. Interactiunea Melatoninei cu Celulele Sistemului Imunitar

Capitolul I Glanda pineală

1.1 Prezentare

1.1.1 Anatomie

Epifiza cerebrală sau glanda pineală este un traductor neuroendocrin care la mamifere face parte din epitalamus, componentă a diencefalului și din structurile circumventriculare. Este o glandă endocraniană nepereche în formă de con de pin situată pe linia mediană deasupra corpilor cvadrigemeni și sub spleniumul corpului calos, cu tija implantată în regiunea posterioară a diencefalului. Ventriculul al 3-lea formează recesul pineal în bifurcația tijei pineale, iar spațiul subarahnoidian formează recesul suprapineal.

Volumul și greutatea pinealei variază funcție de specie, vârstă și stare fiziologică. Volumul său este corelat cu greutatea corporală a speciei. Astfel greutatea medie la șobolanul adult variază de la 0.9 mg (șobolanul Long-Evans) la 1,56 mg (șobolanul Sprague-Dawley) iar la om are o medie de aproximativ 100-150 mg.

1.1.2. Inervația pinealei

La mamifere cea mai importantă inervație a pinealei este cea de la fibrele simpatice post-ganglionare, provenind de la ganglionii cervicali superiori. Pe lângă acest imput mai există și o inervație parasimpatică (comisurală și peptidergică). Inervația simpatică este esențială în producția principalului hormon indolic al pinealei – melatonina (MLT). Glanda pineală poate prezenta chiar ea însăși activitate electrică care are ritmicitate zilnică.

Fig.1 Conexiunile neuronale dintre ochi și glanda pineală la mamifere

La mamifere neurotransmițătorul principal este noradrenalina dar tipurile de receptori adrenergici pineali variază între specii.

Fibrele nervoase aferente de la pineală la creier nu există decât în perioada embrionară. Lumina din mediul înconjurător influențează sinteza melatoninei și a derivaților indolici pe cale nervoasă. Astfel din retină semnalele fotice codificate neural merg prin tractul retino-hipotalamic și prin tractul geniculato-hipotalamic la nucleul suprachiasmatic hipotalamic. De aici, prin nucleul paraventricular și hipotalamusul tuberal, ajung în hipotalamusul lateral. Neuronii acestuia trimit fibre care fac sinapse în coarnele intermediolaterale ale măduvei toracice superioare cu neuronii vegetativi. Neuronii medulari prin fibre preganglionare fac la rândul lor sinapse în ganglionii cervicali superiori. Fibrele postganglionare simpatice ajung în glanda pineală prin nervii conari, dar și printr-un contingent de fibre simpatice ce inervează întâi habenula (7).

Separat de această inervație simpatică a pinealei care reglează biosinteza hormonilor indolici și degenerează la extirparea ganglionilor cervicali superiori, există la mamifere o inervație comisurală pinealopetă, care leagă direct creierul cu pineala și care degenerează după extirparea regiunii habenulare. Fibrele nervoase cerebropineale (7,9) au originea în hipotalamusul paraventricular, în nucleii habenulari, în nucleii comisurii posterioare dar și în corpii geniculați laterali (ex. la șobolan) și au o distribuție regională în organul pineal (11). Fibrele comisurale au și un contingent sărac de fibre simpatice. Putem afirma deci că există o proiecție directă a impulsurilor nervoase optice din corpii geniculați laterali la organul pineal, fără medierea sistemului vegetativ simpatic (7). Lezarea nucleului paraventricular (5) conduce la dispariția bioritmului circadian al melatoninei pineale ceea ce dovedește că nucleii paraventriculari hipotalamici au un rol important în legătura dintre nucleul suprachiasmatic și pineală.

Prin nucleii paraventriculari trec ambele căi nervoase pinealopete, cea medulară simpatică și cea direct comisurală (prin fibrele direct hipotalamo-pineale). In biosinteza hormonilor indolici pineali, fibrele comisurale cerebro-pineale par a interveni prin fibre peptidergice si serotoninergice (1,7,10).

1.2. Melatonina

1.2.1. Sinteza melatoninei

Melatonina este sintetizată și secretată în glanda pineală la toate vertebratele, circulă în sânge și acționează în special la nivelul centrilor neuroendocrini și sistemului nervos central.

Biosinteza melatoninei are loc in pinealocit și este inițiată prin captarea triptofanului din sânge. O parte din cantitatea de triptofan captată în pinealocit este utilizată pentru sinteza derivaților indolici și cealaltă parte pentru sinteza proteică (Fig.2).

Fig.2 Biosinteza melatoninei

Serotonina pineală este precursorul melatoninei, conversia ei în melatonină implicând două etape controlate enzimatic:

– în prima etapă intervine enzima serotonin N-acetiltransferaza (NAT) care transferă o grupă acetil din acetil CoA la o grupă aminică a serotoninei, rezultând N-acetilserotonina. Activitatea NAT fiind strict paralelă cu concentrația melatoninei, ritmul circadian al NAT determină bioritmul melatoninei (4).

– N-acetilserotonina este convertită în melatonină de enzima hidroxi-indol O-metil transferaza (HIOMT), care catalizează transferul grupei metil de la 5-adenozilmetionină la gruparea 5-hidroxi a N-acetilserotoninei. Pteridinele, alți compuși sensibili la lumină, modulează activitatea HIOMT la rozătoare (2).

Sinteza melatoninei la mamifere are loc și în alte țesuturi: retină, glanda Harderian, mucoasa gastro-intestinală și trombocite (38).

1.2.2. Eliberarea melatoninei

Melatonina pare a fi secretată de glanda pineală prin difuzie simplă și nu printr-un mecanism activ, deoarece este solubilă în substanțele membranei celulare lipoproteice. Odată sintetizată în pinealocit, melatonina este eliberată prin exocitoză în sânge (8). În lichidul cefalorahidian ajunge pe o cale incomplet clarificată prin intermediul circulației venoase locale din recesul suprapineal. Circa 60-70% din melatonină din circulația sangvină este legată de albumină restul fiind in stare liberă (aceasta fiind fracțiunea care străbate bariera hematoencefalică).

1.2.3. Metabolizarea melatoninei

Melatonina din circulația sangvină este catabolizată la om la nivelul ficatului (microzomi) în N-acetilserotonină, biologic inactivă și în 6-hidroximelatonină (5,12) care sub formă conjugată de sulfat (75%) și glucuronat (5%) este eliminată în urină. Restul melatoninei se eliberează sub alte trei forme: nativă cca. 1%, ca acid 5-metoxiindolacetic, cca. 0,5% sau catabolizată în gama-acetil N-2-formil-5-metoxikineurenamina și -gama-acetil-5 -metoxikineurenamina la nivelul creierului.

Fig. 4 Metabolizarea melatoninei

1.2.4 Rolul melatoninei

Neurohormonul pineal melatonina sincronizează funcțional organismul cu fotoperioada. Este recunoscut faptul că MLT joacă un rol important imunoreglator. Celulele T helper au receptori membranari pentru MLT cuplați cu proteine G, dar si receptori nucleari pentru MLT. Activarea receptorilor de MLT creste eliberarea celulelor Th1 citokinelor (IFN , IL-2), precum si citokinelor opioide care interactionează incrucișat cu IL-2 si dinorfina B. MLT creste producția de IL-6 de către monocitele umane. Acești mediatori pot contracara imunodeficienta secundară, protejând organismul contra bolilor virale letale si bacteriene, având acțiuni sinergice cu IL-2 la pacienții cu cancer si influențând hematopoeza.

Hematopoeza este aparent influențată de acțiunea opioidelor induse de MLT pe receptorii de opioide kappa prezenți pe suprafața celulelor măduvei osoase stromale. IFN si CSF (colony stimulating factors) pot modula producția MLT in glanda pineală. MLT pare să fie un hormon important imunomodulator care trebuie studiat in viitor pentru identificarea relevantei in bolile cu bază imună, indicațiilor terapeutice si efectelor adverse.

Cele trei componente ale sistemului circadian de organizare temporală sunt: retina, nucleul suprachiasmatic si glanda pineală.

Glanda pineală este un organ endocrin important funcțional care servește ca intermediar intre sistemul endocrin si mediul înconjurător. Ea funcționează ca un traductor neuroendocrin, transformând informația senzorială, in special fotoperioada, intr-un semnal ritmic al celui mai important produs, melatonina (MLT) . Ritmicitatea MLT la mamifere este generată in nucleul suprachiasmatic al hipotalamusului, in timp ce retina si glanda pineală sunt implicate in prevenirea desincronizării ritmului intern. Sistemul retino-pineal funcționează ca un sistem de resetare care sincronizează organismul cu fotoperioada. Semnalul de sincronizare este constituit de indolamina MLT care este sintetizată si eliberată in cursul nopții la toate speciile, pe baza activării adrenoreceptorilor 1 si 1 . MLT reglează fertilitatea la animalele care se înmulțesc sezonal si afectează funcția tuturor celorlalte organe endocrine. Sincronizarea activității endocrine cu mediul înconjurător este de importantă vitală pentru animalele care trăiesc in condiții naturale. Fără semnalul de sincronizare al MLT, animalele nu se mai sincronizează cu mediul, ceea ce devine periculos pentru supraviețuire .

Înainte de 1986, unele studii au susținut ca absenta glandei pineale stimulează proliferarea celulelor imunocompetente , in contrast cu alte studii . In general, multe studii arată că pinealectomia este asociată cu o involuție precoce si o dezorganizare histologică a timusului . In 1981, Maestroni a publicat prima dovadă a posibilei implicări a MLT endogene in răspunsul anticorpilor si celularitatea splinei si timusului la șoarece . Mai târziu, prin intervenții farmacologice variate care au urmărit inhibarea sintezei MLT a confirmat aceasta constatare si a observat că reacția celulelor imune T este de asemenea afectată.

Cercetări care au dus prima oară la ipoteza unui rol al glandei pineale si MLT in imunitate a fost capacitatea antigenelor alogene să manifeste, când sunt injectate la șoareci, modificări endocrinologice in ceea ce privește axa pineală-gonade si pineală-suprarenale. Funcția sistemului imun este de a combate modificările sau amenințările mediului înconjurător. Efectul multor modificări din mediu poate fi general definit ca stress. S-a observat că toți hormonii si neurotransmițătorii influențează răspunsul imun, iar citokinele produse de celulele imunocompetente activate s-a observat că își exercită efectele pe SNC si neuroendocrin . S-a observat că celulele neurogliale sintetizează si eliberează produși imuni , iar celulele imunocompetente au receptori pentru hormonii si neurotransmițătorii semnalului translating specific endocrin .

Este o rețea complexă intre sistemul imun si neuroendocrin care poate fi numită rețea neuroendocrină.

S-a observat ca inhibiția MLT endogene la hamsteri scade greutatea splinei si reduce blastogeneza celulelor T. Administrarea MLT poate contracara aceste efecte .

Producția de IL-2 si ADCC au fost inhibate la șoarecii pianelectomizati ,iar MLT exogenă a refăcut aceste funcții . MLT endogenă influențează concentrația GM-CFU (granulocyte/macrophage colony-forming unity) din măduva osoasă. MLT determină intensificarea atât a răspunsului imun celular, cat si humoral. Efectele MLT in condiții normale nu sunt notabile, decât doar in cazul unor imunodepresii (stress acut, droguri sau tratament cu corticosteroizi, infecții virale sau îmbătrânire).

Wichman si colaboratorii au arătat recent că MLT atenuează depresia imună ce urmează unei traume tisulare sau in caz de soc hemoragic la șoareci

MLT reglează multe funcții imunitare, precum citotoxicitatea celulelor natural-killer (NK), producția de anticorpi, proliferarea limfocitară, producția de -IFN, funcționarea celulelor Th2. Câteva experimente au arătat implicarea indirecta a MLT asupra sistemului imun prin sistemul endogen opioid, care este capabil sa controleze funcția limfocitelor si macrofagelor sau direct asupra funcției măduvei spinării.

Finocchiaro si colaboratorii au arătat ca leucocitele mononucleare din sângele periferic au capacitatea de a metaboliza 5-hidroxitriptamina in melatonină.

Pe lângă controlul asupra sistemului imunitar, MLT are rol antitumoral. Hormonul poate acționa singur sau sinergic cu IL-2 in limfocite. Pinealectomia stim cu IL-2 in limfocite. Pinealectomia stimulează creșterea unor tumori, iar injectarea MLT provoacă scăderea ratei de creștere a tumorii. Pe lângă efectul MLT in limfocite, MLT activează monocitele / macrofagele, inducând in acest tip de celule producerea IL-1 si de intermediari reactivi ai oxigenului si răspunsul macrofagelor la stimularea cu LPS (lipopolysaccharide). Efectele MLT in limfocite si macrofage evidențiază proprietățile antitumorale ale neurohormonului.

Abilitatea MLT de a contracara imunodepresia sau / si a stimula funcția imună se poate explica prin existenta receptorilor specifici de legare la nivelul limfocitelor T helper. Un pas înainte pentru înțelegerea acțiunii circadiene a MLT a fost clonarea familiei de receptori pentru MLT cuplați cu proteinele G. Subtipurile receptorilor pentru MLT sunt: Mel 1a, Mel 1b, Mel 1c, cu domenii Kd intre 20-160pM.

Situsuri cu activitate mare pentru MLT au fost descrise in omogenatele membranare de timus, bursa lui Fabricius si splină la un număr de păsări si mamifere. O serie de studii au stabilit prezenta situsurilor de legare a 2I125 MLT in splina păsărilor si mamiferelor .

Situsuri de legare de pe splenocitele de șobolan sunt localizate mai degrabă la nivel nuclear, decât la nivel membranar si manifestă reversibilitate, afinitate mare, specificitate, sensibilitate la lumină, precum si dependentă de timp si temperatură . Afinitatea situsurilor de legare a 2I125 MLT de pe splenocitele umane corespunde cu legarea la concentrații fiziologice a MLT sangvine. Situsurile de legare a MLT cu afinitate mare s-au găsit si pe celulele limfoide umane . Receptorii membranari de legare a MLT au fost izolați de pe limfocitele circulante si timocite . A fost furnizată dovada prezentei situsurilor de legare cu afinitate mică in granulocitele umane . Activarea celulelor T creste semnificativ legarea MLT. Situsuri de legare a MLT s-au găsit in celulele Th umane, in celulele TCD 8, in celulele TCD 4, dar si in celulele B. Afinitatea acestor situsuri de legare (Kd0,27 nM) sugerează că ele pot recunoaște concentrații fiziologice de MLT in ser.

Se sugerează că limfocitele CD4 pot fi ținte pentru MLT intre limfocitele umane .Receptorii nucleari pentru MLT au fost găsiți in celulele mieloide umane. MLT pare sa fie un ligand natural pentru receptorul orphran RZR/ROR care codifică pentru 5 lipoxigenaza, o enzimă cheie in bolile alergice si inflamatorii. Aceasta genă nu este exprimată in creier si nu este implicată in ritmicitatea circadiană.

Datele care sprijină existenta receptorilor de membrană includ studiul căii transducerii semnalului pentru MLT in limfocite, dar si semnificația fiziologică a situsurilor de legare a MLT in aceste celule. A fost studiată producția cAMP si cGMP in limfocite. MLT indică o creștere a producției cGMP in limfocite intr-un mod dependent de doză. MLT singură nu poate să activeze sau să inhibe producția de cAMP la orice doză studiată. Efectul MLT in reglarea producției cAMP a fost studiat pe splenocitele de șobolan. Rezultatele arată că producția cAMP nu este afectată de MLT in orice condiții experimentale, dar este clar crescută de forskolin, un activator al adenilatciclazei. MLT inhibă parțial producția de cAMP stimulată de forskolin, deși efectul a fost observat la doze farmacologice de MLT.

Situsul central de acțiune al MLT este hipotalamusul. Nucleul suprachiasmatic si eminenta mediană / regiunea pars tuberalis conțin de asemenea situsuri de legare pentru MLT. Situsuri de legare pentru MLT s-au găsit si in talamus, subiculum si aria postrema.

Acțiunea imunofarmacologică a MLT pare sa fie mediată de celule T helper activate care arată o sinteză crescută si / sau eliberare a citokinelor, IL-2, IFN si peptide opioide. Limfocitele T par să fie ținta principală a MLT la șoareci si om la care concentrații fiziologice de MLT stimulează producția IL-2.

Stimularea imună si efectul antistress este neutralizat de opioidul antagonist naltrexona.

Mecanismul de acțiune:

MLT se leagă la receptorii specifici pentru MLT de pe membrana celulelor Th si stimulează producția de IFN , IL-2 si MIO care upreglează răspunsul imun. Mesagerii secunzi nu sunt complet studiați dar includ proteina G si inhibă producerea cAMP.

Efectul imunoterapeutic al MLT împotriva virusului encefalitei sau infecției bacteriene poate fi explicat prin creșterea IFN si /sau IL-2 precum si o creștere a mielopoezei datorită acțiunii hematopoetice a MIO. Un mecanism care implică citokinele Th1 poate fi justificat prin capacitatea MLT de a reface statusul imunodeficitar secundar datorat vârstei, traumei hemoragice sau prin capacitatea de a avea acțiuni sinergice cu IL2 la pacienții cu cancer .

In privința abilității MLT de a contracara involuția timusului si imunodepresia produsă de stress sau tratamentului cu glucocorticoizi, mediatorii majori par sa fie MIO.

Pe baza a numeroase studii care implică opioidele endogene in imunoreglare si a constatării că MLT are proprietăți analgezice si anticonvulsante la șoareci, s-au luat in considerare peptidele opioide ca posibili mediatori in acțiunea imunologică a MLT. S-a observat că antagonistul specific opioid, naltrexona, este capabil sa anuleze imunostimularea si efectul antistress al MLT . S-au mimat efectele imunologice ale MLT prin folosirea peptidelor opioide cunoscute, cum este dinorfina 1-13 si -endorfina . Aceasta sugerează posibilitatea ca MLT să poată stimula celulele imunodependente activate să elibereze peptide opioide. Concentrații fiziologice de MLT pot stimula eliberarea peptidelor opioide prin activarea limfocitelor T helper. Aceste opioide imunoinduse de MLT (MIIO) mediază imunostimularea si efectul antistress al MLT.

Studii recente au arătat că opioidele induse de MLT (MIIO) pot media o interesantă acțiune hematopoetică a MLT. MLT apără organismul (sistemul sangvin) de acțiunea toxică a agenților chimioterapeutici administrați la șoareci ce prezintă tumori. Studiile realizate au arătat implicarea IL-4 in aceasta funcție, iar investigațiile mai complete au relevat faptul că presupusa IL-4 face parte dintr-un grup de opioizi, două polipeptide cu GM de 15 si 67 Kda care sunt recunoscute de anti-IL-4, anti- secvența opioid comună [ (Tyr-Gly-Gly-Phe) si Ac anti-dinorfină.

Celulele Th2 determină eliberarea peptidelor care conțin encefalină; structura moleculară a acestor substanțe previne efectul mediat de receptorii opioizi .Din contră, MIO exprimă la capătul NH2terminal, o secvență comună cu opioizi, care este esențială pentru orice răspuns mediat de receptorii opioizi si acțiunea lor este naltrexon sensibilă, ceea ce indică efectul opioid. Aceste rezultate susțin faptul că MIO poate aparține unei noi clase de citokine T-helper sau unei familii de opioide. MLT creste secreția de IL-2 si INF, dar nu si pe cea de IL-4, fiind posibil ca celulele Th1, mai mult decât Th2, să fie țintă pentru MLT. Ambele citokine, si IL-2 si IFN sunt cunoscute pentru că stimulează activitatea NK si / sau alți parametri imuni.

Intr-un studiu recent se observă că, concentrații fiziologice de MLT pot stimula producerea de IFN de către limfocitele umane activate si că naltrexona contracarează efectele MLT . Aceasta poate sugera că MIIO sunt implicate in efectele MLT in producerea IFN .Aceste studii relevă că IFN este capabil să moduleze atât direct, in pinealocite, cat si indirect, via mecanisme neurale, sinteza MLT in glanda pineală . Aceste studii sugerează existenta conexiunilor fiziologice bidirecționale intre producerea celulelor imunocompetente activate si MLT.

Peptide opioide ale SNC au fost implicate atât in explicarea unor efecte ale MLT sau modulatori ai activității NK . Atât GH cat si PRL au fost raportați a creste activitatea NK si că ar fi influențați de MLT .

In ceea ce privește legarea opioidelor la celulele imunocompetente, rezultatul implică prezenta situsurilor de legare in glanda timică. S-a observat ca membrana timică prezintă situsuri de legare specifice pentru opioide cu afinitate mare, dar si cu afinitate mică .

Cancerul este asociat adesea cu o scădere a secreției de MLT si reactivitate imună . Strategii recente in imunoterapia cancerului sunt centrate in jurul mecanismelor de activare a citotoxicității naturale. Celulele NK si LAK lizează celulele maligne sau infectate viral, in timp ce celulele normale nu sunt afectate .

Interesant este că IL-2 poate potenta activitatea NK si genera celule LAK de la NK . MLT pare să fie un bun candidat pentru combinația cu IL-2 in imunoterapia cancerului. Multe studii dovedesc că glanda pineală si MLT sunt efectori puternic oncostatici.

S-a observat ca DHEA si MLT pot împiedica disfuncția imună, peroxidarea excesivă a lipidelor, scăderea nivelului tisular de vitamina E, induse de infecția retrovirală. Infecția retrovirală inhibă eliberarea celulelor Th1, stimulează secreția citokinelor Th2, creste peroxidarea lipidelor si induce deficienta vitaminei E. Tratamentul cu DHEA si MLT singure administrate, sau împreuna administrate, duce la împiedicarea reducerii proliferării celulelor T si B la fel ca in cazul secreției citokinelor Th1 producătoare de infecție.

Studii recente in biologia tumorală au permis definirea mecanismelor responsabile de proprietățile oncostatice ale MLT .

In prezent, mecanismele antitumorale ale MLT pot fi enumerate:

acțiunea citostatică directă pe unele linii celulare de cancer (cancer de sân si melanom)

inhibarea producerii factorilor de creștere tumorali

diferențierea celulelor canceroase

stimularea răspunsului imun antitumoral al gazdei, constând in special in inhibarea mecanismelor supresive mediate de macrofage si amplificarea activității antitumorale a citokinelor .

In ultimii ani este recunoscut faptul că hormonul pineal MLT poate afecta mecanismele imune atât la șoareci, cat si la om.

MLT :

contracarează efectele imunosupresive induse de stressul acut si / sau tratamentul cu corticosteroizi in producerea anticorpilor si celularitatea timusului.

protejează șoarecii normali sau stressati in infecțiile letale cu virusul encefalitic

salvează sistemul de formare al sângelui de efectele toxice ale compușilor chemoterapeutici ai cancerului

are efecte sinergice cu IL-2 la pacienții cu cancer si inversează defectele imune asociate vârstei .

MLT s-a observat că stimulează ADCC . ADCC este un proces litic care se produce când limfocitele se leagă la celule țintă învelite cu anticorpi specifici prin intermediul receptorilor pentru regiunea Fc a IgG exprimați pe membrana lor.

MLT poate servi ca agent antiinflamator . Activitatea NK si producția IL-2 sunt reduse la șoareci după pinealectomie si stimulate după tratamentul cu MLT .

Sinteza circadiană si eliberarea MLT probabil modulează răspunsul anticorpilor si alterează tumorigeneza .La nivel celular normal, MLT se crede ca afectează procesul antimitotic precum si activitatea citotoxică .La șoareci, sinteza circadiană si eliberarea MLT joacă un rol imunomodulator semnificativ. Când sinteza MLT endogene este blocată, producția anticorpilor este mică; in contrast imunitatea transplantului nu este afectata Eliminarea sintezei de MLT prin pinealectomie scade proliferarea progenitorilor din măduva osoasă pentru granulocite si macrofage (CFU-MG).

MLT stimulează funcția imună mediată de celulele T, in timp ce reduce potențialul mediat de anticorpi, sugerând că schimbă balanța imunologică de la imunitate umorală la celulară .

Efectul in proliferarea celulelor neoplazice depinde de tipul țesutului neoplazic. In general, MLT pare să inhibe proliferarea celulelor neoplazice intr-o manieră dependentă de doză.

Modularea sistemului imunitar de către neuropeptide si de neurohormoni contribuie la susținerea ipotezei existentei unei axe neuroendocrine–imunitare. Câteva encefaline, endorfine si peptide opioide endogene modifică citotoxicitatea celulelor NK, producția de anticorpi si limfokine de către celulele T si B, răspunsul macrofagelor prin IFN la prezenta tumorii in organism. Indolaminele fac parte din circuitul imunoreglator. IFN stimulează producția de serotonină si MLT prin intermediul macrofagelor si limfocitelor, in timp ce indolaminele alterează sinteza IFN. MLT(N-acetil 5 metoxitriptamina) joacă un rol important in sistemul imun, modulând citotoxicitatea NK, răspunsul de proliferare limfocitară fată de mitogeni si producția de IFN. Aceste efecte ale MLT asupra funcțiilor celulare imune pot fi legate de prezenta receptorilor specifici in astfel de celule. Mecanismele implicate in semnalizarea intracelulară sunt încă sub investigație.

MLT poate fi important neuroimunomodulator endogen si un potențial agent imunoterapeutic. Nu este clar dacă MLT acționează pe celulele Th1 si Th2 sau pe ambele tipuri de celule. Nu este clar dacă MLT poate induce expresia genică in cazul citokinelor sau dacă acțiunea este doar posttranslațională . Efectul stimulator al MLT pe IL-2 si IFN si lipsa influentei pe IL-4 sugerează implicarea celulelor Th1 .

Aceleași celule Th pot produce MIIO diferiți de moleculele care conțin encafalină si sunt produse de celulele Th2. Există posibilitatea să distingem două roluri diferite pentru MLT. Primul are loc in condiții acute in timpul infecției virale sau bacteriene care produce o activare substanțială a sistemului imun. MLT endogenă si / sau exogenă poate optimiza răspunsul imun prin susținerea funcției celulelor Th si producerea citokinelor. Al doilea rol mai general, poate fi exercitat la nivel hematopoetic imun printr-o resetare cicadiană cronică a mecanismelor imunologice de menținere a homeostaziei imune.

Capitolul II Citotoxicitatea directa

2.1 Prezentare

Unul din mecanismele prin care organismul elimină celulele self alterate este acțiunea directă a celulelor citotoxice asupra celulelor țintă. Celulele citotoxice recunosc prin receptorii lor modificările care fac celulele țintă indezirabile pentru organism. Acest mecanism poate fi subîmpărțit în două faze succesive: o primă fază de angajare a celulelor citotoxice și o a doua fază, efectoare, de atac asupra celulei țintă.

Angajarea celulelor citotoxice

Există două tipuri principale de celule implicate în acest mecanism efector: celulele natural ucigașe (NK) și celulele T citotoxice. Aceste celule sunt capabile să distrugă celule țintă proprii, tumorale sau infectate viral dar și celule alogene nonself.

Imunitatea nespecifică operează în general cu eficiență limitată, de aceea este în general urmată de imunitatea specifică reprezentată de limfocitele T citotoxice selectate clonal și care proliferează în urma contactului specific cu antigenul. În cursul unei infecții virale tipice celulele NK sunt activate de interferonii și . În consecință se produce un răspuns citotoxic de tip NK în primele trei zile ale infecției care distruge selectiv celulele invadate viral și împiedică propagarea infecției, pentru ca apoi rolul principal de efector citotoxic să fie cedat limfocitelor T. Răspunsul specific mediat de limfocitele T citotoxice necesită 5 până la 8 zile pentru a atinge maximul după care scade ca urmare a eliminării patogenului.

În asemenea infecții cele două principale tipuri celulare citotoxice se succed și se completează reciproc. De altfel celulele NK și limfocitele T citotoxice se influențează reciproc, atât prin contact direct cât și prin intermediul diferitelor citokine. S-a dovedit de asemenea existența unei subpopulații T CD8+ care prezintă aspecte fenotipice caracteristice atât limfocitelor T cât și celulelor NK.

2.2 Celulele NK

Celulele NK reprezintă o subpopulație limfocitară care provine dintr-un precursor medular comun cu limfocitul T si alcătuiesc pe lângă aceste celule si celulele B o a treia populație de tip limfocitar. Celulele mature sunt prezente în sânge si organele limfoide centrale si periferice. Generarea lor din precursorul comun se face în prezenta IL-2 si IL-5 . Celulele NK sun celule mari cu diametrul de 16-20 m si nucleul zimțat. Citoplasma conține granulații mari, înconjurate de membrană care conțin mediatori citotoxici (perforină , granzime TNF). Aceste granulații mari citoplasmatice diferențiază celulele NK de limfocitele B si T si le conferă si denumirea de limfocite mari granulare (LGL).

Markeri imunologici Markerii imunologici prezenți pe suprafața acestor celule sunt: CD65 (N-CAM), receptorul FcRll pentru IgG CD16, markerul CD2 prezent pe suprafața tuturor limfocitelor, CD8, receptori de tip imunoglobulinic (killer inhibitory receptor- KIR) receptori de tip lectinic (CD4 94-NKG2, si molecule de adeziune ICAM-1 (CD54) si LFA-1 (CD11a/CD18).

Funcție Celulele NK prezintă citotoxicitate spontană fată de celulele infectate viral si celulele tumorale. Nu prezintă specificitate antigenică prin absenta unui receptor specific de antigen si nici memorie imunologică. Nu prezintă capacitate fagocitară sau restricție MHC.

Celulele pot fi activate de diferite citokine în principal IL-2 care determină proliferarea si creșterea capacității citotoxice, devenind limfocite kiler activate de citokine(limphokine activate killer cells LAK). În același timp au fost identificate o altă populație de limfocite cu activitate citotoxică specifică tumorilor umane care a fost izolată din tumorile solide, aceste celule au fost denumite limfocite infiltrate tumoral (tumor- infiltrating lymphocyte – TIL) ele având fenotip predominant NK.

Receptorii celulelor NK Celulele NK prezintă pe suprafața lor numeroase structuri macromoleculare cu rol receptor NK-R (natural killer cell receptor). Aceste structuri sunt de două tipuri, unele cu domenii imunoglobulinice si celelalte cu domenii lectinice de tip C.

Celulele NK prezintă o serie de particularități fiziologice, în cadrul celulelor limfocitare care le apropie de imunitatea înnăscută. Limfocitele NK de repaus se găsesc într-o stare preactivă, echipamentul enzimatic de atac este pregătit să intervină în orice moment, nu necesită ca în cazul limfocitelor B si T o diferențiere finală spre stadiul de efector. Absența enzimelor RAG dovedește lipsa unor fenomene de recombinare genetică – caracteristice celorlalte limfocite. Aceste celule nu prezintă memorie imunologică.

Modul de acțiune al celulelor NK

Există mai multe ipoteze care încearcă să explice acțiunea concertată a celor două forme de receptori pentru distrugerea celulelor țintă.

O primă ipoteză susține că receptorii inhibitori recunosc moleculele MHC self în timp ce receptorii activatori detectează structurile MHC mimetice produse de anumite virusuri, cum este virusul citomegalic. Majoritatea adenovirusurilor au dezvoltat o tactica defensivă împotriva recunoașterii de către limfocitul T care constă în inhibarea expresiei moleculelor MHC la suprafața celulelor gazdă. În felul acesta peptidele non-self virale nu sunt detectate de limfocitul T citotoxic (care necesită prezentarea antigenică în asociere cu MHC de clasa l) dar face celula gazdă vulnerabilă la atacul celulei NK, care nu este inhibată de receptorii ei în absența ligandului MHC. Pentru a înlătura acest inconvenient virusul a elaborat o proteină cu structură asemănătoare MHC de clasa l care cuplează 2-microglobulina si mimează structuri MHC self la suprafața celulei gazdă. Aceste molecule mimetice pot cupla receptori activatori ai NK si declanșa activitatea litică a limfocitului.

O altă ipoteză sugerează posibilitatea ca diferite clone de celule NK să prezinte receptori activatori pentru anumite molecule MHC, diferite de moleculele MHC care cuplează receptorii inhibitori ai celulei. Absența selectivă a unei molecule MHC specifică pentru un receptor inhibitor permite activarea celulei NK prin receptorii activatori care recunosc alte molecule MHC ale celulei țintă.

O ultimă ipoteză susține că receptorii activatori si inhibitori ar putea fi răspunzători de procese diferite din cadrul fiziologiei limfocitului NK. Receptorii inhibitori ar putea fi implicați în funcția efectorie citotoxică împiedicând liza celulelor care au la suprafață molecule MHC corespunzătoare calitativ si cantitativ în timp ce receptorii activatori ar putea controla dezvoltarea ontogenetică si proliferarea limfocitelor NK.

2.3 Distrucția celulelor țintă

Faza efectoare a imunității mediate celular constă în atacul asupra celulelor țintă si distrugerea lor. Procesul de distrugere a celulelor țintă este organizat într-o secvență bine orchestrată, pentru a limita amploarea si durata lui la minimum necesar, evitând pe cât posibil distrucția structurilor adiacente sau perpetuarea fenomenului după ce cauza declanșării acestuia a fost eliminată. Acest proces de distrucție se adresează unor agresiuni diverse, infecțioase sau tumorale si unei varietăți largi de tipuri celulare, din această cauza implică câteva mecanisme care acționează redundant pentru a se obține rezultatul final scontat, distrugerea celulei considerată periculoasă. Două mecanisme principale sunt implicate în distrucția celulară: formarea de pori membranari prin perforine si distrucția prin apoptoză.

2.3.1 Perforina

Perforina este sintetizată de limfocitele citotoxice si stocată în granulele citoplasmatice ale acestor celule. Acest mediator citolitic își poartă numele datorită faptului că poate "perfora" membranele țintă prin formarea unor pori transmembranari. Porii formați de perforină distrug integritatea membranei si mediază citoliza celulei țintă prin mecanism osmotic. Practic celula, ciuruită de canalele transmembranare perforinice, se "dezumflă" ca un balon în mediul extracelular.

Structura funcțională a perforinei Molecula de perforină matură este o enzimă constituită dintr-un lanț polipeptidic de 66-70 kDa (534 AA). Glicozilarea posttranslațională variabilă la nivelul celor două situsuri de N-glicozilare produce mici variații ale masei moleculare. Sintetizate în reticulul endoplasmatic rugos, moleculele perforinice sunt preluate de aparatul Golgi unde au loc modificările posttranslaționale si apoi împachetate în granule citoplasmatice lizozom-like. În urma conjugării cu celula țintă, granulele citoplasmatice purtătoare de perforină se reorientează către locul de contact și eliberează conținutul lor în spațiul intercelular.

Monomerii de perforină cuplează și străpung membrana țintă, apoi polimerizează și formează agregate de diferite mărimi. Resturile lipidice de fosforilcolină de pe fața externă a membranei celulei țintă funcționează ca receptori pentru perforină, asigură cuplarea perforinei și penetrarea ei în membrană. Organizarea monomerilor într-un por cu diametru progresiv crescător prin recrutarea de noi monomeri se datorează orientării acestor monomeri, cu aminoacizii hidrofili către interior în timp ce aminoacizii hidrofobi se leagă de catenele laterale ale lipidelor membranare. Formarea unui por funcțional necesită asocierea a minimum 3-4 monomeri de perforină dar numărul acestora poate crește până la 10-20. Monomerii de perforină pătrund în membrană și se supraadaugă progresiv formând un canal funcțional. În final se produce perturbarea permeabilității membranei și liza osmotică a celulei țintă.

Porii formați de perforină sunt asemănători celor formați de complexul de atac membranar al complementului (componentele C5b, C6, C7, C8 și C9). Perforina are o omologie secvențială de aproximativ 20% cu componentele complementului C6-C9, care corespunde unei regiuni de 270 aminoacizi situată în zona centrală a moleculei. Se crede că această moleculă ar fi regiunea funcțională a perforinei cu o conformație amfipatică care asigură orientarea caracteristică și organizarea în pori. Această regiune este probabil responsabilă de similitudinea structurală și funcțională dintre perforină și componentele complementului. Regiunea N-terminală joacă un rol important în interacțiunea cu membrana și/sau polimerizarea moleculelor perforinice, fapt demonstrat de absența aproape totală a activității litice a perforinelor sintetizate prin inginerie genetică cărora le lipsea această regiune.

Funcția litică a perforinei depinde inevitabil de prezența Ca2+. Una din posibilele explicații ar fi aceea că ionul de Ca2+ modifică conformația perforinei. Inițial perforina este o moleculă hidrofilă capabilă să difuzeze în mediul extracelular, ulterior ea își modifică și expune situsurile hidrofobe, necesare cuplării cu lipidele membanare.

2.3.2. Rolul perforinei

Numeroase studii in vitro au demonstrat că perforina din granulele citoplasmatice ale celulelor citotoxice poate liza o varietate extrem de largă de celule țintă. Pe de altă parte perforina s-a dovedit incapabilă să determine în mod direct fragmentarea DNA-ului celulei țintă, evidențiată în citoliza mediată de limfocitele citotoxice, ceea ce sugerează intervenția altor mecanisme citolitice în acest fenomen. Perforina poate acționa în două feluri: ca efector litic direct sau ca o “conductă” pentru alți mediatori ai citolizei.

Prin mecanism direct, perforina produce liza osmotică a celulei țintă. Studiile efectuate pe celule non-citotoxice transfectate cu gena pentru perforină singură poate exercita activitate citolitică și distruge anumite celule țintă.

Perforina singură nu poate induce toate aspectele morfologice și biochimice asociate cu citoliza mediată de limfocitele citotoxice, fiind vorba în special de modificările apoptotice survenite în acest proces. Granzimele, enzimele răspunzătoare de aceste fenomene apoptotice, sunt favorizate în acțiunea lor de prezența porilor perforinici. Perforina acționează în două modalități pentru a ajuta pătrunderea granzimelor în celula țintă. Pe de o parte porii perforinici perturbă homeostazia mediului intracelular, stimulează procesul de reparare celulară și favorizează preluarea prin endocitoză a altor molecule eliberate de limfocitul citotoxic. Pe de altă parte porii perforinici, cu un diametru de până la 20 nm, pot funcționa ca o cale directă de pătrundere în celula țintă a celorlalte molecule litice.

Indiferent de rolul predominant direct sau indirect al perforinei se pune problema dacă această proteină este indispensabilă pentru funcționarea limfocitelor citotoxice. Studiile efectuate au demonstrat că absența perforinei scade drastic clearance-ul unor infecții virale ca și eliminarea anumitor celule tumorale. Mecanismele apoptotice mediate de Fas permit însă citoliza celulelor Fas+. Din această cauză mecanismul citolitic perforindependent și cel Fas-dependent, în aparență redundante, se acoperă doar parțial, perforina intervenind în mod singular asupra celulelor Fas- care nu cuplează FasL (ligandul Fas). În concluzie se poate spune că perforina joacă un rol crucial în majoritatea cazurilor de citoliză mediată de limfocitele citotoxice.

Capitolul III Materiale si metode

3.1. Determinarea viabilității celulelor

3.1.1Lotul investigat

Lot control

Pentru determinările parametrilor de transformare blastică a fost utilizat sânge venos recoltat de la donatori de sânge înregistrați în evidentele Centrului de Hematologie, București si Secția de Hematologie Spitalul Militar Central, București. Lotul control a fost format din 5 donatori.

Lot de pacienți

Lotul cu neoplazii a cuprins 4 pacienți diagnosticați si aflați în stadiul… cu vârsta cuprinsă între 54 si 62 ani aflați înainte de tratamentul specific.

3.1.2 Recoltarea sângelui uman periferic

Materiale

Mediu de cultură IC65 (Institutul Cantacuzino) nesuplimentat

cu bicarbonat

Heparină (Biochimie) 5000 UI/ml

Metoda

Sângele uman a fost recoltat prin puncție venoasă în mediu anticoagulant conținând 200 l mediu de cultură IC65 si 10 UI de heparină pentru fiecare ml de sânge recoltat. Sângele a fost prelucrat la maxim două ore de la recoltare.

3.1.3.Izolarea limfocitelor din sânge uman periferic (centrifugare în gradient de densitate)

Principiul metodei

Prin centrifugare în gradient de densitate, limfocitele din sânge periferic pot fi separate de o serie de alte elemente celulare sanguine (trombocite, monocite, polimorfonucleare, hematii si eventualele celule moarte.) pe baza densității lor.

Pe acest principiu celulele cu densitate mai mică vor rămâne la extremitatea superioară a coloanei de gradient, celelalte tipuri de celule având o densitate mai mare vor străbate mai repede un câmp de gradient de densitate.

Sângele se repartizează în cuve de centrifugă pe un strat de mediu polimer lichid izoton, netoxic pentru celule, cu densitatea relativă 1,077 (figura 1.a). In urma centrifugării la 600g, se obține distribuția spațială de populații celulare sanguine descrisă în figura 1.b.

FIG. 3.1. Izolarea limfocitelor din sânge prin centrifugare în gradient de densitate

a)repartizarea sângelui heparinat pe mediul de separare

b)distribuția spațială a populațiilor celulare sanguine după centrifugare în gradient de densitate.

Faza I: plasmă si trombocite

Faza II: celule mononucleare

Faza III: mediu de separare

Faza IV: granulocite polimorfonucleare si hematii.

Materiale

Sânge uman periferic recoltat pe anticoagulant conform metodei descrise

Mediu de separare a populațiilor celulare sanguine Ficoll – Odiston : 24 de părți Ficoll 400 (Pharmacia Fine Chemicals) 9% în apă distilată + 10 părți Odiston (Întreprinderea de Medicamente București) 34% în apă tridistilată, d = 1,077 la 18oC;

Metoda experimentală [ adaptată după Böyum () ]

Câte 3 ml de sânge venos uman recoltat pe anticoagulant se repartizează în cupe de centrifugă peste 3 ml Ficoll – Odiston;

Centrifugare 20 min la 600g, t = 18oC;

Se decartează fazele II (vezi figura 1.b).

Inelul limfomonocitar recoltat este distribuit în eprubete de centrifugă si se adaugă până la 10 ml mediu IC65 (I. Cantacuzino) pentru a se îndepărta mediul de separare. Eprubetele sunt centrifugate 10 min la 40 C la o turație de 450 g . Operația de spălare se face de 3 x pentru îndepărtarea completă a mediului de separare.

3.1.4 Determinarea concentrației suspensiei celulare si a viabilității celulelor izolate

Principiul metodei

Viabilitatea celulară a fost determinată prin testul excluziei eozinei. Eozina este un colorant vital care difuzează în interiorul celulelor moarte sau a celor care prezintă leziuni ale membranei plasmatice. In consecința, celulele moarte se colorează si pot fi distinse de cele vii prin vizualizare la microscopul optic. Pentru identificarea corectă a celulelor, acestea se tratează cu o soluție diluată de acid acetic, tratament care permite vizualizarea nucleului celular la microscopul optic (mărire de ordinul 300X).

Materiale

Eozină (Merck) : soluție 0,5% în apă distilata;

Acid acetic (Reactivul București) : soluție 10% în apă distilata;

Cameră de numărare a celulelor de tip Burger-Türck cu indicele [concentrație suspensie celulară / celule numărate] de 104.

Metoda experimentală

50l din suspensia celulara obținută conform protocolului descris se amestecă în proporție 1/1 cu soluția de acid acetic. Se omogenizează si se aplică prin capilaritate în camera de numărare Burger-Türck;

Numărarea celulelor la microscopul optic. Se numără celulele aflate în cel puțin 3 arii de numărare si se face media aritmetică

Stabilirea concentrației suspensiei de celule si a purității acesteia Pentru numărarea celulelor la acest tip de cameră se aplică următoarea formulă :

Nr. Celule numărate X 104 Nr. celule / ml.

50l din suspensia celulara obținută conform protocolului descris se amestecă în proporție 1/1 cu soluția de eozină. Se omogenizează si se aplică prin capilaritate în camera de numărare Bürger-Türck. Se stabilește procentul de celule moarte. Nu se consideră celule viabile cele care au incorporat eozină.

Pentru stabilirea procentului de celule vii se aplică următoarea metodă de calcul :

Nr. celule colorate (moarte) + Nr. de celule necolorate (vii) =Nr. de celule citite.

Se aplică regula de trei simplă pentru a afla nr. de celule vii , 100 reprezintă nr. de celule total citite (vii + moarte).

Pentru efectuarea unui experiment corect este necesară o viabilitate de cel puțin 85%.

3.2 Transformare limfoblastică

3.2.1 Principiu

Limfocitele au pe suprafața membranei lor receptori specifici pentru lectine, antigene, limfokine etc. Prin intermediul acestora in vitro (dar si in vivo). Celulele recunosc lectinele sau antigenele de la care primesc semnale ce derepresează nucleul antrenând celula pe linia ciclului celular de diviziune, în cursul căreia are loc sinteza semiconservativă a ADN-ului si mărirea în volum a celulei (transformare blastică). Procesul poate fi evidențiat prin marcarea cu 3H-timidină a ADN-ului nou sintetizat. Încorporare 3H-timidină se cuantifică prin înregistrarea radiațiilor .

3.2.2 Mod de lucru

S-a aplicat metoda (15) modificată (16) conform următorului protocol : sânge venos spălat de 2 ori în mediu IC65 (Inst. Cantacuzino, București) prin centrifugare 10 min la 150g. Sedimentul celular rezultat s-a resuspendat în proporție de 5% în RPMI1640 tamponat cu NaHCO3 0.1M, pH=7.2, suplimentat cu 5% SFV. Sistemele experimentale cu volum final de 1ml conțin 1ml suspensie celulară sanguină 5% si 1,25g/ml; 2,5g/ml; 5g/ml; 10g/ml; 20g/ml , PHA-M (Difco) dar si aceleași concentrații de melatonină. S-au executate experimente în care stimulatorul clasic PHA a fost aplicat concomitent cu PHA +melatonină. Au fost aplicate probe de celule nestimulate (Martor) în triplicat. Probele au fost incubate 48 ore la 37 0 C în atmosferă de 5% CO2 după care au fost marcate cu 1m Ci [3 H]-Td (IFIN, București) cu activitatea specifică de 10 Ci/mmol. Probele au fost incubate încă 18 ore.

Pentru evaluarea [3 H]-Td incorporate, celulele au fost fixate pe filtre Sartorius (fibră de sticlă 13400) si au fost spălate pentru îndepărtarea [3 H]-Td neîncorporate în celule.

Radioactivitatea filtrelor a fost măsurată în lichid de scintilație (PPO 4g, POPOP 50mg / l toluen) la un cititor de radiații .

3.2.3 Prelucrarea rezultatelor

Citirile de radioactivitate au fost exprimate în ppm. Rezultatele experimentale au fost prelucrate statistic ca media aritmetică + abaterea de la medie (X+Sx).

Pentru calcularea indicelui de stimulare IS se folosește următoarea formulă.

3.3 Citotoxicitatea NK

3.3.1 Principiul

Limfocitele umane periferice cu funcție de NK au proprietatea de a liza in vitro linia mieloidă umană K562 marcată în prealabil cu Na2(51 Cr)O4 , proprietate care se cuantifică prin înregistrarea – radioactivității eliberate din țintele lizate.

Linii celulare utilizate în experimentele de citotoxicitate

– K562 (6) linie mieloidă umană utilizată în testele NK (Flow);

Aceste linii celulare utilizate ca ținte în experimentele de citotoxicitate au fost cultivate în RPMI1640 NaHCO3 0.1M pH=7.2 , 5% SFV în atmosferă de 5% CO2 si pasate la două zile înainte de utilizare si cu o zi înainte de a fi introduse în experimentele de citotoxicitate (9). Înainte de utilizare 1×106 celule/ml au fost incubate 45 min la 37 o C în 10 ml Na2 (51 Cr)O4 (1mCi/ml ROTOP, DDR). Celulele spălate de 3 ori în RPMI1640 si resuspendate într-o concentrație de 2.5 x 104 cel./ml sunt utilizate ca ținte în experimentele de citotoxicitate.

3.3.2 Mod de lucru

Metoda (8) constă în cocultivarea celulelor efector obținute cu celulele țintă în rapoarte 10:1 si 100:1. Sistemele experimentale conțin într-un volum final de 0.4ml 2.5 x 104 celule țintă / ml cu 2.5 x 105 /2.5 x 104 celule efector / ml. Pentru favorizarea contactului celular se centrifughează 3 min. la 100g si se incubează 4 ore la 370 C în atmosferă umedă. Concomitent același sistem de lucru au fost utilizate după o incubare prealabilă cu melatonină.

Pe lângă probele de studiat realizate în triplicate se realizează si o serie de probe-control pentru măsurarea radioactivității eliberate spontan din țintele marcate utilizate în citotoxicitate (RS) si a radioactivității totale eliberate din țintele lizate cu 10% Triton X100 (RT).

După incubare din toate probele se extrag 0.2ml supernatant si se citesc la cititorul de radiații . Probelor-control li se citesc atât sedimentele cât si supernatantele.

3.3.3 Prelucrarea rezultatelor

Citirile exprimă pulsuri/min (ppm) si rezultatele sunt prezentate ca procent de eliberare al radioactivității din suspensiile celulare (%ER) :

% ER = (b2 – a2)/ (a3 – a2)

b1= media aritmetică a triplicatelor (ppm) – fond de radioactivitate

b2=b1 x 2

a1= media aritmetică (ppm) a supernatantelor RS – fond de radioactivitate

a2=a1 x 2

a3=media aritmetică (ppm) a sedimentelor RS – fond de radioactivitate+a1

% RS=a2/a3 x 100 (probe-control pentru eliberarea spontană)

% RT=a2/a3 x 100 (probe-control pentru eliberarea totală)

Rezultatele au fost prelucrate statistic calculându-se media aritmetică a experimentelor si abaterea de la valoarea medie (x + Sx).

Capitolul IV Rezultate si discuții

4.1 Stimularea limfoblastică la donatorii sănătoși

Rezultatele testului de transformare blastică efectuate la donatori sănătoși se încadrează în valorile standard obținute în cazurile stimulării cu PHA Fig. Nr.1

Fig. nr.1

În cazul utilizării melatoninei ca modulator efectul stimulator al acesteia deși este prezent est diminuat comparativ cu modulatorul clasic reprezentat de PHA fig. nr.2 si fig. Nr. 3. Trebuie remarcat însă că profilul curbei pentru melatonină se păstrează iar concentrația cu efectul cel mai pregnant este de 10 g/ml

Fig. nr.2

Fig.nr3

În experimentele care au folosit ca modulator tandemul PHA+melatonină nu se remarcă o cumulare a efectului stimulator. Mai degrabă se poate afirma că PHA își păstrează efectul fără a fi influențată de melatonină Fig.nr.4

Fig.nr4

4.2 Stimularea limfoblastică la pacienții cu tumori digestive

În cazul pacienților cu neoplazii gastrice stimularea limfoblastică în care s-a folosit PHA ,apare mult diminuată dar se încadrează în profilul întâlnit la acest tip de patologie,Fig.nr.5.

Fig.5

Stimularea cu melatonină în aceste cazuri nu este semnificativă. Fig. 6. Valorile obținute indică o lipsă de reactivitate la acest tip de modulator comparativ cu stimularea lectinică care si ea este mult diminuată fată de subiecții normali Fig. 7.

Fig.nr.6

Fig.nr.7

Sa încercat o potențare cumulată a efectului de tandem PHA-melatonină . Rezultatele insă indică o preponderentă a efectului dat de PHA tandemul PHA-melatonină indică o creștere nesemnificativă a indicelui de stimulare blastică Fig.8.

Fig.nr.8

4.3 Citotoxicitatea NK modulată cu melatonină la donatorii sănătoși

Al doilea model experimental reprezentat de teste de citotoxicitate nespecifică de tip NK. Pentru evaluarea efectului melatoninei asupra celulelor NK am făcut determinări de determinare a raportului optim de celule efector /celule țintă. Celulele efector au fost obținute de la donatori normali. Procentele de eliberare a izotopului de 51Cr din celulele țintă ne-a făcut să alegem rapoartele E/T extreme, si anume 10:1, si 100:1. Am ales raportul minim de 10:1 din considerente ordin tehnic deși pe grafic apare valoarea 12,5. Fig. 9.

Fig.nr.9

La cele doua rapoarte E/T am făcut determinări de tipul "doză răspuns" pentru melatonină. în fig. 10 si 11. La raportul de 10:1 melatonina are o tendință de stimulare a activității NK, fig. 10, comparativ cu valorile obținute curent în cazul folosiri celulelor nestimulate – valorile normale pentru nestimulate se încadrează între 5,9 si 11 procente de eliberare crom.

Fig.nr.10

Același profil de stimulare a activității citolitice o are melatonina si în experimentele în care rapoartele au fost de 100:1, Fig. 11. Valorile normale obținute în cazurile celulelor nestimulate la acest raport sunt de 30-60% procent eliberare crom. Fig. 11.

Fig.nr.11

În cazul subiecților normali experimentele au constat în evaluarea în paralel a efectului melatoninei fată de celule nestimulate Fig. 12. Valorile obținute pentru raportul E/T 10:1 indică o creștere cu aproximativ 4% mai mare în cazul folosirii melatoninei la concentrația de 5µg/ml, decât la nestimulate. Aceeași tendință se poate observa si la rapoartele de 100:1, valoarea creșterii fiind cu aprox 5% mai mare comparativ cu nestimulatele. Creșterea activității celulelor NK se păstrează si în sistemele de lucru în care s-au folosit concentrații de melatonină de 10 µg/ml . La raportul 10:1 creșterea este cu 5,5% mai mare iar la raportul 100:1cresterea este cu 12,3%.

Fig.nr.12

4.4 Citotoxicitatea NK modulată cu melatonină la pacienții cu tumori digestive

Pentru evaluarea efectului citolitic în cazurile patologice am folosit celule efector provenite de la pacienți cu patologie neoplazică bine determinată neoplasm gastric. Sistemele de lucru au constat în experimente în care celulele efector au fost stimulate cu melatonină. În paralel au fost făcute determinări în care s-au folosit celule nestimulate.

Dacă la celulele provenite de la subiecții normali valorile obținute în urma stimulării cu melatonină au avut un anumit profil, la cele provenite de la lotul cu neoplasm gastric valorile sunt mai mari. În cazul modulării cu melatonină la o concentrație de 5µg/ml creșterile sunt cu 5,1% mai mari la stimulate decât la nestimulate la raportul 10:1 în timp ce la raportul 100:1 stimularea determină o creștere a procentului de eliberare crom cu 33,2%. Fig. 13. La o concentrație ce două ori mai mare de melatonină creșterile procentuale sunt cu 6,8% la raportul 10:1 si cu 43% la raportul 100:1.

Fig.nr.13

4.5 Concluzii

Limfocitele după ce primesc un stimul pentru care au receptori de membrană intră in ciclul de diviziune celulară, proces caracterizat printr-o activitate metabolică complexă si prin modificări morfologice cunoscute sub numele de transformare blastică.

În vederea investigării efectelor melatoninei asupra celulelor sistemului imun, am imaginat două modele de lucru. Modelul transformării blastice a limfocitelor stimulate cu un modulator clasic PHA comparativ cu același sistem de lucru dar în care am folosit melatonina ca modulator. Este știut că PHA determină indici de transformare blastică ridicați Fig. 1. Faptul că si melatonina are un anumit efect stimulator care poate si considerat semnificativ Fig. 2 si fig. 3. Deși în anumite cazuri stimularea cu modulatori în tandem determină o creștere a valorii indicelui de stimulare peste valorile maxime ale celui mai puternic stimulator, în cazul nostru acest fenomen nu apare Fig. 4. Probabil că PHA este un competitor puternic pentru melatonină si legarea de glicoproteinele membranare este în principal cea care determină fenomenul de încorporare a 3H-Td sau dimensiunile moleculei de PHA ecranează receptorii pentru melatonină si nu mai permit acesteia din urmă să aibă acces la ei. Același comportament se poate observa si în cazurile patologice. Deși diminuat din cauza expunerii la Ag răspunsul fată de PHA si melatonină păstrează o anumită proporție în aceste cazuri.

Dacă mecanismele de transformare blastică țintesc o anumită populație de celule în special limfocitele T, mecanismele ce citotoxicitate pot ținti limfocitele Tc(CD8) dar si celulele NK (CD16/56). Datorită faptului că aceste celule (NK) acționează în principal asupra celulelor neoplazice si infectate viral, am încercat studierea efectului melatoninei în testele de citotoxicitate NK.

În acest caz poate fi remarcată o creștere a activității citolitice cu 3-4% la raportul E/T 10:1 si cu 6-26% la raportul E/T 100:1 în urma stimulării cu melatonină. Această creștere depășește valorile normale obținute la celulele nestimulate 6-11%.la raportul de 10:1 si 30-60% la raportul de 100:1.

O creștere si mai mare a citotoxicității NK se poate observa însă în cazurile patologice. Această creștere este de aproximativ 33% în cazul stimulării cu 5g/ml si de aproximativ 42% în cazul stimulării cu 10g/ml.la raportul 100:1.

Deși în literatură este cunoscut efectul de stimulare a celulelor CD4 care produc ulterior IL2 si IFN în sistemele de lucrul imaginate de noi citotoxicitatea este marcantă fără intervenția acestor modulatori. Trebuie deci remarcat că melatonina are un efect direct asupra celulelor NK fără intervenția celulelor CD4 producătoare de IL-2.

În concluzie se poate spune că melatonina are un efect de stimulare a transformării blastice acționând probabil asupra celulelor CD4, sistemele de lucru folosite de noi au un procent de aproximativ 43% celule Th asupra cărora poate acționa melatonina procent mult mai mic comparativ cu adresabilitatea PHA.

BIBLIOGRAFIE

Lane, P. , Traunecker, A., Hubele, S., Inui , S. , Lanzavecchia , A. and Gray, D. (1992) EUR. J. IMMUNOL . 22, 2573 – 2578

Roy, M., Walschmidt, T., Aruffo, A., Ledbetter, A. and Noelle, R. J. (1993) J. IMMUNOL . 151, 2497 – 2510

Razi – Wolf, Z., Freeman, G.J., Galvin, F., Benacerraf, B., Nadler, L. and Reiser, H. (1992) PROC. NATL ACAD. SCI. USA 89, 4210 – 4214

Hathcock, K.S., Laszlo, G., Dickler, H.B., Bradshaw, J., Linsley, P. and Hodes, R.J. (1993) SCIENCE 262, 905 – 907

Springer, T.A. (1990) NATURE 346, 425 – 434

Gimmi, C.D., Freeman , G.J., Gribben, J.G. et al . (1991) PROC. NATL ACAD. SCI. USA 88, 6575 – 6579

Linsley, P.S., Brady, W., Urnes, M., Grosmaire, L.S., Damle, N. K. and Ledbetter, J.A. (1991) J. EXP. MED. 174, 561 – 569

Freeman, G.J., Gray, G.S., Gimmi, C.D. et al .(1991) J. EXP. MED. 174, 625 – 631

Freeman, G.J., Borriello, F., Hodes, R.J . et al. (1993) J. EXP. MED. 2185 – 2192 ,178

Noelle, R. J., Roy, M., Shepherd, D. M., Stamenkovic, I., Ledbetter, J. A. and Aruffo, A. (1992) PROC. NATL ACAD. SCI USA 89, 6550 – 6554

Armitage, R.J., Fanslow, W.C., Strockbine, L. et al . (1992) NATURE 357 ,80 – 82

Castle, B. E., Kishimoto, K., Stearns, C., Brown, M.L. and Kehry, M.R. (1993) J. IMMUNOL . 151, 1777 – 1788

Kaye, J., Hsu, M.L., Sauron, M.E., Jamerson, S.C., Gascoigne, N.R.J. and Hedrick, S.M. (1989) NATURE 341, 746 –749

de Boer, M., Kasran, A., Kwekkeboom, J., Walter, H., Vandenberghe, P. and Ceuppens, J.L. (1993) EUR . J. IMMUNOL . 23, 3120 – 3125

Banchereau, J., Bazan, F., Blanchard, D. et al. (1994) ANNU. REV. IMMUNOL. 12, 881 – 922

Gordon, J., Millsum, M.J., Guy, G.Y. and Ledbetter, J.A. (1988) J. IMMUNOL. 140, 1425 – 1430

Gruber, M.F., Bjorndahl, J.M., Nakamura, S. and Fu, S.M. (1989) J. IMMUNOL. 142, 4144 – 4152

Spriggs, M.K., Armitage, R.J., Strockbine, L. et al. (1992) J. EXP. MED. 176, 1543 – 1550

Hollenbaugh, D., Grossmaire, L.S., Kullas ,C.D. et al. (1992) EMBO. J. 11, 4313 – 4321

Lane, P. Brocker, T., Hubelle, S., Padovan, E., Lanzavecchia, A. and McConnell, F. (1993) J. EXP. MED. 177, 1209 – 1213

Crawford, D.H. and Catovsky, D. (1993) IMMUNOLOGY 80, 40 – 44

Heath, A.W., Chang, R., Harada, N. et al. (1993) CELL. IMMUNOL 152, 468 – 480

Liu ,Y-J, Joshua, D.E., Williams, G.T., Smith, C.A., Gordon, J. and MacLennan ,I.C.M. (1989) NATURE 342, 929 – 931

Clark, E.A. and Shu, G. (1990) J. IMMUNOL . 145, 1400 – 1406

Uckun, F.M., Schieven, G.L., Dibirdik, I., Chandan – Langlie, M., Tuel – Ahlgren, L. and Ledbetter, J.A. (1991) J. BIOL. CHEM. 266, 17478 – 17485

Ren, C.L., Morio, T. ,Fu, S.M. and Geha, R.S. (1994) J. EXP. MED. 179, 673 – 680

Farris, M., Gaskin, F., Parsons, J.T. and Fu, S.M. (1994) J. EXP. MED. 179, 1923 – 1931

Knox, K. A. and Gordon, J. (1993) EUR . J. IMMUNOL. 23, 2578 – 2584

Marshall, L.S., Shepherd, D.M., Ledbetter, J.A., Aruffo, A. and Noelle, R.J. (1994) J. IMMUNOL. 152, 4816 – 4825

Kato, T., Kokuho, T., Tamura, T. and Nariuchi, H. (1994) J. IMMUNOL . 152, 2130 – 2138

Pollok, K.E., O`Brien, V., Marshall, L., Olson, J.W., Noelle, R.J. and Snow, E.C. (1991) J. IMMUNOL. 146, 1633 – 1641

Lalomanach – Girard, A.C., Chiles, T.C., Parker, D.C. and Rothstein, T.L. (1993) J. EXP. MED. 177, 1215 – 1219

DiSanto, J.P., Bonnefoy, J.Y., Gauchat, J.F., Fischer, A. and de Saint Basile, G. (1993) NATURE 361, 541 – 543

Korthäuer, U., Graf, D., Mages, H.W. et al. (1993) NATURE 361, 539 – 541

Allen, R.C., Armitage, R.J., Conley, M.E. et al. (1993) SCIENCE 259, 990 – 993

Aruffo, A., Farrington, M., Hollenbaugh, D. et al. (1993) CELL. 72, 291 – 300

Foy, T.M., Laman, J.D., Ledbetter, J.A., Aruffo, A., Claassen, E. and Noelle, R.J. (1994) J. EXP. MED. 180, 157 – 163

Noelle, R.J., Ledbetter, J.A. and Aruffo, A. (1992) IMMUNOL. TODAY 13, 431 – 433

Durandy, A., Schiff, C., Bonnefoy, J.Y. et al. (1993) EUR. J. IMMUNOL. 23, 2294 – 2299

Maliszewski, C.R., Grabstein, K., Fanslow, W.C., Armitage, R., Spriggs, M.K. and Sato, T.A. (1993) EUR. J. IMMUNOL. 23, 1044 – 1049

Van den Eertwegh, A. J., Noelle, R.J., Roy, M. et al. (1993) J. EXP. MED. 178, 1555 – 1565

Lederman, S., Yellin, M.J., Inghirami, G., Lee. J.J., Knowless, D.M. and Chess, L. (1992) J. IMMUNOL. 149, 3817 – 3826

Yellin, M.J., Sippel, Inghirami, G. et al. (1994) J. IMMUNOL. 152, 598 – 608

Gray, D., Dullforce, P. and Jainandunsing, S. (1994) J. EXP. MED. 180, 141 – 155

Xu, J., Foy, T.M., Laman, J.D. et al. IMMUNITY (in press)

Jenkins, M.K., Pardoll, J., Mizuguchi, J., Chused, T.M. and Schwartz, R.H. (1987) PROC. NATL ACAD. SCI. USA 84, 5409 – 5418

Linsley, P.S. and Ledbetter, J.A. (1993) ANNU. REV. IMMUNOL. 11, 191 – 212

Perlmutter, R.M., Levin, S.B., Appleby, M.W., Anderson, S. J. and Alberola – Illa, J. (1993) ANNU. REV. IMMUNOL. 11, 451 – 499

Charbonneau, H. and Tonks, N.K. (1992) ANNU. REV. CELL . BIOL. 8, 463 – 493

Fischer, E.H., Charbonneau, H and Tonks ,N.K(1991) SCIENCE 253, 401 – 406

Trowbridge, I.S. (1991) J. BIOL. CHEM. 266, 23517 – 23520

Trowbridge, I.S. and Thomas, M.L. (1994) ANNU. REV. IMMUNOL. 12, 85 – 116

Smeland, E.B., Holte, H., Blomhoff, H. K. et al. (1990) SCAND. J. IMMUNOL. 31, 583 – 591

Alsinet, E., Ingles – Esteve, J., Vilella, R. et al. (1990) EUR. J. IMMUNOL. 20, 2801 – 2804

Mittler, R.S. ,Greenfield, R.S., Schacter, B.Z., Richard, N.F. and Hoffman, M.K. (1987) J. IMMUNOL. 138, 3159 – 3166

Deane, D.L., Harvey, E. and Steel, C.M. (1991) CLIN. EXP. IMMUNOL . 83, 175 – 181

Justement, L.B., Wienands, J., Hombach, J., Reth , M. and Cambier, J. C. (1990) J. IMMUNOL. 144, 3272 – 3280

Pingle, J.T. and Thomas, M.L. (1989) CELL 58, 1055 – 1065

Koretzky, G.A., Picus, J. ,Thomas, M.L. and Weiss, A. (1990) NATURE 346 ,66 – 68

Justement, L.B., Campbell, K.S., Chien, N.C. and Cambier, J.C. (1991) SCIENCE

252, 1839 – 1842

61.Moore, M.D., Cooper, N. R., Tack, B.F. and Nemerow (1987) PROC. NATL ACAD. SCI. USA 84, 9194 – 9198

62.Ogimoto, M., Katagin, T., Mashima, K., Hasegawa, Mizuno, K. and Yakura, H. (1994) INT. IMMUNOL. 6, 647 – 654

63.Kim, K-M, Alber, G., Weiser, P. and Reith, M. (1993) IMMUNOL. REV. 132, 125 – 146

64.Kawauchi, K., Lazarus, A.H., Rapoport, M.J., Harwood, A., Cambier J.C. and Delovitch, T.L. (1994) J. IMMUNOL. 152, 3306 – 3315

65.Kishihara, K., Penninger, Wallace et al. (1993) CELL 74,143 – 156

66.Domiati – Saad, Ogle, E.W. and Justement (1993) J. IMMUNOL. 151, 5936 – 5947

67.Hathcock, K.S., Hirano, H., Murakami, S. and Hodes, R.J. (1992) J. IMMUNOL. 149, 2286 – 2294

68.Ogimoto, M., Katigiri, T., Hasegawa, K., Mizuno, K. and Yakura ,H. (1993) CELL. IMMUNOL. 151, 97 – 109

69.Hasegawa, K., Nishimura, H., Ogawa, S., Hirose, S., Sato, H. and Shirai, T. (1990) INT. IMMUNOL. 2, 367 – 375

70.Lane, P. J. L., McConnell, G. M., Schieven, G. L., Clark, E. A. and Ledbetter, J. A. (1990) J. IMMUNOL. 144, 3684 – 3692

71.George, A., Rath, S., Shroff, K. E., Wang, M. and Durdik, J. M. (1994) J. IMMUNOL. 152, 1014 – 1021

72.Morikawa, K., Oseko, F. and Morikawa, S. (1991) INT. J. HEMATOL. 54, 495 – 504

73.Yakura, H., Kawabata, I., Shen, F-W and Katagiri, M. (1986) J. IMMUNOL 136, 2729 – 2733

74.Justement, L.B. (1994) In HANDBOOK OF T AND B LYMPHOCYTES (Snow, E.C., ed.) pp 289 – 316 Academic Press

Lin, J. and Justement, L.B. (1992) J. IMMUNOL 149, 1548 – 1555

Clark, M.R., Campbell, K.S., Kazlaukas, A. et al. (1992) SCIENCE 258, 123 – 126

77.Burkhardt, A.L., Costa, T., Misulovin, Z., Stealy, B., Bolen, J.B. and Nussenzweig, M.C. (1994) MOL. CELL. BIOL. 14, 1095 – 1103

78.Brown, V.K., Ogle, E.W., Burkhardt, A.L., Rowley, R.B., Bolen, J.B. and Justement, L.B. (1994) J. BIOL.CHEM. 269, 17238 – 17244

79.Burkhardt, A.L., Brunswick, M., Bolen, J.B. and Mond, J.J. (1991) PROC. NATL ACAD. SCI. USA 88, 7410 – 7414

80.Gold, M.R and DeFranco (1994) ADV. IMMUNOL. 55, 221 – 295

81. Gold, M.R., Matsuuchi, L., Kelly, R.B. and DeFranco, A.L. (1991) PROC. NATL ACAD. SCI. USA 88, 3436 – 3440

82.Flashwinkel, H. and Reth ,M. (1994) EMBO J. 13, 83 – 89

83.Lin, J., Brown, V. K. and Justement, L. B. (1992) J. IMMUNOL. 149, 3182 – 3190

84.Pleiman, C. M., Abrams, C., Gauen, L. T. et al. (1994) PROC. NATL ACAD. SCI. USA 91, 4268 – 4272

85.Clark, M. R., Johnson, S. A. and Cambier, J. C. (1994) EMBO J. 13, 1911 – 1919

86.Bergman, Mustelin, Oetkin et al. (1992) EMBO J. 11,2919 – 2924

87.Chow, L. M. L., Fournel, M., Davidson, D. and Veillette (1993) NATURE 365, 156 – 160

88.Amrein, K.E., Panholzer, B., Flint, N.A., Bannwarth, W. and Burn, P. (1993) PROC. NATL ACAD. SCI. USA 90, 10285 – 10289

89.Liu,X., Brodeur, Gish et al. (1993) ONCOGENE 8, 1119 – 1126

90.Amrein, K. and Sefton , B.M., (1988) PROC. NATL ACAD. SCI. USA 85, 4247 – 4251

91.Mustelin, T., Coggeshall, K.M. and Altman, A. (1989) PROC. NATL ACAD. SCI. SUA 86, 6302 – 6306

92.Ostergaard, H.L., Shackelford, D.A., Hurley, T.R. et al. (1989) PROC. NATL ACAD. SCI. USA 86, 8959 – 8963

93.Mustelin, T., Pessa – Morikawa, T., Autero, M. et al. (1992) EUR. J. IMMUNOL 22, 1173 – 1178

94.Schraven, Kirchgessner, H., Gaber, B., Samstag, Y. and Meuer, S., (1991) EUR. J. IMMUNOL. 21, 2469 – 2477

95.Koretzky, G.A., Kohmetscher, M. and Ross, S. (1993) J. BIOL. CHEM. 269, 9858 – 8964

96.Autero, M., Saharinen, J., Pessa-Morikawa, T. et al. (1994) MOL. CELL. BIOL. 14, 1308 – 1321

97.Hurley, T.R., Hyman, R, and Sefton, B.M. (1993) MOL. CELL. BOIL. 13, 1651 – 1556

98.McFarland, E.D., Hurley, T.R., Pingel, J.T., Sefton, B.M., Shaw, A and Thomas ,(1993) PROC. NATL ACAD, SCI. USA 90,1402 – 1406

99.Barret, T.B., Shu, Draves, Pezzutto, A. and Clark, E.A. (1990) EUR. J. IMMUNOL. 20, 1053 – 1059

100.Callard, R.E., Rigley, K.P., Smith, S. H. ,Thurstan, S. and Shields J.G. (1992) J. IMMUNOL. 148, 2983 – 2987

101.Carter, R.H. and Fearon, D.T. (1992) SCIENCE 256,105 – 107

102.Moore, M.D., Cooper, N. R., Tack, B.F. and Nemerow (1987) PROC. NATL ACAD. SCI. USA 84, 9194 – 9198

103.Nemerow, G.R., McNaughton, M.E. and Cooper, N.R. (1985) J. IMMUNOL. 135, 3068 – 3073

104.Bohnsack, J.F. and Cooper, N.R. (1988) J. IMMUNOL. 141, 2569 – 2576

105.Carter, R.H., Spycher, M.O., Ng, Y.C., Hoffman, R. and Fearon, D.T., (1988) J. IMMUNOL. 141, 457 – 463

106.Tsokos, G.C., Lambris, J.D., Finkelman, F.D., Anastassiou, E.D. and June, C.H. (1990) J. IMMUNOL. 144, 1640 – 1645

107.Hebell, T., Ahearn, J.M. and Fearon, D.T. (1991) SCIENCE 254, 102 – 105

108.Oren, R., Takahashi, S., Doss, C., Levy, R. and Levy, S. (1990) MOL. CELL. BIOL. 10, 4007 – 4015

109.Wright, M.D.and Tomlinson,M.G. IMMUNOL. TODAY (in press)

110.Schick, M.R. and Levy (1993) J. IMMUNOL. 151, 4090 – 4097

111.Schick, Nguyen, V.Q. and Levy ….J. IMMUNOL. 151 ,1918 – 1925