Interactiuni Intre Substante Care Influenteaza Metabolismul Acidului Arahidonic

TEZĂ DE DOCTORAT

STUDIUL FARMACOLOGIC EXPERIMENTAL AL UNOR INTERACȚIUNI ÎNTRE SUBSTANȚE CARE INFLUENȚEAZĂ METABOLISMUL ACIDULUI ARAHIDONIC ȘI MODULATOARE ALE MEDIAȚIEI ANGIOTENSINICE, LA NIVELUL MUSCULATURII NETEDE

CUPRINS

1. INTRODUCERE

2. STADIUL ACTUAL AL CUNOAȘTERII ÎN DOMENIU

2.1. ANGIOTENSINA

2.1.1. Biosinteză și metabolizare

2.1.2. Angiotensine bioactive

2.1.2.1. Date inițiale

2.1.2.2. Acțiunile biologice ale noilor angiotensine

2.1.2.3. Interacțiuni funcționale între peptidele angiotensinice

2.1.3. Receptori angiotensinici

2.1.3.1. Receptorul AT1

2.1.3.2. Receptorul AT2

2.1.3.3. Receptorul AT4

2.1.3.4. Receptorul pentru angiotensinogen

2.1.4. Transducerea semnalului

2.1.4.1. Receptorul AT1

2.1.4.2. Receptorul AT2

2.1.4.3. Receptorul AT4

2.1.5. Blocanți ai Receptorilor Angiotensinici (BRA)

2.1.6. Implicații funcționale

2.1.7. Aplicații terapeutice

2.1.8. Perspective în inhibiția farmacologică a SRA

2.1.8.1. Inhibitorii vasopeptidazelor

2.2. METABOLISMUL ACIDULUI ARAHIDONIC

2.2.1. Sinteza eicosanoizilor

2.2.2. Efectele prostaglandinelor și tromboxanilor

2.2.3. Efectele lipoxigenazelor și ale produșilor de metabolism ai Citocromului P450

2.2.4. Inhibarea sintezei de eicosanoizi

2.2.4.1. Antiinflamatoare nesteroidiene (AINS)

2.2.4.1.1. Farmacocinetică

2.2.4.1.2. Farmacodinamie

2.2.4.2. Inhibitorii enzimei de conversie ai angiotensinei

2.2.4.2.1. Definiție

2.2.4.2.2. Clasificarea IECA

2.2.4.2.3. Mecanism de acțiune

2.2.4.2.4. Efectele IECA

2.3. IMPORTANȚA PEPTIDELOR ANGIOTENSINICE ÎN REACTIVITATEA MUȘCHIULUI NETED

2.3.1. Efecte ale inhibitorilor de sinteză a COX asupra mușchiului neted visceral și vascular

2.3.2. Interacțiuni la nivelul musculaturii netede viscerale și vasculare dintre inhibitorii ECA, blocanții de receptori AT1 și blocanții de sinteză a COX

3. CONTRIBUȚII PERSONALE

3.1. INVESTIGAREA REACTIVITĂȚII MUSCULATURII NETEDE – NOȚIUNI TEHNICE

3.1.1. Material biologic

3.1.1.1. Artere de conductanță

3.1.1.2. Experimente pe esofag de șobolan

3.1.1.3. Experimente pe ileon de șobolan

3.1.2. Tehnica de lucru folosind stimularea în câmp electric (SCE)

3.1.3. Tehnica de lucru folosind sistemul de organ izolat cu traductori izometrici

3.1.4. Montarea și tensionarea preparatului

3.1.5. Soluția salină, administrarea și îndepărtarea substanțelor

3.1.6. Echilibrarea și testarea preparatului

3.1.7. Protocol de lucru și aparatură pentru miograful izometric vertical

3.1.8. Model experimental de stabilire a indicelui de forță

3.1.9. Substanțe farmacologic active folosite pentru aprecierea contractilității:

3.1.10. Animale de experiență utilizate

3.1.11. Respectarea normelor de bioetică și deontologie a cercetării

3.2. CARACTERISTICI SPECIFICE ALE MUSCULATURII NETEDE

3.2.1. Musculatura netedă vasculară

3.2.1.1. Efectul stimulării farmacologice asupra musculaturii netede vasculare

3.2.1.2. Efectul angiotensinei II administrate izolat asupra mușchi neted vascular

3.2.1.3. Efectul blocanților enzimei de conversie și a blocanților de receptori AT1 asupra diverselor tipuri de mușchi neted vascular

3.2.1.4. Efectul AINS administrat izolat asupra diverselor tipuri de mușchi neted vascular

3.2.1.5. Efectul SCE asupra mușchiului neted vascular de arteră renală

3.2.1.6. Efectele AINS asupra contractilității vasculare angiotensinergice

3.2.1.7. Efectul AINS asupra contractilității adrenergice a mușchiului neted vascular

3.2.1.8. Efectul angiotensinei II asupra preparatelor vasculare stimulate cu SCE

3.2.1.9. Efectul blocanților enzimei de conversie și inhibitorilor de receptor AT1 asupra preparatelor vasculare stimulate cu SCE

3.2.1.10. Efectul AINS asupra preparatelor vasculare stimulate cu SCE

3.2.1.11. Efectele diverselor combinații AINS și angiotensină asupra preparatelor vasculare stimulate cu SCE

3.2.1.12. Efectele modulatoare diferite ale ionilor de amoniu asupra acțiunilor vasculare ale angiotensinei pe aortă și artere renale izolate de șobolan

3.2.1.13. Interacțiunile vasculare dintre aldosteron, ang II și antioxidanți

3.2.1.13.1. Influența aldosteronului asupra efectelor vasculare ale ang II

3.2.1.13.2. Modularea efectelor combinate ale aldosteronului și ang II de către amifostină, N-acetilcisteină și L-NAME

3.2.2. Musculatura netedă digestivă

3.2.2.1. Evaluarea reactivității musculaturii netede esofagiene

3.2.2.1.1. Evaluarea motilității colinergice și adrenergice a preparatului de esofag

3.2.2.1.2. Efectele mediației angiotensinergice asupra motilității esofagiene

3.2.2.1.3. Efectele AINS asupra motilității esofagiene

3.2.2.1.4. Efectul interacțiunii între AINS și Ang II la nivelul musculaturii netede esofagiene

3.2.2.2. Evaluarea contractilității musculaturii ileo-jejunale pe preparat circular și longitudinal

3.2.2.2.1. Stimularea colinergică

3.2.2.2.2. Stimulare în câmp electric

3.2.2.2.3. Efectul administrării de ang II asupra preparatelor de intestin subțire

3.2.2.2.4. Efectul coadministrării de ang II și AINS la nivelul musculaturii netede ileale

3.2.2.2.5. Efectul ang II asupra contractilității musculare netede în condițiile inhibiției adrenergice și colinergice

3.2.2.2.6. Efectele IECA și BRA asupra contracției colinergice

3.2.2.2.7. Efectele AINS asupra contracției colinergice

3.2.2.2.8. Investigarea interacțiunii angiotensină, AINS, BRA și IECA asupra SCE.

3.2.3. Musculatura netedă traheo-bronșică

3.2.3.1. Influența ang II asupra contractilității traheo-bronșice.

3.2.3.2. Efectul AINS asupra reactivității musculaturii netede traheo-bronșice.

3.2.3.3. Efectele administrării concomitente de ang II și AINS asupra musculaturii netede traheo bronșice

3.3. DISCUȚII

3.4. CONCLUZII SUMATIVE DETALIATE

CONCLUZII FINALE ALE STUDIULUI CU TITLUL “STUDIUL FARMACOLOGIC EXPERIMENTAL AL UNOR INTERACȚIUNI ÎNTRE SUBSTANȚE CARE INFLUENȚEAZĂ METABOLISMUL ACIDULUI ARAHIDONIC ȘI MODULATOARE ALE MEDIAȚIEI ANGIOTENSINICE, LA NIVELUL MUSCULATURII NETEDE”

4. BIBLIOGRAFIE

Abrevieri

BRA – blocanți ai receptorilor angiotensinici

AINS – antiinflamatoare nesteroidiene

SCE – stimulare în câmp electric

ECA – enzima de conversie a angiotensinei

IECA – inhibitori ai enzimei de conversie a angiotensinei

SRA – sistemul renină-angiotensină

AMP – aminopeptidaza

NEP – endopeptidaza neutră

PEP – prolil endopeptidaza

SHR – hipertensiune spontană

IRAP – aminopeptidaza membranară reglatoare de insulină

AMP-D – dipeptidil-aminopeptidaza

Ang – angiotensina

DAG – diacilglicerol

IP3 – 1,4,5-inozitoltrifosfat

PTK – fosfotirozin kinaza

NADPH – nicotinamida-dinucleotid fosfat redusă

NANC – nonadrenergic noncolinergic

MAP – proteina activatoare a mitogenezei

NF-κB – factorul nuclear kappa-B

NO – oxid nitric

SRO – specii reactive de oxigen

PKC – proteinkinaza C

PTK – fosfotirozin kinaza

COX – ciclooxigenaza

PG – prostaglandine

PCR – proteina C reactive

IMA – infarct miocardic acut

MCP-1 – chemoatractant monocitic

MMP – matrix metaloproteinază

AA – acid arahidonic

Tx – tromboxan

PL – fosfolipaza

1. INTRODUCERE

Pe măsură ce vârsta medie a pacienților cu tulburări cardio-vasculare crește, depășind foarte frecvent 60 ani, co-administrarea terapiei anti-hipertensive (-blocante, inhibitoare ECA, BRA, diuretice, etc.) cu AINS este din ce în ce mai frecventă în practica medico-farmaceutică de zi cu zi. Din ce în ce mai frecvent se raportează creșteri de presiune arterială datorată AINS, ceea ce crește riscurile de AVC, infarcte miocardice și alte complicații cardiovasculare. De aceea, investigațiile, atât clinice cât și de cercetare fundamentală ale interacțiunilor între aceste substanțe la nivelul musculaturii netede, mai ales vasculare, dar și din alte localizări, sunt din ce în ce mai frecvente și mai bine sistematizate .

Se estimează că ne-luarea în calcul a modificărilor minore de presiune sistolică la pacienții cu osteoartrite ce primesc tratament cu AINS a dus la cel puțin 30.000 de morți determinate de infarct miocardic și alte 2.000 de morți prin boala coronariană, doar la nivelul Statelor Unite .

Există dovezi clare în literatură că stimularea receptorilor AT1 de către angiotensina II are efecte nete proinflamatorii, cu sau fără implicarea variațiilor de presiune arterială. O serie de experimente clinice și paraclinice au demonstrat că blocarea sistemului renină-angiotensină, fie cu inhibitori ai enzimei de conversie (IECA), fie cu blocanți ai receptorilor angiotensinici (BRA) reduce răspunsul inflamator la nivel vascular. Dar, în ciuda investigațiilor intense, mecanismele inflamației vasculare induse de Ang II sunt încă necunoscute. Pe de altă parte, interacțiunea între ang II și rezultatele metabolismului vascular al ciclooxigenazelor la nivelul mușchiului neted sunt mai puțin studiate. Având în vedere multitudinea de instanțe în care medicația pacienților cuprinde atât inhibitori ai enzimei de conversie a angiotensinei (IECA), precum captopril, enalapril, lisinopril și alții sau blocanți ai receptorilor pentru angiotensină (BRA), precum losartan, candesartan, irbesartan și alții, folosiți în tratamentul cronic al hipertensiunii arteriale, în combinație cu diverși agenți care inhibă metabolismul acidului arahidonic precum acidul acetilsalicilic și nenumărate antiinflamatoare nesteroidiene (AINS), folosite ca antalgice și antiiflamatoare, un grad mai mic sau mai mare de interacțiune al acestora la nivelul țesuturilor și celulelor organismului era de așteptat. Având la dispoziție instrumentația tehnologică pentru studierea contractilității și responsivității farmacologice a musculaturii netede, sistemul organului izolat, s-a decis continuarea unor studii nesistematizate, necesitând sistematizarea sub forma acestui proiect de teză de doctorat. Proiectul tezei mele de doctorat se înscrie în această arie majoră de preocupări actuale din domeniul biologiei musculaturii netede viscerale și vasculare.

2. STADIUL ACTUAL AL CUNOAȘTERII ÎN DOMENIU

Sistemul renină-angiotensină (SRA) este unul dintre cele mai importante sisteme hormonale generale și locale ale organismului. Pe scurt, angiotensinogenul circulant (2-proteină plasmatică, sintetizată în principal în ficat), sub acțiunea reninei, o aspartilprotează acidă, în greutate de 40 kDa, de origine mezangială renală (circulantă) și extrarenală (de stocaj sau tisulară) este transformat în angiotensină I . Angiotensina I (1-10) este un nonapeptid, care nu este activ per se, ci numai ca precursor al altor fragmente. Această peptidă este supusă acțiunii unor enzime denumite generic ENZIME DE CONVERSIE.

ECA1 este o dipeptidilcarboxipeptidaza cu localizare predominant membranară prezentă în numeroase țesuturi și organe (plămâni, vase, cord, rinichi, creier, ficat, etc.).

Ang II (1-8) este principalul peptid bioactiv, formată din ang I de ECA (80% în plămâni) și chimaza cardiacă.

Acțiunile se realizează prin intermediul receptorilor membranari de tip AT1 și AT2. Receptori specifici sunt AT1 (blocați de losartan, candesartan), AT2 (blocați de PD123319), AT1-7 (blocați de A779), AT4 (blocați de divalinal-ang IV).

Implicațiile fiziologice ale sistemului renină angiotensină sunt:

autoreglarea circulației

reglarea dipsogenezei și balanței hidroelectrolitice

modelarea și remodelarea cardiovasculară

Sistemul renină-angiotensină este de asemenea implicat în nenumărate fenomene fiziopatologice precum patogeneza bolilor cardiovasculare, HTA, bolilor renale, disgravidie, etc. și are de asemeni o multitudine de implicații farmacoterapeutice – utilizarea inhibitorilor ECA și blocanților de receptori AT1 în HTA și insuficiența cardiacă congestivă, noi posibilități terapeutice în insuficiența cardiacă și hipertensiunea arterială cu inhibitori de angiotensinaze nespecifice.

Estimările în ceea ce privește morbiditatea hipertensivă și cardiovasculară ridică numărul potențial de pacienți la nivel mondial la aproximativ 1 miliard de persoane, din care cca 15% vor muri anual.

SRA și efectele sale de tip eliberator de aldosteron stimulează vasoconstricția coronară, mai ales la nivelul cordului deja ischemic, în vreme ce riscul de insuficiență cardiacă este crescut .

Aceste cifre justifică interesul în ceea ce privește fiziopatologia SRA, mai ales că există și alte dovezi care consideră SRA ca fiind unul dintre principalii vinovați și în alte grupuri fiziopatologice.

Este deja binecunoscut faptul că angiotensina II este unul dintre mediatorii esențiali ai inflamației atât la nivel vascular cât și al sistemului imun.

Există din ce în ce mai multe dovezi că SRA și boala Alzheimer sunt mai puternic asociate decât se credea înainte. Se pare că o anumită alelă a genei Enzimei de Conversie a Angiotensinei (ECA-D) este asociată cu deficiența cognitivă severă .

Tratamentul cronic cu blocanți de ECA pare să scadă puternic prevalența atacului cerebral , în timp ce creșteri ale activității ECA în cortex, ariile hipocampice, parahipocampale și nucleii caudați au fost găsite la pacienții cu Alzheimer .

Enumerarea implicărilor fiziopatologice ale SRA poate fi subiectul unei lucrări separate și depășește scopul prezentei lucrări.

2.1. Angiotensina

În urma cu trei decade a devenit clar că peptidele angiotensinice bioactive pot fi generate nu numai în circulația sistemică ci și ca hormoni locali în câteva țesuturi și organe. Clasic, sistemul renină angiotensină a fost considerat un sistem hormonal circulant în care produsul final și bioactiv, Ang II, este produs cu participarea a două enzime importante, renina și enzima de conversie a angiotensinei . Sistemul renină angiotensină este un sistem hormonal complex cu proprietăți paracrine, autocrine și intracrine.

Astăzi sunt cunoscute mai multe tipuri de angiotensină:

angiotensina I (Ang I) – este considerată un prohormon, este inactivă din punct de vedere biologic;

angiotensina II (Ang II) – octapeptid considerat o lungă perioadă de timp singurul principiu biologic activ al sistemului renină angiotensină (SRA);

angiotensina III (Ang III) – metabolit activ al Ang II;

angiotensina IV (Ang IV) – se formează doar la nivelul encefalului;

angiotensina (1-7) – fragment heptapeptidic al Ang II, a fost descoperit a fi activ biologic în 1988.

2.1.1. Biosinteză și metabolizare

Angiotensinele se formează prin acțiunea reninei asupra substratului său specific, angiotensinogenul, printr-o cascadă de reacții enzimatice (Figura 1).

Renina, carboxipeptidază glicozilată secretată de celulele juxtaglomerulare renale, acționează asupra angiotensinogenului (complex macromolecular proteic eliberat de hepatocite) și formează Ang I (decapeptid aparent inactiv). Ang I este transformată într-un principiu biologic activ, Ang II (8 aminoacizi) prin acțiunea unei glicoproteine eliberate de către țesutul pulmonar, enzima de conversie a angiotensinei (ECA). Recent, o enzimă de conversie a angiotensinei homoloagă numită ECA2 a fost descoperită în cord, rinichi, ficat, intestin. Această nouă enzimă de conversie determină hidroliza ultimului aminoacid al Ang I conducând la Ang (1-9), un inhibitor clasic al ECA1 și un precursor al Ang (1-7). Ang (1-9) poate să limiteze formarea și acțiunile Ang II, contribuind la autoreglarea circulației locale .

De asemenea, Ang II poate fi generată din Ang I prin acțiunea unui număr mare de peptidaze (numite chimaze), care sunt capabile să cliveze restul Phe8-His9 al decapeptidului (cale alternativă de formare a Ang II) .

Ang II este degradată în câteva secunde de diferite peptidaze, numite angiotensinaze, la nivelul diferitelor legături aminoacidice. În urma acestor reacții se formează des-Aspartil-Ang II (Ang III), Ang(1-7) și Ang(3-8) (Ang IV). Ang I are o concentrație dublă față de Ang II. Celelalte peptide angiotensinice se găsesc în concentrație mult inferioară și față de Ang II.

În circulația pulmonară 70% din Ang I este convertită în Ang II, 66% din Ang II este metabolizată în timpul unui singur pasaj prin circulația renală. La nivelul rinichiului, 22% din Ang I este transformată în Ang II, proporție care nu se modifică dacă se reduce fluxul sangvin renal .

Figura 1 Căile de formare și metabolizare ale Ang (1-7)

Rinichiul este recunoscut ca fiind calea cu ponderea cea mai mare în eliminarea angiotensinelor. Ficatul reprezintă un alt organ implicat în metabolizarea și eliminarea acestor peptide.

2.1.2. Angiotensine bioactive

Există dovezi copleșitoare care demonstrează că Sistemul Renină-Angiotensină (SRA) generează o serie de angiotensine bioactive cu o activitate biologică foarte variată. Ca și component principal a SRA circulant si tisular, Ang II poate fi convertită în alte fragmente peptidice, ce au proprietăți variabile. În vreme ce Ang II acționează prin intermediul receptorilor AT 1 și AT 2, producând vasoconstricție, retenție renală de apă și sare, stres oxidativ și acțiuni proinflamatorii unele dintre noile peptide angiotensinice pot produce acțiuni opuse și pot avea proprietăți de contra reglare, limitând efectele vasculare și de alte tipuri ale Ang II.

Prezentul capitol are scopul de a trece în revista principalele căi alternative ale sintezei de noi peptide angiotensinice, împreună cu descrierea proprietăților lor fizio-farmacologice.

2.1.2.1. Date inițiale

În mod clasic, SRA a fost considerat un hormon circulant ce are ca produs final Ang II (1-8), care este produs cu ajutorul a două enzime critice, renina, secretată de celulele juxtaglomerulare ale nefronului, și enzima de conversie a angiotensinei, de origine endotelială (ECA). S-a demonstrat deja că concentrația renală de renină este mai mare în rinichi decât în vase si că cel puțin 40 % din cantitatea totală de Ang II se produce pe căi ce nu implică ECA . Capacitatea rinichiului de a genera mari cantități de renină și Ang II asigură reglarea locală a hemodinamicii renale a echilibrului sodiului și a reabsorbției tubulare a apei.

O serie de achiziții cognitive interesante au fost obținute în ceea ce privește renina circulantă de origine renală și alte enzime clasice de tipul reninei. Pe lângă renina circulantă care este o aspartat-protează acidă mai există încă cel puțin două alte categorii de enzime renin-like tisulare. Prima categorie este reprezentată de catepsinele tisulare (D,E,G), care realizează clivarea augiotensinogenului (1-14) la Ang I (1-10) ca precursor comun al angiotensinelor bioactive. Cea de a doua categorie de enzime renin-like tisulare este reprezentată de tonină, care este o serin protează citosolică ce permite sinteza directă a Ang II din angiotensinogen .

Pe de altă parte, s-a stabilit cu certitudine că Ang I este hidrolizată de – ECA, care clivează dipeptidul histidil – leucina al decapeptidului inactiv producând Ang II ca hormon initial și multifuncțional al SRA.

Pe lângă ECA, ce este o dipeptidil – carboxilază cu activitate nespecifică, în cord, rinichi ficat și intestin s-a descoperit o nouă enzimă omologă de conversie a angiotensinei numită ECA 2 . Ca și carboxipeptidază, această nouă enzimă de conversie induce hidroliza ultimului aminoacid de pe Ang I (1-10), producând inițial Ang (1-9) ca precursor și apoi principalul vasodilatator al SRA heptapeptidul Ang 1-7. În vreme ce ECA îndepărtează doi aminoacizi pentru a realiza producerea de Ang II ECA 2, prin îndepărtarea unui singur aminoacid favorizează degradarea în 2 etape a Ang I pentru producerea de Ang (1-7). Deoarece nu este influențată de inhibitorii clasici de ECA, ECA 2 poate acționa ca reglator tisular negativ – pentru SRA activat cu ajutorul vasodilatației mediate prin Ang (1-7) . Inhibiția ECA 2 pe cale farmacologică sau prin deletie genetică înrăutățește patologia cardiacă sau renală . ECA fiind de asemeni cunoscută ca și kininaza II efectele benefice ale inhibitorilor săi sunt atribuite în parte și acumulării de bradikinină .

Spectrul noilor peptide din interiorul SRA – continuă să se extindă demonstrând că mai multe peptidaze precum amino-, endo- și carboxipeptidazele contribuie la generarea mai multor angiotensine derivate active. În vreme ce aminopeptidazele A (AMP-A) și B (AMP-B) îndepărtează succesiv primul și al doilea aminoacid al Ang II pentru a forma Ang III (2-8) și Ang IV (3-8) endopeptidazele folosesc ca substrat Ang I pentru endopeptidaza neutră (NEP, neprilysin) sau Ang II pentru prolil – endopeptidază (PEP) pentru a forma Ang (1-7). Aminopeptidazele tisulare, carboxipeptidazele și alte enzime proteolitice (pepsina, chimotripsina, tripsina) pot, de asemenea, contribui ca și peptidaze la degradarea în continuare a angiotensinelor bioactive către fragmente inactive.

Recent, o nouă peptidă angiotensinică ce conține cu doi aminoacizi mai mult decât Ang I a fost izolată și identificată prin HPLC . Această nouă peptidă a fost denumită pro-angiotensina 12 (Ang 1-12), este mai mare decât peptidul intermediar Ang I și produce răspunsuri presoare atât pe preparatele de aortă izolată de șobolan cât și pe presiunea sanguină determinată pe sobolani Wistar intacți, efecte abrogate fie de un IECA, fie de un blocant de receptori AT 1. Până acum câtiva ani, Ang (1-12) a fost identificată prin radio – imuno – detecție în mai multe țesuturi și organe la șobolan mai ales în inimă și rinichi dar și în splină, ficat, intestin subțire, plămân, suprarenale și creier. Localizarea imunohistochimică a proangiotensinei în inimile de șobolan a demonstrat nivele semnificativ mai mari la animalele SHR (cu hipertensiune spontană) comparativ cu șobolanii Wistar – Kyoto (WKY) .

Aceste date recente oferă noi dovezi în sprijinul teoriei că Ang (1-12) este un nou membru al familiei SRA, ce participă ca și precursor în formarea locală de peptide angiotensinice active biologic. Conform acestor rezultate, participarea ang (1-12) ca precursor a Ang II și Ang (1-7) este prezentată schematic în Figura 2.

Ca primul descoperit și cel mai activ hormon multifuncțional al SRA, angiotensina II (1-8) a fost studiată intensiv în diverse țesuturi și organe. Pe lângă multiplele și binecunoscutele sale efecte normale și patologice, Ang II este si un precursor pentru fragmentele sale active precum Ang (1-7), Ang lll (2-8), Ang IV (3-8) si Ang V (3-7). Multe studii biochimice și fiziologice arată că o serie dintre aceste căi alternative modulează presiunea sângelui, activitatea cardiacă si alte funcții complementare. În spatele și în urma Ang II aceste peptide participă la activele si funcțiile pleiotrope ale SRA, interesul pentru efectele fizio farmacologice si implicațiile fiziopatologice ale acestui sistem altern al SRA este în creștere în ultimii ani.

Figura 2 – Căi biochimice de formare a Ang (1-7)

2.1.2.2. Acțiunile biologice ale noilor angiotensine

Angiotensina (1-12) a fost identificată și purificată recent ca fiind un peptid presor derivat din SRA cu posibilul rol de precursor non – tradițional pentru Ang II. Din punct de vedere chimic,Ang (1-12) este un dodecapeptid endogen ce prezintă aceeași secvență de aminoacizi ca Ang I si Ang II. (Figura 3).

Figura 3 – Structura comparativă a proangiotensinei 12 și principalele angiotensine

Determinările radio imunologice au demonstrat că Ang (1-12) este ubiquitară pe lângă Ang I și Ang II în diversele organe și țesuturi. Distribuția tisulară și concentrațiile din diverse organe sunt destul de mari dar diferite față de cele ale angiotensinelor tradiționale. Spre deosebire de nivelele tisulare, concentrația plasmatică de Ang (1-12) este mai redusă.

Studiile farmacologice au demonstrat că Ang (1-12) are efecte vasoconstrictoare atât în vitro cât și în vivo. Aceste efecte sunt abolite atât de captopril, cât și de blocanții de receptori AT 1.

Deși enzimele care transformă angiotensinogenul în Ang 1-12) rămân incă de identificat, clivarea promptă a acestei noi peptide pentru a produce Ang II sprijină ipoteza unui rol semnificativ ca moleculă bioactiva a SRA. În opinia noastră, una din catepsinele tisulare ar putea participa la scindarea tetradecapeptidului la Ang (1-12). Trask și col. (2008) au demonstrat că Ang (1-12) este un substrat pentru sinteza de peptide angiotensinice în cord. În concordantă cu aceste rezultate, Jessup și col. (2008) au localizat acest nou peptid angiotensinic în miocitele ventriculare și în celulele tubulare renale, cu diferențe semnificative între șobolanii normali și cei cu hipertensiune spontană. În plus, Chappell și col. au demonstrat că serul participă la sinteza de Ang II doar prin ECA, în vreme ce neprilysina renală convertește Ang (1-12) la Ang (1-7). Amândouă aceste căi sunt independente de renină și oferă substrate alterne pentru producerea de peptide angiotesinice.

Luate împreună, aceste date experimentale oferă dovezi suficiente și solide pentru ipoteza că Ang (1-12) este un precursor alternativ pentru formarea de angiotensine biologic active în mai multe țesuturi, inclusiv inima, rinichiul, ficatul pancreasul, intestinul subțire, creierul, etc.

Angiotensina (1-7) a fost identificată de către Ferrario și Iyer (1998) ca un nou hormon angiotensinic înzestrat cu proprietăți vasodilatatoare, diuretice și antihipertensive față de Ang II (1-8). Biosinteza Ang (1-7) se realizează prin liza enzimatică atât a Ang I cât și a Ang II cu participarea ECA 2 și a altor endopeptidaze specifice, prezentate în Figura 2. În vreme ce Ang II este transformată direct în Ang (1-7), Ang I este clivată întâi în Ang (1-9) ca produs intermediar și apoi în heptapeptidul Ang (1-7). Eficiența catalitică a ECA 2 este de 400 de ori mai mare cu ang II ca substrat decât ECA . A treia alternativă este reprezentată de Ang (1 – 12), prezentată mai sus.

Spre deosebire de Ang II heptapeptidul iși exercită acțiunea fiziologică și farmacologică printr-un receptor specific numit Mas .

Detectat inițial ca un receptor cuplat cu proteine G orfan, Mas a fost găsit în diverse tipuri de celule (cord, muschi, vase, rinichi, creier, testicul etc) ca fiind un sit specific de legare pentru Ang (1-7). Deleția genetică a receptorului Mas produce disfuncții cardiace și abolește efectele renale ale Ang (1-7). Inhibiția specifică a acestui receptor cu analogul său structural D-Ala7-Ang (1-7) suprimă răspunsul relaxant și acțiunile diuretice ale Ang (1-7). Aceste rezultate indică faptul că interacțiunea dintre Ang (1-7) și receptorul său specific Mas sunt o etapă importantă pentru acest peptid. Alte cercetări au relevat că Ang (1-7), prin acțiunea sa pe receptorul cuplat cu proteina G, stimulează sintaza endotelială a monoxidului de azot și producerea de NO .

Un raport recent sugerează existența unui alt subtip de receptor pentru Ang (1-7) la nivelul aortei de șobolan, care ar putea interfera cu receptorul AT 1 .

Oricum, concluzia este că angiotensina (1-7), indiferent că este produsă din Ang (1-12) sau din Ang (1-9), prin realizarea unei axe ECA-Ang (1-7) – receptor Mas, poate modula disfuncțiile induse de Ang II.

Sistemul cardiovascular reprezintă o localizare importantă pentru sinteza si actiunile Ang (1-7) prin intermediul receptorului Mas și cu implicarea NO, a bradikininei, prostanoizilor și a factorilor hiperpolarizanți la fel ca și a inhibiției ECA. În interiorul cordului, receptorul Mas este o țintă pentru vasodilatația coronariană și pentru acțiunea stimulatoare asupra mușchiului cardiac. Concentrația sa este mai mare în infarctul miocardic și în insuficiența cardiacă ca mecanism compensator local . Cercetările ce privesc activarea sau inhibiția axei Ang (1-7) – Mas deschid noi perspective cognitive și aplicative în patogeneza și terapia insuficienței cardiace cronice, a bolilor coronariene și a aritmiilor. Câteva studii au arătat că angiotensina (1–7) are efecte protectoare asupra deficiențelor funcționale cardiace induse de ischemie și că blochează producția de superoxid stimulată de către angiotensina II .

Angiotensina (1–7) activează pompa de sodiu, hiperpolarizează cardiomiocitele și restabilește conducerea impulsului în timpul reperfuziei ischemice .

Infuzia sa atenuează disfuncția ventriculară și reduce creșterea cardiomiocitelor prin Mas. Deoarece angiotensina (1–7) este crescută după inhibiția ECA sau după blocarea receptorilor AT1, ar putea contribui la efectele lor benefice asupra remodelării ventriculare după infarctul miocardic .

Având proprietăți cardioprotectoare, angiotensina (1–7) contracarează efectele cardiovasculare ale angiotensinei II. Luate împreună, aceste studii indică faptul că angiotensina (1–7) exercită efecte pozitive asupra funcțiilor cardiace atât normale cât și alterate. Periferic, angiotensina (1–7) reprezintă un important factor vasodilatator care menține constante efectele presoare și trofice ale angiotensinei II .

Participarea angiotensinei (1–7) în compensarea proprietăților cardiovasculare ale angiotensinei II este sprijinită și de creșterea doză-dependentă a presiunii arteriale după blocarea cu antagonistul receptor-selectiv D-Ala 7–Ang (1-7) sau cu anticorpi specifici .

Efectele vasculare ale angiotensinei (1–7) sunt dependente de edoteliu și independente de receptorii AT1 și AT2. Inhibiția ECA crește răspunsul vasodilatator al angiotensinei (1–7), ce potențează presiunea sanguină scăzută și vasodilatația induse de bradikinină atât la animalele normale cât și la cele hipertensive. Concomitent, angiotensina (1–7) activează NOSe și producerea de NO prin căile dependente de AKt și crește eliberarea de prostaglandine .

Studiile noastre asupra efectelor vasculare ale angiotensinei (1–7) pe inele izolate de aortă toracică de șobolan au arătat că pe lângă binecunoscuta sa relaxare dependentă de endoteliu, angiotensina (1–7) în doze mici, fiziologice inhibă vasoconstricția indusă de angiotensina II atât pe preparatele aortice cu endoteliul intact cât și pe preparatele dezendotelizate. Concentrații crescute de angiotensină (1–7) au produs o creștere evidentă, semnificativă a tonusului vascular care a fost diminuată de blocantul receptorului AT1 – losartan, în timp ce PD-123319 (blocant specific al receptorului AT2) a inhibat numai răspunsul vasodilatator al angiotensinei (1–7) .

Aceste rezultate sugerează faptul că angiotensina (1–7) este unul dintre componenții activi ai SRA implicat nu numai în atenuarea proprietăților vasopresoare ale angiotensinei II, dar, de asemenea, acționează ca o frână pentru vasodilatația indusă de excesul propriilor acțiuni. În concordanță cu aceste posibile acțiuni bifazice ale angiotensinei (1–7) este și descoperirea recentă a rolului său dual asupra căilor de semnalizare ce induc creșterea în inima de șobolan în vivo .

Efectele opuse ale angiotensinei (1–7) și ale angiotensinei II pot fi de asemenea găsite în azul reglării creșterii celulare și dezvoltării mușchiului neted vascular.

Freeman și col. au arătat că angiotensina (1–7) inhibă creșterea celulelor musculare netede izolate din aorta de șobolan iar Gallagher și Tallant au descoperit inhibiția dezvoltării cancerului în mai multe linii celulare canceroase din plămânul uman.

Efectele antiproliferative ale angiotensinei (1–7) au determinat o reducere a dimensiunilor tumorilor pulmonare la șoarecii fără timus prin reducerea COX-2 . Deși la începuturi, studiul efectelor angiotensinei (1–7) asupra creșterii celulelor canceroase este promițător.

La nivel renal, angiotensina (1–7) este larg distribuită în segmentele tubulare și glomerulare, atingând valori maxime la nivel proximal. Acțiunile sale renale sunt opuse celor ale angiotensinei II. În concentrații mici, angiotensina (1–7) crește fluxul sanguin renal, în timp ce în doze mari induce efecte opuse. La nivelul arterelor aferente precontractate produce dilatație și atenuarea acțiunilor vasoconstrictoare ale noradrenalinei .

Angiotensina (1–7) este de asemenea un component important al tubilor urinari care determină efecte natriuretice și diuretice cu creșterea corespondentă a ratei de filtrare glomerulară. Aceste acțiuni nu sunt dependente de receptorii AT1 și AT2, dar interacționează cu receptorii V2 ai vasopresinei și sunt atenuate de D-Ala 7–Ang (1-7), sugerând implicarea receptorului Mas .

Eliminarea urinară a angiotensinei (1–7) este mai mare decât a angiotensinei II, indicând posibilitatea predominantă a degradării ei de către ECA2 la nivel renal.

Pe lângă acțiunile modulatoarea tubulare, angiotensina (1–7) este implicată în autoreglarea hemodinamicii renale, care este indispensabilă fenomenelor vasculare care mențin în limite normale principalii parametrii biologici (hidro-electrolitici, metabolici, acido-bazici). Aceste rezultate sugerează posibilitatea implicării angiotensinei (1–7) ca un reglator fiziologic al presiunii intraglomerulare urmată de compensarea efectelor vasoconstrictoare, proliferative și fibrinogenice ale angiotensinei II.

La nivel hepatic, angiotensina (1–7) pare să fie unul din factorii implicați în vasodilatația produsă de disfuncția hepatică care promovează expresia ECA2. Facilitând degradarea angiotensinei II și formarea angiotensinei (1–7), ECA2 contribuie la inhibarea alterărilor locale induse de angiotensina II. Tratamentul cronic cu inhibitori de ECA1 sau cu blocanți de receptori AT1, crește de câteva ori nivelele de angiotensină (1–7) din ficat. Dovezi noi susțin prezența tuturor constituenților SRA în pancreasul endocrin, unde modulează fluxul sanguin local, eliberarea de hormoni și sinteza de prostaglandine .

Cuplul ECA2–Ang (1–7) a fost de asemenea indentificat în sinusurile corpului cavernos uman și în celulele Leydig de la alte mamifere, sugerând un posibil rol în funcția erectilă. Cuplul ECA2–Ang (1–7) este de asemenea prezent în uter în timpul gestației. În sarcina normală, angiotensina (1–7) și ECA2 sunt de asemenea exprimate în placentă. În sarcinile cu risc de pre-eclampsie s-au observat alterări ale angiotensinei (1–7) plasmatice .

Multe alte date experimentale au confirmat existența și rolul angiotensinei (1–7) în reglarea neuro-endocrină centrală și în unele disfuncții neurodegenerative .

În creier, angiotensina (1–7) a fost găsită atât în complexul hipotalamic-hipofizar ca modulator al eliberării de vasopresină cât și în amigdala laterală, implicată în învățare și memorie prin mecanismul potențării pe termen lung .

Angiotensina III (2–8) rezultată din degradarea angiotensinei II de către aminopeptidaza A, determină efecte presoare, dipsogene și de eliberare a vasopresinei. Angiotensina III prezintă o oarecare afinitate pentru receptorii AT1 și AT2. Injectată intracerebroventricular, angiotensina III crește presiunea sanguină ca și precursorul ei angiotensina II. Locuri specifice și distincte de legare pentru angiotensina III și angiotensina II au fost dovedite în glanda suprarenală la șobolan .

Ambele peptide crescând presiuea sanguină, inhibitorii aminopeptidazei A pot constitui o presupusă țintă terapeutică pentru tratarea hipertensiunii.

Aplicarea microiontoforetică a angiotensinei III în nucleul reticulat gigantocelular a suprimat răspunsul la nocicepția și hipertensiunea induse. Acțiunile antinociceptive ale angiotensinei III au fost blocate de administrarea concomitentă a antagonistului receptorului său – Ile7–Ang III . Similar cu angiotensina II, angiotensina III induce expresia c-Fos, c-Jun și Knox-24 în patru regiuni ale creierului (organul subfornical, area preoptică mediană, nucleul paraventricular și nucleul supraoptic) . De asemenea contribuie la comportamentul alimentar dipsogenic și la tonusul cerebrovascular.

Angiotensina IV (3–8) spre deosebire de angiotensina III, este implicată în reglarea fluxului sanguin, dezvoltarea neuronală, comportamentul explorator, învățare și memorie. Acțiunile cerebrale predominante ale angiotensinei IV sunt datorate interacțiunii cu o enzimă transmembranară (aminopeptidaza membranară reglatoare de insulină – IRAP) care ar putea acționa ca un subtip al receptorului AT4 . Angiotensina IV îmbunătățește învățarea și memoria prin potențarea de lungă durată și stimulează proliferarea celulelor hipofizei anterioare la șobolan independent de receptorul AT1. Efectul antiepileptogenic al angiotensinei IV poate fi mediat prin creșterea densității de receptori adenozinici A1 sau prin prevenirea reducerii numărului de receptori dopaminergici D2 în paralel cu turnover-ul serotoninei .

Deficitul în producerea angiotensinei IV datorat deteriorării enzimelor sintetizatoare, cauzează factori de risc legați de vârstă și vasculari sau metabolici care contribuie la degradarea neuronală progresivă în boala Alzheimer . În favoarea implicării SRA cerebral în patogeneza multifactorială a bolii Alzheimer, pledează atât scăderea ECA la vârstnici cât și participarea sa în degradarea proteinei -amiloid neurotoxice din plachetele senile. După Braszko și col. , efectele cognitive atribuite angiotensinei II ar putea rezulta din conversia sa la angiotensină IV. Astfel angiotensina II trebuie să fie degradată la angiotensină IV înainte ca efectele cognitive să poată apare. Același mecanism este implicat în modularea proliferării celulelor adenocorticale la șobolanii femelă cărora le-au fost îndepărtate ovarele. Arteriografii cerebrale secvențiale au arătat că angiotensina IV are efecte neuroprotective împotriva ischemiei cerebrale acute prin declanșarea unui mecanism dependent de NO, mediat prin AT4 . Alte două peptide angiotensinice sunt legate funcțional de modularea acțiunilor angiotensinei II.

Angiotensina (1–9) de exemplu, care este eliberată de carboxipeptidaza A (catepsina A) numită deamidază de către Jackman și col , este prezentă în țesutul cardiac uman și îmbunătățește pe lângă angiotensina (1–7), eliberarea kininelor, acidului arahidonic și NO ca potențial antagonist al angiotensinei II, inducând modularea efectelor sale cardiovasculare.

Angiotensina V (3–7) este un fragment derivat atât din angiotensina II cât și din angiotensina (1–7) sub influența dipeptidil-aminopeptidazei (AMP-D), care acționează ca un neuromodulator vascular prin interacțiunea cu receptorul Mas al angiotensinei (1–7) la nivelul măduvei spinării ventrolaterale rostrale .

2.1.2.3. Interacțiuni funcționale între peptidele angiotensinice

Datele succint prezentate indică faptul că, clasicul concept despre angiotensina II ca principal peptid angiotensinic presor a suferit schimbări substanțiale în ultimii ani. Multe studii experimentale au relevat aspecte noi ale SRA circulant și tisular, începând cu indentificarea ECA2 ca nouă enzimă de conversie insensibilă la inbitorii ECA și sfârșind cu descoperirea angiotensinei (1–7) și a altor fragmente bioactive ale angiotensinei II. Izolarea recentă a angiotensinei (1–12) ca un nou potențial precursor pentru formarea peptidelor angiotensinice bioactive, pune de asemenea problema originii sale și proprietăților fizio-farmacologice.

Câteva binecunoscute acțiuni normale și patologice ale angiotensinei II ca cel mai activ hormon multifuncțional al SRA, sunt potențate sau contra reglate de alte fragmente angiotensinice reprezentate de angiotensina II, angiotensina IV, angiotensina (1–7) sau angiotensina V. În timp ce angiotensina II operează în principal pe receptorii AT1 determinând vasoconstricție, angiotensina IV modulează unele activități metabolice și nervoase centrale (creșterea fluxului sanguin, asimilarea de glucoză, memoria și învățatul)

Pe de altă parte, angiotensina (1–7) determină efectele vasculare benefice nu numai pe procesele cardiovasculare normale dar și în multe alte stări fiziopatologice. Acest heptapeptid este implicat atât în atenuarea proprietăților vasopresoare ale angiotensinei II cât ca și factor de frânare pentru vasodilatația indusă de excesul propriei sale acțiuni modulatoare. Astfel, angiotensina (1–7) participă ca un principal mecanism contrabalansator împotriva efectelor vătămătoare ale angiotensinei II.

O prezentare sumară a formării și interacțiunilor opuse dintre diferitele peptide angiotensinice este expusă schematic în următoarea figură (Figura 4).

Tot mai multe dovezi sugerează că aceste proprietăți contra-reglatoare induse de mai mulți metaboliți ai angiotensinei II, sunt implicate în auto-reglarea SRA. Aceste date justifică necesitatea de regândire a rolului normal și fiziopatologic al SRA circulant și tisular, ca un sistem integrat și unitar. Deși interacțiunile dintre cercetarea de bază și cea clinică rămân a fi elucidate de cercetările viitoare, aceste date experimentale deschid calea noilor oportunități clinice.

Figura 4 – Biosinteza și principalele acțiuni ale peptidelor angiotensinice bioactive

2.1.3. Receptori angiotensinici

Ca și alți hormoni peptidici, angiotensinele, pentru a-și exercita acțiunea, se leagă de receptorii membranari ai celulelor țintă. Aceste substanțe (Ang II, Ang III, Ang IV) au afinități diferite față de celulele țintă . Experimentele farmacologice au arătat că organele efectoare răspund la Ang II, Ang III, Ang IV diferit, de la țesut la țesut. Bazându-se pe aceste date, s-a ajuns la concluzia că selectivitatea receptorilor Ang II pentru agoniști depinde de relația structură-activitate. Comparând Ang II cu un număr mare de agoniști și antagoniști sintetici (formați prin substituirea diferiților aminoacizi din componența Ang II) au fost demonstrate diferențele structurale ale situsurilor de legare ale acestor receptori .

Studii recente au demonstrat că situsurile de legare diferă de la un țesut la altul . De asemenea, densitatea receptorilor a fost reglată „up” și „down” în diferite țesuturi, după administrarea de infuzie de Ang II sau restricție de sodiu. A fost demonstrată heterogenitatea receptorilor Ang II din cortexul renal și ficatul de șobolan.

O clasificare ulterioară a tipurilor receptorilor Ang II s-a bazat pe studii efectuate pe diferite țesuturi, la diferite specii .

În anul 1980 s-a putut demonstra existența a 2 tipuri de receptori în diferite țesuturi, utilizându-se analogi convenționali precum saralazin (cu o înaltă afinitate, dar o mică selectivitate). Au fost utilizați antagoniști non-peptidici, precum losartan (Ex 89 sau DuP 753) și PD 123177 și o nouă generație de peptide ligand (CGP 42112 și p-aminofenilalanina Ang II) .

Această nouă descoperire a fost făcută simultan și independent în trei laboratoare diferite, iar nomenclatura inițială a fost confuză: receptorii sensibili la losartan au fost numiți 1, B sau α, iar cei care nu au afinitate la losartan s-au numit 2, A sau β. Clasificarea finală a fost aprobată în 1995.

De atunci au mai fost descoperite alte 2 tipuri de receptori ai Ang II: AT3 și AT4.

Numele de AT3 a fost dat inițial receptorului descris în linia celulară din neuroblastomul de șoarece. AT3 nu era blocat de losartan (blocant specific al receptorului AT1) și nici de PD 123319 (blocant specific al receptorului AT2), și nici nu era influențat de analogi GTP .

Receptorul AT3, care are o afinitate scăzută pentru Ang III, a fost numit non-AT1-non-AT2.

Liganzii endogeni pentru receptorul AT4 sunt Ang3-8 sau Ang IV. Există multe diferențe între receptorii AT1 și AT2 și receptorul AT4.

2.1.3.1. Receptorul AT1

Receptorul AT1 conține 359 de aminoacizi și aparține superfamiliei de receptori cuplați cu o proteina G. Prezintă sapte domenii transmembranare (Figura 5). Secvența de aminoacizi este identică în proporție de 95% cu cea a receptorului bovin și de șobolan.

Receptorii AT1 sunt exprimați la nivel renal (în vascularizația renală și glomeruli), în sistemul reproducător, în placentă, țesut adipos, vase pulmonare.

Receptorii AT1, la șoarece, sunt de două tipuri: AT1a și AT1b. Receptorii AT1a și AT1b sunt exprimați în arteriola aferentă, în timp ce receptorii AT1a sunt exprimați doar în arteriola eferentă .

Figura 5 – Receptorul AT1

2.1.3.2. Receptorul AT2

Receptorul AT2 pare a fi mai puțin important decât receptorul AT1 în fiziologia adultului. Receptorul AT2 este un receptor cuplat cu o proteina G, conține 363 de aminoacizi și are șapte domenii transmembranare. Este mai bine exprimat în țesuturile fetale, în special în aria de diferențiere mezenchimală. În majoritatea țesuturilor, receptorul AT2 prezintă fie un puternic regres, fie dispare imediat după naștere .

La adult receptorul AT2 a fost detectat în cord, creier, glanda suprarenală, uter, rinichi , la nivelul adventicei arterelor interlobare . La șobolani, receptorul AT2 a fost detectat în endoteliu.

În rinichiul uman, receptorul AT2 este prezent în vasele preglomerulare de la nivelul cortexului renal și în interstițiul tubular.

2.1.3.3. Receptorul AT4

Receptorul AT4 este un receptor cuplat cu o proteină G, fiind capabil să lege molecule mici. Receptorul angiotensinic AT4 este întâlnit la nivelul creierului.

Receptorii asupra cărora acționează Ang(1-7) sunt subiect de controversă. Un receptor specific al Ang(1-7) nu a fost clonat, dar studii recente sugerează că este un receptor Mas cuplat cu o proteină G .

2.1.3.4. Receptorul pentru angiotensinogen

De curând, a fost dovedită prezența receptorului pentru angiotensinogen la nivelul celulelor epiteliale tubulare proximale renale umane. Astfel, receptorul pentru angiotensinogen poate deveni un component al sistemului renină-angiotensină .

Nivele crescute ale expresiei angiotensinogenului pot inhiba creșterea pereților arterelor renale în vivo .

2.1.4. Transducerea semnalului

2.1.4.1. Receptorul AT1

Cuplarea Ang II cu receptorul AT1 determină modificări conformaționale ale receptorului, care activează proteina Gq . Proteina Gq activează fosfolipaza C, care generează producția de 1,4,5-inozitoltrifosfat (IP3) și diacilglicerol (DAG). IP3 și DAG sunt capabili să crească concentrația intracelulară de calciu. IP3 eliberează calciu din depozitele intracelulare, iar DAG determină un influx de calciu din mediul extracelular. Creșterea concentrației intracelulare de calciu va fi urmată de vasoconstricția celulelor netede vasculare.

Receptorul AT1 reglează, de asemenea, tirozin kinaza care pare a fi necesară la amplificarea efectelor Ang II . Tirozin kinaza poate determina fosforilarea tirozinei din diferite tipuri de molecule semnal, conducând eventual la activarea protein kinazei asociate mitogenezei (MAP). Mitogen-protein kinazele, proteinkinaza C și creșterea intracelulară de calciu, activează transcripția genică a unor factori, precum c-fos, c-myc și c-jun, stimulând astfel creșterea și proliferarea celulară.

Activarea receptorului AT1 induce transcripția nucleară a factorului kappa-B (NF-κB), mediată pe calea kinazei Janus (JAK)/ traducerea semnalului și activarea factorului de transcriptie (STAT) , activatorului proteic (AP-1) și fosfotirozin kinazei (PTK) .

Creșterea activității NF-κB a fost asociată cu creșterea infiltrației macrofagelor, creșterea expresiei monocitelor chemotatice protein-1 (MCP-1), creșterea speciilor reactive ale oxigenului (ROS) și proliferarea celulelor musculare netede vasculare .

Receptorul AT1 stimulează sistemul NADH/NADPH din membrana celulelor endoteliale, generând ROS . ROS sunt capabile să reducă eliberarea oxidului nitric (NO) , determinând vasoconstricție și scăderea oxidării LDL. Aceste efecte sunt asociate cu creșterea aterogenității (Figura 6).

Figura 6 – Transducerea semnalului consecutiv activării receptorului AT1

AP-1: activatorul proteic-1; R-AT1: receptorul AT1 al Ang II;

DAG: diacilglicerol; IP3: 1,4,5-inozitoltrifosfat; MAP: proteina

activatoare a mitogenezei; NF-κB: factorul nuclear kappa-B;

NO: oxid nitric; SRO: specii reactive de oxigen; PKC: protein

kinaza C; PLK: fosfolipaza C; PTK: fosfotirozin kinaza

2.1.4.2. Receptorul AT2

Căile semnalului celular care conduc la activarea receptorului AT2 nu sunt clarificate, dar par a fi implicate căi dependente de proteina G și căi independente de aceasta . Date recente demonstrează că receptorul este cuplat cu proteina G (Giα2 si Giα3) .

Stimularea receptorului AT2 activează fosfotirozinfosfataze, în special serin\treonin fosfataza 2A, proteinkinazfosfataza și SHP-1 tirozin fosfataza, rezultând inactivarea MAPKs, în special MAPKs p42 și p44 sau ERKs. Este evident că receptorul AT2 deschide canale lente de potasiu, activează fosfolipaza A, generează prostaglandine și stimulează producția de ceramide (Figura 7).

În contrast cu receptorul AT1, receptorul AT2 nu este internalizat după cuplarea cu agonistul, sugerând că acesta poate rămâne activ în membrană fără o desensibilizare de lungă durată la răspunsurile biologice.

Figura 7 – Transducerea semnalului consecutiv activării receptorului AT2

AT2r: receptorul AT2 al Ang II; BK: bradikinina; cGMP: GMP ciclic;

PP2A: serin/treonin fosfataza 2A; PTP: fosfotirozin fosfataza;

SRO: speciile reactive ale oxigenului

2.1.4.3. Receptorul AT4

Evenimentele inițiale care caracterizează mecanismul de semnalizare intracelulară a receptorului AT4 sunt în prezent necunoscute. Injectarea intra-cerebro-ventriculară de Ang IV, la iepuri, induce expresia genei c-Fos în regiunile cerebrale asociate cu memoria. De asemenea, agoniștii Ang IV pot stimula expresia genelor c-Fos, c-Jun și egr-1 în cordul izolat de iepure.

Activarea receptorului pentru Ang IV crește expresia inhibitorului activatorului plasminogenului, PAI-1, și este blocată de coadministrarea de antagoniști ai receptorului AT4.

Aria finală de investigații asociate cu semnalizarea receptorului AT4 implică identificarea de liganzi endogeni ai acestui receptor. Primul ligand identificat pentru receptorul AT4 a fost o hexapeptidă, Ang IV. Ang IV este cunoscută ca fiind prezentă în circulație și este generată din Ang II sau Ang III. Studii recente indică prezența altor peptide, precum LVV-hemofin-7, capabile să se lege și să activeze receptorii AT4.

2.1.5. Blocanți ai Receptorilor Angiotensinici (BRA)

Studiile au încercat să dezvolte inhibitori specifici pentru receptorii AT, conducând la apariția unei noi familii de medicamente, blocanții receptorilor angiotensinici.

Antagoniștii nonpeptidici aparțin următoarelor două familii chimice: cea difenilmetilică ce cuprinde losartan, candesartan, irbesartan, telmisartan, valsartan și cea tienilmetacrilică, ce are ca reprezentanți eprosartan și olmesartan.

BRA sunt aprobați numai pentru utilizare în hipertensiunea arterială, singurul aprobat recent pentru tratamentul sincopei fiind valsartanul.

Există cel puțin de 10.000 de ori mai mulți receptori selectivi AT1 decât AT2 iar legarea BRA la receptorii AT1 este definitivă și ireversibiliă .

Farmacologia BRA este bine descrisă . Ei inhibă puternic și selectiv, atât în vivo cât și în vitro majoritatea efectelor biologice ale angiotensinei II.

Compararea efectelor cu ale altor medicamente cardiovasculare este în studiu, dar există câteva aspecte importante:

reduc activarea AT1 mult mai eficient decât inhibitorii ECA,

activează indirect receptorii AT2

inhibitorii ECA cresc nivelul angiotensinei (1-7) mai mult decât BRA.

inhibitorii ECA cresc nivelul bradikininei – deoarece ECA este o enzimă nediscriminatorie care procesează o multitudine de substraturi.

În prezent se recomandă utilizarea inhibitorilor ECA ca primă medicație și păstrarea BRA ca rezervă pentru situațiile necesare, deoarece aceștia nu prezintă efectele adverse ale primilor. BRA sunt de asemenea recomandați în tratamentul hipertensiunii portale la pacienții cu ciroză.

Figura 8 – Posibilități de modificare a mediației angiotensinice

2.1.6. Implicații funcționale

Angiotensina deține un rol important în redistribuirea fluxului sangvin renal, în controlul filtrării glomerulare și a eliminării produșilor de excreție datorită, efectelor sale vasoconstrictoare selective.

Perfuzia rinichiului cu Ang II în concentrație redusă determină vasoconstricție renală, în special în zona medulară a organului .

În adiție cu efectele fiziologice asupra hemodinamicii glomerulare și funcției excretorii, a fost demonstrat rolul jucat de Ang II în medierea fiziopatologică a vasoconstricției renale în bolile rinichiului.

Studii recente au evidențiat că Ang II contractă microvascularizația renală, inclusiv arteriolele aferente și eferente. Vasoconstricția arteriolei aferente determinată de Ang II se realizează prin deschiderea canalelor de clor care induc depolarizare membranară și activează canalele de calciu voltaj – dependente.

Mecanismele care mediază vasoconstricția arteriolelor eferente la Ang II sunt limitate și destul de controversate. Studii experimentale anterioare indicau absența canalelor de calciu voltaj-dependente în arteriola eferentă. S-a emis ipoteza că Ang II deschide canale ionice receptor operate voltaj-independente de calciu în celulele musculare netede vasculare, dar contribuția acestor canale la vasoconstricția arteriolei eferente indusă de Ang II nu a fost demonstrată.

Ulterior s-a descoperit ca vasoconstricția la Ang II a arteriolei eferente este mediată de mobilizarea calciului din depozite, precum și de pătrunderea acestui ion în celulă, pe calea mecanismelor dependente de familia de proteine Gi.

Ang II joacă un rol cheie în dezvoltarea glomerulosclerozei determinată de creșterea presiunii capilarelor glomerulare, prin constricția preferențială a arteriolei eferente.

Vasoconstricția arteriolei aferente și eferente este mediată de receptorii AT1, prezenți la acest nivel.

Prezența receptorului AT2 la nivelul vaselor renale se asociază cu amplificarea răspunsului natriuretic la creșterea presiunii de perfuzie renală .

Absența receptorului AT2, care contracareaza efectele Ang II mediate de receptorul AT1, agravează presiunea renală și arterială, ca raspuns la inhibarea NO sintazei.

Pe de altă parte s-a demonstrat că Ang II determină proliferarea celulelor musculare netede. Administrarea Ang II la șobolani (200 ng/min i.v.), timp de 2 săptămâni, a arătat că proliferarea determinată de Ang II este mai importantă la nivelul neointimei decât în medie. Astfel, hipertrofia vasculară poate juca un rol important în încetinirea efectului presor al Ang II .

Contracția musculaturii netede vasculare la angiotensină este determinată nu numai de nivelele intracelulare ale calciului liber, ci și de sensibilitatea aparatului contractil la acest ion. Un potențial modulator este rho-kinaza.

Pe modelul șobolanului hidronefrotic, modificările diametrului arterelor interlobare, arteriolelor aferente și eferente a fost măsurat utilizând 3 stimuli distincți:

– modificările presiunii intravasculare;

– angiotensina II;

– depolarizarea membranară (component fiziologic al multor căi de semnalizare).

Au fost utilizati doi inhibitori selectivi ai rho-kinazei, diferiți din punct de vedere structural, Y-27632 și HA-1077, precum și un inhibitor selectiv al protein-kinazei C alfa.

Vasoconstricția preglomerulară indusă de depolarizarea membranară directă, creșterea presiunii sau Ang II depind de efectul rho-kinazei.

Diferențe între rolul rho-kinazei în constricția arteriolei eferente determinată de Ang II și microvasele preglomerulare nu au fost gasite.

În concluzie, rho-kinaza, la nivelul rinichiului este implicată într-o varietate de căi de semnalizare, care conduc la constrictia microvaselor. Astfel, rho-kinaza are un rol important în reglarea tonusului pre și postglomerular .

La șobolanii spontan hipertensivi, dar nu și la cei normotensivi, stimularea simpatică îmbunătățește răspunsul vaselor renale la nivelele fiziologice de Ang II, pe calea mecanismelor care implică receptorii Y1 cuplați cu proteine Gi .

În caz de nefrectomie unilaterală, reactivitatea vaselor renale la Ang II crește semnificativ (fenomen de adaptare) .

Ang(1-7) are în general efecte opuse Ang II. Ea induce stimularea eliberării de NO și de prostaglandine vasodilatatorii. Împreuna cu bradikinina, Ang (1-7) determină eliberarea de prostaglandine din endoteliul vascular și din celulele musculare netede , eliberează NO , determină vasodilatație, inhibă creșterea celulelor vasculare și atenuează vasoconstricția indusă de Ang II .

Rinichiul este organul țintă asupra căruia acționează Ang (1-7) , având un efect moderat la nivelul funcției hemodinamice.

2.1.7. Aplicații terapeutice

Angiotensina este indicată în colaps și șoc prin tulburări vasomotorii. Se utilizează în șocul cardiogen și în cel din infarctul miocardic.

2.1.8. Perspective în inhibiția farmacologică a SRA

2.1.8.1. Inhibitorii vasopeptidazelor

Acestea sunt medicamente care inhibă enzimele ce metabolizează peptidele vasoactive, atât ECA cât și endopeptidaza neutră (NEP).

NEP numită și neprilizin, este o metalopeptidază membranară endotelială. Situl său activ clivează peptidele endogene la capătul amino-, iar unitatea catalitică este similară cu ECA. Este distribuită la nivelul celulelor endoteliale, celulelor musculare netede, cardiomiocitelor, celulelor epiteliului tubular renal și a fibroblastelor.

S-a identificat ARNm al NEP în intestin, glandele medulosuprarenale, creier și cord unde catalizează degradarea peptidelor vasodilatatorii și a factorului natriuretic atrial cu izoformele sale ANP, BNP, CNP. De asemenea inhibă efectele substanței P, bradikininei, adrenalinei dar reduce și formarea de substanțe vasoconstrictoare precum endotelina 1 și ang II .

Inhibitorii selectivi ai NEP reduc în vivo și în vitro degradarea peptidelor natriuretice, ceea ce le crește activitatea. Inhibitorii NEP precum candoxatril, thiorphan și fosforamidon au efecte variabile în funcție de nivelele de peptide ce modulează vasomotricitatea. Dacă echilibrul este normal sau înclinat către hipotensiune, inhibitorii NEP sunt vasoconstrictori. Dacă echilibrul mediatorilor vasculari se îndreaptă către hipertensiune inhibitorii NEP devin vasodilatatori.

Tabelul 1. Inhibitorii vasopeptidazelor în curs de investigare clinică

Efectele sinergice ale inhibiției combinate ale ECA și NEP sunt datorate blocadei sintezei de ang II și potențării simultane a bradikininei și peptidelor natriuretice, ceea ce duce la vasodilatație, natriureză și îmbunătățirea funcției miocardice .

2.2. Metabolismul acidului arahidonic

Acidul arahidonic este cel mai abundent și cel mai important dintre precursorii eicosanoidelor. După mobilizare, acidul arahidonic este oxigenat pe patru căi diferite: cicloxigenaze, lipoxigenaze, P450 epoxigenaze și calea izoprostanului .

2.2.1. Sinteza eicosanoizilor

COX-1 și COX-2 transformă acidul arahidonic în prostaglandin-endoperoxid. Aceste două enzime sunt importante deoarece la acest nivel AINS își exercită efectul terapeutic. Indometacinul și sulindacul sunt puțin selective pentru COX-1, meclofenamatul și ibuprofenul sunt aproximativ la fel de selective pentru COX-1 și COX-2 iar celecoxibul și rofecoxibul inhibă specific COX-2.

Metabolizarea acidului arahidonic de către 5-, 12-, 15-lipoxigenaze determină producerea acizilor hidroperoxieicosatetraenoici care se transformă rapid în hidroxi-derivați (HETE) și leucotriene. Cele mai investigate leucotriene sunt cele produse de către 5-lipoxigenaza prezentă în celulele inflamatorii. Această cale este de un mare interes, fiind asociată cu astmul și șocul anafilactic.

P450 mono-oxigenazele convertesc acidul arahidonic în patru acizi epoxieicosatrienoici. Aceștia sunt instabili și formează rapid compuși dihidroxieicosa-trienoici. Produșii epoxigenați sunt activi în celulele mușchiului neted și se pare că au un rol important în funcția renală.

O altă cale importantă este generarea izoprostanilor din acidul arahidonic. Aceștia sunt stereoizomeri ai prostaglandinelor. Importanța acestora constă în cantitățile mari în care se găsesc și efectul lor vasoconstrictor în patul renal și alte paturi vasculare.

Tabelul 2. Receptorii membranari ai prostanoizilor

2.2.2. Efectele prostaglandinelor și tromboxanilor

Prostaglandinele și tromboxanii au efecte majore asupra a patru tipuri de mușchi netezi: respiratori, gastrointestinali, reproductivi și vasculari. Alte ținte importante sunt plachetele și monocitele, rinichii, sistemul nervos central, terminațiile nervoase presinaptice, terminațiile nervoase senzoriale, organele endocrine, țesutul adipos și ochii .

Mușchiul neted vascular: TxA2 are efect mitogen asupra celulelor musculare netede fiind unicul eicosanoid cu acest efect. Este de asemenea și un puternic vasoconstrictor. PGF2 este de asemenea un vasoconstrictor dar nu posedă efecte mitogene asupra celulelor musculare netede . Un alt vasoconstrictor este și 8-epi-PGF2. La pacienții cu ciroză este produs în mari cantități în ficat și se crede că joacă un rol patofiziologic ca un important vasoconstrictor în sindromul hepatorenal. Prostaglandinele vasodilatatoare, în special PGI2 și PGE2, determină vasodilatația prin creșterea cAMP și scăderea calciului intracelular în principal prin receptorii IP și EP4 .

Tractul gastrointestinal: majoritatea prostaglandinelor și tromboxanilor activează mușchiul neted gastrointestinal.

Mușchiul neted respirator este relaxat de către PGD2, PGE1, PGE2 și PGI2 și contractat de către TxA2 și PGF2. Deși PGD2 nu este foarte bine studiată comparativ cu alte prostaglandine, studii efectuate pe șoareci knockout sugerează un important rol al acesteia în astm .

Plachete și celule sanguine: agregarea plachetară este afectată marcat de către eicosanoizi. PGE1 și în special PGI2 inhibă efectiv agregarea în timp ce TxA2 este un potent agregant plachetar. Neutrofilele și limfocitele sintetizează puțin sau deloc prostaglandine, în timp ce monocitele au o capacitate substanțială de sinteză a prostaglandinelor și tromboxanilor. De asemenea eozinofilele umane au capacitatea de a sintetiza prostaglandine și tromboxani .

Rinichi: atât zona medulară cât și cortexul renal sintetizează prostaglandine. Rinichiul sintetizează, de asemenea, câțiva acizi hidroxieicosatetraenoici, leucotriene, produse ale citocrom P450 și epoxizi. Acești compuși joacă un rol important în funcția renală modificând hemodinamica renală și funcția glomerulară și tubulară. Principalii eicosanoizi produși de către cortexul renal sunt PGE2 și PGI2, ambii crescând eliberarea de renină. Glomerulul sintetizează cantități mici de TxA2 dar acest puternic vasoconstrictor nu pare a fi responsabil pentru reglarea funcției glomerulare la oamenii sănătoși .

PGE1, PGE2 și PGI2 cresc filtrarea glomerulară prin efectele lor vasodilatatoare. Aceste prostaglandine cresc, de asemenea, excreția apei și a sodiului. Rinichiul normal sintetizează cantități mici de TxA2 în timp ce în condiții de inflamație și infiltrare celulară (glomerulonefrite, rejecție de transplant renal), celulele inflamatoare (monocite-macrofage) eliberează cantități mari de TxA2. Hipertensiunea este asociată cu sinteza crescută de TxA2 și cu sinteza scăzută de PGE2 și PGI2 .

2.2.3. Efectele lipoxigenazelor și ale produșilor de metabolism ai Citocromului P450

Acțiunea lipoxigenazelor generează compuși care pot regla răspunsurile celulare specifice importante în inflamație și imunitate. Produșii de metabolism ai citocrom P450 afectează funcția de transport a nefronului, ori direct, ori prin metabolizare la compuși activi .

Celulele sanguine și inflamația: LTB4 este un puternic chemoatractant pentru neutrofile iar LTC4 și LTD4 pentru eozinofile. Aceste leucotriene determină, de asemenea, aderența eozinofilelor, degranulație și formarea de radicali ai oxigenului. Leucotrienele sunt puternic implicate în patogeneza inflamației, în special în boli cronice ca astm și boli inflamatorii intestinale .

Inima: LTC4 și LTD4 reduc contractilitatea miocardului și fluxul de sânge coronarian determinând depresie cardiacă. Se pare că lipoxina A și lipoxina B au efecte vasoconstrictoare coronare .

Mușchiul neted gastrointestinal: celulele epiteliale din colonul uman sintetizează LTB4, un chemoatractant pentru neutrofile. Mucoasa colonului la pacienții cu boală inflamatorie intestinală conține cantități crescute de LTB4 .

Căile respiratorii: LTC4 și LTD4 sunt bronhoconstrictori puternici și determină creșterea permeabilității microvasculare, exudat și secreție de mucus în căile respiratorii .

Sistemul renal: rolul leucotrienenlor și al citocromului P450 în rinichiul uman este curent speculativ. Recent a fost arătat în experimente pe animale că 5,6-epoxidul este un puternic vasodilatator .

2.2.4. Inhibarea sintezei de eicosanoizi

Corticosteroizii blochează toate căile cunoscute de sinteză a eicosanoizilor, probabil prin stimularea sintezei unor proteine inhibitoare (anexine și lipocortine). Acestea inhibă activitatea fosfolipazei A2, interferând cu legarea fosfolipidică și astfel prevenind eliberarea de acid arahidonic. AINS (aspirină, indometacin, ibuprofen) blochează atât producerea de prostaglandine cât și de tromboxani prin inhibarea acțiunii COX. Inhibitori selectivi ai căii lipoxigenazelor sunt în principal investigați. Cu câteva excepții AINS nu inhibă activitatea lipoxigenazei la concentrații la care inhibă marcat activitatea COX .

2.2.4.1. Antiinflamatoare nesteroidiene (AINS)

Salicilații și alți agenți similari utilizați în tratamentul bolii reumatice au capacitatea de a suprima semnele și simptomele inflamației. Aceste medicamente au de asemenea efecte antipiretice și analgezice, dar proprietățile antiinflamatoare sunt cele care le fac foarte utile în tratarea bolilor în care durerea este corelată cu intensitatea procesului inflamator. Deoarece aspirina, primul AINS, are efecte adverse, multe alte AINS au fost sintetizate în încercarea de a îmbunătăți eficacitatea aspirinei și a-i scade toxicitatea.

2.2.4.1.1. Farmacocinetică

AINS sunt grupate în câteva clase chimice unele prezentate în Figura 9. Diversitatea chimică duce la o gamă largă de caracteristici farmacocinetice. Deși există multe diferențe în cinetica AINS, ele au câteva proprietăți generale comune. Toate, cu excepția nabumetonei, sunt acizi organici slabi. Majoritatea acestor medicamente sunt bine absorbite, iar alimentele nu influențează substanțial biodisponibilitatea lor. Majoritatea AINS sunt foarte bine metabolizate, unele prin mecanismele fazei I urmate de mecanismele fazei II, iar altele doar direct prin glucuronoconjugare (faza II). Metabolizarea majorității AINS începe prin familiile CYP3A sau CYP2C ale enzimelor P450 în ficat. În timp ce excreția renală este cea mai importantă cale de eliminare finală, aproape toate sunt supuse unor grade variabile de eliminare și reabsorbție biliară (circulația enterohepatică). Majoritatea AINS se leagă de proteine (98%), în principal de albumină .

Figura 9 – Structura chimică a unor AINS

2.2.4.1.2. Farmacodinamie

Activitatea antiinflamatoare a AINS este mediată în principal prin inhibarea sintezei de prostaglandine. Diverse AINS au posibile mecanisme suplimentare de acțiune, incluzând inhibiția chemotaxiei, scăderea producerii de interleukină-1, scăderea producerii de radicali liberi și superoxid și intervenția asupra evenimentelor intracelulare mediate de calciu. Aspirina acetilează și blochează ireversibil ciclooxigenaza plachetară în timp ce majoritatea AINS neselective COX sunt inhibitori reversibili. Inhibitorii puternic selectivi COX-2 nu afectează funcția plachetară la doze normale. În testele făcute aspirina, indometacinul, piroxicamul și sulindacul sunt oarecum selectivi COX-1, ibuprofenul și meclofenamatul inhibă egal COX-1 și COX-2. AINS scad sensibilitatea vaselor la bradikinină și histamină și afectează producerea limfokinelor din limfocitele T. În grade diferite toate AINS noi sunt analgezice și antipiretice și toate (cu excepția celor COX-2 specifice și a salicilaților neacetilați) inhibă agregarea plachetară. AINS sunt toate iritante gastrice însă un grup nou de agenți, tind să producă iritație gastrică mai mică decât aspirina. Nefrotoxicitatea și hepatotoxicitatea au fost de asemenea observată pentru toate medicamentele .

Tabelul 3. Selectivitatea AINS pentru COX

* Exprimată ca raportul dintre concentrația inhibitorie 50% a cyclooxigenazei-2 la concentrație inhibitorie 50% a cicloxigenazei-1 în sânge integral. AINS cu o rație <1 indică selectivitate pentru cicloxigenaza-2 .

Ketoprofenul este un derivat al acidului propionic ce inhibă atât cicloxigenazele (neselectiv) cât și lipoxigenazele. Administrarea concomitentă cu probenecid crește nivelele de ketoprofen și îi prelungește semiviața plasmatică. Se utilizează în tratamentul artritei reumatoide, artroză (osteoartrită), dismenoree și în alte tipuri de dureri. Efectele adverse majore sunt pe tractul digestiv și sistemul nervos central.

Aspirina este un inhibitor neselectiv pentru ambele izoforme COX iar salicilatul este mai puțin eficace în inhibarea oricăreia dintre izoforme. Salicilații neacetilați pot funcționa ca scavengeri (captatori) pentru radicalii oxigenului. Aspirina inhibă ireversibil COX și inhibă agregarea plachetară în timp ce salicilații neacetilați nu au aceste acțiuni. Este eficace în reducerea durerii de intensitate mică până la moderată prin efectele sale asupra inflamației și datorită inhibiției stimulilor dureroși în zona subcorticală. Reduce febra în timp ce temperatura normală este doar foarte puțin afectată, acest efect fiind probabil mediat atât de inhibiția COX în sistemul nervos central cât și de inhibiția IL-1 (care este eliberată din macrofage în timpul episoadelor inflamatorii).

Oxaprozinul este derivat al acidului propionic și are o semiviață de 50-60 ore.

Naproxenul este derivat al acidului naftilpropionic și este un inhibitor COX neselectiv. Se utilizează în afecțiuni reumatice și ca preparat oftalmic.

Indometacinul este un derivat de indol, este un puternic inhibitor COX neselectiv și de asemenea inhibă fosfolipaza A și C, reduce migrarea neutrofilelor și scade proliferarea celulelor T și B. Probenecidul prelungește semiviața indometacinului prin inhibarea clereance-ului renal și biliar. Se utilizează în afecțiuni reumatice, artrita reumatoidă juvenilă, sindrom nefrotic, diabet insipid iar preparatul oftalmic este eficace în inflamații conjunctivale.

Ibuprofenul este un derivat simplu al acidului fenilpropionic. În doze de aproximativ 2400 mg/zi are efect antiinflamator echivalent cu a 4 g de aspirină. Este de obicei prescris în doze mai mici de 2400 mg/zi, doze la care are efect analgezic dar nu are eficiență antiinflamatoare. Comparativ cu indometacinul scade mai puțin eliminările urinare și de asemenea retențiile de lichid sunt mai scăzute. Iritațiile gastrointestinale și sângerările apar mai rar decât în cazul aspirinei. Utilizarea împreună cu aspirina poate scade efectul total antiinflamator.

Ketorolacul este un AINS pentru uz sistemic mai ales ca analgezic și nu ca antiinflamator. A fost utilizat cu succes în locul morfinei în ameliorarea durerilor postoperatorii mici și moderate. Folosirea împreună cu un opioid poate duce la scăderea cerinței de opioid cu 25-50%.

Piroxicamul este un inhibitor COX neselectiv, dar în concentrații mari inhibă migrarea leucocitelor polimorfonucleare, scade producerea de radicali ai oxigenului și inhibă funcția leucocitară. Datorită semivieții lungi permite administrarea o dată pe zi.

Nabumetona este singurul AINS neacid. Este convertit în derivat activ al acidului acetic în organism. Este administrat ca un prodrog ce are în structură și naproxen. Semiviața sa este mai lungă de 24 ore și permite administrarea în doze unice zilnice. Determină pseudoporfirie și fotosensibilitate.

Etodolacul are o rată a selectivității COX-2:COX-1 de aproximativ 10. Este folosit în reducerea durerii după intervenții de bypass arterial.

Meloxicamul este o enolcarboxamidă care inhibă preferențial COX-2 la doze terapeutice mici. Se utilizează în boli reumatice, osteoartrite (artroze). Provoacă mai puține simptome clinice gastrointestinale decât piroxicamul, diclofenacul și naproxenul.

Meclofenamatul și acidul mefenamic inhibă atât COX cât și fosfolipaza A2. Meclofenamatul crește efectul anticoagulantelor orale. Acidul mefenamic este mai puțin eficace decât aspirina ca antiinflamator și este mai toxic. Nu trebuie utilizat mai mult de o săptămână și este contraindicat copiilor.

Diclofenacul este derivat al acidului fenilacetic. Efectele adverse apar la aproximativ 20% din pacienți și includ tulburări de tip ulcerații și hemoragii gastrointestinale.

Diflunisalul deși este derivat din acidul salicilic nu este metabolizat la acid salicilic sau salicilat. Se pretinde a fi eficace în durerile de cancer cu metastaze osoase și pentru controlul durerii în chirurgia dentară.

Salicilații neacetilați includ salicilatul de sodiu și salicilsalicilatul. Sunt medicamente antiinflamatoare eficace dar cu efect analgezic mai slab decât cel al aspirinei.

Inhibitorii COX-2 selectivi sau coxibi au fost sintetizați în încercarea de a inhiba sinteza prostaciclinelor de către COX-2 la locul inflamației fără a afecta acțiunile COX-1. Coxibii se leagă selectiv și blochează situl activ al COX-2. Au acțiune analgezică, antipiretică și antiinflamatoare similară cu aceea a AINS neselective dar cu mai puține efecte secundare gastrointestinale. Nu influențează agregarea plachetară și nu au efect cardioprotector. Din păcate dozele recomandate de inhibitori COX-2 determină toxicitate renală similară celei determinate de AINS neselective. Nu sunt recomandați pacienților cu insuficiență renală severă și unele date clinice sugerează incidența crescută a evenimentelor trombotice cardiovasculare .

Celecoxibul este puternic COX-2 selectiv – de 10-20 de ori mai selectiv pentru COX-2 decât pentru COX-1. Este la fel de eficace ca alte AINS în artrita reumatoidă și artroză (osteoartrită) și în trialuri a determinat mai puține ulcere decât alte AINS.

Rofecoxibul este un puternic inhibitor selectiv COX-2 utilizat în artroze (osteoartite) și artrita reumatoidă. O serie de studii clinice au demonstrat riscurile cardiovasculare crescute la tratamentul cu rofecoxib pe o perioadă mai lungă . Ca urmare a acestor studii firma Merck este obligată să retragă produsul Vioxx din farmacii, retragere care a început pe data de 30 septembrie 2004, retragerea fiind la nivel mondial.

Etoricoxibul este un derivat bipiridinic cu cea mai mare rată de selectivitate dintre coxibi pentru COX-2. Este metabolizat de enzimele P450 hepatice excretat renal și are timpul de înjumătățire de eliminare de 22 de ore. Se utilizează pentru tratamentul semnelor și simptomelor artrozelor (osteoartritelor), artritei reumatoide și pentru scăderea durerilor acute musculo-scheletice.

2.2.4.2. Inhibitorii enzimei de conversie ai angiotensinei

Abordul farmacologic asupra SRA a fost beneficiarul șansei. La mijlocul deceniului șase, savanți brazilieni investigau veninul unor specii locale de șerpi veninoși (Bothrops jararaca) și au descoperit ceea ce au numit la acel moment „Factorul de Potențare a Bradikininei” (Bradykinin-potentiating Factor – BPF) . Mai târziu, s-a demonstrat că această enzimă, care degradează bradikinina, este identică cu kininaza II și inhibă conversia angiotensinei I la angiotensina II . De-a lungul următoarelor decenii, inhibarea farmacologică a ECA a devenit piesa de rezistență în terapia hipertensiunii arteriale .

Primul inhibitor al ECA descoperit a fost teprotidul un analog peptidic al angiotensinei, cu efect inhibitor. N-a avut niciodată o utilizare terapeutică datorită structurii sale peptidice, care nu este folosibilă pentru uz oral și de asemeni datorită farmacocineticii sale deficitare, care nu permite o folosire parenterală pe scară largă.

Nu la mult timp însă, au fost descoperiți o serie de inhibitori ECA non-peptidici. Ei se clasifică după radicalul chimic care interacționează cu zincul din ECA. La ora actuală, există 3 grupuri, sulfhidrilic, carboxilic și fosforilic.

Aproape toți, în doze similare, au efecte aproape egale în tratamentul hipertensiunii primare și insuficienței cardiace. Oricum s-au încercat o multitudine de modificări ale structurii de bază pentru creșterea eficienței, reducerea dozelor și efectelor adverse. Fără excepție, compușii carboxilici au absorbție orală scăzută. Alte diferențe implică penetrabilitatea acestor medicamente sau prodroguri în diverse țesuturi. De exemplu enalaprilul nu are efecte locale la nivelul SNC deoarece, fiind hidrofil, nu trece de bariera hemato-encefalică, în timp ce ramiprilul poate fi găsit ușor în lichidul cefalorahidian datorită bunei sale liposolubilități.

Inhibarea ECA în boala hipertensivă scade rezistența vasculară periferică și astfel presiunea sanguină datorită dilatației arteriolare sistemice . Reduce de asemenea presiunea arterială pulmonară și modifică curba presiune-natriureză reducând astfel stresul hemodinamic intrarenal.

Schimbarea echilibrului intrarenal dintre ang II și NO este responsabilă pentru vasodilatarea arteriolelor renale cu creșterea efectelor asupra ratei de filtrare glomerulară. Creșterea locală de NO, de asemenea, capturează radicalii superoxizi cu efecte malefice asupra celulelor tubulare, are efect antiproliferativ asupra celulelor mezangiale și inhibă producția matricei .

Prin blocarea efectelor pro-inflamatoare renale ale ang II, inhibarea ECA va reduce sinteza de colagen mezangial, proliferarea mezangiului și fibroza structurilor glomerulare și tubulo-interstițiale reducând astfel apariția și severitatea proteinuriei și avansarea spre insuficiență renală la pacienții cu boală renală cronică .

Tabelul 4. Clasificarea inhibitorilor ECA (cu doza uzuală zilnică, la pacienții umani, în mg)

Așa cum s-a arătat ang II și TGF1 reglează ascendent expresia GLUT-1 și transportul bazal al glucozei în celulele mezangiale, aceste efecte vor stimula creșterea depunerii de matrice extracelulară datorită inducerii sintezei de fibronectină și colagen .

Astfel, SRA este implicat direct în evoluția și progresul nefropatiilor diabetice, complicație comună și potențial letală a diabetului zaharat care poate fi controlată de inhibiția ECA .

Datorită faptului că implicarea SRA a fost demonstrată la nivelul tuturor evenimentelor cheie ale cascadei inflamatoare , este clar că inhibiția sintezei de ang II ar putea avea efecte antiinflamatoare benefice. Astfel, blocarea SRA va reduce leziunile vasculare inflamatorii prin blocarea NFB, reducând IL8 și MCP-1, va ajuta la stabilizarea plăcilor ateromatoase, în timp ce reducerea ICAM-1, VCAM-1, selectinei E și MCP la nivelul endoteliului aortic va avea efecte benefice asupra evoluției leziunilor locale aterosclerotice.

La nivel cardiac, blocarea SRA va reduce cantitatea de proteine inflamatoare din insuficiența cardiacă progresivă și va reduce nivelele de CRP și IL-6 la pacienții cu IMA (infarct miocard acut). Va reduce de asemenea riscul trombotic prin reducerea expresiei MCP-1 și MMP și, reducând conversia LDL la ox-LDL, va reduce peroxidarea lipidică.

Totuși, folosirea inhibitorilor de ECA este îngreunată de o multitudine de efecte adverse serioase. Cele mai frecvent întâlnite sunt cefaleea, tusea, edemul angioneurotic, reacțiile alergice. Tusea uscată este unul dintre cele mai comune efecte adverse menționate, datorită creșterii nivelelor de bradikinină în plămâni. De asemenea, un efect periculos potențial poate fi hiperpotasemia, datorată inhibiției secreției de aldosteron, care este angiotensin-dependentă .

Deoarece nivelele efectelor adverse datorate utilizării inhibitorilor ECA cresc la 15-35% după diverși autori , alte căi de inhibiție a SRA au fost încercate recent conducând la introducerea în utilizare a blocanților de receptori pentru Angiotensina (BRA).

2.2.4.2.1. Definiție

IECA inhibă competitiv enzima de conversie a angiotensinei (ECA) . ECA este o enzimă non-specifică implicată în metabolismul multor peptide mici, inclusiv conversia angiotensinei I (un octapeptid inactiv) în angiotensina II. Kimaza, o enzima care catalizează degradarea bradikininei și a altor peptide vasodilatatoare, este inhibată competitiv de IECA

2.2.4.2.2. Clasificarea IECA

IECA sunt clasificați în trei categorii, în funcție de gruparea care se leagă de atomul de zinc din molecula de ECA. Aceste grupări sunt: sulfhidril, carboxil și fosfat.

2.2.4.2.3. Mecanism de acțiune

IECA blochează competitiv conversia angiotensinei I în angiotensină II, reducând nivelele circulatorii și locale de angiotensină II. De asemenea, IECA reduc secreția de aldosteron și vasopresină, scad activitatea nervoasă simpatică și elimină efectele trofice ale angiotensinei II. IECA nu inhibă acțiunile angiotensinei II mediate pe calea activării receptorilor AT1 și AT2 și nu interacționează direct cu alți componenți ai SRA . În plus, IECA inhibă kimaza II și cresc nivelele de bradikinină, care stimulează receptorii B2, conducând la eliberarea de oxid nitric și prostaglandine vasoactive (prostaciclina și prostaglandina E 2) .

Inhibarea ECA plasmatică pare a fi mai puțin importantă în timpul administrării cronice. În același timp, inhibarea ECA în diferite țesuturi (vase, rinichi, cord) pare a fi mai importantă în determinarea efectelor farmacologice .

Deoarece mecanismul de acțiune al IECA este același, efectele lor sunt atribuite clasei din care fac parte. Există importante diferențe între afinitatea de legare a IECA în țesuturi și proprietățile farmacologice individuale ale fiecărui compus, ceea ce explică diferențele marcate ale concentrației tisulare și ale efectelor lor clinice. Diversele tipuri farmacologice disponibile de IECA au același efect asupra presiunii arteriale. Alegerea și doza utilizată se bazează pe tatonările efectuate pe bolnavi.

2.2.4.2.4. Efectele IECA

2.2.4.2.4.1. Efectele hemodinamice

IECA scad rezistența vasculară periferică, stimulează natriureza, dar determină mici modificări ale frecvenței cardiace. Aceste răspunsuri se datorează inhibării ECA locală și a formării de angiotensină II în organele țintă specifice, ca de exemplu peretele vascular.

Spre deosebire de alte vasodilatatoare, nu a fost observată tahicardia reflexă, posibil datorită efectului asupra sensibilității baroreceptorilor, stimulării vagale sau\și reducerii stimulării activității nervoase simpatice.

IECA reduc hipertrofia cardiacă la pacienții hipertensivi și reduc disfuncția endotelială la pacienții normotensivi cu afectarea arterelor coronare, diabet non-insulinodependent și insuficiență cardiacă . Îmbunătățirea funcției endoteliale este dată de atenuarea vasoconstricției și de creșterea producției de bradikinină, care stimulează producția de NO derivat din endoteliu.

La pacienții cu insuficiență cardiacă, IECA determină vasodilatație venoasă și arterială. Vasodilatația venoasă crește capacitanța venoasă și arterială. Vasodilatația venoasă creste capacitanța venoasă periferică, reduce presiunea arterială, presiunea pulmonară, presiunea capilară și volumul și presiunea ventriculară stângă, producând o scădere rapidă a congestiei pulmonare. Efectul vasodilatator arterial reduce rezistența periferică vasculară și crește debitul cardiac (Figura 10).

Figura 10 – Efectele IECA

IECA îmbunătățesc relaxarea și distensibilitatea cardiacă, imediat și pe termen lung, prin reducerea hipertrofiei și presiunii sangvine la hipertensivi.

2.2.4.2.4.2. Efectele neurohormonale

Tratamentul pe termen scurt cu IECA este acompaniat de o scădere a nivelelor de angiotensină II și aldosteron și o creștere a eliberării de renină și a nivelelor de angiotensină I . Deoarece angiotensina II crește stimularea simpatică periferică și centrală și eliberarea de catecolamine din medulara suprarenală, IECA reduc nivelele plasmatice de adrenalină, noradrenalină și vasopresină. În adiție, mărirea nivelelor de angiotensină I poate fi efectul creșterii producției de bradikinină , care exercită proprietăți vasodilatatorii, și a sintezei de de angiotensină II pe căile non-ECA (de exemplu chimaza) .

În timpul inhibării cronice a ECA, nivelele de angiotensină II și aldosteron tind să revină la valorile anterioare tratamentului prin activarea căilor alternative (fenomenul “de scăpare” al aldosteronului) . Secreția de aldosteron este menținută de alți stimuli steroidogenici, precum hiperpotasemia, hipermagnezemia și hormonul adrenocorticotrop . Pe de altă parte, IECA cresc nivelul kininelor, prostaciclinei și NO, care pot, în parte, explica efectele vasodilatatoare, antitrombotice și antiproliferative.

2.2.4.2.4.3. Efectele antiproliferative

IECA exercită efecte antiproliferative (reducerea hipertrofiei vasculare și cardiace și proliferării matrixului extracelular) și reduc remodelarea ventriculară după infarctul miocardic . IECA reduc remodelarea ventriculară prin scăderea pre/postsarcinii, previn efectele antiproliferative ale angiotensinei II și activitatea nervoasă simpatică și prin inhibarea hipertrofiei cardiace induse de aldosteron și fibrozei interstițiale și perivasculare. În cordul hipertrofic, IECA scad hipertrofia cardiacă și îmbunătățesc funcția diastolică. De asemenea, previn apoptoza cardiomiocitelor.

2.2.4.2.4.4. Efectele renale

IECA scad rezistența vasculară renală și cresc fluxul plasmatic renal și excreția de sodiu și apa. Rata filtrării glomerulare rămâne neschimbată sau e ușor modificată, fracția filtrată scăzând. Apare dilatarea arteriolei eferente postglomerulare care, este mai intensă decât a arteliolei aferente, ceea ce conduce la reducerea presiunii hidrostatice în capilarele glomerulare și a ratei de filtrare glomerulară .

Natriureza îmbunătățește hemodinamica renală, scade eliberarea de aldosteron și bradikinină, care exercită efecte tubulare directe și inhibă direct efectele angiotensinei II.

IECA previn progresia microalbuminuriei spre proteinurie , atenuează progresia insuficienței renale la pacienții cu o varietate de nefropatii non-diabetice și previn sau scad progresia nefropatiei la pacienții cu diabet non-insulinodependent .

2.2.4.2.4.5. Efectele asupra balanței fibrinolitice

IECA modulează balanța fibrinolitică vasculară prin scăderea angiotensinei II – un stimul potent pentru inhibarea sintezei activatorului plasminogenului de tip 1 (PAI-1) și crește nivelele bradikininei- un stimul puternic pentru activatorul plasminogenului tisular. IECA scad concentrația inhibitorului activării plasminogenului tip 1 (PAI-1).

De asemenea, IECA contracarează agregarea plachetară indusă de angiotensina II, crescând producția de NO și prostaciclină.

2.2.4.2.4.6. Alte efecte

SRA joacă un rol important în patogeneza și progresia aterosclerozei . Pe modelele animale, IECA pot încetini dezvoltarea aterosclerozei . Aceste proprietăți antiaterogene se datorează inhibării formării angiotensinei II și capacității bradikininei de a crește eliberarea de NO. Apare o scădere a migrării și proliferării celulelor musculare netede vasculare, scade acumularea și activarea celulelor inflamatorii, scade stresul oxidativ și este îmbunătățită funcția endotelială.

S-a demonstrat ca IECA reduc cu 20-25% riscul anginei instabile și recurența infarctului miocardic la pacienții cu disfuncție ventriculară stângă sau insuficiența cardiacă congestivă.

Ramiprilul scade morbiditatea și mortalitatea la pacientii cu risc crescut de evenimente cardiovasculare aterotrombotice. Studiul care a evaluat ecografic modificările carotidiene la pacienții tratati cu ramipril și vitamina E a arătat că, tratamentul pe termen lung cu IECA încetinește progresia aterosclerozei carotidiene la pacienții cu afecțiuni vasculare sau diabetici, dar fără insuficiență cardiacă sau disfuncție ventriculară stângă .

2.3. Importanța peptidelor angiotensinice în reactivitatea mușchiului neted

Angiotensinele bioactive apar ca urmare a unei cascade enzimatice angiotensin-formatoare, care transformă angiotensinogenul (2-proteină plasmatică, sintetizată în principal în ficat), sub acțiunea reninei, o aspartilprotează acidă, în greutate de 40 kDa, de origine mezangială renală (circulantă) și extrarenală (de stocaj sau tisulară), în angiotensină I. Angiotensina I (1-10) este un nonapeptid, care nu este activ per se, ci numai ca precursor al altor fragmente. Această peptidă este supusă acțiunii unor enzime denumite generic ENZIME DE CONVERSIE. Acestea sunt metalozincproteaze cu două izoforme: ECA1 și ECA2 (Allen și col., 2000). ECA1 este o dipeptidilcarboxipeptidază cu localizare predominant membranară (endotelii, epitelii, neuroni), solubilă 5 – 10% în plasmă, LCR și urină și prezentă în numeroase țesuturi și organe (plămâni, vase, cord, rinichi, creier, ficat etc.) . Acțiunea sa este nespecifică în sensul că realizează clivarea dipeptidelor terminale atât ale ang I, cât și a altor peptide bioactive, precum bradikinina, substanța P, enkefalinele, dinorfina și neurotensina. Este inhibată de captopril și derivații acestuia. Ang II (1-8) este principalul peptid bioactiv, formată din ang I de ECA (80% în plămâni) și chimaza cardiacă. Acțiunile se realizează prin intermediul receptorilor membranari de tip AT1 și AT2. Receptori specifici sunt AT1 (blocați de losartan, candesartan), AT2 (blocați de PD123319), AT1-7 (blocați de A779), AT4 (blocați de divalinal-ang IV).

Implicațiile fiziologice ale sistemului renină angiotensină sunt:

autoreglarea circulației

reglarea dipsogenezei și balanței hidroelectrolitice

modelarea și remodelarea cardiovasculară

Sistemul renină-angiotensină este, de asemenea, implicat în nenumărate fenomene fiziopatologice precum patogeneza bolilor cardiovasculare, HTA, bolilor renale, disgravidie, etc. și are, de asemenea, o multitudine de implicații farmacoterapeutice – utilizarea inhibitorilor ECA și blocanților de receptori AT1 în HTA și insuficiența cardiacă congestivă, noi posibilități terapeutice în insuficiența cardiacă și hipertensiunea arterială cu inhibitori de angiotensinaze nespecifice.

I. Reconsiderări și întregiri ale conceptului clasic de SRA

Cascada enzimatică angiotensin-formatoare

Renina

aspartilprotează acidă, 40 kDa

origine renală (circulantă) și extrarenală (de stocaj sau tisulară)

Izorenina tisulară (enzimă renin-like)

Tonina

citozolică – serinprotează

glanda submaxilară, cord, creier (talamus, astrocite)

transformă angiotensinogenul direct în angiotensină II

contribuie la acțiunile centrale ale angiotensinei II

activarea ei crește presiunea sanguină și balanța hidro-salină

Catepsina D

serinprotează lizozomală

prezentă în cord, musculatura netedă și țesut adipos

stimulează creșterea miocitelor

implicată în adipogeneză și tumorigeneză

Catepsinele E (A, B)

participă la biosinteza angiotensinei I și angiotensinei (1-9) și la hidroliza substanței P și neurokininei

Enzimele de conversie

metalozincproteaze cu două izoforme: ECA1 și ECA2

ECA1:

dipeptidilcarboxipeptidaza

localizare predominant membranară (endotelii, epitelii, neuroni)

solubilă 5 – 10% în plasmă, LCR și urină

prezentă în numeroase țesuturi și organe (plămâni, vase, cord, rinichi, creier, ficat, etc.)

acțiune nespecifică – clivează dipeptidele terminale ale ang I, bradikininei, substanței P, enkefalinelor, dinorfinei și neurotensinei

ECA2:

carboxipeptidază identică cu ECA1 – 42%

prezentă în cord, rinichi, testicul, ficat, intestin, etc.

realizează hidroliza unui singur aminoacid (leucina) dând angiotensină (1-9) ca intermediar și precursor de angiotensină (1-7)

nu este inhibată de captopril (crește angiotensina (1-7) de 25 ori)

clivează și des-Asp-bradikinina (nu bradikinina)

Chimazele

serinproteaze stocate în granulele secretorii ale mastocitelor

Chimaza α – umană:

în mastocite din cord, celule endoteliale și mezenchimale cardiace (ventriculi)

clivează ca și ECA ultimii doi aminoacizi ai ang I la ang II

crescută în infarct, insuficiența cardiacă, miocardoscleroză

Chimaza β – șobolan

în mastocitele peritoneale

clivează angiotensina I în fragmente inactive

II. Angiotensinazele – peptidaze generatoare de peptide active și inactive ale angiotensinelor

Aminopeptidaze

A – îndepărtează primul aminoacid al ang I și ang II formând des-asp-ang I (2-10) și ang III

B – clivează aminoacidul următor – formează ang IV (3-8)

M – clivează primul aminoacid al ang I dând ang (2-10)

Dipeptidilaminopeptidaza

îndepărtează primii 2 aminoacizi ai ang II (3-8)

Endopeptidaze

folosesc ca substrat ang I în cazul N-EP (neprilisin) și ang II în cazul P-EP

formează ang (1-7) din ang (1-9) și ang II (1-8)

Carboxipeptidaze

fragmente inactive

formează ang (1-7)

Glu-AP, asp-AP, ala-AP

inactivări finale

fragmente inactive

Enzime tisulare

proteolitice inactivante (tripsină, chimotripsină, pepsină activate de Ca++)

III. Angiotensine bioactive

Ang I (1-10)

formată din angiotensinogen

activă numai prin produșii intermediari de metabolizare

Ang II (1-8)

formată din ang I de ECA (80% în plămâni) și chimaza cardiacă

acțiuni pe AT1 și AT2 (antagonice?)

nu este singurul peptid vasoactiv – noi fragmente active

Ang III (2-8)

formată din ang II și des-asp-ang I (2-10) sub influența AP-A

acțiuni presoare pe AT1 mai slabe ca ale ang II

Ang IV (3-8)

formată din ang III sub influența AP-B și D-AP

efecte vasculare slabe pe receptori AT4

crește fluxul sanguin local – angiogeneză

memorie, învățare

Ang (1-7)

formată din ang II și ang (1-9) sub influența P-EP și ECA2

efecte vasodilatatoare prin receptori specifici

eliberează NO, PGE și EDRF

inhibă efectele presoare ale ang II

antiproliferativ (hormon paracrin)

factor de contrareglare a SRA circulant și tisular

Receptori specifici

AT1 (blocați de losartan, candesartan)

AT2 (blocați de PD123319)

AT1-7 (blocați de A779)

AT4 (blocați de divalinal-ang IV)

IV. Cercetări personale

Prof. Haulică și colaboratorii au adus dovezi experimentale prioritare în favoarea existenței de receptori angiotensinici intracelulari la nivelul musculaturii netede vasculare. Studiind efectele administrării intracelulare de angiotensină II încorporată în lipozomi asupra contractilității inelelor de aortă dezendotelizată, autorii au constatat că atât blocarea receptorilor membranari AT1 cu dithiotreitol cât și distrugerea veziculelor coafate cu clatrină de către sucroză hiperosmolară determină inhibarea contracțiilor induse de angiotensină. Rezultatele obținute demonstrează prezența receptorilor angiotensinici intracelulari activați și internalizați de către angiotensină.

La rândul lor, cercetările colectivului nostru privind proprietățile vasodilatatoare ale angiotensinei (1-7) au evidențiat efectele bifazice ale acesteia în funcție de doză și rolul său modulator de contracarare atât a acțiunii vasoconstrictoare a angiotensinei II cât și a propriilor sale efecte.

V. Implicații

– fiziologice – autoreglarea circulației

– reglarea dipsogenezei și balanței hidroelectrolitice

– modelarea și remodelarea cardiovasculară

– fiziopatologice – patogeneza – bolilor cardiovasculare, HTA, bolilor renale, disgravidie etc.

– farmacoterapeutice – utilizarea inhibitorilor ECA și receptorilor AT1 în HTA și insuficiența cardiacă congestivă

– noi posibilități terapeutice în insuficiența cardiacă și hipertensiunea arterială cu inhibitori de angiotensinaze

– Ex.: – inhibitorii chimazei previn proliferarea vasculară

– inhibitorii endopeptidazelor îmbunătățesc remodelarea cardiacă

2.3.1. Efecte ale inhibitorilor de sinteză a COX asupra mușchiului neted visceral și vascular

Descoperirea izoformelor ciclooxigenazei (COX-1 și COX-2) a dus la conceptul că COX-1, enzimă constitutivă, tinde să aibă o funcție homeostatică, în timp ce COX-2 este o enzimă inductibilă în timpul inflamației și tinde să faciliteze răspunsul inflamator (Figura 11). Pe această bază au fost obținuți și introduși în terapeutică inhibitori selectivi de COX-2, în ideea că aceștia vor fi mai siguri decât inhibitorii neselectivi de COX-1, fără a-și pierde eficacitatea.

COX acționează asupra acidului arahidonic membranar prezent ca și constituent normal al membranei celulare și eliberează, printr-o cascadă de reacții intermediare, o serie de metaboliți lipidici cu nenumărate acțiuni biologice, care pot fi atât benefice cât și dăunătoare (algogene, pro-inflamatorii, vasoconstrictoare, promotoare ale peroxidării lipidice membranare etc.). O prezentare optimă a fost realizată de către părintele bio-assay-ului, laureatul premiului Nobel, John Vane.

Figura 11 – Relația între căile ducând la generarea de prostaglandine prin COX-1 sau COX-2

Descoperirea izoformelor ciclooxigenazei (COX-1 și COX-2) a dus la conceptul că COX-1, enzimă constitutivă, tinde să aibă o funcție homeostatică, în timp ce COX-2 este o enzimă inductibilă în timpul inflamației și tinde să faciliteze răspunsul inflamator.

Calea lipoxigenazei a metabolismului acidului arahidonic duce la leucotriene (LT) care au un puternic efect chemotactic asupra polimorfonuclearelor, neutrofilelor, eozinofilelor și a macrofagelor producând, de asemenea, bronhoconstricție și creșterea permeabilității vasculare.

La locul leziunii tisulare sunt eliberate kinine, neuropeptide, histamina, precum și componente ale complementului, citokine și alte produse ale leukotrienelor și plachetelor. Stimularea de la nivelul membranelor neutrofilului produce radicali liberi derivați ai oxigenului activat. Anionul superoxid este format astfel prin reducerea oxigenului molecular, ceea ce poate stimula producerea altor molecule reactive, cum ar fi peroxidul de hidrogen și radicali hidroxil. Interacțiunea acestor compuși cu acidul arahidonic are ca rezultat generarea de substanțe chemotactice, ceea ce duce la perpetuarea procesului inflamator.

Terapia analgezică modernă este dominată la ora actuală de cele două clase principale de medicamente analgezice și anume analgezice (opioide și neopiodie) și antiinflamatoarele nesteroidiene (AINS). În ceea ce privește substanțele analgezice-AINS, s-au dezvoltat o multitudine de noi variante sintetice îmbunătățite, la fel ca și o serie de căi de administrare optimizate, dar inovațiile conceptuale nu au fost pe deplin satisfăcătoare. Aceasta se datorează probabil unui avans relativ lent al înțelegerii patogenezei durerii inflamatorii.

AINS (antiinflamatoarele nesteroidiene) inhibă activitatea ciclooxigenazei, care convertește acidul arahidonic la diverși compuși de tipul prostaglandinelor și tromboxanilor. Aceasta enzimă se găsește în 2 izoforme: izoforma constitutivă, COX-1, și izoforma inductibilă, COX-2. Există 3 clase de inhibitori de COX: aspirina (acidul acetilsalicilic), AINS ne-selective (ex ibuprofen, indometacin), și inhibitori selectivi COX-2 (ex, celecoxib, rofecoxib, sau nimesulid).

Acid acetilsalicilic

– substanță cu următoarele acțiuni: analgezică, antipiretică, antiinflamatoare, antiagregantă plachetară, dependente de doză. Este un derivat de acid salicilic care blochează neselectiv familia de ciclooxigenaze. Este utilizată frecvent singură sau în asociere cu alte substanțe în tratamentul stărilor algice, stărilor febrile, tratamentul reumatismului articular, profilaxia trombozelor etc.

Ibuprofen

– substanță cu acțiune analgezică, antiinflamatoare, antipiretică, derivat de acid propionic, care blochează neselectiv familia de ciclooxigenaze. La doze mici este evident efectul analgezic, în timp ce efectul antiinflamator este mai puțin evident. Este utilizat în practică în afecțiunile reumatice, în combaterea febrei și a stărilor algice de diferite etiologii. Actualmente tinde să înlocuiască acidul acetlsalicilic.

Grupul oxicami: tenoxicam, meloxicam, piroxicam

Substanțe cu acțiune antiinflamatoare marcată, dar prezintă și efecte analgezice și antipiretice. De asemenea inhibă agregarea plachetară. Mecanismul are la bază inhibiția ciclooxigenazelor iar selectivitatea asupra acestora crește în grupă în ordinea: piroxicam, meloxicam, tenoxicam. Sunt utilizate în practică în tratamentul afecțiuni reumatice articulare (artroză, artrită reumatoidă etc.) și afecțiuni reumatice extraarticulare (tendinite, bursite, periartrite).

Inhibitorii selectivi pentru COX-2 sunt denumiți generic coxibi (celecoxib, etoricoxib, parecoxib, valdecoxib, rofecoxib). Împreună cu etodolac și meloxicam, formează grupul inhibitorilor selectivi COX-2, care, la doze terapeutice, inhibă puternic doar izoenzima COX-2 inductibilă, producând analgezie și având o mai bună toleranță gastrointestinală. Spre deosebire de AINS care inhibă COX-1, inhibitorii COX-2 nu au efect cardioprotector.

Nimesulid

– substanță cu acțiune analgezică antiinflamatoare, blocant selectiv sau specific al ciclooxigenazei 2 (COX-2).

Dintre substanțele de catalog și terapeutice disponibile pentru testare enumerăm: aspirina, azapropazon, celecoxib, dexketoprofen, diclofenac, diflunisal, etodolac, etoricoxib, fenbufen, fenoprofen, flurbiprofen, ibuprofen, indometacin, ketorolac, ketoprofen, acid mefenamic, meloxicam, nabumeton, naproxen, parecoxib, fenilbutazona, piroxicam, rofecoxib, salicilat, sulindac sulfid, tenoxicam, acid tiaprofenic, acid tolfenamic.

2.3.2. Interacțiuni la nivelul musculaturii netede viscerale și vasculare dintre inhibitorii ECA, blocanții de receptori AT1 și blocanții de sinteză a COX

Este cunoscut faptul că stresul oxidativ indus de administrarea angiotensinei II este în strânsă legătură cu procesele inflamatorii de la nivelul organismului . Astfel, administrarea unor blocanți de ciclooxigenaza II, cum ar fi nimesulid sau rofecoxib, determina o scădere a stresului oxidativ indus de angiotensina II, precum și o facilitare a proceselor comportamentale cognitive . Astăzi este acceptat că angiotensina II participă la răspunsul inflamator prin producerea de chemokine, citokine și molecule de adeziune care contribuie la migrarea celulelor inflamatorii către țesutul lezat. Se pare că și angiotensina III, ca produs de degradare al angiotensinei II, păstrează aceste caracteristici chemotactice și legate de producerea de chemokine și factori de creștere. De altfel, unii autori nu ezită să numească angiotensina II o adevărată citokină .

Aspirina este un puternic agent antioxidant, care a redus cu mare eficiență producerea de SRO din țesutul cardiovascular, previne sau atenuează hipertensiunea, restaurează vasorelaxarea lezată la șobolanii cu hipertensiune arterială spontană și a prevenit stresul oxidativ, hipertensiunea și hipertrofia musculaturii netede indusă de angiotensina II.

Efectele antioxidante ale inhibitorilor mai noi de COX, mai ales cei selectivi pentru COX-2 nu au fost suficient de bine investigate, și nici nu se știe la ora actuală dacă aceste efecte pot fi observate și pe alți mușchi netezi, precum ar fi cei digestivi sau urinari.

Date recente sugerează că Ang II este un important mediator inflamator, care crește expresia COX-2 în celulele musculare netede în cultură și activează NF-B în țesuturile renale și cardiovasculare.

A fost demonstrată implicarea SRA în toate evenimentele cheie a cascadei inflamatoare , fiind bine cunoscut că inhibiția sintezei de Ang are efecte benefice antiinflamatoare. Astfel blocarea SRA va reduce leziunile inflamatoare vasculare prin blocarea NFB, reducând IL-8 și MCP-1 va ajuta la stabilizarea plăcii ateromatoase, în timp ce reducerea ICAM-1, VCAM-1, selectin E și MCP la nivelul endoteliului aortic are un efect benefic în evoluția aterosclerotică a leziunilor locale.

La nivel cardiac, blocarea SRA va reduce cantitățile de proteine inflamatoare în sincopa progresivă, va reduce nivelele de proteină C reactivă (PCR) și IL-6 la pacienții cu infarct miocardic acut (IMA). De asemenea va reduce riscul trombotic prin reducerea expresiei de MCP-1 (chemoatractant monocitic) și MMP (matrix metaloproteinază) și reducând conversia LDL la oxLDL, va reduce peroxidarea lipidică.

Totuși, o serie de date indică faptul că numai blocarea comună a ambilor receptori AT1 și AT2 determină reducerea efectelor proinflamatorii.

O serie de rezultate experimentale anterioare au demonstrat că o mare parte din efectele vasoconstrictoare ale angiotensinei al nivel vascular se realizează prin intermediul unei cascade de mediatori intracelulari, din care o proporție importantă este reprezentată de speciile radicalare ale oxigenului (superoxid, peroxid de hidrogen etc.).

Ca urmare, se intenționează investigarea interacțiunilor între AINS, angiotensină și o serie de molecule captatoare (scavenger) de radicali liberi ai oxigenului, precum amifostina și N-acetil-cisteina. Experimentele vor fi realizate și în prezența de L-NAME (L-NitroArgininMetilEster), un inhibitor specific al sintezei de NO endotelial, principalul mediator vasodilatator la nivel arterial.

Calea ciclooxigenazei (COX) din metabolismul acidului arahidonic produce prostaglandine (PG) care au variate efecte asupra vaselor sanguine, terminațiilor nervoase și a celulelor implicate în inflamație.

Interacțiuni între metabolismul acidului arahidonic si SRA

Se cunoaște faptul că activarea receptorilor AT 1 creste sinteza de prostanoizi la nivelul celulelor musculare netede, ceea ce contribuie la unele din răspunsurile celulare mediate de Ang II . Rezultate recente indică faptul că ateroscleroza are o puternică componentă inflamatoare, mediată prin prostaglandine (PG) care servesc ca autacoizi. Pentru sinteza de PG, enzima rată – limitantă este COX care catalizează conversia de la acid arahidonic (AA) la PGG 2 și apoi la PGH 2. Se știe că Ang II induce expresia de COX-2 în mușchii netezi .

Generarea de prostanoizi, prin intermediul activării COX-1 și/ sau COX-2, este responsabilă pentru o multitudine de efecte fiziologice si patologice. La nivelul aortei de șobolan Ang II induce transcripția de COX -2 prin implicarea NFB și medierea mai multor kinaze citoplasmice ce includ Pyk 2, MEKK 4, si p38 . Astfel, Ang II a fost implicată în reglarea COX-2 și în activarea mai multor procese patologice mediate prin intermediul COX-2 .

Din date foarte recente se știe că enzima COX-2 se exprimă în celulele musculare netede din aorta de șoarece și este unul dintre factorii esențiali în apariția anevrismelor aortei . S-a demonstrat că incidența și severitatea anevrismului aortic abdominal (AAA) indus la șoarece prin infuzie continuă de Ang II a fost redusă prin administrarea de inhibitor selectiv de COX-2 de tip celecoxib sau prin inactivarea genetică a COX-2 .

Un alt studiu recent a demonstrat că modificările musculaturii netede vasculare induse de Ang II au fost prevenite de administrarea de blocanți selectivi de COX-1 și de antagonizarea receptorilor tromboxanici, ceea ce indică faptul ca leziunile vasculare angiotensin-dependente sunt mediate de prostaciclina sintetizată de COX-1.

Se cunoaște faptul că ang II produce contracția musculaturii netede. Efectul contractil este inhibat de pre-tratarea cu NS 398 (un inhibitor specific de COX -2) dar nu și cu SC 560 (un inhibitor selectiv de COX -1) ceea ce era suficient să explice teoria că contracția angiotensinica este de origine prostaciclinică, produsă de COX-2 musculară și nu de origine endotelială .

Stimularea receptorului AT 1 produce eliberarea de acid arahidonic liber în citoplasma celulelor epiteliului tubular , în endoteliul vascular , și mușchiul neted prin stimularea fosfolipazei A2. Acidul arahidonic este un substrat pentru o multitudine de enzime citosolice ce generează substanțe musculotrope și mediatori vasoactivi. S-a dovedit că ang II crește producerea de prostaglandine în rinichi și că acești agenți inhibă răspunsurile vasoconstrictoare la angiotensină în rinichi. Agenții vasodilatatori includ PGE 2 și PGI, ce sunt eliberați de glomeruli pentru a atenua vasoconstricția arteriolei eferente . Tromboxanul A2 (TxA 2) este un eicosanoid vasoconstrictor ce se sintetizează în rinichi ca răspuns la Ang II .

Astfel, activarea fosfolipazei A2 (PLA 2) de către Ang II ar putea stimula mușchiul neted, mai ales cel vascular, să producă vasoconstrictori în vreme ce în același timp activează celulele de vecinătate pentru a sintetiza vasodilatatori care sa se opună vasoconstricției. Ca urmare a acestei duble potențialitati a ang II, de a stimula sinteza atât de vasoconstrictori cât și de vasodilatatori, orice tentative de a analiza în profunzime căile acidului arahidonic va duce în mod necesar la rezultate ambigui. Mai mult, există posibilitatea distinctă de a obține rezultate diametral opuse în vivo si în vitro, atunci când se încearcă blocarea anumitor căi ale acidului arahidonic. Pe celule izolate efectele ar putea merge într-o anumită direcție, în vreme ce pe preparatele de organ întreg interacțiunile intercelulare ar putea orienta efectele blocării căilor în cu totul altă direcție.

S-a demonstrat, de ceva vreme, că inhibiția tromboxan-sintazei cu furegrelat (U 63557 A) a redus contracția musculară netedă indusă de Ang II. . S-a speculat, la acel moment, că acest efect s-ar datora redirecționării fondului de acid arahidonic de la sinteza de tromboxan către sinteza de alți metaboliți, cu efecte vasoconstrictoare. Și alte experimente pe rinichi izolat și perfuzat au dovedit că vasoconstricția intrarenală produsă de endotelina 1 este sensibilă la blocarea COX, în vreme ce peste 80% din vasoconstricția indusă de Ang II apare prin sinteza de produși ai căilor lipooxigenazei și ciclooxigenazei .

Pe arteriole aferente si eferente izolate si perfuzate de iepure, reactivitatea la Ang II a fost stimulată de blocarea nespecifică a COX cu indometacin. Pe de altă parte, alti experimentatori au găsit că administrarea de indometacin sau blocarea combinată a lipoxigenazei sau a COX a inhibat în mod semnificativ contracția indusă de Ang II. Când s-a inhibat sinteza de tromboxan, sau când s-a administrat un blocant al receptorului de TxA 2, contracția de Ang II a fost inhibată semnificativ, ceea ce duce la concluzia că tromboxanii sunt cei mai predominanți mediatori ai contractiei angiotensinice la nivelul mușchiului neted.

În plus, administrarea endoluminală în microvase a avut același efect ca și cea extraluminală, ceea ce sugerează că originea endotelială a Tx este perfect posibilă.

3. contribuții personale

3.1. Investigarea reactivității musculaturii netede – noțiuni tehnice

3.1.1. Material biologic

3.1.1.1. Artere de conductanță

Experimentele s-au efectuat pe artere izolate de conductanță (aortă toracică) și artere de rezistență (arteră renală, artera carotidă) de la șobolani Wistar (180-250 g) menținuți în condiții normale de laborator.

După sacrificare și exsanguinare, aorta toracică descendentă a fost disecată, curățată de țesutul conjunctiv și secționată în inele de 3-4 mm. Inelele de aortă intacte sau cu endoteliul îndepărtat prin răzuire blândă cu hârtie de filtru, au fost montate în băi de organe de 4 ml cu ser Krebs-Henseleit barbotat cu O2-95% și CO2-5% la 37o C. Preparatele au fost echilibrate la o tensiune de 1 gr. timp de 60 minute. După echilibrare inelele aortice au fost precontractate cu fenilefrină (10-7-10-6 M) și K+ (40-70 mM), iar integritatea endoteliului a fost testată prin administrarea de carbachol (10-6-10-5 M) ca eliberator endotelial de NO vasorelaxant .

Pentru înregistrarea contracțiilor musculaturii netede vasculare s-au utilizat traductoare de forță (izometrice) cuplate la un sistem computerizat de achiziție. Pentru a se evita tahifilactizarea preparatelor, administrarea angiotensinei a fost repetată la intervale mai mari de 90 minute, între care s-au efectuat spălări repetate.

Rezultatele au fost interpretate sub formă de curbe individuale, tabele și grafice procentuale.

Modificările contractilității mușchiului neted vascular au fost interpretate din punct de vedere statistic prin calcularea variațiilor procentuale a mediilor și erorilor standard prin utilizarea testelor „t” și ANOVA.

Reactivitatea inelelor arteriale a fost măsurată atât în termeni de forță absolută, măsurată ca indice de forță (forța în mN dezvoltată de preparat raportată la greutatea acesteia în mg) cât și ca reacție relativă, față de un martor standardizat. De asemenea, acolo unde a fost posibil (în funcție de disponibilitatea preparatelor), s-au efectuat curbele doză/efect ce au implicat majoritatea substanțelor vasorelaxante și vasoconstrictoare cunoscute și bine caracterizate farmacologic.

Studiul comparativ a fost făcut pe artere similare din punct de vedere a dimensiunilor, care să facă parte din segmentul de rezistență, în speță ramuri din artera coronară gastrică sau mezenterica superioară, care au avut dimensiuni similare: lungime maximă: 2 mm, = 1 mm, greutate 10-15 mg. Cuantificarea forței de contracție a fost realizată în N/mg greutate umedă.

După disecție, vasele au fost exsanguinate, spălate în soluție de ser fiziologic, secționate în fragmente de 5-10 cm și apoi au fost plasate în ser Krebs-Henseleit (preparat conform formulei) și transportate în timp maxim, 30 minute la locul experimentului .

Reactivitatea preparatului a fost testată cu fenilefrină (10-5 M), KCl (40-80 mM) sau PGF2-10-5 M.

Efectul miorelaxant al substanțelor luate în studiu a fost exprimat ca procent din platoul inițial de contracție determinat de substanța de control.

Achiziția datelor s-a realizat utilizând un traductor analog-digital (National Instruments NiDaq 12DD713, USA) și un ansamblu de traductori orizontali cu baie termostatată de 4 ml, model Experimetria EXP-CLSG.

Tehnicile folosite pentru realizarea preparatului, pentru testarea calităților sale din punct de vedere al activității contractile și pentru selecția preparatelor corespunzătoare în vederea aplicării protocoalelor experimentale propriu-zise sunt în conformitate cu exigențele prezentate în lucrări clasice din literatura de specialitate .

3.1.1.2. Experimente pe esofag de șobolan

Experimentele s-au efectuat pe esofag de la șobolani Wistar (180-250 g) menținuți în condiții normale de laborator.

După sacrificare și exsanguinare animalului de experiență, esofagul a fost disecat și secționat în inele de 3-4 mm. Inelele de esofag au fost montate în băi de organe de 5 ml cu ser Krebs-Henseleit barbotat cu O2-95% și CO2-5% la 37o C. Preparatele au fost echilibrate la o tensiune de 1 gr. timp de 60 minute. După echilibrare inelele de esofag au fost precontractate cu carbacol (10-6 M) pentru testarea reactivității.

Pentru determinarea contracțiilor a fost utilizată stimularea în câmp electric (SCE). Pentru înregistrarea contracțiilor musculaturii netede s-au utilizat traductoare de forță (izometrice) cuplate la un sistem computerizat de achiziție.

Rezultatele au fost interpretate sub formă de curbe individuale, tabele și grafice procentuale.

Modificările contractilității mușchiului neted vascular au fost interpretate din punct de vedere statistic prin calcularea variațiilor procentuale a mediilor și erorilor standard medii prin utilizarea testelor „t” și ANOVA.

Reactivitatea inelelor esofagiene a fost măsurată atât în termeni de forță absolută, măsurată ca indice de forță (forța în mN dezvoltată de preparat raportată la greutatea acesteia în mg) cât și ca reacție relativă, față de un martor standardizat. De asemenea, acolo unde a fost posibil (în funcție de disponibilitatea preparatelor), s-au efectuat curbele doză/efect ce au implicat majoritatea substanțelor relaxante și constrictoare cunoscute și bine caracterizate farmacologic.

Studiul comparativ a fost făcut pe preparate similare din punct de vedere a dimensiunilor. Cuantificarea forței de contracție a fost realizată în N/mg greutate umedă.

3.1.1.3. Experimente pe ileon de șobolan

În experiment au fost utilizate inele de ileon de șobolan, cu o lungime de 2 – 3 mm și un diametru mediu de 2 mm.

Reactivitatea preparatului a fost testată cu carbacol (10-6 M).

Efectul miorelaxant al substanțelor luate în studiu a fost exprimat ca procent din platoul inițial de contracție determinat de substanța de control.

Achiziția datelor s-a realizat utilizând un traductor analog-digital (National Instruments NiDaq 12DD713, USA) și un ansamblu de traductori orizontali cu baie termostatată de 5 ml, model Experimetria EXP-CLSG.

Tehnicile folosite pentru realizarea preparatului, pentru testarea calităților sale din punct de vedere al activității contractile și pentru selecția preparatelor corespunzătoare în vederea aplicării protocoalelor experimentale propriu-zise sunt în conformitate cu exigențele prezentate în lucrări clasice din literatura de specialitate .

3.1.2. Tehnica de lucru folosind stimularea în câmp electric (SCE)

Stimularea electrică are ca mecanism esențial depolarizarea terminațiilor nervoase prezente la nivelul vasului luat în studiu. Cele mai multe dintre materialele din literatură consideră că apariția contracției SCE se datorează mai degrabă stimulării terminațiilor nervoase simpatice de la nivelul adventicei vasculare decât unor răspunsuri pur miogenice nespecifice . Diferențierea între răspunsurile adrenergice și miogenice se face prin administrarea de tetrodotoxină (blocant al canalelor de Na voltaj-dependente, care ar trebui să abolească răspunsurile pur „electrogene” sau de prazosin, blocant al receptorilor -adrenergici. Cu toate acestea, deși în literatură apar menționări ale aortei de șoarece ca fiind responsivă la SCE (stimularea în câmp electric), în cazul șobolanilor Wistar folosiți în cadrul experimentărilor noastre nu s-a putut obține un răspuns aortic adrenergic sau electrogen, lucru care a fost menționat într-o lucrare dedicată trimisă spre publicare într-un jurnal de specialitate. Spre deosebire de aortă, vasele de rezistență de la aceiași șobolani (mezenterică și renală de ordinul I sau II) au demonstrat o responsivitate deosebită la stimularea SCE, realizându-se curbe de frecvență/răspuns foarte sugestive .

Răspunsurile contractile izometrice induse de SCE au fost măsurate utilizând aceiași traductori izometrici de forță de la Experimetria (Experimetria, Budapesta, Hungary). SCE au fost produse utilizând un stimulator EXP-MCU (Experimetria, Budapesta, Hungary).

S-au utilizat unde de puls bifazice și monofazice de 10 V și durata pulsului de 0,5 ms timp de 5 secunde în intervalul de frecvențe de la 4 la 20 Hz cu pasul de 4 Hz.

După echilibrare s-a trasat o curbă frecvență-răspuns (CRF). Fiecare administrare a utilizat CRF inițial ca martor pentru efect.

Rezultatele au fost prezentate ca grafice, tabele și desene iar datele au fost evaluate statistic folosind testul „t” (Student) și ANOVA pentru două populații.

Figura 12 – SCE – arteră renală de șobolan, Frecvență 4, 8, 12, 16, 20 Hz, Durata pulsului – 0,5 msec, Timpul de stimulare – 5 sec

3.1.3. Tehnica de lucru folosind sistemul de organ izolat cu traductori izometrici

Miograful orizontal (Error: Reference source not found, Error: Reference source not found) de construcție specială; tip Mulvany-Halpern , cu fălci (Experimetria, HU), este necesar pentru monitorizarea forței de contracție în condiții izometrice în cazul preparatelor arteriale cu diametru submilimetric, deoarece permite montarea sub lupă binoculară, precum și tensionarea uniformă a segmentului vascular tubular. Modelele alternative pentru studiul arterelor de rezistență și arteriolelor izolate sunt reprezentate de diverse variante tehnice ale fragmentului tubular montat pe micropipete de sticlă. Pe asemenea preparate se poate urmări activitatea contractilă sub forma modificărilor de calibru în condiții izobare; se monitorizează prin tehnici de videomicroscopie computerizată modificările de diametru ale segmentului vascular presurizat, cu sau fără perfuzie luminală sau superfuzie. O altă variantă este înregistrarea debitului în cazul preparatului perfuzat la presiune constantă. Ca și în cazul patului vascular, se poate perfuza segmentul arterial cu debit constant, fiind astfel posibilă monitorizarea indirectă a variațiilor de calibru cu un traductor de presiune.

Cele trei modele reflectă acceptabil din punct de vedere mecanic comportamentul vaselor respective în vivo, deoarece permit și urmăresc variații de calibru. Datorită progreselor legate de imagistica microscopică s-au evidențiat diverse avantaje ale înregistrării directe ale variațiilor de calibru vascular, această variantă tehnică fiind mai frecvent utilizată în ultimii ani. Pe de altă parte inelul microvascular în condiții izometrice (miograf orizontal) este utilizat în cadrul unui ansamblu mult mai simplu decât celelalte variante menționate.

3.1.4. Montarea și tensionarea preparatului

Inelul arterial este mai întâi introdus pe un fir metalic prins între fălcile miografului, cu un capăt liber și celălalt ancorat cu șurubul corespunzător. Apoi se ancorează și al doilea capăt și se introduce al doilea fir, care se ancorează la rândul lui. Preparatul este tensionat treptat, până la o valoare a forței pasive de cca. 1g, corespunzătoare tensiunii parietale optime, conform cu caracterele morfometrice și cu valoarea presiunii arteriale la acest nivel .

3.1.5. Soluția salină, administrarea și îndepărtarea substanțelor

Toate substanțele folosite au fost de puritate corespunzătoare, provenind de la producători specializați. Fragmentele tubulare vasculare, excizate prin metoda descrisă, au fost imediat plasate în soluție salină fiziologică (SSF) de tip Krebs-Henseleit, la 4ºC, cu următoarea compoziție (mM):NaCl 119; KCl 4,7; CaCl2 2,5; MgSO4 1,2; NaHCO3 25; KH2PO4 1,18; glucoză 5,5. Sărurile și glucoza utilizate pentru prepararea SSF au fost din categoria pentru analiză. In baia de organ preparatele au fost menținute permanent în SSF barbotată cu un amestec de 95%O2 și 5% CO2, la 37ºC. În aceste condiții tamponul bicarbonat asigură un pH de 7,2 – 7,4. Toate substanțele bioactive utilizate au fost din categoria pentru cercetare (Sigma, US) și au fost administrate direct în baia de organ (volum util 5 ml) sub formă de volume mici de soluții stoc; 50 μl; diluție 1:100. Următoarea intervenție (spălare sau o altă administrare) s-a practicat numai după ce forța a înregistrat un platou pe o durată de 5 min. În unele cazuri s-a realizat creșterea treptată a concentrației substanței bioactive testate, prin administrarea succesivă de volume identice (50 μl) de soluție stoc cu concentrații crescute cu câte un ordin de mărime (mol/l), dar nu mai mult de 250 μl în total. Spălarea s-a efectuat prin aspirarea din baie a volumului preexistent de SSF, urmată de adăugarea unui volum similar de SSF proaspătă.

Figura 13 – Sistemul de achiziție, stimulare în câmp electric și baia orizontală de organ

3.1.6. Echilibrarea și testarea preparatului

Este absolut necesară aplicarea unor protocoale standard de pretensionare, echilibrare și testare a reactivității. Tensionarea preparatului se realizează treptat, asigurându-se valoarea tensiunii parietale corespunzătoare condițiilor fiziologice în vivo. Preparatul este echilibrat pentru 60’, cu înlocuirea soluției la fiecare 15’. Calitatea preparatului este verificată printr-un protocol de control , care constă din trei stimulări cu noradrenalină 10-6 M în soluție depolarizantă (K+ crescut). Contracțiile respective permit evaluarea reactivității preparatului precum și a reproductibilității rezultatelor.

3.1.7. Protocol de lucru și aparatură pentru miograful izometric vertical

Fragmentele de arteră au fost fixate prin intermediul unei serfine metalice pe fundul băilor de organ izolat, inelul tensionându-se prin intermediul vernierelor mărcilor tensiometrice la o tensiune inițială de 100 mN.

Atunci când caracteristicile experimentale au cerut-o, endoteliul vascular a fost îndepărtat prin frecare blândă cu hârtie de filtru umedă. Prezența endoteliului vascular funcțional a fost verificată farmacologic (folosind carbacol) și prin microscopie directă.

Figura 14 – Băile de organ termostatate și serfinele de fixare ale preparatelor

Inelele de arteră au fost montate în băi de organ conținând 4 ml de ser fiziologic Krebs-Henseleit (compoziție (mM): NaCl 118; KCl 4.7; CaCl2 2.52; MgSO4 1.64; NaHCO3 24.88; KH2PO4 1.18; glucoză 5.55), termostatate la 37°C și barbotate cu carbogen (amestec de oxigen 95% și CO2 5%) (Figura 14).

Pentru înregistrarea contracțiilor musculaturii netede vasculare s-au folosit traductori izometrici de forță conectați la un sistem computerizat de achiziție a datelor (Figura 15).

Preparatele au fost lăsate la echilibrat timp de 60-90 minute, sub o tensiune de repaos de 100 mN.

Inele de arteră au fost apoi precontractate cu fenilefrină (10-7 – 10-6)M și K+ (40-70 mM) și tratate cu carbachol (10-6M) pentru eliberarea de NO endotelial. Magnitudinea absolută a contracțiilor a fost de 175 25 mN pentru fenilefrină (10-6 M) și K+ (40-70 mM).

Figura 15 – Ansamblul traductori-termostat folosit în instalația experimentală pentru organ izolat

3.1.8. Model experimental de stabilire a indicelui de forță

Testarea agenților activi pe musculatura netedă vasculară s-a făcut în funcție de mecanismele vasoactive implicate, pe preparate pregătite după cum urmează:

S-au încercat mai multe variante de normalizare pentru compararea forței izometrice maximale dezvoltate de musculatura netedă din diverse localizări și stadii de maturare. Datorită faptului că nu toate aceste proceduri s-au bazat pe principii destul de riguroase, au apărut numeroase confuzii care au făcut să nu existe o formulă-tip pentru aprecierea contractilității musculare netede.

Pentru a se obține un indice mai puțin ambiguu al producerii forței, am măsurat în vitro producerea de forță folosind inele de artere recoltate din aceleași zone, curățate foarte riguros de adventice și țesuturile înconjurătoare și am raportat generarea de forță, măsurată în mN, la greutatea umedă (wet-weight), a preparatului.

Formula de lucru a fost:

Ic = Fgen/ Gu

unde Fgen – forța generată în mN

Gu – greutatea umedă a preparatului măsurată înainte de experiment

În condițiile noastre experimentale, greutatea umedă a preparatelor a fost menținută la 5±1 mg, iar forța dezvoltată de preparate a variat între 20 și 45 mN, în funcție de specia animală de la care a fost prelevat preparatul.

Inelul a fost fixat de un știft de oțel inoxidabil pe fundul băii și conectat prin intermediul unui fir de nichelină de 10 cm la un sistem de mărci tensiometrice cu traductori izometrici.

Acesta este un sistem alcătuit dintr-un traductor de forță-deplasare, o unitate electronică de control, o interfață analog-digital și un sistem computerizat cu software dedicat ce permite achiziția și analiza datelor.

Complianța totală a sistemului pârghie-mărci este de 0,2 m/mN, cu o masă totală echivalentă în mișcare care este de 0,2g, cu o rezoluție de timp de 2 ms.

Complianța totală medie din ansamblul experimental a fost de 5m/mN (mai ales datorită firului de nichelină), o valoare care nu a afectat în mod considerabil variabilele investigate.

Rezoluția traductorului a fost de 0,1 mM pentru înregistrarea forței. Unitatea de control a permis aplicarea unei presarcini pe mușchi de la un minim de CmM până la un maxim de 40 mN în pași de 0,1mN.

Semnalul de voltaj de la traductor a fost convertit într-un semnal digital de către o placă de achiziție de tip Industrial Acquisition (Taiwan), cu o frecvență de eșantionare maximă de la 1 la 10 Hz.

Achiziția de date a fost realizată la o frecvență de eșantionare de 1Hz, suficientă pentru crearea unei rezoluții eficiente a tranzițiilor izometrice.

3.1.9. Substanțe farmacologic active folosite pentru aprecierea contractilității:

Substanțe contractile în cazul preparatelor arteriale:

Fenilefrina

KCl

Angiotensina II

Substanțe contractile în cazul preparatelor din tubul digestiv:

– Carbacol

Substanțe relaxante în cazul preparatelor arteriale:

– Carbacol

3.1.10. Animale de experiență utilizate

Pentru toate experimentele au fost utilizați șobolani Wistar masculi adulți, cu greutate de 180-220 g. Animalele au fost găzduite în cuști individuale, la o temperatură de 21 ± 2ºC, ciclu nictemeral de 12-12 ore, cu hrană și apă la discreție. Toate animalele au fost menținute în condiții similare de mediu și alimentație. Sacrificarea a fost efectuată întotdeauna prin simplă decapitare, fără vreo intervenție farmacologică asupra animalului viu sau sacrificat. Asupra fiecărui preparat a fost aplicat câte un singur protocol experimental unitar. Acesta a fost diferit pentru fiecare din specimenele de preparat vascular obținute de la același animal. Ca urmare numărul de experimente din fiecare serie (n=6), reprezintă aplicarea protocolului respectiv asupra unui număr de preparate similare, fiecare provenind de la alt individ. Toate procedurile experimentale folosite sunt în concordanță cu reglementările internaționale în vigoare privind utilizarea animalelor în cercetarea științifică (Directiva 609 din 24 Noiembrie 1986, a Consiliului Comunității Europene).

3.1.11. Respectarea normelor de bioetică și deontologie a cercetării

Teza de doctorat este o operă originală de creație intelectuală în domeniul științific, iar autorul acesteia are o responsabilitate majoră în privința rezultatelor acestei cercetări. De aceea, pe parcursul studiului vom evita orice tip de comportament științific necorespunzător și nu vom recurge la distorsionarea datelor sau eliminarea rezultatelor nedorite.

De asemenea, valorificarea rezultatelor prin publicarea de articole și prin participarea cu lucrări la manifestări științifice interne și internaționale vor respecta principiul originalității; totodată, nu vom realiza publicații redundante sau în duplicat și nu vom recurge la plagiat sau utilizarea și diseminarea neautorizată a ideilor altor persoane.

Toate experimentele sunt efectuate pe baza unor protocoale detaliate, consemnate ca atare în documentația laboratorului. Toate intervențiile asupra animalelor de laborator (manipulare, întreținere, sacrificare, tratamente cronice etc.) se fac cu respectarea strictă a normelor de bioetică impuse de legislația Uniunii Europene (Directiva Consiliului UE nr. 609, din 24 Noiembrie 1986) și sunt specificate în protocoale standard, care sunt aprobate de comisia de bioetică a Universității. Având în vedere natura de studiu comparativ, cu implicații privind interpretarea unui volum mare de date obținute anterior, nu este cazul de a identifica și aplica metode alternative la studiul preparatelor vasculare de origine animală. Fiecare animal este sacrificat cu minimă brutalitate și oferă un număr mare de preparate pentru studiu, astfel că numărul necesar de animale este mic. Protecția celor implicați în experimente este asigurată prin nivelul ridicat de instruire tehnică și prin respectarea normelor generale de protecție a muncii în laboratorul respectiv și a normelor speciale de protecție a cercetătorului incluse în protocoalele tehnice și experimentale.

Probele tisulare de origine umană (dacă vor fi folosite) sunt recoltate numai în clinici din Universitatea noastră și sunt reprezentate de fragmente din piese de exereză sau de probe microbioptice obținute în cursul actului chirurgical, care sunt subiectul regulilor generale pentru probele biologice de interes didactic și științific în clinici universitare. Pentru obținerea probelor respective subiectul uman nu suferă absolut nici o manevră suplimentară față de actul terapeutic propriu-zis. Cele de mai sus sunt garanție pentru respectarea drepturilor individuale și pentru protecția persoanei față de eventuale efecte negative.

Acest cadru asigură aplicarea strictă a principiilor etice impuse de organismul finanțator al granturilor de cercetare menționate (http://www.cncsis.ro/includes/etica.html).

3.2. caracteristici specifice ale musculaturii netede

3.2.1. Musculatura netedă vasculară

Principalele studii efectuate asupra metabolismului și efectelor SRA au fost realizate pe musculatură netedă vasculară cu precădere folosind cel mai cunoscut model funcțional și anume aorta de șobolan. Acest model este preferat datorită stabilității și reproductibilității pe care le prezintă. De asemenea îndepărtarea endoteliului vascular este ușoară și de manieră reproductibilă în așa fel încât rezultatele sunt demne de încredere. Totuși, aorta prezintă o serie de caracteristici care o fac mai puțin utilă pentru protocoalele care s-au folosit cu precădere. Aorta de șobolan nu reacționează de obicei la stimularea în câmp electric sau răspunsul este slab iar reproductibilitatea este deficitară. Există unele studii care sugerează că sistemul NANC este prezent în aorta toracică de șobolan dar rezultatele sunt puține și par a fi dependente în cel mai înalt grad de endoteliu și mai puțin de mușchiul neted vascular . În experiența noastră, folosind șobolani Wistar, nu am reușit să obținem o contracție stabilă și reproductibilă la SCE, lucru care este în acord și cu rezultatele din literatură, care precizează că singurul rozător care prezintă un răspuns la SCE pe aortă este iepurele .

Pentru a folosi totuși SCE, care a reprezentat o modalitate esențială de lucru în cazul lucrării de față, am utilizat o arteră somatică care a dovedit un răspuns suficient de puternic și reproductibil pentru a fi cosiderat de încredere și anume artera renală. Modele prezentate în literatură demonstrează o responsivitate semnificativă la stimularea electrică , probabil datorită faptului că inervația colinergică dar mai ales adrenergică a arterei renale este în mod fiziologic foarte abundentă. Artera renală și colateralele ei trebuie să fie capabile de a regla fluxul sanguin renal la stimularea simpatică și ca urmare sistemul nervos intramural este foarte bine dezvoltat, ceea ce o face să răspundă puternic și reproductibil la stimularea în câmp electric .

Pentru a lărgi aria de investigație am folosit și alte tipuri de artere dintre care cel mai frecvent folosite au fost arterele carotide și în câteva ocazii arterele mezenterice.

Artera carotidă de șobolan nu răspunde în mod semnificativ la stimularea în câmp electric dar are o contracție stabilă și reproductibilă la stimularea farmacologică. După cum se va observa din datele prezentate mai jos responsivitatea adrenergică, potasică și angiotensinergică este diferită din punct de vedere cantitativ față de aortă și arteră renală, lucru care ar putea fi interesant din punct de vedere fizio-farmacologic.

3.2.1.1. Efectul stimulării farmacologice asupra musculaturii netede vasculare

Contracția de control cea mai utilizată pentru mușchiul neted vascular este cea produsă de fenilefrină (Figura 16). Aceasta este un agonist -adrenergic care acționează prin intermediul receptorilor adrenergici care sunt omniprezenți la nivelul musculaturii netede vasculare.

Figura 16 – Structura chimică a fenilefrinei

Receptorii 1 cuplați de fenilefrină sunt receptori cu 7 domenii transmembranare cuplați cu proteine G. Există trei subtipuri de receptori 1, dintre care cel mai important este receptorul 1a a cărui activare duce la stimularea fosfolipazei A2, C și D. Aceasta duce la mobilizarea calciului din depozitele intracelulare, activarea MAP-kinazei și IP3 kinazei cu efecte musculo-constrictoare. In vivo este descompusă de monoaminoxidază iar în vitro este îndepărtată prin spălarea repetată a preparatului. Constanta de legare pe receptorii 1 este destul de redusă, ca urmare receptorii se desaturează rapid reducând efectul stimulator după câteva spălări. Fenilefrina este folosită mai ales datorită solubilității mari (comercial se prezintă ca sare hidroclorică) ceea ce permite obținerea de diluții foarte variate, stabilității în soluție (spre deosebire de catecolaminele naturale precum noradrenalina și adrenalina, care se degradează spontan, încă din momentul solubilizării, către adrenocrom), care permite păstrarea unei concentrații stabile pe perioade îndelungate (zile, săptămâni) și efectului semnificativ la concentrații foarte mici. Contracția de control pentru sistemul vascular se obține 10-6 M, ceea ce este o concentrație mică și nu are nici un fel de efect chimic sau osmotic.

Contracția este caracteristică ca și aspect și configurație și, pentru un ochi antrenat, este o modalitate de apreciere vizuală rapidă a viabilității și responsivității preparatului (Figura 17).

Figura 17 – Contracție martor la administrarea de 10-6 M fenilefrină pe aortă de șobolan

Endoteliul vascular este o componentă fiziologică extraordinar de importantă a vasului. Endoteliul are o activitate biologică semnificativă iar din punct de vedere funcțional cea mai importantă este capacitatea de vasorelaxare. Aceasta se realizează prin intermediul sintezei de NO produsă de către NO-sintaza stimulată de către receptorii de tip M colinergici de la nivelul endoteliului. Acești receptori sunt sensibili la stimularea colinergică cu carbacol și produc relaxarea musculaturii netede vasculare.

Pe preparatul izolat de arteră, efectul vasorelaxant este în întregime dependent de integritatea endoteliului vascular, lucru demonstrat de producerea vasodilatației la administrarea de carbacol în soluție (Figura 18). Aspectul calitativ și cantitativ al efectului musculo-relaxant este caracteristic și dependent în întregime de integritatea endoteliului, ca urmare se folosește ca test funcționale pentru verificarea prezenței sau absenței acestuia. De asemenea, în eventualitatea că unele din efectele substanțelor de cercetat sunt endotelio-dependente, îndepărtarea intenționată a acestuia poate face diferența între efecte endotelio-trope și musculo-trope.

Figura 18 – Efectul administrării de carbacol în platoul contracției produse de fenilefrină 10-6 M pe aorta de șobolan cu endoteliul intact

O altă modalitate de a testa contractilitatea mușchiului neted este folosirea depolarizării cu potasiu. Clorura de potasiu, administrată în concentrații variabile produce la nivelul mușchiului neted, atât vascular cât și digestiv, o contracție caracteristică, dependentă de doză (Figura 19). Potasiul acționează ca depolarizant al membranei, ceea ce produce deschiderea canalelor de calciu voltaj-dependente de la nivelul membranei musculaturii netede. Rezultatul este o contracție independetă de mediatori secunzi sau receptori, puțin dependentă de concentrația de KCl (efectul este aproximativ maximal la doza minimă). Testarea cu KCl este folosită pentru aprecierea contractilității pure a mușchiului fără implicarea vreunor sisteme mediatoare.

Figura 19 – Contracții martor la KCl 40 M și 80 M pe arteră carotidă de șobolan

3.2.1.2. Efectul angiotensinei II administrate izolat asupra mușchi neted vascular

Figura 20 – Contracție specifică la administrarea de angiotensină II (10-6 M) pe arteră renală de șobolan

Angiotensina II este un puternic vasoconstrictor dar ale cărui caracteristici contractile pe preparatul izolat sunt semnificativ diferite de cele induse de mediația adrenergică sau de KCl (Figura 21). Din punct de vedere cantitativ angiotensina II în concentrație optimă (10-6 M) administrată în lichidul de perfuzie nu produce o contacție la fel de mare ca și fenilefrina în aceeași concentrație, iar caracteristicile curbei contractile sunt diferite. Contracția nu se menține indefinit precum în cazul stimulării adrenergice, ceea ce sugerează că receptorii AT1 nu rămân ocupați pe o perioadă foarte lungă (ipoteză infirmată de fenomenul de tahifilaxie caracteristic angiotensinei II) sau, mai probabil, contracția angiotensinică are mediație multiplă care epuizează mult mai rapid rezervele energetice ale preparatului.

Figura 21 – Comparație între contracția adrenergică și cea angiotensinergică

Contracția angiotensinică la nivel vascular se conformează relației doză-efect, administrarea succesivă de doze crescătoare permițând trasarea unei curbe cumulative doză-efect de tip clasic (Figura 22).

Un element important este că acest aspect al curbei generată de administrarea de angiotensină II nu este influențat de prezența sau absența endoteliului vascular, ceea ce semnifică faptul că receptorii AT1 care mediază contracția se găsesc la nivelul membranei miocitelor vasculare. De altfel, pe niciunul din tipurile de preparate vasculare efectele angiotensinei sau ale substanțelor care influențează metabolismul său nu au fost endotelio-dependente.

Figura 22 – Curba doză-efect la administrarea de angiotensină II în concentrații crescânde (10-10, 10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5 M)

3.2.1.3. Efectul blocanților enzimei de conversie și a blocanților de receptori AT1 asupra diverselor tipuri de mușchi neted vascular

În administrarea unică sau în doze cumulative captoprilul (inhibitor al enzimei de conversie a angiotensinei) nu a avut nici un efect per se asupra tonusului mușchiului neted vascular. Acest rezultat este în concordanță cu literatura și sugerează că la nivelul ansamblului endotelio-muscular vascular atât angiotensina I cât și enzima de conversie se găsesc în cantități minime și nu afectează sinteza locală de angiotensină II.

De asemenea administrarea de losartan (blocant de receptori AT1) și de PD123379 (blocant de receptori AT2) nu a avut nici un efect per se asupra preparatelor vasculare. Aceasta sprijină în continuare ideea că la nivelul ansamblului endotelio-muscular vascular angiotensina II activă provine doar din plasmă și nu este generată local.

3.2.1.4. Efectul AINS administrat izolat asupra diverselor tipuri de mușchi neted vascular

Administrarea de AINS asupra preparatelor izolate arteriale nu a produs efecte per se. S-au folosit majoritatea AINS disponibile și utilizate pe piața farmaceutică, acestea fiind în ordinea selectivității lor asupra COX-2 astfel: ibuprofen, ketoprofen, sulindac, nimesulid și meloxicam.

Aceste rezultate sugerează că, deși, conform literaturii, atât în endoteliu cât și în mușchiul neted vascular există atât COX-1, COX-2, cât și receptori pentru prostaglandine și tromboxani, medierea tonusului bazal arterial nu se face cu ajutorul acestora.

3.2.1.5. Efectul SCE asupra mușchiului neted vascular de arteră renală

Dintre preparatele folosite, singurul care a fost utilizabil și care a dovedit un răspuns suficient de puternic și reproductibil pentru a fi considerat de încredere a fost artera renală. Modele prezentate în literatură demonstrează o responsivitate semnificativă la stimularea electrică, probabil datorită faptului că inervația colinergică, dar mai ales adrenergică a arterei renale este în mod fiziologic foarte abundentă. Artera renală și colateralele ei trebuie să fie capabile de a regla fluxul sanguin renal la stimularea simpatică și ca urmare sistemul nervos intramural este foarte bine dezvoltat, ceea ce o face să răspundă puternic și reproductibil la stimularea în câmp electric. Frecvențele de stimulare se obțin prin tatonare și sunt specifice pentru fiecare tip de preparat. Toate studiile noastre au luat în calcul semnificația statistică a relației între frecvență și contracție în construcția unei curbe frecvență/răspuns și toate preparatele care au dovedit o variabilitate a răspunsului mai mare de o deviație standard au fost eliminate. Avantajul sistemului de SCE este că răspunsul durează de obicei doar atât timp cât este prezentă stimularea, ceea ce face ca preparatul să nu fie epuizat din punct de vedere energetic foarte repede și nici spoliat de resurse datorită numeroaselor spălări (schimbări ale serului din băile de organ) care sunt necesare în cazul stimulării farmacologice.

Figura 23 – Curbă control SCE – arteră renală de șobolan, Frecvență 4, 8, 12, 16, 20 Hz, Durata pulsului – 0,5 msec, Timpul de stimulare – 5 sec

3.2.1.6. Efectele AINS asupra contractilității vasculare angiotensinergice

Există dovezi clare în literatură că stimularea receptorilor AT1 de către angiotensina II are efecte nete proinflamatorii, cu sau fără implicarea variațiilor de presiune arterială . O serie de experimente clinice și paraclinice au demonstrat că blocarea sistemului renină-angiotensină fie cu inhibitori ai enzimei de conversie (ECA), fie cu blocanți ai receptorilor angiotensinici (ARB) reduce răspunsul inflamator la nivel vascular . Dar, în ciuda investigațiilor intense, mecanismele inflamației vasculare induse de Ang II sunt încă necunoscute. Pe de altă parte, interacțiunea între ang II și rezultatele metabolismului vascular al cicloxigenazelor la nivelul mușchiului neted vascular sunt mai puțin studiate.

Investigația de față a folosit modelul aortei izolate toracice de șobolan în baie de organ izolat, prezentat în partea inițială a prezentului raport.

S-a folosit preparatul de organ izolat aortă toracică de șobolan și preparatul de arteră mezenterică de șobolan.

După testarea preparatului pentru contractilitate cu fenilefrină 10-6 M și pentru integritatea sau îndepărtarea completă a endoteliului vascular cu carbacol 10-5 M, s-a administrat angiotensină II 10-6 M pentru obținerea contracției de control. La 90-120 minute de la prima administrare de angiotensină II, interval în care s-au efectuat spălări multiple ale preparatului, s-a administrat ibuprofen (inhibitor nespecific COX-1 și COX-2) în concentrații variabile. După 10-15 minute de incubare, s-a administrat din nou angiotensină II 10-6 M.

Administrarea de ibuprofen în incubare a redus contracția determinată de ang II în manieră dependentă de doză, până la abolirea completă a acesteia.

Figura 24 – Abolirea contracției angiotensinice de către ibuprofen

În urma experimentelor înseriate (n=6) s-a putut construi o curbă doză-efect.

Figura 25 – Contracție martor ang II vs contracție cu preincubare cu ibuprofen

Rezultatele experimentale au fost independente de prezența endoteliului vascular pe preparat, inhibiția contracției fiind prezentă în ambele cazuri.

S-a folosit ketoprofen hidrocloric (Sigma) ca inhibitor hidrosolubil nespecific de COX în aceleași condiții ca cele prezentate mai sus.

În urma experimentărilor efectuate, s-a dovedit că preincubarea cu ketoprofen are efecte similare cu cele determinate de ibuprofen, cu diferențe cantitative nesemnificative. În urma experimentărilor s-a putut construi o curbă doză-efect a inhibiției procentuale a contracției induse de ang II la nivelul aortei toracice endotelizate și dezendotelizate (n=6).

Figura 26 – Inhibiția contracției angiotensinice la preincubarea cu ketoprofen

S-a repetat protocolul prezentat la punctele anterioare și s-a demonstrat un efect puternic inhibitor, dependent de doză, al nimesulidului asupra contracției induse de ang II 10-6 M. Fiind un efect dependent de doză s-a putut construi curba doză-efect, ce are o configurație similară cu cele ale ibuprofenului și ketoprofenului.

Experimentele au fost completate cu administrarea de nimesulid în pretratare a contracției fenilefrinice și potasice. Nu s-au obținut modificări semnificative ale contractilității fenilefrinice sau potasice.

Figura 27 – Inhibiția contracției angiotensinice la preincubarea cu nimesulid

3.2.1.7. Efectul AINS asupra contractilității adrenergice a mușchiului neted vascular

Pentru a se diferența între efecte inhibitorii musculotrope neselective și efecte specifice, protocolul experimental a fost repetat folosind ca agent contractant fenilefrina 10-6 M.

Figura 28 – Absența efectului preincubării cu ibuprofen asupra contracției fenilefrinice

Figura 29 – Absența efectului preincubării cu ibuprofen asupra contracției fenilefrinice

S-a demonstrat că pre-incubarea cu ibuprofen nu a produs nici un fel de modificare a contracției fenilefrinice, nici în doză minimă (10-9 M) nici în doză maximă (10-5 M) (n=4).

Protocolul experimental a fost repetat folosind ca agent contractant KCl 40 mM. Nici de această dată nu a fost obținută nici un fel de modificare a contracției potasice în prezență de ibuprofen 10-5 sau 10-9 M (n=4).

Figura 30 – Absența efectului preincubării cu ibuprofen asupra contracției fenilefrinice și potasice

În scopul eliminării suspiciunii de efect inhibitor nespecific al contractilității musculare netede, s-au repetat experimentările cu ketoprofen în prezența fenilefrinei 10-6 M și a KCl 40 mM. Nici una dintre contracțiile induse de aceste substanțe nu a fost afectată de preincubarea de ketoprofen, ceea ce certifică faptul că efectul inhibitor este conturat doar la contracția angiotensinică.

3.2.1.8. Efectul angiotensinei II asupra preparatelor vasculare stimulate cu SCE

AB

Figura 31 – Traseu martor SCE (4, 8, 12, 16, 20 Hz) (A) și influența preadministrării de angiotensină II asupra contracției SCE (B)

Figura 32 – Influența pre-administrării de angiotensină II asupra contracției SCE

Preincubarea cu angiotensină II (10-6 M) a preparatelor de arteră renală a produs o contracție per se care a revenit la nivelul bazal după aproximativ 10 minute. Administrarea de SCE s-a făcut numai după reatingerea pragului contractil bazal. Administrarea de stimuli electrici cu frecvențe crescânde a produs o creștere cantitativă a răspunsului contractil al arterei renale (Figura 32). Creșterea răspunsului contractil determinată de angiotensina II a fost cu 60,05 ± 15,29 % față de răspunsul martor. Folosind testul One – Way Anova, p = 0,03463 ceea ce demonstrează o potențare semnificativă statistic a SCE în prezența angiotensinei II 10-6 M.

3.2.1.9. Efectul blocanților enzimei de conversie și inhibitorilor de receptor AT1 asupra preparatelor vasculare stimulate cu SCE

Incubarea preparatului cu IECA a produs răspunsuri semnificativ mai mari (p = 0,00012) la stimularea în câmp electric, la fel ca și incubarea cu blocanți ai receptorilor pentru angiotensină (BRA) (p = 0,00186).

A

B

Figura 33 – Efectul blocării enzimei de conversie (A) sau al receptorilor AT1 (B) asupra contracției SCE

3.2.1.10. Efectul AINS asupra preparatelor vasculare stimulate cu SCE

Administrarea de AINS în pretratare a produs un efect inhibitor asupra răspunsului contractil la stimulare electrică.

AB

Figura 34 – Traseu martor SCE (4, 8, 12, 16, 20 Hz) (A) și influența preadministrării de nimesulid asupra contracției SCE (B)

Figura 35 – Influența administrării de nimesulid asupra contracției SCE

Administrarea de nimesulid a produs o scădere cu o medie de 64,58 ± 5,84 % a răspunsului contractil. Testul One–Way Anova a demonstrat o scădere semnificativă statistic, p = 0,00977.

Figura 36 – Influența administrării de ketoprofen asupra contracției SCE

Administrarea de ketoprofen a produs o scădere semnificativă (p = 0,0267) a răspunsului contractil cu o medie de 68,42 ± 9,72 %.

3.2.1.11. Efectele diverselor combinații AINS și angiotensină asupra preparatelor vasculare stimulate cu SCE

S-au folosit preparate similare, dar reactivitatea mușchiului neted a fost testată folosind stimulare în câmp electric conform protocolului prezentat mai sus.

Incubarea cu ang II a crescut contractilitatea.

A

B

Figura 37 – Contracție SCE la 4, 8, 12, 16, 20 Hz, durata 0,5 ms, tensiune 10 V. A – contracție pe fond de preincubare cu ang II. B – contracție pe fond de preincubare cu ang II și ibuprofen

Co-administrarea de ibuprofen împreună cu ang II a redus în mod semnificativ amplitudinea contractilă la stimularea în câmp electric, ceea ce duce la ipoteza că cel puțin parțial, contracția angiotensinică a mușchiului neted vascular este mediată prin COX.

Figura 38 Curba frecvență-răspuns în prezență de ang II și ang II + ibuprofen

Folosind testul One-Way Anova s-a observat că inhibiția contracției SCE de preadministrarea concomitentă de ibuprofen și angiotensină II este semnificativă statistic p = 0,00049. De asemenea potențarea contracției SCE de către preadministrarea de angiotensină II este semnificativă statistic p = 0,029.

3.2.1.12. Efectele modulatoare diferite ale ionilor de amoniu asupra acțiunilor vasculare ale angiotensinei pe aortă și artere renale izolate de șobolan

Ang II este un puternic reglator al funcției renale, mai ales la nivelul tubului renal proximal, acționând la nivelul transportului de lichide și bicarbonat. Angiotensina II acționează în mod stimulator asupra excreției tubulare de amoniu .

Pe de altă parte, amoniul plasmatic are și el un efect propriu asupra vascularizației, efect care poate crește sau scădea perfuzia glomerulară.

Angiotensina II în concentrații mici a crescut eliminarea de amoniu prin tubii renali, în manieră bifazică, crescând eliminarea la concentrații mici și inhibând-o la concentrații mari. Mecanismul prin care ang II a alterat metabolismul renal al amoniului pare a fi legat de efectele asupra antiportului Na/H, deoarece adăugarea de amilorid (blocant specific al pompei Na/H) a inhibat efectul angiotensinei .

Pe de altă parte, efectul vascular al ang II este și el parțial responsabil de aceste rezultate. Pe măsură ce se acidifică mediul, expresia receptorilor AT 1 crește atât la nivel tubular cat și vascular. Ca urmare, s-a urmărit efectul pe care îl are ionul liber de amoniu în lichidul de perfuzie asupra contractilității generale a vaselor, pe de o parte, și asupra răspunsului contractil la angiotensină, pe de altă parte.

În același timp, se cunoaște faptul că sistemul renină – angiotensină renal modulează expresia COX la nivel renal, mai ales în macula densa și în celulele interstițiale la probele prelevate de la pacienți cu vârste mai mari de 60 ani. Creșterea concentrației plasmatice de ang II a redus semnificativ expresia COX-2 la nivel tubular renal și interstițiu, în vreme ce co-administrarea de captopril a crescut în mod semnificativ expresia COX .

Contramodularea SRA de către COX este și ea o realitate. O serie de studii au indicat că eliberarea reninei este influențată de COX-2. Inhibitorii acesteia de tip rofecoxib și meloxicam reduc reabsorbția de amoniu și de alți metaboliți proteici, iar indometacinul reduce și el la rândul sau eliberarea renală de renină .

Din aceste motive, s-a investigat rolul amoniului ionic din lichidul de perfuzie, administrat sub formă de clorură de amoniu, asupra contractilității vasculare native și angiotensinice.

Influența ionilor de amoniu asupra acțiunii renale vasculare a peptidelor angiotensinice a fost studiată mai puțin. Scopul acestui studiu a fost de a determina acțiunile lor comparative asupra contractilității aortei și arterelor renale de șobolan indusă de către ang II.

Arterele renale au fost disecate din teritoriile extra și intrarenale folosindu-se aceeași tehnică. Preparatele au fost echilibrate la o tensiune de 2 gr. timp de 60 minute. După echilibrare inelele aortice au fost precontractate cu fenilefrină (10-7-10-6 M) și K+ (40-70 mM), iar integritatea endoteliului a fost testată prin administrarea de carbachol (10-6-10-5 M) ca eliberator endotelial de NO vasorelaxant.

Modificările contractilității mușchiului neted vascular au fost interpretate din punct de vedere statistic prin calcularea variațiilor procentuale a mediilor și erorilor standard medii prin utilizarea testelor „t” și ANOVA. Rezultatele au fost exprimate ca medie ± SEM.

Analizele post hoc au fost efectuate utilizând testul Tukey pentru identificarea diferențelor semnificative între dozele diferite de NH4Cl + Ang II folosite. Valorile lui F pentru care P < 0,05 au fost considerate statistic semnificative.

Într-o primă serie de experimente s-a testat reactivitatea inelelor aortice și renale normale și dezendotelizate stimulate electric sau farmacologic cu fenilefrină, noradrenalină și ang II. În ambele, atât stimularea electrică cât și cea farmacologică a preparatelor a determinat, în condiții bazale, reacții vasoconstrictoare mai intense în cazul arterei renale, însoțite în unele experiențe de variații spontane lente ale tonusului vascular bazal.

Spre deosebire de reacțiile vasculare ale aortei toracice, care au fost numai de tip vasoconstrictor indiferent de natura excitantului, cele ale arterei renale au apărut bifazice în cazul angiotensinei II. În afara binecunoscutei sale acțiuni vasoconstrictoare, ang II a produs relaxarea inelelor vasculare renale precontractate cu fenilefrină sau noradrenalină.

În continuare, reactivitatea inelelor aortice și renale a fost studiată comparativ sub influența expunerii de scurtă durată la ionii de amoniu. Preparatele pretratate timp de 10 minute cu NH4Cl în doze variabile (0,5 – 50 M) au prezentat reacții diferite la nivelul inelelor renale în cazul ang II. În timp ce vasoconstricția inelelor aortice provocată de ang II a fost puternic inhibată de NH4Cl, reactivitatea preparatelor renale a crescut semnificativ în prezența ionilor de amoniu (Figura 39).

Figura 39 – Influența ionilor de ammoniac asupra efectelor vasoconstrictoare ale ang II pe aorta toracică de șobolan (A) și artera renală (B)

Valorile medii și variațiile statistice ale rezultatelor obținute sunt prezentate în Figura 40.

A

B

Figura 40 – Valorile medii ale efectelor modulatoare inhibitoare ale NH4Cl asupra vasoconstricției produse de către ang II la nivelul inelelor de aortă de șobolan (A) – *** p < 0,0001 față de grupul de control ang II, și arteră renală (B) – * p = 0,002 față de grupul de control ang II, *** p < 0,0001 față de grupul de control ang II. Valorile sunt medii ± S.E.M. (n = 6 animale pe grup)

Așa cum a fost descris în cazul aortei toracice de șobolan, am observat o scădere semnificativă a procesului contractil la grupul tratat cu NH4Cl 5M + ang II (F(1,10) = 53, p < 0,0001), ca și la grupul tratat cu NH4Cl 25M + ang II (F(1,10) = 51, p < 0,0001), și la grupul tratat cu NH4Cl 50M + ang II (F(1,10) = 51, p < 0.0001), în comparație cu grupul de control tratat cu ang II (Figura 40 A). Totuși analiza post hoc nu a arătat diferențe semnificative între grupul tratat cu NH4Cl 5 μM + Ang II și cel tratat cu NH4Cl 25 μM + Ang II (p = 0,068) sau între cel tratat cu NH4Cl 5 μM + Ang II și cel tratat cu NH4Cl 50 μM + Ang II (p = 0,87) sau între grupurile tratate cu ang II față de cel tratat cu NH4Cl 25 μM și față de NH4Cl 50 μm + Ang II (p = 0,083)

În plus, cu privire la artera renală, am demonstrat o creștere semnificativă a procesului contractil la grupul tratat cu NH4Cl 5 μM + Ang II (F(1,10) = 7, p < 0,02), cât și la grupul tratat cu NH4Cl 25 μM + Ang II (F(1,10)=7, p < 0,02) și la grupul tratat cu NH4Cl 50 μM + Ang II (F(1,10) = 117, p < 0,0001), în comparație cu grupul control tratat cu ang II (Figura 40 B). Totuși, în acest caz analiza post hoc a arătat diferențe semnificative între grupurile NH4Cl 5 μM + Ang II și NH4Cl 25 μM + Ang II (p = 0,006), cât și între grupurile NH4Cl 5 μM + Ang II și NH4Cl 50 μM + Ang II (p = 0,002), dar nu și între grupurile Ang II și NH4Cl 25 μM și NH4Cl 50 μM + Ang II (p = 0,34).

Efectele vasodilatatoare produse de ang II asupra inelelor precontractate cu fenilefrină sau noradrenalină au apărut semnificativ inhibate de către NH4Cl (Figura 41). Ph-ul soluției a fost păstrat între 7,38 – 7,42.

Figura 41 – Proprietățile modulatoare diferite ale NH4Cl asupra efectelor ang II pe arteră renală izolată (A) și aortă toracică (B).

3.2.1.13. Interacțiunile vasculare dintre aldosteron, ang II și antioxidanți

Acumularea de dovezi sugerează că acțiunile nongenomice cardiovasculare ale aldosteronului sunt produse de căi celulare variate și mediate de o multitudine de sisteme mesagere inclusiv speciile reactive ale oxigenui și azotului. Având în vedere implicarea stresului oxidativ și nitrozativ în căile care duc la activarea sistemului angiotensină – aldosteron, în studiul de față am încercat să evaluăm interacțiunile funcționale dintre aldosteron, angiotensină II și antioxidanți în celulele musculare netede vasculare izolate din inele aortice de șobolan. Datele noastre oferă argumente suplimentare, că acțiunile nongenomice ale aldosteronului asupra celulelor musculare netede aortice de șobolan sunt o problemă de dialog și echilibrul între efectele sale vasoconstrictor și vasodilatatoare rapide, ca urmare a activării de specii reactive de oxigen, în primul caz și de specii de azot în al doilea. În acest fel, se pare că într-un ambient scăzut de stres oxidativ, aldosteronul determină producerea de oxid nitric (NO) și vasodilatație, în timp ce în situații cu creșterea stresului oxidativ vor prevala disfuncția endotelială și efectele negative induse de vasoconstricție. Astfel, aldosteronul ar putea fi considerat „atât prieten cât și dușman”. Acest lucru ar putea fi relevant pentru modul în care aldosteronul dăunează funcțiilor cardiovasculare și ar putea conduce la îmbunătățiri terapeutice semnificative.

În prima serie de experimente, efectele vasculare ale aldosteronului (Merck) în doze progresive (10-9 – 10-6 M) atât per se cât și asupra acțiunilor vasoconstrictoare ale angiotensinei II (10-6 M) (Sigma Co) sau KCl (40 mM) au fost investigate în condiții de relaxare bazală înainte și după 10 minute de la administrarea spironolactonei (Boehringer GmbH) inhibitor specific al receptorilor mineralocorticoizi. Aldosteronul și spironolactona au fost folosiți în doze variabile (10-6 – 10-5 M) pe preparate aortice atât cu endoteliul intact cât și dezendotelizate.

Ținând cont că efectele vasculare ale aldosteronului depind parțial de speciile reactive ale oxigenului și oxidului de azot, în altă serie de experimente am studiat influența sa asupra vasoconstricției angiotensinice în preparatele pretratate cu amifostină (10-8 – 10-7 M) (Schering – Plough Ltd), N-acetyl-cisteină (10-6 – 10-5 M) și L-NAME (10-5 M) (Sigma Co).

Rezultatele experimentelor prelminare au arătat că aldosteronul per se nu a modificat în mod semnificativ tonusul bazal al inelelor de mușchi neted aortic în primele 10–15 minute de la administrare. Totuși, o modificare evidentă a reactivității vasculare testată cu ang II și potasiu a fost obținută în preparatele pretratate cu doze diferite de aldosteron.

3.2.1.13.1. Influența aldosteronului asupra efectelor vasculare ale ang II

Vasoconstricția angiotensinică a fost inhibată de către expunerea acută la aldosteron în majoritatea experimentelor (75%), în timp ce contracția vasculară indusă de potasiu a fost invariabil potențată. O creștere a vasoconstricției indusă de ang II a fost aleatoriu obținută doar în 25% din experimente. Efectele diferite ale aldosteronului asupra vasoconstricției angiotensinice și potasice sunt prezentate în Figura 42.

Figura 42 – Efectele diferite ale aldosteronului asupra vasoconstricției angiotensinice (A) și potasice (B) pe inele de aortă normale de șobolan

Pentru a determina dacă endoteliul este implicat în aceste acțiuni vasculare ale aldosteronului, influența sa asupra vasoconstricției angiotensinice a fost studiată comparativ pe inele normale și dezendotelizate. Integritatea endoteliului a fost testată prin administrarea de carbacol pe inelele precontractate cu fenilefrină. Acțiunile inhibitoare ale aldosteronului asupra vasoconstricției angiotensinice au apărut atât în cazul inelelor normale cât și în cazul celor dezendotelizate. Potențarea vasoconstricției angiotensinice indusă de către aldosteron în unele preparate normale a fost de asemenea inhibată în inelele dezendotelizate (Figura 43).

Figura 43 – Influența aldosteronului asupra vasoconstricției angiotensinice (10-6 M) pe preparate normale (A) și dezendotelizate (B)

Următorul pas a fost testarea efectelor aldosteronului asupra vasoconstricției angiotensinice pe preparatele inelare aortice pretratate cu spironolactonă. Blocarea receptorilor aldosteronici de către spironolactonă nu a modificat semnificativ reactivitatea vasculară a preparatelor normale sau dezendotelizate la vasocontricția angiotensinică alterată de aldosteron. Efectele comparative ale aldosteronului și spironolactonei asupra vasoconstricției indusă de ang II pe preparatele normale și dezendotelizate este prezentată în Figura 44.

Figura 44 – Efectele comparative ale aldosteronului (A) și spironolactonei (B) asupra vasoconstricției angiotensinice pe inele de aortă normale și dezendotelizate

În acest mod, în timp ce administrarea de aldosteron 10-6 M (F(1,10) = 695, p < 0,01) și aldosteron 10-8 (F(1,10) = 530, p < 0,01) pe inelele normale a determinat o scădere semnificativă a contracției angiotensinice (ang II – 10-6 M), concentrația de 10-9 M a aldosteronului (F(1,10) = 5, p = 0,99) nu a determinat modificări semnificative (Figura 44 A). Mult mai important este faptul că acest răspuns a fost dependent de doză, deoarece analiza post hoc a arătat diferențe semnificative între grupurile tratate cu aldosteron 10-6 M și cele tratate cu aldosteron 10-8 M (p < 0,01), ca și între cele tratate cu aldosteron 10-8 M și cele tratate cu aldosteron 10-9 M (p < 0,01) și între cele tratate cu aldosteron 10-6 M și cele tratate cu aldosteron 10-9 M (p < 0,01).

În ceea ce privește rezultatele administrării de aldosteron pe inele dezendotelizate, am observat de asemenea o scădere semnificativă a contracției determinate de ang II 10-6 M la grupurile tratate cu aldosteron 10-6 M (F(1,10) = 632, p < 0,01) și aldosteron 10-8 M (F(1,10) = 125, p < 0,01). În cazul grupului tratat cu aldosteron 10-9 M (F(1,10) = 1, p = 0,81) nu s-au observat modificări semnificative (Figura 44 A). De asemenea, acesta a fost un răspuns doză-efect dependent pe inelele dezendotelizate, deoarece analiza post hoc a evidențiat diferențe semnificative între grupurile tratate cu aldosteron 10-6 M și cele tratate cu aldosteron 10-8 M (p < 0,01), ca și între cele tratate cu aldosteron 10-8 M și cele tratate cu aldosteron 10-9 M (p < 0,01) și între cele tratate cu aldosteron 10-6 M și cele tratate cu aldosteron 10-9 M (p < 0,01)

În ceea ce privește contracția angiotensinică după administrarea de spironolactonă am observat o scădere semnificativă a contracției după administrarea de spironolactonă 10-6 M (F(1,10) = 265, p < 0,01) și o creștere semnificativă a contracției după administrarea de spironolactonă 10-6 M și aldosteron (F(1,10) = 130, p < 0,01) pe inelele normale (Figura 44 B). În plus, analiza post hoc a evidențiat diferențe semnificative între grupurile tratate cu spironolactonă 10-6 M și cele tratate cu spironolactonă 10-6 M și aldosteron (p<0,01).

Totuși, în cazul inelelelor dezendotelizate am observat o scădere a contracției angiotensinice atât la grupurile tratate cu spironolactonă 10-6 M (F(1,10) = 18, p = 0,001) cât și în cazul celor tratate cu spironolactonă 10-6 M și aldosteron (F(1,10) = 1, p = 0,4), doar primul fiind, bineînțeles, semnificativ statistic (Figura 44 B).

De asemenea, analiza post hoc a arătat diferențe semnificative între grupul tratat cu spironolactonă 10-6 M față de grupul tratat cu spironolactone 10-6 M și aldosteron (p = 0,023) pe inele dezendotelizate.

La rândul său, potențarea efectelor vasoconstrictoare ale ang II de către aldosteron a fost evidentă numai în inelele aortice cu endoteliu normal (Figura 45).

Figura 45 –Efectele aldosteronului asupra vasocontricției angiotensinice pe preparate inelare de aorta normale (A) și dezendotelizate (B)

În concordanță cu alți autori aceste rezultate aduc noi dovezi asupra faptului că aldosteronul modulează prin efectele sale nongenomice rapide reactivitatea unor teritorii vasculare cu participarea unor molecule semnal variate, incluzând speciile reactive ale oxigenului și azotului.

Pornind de la bine-cunoscutul fapt că atât aldosteronul cât și angiotensina II activează la nivel cardiovascular sinteza speciilor radicalare ale oxigenului și speciilor reactive ale azotului , activare care este inhibată de captatorii (scavengerii) de radicali liberi și alți antioxidanți endogeni și exogeni am investigat proprietățile modulatoare ale unor substanțe antiradicalare asupra efectelor vasculare ale aldosteronului și ang II pe inelele izolate de aortă.

3.2.1.13.2. Modularea efectelor combinate ale aldosteronului și ang II de către amifostină, N-acetilcisteină și L-NAME

În cazul amifostinei, un captator (scavenger) al speciilor reactive ale oxigenului cu efecte chemo- și radioprotective vasoconstricția indusă de ang II a fost semnificativ influențată de speciile radicalare ale oxigenului (O-, H2O2), fiind diminuată mai ales pe preparatele dezendotelizate (Figura 46 A).

Figura 46 – Influența amifostinei (A) și L-NAME (B) asupra vasoconstricției angiotensinice pe preparate normale și dezendotelizate pretratate cu aldosteron

* – semnificativ statistic (p < 0,05)

În acest mod, în timp ce pentru inelele normale putem vedea o scădere semnificativă a procentului contracției la ang II 10-6 M, doar în grupurile pretratate cu amifostină 10-7 M (F(1,10) = 27, p = 0,0004) și cu L-NAME și amifostină (F(1,10) = 25, p = 0,0005), în cazul inelelor dezendotelizate această scădere semnificativă a fost observată atât la grupul pretratat cu amifostină 10-7 M (F(1,10) = 112, p < 0,01) cât și la grupul pretratat cu amifostină 10-8 M (F(1,10) = 133, p < 0,01). Totuși, am observat de asemenea o creștere semnificativă a contracției angiotensinice la grupul pretratat cu L-NAME și amifostină (F(1,10) = 117, p < 0,01) (Figura 46 A).

Analiza post hoc a evidențiat de asemenea diferențe semnificative între grupul pretratat cu amifostină 10-7 M și cel pretratat cu amifostină 10-8 M (p = 0,006) și între grupul pretratat cu amifostină 10-8 M față de cel pretatat cu L-NAME și amifostină (p = 0,006), în cazul inelelor de aortă cu endoteliul intact. De asemenea, diferențe semnificative au fost evidențiate între grupul tratat cu amifostină 10-7 M față de cel tratat cu L-NAME și amifostină (p < 0,01) și de asemenea între grupul tratat cu amifostină 10-8 M față de cel tratat cu L-NAME și amifostină (p < 0,01) în cazul preparatelor dezendotelizate.

Reacții similare au apărut în cazul inelelor aortice pretratate cu N-acetilcisteină, care are proprietăți antioxidante, demonstrate recent, în cazul stresului oxidativ .

După cum s-a precizat, pretratarea cu L-NAME a indus o creștere a reactivității vasculare la ang II, creștere ce a fost mai intensă în cazul preparatelor cu endoteliu intact față de cele dezendotelizate.

Inhibiția NOS cu L-NAME a determinat o creștere semnificativă a reactivității vasculare, potențată de aldosteron numai în cazul inelelor cu endoteliul intact. Eliminând componenta vasodilatatoare cuplului eNOS–NO cu L-NAME, acțiunile constrictoare ale speciilor radicalare ale oxigenului au fost crescute. Această ipoteză este favorizată de potențarea efectelor vasoconstrictoare ale ang II pe preparatele inelare aortice cu endoteliul intact pretratate cu aldosteron și L-NAME (Figura 46 B). După cum se observă din figura de mai sus, contracția angiotensinică pe preparatele cu endoteliul intact a fost crescută semnificativ atât în cazul grupului pretratat cu L-NAME (F(1,10) = 161, p < 0,01) cât și în cazul grupului pretratat cu L-NAME și aldosteron (F(1,10) = 1364, p < 0,01). Totuși pe inelele aortice dezendotelizate se poate observa o scădere semnificativă a contractilității atât în grupul pretratat cu L-NAME (F(1,10) = 10, p = 0,01) cât și în cazul grupului pretratat cu L-NAME și aldosteron (F(1,10) = 1364, p = 0,007) (Figura 46 B).

În plus analiza post hoc a evidențiat diferențe semnificative, în cazul inelelor aortice cu endoteliul intact, între grupul pretratat cu L-NAME și cel pretratat cu L-NAME și aldosteron (p < 0,01).

3.2.2. Musculatura netedă digestivă

3.2.2.1. Evaluarea reactivității musculaturii netede esofagiene

Esofagul în porțiunea sa terminală este un conduct musculo-membranos a cărui musculatură și inervație respectă distribuția generică a tubului digestiv. La șobolan și alte rozătoare, esofagul are o serie de caracteristici anatomice și structurale care-l fac diferit față de om și animale. Deși lung din punct de vedere anatomic, esofagul nu are musculatura netedă separată printr-o limitare netă ca la alte grupuri de animale și doar partea strict inferioară a acestuia este pur netedă . Aceasta, împreună cu lipsa unor neuroni centrali bulbari dedicați, face ca rozătoarele să nu aibă reflex de vomă și să nu aibă posibilitatea de tranzit aboral . De asemenea un studiu foarte amănunțit a demonstrat că mediația regiunii inferioare a esofagului și a sfincterului esofagian inferior nu este net parasimpatică, lucru observat și de către noi. Se pare că mediația motilității esofagiene la rozătoare este predominant nitrinergică .

Având în vedere orientarea către investigarea mediației angiotensinergice, nu am continuat în mod special această cale ci am aplicat protocolul tipic pe care l-am folosit la toate investigațiile din cadrul acestei lucrări.

3.2.2.1.1. Evaluarea motilității colinergice și adrenergice a preparatului de esofag.

Am testat motilitatea preparatelor esofagiene circulare și longitudinale în funcție de înălțimea prelevării. Cel puțin pe preparatele care au folosit șobolani Wistar și șoareci Swiss, nu am obținut contracție colinergică la nici o concentrație de carbacol aplicată (pornind de la 10-9 M până la 10-5 M). Aceasta în condițiile în care stimularea cu SCE a avut rezultate clare, puternice și reproductive atât pe preparatele circulare cât și longitudinale. Stimularea cu KCl de la 20, 40, 60, 80 mM în curbă cumulativă a produs un răspuns nesemnificativ din punct de vedere al generării de forță, comparativ cu stimularea electrică.

Ca urmare putem concluziona că mediația motorie esofagiană la nivelul porțiunii inferioare a acestui organ nu este predominant colinergică. Pentru a investiga mediația nonadrenergică/noncolinergică (NANC) s-au folosit blocanți specifici ai mediatorilor simpatici și parasimpatici pentru a se observa efectele asupra contractilității SCE.

A B

Figura 47 – Inhibiția contracției SCE de către pretratarea cu atropină și prazosin pe preparat de esofag longitudinal (A) și circular (B)

Ca substanțe de lucru s-au folosit blocantul -adrenergic al receptorilor de tip 1 numit prazosin (Sigma Co.) și blocantul de receptori colinergici M atropina (Sigma Co.). Dozele administrate au fost de 10-6 M. Administrarea s-a făcut în pretratare de 10 – 15 minute înainte de SCE. Contracțiile SCE inițiale au fost folosite drept control.

Pretratarea cu coctailul NANC a redus în mod semnificativ contractilitatea SCE pe toate preparatele, atât longitudinal (Figura 47 A) (p = 0,00691) cât și circulare (Figura 47 B).

3.2.2.1.2. Efectele mediației angiotensinergice asupra motilității esofagiene

Studiul s-a efectuat folosind ang II 10-9 M până la 10-5 M în administrare cumulativă. Nici una din dozele administrate nu a avut efect per se asupra tonusului bazal al preparatelor longitudinale cât și al celor circulare de esofag.

Pentru a se investiga efectul pretratării cu ang II asupra răspunsului contractil la SCE în preparatele de esofag de șobolan s-a efectuat pretratarea cu ang II 10-5 M și incubarea preparatului timp de 15 minute.

A

B

Figura 48 – Influența pretratării cu ang II asupra contracției SCE pe preparat de esofag circular (A) și longitudinal (B)

Pretratarea cu ang II a produs reducerea semnificativ statistică (p = 0,003122 ileon circular, p = 0,001817 ileon longitudinal) a contractilității SCE atât pe praparatele longitudinale cât și pe inele. Din punct de vedere al forței generate preparatul longitudinal a fost cel mai afectat cu o medie de 30 – 40 %, în timp ce pe preparatul circular inhibiția nu a fost atât de puternică 10 – 15 % (Figura 48).

Figura 49 – Efectul pretratării cu losartan și ang II asupra SCE (p = 0,00893)

Administrarea de losartan a inhibat influența angiotensinei II asupra contracției SCE, contractilitatea preparatului revenind aproape la valorile inițiale (Figura 49).

3.2.2.1.3. Efectele AINS asupra motilității esofagiene

Pentru investigarea contractilității esofagiene s-a folosit și ansamblul de traductori izometrici cu SCE (stimulare în câmp electric). Pentru stabilirea unei curbe contractile de bază preparatele montate în baia de organ au fost stimulate cu frecvențe și tensiuni variabile de curent. Tatonările experimentale au dus la stabilirea unei serii frecvență/tensiune cu rezultate reproductibile, care au fost folosite în continuare (Figura 50). Pentru preparatul de esofag de șobolan am obținut contracții optimale și reproductibile la frecvențe de 5, 15, 30, 45, 60 Hz, tensiune de 150 V, timp de 10 s.

Figura 50 – Contracție control SCE – esofag șobolan (n = 5, 15, 30, 45, 60 Hz, tensiune de 150 V, timp de 10 s)

A

B

C

Figura 51 – Influența pretratării cu sulindac (p = 0,03732) (A), piroxicam (p = 0,04132) (B) și nimesulid (p = 0,03586) (C) asupra SCE

Administrarea de AINS 10-6 M în pretratare nu a produs nici un efect per se.

Toate AINS folosite au avut un efect de inhibiție a contracției SCE cu același profil al curbei de răspuns ceea ce sugerează un efect unitar asupra contractilității (Figura 51).

3.2.2.1.4. Efectul interacțiunii între AINS și Ang II la nivelul musculaturii netede esofagiene

Preincubarea cu ang II a redus semnificativ contractilitatea la SCE, de manieră previzibilă, în acord cu toate celelalte rezultate obținute cu acest protocol. Coadministrarea de ketoprofen sau alte inhibitoare neselective de COX a redus și mai mult contractilitatea musculaturii netede esofagiene (p = 0,03658) (Figura 52). Toate aceste rezultate indică faptul că musculatura netedă esofagiană pare a fi mai puțin dependentă de medierea tromboxani/prostaglandine a contracției. Efectele inhibiției COX par a fi strict cantitative. Este dificil de determinat, datorită variabilității interindividuale ale animalelor de experiență, care este contribuția procentuală a fiecăruia dintre factorii contractili (COX, PLA2, AMPc) dar, cel puțin în cazul contracției mușchiului neted esofagian angiotensina și receptorii AT1 nu par a fi de o importanță majoră.

Figura 52 – Influența coadministrării de ang II și ketoprofen asupra contracției SCE

3.2.2.2. Evaluarea contractilității musculaturii ileo-jejunale pe preparat circular și longitudinal

3.2.2.2.1. Stimularea colinergică

După cum este cunoscut mediația principală a motilității la nivelul tubului digestiv este colinergică. Carbamoil-colina (carbacolul) este un analog sintetic al acetilcolinei folosit pentru studii farmacologice datorită acțiunii sale de agonist al receptorilor colinergici de tip M de la nivelul musculaturii netede, precum și datorită stabilității sale chimice în soluție ceea ce permite menținerea unor doze stabile. În toate preparatele care folosesc musculatură netedă digestivă contracția indusă de carbacol este folosită ca martor datorită stabilității și reproductibilității sale (Figura 53).

Figura 53 – Contracție martor de carbacol pe ileon circular

S-au folosit diluții succesive de carbacol pornind de la 10-10 M până la 10-6 M pentru construirea unei curbe doză efect cumulative (n = 6) folosită ca referință pentru experimentele ulterioare.

Figura 54 – Curba doză-efect la administrarea de carbacol (10-10, 10-9, 10-8, 10-7, 10-6 M) pe ileon de șobolan

După cum se observă din figura de mai sus (Figura 54) administrarea de carbacol produce atât creșterea tonusului contractil al preparatului de intestin, indiferent de la ce nivel a fost prelevat (jejun, ileon medial până la terminal) cât și amplitudinea și frecvența contracțiilor spontane. Datorită variabilității interindividuale, efectele pretratării preparatelor de intestin au fost evaluate folosind contracția de control cu carbacol pe același preparat (Figura 55).

Figura 55 – Contracție martor carbacol – ileon longitudinal

3.2.2.2.2. Stimulare în câmp electric

Tubul digestiv și în special intestinul este deosebit de responsiv la stimularea în câmp electric. Aceasta se datorează faptului că la nivelul tubului digestiv există plexurile mienteric și submucos ce conțin o multitudine de neuroni modulatori ai motilității digestive, ce reacționează foarte rapid și energic la depolarizarea indusă de variațiile de câmp electric. Ca urmare stimularea va obține efecte reproductibile și clar dependente de frecvența de stimulare ceea ce ne permite trasarea de curbe doză-efect cu ușurință (Figura 56).

Figura 56 – Contracție control la stimularea în câmp electric ( – 8, 16, 32, 64 Hz, 10 V, 10 s)

3.2.2.2.3. Efectul administrării de ang II asupra preparatelor de intestin subțire

Se cunoaște implicarea SRA în maturarea musculaturii netede în utero (prin AT2) . Animalele knock out pentru receptorul AT2 nu supraviețuiesc perioadei de gestație datorită (printre altele) incapacității de angiogeneză. Receptorul angiotensinergic 2 reglează creșterea mușchiului neted și generarea forței în timpul dezvoltării fetale .

Ang II este cel mai puternic vasconstrictor al circulației splahnice .

De asemenea este binecunoscut faptul că ECA se secretă la nivelul mucoasei intestinale ceea ce semnifică o mediație angiotensinică importantă atât a circulației splahnice, cât și probabil a motilității intrinsece a tubului digestiv.

Autoradiografierea mucoasei cu 131I-Sar demonstrează existența receptorilor pt. Ang II .

Contracția la Ang II este menționată pentru musculatura sfincteriană, mai puțin pentru intestin propriu-zis .

A

B

Figura 57 – Curba doză efect la administrarea în doze cumulative de ang II (1010M – 10-6 M) pe ileon longitudinal (A) și circular (B).

Administrarea de angiotensină în doze cumulative pornind de la 10-10 M până la 10-6 M a produs o creștere a tonusului contractil de amplitudini similare (60 – 80 %) cu contracția indusă de carbacol (Figura 57). Pretratarea cu inhibitorul de enzimă de conversie captopril nu a produs efecte semnificative asupra contracției angiotensinice pe mușchiul neted digestiv.

3.2.2.2.4. Efectul coadministrării de ang II și AINS la nivelul musculaturii netede ileale

După cum se poate observa din Figura 58 pretratarea cu AINS s-a făcut în ordinea selectivității lor pentru COX-2 conform tabelului următor.

Tabelul 5. Efectul procentual al pretratării cu AINS în ordinea selectivității pentru COX-2 asupra contracției la ang II

A B

C D

E

Figura 58 – Efectul pretratării cu ibuprofen (A), ketoprofen (B), sulindac (C), piroxicam (D) și meloxicam (E) asupra contracției angiotensinice

Din datele de mai sus se observă că pretratarea cu AINS reduce efectul stimulării angiotensinice. Acest rezultat este în acord cu literatura care precizează că un procent important al contracției angiotensinice la nivelul mușchiului neted, mai ales vascular, dar și de alte origini este dependentă de COX și de metaboliții lipidici ai acesteia în special TxA2. După cum se observă însă gradul de inhibiție variază cu selectivitatea AINS. Antiinflamatoarele nesteroidiene cu selectivitate minimă, care blochează atât COX-1 (constitutivă) cât și COX-2 (inductibilă), au, în mod paradoxal, un grad mai mic de inhibiție a contracției decât meloxicamul, de exemplu, care este un inhibitor selectiv COX-2 și care are un efect inhibitor maxim. Aceste rezultate ridică niște întrebări importante în ceea ce privește mediația contacției angiotensinice la nivelul tubului digestiv. Este de necontestat faptul că axa AT1 – PLA2 – AA – COX – Tx și PG este implicată în mod esențial dar se pare că metaboliții acidului arahidonic implicați în contracție sunt produși mai ales de COX-2 la nivelul celulei muscular netede digestive.

Această ipoteză este sprijinită de raportarea ang II ca fiind o moleculă proinflamatorie (și în acord cu rezultatele noastre din experimentele precedente care au folosit antioxidanți pentru inhibarea efectelor angiotensinice la nivel vascular).

3.2.2.2.5. Efectul ang II asupra contractilității musculare netede în condițiile inhibiției adrenergice și colinergice

După cum se știe, o parte importantă din medierea contractilității mușchiului neted digestiv de către neuronii intramurali se realizează folosind neuromediatori de alte origini decât cei ai sistemului nervos vegetativ (mediație nonadrenergică-noncolinergică – NANC). În aceste condiții am dorit să știm dacă inhibarea mediației clasice cu 1-blocantul adrenergic – prazosin și cu blocantul receptorilor colinergici M – atropină are efecte asupra contracției colinergice și asupra medierii COX a acesteia.

A

B

Figura 59 – Influența pretratării cu piroxicam (A) și ibuprofen (B) asupra contracției angiotensinice în condițiile inhibării mediației NANC

După cum se observă din rezultatele prezentate mai sus (Figura 59) pretratarea cu atropină și prazosin nu are efecte semnificative asupra inhibiției induse de AINS asupra contracției angiotensinice ba chiar, uneori, se produce o reversie a efectului inhibitor, fără semnificație statistică. Acest rezultat demonstrează, că cel puțin în ceea ce privește medierea COX a contracției angiotensinice la nivelul mușchiului neted digestiv, aceasta nu interferă cu celelalte mecanisme modulatoare ale contractilității digestive.

Administrarea în doză unică de atropină 10-6 M readuce contractilitatea digestivă în limite aproximativ normale pentru stimularea angiotensinică ceea ce înseamnă că există mecanisme inhibitoare sau cel puțin modulatoarea în sens inhibitor cu mediație colinergică. Este posibil ca unii neuroni intramurali cu acțiune inhibitorie să posede receptori colinergici, activarea cărora va produce această revenire a contractilității.

3.2.2.2.6. Efectele IECA și BRA asupra contracției colinergice

Contracția de control a fost realizată prin administrarea unei diluții de 10-6 M carbacol care a produs o contracție stabilă și reproductibilă conform subcapitolului 3.2.2.2.1. Această contracție a fost folosită ca martor pentru fiecare dintre preparatele luate în lucru. Pentru a se vedea dacă există interacțiuni între răspunsul colinergic și preadministrarea de substanțe cu efect asupra metabolismului angiotensinei s-a investigat interacțiunea între acestea.

Preadministrarea de captopril 10-6 M, inhibitor al enzimei de conversie a avut un rezultat neașteptat (Figura 60)

Figura 60 – Efectul preadministrării de captopril asupra contracției indusă de carbacol

Contracția carbacolică a fost diminuată în mod semnificativ deși de principiu cele două substanțe acționează pe substrate complet diferite iar captoprilul nu a avut efecte per se asupra contracției musculaturii netede digestive. Nici stimularea contracției cu SCE pe fond de captopril nu a demonstrat variabilitate semnificativă a contracției electrice. Cauza acestui comportament nu ne este clară încă, dar este posibil ca în lipsa angiotensinei I captoprilul să acționeze asupra altui substrat peptidic angiotensinic deoarece știm că multe dintre aceste enzime sunt interschimbabile, ceea ce ne duce cu gândul la sinteza unui metabolit relaxant și pe de altă parte, s-a dovedit, pe studii clinice, că unii pacienți au prezentat cazuri de constipație cronică după tratamentul cu captopril. De aceea este posibil ca inhibiția enzimei de conversie să reducă motilitatea prin mecanisme încă necunoscute . Inhibiția simultană a sintezei de metaboliți ai acidului arahidonic cu indometacin nu a alterat, conform literaturii, acest efect inhibitor al captoprilului.

În cadrul aceluiași set de experimente preliminare s-a investigat și efectul preadministrării blocantului de receptor AT1, losartan. Ca urmare a preincubării timp de 15 minute s-a observat o creștere semnificativă a capacității de contracției a mușchiului neted intestinal (30 – 40%) (Figura 61).

Figura 61 – Influența preadministrării de losartan asupra contracției carbacolice

Având în vedere efectele inhibitorii ale ang II asupra contractilității musculare netede, efectul losartanului era de așteptat. Pe de altă parte în condițiile lipsei unui aport exogen de angiotensină II există două alternative: fie mucoasa intestinală reține o mică cantitate de peptide angiotensinice ca parte a SRA tisular, peptide a căror efect va fi blocat de losartan, fie receptorul AT1 mai este implicat și în alte moduri în ceea ce privește motilitatea mușchiului neted digestiv.

Figura 62 – Efectele comparative ale captoprilului și losartanului asupra contracției colinergice

Figura 62 reprezintă efectele comparative ale captoprilului și losartanului asupra contracției colinergice. După cum se observă contracția este inhibată de către captopril și stimulată de losartan de manieră semnificativă statistic, toate aceste în condițiile în care motilitatea generală a preparatelor nu a fost modificată în nici un fel, lucru dovedit de contracția finală de control pe carbacol, care respectă în mod riguros contracția inițială.

3.2.2.2.7. Efectele AINS asupra contracției colinergice

Pentru a se observa dacă contracția carbacolică folosește metaboliți ai acidului arahidonic ca mediatori s-a realizat verificarea interacțiunii între AINS și carbacol. După cum se observă din Figura 63, pretratarea cu ketoprofen 10-6 M produce o inhibiție semnificativă a contractilității carbacolice, lucru observat și la AINS-ul COX-2 selectiv – meloxicam. Substanțele care au fost luate în lucru sunt, pe de o parte un inhibitor neselectiv COX-1, COX-2, (ketoprofen), a cărui efect este absolut similar cu cel al meloxicamului, care acționează predominant asupra COX-2. Aceste rezultate demonstrează un anume grad de mediere a contractilității musculare netede prin intermediul metaboliților ciclooxigenazei, lucru care este în acord cu literatura. O serie de alți autori, folosind indometacin ca inhibitor neselectiv de COX-1 și COX-2 și celebrex ca blocant specific de COX-2 , au demonstrat că PGI și TxA2 sunt printre principalii responsabili ai contracțilității musculare netede vasculare.

Din observațiile noastre, se pare că același ansamblu contractil este prezent și pentru efectul contractil al stimulării colinergice. Faptul că nu există diferențe semnificative între reducerea contractilității de către ketoprofen și de către meloxicam (Figura 63) denotă că probabil izoforma inductibilă COX-2 este cea mai importantă în economia contracției.

A

B

Figura 63 – Efectul preadministrării de ketoprofen (A) și meloxicam (B) asupra contracției carbacolice

3.2.2.2.8. Investigarea interacțiunii angiotensină, AINS, BRA și IECA asupra SCE.

După cum am prezentat în partea inițială a lucrării, SCE reprezintă o modalitate rapidă și ușoară de a obține contracții musculare netede, ușor cuantificabile în funcție de frecvența de stimulare, care nu necesită stimulare chimică, reproductibile, de foarte scurtă durată (de obicei durează strict cât stimularea), ceea ce permite repetarea stimulărilor de mai multe ori în cursul aceluiași experiment fără epuizarea preparatului, nu necesită spălări repetate pentru eliminarea stimulantului chimic și în general, după o perioadă de tatonare pentru stabilirea frecvențelor și timpilor de lucru, sunt foarte ușor de folosit.

3.2.2.2.8.1. Efectele ang II asupra motilității intestinale stimulate SCE.

După cum era de așteptat, curba contractilă a stimulării electrice (Figura 64) la frecvențe variabile (4, 8, 16, 32, 64, 100 Hz) a demonstrat în condițiile preincubării cu angiotensină II o inhibiție a contracției SCE (utilizând testul One – Way Anova, p = 0,0364).

Figura 64 – Inhibiția SCE de către pretratarea cu ang II

Toate efectuările de stimulări electrice au fost făcute după dispariția efectului per se al ang II, care necesită aproximativ 10 – 15 minute până la relaxare. Ca și interpretare a acestor rezultate, cea mai plauzibilă ipoteză este cea a angiotensinelor vasodilatatoare obținute din metabolismul altern al angiotensinogenului, angiotensinei 1-12 și al angiotensinei II. Un studiu al distribuției enzimelor alterne a SRA tisular, a prezenței metaboliților de mici dimensiuni (penta-, hexa- heptapeptide de tip angiotensinic) și al distribuției receptorilor de tip Mas, AT1, AT2 și a altora, ar fi de dorit. Probabil ECA 2 sau vreuna din kimazele tisulare prezente în celulele mucoasei intestinale, descompune angiotensina în exces, în condițiile ocupării tuturor receptorilor AT1, în ang 1-7 a cărei efect musculotrop inhibitor este arhicunoscut . Se știe că receptorii AT1 se saturează rapid și este cunoscut efectul tahifilactizant al administrărilor repetate de angiotensină pe orice tip de preparat. Odată ce activitatea contractilă a ang II a fost realizată, receptorii AT 1 rămân blocați o perioadă semnificativă de timp (90 – 120 minute), suficient pentru ca ang II în exces din lichidul de perfuzie să poată fi transformat în ang 1-7. Pe de altă parte, se știe că mucoasa intestinală prezintă o serie de carboxipeptidaze cu rol în digestie și nu este improbabil ca și acestea să aibă un oarecare efect în degradarea ang II în metaboliți inhibitori.

3.2.2.2.8.2. Investigarea contractilității NANC pentru SCE

După cum se știe, contracția SCE este indusă prin depolarizarea neuronilor care se găsesc la nivelul plexurilor submucos și intramural. Acești neuroni sunt în marea lor majoritate colinergici, dar suficienți dintre ei folosesc ca mediatori alte substanțe chimice. Pentru a vedea care este impactul mediației colinergice și adrenergice asupra contractilității native a mușchiului neted ileal s-au blocat receptorii 1 adrenergici cu prazosin și receptorii M colinergici cu atropină. Rezultatul asupra contractilității în câmp electric este prezentat în figurile de mai jos (Figura 65).

A

B

Figura 65 – Influența inhibiției NANC asupra contracției SCE pe preparat circular (A) și longitudinal (B)

Studii preliminare au demonstrat că nici atropina nici prazosinul nu au efecte contractile per se asupra mușchiului neted ileal. Stimularea în câmp electric pe fond de atropină a produs o scădere semnificiativă a contractilității, care se regăsește și la administrarea amestecului atropină plus prazosin. Pe de altă parte, preadministrarea izolată de prazosin nu a produs nici un efect asupra rezultatelor stimulării în câmp electric, ceea ce era de așteptat, având în vedere că activitatea 1 adrenergică a tubului digestiv este destul de redusă.

Administrate ca amestec, cele două substanțe au avut un foarte puternic efect inhibitor al contracției musculaturii netede pe preparatele longitudinale (p = 0,00094) (Figura 65 B). Spre deosebire de acestea, administrarea amestecului atropina/prazosin a avut efecte variabile pe preparatul circular (p = 0,03754) (Figura 65 A). La frecvențe mici de stimulare efectul a fost de inhibiție a contractilității, în vreme ce la frecvențe mai mari contractilitatea a revenit către normal. Aceste efecte ar putea fi explicate astfel:

La nivelul mușchiului longitudinal mediația esențială este cea colinergică, întrucât fibrele musculare longitudinale sunt responsabile pentru mecanismul de propulsie care este în cel mai înalt grad dependent de stimularea vagală. Blocarea receptorilor M cu atropină produce limitarea răspunsurilor întrucât, deși preparatul este izolat și terminațiile vagale sunt îndepărtate, probabil majoritatea neuronilor intramurali prezintă mediație colinergică. Ei eliberează la stimularea electrică tot acetilcolină, la fel ca și terminațiile vagale, care, în condițiile blocării cu atropină reduc contractilitatea. Contractilitatea remanentă (20 – 25%) este probabil independentă, atât de mediația colinergică cât și de cea adrenergică, folosind ca mediator alte substanțe, poate chiar derivați ai acidului arahidonic.

În ceea ce privește contractilitatea musculaturii circulare, aceasta are caracteristici diferite care au fost prezentate mai sus. Forța contractilă este mult mai redusă, frecvența contracțiilor spontane este mai mare, iar funcționalitatea în fiziologia intestinului subțire este legată mai mult de mișcările de segmentare decât de cele de propulsie. Efectul cantitativ observat la acest nivel – în speță inhibiția la frecvențe mici și lipsa de efect la frecvențe mari poate fi datorat intrării treptate în acțiune a neuronilor responsabili cu motilitatea circulară. Ipoteza de lucru este că la stimulare cu frecvență redusă mai puțini neuroni intramurali și submucoși se vor depolariza și majoritatea sunt colinergici. Pe măsură ce frecvența de stimulare crește (adică energia transmisă către celule crește) din ce în ce mai mulți neuroni noncolinergici se vor depolariza astfel producând rezultatele contractile obținute.

3.2.2.2.8.3. Efectele AINS asupra contracției SCE în condițiile inhibiției colinergice și adrenergice

După cum am prezentat mai sus, în condițiile în care scoatem din ecuație stimularea colinergică și adrenergică, mediația prin intermediul metaboliților acidului arahidonic rămâne printre cele mai importante în ceea ce privește contractilitatea musculaturii netede. Se observă că la administrarea mai multor tipuri de AINS inhibiția produsă de atropină și prazosin se păstrează și există un anume grad de contracție remanentă în toate experimentele, cu variații cantitative nesemnificative.

Figura 66 – Influența pretratării cu ketoprofen și sulindac asupra SCE în condițiile inhibiției NANC

Adminstrarea de SCE cu frecvență de 8, 16, 32, 64 Hz asupra preparatului de ileon pretratat cu ketoprofen pe fond de atropină și prazosin a produs inhibiția contracției cu o medie de 75 % (p = 0,00028). De asemenea, administrarea de sulindac pe preparat de ileon pe fond de atropină și prazosin a produs inhibiția contracției cu o medie de 80 % (Figura 66) (p = 0,00002).

A

B

Figura 67 – Influența pretratării cu ibuprofen și piroxicam asupra SCE în condițiile inhibiției NANC

Adminstrarea de SCE cu frecvență de 8, 16, 32, 64 Hz asupra preparatului de ileon pretratat cu ibuprofen pe fond de atropină și prazosin a produs inhibiția contracției cu o medie de 40 % (p = 0,0024) (Figura 67 A). De asemenea, administrarea de piroxicam pe preparat de ileon pe fond de atropină și prazosin a produs inhibiția contracției cu o medie de 38 % (p = 0,01429) (Figura 67 B).

În condițiile în care pretratarea cu AINS ar fi trebuit să inhibe ambele ciclooxigenaze, ramura prostaglandino-tromboxanică a mediației contractile ar fi trebuit să fie abolită, deci contractilitatea ar fi trebuit să se apropie de zero. Aceste rezultate vin în contradicție cu teoria actuală care conferă un procentaj important din mediația contractilă derivaților de acid arahidonic. Rezultatele în acest caz sugerează că, de fapt, există o altă mediație contractilă care este implicată în contracția musculaturii netede digestive. Rezultatele obținute infirmă clar teoria medierii tromboxanice a peristaltismului.

3.2.2.2.8.4. Evaluarea mediației nitrinergice în contractilitatea musculaturii netede intestinale

Este cunoscut faptul că monoxidul de azot este un mediator gazos difuzibil de importanță capitală în medierea relaxării vasculare. De asemenea, o multitudine de studii au demonstrat că NO sintaza este prezentă atât la nivelul mucoasei cât și a celulelor musculare și neuronale din tubul digestiv. NO este un mediator intestinal, dar implicarea sa în motilitatea digestivă nu face obiectul investigației de față, decât în măsura în care ar putea afecta reactivitatea angiotensinică.

Ca urmare, s-a folosit inhibitorul specific de NO sintază L-NAME (L Nitro-Arginin-Metil-Ester) pentru a reduce sau aboli sinteza de NO la nivel intestinal.

Figura 68 – Inhibiția SCE de către pretratarea cu L-NAME

Incubarea cu L-NAME a produs o scădere minoră a contractilității, ceea ce sugerează o mediație nitrinergică a contractilității (Figura 68). Pe de altă, parte se știe că NO este un mediator musculo-relaxant prin intermediul GTP și în nici un caz contractil, ceea ce face ca inhibiția contractilității electrice de către L-NAME să fie cu atât mai paradoxală. Singura ipoteză care poate fi formulată în această situație este că o serie de neuroni contractili de la nivelul inervației intrinseci intestinale au mediație activatoare nitrinergică, iar inhibiția lor va duce la o scădere a contractilității. Pe de altă parte, coadministrarea de L-NAME, angiotensină și prazosin nu a produs o abolire totală a contractilității, ceea ce presupune și o altă serie de mecanisme contractile, probabil un mecanism strict electric reprezentat de depolarizarea membranei și deschiderea canalelor de calciu voltaj dependente.

3.2.3. Musculatura netedă traheo-bronșică

Interacțiunile între angiotensină, AINS și IECA la nivelul musculaturii netede bronșice fac obiectul subcapitolului următor. Studiul a fost efectuat pe ansamblul de traductori izometrici cu stimulare farmacologică și pe sistemul de traductori izometrici cu stimulare în câmp electric. Preparatele folosite au fost inele de trahee și/sau bronhie principală de șobolan Wistar. Preparatele au fost montate în sistemul de traductori și lăsate la echilibrat timp de 60 de minute. Apoi au fost supuse unor contracții de control cu carbacol 10-9 M până la 10-5 M în administrare cumulativă (Figura 69). În urma trasării curbei de control, s-a decis folosirea concentrației de 10-6 M carbacol pentru efectuarea stimulării farmacologice, datorită faptului că doza respectivă este suficient de mare pentru a obține o contracție maximală și suficient de mică pentru a se apropia de concentrațiile fiziologice.

Figura 69 – Curba de control la administrarea cumulativă de carbacol în concentrații de: 10-9 M, 10-8 M, 10-7 M, 10-6 M și 10-5 M.

3.2.3.1. Influența ang II asupra contractilității traheo-bronșice.

Studiul s-a efectuat folosind ang II 10-9 M până la 10-5 M în administrare cumulativă. Nici una din dozele administrate nu a avut efect per se asupra tonusului bazal al inelelor de trahee.

Pentru a se investiga efectul pretratării cu ang II asupra răspunsului contractil la alți stimuli farmacologici în preparatul de trahee de șobolan, s-a efectuat pretratarea cu ang II 10-6 M și incubarea preparatului timp de 15 minute. După acest interval s-a administrat carbacol 10-9 M – 10-5 M în doză cumulativă. Pretratarea cu ang II a inhibat în mod semnificativ contracția colinergică (One – Way Anova: p = 0,04648, diferențe semnificativ statistice între cele două grupuri) (Figura 70).

Figura 70 – Inhibiția contracției carbacolice de pretratarea cu ang II 10-5 M

Având în vedere corespondența între efectul inhibitor asupra contractilității musculaturii bronșice, atât pentru carbacol cât și folosind SCE, este evident că pretratarea are aceste efecte inhibitorii ale contractilității. Co-administrarea de carbacol, ang II și losartan sau PD 123319 nu a produs rezultate semnificative statistic, probabil ca urmare a efectelor strict farmacocinetice în baia de organ. Oricum problema mediației inhibiției contracției colinergice primește un răspuns în subcapitolul imediat următor, unde se dovedește fără echivoc dependența de receptorii AT1 a efectului inhibitor al contracției colinergice.

Pentru investigarea contractilității traheale s-a folosit și ansamblul de traductori izometrici cu SCE (stimulare în câmp electric). Pentru stabilirea unei curbe contractile de bază preparatele montate în baia de organ au fost stimulate cu frecvențe și tensiuni variabile de curent. Tatonările experimentale au dus la stabilirea unei serii frecvență/tensiune cu rezultate reproductibile, care au fost folosite în continuare (Figura 71). Pentru preparatul de trahee de șobolan am obținut contracții optimale și reproductibile la frecvențe de 5, 15, 30, 45, 60 Hz, tensiune de 150 V, timp de 10 s.

Figura 71 – Contracție martor SCE frecvențe: 5, 15, 30, 45, 60 Hz, tensiune de 150 V, timp de 10 s.

Administrarea de angiotensină 10-6 M în pretratare nu a produs nici un efect per se (vezi mai sus). Stimularea cu frecvențele prezentate mai sus a produs la nivelul preparatului pretratat cu ang II un răspuns contractil ce demonstrează o inhibiție (Figura 72) semnificativă statistic (p = 0,00329, Pearson = 0,93965) folosind testul „t” (Paired Two Sample for Means).

Figura 72 – Efectul pretratării cu ang II 10-6 M asupra preparatelor de trahee stimulate în câmp electric.

În concluzie, preadministrarea de angiotensină II inhibă contractilitatea musculaturii netede traheale. Pentru a se verifica medierea acestui efect s-a realizat coadministrarea de angiotensină II cu losartan, blocant specific al receptorilor angiotensinergici de tip 1. Rezultatul administrării a fost o revenire aproape la normal a contractilității traheale conform rezultatelor prezentate în Figura 73.

Figura 73 – Efectul pretratării cu losartan asupra inhibiției angiotensinice a contractilității SCE pe mușchi traheal de șobolan (n = 6, p = 0,0023858)

După cum se poate observa, inhibiția contractilității indusă de ang II este un mecanism AT1 dependent, fapt demonstrat de dispariția aproape completă a efectului la administrarea de losartan. Totuși, se poate observa o ușoară inhibiție remanentă, de 5 – 10 % care ar putea fi atribuită unei mediații prin intermediul AT2.

Administrarea blocantului de receptori AT2 – PD 123319 a produs revenirea efectului contractil al stimulării în câmp electric după administrarea de angiotensină II, dar la nivele intermediare comparativ cu losartanul, ceea ce sugerează o implicare mai redusă, dar posibilă a receptorilor de tip AT2 (Figura 74).

Figura 74 – Efectul pretratării cu PD 123319 asupra inhibiției angiotensinice a contractilității SCE pe mușchi traheal de șobolan

La administrarea de PD 123319 contracția indusă de carbacol pe fondul pretratării cu ang II a revenit la valorile martor.

O altă ipoteză de studiu a fost posibilitatea ca ang II administrată în baia de organ să se scindeze în metaboliți vasodilatatori (a se vedea ang 1-7). Pentru a se elimina această potențială cale metabolică s-a folosit coadministrarea de A773 (inhibitor specific al receptorului Mas). Nici această tentativă nu a redus inhibiția angiotensinică, atât a contracției colinergice cât și SCE, ceea ce scoate, pentru moment, ang 1-7 și alți metaboliți mai mici din discuție.

3.2.3.2. Efectul AINS asupra reactivității musculaturii netede traheo-bronșice.

Studiul s-a efectuat folosind carbacol 10-9 M până la 10-5 M în administrare cumulativă.

Pentru a se investiga efectul pretratării cu AINS asupra răspunsului contractil la carbacol în preparatul de trahee de șobolan, s-a efectuat pretratarea cu AINS 10-6 M și incubarea preparatului timp de 15 minute. După acest interval s-a administrat carbacol 10-9 M – 10-5 M în doză cumulativă. După cum se observa din Figura 75, pretratarea cu AINS clasici cu selectivitate COX-2 în creștere (ibuprofen, ketoprofen, piroxicam, meloxicam) produce o ușoară reducere a contractilității colinergice, dar fără semnificație statistică (n=6, p>0,05). Aceasta poate sugera un efect generic de inhibiție a contactilității, care se poate observa pe aproape toate preparatele musculare netede, dar mecanismul este dificil de precizat.

A

B

C

Figura 75 – Contracție martor de carbacol (A); influența pretratării cu ibuprofen și ketoprofen asupra contracției induse de carbacol (B); influența pretratării cu meloxicam și piroxicam asupra contracției induse de carbacol (C)

Pentru investigarea contractilității traheale s-a folosit și ansamblul de traductori izometrici cu SCE (stimulare în câmp electric). Pentru stabilirea unei curbe contractile de bază preparatele montate în baia de organ au fost stimulate cu frecvențe și tensiuni variabile de curent. Tatonările experimentale au dus la stabilirea unei serii frecvență/tensiune cu rezultate reproductibile, care au fost folosite în continuare (Figura 76). Pentru preparatul de trahee de șobolan am obținut contracții optimale și reproductibile la frecvențe de 5, 15, 30, 45, 60 Hz, tensiune de 150 V, timp de 10 s.

Figura 76 – Contracție martor SCE (n – 5, 15, 30, 45, 60 Hz, tensiune de 150 V, timp de 10 s) pe preparat de trahee de șobolan

Administrarea de AINS 10-6 M nu a produs nici un efect per se asupra contactilității preparatelor taheo-bronșice.

Figura 77 – Influența preadministrării de tenoxicam, ketoprofen și meloxicam asupra contracției SCE

Un rezultat neașteptat a fost obținut la preadministrarea de AINS înainte de stimularea în câmp electric. De manieră sistematică, inhibiția COX a crescut ușor, dar semnificativ, reactivitatea preparatelor stimulate electric (Figura 77).

Acest efect nu este în concordanță cu rezultatele obținute anterior pe stimulare farmacologică, unde administrarea de AINS a inhibat contracția colinergică, iar în prezența angiotensinei II nu s-a obținut nici un efect.

Se știe că stimularea colinergică are o componentă COX semnificativă, responsabilă pentru aproximativ 25% din contracție. În aceste condiții este de înțeles de ce inhibiția COX ar putea reduce contracția rezultată din stimularea receptorilor M, dar nu și creșterea contractilității în condițiile stimulării electrice. Mecanismele prin care se realizează contracția SCE la nivel traheo-bronșic sunt considerate a fi totuși legate de contracția colinergică. Receptorii colinergici esențiali care se găsesc la nivelul musculaturii netede traheo-bronșice sunt de tip M2 și M3 care sunt de tip Gi și Gq. Receptorii de tip M3 produc contracție prin activarea fosfolipazei C, creșterea producției de IP3 și eliberarea de calciu din reticul. Calea M2/Gi nu este încă certă, dar se pare că se realizează prin inhibarea adenililciclazei, care la rândul ei reduce nivelele de AMPc, care deschid canalele de calciu . Stimularea electrică produce depolarizarea neuronilor colinergici și eliberarea intrinsecă de acetilcolină la nivelul musculaturii netede traheo-bronșice (fenomenul se numește cuplare farmaco-contractilă).

Cu toate acestea, rezultatele noastre nu sprijină această ipoteză, deoarece SCE în prezența AINS crește contractilitatea, în timp ce carbacolul în prezența AINS, produce contractilitate scăzută.

Concluzia este că există o cale de mediație COX-dependentă a contractilității, probabil prin intermediul unor derivați musculo-relaxanți de acid arahidonic. Inhibiția COX produce reducerea sintezei acestor substanțe relaxante, ceea ce face ca efectul colinergic de cuplare farmaco-contractilă să fie mai puternic.

Administrarea de atropină pe fondul acestei inhibiții ar fi trebuit să reducă complet sau măcar să inhibe în mod semnificativ contracția produsă de SCE. Totuși, din rezultatele noastre, acest fenomen nu s-a întâmplat în condițiile administrării de AINS și atropină, lucru care sprijină în continuare ipoteza medierii COX a contracției stimulate electric la mușchiul neted traheo-bronșic (Figura 78).

Figura 78 – Influența preadministrării de ibuprofen și de atropină și ibuprofen asupra SCE

3.2.3.3. Efectele administrării concomitente de ang II și AINS asupra musculaturii netede traheo bronșice

Preincubarea cu AINS de tip ibuprofen, ketoprofen, meloxicam și piroxicam nu a produs efecte semnificative asupra inhibiției contracției SCE de către ang II (Figura 79) Lipsa oricărui tip de efect reprezintă probabil neimplicarea COX, ambele izoforme, în acțiunea angiotensinei, cu toate că unii autori sugerează un astfel de rezultat, deși doar la nivel vascular. Experimentele s-au realizat la multiple nivele ale traheei și bronhiilor principale de șobolan, până la limita aparaturii din dotare. Nici unul dintre aceste preparate nu a demonstrat producerea unei contracții semnificative. Deși literatura indică prezența receptorilor atât de tip AT1 cât și de tip AT 2 la nivelul mucoasei și musculaturii netede traheo bronsice, precum și a ECA, angiotensinogenului dar nu și a reninei la acest nivel , cauza acestei lipse de răspuns per se încă nu poate fi elucidată. Deși autorii mai sus menționați admit existența unei contracții slabe și tranzitorii abolită de losartan experimentele noastre nu au putut-o pune în evidență.

Utilizarea de inhibitori de enzimă de conversie precum captopril produce o reversie a efectului inhibitor al ang II asupra contractilității musculaturii atât colinergică cât și SCE. Având însă în vedere că ang II se găsește în soluție din surse exogene efectul captoprilului sugerează mai degrabă o intervenție asupra metabolismului bradikininei decât al angiotensinelor.

Se știe că IECA au efecte bronhoconstrictoare la un număr semnificativ de pacienți dar efectul în vitro asupra contracției musculare netede traheo bronșice este puțin studiat. În orice caz mediația kininergică depășește obiectul studiului de față și va fi probabil urmărită în investigații ulterioare.

A

B

C

D

Figura 79 – Influența pretratării cu ang II asupra contracției SCE (A); influența pretratării cu ibuprofen și ang II asupra contracției SCE (B); influența pretratării cu ketoprofen și ang II asupra contracției SCE (C); grafic cumulativ cu influența pretratării cu ang II, ibuprofen și ang II și ketoprofen și ang II asupra contracției SCE (D)

3.3. DISCUȚII

Efectul angiotensinei II administrate izolat asupra mușchi neted vascular

Angiotensina II este un puternic vasoconstrictor, dar ale cărui caracteristici contractile pe preparatul izolat sunt semnificativ diferite de cele induse de mediația adrenergică sau de KCl. Din punct de vedere cantitativ, angiotensina II în concentrație optimă (10-6 M) administrată în lichidul de perfuzie nu produce o contracție la fel de mare ca și fenilefrina în aceeași concentrație, iar caracteristicile curbei contractile sunt diferite. Contracția nu se menține indefinit precum în cazul stimulării adrenergice, ceea ce sugerează că receptorii AT1 nu rămân ocupați pe o perioadă foarte lungă (ipoteză infirmată de fenomenul de tahifilaxie caracteristic angiotensinei II) sau, mai probabil, contracția angiotensinică are mediație multiplă care epuizează mult mai rapid rezervele energetice ale preparatului.

Contracția angiotensinică la nivel vascular se conformează relației doză-efect, administrarea succesivă de doze crescătoare permițând trasarea unei curbe cumulative doză-efect de tip clasic.

Un element important este că acest aspect al curbei generată de administrarea de angiotensină II nu este influențat de prezența sau absența endoteliului vascular, ceea ce semnifică faptul că receptorii AT1 care mediază contracția se găsesc la nivelul membranei miocitelor vasculare. De altfel, pe niciunul din tipurile de preparate vasculare efectele angiotensinei sau ale substanțelor care influențează metabolismul său nu au fost endotelio-dependente.

Contracția angiotensinică are niște caracteristici aparte, prin faptul că este dependentă de mai multe căi de mediere pentru a se realiza, căi de mediere care au importanță variabilă în funcție de tipul de țesut muscular neted la nivelul căruia are loc medierea:

– Receptorul AT1 activat acționează prin intermediul proteinei Gq. Proteina Gq activează fosfolipaza C, care generează producția de 1,4,5-inozitoltrifosfat (IP3) și diacilglicerol (DAG). IP3 eliberează calciu din depozitele intracelulare, iar DAG determină un influx de calciu din mediul extracelular. Creșterea concentrației intracelulare de calciu va fi urmată de contracția celulelor musculare, mai ales la nivelul celulelor netede vasculare .

– Receptorul AT1 stimulează tirozin kinaza care activează proteinkinaza asociate mitogenezei (MAPK). Aceasta stimulează creșterea activității NF-κB și a fost asociată cu sistemul NADH/NADPH din membrana celulelor endoteliale, generând SRO. SRO sunt capabile să reducă eliberarea oxidului nitric (NO), determinând vasoconstricție și scăderea oxidării LDL

– O altă cale prin care se mediază contracția indusă de ang II este reprezentată de efectul asupra ciclooxigenazelor, care, la rândul lor, generează metaboliți lipidici vasoconstrictori de tipul TxA2 și a PGI .

Efectul blocanților enzimei de conversie și a blocanților de receptori AT1 asupra diverselor tipuri de mușchi neted vascular

În administrarea unică sau în doze cumulative captoprilul (inhibitor al enzimei de conversie a angiotensinei) nu a avut nici un efect per se asupra tonusului mușchiului neted vascular. Acest rezultat este în concordanță cu literatura și sugerează că, la nivelul ansamblului endotelio-muscular vascular, atât angiotensina I cât și enzima de conversie se găsesc în cantități minime și nu afectează sinteza locală de angiotensină II.

De asemenea, administrarea de losartan (blocant de receptori AT1) și de PD123379 (blocant de receptori AT2) nu a avut nici un efect per se asupra preparatelor vasculare. Aceasta sprijină în continuare ideea că la nivelul ansamblului endotelio-muscular vascular angiotensina II activă provine doar din plasmă și nu este generată local.

Efectul AINS administrat izolat asupra diverselor tipuri de mușchi neted vascular

Administrarea de AINS asupra preparatelor izolate arteriale nu a produs efecte per se. S-au folosit majoritatea AINS disponibile și utilizate pe piața farmaceutică, acestea fiind în ordinea selectivității lor COX-2 astfel: ibuprofen, ketoprofen, sulindac, nimesulid și meloxicam.

Aceste rezultate sugerează că, deși, conform literaturii, atât în endoteliu cât și în mușchiul neted vascular există atât COX-1, COX-2 cât și receptori pentru prostaglandine și tromboxani, medierea tonusului bazal arterial nu se face cu ajutorul acestora.

Efectul AINS asupra contracției angiotensinice

Există dovezi clare în literatură că stimularea receptorilor AT1 de către angiotensina II are efecte nete proinflamatorii, cu sau fără implicarea variațiilor de presiune arterială (197). O serie de experimente clinice și paraclinice au demonstrat că blocarea sistemului renină-angiotensină fie cu inhibitori ai enzimei de conversie (ECA), fie cu blocanți ai receptorilor angiotensinici (BRA), reduce răspunsul inflamator la nivel vascular (198). Dar, în ciuda investigațiilor intense, mecanismele inflamației vasculare induse de Ang II sunt încă necunoscute. Pe de altă parte, interacțiunea între ang II și rezultatele metabolismului vascular al cicloxigenazelor la nivelul mușchiului neted vascular sunt mai puțin studiate.

Administrarea de ibuprofen în incubare a redus contracția determinată de ang II în manieră dependentă de doză, până la abolirea completă a acesteia.

Rezultatele experimentale au fost independente de prezența endoteliului vascular pe preparat, inhibiția contractilă fiind prezentă în ambele cazuri.

După ce s-a stabilit selectivitatea efectului inhibitor la contracția angiotensinică, s-au folosit și alți inhibitori de COX în diverse concentrații, pentru a se elimina un eventual efect idiosincrazic.

Ca urmare, s-a folosit ketoprofen hidrocloric (Sigma) ca inhibitor hidrosolubil nespecific de COX, în aceleași condiții ca cele prezentate mai sus.

O altă serie de experimente a fost efectuată în scopul diferențierii acțiunii asupra enzimelor implicate în metabolismul acidului arahidonic, care ar putea fi implicate în reducerea contracției angiotensinice de către agenții farmacologici inhibitori ai COX. Ca urmare, s-a folosit un inhibitor specific al COX-2, nimesulid hidrosolubil și disponibil comercial (Sigma Co).

S-a repetat protocolul prezentat la punctele anterioare și s-a demonstrat un efect puternic inhibitor, dependent de doză, al nimesulidului asupra contracției induse de ang II 10-6 M. Fiind un efect dependent de doză, s-a putut construi curba doză-efect, ce are o configurație similară cu cele ale ibuprofenului și ketoprofenului.

Efectul AINS asupra contracției adrenergice

Experimentele au fost completate cu administrarea de nimesulid în pretratare a contracției fenilefrinice și potasice. Nu s-au obținut modificări semnificative ale contractilității fenilefrinice sau potasice.

S-a demonstrat că pre-incubarea cu ibuprofen nu a produs nici un fel de modificare a contracției fenilefrinice, nici în doză minimă (10-9 M) nici în doză maximă (10-5 M) (n=4).

Protocolul experimental a fost repetat folosind ca agent contractant KCl 40 mM. Nici de această dată nu a fost obținută nici un fel de modificare a contracției potasice în prezență de ibuprofen 10-5 sau 10-9 M (n=4).

În scopul eliminării suspiciunii de efect inhibitor nespecific al contractilității musculare netede, s-au repetat experimentările cu ketoprofen în prezența fenilefrinei 10-6 M și a KCl 40 mM. Nici una dintre contracțiile induse de aceste substanțe nu a fost afectată de preincubarea de ketoprofen, ceea ce certifică faptul că efectul inhibitor este conturat doar la contracția angiotensinică

Efectul angiotensinei II asupra preparatelor vasculare stimulate cu SCE

Creșterea contractilității se poate datora unui efect cantitativ – în urma preadministrării de angiotensină II în celulele musculare netede s-a acumulat o cantitate suplimentară de calciu, care nu a fost eliminată complet. În condițiile în care se aplică stimul electric, mecanismele de stimulare a contracției ce funcționează în cadrul SCE vor produce un influx suplimentar de calciu care împreună cu cantitatea deja existentă vor realiza o contracție mai puternică.

Receptorii AT1 au activat sistemul de fosfolipaze membranare producând o cantitate crescută de mediatori secunzi de tip IP3 și DAG, care nu au fost încă degradați în cele 5 – 10 minute care s-au scurs între sfârșitul contracției angiotensinice și aplicarea de stimuli electrici. Există modalități de identificare a acestor mecanisme, dar nu fac parte din obiectivele lucrării și astfel nu au fost urmărite în continuare.

Efectul blocanților enzimei de conversie și inhibitorilor de receptor AT1 asupra preparatelor vasculare stimulate cu SCE

Incubarea preparatului cu IECA a produs răspunsuri semnificativ mai mari la stimularea în câmp electric.

Și incubarea cu blocanți ai receptorilor pentru angiotensină (BRA) a crescut răspunsurile la stimularea electrică.

Rezultatul este oarecum paradoxal deoarece însăși pretratarea cu angiotensină II crește contractilitatea preparatului de arteră renală stimulat cu SCE. Blocarea enzimei de conversie nu ar trebui să aibă efecte semnificative asupra contractilității vasculare, de vreme ce rezervele locale de angiotensină I sunt nesemnificative. Literatura prevede efecte inhibitoare ale contractilității în cazul captoprilului prin mecanisme antiangiotensinice, inhibitoare ale influxului de calciu, stimulatoare ale metabolismului bradikininei sau modulatoare ale metabolismului prostaglandinelor. Totuși o serie de rezultate privind experimente efectuate exclusiv pe câmp electric au arătat că administrarea de captopril nu are efect sau chiar crește răspunsul presor în condițiile stimulării electrice .

Efectul AINS asupra preparatelor vasculare stimulate cu SCE

Aceste rezultate se înscriu în tendința generală de scădere a contractilității musculaturii netede de către AINS. O serie de studii implică COX-1 ca unul din mecanismele de mediație a contractilității musculare netede vasculare ceea ce face ca discuția rezultatelor de mai sus să fie ipotetică. SCE produce contracție a mușchilor netezi prin depolarizarea terminațiilor nervoase vegetative. Acești neuroni secretă o multitudine de neuromediatori printre care se poate presupune că există și produși lipidici ai metabolismului COX, cu acțiune predominant constrictoare, mai ales din grupul tromboxanilor. Blocarea receptorilor prostaglandinici de la acest nivel ar trebui să fie următorul pas în studiul interacțiunii COX – Ang II.

Pe de altă parte, este cunoscută ipoteza intervenției metaboliților acidului arahidonic în contractilitatea musculară netedă. Se știe că unul (unii) din metaboliții contractili la nivelul msculaturii netede vasculare este așa numitul EDHF (Endothelium-Derived-Hiperpolarising-Factor) care este un acid hidroxieicosaenoic sau epoxieicosatrienoic, produs de către lipoxigenazele (LOX) care acționează la nivelul mușchiului neted. Pe de altă parte, există o serie de prostaglandine și tromboxani vasoconstrictori care sunt implicați în menținerea contracției mușchiului neted pe perioade îndelungate . Este posibil ca inhibitori nespecifici de COX precum ketoprofenul sau nimesulidul să aibă efecte asupra mediației lipidice a acestei contracții și astfel să reducă contractilitatea mușchiului neted vascular.

Artrita reumatoidă, de exemplu, este asociată cu o mortalitate cardiovasculară înaltă , care este pusă pe seama funcției deficitare a endoteliului vascular în condițiile unei prezențe crescute de angiotensină II. Reducerea efectului contractil al EDHF cu ajutorul combinației dintre AINS și inhibitori ai receptorilor AT1 ar putea avea efecte benefice asupra mortalității cardiovasculare din afecțiunile inflamatorii articulare cronice.

Efectele diverselor combinații AINS și angiotensină asupra preparatelor vasculare stimulate cu SCE

Co-administrarea de AINS (ibuprofen) împreună cu ang II a redus în mod semnificativ amplitudinea contractilă la stimularea SCE.

Din rezultatele anterioare s-a observat că angiotensina II potențează contracția indusă de SCE. Reducerea efectului contractil al SCE pe fond de angiotensină observată la inhibiția COX cu AINS este o dovadă clară a implicării metaboliților acidului arahidonic în contracția musculară netedă. Acest fenomen, al inhibiției forței contractile a musculaturii netede de către AINS, observat nu numai la nivelul mușchiului neted vascular ci și la mușchiul neted digestiv și respirator, nu numai pe angiotensină II ci și pe contracție adrenergică, colinergică sau potasică, vine în sprijinul ipotezei mediației nespecifice a contracției prin metaboliții acidului arahidonic. Rezultatul este util prin faptul că sugerează că asocierea de AINS cu substanțe medicamentoase cu potențial vasocontractil ar putea reduce riscurile cardiovasculare induse de acestea.

Efectele modulatoare diferite ale ionilor de amoniu asupra acțiunilor vasculare ale angiotensinei pe aortă și artere renale izolate de șobolan

Amoniacul (NH3) este cea mai simplă moleculă neionică dintre compușii cu azot care are rol esențial în multe procese biologice. Fiind o bază slabă NH3 este format prin dezaminarea naturală a moleculele endogene și apare în concentrații micro-moleculare în sângele uman ca rezultat a difuziei sale prin membranele celulare. Ca parte a ciclului azotului, NH3 îndeplinește rolul de componentă pentru sinteza aminoacizilor, nucleotidelor și proteinelor. Având multe origini endogene și exogene, mare parte din NH3 este detoxificat la mamifere, în principal, prin conversia sa la uree în ficat cu participarea a cinci enzime ale ciclului ureei . În celulele tubilor renali, NH3 este protonat și transformat în forma ionică (NH4+) prin reacția cu ionii de H+ secretați. Ionii de amoniac rezultați cresc în celulă prin captarea H+ datorită mediului intacelular mai acid și a membranei puternic permeabile. În aceste circumstanțe, NH3 se echilibrează între spațiile extra și intracelulare, inducând o mare varietate de alterări biochimice și neuropatologice.

În lichidele biologice, NH3 există ca atare sau predominant ca ioni de amoniu (NH4+), în funcție de pH-ul soluțiilor. Efectele NH3/NH4+ în sistemele biologice sunt iritative și sunt responsabile pentru câteva acțiuni toxice care interferează cu metabolismul energetic mai ales în creier. Creșterea NH4+/NH3 în sânge a fost corelată cu coma hepatică, scăderea excitabilității neuronale, crizele epileptice, convulsii induse de presiunea crescută a oxygenului în aerul respirat și stări de oboseală .

Ionii de amoniu inhibă transmisia sinaptică prin acțiune postsinaptică, producând un efect inhibitor asupra descărcărilor induse de glutamat . Hiperamoniemia cronică intensifică apoptoza neuronală și crește turnover-ul serotoninei inducând alterări ale somnului văzute în encefalopatia hepatică .

Câteva mecanisme electrofiziologice și biochimice au fost propuse pentru a explica efectele dăunătoare ale NH4+/NH3 pe funcțiile sistemului nervos central (SNC), începând cu procesele normale de asimilare, depozitare sau eliberare a neurotransmițătorilor și sfârșind cu întreruperea traficului neuronal-astrocitar al aminoacizilor sau neuroaminelor la nivel cerebral .

Toxicitatea acută a amoniacului este mediată prin creșterea acumulării de oxid nitric care se combină cu radicalii liberi și formează un compus foarte toxic, peroxinitritul . O legătură de hidrogen formată între anionul superoxid și ionul amoniu accelerează transferul de electroni de la radicalul anion la oxigen. Producerea nitrogenului reactiv intermediază nitrarea proteinei tirozină, alterează funcția astrocitelor și contribuie la neurotoxicitatea amoniului .

Hiperamonemia blochează canalele de calciu, acțiune ce mărește efectele depresiei sistemului nervos central și al unor analgezice opioide .

Relația dintre hiperamonemie și sistemul hormonal renină-angiotensină a fost studiată predominant la nivel renal. Administrarea de NH4Cl este asociată cu acidoză metabolică și cu nivele crescute în plasmă de renină-angiotensină și aldosteron . Perfuzia timp de 60 de minute de NH4Cl a suprimat activitatea reninei plasmatice .

În timp ce ang II are efecte puternice asupra vitezei de secreție și producere a amoniacului renal de către segmentele tubulare proximale , potențate de acidoza NH2Cl , efectul ionilor de amoniu pe mușchiul neted vascular în general și pe artera renală în particular, sunt încă sub investigații. Folosind benzi (stripuri) helicoidale din aortă izolată de iepure, Furtado în 1987 a semnalat faptul că o scurtă expunere la NH4Cl nu a afectat tensiunea aortică de repaus, dar a modificat responsivitatea strip-urilor precontractate cu noradrenalină. Ionii de amoniu determină relaxarea arterelor mari izolate de câine, independent de prezența endoteliului , și amplifică contracția indusă de K+ pe aorta de șobolan facilitând influxul transmembranar de Ca2+ . Pe de altă parte, tonusul vascular și contractilitatea spontană a venei portale izolate de sobolan au fost crescute de clorura de amoniu și scăzute în soluția fără calciu în prezența a 1M nifedipină .

În acord cu unele date din literatură , rezultatele succint prezentate aduc o modestă contribuție la studiul proprietăților modulatoare diferite ale ionilor de amoniu la nivelul aortei toracice și arterei renale de șobolan. Mecanismul de producere a acestor efecte este complex, începând cu reactivitatea receptorilor specifici și manifestările electro-chimice membranare însoțitoare și sfârșind cu reacțiile metabolice celulare.

Deși ambele teritorii (structuri) vasculare sunt vase de conductanță cu densitate și sensibilitate diferită a formațiunilor receptoare, receptorii alfa-adrenergici testați cu fenilefrină sau noradrenalină nu au prezentat modificări semnificative de reactivitate în prezența ionilor de amoniu, în timp ce receptorii angiotensinici au fost intens influențați în prezența acestora, mai ales în cazul inelelor perfuzate de arteră renală.

Studiul comparativ al efectelor NH4Cl asupra contractilității inelelor aortice și renale produsă de ang II, a evidențiat inhibarea acțiunii vasoconstrictoare a acesteia în cazul aortei toracice și potențarea semnificativă a contractilității arterelor renale. Mare parte din studiile anterioare au demonstrat că efectele vasculare ale ang II sunt în principal constrictive datorită stimulării receptorilor AT1 și protein kinazei C, activării IP3 și eliberării de calciu citosolic dublată de proprietăți decelabile vasodilatatoare . Acțiunile vasodilatatoare ale ang II au la bază stimularea receptorilor AT2 activatori ai formării și eliberării de NO-GMPc, prostaglandine și kinine plasmatice . În timp ce receptorii AT1 interacționează cu proteinele G5 inducând fosforilarea tirozin kinazei și activarea protein kinazei activată de NO , receptorii AT2 sunt implicați prin proteinele Gi în activarea fosfatazelor defosforilatoare . Vasorelaxarea determinată de ang II apărând evidentă în experiențele noastre numai la nivelul vaselor renale precontractate cu fenilefrină sau noradrenalină, ne-a permis evidențierea proprietăților modulatoare ale NH4Cl și asupra receptorilor de tip AT2 ai angiotensinei la nivel arterial renal. Spre deosebire de acțiunea vasoconstrictoare potențată de către NH4Cl, efectele vasodilatatoare ale acesteia, semnalate anterior de Tirapelli și col. pe carotidă izolată de șobolan și de Grbovic și col. pe arteră renală izolată, au apărut puternic inhibate în prezența ionilor de amoniu.

Semnificația funcțională a acestor modificări de reactivitate vasculară renală diferită la ang II de către excesul ionilor de amoniu este insuficient precizată. Potențarea vasoconstricției la nivelul arterei renale produsă de creșterea reactivității receptorilor AT1, dublată de inhibarea relaxării indusă de receptorii AT2, ar putea contribui la dereglările fluxului sanguin renal în hiperamonemiile de diferite cauze.

Rezultatele de mai sus furnizează o dovadă în plus pentru proprietățile modulatoare diferite ale ionilor de amoniu asupra aortei toracice și arterei renale de șobolan. Deși promițătoare, aceste studii au nevoie de reproduceri ulterioare și de noi cercetări cu tehnici și metode mai avansate.

Interacțiunile vasculare dintre aldosteron, ang II și antioxidanți

Datele recente referitoare la efectele nongenomice ale aldosteronului au identificat un receptor membranar specific (receptor nongenomic – NGR), care este diferit de receptorul de mineralocorticoizi citosolic (MR), având o varietate de acțiuni care contribuie la reglarea cardiacă și a homeostaziei tensiunii arteriale, independente de sărurile renale și de echilibrul hidro-electrolitic . Ambele tipuri de receptori mineralocorticoizi sunt prezente în celulele endoteliale și musculare netede vasculare . S-a stabilit că prezența dehidrogenazei hidroxisteroid 11 (11HSH2) în țesuturile sensibile la mineralocorticoizi, protejează MR împotriva activării de către glucocorticoizi . În același timp, s-a demonstrat că aldosteronul acționează ca un hormon cheie care participă în patogeneza unor afecțiuni cardiovasculare . Aldosteronul inhibă contractilitatea în trabeculele ​​atriale și ventriculare ale inimii umane și potențează răspunsul vasoconstrictor al angiotensinei II (ang II) în arterele coronare, în timp ce reglează „up” receptorii angiotensinei .

Angiotensina II fiind principalul reglator al sintezei de aldosteron suprarenal, prin complexul AT1R membranar , interacțiunile dintre acești doi hormoni, sunt de asemenea prezente în mușchiul cardiac și în celulelor musculare netede vasculare . Prin efecte rapide nongenomice, aldosteronul poate crește eliberarea de NO (oxid nitric) din endoteliul vascular sau poate stimula producția de SRO ca molecule de semnalizare prin activarea NADPH – oxidazei, în funcție de nivelul stresului oxidativ din mediu . În situații cu nivel scăzut de stres oxidativ, aldosteronul contribuie la vasodilatația indusă de activarea eliberării predominante de eNOS și NO, în timp ce în anumite condiții vasculare preexistente de daune oxidative importante, aldosteronul participă la producerea de vasoconstricție prin creșterea nivelului de radicali liberi derivați din oxigen . În acest fel, prin acțiuni rapide nongenomice vasculare, aldosteronul poate provoca vasoconstricție, vasodilatație sau nici un efect.

Tratamentul combinat al celulelor musculare netede vasculare, cu aldosteron și Ang II exercită un efect sinergic chiar la doze de neeficace . Inducând stres oxidativ și vasoconstricție prin mecanisme nongenomice, aldosteronul a fost considerat a fi implicat în patogeneza unor forme de hipertensiune arterială, pe lângă implicațiile sale genomice. Aceste noi descoperiri subliniază rolul aldosteronului ca un hormon cardiovascular cheie.

Pe de altă parte, formarea crescută de specii reactive de oxigen datorită aldosteronului și Ang II contribuie la disfuncțiile cardiace și vasculare. Captatorii (scavengerii) de radicali liberi superoxid dismutaza, catalaza și dimetil sulfoxidul (DMSO), administrate la șobolani cu hipertensiune acută indusă cu Ang II în perfuzie, au redus daunele vasculare induse de acest tip de hipertensiune arterială, ceea ce sugerează că speciile reactive ale oxigenului pot juca un rol în patogeneza unor boli vasculare hipertensive .

Există, de asemenea, un echilibru delicat între vasoconstricția produsă de Ang II indusă de anionul superoxid, H2O2 și peroxinitrit pe de o parte, și vasodilatația cauzată de NO în celulele musculare netede vasculare, pe de altă parte . Inhibarea sintezei de NO cu L-NAME mărește vasoconstricția produsă de Ang II și determină stres oxidativ . Peroxinitritul rezultat din combinația NO și superoxid contribuie la efectele vasculare cerebrale nocive ale Ang II .

Blocarea receptorilor aldosteronului este frecvent utilizată în cardio-miopatii , deoarece reduce răspunsurile inflamatorii/fibrinogenice induse de Ang II , prevenind apoptoza celulelor endoteliale și îmbunătățirea activității nervilor simpatici .

În timp ce spironolactona inhibă receptorii mineralocorticoizi clasici ai aldosteronului, eplerenona blochează predominant efectele sale nongenomice asupra schimbului Na+/H+, nivelelor de Ca2+ intracelular și vasoconstricției vaselor de rezistență mezenterice .

Acumularea de noi dovezi sugerează că acțiunile nongenomice cardiovasculare ale aldosteronului sunt produse prin căi celulare variate și mediate de o multitudine de sisteme mesagere inclusiv speciile reactive ale oxigenului și azotului. Stresul oxidativ și nitrosativ fiind implicat în căile ce conduc la activarea sistemului angiotensină-aldosteron, am propus reevaluarea interacțiunilor funcționale dintre aldosteron, ang II și antioxidanți în mușchiul neted vascular izolat din inelele de aortă de șobolan. A fost demonstrat că la pacienții hipertensivi cu insuficiență cardiacă, tratamentul prelungit cu diuretice tiazidice, blocanți de canale de calciu, inhibitori ai ECA și alte combinații terapeutice produce creșterea stresului oxidativ și disfuncție endotelială chiar dacă tensiunea arterială este scăzută .

Multe cercetări au demonstrat în ultimii ani că, pe lângă activarea transportului de sodiu transepitelial unidirecțional, aldosteronul participă în reglarea și modularea activității cardiovasculare, completând astfel efectele sale renale și volemice. Cele două acțiuni principale ale aldosteronului, fiind produse prin receptorii mineralocorticoizi citosolici/nucleari (genomic) și prin receptorii membranari (nongenomic), se bazează pe mecanisme diferite. Spre deosebire de receptorii mineralocorticoizi genomici, care activează lent transcripția genică nucleară, generând proteine efectoare, receptorii membranari nongenomici declanșează reacții electrochimice care determină activarea sau inhibarea rapidă a răspunsurilor celulare cu participarea speciilor endoteliale reactive ale oxigenului și azotului.

Astfel, aldosteronul inhibă efectele vasoconstrictoare ale angiotensinei într-o manieră doză-dependentă, fără a fi implicat și endoteliul. Acest efect nu pare să fie mediat de către receptorii genomici pentru aldosteron, deoarece blocarea acestor receptori cu spironolactonă nu afectează vasoconstricția angiotensinică.

Datele obținute furnizează argumente suplimentare asupra faptului că acțiunile nongenomice ale aldosteronului pe celulele musculare netede aortice de șobolan sunt o problemă de interacțiune și echilibru între efectele sale rapide vasoconstrictoare și vasodilatatoare, ca rezultat al activării speciilor reactive ale oxigenului în primul caz și a speciilor reactive ale azotului în cel de-al doilea caz.

Cascada chimică a interacțiunilor vasculare dintre aldosteron, angiotensină II și antioxidanți pe celula musculară netedă aortică este prezentată în Figura 80.

Figura 80 – Interacțiunile vasculare dintre aldosteron, angiotensină II și antioxidanți pe celula musculară netedă aortică de șobolan

Această interacțiune complexă poate explica faptul că aldosteronul ca activator al speciilor oxigenului și azotului, poate avea de asemenea acțiuni benefice dar și dăunătoare asupra funcțiilor cardiovasculare.

Efectele biologice ale aldosteronului ar trebui interpretate în acest context. La un nivel scăzut al stresului oxidativ ambiental, aldosteronul determină producția de NO și vasodilatație, în timp ce în situații cu creșterea stresului oxidativ va prevala disfuncția endotelială și efectele negative induse de vasoconstricție. Astfel, aldosteronul ar putea fi considerat „atât prieten cât și dușman”. În acest fel, progrese recente au ridicat o serie de întrebări cu privire la modul în care aldosteronul deteriorează funcțiile cardiovasculare și soluționarea lor ar putea conduce la îmbunătățiri terapeutice.

Evaluarea motilității colinergice și adrenergice a preparatului de esofag

După cum se poate observa, contractilitatea pe preparatele longitudinale este foarte puternic afectată de inhibiția receptorilor adrenergici și colinergici, ceea ce intră în oarecare conflict cu inabilitatea de răspuns de la nivelul stimulării colinergice. Singura modalitate prin care s-ar putea explica inhibarea contracției de către atropină este că mediația contractilă a neuronilor plexurilor intramusculare nu este strict colinergică, ci eliberează și alți mediatori cu efect contractil. Pe organul izolat, cu mediația vagală întreruptă este posibil ca răspunsul neuronal colinergic să fie mai important decât cel muscular colinergic. Terminațiile vagale eliberează acetilcolină către neuronii Meissner și Auerbach, stimulându-i pe aceștia să elibereze un mediator musculotrop. În lipsa vagului adăugarea de carbacol în baia de organ nu stimulează echivalent acești neuroni, ca urmare nu se produce contracție colinergică.

Pe de altă parte, SCE produce depolarizarea electrică a neuronilor mienterici, ceea ce va produce eliberarea de mediatori musculotropi, cu răspunsul contractil evidențiat. În condițiile în care în lichidul de perfuzie este prezentă atropina, efectul acesteia probabil reduce responsivitatea electrică a neuronilor mienterici, ceea ce inhibă răspunsul contractil conform datelor prezentate în figurile de mai sus.

Pe de altă parte, se știe că stimularea 1 adrenergică este un puternic stimul la nivelul musculaturii netede, deși receptorii 1 sunt mai puțin prezenți la nivelul tubului digestiv. Totuși coincubarea cu prazosin (blocant 1) produce o inhibiție a contracției la SCE de 20 – 25 %, lucru care poate fi pus pe seama mediației histaminice sau adenozinice de cale intermediară în circuitele interplexare scurte .

Din toate cele de mai sus putem conchide că mediația contractilă esofagiană este extraordinar de complexă, necesită studii prelungite iar orice inferențe am putea obține din datele funcționale legate de contractilitatea angiotensinică sunt obligatoriu provizorii și supuse discuției.

Efectele mediației angiotensinergice asupra motilității esofagiene

Acest rezultat respectă tendința generală de inhibiție a contractilității de către angiotensina II administrată exogen. Pentru a se evidenția mediația acestui efect inhibitor s-au folosit blocanți de receptori angiotensinici (losartan și PD 123319). Administrarea de losartan a redus aproape complet efectul inhibitor al pretratării cu ang II, ceea ce sugerează în mod evident implicarea receptorilor AT1 în inhibiția contracției. Coadministrarea de PD 123319 nu a modificat în mod semnificativ efectele pretratării cu ang II, ceea ce sugerează implicarea redusă a receptorilor AT2 în motilitatea esofagiană.

Efectul interacțiunii între AINS și Ang II la nivelul musculaturii netede esofagiene

Preincubarea cu ang II a redus semnificativ contractilitatea la SCE, de manieră previzibilă, în acord cu toate celelalte rezultate obținute cu acest protocol. Coadministrarea de ketoprofen sau alte inhibitoare neselective de COX a redus și mai mult contractilitatea musculaturii netede esofagiene. Toate aceste rezultate indică faptul că musculatura netedă esofagiană pare a fi mai puțin dependentă de medierea tromboxani/prostaglandine a contracției. Efectele inhibiției COX par a fi strict cantitative. Este dificil de determinat, datorită variabilității interindividuale ale animalelor de experiență, care este contribuția procentuală a fiecăruia dintre factorii contractili (COX, PLA2, AMPc) dar, cel puțin în cazul contracției mușchiului neted esofagian angiotensina și receptorii AT1 nu par a fi de o importanță majoră.

Evaluarea contractilității musculaturii ileale pe preparat circular și longitudinal

Efectul administrării de ang II asupra preparatelor de intestin subțire

Se cunoaște implicarea SRA în maturarea musculaturii netede în utero (prin AT2) . Animalele knock out pentru receptorul AT2 nu supraviețuiesc perioadei de gestație datorită (printre altele) incapacității de angiogeneză. Receptorul angiotensinergic 2 reglează creșterea mușchiului neted și generarea forței în timpul dezvoltării fetale .

Ang II este cel mai puternic vasconstrictor al circulației splahnice .

De asemenea este binecunoscut faptul că ECA se secretă la nivelul mucoasei intestinale ceea ce semnifică o mediație angiotensinică importantă atât a circulației splahnice, cât și probabil a motilității intrinsece a tubului digestiv.

Autoradiografierea mucoasei cu 131I-Sar demonstrează existența receptorilor pentru Ang II .

Contracția la Ang II este menționată pentru musculatura sfincteriană, mai puțin pentru intestin propriu-zis .

Efectul coadministrării de ang II și AINS la nivelul musculaturii netede ileale

Din datele de mai sus se observă că pretratarea cu AINS reduce efectul stimulării angiotensinice. Acest rezultat este în acord cu literatura care precizează că un procent important al contracției angiotensinice la nivelul mușchiului neted, mai ales vascular, dar și de alte origini, este dependentă de COX și de metaboliții lipidici ai acesteia, în special TxA2. După cum se observă însă, gradul de inhibiție variază cu selectivitatea AINS. Antiinflamatoarele nesteroidine cu electivitate minimă, care blochează atât COX-1 (constitutivă) cât și COX-2 (inductibilă), au în mod paradoxal un grad mai mic de inhibiție a contracției decât meloxicamul de exemplu, care este un inhibitor selectiv COX-2 și care are un efect inhibitor maxim. Aceste rezultate ridică niște întrebări importante în ceea ce privește mediația contacției angiotensinice la nivelul tubului digestiv. Este de necontestat faptul că axa AT1 – PLA2 – AA – COX – Tx și PG este implicată în mod esențial, dar se pare că metaboliții acidului arahidonic implicați în contracție sunt produși mai ales de COX-2 la nivelul celulei muscular netede digestive.

Această ipoteză este sprijinită de raportarea ang II ca fiind o moleculă proinflamatorie (și în acord cu rezultatele noastre din experimentele precedente, care au folosit antioxidanți pentru inhibarea efectelor angiotensinice la nivel vascular).

Efectul ang II asupra contractilității musculare netede în condițiile inhibiției adrenergice și colinergice

După cum se observă din rezultatele prezentate mai sus, pretratarea cu atropină și prazosin nu are efecte semnificative asupra inhibiției induse de AINS asupra contracției angiotensinice, ba chiar, uneori, se produce o reversie a efectului inhibitor, fără semnificație statistică. Acest rezultat demonstrează că, cel puțin în ceea ce privește medierea COX a contracției angiotensinice la nivelul mușchiului neted digestiv, aceasta nu interferă cu celelalte mecanisme modulatoare ale contractilității digestive.

Administrarea în doză unică de atropină 10-6 M readuce contractilitatea digestivă în limite aproximativ normale pentru stimularea angiotensinică, ceea ce înseamnă că există mecanisme inhibitoare, sau cel puțin modulatoare în sens inhibitor cu mediație colinergică. Este posibil ca unii neuroni intramurali cu acțiune inhibitorie să posede receptori colinergici, activarea cărora va produce această revenire a contractilității.

Efectele IECA și BRA asupra contracției colinergice

Contracția carbacolică a fost diminuată în mod semnificativ deși, de principiu, cele două substanțe acționează pe substrate complet diferite, iar captoprilul nu a avut efecte per se asupra contracției musculaturii netede digestive. Nici stimularea contracției cu SCE pe fond de captopril nu a demonstrat variabilitate semnificativă a contracției electrice. Cauza acestui comportament nu ne este clară încă, dar este posibil ca în lipsa angiotensinei I captoprilul să acționeze asupra altui substrat peptidic angiotensinic, deoarece știm că multe dintre aceste enzime sunt interschimbabile, ceea ce ne duce cu gândul la sinteza unui metabolit relaxant și, pe de altă parte s-a dovedit, pe studii clinice, că unii pacienți au prezentat cazuri de constipație cronică după tratamentul cu captopril. De aceea este posibil ca inhibiția enzimei de conversie să reducă motilitatea prin mecanisme încă necunoscute . Inhibiția simultană a sintezei de metaboliți ai acidului arahidonic cu indometacin nu a alterat, conform literaturii, acest efect inhibitor al captoprilului.

În cadrul aceluiași set de experimente preliminare s-a încercat și investigarea efectului preadministrării blocantului de receptor AT1, losartan. Ca urmare a preincubării timp de 15 minute s-a observat o creștere semnificativă a capacității de contracției a mușchiului neted intestinal (30 – 40%).

Având în vedere efectele inhibitorii ale ang II asupra contractilității musculare netede, efectul losartanului era de așteptat. Pe de altă parte, în condițiile lipsei unui aport exogen de angiotensină II există două alternative: fie mucoasa intestinală reține o mică cantitate de peptide angiotensinice ca parte a SRA tisular, peptide a căror efect va fi blocat de losartan, fie receptorul AT1 mai este implicat și în alte moduri în ceea ce privește motilitatea mușchiului neted digestiv.

Efectele AINS asupra contracției colinergice

Pretratarea cu ketoprofen 10-6 M produce o inhibiție semnificativă a contractilității carbacolice, lucru observat și la AINS COX-2 selectiv – meloxicam. Substanțele care au fost luate în lucru sunt, pe de o parte un inhibitor neselectiv COX-1, COX-2, (ketoprofen) a cărui efect este absolut similar cu cel al meloxicamului care acționează predominant asupra COX-2. Aceste rezultate demonstrează un anume grad de mediere a contractilității musculare netede prin intermediul metaboliților ciclooxigenazei, lucru care este în acord cu literatura. O serie de alți autori, folosind indometacin ca și inhibitor neselectiv de COX-1 și COX-2 și celebrex ca și blocant specific de COX-2 au demonstrat că PGI și TxA2 sunt printre principalii responsabili ai contracțilității musculare netede vasculare.

Investigarea interacțiunii angiotensină, AINS, BRA și IECA asupra SCE.

După cum era de așteptat, curba contractilă a stimulării electrice la frecvențe variabile (4, 8, 16, 32, 64, 100 Hz) a demonstrat, în condițiile preincubării cu angiotensină II, o inhibiție a contracției SCE. Toate efectuările de stimulări electrice au fost făcute după dispariția efectului per se al ang II, care necesită aproximativ 20 – 30 minute până la relaxare. Ca interpretare a acestor rezultate, cea mai plauzibilă ipoteză este cea a angiotensinelor vasodilatatoare obținute din metabolismul altern al angiotensinogenului, angiotensinei 1-12 și al angiotensinei II. Un studiu al distribuției enzimelor alterne a SRA tisular, a prezenței metaboliților de mici dimensiuni (penta-, hexa- heptapeptide de tip angiotensinic) și al distribuției receptorilor de tip Mas, AT1, AT2 și a altora ar fi de dorit. Probabil ECA2 sau vreuna din kimazele tisulare prezente în celulele mucoasei intestinale descompune angiotensina în exces, în condițiile ocupării tuturor receptorilor AT1, în ang 1-7 a cărei efect musculotrop inhibitor este arhicunoscut . Se știe că receptorii AT1 se saturează rapid și este cunoscut efectul tahifilactizant al administrărilor repetate de angiotensină pe orice tip de preparat. Odată ce activitatea contractilă a ang II a fost realizată, receptorii AT 1 rămân blocați o perioadă semnificativă de timp (90 – 120 minute), suficient pentru ca ang II în exces din lichidul de perfuzie să poată fi transformat în ang 1-7. Pe de altă parte, se știe că mucoasa intestinală prezintă o serie de carboxipeptidaze cu rol în digestie și nu este improbabil ca și acestea să aibă un oarecare efect în degradarea ang II în metaboliți inhibitori.

Investigarea contractilității NANC pentru SCE

După cum se știe, contracția SCE este indusă prin depolarizarea neuronilor care se găsesc la nivelul plexurilor submucos și intramural. Acești neuroni sunt în marea lor majoritate colinergici, dar suficienți dintre ei folosesc ca mediatori alte substanțe chimice. Pentru a vedea care este impactul mediației colinergice și adrenergice asupra contractilității native a mușchiului neted ileal, s-au blocat receptorii 1 adrenergici cu prazosin și receptorii M colinergici cu atropină.

Studii preliminare au demonstrat că nici atropina nici prazosinul nu au efecte contractile per se asupra mușchiului neted ileal. Stimularea în câmp electric pe fond de atropină a produs o scădere semnificiativă a contractilității, care se regăsește și la administrarea amestecului atropină plus prazosin. Pe de altă parte, preadministrarea izolată de prazosin nu a produs nici un efect asupra rezultatelor stimulării în câmp electric, ceea ce era de așteptat, având în vedere că activitatea 1 adrenergică a tubului digestiv este destul de redusă.

Administrate ca amestec cele două substanțe au avut un foarte puternic efect inhibitor al contracției musculaturii netede pe preparatele longitudinale. Spre deosebire de acestea, administrarea amestecului atropina/prazosin a avut efecte variabile pe preparatul circular. La frecvențe mici de stimulare efectul a fost de inhibiție a contractilității, în vreme ce la frecvențe mai mari contractilitatea a revenit către normal. Aceste efecte ar putea fi explicate astfel:

La nivelul mușchiului longitudinal mediația esențială este cea colinergică, întrucât fibrele musculare longitudinale sunt responsabile pentru mecanismul de propulsie, care este în cel mai înalt grad dependent de stimularea vagală. Blocarea receptorilor M cu atropină produce limitarea răspunsurilor întrucât, deși preparatul este izolat și terminațiile vagale sunt îndepărtate, probabil majoritatea neuronilor intramurali prezintă mediație colinergică. Ei eliberează la stimularea electrică tot acetilcolină, la fel ca și terminațiile vagale, care, în condițiile blocării cu atropină, reduc contractilitatea. Contractilitatea remanentă (20 – 25%) este probabil independentă atât de mediația colinergică cât și de cea adrenergică, folosind ca mediator alte substanțe, poate chiar derivați ai acidului arahidonic.

În ceea ce privește contractilitatea musculaturii circulare, aceasta are caracteristici diferite care au fost prezentate mai sus. Forța contractilă este mult mai redusă, frecvența contracțiilor spontane este mai mare, iar funcționalitatea în fiziologia intestinului subțire este legată mai mult de mișcările de segmentare decât de cele de propulsie. Efectul cantitativ observat la acest nivel – în speță inhibiția la frecvențe mici și lipsă de efect la frecvențe mari, poate fi datorat intrării treptate în acțiune a neuronilor responsabili cu motilitatea circulară. Ipoteza de lucru este că la stimulare cu frecvență redusă mai puțini neuroni intramurali și submucoși se vor depolariza și majoritatea sunt colinergici. Pe măsură ce frecvența de stimulare crește (adică energia transmisă către celule crește) din ce în ce mai mulți neuroni noncolinergici se vor depolariza astfel producând rezultatele contractile obținute.

Efectele AINS asupra contracției SCE în condițiile inhibiției colinergice și adrenergice

După cum am prezentat mai sus, în condițiile în care scoatem din ecuație stimularea colinergică și adrenergică, mediația prin intermediul metaboliților acidului arahidonic rămâne printre cele mai importante în ceea ce privește contractilitatea musculaturii netede. Se observă că la administrarea mai multor tipuri de AINS inhibiția produsă de atropină și prazosin se păstrează și există un anume grad de contracție remanentă în toate experimentele, cu variații cantitative nesemnificative.

Efectuarea de SCE cu frecvență de 8, 16, 32, 64 Hz, asupra preparatului de ileon pretratat cu ibuprofen pe fond de atropină și prazosin, a produs inhibiția contracției cu o medie de 40 %. De asemenea, administrarea de sulindac pe preparat de ileon, pe fond de atropină și prazosin, a produs inhibiția contracției cu o medie de 38 %.

În condițiile în care pretratarea cu AINS ar fi trebuit să inhibe ambele ciclooxigenaze, ramura prostaglandino-tromboxanică a mediației contractile ar fi trebuit să fie abolită, deci contractilitatea ar fi trebuit să se apropie de zero. Aceste rezultate vin în contradicție cu teoria actuală care conferă un procentaj important din mediația contractilă derivaților de acid arahidonic. Rezultatele în acest caz sugerează că, de fapt, există o altă mediație contractilă care este implicată în contracția musculaturii netede digestive. Rezultatele obținute infirmă clar teoria medierii tromboxanice a peristaltismului.

Evaluarea mediației nitrinergice în contractilitatea musculaturii netede intestinale

Este cunoscut faptul că monoxidul de azot este un mediator gazos difuzibil de importanță capitală în medierea relaxării vasculare. De asemenea, o multitudine de studii au demonstrat că NO sintaza este prezentă atât la nivelul mucoasei cât și a celulelor musculare și neuronale din tubul digestiv. NO este un mediator intestinal, dar implicarea sa în motilitatea digestivă nu face obiectul investigației de față, decât în măsura în care ar putea afecta reactivitatea angiotensinică.

Ca urmare s-a folosit inhibitorul specific de NO sintază L-NAME (L Nitro-Arginin-Metil-Ester) pentru a reduce sau aboli sinteza de NO la nivel intestinal.

Incubarea cu L-NAME a produs o scădere minoră, dar semnificativă, a contractilității ceea ce sugerează o mediație nitrinergică a contractilității. Pe de altă parte, se știe că NO este un mediator musculo-relaxant prin intermediul GTP și, în nici un caz contractil, ceea ce face ca inhibiția contractilității electrice de către L-NAME să fie cu atât mai paradoxală. Singura ipoteză care poate fi formulată în această situație este că o serie de neuroni contractili de la nivelul inervației intrinseci intestinale au mediație activatoare nitrinergică, iar inhibiția lor va duce la o scădere a contractilității. Pe de altă parte, coadministrarea de L-NAME, angiotensină și prazosin nu a produs o abolire totală a contractilității, ceea ce presupune și o altă serie de mecanisme contractile, probabil un mecanism strict electric reprezentat de depolarizarea membranei și deschiderea canalelor de calciu voltaj dependente.

Musculatura netedă traheo-bronșică

Având în vedere corespondența între efectul inhibitor asupra contractilității musculaturii bronșice atât pentru carbacol cât și folosind SCE, este evident că pretratarea are aceste efecte inhibitorii ale contractilității. Co-administrarea de carbacol, ang II și losartan sau PD 123319 nu a produs rezultate semnificative statistic, probabil ca urmare a efectelor strict farmacocinetice în baia de organ. Oricum problema mediației inhibiției contracției colinergice primește un răspuns în subcapitolul imediat următor, unde se dovedește fără echivoc dependența de receptorii AT1 a efectului inhibitor a contracției colinergice.

În concluzie, preadministrarea de angiotensină II inhibă contractilitatea musculaturii netede traheale. Pentru a se verifica medierea acestui efect s-a realizat coadministrarea de angiotensină II cu losartan, blocant specific al receptorilor angiotensinergici de tip 1. Rezultatul administrării a fost o revenire aproape la normal a contractilității traheale.

După cum se poate observa, inhibiția contractilității indusă de ang II este un mecanism AT1 dependent, fapt demonstrat de dispariția aproape completă a efectului la administrarea de losartan. Totuși, se poate observa o ușoară inhibiție remanentă, de 5 – 10 % care ar putea fi atribuită unei mediații prin intermediul AT2.

Administrarea blocantului de receptori AT2 – PD 123319 a produs revenirea efectului contractil al stimulării în câmp electric după administrarea de angiotensină II, dar la nivele intermediare comparativ cu losartanul, ceea ce sugerează o implicare mai redusă, dar posibilă, a receptorilor de tip AT2.

La administrarea de PD 123319 contracția indusă de carbacol, pe fondul pretratării cu ang II, a revenit la valorile martor.

O altă ipoteză de studiu a fost posibilitatea ca ang II administrată în baia de organ să se scindeze în metaboliți vasodilatatori. Pentru a se elimina această potențială cale metabolică s-a folosit coadministrarea de A773 (inhibitor specific al receptorului Mas). Nici această tentativă nu a redus inhibiția angiotensinică, atât a contracției colinergice cât și SCE, ceea ce scoate, pentru moment, ang 1-7 și alți metaboliți mai mici din discuție.

Efectul AINS asupra reactivității musculaturii netede traheo-bronșice.

Studiul s-a efectuat folosind carbacol 10-9 M până la 10-5 M în administrare cumulativă.

Pentru a se investiga efectul pretratării cu AINS asupra răspunsului contractil la carbacol în preparatul de trahee de șobolan s-a efectuat pretratarea cu AINS 10-6 M și incubarea preparatului timp de 15 minute. După acest interval s-a administrat carbacol 10-9 M – 10-5 M în doză cumulativă. După cum se observă, pretratarea cu AINS clasici cu selectivitate COX-2 în creștere (ibuprofen, ketoprofen, piroxicam, meloxicam) produce o ușoară reducere a contractilității colinergice, dar fără semnificație statistică (n=6, p>0,05). Aceasta poate sugera un efect generic de inhibiție a contactilității, care se poate observa pe aproape toate preparatele musculare netede, dar mecanismul este dificil de precizat.

Un rezultat neașteptat a fost obținut la preadministrarea de AINS înainte de stimularea în câmp electric. De manieră sistematică, inhibiția COX a crescut ușor dar semnificativ reactivitatea preparatelor stimulate electric.

Acest efect nu este în concordanță cu rezultatele obținute anterior pe stimulare farmacologică, unde administrarea de AINS a inhibat contracția colinergică, iar în prezența angiotensinei II nu s-a obținut nici un efect.

Se știe că stimularea colinergică are o componentă COX semnificativă, responsabilă pentru aproximativ 25% din contracție. În aceste condiții este de înțeles de ce inhibiția COX ar putea reduce contracția rezultată din stimularea receptorilor M, dar nu și creșterea contractilității în condițiile stimulării electrice. Mecanismele prin care se realizează contracția SCE la nivel traheo-bronșic sunt considerate a fi totuși legate de contracția colinergică. Receptorii colinergici esențiali care se găsesc la nivelul musculaturii netede traheo-bronșice sunt de tip M2 și M3 care sunt de tip Gi și Gq. Receptorii de tip M3 produc contracție prin activarea fosfolipazei C, creșterea producției de IP3 și eliberarea de calciu din reticul. Calea M2/Gi nu este încă certă, dar se pare că se realizează prin inhibarea adenililciclazei care la rândul ei, reduce nivelele de AMPc, care deschid canalele de calciu . Stimularea electrică produce depolarizarea neuronilor colinergici și eliberarea intrinsecă de acetilcolină la nivelul musculaturii netede traheo-bronșice (fenomenul se numește cuplare farmaco-contractilă).

Cu toate acestea, rezultatele noastre nu sprijină această ipoteză, deoarece SCE în prezența AINS crește contractilitatea, în timp ce carbacolul în prezența AINS are contractilitate scăzută.

Concluzia este că există o cale de mediație COX-dependentă a contractilității, probabil prin intermediul unor derivați musculo-relaxanți de acid arahidonic. Inhibiția COX produce reducerea sintezei acestor substanțe relaxante ceea ce face ca efectul colinergic de cuplare farmaco-contractilă să fie mai puternic.

Administrarea de atropină pe fondul acestei inhibiții ar fi trebuit să reducă complet sau măcar să inhibe în mod semnificativ contracția produsă de SCE. Totuși, din rezultatele noastre, acest fenomen nu s-a întâmplat în condițiile administrării de AINS și atropină, lucru care sprijină în continuare ipoteza medierii COX a contracției stimulate electric la mușchiul neted traheo-bronșic.

Efectele administrării concomitente de ang II și AINS asupra musculaturii netede traheo bronșice

Preincubarea cu AINS de tip ibuprofen, ketoprofen, meloxicam și piroxicam nu a produs efecte semnificative asupra inhibiției contracției SCE de către ang II. Lipsa oricărui tip de efect reprezintă probabil neimplicarea COX, ambele izoforme, în acțiunea angiotensinei cu toate că unii autori sugerează un astfel de rezultat, deși doar la nivel vascular. Experimentele s-au realizat la multiple nivele ale traheei și bronhiilor principale de șobolan, până la limita aparaturii din dotare. Nici unul dintre aceste preparate nu a demonstrat producerea unei contracții semnificative. Deși literatura indică prezența receptorilor atât de tip AT1 cât și de tip AT 2 la nivelul mucoasei și musculaturii netede traheo bronsice, precum și a ECA, angiotensinogenului dar nu și a reninei la acest nivel , cauza acestei lipse de răspuns per se încă nu poate fi elucidată. Deși autorii mai sus menționați admit existența unei contracții slabe și tranzitorii abolită de losartan, experimentele noastre nu au putut-o pune în evidență.

Utilizarea de inhibitori de enzimă de conversie precum captopril produce o reversie a efectului inhibitor al ang II asupra contractilității musculaturii atât colinergică cât și SCE. Având însă în vedere că ang II se găsește în soluție din surse exogene efectul captoprilului sugerează mai degrabă o intervenție asupra metabolismului bradikininei decât al angiotensinelor.

Se știe că IECA au efecte bronhoconstrictoare la un număr semnificativ de pacienți, dar efectul în vitro asupra contracției musculare netede traheo bronșice este puțin studiat. În orice caz mediația kininergică depășește obiectul studiului de față și va fi probabil urmărită în investigații ulterioare.

3.4. Concluzii SUMATIVE DETALIATE

Mușchi neted vascular

Sistemul renină-angiotensină-aldosteron are interacțiuni importante la nivelul mușchiului neted cu sistemul acidului arahidonic, prin intermediul sistemului enzimelor ciclooxigenazice și lipoxigenazice, al enzimei de conversie, interacțiuni ce pot fi modulate de către susbstanțe cu acțiune medicamentoasă asupra celor două sisteme, substanțe care sunt disponibile în farmacopeea națională și care sunt utilizate simultan sau consecutiv.

În administrarea unică sau în doze cumulative, captoprilul (inhibitor al enzimei de conversie a angiotensinei) nu a avut nici un efect per se asupra tonusului mușchiului neted vascular.

Administrarea de losartan (blocant de receptori AT1) și de PD123379 (blocant de receptori AT2) nu a avut nici un efect per se asupra preparatelor vasculare.

Administrarea de AINS asupra preparatelor izolate arteriale nu a produs efecte per se. Administrarea a fost făcută în ordinea selectivității lor pentru COX-2 astfel: ibuprofen, ketoprofen, sulindac, nimesulid și meloxicam.

Administrarea de ibuprofen în incubare a redus contracția determinată de ang II în manieră dependentă de doză, până la abolirea completă a acesteia. Rezultatele experimentale au fost independente de prezența endoteliului vascular pe preparat, inhibiția contractilă fiind prezentă în ambele cazuri.

S-a demonstrat un efect puternic inhibitor, dependent de doză, al nimesulidului asupra contracției induse de ang II. Curba doză-efect are o configurație similară cu cele ale ibuprofenului și ketoprofenului.

Administrarea de nimesulid în pretratare nu a produs modificări semnificative ale contractilității fenilefrinice sau potasice. Pre-incubarea cu ibuprofen nu a produs nici un fel de modificare a contracției fenilefrinice.

Protocolul experimental a fost repetat folosind ca agent contractant KCl 40 mM. Nici de această dată nu a fost obținută nici un fel de modificare a contracției potasice în prezență de ibuprofen.

În scopul eliminării suspiciunii de efect inhibitor nespecific al contractilității musculare netede, s-au repetat experimentările cu ketoprofen în prezența fenilefrinei 10-6 M și a KCl 40 mM. Nici una dintre contracțiile induse de aceste substanțe nu a fost afectată de preincubarea de ketoprofen, ceea ce certifică faptul că efectul inhibitor este conturat doar la contracția angiotensinică

Pre-tratarea cu angiotensină 2 produce creșterea contractilității la stimularea cu SCE.

Incubarea preparatului cu IECA a produs răspunsuri semnificativ mai mari la stimularea în câmp electric.

Și incubarea cu blocanți ai receptorilor pentru angiotensină (BRA) a crescut răspunsurile la stimularea electrică.

Administrarea de AINS în pretratare a produs un efect inhibitor asupra răspunsului contractil la stimulare electrică.

Co-administrarea de AINS (ibuprofen) împreună cu ang II a redus în mod semnificativ amplitudinea contractilă la stimularea SCE. Rezultatul este util prin faptul că sugerează că asocierea de AINS cu substanțe medicamentoase cu potențial vasocontractil ar putea reduce riscurile cardiovasculare induse de acestea.

Potențarea vasoconstricției la nivelul arterei renale produsă de creșterea reactivității receptorilor AT1, dublată de inhibarea relaxării indusă de receptorii AT2, ar putea contribui la dereglările fluxului sanguin renal în hiperamonemiile de diferite cauze.

Astfel, aldosteronul inhibă efectele vasoconstrictoare ale angiotensinei într-o manieră doză-dependentă, fără a fi implicat și endoteliul. Acest efect nu pare să fie mediat de către receptorii genomici pentru aldosteron, deoarece blocarea acestor receptori cu spironolactonă nu afectează vasoconstricția angiotensinică.

Vasoconstricția angiotensinică a fost inhibată de către expunerea acută la aldosteron în majoritatea experimentelor (75%), în timp ce contracția vasculară indusă de potasiu a fost invariabil potențată. Acțiunile inhibitoare ale aldosteronului asupra vasoconstricției angiotensinice au apărut atât în cazul inelelor normale cât și în cazul celor dezendotelizate.

Blocarea receptorilor aldosteronici de către spironolactonă nu a modificat semnificativ reactivitatea vasculară a preparatelor normale sau dezendotelizate la vasocontricția angiotensinică alterată de aldosteron.

În cazul inelelelor dezendotelizate am observat o scădere a contracției angiotensinice atât la grupurile tratate cu spironolactonă cât și în cazul celor tratate cu spironolactonă 10-6 M și aldosteron.

Aldosteronul modulează prin efectele sale nongenomice rapide reactivitatea unor teritorii vasculare cu participarea unor molecule semnal variate, incluzând speciile reactive ale oxigenului și azotului.

Contracția angiotensinică este inhibată de coincubarea cu captatori (scavengeri) de radicali liberi de tipul amifostină sau L-acetilcisteină, în manieră dependentă de doză. Aceste rezultate dovedesc că o parte semnificativă din contractilitatea angiotensinică este dependentă de generarea de radicali liberi.

Rezultatele sunt endotelio-dependente iar mediația inhibiției cu antioxidanți este depednentă și de mediația nitrinergică.

Pretratarea cu L-NAME a crescut contracția la angiotensină, ceea ce dovedește că inhibiția efectului contrareglator al NO crește efectul pro-inflamator și pro-radicalar al angiotensinei II.

Mușchi neted digestiv

Nici una din dozele de ang II administrate nu a avut efect per se asupra tonusului bazal al preparatelor longitudinale cât și al celor circulare de esofag.

Pretratarea cu ang II a produs reducerea semnificativ statistică a contractilității SCE atât pe praparatele longitudinale cât și pe inele.

Administrarea de losartan a redus aproape complet efectul inhibitor al pretratării cu ang II.

Coadministrarea de PD 123319 nu a modificat în mod semnificativ efectele pretratării cu ang II.

Administrarea de AINS 10-6 M în pretratare nu a produs nici un efect per se.

Toate AINS folosite au avut un efect de inhibiție a contracției SCE cu același profil al curbei de răspuns.

Administrarea combinată de ketoprofen sau alte inhibitoare neselective de COX și ang II a redus și mai mult contractilitatea musculaturii netede esofagiene.

Angiotensina II are effect contractil asupra musculaturii netede digestive. Se poate trasa o curbă doză efect la administrări atât cumulative cât și succesive de ang II, cu caracteristici stabile și cu ajutorul căreia se pot trasa lini de regresie sau se pot efectua alte determinări farmacologice. Coadministrarea împreună cu captopril nu a produs efecte ceea ce demonstrează că sinteza de ang II nu se face la nivel local ci probabil plasmatic. De asemenea, contracția este sensibilă la losartan, ceea ce semnifică prezența și activitatea corectă și completă a receptorilor AT1 la nivelul musculaturii netede digestive.

Pretratarea cu AINS reduce efectul stimulării angiotensinice la nivelul mușchiului neted jejuno-ileal. Semnificația cea mai probabilă a acestui rezultat este că COX-1 și COX-2 sunt implicate în medierea contracției angiotensinice la nvelul musculaturii netede digestive. Rezultatele noastre indică ca țintă principală a inhibiției COX-2.

Pretratarea cu atropină și prazosin nu are efecte semnificative asupra inhibiției induse de AINS asupra contracției angiotensinice. În ceea ce privește medierea COX a contracției angiotensinice la nivelul mușchiului neted digestiv, aceasta nu interferă cu celelalte mecanisme modulatoare ale contractilității digestive.

Contracția carbacolică a fost diminuată în mod semnificativ de către pretratarea cu captopril, mecanismele prin care apare acest rezultat nu sunt încă identificate.

Preincubarea timp de 15 minute cu losartan a produs o creștere semnificativă a capacității de contracției colinergice a mușchiului neted intestinal (30 – 40%).

Pretratarea cu ketoprofen și meloxicam produce o inhibiție semnificativă a contractilității carbacolice. Acest rezultat sugerează medierea contractilității generale a mușchiului neted digestiv, cel puțin parțial, prin intermediul metaboliților COX.

Preincubarea cu angiotensină II a demonstrat o inhibiție a contracției SCE. Cauza probabil este existența angiotensinelor vasodilatatoare obținute din metabolismul altern al angiotensinogenului, angiotensinei 1-12 și al angiotensinei II.

Nici atropina nici prazosinul nu au efecte contractile per se asupra mușchiului neted ileal. Stimularea în câmp electric pe fond de atropină a produs o scădere semnificativă a contractilității, care se regăsește și la administrarea amestecului atropină plus prazosin.

Preadministrarea izolată de prazosin nu a produs nici un efect asupra rezultatelor stimulării în câmp electric.

Administrate ca și amestec cele două substanțe au avut un foarte puternic efect inhibitor al contracției musculaturii netede pe preparatele ileo-jejunale.

Adminstrarea de SCE asupra preparatului de ileon pretratat cu ibuprofen pe fond de atropină și prazosin a produs inhibiția contracției cu o medie de 40 %. De asemenea, administrarea de sulindac pe preparat de ileon pe fond de atropină și prazosin a produs inhibiția contracției cu o medie de 38 %. Rezultatele obținute infirmă clar teoria medierii tromboxanice a peristaltismului.

Incubarea cu L-NAME a produs o scădere minoră, dar semnificativă, a contractilității, ceea ce sugerează o mediație nitrinergică a contractilității. Coadministrarea de L-NAME, angiotensină și prazosin nu a produs o abolire totală a contractilității, ceea ce presupune și o altă serie de mecanisme contractile, probabil un mecanism strict electric reprezentat de depolarizarea membranei și deschiderea canalelor de calciu voltaj dependente.

Mușchi neted traheo-bronșic

Ang II nu are efecte contractile per se asupra musculaturii traheo-bronșice.

Tratarea cu ang II a preparatului traheo-bronșic produce o scădere generalizată a contractilității acestuia atât la stimularea chimică cu carbacol cât și la stimularea electrică.

Scăderea contractilității pare a fi mediată prin intermediul receptorilor de tip AT1, fapt dovedit de dispariția inhibiției la administrarea de losartan, atât pe contracție colinergică cât și pe contracție SCE.

Coadministrarea de A773 (inhibitor specific al receptorului Mas) nu a redus inhibiția angiotensinică, atât a contracției colinergice cât și SCE, ceea ce infirmă mediația prin intermediul ang 1-7 și a altor metaboliți ai ang II.

Preadministrarea de AINS a crescut ușor, dar semnificativ, reactivitatea preparatelor stimulate electric.

SCE în prezența AINS crește contractilitatea, în timp ce carbacolul în prezența AINS are contractilitate scăzută.

Există o cale de mediație COX-dependentă a contractilității, probabil prin intermediul unor derivați musculo-relaxanți de acid arahidonic. Inhibiția COX produce reducerea sintezei acestor substanțe relaxante ceea ce face ca efectul colinergic de cuplare farmaco-contractilă să fie mai puternic.

Administrarea de atropină nu inhibă în mod semnificativ contracția produsă de SCE, lucru care sprijină în continuare ipoteza medierii COX a contracției stimulate electric la mușchiul neted traheo-bronșic.

Coadministrarea cu IECA produce restabilirea contractilității musculaturii chiar sub stimulare angiotensinergică, ceea ce sugerează implicarea mediației bradikininice.

Coadministrarea cu AINS, indiferent de gradul de selectivitate COX a acestora, nu reduce inhibiția contractilității bronșice.

Concluzii finale ale studiului CU TITLUL “STUDIUL FARMACOLOGIC EXPERIMENTAL AL UNOR INTERACȚIUNI ÎNTRE SUBSTANȚE CARE INFLUENȚEAZĂ METABOLISMUL ACIDULUI ARAHIDONIC ȘI MODULATOARE ALE MEDIAȚIEI ANGIOTENSINICE, LA NIVELUL MUSCULATURII NETEDE”

Studiul farmacologic experimental intenționat a fost realizat într-o manieră sistematică și organizată, permițând investigarea unor teritorii care nu sunt încă bine cunoscute. Reacțiile musculaturii netede sunt cel mai bine studiate la nivelul musculaturii cardiovasculare, pe model uman și animal, dar celelalte tipuri de musculatură sunt mai puțin studiate, având în vedere că rolul lor în patologie este mai puțin evident. Studiile asupra contractilității musculaturii digestive și traheo-bronșice, deși nu sunt exhaustive, oferă informații noi si utile asupra acestor componente esențiale ale fiziologiei si fizio-farmacologiei. Modelul de stimulare în câmp electric este folosit mult mai rar în studiul reactivității musculare netede, deși avantajele sunt evidente.

Scopul studiului a fost de a obține informații dintr-un domeniu al interacțiunilor farmacologice foarte puțin sau deloc studiat, deși în viața de zi cu zi aceste interacțiuni sunt prezente si au loc la o multitudine de pacienți. Informațiile obținute, o dată publicate, se vor adăuga la baza de date științifice a farmacologiei, realizând o contribuție importanta la studiul acestor medicamente.

Se știe ca pacienții care utilizează cronic medicamente din grupa antiinflamatoarelor nesteroidiene prezintă o morbiditate si mortalitate mai mare din cauza evenimentelor cardiovasculare, dar nu se cunoaște exact efectul direct al acestora asupra musculaturii netede cardiovasculare și interacțiunea cu alte sisteme de reglare hormonale. Studiul de față se adresează interacțiunii cu sistemul renină-angiotensină-aldosteron și cu substanțele care modifică acest sistem.

S-a identificat faptul ca antiinflamatoarele nesteroidiene nu au o acțiune vasoconstrictoare în sine, și în același timp, au o acțiune inhibitoare asupra efectelor vasoconstrictoare ale angiotensinei II, ceea ce face ca efectul lor să fie potențial benefic la pacienții suferinzi de hipertensiune arterială, prin creșterea acțiunii SRA.

Rezultatele investigațiilor au demonstrat faptul ca stimularea contractilă angiotensinică posedă o componentă mediată de către metaboliții acidului arahidonic, iar inhibiția ciclooxigenazelor realizată cu ajutorul antiinflamatoarelor nesteroidiene reduce potența contracției angiotensinice.

S-a demonstrat că hormonul liposolubil aldosteron, indisolubil legat de sistemul renină-angiotensină, are efecte rapide non-genomice care inhibă contracția angiotensinică.

S-a demonstrat că contracția angiotensinică are și o componentă legată de radicalii liberi, iar inhibiția producerii lor are efecte relaxante asupra vaselor.

Se cunosc, de multă vreme, efectele secundare ale tratamentului cu antiinflamatoare nesteroidiene asupra tubului digestiv, dar interacțiunile acestor substanțe cu mușchiul neted și în special cu sistemele hormonale și neuromediatoare sunt mai puțin studiate. Lucrarea de față adresează o parte din aceste întrebări.

Musculatura netedă esofagiană nu reacționează în mod specific la angiotensina II

Totuși, alte mecanisme contractile esofagiene sunt inhibate de prezența angiotensinei. Toate AINS folosite au avut un efect de inhibiție a contracției SCE, cu același profil al curbei de răspuns. Administrarea combinată de ketoprofen sau alte inhibitoare neselective de COX și ang II, a redus și mai mult contractilitatea musculaturii netede esofagiene. Toate aceste efecte demonstrează că esofagul posedă receptori și mediație angiotensinergică și prin intermediul metaboliților ciclooxigenazei.

La nivel intestinal, angiotensina II are efecte similare cu cele vasculare, ceea ce demonstrează prezența și activitatea receptorilor de tip AT 1 la acest nivel. Pretratarea cu AINS reduce efectul stimulării angiotensinice la nivelul mușchiului neted jejuno-ileal. Semnificația cea mai probabilă a acestui rezultat este că COX-1 și COX-2 sunt implicate în medierea contracției angiotensinice la nvelul musculaturii netede digestive. Rezultatele noastre indică ca țintă principală a inhibiției COX-2.

S-a demonstrat implicarea metaboliților acidului arahidonic și ciclooxigenazelor în mediația non-adrenergică non-colinergică (NANC) a contracțiilor induse și spontane de jejun și ileon terminal.

Efectele angiotensinelor sau ale substanțelor ce afectează metabolismul SRA, ca și cele ale metaboliților acidului arahidonic și ale inhibitorilor de COX sunt și mai puțin studiate. Cercetările noastre au produs o serie de rezultate ce se pot dovedi utile ca sprijin în identificarea de cauze ale efectelor secundare respiratorii ale unor medicamente de tip AINS.

S-a demonstrat că nu există o mediație prin ang 1-7 sau alți metaboliți bronhodilatatori ai Ang II.

Inhibiția COX face ca efectul colinergic de cuplare farmaco-contractilă să fie mai puternic, lucru care sprijină în continuare ipoteza medierii COX a contracției stimulate electric la mușchiul neted traheo-bronșic.

Coadministrarea cu IECA produce restabilirea contractilității musculaturii chiar sub stimulare angiotensinergică, ceea ce sugerează implicarea mediației bradikininice.

Studiul s-a dorit a fi o investigare în profunzime a mecanismelor de contracție a mușchiului neted, un studiu experimental farmacologic, fără putința de a evolua într-un studiu fiziopatologic sau clinic, datorită limitărilor inerente ale tehnicilor, resurselor și calificărilor autorului.

Rezultatele obținute, publicate sau pe cale de a fi publicate, expertiza obținută în domeniu, căile de explorare ce au fost deschise de către aceste rezultate, sunt o probă a faptului că obiectivele acestei teze au fost atinse.

4. BIBLIOGRAFIE

1. White WB. Defining the problem of treating the patient with hypertension and arthritis pain. Am J Med. 2009; 122(5 Suppl):S3-9.

2. Salort-Llorca C, Minguez-Serra MP, Silvestre-Donat FJ. Interactions between ibuprofen and antihypertensive drugs: incidence and clinical relevance în dental practice. Med Oral Patol Oral Cir Bucal. 2008; 13(11):E717-21.

3. Haulica I, Bild W, Serban DN. Angiotensin peptides and their pleiotropic actions. Journal of the renin-angiotensin-aldosterone system : JRAAS. 2005; 6(3):121-31.

4. Jennings DL, Kalus JS, O'Dell KM. Aldosterone receptor antagonism în heart failure. Pharmacotherapy. 2005; 25(8):1126-33.

5. Cheng ZJ, Vapaatalo H, Mervaala E. Angiotensin II and vascular inflammation. Med Sci Monit. 2005; 11(6):RA194-205.

6. Amouyel P, Richard F, Berr C, David-Fromentin I, Helbecque N. The renin angiotensin system and Alzheimer's disease. Ann N Y Acad Sci. 2000; 903:437-41.

7. Epstein BJ, Gums JG. Can the renin-angiotensin system protect against stroke? A focus on angiotensin II receptor blockers. Pharmacotherapy. 2005; 25(4):531-9.

8. Savaskan E. The role of the brain renin-angiotensin system în neurodegenerative disorders. Curr Alzheimer Res. 2005; 2(1):29-35.

9. Resende MM, Mill JG. Alternate angiotensin II-forming pathways and their importance în physiological or physiopathological conditions. Arquivos brasileiros de cardiologia. 2002; 78(4):425-38.

10. Rosivall L, Rinder DF, Champion J, Khosla MC, Navar LG, Oparil S. Intrarenal angiotensin I conversion at normal and reduced renal blood flow în the dog. The American journal of physiology. 1983; 245(3):F408-15.

11. Carey RM, Jin XH, Siragy HM. Role of the angiotensin AT2 receptor în blood pressure regulation and therapeutic implications. American journal of hypertension. 2001; 14(6 Pt 2):98S-102S.

12. Das UN. Is angiotensin-II an endogenous pro-inflammatory molecule? Med Sci Monit. 2005; 11(5):RA155-62.

13. Hollenberg NK, Fisher ND, Price DA. Pathways for angiotensin II generation în intact human tissue: evidence from comparative pharmacological interruption of the renin system. Hypertension. 1998; 32(3):387-92.

14. Urata H, Ganten D. Cardiac angiotensin II formation: the angiotensin-I converting enzyme and human chymase. Eur Heart J. 1993; 14 Suppl I:177-82.

15. Donoghue M, Hsieh F, Baronas E, Godbout K, Gosselin M, Stagliano N, et al. A novel angiotensin-converting enzyme-related carboxypeptidase (ECA2) converts angiotensin I to angiotensin 1-9. Circ Res. 2000; 87(5):E1-9.

16. Ferrario CM, Jessup J, Chappell MC, Averill DB, Brosnihan KB, Tallant EA, et al. Effect of angiotensin-converting enzyme inhibition and angiotensin II receptor blockers on cardiac angiotensin-converting enzyme 2. Circulation. 2005; 111(20):2605-10.

17. Batlle D, Soler MJ, Wysocki J. New aspects of the renin-angiotensin system: angiotensin-converting enzyme 2 – a potential target for treatment of hypertension and diabetic nephropathy. Current Opinion în Nephrology and Hypertension. 2008; 17(3):250-7.

18. Fleming I, Kohlstedt K, Busse R. New fECAs to the renin-angiotensin system. Physiology (Bethesda). 2005; 20:91-5.

19. Nagata S, Kato J, Sasaki K, Minamino N, Eto T, Kitamura K. Isolation and identification of proangiotensin-12, a possible component of the renin-angiotensin system. Biochemical and biophysical research communications. 2006; 350(4):1026-31.

20. Varagic J, Trask AJ, Jessup JA, Chappell MC, Ferrario CM. New angiotensins. Journal of molecular medicine. 2008; 86(6):663-71.

21. Trask AJ, Jessup JA, Chappell MC, Ferrario CM. Angiotensin-(1-12) is an alternate substrate for angiotensin peptide production în the heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2008; 294(5):H2242-7.

22. Jessup JA, Trask AJ, Chappell MC, Nagata S, Kato J, Kitamura K, et al. Localization of the novel angiotensin peptide, angiotensin-(1-12), în heart and kidney of hypertensive and normotensive rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2008; 294(6):H2614-8.

23. Chappell MC, Pirro NT, Sykes A, Ferrario CM. Metabolism of angiotensin-(1-7) by angiotensin-converting enzyme. Hypertension. 1998; 31(1 Pt 2):362-7.

24. Ferrario CM, Iyer SN. Angiotensin-(1-7): a bioactive fragment of the renin-angiotensin system. Regul Pept. 1998; 78(1-3):13-8.

25. Ferrario CM, Chappell MC, Dean RH, Iyer SN. Novel angiotensin peptides regulate blood pressure, endothelial function, and natriuresis. J Am Soc Nephrol. 1998; 9(9):1716-22.

26. Ferrario CM, Martell N, Yunis C, Flack JM, Chappell MC, Brosnihan KB, et al. Characterization of angiotensin-(1-7) în the urine of normal and essential hypertensive subjects. Am J Hypertens. 1998; 11(2):137-46.

27. Ferrario CM. Angiotension-(1-7) and antihypertensive mechanisms. J Nephrol. 1998; 11(6):278-83.

28. Vickers C, Hales P, Kaushik V, Dick L, Gavin J, Tang J, et al. Hydrolysis of biological peptides by human angiotensin-converting enzyme-related carboxypeptidase. The Journal of biological chemistry. 2002; 277(17):14838-43.

29. Santos RA, Ferreira AJ, Pinheiro SV, Sampaio WO, Touyz R, Campagnole-Santos MJ. Angiotensin-(1-7) and its receptor as a potential targets for new cardiovascular drugs. Expert Opin Investig Drugs. 2005; 14(8):1019-31.

30. Sampaio WO, dos Santos SRA, Faria-Silva R, Machado LTD, Schiffrin EL, Touyz RM. Angiotensin-(1-7) through receptor Mas mediates endothelial nitric oxide synthase activation via Akt-dependent pathways. Hypertension. 2007; 49(1):185-92.

31. Silva DMR, Vianna HR, Cortes SF, Campagnole-Santos MJ, Santos SRA, Lemos VS. Evidence for a new angiotensin-(1-7) receptor subtype în the aorta of Sprague-Dawley rats. Peptides. 2007; 28(3):702-7.

32. Fernandes L, Fortes ZB, Nigro D, Tostes RCA, Santos SRA, de Carvalho MHC. Potentiation of bradykinin by angiotensin-(1-7) on arterioles of spontaneously hypertensive rats studied în vivo. Hypertension. 2001; 37(2):703-9.

33. Burrell LM, Risvanis J, Kubota E, Dean RG, MacDonald PS, Lu S, et al. Myocardial infarction increases ECA2 expression în rat and humans. Eur Heart J. 2005; 26(4):369-75; discussion 22-4.

34. Brosnihan KB, Li P, Ferrario CM. Angiotensin-(1-7) dilates canine coronary arteries through kinins and nitric oxide. Hypertension. 1996; 27(3 Pt 2):523-8.

35. Ferreira AJ, Santos RA, Almeida AP. Angiotensin-(1-7) improves the post-ischemic function în isolated perfused rat hearts. Brazilian journal of medical and biological research = Revista brasileira de pesquisas medicas e biologicas / Sociedade Brasileira de Biofisica [et al]. 2002; 35(9):1083-90.

36. Polizio AH, Gironacci MM, Tomaro ML, Pena C. Angiotensin-(1-7) blocks the angiotensin II-stimulated superoxide production. Pharmacol Res. 2007; 56(1):86-90.

37. De Mello WC. Angiotensin (1-7) re-establishes impulse conduction în cardiac muscle during ischaemia-reperfusion. The role of the sodium pump. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst. 2004; 5(4):203-8.

38. Tallant EA, Ferrario CM, Gallagher PE. Angiotensin-(1-7) inhibits growth of cardiac myocytes through activation of the mas receptor. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2005; 289(4):H1560-6.

39. Ferrario CM, Chappell MC, Tallant EA, Brosnihan KB, Diz DI. Counterregulatory actions of angiotensin-(1-7). Hypertension. 1997; 30(3 Pt 2):535-41.

40. Iyer SN, Averill DB, Chappell MC, Yamada K, Allred AJ, Ferrario CM. Contribution of angiotensin-(1-7) to blood pressure regulation în salt-depleted hypertensive rats. Hypertension. 2000; 36(3):417-22.

41. Giani JF, Gironacci MM, Munoz MC, Turyn D, Dominici FP. Angiotensin-(1-7) has a dual role on growth-promoting signalling pathways în rat heart în vivo by stimulating STAT3 and STAT5a/b phosphorylation and inhibiting angiotensin II-stimulated ERK1/2 and Rho kinase activity. Exp Physiol. 2008; 93(5):570-8.

42. Freeman EJ, Chisolm GM, Ferrario CM, Tallant EA. Angiotensin-(1-7) inhibits vascular smooth muscle cell growth. Hypertension. 1996; 28(1):104-8.

43. Gallagher PE, Tallant EA. Inhibition of human lung cancer cell growth by angiotensin-(1-7). Carcinogenesis. 2004; 25(11):2045-52.

44. Menon J, Soto-Pantoja DR, Callahan MF, Cline JM, Ferrario CM, Tallant EA, et al. Angiotensin-(1-7) inhibits growth of human lung adenocarcinoma xenografts în nude mice through a reduction în cyclooxygenase-2. Cancer research. 2007; 67(6):2809-15.

45. Stegbauer J, Vonend O, Oberhauser V, Rump LC. Effects of angiotensin-(1-7) and other bioactive components of the renin-angiotensin system on vascular resistance and noradrenaline release în rat kidney. J Hypertens. 2003; 21(7):1391-9.

46. Li N, Zimpelmann J, Cheng K, Wilkins JA, Burns KD. The role of angiotensin converting enzyme 2 în the generation of angiotensin 1-7 by rat proximal tubules. Am J Physiol Renal Physiol. 2005; 288(2):F353-62.

47. Tikellis C, Cooper ME, Thomas MC. Role of the renin-angiotensin system în the endocrine pancreas: implications for the development of diabetes. The international journal of biochemistry & cell biology. 2006; 38(5-6):737-51.

48. Valdes G, Neves LA, Anton L, Corthorn J, Chacon C, Germain AM, et al. Distribution of angiotensin-(1-7) and ECA2 în human placentas of normal and pathological pregnancies. Placenta. 2006; 27(2-3):200-7.

49. Thone-Reineke C, Zimmermann M, Neumann C, Krikov M, Li J, Gerova N, et al. Are angiotensin receptor blockers neuroprotective? Curr Hypertens Rep. 2004; 6(4):257-66.

50. Albrecht D. Angiotensin-(1-7)-induced plasticity changes în the lateral amygdala are mediated by COX-2 and NO. Learn Mem. 2007; 14(3):177-84.

51. Devynck MA, Pernollet MG, Matthews PG, Meyer P. [Demonstration of specific receptors for angiotensin III în rat adrenal glands]. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 1977; 284(14):1293-6.

52. Chan JY, Tsai HF, Kuo TB, Chan SH. Modulation by angiotensin III of nociception-related and arterial pressure-related neuronal responsiveness în the nucleus reticularis gigantocellularis of the rat. Regul Pept. 1994; 50(3):247-57.

53. Blume A, Undeutsch C, Zhao Y, Kaschina E, Culman J, Unger T. ANG III induces expression of inducible transcription factors of AP-1 and Krox families în rat brain. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2005; 289(3):R845-50.

54. Wright JW, Stubley L, Pederson ES, Kramar EA, Hanesworth JM, Harding JW. Contributions of the brain angiotensin IV-AT4 receptor subtype system to spatial learning. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 1999; 19(10):3952-61.

55. Mendelsohn FA, Jenkins TA, Berkovic SF. Effects of angiotensin II on dopamine and serotonin turnover în the striatum of conscious rats. Brain Res. 1993; 613(2):221-9.

56. Kehoe PG. The renin-angiotensin-aldosterone system and Alzheimer s disease? J Renin Angiotensin Aldosterone Syst. 2003; 4(2):80-93.

57. Braszko JJ, Walesiuk A, Wielgat P. Cognitive effects attributed to angiotensin II may result from its conversion to angiotensin IV. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst. 2006; 7(3):168-74.

58. Faure S, Javellaud J, Achard JM, Oudart N. Vasoconstrictive effect of angiotensin IV în isolated rat basilar artery independent of AT1 and AT2 receptors. J Vasc Res. 2006; 43(1):19-26.

59. Faure S, Oudart N, Javellaud J, Fournier A, Warnock DG, Achard JM. Synergistic protective effects of erythropoietin and olmesartan on ischemic stroke survival and post-stroke memory dysfunctions în the gerbil. J Hypertens. 2006; 24(11):2255-61.

60. Jackman HL, Massad MG, Sekosan M, Tan F, Brovkovych V, Marcic BM, et al. Angiotensin 1-9 and 1-7 release în human heart: role of cathepsin A. Hypertension. 2002; 39(5):976-81.

61. Ferreira PM, Souza Dos Santos RA, Campagnole-Santos MJ. Angiotensin-(3-7) pressor effect at the rostral ventrolateral medulla. Regul Pept. 2007; 141(1-3):168-74.

62. Peach MJ. Renin-angiotensin system: biochemistry and mechanisms of action. Physiological reviews. 1977; 57(2):313-70.

63. Devynck MA, Meyer P. Angiotensin receptors. Biochemical pharmacology. 1978; 27(1):1-5.

64. Peach MJ, Levens NR. Molecular approaches to the study of angiotensin receptors. Advances în experimental medicine and biology. 1980; 130:171-94.

65. Ferrario CM, Brosnihan KB, Diz DI, Jaiswal N, Khosla MC, Milsted A, et al. Angiotensin-(1-7): a new hormone of the angiotensin system. Hypertension. 1991; 18(5 Suppl):III126-33.

66. Speth RC, Kim KH. Discrimination of two angiotensin II receptor subtypes with a selective agonist analogue of angiotensin II, p-aminophenylalanine6 angiotensin II. Biochemical and biophysical research communications. 1990; 169(3):997-1006.

67. Chaki S, Inagami T. Identification and characterization of a new binding site for angiotensin II în mouse neuroblastoma neuro-2A cells. Biochemical and biophysical research communications. 1992; 182(1):388-94.

68. Harrison-Bernard LM, Monjure CJ, Bivona BJ. Efferent arterioles exclusively express the subtype 1A angiotensin receptor: functional insights from genetic mouse models. American journal of physiology Renal physiology. 2006; 290(5):F1177-86.

69. Grady EF, Sechi LA, Griffin CA, Schambelan M, Kalinyak JE. Expression of AT2 receptors în the developing rat fetus. The Journal of clinical investigation. 1991; 88(3):921-33.

70. Lazard D, Briend-Sutren MM, Villageois P, Mattei MG, Strosberg AD, Nahmias C. Molecular characterization and chromosome localization of a human angiotensin II AT2 receptor gene highly expressed în fetal tissues. Receptors & channels. 1994; 2(4):271-80.

71. Sechi LA, Grady EF, Griffin CA, Kalinyak JE, Schambelan M. Distribution of angiotensin II receptor subtypes în rat and human kidney. The American journal of physiology. 1992; 262(2 Pt 2):F236-40.

72. Zhuo J, Dean R, MacGregor D, Alcorn D, Mendelsohn FA. Presence of angiotensin II AT2 receptor binding sites în the adventitia of human kidney vasculature. Clinical and experimental pharmacology & physiology Supplement. 1996; 3:S147-54.

73. Santos RA, Campagnole-Santos MJ, Andrade SP. Angiotensin-(1-7): an update. Regulatory peptides. 2000; 91(1-3):45-62.

74. Pan N, Luo J, Kaiser SJ, Frome WL, Dart RA, Tewksbury DA. Specific receptor for angiotensinogen on human renal cells. Clinica chimica acta; international journal of clinical chemistry. 2006; 373(1-2):32-6.

75. Brand M, Lamande N, Sigmund CD, Larger E, Corvol P, Gasc JM. Angiotensinogen modulates renal vasculature growth. Hypertension. 2006; 47(6):1067-74.

76. Noda K, Feng YH, Liu XP, Saad Y, Husain A, Karnik SS. The active state of the AT1 angiotensin receptor is generated by angiotensin II induction. Biochemistry. 1996; 35(51):16435-42.

77. Berk BC, Corson MA. Angiotensin II signal transduction în vascular smooth muscle: role of tyrosine kinases. Circulation research. 1997; 80(5):607-16.

78. Marrero MB, Schieffer B, Paxton WG, Heerdt L, Berk BC, Delafontaine P, et al. Direct stimulation of Jak/STAT pathway by the angiotensin II AT1 receptor. Nature. 1995; 375(6528):247-50.

79. Ruiz-Ortega M, Lorenzo O, Ruperez M, Konig S, Wittig B, Egido J. Angiotensin II activates nuclear transcription factor kappaB through AT(1) and AT(2) în vascular smooth muscle cells: molecular mechanisms. Circulation research. 2000; 86(12):1266-72.

80. Hernandez-Presa M, Bustos C, Ortego M, Tunon J, Renedo G, Ruiz-Ortega M, et al. Angiotensin-converting enzyme inhibition prevents arterial nuclear factor-kappa B activation, monocyte chemoattractant protein-1 expression, and macrophage infiltration în a rabbit model of early accelerated atherosclerosis. Circulation. 1997; 95(6):1532-41.

81. Zhang H, Schmeisser A, Garlichs CD, Plotze K, Damme U, Mugge A, et al. Angiotensin II-induced superoxide anion generation în human vascular endothelial cells: role of membrane-bound NADH-/NADPH-oxidases. Cardiovascular research. 1999; 44(1):215-22.

82. Berry C, Hamilton CA, Brosnan MJ, Magill FG, Berg GA, McMurray JJ, et al. Investigation into the sources of superoxide în human blood vessels: angiotensin II increases superoxide production în human internal mammary arteries. Circulation. 2000; 101(18):2206-12.

83. Bauersachs J, Bouloumie A, Fraccarollo D, Hu K, Busse R, Ertl G. Endothelial dysfunction în chronic myocardial infarction despite increased vascular endothelial nitric oxide synthase and soluble guanylate cyclase expression: role of enhanced vascular superoxide production. Circulation. 1999; 100(3):292-8.

84. Hansen PB, Castrop H, Briggs J, Schnermann J. Adenosine induces vasoconstriction through Gi-dependent activation of phospholipase C în isolated perfused afferent arterioles of mice. Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 2003; 14(10):2457-65.

85. de Gasparo M, Catt KJ, Inagami T, Wright JW, Unger T. International union of pharmacology. XXIII. The angiotensin II receptors. Pharmacological reviews. 2000; 52(3):415-72.

86. Berry C, Touyz R, Dominiczak AF, Webb RC, Johns DG. Angiotensin receptors: signaling, vascular pathophysiology, and interactions with ceramide. American journal of physiology Heart and circulatory physiology. 2001; 281(6):H2337-65.

87. Mimran A, Ribstein J, DuCailar G. Angiotensin II receptor antagonists and hypertension. Clin Exp Hypertens. 1999; 21(5-6):847-58.

88. McConnaughey MM, McConnaughey JS, Ingenito AJ. Practical considerations of the pharmacology of angiotensin receptor blockers. J Clin Pharmacol. 1999; 39(6):547-59.

89. Timmermans PB, Wong PC, Chiu AT, Herblin WF, Benfield P, Carini DJ, et al. Angiotensin II receptors and angiotensin II receptor antagonists. Pharmacological reviews. 1993; 45(2):205-51.

90. Chou SY, Faubert PF, Porush JG. Contribution of angiotensin to the control of medullary hemodynamics. Federation proceedings. 1986; 45(5):1438-43.

91. Gross SS, Wolin MS. Nitric oxide: pathophysiological mechanisms. Annual review of physiology. 1995; 57:737-69.

92. Simon G, Altman S. Subpressor angiotensin II is a bifunctional growth factor of vascular muscle în rats. Journal of hypertension. 1992; 10(10):1165-71.

93. Roos MH, van Rodijnen WF, van Lambalgen AA, ter Wee PM, Tangelder GJ. Renal microvascular constriction to membrane depolarization and other stimuli: pivotal role for rho-kinase. Pflugers Archiv : European journal of physiology. 2006; 452(4):471-7.

94. Dubinion JH, Mi Z, Jackson EK. Role of renal sympathetic nerves în regulating renovascular responses to angiotensin II în spontaneously hypertensive rats. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 2006; 317(3):1330-6.

95. Joly E, Seqqat R, Flamion B, Caron N, Michel A, Imig JD, et al. Increased renal vascular reactivity to ANG II after unilateral nephrectomy în the rat involves 20-HETE. American journal of physiology Regulatory, integrative and comparative physiology. 2006; 291(4):R977-86.

96. Muthalif MM, Benter IF, Uddin MR, Harper JL, Malik KU. Signal transduction mechanisms involved în angiotensin-(1-7)-stimulated arachidonic acid release and prostanoid synthesis în rabbit aortic smooth muscle cells. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 1998; 284(1):388-98.

97. Jaiswal N, Diz DI, Chappell MC, Khosla MC, Ferrario CM. Stimulation of endothelial cell prostaglandin production by angiotensin peptides. Characterization of receptors. Hypertension. 1992; 19(2 Suppl):II49-55.

98. Li P, Chappell MC, Ferrario CM, Brosnihan KB. Angiotensin-(1-7) augments bradykinin-induced vasodilation by competing with ECA and releasing nitric oxide. Hypertension. 1997; 29(1 Pt 2):394-400.

99. Ueda S, Masumori-Maemoto S, Ashino K, Nagahara T, Gotoh E, Umemura S, et al. Angiotensin-(1-7) attenuates vasoconstriction evoked by angiotensin II but not by noradrenaline în man. Hypertension. 2000; 35(4):998-1001.

100. Chappell MC, Diz DI, Yunis C, Ferrario CM. Differential actions of angiotensin-(1-7) în the kidney. Kidney international Supplement. 1998; 68:S3-6.

101. Nathisuwan S, Talbert RL. A review of vasopeptidase inhibitors: a new modality în the treatment of hypertension and chronic heart failure. Pharmacotherapy. 2002; 22(1):27-42.

102. Bani M, Colantoni A, Guillaume M, Macchi F, Moroni G, Persiani S. A double-blind, placebo-controlled study to assess tolerability, pharmacokinetics and preliminary pharmacodynamics of single escalating doses of Z13752A, a novel dual inhibitor of the metalloproteases ECA and NEP, în healthy volunteers. Br J Clin Pharmacol. 2000; 50(4):338-49.

103. Corti R, Burnett JC, Jr., Rouleau JL, Ruschitzka F, Luscher TF. Vasopeptidase inhibitors: a new therapeutic concept în cardiovascular disease? Circulation. 2001; 104(15):1856-62.

104. Fitzgerald GA. Prostaglandins: modulators of inflammation and cardiovascular risk. J Clin Rheumatol. 2004; 10(3 Suppl):S12-7.

105. Katzung BG. Basic & clinical pharmacology. 9th ed. New York: Lange Medical Books/McGraw Hill; 2004. xiv, 1202 p. p.

106. Sellers RS, Radi ZA, Khan NK. Pathophysiology of cyclooxygenases în cardiovascular homeostasis. Vet Pathol. 2010; 47(4):601-13.

107. McClelland S, Gawaz M, Kennerknecht E, Konrad CS, Sauer S, Schuerzinger K, et al. Contribution of cyclooxygenase-1 to thromboxane formation, platelet-vessel wall interactions and atherosclerosis în the ApoE null mouse. Atherosclerosis. 2009; 202(1):84-91.

108. Kobayashi H, Gonda T, Uetake H, Higuchi T, Enomoto M, Sugihara K. JTE-522, a selective COX-2 inhibitor, interferes with the growth of lung metastases from colorectal cancer în rats due to inhibition of neovascularization: a vascular cast model study. Int J Cancer. 2004; 112(6):920-6.

109. Pratico D, Lawson JA, Rokach J, FitzGerald GA. The isoprostanes în biology and medicine. Trends Endocrinol Metab. 2001; 12(6):243-7.

110. Guthikonda S, Lev EI, Patel R, DeLao T, Bergeron AL, Dong JF, et al. Reticulated platelets and uninhibited COX-1 and COX-2 decrease the antiplatelet effects of aspirin. J Thromb Haemost. 2007; 5(3):490-6.

111. Fukuzaki A, Morrissey J, Klahr S. Role of glomerular eicosanoid production în the obstructed kidney. Int Urol Nephrol. 1993; 25(6):525-31.

112. Lomnicka M, Karouni K, Sue M, Wessel LA, Bing RJ. Effects of nonsteroidal anti-inflammatory drugs on prostacyclin and thromboxane în the kidney. Pharmacology. 2003; 68(3):147-53.

113. Martynova TV, Aleksieieva IM, Bryzhina TM, Aleksiuk LI, Sukhina VS. [Effect of inhibitors of cyclooxygenase and lypoxygenase pathway of metabolism of arachidonic acid on the development and suppression of the immune response în mice]. Fiziol Zh. 2003; 49(1):18-22.

114. Back M, Sakata K, Qiu H, Haeggstrom JZ, Dahlen SE. Endothelium-dependent vascular responses induced by leukotriene B4. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 2007; 83(3):209-12.

115. Sanak M, Plutecka H, Szczeklik W, Piwowarska W, Rostoff P, Szczeklik A. Functional promoter polymorphism of cyclooxygenase-2 modulates the inflammatory response în stable coronary heart disease. Pol Arch Med Wewn. 2010; 120(3):82-8.

116. Pawlik WW, Gustaw P, Sendur R, Czarnobilski K, Konturek SJ, Beck G, et al. Vasoactive and metabolic effects of leukotriene C4 and D4 în the intestine. Hepatogastroenterology. 1988; 35(2):87-90.

117. Joos GF. Which patients with asthma could benefit from using anti-leukotriene drugs: an evidence based review. Pol Arch Med Wewn. 2008; 118(12):689-90.

118. Leung N, Eirin A, Irazabal MV, Maddox DE, Gunderson HD, Fervenza FC, et al. Acute kidney injury în patients with inactive cytochrome P450 polymorphisms. Ren Fail. 2009; 31(8):749-52.

119. Rainsford KD, Kean WF, Ehrlich GE. Review of the pharmaceutical properties and clinical effects of the topical NSAID formulation, diclofenac epolamine. Curr Med Res Opin. 2008; 24(10):2967-92.

120. Yeomans ND, Naesdal J. Systematic review: ulcer definition în NSAID ulcer prevention trials. Aliment Pharmacol Ther. 2008; 27(6):465-72.

121. Feldman M, McMahon AT. Do cyclooxygenase-2 inhibitors provide benefits similar to those of traditional nonsteroidal anti-inflammatory drugs, with less gastrointestinal toxicity? Ann Intern Med. 2000; 132(2):134-43.

122. Goodman LS, Gilman A, Brunton LL. Goodman & Gilman's manual of pharmacology and therapeutics. New York: McGraw-Hill Medical; 2008. ix, 1219 p. p.

123. Moodley I. Review of the cardiovascular safety of COXIBs compared to NSAIDS. Cardiovasc J Afr. 2008; 19(2):102-7.

124. Weberschock TB, Muller SM, Boehncke S, Boehncke WH. Tolerance to coxibs în patients with intolerance to non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs): a systematic structured review of the literature. Arch Dermatol Res. 2007; 299(4):169-75.

125. Levesque LE, Brophy JM, Zhang B. The risk for myocardial infarction with cyclooxygenase-2 inhibitors: a population study of elderly adults. Ann Intern Med. 2005; 142(7):481-9.

126. Graham DJ, Campen D, Hui R, Spence M, Cheetham C, Levy G, et al. Risk of acute myocardial infarction and sudden cardiac death în patients treated with cyclo-oxygenase 2 selective and non-selective non-steroidal anti-inflammatory drugs: nested case-control study. Lancet. 2005; 365(9458):475-81.

127. Ferreira SH. A Bradykinin-Potentiating Factor (Bpf) Present în the Venom of Bothrops Jararca. Br J Pharmacol Chemother. 1965; 24:163-9.

128. Erdos EG. Angiotensin I converting enzyme. Circ Res. 1975; 36(2):247-55.

129. Barretto AC, Wajngarten M, Serro-Azul JB, Pierri H, Nussbacher A, Gebara OC. [Medical treatment of heart failure at a tertiary hospital of Sao Paulo]. Arq Bras Cardiol. 1997; 69(6):375-9.

130. Jaeger P, Ferguson RK, Brunner HR, Kirchertz EJ, Gavras H. Mechanism of blood pressure reduction by teprotide (SQ 20881) în rats. Kidney Int. 1978; 13(4):289-96.

131. Adam A, Raij L. Nitric oxide–angiotensin II axis în renal and cardiovascular injury. J Nephrol. 2000; 13(3):211-20.

132. Luno J, Praga M, de Vinuesa SG. The reno-protective effect of the dual blockade of the renin angiotensin system (RAS). Curr Pharm Des. 2005; 11(10):1291-300.

133. Weigert C, Brodbeck K, Brosius FC, 3rd, Huber M, Lehmann R, Friess U, et al. Evidence for a novel TGF-beta1-independent mechanism of fibronectin production în mesangial cells overexpressing glucose transporters. Diabetes. 2003; 52(2):527-35.

134. Raij L. The pathophysiologic basis for blocking the renin-angiotensin system în hypertensive patients with renal disease. Am J Hypertens. 2005; 18(4 Pt 2):95S-9S.

135. Sironi L, Nobili E, Gianella A, Gelosa P, Tremoli E. Anti-inflammatory properties of drugs acting on the renin-angiotensin system. Drugs Today (Barc). 2005; 41(9):609-22.

136. Haulica I, Bild W, Boisteanu D. Biosynthesis and physio-pharmacological actions of angiotensin peptides: 2. Physio-pharmacological properties. Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi. 2006; 110(2):384-90.

137. Kaufman J, Casanova JE, Riendl P, Schlueter DP. Bronchial hyperreactivity and cough due to angiotensin-converting enzyme inhibitors. Chest. 1989; 95(3):544-8.

138. Salena BJ. Chronic cough and the use of captopril: unmasking asthma. Arch Intern Med. 1986; 146(1):202-3.

139. Williams GH. Converting-enzyme inhibitors în the treatment of hypertension. The New England journal of medicine. 1988; 319(23):1517-25.

140. Kostis JB. Angiotensin-converting enzyme inhibitors. Emerging differences and new compounds. American journal of hypertension. 1989; 2(1):57-64.

141. Brown NJ, Vaughan DE. Angiotensin-converting enzyme inhibitors. Circulation. 1998; 97(14):1411-20.

142. Lonn EM, Yusuf S, Jha P, Montague TJ, Teo KK, Benedict CR, et al. Emerging role of angiotensin-converting enzyme inhibitors în cardiac and vascular protection. Circulation. 1994; 90(4):2056-69.

143. Zimmerman BG, Sybertz EJ, Wong PC. Interaction between sympathetic and renin-angiotensin system. Journal of hypertension. 1984; 2(6):581-7.

144. Hornig B, Kohler C, Drexler H. Role of bradykinin în mediating vascular effects of angiotensin-converting enzyme inhibitors în humans. Circulation. 1997; 95(5):1115-8.

145. Linz W, Wohlfart P, Scholkens BA, Malinski T, Wiemer G. Interactions among ECA, kinins and NO. Cardiovascular research. 1999; 43(3):549-61.

146. Dzau VJ, Bernstein K, Celermajer D, Cohen J, Dahlof B, Deanfield J, et al. The relevance of tissue angiotensin-converting enzyme: manifestations în mechanistic and endpoint data. The American journal of cardiology. 2001; 88(9A):1L-20L.

147. Schmieder RE, Martus P, Klingbeil A. Reversal of left ventricular hypertrophy în essential hypertension. A meta-analysis of randomized double-blind studies. JAMA : the journal of the American Medical Association. 1996; 275(19):1507-13.

148. Hornig B, Arakawa N, Drexler H. Effect of ECA inhibition on endothelial dysfunction în patients with chronic heart failure. European heart journal. 1998; 19 Suppl G:G48-53.

149. Francis GS, Benedict C, Johnstone DE, Kirlin PC, Nicklas J, Liang CS, et al. Comparison of neuroendocrine activation în patients with left ventricular dysfunction with and without congestive heart failure. A substudy of the Studies of Left Ventricular Dysfunction (SOLVD). Circulation. 1990; 82(5):1724-9.

150. Swedberg K, Eneroth P, Kjekshus J, Wilhelmsen L. Hormones regulating cardiovascular function în patients with severe congestive heart failure and their relation to mortality. CONSENSUS Trial Study Group. Circulation. 1990; 82(5):1730-6.

151. Swedberg K. Importance of neuroendocrine activation în chronic heart failure. Impact on treatment strategies. European journal of heart failure. 2000; 2(3):229-33.

152. Husain A. The chymase-angiotensin system în humans. Journal of hypertension. 1993; 11(11):1155-9.

153. Lee AF, MacFadyen RJ, Struthers AD. Neurohormonal reactivation în heart failure patients on chronic ACE inhibitor therapy: a longitudinal study. European journal of heart failure. 1999; 1(4):401-6.

154. Boon WC, McDougall JG, Coghlan JP. Hypothesis: aldosterone is synthesized by an alternative pathway during severe sodium depletion. 'A new wine în an old bottle'. Clinical and experimental pharmacology & physiology. 1998; 25(5):369-78.

155. Lotshaw DP. Role of membrane depolarization and T-type Ca2+ channels în angiotensin II and K+ stimulated aldosterone secretion. Molecular and cellular endocrinology. 2001; 175(1-2):157-71.

156. Paul M, Ganten D. The molecular basis of cardiovascular hypertrophy: the role of the renin-angiotensin system. Journal of cardiovascular pharmacology. 1992; 19 Suppl 5:S51-8.

157. Schiffrin EL, Deng LY. Comparison of effects of angiotensin I-converting enzyme inhibition and beta-blockade for 2 years on function of small arteries from hypertensive patients. Hypertension. 1995; 25(4 Pt 2):699-703.

158. Matsuda H, Hayashi K, Arakawa K, Naitoh M, Kubota E, Honda M, et al. Zonal heterogeneity în action of angiotensin-converting enzyme inhibitor on renal microcirculation: role of intrarenal bradykinin. Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 1999; 10(11):2272-82.

159. Keane WF, Shapiro BE. Renal protective effects of angiotensin-converting enzyme inhibition. The American journal of cardiology. 1990; 65(19):49I-53I.

160. Ruggenenti P, Perna A, Gherardi G, Garini G, Zoccali C, Salvadori M, et al. Renoprotective properties of ECA-inhibition în non-diabetic nephropathies with non-nephrotic proteinuria. Lancet. 1999; 354(9176):359-64.

161. Lewis EJ, Hunsicker LG, Bain RP, Rohde RD. The effect of angiotensin-converting-enzyme inhibition on diabetic nephropathy. The Collaborative Study Group. The New England journal of medicine. 1993; 329(20):1456-62.

162. Lonn E, Yusuf S, Dzavik V, Doris C, Yi Q, Smith S, et al. Effects of ramipril and vitamin E on atherosclerosis: the study to evaluate carotid ultrasound changes în patients treated with ramipril and vitamin E (SECURE). Circulation. 2001; 103(7):919-25.

163. Pitt B. Potential role of angiotensin converting enzyme inhibitors în treatment of atherosclerosis. European heart journal. 1995; 16 Suppl K:49-54.

164. Vane JR, Botting RM. A better understanding of anti-inflammatory drugs based on isoforms of cyclooxygenase (COX-1 and COX-2). Advances în prostaglandin, thromboxane, and leukotriene research. 1995; 23:41-8.

165. Kumari B, Kumar A, Dhir A. Protective effect of non-selective and selective COX-2-inhibitors în acute immobilization stress-induced behavioral and biochemical alterations. Pharmacol Rep. 2007; 59(6):699-707.

166. Tassoni D, Kaur G, Weisinger RS, Sinclair AJ. The role of eicosanoids în the brain. Asia Pac J Clin Nutr. 2008; 17 Suppl 1:220-8.

167. Ruiz-Ortega M, Lorenzo O, Ruperez M, Esteban V, Suzuki Y, Mezzano S, et al. Role of the renin-angiotensin system în vascular diseases: expanding the field. Hypertension. 2001; 38(6):1382-7.

168. Shinoda J, Kozawa O, Suzuki A, Watanabe-Tomita Y, Oiso Y, Uematsu T. Mechanism of angiotensin II-induced arachidonic acid metabolite release în aortic smooth muscle cells: involvement of phospholipase D. European journal of endocrinology / European Federation of Endocrine Societies. 1997; 136(2):207-12.

169. Ohnaka K, Numaguchi K, Yamakawa T, Inagami T. Induction of cyclooxygenase-2 by angiotensin II în cultured rat vascular smooth muscle cells. Hypertension. 2000; 35(1 Pt 1):68-75.

170. Derbyshire ZE, Halfter UM, Heimark RL, Sy TH, Vaillancourt RR. Angiotensin II stimulated transcription of cyclooxygenase II is regulated by a novel kinase cascade involving Pyk2, MEKK4 and annexin II. Molecular and cellular biochemistry. 2005; 271(1-2):77-90.

171. Morinelli TA, Kendall RT, Luttrell LM, Walker LP, Ullian ME. Angiotensin II-induced cyclooxygenase 2 expression în rat aorta vascular smooth muscle cells does not require heterotrimeric G protein activation. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 2009; 330(1):118-24.

172. Ghoshal S, Loftin CD. Cyclooxygenase-2 inhibition attenuates abdominal aortic aneurysm progression în hyperlipidemic mice. PloS one. 2012; 7(11):e44369.

173. King VL, Trivedi DB, Gitlin JM, Loftin CD. Selective cyclooxygenase-2 inhibition with celecoxib decreases angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation în mice. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 2006; 26(5):1137-43.

174. Gitlin JM, Trivedi DB, Langenbach R, Loftin CD. Genetic deficiency of cyclooxygenase-2 attenuates abdominal aortic aneurysm formation în mice. Cardiovascular research. 2007; 73(1):227-36.

175. Virdis A, Colucci R, Neves MF, Rugani I, Aydinoglu F, Fornai M, et al. Resistance artery mechanics and composition în angiotensin II-infused mice: effects of cyclooxygenase-1 inhibition. European heart journal. 2012; 33(17):2225-34.

176. Castillo-Hernandez MC, Martinez-Godinez MA, Guevara-Balcazar G, Miliar-Garcia A, Mancilla J, Lopez-Mayorga RM, et al. Extraendothelial and constitutive COX-2 expression is involved în the contractile effect of angiotensin II în the rat aorta. Autonomic & autacoid pharmacology. 2010; 30(4):205-11.

177. Castillo-Hernandez MC, Guevara-Balcazar G, Lopez-Sanchez P, Asbun-Bojalil J, Lopez RM, Castillo EF, et al. The influence of constitutive COX-2 în smooth muscle tissue on the contractile effect of phenylephrine în the rat abdominal aorta. Frontiers în bioscience. 2010; 2:441-8.

178. Pueyo ME, Michel JB. Angiotensin II receptors în endothelial cells. General pharmacology. 1997; 29(5):691-6.

179. Rao GN, Lassegue B, Alexander RW, Griendling KK. Angiotensin II stimulates phosphorylation of high-molecular-mass cytosolic phospholipase A2 în vascular smooth-muscle cells. The Biochemical journal. 1994; 299 ( Pt 1):197-201.

180. Bugge JF, Stokke ES. Angiotensin II and renal prostaglandin release în the dog. Interactions în controlling renal blood flow and glomerular filtration rate. Acta physiologica Scandinavica. 1994; 150(4):431-40.

181. Arima S, Ren Y, Juncos LA, Carretero OA, Ito S. Glomerular prostaglandins modulate vascular reactivity of the downstream efferent arterioles. Kidney international. 1994; 45(3):650-8.

182. Wilcox CS, Welch WJ, Snellen H. Thromboxane mediates renal hemodynamic response to infused angiotensin II. Kidney international. 1991; 40(6):1090-7.

183. Kaushal RD, Wilson TW. Effect of furegrelate on renal plasma flow after angiotensin II infusion. Canadian journal of physiology and pharmacology. 1990; 68(4):500-4.

184. Oyekan A, Balazy M, McGiff JC. Renal oxygenases: differential contribution to vasoconstriction induced by ET-1 and ANG II. The American journal of physiology. 1997; 273(1 Pt 2):R293-300.

185. Silldorff EP, Hilbun LR, Pallone TL. Angiotensin II constriction of rat vasa recta is partially thromboxane dependent. Hypertension. 2002; 40(4):541-6.

186. Haulica I, Bild W, Mihaila CN, Ionita T, Boisteanu CP, Neagu B. Biphasic effects of angiotensin (1-7) and its interactions with angiotensin II în rat aorta. Journal of the renin-angiotensin-aldosterone system : JRAAS. 2003; 4(2):124-8.

187. Haulica I, Bild W, Mihaila C, Serban DN, Serban L, Boisteanu D, et al. Comparative study of the inhibitory effects of adrenomedullin on angiotensin II contraction în rat conductance and resistance arteries. Journal of the renin-angiotensin-aldosterone system : JRAAS. 2004; 5(2):79-83.

188. Martinez AC, Pagan RM, Prieto D, Recio P, Garcia-Sacristan A, Hernandez M, et al. Modulation of noradrenergic neurotransmission în isolated rat radial artery. J Pharmacol Sci. 2009; 111(3):299-311.

189. Ozkan MH, Uma S. Does endothelium-derived hyperpolarizing factor play a role în endothelium-dependent component of electrical field stimulation-induced vasorelaxation of rat mesenteric arterial rings? J Cardiovasc Pharmacol. 2009; 53(1):30-7.

190. Mulvany MJ, Aalkjaer C. Structure and function of small arteries. Physiol Rev. 1990; 70(4):921-61.

191. Mulvany MJ, Halpern W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells în situ. Nature. 1976; 260(5552):617-9.

192. Park JI, Shin CY, Lee YW, Huh IH, Sohn UD. Endothelium-dependent sensory non-adrenergic non-cholinergic vasodilatation în rat thoracic aorta: involvement of ATP and a role for NO. The Journal of pharmacy and pharmacology. 2000; 52(4):409-16.

193. Nakanishi H, Matsuoka I, Ono T, Nakahata N. Contribution of endothelium în contractile response of isolated rabbit aortic preparation to electrical field stimulation. Fukushima journal of medical science. 1998; 44(1):23-33.

194. Geary GG, Maeda G, Gonzalez RR, Jr. Endothelium-dependent vascular smooth muscle relaxation activated by electrical field stimulation. Acta physiologica Scandinavica. 1997; 160(3):219-28.

195. Tarasova O, Sjoblom-Widfeldt N, Nilsson H. Transmitter characteristics of cutaneous, renal and skeletal muscle small arteries în the rat. Acta physiologica Scandinavica. 2003; 177(2):157-66.

196. Walkowska A, Badzynska B, Kompanowska-Jezierska E, Johns EJ, Sadowski J. Effects of renal nerve stimulation on intrarenal blood flow în rats with intact or inactivated NO synthases. Acta physiologica Scandinavica. 2005; 183(1):99-105.

197. Mervaala E, Muller DN, Schmidt F, Park JK, Gross V, Bader M, et al. Blood pressure-independent effects în rats with human renin and angiotensinogen genes. Hypertension. 2000; 35(2):587-94.

198. Burnier M, Brunner HR. Angiotensin II receptor antagonists. Lancet. 2000; 355(9204):637-45.

199. Chobanian MC, Julin CM. Angiotensin II stimulates ammoniagenesis în canine renal proximal tubule segments. The American journal of physiology. 1991; 260(1 Pt 2):F19-26.

200. Nagami GT. Ammonia production and secretion by the proximal tubule: effect of peritubular and luminal potassium concentration. Contributions to nephrology. 1991; 92:136-40.

201. Harris RC, Zhang MZ, Cheng HF. Cyclooxygenase-2 and the renal renin-angiotensin system. Acta physiologica Scandinavica. 2004; 181(4):543-7.

202. Kammerl MC, Nusing RM, Richthammer W, Kramer BK, Kurtz A. Inhibition of COX-2 counteracts the effects of diuretics în rats. Kidney international. 2001; 60(5):1684-91.

203. Hocherl K, Kammerl MC, Schumacher K, Endemann D, Grobecker HF, Kurtz A. Role of prostanoids în regulation of the renin-angiotensin-aldosterone system by salt intake. American journal of physiology Renal physiology. 2002; 283(2):F294-301.

204. Stichtenoth DO, Wagner B, Frolich JC. Effect of selective inhibition of the inducible cyclooxygenase on renin release în healthy volunteers. Journal of investigative medicine : the official publication of the American Federation for Clinical Research. 1998; 46(6):290-6.

205. Reinalter SC, Jeck N, Brochhausen C, Watzer B, Nusing RM, Seyberth HW, et al. Role of cyclooxygenase-2 în hyperprostaglandin E syndrome/antenatal Bartter syndrome. Kidney international. 2002; 62(1):253-60.

206. Skott O, Uhrenholt TR, Schjerning J, Hansen PB, Rasmussen LE, Jensen BL. Rapid actions of aldosterone în vascular health and disease–friend or foe? Pharmacology & therapeutics. 2006; 111(2):495-507.

207. Miyata K, Rahman M, Shokoji T, Nagai Y, Zhang GX, Sun GP, et al. Aldosterone stimulates reactive oxygen species production through activation of NADPH oxidase în rat mesangial cells. J Am Soc Nephrol. 2005; 16(10):2906-12.

208. Wilson SK. Role of oxygen-derived free radicals în acute angiotensin II–induced hypertensive vascular disease în the rat. Circ Res. 1990; 66(3):722-34.

209. Lazartigues E, Lawrence AJ, Lamb FS, Davisson RL. Renovascular hypertension în mice with brain-selective overexpression of AT1a receptors is buffered by increased nitric oxide production în the periphery. Circ Res. 2004; 95(5):523-31.

210. Lyle AN, Griendling KK. Modulation of vascular smooth muscle signaling by reactive oxygen species. Physiology (Bethesda). 2006; 21:269-80.

211. Santini V, Giles FJ. The potential of amifostine: from cytoprotectant to therapeutic agent. Haematologica. 1999; 84(11):1035-42.

212. Aitio ML. N-acetylcysteine – passe-partout or much ado about nothing? Br J Clin Pharmacol. 2006; 61(1):5-15.

213. Powley TL, Baronowsky EA, Gilbert JM, Hudson CN, Martin FN, Mason JK, et al. Vagal afferent innervation of the lower esophageal sphincter. Autonomic neuroscience : basic & clinical. 2013.

214. Horn CC, Kimball BA, Wang H, Kaus J, Dienel S, Nagy A, et al. Why can't rodents vomit? A comparative behavioral, anatomical, and physiological study. PloS one. 2013; 8(4):e60537.

215. Kuramoto H, Kadowaki M, Yoshida N. Morphological demonstration of a vagal inhibitory pathway to the lower esophageal sphincter via nitrergic neurons în the rat esophagus. Neurogastroenterology and motility : the official journal of the European Gastrointestinal Motility Society. 2013; 25(7):e485-94.

216. Blennerhassett MG, Lourenssen S. Neural regulation of intestinal smooth muscle growth în vitro. American journal of physiology Gastrointestinal and liver physiology. 2000; 279(3):G511-9.

217. Perlegas D, Xie H, Sinha S, Somlyo AV, Owens GK. ANG II type 2 receptor regulates smooth muscle growth and force generation în late fetal mouse development. American journal of physiology Heart and circulatory physiology. 2005; 288(1):H96-102.

218. Strohmenger HU, Lindner KH, Wienen W, Radermacher P. Effects of an angiotensin II antagonist on organ perfusion during the post-resuscitation phase în pigs. Critical care. 1998; 2(2):49-55.

219. Naim HY. Secretion of human intestinal angiotensin-converting enzyme and its association with the differentiation state of intestinal cells. The Biochemical journal. 1996; 316 ( Pt 1):259-64.

220. Duggan KA, Mendelsohn FA, Levens NR. Angiotensin receptors and angiotensin I-converting enzyme în rat intestine. The American journal of physiology. 1989; 257(4 Pt 1):G504-10.

221. Coruzzi G, Poli E, Adami M, Bertaccini G, Starcich B. Action of angiotensin on vascular and intestinal smooth muscle and its antagonism by saralasin. Pharmacological research communications. 1983; 15(8):719-34.

222. Edwards IR, Coulter DM, Macintosh D. Intestinal effects of captopril. Bmj. 1992; 304(6823):359-60.

223. Adami M, Coppelli G, Guaita E, Pozzoli C, Menozzi A, Giovannini E, et al. Effects of cyclooxygenase-1 and -2 inhibition on gastric acid secretion and cardiovascular functions în rats. Pharmacology. 2006; 76(2):84-92.

224. Semenov I, Herlihy JT, Brenner R. In vitro measurements of tracheal constriction using mice. Journal of visualized experiments : JoVE. 2012; (64).

225. Sakai H, Nishizawa Y, Nishimura A, Chiba Y, Goto K, Hanazaki M, et al. Angiotensin II induces hyperresponsiveness of bronchial smooth muscle via an activation of p42/44 ERK în rats. Pflugers Archiv : European journal of physiology. 2010; 460(3):645-55.

226. Barauna VG, Magalhaes FC, Campos LC, Reis RI, Kunapuli SP, Costa-Neto CM, et al. Shear stress-induced Ang II AT1 receptor activation: G-protein dependent and independent mechanisms. Biochemical and biophysical research communications. 2013; 434(3):647-52.

227. Oudit GY, Kassiri Z, Patel MP, Chappell M, Butany J, Backx PH, et al. Angiotensin II-mediated oxidative stress and inflammation mediate the age-dependent cardiomyopathy în ECA2 null mice. Cardiovascular research. 2007; 75(1):29-39.

228. Morinelli TA, Walker LP, Ullian ME. COX-2 expression stimulated by Angiotensin II depends upon AT1 receptor internalization în vascular smooth muscle cells. Biochimica et biophysica acta. 2008; 1783(6):1048-54.

229. Alvarez Y, Perez-Giron JV, Hernanz R, Briones AM, Garcia-Redondo A, Beltran A, et al. Losartan reduces the increased participation of cyclooxygenase-2-derived products în vascular responses of hypertensive rats. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 2007; 321(1):381-8.

230. Bishnoi M, Patil CS, Kumar A, Kulkarni SK. Protective effects of nimesulide (COX Inhibitor), AKBA (5-LOX Inhibitor), and their combination în aging-associated abnormalities în mice. Methods Find Exp Clin Pharmacol. 2005; 27(7):465-70.

231. Santos CF, Coelho EB, Salgado MCO. Effect of captopril on neurally induced contraction and relaxation of mesenteric arteries of renal hypertensive rats. Canadian journal of physiology and pharmacology. 2000; 78(6):469-75.

232. Hirao A, Kondo K, Takeuchi K, Inui N, Umemura K, Ohashi K, et al. Cyclooxygenase-dependent vasoconstricting factor(s) în remodelled rat femoral arteries. Cardiovascular research. 2008; 79(1):161-8.

233. Lindhardsen J, Gislason GH, Jacobsen S, Ahlehoff O, Olsen AM, Madsen OR, et al. Non-steroidal anti-inflammatory drugs and risk of cardiovascular disease în patients with rheumatoid arthritis: a nationwide cohort study. Annals of the rheumatic diseases. 2013.

234. Visek WJ. Ammonia: its effects on biological systems, metabolic hormones, and reproduction. Journal of dairy science. 1984; 67(3):481-98.

235. Mutch BJ, Banister EW. Ammonia metabolism în exercise and fatigue: a review. Medicine and science în sports and exercise. 1983; 15(1):41-50.

236. Fan P, Lavoie J, Le NL, Szerb JC, Butterworth RF. Neurochemical and electrophysiological studies on the inhibitory effect of ammonium ions on synaptic transmission în slices of rat hippocampus: evidence for a postsynaptic action. Neuroscience. 1990; 37(2):327-34.

237. Szerb JC, Butterworth RF. Effect of ammonium ions on synaptic transmission în the mammalian central nervous system. Progress în neurobiology. 1992; 39(2):135-53.

238. Butterworth RF. Effects of hyperammonaemia on brain function. Journal of inherited metabolic disease. 1998; 21 Suppl 1:6-20.

239. Konopacka A, Fresko I, Piaskowski S, Albrecht J, Zielinska M. Ammonia affects the activity and expression of soluble and particulate GC în cultured rat astrocytes. Neurochemistry international. 2006; 48(6-7):553-8.

240. Schliess F, Gorg B, Fischer R, Desjardins P, Bidmon HJ, Herrmann A, et al. Ammonia induces MK-801-sensitive nitration and phosphorylation of protein tyrosine residues în rat astrocytes. Faseb J. 2002; 16(7):739-41.

241. Kuta CC, Maickel RP, Borowitz JL. Modification of drug action by hyperammonemia. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 1984; 229(1):85-90.

242. Schambelan M, Sebastian A, Katuna BA, Arteaga E. Adrenocortical hormone secretory response to chronic NH4Cl-induced metabolic acidosis. The American journal of physiology. 1987; 252(4 Pt 1):E454-60.

243. Gyorke ZS, Sulyok E, Guignard JP. Ammonium chloride metabolic acidosis and the activity of renin-angiotensin-aldosterone system în children. European journal of pediatrics. 1991; 150(8):547-9.

244. Kisch ES, Dluhy RG, Williams GH. Regulation of renin release by calcium and ammonium ions în normal man. The Journal of clinical endocrinology and metabolism. 1976; 43(6):1343-50.

245. Nagami GT. Ammonia production and secretion by S3 proximal tubule segments from acidotic mice: role of ANG II. American journal of physiology Renal physiology. 2004; 287(4):F707-12.

246. Furtado MR. Effect of NH4Cl on the contractility of isolated vascular smooth muscle. Life sciences. 1987; 41(1):95-102.

247. Feletou M, Harker CT, Komori K, Shepherd JT, Vanhoutte PM. Ammonium ions cause relaxation of isolated canine arteries. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 1989; 251(1):82-9.

248. Tanaka H, Wakabayashi I, Sakamoto K, Kakishita E. Mechanism of the potentiating effect of NH4Cl on vasoconstriction în rat aorta. General pharmacology. 1996; 27(3):535-8.

249. Wakabayashi I, Hatake K, Sakamoto K. Ammonium ion increases the tone of rat portal vein. General pharmacology. 1992; 23(6):1189-92.

250. Toda N, Miyazaki M. Angiotensin-induced relaxation în isolated dog renal and cerebral arteries. The American journal of physiology. 1981; 240(2):H247-54.

251. Israel A, Cierco M, Sosa B. Angiotensin AT(2) receptors mediate vasodepressor response to footshock în rats. Role of kinins, nitric oxide and prostaglandins. European journal of pharmacology. 2000; 394(1):103-8.

252. Katada J, Majima M. AT(2) receptor-dependent vasodilation is mediated by activation of vascular kinin generation under flow conditions. British journal of pharmacology. 2002; 136(4):484-91.

253. Touyz RM, Berry C. Recent advances în angiotensin II signaling. Brazilian journal of medical and biological research = Revista brasileira de pesquisas medicas e biologicas / Sociedade Brasileira de Biofisica [et al]. 2002; 35(9):1001-15.

254. Nouet S, Nahmias C. Signal transduction from the angiotensin II AT2 receptor. Trends în endocrinology and metabolism: TEM. 2000; 11(1):1-6.

255. Tirapelli CR, Fukada SY, de Godoy MA, de Oliveira AM. Analysis of the mechanisms underlying the vasorelaxant action of angiotensin II în the isolated rat carotid. Life sciences. 2006; 78(23):2676-82.

256. Grbovic L, Djokic J, Radenkovic M, Pesic S. Analysis of the vasorelaxant action of angiotensin II în the isolated rat renal artery. Journal of pharmacological sciences. 2008; 106(3):376-84.

257. Connell JM, Davies E. The new biology of aldosterone. J Endocrinol. 2005; 186(1):1-20.

258. Spieker LE, Flammer AJ, Luscher TF. The vascular endothelium în hypertension. Handb Exp Pharmacol. 2006; (176 Pt 2):249-83.

259. Christy C, Hadoke PW, Paterson JM, Mullins JJ, Seckl JR, Walker BR. 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 în mouse aorta: localization and influence on response to glucocorticoids. Hypertension. 2003; 42(4):580-7.

260. Losel R, Schultz A, Boldyreff B, Wehling M. Rapid effects of aldosterone on vascular cells: clinical implications. Steroids. 2004; 69(8-9):575-8.

261. Chai W, Garrelds IM, de Vries R, Batenburg WW, van Kats JP, Danser AH. Nongenomic effects of aldosterone în the human heart: interaction with angiotensin II. Hypertension. 2005; 46(4):701-6.

262. Ciobica A, Bild W, Hritcu L, Haulica I. Brain renin-angiotensin system în cognitive function: pre-clinical findings and implications for prevention and treatment of dementia. Acta Neurol Belg. 2009; 109(3):171-80.

263. Min LJ, Mogi M, Li JM, Iwanami J, Iwai M, Horiuchi M. Aldosterone and angiotensin II synergistically induce mitogenic response în vascular smooth muscle cells. Circ Res. 2005; 97(5):434-42.

264. Hashikabe Y, Suzuki K, Jojima T, Uchida K, Hattori Y. Aldosterone impairs vascular endothelial cell function. J Cardiovasc Pharmacol. 2006; 47(4):609-13.

265. Schmidt BM, Oehmer S, Delles C, Bratke R, Schneider MP, Klingbeil A, et al. Rapid nongenomic effects of aldosterone on human forearm vasculature. Hypertension. 2003; 42(2):156-60.

266. Bild W, Ciobica A, Padurariu M, Bild V. The interdependence of the reactive species of oxygen, nitrogen, and carbon. J Physiol Biochem. 2012.

267. Ciobica A LH, Veronica Nastasa, Manuela Padurariu, Walther Bild. Inhibition of central angiotensin converting enzyme exerts anxiolytic effects by decreasing brain oxidative stress. J Med Biochem. 2011; 30:109-14.

268. Ciobica A VB, Lucian Hritcu, Manuela Padurariu, Walther Bild. Effects of angiotensin II receptor antagonists on anxiety and some oxidative stress markers în rat. . Central European Journal of Medicine. 2011; 6:331-40.

269. Ciobica A BW, Hritcu L, Artenie V, Haulica I. The importance of oxidative stress în angiotensin II-mediated effects on cognitive functions. Neuropeptides 2009; 43:420-1.

270. Millatt LJ, Abdel-Rahman EM, Siragy HM. Angiotensin II and nitric oxide: a question of balance. Regul Pept. 1999; 81(1-3):1-10.

271. Haulica I, Todiras M, Brailoiu E, Baltatu O. Modulatory role of nitric oxide on angiotensins vasoconstriction. Rom J Physiol. 1996; 33(1-4):83-90.

272. Usui M, Egashira K, Kitamoto S, Koyanagi M, Katoh M, Kataoka C, et al. Pathogenic role of oxidative stress în vascular angiotensin-converting enzyme activation în long-term blockade of nitric oxide synthesis în rats. Hypertension. 1999; 34(4 Pt 1):546-51.

273. Kazama K, Anrather J, Zhou P, Girouard H, Frys K, Milner TA, et al. Angiotensin II impairs neurovascular coupling în neocortex through NADPH oxidase-derived radicals. Circ Res. 2004; 95(10):1019-26.

274. Ramires FJ, Mansur A, Coelho O, Maranhao M, Gruppi CJ, Mady C, et al. Effect of spironolactone on ventricular arrhythmias în congestive heart failure secondary to idiopathic dilated or to ischemic cardiomyopathy. Am J Cardiol. 2000; 85(10):1207-11.

275. Zhao W, Ahokas RA, Weber KT, Sun Y. ANG II-induced cardiac molecular and cellular events: role of aldosterone. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2006; 291(1):H336-43.

276. Williams TA, Verhovez A, Milan A, Veglio F, Mulatero P. Protective effect of spironolactone on endothelial cell apoptosis. Endocrinology. 2006; 147(5):2496-505.

277. Kasama S, Toyama T, Kumakura H, Takayama Y, Ichikawa S, Suzuki T, et al. Spironolactone improves cardiac sympathetic nerve activity and symptoms în patients with congestive heart failure. J Nucl Med. 2002; 43(10):1279-85.

278. Pitt B, Remme W, Zannad F, Neaton J, Martinez F, Roniker B, et al. Eplerenone, a selective aldosterone blocker, în patients with left ventricular dysfunction after myocardial infarction. N Engl J Med. 2003; 348(14):1309-21.

279. Michea L, Delpiano AM, Hitschfeld C, Lobos L, Lavandero S, Marusic ET. Eplerenone blocks nongenomic effects of aldosterone on the Na+/H+ exchanger, intracellular Ca2+ levels, and vasoconstriction în mesenteric resistance vessels. Endocrinology. 2005; 146(3):973-80.

280. Yamanari H, Nakamura K, Miura D, Yamanari S, Ohe T. Spironolactone and chlorthalidone în uncontrolled elderly hypertensive patients treated with calcium antagonists and angiotensin II receptor-blocker: effects on endothelial function, inflammation, and oxidative stress. Clin Exp Hypertens. 2009; 31(7):585-94.

281. Bozarov A, Wang YZ, Yu JG, Wunderlich J, Hassanain HH, Alhaj M, et al. Activation of adenosine low-affinity A3 receptors inhibits the enteric short interplexus neural circuit triggered by histamine. American journal of physiology Gastrointestinal and liver physiology. 2009; 297(6):G1147-62.

LISTA DE LUCRĂRI

I Haulică, W. Bild, R. Popescu – New facets of the renin-angiotensin system. Acta Endocrinologica, 2007, Vol. III, No. 2, April-June, p. 225-234, IF 2011: 0,183

Georgios Manolidis, Veronica Nastasă-Bild, Walther Bild, Răducu I. Popescu, Ion Haulică – Cercetări privind rolul calosotomiei în sensibilitatea nociceptivă mecanică. Simpozionul „Gheorghe Marinescu” al Societății Naționale de Neuroștiințe, 2-3 iunie, București. 2007

I. Haulică, W Bild, I. R. Popescu – Interacțiuni între aldosteron și angiotensina II la nivelul musculaturii netede vasculare. A XXII-a Conferință Națională a Societății Române de Științe Fiziologice, „Mecanisme fiziologice integrative de la nivel celular la nivel sistemic”, 1-2 iunie, București. 2007

W Bild, I. Haulică, I. R. Popescu, Oana Rădășanu – Cercetări asupra medierii efectelor vasculare ale angiotensinei II prin intermediul radicalilor liberi. A XXII-a Conferință Națională a Societății Române de Științe Fiziologice, „Mecanisme fiziologice integrative de la nivel celular la nivel sistemic”, 1-2 iunie, București. 2007

Haulică Ion, Bild Walther, Boișteanu Daniela, Rădășanu Oana, Popescu Răducu – Recent data concerning the implications of nitrosative stress in senescence. Gerontology Today, The International Conference on Gerontology, september 15-16, 2006, 251-256

A. Ciobica, W. Bild, R. Popescu, L. Hritcu, I. Haulica, Central angiotensin peptides: pre-clinical findings and possible implications for dementia treatment, Journal of Neurology, 2010, Volume 257, Supplement 1, Page 139

A. Ciobica, L. Hritcu, I. Haulica, R. Popescu, V. Bild, The involvement of oxidative stress in some cognitive effects of angiotensin II and angiotensin 1-7 in rats, European Neuropsychopharmacology, 2010, Volume 20, Supplement 3, Page S287

A. Ciobica, I. Haulica, L. Hritcu, R. Popescu, W. Bild, The involvement of some central angiotensins in cognitive processes and oxidative stress in rats, European Journal of Neurology, 2010, 17 (Suppl. 3), 366

Alin Ciobica, Walther Bild, Lucian Hritcu, Radu Popescu, Ion Haulica, Comparative effects of central angiotensin II and angiotensin 1-7 in modulating cognitive processes and oxidative stress in rats: relevance for dementia, Alzheimer's and Dementia, Volume 6, Issue 4, Supplement 1, July 2010, Page S206

Hogaș MM, Serban IL, Oprișa C, Oleniuc M, Hogaș S, Popescu IR, Hurjui L, Serban DN, Siriopol D, Dimitriu AG. Essential hypertension in children–risk factors and target organ damage. Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi. 2011 Oct-Dec;115(4):1024-9

Ciobica Alin, Popescu Raducu, Haulica Ion, Bild, Walther. Aspects regarding the neurobiology of psycho-affective functions. J Med Biochem 31: 83–87, 2012, IF 2012: 1,084

Ionut Raducu Popescu, Alin Ciobica, Mircea David Gheorghe Pavelescu. New insights into the generation of the angiotensin peptides. Analele Stiintifice ale Universitatii „Alexandru Ioan Cuza”, Sectiunea Genetica si Biologie Moleculara, TOM XIII, 2012

Popescu Raducu I., Bild W., Ciobica A., Bild Veronica. Different modulatory effects of ammonium ions on angiotensin vascular actions in isolated rat aortic and renal arteries. Archives of Biological Sciences 2012 Volume 64, Issue 2, Pages: 427-433, IF 2012: 0,791

Raducu Popescu, Walther Bild, Alin Ciobica, Veronica Bild. New evidence for vascular interactions between aldosterone, angiotensin II and antioxidants in isolated smooth muscle cells of rats. Central European Journal of Medicine, December 2012, Volume 7, Issue 6, pp 704-712, IF 2012: 0,262