Insamantarea Artificiala Prin Metoda Chirurgicala la Catea

CUPRINS

INTRODUCERE

1. MORFOLOGIA APARATULUI GENITAL FEMEL ȘI FIZIOLOGIA CICLULUI SEXUAL

1.1. Morfologia aparatului genital femel

1.2. Fiziologia ciclului sexual la cățea

1.3. Momentul ovulației și hormonii implicați

2. METODE FOLOSITE PENTRU DEPISTAREA OVULAȚIEI

2.1. Frotiu citovaginal

2.2. Determinarea nivelului de progesteron din sânge

3. MATERIALUL SEMINAL

4. CONSIDERAȚII PRACTICE PRIVIND CONSERVAREA MATERIALULUI SEMINAL ȘI REANIMAREA SPERMATOZOIZILOR

4.1. Material seminal refrigerat

4.2. Material seminal congelat

5. MATERIALE ȘI METODE

5.1. Examinarea materialului seminal după decongelare

5.2. Tehnica înseminării artificiale prin metoda chirurgicală

6. REZULTATE ȘI DISCUȚII

7. CONCLUZII ȘI RECOMANDĂRI

BIBLIOGRAFIE

PARTEA I – STADIUL ACTUAL AL CUNOAȘTERII ÎN DOMENIUL TEMEI ABORDATE

ÎNSEMINARE ARTIFICIALĂ PRIN METODA CHIRURGICALĂ LA CĂȚEA

Autor: Ana Mureșan

Coordonator Ștințific: Ioan Ștefan Groza

Îndrumător Științific: Șef lucr. Dr. Raul Alexandru POP

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară, Facultatea de Medicină Veterinară,

Calea Mănăștur nr. 3-5, 400372, Cluj-Napoca, România

[anonimizat]

REZUMAT

Înseminarea artificială prin metoda chirurgicală este o tehnică aplicată cu succes în biothnologia reproducției la cățea, folosind material seminal refrigerat sau congelat, în cazurile în care monta naturală sau înseminarea artificială cu material seminal proaspăt nu pot fi efectuate. Principalele exemple ar fi situația în care femela este la final de perioada reproductivă sau când proba de material seminal este de o calitate mai scăzută din varii motive (vȃrsta înaintată a donatorului, masculi cu fertilitate scazută, recoltări multiple realizarte într-un interval scurt de timp, etc.) însa masculul are o valoare genetică ridicată.

Scopul studiului întreprins în perioada decembrie 2013– iunie 2015, în cadrul Clinicii de Reproducție, Obstetrică și Ginecologie Veterinară a Facultății de Medicină Veterinară Cluj, constă în optimizarea procesului reproductiv prin efectuarea tehnicii de înseminare artificială, metoda chirurgicală, și urmărirea evoluției gestației, fătării și a numărului de produși viabili rezultați în urma acesteia. Cercetările s-au efectuat pe un număr de 6 femele cu vârsta cuprinsă între 2,5 și 7 ani, apartinând unor rase diferite: Saint Bernard, Basset Hound, Cane Corso Italiano și Dog Argentinian.

Conform rezultatelor 50 % din numărul de femele înseminate prin această tehnică au rămas gestante și tot atâtea au dus gestația la un bun sfârșit. Numărul de produși din fiecare cuib a fost în limitele normale sau chiar peste media rasei.

În concluzie această metodă poate fi folosită cu succes atunci când femela este sănătoasă și poate duce gestația la bun sfârșit, iar materialul seminal are o motilitate de până la 40%.

Cuvinte cheie: înseminare artificială, metoda chirurgicală, material seminal.

ARTIFICIAL INSEMINATION IN BITCHES USING THE SURGICAL METHOD

Author: Mureșan Ana Alexandra

Scientific Coordinator: Prof. Dr. Ioan Ștefan Groza

Scientific Advisor: Șef lucr. Dr. Raul Alexandru POP

University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine, Faculty of Veterinary Medicine,

Calea Mănăștur nr. 3-5, 400372, Cluj-Napoca, Romania

[anonimizat]

ABSTRACT

Artificial insemination useing the surgical method in bitches is a technique used with succes in the biotehnology of breeding, using frozen or chilled semen, in the cases that natural breeding or the use of fresh semen is not possible. Examples for this case would be when the female is at the end of her reproductive period or when the semen is of lower quality (old age of the donor male, low fertilizing quality, hy number of semen harvesting, ecc.) but from a high quality male.

The purpouse of this study, wich was done during December 2013 – June 2015, within the Reproduction Clinic, Obstretical and Gynecology departments of the Faculty of Veterinary Medicine Cluj-Napoca consists in optimizing the reproductive proces through the surgical insemination method and in folowing the gestation, whelping and the number of viable puppies that result from this. The study was done on a number of 6 bitches with the age between 2.5 and 7 zears old, from different breeds: Saint Bernard, Basset Hound, Cane Corso Italiano and Dogo Argentino.

The rezults show that 50% of the bithes inseminated by this method were pregnant and whelped puppies. The litter sizes were in range or even bigger that expected for easch of the breeds.

In conclusion this method can be used with succes when the bitch is healthy and can take the gestation onto whelpipng, and when the semen has a mothility of 40% of higher.

Key words: artificial insemination, surgical method, semen.

INTRODUCERE

Specia canină este din punct de vedere al biologiei reproducției o specie diestrică sezonieră (caracterul de sezonalitate se estompează ȋn cazul femelelor crescute în condiții de microclimat controlate), reprezentată prin două cicluri de călduri pe an, fiecare având durata de aproximativ 6 luni (Verstegen et al., 1999). Lucrarea de față are ca scop optimizarea procesului reproductiv, de la călduri la montă sau înseminare și până la fătare, implicit numărul de produși cât mai crescut, dorim o creștere a numărului de monte care au succes. Așadar pentru marii reproducători, masculi cu o mare valoare chinologică sau aflați la o distanță prea mare față de femela care solicită monta, transportul de material seminal refrigerat sau congelat constituie o soluție practică viabilă.

Atunci când înseminarea artificială se realizeaza cu material seminal refrigerat sau congelat este necesar ca inocularea acestuia să se facă intrauterin. Există două metode prin care putem ajunge în această poziție și anume: înseminare artificială transcervicală (TCI) sau înseminare artificială prin metoda chirurgicală. Metoda chirurgicală de însămânțare artificială este preferată atunci când femela este pe final de perioadă reproductivă. În acest studiu am urmărit rezultatele în urma însămânțarii artificiale prin metoda chirurgicală la mai multe cățele pentru care din diverse motive s-a optat pentru această tehnică.

Studiul s-a derulat în perioada decembrie 2013 – iunie 2015 în cadrul clinicii de Reproducție, Obstetrică și Ginecologie Veterinară a Facultății de Medicină Veterinară, Universitații de Ștințe Agricole și Medicină Veterinară Cluj-Napoca, sub îndrumarea cadrului didactic, Șef Lucrări Dr. Alexandru Raul Pop.

Capitolul 1

MORFOLOGIA APARATULUI GENITAL FEMEL ȘI FIZIOLOGIA CICLULUI SEXUAL

În etapa de pubertate, femelele manifestă primul cliclu de călduri, la majoritatea această etapă poate să înceapă la o vârstă cuprinsă între 10 și 12 luni, dar aceasta poate varia considerabil în funcție de rasă, fiind direct proporțională cu talia: la rasele mici ciclul de călduri poate să se manifeste începand cu o vârstă fragedă, ca vârsta de 4 luni, rasele de talie mare putând să manifeste mai târziu până la varsta de 24 de luni (vârsta medie la cățele fiind cuprinsă între 6 și 14 luni) (Dan Rice, 2008).

Morfologia aparatului genital femel

Aparatul genital femel este format din două tipuri de organe: esențiale (ovare) și căi conducătoare (oviducte, uter, vagin și vulva); acestea îndeplinesc împreună funcția de reproducere.

Ovarele. Ovarele sunt dispuse la nivelul vertebrelor lombare L3-L4, ovarul stâng fiind situat mai anterior față de cel drept, retrorenal, având o formă elipsoidală, ușor alungit de culoare gri-roșiatică, îmbrăcat în bursa ovariană și țesut adipos. Volumul ovarului variază în funcție de stadiile și fazele ciclului sexual și de starea de întreținere a femelei. În estrus ovarul își dublează volumul față de metrestus, iar în diestrus o mare parte este reprezentat de corpii galbeni. Ovarele sunt suspendate în cavitatea abdominală de către peritoneu prin mezoovarul care este plasat anterior de ligamentele largi și cuprinde în grosimea lui artera și vena ovariană și filete nervoase.

Uterul. Uterul are forma literei V cu coarne lungi rectilinii de aproximativ 15 cm, el găsindu-se în totalitate în cavitatea abdominală. Corpul uterin are un aspect cilindroid, turtit ușor dorso-ventral, iar pe fețele lui laterale se inseră ligamentele largi. Uterul are în structura sa patru straturi: perimetriu (tunica seroasă), parametriu (țesut conjunctiv subseros), miometrium (tunica musculoasă), endometrium (tunica mucoasă). În gestație uterul își mărește volumul de aproximativ 100 de ori, datorită capacității de hipertrofiere a celulor musculare.

Cervixul. Cervixul nu are floare involtă.

Vaginul. Vaginul este un conduct musculo-membranos care se întinde de la uter la vulvă și formează organul copulator femel. Este limitat cranial de gâtul uterin iar caudal de plica himenală care îl separă de vestibulul vaginal. Are o lungime de 10-15 cm prezintă pliuri longitudinale și are aceeași structură ca cea a uterului.

Vulva. Vulva reprezintă partea externă a organului genital femel și este așezată sub anus. Buzele vulvei au aspect cărnos și prezintă o comisură superioară rotunjită și una inferioară ascuțită, terminandu-se printr-un apendice triunghiular. Corpul clitorisului este bine de dezvoltat iar mucoasa formează o fosă în care se evidențiază organul erectil.

Fiziologia ciclului sexual la cățea

Cățeaua este un animal cu ciclu diestric, cu o durată medie a ciclului sexual de 6 luni. În general căldurile apar toamna și primăvara (Groza Ioan, Muntean M, 2002). Ciclul sexual se împarte în mai multe faze după cum urmează:

Proestru: durează timp de 8-10 zile (perioadă în care apar scurgeri sangvinolente); în proestrul târziu avem peak-ul de estrogen;

Estru: timp de 8-10 zile (ovulatia are loc începȃnd cu ziua a doua); începe in ziua cand se produce prima descărcare de LH, și este marcată de creșterea progesteronului și scăderea 17β-estradiolului plasmatic;

Diestru: avȃnd o durată de 20 pȃnă la 90 zile; nivelul de progesteron este în creștere și la examenul citologic cornificarea celulelor este în scădere. Diestrul durează fie până cățeaua fată, fie până nivelul de progesteron revine la normal.

Anestru: ȋntre 15-150 de zile.

Ovulația are loc la sfrârsitul căldurilor (estrului), foliculii maturându-se succesiv, fiind în număr de 4-6 la femelele de talie mică și până la 15-20 la cele de talie mare. Primul estru apare în mod obisnuit la vârsta de 6 luni, după ce cațeaua se apropie de greutatea corporală a adultului.

Momentul ovulației și hormonii implicați

Ovulația se urmărește prin diferite metode, majoritatea fiind legate de nivelul unor hormoni direct responsabili de fazele ciclului sexual, cum ar fi dozarea progesteronului, estrogenilor, urmărirea nivelelor de LH si FSH; sau întocmirea unui frotiu vaginal și prin tehnici de citologie, estimarea perioadei în care se află cățeaua.

Estrogenul este primul hormon de referință al ciclului estral, o creștere a nivelului de estrogen este vizualizat clinic prin primele semne de călduri. Vaginul și vulva prezintă tumefiere, se observă scurgeri sangvinolente. Sub efectul estrogenului, peretele vaginal se îngroașă și se exfoliază, de aici provenind și primele modificări pe care le putem vedea la examenul citologic. Nivelul său crește în proestrul timpuriu, ajunge la un peak și apoi scade, producând modificări tipice și în comportamentul femelei (Scarlette Gotwals).

LH-ul (Lueteinizing Hormone) este hormonul central al cilului estral. Creșterea sa este stimulată de nivelul crescut de etrogen, care persistă o perioada variabilă, și are ca și rezultat, la 2 zile, post-surge, ovulația. Ovulele însă nu sunt mature și capabile de a fi fertilizate numai la trecerea a încă 2 zile de la creștrea de LH, si apoi ele mai trăiesc încă 1 până la 3 zile. Asadar, notând ziua cu cresterea de LH ca fiind ziua 0, femela este în perioada fertilă în zilele 4, 5 și 6. Pentru a depista acest peak al LH-ului sunt necesare teste sangvine zilnice (Scarlette Gotwals).

Creșterea progesteronului provoacă schimbarea secreției celulelor foliculare de la estrogen la progesteron (Scarlette Gotwals).

Progesteronul este hormonul necesar întreținerii gestației. La câini nivelul de progesteron îsi atinge limita inferioară (<1,0 ng/ml) înaintea peak-ului de LH. Urmărind creșterea de LH și nivelul de progesteron din sange v-a creste, până la o valoare de aproximativ 1,5-2 ng/ml. După peak-ul de LH, progesteronul își continuă cresterea până la un nivel > 5 ng/ml în zilele 2 până la 4 și în continuare la o valoare > 10-15 ng/ml la sfârsitul perioadei fertile (Scarlette Gotwals).

Creșterea inițială de progesteron se leagă strâns de peak-ul de LH și astfel o putem folosi, în practică, pentru a planifica perioada fertilă a femelei. (fig. 1.1)

Fig. 1.1 – Evoluția hormonilor pe parcursul unui ciclu

(Sursa: http://www.peteducation.com/images/articles/ill_breeding1.gif)

Capitolul 2

METODE FOLOSITE PENTRU DEPISTAREA OVULAȚIEI

Frotiu citovaginal

Întocmirea unui frotiu vaginal este în general prima variantă folosită pentru a depista perioada ciclului estral în care se află cățeaua și chiar pentru stabilirea momentului optim pentru montă. Schimbările citologice reflectă în totalitate schimbările endocrine care au loc în organismul femelei, în principal concentrația de estrogen din sânge (fig. 2.1). Nivelul crescut de estrogen determină o cornificare a celulelor caracteristică estrului (Robert Bowen, 1998).

Fig. 2.1 Relația dintre peak-ul de estrogen și cel de LH

(Sursa: http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/pathphys/reprod/vc/cycle.gif)

Pentru a identifica diferitele stadii este de cele mai multe ori suficientă examinarea unei singure lame, însă există unele situații, de exemplu pentru a diferenția diestrul de proestru, unde sunt necesare mai multe amprente.

Tamponul trebuie introdus adânc în vagin pentru a evita colectarea de celule din vestibulul vaginal, formand un unghi ascuțit față de peretele dorsal al cavității. La rasele de talie mare, ex. Ciobănesc German, Ciobănesti Românesti, Saint Bernard, etc, se introduce pâna la 15 cm iar la cele de talie mică undeva în jur de 5 cm (Robert Bowen, 1998). După ce tamponul este introdus complet este necesară rotirea sa de 2-3 ori pentru a colecta cantitatea dorită de celule. (fig. 2.2)

Fig. 2.2 Recoltarea celulelor cu ajutorul tamponului steril

(Sursă: http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/pathphys/reprod/vc/swab.jpg)

Amprenta se prepară imediat după recoltare prin rularea tamponului (fig.2.3) pe o lamă curată și uscată prin efectuarea coloratiei Diff-Quick (fig 2.4.a și 2.4.b) și nu numai.

Fig 2.3. Rularea tamponului pentru creerea amprentei frotiului

(Sursă: http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/pathphys/reprod/vc/rolling.jpg)

Fig. 2.4.a Coloranții Diff-Quick

(Sursă:http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/pathphys/reprod/vc/stains.jpg)

Fig. 2.4.b Lamă cu amprentă colorată pregatită pentru examinare

(Sursă: http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/pathphys/reprod/vc/stained.jpg)

Majoritatea celulelor depistate printr-un frotiu sunt celule epiteliale vaginale. Mai găsim pe lângă acestea un număr variabil de leucocite, eritrocite, bacterii, și un număr mic compus din alte celule și microorganisme contaminante. Citirea unui frotiu înseamnă clasificarea celulelor epiteliale în unul dintre cele 3 tipuri fundamentale: celule parabazale, intermediare sau superficiale.

Celulele parabazale (fig. 2.5) sunt cele mai mici ca și dimensiune de pe frotiu, rotunde sau aproape rotunde și au un raport citoplasmă/nucleu mare. Ele predomină în diestru, anestru și la începutul proestrului, dar lipsesc în estru (Robert Bowen, 1998).

Fig.2.5 Celule parabazale

(Sursă: http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/pathphys/reprod/vc/pbasals.jpg)

Celulele intermediare (fig.2.6) pot varia ca și formă și mărime, dar în mod normal sunt de 2-3 ori mai mari decât celulele parabazale și apar în toate stadiile ciclului, exceptând estrul. Raportul citoplasmă/nucleu este în favoarea citoplasmei.

Fig.2.6 Celule intermediare

(Sursă: http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/pathphys/reprod/vc/intermed.jpg)

Celulele superficiale (fig. 2.7) sunt mari, au formă poligonală cu nucleul absent sau picnotic. Celulele fără nucleu sunt considerate complet cornificate și nu se întâlnesc în anestrus și proestru, ele fiind o caracteristică citologică a estrului (Robert Bowen, 1998).

Fig. 2.7 Celule superficiale

(Sursă: http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/pathphys/reprod/vc/superx2.jpg)

Depistarea ovulației cu ajutorul frotiului se bazează pe corectitudinea cu care se execută recoltarea și colorarea frotiului și mai apoi pe citirea imaginii care apare în timpul examinării la microscop.

Determinarea nivelului de progesteron din sânge

Determinarea nivelului de progesteron din ser este tehnica cea mai sigură pentru stabilirea perioadei fertile, și stabilirea exactă a momentului oportun pentru montă. Determinările se pot face în cadrul unui laborator specializat sau cu diferite kit-uri de dozare: Stat-Pro (ICG/Synbiotics), Target (Biometallics), PreMate (Camelot Farms), etc. Aceste kit-uri sunt folosite pentru a determina rapid perioada în care se află femela și funcționează bine pentru montele care decurg normal. Pentru montele în care se folosește spermă refrigerată sau congelată, femele cu probleme anterioare de infertilitate sau monte cu masculi cu număr redus de sermatozoizi, determinarea cantitativă a progesteronului este recomandată (Scarlette Gotwals).

Nivelul progesteronului înainte de peak-ul de LH este în limitele normale, crește apoi la 1,5-2 ng/ml la începutul peak-ului, apoi până >5 ng/ml în timpul acestuia și ajunge până la valori de >10-15 ng/ml la sfârșitul perioadei fertile. Momentul peak-ului de LH poate fi estimat în funcție de creșterea nivelului de progesteron, acestea fiind strâns corelate (Scarlette Gotwals) (fig. 2.10).

Fig. 2.10 Modificările progesteronului și LH-ului din timpul unui ciclu estral

(Sursă: http://www.atozvetsupply.com/v/vspfile s/assets/images/target 1.bmp)

Detectarea momentului optim pentru montă este crucial mai ales din punctul de vedere al crescătorilor, deoarece cățelele au un ciclu mono-estru, intervalul dintre călduri fiind de 6-7 luni.

Tabelul 2.1. ilustrează ciclul estral în zile, nivelul hormonilor, momentul optim pentru diferite tipuri de montă/înseminare și cum se poate estima data probabilei fătări, venind în ajutorul practicienilor.

Tabel 2.1. Corelații între concentrațiile plasmatice ale hormonilor gonadotropi hipofizari și steroidieni, momentul optim al înseminarii artificiale și durata gestației

(Sursa: http://www.peteducation.com/article.cfm?c=2+2109&aid=3201)

Capitolul 3

MATERIALUL SEMINAL

3.1. Caracteristicile materialului seminal

După locul de depunere al materialului seminal, înseminarea artificială se clasifică astfel: înseminare intra-vaginală profundă (A/I), înseminare transcervicală (TCI) sau implant intrauterin (metoda chirurgicală) (William C. Truesdale, July 2011).

Materialul seminal este format din trei fracțiuni: prima este un lichid clar denumit fracțiune pre-spermatică (care de obicei este înlăturată, cu un volum între 0,5-2 ml); a doua parte este fracțiunea spermatică, cu densitate crescută, lăptoasă (aceasta este partea de interes și care dorim să o colectăm), iar spre final obținem ultima fracțiune, prostatică, un lichid clar, de care nu avem nevoie (Valeria Rickard, 2011).

Evaluarea este o etapă foarte importantă și se realizează prin etalarea unei picături de material seminal pe o lamă curată, uscată și preîncălzită care va fi examinată la microscop. Se urmarește motilitatea, morfologia spermatozoizilor, concentrația materialului seminal recoltat și alte caracteristici după cum urmează (Rober Bowen, 2003):

Tabel 3.1 Valori pentru principalele caracteristici ale materialului seminal

(Sursa: http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/pathphys/reprod/semeneval/dog.html)

Culoarea normală este opacă, alb-lăptoasă; dacă ejaculatul este roșu sau maro aceasta indică prezența de sânge, culoarea galbenă se datorează urinei și cea verde unei infecții;

Volumul (în ml de ejaculat) poate varia considerabil în funcție de vârstă, rasă și libidoul masculului de la 1 ml la 20 ml;

pH-ul se masoară numai la fracțiunea prostatică și trebuie să fie între 6,5 și 7,0, devieri de la aceste valori pot indica inflamații sau infecții;

Mobilitatea masoară procentajul total de spermatozoizi care sunt vii și se mișcă; ea trebuie să fie > 70%;

Morfologia celulelor spermatice este dificil de observant fara un microscop performant, o colorație adecvată și puțină experiență. Colorația Diff-Quick poate fi folosită și în acest caz cu succes. Se consideră normal când > 80% din spermatozoizi sunt corecți structural;

Numărul spermatozoizilor poate fi determinat cu dificultate, însă se poate folosi un hemocitometru pentru ușurarea procedeului (William C. Truesdale, July 2011)

Fig. 3.1. Spetmatozoid normal

(Sursă: Neagu Vasile Radu, 2011)

3.2. Considerații practice privind conservarea materialului seminal și reanimarea spermatozoizilor

3.2.1. Material seminal refrigerat

Materialul seminal recoltat este răcit până la 4°C și trimis imediat pentru a fi folosit. Pentru aceasta femela trebuie să se afle în momentul optim pentru montă, să fie aproape de ovulație.

Tehnica de conservare prin refrigerare este folosită mai ales pentru transportul pe distanțe mici (ex. în interiorul Europei) deoarece este mult mai ușoră și mai ieftină decât cea prin congelare. Pentru a răci o doză de lichid seminal, fracțiunea spermatică poate fi diluată într-o proporție de 1:3 sau 1:4 (1 ml de lichid seminal la fiecare 3-4 ml de diluant) apoi doza este pusă într-un bol cu apă la 37°C și răcită încet în frigider până la 4-5°C, unde poate fi păstrată până la 10 zile, în funcție de diluantul folosit (Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift, 2011). Unii diluanți mentin capacitatea fecundantă a celulei spermatice (in condiții de refrigerare 0-5 ºC) până la 27 de zile, cu condiția ca ei să fie reîmprospătați o data la 10 zile (Iguer-ouada M., Verstegen J.P. ,2001). Materialul refrigerat poate fi transportat într-o ladă frigorifică specială sau o cutie de polistiren cu inserții pentru gheata si separate de materialul seminal. (fig. 4.1)

Fig. 4.1 – Canine Express® Cooled Semen & Genetic Preservation Transport System

(Sursă: http://www.enasco.com/prod/images/products/C9/AC136827l.jpg)

Odată ajuns materialul seminal la destinație este foarte important de analizat starea și calitatea în care acesta se află, pentru a fi siguri că transportul a avut succes iar spermatozoizii sunt încă viabili. El poate fi folosit atât la 4°C cât și încălzit până la 37°C (Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift, 2011). Acesta se pretează pentru însămânțare intra-vaginală, cu o rată de success de până la 80% când motilitatea este >70%. Însămânțarea pe cale chirurgicală v-a ridica procentul de reusită invers proportional cu calitatea materialului seminal: adică la un material excelent, cu calitate de 80%, creșterea este nesemnificativă; la unul cu calitate bună (60-70%) este puțin mărită, iar la unul slab-marginal (40-50%), aceasta ar putea face diferența intre reușită și eșec (Scarlette Gotwals).

3.2.2. Material seminal congelat

În cele mai multe cazuri sperma este colectată manual și fracțiunea spermatică este folosită pentru congelare. Pașii cei mai importanți din această tehnică sunt: centrifugarea, diluția, echilibrarea termică, ambalarea, congelarea și decongelarea.

Centrifugarea are ca scop îndepărtarea fracțiunii prostatice care s-a dovedit că are un efect negativ asupra motilității și viabilității spermatozoizilor trecuți prin congelare-decongelare (England, G.C.W., Allen, W.E. (1992); Rota, A., Ström, B., Linde-Forsberg, C. (1995); Sirivaidyapong, S., Ursem, P., Bevers, M.M., Colenbrander, B. (2001) și de a standardiza cu ajutorul diluției concentrația finală a materialului seminal în spermatozoizi (Linde-Forsberg, C. (2005). Cel mai utilizat protocol de centrifugare este la 600-700 rotații/ minut timp de 5-10 minute (Igna, V, 2007).

Diluarea spermei are urmatoarele roluri: protejarea spermatozoizilor de efectele negative ale temperaturilor scăzute și obținerea unei concentrații finale standard. În majoritatea sistemelor materialul seminal final ajunge la o diluție de 50-100 milioane de spermatizoizi pe 0,5 ml de paietă, când folosim 2-4 paiete pentru o însămânțare (Igna, V. , 2007).

Pregatirea spermei pentru congelare include ambalarea și divizarea care permit depozitarea materialului în doze ușor identificabile: paiete, palete, tuburi. Curent, cea mai comună formă de ambalare a materialului seminal congelat pentru câini sunt paietele, deoarece ele prezină câteva avantaje în plus față de celălalte metode: volum redus (crește capacitatea de stocare), congelare uniform, posibilitatea de identificare și marcare ușoară (numele câinelui, data colectării, etc.) (Igna, V. (2007). Înaintea congelării, materialul este răcit până la 4°C și păstrat la această temperatură un anumit interval de timp (1-4 ore) în funcție de protocolul utilizat. Acest proces dă posibilitatea spermei să dezvolte o rezistența la șocul termic care vine odată cu congelarea. Congelarea în sine poate fi realizată cu ajutorul unor congelatoare programabile sau prin punerea paietelor la distanțe diferite deasupra vaporilor de azot lichid. Ultimul stadiu al congelării este introducerea direct în azot lichid la -196 °C (fig.4.3), (Igna, V. (2007).

Rata de decongelare poate influența semnificativ rezultatele și este strâns corelată cu protocolul de congelare folosit. O decongelare înceată poate duce la recristalizare, în timp ce o procedură de decongelare prea rapidă poate cauza balonarea celulei, deoarece se creează un stres osmotic brusc celulei deshidratate (Neagu Vasile Radu, 2011).

Decongelarea paietelor de 0,5 ml în apă la 70°C, timp de 8 secunde, are ca și rezultat o rată de supraviețuire a spermatozoizilor mult mai mare decât dezghețarea făcută cu apă la 37°C timp de 15 până la 60 de secunde (Peña, A.I., Linde-Forsberg, C. (2000b); Olar, T.T. (1984); Concannon, P.W., Battista, M. (1989); Rota, and Coll.(1998 ).

Pentru baia de apă nu sunt necesare materiale sofisticate putându-se utiliza chiar și un borcan suficient de înalt, fiind important ca întreaga paietă să fie introdusă în apă.

Extragerea paietei din azotul lichid este recomandat să se facă cu ajutorul unei pense special destinată. Dacă paieta este extrasă cu mâna, trebuie să fie prinsă de la nievlul dopului uzinal. După extragere, se impune o singură mișcare puternică în scopul îndepărtării urmelor de azot rămase și a condesului format.

Transferul paietelor în apa încălzită trebuie făcut cât mai repede posibil. Decongelarea în interiorul unei paiete de 0,5 ml, la temperatura camerei, începe doar la 4 secunde de la extragerea din azot, ceea ce duce la alterări ale materialului seminal conținut (Neagu Vasile Radu, 2011).

PARTEA II – MATERIALE ȘI METODE

Capitolul 4

MATERIALE ȘI METODE

Cercetările s-au efectuat în perioada decembrie 2013 – iunie 2015, în cadrul Clinicii de Reproducție, Obstetrică și Ginecologie Veterinară a Facultății de Medicină Veterinară Cluj, pe un număr 6 de cățele cu vârsta cuprinsă între 2,5 și 7 ani, aparținând unor rase diferite: Saint Bernard, Basset Hound, Cane Corso Italiano și Dog Argentinian.

Cazul numărul 1

Femelă din rasa Saint Bernard, în vârstă de 2,5 ani, 55 kg, destinată reproducției și având o stare de întreținere foarte bună (fig. 4.1). Prezintă toate semnele caracteristice perioadei estrale: prezintă interes față de masculi, acceptă saltul, vulva este tumefiată și prezintă scurgeri de culoare roz-roșiatica diminuate volumetric în comparație cu faza proestrală a ciclului sexual, urinează frecvent și prezintă sindrom de imobilitate.

Fig. 4.1 Caz nr. 1, femelă Saint Bernard, 2,5 ani, 55 kg

Anterior acestui ciclu de călduri, femela a fost diagnosticată cu ascită și hidropericard de cauză idiopatică. La data diagnosticării, femelei i s-a efectuat un control ecografic cardiac și medicul curant a decis efectuarea unei puncții cardiace. Tratamentul recomandat și administrat timp de 2 săptămâni și până la data de 15.12.2014 (ziua a 5-a de călduri) a fost de 5 mg/kgc Furosemid și 0,5 mg/kgc de Vetmedin în două doze. În cazul nostru întrucât femela are o greutate de 55 kg s-a recomadat doza de 275 mg/animal (1/2 tab de 500 mg), o data la 6-8 ore, per os de Furosemid și 27,5 mg/animal în două doze (2,5 comprimate de 5 mg) de Vetmedin pe zi, oral.

Deoarece s-a determinat că problemele de sănătate anterioare nu sunt de natură genetică sau ereditare și întrucât femela are o mare valoare d.p.d.v. chinologic, proprietarul decide să o reintroducă în programul de reproducție al canisei sale.

Se pregătește un frotiu citovaginal cu scopul determinării momentului ovulației folosind următoarea metodă: fiind un câine de talie mare tamponul steril este introdus adânc în vagin, până la 15 cm, pentru a recolta proba, prin rotirea sa de 2-3 ori în interiorul cavitații. Amprenta se prepară imediat după recoltare prin rularea tamponului pe o lama curată și uscată, urmată de colorarea prin tehnica Diff Quick. În urma examinării acestuia s-au observat celule epiteliale vaginale din straturile superficial și intermediar, complet cornificate, fără nucleu vizibil, acestea fiind o caracteristică citologică a estrului (cellule de tip Schöllen) (fig. 4.2.)

Fig. 4.2. Frotiu citovaginal Cazul 1, celule superficiale și intermediare, microscop cu obiectiv x40

În data de 19.12.2014 femela se află în ziua 9 a căldurilor. Precedând această dată s-a monitorizat nivelul de progesteron din ser cu scopul stabilirii fazei ciclului sexual în care se află femela (fig. 5.3.):

-12.12.2014 (ziua 1-2) progesteronul avea valoarea de 0,112 ng/ml;

-15.12.2014 (ziua 4-5) progesteronul avea valoarea de 2,5 ng/ml;

-17.12.2014 (ziua 6-7) progesteronul avea valoarea de 4,5 ng/ml;

-18.12.2014 (ziua 7-8; test făcut la 20 h după precedentul) progesteronul avea valoarea de 10 ng/ml.

Fig. 4.3 Evoluția nivelului progesteronului plasmatic (ng/ml) la femela nr.1

Femela este supusă unui control ecografic al aparatului genital pentru a elimina orice suspiciune a unei eventuale afecțiuni cronice sau subclinice ale aparatului genital (fig. 4.4.).

Fig. 4.4. Ecograful Mindray, model DC3 Vet

În funcție de aceste rezultate se decide efectuarea înseminării artificiale prin metoda chirurgicală.

Materialul seminal folosit a fost supus conservării prin refrigerare, utilzȃnd metoda Clone®, în cantitate de 2,5 ml (din care 0,9 ml centrifugat și 1,6 ml diluant), provine de la un mascul de rasă Saint Bernard ȋn vȃrstă de 3 ani, mascul resident ȋn Norvegia. A fost recoltat cu aproximativ 20 de ore în urmă, transportul fiind efectuat conform specificațiilor din kit-ul folosit, el având o concentrație de 8.200.000 spermatozoizi/ml. Fiolele cu material seminal se scot de la frigider și se lasă la temperatura camerei timp de 30 de minute împreună cu flaconul ce conține activatorul pentru materialul refrigerat (fig. 4.5a). După acest interval de timp materialului i se adaugă o cantitate de 5 ml activator și apoi se imersează într-o baie de apă la temperatura de 36-37°C timp de 10 minute (fig. 4.5b).

Fig. 4.5a Materialul seminal refrigerat și activatorul lăsate la temperature camerei;

Pentru cazul 1

Fig. 4.5b Materialul seminal după ce i s-a adăugat activatorul, în baie de apă la 36,2°C;

Femela este pregătită pentru intervenție: cateter venos la membrul anterior drept; se tunde și se rade abdominal (fig. 4.6), pe linia alba unde va avea loc incizia și i se administrează 4 ml de Diazepam i.v. (doza pentru Diazepam este de 0,4 mg/kg de masa corporală, femela având 55 kg => 22 mg/ animal; O fiola de 2 ml având 10 mg, avem nevoie initial de 2 fiole); la 1 minut după Diazepam se administrează 5 ml de Ketamină i.v. (doza pentru Ketamină este de 10 mg/ kg masa corporală, femela având 55 kg => 550 mg/ animal; 1 ml de Ketamină are 100 mg, deci am avut nevoie de 5 ml). După ce femela a adormit se trece la antisepsia locului de incizie (fig. 4.7).

Fig. 4.6 Femela este tunsă abdominal

Fig. 4.7 Femela estecontentionata ȋn decubit dorso-lombar pe masa de operație și se efectuează asepsia și antisepsia; instrumentarul pentru operație este pregătit.

Cazul numărul 2

Femela din rasa Saint Bernard, în vârstă de 4 ani, 70 kg, (fig. 4.8) destinată reproducției și având o stare de întreținere foarte bună, este clinic sănătoasă dar are antecenente de resorbție fetală de la montele precedente, datorată unei insuficienței luteale.

În ciuda antecedentelor, deoarece au fost excluse cauze ereditare sau transmisibile și întrucât femela are o mare valoare d.p.d.v. chinologic, proprietarul decide să o reintroducă în programul de reproducere al canisei sale.

Datorită semnelor vizibile se presupune că și această femelă este în estru. Prezintă interes față de masculii întâlniți și scurgeri vaginale caracteristice estrului.

Fig. 4.8 Caz nr. 2, femelă Saint Bernard, 4 ani, 70 kg

Se trece la întocmirea unui frotiu citovaginal cu scopul vizualizării tipurilor de celule existente. Se etalează pe lama tamponul colectat și se colorează folosind metoda Diff Quick. Examinarea frotiului relevă prezența de celule complet cornificate, fără nucleu sau cu nucleu picnotic confirmând că femela este în estru (fig. 4.10.)

Fig. 4.10. Frotiu citovaginal Caz nr. 2, celule superficiale, examinat la microscop cu obiectiv x40

Data de 19.12.2014 se crede a fi în ziua 8 de călduri, precedând această dată, s-a monitorizat nivelul de progesteron din ser cu scopul stabilirii fazei ciclului sexual în care se află femela (fig. 4.9.):

– 12.12.2014 (ziua 1) progesteronul avea valoarea de 0,154 ng/ml;

– 15.12.2014 (ziua 3-4) progesteronul avea valoarea de 2,2 ng/ml;

– 17.12.2014 (ziua 5-6) progesteronul avea valoarea de 3,8 ng/ml;

– 18.12.2014 (ziua 6-7; test făcut la 20 h după precedentul) progesteronul avea valoarea de 7 ng/ml.

Fig. 4.9. Evoluția nivelului de progesteron (ng/ml) raportat la ziua de călduri

Femela este supusă unui examen ecografic pentru a îndepărta orice suspiciune a unei afectiuni cornice sau subclinice la nivelul aparatului reproducător. În funcție de aceste rezultate se horăraște utilizarea tehnicii de înseminare artificială prin metoda chirurgicală.

Materialul seminal folosit este refrigerat prin metoda Clone, în cantitate de 3,7 ml ( din care 1,5 ml centrifugat și 2,2 ml diluant) (fig. 4.11) provine de la un mascul Saint Bernard de 8 ani din Norvegia recoltat cu aproximativ 20 de ore în urmă și având o concentrație de 2.250.000 spermatozoizi/ml. Paieta folosită se scoate de la refrigerat și se lasă la temperatura camerei timp de 30 de minute împreună cu activatorul. După acest interval de timp, se adaugă 3 ml activator, iar apoi amestecul proba-activator se imersează într-o baie marină la temperatura de 36-37°C timp de 10 minute.

Fig 5.11. Materialul seminal și activatorul pentru cazul 2

Femela este pregătită pentru intervenție: cateter venos la membrul la membrul anterior drept (fig. 4.12); se tunde și se rade abdominal pe linia alba unde va avea loc incizia și i se administrează 6 ml de Diazepam i.v. (doza pentru Diazepam este de 0,4 mg/kg de masa corporală, femela având 70 kg => 28 mg/ animal; O fiola de 2 ml având 10 mg, avem nevoie initial de 3 fiole); la 1 minut după Diazepam se administrează 8 ml de Ketamină i.v. (doza pentru Ketamină este de 10 mg/ kg masa corporală, femela având 70 kg => 700 mg/ animal; 1 ml de Ketamină are 100 mg, deci am avut nevoie de 5 ml). După ce femela a adormit se trece la antisepsia și antisepsia locului de incizie (fig. 4.13).

Fig. 4.12 Cateter venos

Fig. 5.13 Antisepsia locului de elecție

Cazul numărul 3

Femelă rasa Basset Hound, în vârstă de 7 ani și 35 kg, destinată reproducerii și având o stare de întreținere foarte bună, clinic sănătoasă. (fig. 5.14.). În ziua consultului nivelul de progesteron era de 12 ng/ml.

La examenul clinic al femelei se observă semne ale căldurilor: femela urinează des, se observă scurgeri roșii deschise, vulva este tumefiată, mucoasa vulvo-vestibulară este roz-pală. Proprietarul ne informează că femela este interesată de masculi și aceptă saltul.

Datorită taliei rasei și dificultății cu care s-ar desfăsura monta naturală, proprietarul împreună cu medicul curant decid că o inseminarea artificială reprezintă soluția potrivită în acest cazIntrucât distanța la care se găsește masculul donator este foarte mare, varianta montei naturale se exclude automat. Materialul seminal congelat a fost preferat celui refrigerat datorită perioadei de păstrare mai indelungate.

Fig. 4.14. Cazul nr.3, femelă Basset Hound 7 ani. 35 kg

Materialul seminal congelat provine de la un mascul Basset Hound de 3 ani, din Anglia. Se folosesc 3 paiete cu o concentrație de 150.000.000 spermatozoizi/ ml și mobilitate de 60%. Paietele folosite se scufundă timp de 8 secunde în apă cu temperatură de 70°C și astfel are loc decongelarea.

Cazul numărul 4

Femela din rasa Dog Argentinian (fig. 4.15.), în vârstă de 5 ani și 50 kg, destinată reproducerii și având o stare de întreținere foarte bună, clinic sănătoasă. În ziua consultului nivelul de progesteron era de 10 ng/ml.

Semnele estrului sunt evidente, femela este agitată și proprietarul ne comunică dorința de montă a femelei. Scurgerile vaginale sunt roz-roșietic deschis, vulva este tumefiată.

Fig. 4.15 Cazul nr. 4, femelă Dog Argentinian, 5 ani, 50 kg

Se efectuează un frotiu citovaginal cu scopul determinării stadiului în care se află femela. Se recoltează celule de la nivelul vaginului cu ajutorul unui tampon steril, care mai apoi se etalează pe o lamă și se colorează prin metoda Diff Quick (fig. 4.16.). Pe acesta se observă celule superficiale tipice estrului.

Fig. 5.16. Frotiu citovaginal Cazul 3, celule superficiale, examinat la microscop cu obiectiv x40

Materialul seminal congelat provine de la un mascul de Dog Argentinian, 11 ani, incapabil de a efectua monta natural datorită vârstei înaintate. Se folosesc 2 paiete cu o concentrație de 150.000.000 spermatozoizi/ml și mobilitate de 45%. Paietele folosite se scufundă timp de 8 secunde în apă cu temperatură de 70°C și astfel are loc decongelarea.

La final femela este supusă unui examen ecografic pentru a îndepărta orice suspiciune a unei afecțiuni cronice sau subclinice la nivelul aparatului reproducător, iar după acesta se începe pregatirea femelei pentru operație.

Cazul numărul 5

Femelă din rasa Cane Corso Italiano (Fig. 6.17.), 7 ani și 52 kg, destinată reproducerii și având o stare de întreținere foarte bună, clinic sănătoasă. În ziua consultului nivelul de progesteron era de 13 µg/ml. Prezintă clinic semne ale căldurilor: vulva este tumefiată, există scurgeri roșu deschise, femela este agitate și caută masculul.

Fig. 5.17 Cazul nr. 5, femela Cane Corso, 7 ani, 52 kg

Materialul seminal congelat provine de la un mascul de Cane Corso Italiano în vârstă de 10 ani, decedat. Se folosesc 2 paiete cu o concentrație de 250.000.000 spermatozoizi/ml și mobilitate de 40%. Paietele folosite se scufundă timp de 8 secunde în apă cu temperatură de 70°C și astfel are loc decongelarea (fig. 5.18., fig. 5.19.).

Fig. 5.18 Paietele sunt extrase din azotul lichid

Fig. 5.19 Paieta este imersată în apă la o temperature de 70ºC timp de 8 secunde

Din cauza procentului de motilitate de 40% a spermei folosite, întrucât ea provine de la un mascul de o foarte mare valoare, dar decedat la vârsta de 10 ani, se decide folosirea metodei de înseminare artificială prin metoda chirurgicală, care în acest caz cu siguranță v-a face diferența dintre reușită și eșec.

Cazul numărul 6

Femelă rasa Basset Hound (fig. 5.20), în vârstă de 3 ani, destinată reproducerii și avînd o stare de întreținere foarte bună, clinic sănătoasă. În ziua consultului nivelul de progesteron era de 14 µg/ml.

În timpul consultației se observă tumefierea vulvei, de o consistență moale cu scurgeri tipice estrului. Proprietarul ne comunică schimbările de comportament din ultimele zile.

Fig. 5.20 Cazul nr. 6, femela Basset Hound, 3 ani.

Datorită distanței dintre mascul și femelă (2200 km) și mobilității de 50% a materialului folosit, se decide folosirea înseminarii prin metoda chirurgicală.

Se întocmește un frotiu citovaginal pentru a determina perioada estrală în care se află femela, prin recoltarea de la nivelul vaginului de celule ecuamate, etalarea lor pe o lamă și colorarea prin tehnica Diff Quick (fig.5.21.)

Fig. 5.21. Frotiu citovaginal colorat prin metoda Diff Quick

Frotiul se citește la microscop optic, cu obiectiv de 40x. Se poate observa prezența de celule cornificate complet, fără nucleu, sau cu nucleu picnotic, acestea sunt celule superficiale și sunt considerate tipice pentru estru (fig.5.22.).

Fig. 5.22 Frotiu citovaginal Cazul 6, celule superficiale, examinat la microscop cu obiectiv x40

Materialul seminal congelat provine de la un mascul de Basset Hound în vârstă de 5 ani, aflat In Anglia. Se folosesc 3 paiete cu o concentrație de 150.000.000 spermatozoizi/ml și mobilitate de 50%. Paietele folosite se scufundă timp de 8 secunde în apă cu temperatură de 70°C și astfel are loc decongelarea.

Examinarea materialului seminal după decongelare

Cel mai frecvent test realizat după decongelare este reprezentat de evaluarea mobilității spermatozoizilor. Din păcate, mobilitatea, pe lângă faptul că reprezintă o caracteristică destul de subiectivă a calității, nu reprezintă o garanție a fertilității.

La 10 minute după imersia în baia marină, materialul seminal refrigerat este gata pentru inocularea în coarnele uterine ale femelei. După finalul acestei proceduri, o parte din cantitatea rămasă, se examinează la microscop între lamă (curate, uscată și preîncălzită pentru a nu produce un șoc termic spermatozoizilor) și lamelă. În urma examinării cu obiectivul de 4x se observă o densitate mare a spermatozoizilor, mobilitate crescută și lipsa anomaliilor (fig 5.23).

Fig.4.23 Material seminal examinat cu obiectiv de x40, imediat după însămânțare

Se poate concluziona că materialul seminal a fost colectat, refrigerat și adus din nou la tempetura de utilizare în condițiile cele mai bune și fără a afecta calitatea sa.

După 30 de minute din cauza căldurii produse de becul microscopului spermatozoizii de pe lamă se epuizează mai repede decât în mod normal (fig 4.24 fig. 4.25.).

Fig. 5.10 Material seminal examinat cu obiectiv de x40 la microscopul electronic, la 30 de minute după examinarea inițială – spermatozoizi aglutinați

Fig. 5.25 Spermatozoizi aglutinați

(Sursă: Neagu Vasile Radu, 2011)

Tehnica înseminării artificiale prin metoda chirurgicală

După instalarea anesteziei femela este contențonată pe masa de operație, imobilizată în poziție ventro-dorsală, cu expunerea regiunii mezo- și hipogastrice. Femelei i se administrează 10 ml/kgc/oră soluție perfuzabilă de NaCl 0,9% pentru a o hidrata pe tot parcursul intervenției chirurgicale.

Pentru a menține anestezia, se suplimentează doza inițială de ketamină:

în minutele 3, 14 (câte 1 ml) și 16, 24, 28, 35 (câte 0,5 ml) pentru cazul 1

în minutele 16, 17, 19 ( cȃte 1 ml) și 25, 34 (câte 0,5 ml) pentru cazul 2

la fel în funcție de greutatea și diferențele de metabolizare s-a suplimentat cu doza de Ketamină corespunzătoare la toate cazurile.

Se efectuează o incizie pe linia albă de aproximativ 6-10 centimetrii între pubis și ombilic, în funcție de talia animalului (fig. 5.26). Când se începe incizia, un asistent decongelează materialul seminal. Chirurgul folosește o seringă sterilă pentru a aspira materialul seminal din paietă. Coarnele uterine sunt aduse în plaga operatorie (fig. 5.27) și în fiecare corn uterin, cu ajutorul unei branule de 24 G înclinată la 45° introducem materialul seminal ales (fig. 5.28). În tot acest timp un ajutor, prin taxis digital, obstrucționează partea distală a cornului forțând progresia materialului spre oviduct. După introducerea materialului seminal, se efectuează un ușor masaj dinspre locul inoculării spre oviduct, pentru a favoriza înaintarea materialului (fig. 5.29).

Fig. 5.26 Efectuarea inciziei pe linia albă

Fig. 5.27 Coarnele uterine aduse în plaga operatorie

Fig. 5.28 Histero-centeza, într-un unghi de 45°

Fig. 5.29. Introducerea materialului seminal în timp ce un ajutor obstrucționează lumenul cornului uterin în partea ce duce spre uter.

Locul de puncție se tamponează până la oprirea sângerării (fig. 5.30) și uterul este repus în poziția inițială (fig. 5.31). Procedura se încheie prin sutura planurilor incizate (fig.5.32).

Fig. 5.30 După retragerea branulei se tamponează locul pentru a îndeparta eventuali coaguli sangvini

Fig. 5.31 Repunerea coarnelor uterine

Fig.5.32 Plaga suturată

Managementul algic s-a realizat prin administrarea de Novasul (doza in mg/kgc), iar antibio-terapia necesară preventiei complicatiilor septice post-operatorii cu Synulox (doza in mg/kgc).

Capitolul 6

REZULTATE ȘI DISCUȚII

Cazul nr. 1

Femelei i s-a dozat progesteronul plasmatic în ziua 17 după înseminare (05.01.2015) având valoarea de 55,5 ng/ml, aceasta fiind o valoare normală pentru a susține gestația. Cățeaua a fost adusă din nou la 24 de zile după înseminare (12.01.2015) pentru un control ecografic, unde s-a constatat un început de resorbție fetală (fig. 6.1), datorat probabil diureticului (Furosemid) administrat până aproape de ziua înseminării. Furosemid este contraindicat animalelor gestante și conform testărilor făcute în acest sens s-a constatat că administrarea acestuia animalelor aflate în această stare duce la anomalii fetale și resorbție.

Fig. 6.1. Cazul 1 femelă Saint Bernard 2,5 ani, ecografie – resorbție fetală

Cazul nr. 2

Femelei i s-a dozat progesteronul în ziua 17 după înseminare (05.01.2015) acesta având valoarea de 23,5 ng/ml. Această valoare se află la limita inferioară și datorită acestui fapt, se recomandă administrarea de progesteron și se suspectează o insuficiență luteală. Progesteronul este hormonul care susține gestația, când o femelă are un nivel de progesteron scăzut, corpul ei va crede că este timpul să expulzeze puii ducând la pierderea gestației.

Ea a fost adusă din nou la 24 de zile după înseminare (12.01.2015) pentru un control ecografic, unde s-a constatat că uterulera gol. Tot atunci proprietarul ne-a comunicat prezența căldurilor prelungite, care susține în continuare ipoteza nivelului scăzut de progesteron fapt pentru care gestația a fost întreruptă. Ciclurile anterioare de călduri au fost, de asemenea, prelungite fără a se reuși susținerea unei gestații (fig. 6.2).

Fig. 6.2. Caz nr. 2 femelă Saint Bernard 4 ani, ecografie – resorbție fetală

Cazul nr. 3

Femela se prezintă la clinică, la 24 de zile după data înseminării, în vederea efectuarii unui examen ecografic. În urma acestuia s-a constatat că femela este gestantă (fig.6.3.), având un număr de aproximativ 8 pui.

Fig. 6.3 Caz nr. 3, 24 de zile de la înseminare – gestație confirmată

La 61 de zile de la înseminare, femela a născut natural un număr de 9 pui, toți sănătoși. Proprietarul ne relatează în continuare că toți puii au supraviețuit.

Cazul nr. 4

Femela din rasa Dog Argentinian se prezintă pentru examen ecografic la 28 de zile după înseminare, în urma acestui examen gestația este confirmată și sunt vizualizați un număr de aproximativ 7 pui.

La 60 de zile de la înseminare femela a născut 9 pui din care doar 7 au supraviețuit consecința unor malformații congenitale grave.

Cazul nr. 5

Femelă din rasa Cane Corso Italiano de 7 ani se prezintă pentru examen ecografic la 25 de zile după înseminare, în urma acestuia gestația este confirmată și un număr de aproximativ 5 pui pot fi vizualizați.

În ziua 62 de gestație, în cadrul Clinicii de Reproducție, Obstetrică și Ginecologie Veterinară a Facultății de Medicină Veterinară Cluj Napoca, am efectuat operația de histerotomie. La extragerea puilor din uter, s-a confirmat rezultatul examenului ecografic, și anume existența a 5 pui, toți sănătoși.

Cazul nr. 6

Femelă din rasa Basset Hound se prezintă în ziua 27 pentru confirmarea gestației prin examen ecografic. Din păcate, în urma acestei proceduri se stabilește că femela nu este gestantă.

Fiecare caz este prezentat succinct în Tabelul 6.1. De aici putem concluziona ca dintr-un lot de 6 femele 50% au rămas gestante și tot atâta au și dus gestația la un bun sfârșit. Numărul de produși din fiecare cuib a fost în limitele normale sau chiar peste media rasei.

Tabelul 6.1. Rezultatele în urma procedurii și caracteristicile fiecărui caz

,

Metoda chirurgicală de înseminare artificială este preferata atunci când femela este pe final de perioada reproductivă sau prezintă afectiuni incompatibile cu functia de reproductive la nivelul vaginului sau a cervixului; sau când proba de material seminal are o calitate mai scăzută din varii motive (vȃrsta inaintata a donatorului, masculi cu fertilitate scazută).

Înseminarea artificială prin histero-centeza (metoda chirurgicala) conferă un procent de reușită superior față de metodele clasice de înseminare artificială transcervicală (TCI), pentru probele de material seminal cu 40-50% motilitate și face deseori diferența dintre reușită și eșec. Principalul avantaj constă în depunerea strict intra-utrină a materialului seminal, aspect obligatoriu avand în vedere faptul că după decongelare spermatozoizii iși pierd capacitatea de a depăsii cervixul (“sperm-selector-ul cervical”). Totodată, putem evita posibilele afecțiuni de la nivelul vaginului sau cervixului și datorită deschiderii cavității abdominale putem examina starea de sănătate a uterului, coarnelor uterine și a ovarelor, putem vizualiza existența aderențelor sau colectiilor patologice din interiorul cavității abdominale și uterine. Efectuarea corectă a metodei chirurgicale și manipularea în standardele cerute a materialului seminal duce la o creștere a ratei de concepție și implicit al numărului de pui născuți și înțărcați. Testarea donatorilor de material seminal precum și a materialului seminal refrigerat sau congelat (indiferent de metodă) se efectuează în mod obligatoriu (ȋntrucât face, în cele mai multe cazuri, obiectul transportului trans-frontalier), astfel se pot evita bolile cu transmitere sexuală, prezența bacteriilor și eventualilor viruși este înlăturată. Gestația, fătarea și comportamentul ante și post-partum al femelei nu sunt afectate.

Fiind o metodă chirurgicală aceasta prezintă anumite riscuri. Primul dintre acestea este riscul produs de anestezie care presupune o dozare corectă în funcție de individ, rata de metabolizare a analgezicului și posibilitatea apariției unei reacții de hipersensibilitate din partea pacientului. În timpul desfășurării actului chirurgical există riscul secționării/ruperii accidentale a unui organ din cavitatea abdominală sau riscul unei hemoragii la locul de inoculare a materialului seminal deoarece uterul este congestionat în urma reacțiilor produse de estru. Depunerea materialului seminal trebuie facută intraluminal și evitat peretele cornului uterin. Totodată, fiind o operație care necesită deschiderea cavității abdominale, riscul septic este prezent mai ales în cadrul nerespectării regulilor de asepsie și antisepsie. Pacientul poate dezvolta peritonită, abcese parietale, aderențe, etc.

Costul, timpul de recuperare al animalului și faptul ca este o metodă invazivă, sunt considerate principalele dezavantaje ale acestei metode.

Primul pas pentru creșterea șanselor de reușită este cunoașterea momentului optim pentru înseminare, prin dozarea progesteronului, timp de mai multe zile consecutive, până la depistarea peak-ului de LH. Apoi, materialul seminal folosit să fie refrigerat/congelat și reactivat conform standardelor, fără a-i deteriora calitățile. Tehnica chirurgicală folosită să fie una corectă și sigură, materialul seminal să fie introdus în lumenul cornului uterin.

Monitorizarea gestației este necesară pentru a prevenii eventualele probleme ce pot apărea. Se recomandă o dozare a progesteronului la 15-20 de zile după înseminare pentru a prevenii o eventuală insuficiență luteală. Controlul ecografic este de asemenea de dorit, cu ajutorul său se pot vizualiza eventualele resorbții fetale sau patologii ale aparatului reproducător survenite în urma intervenției.

Deși prima gestație folosind spermă congelată a fost obținută prin depunerea vaginală (Seager,1969), depunerea în uter a materialului seminal este mult mai practică din punct de vedere al rezultatelor obținute. Într-un studiu complex realizat de Linde Forsberg și col.,1993 ratele de concepție folosind inseminarea intrauterină și cateterul norvegian a fost de 84,4% comparativ cu 34,8% folosind inseminarea vaginală, iar mărimea medie a cuibului a fost de 5±3 comparativ cu 2,5±1,3.

Rezultate similare au fost obținute și de alți cercetători (Thomassen și col., 2001, 2006) folosind inseminarea transcervicală cu cateterul norvegian. Un total de 526 de cățele din 99 de rase diferite au fost inseminate artificial în 635 de cicluri sexuale cu spermă congelată de la 368 de masculi. Rata de concepție a fost de 73,1% iar mărimea cuibului de 5,7±0,1 căței. Volumul fiecărei doză de inseminare a fost de 2-2,25 ml cu 2×108 spermatozoizi. Au fost realizate una sau doua inseminări. Rata de concepție a fost mai mare după inseminarea transcervicală (75%) decât după inseminarea intravaginală (10%). Lăsând la o parte alți factori, inseminarea transcervicală la timpul optim (2, 3 zile după ovulație) a avut cele mai bune rezultate (70%) și o rată de concepție de 5,8±0,2 marimea cuibului.

Totuși există situații ca cele enumerate mai sus care necesită o abordare chirurgicală.

Capitolul 7

CONCLUZII ȘI RECOMANDĂRI

Dintr-un total de 6 femele care au fost înseminate prin metoda chirurgicală, 3 dintre ele au rămas gestante, reprezentând un procent de 50%.

Înseminarea artificială prin metoda chirurgicală necesită monitorizarea atentă a ovulației, prin dozarea LH-ului și/sau a progesteronului din ser, deoarece această tehnica implică o singură inoculare de material seminal. În cazul materialului seminal conservat prin congelare spermatozoizii au capacitate fecundantă aproximativ 9 ore dupa depunerea în căile genitale femele și 24 de ore în cazul materialului refrigerat. Astfel este obligatorie identificarea exactă a momentului optim al inseminării prin monitorizarea concentrațiilor plasmatice de progesteron și LH.

Metoda chirurgicală de înseminare artificială prezintă o serie de dezavantaje cum ar fi: riscul anestezic, costul, timpul de recuperare al animalului și faptul ca este o metodă invazivă.

Principalul avantaj consta în depunerea strict intra-utrină a materialului seminal, aspect obligatoriu avand în vedere faptul că după decongelare spermatozoizii iși pierd capacitatea de a depăsii cervixul. Totodată putem evita posibilele afecțiuni de la nivelul vaginului sau cervixului și datorită deschiderii cavității abdominale putem examina starea de sănătate a uterului, coarnelor uterine și a ovarelor.

În concluzie recomandăm tehnica de înseminare artificială prin metoda chirurigicală în toate situațiile în care se folosește material seminal congelat sau există alte considerente speciale legate de femela sau masculul implicat.

BIBLIOGRAFIE

Concannon, P.W., Battista, M. (1989). Canine semen freezing and artificial inseminations. In: Kirk RW (ed). Current Veterinary Therapy X: Small Animal Practice. Philadelphia, WB Saunders, p. 1247-1259

Dan Rice, 2008, The Complete Book of Dog Breeding. Barron's Educational Series. pp. 51–. ISBN 978-0-7641-3887-4. Retrieved 7 February 2013.

England, G.C.W., Allen, W.E. (1992). Factors affecting the viability of canine spermatozoa. II. Effects of seminal plasma and blood. Theriogenology 37, p. 373-381.

Igna, V. (2007). Sperm preservation, p. 265-278. In: Canine reproduction, obstetrics and gynecology (in Romanian). Ed. Brumar, Timișoara; Romania

Iguer-ouada M., Verstegen J.P. ,2001, Long-term preservation of chilled canine semen: effect of commercial and laboratory prepared extenders. Theriogenology 55, 671- 684

Ioan Ștefan Groza, Muntean M., 2002

LINDE-FORSBERG C., FORSBERG M., 1993 – Results of 527 controlled artificial inseminations in dogs. J. Reprod. Fertil. (Suppl) 47: 313-323.

Linde-Forsberg, C. (2005). Artificial insemination. Proc. ESAVS-EVSSAR-ENVN Congress, Nantes, France.

Neagu Vasile Radu, 2011, Cercetări privind prelevarea, prelucrarea și crioconservarea materialului seminal canin, 53

Olar, T.T. (1984). Cryopreservation of dog spermatozoa. PhD thesis. Fort Collins, Colorado State University, USA.

Peña, A.I., Linde-Forsberg, C. (2000b). Effects of Equex, one- or two- steps dilution, and two freezing and thawing rates on post-thaw survival of dog spermatozoa. Theriogenology, 53: 859- 875

Robert Bowen, 1998, Vaginal Cytology: Introduction and Index

Rober Bowen, 2003, Collection and Evaluation of Semen: Introduction and Index

Rota, A., Ström, B., Linde-Forsberg, C. (1995). Effects of seminal plasma and three different extenders on canine semen stored at 4C. Theriogenology, 44, p. 885-900.

Rota, A., Linde-Forsberg, C., Vannozzi, I., Romagnoli, S., Rodriguez-Martinez, H. (1998). Cryosurvival of dog spermatozoa at different glycerol concentrations and freezing/thawing rates. Reproduction in Domestic Animals 33, 355-361.

Scarlette Gotwals, Timing the fertile period of the bitch: Brief review. Canine Reproduction Seminar

SEAGER S.W.J., 1969 – Successful pregnancies utilizing frozen dog semen. A.I. Digest 17: 6-7.

Sirivaidyapong, S., Ursem, P., Bevers, M.M., Colenbrander, B. (2001). Effect of prostatic fluid on motility, viability and acrosome integrity of chilled and frozen-thawed dog spermatozoa. Journal of Reproduction and Fertility, Suppl 57, 383-386

THOMASSEN R., FARSTAD W., KROGENAES A., FOUGNER J.A., BERG K.A., 2001 – Artificial insemination with frozen semen in dogs: a retrospective study. J. Reprod. Fertil. (Suppl) 57:341-6.

Valeria Rickard, 2011, The Informed Breeder: Semen Collection and Packaging for Chilled Semen Shipment

Verstegen, J.P., K. Onclin, L.D.M. Silva and P.W. Concannon, 1999, Effect of stage of anoestrus on the induction of estrus by the dopamine agonist cabergoline in dogs. Theriogenology. 51: 597-611

Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift, 2011, Preservation and shipment of chilled and cryopreserved dog semen, 250

William C. Truesdale, July 2011, Artificial Insemination Handout, ICSB-MA