Interactia Dintre Receptor Si Efector (ligand)

Capitolul I: INTERACȚIA LIGAND – RECEPTOR BIOLOGIC

Ligand. Receptor

Interacția dintre receptor și efector (ligand) este, de cele mai multe ori, factorul dominant în determinarea activității biologice. Activitatea biologică poate fi privită ca o expresie cantitativă a unei mărimi ce poate fi pusă în relație cu răspunsul biologic la administrarea unei substanțe (medicament, insecticid, pesticid etc.).

Terapia medicală depinde de interacțiile chimice și de procesele biologice ale organismului uman. Sistemele din organismul uman comunică cu alte sisteme prin semnale lansate de celule, aceste semnale fiind, de fapt, interacții între substanțele chimice. Exemplele de semnale ale celulelor includ hormoni, neurotransmițători și factori de creștere.

Moleculele constituie unitățile fundamentale în explicarea efectelor biologice ale substanțelor bioactive. Ca urmare, activitatea biologică se poate exprima pe baza interacțiunii moleculelor substanței medicamentoase, denumită efector sau ligand, cu anumite molecule specifice (complecși moleculari sau părți ale lor) care caracterizează substratul activ și care se numesc receptori specifici sau numai receptori.

Receptorul este imaginat ca o structură macromoleculară specializată ce poate fi o enzimă, o proteină, o polinucleotidă și care este parte integrată dintr-o structură moleculară complexă, cum ar fi o membrană celulară (Figura 1.1). Cu ajutorul lui se interceptează semnale sau mesaje venite pe cale nervoasă sau pe cale umorală. O enzimă este un catalizator biochimic format din proteine, constituite la rândul lor din aminoacizi. Acești aminoacizi sunt chirali și, ca urmare, reacțiile în care sunt implicate enzimele constituite din aminoacizi chirali vor produce compuși chirali, dacă structura chimică a substratului implică apariția de enantiomeri.

Fiecare receptor conține un situs activ specific de care se poate lega un substrat specific, denumit ligand (efector). La acest situs activ apare activitatea biologică, ca răspuns celular caracteristic declanșat la interația dintre ligand și receptor.

Figura 1. Receptorul și regiunea situsului activ.

Elementele de recunoaștere ale situsurilor active ale receptorului sunt astfel orientate încât recunoașterea și interacția cu liganzii poate avea loc optim, conducând la un răspuns biologic sau farmacologic evident.

Termenul de receptor a fost introdus încă din anul 1906 de Paul Erlich, dar noțiunea a fost definită mult mai târziu astfel: “orice moleculă biologică la care se leagă un medicament și produce un răspuns măsurabil” (Goodman, 1968) și, respectiv, „proteine care sunt responsabile pentru transducția semnalelor extracelulare în răspunsul intracelular” (Lindupp, 1990).

In momentul actual, receptorii biologici sunt “formațiuni infrastructurale ale celulelor care au proprietatea de a lega mai mult sau mai puțin specific anumite molecule: medicamente, substanțe endogene și toxice”. Acești receptori sunt situați pe membrana celulară sau în interiorul celulei, de aceea medicamentele (liganzii) pot acționa pe suprafața celulelor sau în interiorul acestora (Figura 1.2).

Figura 1.2. Tipuri de receptori biologici.

Efectorul (ligandul, medicamentul) este o moleculă endogenă (moleculă naturală, produsă în mod normal de organism) sau exogenă (agent farmacologic), având un efect biologic prin acțiune specifică asupra unuia sau mai multor receptori. Moleculele endogene sunt cele ce se găsesc în mod obișnuit în celule. Liganzii endogeni sunt selectați din categoria hormonilor, a mediatorilor chimici, a neurotransmițătorilor, a polipeptidelor sau a substraturilor enzimatice. Ei sunt apoi modificați chimic pentru a satisface cerințele biomedicale, în vederea folosirii lor ca medicamente în terapia umană. Liganzii exogeni sunt xenobioticele.

Există două tipuri de liganzi: specifici, cei care leagă doar o anumită specie moleculară (modelul anticorp/antigen; Figura 1.3) și generali, care formează legături cu grupe specifice ale speciei țintă.

Figura 1.3. Principiul specificității: ligandul cu formă triunghiulară este capabil

să se lege de receptor; în schimb ligandul stea nu este capabil.

Un ligand poate fi definit ca o substanță specifică (de obicei, o moleculă mică), care este capabilă de formarea unui complex stabil din punct de vedere termodinamic prin legarea de o biomoleculă. Formarea acestui complex declanșează răspunsul intracelular. Reprezentarea schematică a formării complexului stabil ligand – receptor și a modificării conformaționale ulterioare ale receptorului este dată în Figura 1.4 (a și b).

Cuvântul ligand derivă din cuvântul ligandum care înseamnă legătură.

In funcție de natura chimică, liganzii pot fi liposolubili (străbat stratul lipidic membranar, pătrund în celulă unde se leagă de receptori citoplasmatici sau nucleari) sau hidrosolubili (nu pot străbate membrana, fixându-se pe receptorii membranari).         

Termenul ligand poate fi substituit celui de medicament, deoarece moleculele de medicament acționează în același mod (ca ligand) la nivelul unui receptor. Medicamentele, prin similitudine moleculară sau mimetism molecular, pot înlocui cu succes moleculele endogene recunoscute de către receptor. Intre moleculele endogene și medicamente intervine o competiție pentru ocuparea situsurilor active ale receptorului (agoniști, antagoniști). Acest lucru face ca înmulțirea unei bacterii invadatoare să fie inhibată sau sinteza anumitor molecule să fie stopată.

b)

Figura 1.4. a) Formarea complexului ligand – receptor și

b) Modificare conformațională a unei macromolecule receptoare (hașurat), inclusă în membrană, ca urmare a acționării specifice de către ligand; consecutiv se deschide un canal membranar prin care trec ionii.

Medicamentele sunt clasificate în două grupe:

– medicamente care produc un răspuns fiziologic în organism și

– medicamente care ucid sau inhibă creșterea substanțelor ce pot cauza infecții.

Aspirina, hormonii sintetici și medicamentele active psihologic fac parte din prima grupă de medicamente, iar antibioticele de exemplu sunt medicamente care ucid intrușii străini.

Prin medicament, conform definiției OMS, se înțelege «orice produs utilizat în diagnosticul, tratamentul, atenuarea sau prevenirea unei maladii, a unei stări fizice anormale sau a simptomelor lor, la om sau animal».

In sens restrâns, medicamentul este orice substanță de origine naturală, de sinteză sau semisinteză care administrată unui organism previne, ameliorează, vindecă sau diagnostică o boală sau unele simptome ale ei.

Medicamentul, acționând asupra unui sistem sau organ, nu va schimba caracterul funcțiilor acestuia, ci numai le va amplifica sau diminua, accelerând sau diminuând procesele și fenomenele fiziologice dereglate ale organismului.

Un medicament este format din două părți: farmacofor și spațiator (Figura 1.5). Medicamentul interacționează cu receptorul utilizând numai o anumită parte din structura lui moleculară, parte ce se numește farmacofor (functon). Un farmacofor poate fi definit ca un aranjament în spațiu de atomi sau grupe funcționale (-OH, -NH2 etc.), care este recunoscut de receptor și asigură interacția supramoleculară optimă cu acesta pentru a declanșa sau a bloca răspunsul biologic. Un set de molecule biologic active, care produc activitatea prin același mecanism, se presupune că au același farmacofor. Cu alte cuvinte, farmacoforul reprezintă partea din ligand (medicament) care este recunoscută și poate, prin urmare, interacționa cu receptorul sau cu un situs activ al acestuia.

Spațiatorul sau distanțorul (spacer) este partea din ligand care ține farmacoforul la o distanță adecvată de o altă parte din ligand. Exemple: radicali fenil, ciclohexil, duble legături etc.

Figura 1.5. Părțile componente ale unui medicament.

Caracteristicile unui medicament sunt:

– afinitatea și

– activitatea intrinsecă, care reprezintă capacitatea unui medicament de a produce o modificare conformațională a receptorului esențială în producerea efectului biologic.

Ținând seama de aceste caracteristici, medicamentele se clasifică în agoniști (compuși cu afinitate pentru receptor și activitate intrinsecă) și antagoniști (substanțe exogene ce au acțiune pe un receptor, dar nu au activitate intrinsecă).

Interacția ligandului cu receptorul biologic determină răspunsul celular. Acesta poate apărea ca o reacție primară (recunoașterea ligandului – mesagerul primar

și legarea reversibilă cu mare afinitate și cu o deosebită specificitate între mesager și

receptorii celulari specifici) sau ca o reacție secundară (inducerea unei modificări de conformație chimică a receptorului care trece într-o stare activă).

Răspunsul biologic produs de interacția ligand – receptor depinde de funcționarea normală a locației la care proprietățile moleculare ale medicamentului îi permit acestuia să persiste, să se acumuleze și să se cupleze.

1.2. Mecanismul producerii acțiunii biologice

Teoria receptorilor pleacă de la ideea că: o substanță va deveni activă la nivel celular atunci când la locul acțiunii va fi prezent un anumit partener molecular de interacție. Acest partener de interacție, și anume receptorul R, trebuie să posede calități specifice, astfel încât o anumită substanță (denumită ligand) să poată forma cu el o legătură chimică (al cărei tip nu joacă, de obicei, nici un rol farmacodinamic).

Drept urmare, modificările fizico-chimice ale proprietăților biologice de la locul desfășurării interacției vor constitui o excitație care va declanșa răspunsul biologic.

Procesul de cuplare ligand (medicament) – receptor biologic se realizează, în principiu, în două etape:

► prima, de ordin farmacocinetic: formarea complexului activat ligand – receptor. Reacția este reversibilă și depinde de afinitatea dintre substanța bioactivă și receptorul biologic. Reacția este foarte rapidă (10-9 sec), iar forțele implicate în cuplaj sunt slabe, permițând disocierea cu ușurință a complexului pe măsură ce acesta se formează;

► a doua etapă este de ordin farmacodinamic: apariția efectului medicamentos ca urmarea a formării complexului activat, respectiv în urma modificărilor biofizice, biochimice și fiziologice ale substratului pe care sunt fixați receptorii.

In urma cuplării, au loc modificări de conformație chimică a receptorului, lucru necesar pentru acțiunea medicamentoasă.

Molecula medicamentoasă se poate decupla de pe receptor atunci când energia sa cinetică crește în valoare datorită coliziunilor termice întâmplătoare, ajungând la o valoare la care depășește energia de cuplare.

Noțiunile prezentate sunt esențiale în teoria interacției ligand (medicament) – receptor, interacție care a fost comparată cu principiul cheie – lacăt, dezvoltat de Paul Erlich la începutul secolului XX. In această sens, “cheia” este medicamentul, iar “lacătul” este reprezentat de receptor.

Conform principiului cheie–lacăt, ligandul se acomodează în situsul activ al receptorului biologic. Acomodarea ligandului (farmacoforului) la receptor se numește docking; în acest proces cei 2 parteneri se orientează astfel încât energia de interacție între ei să fie cât mai mare. Prin docare se investighează posibilitățile teoretice de legare ale unui ligand în situsul de legare al receptorului sau ale unei proteine cu alta sau chiar ale unei proteine cu un acid nucleic, prin calculul energiilor intermoleculare.

Interacția dintre ligand și receptor are loc în două etape de recunoaștere moleculară:

– Prima etapă a recunoașterii moleculare a farmacoforului de către receptor constă în acomodarea sterică a ligandului în situsul activ al receptorului. Această acomodare sterică se bazează pe flexibilitatea structurii moleculare a ligandului sau a unei părți din aceasta (denumită farmacofor), prin rotirea unor grupări de atomi în jurul unei legături chimice σ etc.

– Al doilea pas este interacția electrostatică, dacă ligandul și receptorul au o distribuție adecvată a sarcinilor electrice pe atomi. Recunoașterea are loc dacă sarcinile electrice pe ligand (farmacofor) sunt complementare (de semn opus) cu sarcinile electrice ale atomilor din situsul activ al receptorului. Acest stadiu al recunoașterii moleculare are loc dacă ligandul și receptorul sunt situați la mai mult decât 2 raze van der Waals.

Prin interacția substanței bioactive cu receptorul, interacție care duce la formarea unor complecși biologic activi, se stabilesc, în general, legături variate. Formarea lor este favorizată de faptul că moleculele multor substanțe bioactive manifestă flexibilitate, dar și de faptul că molecula receptorului posedă, într-o oarecare măsură, această proprietate. Legăturile mai des întâlnite sunt de natură electrostatică (ion-ion), forțe dipol-ion, forțe dipol-dipol, legături de hidrogen și atracții reciproce prin forțe van der Waals. Legăturile covalente apar mult mai rar. Legăturile covalente sau coordinative sunt formate de către unele medicamente, ca o caracteristică a modului lor specific de acțiune (de exemplu, anticolinesterazicele organofosforice).

Legăturile energice de acest tip sunt stabile și, de multe ori, caracterizează medicamentele care au o durată mare de acțiune.

In afara legăturilor chimice propriu-zise, la formarea complecșilor un rol important îl joacă legăturile de hidrogen, deoarece ele se caracterizează printr-o specificitate avansată, o labilitate cinetică și o energie de legătură mică, parametri care le fac apte pentru formarea acestora. Punțile de hidrogen se realizează între grupări alcoolice, între grupări acide, între o grupare alcoolică și una acidă sau între o grupare alcoolică și o amină sau o amidă. Atracțiile prin forțe van der Waals, deși manifestate pe distanțe mici, prezintă o importanță semnificativă.

Conform teoriei receptorului, o interacțiune substanță bioactivă – receptor depinde de afinitatea chimică între moleculelor substanței și receptorului, precum și de o aranjare cât mai favorabilă – întocmai ca și cheia pentru lacăt (broască) (Emil Fischer) (Figura 1.6). Potrivirea constă atât în mărimea, forma moleculei, natura și poziția grupelor reactive în molecula substanței, cât și în capacitatea ei de reacție, la structura și reactivitatea receptorului.

Figura 1.6. Interacțiunea receptor – ligand în aproximarea modelului cheie-lacăt.

Astfel, în cercetarea medicamentelor, o parte a receptorului este considerată drept lacătul (broasca) în care trebuie să se potrivească substanța activă (cheia) încât să poată deschide/activa sau închide/dezactiva broasca. Un exemplu sugestiv este prezentat în Figura 1.7: legarea vitaminei A (retinolului) de un receptor specific. Lacătul este, de fapt, denumit situs de legare și este în acest caz o cavitate cu caracter hidrofob din interiorul macromoleculei, fiind format din catenele laterale și lanțurile peptidice ale unor aminoacizi cu importanță deosebită pentru legarea retinolului. In cazul de față, situsul de legare este format din mai multe fenilalanine, o tirozină și o metionină, care interacționează cu retinolul, acesta având complementaritate sterică și electrostatică cu situsul de legare. Numai grupa hidroxil este exterioară buzunarului de legare, fiind expusă mediului apos care înconjoară proteina. Teoria cheii în broască (lock and key theory) a lui Fischer continuă să aibă un impact enorm asupra chimiei medicinale.

Gradul de interacțiune substanță medicamentoasă (ligand) – receptor este determinat de concentrația substanței în compartimentul „țintă“ și de afinitatea moleculelor celor doi parteneri. In afara afinității, substanța trebuie să producă schimbări în conformația sau distribuția de sarcini a receptorului, schimbări necesare formării unui anumit stimul. Toate aceste schimbări pot fi cauzate de activitatea intrinsecă.

Figura 1.7. Structura retinolului în situsul de legare

(indicată printr-o săgeată).

Mecanismul producerii acțiunii biologice de către o substanță denumită ligand (L) implică, deci, combinarea moleculelor acestei substanțe cu receptorul (R), intensitatea acțiunii biologice fiind exprimată, de obicei, prin logaritmul inversului concentrației molare (C), concentrație la care se produce un răspuns biologic specificat:

A = log (1/C) = – log C

De remarcat că, în multe situații, se utilizează concentrația C50 (doza toxică), adică acea concentrație molară care produce 50% din activitatea biologică maximă. Activitatea biologică, A, este proporțională cu afinitatea moleculei ligandului L pentru receptor (R), receptor care stă la baza acțiunii biologice specificate.

In afara acestui mecanism specific de acțiune există și un mecanism nespecific, caracteristic anestezicelor, acțiunii toxice a alcoolilor, cetonelor, aldehidelor sau detergenților. Doza toxică pentru aceste substanțe, C50, corespunde de obicei unei concentrații de peste 10-3 M (calculată pentru un volum total de aproximativ 50 l, ce corespunde soluțiilor apoase din organismul uman). Aceste substanțe au, de regulă, un coeficient de partiție octanol/apă destul de mare. In cazul anestezicelor generale, este inhibată capacitatea de excitare și transmitere a influxului nervos în membranele excitabile prin legarea puțin specifică de proteinele implicate în funcționarea unor sinapse. Pentru o clasă mare de anestezice, activitatea biologică A corelează bine coeficientul de partiție octanol/apă, P, cu o variabilă indicator pentru prezența unui atom de hidrogen polar (specific punții de hidrogen).

1.3. Teorii asupra interacției ligand – receptor biologic

Din perspectivă farmacologică, acțiunea unui medicament (ligand) se poate simplifica astfel:

L + R → [L – R] → Răspuns biologic,

în care L – ligand (medicament),

R – receptor,

L – R – complex activat (C*).

Ideal, se dorește înțelegerea și apoi prezicerea tuturor proprietăților și, mai ales, a modului în care un medicament poate cauza un răspuns în orice țesut. Din nefericire sunt mulți factori ce fac acest lucru greu de realizat, ba chiar imposibil. De exemplu, evenimente ce afectează accesul medicamentului la receptor (difuzia limitată la scară macro sau microscopică, metabolismul etc.) pot da rezultate experimentale ce se abat de la teoria enunțată schematic mai sus.

Nu există, deci, o corespondență biunivocă între producerea de stimuli și răspunsul măsurat experimental. Răspunsul cauzat de receptorul activat prin legarea medicamentului poate implica o varietate de mecanisme diferite.

Teoriile privind interacția ligand (medicament) – receptor biologic sunt:

1) Teoria ocupării – se bazează pe ideea că răspunsul produs de un receptor apare numai dacă acesta interacționează cu un ligand adecvat.

2) Teoria vitezei de interacție ligand–receptor – se bazează pe faptul că răspunsul produs de un receptor este direct proporțional cu viteza cinetică a legării sau a dezlegării ligandului de receptor.

3) Modelul operațional este o aproximație semiempirică a teoriei ocupării ce încorporează un factor privind complexul format între ligandul agonist – receptor și răspunsul produs.

Toate aceste teorii sunt interesante, dar nu acoperă 100% faptele experimentale. Dintre ele, foarte utilă este teoria vitezei de interacție ligand – receptor și este considerată astăzi utilă chiar și în descrierea cantitativă a celorlalte teorii.

Cinetica asocierii moleculare. Legea acțiunii maselor

Cinetica reacției dintre ligand și receptor este asemănătoare cu cinetica reacției enzimă – substrat. Interacția este guvernată de legea acțiunii maselor. Ligandul, adică medicamentul, se combină cu receptorul printr-o reacție reversibilă. Complexul creat L-R se scindează și determină apariția unui răspuns biologic. Cinetica reacției este caracterizată prin două mărimi: afinitate și activitate intrinsecă.

Astfel, în cazul interacției ligand (medicament) (L) – receptor (R), cu o populație omogenă de receptori, se poate scrie următoarea reacție chimică:

unde kon semnifică constanta de viteză pentru reacția de asociere, iar koff – pentru reacția de disociere.

Legarea ligandului de receptor apare dacă L și R se ciocnesc, datorită difuziei într-o orientare corectă a acestora și cu energie suficientă (energia de activare).

Viteza de asociere (numărul de evenimente de legare pe unitatea de timp) este exprimată, conform teoriei cineticii chimice, prin relația:

viteza de asociere = kon [L][R].

Odată legătura apărută, ligandul și receptorul rămân împreună un anumit timp sub forma complexului activat. Viteza de disociere, definită ca numărul de evenimente de disociere pe unitatea de timp, este exprimată astfel:

viteza de disociere = koff [L – R].

Probabilitatea de disociere este aceeași în orice moment, deoarece receptorul biologic R “nu știe” cât timp a fost legat de ligand, iar după disociere ligandul și receptorul sunt aceiași ca înainte de legare. Dacă ligandul și receptorul sunt modificați, nu se mai aplică legea acțiunii maselor. Echilibrul este atins dacă cele două viteze de reacție sunt egale:

kon [L][R] = koff [L – R],

iar constanta de disociere este definită astfel:

.

In mod curent se utilizează următoarea expresie:

,

în care KA se numește constantă de asociere a celor două molecule, ligandul și receptorul.

Un termen foarte util în descrierea cantității farmacologice a interacției ligand – receptor este reprezentat de factorul de ocupare parțială FO (Fractional Occupancy):

.

Din relația stabilită anterior pentru constanta de disociere KD (relația 1.12) se obține:

,

iar din expresia care definește cantitatea totală de receptor [R]T = [R] + [L – R] se obține următoarea relație:

.

Din această ultimă relație rezultă:

sau

.

Ultima expresie obținută reprezintă matematic o hiperbolă rectangulară.

Pentru [L] = KD (constanta de disociere KD are dimensiunea unei concentrații), din ultima relație se obține că, procentual, factorul de ocupare parțială FO = 50%.

Egalitatea [L] = KD, pentru care FO = 50%, este valabil numai dacă [R] = [L-R], adică toată concentrația de receptor este implicată și se regăsește în concentrația de complex activat C*.

Deși legea acțiunii maselor este un model simplu, el poate fi utilizat să explice datele experimentale. De notat că acest model nu este util în toate situațiile, deoarece:

– presupune că toți receptorii sunt în mod egal accesibili liganzilor;

– ignoră stările de legare parțială: conform modelului, receptorii sunt fie liberi, fie legați;

– presupune că ligandul nu este alterat de legare;

– presupune că legarea este reversibilă.