Interacțiuni spațiale între macrofagele Iba-1 () [305945]
UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI
FACULTATEA DE BIOLOGIE
LUCRARE DE DISERTAȚIE
Interacțiuni spațiale între macrofagele Iba-1 (+)
și neuronii NF200 (+)
Coordonator științific:
Prof. Dr. VIOLETA RISTOIU
Îndrumător științific:
Asist. Dr. ROXANA OLIMPIA GHEORGHE
Absolvent: [anonimizat] 2020
[anonimizat], ce afectează considerabil calitatea vieții deoarece o mare parte dintre pacienții diagnosticați cu această patologie nu primesc un tratament corespunzător. Aceasta poate apărea ca urmare a unei leziuni sau afecțiuni (infecții, tumori) a [anonimizat], și afectează între 7 și 10% din populație. [anonimizat] (apariția senzației de durere ca răspuns la stimuli nedureroși în mod normal) și hiperalgezie ([anonimizat], la stimuli dureroși). [anonimizat] (macrofage, neutrofile, limfocite), astrocite, celule Schwann și celule satelit.
[anonimizat] 1 (Iba-1) este un marker de activare specific macrofagelor și microgliilor, o proteină de citoschelet ce induce modificări în filamentele de actină prin interacția cu fimbrina. [anonimizat] s-a [anonimizat], adeziune și semnalizare celulară.
Având în vedere importanța proteinei Iba-1 pentru buna funcționare a [anonimizat], [anonimizat]-1 (Iba-1 ARNi), în urma ligaturării și tăierii nervului spinal L5 (SNL), asupra expresiei acestei proteinei, a interacțiunii spațiale dintre macrofage și neuroni și a fenotipului acestor celule imunitare. [anonimizat] L5, recoltați în condiția Control și la 5 [anonimizat]+Iba-1 ARNi, și am folosit anticorpi anti Iba-1 și anti NF200 pentru a [anonimizat] (>50µm).
Capitolul 1. Aspecte teoretice
1.1 Sistemul nervos
Sistemul nervos este o componentă indispensabilă a organismului, [anonimizat]-se de semnale electrice pentru a transmite informația rapid de la periferie către segmentele centrale și invers.
Țesutul nervos este format din două mari categorii de celule: neuroni și celule gliale.
[anonimizat], procesarea și transmiterea impulsurilor electrice. [anonimizat] o durată de funcționare extrem de lungă (zeci de ani) și o [anonimizat] 3 minute. [anonimizat]:
[anonimizat] o transmit către măduva spinării și creier; aceștia pot fi somatosenzitivi sau viscerosenzitivi;
[anonimizat]mentele centrale către efectori, reprezentați de mușchi și glande;
Interneuroni – asigură legătura între neuroni, fiind cei mai numeroși: aproximativ 99% din totalul neuronilor. Sunt prezenți în sistemul nervos central și sunt dispuși între neuronii senzitivi și cei motori.
Celulele gliale sunt celule neexcitabile implicate în protecția și controlul metabolic al neuronilor, fiind mult mai numeroase decât aceștia (în raport de aproximativ 50:1). Din categoria acestora fac parte nevrogliile: celulele gliale din sistemul nervos central, reprezentate de microglii, astrocite, celule ependimale și oligodendrocite și celulele gliale ale sistemului nervos periferic, reprezentate de celulele satelit și celulele Schwann.
Astrocitele sunt celule în formă de stea, de dimensiuni mari și reprezintă cea mai mare parte a nevrogliilor. Acestea sunt implicate în formarea barierei hemato-encefalice, care permite transportul din sânge către neuroni doar a anumitor substanțe. De asemenea, aceste celule au rol și în asigurarea nutrienților necesari neuronilor și în repararea țesutului nervos în urma unei leziuni.
Microgliile sunt macrofagele rezidente din sistemul nervos central, fiind implicate în protejarea acestuia de diferiți agenți patogeni sau substanțe toxice prin fagocitoză și în menținerea homeostaziei.
Din punct de vedere anatomic, sistemul nervos este împărțit în sistem nervos central (alcatuit din creier și măduva spinării) și sistem nervos periferic (format din nervi și ganglioni nervoși), iar din punct de vedere funcțional în sistem nervos somatic (asigură legătura între mediul extern și organism) și sistem nervos vegetativ (reglează activitatea viscerelor).
1.2. Sistemul nervos periferic
Asigură conexiunea dintre sistemul nervos central și mediul extern, respectiv mediul intern al organismului, fiind format din receptori, nervi și ganglioni nervoși (Flonta și colab., 2007).
1.2.1. Receptorii
Sunt de trei tipuri, în funcție de zonele din care culeg informațiile:
proprioceptori – preiau informații de la mușchi, tendoane și articulații;
interoceptori – culeg informații de la organele interne;
exteroceptori – sunt de mai multe tipuri, în funcție de stimulii la care răspund:
corpusculii Meissner – răspund la atingeri fine și deformări dinamice ale pielii;
corpusculii Pacini – detectează vibrațiile;
discurile Merkel – responsabile de simțul tactil fin, spre exemplu pentru perceperea formei și texturii unui obiect;
corpusculii Ruffini – detectează întinderea pielii;
receptori termici
termonociceptori
mecanonociceptori – răspund la leziuni ale pielii;
nociceptori polimodali – răspund în același timp la stimuli mecanici, termici, chimici.
În general, terminațiile nervoase ale fibrelor tip Aβ sunt mecanoreceptori cu prag de excitabilitate scăzut, răspunzând la stimuli mecanici inofensivi (discurile Merkel, corpusculii Meissner, corpusculii Pacini, Ruffini), în timp ce terminațiile fibrelor Aδ și C transmit senzațiile dureroase (Delmas et al., 2011).
1.2.2. Nervii spinali
Nervii spinali sunt structuri bilaterale, localizate de o parte și de alta a măduvei spinării, formate din neuroni care conduc informații senzitive, motorii și vegetative de la periferie către măduva și invers, inervând toată suprafața corpului, excepție făcând zona cefalică. La om au fost indentificate 31 de perechi de nervi spinali, grupați în opt perechi cervicale, doisprezece toracale, cinci lombare, cinci sacrale și o pereche de nervi spinali coccigieni. Nervii spinali rezultă din unirea rădăcinii dorsale (posterioară) cu rădăcina ventrală (anterioară).
Rădăcina dorsală prezintă pe traiectul său ganglionul spinal, format din corpii neuronali ai neuronilor pseudounipolari senzitivi primari (protoneuronii căilor sensibilităților somatice și vegetative). Aceasta este formată din fibre senzitive, care culeg informațiile de la periferie (exteroceptori, interoceptori, proprioceptori) și le transmit către segmentele centrale ale sistemului nervos, unde pot face sinapsă fie cu deutoneuronii, fie cu neuronii motori din coarnele anterioare, fie pot avea traiect ascendent către bulb (tractul spino-bulbar).
Rădăcina anterioară conține fibre motorii, reprezentate de axonii neuronilor somato-motori α și γ din coarnele anterioare și axonii neuronilor visceromotori din coarnele laterale. Aceste fibre se vor distribui glandelor, mușchilor scheletici și musculaturii netede a viscerelor și a vaselor de sânge.
Cele două rădăcini se unesc pe o porțiune de 1-2 cm și formează trunchiul nervului spinal; acesta părăsește canalul vertebral la nivelul neuroforamenului și se împarte în cinci ramuri:
a) Ramura dorsală – este subțire, scurtă și își păstrează organizarea metamerică. Aceasta conține fibre senzitive care inervează tegumentul feței dorsale a trunchiului și fibre motorii care inervează mușchii profunzi ai spatelui și cefei.
b) Ramura ventrală – este mai voluminoasă și inervează atât senzitiv cât și motor regiunile anterolaterale ale trunchiului și membrelor. Ramurile ventrale ale nervilor spinali T2-T12 își păstrează organizarea metamerică și formează cele 12 perechi de nervi intercostali, în timp ce restul ramurilor ventrale se anastomozează și formează plexurile cervical, brahial, lombar, sacral și sacrococcigian.
c) Ramura meningeală – se întoarce în canalul vertebral și inervează foițele meningeale și vasele sanguine de la acest nivel.
d) Ramura comunicantă albă – este prezentă la nivelul nervilor spinali toracali și lombari; conține fibre aferente vegetative care sunt dendritele neuronilor pseudounipolari viscerosenzitivi ce culeg informații de la organele interne și fibre eferente vegetative care reprezintă fibrele preganglionare simpatice mielinizate.
e) Ramura comunicantă cenușie – formată din fibre postganglionare nemielinizate colinergice care se întorc în trunchiul nervului spinal iar prin ramura ventrală sau dorsală se distribuie la vasele de sânge din tegument și din mușchii scheletici, glandele sudoripare și mușchii netezi erectori ai firelor de păr. Acestea intră în altcătuirea tuturor nervilor spinali (Flonta și colab., 2007).
1.2.3. Ganglionii spinali
Ganglionii spinali sunt structuri bilaterale, prezente la nivelul fiecărui segment vertebral, pe traiectul rădăcinii dorsale a nervului spinal. Tipurile celulare întâlnite la acest nivel sunt reprezentate de neuroni, celule satelit, macrofage rezidente și fibroblaste.
1.2.3.1 Celulele satelit sunt un tip specializat de celule gliale care învelesc și aderă intim la neuronii senzitivi și care sunt de aproximativ opt ori mai numeroase decât aceștia (Znaor, Lovrić, Hogan, & Sapunar, 2007). Rolul lor nu a fost complet elucidat, însă localizarea în proximitatea neuronilor permite un schimb bidirecțional de semnale ce poate influența excitabilitatea neuronilor, putând fi astfel implicate în procesarea informațiilor nociceptive. Celulele satelit exprimă markeri gliali specifici, precum sintetaza glutaminică (glutamine synthetase, GS), proteina S100β și proteina glială fibrilară acidică (glial fibrillary acidic protein, GFAP). În condiții fiziologice, celulele satelit nu exprimă GFAP, acesta fiind un marker al activării lor, spre exemplu în urma unei leziuni la nivelul nervului, a inflamației sau a unei infecții virale (Menachem Hanani, 2005). În aceste condiții, celulele satelit proliferează și secretă molecule care cel mai probabil atrag atât macrofagele rezidente cât și leucocitele circulatorii, care vor prolifera în ganglion (Campana, 2007; Ping Hu & McLachlan, 2003). În plus față de creșterea numărului de celule satelit în urma unei leziuni la nivelul nervului, s-a observat și faptul că are loc o creștere a conexiunii dintre acestea și neuroni, cel mai probabil prin creșterea numărului de joncțiuni gap (Huang & Hanani, 2005; Ledda et al., 2009; H. Zhang et al., 2009), care se consideră că ar juca un rol în durerea neuropatică (Cherkas et al., 2004; M. Hanani et al., 2002).
1.2.3.2 Neuronii din ganglionii spinali sunt pseudounipolari, ceea ce înseamnă că au un singur axon care părăsește corpul neuronal și care se bifurcă la nivelul unei joncțiuni T într-o parte periferică, ce are rol de dentrită și preia informațiile de la receptori și o parte centrală care pătrunde în măduva spinării și se arborizează, făcând sinapse cu neuronii din coarnele dorsale ipsilaterale, coarnele anterioare contralaterale sau interneuroni inhibitori (Leijnse & D’Herde, 2016; Oakley & Prager, 2002). Mai există o categorie de axoni care nu fac sinapsă la nivelul măduvei spinării, ci traversează cordoanele dorsale până ajung la trunchiul cerebral, formând tractul spino-bulbar.
Corpii neuronilor din ganglionii spinali au un diametru ce variază între 20 µm și 150 µm (Devor, 1999), fiind grupați în trei mari categorii: neuroni cu diametru mare (>50 µm), mic (<35 µm) și intermediar (35 – 50 µm). Studii vechi au realizat o corelație între dimensiunea pericarionului și viteza de conducere a axonului corespunzător. Astfel, s-a demonstrat faptul că neuronii cu dimensiuni mari sunt mielinizați și au o viteză de conducere a impulsului electric de minim 2,5 m/s, cei cu diametru mic sunt amielinici și conduc impulsurile cu mai puțin de 2,5 m/s iar pentru neuronii intermediari nu s-a observat nicio corelație. Astfel, s-a ajuns la concluzia că mărimea pericarionului este direct proporțională cu viteza de conducere a axonului și s-au descris neuroni de tip A, care sunt mielinizați și au o viteză de conducere mare și neuroni de tip C, nemielinizați și cu viteză de conducere mică (Lee et al., 1986).
O primă clasificare a fibrelor nervoase a fost realizată de către J. Erlanger and H. Gasser în anul 1930, care au observat în urma înregistrării potențialelor de acțiune in vitro trei maxime de voltaj, pe care le-au denumit α, β, γ și pe care le-au atribuit unui grup de fibre denumite A. Ulterior au mai descris încă două astfel de categorii: fibre B și C (Erlanger & Gasser, 1930) (Tabelul 1.1.).
Tabelul 1.1. Clasificarea fibrelor nervoase în funcție de viteza de conducere, diametrul fibrei și rolul acestora (adaptată după Erlanger & Gasser, 1930).
Într-un studiu ulterior, autorii au folosit un anticorp monoclonal produs în șoarece care se leagă specific la neurofilamentul de 200 kDa (NF200), pe care l-au numit RT97 (Wood & Anderton, 1981). Făcând o corelație între imunoreactivitatea față de acest anticorp, viteza de conducere a axonilor și dimensiunea corpilor neuronali, aceștia au clasificat fibrele nervoase în patru categorii:
Fibre C, nemielinizate, care conduc impulsurile cu 1,3 m/s și sunt RT97 negative;
Fibre C/Aδ, slab mielinizate, care conduc impulsurile cu 1,3-2 m/s și pot fi atât RT97 pozitive cât și negative;
Fibre Aδ, mielinizate, care conduc impulsurile cu 2-12 m/s și sunt RT97 pozitive;
Fibre Aα/β, mielinizate, care conduc impulsurile cu peste 12 m/s și sunt RT97 pozitive.
În urma acestui studiu s-a demonstrat faptul că anticorpii anti NF200 marchează specific populațiile de neuroni care corespund fibrelor nervoase de tip A. De asemenea, autorii au obervat următoarele corelații: cu cât crește intensitatea imunoreactivității față de RT97, crește și viteza de conducere și dimensiunea corpilor neuronali. Asemănător, odată cu creșterea conductanței crește și dimensiunea corpilor neuronali (Lawson & Waddell, 1991).
Neurofilamentele fac parte din categoria filamentelor intermediate de tip IV, fiind heteropolimeri formați din lanțuri ușoare, medii și grele. Acestea sunt componente esențiale ale citoscheletului neuronal, abundente în special în neuronii de dimensiuni medii și mari și implicate în menținerea homeostaziei, transportul intracelular către axon și dendrite și reglarea funcției enzimelor. A fost observat faptul că expresia acestora prezintă o creștere în cursul regenerării axonale (Wang et al., 2012). La om, lanțul greu are o greutate moleculară de 200 kDa și este codificat de gena Neurofilament heavy (NEFH) (https://ghr.nlm.nih.gov/gene/NEFH).
De asemenea, un studiu mai recent a demonstrat că această asociere specifică dintre NF200 și neuronii cu fibre nervoase tip A se menține valabilă și în urma leziunii nervilor periferici. Autorii au folosit ca model de durere neuropatică constricția cronică și au observat că neuronii cu fibre de tip A au exprimat în proporție de 100% NF200 în grupul control, dintre acești neuroni 30-40% fiind pozitivi și pentru calcitonin gene-related peptide (CGRP). După leziune, această categorie de neuroni a rămas pozitivă pentru NF200, iar o mare parte dintre ei au început să exprime și neuropeptidul Y. Neuronii cu fibre nervoase de tip C, în grupul control exprimă fie isolectina B4 (IB4), fie CGRP/substanța P (neuroni peptidergici) în proporții aproximativ egale. După leziune, grupul de neuroni peptidergici reprezintă o proporție mai mică decât neuronii care exprimă IB4 (Ruschewey et al., 2007).
1.3. Macrofage
Macrofagele sunt componente esențiale ale sistemului imunitar, fiind întâlnite în toate tipurile de țesuturi și având un rol fundamental în reglarea răspunsului inflamator (Murray & Wynn, 2011). Aceste celule sunt caracterizate de o plasticitate crescută, fiind capabile de a-și schimba fenotipul și fiziologia în funcție de mediul înconjurător. Funcția lor principală este de a îndepărta prin fagocitoză resturi celulare, agenți patogeni, substanțe străine sau orice alte debriuri (Mosser & Edwards, 2008). Ele provin din monocitele circulatorii din sângele periferic, care pot evolua pe două căi: fie pătrund în țesuturi pentru a forma populația de macrofage rezidente, cu rol în menținerea homeostaziei tisulare (Davies et al., 2013; Gordon & Taylor, 2005), fie rămân în sânge și formează populația inflamatorie, care va pătrunde în țesuturi ca urmare a unui proces inflamator (Mosser & Edwards, 2008).
În ganglionii spinali, pe lângă neuroni și celule satelit este prezentă și o populație de celule care exprimă pe suprafața lor markeri specifici macrofagelor, precum molecule aparținând complexului major de histocompatibilitate de clasă II (CMH II) (Lu & Richardson, 1993). Acestea sunt macrofagele rezidente, care sunt prezente în condiții fiziologice și suferă o înlocuire în proporție de aproximativ 80% o dată la 12 săptămâni (Müller et al., 2010). Studii de imunohistochimie au demonstrat că numărul macrofagelor crește în urma unei leziuni la nivelul nervului (Gehrmann, Monaco, & Kreutzberg, 1991), observându-se un raport de 3 la 1 între macrofagele infiltrate și cele rezidente, la șapte zile după leziune (Müller et al., 2010).
S-au descris două tipuri de macrofage distincte din punct de vedere funcțional: M1 și M2. Macrofagele de tip M1 au rol proinflamator iar activarea acestora, pe calea clasică, este indusă de molecule precum lipopolizaharidele bacteriene (LPS), interferonul γ (IFNγ) sau citokinele secretate de limfocitele T ajutătoare tip 1 (T helper 1, Th1) (Sica & Mantovani, 2012). Odată activate, ele secretă interleukina 1β (IL-1β), IL-6, factorul de necroză tumoral α (tumor necrosis factor α, TNFα), specii reactive de oxigen, oxid nitric și metaloproteinaze, toate acestea fiind implicate în menținerea inflamației (Martinez & Gordon, 2014). Activarea macrofagelor de tip M2 are loc pe calea alternativă și este indusă de citokine secretate de limfocitele T ajutătoare tip 2 (T helper 2, Th2), precum IL-4 și IL-13. IL-4 polarizează macrofagele către fenotipul M2, prin legarea la receptorii specifici de pe membrana acestora și activarea căii de semnalizare STAT6 (Lawrence & Natoli, 2011). Un studiu recent a demonstrat că IL-4 duce la reducerea populației de macrofage M1, determină schimbarea fenotipului către cel antiinflamator, M2 și atenuează simptomele durerii neuropatice datorită acestei înlocuiri. Pentru exercitarea efectului acestei interleukine s-a observat că este esențială semnalizarea celulară prin intermediul proteinei STAT6. De asemenea, experimente realizate în prezența lipopolizaharidelor au arătat faptul că IL-4 poate chiar și în aceste condiții să scadă expresia moleculelor asociate cu macrofagele tip M1 și să o crească pe a celor asociate cu cele polarizate M2 (Kiguchi et al., 2015). La rândul lor, aceste celule sintetizează o serie de molecule antiinflamatorii, printre care și IL-10, CD163, CD206, factorul de creștere tumorală β (tumor growth factor β, TGFβ), proteine ale matricei extracelulare și arginază (Wynn & Vannella, 2016).
În condiții normale, macrofagele rezidente din ganglionii spinali sunt în marea lor majoritate de tip M2, anti-inflamator, fiind implicate în protejarea sistemului nervos periferic și în menținerea homeostaziei (Davies et al., 2013). Interesant este faptul că în urma unei leziuni la nivelul nervului sciatic, s-a observat o acumulare de macrofage tot de tip M2 (Kwon et al., 2015; Niemi et al., 2016). Astfel, se consideră că atunci când procentul macrofagelor tip M1 crește și devine predominant, modificându-se echilibrul dintre cele polarizate M1 și cele M2, apare neuroinflamația care ar sta la baza durerii neuropatice (Komori et al., 2011).
În urma lezării nervilor periferici, neutrofilele răspund semnalelor chemotactice eliberate de către celulele rezidente din țesut și se infiltrează la locul leziunii în câteva ore (Kiguchi et al., 2012). Ulterior, monocitele/macrofagele se infiltrează și ele, fiind urmate de limfocite; aceste tipuri leucocitare facilitează în mod sinergic răspunsul imun și duce la dezvoltarea durerii neuropatice (P. Hu & McLachlan, 2002). Neuronii ai căror axoni au fost afectați secretă chemokina atractantă pentru monocite (monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1), denumită și C-C motif chemokine ligand 2 (CCL2) – care se leagă la receptorul specific de pe suprafața acestora – C-C motif chemokine receptor 2 (CCR2) – și determină infiltrarea lor în țesut (Auffray et al., 2007; Charo & Ransohoff, 2006; Takeda et al., 2018). CCL2, dar și alte chemokine din această familie, precum CCL3, CCL4, CCL5, recrutează și activează monocitele/macrofagele, fiind factori esențiali în durerea neuropatică; expresia lor este crescută în macrofagele care se infiltrează în nervii periferici în urma unei leziuni datorită unor modificări epigenetice la nivelul histonelor (Kiguchi et al., 2013). ARN-ul mesager pentru CCL2 este crescut în neuronii din ganglionii spinali la câteva ore după axotomie, gena care codifică sinteza acestuia putând astfel fi considerată o genă asociată regenerării (Schreiber et al., 2001). Odată pătrunse la acest nivel, monocitele se diferențiază în macrofage care sunt responsabile de menținerea răspunsului inflamator, prin sinteza de citokine implicate în repararea țesutului lezat (Murray & Wynn, 2011; Shi & Pamer, 2011). De asemenea, macrofagele rezidente din ganglionii spinali și de pe traiectul nervilor se activează și proliferează, participând la menținerea neuroinflamației prin recrutarea leucocitelor (Scholz & Woolf, 2007b), îndepărtarea debriurilor axonale și resturilor de mielină (degenerare Walleriană), stimularea sintezei factorului de creștere nervoasă (nerve growth factor, NGF) și proliferarea celulelor Schwann. La nivelul nervului, se consideră că macrofagele rezidente împreună cu celulele Schwann sunt implicate în etapele inițiale ale degenerării Walleriene, în timp ce macrofagele infiltrante au un rol important în faza tardivă a acestui proces (Dubový, 2011; Stoll et al., 1989).
Degenerarea Walleriană presupune fragmentarea segmentului distal al nervului lezat și fagocitarea acestuia, ceea ce permite ulterior regenerarea segmentului proximal. La animalele modificate genetic Ccl2 -/- sau Ccr2 -/-, în urma leziunii nervului periferic, s-a observat o acumulare redusă de macrofage atât în ganglionul spinal cât și la nivelul segmentului distal al nervului. În acest experiment, degenerarea Walleriană a fost mult redusă iar procesul ulterior de regenerare a fost încetinit (Niemi et al., 2013). Alte studii au observat că macrofagele infiltrante au suplimentat răspunsul celor rezidente doar în anumite zone ale nervilor periferici, ducând la ideea că în funcție de leziune, o componentă se poate activa mai rapid, poate fi singura componentă a răspunsului imun sau cele două se pot completa reciproc (Mueller et al., 2003). Acumularea macrofagelor la nivelul segmentului distal în urma tăierii nervului spinal poate fi observată la trei zile, atinge un maxim la 14 zile și scade până la 56 zile, fiind totuși încă observabile. Majoritatea acestor celule se acumulează în segmentul distal al nervului, însă o mică parte din ele se regăsesc și în segmentul proximal (Taskinen & Röyttä, 1997).
După axotomie, macrofagele se acumulează și în ganglionul spinal corespunzător. Această acumulare poate fi observată după 4 zile și este încă detectabilă chiar și după 32 de zile. Deși majoritatea macrofagelor se acumulează în ganglionul ipsilateral corespunzător axotomiei, într-o măsură mai mică aceste celule se infiltrează și proliferează și în ganglionul contralateral (Lu & Richardson, 1993). Într-un studiu care a folosit modelul de durere spared nerve injury (SNI), macrofagele din ganglionii L4 și L5 erau localizate preferențial în jurul neuronilor cu diametru mare (cu fibre tip A, NF200 pozitivi) a căror axoni au fost tăiați și într-o măsură mai mică în jurul neuronilor cu diametru mic și cu axoni tăiați sau a neuronilor care nu au axonii tăiați (Vega-Avelaira et al., 2009).
Pe lângă rolul lor în cadrul procesului inflamator, macrofagele secretă și TNFα și alte citokine excitatorii care sunt implicate în procesarea senzației de durere (Wagner & Myers, 1996). Durerea spontană sau indusă în urma lezării nervului se consideră că este provocată de hiperexcitabilitatea neuronilor senzitivi primari sau secundari, aceasta fiind la rândul ei determinată de prezența neurotrofinelor și citokinelor proinflamatorii secretate de celulele sistemului imunitar, precum macrofagele, care se presupune că sunt cele mai numeroase tipuri de leucocite în aceste condiții. Prin blocarea sintezei anumitor citokine (Wieseler-Frank et al., 2005), sau chiar a sistemului complement (Twining et al., 2005) s-a obținut o diminuare a comportamentului indus de durere, ceea ce a dus la concluzia că inflamația joacă un rol esențial în generarea senzației de durere. Alte studii au arătat că depleția macrofagelor infiltrante determină o scădere a hiperalgeziei și alodiniei, în urma unei leziuni traumatice sau metabolice a nervului (Liu et al., 2000; Mert et al., 2009). Citokinele și chemokinele secretate de către macrofage, precum TNFα, IL-1β, IL-6, proteina inflamatorie 1α a macrofagelor (macrophage inflamatory protein 1α, MIP-1α) sunt considerate potențiali mediatori ai hiperalgeziei deoarece pot acționa direct asupra fibrelor aferente sau indirect prin alți mediatori (Kawasaki et al., 2008). O curiozitate este faptul că intensitatea durerii este uneori independentă de severitatea leziunii, acest lucru fiind încă o dovadă că în senzația de durere sunt implicate celule non-neuronale care acționează asupra neuronilor senzitivi (Sommer et al., 1999).
1.4. Ionized calcium-binding adapter molecule 1 (Iba-1)
Iba-1, denumită și Allograft inflammatory factor 1 (AIF1) este o proteină de citoschelet specifică microgliilor și macrofagelor. La om, aceasta este codificată de gena AIF1, situată pe cromozomul 6p21.33, și are o greutate moleculară de 17 kDa. Această proteină are o expresie crescută la nivelul macrofagelor și microgliilor activate, având rol în legarea încrucișată a fibrelor de F-actină (actină filamentoasă), prin formarea de complexe cu L-fimbrina (Ohsawa et al., 2004). Se consideră că Iba-1 este implicată în procesul de fagocitoză, fiind co-localizată cu F-actina atât la nivelul cupelor fagocitare, cât și la nivelul unor structuri de membrană specializate denumite ruffles (Ohsawa et al., 2000). De asemenea, interacționează cu factorii de transcriere Pax5 și Pax6 (Maurya & Mishra, 2017, 2018), implicați în remodelarea microgliilor în cursul scanării țesutului nervos și este indispensabilă pentru supraviețuirea și activitatea proinflamatorie a macrofagelor (Yang et al., 2005).
Un studiu recent, realizat pe linia celulară de microglii BV2, a demonstrat faptul că Iba-1 joacă un rol esențial în procesul de migrare al acestor celule. Scăderea expresiei acestei proteine a dus la reducerea ratei de migrare, a capacității de proliferare și adeziune celulară a celulelor BV2, în timp ce procesul de fagocitoză și activitatea receptorilor P2x7 au crescut (Gheorghe et al., 2020).
1.5. Senzația de durere și durerea neuropatică
Durerea nociceptivă rezultă în urma detecției unor stimuli inteși sau nocivi de către neuronii senzitivi primari din ganglionii spinali, urmată de o transmitere a potențialelor de acțiune către măduva spinării și transferul ulterior al semnalului către creier. Fibrele C amielinice și cele Aδ slab mielinizate funcționează ca nociceptori, preluând informația de la stimulii nocivi reprezentați de căldură excesivă, temperatură scăzută, presiune, substanțe chimice și transformându-i în potențiale de acțiune (Woolf & Ma, 2007).
Durerea neuropatică este un sindrom complex, foarte dificil de tratat și care are un impact major asupra calității vieții umane. Aceasta este cauzată de leziuni traumatice sau metabolice, infecții, tumori sau substanțe neurotoxice în sistemul nervos central sau periferic (Woolf, 2004). O mare parte dintre pacienții diagnosticați cu această patologie nu primesc un tratament corespunzător (Attal & Bouhassira, 2015), acest lucru ducând la o scădere semnificativă a calității vieții și o pierdere economică atât a societății cât și a individului. Este nevoie astfel de dezvoltarea unor noi modalități farmacologice de tratare a durerii neuropatice (Attal et al., 2011).
Procesul de apariție al durerii neuropatice implică pe lângă căile de semnalizare neuronale și activitatea celulelor Schwann, a celulelor satelit, a componentelor sistemului imunitar și a astrocitelor, precum și interacții neuroni-celule imune, mediate de citokine și chemokine inflamatorii (Gosselin et al., 2010; Scholz & Woolf, 2007). Printre celulele imunitare implicate se numără macrofagele și microgliile, a căror profil de activare variază în funcție de tipul leziunii datorită plasticității crescute ce permite modificarea fenotipului în funcție de semnalele din mediu (Ristoiu, 2013).
Durerea neuropatică este caracterizată de hipersenzitivitate senzorială, care se manifestă prin durere spontană, hiperalgezie (senzitivitate anormală, crescută la stimuli dureroși) și alodinie (apariția senzației de durere ca răspuns la stimuli nedureroși în mod normal) rezistente la analgezicele clasice (Jensen & Finnerup, 2014). În urma unei leziuni la nivelul nervilor, numeroase tipuri celulare (inclusiv neuronii afectați) secretă citokine și chemokine proinflamatorii care recrutează leucocitele circulatorii, precum monocitele/macrofagele, neutrofilele și limfocitele (Kiguchi et al., 2012; Scholz & Woolf, 2007). Aceste celule secretă și ele la rândul lor citokine precum IL-1β, IL-6, TNFα și chemokine (CCL2, CCL3, CCL4) care sensibilizează direct nociceptorii, alterând procesarea informațiilor de către neuronii senzitivi (Nicol et al., 1997; Obreja et al., 2002; Oh et al., 2001; Zhang et al., 2005). În timpul durerii neuropatice, expresia și sensibilitatea canalelor ionice de la nivelul neuronilor este modificată, acestea fiind în general hiperexprimate, ceea ce duce la legarea citokinelor și chemokinelor proinflamatorii și sensibilizarea directă a nociceptorilor.
Sensibilizarea periferică determină în continuare o sensibilizare la nivel central, datorită unei transmiteri anormale de semnale nociceptive, pe o perioadă lungă de timp, către neuronii din coarnele dorsale ale măduvei spinării (Keller et al., 2007). Aceasta se caracterizează prin creșterea excitabilității deutoneuronilor și activarea microgliilor și astrocitelor, ceea ce va duce în final la o hipersensibilizare a neuronilor responsabili de procesarea senzației de durere de la nivelul coarnelor dorsale (Grace et al., 2014).
Până în prezent au fost dezvoltate șase modele experimentale ce presupun leziuni la nivelul nervului sciatic și sunt caracterizate de simptome diferite, asociate durerii neuropatice: constricția cronică (chronic constriction injury, CCI), ligaturarea nervului spinal (spinal nerve ligation, SNL), ligaturarea parțială a nervului sciatic (partial sciatic nerve ligation, PSL), tăierea nervului tibial și sural (tibial and sural nerve transection, TST), tăierea completă a nervului sciatic (complete sciatic nerve transection, CST) și Spared nerve injury (SNI). Toate aceste modele determină hiperalgezie, alodinie și hiperreactivitate chimică, ceea ce diferă însă este intensitatea și durata răspunsului la acești stimuli (Dowdall et al., 2005).
1.6. Ligaturarea și tăierea nervului spinal (SNL)
Modelul de durere neuropatică SNL a fost dezvoltat de către Kim și Chung, în anul 1992, fiind unul dintre cele mai utilizate în prezent. În urma acestuia apar modificări comportamentale prelungite, precum alodinie mecanică și indusă de temperaturi scăzute, hiperalgezie indusă termic și durere persistentă.
Operația presupune anestezia animalului, folosind izofluran, și așezarea acestuia pe partea ventrală. La nivelul regiunii lombare, luând ca reper creasta iliacă, se realizează o incizie longitudinală de aproximativ 3 cm, fiind astfel expuși mușchii paraspinali de la acest nivel. Cu ajutorul unui foarfec special se îndepărtează musculatura până se observă procesul transvers L6, care este ulterior tăiat, expunându-se astfel ramurile L4 și L5 ale nervului sciatic. Ramura L5 este apoi ligaturată și tăiată distal față de ligatură, pentru a asigura întreruperea completă a transmiterii impulsurilor electrice. O ajustare a acestui model poate fi ligaturarea și tăierea suplimentară a ramurii L6, care se este localizată sub osul sacrum. Îndepărtarea unei porțiuni a acestuia este necesară pentru vizualizarea clară a nervului, însă acest proces este însoțit de sângerare excesivă și astfel se recomandă manipularea ramurii L6 fără tăierea osului. În final, musculatura și pielea sunt cusute iar animalul este scos de sub anestezie. În general, antibioticele nu sunt necesare dacă s-a lucrat în condiții sterile, dar acestea pot fi aplicate totuși local sau sistemic.
O operație realizată corect va cauza modificări comportamentale caracteristice durerii neuropatice; deficitul motor nu este prezent în mod normal, cu excepția menținerii piciorului într-o poziție ușor curbată ventral (Figura 1.2). Acesta poate fi observat însă la animalele care au avut ramura L4 lezată, ceea ce se manifestă prin târârea piciorului de pe partea operată, semn că au fost paralizați mușchii proximali. În acest caz, animalele nu pot fi folosite pentru testele clasice de evaluare a durerii neuropatice, precum retragerea piciorului ca răspuns la stimuli externi. De asemenea, animalele operate corect prezintă alodinie mecanică, manifestată prin retragerea piciorului mult mai rapid și mai des, atât la stimulii dureroși cât și la cei nedureroși în mod normal (Chung, Kim, & Chung, 2004; Kim & Chung, 1992).
Figura 1.2. Menținerea piciorului de pe partea operată într-o poziție curbată în urma ligaturii ramurii L5 a nervului sciatic, semn clasic al durerii neuropatice (Kim & Chung, 1992).
1.7. Nervul sciatic
Nervul sciatic este cel mai voluminos nerv al plexului sacral, părăsind bazinul prin marele foramen sciatic și extinzându-se inferior, pe partea posterioară a coapsei, până la nivelul piciorului. Se împarte în două ramuri terminale: nervul tibial și nervul fibular comun (Flonta și colab., 2007).
Acesta inervează senzitiv partea anterioară, posterioară și exterioară a coapsei și gambei, partea superioară și exterioară a piciorului, talpa piciorului și zona dintre degetul 1 și 2. De asemenea, controlează articulația șoldului, a genunchiului și a gleznei, și inervează motor numeroși mușchi: mușchii posteriori ai coapsei, mușchii gambei și ai piciorului, făcând posibilă flexarea genunchiului, a piciorului și a degetelor (https://www.spine-health.com/conditions/spine-anatomy/sciatic-nerve-anatomy).
În urma unui studiu s-a observat că nervul sciatic la modelul murin prezintă o variație în ceea ce privește anatomia acestuia, deși până atunci se considera că este format din ramurile L4, L5 și L6 (Figura 1.3). Autorii au folosit 24 de șobolani Sprague-Dawley adulți și au observat că:
Ramurile L4 și L5 fuzionau pentru a forma nervul sciatic la toate animalele;
Ramura L6 (pe care ei o consideră a fi componenta majoră a nervului pudendal) trimitea o ramură subțire către nervul sciatic doar la 13 șobolani (54%), în timp ce la ceilalții 11 nu participa deloc la formarea acestuia (46%);
Ramura L3 trimitea o ramificație subțire către L4/nervul sciatic la 6 șobolani (25%).
Astfel, aceștia au ajuns la concluzia că părțile componente majore ale nervului sciatic sunt nervii spinali L4 și L5, în timp ce L3 și L6 pot participa sau nu la formarea acestuia (Asato et al., 2000).
Figura 1.3. Localizarea nervilor spinali L4, L5 și L6 (preluată și adaptată după Chung et al., 2004).
Nervul sciatic este cel mai folosit în studiile ce au la bază modele de lezare a nervilor periferici, deoarece are dimensiuni mari ce facilitează operația, este ușor accesibil, permite realizarea testelor comportamentale pe membrele posterioare și compararea rezulatelor obținute cu un număr mare de date prezente deja în literatură (Geuna, 2015).
1.7. Injecția intraganglionară
Având în vedere importanța neuronilor senzitivi dar și a celulelor non-neuronale din ganglionii spinali în patologia durerii neuropatice, administrarea de substanțe la acest nivel ar putea reprezenta o modalitate de tratament a acestei afecțiuni. Injecția intraganglionară a agenților terapeutici oferă oportunitatea de a manipula funcția neuronilor senzitivi și a celorlalte tipuri celulare pentru a explora fiziopatologia durerii (Fischer et al., 2011). Ganglionii spinali sunt localizați în foramenul intervertebral, fiind astfel greu de accesat pentru injecție; totuși, permeabilitatea crescută a capsulei care îi învelește permite transferul substanțelor la acest nivel. În majoritatea studiilor care folosesc șobolanii drept model experimental, ganglionul spinal lombar L5 este cel mai comun injectat (Abram et al., 2006).
Administrarea de agenți terapeutici în ganglionii spinali a fost utilizată în numeroase studii ce investigau mecanismele durerii, toxicitatea unor medicamente sau transferul de gene (Han et al., 2004; Xu et al., 2003; J.-M. Zhang et al., 2001). Într-un studiu din 2009, Puljak și colaboratorii au analizat trei metode de injecție intraganglionară: injecție percutanată fără operație, injecție după îndepărtarea țesutului moale și injecție după îndepărtarea țesutului moale și a osului laminar. Autorii au observat faptul că metoda percutanată nu a dus la o administrare corespunzătoare, în schimb îndepărtarea țesutului moale a facilitat procedura și a dus la rezultate semnificativ îmbunătățite. În această situație, ganglionul spinal nu este vizibil iar acul seringii trebuie introdus “în orb” prin foramenul intervertebral aproximativ 5 mm. Totuși, injecția precedată de laminectomie a fost cea mai promițătoare deoarece expune complet ganglionul spinal (Figura 1.4.). De asemenea, au observat și faptul că cele două metode care au presupus operația animalului nu au determinat ulterior modificări comportamentale care să influențeze rezultatele studiului (Puljak et al., 2009). Pentru injecție pot fi folosite seringi Hamilton, ace în formă de L, micropipete de sticlă sau cateter din poliuretan. Volumele injectate pot fi între 0.2 µl până la 5 µl la șobolani cu greutăți între 150g și 400g (S. J. Hu & Xing, 1998; Xin Lu & Richardson, 1991; Obata et al., 2002).
Figura 1.4. Injecție intraganglionară în ganglionul spinal L5, în urma laminectomiei; B – îndepărtarea procesului transvers L6; E – expunerea ganglionului spinal L5 (Puljak et al., 2009).
Capitolul 2. Materiale și metode
2.1. Condiții experimentale
Pentru studiul interacțiunilor spațiale între neuronii cu diametru mare (NF200 pozitivi) și macrofage (Iba-1 pozitive) am folosit modelul de durere neuropatică ligaturarea și tăierea nervului spinal (spinal nerve ligation, SNL). În acest sens, am utilizat șobolani masculi adulți Sprague-Dawley pe care i-am grupat în cinci condiții experimentale:
Control negativ – animalele nu au fost supuse niciunui tip de intervenție;
Sham PBS – animalele au fost injectate cu tampon fosfat salin (PBS 0,2x) în ganglionul corespunzător ramurii L5 a nervului sciatic;
Sham ARN control – animalele au fost injectate cu ARN control (ARNc, 400nM) (Axolabs, 01955), în ganglionul corespunzător ramurii L5 a nervului sciatic;
SNL – a presupus ligatura și tăierea ramurii L5 a nervului sciatic;
SNL urmat de injecție cu ARN de interferență (SNL+Iba-1 ARNi) –animalele la care a fost realizat SNL au fost injectate cu ARN de interferență specific pentru proteina Iba-1 (Iba-1 ARNi, 400nM) (Axolabs, 18491), în ganglionul spinal lombar 5 (Figura 2.1).
Figura 2.1. Condiții experimentale: animale control (a) și operate – Sham PBS (b), Sham ARNc (c), SNL (d), SNL+Iba-1 ARNi (e).
2.2. Prelucrarea probelor
Colectare: La 5 zile după operație, animalul a fost perfuzat cu paraformaldehidă 4% (PFA 4%) prin aorta ascendentă iar ganglionul L5 recoltat. Astfel, animalul a fost anesteziat folosind izofluran, iar pentru a testa dacă anestezia este profundă, s-a stimulat laba piciorului cu o pensă. Dacă animalul nu a prezentat niciun reflex, procedura a fost continuată astfel: s-a localizat sternul, iar la baza acestuia s-a realizat o incizie prin piele și mușchi. Ulterior, prin tăieturi mici, de o parte și de alta a abdomenului, s-a înlăturat țesutul până când s-a observat diafragma, iar în urma îndepărtării acesteia a fost expusă baza inimii. Apoi s-au realizat tăieturi de o parte și de alta a coastelor, până când inima a devenit complet vizibilă, iar cutia toracică a fost fixată, cu ajutorul unor pense hemostatice, într-o poziție ce permite o bună vizibilitate în interiorul acesteia. Odată expusă inima, s-a făcut o incizie la baza ventriculului stâng, la nivelul căreia s-a introdus acul conectat la pompa peristaltică, pe o distanță de aproximativ 5 mm, având grijă să nu lezăm țesutul cardiac iar cu ajutorul unei pense hemostatice, acul a fost fixat în poziție pe tot parcursul procedurii. De asemenea, a fost realizată o incizie și la nivelul atriului drept, pentru a permite eliminarea din organism a sângelui și soluțiilor perfuzate. Inițial s-a introdus o soluție de PBS 1x până când sângele a fost înlocuit, iar apoi aceasta a fost schimbată cu PFA 4%, care asigură fixarea. Când s-a observat atât creșterea durității țesutului cât și apariția contracțiilor musculare spontane, procesul de fixare a fost considerat complet și perfuzarea oprită. Ulterior, ganglionul L5 a fost recoltat și păstrat în PFA 4%, la 4°C, peste noapte.
Permeabilizare: Pentru următoarele 48-72 ore, ganglionii au fost tratați cu soluție de sucroză 30% (în PBS 1x), pentru crioprotecție, până când țesutul a sedimentat. Ulterior, aceștia au fost înghețați în mediu Optimal cutting temperature freezing medium (OCT) (Bio-Optica, 05-9801) și păstrați la -80°C până când au fost secționați.
Secționare: Ganglionii au fost scoși de la -80°C și lăsați o perioadă de timp la -20°C. Ulterior, aceștia au fost secționați la criotom iar secțiunile rezultate, cu o grosime de 10 µm, au fost dispuse pe lame de sticlă Superfrost Ultra Plus (ThermoFisher Scientific, J3800AMNZ). Lamele au fost lăsate la temperatura camerei peste noapte și apoi păstrate la -20°C până la începerea protocolului de imunohistochimie.
2.3. Imunohistochimie
Pentru fiecare condiție experimentală au fost recoltați trei ganglioni spinali de la nivel lombar 5, provenind de la 3 animale, iar pentru fiecare ganglion am marcat imunohistochimic 8 secțiuni; acestea au fost alese din patru în patru, pentru a evita suprapunerea câmpurilor și prezența acelorași celule în două secțiuni succesive. Neuronii cu diametru mare au fost evidențiați cu ajutorul anticorpului primar anti NF200 (Sigma, NO142, produs în șoarece, diluție 1:1000), care marchează neurofilamentul cu masa moleculară de 200 kDa iar macrofagele au fost marcate cu un anticorp primar anti Iba-1 (Wako, produs în iepure, diluție 1:1000). Ca anticorpi secundari, fluorescenți, am folosit Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A11008, diluție 1:1500), capră-anti iepure IgG (H+L), care recunoaște specific anticorpul primar anti Iba-1 și Alexa Fluor 568 (Invitrogen, A11004, diluție 1:1500) capră-anti șoarece IgG (H+L), care se leagă la anticorpul primar anti NF200.
Secțiunile au fost scoase de la -20°C și lăsate la temperatura camerei timp de 10-20 minute pentru a se dezgheța, apoi au fost spălate cu PBS 1x de cinci ori. A urmat etapa de blocare a situsurilor nespecifice, timp de o oră, la temperatura camerei, folosind ser normal de capră 4% preparat în PBS cu Triton-X-100 0.1% (PBS-T). După această etapă, secțiunile au fost tratate cu soluția de anticorpi primari (preparată în soluția de blocare) peste noapte, la 4 °C. A doua zi, s-au realizat cinci spălări cu PBS-T, iar apoi s-a adăugat soluția de anticorpi secundari preparată tot în soluția de blocare, timp de două ore, la temperatura camerei, la întuneric. Ulterior, secțiunile au fost spălate de trei ori cu PBS-T și de trei ori cu PBS 1x. Apoi, peste acestea s-a adaugat soluția de montare, și anume, reactivul ProLong Gold antifade reagent with DAPI (Life Technologies, P36935), care încetinește pierderea fluorescenței și marchează nucleii celulelor. La sfârșit, secțiunile au fost acoperite cu un coverslip iar lamele au fost lăsate la uscat pentru 24h la temperatura camerei, fiind apoi stocate la frigider, la 4°C (Figura 2.2).
Figura 2.2. Marcarea imunohistochimică a secțiunilor de ganglioni spinali; a. Blocarea situsurilor nespecifice cu soluție 4% ser normal de capră; b. Marcarea macrofagelor și neuronilor cu anticorpi primari specifici anti Iba-1, respectiv anti NF200; c. Adăugarea anticorpilor secundari A488 capră-anti iepure și A568 capră-anti șoarece.
2.4. Captarea și analiza imaginilor
Imaginile au fost captate la microscopul optic cu fluorescență Olympus IX73, cu ajutorul camerei digitale Hamamatsu ORCA-03 și a programului CellSens Dimension, cu obiectivul 40x. Fiecare secțiune marcată a fost fotografiată în întregime, urmând ca ulterior să alegem trei câmpuri reprezentative din fiecare, folosind ca și criteriu numărul mare de neuroni, atât NF200 pozitivi cât și NF200 negativi. Pentru a vizualiza macrofagele, imaginile au fost captate pe canalul FITC (pentru A488), cu o expunere de 549,3 ms, care a fost menținută pe tot parcursul protocolului (Figura 2.3).
Figura 2.3. Imagine captată pe canalul pentru A488, obiectiv 40x, ilustrând macrofagele Iba-1 pozitive. (scală, 20 µm)
Ulterior, același câmp a fost fotografiat și pe canalul TRITC (pentru A568), cu o expunere de 210 ms (păstrată constantă pentru toate condițiile), pentru a vizualiza neuronii cu diametru mare (Figura 2.4).
Figura 2.4. Imagine captată pe canalul pentru A568, obiectiv 40x, ilustrând neuronii NF200 pozitivi. (scală, 20 µm)
Pentru a asigura specificitatea anticorpilor secundari, am inclus și controale negative, în care secțiunile au fost marcate doar cu A488 și A568 (Figura 2.5).
Figura 2.5. A. Control negativ pentru Alexa Fluor 488, obiectiv 40x; B. Control negativ pentru Alexa Fluor 568, obiectiv 40x. (Scală, 20 µm)
Ulterior, imaginile selectate au fost analizate folosind un plugin personalizat pentru programul ImageJ. Inițial, acesta ia imaginea captată pe canalul pentru A568 și o convertește în alb-negru, apoi identifică neuronii NF200 pozitivi (în funcție de intensitatea fluorescenței și numărul de pixeli), îi numerotează și îi delimitează (Figura 2.6).
Figura 2.6. Convertirea imaginii în alb-negru, delimitarea neuronilor și numerotarea acestora.
Apoi, programul deschide imaginea corespunzătoare captată pe canalul pentru A488 și măsoară intensitatea fluorescenței în cadrul regiunilor delimitate anterior, corespunzătoare neuronilor NF200 pozitivi. Suplimentar acestor informații, este salvat și numărul de neuroni pozitivi din fiecare imagine, toate aceste date fiind ulterior regăsite într-un fișier Excel cu denumirea “Regiunea 1” (Figura 2.7).
Figura 2.7. Regiunea 1: Intensitatea fluorescenței macrofagelor Iba-1 pozitive în interiorul neuronilor NF200 pozitivi, obiectiv 40x. (Scală, 20 µm)
În continuare, este mărită suprafața corespunzătoare neuronilor NF200 pozitivi și măsurată din nou intensitatea macrofagelor în cadrul acestei noi regiuni. Datele sunt salvate de asemenea într-un al doilea fișier Excel, denumit “Regiunea 2” (Figura 2.8).
Figura 2.8. Regiunea 2: Extinderea marginilor neuronilor pentru măsurarea intensității fluorescenței macrofagelor Iba-1 pozitive în cadrul acestora. (Scală, 20 µm)
La sfârșit, programul combină cele două imagini corespunzătoare aceluiași câmp, rezultând o poza suprapusă, în care se pot observa atât macrofagele cât și neuronii NF200 pozitivi (Figura 2.9).
Figura 2.9. Suprapunerea imaginilor captate pe canalul pentru A488, respectiv pentru A568. (Scală, 20 µm)
Ulterior, ne-am folosit de datele salvate automat de ImageJ în Excel și am realizat două tipuri de analiză: în primul rând am făcut media intensității fluorescenței Iba-1 pe tot câmpul iar ulterior, pentru cel de-al doilea tip de analiză, am făcut media intensității fluorescenței Iba-1 în regiunea 2, valoare pe care am raportat-o la media ariei regiunii 2. Datele au fost ulterior normalizate la condiția Control și introduse în Prism, unde au fost analizate folosind testele One-Way ANOVA și Bonfferoni. Valoarea lui p a fost considerată semnificativă din punct de vedere statistic astfel: p<0.05 *, p<0.01 **, p<0.001 ***, p<0.0001 ****, iar rezultatele sunt prezentate ca medie ± eroare standard a mediei (SEM).
Capitolul 3. Rezultate și discuții
3.1. Efectul administrării ARN-ului de interferență specific pentru proteina Iba-1, la nivelul ganglionului spinal L5, asupra expresiei proteinei Iba-1.
Într-un studiu anterior care face parte din teza de doctorat intitulată “Rolul receptorului TRPV1 și al macrofagelor endogene din ganglionii spinali în producerea durerii neuropatice”, autor Dr. Roxana Gheorghe (2019), a fost demonstrată eficiența administrării de ARN de interferență specific proteinei Iba-1 la nivelul ganglionului spinal L5 prin teste de polimerizare în lanț (Polymerase Chain Reaction, PCR) și Western Blot. Astfel, testele efectuate pe țesutul recoltat în cele cinci condiții experimentale (Control, Sham PBS, Sham ARNc, SNL, SNL+Iba-1 ARNi) au arătat o reducere semnificativă a cantității de proteină Iba-1 în urma aplicării tratamentului (Gheorghe R., 2019, teză de doctorat).
În cadrul prezentului studiu ne-am propus pentru început să reconfirmăm efectul ARN-ului de interferență asupra proteinei Iba-1 prin teste de imunohistochimie. Astfel, secțiuni de ganglioni spinali L5 din toate condițiile experimentale (i.e Control, Sham PBS, Sham ARNc, SNL, SNL+Iba-1 ARNi) au fost analizate pentru intensitatea fluorescenței Iba-1 la nivelul tuturor macrofagelor, atât în cele ce formau inelul peri-neuronal, cât și în cele dispersate printre neuroni. După cum am precizat și în capitolul de Materiale și metode, pentru fiecare dintre cele cinci condiții experimentale am folosit câte 3 animale (respectiv 3 ganglioni), din fiecare ganglion am marcat imunohistochimic 8 secțiuni, iar pentru fiecare dintre acestea am ales 3 câmpuri reprezentative folosind drept criteriu de selecție numărul mare de neuroni, atât NF200 pozitivi cât și NF200 negativi. Valoarea lui “n” menționată mai jos se referă la numărul de animale folosite per condiție, iar rezultatele sunt prezentate ca medie±SEM.
În cazul condiției Sham, intensitatea fluorescenței Iba-1 a fost la un nivel scăzut, asemănător nivelului bazal cuantificat în cazul condiției Control. Deoarece nu au fost identificate diferențe statistic semnificative între cele două grupuri experimentale Sham, respectiv Sham PBS și Sham ARNc, cele două condiții au fost grupate într-un singur lot Sham (Figura 3.1).
Figura 3.1. Imagini reprezentative pentru condițiile Sham PBS și Sham ARNc (scală, 20µm).
În cazul condiției SNL, ca urmare a ligaturării și tăierii nervului spinal L5, intensitatea fluorescenței proteinei Iba-1 a crescut semnificativ în comparație cu condiția Sham, în timp ce după administrarea ARN-ului de interferență, intensitatea fluorescenței a scăzut semnificativ în comparație cu condiția SNL, ajungând aproximativ la același nivel bazal ca cel din condițiile Control și Sham (Figura 3.2 a și b: intensitatea fluorescenței Iba-1 în condiția Control: 1.00±0.02, n=3; în condiția Sham: 0.90±0.02, n=3; în condiția SNL: 1.39±0.06, n=3; și în condiția SNL+Iba-1 ARNi: 1.05±0.03, n=3; cu ****p<0.0001 pentru SNL vs Sham și ****p<0.0001 pentru SNL vs SNL+Iba-1 ARNi). Aceste rezultate confirmă rezultatele anterioare obținute prin RT-PCR si Western blot, respectiv că administrarea ARN-ului de interferență specific pentru Iba-1, prin injecție în ganglionul spinal L5, scade semnificativ nivelul de expresie al acestei proteine la nivelul macrofagelor.
Figura 3.2. Administrarea ARN-ului de interferență prin injecție în ganglionul spinal L5 determină scăderea expresiei proteinei Iba-1. (A) Grafic ilustrând intensitatea fluorescenței Iba-1. (B) Imagini reprezentative pentru imunomarcarea cu anticorpi anti Iba-1 în condiția control și la 5 zile după Sham, SNL și SNL+Iba-1 ARNi (scală, 20µm).
Rezultatele noastre au arătat că în urma ligaturării și tăierii nervului spinal L5 are loc creșterea expresiei proteinei Iba-1 la nivelul macrofagelor din ganglionul spinal aferent, proces care este diminuat de administrarea ARN-ului de interferență specific acestei proteine. Într-un studiu din 2013, Ton și colaboratorii au analizat evoluția în timp a concentrației de ARNm pentru Iba-1 la 1, 3, 5 și 10 zile după SNL, observând că aceasta crește progresiv până în ziua 5, când atinge valoarea maximă, fiind într-o cantitate de 8 ori mai mare decât în Sham. Ulterior concentrația de ARNm scade, însă este în continuare semnificativ statistic mai mare comparativ cu grupul Sham (de 5 ori mai mare, la 10 zile după SNL) (Figura 3.3) (Ton et al., 2013).
Figura 3.3. Evoluția în timp a concentrației de ARNm pentru Iba-1 după SNL. (A) Imagine reprezentativă pentru fluorescența Iba-1 la 5 zile după SNL, în ganglionul spinal L5 (scală, 50 µm). (B) Grafic ilustrând cantitatea de ARNm pentru Iba-1 la 1, 3, 5 și 10 zile după operație (preluată și adaptată după Ton et al., 2013).
Creșterea expresiei Iba-1 la nivelul ganglionilor spinali a fost observată și după realizarea modelului de durere neuropatică de constricție cronică a nervului sciatic (CCI), această creștere fiind semnificativă la 7, respectiv 14 zile după leziune (Kwiatkowski et al., 2017).
3.2. Efectul administrării ARN-ului de interferență specific pentru proteina Iba-1, la nivelul ganglionului spinal L5, asupra interacțiunii spațiale dintre macrofage și neuroni.
Pentru a studia interacțiunea spațială dintre macrofage și neuroni am analizat 3 ganglioni spinali L5 per condiție, 8 secțiuni per ganglion și 3 câmpuri per secțiune. Valoarea lui “n” menționată mai jos face referire la numărul de animale folosite per condiție iar rezultatele sunt prezentate ca medie±SEM. Așa cum am specificat și în capitolul de Materiale și metode, pentru fiecare câmp, folosindu-ne de programul ImageJ și de plugin-ul personalizat, am delimitat două regiuni asociate neuronilor NF200 pozitivi, denumite regiunea 1 (care corespunde marginilor neuronilor, stabilite în funcție de intensitatea fluorescenței și numărul de pixeli) și regiunea 2 (în care este mărită suprafața corespunzătoare neuronilor NF200 pozitivi) (Figura 3.4).
Figura 3.4. Imagini reprezentative ilustrând cele două regiuni asociate neuronilor NF200 pozitivi. (A) Regiunea 1, corespunzătoare marginilor neuronilor. (B) Regiunea 2, care presupune extinderea marginilor neuronale (scală, 20µm).
În cadrul acestui experiment am măsurat intensitatea fluorescenței Iba-1 la nivelul macrofagelor care formează inelele peri-neuronale, raportată la aria inelului peri-neuronal.
Rezultatele au arătat că în cazul condițiilor Control și Sham, macrofagele sunt dispersate omogen la nivelul ganglionului, nu se aglomerează în jurul neuronilor și nici nu formează inele (Figura 3.5 a și b). După ligaturarea și tăierea nervului spinal L5, acestea se concentrează în jurul celulelor nervoase unde formează inelele peri-neuronale specifice (Figura 3.5 b SNL), similare cu cele descrise anterior (Ton et al., 2013). Dispunerea peri-neuronală este însoțită și de o creștere a fluorescenței Iba-1 comparativ cu valorile din Control și Sham (Figura 3.5.a), sugerând că pe lângă faptul că macrofagele formează inele peri-neuronale, crește și gradul lor de activare identificat prin creșterea expresiei proteinei Iba-1. În urma administrării tratamentului după SNL, am constatat că macrofagele au tendința de a se îndepărta de neuroni. Astfel, deși inelele peri-neuronale nu sunt complet dezorganizate, acestea devin mai laxe, fiind formate din macrofage care nu mai sunt localizate în imediata vecinătate a neuronilor (Figura 3.5.b, SNL+Iba-1 ARNi). Distribuirea macrofagelor după SNL+Iba-1 ARNi pe o arie mai mare, împreună cu fluorescența Iba-1 scazută, după cum am arătat în secțiunea 3.1, explică raportul scăzut dintre fluorescența Iba-1 și arie în comparație cu condiția SNL (Figura 3.5 a și b, fluorescență Iba-1 medie/arie în condiția Control: 1.00±0.01, n=3; în condiția Sham: 0.95±0.02, n=3; în condiția SNL: 1.26±0.05, n=3; și în condiția SNL+Iba-1 ARNi: 1.12±0.03, n=3, cu *p<0.05 pentru SNL vs SNL+Iba-1 ARNi).
Figura 3.5. Administrarea ARN-ului de interferență pentru Iba-1 determină dezorganizarea parțială a inelelor peri-neuronale. (A) Grafic ilustrând fluorescența inelului peri-neuronal, obținută prin raportul dintre intensitatea fluorescenței Iba-1 și aria în care a fost măsurată. (B) Imagini reprezentative pentru co-marcarea cu anticorpi anti Iba-1 și anti NF200, în condiția control și la 5 zile după Sham, SNL și SNL+Iba-1 ARNi. Inset-urile evidențiază inelele peri-neuronale formate în jurul neuronilor NF200 pozitivi în condiția SNL, respectiv în condiția SNL+Iba-1 ARNi (scală, 20 µm)
Durerea neuropatică poate apărea ca urmare a lezării nervilor periferici, ceea ce determină activarea celulelor imunitare, inclusiv a macrofagelor, și interacțiunea acestora cu neuronii senzitivi pe care îi sensibilizează (Gosselin et al., 2010; Scholz & Woolf, 2007). În urma ligaturării și tăierii nervului spinal L5, macrofagele Iba-1 pozitive își măresc corpul celular, care devine aplatizat și se aglomerează în special în jurul neuronilor cu diametru mare, de tip A (>50µm), formând inele peri-neuronale care indică o conexiune strânsă între aceste două categorii de celule (Ton et al., 2013). NF200 este un neurofilament folosit ca marker pentru această populație de neuroni care sunt implicați în sensibilitatea mecanică (Lawson & Waddell, 1991). Rezultatele noastre au arătat faptul că administrarea prin injecție a ARN-ului de interferență specific proteinei Iba-1 la nivelul ganglionului spinal L5 determină o scădere a expresiei Iba-1, ceea ce în consecință duce la dezorganizarea parțială a inelelor peri-neuronale asociate cu neuronii NF200 pozitivi, care devin mai laxe. Un studiu anterior, parte a tezei de doctorat “Rolul receptorului TRPV1 și al macrofagelor endogene din ganglionii spinali în producerea durerii neuropatice”, autor Dr. Roxana Gheorghe (2019), bazat pe teste comportamentale a arătat faptul că animalele injectate cu ARN de interferență specific pentru Iba-1 au prezentat o diminuare a durerii neuropatice (Gheorghe R, 2019, teză de doctorat). În urma asocierii acestor rezultate cu cele obținute prin imunohistochimie putem concluziona că scăderea expresiei Iba-1 duce la dezorganizarea parțială a inelelor din jurul neuronilor NF200 pozitivi, ceea ce determină, probabil, desensibilizarea neuronilor și reducerea senzației de durere.
Interacțiunea dintre macrofage și neuroni a mai fost studiată și în alte modele de durere neuropatică, precum SNI (spared nerve injury), fiind observată aceeași tendință a celulelor Iba-1 pozitive de a se grupa în jurul neuronilor de dimensiuni mari. Într-un studiu din 2009, Vega-Avelaira și colaboratorii au arătat că la 7 zile după SNI, procentul de macrofage care formează inele peri-neuronale este mult mai mare în jurul neuronilor de tip A (>25µm), decât în jurul celor cu fibre de tip C (<25µm). De asemenea, aceștia au evidențiat celulele nervoase lezate cu ajutorul marcării cu Fluorogold, observând că există o proporție mai mare de neuroni tip A lezați care sunt înconjurați de macrofage (33.8%), comparativ cu cei intacți (9.9%). În cazul neuronilor tip C, procentul de celule lezate care prezintă inele era mult mai mic (10%), în timp ce neuronii intacți nu au fost înconjurați deloc de către macrofage (Figura 3.6) (Vega-Avelaira et al., 2009a). Aceeași distribuție a celulelor Iba-1 pozitive, ce presupune formarea inelelor peri-neuronale în jurul neuronilor senzitivi după SNI a fost observată și în alte studii (Bravo-Caparrós et al., 2020; Kwon et al., 2013).
Figura 3.6. Distribuția macrofagelor la 7 zile după SNI. (A) Macrofagele Iba-1 pozitive se grupează sub formă de inele peri-neuronale în jurul neuronilor de tip A, având corpi celulari măriți, cu procese direcționate către celulele nervoase lezate (săgeți galbene) și intacte (săgeți roșii). Neuronii tip C nu prezintă în general inele (săgeți albe), deși există și excepții (săgeți albastre). Scală, 100 µm. (B) Grafic ilustrând proporția de neuroni tip A lezați sau intacți, cu/fără inel. (C) Grafic ilustrând proporția de neuroni tip C lezați sau intacți, cu/fără inel (preluată și adaptată după Vega-Avelaira et al., 2009a).
Conform studiului lui Yu et al., 2020, creșterea numărului de macrofage la nivelul ganglionului spinal după axotomie se datorează în primul rând proliferării locale, deși ideea de infiltrare nu poate fi complex exclusă. De asemenea, autorii acestui studiu au concluzionat faptul că pentru inițierea și menținerea alodiniei induse de axotomie, cât și pentru inițierea durerii neuropatice, sunt esențiale macrofagele de la nivelul ganglionilor spinali, aceste procese fiind independente de macrofagele infiltrate la nivelul zonei lezate a nervului periferic. În plus, ei au observat o comunicare bidirecțională între neuroni și macrofage: ca urmare a unei leziuni la nivelul nervilor periferici are loc creșterea numărului de macrofage datorită interacțiunii cu neuronii lezați care exprimă factorul stimulator de colonii 1 (colony stimulating factor 1, CSF1) iar la rândul lor, aceste celule imunitare secretă interleukina 1β (IL1β), o citokină care va determina sensibilizarea neuronilor (Yu et al., 2020).
O altă moleculă ce face parte din familia citokinelor, și care se consideră a fi implicată în interacțiunea neuroni-macrofage, și implicit în durerea neuropatică, este CCL2; aceasta are un rol esențial în recrutarea macrofagelor la nivelul ganglionului spinal în urma unei leziuni a nervilor periferici, exercitându-și rolul prin intermediul receptorului CCR2 (Dansereau et al., 2008; Jung et al., 2009). În urma unor teste comportamentale s-a observat faptul că administrarea de anticorpi anti CCL2 determină reducerea alodiniei mecanice induse de constricția cronică a nervului sciatic (Thacker et al., 2009). De asemenea, un studiu recent a arătat că neuronii lezați încep să secrete CCL2 la 24h după SNI, concentrația atingând maxim-ul la 3 zile și scăzând spre ziua 7 (Bravo-Caparrós et al., 2020). Rolul esențial al acestei chemokine în recrutarea macrofagelor în ganglionii spinali a fost demonstrat folosind animale CCL2-/-. Acestea nu au prezentat o acumulare de celule Iba-1 pozitive după SNI, spre deosebire de animalele nemodificate genetic, cu fenotip sălbatic (Figura 3.7) (Kwon et al., 2015).
Figura 3.7. Modificări la nivelul numărului de macrofage Iba-1 pozitive după SNI, în animalele cu fenotip sălbatic și animalele CCL2 -/-. (A, B) Imagini reprezentative ilustrând celulele Iba-1 pozitive la nivelul ganglionului spinal recoltat din animale cu fenotip sălbatic (A) și animale CCL2 -/- (B), după SNI (scală, 50 µm). (C) Cuantificarea numărului de macrofage la 0 (CTRL), 1, 3 și 7 zile după SNI (preluată și adaptată după Kwon et al., 2015).
3.3. Efectul administrării ARN-ului de interferență specific pentru proteina Iba-1, la nivelul ganglionului spinal L5, asupra fenotipului macrofagelor Iba-1 pozitive.
În ceea ce privește fenotipul macrofagelor Iba-1 pozitive, am observat faptul că în condițiile Control și Sham, acestea prezentau un corp celular mic, preponderent rotund sau ușor oval/fusiform, în general fiind lipsite de prelungiri. După SNL au avut loc modificări fenotipice, astfel că macrofagele și-au mărit corpul celular, acesta devenind alungit și aplatizat. În urma administrării tratamentului, respectiv a ARN-ului de interferență, la nivelul ganglionului spinal L5, celulele Iba-1 pozitive au avut tendința de a-și păstra forma alungită, însă corpul celular a devenit mai îngust (Figura 3.8).
Figura 3.8. Imagini reprezentative, ilustrând fenotipul predominant al macrofagelor Iba-1 pozitive în cadrul condiției Control și la 5 zile după Sham, SNL și SNL+Iba-1 ARNi. Inset-urile evidențiază macrofage cu corp celular mic și rotund în condițiile Control și Sham, respectiv cu corp celular mărit, în condițiile SNL și SNL+Iba-1 ARNi (scală, 20µm).
O morfologie asemănătoare a fost observată și în cadrul macrofagelor Iba-1 pozitive activate în urma modelului de durere SNI. Astfel, aceste celule prezentau un corp celular mărit și aplatizat, care nu era observat în cazul condiției Sham (Figura 3.9) (Kobiela Ketz et al., 2017). De asemenea, în urma inducerii neuropatiei diabetice, macrofagele nu prezintă modificări morfologice importante, dar sunt caracterizate de hipertrofie la 2-4 săptămâni după instalarea diabetului (Ton et al., 2013).
Figura 3.9. Imagini reprezentative pentru morfologia macrofagelor Iba-1 pozitive la 7 și 14 zile după SNI (B,D), respectiv Sham (A,C). Săgețile albe evidențiază macrofagele activate cu morfologie tipică (scală, 100 µm; obiectiv 10x) (preluată și adaptată după Kobiela Ketz et al., 2017)
Capitolul 4. Concluzii
Prin intermediul acestui studiu am dorit să investigăm efectul administrării prin injecție a ARN-ului de interferență specific pentru Iba-1, la nivelul ganglionului spinal L5, asupra expresiei acestei proteine, a fenotipului macrofagelor Iba-1 pozitive și a interacțiunii spațiale dintre acestea și neuronii NF200 pozitivi. Astfel, principalele noastre observații sunt:
la 5 zile după SNL are loc creșterea expresiei proteinei Iba-1 la nivelul ganglionului spinal aferent, proces ce este semnificativ diminuat prin administrarea ARN-ului de interferență;
în urma ligaturării și tăierii nervului spinal L5, macrofagele Iba-1 pozitive se aglomerează în jurul neuronilor NF200 pozitivi, pe care îi înconjoară, formând inele peri-neuronale ce indică o conexiune strânsă între aceste două categorii de celule. Aplicarea tratamentului a determinat dezorganizarea parțială a acestor inele, care au devenit mai laxe, macrofagele nemaifiind localizate în imediata vecinătate a neuronilor;
administrarea ARN-ului de interferență specific pentru Iba-1 nu a determinat modificări morfologice majore la nivelul macrofagelor, acestea păstrându-și fenotipul alungit, cu un corp celular mare, caracteristic acestui model de durere neuropatică.
Concluzionând, studiul nostru a evidențiat rolul esențial pe care îl are proteina Iba-1 asupra interacțiunii spațiale dintre macrofage și neuroni în urma ligaturării și tăierii nervului spinal L5. Având în vedere importanța interacțiunilor dintre celulele nervoase și cele imunitare în inițierea și menținerea durerii neuropatice, înțelegerea modului în care aceste două categorii de celule comunică, și a mecanismelor moleculare care stau la baza acestei comunicări reprezintă un progres în tratamentul acestei patologii.
Capitolul 5. Direcții de cercetare
La nivelul ganglionilor spinali, în plus față de neuronii cu diametru mare, NF200 pozitivi, se mai disting două categorii de celule nervoase: cele cu diametru mic (<35 µm) și intermediar (35 – 50 µm) (Lee et al., 1986). Pentru evidențierea neuronilor cu diametru mic, care funcționează ca nociceptori polimodali, activați de stimuli chimici, termici și mecanici, cu prag de excitabilitate înalt și cu axoni slab mielinizați (Aδ) sau nemielinizați (C) este folosit ca marker CGRP (Gold & Gebhart, 2010; Gu & Yu, 2007). Acesta este o neuropeptidă care, prin intermediul unui complex de receptori, crește frecvența eliberării de neurotransmițători și răspunsul la stimuli nocivi, ceea ce determină o sensibilizare la nivel central, conducând la durerea neuropatică (Poyner, 1992). A fost observat faptul că ulterior tăierii unilaterale a nervului sciatic, neuronii CGRP pozitivi de la nivelul ganglionilor spinali ipsilaterali prezintă o expresie crescută a acestei neuropeptide, în timp ce în urma ligaturării și tăierii ramurii L5 a nervului sciatic are loc scăderea expresiei CGRP sub nivelul bazal, datorită afectării transportului retrograd a factorului de creștere nervoasă (Zheng et al., 2008).
Având în vedere rolul neuronilor CGRP pozitivi în sensibilitatea dureroasă și durerea neuropatică, în cadrul unor studii ulterioare ne propunem realizarea experimentelor de imunohistochimie pe ganglioni spinali recoltați din cele patru condiții experimentale: Control, Sham, SNL, SNL+Iba-1 și marcarea neuronilor cu anticorpi anti CGRP și a macrofagelor cu anticorpi anti Iba-1. Astfel, vom putea observa distribuția celulelor Iba-1 pozitive în jurul acestor nociceptori și efectul administrării ARN-ului de interferență specific proteinei Iba-1 asupra interacțiunii dintre macrofage și această subpopulație de neuroni.
Un alt model de durere neuropatică este SNI, care presupune ligaturarea a două dintre cele trei ramuri ale nervului sciatic: nervul tibial și nervul peroneal comun, în timp ce nervul sural rămâne intact (Decosterd & Woolf, 2000). În această situație s-a observat faptul că macrofagele Iba-1 pozitive formează inele peri-neuronale doar în jurul neuronilor NF200 pozitivi, la 7 zile după realizarea modelului, comparativ cu 3-5 zile după SNL, caz în care macrofagele se aglomerează și în jurul neuronilor care exprimă CGRP, deși într-o proporție mai mică (Vega-Avelair et al., 2009). În cazul ambelor modele de durere neuropatică, se consideră că celulele Iba-1 pozitive sunt atrase la nivelul ganglionilor spinali datorită expresiei crescute de CCL2 de către neuroni, această chemokină mediind interacțiunea dintre celulele neuronale și macrofage (Kwon et al., 2015). Astfel, o potențială continuare a acestui proiect ar fi să investigăm ce procent din neuronii NF200/CGRP pozitivi din ganglionii spinali, care prezintă inele peri-neuronale de macrofage, sunt pozitivi și pentru CCL2.
Nu în ultimul rând, un pas următor în această direcție ar fi să observăm ce se întâmplă în măduva spinării în urma acestor două modele de durere neuropatică. La nivel central, ulterior lezării nervului sciatic, are loc activarea microgliilor care reprezintă macrofagele rezidente de la acest nivel și care sunt de asemenea Iba-1 pozitive. S-a observat că microgliile se activează la nivelul coarnelor dorsale la 3 zile după SNL (Ton et al., 2013), în timp ce la 3 zile după SNI acestea sunt prezente atât în coarnele ventrale cât și în cordoanele dorsale (Ketz KA et al., 2017). Având în vedere faptul că macrofagele Iba-1 pozitive de la nivelul ganglionilor spinali sensibilizează neuronii, crescându-le excitabilitatea și frecvența de transmitere a impulsurilor, ne propunem să investigăm ulterior dacă la nivelul măduvei spinării, prelungirile neuronilor din ganglionii spinali care prezintă inele peri-neuronale vor avea în proximitatea lor un număr mai mare de microglii activate.
Bibliografie
Abram, S. E., Yi, J., Fuchs, A., & Hogan, Q. H. (2006). Permeability of injured and intact peripheral nerves and dorsal root ganglia. Anesthesiology, 105(1), 146–153.
Asato, F., Butler, M., Blomberg, H., & Gordh, T. (2000). Variation in rat sciatic nerve anatomy: Implications for a rat model of neuropathic pain. Journal of the Peripheral Nervous System,
Attal, N., & Bouhassira, D. (2015, April 1). Pharmacotherapy of neuropathic pain: Which drugs, which treatment algorithms? Pain. Lippincott Williams and Wilkins.
Attal, N., Lanteri-Minet, M., Laurent, B., Fermanian, J., & Bouhassira, D. (2011). The specific disease burden of neuropathic pain: Results of a French nationwide survey. Pain, 152(12),
Auffray, C., Fogg, D., Garfa, M., Elain, G., Join-Lambert, O., Kayal, S., … Geissmann, F. (2007). Monitoring of blood vessels and tissues by a population of monocytes with patrolling behavior. Science, 317(5838), 666–670.
Bravo-Caparrós, I., Ruiz-Cantero, M. C., Perazzoli, G., Cronin, S. J. F., Vela, J. M., Hamed, M. F., … Nieto, F. R. (2020). Sigma-1 receptors control neuropathic pain and macrophage infiltration into the dorsal root ganglion after peripheral nerve injury. FASEB Journal, 34(4), 5951–5966.
Campana, W. M. (2007, July). Schwann cells: Activated peripheral glia and their role in neuropathic pain. Brain, Behavior, and Immunity.
Charo, I. F., & Ransohoff, R. M. (2006, February 9). Mechanisms of disease: The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation. New England Journal of Medicine.
Cherkas, P. S., Huang, T. Y., Pannicke, T., Tal, M., Reichenbach, A., & Hanani, M. (2004). The effects of axotomy on neurons and satellite glial cells in mouse trigeminal ganglion. Pain, 110(1–2), 290–298.
Chung, J. M., Kim, H. K., & Chung, K. (2004). Segmental spinal nerve ligation model of neuropathic pain. Methods in Molecular Medicine, 99(February 2016), 35–45.
Dansereau, M. A., Gosselin, R. D., Pohl, M., Pommierjt, B., Mechighel, P., Mauborgne, A., … Melik-Parsadaniantzt, S. (2008). Spinal CCL2 pronociceptive action is no longer effective in CCR2 receptor antagonist-treated rats. Journal of Neurochemistry, 106(2), 757–769.
Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., & Taylor, P. R. (2013). Tissue-resident macrophages. Nature Immunology.
Decosterd, I., & Woolf, C. J. (2000). Spared nerve injury: An animal model of persistent peripheral neuropathic pain. Pain, 87(2), 149–158.
Delmas, P., Hao, J., & Rodat-Despoix, L. (2011, March). Molecular mechanisms of mechanotransduction in mammalian sensory neurons. Nature Reviews Neuroscience.
Devor, M. (1999). Unexplained peculiarities of the dorsal root ganglion. Pain, 82(SUPPL.1).
Dowdall, T., Robinson, I., & Meert, T. F. (2005). Comparison of five different rat models of peripheral nerve injury. Pharmacology Biochemistry and Behavior, 80(1), 93–108.
Dubový, P. (2011). Wallerian degeneration and peripheral nerve conditions for both axonal regeneration and neuropathic pain induction. Annals of Anatomy, 193(4), 267–275.
Erlanger, J., & Gasser, H. S. (1930). THE ACTION POTENTIAL IN FIBERS OF SLOW CONDUCTION IN SPINAL ROOTS AND SOMATIC NERVES. American Journal of Physiology-Legacy Content, 92(1), 43–82.
Fischer, G., Kostic, S., Nakai, H., Park, F., Sapunar, D., Yu, H., & Hogan, Q. (2011). Direct injection into the dorsal root ganglion: Technical, behavioral, and histological observations. Journal of Neuroscience Methods, 199(1), 43–55.
Flonta M.L., Marcu-Lapadat M., Ristoiu V., 2007. Anatomia sistemului nervos. În: Noțiuni de anatomie și fiziologie, Editura Universității din București, 204-209, 17-18.
Gehrmann, J., Monaco, S., & Kreutzberg, G. W. (1991). Spinal cord microglial cells and DRG satellite cells rapidly respond to transection of the rat sciatic nerve. Restorative Neurology and Neuroscience, 2(4), 181–198.
Geuna, S. (2015, March 1). The sciatic nerve injury model in pre-clinical research. Journal of Neuroscience Methods. Elsevier.
Gheorghe, R.O., 2019, Rolul receptorului TRPV1 și al macrofagelor endogene din ganglionii spinali în producerea durerii neuropatice, teză de doctorat.
Gheorghe, R. O., Deftu, A., Filippi, A., Grosu, A., Bica-Popi, M., Chiritoiu, M., … Ristoiu, V. (2020). Silencing the Cytoskeleton Protein Iba1 (Ionized Calcium Binding Adapter Protein 1) Interferes with BV2 Microglia Functioning. Cellular and Molecular Neurobiology.
Gold, M. S., & Gebhart, G. F. (2010, November). Nociceptor sensitization in pain pathogenesis. Nature Medicine. NIH Public Access.
Gordon, S., & Taylor, P. R. (2005, December). Monocyte and macrophage heterogeneity. Nature Reviews Immunology.
Gosselin, R.-D., Suter, M. R., Ji, R.-R., & Decosterd, I. (2010). Glial Cells and Chronic Pain. The Neuroscientist, 16(5), 519–531.
Grace, P. M., Hutchinson, M. R., Maier, S. F., & Watkins, L. R. (2014). Pathological pain and the neuroimmune interface. Nature Reviews Immunology. Nature Publishing Group.
Gu, X. L., & Yu, L. C. (2007). The colocalization of CGRP receptor and AMPA receptor in the spinal dorsal horn neuron of rat: A morphological and electrophysiological study. Neuroscience Letters, 414(3), 237–241.
Han, P. J., Shukla, S., Subramanian, P. S., & Hoffman, P. N. (2004). Cyclic AMP elevates tubulin expression without increasing intrinsic axon growth capacity. Experimental Neurology, 189(2), 293–302.
Hanani, M. (2005, June). Satellite glial cells in sensory ganglia: From form to function. Brain Research Reviews.
Hanani, M., Huang, T. Y., Cherkas, P. S., Ledda, M., & Pannese, E. (2002). Glial cell plasticity in sensory ganglia induced by nerve damage. Neuroscience, 114(2), 279–283.
https://www.spine-health.com/conditions/spine-anatomy/sciatic-nerve-anatomy
https://ghr.nlm.nih.gov/gene/NEFH
Hu, P., & McLachlan, E. M. (2002). Macrophage and lymphocyte invasion of dorsal root ganglia after peripheral nerve lesions in the rat. Neuroscience, 112(1), 23–38.
Hu, P., & McLachlan, E. M. (2003). Distinct functional types of macrophage in dorsal root ganglia and spinal nerves proximal to sciatic and spinal nerve transections in the rat. Experimental Neurology, 184(2), 590–605.
Hu, S. J., & Xing, J. L. (1998). An experimental model for chronic compression of dorsal root ganglion produced by intervertebral foramen stenosis in the rat. Pain, 77(1), 15–23.
Huang, T. Y., & Hanani, M. (2005). Morphological and electrophysiological changes in mouse dorsal root ganglia after partial colonic obstruction. American Journal of Physiology – Gastrointestinal and Liver Physiology, 289(4 52-4).
Jensen, T. S., & Finnerup, N. B. (2014). Allodynia and hyperalgesia in neuropathic pain: Clinical manifestations and mechanisms. The Lancet Neurology. Lancet Publishing Group.
Jung, H., Bhangoo, S., Banisadr, G., Freitag, C., Ren, D., White, F. A., & Miller, R. J. (2009). Visualization of chemokine receptor activation in transgenic mice reveals peripheral activation of CCR2 receptors in states of neuropathic pain. Journal of Neuroscience, 29(25), 8051–8062.
Kawasaki, Y., Zhang, L., Cheng, J. K., & Ji, R. R. (2008). Cytokine mechanisms of central sensitization: Distinct and overlapping role of interleukin-1β, interleukin-6, and tumor necrosis factor-α in regulating synaptic and neuronal activity in the superficial spinal cord. Journal of Neuroscience, 28(20), 5189–5194.
Keller, A. F., Beggs, S., Salter, M. W., & De Koninck, Y. (2007). Transformation of the output of spinal lamina I neurons after nerve injury and microglia stimulation underlying neuropathic pain. Molecular Pain, 3.
Kiguchi, N., Kobayashi, Y., & Kishioka, S. (2012, February). Chemokines and cytokines in neuroinflammation leading to neuropathic pain. Current Opinion in Pharmacology.
Kiguchi, N., Kobayashi, Y., Saika, F., & Kishioka, S. (2013). Epigenetic upregulation of CCL2 and CCL3 via histone modifications in infiltrating macrophages after peripheral nerve injury. Cytokine, 64(3), 666–672.
Kiguchi, N., Kobayashi, Y., Saika, F., Sakaguchi, H., Maeda, T., & Kishioka, S. (2015). Peripheral interleukin-4 ameliorates inflammatory macrophage-dependent neuropathic pain. Pain, 156(4), 684–693.
Kim, S. H., & Chung, J. M. (1992). An experimental model for peripheral neuropathy produced by segmental spinal nerve ligation in the rat. Pain, 50(3), 355–363. Retrieved from
Kobiela Ketz A, Byrnes KR, Grunberg NE, Kasper CE, Osborne L, Pryor B, Tosini NL, Wu X, A. J. (2017). Characterization of Macrophage/Microglial Activation and Effect of Photobiomodulation in the Spared Nerve Injury Model of Neuropathic Pain |
Komori, T., Morikawa, Y., Inada, T., Hisaoka, T., & Senba, E. (2011). Site-specific subtypes of macrophages recruited after peripheral nerve injury. NeuroReport, 22(17), 911–917.
Kwiatkowski, K., Piotrowska, A., Rojewska, E., Makuch, W., & Mika, J. (2017). The RS504393 Influences the Level of Nociceptive Factors and Enhances Opioid Analgesic Potency in Neuropathic Rats. Journal of Neuroimmune Pharmacology, 12(3), 402–419.
Kwon, M. J., Kim, J., Shin, H., Jeong, S. R., Kang, Y. M., Choi, J. Y., … Kim, B. G. (2013). Contribution of macrophages to enhanced regenerative capacity of dorsal root ganglia sensory neurons by conditioning injury. Journal of Neuroscience, 33(38), 15095–15108.
Kwon, M. J., Shin, H. Y., Cui, Y., Kim, H., Le Thi, A. H., Choi, J. Y., … Kim, B. G. (2015). CCL2 mediates neuron-macrophage interactions to drive proregenerative macrophage activation following preconditioning injury. Journal of Neuroscience, 35(48), 15934–15947.
Lawrence, T., & Natoli, G. (2011, November). Transcriptional regulation of macrophage polarization: Enabling diversity with identity. Nature Reviews Immunology.
Lawson, S. N., & Waddell, P. J. (1991). Soma neurofilament immunoreactivity is related to cell size and fibre conduction velocity in rat primary sensory neurons. The Journal of Physiology, 435(1), 41–63.
Ledda, M., Blum, E., De Palo, S., & Hanani, M. (2009). Augmentation in gap junction-mediated cell coupling in dorsal root ganglia following sciatic nerve neuritis in the mouse. Neuroscience, 164(4), 1538–1545.
Lee, K. H., Chung, K., Chung, J. M., & Coggeshall, R. E. (1986). Correlation of cell body size, axon size, and signal conduction velocity for individually labelled dorsal root ganglion cells in the cat. The Journal of Comparative Neurology, 243(3), 335–346.
Leijnse, J. N., & D’Herde, K. (2016). Revisiting the segmental organization of the human spinal cord. Journal of Anatomy, 229(3), 384–393. https://doi.org/10.1111/joa.12493
Liu, T., Van Rooijen, N., & Tracey, D. J. (2000). Depletion of macrophages reduces axonal degeneration and hyperalgesia following nerve injury. Pain, 86(1–2), 25–32.
Lu, X., & Richardson, P. M. (1991). Inflammation near the Nerve Cell Body Enhances Axonal Regeneration. The Journal of Neuroscience (Vol. 1).
Lu, X., & Richardson, P. M. (1993). Responses of macrophages in rat dorsal root ganglia following peripheral nerve injury. Journal of Neurocytology, 22(5), 334–341.
Martinez, F. O., & Gordon, S. (2014). The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: Time for reassessment. F1000Prime Reports, 6.
Maurya, S. K., & Mishra, R. (2017). Pax6 interacts with Iba1 and shows age-associated alterations in brain of aging mice. Journal of Chemical Neuroanatomy, 82, 60–64.
Maurya, S. K., & Mishra, R. (2018). Co-Localization and Interaction of Pax5 with Iba1 in Brain of Mice. Cellular and Molecular Neurobiology, 38(4), 919–927.
Mert, T., Gunay, I., Ocal, I., Guzel, A. I., Inal, T. C., Sencar, L., & Polat, S. (2009). Macrophage depletion delays progression of neuropathic pain in diabetic animals. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology, 379(5), 445–452.
Mosser, D. M., & Edwards, J. P. (2008, December). Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology.
Mueller, M., Leonhard, C., Wacker, K., Ringelstein, E. B., Okabe, M., Hickey, W. F., & Kiefer, R. (2003). Macrophage response to peripheral nerve injury: the quantitative contribution of resident and hematogenous macrophages. Laboratory Investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology, 83(2), 175–185.
Müller, M., Leonhard, C., Krauthausen, M., Wacker, K., & Kiefer, R. (2010). On the longevity of resident endoneurial macrophages in the peripheral nervous system: A study of physiological macrophage turnover in bone marrow chimeric mice. Journal of the Peripheral Nervous System, 15(4), 357–365.
Murray, P. J., & Wynn, T. A. (2011, November). Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology.
Nicol, G. D., Lopshire, J. C., & Pafford, C. M. (1997). Tumor necrosis factor enhances the capsaicin sensitivity of rat sensory neurons. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience, 17(3), 975–982. Retrieved from
Niemi, J. P., DeFrancesco-Lisowitz, A., Cregg, J. M., Howarth, M., & Zigmond, R. E. (2016). Overexpression of the monocyte chemokine CCL2 in dorsal root ganglion neurons causes a conditioning-like increase in neurite outgrowth and does so via a STAT3 dependent mechanism. Experimental Neurology, 275, 25–37.
Niemi, J. P., Defrancesco-Lisowitz, A., Roldan-Hernandez, L., Lindborg, J. A., Mandell, D., & Zigmond, R. E. (2013). A critical role for macrophages near axotomized neuronal cell bodies in stimulating nerve regeneration. Journal of Neuroscience, 33(41), 16236–16248.
Oakley, J. C., & Prager, J. P. (2002). Spinal cord stimulation: Mechanisms of action. In Spine (Vol. 27, pp. 2574–2583).
Obata, K., Tsujino, H., Yamanaka, H., Yi, D., Fukuoka, T., Hashimoto, N., … Noguchi, K. (2002). Expression of neurotrophic factors in the dorsal root ganglion in a rat model of lumbar disc herniation. Pain, 99(1–2), 121–132.
Obreja, O., Rathee, P. K., Lips, K. S., Distler, C., & Kress, M. (2002). IL-1β potentiates heat-activated currents in rat sensory neurons: Involvement of IL-1RI, tyrosine kinase, and protein kinase C. FASEB Journal, 16(12), 1497–1503.
Oh, S. B., Tran, P. B., Gillard, S. E., Hurley, R. W., Hammond, D. L., & Miller, R. J. (2001). Chemokines and glycoprotein 120 produce pain hypersensitivity by directly exciting primary nociceptive neurons. Journal of Neuroscience, 21(14), 5027–5035.
Ohsawa, K., Imai, Y., Sasaki, Y., & Kohsaka, S. (2004). Microglia/macrophage-specific protein Iba1 binds to fimbrin and enhances its actin-bundling activity. Journal of Neurochemistry, 88(4), 844–856.
Poyner, D. R. (1992, January 1). Calcitonin gene-related peptide: Multiple actions, multiple receptors. Pharmacology and Therapeutics. Pergamon.
Puljak, L., Kojundzic, S. L., Hogan, Q. H., & Sapunar, D. (2009). Targeted delivery of pharmacological agents into rat dorsal root ganglion. Journal of Neuroscience Methods, 177(2), 397–402.
Ristoiu, V. (2013). Contribution of macrophages to peripheral neuropathic pain pathogenesis. Life Sciences, 93(23), 870–881.
Ruscheweyh, R., Forsthuber, L., Schoffnegger, D., & Sandkühler, J. (2007). Modification of classical neurochemical markers in identified primary afferent neurons with Aβ-, Aδ-, and C-fibers after chronic constriction injury in mice. The Journal of Comparative Neurology, 502(2), 325–336.
Scholz, J., & Woolf, C. J. (2007a). The neuropathic pain triad: Neurons, immune cells and glia. Nature Neuroscience, 10(11), 1361–1368.
Scholz, J., & Woolf, C. J. (2007b, November). The neuropathic pain triad: Neurons, immune cells and glia. Nature Neuroscience.
Schreiber, R. C., Krivacic, K., Kirby, B., Vaccariello, S. A., Wei, T., Ransohoff, R. M., & Zigmond, R. E. (2001). Monocyte chemoattractant protein (MCP)-1 is rapidly expressed by sympathetic ganglion neurons following axonal injury. NeuroReport, 12(3), 601–606.
Shi, C., & Pamer, E. G. (2011, November). Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nature Reviews Immunology.
Sica, A., & Mantovani, A. (2012, March 1). Macrophage plasticity and polarization: In vivo veritas. Journal of Clinical Investigation.
Sommer, C., Petrausch, S., Lindenlaub, T., & Toyka, K. V. (1999). Neutralizing antibodies to interleukin 1-receptor reduce pain associated behavior in mice with experimental neuropathy. Neuroscience Letters, 270(1), 25–28.
Stoll, G., Griffin, J. W., Li, C. Y., & Trapp, B. D. (1989). Wallerian degeneration in the peripheral nervous system: participation of both Schwann cells and macrophages in myelin degradation. Journal of Neurocytology, 18(5), 671–683.
Takeda, M., Nasu, M., Kanazawa, T., Takahashi, M., & Shimazu, Y. (2018). Chemokine ligand 2/chemokine receptor 2 signaling in the trigeminal ganglia contributes to inflammatory hyperalgesia in rats. Neuroscience Research, 128, 25–32.
Taskinen, H. S., & Röyttä, M. (1997). The dynamics of macrophage recruitment after nerve transection. Acta Neuropathologica, 93(3), 252–259.
Thacker, M. A., Clark, A. K., Bishop, T., Grist, J., Yip, P. K., Moon, L. D. F., … McMahon, S. B. (2009). CCL2 is a key mediator of microglia activation in neuropathic pain states. European Journal of Pain, 13(3), 263–272.
Ton, B. H. T., Chen, Q., Gaina, G., Tucureanu, C., Georgescu, A., Strungaru, C., … Ristoiu, V. (2013). Activation profile of dorsal root ganglia Iba-1 (+) macrophages varies with the type of lesion in rats. Acta Histochemica, 115(8), 840–850.
Twining, C. M., Sloane, E. M., Schoeniger, D. K., Milligan, E. D., Martin, D., Marsh, H., … Watkins, L. R. (2005). Activation of the spinal cord complement cascade might contribute to mechanical allodynia induced by three animal models of spinal sensitization. Journal of Pain, 6(3), 174–183.
Vega-Avelaira, D., Géranton, S. M., & Fitzgerald, M. (2009a). Differential regulation of immune responses and macrophage/neuron interactions in the dorsal root ganglion in young and adult rats following nerve injury. Molecular Pain, 5, 1–17.
Vega-Avelaira, D., Géranton, S. M., & Fitzgerald, M. (2009b). Differential regulation of immune responses and macrophage/neuron interactions in the dorsal root ganglion in young and adult rats following nerve injury. Molecular Pain, 5, 70.
Wagner, R., & Myers, R. R. (1996). Endoneurial injection of TNF-alpha produces neuropathic pain behaviors. Neuroreport, 7(18), 2897–2901.
Wang, H., Wu, M., Zhan, C., Ma, E., Yang, M., Yang, X., & Li, Y. (2012). Neurofilament proteins in axonal regeneration and neurodegenerative diseases. Neural Regeneration Research, 7(8), 620–626.
Wieseler-Frank, J., Maier, S. F., & Watkins, L. R. (2005, March). Immune-to-brain communication dynamically modulates pain: Physiological and pathological consequences. Brain, Behavior, and Immunity.
Wood, J. N., & Anderton, B. H. (1981). Monoclonal antibodies to mammalian neurofilaments. Bioscience Reports, 1(3), 263–268.
Woolf, C. J. (2004). Dissecting out mechanisms responsible for peripheral neuropathic pain: Implications for diagnosis and therapy. In Life Sciences (Vol. 74, pp. 2605–2610).
Woolf, C. J., & Ma, Q. (2007, August 2). Nociceptors-Noxious Stimulus Detectors. Neuron.
Wynn, T. A., & Vannella, K. M. (2016, March 15). Macrophages in Tissue Repair, Regeneration, and Fibrosis. Immunity. Cell Press.
Xu, Y., Gu, Y., Wu, P., Li, G. W., & Huang, L. Y. M. (2003). Efficiencies of transgene expression in nociceptive neurons through different routes of delivery of adeno-associated viral vectors. Human Gene Therapy, 14(9), 897–906.
Yang, Z. F., Ho, D. W., Lau, C. K., Lam, C. T., Lum, C. T., Poon, R. T. P., & Fan, S. T. (2005). Allograft inflammatory factor-1 (AIF-1) is crucial for the survival and pro-inflammatory activity of macrophages. International Immunology, 17(11), 1391–1397.
Yu, X., Liu, H., Hamel, K. A., Morvan, M. G., Yu, S., Leff, J., … Basbaum, A. I. (2020). Dorsal root ganglion macrophages contribute to both the initiation and persistence of neuropathic pain. Nature Communications, 11(1), 1–12.
Zhang, H., Mei, X., Zhang, P., Ma, C., White, F. A., Donnelly, D. F., & Lamotte, R. H. (2009). Altered functional properties of satellite glial cells in compressed spinal ganglia. GLIA, 57(15), 1588–1599.
Zhang, J.-M., Homma, Y., Ackerman, W. E., & Brull, S. J. (2001). Topical Application of Acidic Bupivacaine to the Lumbar Ganglion Induces Mechanical Hyperalgesia in the Rat. Anesthesia & Analgesia, 93(2), 466–471.
Zhang, N., Inan, S., Cowan, A., Sun, R., Wang, J. M., Rogers, T. J., … Oppenheim, J. J. (2005). A proinflammatory chemokine, CCL3, sensitizes the heat- and capsaicin-gated ion channel TRPV1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 102(12), 4536–4541.
Zheng, L. F., Wang, R., Xu, Y. Z., Yi, X. N., Zhang, J. W., & Zeng, Z. C. (2008). Calcitonin gene-related peptide dynamics in rat dorsal root ganglia and spinal cord following different sciatic nerve injuries. Brain Research, 1187(1), 20–32.
Znaor, L., Lovrić, S., Hogan, Q., & Sapunar, D. (2007). Association of neural inflammation with hyperalgesia following spinal nerve ligation. Croatian Medical Journal, 48(1), 35–42.
Copyright Notice
© Licențiada.org respectă drepturile de proprietate intelectuală și așteaptă ca toți utilizatorii să facă același lucru. Dacă consideri că un conținut de pe site încalcă drepturile tale de autor, te rugăm să trimiți o notificare DMCA.
Acest articol: Interacțiuni spațiale între macrofagele Iba-1 () [305945] (ID: 305945)
Dacă considerați că acest conținut vă încalcă drepturile de autor, vă rugăm să depuneți o cerere pe pagina noastră Copyright Takedown.