproteine,
fibronectina
Matricea extracelulară a pulpei dentare este asemănătoare cu matricea extracelulară
a oricărui țesut conjunctiv lax și reprezintă locul în care pulpa de ntară își desfășoară toate
procesele vitale. Constituie un sistem coloidal care poate fi afectat în cazul apariț iei unui

17
stimul patologic precum: edemul, căldura, mediatorii chimici. Modificarea calității
matricei extracelulare influențează direct funcțion alitatea pulpară. Matricea extracelulară
este alcătuită din proteoglicani, glicoproteine: fibronectină, laminină, tenascină 6.
Proteoglicanii sunt reprezen tați de glicozaminoglicani și anume produși sulfatați:
condroitin sulfat, dermatan sulfat, heparan sulfat, keratan sulfat și produși nesulfatați:
acidul hialuronic. Printre numeroasele funcții ale acidului hialuronic, acesta intervine în
homeostazia apei î n țesuturi; are o mare afinitate pentru apă ceea ce conferă un grad
permanent de hidratare a țesutului conjunctiv; acționează ca absorbant biologic al
solicitărilor mecanice și intervine în procesele de vindecare și regenerare. Odată cu erupția
dintelui pr oporția celulară în pulpa dentară devine: 60% acid hialuronic, 28% dermatan –
sulfat și 12% condroitin -sulfat 6.

E. Fibre le conjunctive pulpare – componență și funcții: fibre de colagen, fibre
de reticulină, fibrele de elastină
Fibrele de colagen reprezintă produsul de sinteză al fibroblaștilor pulpari. La
nivelul pulpei dentare, fibrele de colagen ocupă 3 -5% din greutatea acesteia. Colag enul
este format din molecule de tropocolagen, o proteină solubilă. Există patru tipuri de fibre
de colagen: colagen tip I, întâlnit în țesuturile conjunctive, respectiv și în pulpa dentară;
colagen tip II, localizat în țesutul cartilaginos, colagen tip II I, găsit și în pulpa dentară, iar
colagenul tip IV este pre zent doar în membranele bazale. În pulpa dentară, raportul
colagen tip I/colagen tip III este de 55/45. Colagenul pulpar este format din fibre mici și
fibre mari de colagen, dispuse paralel, într -o rețea difuză. Se găsește și în jurul nervilor
pulpari, sub formă de teacă, cu rol în protecția acestora 6.
Fibrele de reticulină sunt denu mite și fibre precolagenice, datorit ă compoziției lor
asemănătoare și sunt fibre de colagen tip III, localizate în zonele perivasculare și
perineurale 6. Fibrele de elastină sunt puține și prezente doar în pereții arteriolelor pulpare
6.

F. Circulația pulpară
1. Arteriolele pulpare. Capilarele pulpare. Venulele p ulpare. Limfaticele pulpare
Artera maxilară internă, prin ramurile sale dentare: artera alveolară superioară și
posterioară, artera infraorbitală și artera alveolară inferioară, vascularizează intens pulpa
dentară. La polul apical al pulpei dentare se găsește foramenul apical, loc prin care are loc
comunicarea pulpei dentare cu restul organismului 6.

18
Prin formenul apical pătrund în spațiul endodontic: 1-2 arteriole , venule , vase
limfatice și fascicule nervoase senzitive și simpatice 6.

Arteriolele pul pare
Asemenător vaselor de acest tip, arteriolele prezintă tunică externă, tunică medie
și tunică internă. Arteriolele pul pei dentare au pereții subțiri, calibru redus, iar tunica
medie prezint ă doar 1 -2 straturi musculare. Arteriolele se comportă precum un sfincter
precapilar, controlând circulația sângelui spre patul capilar. Acest sfincter se contractă și se
dilată, permițând /restricționând accesul sângelui în patul vascular 6.

Capilarele pulpare
Capilarele pulpei dentare fac legătura dintre arteriole si venule. Sunt vase formate
dintr -un singur strat de celule endoteliale turtite, cu nuclei lobați și membrană bazală
înfășurată într -o masă amorfă de proteoglicani. În jurul capilarelor sunt localizate
pericitele, celulele lui Rouget, celule cu capacitate contracti lă, reducând calibrul vascular.
O mică parte dintre capilarele pulpei dentare au structură fenestrată, ceea ce le conferă o
permeabilitate crescută față de restul capilarelor, asigurând un transport rapid și o
aprovizionare corespunzătoare cu electroliți, substanțe nutritive, metaboliți 6.

Venulele pulpare
Sunt alcătuite din tun ică internă, cu mai puține filamente comparativ cu cea a
arteriolelor, tunică medie subțire și discontinuă și tunică externă, care uneori poate lipsi.
Venulele au pereții mult mai subțiri comparativ cu ai arteriolelor, nu prezintă valvule și au
structură mai delicată 6.

Limfaticele pulpare
Apar în zona periferică pulpară și se unesc cu alte capilare limfatice pentru a forma
vasele colectoare. Aceste vase se unesc cu canale limfatice din ce în ce mai mari, care ies
prin apex și se anastomozează cu limfaticele parodontale și ale osului alveolar. Au cale
comună de drenaj cu limfaticele parodontale, spre ganglionii limfatici submandibulari și
cervicali 6.
Rolurile limfaticelor pulpei dentare: reduc presiunea coloidosmotică din pulpa
dentară , au rol a ntiinflamator și stimulează vindecarea pulpară în inflamația re versibilă,
prin reechilibrarea presiunii tisulare și îndepărtarea stimulilor toxici 6.

19
2. Pericitele
Celulele stem mezenchimale sunt unele dintre cele mai studiate celule stem ,
datorită potențialului lor de auto -reînnoire și capacității de diferenț iere în multiple linii
celulare precum adipocite, osteocite, condrocite, mioblaste, celule de origine
mezodermală. În anul 1960, Friedenstein și colaboratorii au izolat pentru prima dată, in
vitro , din măduva osoasă a rozătoarelor celule fibroblastoide, care au aderat și au format
unități de fibroblaste. Ulterior, celulele stem mezenchimale au fost izolate din țesutul
adipos, țesutul fetal, tendoane, mușchi, pl acentă, lichidul amniotic, cordonul ombilical,
ligamentul periodontal, pulpa dentară, etc 7.
Societatea Internațională pentru Terapia Celulară – Comi tetul Celulelor Stem
Tisulare a realizat o listă de criterii pe baza cărora o celulă poate fi încadrată în celulele
stem mezenchimale umane: celula trebuie să ad ere la plastic, să exprime antigene de
suprafață CD73, CD90, CD105, să nu exprime CD11b, CD14, CD19, CD34, CD45, HLA –
DR și să se diferențieze în osteoblaști, adipocite sau condroblaști, in vitro . De-a lungul
anilor s -au făcut cercetări referitoare la local izarea anatomică a celulelor stem, rămânând
încă de elucidat acest asp ect. Crișan și colaboratorii au menționat în anul 2008, în urma
cercetărilor făcute că celulele stem mezenchimale pot fi izolate din orice organ
vascularizat, concluzionând că celulele p erivasculare pot fi in vivo sursa celulelor stem.
Celulele vasculare cuprind celulele adventiciale și pericitele, ambele categorii prezentând
proprietăți asemănătoare celulelor stem mezenchimale: potențial de multidiferențiere
(adipogeneză, osteogeneză, m iogeneză, condrogeneză), exprimă markeri celulari de
suprafață: CD73, CD90, CD105, nu exprimă CD31, CD34, CD45 și factorul von
Willebrand 8.
Pericitele, denumite și celulele lui Rouget sau celule murale, reprezintă celule
perivasculare, l ocalizate în jurul celulelor endoteliale din capilare și microvase (peri=în
jurul, cyte=celulă). Acestea au fost descoperite pentru prima dată în anul 1873, de către
Rouget și denumite celule adventiceale nepigmentate, iar în anul 1923, Zimmermann le -a
denumit “pericite” 7. Pericitele sunt celule asemănătoare fibroblastelor, prezintă un nucleu
ce ocupă mare parte din spațiu și o citoplasmă slab reprezentată. Majoritatea sunt de
origine mezodermală, însă cele localizate în retină și creier sunt derivate din creasta
neurală. Vasele sanguine mari, arterele și venele, sunt alcătuite din 3 lam ine: tunic a intimă,
tunica medie și adventicea. Pericitele sunt localizate între tunica medie și intima în vasele
mari și în jurul stratului endotelial în vasele mici. Pericitele comunică prin contact direct
cu celulele endoteliale, astfel ele având rol în proliferarea și diferențierea celulelor

20
endoteliale și transmiterea forțelor contractile endoteliului. Procentul de pericite și celule
endoteliale diferă de la țesut la țesut, fiind în concordanță cu funcțiile, presiunea vasculară
și fluxul sanguin al țes utului în care se află. De aceea, retina și creierul au cel mai mare
raport de 1:1, pielea și plămânii raport 1:10, iar în țesutul muscular striat raportul este de
1:100. Pe lângă proprietățile pericitelor de a se diferenția în adipocite, condrocite,
osteo cite, ele se pot diferenția și în celule musculare netede sau în fibroblaste producătoare
de cola gen tip I, în caz de inflamație 8.
Morfologia pericitelor diferă în funcție de localizare și tipul vasului. De obicei
pericitele au formă alung ită, stelată cu numeroase ramificării, prezintă corp celular, nucleu
sau perikarion din care pornesc diferite prelungiri care înconjoară endoteliul. Regiunea
nucleului sau corpul celular este mi c și oval și se află adiacent endoteliu lui, în anumite
cazuri pătrunde în spațiul interstițial. Prelungirile principale sunt orientate paralel cu axul
lung vascular, iar cele secundare înconjoară pereții vasculari. Citoplasma pericitelor poate
avea două sau mai multe straturi. Nucleul este proeminent, comparativ cu c antitatea redusă
de citoplasmă. În vecinătatea fiecărui pol al nucleului sunt prezente mitocondrii și în
cantitate redusă glicogen, reticul endoplasmatic, ribozomi, complexe Golgi etc 7.

Importanța pericitelor
Pericitele necesită o mare atenție, deoarece au importante funcții reglatoare, au rol
în dezvoltarea vasculară, în stabilizare, maturare și remodelare. Stabilizează
permeabilitatea vasculară, c ontrolează presiunea sanguină, intervin în coagulare, în
vasculogeneză și angiogeneză, ajută la repararea țes uturilor, la vindecarea rănilor 9.
Studiile recente au demonstrat că pericitele secretă o varietate de agenți vasoactivi ,
exprimă tropomiozina, actina, miozina, au receptori colinergici și adrenergici, reglând
diametrul vaselor și presiunea sanguină. Un alt rol important al pericit elor îl reprezintă
funcția imunomodulatorie, prin secretarea de citokine, chemokine, ce modulează răspunsul
inflamat or. Au activitatea fagocitotică asemenea macrofagelor și funcții special e la nivelul
ficatului, rinichilor și creierului. Creierul are cea m ai mare densitate de pericite, datorită
existe nței barierei hemato -encefalice care menține departe potențialul toxic al factorilor
sanguini. La nivelul creierului, pericitele sunt precursori ai macrofagelor și pri n
intermediul pinocitelor curăță fluidul ex tracelular. În ficat, pericitele au funcții speciale și
sunt numite celule hepatice stelate sau celule Ito. Remodelează matricea extracelulară a
țesutului hepatic, secretă proteine ale matricei extr acelulare și metaloproteinaze, i ntervin în
metabolismul vi taminei A, repară țesutul hepatic, iar la nivelul rinichilor, intervin în

21
filtrarea sanguină 10.
Angiogeneza și vasculogeneza
Angiobl aștii și hemangioblaștii, precusor i ai măduvei osoase, migrează în zonele
avascul are și formează plexul vaselor primare. TGF – β1 stimulează diferențierea PDGFR –
β și a progenitorilor pericitelor. Angiogeneza reprezintă formarea vaselor sanguine, prin
intermediul altor vase preexistente. Plexul primar al vaselor sanguine se remodelează și
devine funcț ional. Interacțiunea dintre celulele endoteliale și pericite asigură proliferarea și
recrutarea unor noi pericit e care formează noi vase sanguine. În final, pericitele se
diferențiază morfologic în funcție de țesutul în care ajung, cu funcțiile aferente, care au
fost prezentate mai sus 9.

Izolarea pericitelor
Surse de izolare a pericitelor pot fi: retina bovină , creier bovin, mușchi scheletic,
piele, țesut adipos, placentă, cordon ombilical, rinichi și ficat. Protocoalele de izolare a
pericitelor încep prin digestia mecanică și enzimatică a materialului tisular, folosind
colagenaze. După digestia enzimatică, suspensia obținută este trecută printr -o sită cu
ochiuri de 100 sau 40 μm pentru a îndepărta segmenetele mari de vase și țesutul fibros.
Ulter ior urmează creșterea vasculară sau imunoselecția pozitivă, (utilizând FACS sau
MACS), în conformitatea cu markerul CD146, culturile primare ale vaselor fiind inițial
forma te din populații celulare mixte 7.
Cercetătorii au folosit diferite medii de cultură pentru creșterea pericitelor.
Naka gawa și colaboratorii au folosit pericite cerebrale de șoarece, cultivate pe farfurii
neacoperite, ut ilizând DMEM cu 10% ser fetal de bovină. Tsang și colaboratorii au izolat
celule perivasculare utilizând DMEM cu 15% celule stem embrionice de bovine. Hosseini
și colaboratorii au cultivat celule perivasculare în 75% α-MEM și 15% FBS. S -a ajuns la
concluzia că toate mediile au oferit poten țial de creștere pentru pericite și este clar că nu
există un mediu unic pentru izolarea acestora 7.
Există mai mulți markeri de identificare a pericitelor: CD146, PDGFR – β, NG2,
RGS -5, α-SMA. Markerul CD146 este un marker perivascular, care exprimă endoteliul
vascular, pericite și celule musculare netede, găsit de asemenea și în sinusoidele
pericitelor, dându -le poten țial de auto -regenerare. PDGFR – β este un mark er exprimat de
pericite, astroci te, fibroblaști. α -SMA este un marker universal pentru celulele musculare
netede, asociat cu funcția contractilă a acestora. NG2 exprimă pericitele în timpul
angiogenezei și vasculogenezei. Diferența expresie i markerilor NG2/ α -SMA este asociată

22
în funcție de localizare: ca pilarele exprimă NG2 +, α -SMA -, venulele NG2 -, α-SMA + și
arteriolele NG2+, α -SMA+ 7.
Pericitele sunt caracterizate prin expresia pozitivă a markerilor perivasculari
CD146, PDGFR – β , NG2, RGS -5, α-SMA și a markerilor celulelor stem mezenchimale
CD44, CD73, CD90, CD105. În schimb, ele sunt negative pentru markerii endoteliali și
hematopoietici CD31, CD34, factorul von Willebrand și marke rul CD56. Pericitele pot fi
diferenț iate de celelalte celule perivasculare care sunt negative pentru markerul CD146 și
pozitive CD34 8 7.

G. Inervația pulpei dentare . Plexul Raschkow . Plexul Bradlaw
Pulpa dentară este un organ cu o inervație extrem de bogată, realizată de fibre
nervoase senzitive, simpatice și parasimpatice. Numărul și gradul de concentra re al
nervilor variază în funcție de stadiul de dezvoltare al dintelui și de localizare 6.
Nervii senzoriali răspund la stimulii nocivi pri n senzația de durere, atunci când
stimulul acționează la nivelul dentinei sau mai profund, pe pulpa dentară. Fibrele nervoase
simpatice, provenite din ganglionul simpatic cervical superior, sunt responsabile de
reglarea fluxului sanguin în arteriolele pulp are prin deschiderea sau închiderea șuturilor
arteriolo -venoase, dar modulează și dentinogeneza. Fibrele nervoase pătrund în pulpa
dentară ca fascicule de axoni mielinici și amielinici, încojurați de o teacă de țesut
conjunctiv. Fibrele nervoase amielinice sunt cele mai însemnate din punct de vedere
cantitativ, aproximativ 70 -80%. Ele sunt încojurate de celule Schwann, indispensabile
vieții și funcțiilor fibrelor nervoase periferice. Fibrele nervoase mielinice sunt fibre A –
delta, au calibru redus și rol în transmiterea durerii pulpare. Au teacă groasă de mielin ă și
sunt înconjurate de celule Schwann 6.
Fibrele nervoase pătrund în pulpa dentară la nivelul fora menului apical și a
canalelor accesorii, urmând ulterior trasee de ramifi care, similare vaselor sanguine pe care
le însoțesc. În zona centrală a pulpei dentare, fibrele nervoase sunt dispuse în evantai, se
divid în ramuri din ce în ce mai mici și suferă o arborizare periferică, dând naștere plexului
Raschkow 6.

Plexul Raschkow. Plexul Bradlaw .
Plexul nervos subodontoblastic devine evident doar după erupția dentară și se
formează complet după terminarea formării rădăcinii dentare. Este alcătuit din fibre
amielinice cu diametru mic, reprezintă un câmp receptor imens, sumând cel puțin 8

23
ramificați i terminale de la fiecare fibră nervoasă ce traversează foramenul apical. Din
plexul Raschkow se desprind ramuri nervoase care trec printre odontoblaști ca terminații
nervoase libere, pătrund în canaliculele dentinare și dau naștere unui alt plex – plexul
Bradlaw. Plexul Bradlaw, deși conține terminații nervoase libere, acestea nu se comportă
precum unele reale, ci se termină la joncțiunea odontoblast -predentină și pot fi stimulați
aici împreună cu celelalte terminații care au traseu nervos și la nivelul de ntinei 6.

24
III. Celulele si nișele stem adulte
A. Ciclul celular
1. Celula – definiție, structură și morfologie
Celula este unitatea de bază morfo -funcțională a materiei vii, un produs al evoluției
cu o structură complexă, aflată într -o relație de autonomie și echilibru dinamic cu mediul
înconjurător. Celula parcurge mai multe etape: de creștere, dezvoltare, autoreglare și
reproducere. Componentele principale ale unei celule sunt membrana, citoplasma și
nucleul 11.
Diviziunea celulară reprezintă totalitatea proceselor biologice care conduc la
formarea, dintr -o celulă mamă, a două celule fiice, etapă în care are loc distribuirea
materialului biologic celular din celula parentală, în cele două celule fiice. Diviziun ea
celulară se poate face prin două etape: prin diviziune directă (amitoză) și prin diviziun e
indirectă (mitoză și meioză) 11.
Ciclul celular este perioada de timp parcursă de la apariția unei celule și încheierea
propriei sale diviziuni. În acest ciclu se disting două mari perioade: intercineza sau
interfaza și cineza sau faza (amitoza, mitoza și meioza). Durata ciclului celular variază în
funcție de celulă, specie, individ. Celulele eucariote au o durată a ciclului celular de 10 -25
ore, o oră fiind reprezentată de mitoză. Unele mami fere au o durată a ciclului celular de 16
ore dintre care 15 ore pentru interfază și o oră pentru mitoză. În organismul animal există
și celule care se divid foarte repede, ele parcurgând tot ciclul celular în 8 ore, dar există și
celule care se divid mai rar, și care au un ciclu celular de 100 de zile sau chiar mai mult. În
același timp în organism există și celule care nu se mai divid deloc (neuronul, rabdocitul,
hematia) 11.
În funcție de modul în care celulele parcurg ciclul celular exi stă trei categorii:
categoria I (celulele și -au pierdut capacitatea de a se divide): neuronii, rabdocitele,
leiocitele, hematiile; categoria II (celulele au o mare capacitate de diviziune: cele din
măduva osoasă hematogenă, cele din straturile bazale ale epiteliilor, etc. și categoria III
(celulele cu o capacitate redusă de diviziune, dar care atunci când sunt puse în condiții
speciale se pot divide rapid): hepatocitele, celulele glandulare endocrine, etc 11.
Ciclul celular este influențat de factori stimulatori precum temperatură, hrană,
substanțe activatoare, starea de sănătate a celulelor, dar și de factori inhibi tori: lumina,
radiațiile, frigul ș i unele substanțe chimice inhibi toare, care blochează sinteza de ADN 11.
Fiecare ciclu celular cuprinde două perioade dinamic și calitativ distincte: interfaza
și mitoza /meioza. Multiplicarea celulară are la origine replicarea ADN -ului cromozomial,

25
replicare care ar e loc în perioada interfazică. În nucleul celulelor se găsește ADN -ul,
moleculă foarte complexă ce îndeplinește importante funcții în sinteza proteinelor și în
transmiterea informației genetice către celulele -fiice în urma diviziunii celulare. ADN -ul
este alcătuit din două lanțuri de nu cleotide unite prin legături de hidrogen; el se poate găsi
în interiorul nucleului în două forme, în funcție de perioada din timpul ciclului celular: sub
formă de cromatină , adică răsfirat, necondensat (în interfază) sau sub formă de cromozomi ,
fiind condensat, mai gros, vizibil la microscopul optic (în timpul diviziunii celulare) 11.
După particularitățile de desfășurare și celulele care rezultă în urma diviziunii,
există două modalități de cariochineză: mitoza se realizează doar în celulele somatice și
reprezintă procesul de diviziune celulară prin care celula -mamă se divide în două celule –
fiice identice din punct de vedere genetic, astfel, cromozomii din nucleul celulei -mame se
împart în două seturi indentice în nucleii celulelor -fiice. Meioza se realizează doar în
celulele sexuale și reprezintă procesu l de diviziune celulară prin care celula -mamă se
divide în patru celule -fiice – acestea au însă numai jumătate din numărul de cromozomi ai
celulei -mamă 11.

B. Celulele stem și celulele progenitoare. Nișele stem pulpare.
Primele înregistrări ale omului referitoare la originea vieții și dezvoltarea
organismului uman se regăsesc în Grecia antică, perioadă în care grecii credeau că
entitățile vii pot apărea spontan. Aristotel (384 -322 î. Hr.) nu a fost de acord cu teoria
apariției spontane, motivând că această ordine ar putea proveni din dezordine. Acest
concept a fost ac ceptat până la jumătatea anilor 1600, când Francesco Redi, fizician italian,
a demonstrat că nu toate formele de viață apar spontan (Six jar experiment). La mijlocul
anilor 1800, Franz Leydig susținea că orice formă de viață provine dintr -o altă formă de
viață preexistentă acesteia. De -a lungul anilor, cercetători precum Purkyne, Robert Hooke,
Rudolph Virchow și alții au venit cu noi ipoteze legate de punctul de plecare al entităților
vii. În anul 1858 Virchow a demonstrat teoria conform căreia celula provi ne dintr -o altă
celulă preexistentă (Omnis cellula e cellula) și a fost un susținăt or convins al Teoriei
celulare. Aproape 100 de ani mai târziu, în 1961, James Till, fizician și Ernest McCulloch,
hematolog, au descoperit întâmplător existența celulelor st em adulte într -o suspensie de
măduvă osoasă, celule capabile de proliferare nedefinită. Această descoperire timpurie a
avut, probabil, cel mai mare impact asupra celulelor stem și asupra progreselor terapeutice
din acea vreme până în prezent 12.

26
Nișa celulelor stem
Nișa celulară reprezintă un subgrup de celule tisulare și substrate extracelulare ce
pot găzdui pe termen nelimitat una sau mai multe celule stem, controlând capacitatea lor
de auto -reînnoire și diviziunea în celulele fiice 13.
Nișa celulară reprezintă un micromediu specific, distribuit la nivelul organismului
precum măduva osoasă, creier, pancreas, piele, pulpa dentară, cu rol în reglarea procesului
de reparar e, regenerare și menținerea integrității tisulare de către celulele stem 13.
Semnale specifice derivate din zonele exacte ale nișelor stem permit celulelor să
rămână în viață, să își schimbe numărul și funcțiile. Matricea glicoproteică, celulele și
spațiile tridimensionale determinate de aceste structuri, formează ultrastructura nișelor
stem. Aceste elemente venind în contact determină apariția unor interacțiun i moleculare cu
rol important în reglarea funcțiilor celulelor stem. Proteinele au un control paracrin asupra
funcțiilor celule lor stem, rol important avâ nd și componentele non -proteice 14. Molecule
simple cum sunt ionii anorganici pot contribui la f uncționarea normală a nișei. Calciul și
alte produse metabolice ce influențează comportamentul celulelor stem reprezintă o
modalitate de reglare a funcțiilor celulelor stem. Stresul oxidativ afectează funcțiile și
soarta celulelor stem 15.
Moleculele solubile precum Wnt, Notch, factorul de creștere al fibroblaștilor etc.
sunt factori paracrini cu rol în reglarea funcțiilor celulelor stem, cu inducerea proliferării și
diferențierii acestora 15.
Receptorii Notch (Notch1, Notch2, Notch3) sunt proteine transmembranare ce
realizează legături cu genele Notch -specifice. Complexele Notch activează două sisteme
enzimatice -TACE/ADAM10 si γ-secretaza. Aceste sisteme enzimatice degradează
proteinele și eliberează componenta intermediară (NICD) ce conține semnale nucleare de
localizare 15. Componenta intermediară formează un complex cu proteina RBP -Jk/CBF1 ,
acest complex activează transcripția unor gene ce participă la proliferarea celulară sau la
menținerea celulei în stare nediferențiată. Semnalele Notch joacă un rol cheie în
determinarea naturii celulei stem și menținerea acestora prin activare sau inhib are. De
exemplu, pierderea simultană de Notch1 și Notch 2 conduce la dispariția progenitorilor
celulelor stem și le limitează potențialul de diferențiere (Riccio, 2008).
Caderinele, integrine le și alte molecule de adeziune au rol în interacțiunile celular e,
în semnalizare și polaritatea celulelor. Adeziunea prin intermediul caderinei și integrinei
este importantă și pentru orientarea axului celulelor stem din piele și creier 15.

27
Competiția celulelor stem pentru ocuparea unei nișe reprezintă un mecanism de
control al calități i celulelor și poate să îmbunătățească eficiența transplantării în
tratamentele cu celule stem. Adeziunea între celulele stem și nișa este reglată de caderina,
prin 2 mecanisme : prin intermediul celulelor st em propriu -zise și prin intermediul celulelor
nișei. Adeziunea poate fi reglată și de factori intrinseci derivați din celulele stem. Celulele
stem foliculare și germinale sunt ancorate la nivelul nișei prin intermediul caderinei.
Interacțiunile caderinei și integrinei cu celulele stem determină legarea acestora de nișă și
expunerea la diferite semnale emise de la nivelul nișei 16.

Dezvoltarea embrionară și originea celulelor stem
În ultimii 100 de ani s -au făcut eforturi masive în a înțelege mecanism ele
biochimice, moleculare și morfologice ale dezvoltării embrionare, de la fertilizare până la
naștere. Pentru a înțelege proprietățile celulelor stem este necesară trecerea în revistă a
dezvoltării embrionare timpurii. În cursul procesului de dezvoltare embrionară, diviziunea
celulei ou dă naștere unei diviziuni celulare simetrice, orientată în primul rând în creșterea
mărimii embrionului, prin acumulare de populații celulare nediferențiate, însă în curs de
specializare ulterioară în alte tipuri de celule . Celulele rezultate în urma diviziunii
simetrice sunt cunoscute sub numele de blastomere. Blastomerele rețin potențialul genetic
de a se divide și produce celule fiice, care vor deven i ulterior celule specializate.
Embrionul propriu -zis, cunoscut sub nume le de blastocist, este format din trei categorii
unice de celule: ectodermul primitiv, epiblastul și trofectodermul 12.
Dezvoltarea și organizarea anatomică a celor trei tipuri liniare este esențială
deoarece ele vor da naștere endodermului, mezodermului și ectodermului embrionului.
Este cunoscut faptul că identitatea uneia dintre cele 3 linii celulare este reglement ată de
factorul de transcriere CDx2. Supraexpresia de CDx2 în celulele stem embrionare le
determină să se diferențieze în trofoblaste și să prezinte caracteristici de celule stem
trofoblaste 12.
Cercetarea lui Martin Evans a arătat că embrionii pot fi obținuți in vitro cu succes
și celulele stem derivate se pot diferenția într -o varietate de tipuri celulare mature. Astfel,
celula stem (denumită și celulă sușă ) este definită ca o celulă care, prin diviziune , produce
două celule ce au capacitatea de a rămâne în stadiul de celulă stem (păstrând astfel
caracterul nediferențiat) sau de a se diferenția în urma unor div iziuni succesive. În acest
fel, celula stem se poate divide fie simetric (caz în care rezultă fie două noi celule stem, fie
două celule diferențiate), fie asimetric (rezultând o celulă stem și o celulă diferențiată).

28
Capacitatea celulei stem de a da nașter e unei celule identice se numește diviziune , iar cea
de a da naștere unor alte tipuri de celule se numește diferențiere, celula stem căpătând
astfel denumire de celulă pluripotentă sau multipotentă. Celulele stem se impart în două
mari categorii: celule st em embrionare și celule stem adulte 17, 18.

Originea țesutului Tipul celulei stem
adulte Linia celulară produsă
Sânge Sistemul circulator Adipocite
Osteocite
Măduva osoasă Angioblast Endoteliu matur și vase sanguine de
neoformație
Celule stem
hematopoietice Hepatocite
Celule stem
mezenchimale Adipocite
Condrocite
Osteocite
Neuroni
Condrocite
Cardiomiocite
Miocite
Măduvă osoasă fetală Celule stem
hematopoietice Celule roșii și celule albe
Țesut cerebral Celule stem neurale Celule musculare
Țesut cerebral adult și
fetal Celule neurale
progenitoare Astrocite
Neuroni
Oligodentrocite
Ficat fetal Celule stem
hematopoietice Hematii și leucocite
Cordon ombilical Celule stem
hematopoietice Hematii și leucocite
Osteoblaști
Tab.1. Clasificarea celulelor stem și capacitatea lor de diferențiere

29
1. Celulele stem embrionare .
Celulele stem embrionare, celule derivate din blastocist, pot da naș tere orică rui tip
de celul ă/țesut și se numesc și celule stem totipotente. Se pot obține din țesut embrionar,
însă din considerente etice utilizarea lor este restrânsă. Descoper irea celulei stem
embrionară a avut loc în 1981, când s -a reușit izolarea de celule de la un embrion de
șoarece, ia r cultivarea lor în medii diferite a dus la formarea mai multor tipuri celulare
prezente în șoarecele adult. După aceste reușite, cercetările și rezultatele au deve nit din ce
în ce mai edificatoare și mai cu seamă promițătoare 12,17.
În anul 1994, Bongo reușește să provoace dezvoltarea embrionilor supranumerari
obținuți prin fecundare in vitro, până la stadiul de blastocist, embrion de 5 zile. În acest
stadiu de dezvoltare a embrionului se diferențiază un grup de celule periferice, care sta u la
originea formării placentei și un grup de celule care formează masa centrală, butonul
embrionar. Autorul izolează și cultivă celule din butonul embrionar și constată că unele se
diferențiază , iar altele mor, după câteva zile. Echipa condusă de Thomson , în 1995,
izolează și cultivă celule stem embrionare de primate, iar trei ani mai târziu reușesc să
multiplice în cultură celule stem umane provenite dinr -un embrion în stadiu de blastocist
12.
În anul 1998, James Thomson, a izolat pentru prima dată tipuri de celule stem
pluripotente din embrioni de om; apoi s -a demonstrat că aceste celule au capacitatea de a
se specializa, având potențial regenerativ atunci când sunt plasate între celulele unui țesut
sau organ. Aceste celule se pot transforma în fiecare dintre cele peste 200 de tipuri ce lulare
ale adultului. Diferențierea și menținerea pluripotenței celulelor stem embrionar e are
nevoie de expresia câtorva factori de transcripție și proteine de suprafață, care asigură
supresia genelor care duc la diferențier ea și menținerea pluripotenței. Aceste celule
pluripotente necesită semnale specific e pentru diferențierea corectă, dacă sunt injectate în
alt corp. Datorită proprietăților sale combinate de expansiune nelimitată și pluripotentă,
celulele stem embrionare rămân o sursă teoretică pentru med icina regenerativă și
reînlocuirea tisulară după traumatisme și boli 12.
La începutul acestui mileniu cercetătorii au stabilit existența a trei tipuri de celule
stem, având caracteristici morfofuncționale distincte: celule stem de tip adult, de tip
embrionar și de tip fetal.

30
2. Celulele stem adulte
Celulele stem adulte sunt denumite și celule somatice și pot fi regăsite atât la copil,
cât și la adult. Ele pot fi definite ca celule nediferențiate, sunt rare și în general în număr
mic, adesea localizate printre organe și țesuturi adulte, care suferă procese de auto –
reînnoire. Ele au capacitatea de a se diferenția în una sau mai multe tipuri celulare
specializate ale acelui sistem de organe sau țesuturi. Celulele stem adulte sunt limitate în
capacitatea de diferențiere, definite ca fiind unipotente sau multipotente. Deseori sunt
numite celule stem somatice, denumirea deosebindu -le de celul ele stem de origine
embrionară. Măduva osoasă este una dintre cele mai bogat e surse de celule stem adulte,
însă cantitatea de celule stem scade pe parcursul înaintării în vârstă, iar la femeile fertile
este mai mică decât la bărbații de aceeași vârstă 12 17.
Începând cu studiile lui McCulloch și până în prezent, au fost d escoperite
multitudini de celule stem somatice, caracterizate prin potențialul lor de a popula țesuturi
și organe unde sunt necesare astfel de celule. Celulele stem adulte au fost descoperite în:
creier, măduvă osoasă, țesut cardiac, țesut hepatic, epiteli u ovarian, testicul, pulpă dentară,
sac folicular etc. Aceste celule pot oferi o sursă valoroasă pentru numeroase tratamente
medicale. În fiecare țesut menționat mai sus există o nișă de celule stem, un mediu ideal în
care celulele stem își au reședința. A ceastă nișă este responsabilă atât cu propagarea
celulelor stem, cât și cu diferențierea acestora în alte tipuri celulare. Trebuie menționat
faptul că celulele stem adulte au o capacitate finită de a suferi diviziune celulară, limitată
la una sau câteva de scendențe. Această proprietate le diferențiază de celulele stem
embrionare 17.
Experimentele efectuate pe șoareci cuprind celule stem generate direct din
fibroblastele adulte, însă mulți dintre aceștia nu sup raviețuiesc mult timp cu organe le
realizate. Terapiile cu celule stem adulte sunt folosite cu succes pentru mulți ani în cazul
leucemiei, a neoplaziilor osoase și sanguin e prin transplantul de măduvă. În cazul în care
celulele stem sun t obținute din autogrefă, riscul de rejecție este inexistent. Folosirea
acestor celule în cercetare și terapie nu este atât de controversată ca folosirea celulelor
embrionice 17.
Celulele stem adulte sunt dificil de identificat după fenotip. După mai mult de 20
de ani de cercetări, acest lucru este posibil, cel puți n la șoareci, folosind anticorpi
împotriva membrane i antigenelor și markeri ai ciclului celular. Cu toate acestea, chiar și în
acest caz rămâne imposibil de definit, în cadrul unei populații celulare, care celulă stem se
va comporta ca o bonă a CSH, capabi lă sa repopuleze 17.

31
Celule stem embrionare Celule stem adulte
Se pot diferenția în orice tip celular Au capacitate de difere nțiere într -un număr
limitat de tipuri celulare
Sunt relativ ușor de cultivat Sunt rare în țesuturi, dificil de cultivat in
vitro
Teoretic pot exista reacții de respingere a
celulelor stem embrionare implantate Nu există potenț ial de rejecție dacă celulele
stem sunt recoltate de la același individ la
care vor fi implantate după diferențiere
Tab.2. Celule stem embrionare versus celule stem adulte

3. Celulele stem hematopoietice
Celulele stem hematopoietice sunt definite ca fiind o populație heterogen ă de celule
stem multipotente care se pot diferenția în celulele mieloide sau limfoide, celule prezente
în sistemul sanguin adult. Celulele stem hepatopoietice adulte apar mai târziu în dezvoltare
și nu au legătură cu hemangioblastele, dar mecanismele de c ontrol transcripțional care
conduc la formarea timpurie a CSH în timpul embriogenezei joacă un rol important,
ulterior, în dezvoltarea fătului și chiar la adult 18.
În anul 1978, Schofield relata că CSH își au reședința într -o nișă a măduvei osoase,
aceasta fiind necesară pe tot parcursul vieții pentru generarea constantă a diferitelor tipuri
de celule sanguine. În ultimii patruzeci de ani, acest concept a fost extins, existând o
delimitare exactă între nișa măduvei osoase și ni șa vasculară tot cu rol în dezvoltarea CSH.
Endosteumul, interfața dintre măduva osoasă și os, este infiltrată cu celule osteoblastice
care secretă numeroase citokine ce dirijează dezvoltarea, întreținerea și comportamentul
CSH de la nivelul nișei endost eale. Sâng ele, vascularizația sunt indispensabile dezvol tării
embrionare, ele fiind astfel primele țesuturi diferențiate. Hematopoi eza primară a
embrionului are loc mai înt âi în sacul vitelin, în placentă și ficat, stabilizându -se ulterior în
măduva osoasă f etală. Mai multe structuri, linii germ inative produc celule sanguine î n
timpul dezvoltării. Celule sanguine endoteliale prezente în aorta dorsală și posibil și în alte
organe, aprovizionează embionul cu celule stem hemato poietice. Mecanismele celulare ș i
moleculare implicate în acest process au fost analizate pe culturi de stromă și celule
hematopoietice. De exemplu, culturile de celule endoteliale folosesc factori angiocrini
pentru a regla diferențierea celule lor progenitoare sau auto -reînnoirea 18.

32
Deși celulele stem hemat opoieti ce au fost detectate iniț ial în regiunile endosteale
ale măduvei osoase, studii recente arată existența lor și la nivelul nișei perivasculare, unde
au fost descoperite celule stem progenitoare. Studii elaborate de Mendez -Ferrer au arătat
ca celulele retic ulate perivasculare, care exprimă CXCL12, joacă un rol important în
întreținerea numărului de celule stem hematopoietice. Ding și colaboratorii confirmă
ulterior rolul direct al celulelor perivasculare în hematopoieză 18.
În anul 1970, Friedenstein și colaboratorii au identificat exi stența celulelor stem
mezenchimale ca formatoare de colonii de unități de fibroblaste. Prima descriere a
potențialului de tri -descendență a CSM a fost detaliată de Pittenger și colaboratorii și a
avut o mare importanță în înțelegerea acestor tipuri celular e unice. CSM se folosesc în
ingineria tisulară și au multiple aplicații terapeutice datorită multipotențialului lor și ușoara
izolare din numeroase țesuturi. Studiile actuale prezintă capacitatea CSM de auto –
reînnoire, de diferențiere, nișele biologice și mecanismele molecu lare de dezvoltare ale
acestora 19.

C. Funcțiile celulelor stem și caracteristicile acestora
1. Potența celulară
Diferențierea celulară este indusă de stimuli interni și stimuli externi. Stimulii
interni sunt reprezentați de bagajul genetic al celulei respective, iar stimulii externi de
factorii de contact, semnalele intercelulare (molecule secretate de celule învecinate) și
factori prezenți în mediul extracelular. Există însă și probleme în acest sens, iar celulele
stem rămân încă la stadiul d e studii și experimente, deoarece mai trebuie identificate seturi
de factori care determină diferențiere unei celule într -o direcție sau în alta. 20

Potențialul de
difer ențiere Numărul tipurilor
celulare în care se
pot diferenția Exemple de celule
stem Tipuri de celule
rezultate
Celule
totipotente toate Zigotul, blastomerele Orice tip celular
Celule
pluripotente Toate, cu excepția
celulelor embrionare Celulele stem
embrionare umane Celule provenite din
straturile embrionare
Celule
multipotente Un număr mare Celulele
hematopoietice Celule cardiace,
hepatice, sanguine,

33
scheletale
Celule
oligopotente Un număr mic Precursorii mieloizi Monocite, macrofage,
eritrocite, neutrofile,
eozinofile
Celule
cvadripotente 4 Celulele progenitoare
mezenchimale Astrocite și
oligodentrocite
Celule tripotente 3 Precursori gliali
Limfocite B, macrofage

Celule bipotente 2 Precursori bipotenț i
din ficatul fetal
murin Mastocite
Celule
unipotente 1 Precursori
mastocitari Nu se divid
Celule
nulipotente Niciun tip Eritrocite
Tab.3. – Potențialul de diferen țiere al celulelor: clasificare

Totipotența
Reprezintă proprietatea unei singure celule, care în urma diviziunii produce toate
tipurile celulare diferențiate din organism. Un astfel de exemplu de totipotență îl reprezintă
zigotul, prima diviziune celulară existentă după fecundarea ovulului de către spermatozoid.
În urma procesului de fecundare, dezvoltarea umană începe prin prezența unei singure
celule, totipotente -zigotul. Ulterior, acesta se divide în celule identice totipotente, care
ulterior formează endodermul, mezodermul și ectodermul 21.
În urma celei de -a 16-a diviziuni, cel ulele totipotente ale morulei se diferențiază în
celule care vor deveni masa internă a blastocistului sau a trofoblastului exterior. La 4 zile
după fertilizare și după multiple cicluri de diviziune, celulele totipotente încep să se
specializeze, iar masa c elulară interioară, sursa celulelor stem devine pluripote ntă 21 22.

Pluripotența
Există o singură celulă stem care are potențial pluripotent și se poate diferenția în
oricar e dintre cele trei straturi germinale – celulele stem embrionare umane. Celulele

34
nonpotente pot fi derivate artificial în celule stem pluripotente, iar un astfel de exemplu
este celula somatică adultă, la nivelul căreia se induce o expresie forțată a anumitor gene și
factori de transcriere. Deși reprezintă un real avantaj, deoarece s -ar elimina controversele
etice referitoare la celulele embrionare, celulele stem cu pluripotență indusă prezintă și
dezavantaje precum îmbătrânirea celulal ară precoce, pot ențialul tumorigen și de aceea nu
au fost aprobate în cercetările clinice 21.

Multipotența
Reprezintă potețialul celulelor progenitoare de a se diferenția în alte tipuri celulare,
însă un număr limitat. De exempl u, celula hematopoietică se poate diferenția în limfocit,
monocit, neutrofil, etc, dar nu se poate diferenția în alte tipuri celulare nonsanguine. Există
studii care demonstrează că au totuși potențial de regenerare în tipuri celulare neînrudite.
Un astfel de experiment a arătat că fibroblastele au fost tran sformate în neuroni
funcționali17. Celule multipotent e au fost prelevate și din stroma mezenchimală a
molarului trei. Celulele stem multipotente prelevate de la nivelul dinților sunt niște surse
importante, ușor de prelevat și este demonstra t faptul că acestea se pot dife renția în
osteobla ste, condrocite, ad ipocite, etc . 21.

Oligopotența
Reprezintă potențialul celulelor de a se diferenția în alte tipuri celulare, însă în
număr mic. Exemple ale acestei categorii sunt celulele stem limfoide și mieloide. De
exemplu, o celulă limfoidă poate da naștere unei celule B sau T, dar nu se poate diferenția
în eritrocit 21.
Unipotența
Reprezintă potențialul unei celule de a se diferenția într -un singur tip celular. Un
astfel de exemplu î l reprezintă precursorii mastocitari 21.

2. Celulele stem mezenchimale: potențialul de auto -reînnoire și menținere
Potențialul de auto -reînnoire se referă la acele căi biologice și mecanismele prin
care unele celule stem rămân nediferențiate. LIF – factorul inhibitor al leucemiei, FGF –
factor de creștere fibroblas tică și WNT, împreună cu alți factori de creștere și citokine,
sunt implicați în menținerea sur sei de celule stem mezenchimale 19. Factorii enumerați mai
sus au un rol important în procesul de auto -reînnoire al CSM, în menținerea acestora
nediferențiate. LIF, o citokină pleiotropică menține starea de celulă stem mezenchimală,

35
activează sau blochează activitățile osteoblastelor și osteoclastelor. Mecanismele ac țiunii
LIF în procesul de auto -reînnoire al celulelor stem mezenchimale este încă necunoscut, dar
pot fi implicate mecanisme paracrine cu celulele învecinate 17.
O altă cercetare arată că Wnts poate fi de asemenea implicată în procesul de
menținere al celulelor stem mezenchimale, așa cum face și în cazul reînnoirii celulelor
neurale, hematopoietice, dermice, intestinale. Celulele stem mezenchimale ale unor specii
de mamifere sunt expresia unor markeri celulari stem embrionici: oct -4, sox-2, rex -1 17.

3. Potențialul de diferențiere al celulelor stem mezenchimale
Pentru a analiza potențialul de diferențiere al celulelor stem mezenchimale, este
necesară cunoașterea provenienței tisulare a acestora. În prezent se izolează celule stem din
măduva osoasă și din alte țesuturi mezodermale precum țesutul adipos, țesutul mu scular,
osos sau din tendoane.
Numeroase studii demnostrează că există potențial de diferențiere al celulelor stem
și din țesuturi fără origine mezodermală, experimente făcute pe țesuturi de șoarece de la
nivel cerebral – creier, rini chi, timus, ficat, pa ncreas, plămâ n. Există oare o nișă de celule
stem mezenchimale comună tuturor acestor țesuturi sau CSM funcționează autonom, într -o
manieră independent de mediul lor? 21

4. Condrogeneza . Osteogeneza. Miogeneza. Tendogeneza. Adipogeneza
Studiile realizate la nivelul celulelor stem mezenchimale arată că acestea prezintă
potențial condrogenetic de diferențiere, potențial care realizat in vitro imită procesul de
dezvoltare cartilagino asă realizat in vivo 19. Markerii d e expresie pozitivi asociați
diferențierii condrogenetice sunt SOX -9, scleraxis, tipuri de colagen II și IX, proteine
agrecan și biglican, matrice proteică oligomerică cartilaginoasă și alții. Ca și în celelalte
cazuri, potențialul de diferențiere condroge netică este momentan incompl et deslușit , însă
s-a demonstrat că proteinele recombinate sau infecțiile adenovirale ale celulelor stem
mezenchimale cu TGF -B1, TGF -B2, BMP -2, BMP -4, BMP -6, BMP -12, BMP -13 și GDF –
5 induc rapid condrogeneza CSM, dintr -o varietat e de țesuturi mezodermale 19.

Osteogeneza
Studiile arată că markerii BMP -2 și BMP -6 induc osteogeneza celulelor stem
mezenchimale. BMP -2 induce acetilarea mediată a p300 Runx2, o genă osteogenică a căre i

36
răspuns este transactivarea Runx2. Procesul de acetil are este specific histonelor
deacetilazelor 4 și 5, prin deacetilarea Runx2 și degradarea u lterioara prin Smurf1 și
Smurf2 19. Citokina Tnf -α, asociată cu degradarea osoasă inflamatorie, mediază și
degradarea de Smurf1 și Smurf2. Studii realizate pe șoareci arată niveluri crescute de
Smurf1 și Smurf2, concomitente cu niveluri scăzute de proteină Runx2. Aceste constatări
sugerează că abordările terapeutice ale celulelor stem mezenchimale bazate pe ingineria
tisulară, BMP, Runx2 și deacetilarea histonelor, pot spori imunoterap ia TNF -α în
distrucțiile osoase 19. Wnts au un rol important în inițierea și producerea osteogenezei. Noi
descoperiri referitoare la mecanismul de for mare osoasă și pierderea globală de gene
osteogene runx2, reprezintă importante modele în în țelegerea reglării transcripționale a
osteogenezei și potențialului celulelor stem mezenchim ale de diferențiere descendentă 23.

Adipogeneza
PPARY, hormonul receptor peroxizom al activării proliferării y stimulează
potențialul adipogenic al celulelor stem mezenchimale și inhibă potențialul osteogenetic, în
timp ce TAZ, un coregulator al Runx2 stimulează osteogeneza și inhibă adipogeneza.
Acest mecanism este plauzibil, ținând cont c ă ambele linii celulare derivă dintr -o sursă
comună de celule stem mezenchimale 19.

Miogeneza
Studiile efectuate pentru demonstrarea potențialului miogenetic al celulelor stem
mezenchimale s -au bazat pe o mică populație de celule stem scheletice, derivate din
mușchi sau celule satelite. În cadrul unui studiu recent s -a demonstrat potențialul crescut
de inducere a procesului de miogeneză al celulelor stem mezenchimale, după
transformarea și activarea Notch 1, însă mecanismele de a cțiune sunt incomplet cunosc ute
19. Alte studii de succes au arătat importanța contactului celulă -celulă în stimularea
potențialului cardiomiogenetic. Astfel, s -au utilizat culturi de celule stem mezenchimale și
cardiomiocite, urmărind stimularea celulelor stem și producerea de cardiom iocite, într -un
experiment de infarct miocar dic realizat pe șoarece 19.

Tendogeneza
Studii realizate cu ajutorul proteinele GDF, aparținătoare ale familiei TGF -β, au
demonstrat posibilitatea de transformare în tendoane, in vivo. Ca și celelalte, diferen țierea
specifică a genelor marker în tendogeneza celulelor stem mezenchimale este parțial

37
cunoscută. Studii recente arată că R -Smad8, tradusă specific prin semnale BMP -2 in
murina C3H10T12, transformă mai degrabă celulele în tendocite, în defavoarea
osteo blastelor. Domeniul de activare R -Smad8 poate fi utilizat în a forma complexe de
transcriere specifice în diferențierea tendogenetică 19.

D. Surse de celule stem de la nivelul feței
Țesuturile faciale reprezintă o varietate importantă, nu doar din punct de vedere
estetic, cât și funcțional: ele sunt necesare pentru funcții precum respirația, vorbirea,
mirosul, mestecatul etc. În cazul anomalilor congenitale, în infecții sau în urma
traumatismele, o parte dintre țesuturile faciale lipsesc. De aceea, este abso lut necesară
reconstrucția acestora din punct de vedere estetic și funcțional 25.
În urma experimentelor efectuate, s -a demonstrat că celulele stem de la nivelul
țesuturilor oro -faciale pot fi o importantă sursă celular ă folosită în reconstrucție, însă încă
sunt necesare multe cercetări științifice în acest domeniu, pentru demonstrarea
potențialului, limitărilor și utilitatea lor la nivelul ființelor umane. Sursele stem celulare de
la nivelul faciesului sunt reprezente d e: structuri dentare – pulpa dentară, sacul folicular al
dinților incluși, glande salivare, mușchi masticatori oro-faciali, nișa retrodiscală 25.
În ultimii ani, cercetările au demonstrat că ce lule de origine ectodermală sau
mezodermală localizate la nivel oro -facial, au proprietăți de auto -reînnoire, diferențiere
multiliniară și potențial de inducere a formării tisulare in vivo. Există două tipuri de celule
stem progenitoare la nivel facial: c elulele stem progenitoare provenite de la nivelul
țesuturilor conjunctive: pulpa dentară, ligamentul periodontal, lamina propria a mucoasei
orale, porțiunea retrodiscală a articulației temporo -mandibulare și alt tip de celule stem,
provenite din epiteliul oral, glandele salivare ș i dezvoltarea organelor dentare 17.
Celulele stem oro -faciale exprimă o gamă largă de markeri molecul ari, markeri
atribuiți de asemenea și celulelor stem din măduva osoasă, dar exprimă puțină informație.
Markerii moleculari exprimați sunt: CD14, un marker imunologic înnă scut, CD31
PECAM -1, CD34, CD45. Până în prezent nu s -a descoperit niciun marker celular de
suprafață care să identifice populațiile stem celulare sau să poată diferenția celule stem
izolate di n diferite țesuturi oro -faciale 26. Celulele stem din pulpa dentară, lamina proprie
orală, ligamentul periodontal e tc sunt o populație celulară heterogenă, care pare a fi supusă
unei proliferări mai rapide ex vivo, comparativ cu celulele stem din măduva osoasă.
Această descoperire, în schimb, nu garantează reușita folosirii acestora în diferite scopuri
terapeutice 25.

38
1. Celule stem de origine conjunctivă
Celulele stem hematopoietice localizate în măduva osoasă sunt formate de celulele
stromale și osteoblaste. Celule stromale ale măduvei osoase sunt denumite astfel deoarece
indică localizarea lor, iar ca funcții primare ele realizează hematopoieza și au capacita tea
de a genera os heterotopic. Ținând cont că mezenchimul există doar în perioada prenatală,
vom folosi în continuare termenul de celule stem ale țesutului conjunctiv, făcân d referire la
celulele stem postnatale, incluzând aici pulpa dentară, ligamentul periodonta , papila
apicală și lamina proprie a mucoasei orale 26.
Celulele stem conjunctive din teritoriul oro -facial sunt celule mononucleate, celule
aderente. Ex vivo, diferențierea celulelor aderente mononucleate în osteoblaste, condrocite
și adipocite reprezintă certitudinea că acestea sunt celule stem. În schimb, deși ex vivo are
loc acest fenomen, in vivo, diferențierea celulelor stem în mul tiple linii celulare, sunt
departe de a fi celule stem pure 26.

2. Celulele stem de la nivelul ligamentului periodontal
Rădăcina dintelui este atașată osului alveolar prin intermediul ligamentului
periodontal. Acest ligament conț ine vase de sânge, nervi și contituie o zonă de amortizar e
a forțelor între os și dinte. Pe lângă funcția de absorbant al presiunilor exercitate în
masticație, ligamentul periodontal menține și homeostazia periodontală și cementară.
Celulele folicului dent ar, cu origine în creasta neurală derivată din mezenchim, se
diferențiază în celule care formează ligamentul periodontal, prezente și în dezvoltarea
germenulu i dentar și a rădăcinii dentare 26.
Celulele izolate de la nivelul li gamentului periodontal al dinților extrași sunt
reprezentate de: cementoblaști, adipocite, celule formatoare de colagen și exprimă markeri
imunologici precum Stro -1 și CD146. În comparație cu tendinopatia unde țesutul adipos se
acumulează în tendon, la niv elul țesutului periodontal nu se acu mulează țesut adipos, ceea
ce rezultă că celulele stem din această regiune sunt incapabile de adipogeneză. Celulele
stem de la nivelul ligamentului periodontal au rol în reparația tisulară prin proprietatea
acestora de a suprima celulele inflamatorii. Aceste descoperiri arată că celulele stem
faciale reprezintă mai degrabă celule de se mnalizare în vindecarea rănilorși nu celule de
înlocuire 26.

39
3. Celulele stem de la nivelul mucoasei orale
Epite liul mucoasei orale este reprezentat de epiteliul oral, subiacent acestuia
aflându -se țesut conjunctiv, reprezentat de lamina propria. De la nivelul epiteliului
mucoasei orale au fost izolate celule mononucleate și aderente, celule cu un potențial mare
de proliferare ce se presupun a fi ce lule stem, celule progenitoare. Celulele stem de la acest
nivel diferă de celulele stem din pulpa dentară sau ligamentul periodontal datorită
expresiei lor cu marker CD49d – integrina a2 sau VLA -4. În schimb, acestea prezi ntă o
slabă expresie de transcrip ție a factorilor precum Runx2. Inițial s -a descoperit faptul că
celulele stem mezenchimale participă la regenerarea tisulară, însă, date recente arată că
acestea interacționează cu celule imune și celule inflamatorii care i nfiltrează țesutul lezat.
In vitro, celulele ste m gingivale -macrofage obțin un răsp uns anti -inflamator fenotip T2. In
vivo s -a obținut același rezultat, celulele stem gingivale intervenind în reparația tisulară.
Macrofagele T2 polarizate au un rol important în procesul de vindecare inflamatorie,
datorită proprietăților acestora și anume: eliberează factori trofici și suprimă secreț ia de
citokine pro -inflamatorii 26.

4. Celulele stem epiteliale oro -faciale: dintele ca model
Dezvoltarea dintelui reprezintă un model clasic de intera cțiune epitelial –
mezenchimală. Atenția este atrasă de incisivii rozătoarelor care continuă să erupă și să
crească pe tot parcursul vieții, acest aspect fiind interesant de studiat și demonstrat .
Mineralizarea smalțului și a dentinei, în comparație cu pulpa dentară
nemineralizată, oferă o unică oportunitate de a studia contrastul realizat de o singură
origine stem celulară, papila dentară, care se diferențiază în țesuturi mineralizate și țesuturi
nemineralizate. Există puține studii făcute în acest sens, însă trebuie amintită descoperirea
recentă care arată că o axă stem celulară de la nivelul glandelor salivare, prin intermediul
semnalelor acetilcolinei, a crescut potențialul de proliferare și morfo geneză a keratinei 5 –
pozitive de progenitori stem, în timp ce inervația parasimpatică a menținut populația stem
epitelială progenitoar e (Knox și colaboratorii, 2010) 26 27.

40
IV. Material și metodă de studiu
A. Material biologic
Pentru acest studiu au fost prelevate specimene bioptice – pulpe dentare adulte
clinic sănătoase, de la 5 pacienți obținute cu consimțământul informat al acestora .
Cazurile donatoare a u avut v ârsta medie de 30 de ani , iar sex ratio a fost de 3:2.
Motivul extracțiilor: boală parodontală sau extracții în scop ortodontic
B. Metoda de prelevare a țesuturilor
Protocol de prelevare a pulpei dentare de la nivelul molarilor de minte semi -incluși:
anestezie, incizie mucoasă, sind esmotomia – secționarea ligamentelor alveolo -dentare
superficiale, extracția propriu -zisă cu ajutorul elevatoarelor și a cleștilor de extracție.
Ulterior extracțiilor, dinții au fost secționați în două jumătăți, astfel: cu ajutorul unei freze
diamantate de formă cilindrică, de turbină, s -au realizat două șanțuri pe fețele mezială și
distală a molarilor, cu unirea acestora pe linie mediană. Au rezultat astfel două jumătăți
dentare în interiorul cărora s -a obser vat pulpa dentară, încă vitală. Aceasta a fost
îndepărtată cu ajutorul unui ac Tirre -nerfs, depozitată în recipiente speciale, în formol
tamponat 8 % și introdusă la frigider la o temperatură de 5 grade Celsius.
C. Metoda imunohistochimică
1. Pregătirea lamelor de microscopie
Specimenele tisulare au fost fixate timp de 24 ore în formol tamponat (8%) și au
fost prelucrate cu un histoprocesor automat (Diapath, Martinengo, BG, Italy), cu includere
în parafină. Secțiunile au fost tăiate manual la 3 micrometri și au fost montate pe lame de
sticlă electrostatice SuperFrost® (Thermo Scientific, Menzel -Gläser, Braunschweig,
Germany) pentru imunohistochimie. Pentru aprecierea histologică am folosit secțiuni
groase de 3 micrometri colorate cu hematoxilină -eozină.
2. Anticorpii primari utilizați
Am folosit anticorpi pri mari pentru:
1. CD10 (clona 56C6, Biocare Medical, Concord, CA, USA, 1:20);
2. CD117/c -kit (rabbit monoclonal, clona Y145, Biocare Medical, Concord, CA,
USA, 1:100);
3. CD34 (mouse monoclonal, clona QBEnd/10, Biocare Medical, Concord, CA, USA,
1:50);
4. CD45 (mouse monoclonal, clona PD7/26, Biocare Medical, Concord, CA, USA,
ready -to-use);

41
5. nestină (mouse monoclonal, clona 10c2, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz,
CA, USA, 1:500);
6. Stro-1 (mouse monoclonal, clona STRO -1, Sigma -Aldrich, Sigma -Aldrich Co.,
MO, USA, 1:1 00);
7. enolaza neuron -specifică (neuron -specific enolase, NSE, mouse monoclonal, clona
BBS/NC/VI -H14, Dako, Glostrup, Denmark, 1:200);
8. CD 105 (policlonal, Thermo Scientific, Pierce Biotechnology, Rockford, USA,
1:50).
3. Metoda imunohistochimică
Pentru imunoma rcarea cu CD34, Stro -1 țesuturile au fost deparafinate și hidratate,
apoi au fost blocate peroxidazele endogene cu Peroxidazed 1 (Biocare Medical, Concord,
CA, USA). Pentru digestia enzimelor s -a folosit tripsina – Carezyme I. Biotina endogenă a
fost bloc ată și s -a aplicat blocant de background pentru a reduce colorația nespecifică. A
fost aplicat anticorpul primar la diluția indicată, la temperatura camerei, pentru 60 minute.
Apoi a fost folosită o detecție în doi timpi cu HRP (horseradish peroxidase) cu un sistem
de detecție 4 plus, fiind aplicat un cromogen (DAB) compatibil cu HRP. Secțiunile au fost
supracolorate cu hematoxilină (albastru) și clătite cu apă deionizată. Pentru spălare s -a
folosit soluție TBS (Tris -Buffered Saline) la pH de 7,6.
Pentru i munomarcarea cu CD10 și CD45 țesuturile au fost deparafinate și hidratate,
apoi au fost blocate peroxidazele endogene cu Peroxidazed 1 (Biocare Medical, Concord,
CA, USA). Pentru descoperirea la căldură a epitopului a fost utilizată o cameră de
demascare – Decloaking Chamber (Biocare Medical, Concord, CA, SUA) și soluție de
recuperare pH 6 (Biocare Medical, Concord, CA, SUA) care este un tampon formulat
special pentru stabilizarea pH -ului la temperaturi ridicate. S -a folosit Background Blocker
(Biocare Med ical, Concord, CA, USA) pentru a reduce colorația de fond nespecifică.
Anticorpii primari au fost aplicați la diluțiile specifice respective. A fost folosit sistemul de
detecție MACH 4 (Biocare Medical, Concord, CA, USA) care este o metodă de detecție cu
HRP universală în doi timpi (probă/polimer). A fost aplicat un cromogen (DAB) HRP –
specific. Secțiunile au fost supracolorate cu hematoxilină (albastru) și clătite cu apă
deionizată. Pentru spălare s -a folosit soluție TBS (Tris -Buffered Saline) la pH de 7,6.
Pentru imunomarcarea cu CD117/c -kit, nestină țesuturile au fost deparafinate și
hidratate, apoi au fost blocate peroxidazele endogene cu Peroxidazed 1 (Biocare Medical,

42
Concord, CA, USA). Pentru descoperirea la căldură a epitopului a fost utilizată o ca meră
de demascare – Decloaking Chamber (Biocare Medical, Concord, CA, SUA) și soluție de
recuperare pH 6 (Biocare Medical, Concord, CA, SUA) care este un tampon formulat
special pentru stabilizarea pH -ului la temperaturi ridicate. S -a folosit Background Bl ocker
(Biocare Medical, Concord, CA, USA) pentru a reduce colorația de fond nespecifică.
Anticorpii primari au fost aplicați la diluțiile specifice respective. A fost folosit sistemul de
detecție MACH 2 rabbit HRP polymer detection (Biocare Medical, Concor d, CA, USA)
care constă dintr -un singur reactiv aplicat peste anticorpul primar. A fost aplicat un
cromogen (DAB) HRP -specific. Secțiunile au fost supracolorate cu hematoxilină (albastru)
și clătite cu apă deionizată. Pentru spălare s -a folosit soluție TBS (Tris -Buffered Saline) la
pH de 7,6.
4. Documentarea rezultatelor
Lamele de microscopie au fost analizate; au fost făcute microfotografii care au fost
scalate pe o stație calibrată. Am utilizat o stație de lucru Zeiss compusă dintr -un microscop
AxioImager M1 cu o cameră AxioCam HRc și comandat printr -un software de procesare
digitală a imaginii microscopice AxioVision (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany).

43
V. Rezultate
Am evaluat pe lame fenotipul CD10 la nivelul pulpei dentare ( fig.1, fig.2 ). Am
observat că stroma pulpei dentare a prezentat o rețea celulară bine reprezentată cu fenotip
CD10 -pozitiv. Celulele stromale ale acestei rețele au prezentat de regulă morfologii
multipolare. De asemenea, endotelii microvasculare au exprimat CD10. Am î n vedere
faptul că acest marker indică potențial stem, fapt ce asociază capacitatea clonogenică și de
multidiferențiere cu celulele endoteliale ale pulpei dentare.
Enolaza neuron -specifică a fost exprimată, în conformitate cu specificitatea sa
neurală, în nervi pulpari ( fig.3, fig,4 ). Aceasta a permis identificarea pe lamele de
microscopie a componentelor plexului Raschkow din mantaua pulpară ( fig.4). Ocazional,
enolaza neuron -specifică a fost exprimată și în endotelii microvasculare pulpare ( fig.4)
fapt ce poate indica un multi – sau bi -potențial nativ al celulelor endoteliale.
Expresia Stro -1 în pulpa dentară ( fig.5, fig.6, fig.7 ) a fost pozitivă în celule
stromale și în celule endoteliale microvasculare. În mantaua pulpară am decelat două
subseturi de celu le, unele Stro -1-negative, altele Stro -1-pozitive. De asemenea celule
endoteliale au prezentat fenotip Stro -1+, ceea ce a sugerat faptul că atât celulele
endoteliale cât și cele stromale care au exprimat Stro -1 ar putea aparține liniei celulare
endoteliale .
Endoteliile microvasculare au exprimat de asemenea CD34 ( fig.8) și endoglina
(CD105) ( fig.15 ). De asemenea am pus în evidență celule stromale izolate care au
exprimat pozitiv CD45 (fig.9), marker hematopoietic. Însă, astfel de celule nu au exprimat
CD34. Am interpretat lipsa de corelare între cele două fenotipuri moleculare prin aceea că
expresia singulară a CD45 indică mai degrabă celule ale sistemului imun. Endoglina a fost
exprimată și în celule stromale izolate.
Rețelele stromale ale pulpei dentare au fost de asemenea marcate pozitiv cu
anticorpul anti -nestină ( fig.10, fig.11, fig.12 ). Celulele stromale nestin -pozitive au avut
morfologie multipolară și prelungiri decelabile, dihotomice. De asemenea, expresia
nestinei a fost puternică în stratul odontoblastelor. Mai mult, endotelii microvasculare au
exprimat pozitiv nestina.
Rețelele stromale pulpare au exprimat de asemenea pozitiv CD117/c -kit (fig.13,
fig.14 ). Expresia c -kit nu a fost su perpozabilă cu expresiile CD34 și CD45, ceea ce a
exclus interpretarea c -kit în corelație cu linia hematopoietică. Corelația pozitivă dintre

44
fenotipurile c -kit+ și nestină+ indică mai degrabă o populație stromală cu potențial stem
sau progenitor.

45

Fig. V-1 – Imunoexpresia pulpară a CD10.

Fig. V-2 – Pulpă dentară adultă, imunomarcare cu CD10. Miez pulpar cu vase largi de tip
arteriolar și nervi. Stroma pulpară exprimă CD10 la nivelul unei rețele globale de celule
stromale. Capilare născânde cu fenotip CD10 pozitiv.

46

Fig. V-3. Pulpă dentară adultă, imunomarcare cu enolază neuron -specifică. Antigenul este
exprimat pozitiv într -un nerv pulpar de calibru important secționat oblic. În partea
inferioară a imaginii este un tandem neuro -vascular cu un nerv pulpar de calibru mic ce
exprimă enolaza neuron -specifică. Vasul respectiv are calibru mare și perete subțire, este
deci de tip venulă. Celulele endoteliale exprimă enolază neuron -specifică și se identifică
celula perivasculară cu fenotip NSE pozitiv. NSE nu este exprimat în mantaua pulpară.

Fig. V-4. Pulpă dentară adultă, imunomarcare cu enolază neuron -specifică. Celule din
mantaua pulpară, plexul subodontoblastic, nu exprimă antigenul, însă endoteliile pulpare,
vasculare nu exclusiv. Celule stromale izolate, fibroblastoide, exprimă NSE.

47

Fig. V-5. Pulpă dentară adultă, imunomarcare cu STRO -1. Mantaua pulpară cu expresie
heterogenă. Endotelii imunonegative.

Fig. V-6. Pulpă dentară adultă, imunomarcare cu STRO -1. Două celule Stro -1 pozitive, de
talie mare, rotund ovalare, la limita dintre miezul pulpar și mantaua pulpară, par a
configura lumene vasculare.

48

Fig. V-7. Pulpă dentară adultă, imunomarcare cu STRO -1. Celule stromale de aspect
fibroblastoid, aparent lipsite de prelungiri, exprimă Stro -1. Expresia endotelială a Stro -1
în endoteliile microvasculare este heterogenă.

Fig. V-8. Pulpă dentară adultă, imunomarcare cu CD34. Expresia exculsivă a antigenului
în celulele endoteliale vasculare. Celulele mantalei pulpare sunt CD34 negative. Rețelele
stromale pulpare sunt de asemenea CD34 negative.

49

Fig. V-9. Pulpă dentară adultă, imunomarcare cu CD45. Expresia CD45 într -o celulă
stromală pulpară aparent lipsită de prelungiri.

Fig. V-10. Pulpă dentară adultă, imunomarcare cu nestină. Rețeaua stromală a miezului
pulpar exprimă nestină. La limita miez -manta o celulă de talie mare, cu raport nucleu –
citoplasmă mare și prelungiri dihotomice sugerează un fenotip stem.

50

Fig. V-11. Pulpă dentară adultă, imunomarcare cu nestină. Vas pulpar cu perete gros,
înglobat în stroma nestin -pozitivă.

Fig. V-12. Pulpă dentară adultă, imunomarcare cu nestină. Mantau a pulpară nestin –
pozitivă. Expresia puternică a antigenului în stratul odontoblastelor.

51

Fig. V-13. Pulpă dentară adultă, imunomarcare cu CD117/CD -kit. Expresie consistentă,
dar heterogenă CD117/CD -kit în mantaua pulpară.Pulpă dentară adultă, imuno -markare
cu CD117/ c-kit. Nervi pulpari imuno -negativi. Rețea stromală pulpară C -kit pozitivă,
construită din celule multipolare cu prelungiri. Sunt identificate și celule C -kit pozitive
apolare. Expresia C -kit este heterogenă în stroma pulpară.

Fig. V-14. Pulpă dentară adultă, imunomarcare cu CD117/CD -kit. Nervi pulpari imuno –
negativi. Rețea stromală pulpară C -kit pozitivă, construită din celule multipolare cu
prelungiri. Sunt identificate și celule C -kit pozitive apolare. Expresia C -kit este heterogenă
în stroma pulpară.

52

Fig. V-15. Pulpă dentară adultă, imunomarcare cu CD105. Expresia CD105 pozitivă în
endoteliile vasculare, dar și în celulele izolate ale stromei pulpare , cu nuclei
heterocromatici și citoplasmă puțin ă.

53
VI. Discuții

Denumirea de celule stem (CS) se referă la o varietate mare de celule provenite din
diferite surse. Celulele stem sunt prezente în cele mai multe, d acă nu toate organismele
multicelulare și sunt cei mai importanți factori ai creșterii și regenerării. Ele sunt defin ite
ca celule biologice capabile de auto -reînnoire și diferențiere într -o varietate de alte tipuri
celulare. Celulele stem sunt considerate cele mai importante componente biologice
necesare creșterii și dezvoltării corecte în timpul embriogenezei 17.
Celulele stem se î mpart în două mari categorii: celule stem embrionare și celule
stem adulte. Celulele stem embrionare sunt celule totipotente, capabile de diferențiere în
orice alt tip de celulă, însă controversele bioetice și legale, la care se adaugă o rată crecută
a rejetului după transplantarea CS embrionare și asocierea cu formarea de teratoame, face
ca acestea să nu fie folosit e în prezent în medicina regenerativă 17.
De aceea, o mai mare atenție au atras celulele stem adulte cu potențial promițător î n
viitor, în medicina regenerativă. CS mezenchimale au fost izolate din aproape toate
țesuturile: măduvă osoasă, creier, ficat, mușchi scheletic, păr, periost, lichid amniotic,
pulpa dentară, sac folicular, glande salivare etc. Spre deosebire de celulele s tem
embrionare, acestea nu prezintă potențial de rejecție dacă sunt recoltate de la același
individ la care vor fi implantate după diferențiere 19.
În încercările de identificare a surselor de CS mezenchimale, cercetătorii au
confirmat că acestea se găsesc adiacent vaselor de sânge. Pericitele, denumite și celulele
lui Rouget sau celule murale, reprezintă celule perivasculare, localizate în jurul celulelor
endoteliale din capilare și microvase (peri=în jurul, cyte=celulă). Acestea au fost
descoperite pentru prima dată în anul 1873, de către Rouget și denumite celule
adventiceale nepigmentate, iar în anul 1923, Zimmermann le -a denumit “pericite”. Alte
denumire utilizate pentru pericite sunt: “celule pericapilare intramembranare”, „celule
Rouget”, „celule peric apilare”, „celule perivasculare”, „celule adventițiale”, „celule
nediferențiate”, „celule periendoteliale”. Pericitele au fost descoperite la nivelul capilarelor
din creier, din retină, din cortexul cerebral și la nivelul nervului optic 8.
Pericitele sunt celule heterogene care includ toate celulele localizate perivascular
cu morfologie asemănătoare. Acestea se găsesc în vasele mici, capilare și venule post –
capilare. Pentru evidețierea acestora s -au folosit tehnici de impregnare cu argint ș i
microscopie electronică de transmisie, iar pentru identificarea formei și aranjamentului
microscopia electronică 34.

54
Morfologia pericitelor diferă în funcție de localizare și tipul vasului. De obicei
pericitele au formă alungită, stelată cu numeroase ramificării, prezintă corp celular, nucleu
sau perikarion din c are pornesc diferite prelungiri care înconjoară endoteliul. Regiunea
nucleului sau corpul celular este mic și oval și se află adiacent la endoteliu, în anumite
cazuri pătrunde în spațiul interstițial. Prelungirile principale sunt orientate paralel cu axul
lung vascular, iar cele secundare înconjoară pereții vasculari. Citoplasma pericitelor poate
avea două sau mai multe straturi. Nucleul este proeminent, comparativ cu cantitatea redusă
de citoplasmă. În vecinătatea fiecărui pol al nucleului sunt preze nte mitocondrii și în
cantitate redusă glicogen, reticul endoplasmatic, ribozomi, complexe Golgi etc 7.
Pericitele au roluri importante în menținerea homeostaziei, participă la reglarea
locală a permeabilității, au rol supresor asupra proliferării celulelor endoteliale în timpul
angiogenezei, prezintă funcții asemănătoare macrofagelor și reglează fluxul sanguin 7.

A. Întrebuințări ale celulelor stem
Celulele stem mezenchimale au atras atenția cercetătorilor nu doar prin
proprietățile lor de diferențiere în alte tipuri celulare, cât și datorită potențialului acestora
de a migra spre zonele de injurie sau de inflamație atunci când sunt injectate intravenos,
participâ nd în acest fel la regenerarea tisulară. Acest proces se produce prin secreția unor
citokine și factori de creștere ce duc la sinteza de noi componente tisulare. Atunci când
celulele stem sunt transplantate alogen, se presupune că nu sunt ținta limfocitelo r T
citotoxice și natural killer, putând fi astfel depășite barierele sistemului major de
histocompatibilitate 19.
În prezent, celulele stem mezenchimale multiplicate în cultură au fost folosite
pentru tratarea unor patologii complexe precum: infarctul mioca rdic, scleroza laterală
amniotrofică, leucodistrofia, accidentul vascular cerebral, diabetul, lupusul eritematos
sistemic etc 20.
Deși utilizarea lor ar aduce mari beneficii medicinii regenerative, există însă și
probleme legate de siguranța folosirii acestor celule, din cauza lipsei unei metode
standardizate de izolare, multiplicare, identificare. Alte probleme întămpinate în pre zent ar
fi legate de lipsa calificăr ii personalului care manipulează ex vivo celulele, timpul și costul
ridicat, riscul de transmitere al unor afecțiuni virale datorate mediilor de cultură și
potențialului tumorigen 20.

55
B. Celulele stem orale
În urma experimentelor făcute s -a demonstrat că surse de celule stem există în
număr mare la nivelul cavității orale: pulpa dentară, ligament periodontal, sac folicular,
gingie și mucoasa orală, nița retrodiscală, delta apiclă. Aceste celule exp rimă markeri de
suprafață specifici și se pot diferenția in vitro în osteoblaste, condrocite, adipocite 35.
În afara abundenței de surse orale, un mare avantaj îl reprezintă posibilitatea de a
beneficia de aceste celule în urma unor intervenții stomatologice uzuale: extracția dinților
în sc opuri ortodontice, extracția dinților parodontotici, gingivectomii, extracția molarilor
de minte incluși. Spre deosebire de alte surse de celule stem, cum ar fi măduva osoasă,
accesul la celulele stem orale este extrem de facil și ar putea avea în viitor o influență
majoră asupra dezvoltării medicinei regenerative 35.
Patolo giile dentare precum caria dentară, anomaliile genetice etc sunt probleme
comune care afectează mare parte a populației globului. Din motive estetice, psihologice și
medicale refacerea structurilor dentare este o problemă importantă de ordin social.
Medicina dentară evoluează continuu adăugând permanent noi tehnici și materiale pentru a
înlocui țesuturile pierdute 35.
În ultimii 10 ani oamenii de știință au făcut progrese majore în ceea ce privește
științele celulare și biologia moleculară, cu scopul de a găs i alternative inovatoare în
regenerarea dentară. Astfel, studiile arată că celulele stem oferă un potențial uimitor în
homeostazia dentară, repararea și refacerea acestora. Cu toate acestea, descoperirea nu este
lipsită de provocări, probleme ce trebuie re zolvate înainte de orice aplicare clinică a
acestor resurse. Cunoașterea surselor și diferitelor tipuri de celule stem dentare, precum și
mecanismele care fac posibilă supraviețuirea acestora este estențială și garantează succesul
abordărilor terapeutice b azate pe celulele stem în stomatologia modernă 35.
Obiectivul stomatologiei regenerative este acela de a re -crea procesele
embriologice prin care un dinte trece în timpul dezvoltării. Acesta este un proces complex,
ce presupune multiple interacțiuni epitelial -mezenchimale, celule ale epiteli ului oral ș i
celule mezenchimale derivate din creasta neurală ce dau naștere structurilor mineralizate
dentare 35.
Celulele stem sunt celu le capabile de auto -reînnoire, g enerează celule fiice cu
proprietăți diferite și repopulează gazda. Celulele stem dentare sunt considerate o nouă
sursă de celule stem ce pot fi utilizate în medicina regenerativă, prin extragerea acestora
din sursa respectivă și modificate și reintroduse la același individ, eliminând astfel
potențialul de rejecție 35.

56
Pentru prima dată celulele stem dentare au fost izolate în anul 2000 din pulpa
dentară de Gro nthos și colaboratorii și în anul 2003 de la nivelul dinților exfoliați,
Gronthos și Shi. Alte surse în care se găsesc celule stem sunt reprezentate de: papila
apicală a dinților temporari, sacul folicular, mucoasa orală, glandele salivare etc 35.
Celulele stem dentare au caracter multipotent și sunt capabile să se diferențieze în
adipocite (Waddington, 2008), osteoblaste (Mendonca Costa, 2008), condrocite
(Waddington, 2009), miocite (Kerkis, 2008), celule neuronale (Gandia, 2008) etc. Aceste
celule au arătat potențial de regenerare și diferențiere în multiple țesuturi: os (Granziano,
2008), țesut cardiac (Gandia, 2008), mușchi (Kerkis 2008), dinte (Onyekwelu, 2007, Nedel
2009) 35.
Mediul de cultură în care aceste celule stem cresc le dictează potențialul de
diferențiere în osteoblaști, osteocite, condroblaști sau con drocite, iar această proprietate le
face să prezinte un mare interes în ingineria tisulară în vedere utilizării lor ca transplant
autolog la nivelul osului și cartilajelor 35.
Deși toate studiile arată că celulele stem dentare pot aduce imense beneficii
medicinii regenerative, identitatea ex actă a acestor celule rămâne o provocare din cauza
lipsei unui marker unic, specific. Analizele standard de identificare se bazează pe
morfologia lor, aderența la suprafețe solide, capacitatea de diferențiere și abilitatea de a
repara țesuturile afectate 35.
Celulele stem dentare se caracter izează prin expresia negativă a antigenilor
hematopoietici: CD 45, CD34, CD14 și expresia pozitivă a CD29, CD73, CD105, CD44 și
colagen, vimentină, laminină, fibronectină etc 35.
Dovezile furnizate de diferite studii confirmă că celulele pulpei dentare au caracter
mezenchimal și si pot diferenția în multiple linii celulare, însă purificarea acestora
momentan nu este posibilă, producerea celulelor stem dentare omogene re prezentând o
provocare actuală 35.

57
C. Nișa stem a pulpei dentare
1. Caracteristici ultrastructurale și imunofenotipice ale celulelor stem
Pentru a înțelege numeroasele aplicații terapeutice ale CSM este necesară o bună
cunoaștere a acestor celule. De -a lungul anilor au fost făcute numeroase încercări de a
dezvolta un profil antigenic de suprafață pentru o mai bună purificare și identificare a
celulelor stem mezenchimale. O particularitate importantă de demonstrat este aceea de a
izola celule stem mezenchimale din diverse țesuturi și de a le putea identifica cu același
fenotip imunologic. Majoritatea studiilor efectuate pe măduva osoasă umană și de șoarece,
furnizează informații cu privire la existența a 16 proteine de suprafață. Chiar și între
celulele izolate din diferite surse există o cantitate mică de variații imunologice 10.
Markeri negativi
Studiile arată că CSM nu exprimă CD11b (un marker celular imun), glicoforina -A
(un marker eritrocitar), CD45 (un marker al celulelor hematopoietice). Markerul CD34, un
marker primitiv al CS hematopoietice este rar exprimat în CSM umane, în schimb, acesta
este prezent în CSM ale șoarecilor. De asemenea, markerii CD31 (expresia celulelor
endoteliale și hematopoietice) și CD117 (marker al celulelor stem progenitoare) sunt
absenți în CSM adulte și CSM ale șoarecilor. Problema actuală o reprezintă lipsa unui
marker caracteristic, pozitiv al CSM. Cercetările au raportat o multitudine de markeri
pozitivi, fiecare grup de cercetare folosind alt set. De aceea, fără un marker caracteristic,
studiile in vivo asupra nișelor stem și descendențelor sunt dificile 19.

Marker i pozitivi
Stro-1 este cel mai cunoscut marker al celulelor stem mezenchimale. Populația de
celule negative pentru Stro -1 nu este capabilă să formeze colonii, adică nu conțin CFU -Fs.
Celulele Stro -1 pozitive pot deveni CSH de tip fibroblaste, celule muscul are netede,
adipocite, osteoblaste, condrocite, ceea ce este în concordanță cu rolul funcțional al CSM.
Cu toate acestea, Stro -1 este puțin probabil să fie un marker general, din trei motive: nu se
cunoaște niciun omolog Stro -1 la șoareci; expresia pozitiv ă Stro -1 nu este exclusivă
celulelor stem mezenchimale, iar în al treilea rând, expresia CSM se pierde treptat în
timpul expansiunii culturii, limitând utilizarea etichetei Stro -1 în timpul izolării și
identificarea CSM în timpul anumitor pasaje 19.
Toate a ceste restricții fac ca Stro -1, marker al celulelor stem mezenchimale să fie
utilizat doar în asociere cu alți markeri, precum CD106 sau VCAM -1. Luate împreună,

58
studiile arată că Stro -1 și CD106 sunt buni markeri al celulelor stem mezenchimale umane.
Alți markeri existenți: CD 271/NGFR, CD105, CD90/Thz -1, CD44, CD29, CD13, Flk –
1/CD309, Sca -1 și CD10 17.
Concluzie: Stro -1, CD73 și CD106 sunt cei mai folositori markeri, însă funcțiile lor
încă rămân a fi studiate.
Caracterizarea celulelor stem și a progenitorilor celulari este extrem de importantă
și relevantă pentru identificarea lor și utilizarea în cercetare sau pentru diferite terapii, în
medicina regenerativă, caracteristici ce presupun cunoașterea funcțională și a markerilor
fenotipici. În afara localizării lor tisulare tipice și identificării pe baza markerilor proteici
sau epitopilor specifici, de obicei celulele stem nu pot fi clasificate doar pe baza unui
singur marker proteic, ci a 6 -8 markeri în același timp, datorită creșterii disponibilităților
comerciale a anticorpilor monoclonali, citometriei etc 10.
De exemplu, analiza combinațiilor lineare pozitive și negative la markerii proteici,
permite diferențierea celulelor stem hematopoietice de cele endoteliale, prin dete cția
simultană a expresiei diferitelor antigene. Există mai multe studii în prezent, în care sunt
menționate caracteristicile celulelor stem de la nivelul sângelui periferic, tumori, ochi,
intestin și alte localizări, studii realizate pe baza fenotipurilor celulelor stem 10.
În studiul de față, mai mulți cercetători au analizat celule stem diferite, derivate din
țesuturi diferite, prezente chiar și în condiții patologice, precum boli hepatice, unde autorii
au observat o mare implicare a acestora în regenerarea hepatică, prin realizarea fibrozei. A
fost realizat un tabel în care au fost trecute țesutur ile analizate, proveniența lor: umană sau
animală, fenotipurile și markerii la care acestea au răspuns pozitiv/negativ. Fiecare grup de
cercetare, pe măsură ce avansa în studiu, upgrada tabelul cu rezultatele obținute, pe baza
cercetărilor făcute și pe baz a literaturii adiționale. În tabel erau prezentate fenotipurile
diferitelor celulele embrionice stem -like vSELs, celule stem neurale NSCs, celule stem
hematopoietice HDCs, celule stem ale sistemului epitelial limbic LSCs, progenitori
endoteliali EPCs, celu le adipoase SA -ASCs, pericite și celule stem canceroase CSCs.
Analizând tabelul, se observă că există o mare varietate a markerilor fenotipici analizați.
Markerii exprimați de toate celulele evaluate au fost: CD34, CD45, CD105, CD133.
Analiza fenotipică a markerilor specifici celulelor stem a arătat că la nivelul
ficatului, progenitorii endoteliali sunt caracterizați prin markerul KDR și expresia CD146
sau CD451 sau CD452, în concordanță cu analiza sangelui periferic și a celulelor adipoase
endoteliale, un imunoreactivitatea CD45 nu a identificat EPCs 10.

59
Nivelurile de expresie pentru CD90 și CD146 par să fie diferite între celulele
progenitoare endoteliale din ficat și țesut ul adipos. De asemenea celulele stem din măduva
osoasă și ficat, ambele caracterizate prin expresia CD45, diferă în exprimarea markerilor
CD34 și CD 133, subliniind că detectarea a doi markeri este insuficientă pentru a putea
identifica cu certitudine celule stem 22.
Celulele stem neuronale și progenitoare formează neurosfere cu potențiale diferite.
Celulele precursoare neuronale au fost identifica te cu expresiile CD133, CD15, CD24,
A2B5, PSA -NCAM. Cu toate acestea, cele mai înalte niveluri CD 133, CD15 au fost
identificate la progenitorii neuronali, în timp ce NSC a prezentat un nivel scăzut la acești
markeri proteici 10.
Rămân deschise întrebările referitoare la diferența celulelor, au ele origine comună,
dar organul/țesutul în care se găsesc le induce o expresie diferită? Sau fenotipurile lor
diferă din cauza metodelor diferite de izolare? Paradigma conform căreia genele neuronale
sunt exprimate doar în celulele cu origine neuroectodermală pare să nu fie validă, deoarece
există și alte gene care exprimă celule stem de origine diferită, care nu participă la
neurogeneză.Variațiile markerilor de expresie pot indica potențialul diferit al celulelor din
țesuturi diverse sau surprinderea acestora în faze diferite ale ciclului celular. Fără nici o
îndoi ală, sunt necesare investigații ulterioare pentru elucidarea mecanismelor, funcțiilor
celulelor stem, diferențierea și utilitatea acestora în terapiile medicinei regenerative 22.

Izolarea celulelor stem
Celulele stem adulte găsite în pulpa dentară locuiesc ca mici nișe de celule
nediferențiate. Celula stem mama prezintă capacitate nelimitată de auto -reînnoire, este
multipotentă și dă naștere celulelor fiice cu potențial de reînnoire limitat.
Celulele stem fiice au un rol important în repararea tisulară, prezintă un înalt
potențial proliferativ, de obicei rămân în stare latentă în țesuturile adulte, dar în momentul
apariției unui stimul negativ la nivelul dintelui, acestea răspund injuriei producând celule
odontoblaste. Studiile anterioare au încercat să realizeze izolarea celulelor stem și
caracterizarea liniilor progenitoare. Celulele STRO -1 pozitive au fost izolate din pulpa
dentară și exprimă markeri de celule vasculare CD 146 și antigene de pericite 3G5 (Shi și
Gronthos, 2003; Miura și colaboratorii, 2004) 28.
Iohara și colaboratorii, demonstrează în anul 2006 că o populație de celule din
pulpa dentară, care nu încorporează ADN -ul, leagă colorantul Hoechst 33342 și prezintă
proprietăți asemenea celulelor stem. Din încercările inițiale de a izola colonii de celul e

60
stem prin expansiunea unei singure celule progenitoare din pulpa dentară s -a ajuns la
concluzia că există o varietate substanțială de posibiltăți, în raport cu potențialul lor
odontogenic pusă pe seama statusului embrional al celulei progenitoare 28.
În cursul dezvoltării dentare, celulele derivate din creasta neurală, cu origine
ectomezenchimală, contribuie la formarea papilei dentare. Aceste celule neurale prezintă
multipotență (Rao și Anderson, 1197; Deng și colaboratorii, 2004).
Smith și colaboratorii, în anul 2005, utilizează receptorul LANGFR, receptor cu
afinitate scăzută pentru factorul de creștere nervoasă, izolează din pulpa dentară adultă o
populație nesemnificativă numeric, al cărui potențial este neclar.
Studiul de față și -a propus să compare caracteristicile dintre existența unei singure
populații stem progenitoare din pulpa dentară și existența a două populații stem
progenitoare, utilizând metode de izolare diferite 28.

Material și metodă
Izolarea celulelor progenitoare cu proprietatea de adeziune preferențială la
fibronectină
Studiul a fost realizat pe pulpa dentară a unor incisivi de șobolani Wistar, în vârstă
de 28 de zile, combinată cu 4 mg/ml pentru o oră, la 37 ° C. Celulele au fost centrifugate,
iar la 800 de grame din noul amestec s -au adăugat –MEM (ribonucleozide și
dezoxiribonucleozide), 10 000 unități/ml penicilină , 10 g/ml streptomicină și 25 ml
amfotericină B. Produsul obținut a fost depozitat peste noapte în șase godeuri, la 37° C cu
10g/ml de fibronectină. Rezultatul obținut: 4000 celule/ cm2 au fost însămânțate pe
fibronectină și incubate din nou pentru 20 de m inute la temperatura de 37° C, în timp ce
celelalte celule neaderente au fost îndepărtate. La mediile de cultură nou însămânțate a fost
adăugat 10% ser fetal de vițel pentru formarea coloniilor celulare 28.

Izolarea celulelor progenitoare prin activarea sortării celulare activate magnetic –
celule progenitoare LANGFR pozitive
De această dată s -a folosit o singură suspensie celulară, centrifugată și resuspendată
în 80 ml PBS/0,5% BSA/ 2mM EDTA, la un pH de 7,2, pentru 30 de minute, la 4° C.
Douăzeci de microlitrii de microperle au fost adăugate celul elor și au fost sortate celulele
aderente utilizând o coloană Miltenyi Biotech MS plasată într -un câmp magnetic. Pentru
formarea coloniilor celulare s -au însămânțat 4000 celule/cm2 și cultivate în ser cu –MEM
28.

61
Eficiența formării coloniilor și dublarea pop ulațiilor celulare
În cadrul studiului s -au numărat coloniile celulare însămânțate în fiecare godeu în
zilele 3, 6, 10, 12, raportate procentual la numărul inițial de celule. În ziua a doisprezecea
coloniile celulare au fost izolate și tratate cu EDTA -tripsină 0,25% și au fost notate la
fiecare pasaj dublările celulare care s -au produs.
Concluzii: Studiul realizat pe plupa dentară a unor incisivi de șobolani Wistar, în
vârstă de 28 de zile a demonstrat: formarea adipocitelor, determinată cu ajutorul
marker ului Oil Red O, diferențierea osteoblastelor, confirmată cu expresia Runx2 și
osteopontină prin imunocitochimie și RT -PCR, iar diferențiere a condrocitelor a fost
indicată prin sinteza ridicată de proteoglicani, prin colorarea cu toluidină albastră.
Imunoci tochimia a fost utilizată pentru identificarea markerilor celulari stem exprimați
prin expansiunea celulelor clonale și diferențierea markerilor folosind medii de culturi
diferite 28.
După selectarea preferențială a celulelor cu aderență la fibronectină, din cele
treizeci de colonii numărate în ziua a doisprezecea, reprezentând 36 000 de celule
însămînțate, doar 185 dintre ele au prezentat potențial de aderență la fibronectină. S -a
continuat izolarea acestora, însă o singură colonie a arătat o dublare a popolației, de aceea
a fost luată independent pent ru analiza ulterioară. Din cele 106 celule LANGFR pozitive
folosite inițial pentru sortarea celulară activată magnetic, a supraviețuit clonării o singură
colonie și la fel ca în cazul precedent, aceasta a fost ulterior analizată individual. Ambele
populaț ii celulare au prezentat caracteristici mezenchimale, atât cele aderente pozitiv la
fibronectină, cât și cele LANGFR pozitive 28.
Studiate individual, cele două populații clonale au prezentat caracteristici foarte
diferite, însă, examinate pentru expresia ARNm, ambele au prezentat expresia markerilor
clasici de celule stem adulte cu CD31 și MSX -1 (celulele LANGFR pozitive, au prezentat
expresia ARNm ridicată comparativ cu celulele FBN pozitive). Ambele populații prezintă
multipotență și puse pe medii de cultură apropiate, s -a demonstrat existența marke rilor
pentru formarea adipocitelor, osteoblastelor și condrocitelor 29.
Celulele stem din pulpa dentară imatură, cu origine din creasta neurală contribuie la
formarea papilei dentare alcătuită din populații celulare ectomezenchimale. Rezultatele
studiului actual sunt interesante, deoarece celulele din creasta neurală au fost i zolate dintr –
un număr limitat de țesuturi non -neurale, incluzând aici intestinul (Kruger și colaboratorii,
2002), măduva osoasă (Hermann și colaboratorii, 200 4), cornee a (Amano și colaboratorii,
2006), pielea (Toma și colaboratorii, 2001, 2005) 30.

62
Pulpa dentară a fost gândită să conțină o serie de celule stem progenitoare, iar acest
studiu caracterizează două populați i celulare potențiale. Localizarea populațiilor celulare
stem poate fi diferită și se presupune că nișa celulară de unde provin dictează
caracteristicile și soarta celulelor progenitoare, precum si menținerea lor într -o stare
diferențiată sau nediferențiat ă (Scadden, 2006) 20.
Tecles și colaboratorii, menționează în anul 2005 că, în momentul apariției unui
stimul negativ la nivel pulpar, progenitori celulari stem răspund injuriei prin migrarea lor
din regiunile perivasculare ale cavității pulpare, la locul de prejudiciu. Important de știut
este faptul că, în studiul de față, populația progenitoare aderentă la fibronectină nu a
exprimat markeri de suprafață CD105, markeri de expresie endotelială, de aceea nișele
stem celulare pot proveni din localizări îndepărtate de regiunea perivasculară 28.
Nișele pulpare răspund diferit, sinergic sau secvențial la acelasi stimul negativ sau
nișele pulpare diferite prezintă același tip de răspuns? Răspunsul la această întrebare
continuă sa fie studiat și ar putea îmbunătăți reparația tisulară în viitor.

D. Studiu comparativ între două subpopulații stem utilizând markerii CD3,
STRO -1 și c -kit
Datorită proprietăților lor de reparare a țesuturilor lezate și restabilirea parțială a
funcțiilor organelor, celulele st em reprezintă un punct de interes pentru cercetătorii
științifici în vederea descoperirii unor strategii terapeutice de utilizat în medicina
regenerativă. Printre funcțiile celulelor stem se numără: capacitatea de auto -reînnoire,
proliferare și diferențier e în alte linii celulare, diferențiere ce poate fi constatată prin
schimbarea morfologiei celulei și expresia unor proteine tisulare specifice 31.
Printre multiplele localizări ale celulelor stem: măduva osoasă, piele, intestin, ficat,
rețeaua sanguină etc., se numără și pulpa dentară, reprezentată de un țesut conjunctiv
localizat în camera pulpară a dintelui. Această localizare prezintă un mare interes pentru
cercetările actuale, prin facilitatea izolării acesteia, prin proceduri minim -invazive,
comparativ cu alte surse. Celule stem adulte, din sursă umană pot fi obținute din pulpa
dentară a dinților permanenți, a dinților temporari în faza de exfoliere, dinți supranumerari,
de la nivelul papilei d entare apicale a dinților imaturi, de la nivelul ligamentului
periodontal, etc.
Studiile anterioare au demonstrat că celulele stem reprezintă o populație celulară
heterogenă, fără existența unui singur marker specific care să le exprime. Markerii uzali
exprimați de celulele stem mezenchimale sunt: CD34, CD 44, CD 45, CD 73, CD 90, CD

63
105, CD 271, STRO -1, HLA -DR. STRO -1 este considerat a fi un marker specific al
celulelor stem mezenchimale, în timp ce unele populații celulare pot fi pozitive pentru
CD34, CD 117, dar negative pentru CD45. C -Kit, un receptor membranar al tirozin –
kinazei, interacționează specific cu factorii celulelor stem și exprimă diferite tipuri
celulare: melanocite, celule stem hematopoietice, celule stem adipoase, celule stem din
măduva o soasă și de asemenea, Laino și colaboratorii au demonstrat că expresia c -Kit a
fost găsită și la nivelul celulelor stem din pulpa dentară adultă. Așa cum am amintit mai
sus, celulele stem din pulpa dentară exprimă markeri multipli, printre care și CD271,
CD105, Notch2. CD271, unul dintre cei doi receptori ai neurotrofinelor, o familie de
factori de creștere proteică ce stimulează celulele neuronale, inhibă diferențierea celulelor
stem mezenchimale în osteocite, adipocite, condrocite și miocite (Mikami, Ish ii Y,
Watanabe, Shirakawa, Suzuki, Irie S și colaboratorii). Numeroase studii au confirmat
multipotența celulelor stem, capacitatea de a se diferenția în tipuri celulare precum
osteoblaste, celule musculare netede, adipocite, celule neuronale, dar, în prez ent, numeroși
antigeni de suprafață au exprimat existența celulelor stem, dar există o mare varietate de
expresie, în funcția de sursa de proveniență. Feng și colaboratorii și Lv Fj și colaboratorii,
concluzionează în studiile lor că izolarea celulelor ste m mezenchimale, in vivo rămâne
momentan neclară și declară că aceste celulele par a avea origine fibroblastică sau
pericitică 27.
În studiul de față, Pisciotta, Alessandra Carnevale, Gianluca Meloni și Simona Ricc
au analizat și comparat caracteristicile a două subpopulații ale celulelor stem din pulpa
dentară adultă. S -a plecat de la ideea că ambele subpopulații celulare au selecție imună
pozitivă pentru STRO -1 și c -Kit și s -a dorit compararea acestora în funcție de markerul
CD34, pozitiv și negativ. Cara cteristicile evaluate în acest studiu au fost: proliferarea celor
două subpopulații, mentenanța stem, potențialul de diferențiere, senescența și apoptoza.
Societatea Internațională pentru Terapia Celulară – Comitetul Celulelor Stem
Mezenchimale și Tisulare, menționează markerul CD34 ca fiind marker negativ al
celulelor stem hematopoietice, în timp ce, markerul CD34 este universal recunoscut ca
fiind un marke r al celulelor stem hematopoietice. De -a lungul anilor, numeroase studii au
analizat expresia markerului CD34 la nivelul celulelor stem, însă funcția lui rămâne
momentan neclară. Tocmai de aceea, Pisciotta si colaboratorii au realizat un studiu
comparativ între cele două populații: subpopulația celulelor stem din pulpa dentară adultă
cu expresie pozitivă la STRO -1, c-Kit și pozitivă la CD34, comparativ cu subpopulația
pozitivă la STRO -1, c-Kit și negativă la CD34. S -a ajuns la concluzia că cele două

64
subpopu lații prezintă caracteristici distincte raportate la rata de proliferare, mentenanța,
senescența si apoptoza celulară. Cea mai importantă deosebire dintre cele două
subpopulații a fost observată, in vitro, între liniile mezodermale și ectodermale. Ambele
subpopulații nu au prezentat diferențe semnificative pe linie mezodermală, în schimb,
subpopulația celulelor stem din pulpa dentară adultă STRO -1+/c-Kit+/CD34+ a prezentat
tendință spre linia neurogenă. Celulele stem provenite din pulpa dentară adultă deriv ă și
din mezoderem și din neuro -ectoderm, de aceea, studiul de față a studiat diferența celor
două subpopulații pentru o mai bună întelegere și aplicabilitate a acestora în medicina
terapeutică 27.

Metodă de lucru
Izolarea și sortarea celulară
Pentru stu diul de față, Pisciotta și colaboratorii au folosit pulpa dentară adultă de la
nivelul molarilor trei, incluși, obținută în urma unor extracții de rutină, cu acordul informat
al pacientului. După extragerea pulpei dentare, aceasta a fost introdusă într -o imersie de: 3
mg/ml colagenază tip I+4 mg/ml dizolvată în α –MEM, timp de o oră, la 37o C. După
dezagregarea enzimatică, pulpa dentară a fost disociată și filtrată în 100 μ m, pentru a
obține o suspensie celulară. Aceasta a fost introdusă în eprubete de 25 cm2 și aplicată în
mediu de cultură (α -MEM cu 10% ser fetal de vițel inactivat termic, 2 mM L -glutamină,
100 U/mL penicillină, 100 μg/mL streptomicină), la 37o C și 5% CO2. În zilele 3 -4 cultura
obținută a fost tripsinizată, resuspendată și placată la densitatea de 1,6 celule/cm2. În ziua
a7-a, opt populații celulare au fost izolate din col oniile generate de celule singulare și
extinse până la obținerea a 70% confluență și 5×106 celule au fost folosite pentru
următoarea sortare magnetică (pasajul 2). Markerii STRO -1+/c-Kit + au fost obținuți
utilizând antigene anti -STRO -1 de la șoarece și an ti-c-Kit de la iepure [Abs, Santa Cruz].
Utilizând tehnologia MACS, prin folosirea antigenului anti -CD34 provenit de la șoarece,
s-au separat cele două subpopulații cercetate: STRO -1+/c-Kit+/CD34 − și STRO -1+/c-
Kit+/CD34+ 27.

Proliferarea celulară
A fost analizată rata de proliferare a ambelor subpopulații de celule stem provenite
din pulpa dentară adultă, însămânțate la o densitate de 4×103 celule/cm2, timp de o
săptămână, până la obținerea confluării celulare, și numerate în fiecare zi. Numărătoare

65
celul ară a fost realizată pentru fiecare grup experimental, iar densitatea celulară exprimată
în celule/ cm2 +/- deviația standard 27.
Populația dublată s -a calculate folosind formula:
, unde N7d reprezintă celulele numărate în ziua a
șaptea, N1d – celulele numerate în ziua 1.
Pentru a determina rata de dublare a ambelor subpopulații, acestea au fost însămânțate pe
mediu de cultură cu densitatea de 4×103 celule/cm2, până s -a obținut o c onfluență de 80%
(pasajul 6). Pentru fiecare grup experimental s -au folosit trei eșantioane, aplicând
următoarea formula:
, unde N este numărul de celule recoltate și Ns numărul de
celule inițiale. Indicele de dublare a populațiilor a fost obținut prin a dăugarea indicelui de
dublare al fiecărui pasaj, la pasajul celular anterior 27.
Senescența și apoptoza celulară
Pentru a analiza cele două caracateristici ale subpopulațiilor celulelor stem, au fost
analizate pasajele 6, însămânțate în 12 eșantioane și lă sate până au confluat. S -a calculat
procentajul de senescență celulară pentru câte 3 eșantioane din fiecare grup de analizat.
Apoptoza celulelor pozitive/negative la CD34 s -a analizat urmărind forma activată a
caspazei 3. Toate celulele subpopulațiilor din pasajele 1 și 6 au fost procesate prin metoda
Western blot și s -a analizat forma activată a caspazei 3 cu semnale celulare anti -caspază 3.
Densitatea caspazei 3 activate s -a pus în evidență cu un software NIS (Nikon) (suma
valorilor pixelilor minus valoar ea de fundal pentru fiecare pixel dintr -o zonă delimitată),
normalizând ulterior valoarea de fond și controlul unei benzi de actină 27.
Diferențierea multiliniară
Pentru determinarea diferențierii subpopulațiilor stem în linii cu potențial
osteogenetic, miogenetic, adipogenetic și neurogenetic s -au folosit trei eșantioane pentru
fiecare grup analizat. Pentru evaluarea acestei proprietăți, au fost însămânțate aproximativ
3×103 celule/cm2 , în mediu osteogenic (mediul de cultură a fost suplimentat cu 5% FCS,
100 μM 2P -acid ascorbit, 100 nM dexametazonă, 10 mM β – glicerofosfat). Pentru
evaluarea expresiei proteinelor specifice de os, s -au folosit anti -osteopontină de șoarece,
anti-osteocalcină de șoarece, anti -runx2 de iepure, timp de patru săptămâni după inducția
osteogenică a ambelor subpopulații de celule stem din pulpa dentară adultă 27.

66
Pentru analiza potețialului miogenetic s -a realizat cultura celor două subpopulații
cu C2C12 mioblaste de șoarece în concentrație de 10:1, în DMEM Glucoză înaltă,
suplimentată cu 10% FCS, 2 mM L -glutamină, 100U/ml penicilină, 100 mg/ml
steptomicină. După confluare, mediul de creștere a fost înlocuit cu DMEM Glucoză înaltă,
suplimentată cu 1% FCS și 10 nM insulină, menținute în acest nou mediu timp de 2
săptămâni. S -a dorit testarea in vitro a tipurilor celulare non -miogenetice de a forma noi
miotubuli și verificarea formării miotubulilor prin directa contribuție a celor două
subpopulații de c elule stem provenite din pulpa dentară adultă 27.
Pentru analiza potențialului adipogenic ambel e subpopulații au fost însămînțate 24
de eșantioane, la o densitate celulară de 2×104 celule/cm2 și incubate în mediu adipogenic
(0,5 mM izobutil -metilxantină, 1 μM dexametazonă, 10 μM insulină, 200 μM
indometacină, 50 mg/ml gentamicină) , pentru trei săpt ămâni. Culturile au fost evaluate la
fiecare trei zile în vederea formării cristalelor de lipide prin intermediul colorării uleiului
rosu O și țesutului AdipoRed (conform instrucțiunilor; Lonza) 27 29.
Pentru analiza potențialului neurogenic, ambele subpopulații analizate au fost
însămânțate pe 6 eșantioane la o densitate celulară de 2×104 celule/cm2. Ulterior, celulele
au fost însămânțate pe medii de cultură suplimentate cu 1mM β – mercaptoetanol. După 24
de ore au fost spălate în PBS și differentiate în α -MEM ce conținea 10 mM β –
mercaptoetanol, 2% dimetil sulfoxid și 200 μM butilat -hidroxianisol, lăsate până când au
prezentat morfologie neuronală 27 31.

Expresia nestinei și CD271
Nestina reprezintă un filament proteic intermediar, aparținând familiei proteinelor,
care este exprimată în timpul diviziunii celulare, în fazele inițiale ale dezoltării sistemului
nervos central. Antigenul de suprafață CD271 este unul dintre cei doi receptori ai
neurotrofinei, aparținând familiei factorilor de creștere proteici care activează și susțin
diferențierea c elulelor neuronale 27.
Rezultate
Cu ajutorul citometriei s-au analizat cele două subpopulații și s -a determinat
procentual coeficientul de exprimare al markerilor STRO -1, c-Kit, CD34. Datele arată că
ambele subpopulații au prezentat markerii STRO -1, c-Kit, iar 0,5% au fost negative la
CD34, în timp ce aproximat iv 20% din subpopulații a fost pozitivă la CD34 27.
La evaluarea subpopulațiilor celulelor stem din pulpa dentară adultă s -a obervat că:
ambele subpopulații au prezentat o creștere în ziua a5 -a, CD34 – a înregistrat o proliferare

67
importantă în ziua a8 -a, în timp ce subpopulația CD34+ a înregistrat o scădere masivă între
zilele 6 și 8. Datele CPD analizate arată că subpopulația CD34 – a avut o creștere constantă
în toate pasajele examinate, în timp ce subpopulația CD34+ a înregistrat un maxim de
creștere în p asajul 3, apoi a încetinit în pasajele 4 și 5. În plus, timpul de dublare al
subpopulației CD34 – a fost mai scăzut comparativ cu cealaltă subpopulație: 19,91 +/ – 2:30
ore, comparativ cu 24.55 +/ – 4:20 ore 27.

Rezultate privind senescența și apoptoza subpopulațiilor analizate
S-a observat la microscop ca subpopulația CD34 – a prezentat niveluri scăzute de β –
galactozidază, comparativ cu subpopulația CD34+ care a prezentat procentaje
semnificative. În cadrul subpopulației CD34+ s -a observat existența nucl eilor picnotici,
care denotă un proces de degenerare a nucleului celular, proces prezent în apoptoză și
reducerea în volum a nucleului, fenomen prezent în pasajele finale 27.

Diferențierea multiliniară
Ambele subpopulații celulare stem provenite din pulpa dentară adultă au
demonstrat că au potențial osteogenic, prin expresia osteocalcinei, exprimând markeri
precum osterix și osteopontină. O altă confirmare a potențialului osteogenic îl reprezintă
expresia colagenului de tip I, observată la analiza Western blot 27.
În ceea ce privește potențialul miogenic, amb ele subpopulații au prezentat formarea
mioblaștilor C2C12, apariția miotubulilor confirmând acest proces.
În ceea ce privește potențialul adipogenic, nu au fost observate diferențe între cele
două subpopulații, ambele având capacitate de diferențiere, dem onstrată prin apariția
cristalelor lipidice, observate la microscop 27.
În ceea ce privește potențialul neuronal, subpopulația CD34+ a exprimat β -III-
Tubulina, comparativ cu subpopulația CD34 -. La analiza markerilor CD271 și a nestinei,
s-a observat că su bpopulația CD34 – nu a exprimat niciunul dintre cei doi markeri, în timp
ce populația CD34+ a fost pozitivă pentru ambii markeri, ceea ce demonstrează existența
potențialului de activare și diferențiere în celule neuronale, implicate în dezvoltarea
sistemul ui nervos central 27.

68
E. Utilizările celulelor stem de la nivelul pulpei dentare. Medicina
regenerativă și ingineria tisulară
În ultimii ani biologia celulară și ingineria tisulară au luat amploare, încercând să
ofere soluții medicinii regenerative. Medicina regenerativă însumează o serie de alte
discipline cu scopul de a crea regenerarea țesuturilor funcționale, înlocuirea sau r epararea
unui organ sau a unei funcții pierdute odată cu înaintarea în vârstă, repararea în cazul unor
boli sau defecte congenitale. Medicina regenerativă cuprinde biologia celulelor stem,
biologia moleculară, genetică, inginerie chimică, nanotehnologie și alte discipline, care
încearcă să proiecteze factori de creștere sau celule vii, in vitro, gata de transplantare 32.
Un nou concept atrăgător în terapia regenerativă actuală care ar putea face posibilă
în viitor înlocuirea transplantului convențional este reprezentat de transplantul de celule
stem pentru a repara țesuturile și organele afectate. Scopul medicinii regenerative este de a
dezvolta terapii de înlocuire a organelor și țesut urilor deteriorate ca urmare a bolilor,
leziunilor, îmbătrânirii cu un organ de bioinginerie complet funcțional, realizat pe baza
tehnologiei tri -dimensionale, organ artificial care imediat transplantării in vivo ar putea
deveni funcțional 32.
Pierderea unui dinte poate cauza multiple probleme fizionomice, fonatorii și
funcționale. Un dinte de bioinginerie ar putea restaura funcțiile orale afectate 32.
Oshima și colaboratorii au realizat cu ajutorul bioingineriei medicale un astfel de
dinte, care ulterior transplantării la nivelul cavității orale a unui șoarece adult a erupt ca o
structură dentară corectă și a prezentat performanță masticatorie, funcții parodontale și
reacții la stimulii nocivi. Transplantul unui astfel de dinte a fost propus și ca o alternativă
viabilă pentru a repara defectele de resorbție osoasă apărute după pi erderea dinților
naturali 32.
În studiul de față s -a reușit realizarea unui dinte de bioingierie, controlat ca
dimensiune, formă, lungime și transplantat în regiunea în care se pierdu se un dinte.
Procesul a fost urmat de integrare osoasă și restabilirea funcțiilor fiziologice, ceea ce face
ca această terapie să aibă mare potențial în viitor 32.

69

Fig.1. Schema generală de producere a unui dintre prin inginerie medicală, utilizâ nd celule stem (sursa :
Stem cell sources for t ooth regeneration, Keishi Otsu)
Scopul studiului realizat de George și Huang a fost să demonstreze că pulpa
dentară și dentina afectate pot fi regenerate cu ajutorul celulelor stem progenitoare și a
tehnologiilor de inginerie tisulară 33.
A fost testată posibilitatea regenerării vasculare a pulpei dentare umane la nivelul
unui canal radicular gol, pe un dinte devital și producerea de dentină de neoformație pe
baza perețilo r dentinari deja existenți, cu ajutorul celulelor stem. Studiul s -a realizat pe
șoarece și au fost folosite celule stem de la nivelul papilei apicale dentare, izolate,
însămânțate pe medii de cultură cu poli D,L -lactic -glicolidă și ulterior inserate în
fragmentele dentare de șoarece. Rezultatele au arătat că spațiul radicular a fost ocupat în
întregime de un țesut asemănător pulpei dentare, cu o vascularizație bine reprezentată. În
plus, la nivelul canalului radicular s -a depus un strat continuu de țesut as emănător dentinei.
Această structură nou produsă părea a fi produsă de un strat de celule de tip odontoblaști,
deoarece au exprimat sialofosfoproteină dentinară, sialoproteină o soasă, fosfatază alcalină
și CD 105 33.
Acest studiu a oferit primele dovezi care arată că pulpa dentară afectată poate fi
regenerată de novo în spațiul radicular, prin pro ducere de celule asemănătoare
odontoblaștilor, celule producătoare de dentină 33.

70
Pe lângă zo nele de interes prezentate în studiile de mai sus, alte cercetări care au
utilizat celulele stem prezintă rezultate interesante.
Endodonția regenerativă urmărește restabilirea vitalității pulpare și continuarea
dezvoltării rădăcinii dentare, proces care im plică eliberarea în interiorul canalului radicular
a cheagu lui sanguin cu rol de matrice, î mpreună cu facto ri de creștere și celule stem. Î n
vivo, transplantarea celulelor stem la șoareci imunocompromiși a dat rezultate
satisfăcătoare, generând formațiuni asemănătoare complexelor pulpo -dentinare: țesut
vascularizat asemănător pulpei dentare, în jurul căruia se afla un strat de odontoblaști și
structuri asemănătoare tubulilor dentinari.
Alte provocări terapeutice bazate pe aplicabilitatea celulelor stem den tare sunt
reprezentate de formarea sau regenerarea unui parodonțiu funcțional. Utilizarea celulelor
stem parodontale și de la nivelul deltei apicale crescute pe medii de hidroxiapatită
amestecată cu fosfat tricalcic a dus la reconstrucția unei rădăcini den tare perfect
funcționale, inclusiv cu formarea de ligamente periodontale în jurul acesteia.

71
Concluzii
1. În urma cercetărilor și studiilor efectuate s -a ajuns la concluzia că pulpa dentară
reprezintă o sursă importantă de celule stem, alături de alte țesuturi prezente la
nivelul cavității bucale.
2. Prelevarea celulelor stem dentare este minim invazivă, facilă și se poate realiza atât
de la nivelul dinților temporari, cât și la nivelul dinților permanenț i.
3. Identificarea acestor noi surse de celule stem oferă imense oportunități de
exploatare și utilizare în medicina regenerativă, în tehnicile de inginerie tisulară
care vizează regenerarea structurilor dentare lezate, refacerea defectelor oro –
faciale cong enitale sau dobândite sau vindecarea altor boli sistemice importante .
4. Rezultatele folosirii celulelor stem provenite din surse orale sunt promițătoare și au
generat rezultate interesante în cercetările efectuate: reparația dentinei afectate, a
pulpei denta re și ligamentului parodontal, regenerare osoasă și nervoasă. Cel mai
spectaculos rezultat este reprezentat de germenele dentar obținut in vitro cu ajutorul
celulelor stem prin bioinginerie medicală, germene ce a generat la rândul lui un
dinte complet și c orect structurat, cu potențial de erupție după transplantarea în
cavitatea bucală.
5. Cu toate acestea, este nevoie de studii numeroase și desfășurate pe termen lung
pentru a înțelege proprietățile, funcțiile și limitele celulelor celulelor stem în
dezvoltar ea, patogeneza și regenerarea tisulară și pentru a fi utilizate in vivo în
contextele clinice specifice.
6. În anatomia moleculară paneluri de markeri pentru celule stem sunt superpozabile
pe subseturile de nișe stem dentare; identificările specifice trebuie să țină seama de
condițiile experimentale, in vivo sau in vitro .
7. Deși experimente numeroase au identificat potențialul nișelor stem dentare pentru
medicina regenerativă, majoritatea rezultatelor au fost obținute după xenogrefe,
om-la-animal. Acestea trebu ie privite cu circumspecție și apreciate specific.
8. Sunt necesare studii care să aprecieze substructurile celulelor din nișa dentară, către
confirmarea sau infirmarea ipotezei conform căreia celula primordială a nișei este
celula endotelială și nu pericitul .

72
Bibliografie

1. Rusu MC. Anatomia dezvoltării oro -faciale. București: INFOMEDICA; 2003.
2. Dumitriu HT. Tratat de Parodontologie: Editura Viața Medicală Românească;
2015.
3. Boboc G. Aparatul dento -maxilar. II ed; 2003.
4. V. A. Elemente de embriologie; 1963.
5. Schroeder HE. Oral Structure Biology: Embryology, Structure, and Function of
Normal Hard and Soft Tissues of the Oral Cavity and Temporomandibular Joints: G.
Thieme Verlag; 1991.
6. Andrei I. Tratat de Endodonție; 2015.
7. Diaz-Flores L, Gutierrez R, Madrid JF, et al. Pericytes. Morphofunction,
interactions and pathology in a quiescent and activated mesenchymal cell niche. Histology
and histopathology 2009; 24(7): 909 -69.
8. Hirschi KK, D'Amore PA. Pericytes in the microvas culature. Cardiovascular
research 1996; 32(4): 687 -98.
9. Ashton N, de Oliveira F. Nomenclature of pericytes. Intramural and extramural.
The British journal of ophthalmology 1966; 50(3): 119 -23.
10. Tarnok A, Ulrich H, Bocsi J. Phenotypes of stem cells fro m diverse origin.
Cytometry Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology 2010;
77(1): 6 -10.
11. Dragoș Ștefănescu IS, Mircea Covic. Genetică medicală: Polirom; 2001.
12. Sell S. Stem cells handbook. II ed: Humana press.
13. Spradling A, Drummond -Barbosa D, Kai T. Stem cells find their niche. Nature
2001; 414(6859): 98 -104.
14. Scadden DT. The stem -cell niche as an entity of action. Nature 2006; 441(7097):
1075 -9.
15. Mitsiadis TA, Feki A, Papaccio G, Caton J. Dental pulp stem ce lls, niches, and
notch signaling in tooth injury. Advances in dental research 2011; 23(3): 275 -9.
16. Chen S, Lewallen M, Xie T. Adhesion in the stem cell niche: biological roles and
regulation. Development 2013; 140(2): 255 -65.
17. Alison MR, Islam S. Att ributes of adult stem cells. The Journal of pathology 2009;
217(2): 144 -60.

73
18. Corselli M, Chin CJ, Parekh C, et al. Perivascular support of human hematopoietic
stem/progenitor cells. Blood 2013; 121(15): 2891 -901.
19. Kolf CM, Cho E, Tuan RS. Mesenchymal stromal cells. Biology of adult
mesenchymal stem cells: regulation of niche, self -renewal and differentiation. Arthritis
research & therapy 2007; 9(1): 204.
20. Huang GT, Gronthos S, Shi S. Mesenchymal stem cells derived from dental tissues
vs. those from other sources: their biology and role in regenerative medicine. Journal of
dental research 2009; 88(9): 792 -806.
21. Nuti N, Corallo C, Chan BM, Ferrari M, Gerami -Naini B. Multipotent
Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells: a Literature Review. Stem cell reviews
2016; 12(5): 511 -23.
22. Weissman IL, Anderson DJ, Gage F. Stem and progenitor cells: origins,
phenotypes, lineage commitments, and transdifferentiations. Annual review of cell and
developmental biology 2001; 17: 387 -403.
23. Yasui T, Mab uchi Y, Toriumi H, et al. Purified Human Dental Pulp Stem Cells
Promote Osteogenic Regeneration. Journal of dental research 2016; 95(2): 206 -14.
24. Chen Y, Zhang F, Fu Q, Liu Y, Wang Z, Qi N. In vitro proliferation and osteogenic
differentiation of human dental pulp stem cells in injectable thermo -sensitive
chitosan/beta -glycerophosphate/hydroxyapatite hydrogel. Journal of biomaterials
applications 2016; 31(3): 317 -27.
25. Robey PG, Bianco P. The use of adult stem cells in rebuilding the human face.
Journal of the American Dental Association 2006; 137(7): 961 -72.
26. Mao JJ, Prockop DJ. Stem cells in the face: tooth regeneration and beyond. Cell
stem cell 2012; 11(3): 291 -301.
27. Pisciotta A, Carnevale G, Meloni S, et al. Human dental pulp stem cells (hDPSCs):
isolation, enrichment and comparative differentiation of two sub -populations. BMC
developmental biology 2015; 15: 14.
28. Waddington RJ, Youde SJ, Lee CP, Sloan AJ. Isolation of distinct progenitor stem
cell populations from dental pulp. Cells, tissues, organs 2009; 189(1-4): 268 -74.
29. Carbone A, Valente M, Annacontini L, et al. Adipose -derived mesenchymal
stromal (stem) cells differentiate to osteoblast and chondroblast lineages upon incubation
with conditioned media from dental pulp stem cell -derived osteoblasts and auricle cartilage
chondrocytes. Journal of biological regulators and homeostatic agents 2016; 30(1): 111 –
22.

74
30. Ledesma -Martinez E, Mendoza -Nunez VM, Santiago -Osorio E. Mesenchymal
Stem Cells Derived from Dental Pulp: A Review. Stem cells international 2016; 2016 :
4709572.
31. Carnevale G, Pisciotta A, Riccio M, et al. Human dental pulp stem cells expressing
STRO -1, c-kit and CD34 markers in peripheral nerve regeneration. Journal of tissue
engineering and regenerative medicine 2016 .
32. Oshima M, Mizuno M, Imamura A, et al. Functional tooth regeneration using a
bioengineered tooth unit as a mature organ replacement regenerative therapy. PLoS One
2011; 6(7): e21531.
33. Huang GT. Dental pulp and dentin tissue engineering and regenera tion:
advancement and challenge. Frontiers in bioscience 2011; 3: 788 -800.
34. Shepro D, Morel NM. Pericyte physiology. FASEB journal : official publication of
the Federation of American Societies for Experimental Biology 1993; 7(11): 1031 -8.
35. Casagrand e L, Cordeiro MM, Nor SA, Nor JE. Dental pulp stem cells in
regenerative dentistry. Odontology 2011; 99(1): 1 -7.

75
Index de figuri în text
FIG. V -1 – IMUNOEXPRESIA PULPAR Ă A CD10. ………………………….. ………………… 45
FIG. V -2 – PULPĂ DENTARĂ ADULTĂ , IMUNOMARCARE CU CD 10. MIEZ
PULPAR CU VASE LARGI DE TIP ARTERIOLAR ȘI NERVI. STROMA
PULPARĂ EX PRIMĂ CD10 LA NIVELU L UNEI REȚELE GLOBAL E DE
CELULE STROMALE. CAP ILARE NĂSCÂNDE CU FE NOTIP CD10 POZITIV. 45
FIG. V -3. PULPĂ DENTARĂ ADULTĂ, IMUN OMARCARE CU ENOLAZĂ
NEURON -SPECIFICĂ. ANTIGENUL ESTE EXPRIMAT POZITI V ÎNTR -UN
NERV PULPAR DE CALIB RU IMPORTANT SECȚION AT OBLIC. ÎN PARTEA
INFERIOARĂ A IMAGINI I ESTE UN TANDEM NEU RO-VASCULAR CU UN
NERV PULPAR DE CALIB RU MIC CE EXPRIMĂ EN OLAZA NEURON –
SPECIFICĂ. VASUL RES PECTIV ARE CALIBRU M ARE ȘI PERETE SUBȚIR E,
ESTE DECI DE TIP VEN ULĂ. CELULELE ENDOTE LIALE EXPRIMĂ
ENOLAZĂ NEURON -SPECIFICĂ ȘI SE IDEN TIFICĂ CELULA
PERIVASCULARĂ CU FEN OTIP NSE POZITIV. NS E NU ESTE EXPRIMAT Î N
MANTAUA PULPARĂ . ………………………….. ………………………….. ……………………. 46
FIG. V -4. PULPĂ DENTARĂ ADU LTĂ, IMUNOMARCARE CU ENOLAZĂ
NEURON -SPECIFICĂ. CELULE DI N MANTAUA PULPARĂ, P LEXUL
SUBODONTOBLASTI C, NU EXPRIMĂ ANTIGE NUL, ÎNSĂ ENDOTELIIL E
PULPARE, VASCULARE N U EXCLUSIV. CELULE S TROMALE IZOLATE,
FIBROBLASTOIDE, EXPR IMĂ NSE. ………………………….. ………………………….. … 46
FIG. V -5. PULPĂ DENTARĂ ADU LTĂ, IMUNOMARCARE CU STRO -1. MANTAUA
PULPARĂ CU EXPRESIE HETEROGENĂ. ENDOTELI I IMUNONEGATIVE. .. 47
FIG. V -6. PULPĂ DENTARĂ ADU LTĂ, IMUNOMARCARE CU STRO -1. DOUĂ
CELULE STRO -1 POZITIVE, DE TALIE MARE, ROTUND OVALARE , LA
LIMITA DINTRE MIEZUL PULPAR ȘI MANTAUA PU LPARĂ, PAR A
CONFIGURA LUMENE VAS CULARE. ………………………….. ………………………….. 47
FIG. V -7. PULPĂ DENTARĂ ADU LTĂ, IMUNOMARCARE CU STRO -1. CELULE
STROMALE DE ASPECT F IBROBLASTOID, APAREN T LIPSITE DE
PRELUNGIRI, EXPRIMĂ STRO -1. EXPRESIA ENDOTELIALĂ A STRO -1 ÎN
ENDOTELIILE MICROVAS CULARE ESTE HETEROGE NĂ. ……………………….. 48
FIG. V -8. PULPĂ DENTARĂ ADU LTĂ, IMUNOMARCARE CU CD34. EXPR ESIA
EXCULSIVĂ A ANTIGENU LUI ÎN CELULELE ENDO TELIALE VASCULARE.
CELULELE MANTALEI PU LPARE SUNT CD34 NEGA TIVE. REȚELELE
STROMALE PULPARE SUN T DE ASEMENEA CD34 N EGATIVE. ………………. 48
FIG. V -9. PULPĂ DENTARĂ AD ULTĂ, IMUNOMARCARE C U CD45. EXPRESIA
CD45 ÎNTR -O CELULĂ STROMALĂ PU LPARĂ APARENT LIPSIT Ă DE
PRELUNGIRI. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …….. 49
FIG. V -10. PULPĂ DENTARĂ AD ULTĂ, IMUNOMARCARE C U NESTINĂ.
REȚEAUA STROMALĂ A M IEZULUI PULPAR EXPRI MĂ NESTINĂ. LA
LIMITA MIEZ -MANTA O CELULĂ DE TA LIE MARE, CU RAPORT NUCLEU –
CITOPLASMĂ MARE ȘI P RELUNGIRI DIHOTOMICE SUGEREAZĂ UN
FENOTIP STEM. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …. 49
FIG. V -11. PULPĂ DENTARĂ AD ULTĂ, IMUNOMARCARE CU NEST INĂ. VAS
PULPAR CU PERETE GRO S, ÎNGLOBAT ÎN STROM A NESTIN -POZITIVĂ. … 50

76
FIG. V -12. PULPĂ DENTARĂ AD ULTĂ, IMUNO MARCARE CU NESTINĂ.
MANTAUA PULPARĂ NEST IN-POZITIVĂ. EXPRESIA P UTERNICĂ A
ANTIGENULUI ÎN STRAT UL ODONTOBLASTELOR. ………………………….. …… 50
FIG. V -13. PULPĂ DENTARĂ ADULTĂ , IMUNOMARCARE CU CD 117/CD -KIT.
EXPRESIE CONSISTENTĂ , DAR HETEROGENĂ CD1 17/CD -KIT ÎN
MANTAUA PULPARĂ.PULP Ă DENTARĂ ADULTĂ, IM UNO -MARKARE CU
CD117/C -KIT. NERVI PULPARI I MUNO -NEGATIVI. REȚEA STRO MALĂ
PULPARĂ C -KIT POZITIVĂ, CONSTR UITĂ DIN CELULE MULTIPOLARE C U
PRELUNGIRI. SUNT IDE NTIFICATE ȘI CELULE C-KIT POZITIVE APOLARE .
EXPRESIA C -KIT ESTE HETEROGENĂ ÎN STROMA PULPARĂ. ……………….. 51
FIG. V -14. PULPĂ DENTARĂ AD ULTĂ, IMUNOMARCARE C U CD117/CD -KIT.
NERVI PULPARI IMUNO -NEGATIVI. REȚEA STRO MALĂ PULPARĂ C -KIT
POZITIVĂ, CONSTRUITĂ DIN CELULE MULTIPOLA RE CU PRELUNGIRI.
SUNT IDENTIFICATE ȘI CELULE C -KIT POZITIVE APOLARE . EXPRESIA C –
KIT ESTE HETEROGENĂ ÎN STROMA PULPARĂ. ………………………….. ……….. 51
FIG. V -15. PULPĂ DENTARĂ AD ULTĂ, IMUNOMARCARE C U CD105. EXPRESIA
CD105 POZITIVĂ ÎN ENDOTELIILE VASCULAR E, DAR ȘI ÎN CELULEL E
IZOLATE ALE STROMEI PULPARE, CU NUCLEI H ETEROCROMATICI ȘI
CITOPLASMĂ PUȚINĂ. ………………………….. ………………………….. …………………… 52