Inhibitori Ai Proteinelor

Până în prezent s-au efectuat numeroase studii farmacologice și analitice privind veninul de vipere. Ceea ce s-a urmărit în studiile efectuate au fost urmatoarele: toxicitatea acută, influența veninului asupra rezistenței globulare a hematiilor de șoarece. Polipeptidele farmacodinamic active din structura veninului au fost puse în evidență prin electroforeza proteinelor în gel de poliacrilamidă.

Cele mai multe studii s-au efectuat asupra veninului provenind de la speciile: Vipera Ammodytes ammodytes, Vipera berus berus si Vipera ursini. Veninul de vipera proaspăt nu prezintă miros, gust specific si este lipicios. Are un aspect vâscos, limpede de culoare galbuie. Se dizolva in salivă si apă.

Din punct de vedere chimic veninul este un amestec de substanțe proteice cum sunt: hemolizine, neurotoxine, leucotoxine si hemoragine. Acesta este reprezentat în proporție de 70% apă si 30 % alte substanțe cum sunt: substanțele minerale ( Na, Ca, Zn, Mg, P, Fe, Si, Al, Cu) și enzime. Fosfolipaza A, o enzimă tipică veninurilor de Viperidae, este de mai multe tipuri si anume: i, j, k1, k2 si l. Fracțiunea i este netoxică iar restul fracțiunilor au efecte letale de intensitate diferită. Alte enzime prezente în venin sunt: Ammodytoxina A (de la Vipera Ammodytes), hialuronidaza, colinesteraza, fibrinogen coagulaza, etc.

În funcție de natura și acțiunea fiziopatologică a fracțiunilor enzimatice din structura veninurilor se disting 4 categorii de venin: hemotoxic, neurotoxic, citotoxic si miotoxic.

Veninul cu acțiune hemotoxică atacă sistemul cardio-vascular, provocând astfel atacul de cord. Veninul citotoxic prezintă simptome locale ce constau în distrugerea vaselor de sânge, a celulelor și a țesuturilor în general. Veninul miotoxic provoacă necroza musculară. Acesta contine peptide care distrug fibra musculară ducând la mionecroză. Veninul neurotoxic atacă sistemul nervos, victima suferă de insuficientă respiratorie care se asociază cu atacul de cord și colapsul organismului, în scurt timp instalându-se moartea.

În cazul unei mușcături manifestările clinice depind de mai mulți factori: cantitatea și tipul veninului, starea de sănătate a victimei, greutatea si suprafața corporală a victimei, regiunea mușcaturii, momentul si tipul tratamentului aplicat.

Din punct de vedere al acțiunii farmacologice, veninul de viperă determină: vasodilatația prin diminuarea tonusului vascular si heperemie, scăderea sensibilitații terminațiilor nervoase la stimuli, stimularea fibrinogenezei având prin aceasta, acțiune hemostatică.

Veninul de viperă s-a utilizat și se utilizează în continuare în obținerea diferitelor preparate larg utilizate în medicină și farmacie. Astfel din veninul viperei Ammodytes s-au obținut urmatoarele preparate:

Vipracutan: utilizat în acuze reumatice și nevralgii, entorse, zdrobituri de membre.

Viprasid: soluție injectabilă utilizată în artrite și reumatism.

Hemarcitin: efect hemostatic în diateze hemoragice prin deficit al factorilor de coagulare, fiind folosit cu succes în hemoragiile din bolile pulmonare, gastrointestinale, de căi urinare, etc.

Vipericin: utilizat în acuze reumatice, accidente sportive, tulburări de circulație periferică.

Ammodyn –N: afecțiuni reumatice, mialgii, nevralgii.

Structura chimică a veninului

Veninul este constituit dintr-un amestec complex de compuși biologic activi dintre care la vipere, foarte importante sunt fosfolipazele. Pe lângă acestea o grupă de interes farmacologic crescut îl prezintă enzimele cu acțiune de inhibitori proteici.

Inhibitori ai proteinelor

Acestea sunt proteine mici clasificate în mai multe grupe, 2 dintre ele inhibând mai bine tripsina decât chimotripsina, iar acțiunea celei de-a 3 este opusă. Reprezinta mai puțin de 0,5% din proteinele veninului.

Au fost izolate din veninul brut de Vipera ammodytes. Grupul N terminal al inhibitorilor este blocat, arginina reprezentând aminoacidul N terminal. Pe langa tripsină și chimotripsină aceștia mai inhibă si plasminul, însă inhibitorii chimotripsinei nu inhibă deloc plasminul dar inhibă slab plasma umană si tripsina.

Datorită proprietaților lor toate cele 3 grupe de inhibitori aparțin marii familiei ai inhibitorilor de tripsină pancreatică Kunitz. Sunt proteine mici și astfel foarte susceptibile pentru studii biochimice și structurale. Au fost clasificați potrivit proprietaților lor în mai multe familii. În veninul de șarpe inhibitorii proteinazelor sunt prezenți în veninul unor specii aparținând familiilor Elipidae si Viperidae (Takahashi, H., Iwanaga, S.and Suzuki, T.(1974) Toxicon 12, 193-197)

Cateva tipuri de inhibitori Kunitz din veninul de șarpe au fost izolate și secvențiate.(Takahaski, H., Iwanaga, S., Kitagawa, T.,Hokama, Y and Suzuki, T.(1974) J. Biochem. (Tokyo) 76, 721-733)

A fost raportat faptul că inhibitorii de tip Kunitz pe langă rezidurile din jurul situsului activ mai posedă și alte reziduri în situsul weak-loop care sunt importante pentru diferite interacțiuni cu diferite serin proteinaze (Dietl, T., Huber, C., Geiger, R., Iwanaga, S.& Fritz,(1979) Hoppe Seyler’s Z. Physiol. Chem. 360, 67-71)

Proteinele hemoragice

În decursul anilor și studiilor efectuate s-a acordat deasemenea atenție proteinelor hemoragice din veninul de șarpe. Astfel s-au efectuat studii asupra izolării și caracterizării metaloproteinazei hemoragice. Aceste proteine au fost izolate de la crotalide și le-au fost investigate proprietațile. Au fost determinate: toxinele hemoragice, mucrotoxina A, factorii hemoragici a si b, etc. În urma analizarii acestor polipeptide s-a constatat activitatea proteolitică. Aceste proteine conțin zinc, elememtul esențial al procesului catalitic în moleculă ( Bjarnason et al., 1978, 1983, 1984, 1987, 1988; Nikai et al., 1984; Fox et al., 1986; Civelle et al., 1983; Huang et al., 1984; Sugihara et al., 1983; Nikai et al., 1985; ).

În cazul speciei Viperei berus berus s-a constat că veninul acesteia conține numeroase enzime proteolitice. Au fost clasificate în 2 mari grupe și anume: metaloproteinaze si serinproteinaze. (Siigur et al., 1979; Samel et al., 1987)

În cadrul unui studiu în care s-a analizat o fracțiune preliminară a veninului s-a constatat faptul că activitatea elementelor cazeinesterolitic si argininesterolitic este asociată cu diferite enzime si că metaloproteinazele acestui venin au activitate hemoragica (Siigur et al., 1979). Procedeul constă în trecerea metaloproteinazei printr-un gel filtrant după care se face separarea acestuia de alte componente prin cromatografie folosind coloanele cu agaroză HPS-7. S-a stabilit astfel și greutatea lor moleculară ca fiind de 56,7 kDa.

Proteinazele hemoragice din veninul de șarpe pot fi clasificate în 2 grupe:

cele cu greutate moleculară mică: 15- 26 kDa

cele cu greutate moleculară mare: 50- 100 kDa

Proteinazele din veninul speciei Vipera berus berus fac astfel parte din grupa proteinelor cu greutate moleculară mare. Proteinele hemoragice din veninul de crotalide a fost înalt purificate si caracterizate, dar există puține date privind purificarea proteinelor hemoragice la Viperidae.

Eficacitatea toxinelor hemoragice variaza, motiv pentru care s-a utilizat doza minimă hemoragică (MHD) ca element de diferențiere a efectelor toxice generate de acestea. MHD este definită ca si cantitatea de toxină în micrograme care produce un spot hemoragic de 10 mm la timpul specific, de obicei 3-6 ore, după inocularea intradermală sau subcutanată la iepuri si șoareci. Chiar daca toxinele hemoragice sunt potențial capabile sa interfereze cu sistemul de coagulare al sangelui, ele au fost analizate pentru efectul lor proteolitic asupra fibrinogenului si a fibrinei din sânge.

Toxina hemoragică de la Vipera berus berus nu a putut digera (descompune) fibrinogenul. La mai puțin de 30 de minute de digestie lanțul Aα al fibrinogenului a fost pierdut. Lanțul β este mai rezistent la hidroliză, iar lanțul y nu a fost digerat. Toxina hemoragică are o activitate proteolitică slabă față de fibrină la un timp al incubării mai mare de 24 h (Samel si Sugur, 1990). Specificitatea proteolitică a fost investigată utilizând lanțuri B oxidate din insulină bovină. Enzima din veninul spciei Vipera berus clivează legăturile: Ala14-Leu15, Tyr16-Leu17 si His10-Leu11.

Cu toate că masele moleculare ale toxinelor hemoragice variază mult (22- 90,000 kDa) toate par a fi metaloproteinaze. Două principii hemoragice, Bitis arientas, respectiv hemoragina a (HBRa) și hemoragina b (HBRb) au fost izolate și purificate din veninul speciei Bitis arientas. Ele aparțin unui grup de metaloproteinaze hemoragice cu masa moleculară mare. Masele moleculare sunt: 68,000 (kDa) pentrut BHRa și 75,000 (kDa) pentru BHRb (Omori- Satoh et al., 1995).

Hemoraginele hidrolizează gelatinele preparate din colagen de tip I, II, III si IV. Hemoraginele hidrolizeaza angiotensina I si luteinizeaza hormonii de eliberare. Lanțul B de insulină este clivat de BHRa si BHRb la pozițiile 10 si 11 (Yamakawa et al.,1995). Nu există informații privind activitatea fibrinolitică a acestor hemoragine. Veninul de Bitis arietas nu conține hemoragine cu greutate moleculară mică.

Fosfolipazele A2

Unul dintre cei mai studiați compuși a fost fosfolipaza A2. Aceasta a fost purificată de la specia Vipera ammodites prin tehnici cromatografice cu schimb de ioni. Doza letală este de 0.36 mg/kg aplicată intravenos. Acestea sunt enzime larg raspandite în natură jucând un rol important în metabolismul lipidelor, cerința pentru Ca 2+, prezintă un înalt grad de constrângere funcțională în structura lor terțiara impusă de numeroasele legaturi disulfidice.

Au un singur lanț polipeptidic conținand 129 resturi de aminoacizi,(triptofanul nu a fost determinat). Cele mai multe dintre veninurile de șarpe conțin fosfolipaza A2 în a carei poziție 49 din situsul activ se află o lizină sau o serină în locul restului de aspartat prezent de obicei la restul fosfolipazelor.

Deși aceste proteine nu leagă Ca2+ și sunt lipsite de activitate catalitică ele sunt miotoxine înalt specializate și recent s-a demonstrat faptul că ele pot produce distrugerea membranelor printr-un nou tip de mecanism citolitic. Trei dintre aceste toxine: miotoxina II, amoditin L si proteina K 49 au fost examinate pentru interacțiunile lor cu acizii grași și s-a constatat că leagă covalent lanțuri lungi de acizi grași.

Enzimele fosfolipaze A2 sunt hidrolaze esterolitice care catalizează hidroliza 3-sn-fosfogliceridei. În mod special ele hidrolizează și eliberează acizii grași din poziție secundară. Aceste enzime sunt omniprezente în natură, și apar în ambele forme: intracelular- tipul celular sau enzime cPLA2- și extracelular – tipul secretor sau sPLA2. În general, cPLA2 sunt prezente în cantitați mici și prin urmare purificarea lor este relativ dificilă. Fracțiunea sPLA2 pe de altă parte se gasește în cantitați mari în natură, respectiv în veninul de șarpe și în pancreasul mamiferelor care sunt surse bogate în aceste enzime.

Deoarece purificarea enzimei sPLA2 este mai ușoara, cateva sute din acest tip de enzime au fost purificate și caracterizate. Enzima PLA2 de la mamifere joaca roluri importante în intreținerea polilor fosfolipidici celulari, în procesele de reparare membranară prin deacilare și reacilare, precum și în biosinteza prostaglandinelor. Au deasemenea roluri crucial în diferite procese fiziologice și patologice. Importanța enzimelor PLA2 în fertilitate, proliferare celulară, contracția musculaturii netede, hipersenzitivitate și în bolile cronice inflamatorii, au fost recunoscute și demonstrate. Sunt deasemenea importante în funcțiile celulare precum cea de semnal de transducție și homeostazie membranară.(Kudo et al., 1993, Vadas et al., 1993; Vadas and Pruzanski, 1986; Sommers et al., 1992; Nakajima et al., 1992)

Fosfolipazele A2 sunt componente importante ale veninului. Unele dintre ele posedă neurotoxicitate presinaptică înaltă, cum sunt: Amoditoxina A, B și C, iar altele nu sunt toxice, cum este Amoditin I2. Amoditin L este un omolog al Ser-49 PLA2 care nu are activitate enzimatică si neurotoxică dar are o puternică activitate miotoxică (s-a demonstrat pe culturi de celule musculare de șoarece – Bieber, A. L., personal comunication).

Fosfolipazele A2 pot fi clasificate in 2 grupe:

Grupa 1: prezentă în principal în pancreasul mamiferelor și în veninul a două familii de șerpi: Elipidae si Hydrophidae

Grupa 2: descoperită pentru prima dată în veninul de la Crotalidae si Viperidae.

PLA2s din grupa a 2-a a fost izolată și de la mamifere constituind un tip non-pancreatic. Cea mai toxică dintre toate este Amoditoxina A cu doza letală de 0,021 mg/Kg (la șoarecele alb de laborator).

În constrast cu PLA2s de la mamifere, multe structuri similare și omologe au fost izolate de la o singură specie de șarpe. Astfel analizele Southern Blot a ADN-ului cromosomal din probe biologice umane și de șoarece indică faptul că este foarte posibil să existe o singură genă pentru grupa 2 de PLA2s la mamifere. În prezent structura nucleotidică a genelor la șerpi a grupei 2 PLA2s este nca neelucidata dar se poate specula ca la sarpe aceasta este codata de mai multe familii de gene (Kramer et al., 1989, Komada et al., 1990).

Scurta caracterizare a unor compusi

Amoditin L – structura primară a fosfolipazei miotoxice Amoditin L dezvăluie mutații aditive în poziții importante pentru activitatea enzimatică. Tyr (Tiroxina) 28 este schimbată cu o histidină și Gly (Glicina) 33 cu o aspargină. Totuși este foarte puțin probabil ca aceste modificări sa slăbească activitatea enzimatică. Acestea au rol în miotoxicitate, lucru demonstrat în culturile de celule musculare recoltate din perioada neonatală a șobolanilor (Igor Krizaj, Allan L. Bieber, Anka Ritonja and Frank Gubensek, 1991).

Amoditoxina A – secvența de aminoacizi s-a determinat în urma izolarii enzimei din veninul speciei Vipera ammodytes. Structura primară a fost dedusă în urma secvențierii peptidelor obținute de la Staphylococcus aureus. Potrivit secvențierii enzima se clasifică în subgrupa a 2 a fosfolipazelor A2. Secvența responsabilă de activitatea toxică a fosfolipazei active presinaptic se crede a fi localizată în rezidurile bazice. Aceasta activitate toxică diferă substanțial de enzimele toxice ale celorlalte grupe. Veninul speciei Vipera ammodytes conține ambele fosfolipaze A2: letale și non letale. Toxicitatea celor letale (toxice) este generată de blocarea parții presinaptice a transmisiei neuromusculare. Izoenzimele toxice din veninul speciei Vipera ammodytes sunt toate de baza, avand o toxicitate considerabil diferită dar o structură primară foarte asemanatoare (Lee, C.Y., Tsai, M.C., Ritonja, A. and Gubensek, F. (1984) Arch. Int. Pharmacodyn. 268, 313-324).

Miotoxinele: miotoxina acilată se leagă la suprafața lipozomilor și izolează membrana musculară cu conținutul acizilor grași inserați în lipide și acționează ca posibile ancore. Miotoxina fosfolipază like reprezintă primul grup de proteine capabile să se supună acilarii prin reacții spontane fără acizii grași. Se presupune că această abilitate ar putea fi singura parte ramasă dintr-un proces complet al reacției fosfolipazei (J.Z. Pedersen, B. Lomonte, R. Massoud, F. Gubensek, J.M. Gutierrez and S. Rufini, Autocatalytic Acylation of Phospholipase-like Myotoxins, Biochemistry 1995, 34, 4670-4675).

Modificări chimice ale grupului Aminofosfolipaza A2 din veninul de șarpe

S-au izolat mai multe fosfolipaze din veninul de la speciile Crotalus atrox, Vipera berus si Naja melanoleuca. S-a observant că acestea reacționează rapid cu acidul glioxilic în prezența Cu2+(ion), acetat buffer, pH 5,5 și tetrametilurea (4M) pentru a capta proteine cu un alfa cetoacid la capătul N terminal.

Proteinele modificate nu au activitate cănd sunt testate pe substrat micelar dar activitatea revine parțial cănd substraturile sunt de forma monomerică sau substanțe organizate la interfața aer – apă. Modificarea scade, dar nu abolește definitiv afinitatea proteinelor pentru micelii de pe substartul analog n-hexadecilfosfocolina, precum fitrarea prin gel și spectroscopie UV.

Proteina modificată va interacționa cu fosfolipida dar nu o va hidroliza în ciuda puterii potențialului lor catalitic, precum în cazul substratului monomeric.

Fosfolipazele A2 au fost izolate din mai multe tipuri de venin precum cel de albină, șerpi sau cel din pancreasul mamiferelor (Tu, 1997). Enzimele izolate din surse vertebrate arată un înalt grad de secvențe omoloage (Heinrickson et al., 1977). Aceste enzime hidrolizează fosfolipidele stereospecific. Ele arată o cerința absolută de ioni de calciu și sunt rezistente la condiții de denaturare.

În ciuda acestor similaritați, diverse rezultate au fost raportate pentru studii privind mecanismele de acțiune ale enzimelor din diferite surse. S-a raportat faptul ca aceste enzime sunt prezente ca și dimeri chiar și în soluții diluate și sunt active exclusiv în timpul procesului catalitic (Tinker et al., 1978, Tinker & Wei, 1979; Wells, 1971; Shen et al., 1975)

Fosfolipaza A2 din veninul de cobră este prezentă ca monomer la concentrație redusă dar s-a propus un substrat care să încerce dimerizarea acesteia. Pentru enzimele din pancreasul porcin nu s-a putut obține nici o informație cu privire la existența unui dimer funcțional.

Fosfolipazele din venin prezintă o gama largă de activitați farmacologice, una dintre cele mai studiate proprietași fiind abilitatea anumitor enzime de a interfera cu neurotransmițatorii eliberați de joncțiunile neuromusculare, în timp ce alte fosfolipaze sunt inerte în acest sistem (Karlsson, 1979).

Alte aspecte privind fosfolipazele A2

Deși există similaritați structurale și catalitice între enzimele PLA2 de la mamifere și cele din venin, acestea din urmă au o largă activitate de efecte farmacologice și de toxicitate. Efectele neurotoxice, cardiotoxice, miotoxice, anticoagulante, antitrombotice, hemolitice și hemoragice sunt unele dintre cele mai importante efecte farmacologice induse de enzimele PLA2 din vninul de șarpe. Deși o varietate de efecte farmacologice sunt induse de enzimele PLA2, nu toate efectele sunt expuse de toate enzimele PLA2. Fiecare enzimă expune un efect specific. Spre exemplu, b-bungarotoxina induce un efect presinaptic dar nu reuseste să arate nici un efect postsinaptic (Strong et al., 1976)

Când izoenzimele sunt injectate intraperitoneal, ele oferă efecte diferite:

produce hemoragie la nivelul ficatului și al rinichilor

provoaca hemoragii la nivelul plamânilor

omoară șoarecii prin simptome neurotoxice.

Acest lucru indică susceptibilitatea unui sistem specific, țesut sau organ spre o enzimă particulară PLA2. O specifictate similară a unui atac asupra unuii țesut particular a fost descoperită la izoenzimele PLA2 de la Trimeresurus flavoviridis. Această sceptibilitate poate fi explicată de prezența unui receptor de membrană pe suprafața celulelor sau țesuturilor vizate. Aceste situs-uri țintă sunt recunoscute de situs-uri farmacologice specifice pe moleculele de PLA2. Aceste situs-uri farmacologice sunt independente dar cateodată se suprapun cu situs-urile active ale enzimei. Marea afinitate dintre cele 2 situs-uri determină efectele farmacologice specifice ale enzimelor PLA 2 (Rosenberg. 1986).

Situs-urile țintă propuse ar trebui să fie localizate la suprafața celulelor vizate. Prin urmare aceste situs-uri pot fi lipide membranare sau proteine (glicoproteine). Deoarece enzimele PLA2 se leagă și hidrolizează fosfolipidele, acestea din urmă ar putea funcționa ca și situs-uri țintă.

Două enzime PLA 2 care afectează aceiași celulă se pot lega fie la 2 situs-uri diferite ale aceluiaș receptor de proteina, fie la 2 receptori de proteină diferiți și induc simptome similare dacă nu chiar identice. De exemplu, deși neurotoxinele presinaptice precum notexina, crotoxina, taipoxina generează efecte sinergice și potentare mutuală. Este deasemenea important de notat faptul că nu există competiție în procesul legării acestor neurotoxine (Tzeng et al., 1986).

Acești factori fac enzimele PLA2 să fie instrumente atractive în biologia celulei. Ele interacționează în mod specific cu un tip particular de celule și prin urmare se pot studia efectele lor pe varietați importante de celule si țesuturi (Kini, 1997).

Purificarea enzimelor PLA2

Veninurile de șarpe sunt foarte bogate în enzime PLA2 , acestea putând reprezenta 20 până la 40% din masa totală a veninului. În procesul de purificare, însă, trebuie să ținem cont de anumite probleme ale enzimelor ți anume:

Numărul izoenzimelor, veninul de șarpe conținând forme multiple ale enzimelor PLA2.

Agregarea: interacțiunile proteină-proteină dintre moleculele PLA2 și autoagregarea acestora pot complica procedura separării și purificării.

Interacțiunea cu alte proteine ale veninului

Strategia de purificare

Deoarece fiecare enzima diferă din punct de vedere al proprietaților fizice și deoarece fiecare venin este diferit în compoziție, nu putem vorbi doar de o strategie a purificarii, în parctică fiind folosite mai multe tehnici. Totuși în general primul pas care trebuie făcut prevede folosirea cromatografiei cu ajutorul gelului de filtare.( mai ales în cazul veninului de la specii aparținatoare familiei Elipidae).

Dacă metodele cromatografice cu schimb de ioni sunt folosite ca și prim pas, concentrația marită a sării folosită în diluție face ca proteinele să-și imbunătățească interacțiunile hidrofobice dintre aceste doua grupe de proteine. Filtrarea prin gel poate fi executată cu Sephadex (G-50 sau G-75), BioGel (P-10 sau P-30), Superdex 75 sau coloane similare. În veninul de șarpe există doar cateva alte proteine care au masă moleculară similară enzimelor PLA2. De aceea filtrarea prin gel este un foarte bun prim pas de a separa aceste enzime de restul proteinelor.

Cromatografia prin schimb de ioni este un al doilea pas, logic, în purificarea izoenzimelor PLA2. În această etapă enzimele sunt separate pe baza diferențelor de sarcină. Cele mai multe izoenzime pot fi separate prin oricare dintre coloanele cu schimb cationic. Valoarea pH-ului gradienților oscilează între 6 și 8 deopotrivă cu concentrația sării, care dacă depașește 1M este mult mai potrivită pentru separarea diferitelor enzime PLA2.

În unele cazuri există si un al treilea pas, final, de inversare a fazei HPLC, care separă enzimele de proteinele contaminante pe baza diferențelor lor hidrofobice.

Testul de homogenitate

Datorită greutații moleculare similare, a punctelor izoelectrice apropiate și a secvenței identice de aminoacizi dintre izoenzime pot apare neajunsuri corelate cu gradul de puritate al preparatului. De aceea trebuie luate în considerare metode riguroase de determinare a omogenitații enzimelor PLA2. Chiar și metodele HPLC pot conduce uneori la erori astfel că se vor folosi metode mai sofisticate care includ electroforeza de capilaritate si spectofotometria de masă.

Numărul mare de plăci pe cm în cazul acestor metode, care generează o mai mare rezoluție și o mai mare senzitivitate pot ajutaîn identificarea particulelor cantaminante. Metodele spectofotometrice de masă care folosesc ionizarea în flux de electroni „electrospray ionization” sau tehnica MALDI (MALDI-TOF) pot juca un rol important în determinarea omogenitații (R. M. Kini, Snake Venom Phospholipase A2 Enzymes in Cell Biology).

Proba activitații enzimatice

Există mai multe proceduri care pot determina activitatea catalitică a enzimelor, acestea incluzand: masuratori titrimetrice, radiometrice, spectofotometrice si fluorometrice. Metodele diferă însa prin sensibilitate, utilitatea în monitorizarea continuă si folosirea în studierea hidrolizei pe substraturi naturale. Astfel, metoda radiometrică deși este cea mai sensibilă nu este utilizată pentru monitorizare continuă și nici pentru substarturile naturale. Metodele titrimetrice care folosesc valorii pH-metrice sunt mai puțin sensibile dar sunt susceptibile în a fi utilizate în monitorizare continuă sau pentru substraturi naturale. Metodele fluorometrice par a fi cele mai bune în ceea ce privește sensibilitatea și susceptibilitatea monitorizarii continue. Totuși în aceste metode sunt folosite substraturi modificate și astfel nu sunt folosite pentru studiul hidrolizei fosfolipidelor naturale (Reynolds et al., 1991; Hendrikson, 1994).

Recent o nouă sondă fluorescentă a fost descoperită. Aceasta poate determina concentrția monomerică a acizilor grași în fază apoasă precum schimburile ADIFAB de la 432 la 505 nm legând un acid gras. Proporția de 505 si 432 nm fluorescența dă o masură directa a fracțiunii legate de ADIFAB. Concentrațiile fără acid gras sunt calculate basându-se pe raport și masurându-se constantele de legare ale acizilor grași. Richieri si Kleinfeld (1995) au dezvoltat o metodă pentru masurarea continuă a activitații enzimelor PLA 2. Această metodă poate fi folosită pentru studierea hidrolizei fosfolipidelor naturale.

Biologia celulei si enzimele PLA2

Enzimele PLA2 pot fi folosite ca instrumente de cercetare în biologia celulară. Cu toate că specificitatea enzimelor PLA2 spre un tip particular de celula sau organ a fost bine documentată, acest grup de proteine nu a fost folosit ca și sondă precum alte toxine. Mai multe efecte farmacologice ale enzimelor PLA2 s-a crezut a fi datorate nonspecificitații și distrugerii membranelor plasmatice. Aceasta este datorată activitații fosfolipolitice inerente și specificitatea lor se afla în raport cu fosfolipide sau domenii fosfolipidice specifice. Enzimele PLA2 se leagă de diferite tipuri celulare datorită afinitații lor ridicate pentru proteinele țintă aflate pe suprafața celulelor. Legătura dintre PLA2 și proteina țintă se afla la un nivel nanomolar scăzut, pe cănd legatura dintre PLA2 și fosfolipide se află în nivelul micromolar înalt.

Identificarea proteinelor țintă

Motivul pentru care se dorește identificarea enzimelor țintă pentru enzimele PLA2 servește urmatoarelor scopuri:

Pentru clarificarea rolului fiziologic al proteinei țintă și descrierea susceptibilitații pentru o celulă specifică.

Ne ajută la înțelegerea mecanismelor efectelor farmaceutice (farmacochinetice) și toxice ale enzimelor.

Metode de identificare a proteinelor țintă

Deși se folosesc diferite metode pentru a identifica celule ținta urmatoarea abordare este una des folosită.

Primul pas care trebuie făcut când se dorește identificarea unei proteine țintă este acela de a studia legaturile specifice ale enzimelor PLA2 cu celulele si țesuturile (Lambeau et al., 1997). Precauții: Trebuie însă avut în vedere că Enzima PLA2 marcată radioactiv trebuie să aibă un potențial farmacologic similar celei nemarcate. Această modificare este importantă dacă marcarea radioactivă apare pe sit-ul farmacologic.

Enzimele PLA2 sunt nevoite să adiționeze pe suprafața celulelor. De aceea este critică evitarea folosirii proteinazelor non specifice în timpul pregatirii celulelor. De exemplu, un tratatment cu colagen în locul tripsinizarii poate fi mult mai folositor pentru recolatarea celulelor din cultură.

Studiile de „cross linking” a enzimelor PLA2 marcate radioactiv către proteinele țintă sunt folosite în al doilea stagiu pentru a se identifica marimea precum și specificitatea legaturilor. Aceasta se poate realiza cu ajutorul glutaraldehidei sau cu agenți „cross linking” bifuncționali.

În unele cazuri se mai pot folosi și tehnicile de fotoafinitate-etichetare. În cadrul acestei metode rezultatele se pot modifica drastic depinzând de poziția etichetei pentru că „cross linkingul” apare cu cel mai apropiat grup radioactiv. Astfel, este posibil să apară un „cross link” cu două proteine diferite având grupul fotolabil în diferite locații ale moleculei. Ar trebui notat faptul că în unele cazuri activitatea enzimatică inerentă a PLA2 poate compromite legatura. De aici este recomandat să se execute studiile de legatură în condiții catalitice inactive. Izolarea și urmatoarele strategii de caracterizare depind de natura proteinei țintă.

Enzimele PLA2 și agregarea trombocitelor

Enzimele PLA2 din diferite tipuri de venin de șarpe afectează agregarea trombocitelor: un grup inițiază agregarea, un altul inhibă agregarea și un alt grup realizează atât inițierea cât și inhibiția agregării (Kini si Evans, 1997). Aceste efecte ale enzimelor sunt depenndente în unele cazuri de activitatea enzimatică dar în unele cazuri este independentă de activitatea fosfolipolitică. Aceste enzime inhibă agregarea prin mai multe mecanisme diferite

(Kini et al.,1997) și cel mai probabil ele interacționează cu membranele proteinelor acceprtoare. Nici o proteină acceptoare de trombocite nu a fost încă identificată și detaliile evenimentelor moleculare sunt sumare. Aceste enzime ne ajuta sa ințelegem evenimentele celulare în tromboză și hemostază.

Polipeptide si proteine active in procesul de coagulare

Se cunoaște că veninurile de șarpe conțin un număr de factori care afectează coagularea sângelui. S-a descoperit că aceste veninuri au efecte care potențează asupra cuagularii prin mecanisme pro- și anticuagulante. ( Kornalik, 1985, 1990; Stocker, 1990; Markland, 1991; Siigur si Siigur, 1992)

Studiile asupra procesului de cuagulare a sângelui folosind componente din veninul de șarpe sunt importante nu numai pentru înțelegerea mecanismului de cuagulare a sângelui ci și pentru dezvoltarea unor noi agenți pentru tratamentul bolilor trombotice.

Enzimele convertoare de fibrinogen. Conversia fibrinogenului la fibrina are loc prin eliberarea fibrinopeptidelor A și B din nodul disulfitic N terminal al fibrinogenului. Monomerele de fibrinogen rezultate se agregă pentru a forma un cheag ferm de fibrină(Stocker, 1980, pt prima data):

N(AαBβy)2 2nA + 2nB + n(αβy)2 (αβy)2n

Un asemenea comportament este specific pentru trombin și o enzima extrasă de la Bitis gabonica numită gabonasă. Aceasta enzima izolată de catre Pirkle et al., 1986, este o glicoproteină cu un singur lanț și cu un Mr de 30,600 și pI de 5.3. este o serin proteinază și TAME este cel mai bun substrat sintetic pentru gabonază.

Enzimele „thrombin like” cu specificitate diferită au fost izolate din veninul de Cerastes : cerastobin de la C. Vipera ( Farid si Tu, 1989) și proteinaza RP34 de la C.cerastes (Laraba-Djebari et al., 1992). Proteinaza RP34 pierde niște fibrinopeptide de tip A formând un cheag slab:

N(AαBβy)2 2nA + n(αBβy)2 (αBβy)2n

Cerastobin este o proteină cu un singur lanț cu Mr egal cu 38,000, 348 resturi de acizi, pI 7.7 și fără carbohidrați (Farid si Tu, 1989). Are o specificitate de substrat foarte largă, hidrolizând fibrinogenul, monomerii de fibrină, factorul X, antitrombina III și unii esteri eliberând bradikinină din bradikinogen și cauzaâd contracții uterine. În plus cerastobinul are activitate agregatorie a trombocitelor.

Proteinaza RP34 are Mr 97,000 neredusă sau 48,500 redusă în SDS PAGE. pI 3,75. Din același venin s-a izolat o alta enzimă „thrombin like” numită afaacitynă. Are Mr 40,000 în formă neredusă și produce 3 benzi distincte sub condiții reducatoare cu Mr de 43,000(α), 35,500(β) și 10,200(y). Afaacitina are o largă specificitate de substrat scinzând caseina, fibrinogenul, esterii de arginine și amidele ( Laraba-Djebari, 1995).

Capatul N terminal al gabonasei, cerastobin, proteinaza RP34 și lanțurile afaacitin α și β sunt înalt omoloage.

Activarea protrombinului prin enzime din veninul de viperidae

Protrombinul este unic printre proteazele de cuagulare pentru că dupa activare alte protease rămân legate de suprafața fosfolipidei, întrucât trombina activă este eliberată și este capabilă să atingă toate substraturile sale în mediu (Kornalik, 1985)

În cadrul cuagularii sângelui, trombinul este format din protrombin de așa numitul complex protrombinaza, constând în activarea factorilor X si V, a fosfolipidelor, și a ionului de Ca2+. Protrombina este activată de asemenea și de niște componente ale veninului de șarpe (Rosing si Tans, 1992). Un component activ găsit în veninul de Echis carinatus -ecarin- a fost pentru prima dată parțial purificat de catre Schieck et al., 1972, și mai tarziu izolat și caracterizat de alți cercetători. Potrivit Rosing și Tans ecarin aparține primului grup de activatori de protrombine care nu necesită ionii metalici, fosfolipide sau factorul Va. Acești activatori sunt capabili doar de a hidroliza legatura Arg 322- Ile 323. Produsul activarii protrombinului de catre ecarin este meizotrombinul.

În unele cazuri în incubarea prelungită va rezulta formarea de trombin probabil prin ruperea autocatalitică a legaturii 2 prin meizotrombin (Rhee et al., 1982).

Ecarina este o glicoproteina cu un singur lanț cu o greutate moleculară de 55,000-63,000 si pI 4.5. conține 16,6% carbohidrați. Are o specificitate de substrat foarte restransă: nu activeaza factorul X sau IX, plasminogenul, tripsinogenul. Nu are nici un efect asupra caseinei, argininei, lisinei sau amodelor. Activarea protrombinului poate fi monitorizată cu peptide cromogenige care elibereaza pNA proporțional cu cantitatea trombinului derivat, generat. Ecarina este relativ instabilă în medii prea acide sau prea bazice. Își pierde activitatea prin încalzire 10 minute la 600C sau datorită metaloproteinazelor și inhibitorilor de tiol (Morita si Iwanaga, 1987).

In 1995 s-a publicat întreaga secvența de aminoacizi a ecarinului, dedusă din secvența de nucleotide a unui ADNc, izolat prin scanarea ADNc a unei glande veninoase de la Echis carinatus. Secvența de ADNc cu 2379 baze azotate codifică o ramă de citire de 616 aminoacizi. Ecarina este tradusă ca și proteina precursor care ar putea fi prelucrată postranslațional. Proteina matură prelucrată conține 426 resturi de aminoacizi, aratând cea mai puternică similaritate de secvența cu cea a lanțului greu a activatorului factorului X din veninul speciei Vipera russeli (64% identice) ( Nishida et al., 1995).

O enzima similară ecarinului -ecamulin- a fost izolată din veninul de E. multisquamatus din Asia Centrala (Solovyov,1996). Enzima dă o dublă lovitură cu Mr= 67,000 si 27,000 în SDS PAGE în condiții nereducatoare și produce 3 benzi distincte în prezența DTT sau 2 mercaptoetanol, cu Mr= 67,000, 14,000 și 13,000. pI al ecamulinului oscilează între valoriile pH-ului cuprinse între 4.3 si 4.5, nu hidrolizează esterii sau amidele argininei cu excepția substratului cromogenic pentru calicreină S 2302 și S 2266. Este o enzimă Zn dependentă. Activitatea enzimatică este inhibată de EDTA și DDT dar nu și de DFP sau PMSF. Procesul de activare al protrombinului este identic cu cel al ecarinului și nu cere Ca2+, fosfolipide sau factorul V( Solovyov, 1996).

Recent, un nou activator de protrombină cu un mecanism catalitic unic a fost decoperit în veninul de la E carinatus –carinactivaza (CA 1) (Yamada et al., 1996). În SDS PAGE au fost obținute 2 benzi sub condiții nereducatoare și 3 benzi în condiții reducatoare. Secvența capătului N-terminal al lanțului de 60-62 kDa este înalt omologă cu ecarina și aceasta subunitate are activitate metaloproteinazică. Cele 2 lanțuri ale subunității de 25 kDa au fost unite și au fost mai degraba similare cu cele ale proteinei de legare a factorilor X și IX (Atoda et al., 1991).

Specificitatea CA 1 este mai strictă decât cea a ecarinului. Diferența majoră dintre CA1 și ecarin este aceea că CA1 necesită ioni de Ca2+ pentru activarea protrombinului. Ca rezultat al mai multor experimente, autorii au ajuns la concluzia că structura unică a CA1 explică mecanismul unic al activarii protrombinului; subunitatea de 25,000 Da recunoaste pentru prima dată domeniul N terminal Gla al protrombinului într-o forma care este dependenta de Ca2+ și apoi subunitatea de 62,000 de Da rupe legatura dintre lanțurile A și B.( Yamada et al., 1996)

În plus, un activator al protrombinului de la E. carinatus, un procuagulant cu Mr 125,000 și pI 4,3, a fost purificat din veninul speciei Vipera aspis aspis care ar putea participa la activarea protrombinului.( Komori et al., 1993).

Enzima are o slabă activitate de hidroliză a dimetil caseinei și nici un fel de activitate proteolitică. Nu taie esterii și amidele argininei. Incubarea procuagulantului cu protrombina în prezența factorului V, a fosfolipidelor și a Ca2+ scade timpul de cuagulare al fibrinogenului și în același timp crește activitatea esterazelor, lucru care ar putea fi explicat prin generarea de thrombin din protrombin.

Absența factorului V, a fosfolipidelor și a Ca scade drastic activitatea esterolitică a reacției amestecului. Aceasta ar putea fi dovada indirectă a activarii protrombinului cu ajutorul procuagulantului V aspis. În timp ce procesul este inhibat de DFP (diisopropil fluorofosfat), enzima este o serin proteinază și astfel procuagulantul din veninul speciei Vipera aspis aspis poate reacționa cu protrombinul ca și factor Xa din plasmă.

Activatorul factorului V

Factorul V este o proteină cofactor care accelerează conversia protrombinului în trombin activând factorul X. în plasmă activarea acestuia a fost arătat că apare printr-o proteoliză discretă a trombinului de a da o subunitate multiplă a proteinei (Kisiel, 1991). Factorul V poate fi deasemenea activat de un component al veninului provenit de la specia Vipera russeli. RVV-V (serin proteinaza) este o glicoproteină cu Mr de 28,000 -29,000 conținând 6 % carbohidrați. Are o slabă activitate a amidazelor dar hidrolizeaza pe TAME (N-p-Tosyl-L-Arginine methyl ester hydrochloride).

Hidroliza este inhibată de DFP indicând natura serin proteinaza a RVV-V. Cu toate că RVV-V apare omogen în SDS-PAGE, Tokunaga et al., 1988 au încadrat-o în trei fracțiuni: RVV-Vα, RVV-Vβ, RVV-Vy prin contrast de fază HPLC cu coloane Cosmosil SC4 300. Cei trei izomeri au fost prezenți în preparatul final în proporție de 2:1:6. Secvențele complete de aminoacizi a RVV-Vα și RVV-Vy au fost determinate. Ambele enzime conțin 236 resturi aminiacizi cu 6 punți disulfiddice și diferă doar prin 6 resturi de aminoacizi în moleculă. Secvențele N terminale sunt omologe cu alte serin proteinase din veninul de vipere, precum gabonaza (Pirkle et al., 1986) si cerastobinu ( Farid si Tu, 1989).

Cu toate că activitatea de calataliză a trombinului asupra factorului V apare în trei clivaje ale moleculei factorului V, RVV-V clivează numai o legatură peptidică în factorul V (Kisiel, 1991). Aceiași specificitate ar putea fi caracteristică activatorului factorului V parțial purificat din veninul de V. aspis.( Boffa si Boffa, 1974).

Activatorii factorului X

Factorul X este o glicoproteină care joacă un rol important în cuagularea sângelui. Este activat prin 2 mecanisme fiziologice numite sistem intrinsec și extrinsic. Factorul Xα este o serin proteinază care pe rând activează protrombinul în prezența factorului V, ionii de calciu și fosfolipidele. Factorul X poate fi deasemenea activat de componente ale unor veninuri de șarpe, cel mai cunoscut fiind RVV-X – activatorul factorului X din veninul de V. russeli.

Conversia factorului X la Xα prin factorul IXα și factorul VIII’ precum și prin proteinazele din veninul speciei Vipera russeli este dată de clivajul legaturii peptidice dintre Arg-51 și Ile 52, dând naștere unei noi isoleucine N terminal și o scadere a greutații moleculare a zimogenului de la 55,100 la 45,300(Xaα). În al doilea pas legatura peptidică dintre Arg-290 si Gly-291 este clivată de factorul Xaα pentru a produce factorul Xaβ. Clivarea celei de-a doua legaturi nu alterează activitatea specifică a factorului Xa (Fujikawa et al., 1975).

RVV-X este izolat în cateva laboratoare diferite folosind filtrarea prin gel și cromatografia prin schimb de ioni, imunoafinitate cu anticorpi monoclonali sau cromatografia de afinitate în coloane Sepharose-factor X echilibrate cu ioni de lantanide (Furies si Furie, 1975). Proprietațile fizico-chimice ale enzimelor izolate sunt conflictuale.

Takeya et al. (1992) au determinat structura primara a lantului greu al RVV-X și a unuia dintre lanțurile ușoare (LC1). Aceste lanțuri au fost separate după reducere și după S piridiletilare cu HPLC în contrast de fază. Lanțul greu conține 427 resturi aminoacizi cu 4 lanțuri asparagine linked sugar în pozițiile 28, 69, 163 și 183. Lanțul ușor LC1 conține 123 resturi aminoacizi cu un lanț asparagine linked sugarin poziția 24. Lanțul greu conține metaloproteinaze, precum dizintegrinele și domenii bogate în cisteină. Lanțul ușor arată secvențe omologe cu cele găsite în așa numita lectină de tip C. (Takeya et al., 1992).

RVV-X inhibă puternic colagenul și ADP induce agregarea trombocitelor într-un mod dependent de doză, probabil datorită domenilor sale dezintegrine. Activitatea inhibitorilor agregarii trombocitelor ar putea fi datorată activitații proteolitice sau activitații lectin like, din moment ce întreg RVV_X a fost folosit pentru acel experiment. ( Takeya et al., 1992).

Gowda et al.(1994) au obținut constant prin SDS PAGE, în condiții nonreducatoare, o valoare a Mr egala cu 93,000 (Da) pentru RVV-X și 78,000 Da pentru molecula complet deglicozilată. Ei au observant deasemenea că cele 2 lanțuri ușoare sunt prezente in proporții egale în SDS PAGE la moleculele reduse. Mr: 62,000, lanțul greu (lanțul α); 21,000, lanțul β; 18,000, lanțul y. Dupa deglicozilarea formei reduse a Mr au fost: 48,000 (kDa) lanțul alfa, 17,000 lanțul beta , 14,000 lanțul gama.

Microsecvența capatului N terminal a lanțului α corespunde cu secvența, exceptând Ala în al treilea ciclu (Takeya et al.,1992). Secvența de aminoacizi a lanțului y se pare că este identică cu cea raportată pentru LC1. Secvența de aminoacizi a capatului NH2 terminal al lanțului β nu a fost prezentată. Ca și concluzie, ei au descoperit că RVV-X este o glicoproteină de 92,880 kDa și conține 3 lanțuri polipeptidice glicozilate legate disulfidic și toate cele 3 lanțuri polipeptidice ale RVV_X conțin oligozaharide legate de asparagine. Lanțul α contine 4 oligozaharide, iar lanțurile β si y conțin fiecare câte o oligozaharidă.

Gowda et al.(1996) au investigat rolul carbohidraților în structura și activitatea funcțională a RVV-X și au descoperit că compușii carbohidrat periferici nu sunt implicați în interacțiunea cu factorul X. Îndepărtarea tuturor lanțurilor oligozaharidice cu N glicanaza a cauzat aproape o pierdere totală a abilitaților RVV-X de a activa factorul X spre factorul Xa. Au survenit deasemenea modificări semnificative în structura secundară a proteinei. Activatoare ale enzimei factorului X au fost deasemenea izolate și din alte veninuri de șarpe. Activatorul factorului X de la vipera Aspis aspis a fost purificat de către Komory et al.(1992) a avut un Mr de 75,000 (neredus in SDS PAGE) și pI 4,6. Proteina redusă a dat două benzi în raport de 2:3, cu Mr 16,000 și 14,000 în SDS PAGE. Secvența terminală amino a derivaților activatorului, reduși și piridiletilați, a fost diferită de cea a RVV-X. Este interesant faptul că toți derivații posedau aceiați secvența, asa că activatorul aspis este suspectat că este alcătuit din mai multe lanțuri peptidice cu Mr 14,000 și 16,000. Situl de clivaj al factorului X de către activatorul aspis nu a fost definit (Komori et al., 1990).

Un activator al factorului X a fost gasit în veninul speciei Vipera cerastes cerastes, de către Franssen et al.(1983). Acest activator seamănă cu RVV X atăt în cadrul structurii cât și a proprietaților catalitice. Proteina neredusă dă un dublet cu Mr 76,000 (Da) și 67,000 (Da) în SDS PAGE. Forma redusă conține un lanț greu cu Mr 58,000 (Da) și doua lanțuri ușoare cu Mr 17,700 și 15,000(Da). Activatorul se pare că cliveaza aceiași legatura a factorului X care este clivată de factorul IXa. Activarea factorului x este puternic stimulată de Ca2+( Franssen et al. 1993).

Un alt activator al factorului X cu greutate moleculară mică a fost purificat din veninul speciei Vipera cerastes cerastes (vipera de nisip în Sahara) de către Farid et al. în 1993. Are Mr egala cu 12,500 (Da) în SDS PAGE în ambele tipuri de condiții și pI 4,4. Activarea factorului X a fost studiată în SDS PAGE folosind un substrat chromogenic pentru Xa( S2222, Bz-Ile-Gly-Arg pNAHCl). Efectele activării au fost inhibate de către PMSF (phenilmethanesulfonylfluoride), sugerând că activatorul din veninul speciei Vipera cerastes cerastes este o serin proteinază. Observațiile au indicat faptul că activatorul este capabil să convertească factorul X la factorul Xa sau la un intermediar avănd aceleași activitați amidolitice și coagulante (Farid et al., 1993).

În 1995 un activator cu greutate moleculară medie a fost izolat din veninul speciei Vipera berus berus (Samel si Siigur, 1995). Această enzimă avea Mr 38,000 (Da) atât în formă redusă cât și neredusă în SDS PAGE. pI se afla în intervalul de pH 3,5- 4,5. După tratamentul cu neuroamidasă s-a obținut o singură bandă cu pI 4,5. Activatorul a generat formarea factorului Xa în prezența ionilor de calciu. A fost inactiv pe substraturi sintetice, pe caseină, protrombină și fibrinogen. Lanțul B de insulină a fost ușor clivat în pozițiile: Ala14,- Leu15 si Tyr16 – Leu17, și acest proces a fost inhibat prin EDTA. Situl de clivaj în factorul X nu este înca detrminat.

Veninul de Viperidae conține o gamă largă de enzime coagulante. Unele dintre ele au fost mai mult, altele mai puțin studiate dar efectul final al tuturor acestor enzime este generarea de fibrin în sângele victimei ducând la activarea factorilor V, X; a protrombinului sau convertirea fibrinogenului.

Actiunea anticoagulantului: Enzimele fibrin(ogen)olitice

Enzimele fibri(ogen)olitice au fost izolate din veninurile a numeroase speci de șerpi incluzând deasemenea membrii ai genului Viperidae. Proteinazele din veninul de șarpe care clivează legaturile peptidice din fibrinogen pot fi divizate în trei grupe (Kornalik, 1990).

Enzimele thrombin like (protease trombice): proteaze coagulante de fibrinogen. Sunt proteaze fibrinogen-coagulante. Aceste enzime sunt serin proteinase care la fel ca si trombinul catalizează eliberarea fibrinopeptidelor A si B din fibrinogen la punctul NDS al lanturior Aα si Bβ ale moleculei. Proteinazele thrombin like se comporta in vitro ca și coagulanți, convertind fibrinogenul în fibrină.

Enzimele fibrin(ogen)olitice. Aceste enzime taie fragmente de la capetele C terminale ale lanțurilor de fibrinogen α, β si y adiționându-le moleculei de trombină trombinului. α(β) fibrinogenazele sunt metaloproteinaze ce cliveaza mai ales lanțurile α de fibrinogen. β fibrinogenazele sunt mai degrabă serin proteinaze termostabile. Fibrinogenazele care s-au gasit până acum sunt metaloproteinaze.

Enzimele activatoare de plasminogen și care acționeaza indirect ca o enzimă fibrinolitică. Enzimele activatoare de plasminogen nu au fost încă separate din veninul de Viperidae.

Deși există numeroase rapoarte privind activitatea acestor enzime, există totuși puține investigații asupra izolării și caracterizării detaliate a acestor enzime. Activitatea fibrinolitică a fost detectată în veninurile speciilor Vipera russelli, Vipera aspis, Bitis gabonica, Cerastes cerastes, Vipera lebetina și Echis carinatus.

O astfel de enzimă a fost purificată din veninul speciei Vipera aspis. Enzima hidrolizează caseina, fibrinogenul și fibrinul uman și bovin. A fost inhibat de EDTA dar nu și de DFP (Boffa and Boffa, 1974). Viljoen și coechipierii (1979) au fracționat veninul de Bitis gabonica (genul Viperidae) și au descoperit fracțiunea care posedă activitate fibrinolitică. Totuși Bajawa et al. (1982) nu au reușit să detecteze activitate fibrinolitică a veninului de Bitis gabonica.

Enzima fibrin(ogen)olitică, cerastaza F4, a fost izolată din veninul speciei Cerastes cerastes. Cerastaza este o proteină cu un singur lanț cu o greutate moleculară de 22,500 (Da) și hidrolizează lanțul de fibrinogen Aα urmat de hidroliza lanțului Bβ; deasemenea degradează cele trei lanțuri ale fibrinului în moduri diferite (Daoud et al., 1986). Cerastaza F4 este o metaloenzimă care conține un ion de Ca2+ și un ion de Zn2+ per molecula proteină. Este complet inhibată de EDTA și EGTA (Daoud et al., 1987)

Siigur și colaboratorii în 1991 izolează 2 fibrinogenaze din veninul speciei Vipera lebetina. O fibrinogenază cu greutate moleculară de 52,500 (Da) și punct isoelectric cu pH aproximativ 3, este inactivată de DFP și PMSF dar nu și de EDTA, sugerând că această enzimă este o serin proteinază. Activitatea enzimei este îndreptată în mod preferențial către lanțurile Bβ ale moleculei de fibrinogen dar la incubare prelungită cu fibrinogen a existat o digestie partială și a lanțurilor Aα. Bβ fibrogenaza este o glicoproteină care conține 23% zaharide neutre. Hidrolizează BAEE (N-Benzoyl-L-arginine ethyl ester hydrocloride) cu Km 7.7 × 10-5M, kcat 43,8 sec-1, TAME cu Km 3,6 ×10-4M si kcat 39,8 sec-1 si BAPNA (α-N-Benzoyl-L-arginine-p-nitroanilide) cu Km 1,8 × 10-4 si kcat 0,94 sec-1. Esterii lizinei nu sunt hidrolizati. Enzima are slabă activitate caseinolitică și hidrolizează glucagonul la pozițiile: Lys12- Tyr13, Arg17- Arg18, si Arg18- Ala19( Siigur et al., 1991).

Fibrinogenaza Bβ din veninul speciei Vipera lebetina a arătat o extremă stabilitate la caldură: încalzită 20 min la 950C nu i-a fost afectată activitatea catalitică. Cealaltă enzimă fibrinogenolitică izolată din veninul speciei Vipera lebetina (numită lebetază) este o metaloproteinază care este inhibată de EDTA și DDT și are o greutate moleculară de aproximativ 23,700 (Da). Lebetaza hidrolizează ușor lanțul Aα și mult mai încet lanțurile Bβ de fibrinogen. În fibrin sunt atacate aceleași lanțuri, astfel că enzima este o AαBβ fibrinogenaza. Activitatea fibrinolitică a lebetazei este directă, fără activarea plasminogenului. Lebetaza deasemenea hidrolizeaza cazeina, asocazeina și oxidează lanțurile B de insulină în pozitiile Ala14- Leu15 și Tyr16- Leu17. Conține mai multe izoforme la un pH ce oscilează între 4,6- 5,4, toate prezentând activitate fibrinolitică (Siigur et Siigur, 1991).

Proprietațile imunologice ale lebetazei au fost investigate de către Siigur et al., 1996. Anticorpii policlonali împotriva a două fracțiuni ale enzimei fibrinolitice în veninul speciei Vipera lebetina, au fost produși și purificați prin cromatografie de afinitate a proteinei A. Anticorpii au reacționat numai cu enzima fibrinolitică fapt demonstrat prin Western imunoblotting. Probele imunologice ELISA și Western immunoblotting au relevant faptul că 11 veninuri de șarpe, incluzând specii de Viperidae și Crotalidae dar nu și Elipidae, reacționează încrucișat cu anticorpii lebetazei la grade diferite. Greutatea moleculară a componenților care reacționează arată că cel mai probabil anticorpii produc reacții cu compușii fibrinogenici sau fibrinolitici din alte veninuri de șarpe.

Recent secvența completă de aminoacizi a lebetazei a fost dedusă din secvența de nucleotide a unei clone ADN complementar. Secvența AND-ului complemantar cu 2011 baze azotate codifica o secvență de 478 aminiacizi care include un segment semnal constituit dintr-o secvență de 18 aminoacizi plus un segment zimogen propeptid constituit din 175 de aminoacizi, o proteină matură de 204 aminoacizi, un spacer de 18 aminoacizi si un segment de dezintegrare proteică de 63 aminoacizi. În segmentul de dezintegrare al proteinei, secvența RGD este înlocuită de VGD. Proteina matură lebetasa izolată din veninul brut are greutate moleculară de aproximativ 23,700 (Da) astfel și lebetasa la fel ca și alte metaloproteinaze din veninurile de șarpe este tradusă ca și proteină precursor care poate fi prelucrată posttranslațional. Domeniul metaloproteinazei are o secvență tipică zinc (HEXXHXXGXXH). O fibrinogenază (Mr 26,000) a fost izolată din veninul speciei Vipera lebetina care este diferită de lebetasă (Gasmi et al., 1991). Aceasta hidrolizează mai degrabă lanțurile Bβ de fibrinogen și fibrin.

O fibrinogenolisină (α fibrinogenaza) a fost izolată de la specia de viperid Echis carinatus folosind cromatografia cu interacțiune hidrofobică. După purificare prin schimb de ioni și contrast de fază HPLC, au fost descoperite 14 resturi aminoacizi din capatul său N terminal (Tseng et al., 1989). Secvența n terminală a fibrinogenolisinei din veninul speciei Echis carinatus este similară cu cea a lebetasei, doar că în cazul lebetazei capătul N terminal este blocat.

Factorul de coagulare IX, factor X-proteine de legatură

Un nou factor de coagulare, factorul IX, factor X- proteină de lagătură (ECLV IX, X bp) a fost izolat și purificat din veninul speciei Echis carinatus leucogaster. ECLV IX, Xpb leagă factorul IX și X într-o manieră dependentă de Ca2+ și este lipsită de inhibitorii de thrombină și de activitatea de agregare a trombocitelor. Prelungește timpul de coagulare in vivo inhibând reversibil activarea protrombinului. Poate fi un agent anticoagulant folositor pentru uz farmaceutic. O legare directă a IX, Xpb de factorul IX și X a putut fi deasemenea detectată prin far-Western blotting și rezultatele experimentului au scos în evidență mecanismul lectin like al ECLV IX,Xbp. Secvențe complete a aminoacizilor și modelul disulfidic al ECVL IX, X bp a fost dedus prin hidroliza enzimatică și secvențiere automată a proteinei S- piridilentilata. Proteina din venin este un heterodimer cu o subunitate de 131 resturi aminoacizi și o alta de 125. Ambele unitați sunt omologe una alteia și altor proteine din veninul de șarpe, de tip C din familia lectinelor.

Acțiunea componentelor veninului asupra trombocitelor

Componentele veninului de șarpe afectează funcția trombocitelor în moduri diferite. Unele proteine din venin induc reacția de eliberare și agregare a trombocitelor în timp ce altele inhibă aceste activitați. Cei mai eficienți constituenți anti-trombocitari sunt Arg-Gly-Asp (RGD) ce conțin secvențe polipeptidice ce au fost identificate ca antagonisti ai receptorilor specifici fibrinogenului și care au fost denumite dezintegrine . Dizintegrinele sunt o familie a RGD care conține proteine nonenzimatice izolate din veninul de crotalide și viperide, care inhibă interacțiunea mediată de integrine: celulă – celulă, celulă- matrice (Gould et al., 1990; Dennis et al., 1990; Kini si Evans, 1992). Dezintegrinele au fost clasificate în trei familii pe baza lungimii lanțului lor polipeptidic (Gould et al., 1990):

dezintegrinele cu lanț scurt, 47-51 resturi aminoacizi și 4 punți disulfitice;

dezintegrinele cu lanț mediu, 68-75 resturi aminoacizi și 6 punți disulfitice;

dezintegrinele cu lanț lung, 83-84 resturi de aminoacizi și 7 punți disulfitice.

Toate dezintegrinele conțin secvența tripeptidă Arg-Gly-Asp(RGD) sau Lys-Gly-Asp(KGD) comună liganzilor pentru receptorii GP IIb, IIIa. RGD este implicat în legarea fibrinogenului, vitronectinei, fibronectinei, factorului von Willebrand și a trombospondinei de receptorii lor. În toate dizintegrinele pentru care structurile tridimensionale au fost determinate, secvența RGD este prezentată la receptor la finalul unei structuri în porțiunea carboxi-terminală a dezintegrinei.

Porțiunea amino- terminală a dezintegrinei ar putea să nu determine activitatea inhibitorilor de agregare a trombocitelor. Înlăturarea unui segment din această regiune nu afecteaza în mod semnificativ activitatea inhibitorilor de integrină. Astfel, în ciuda diferențelor de marime, atât echistatina cât și carinatina din veninul speciei de viperid Echis carinatus arată o capacitate inhibitoare similară (Kini si Evans, 1992).

Studiile in vitro au arătat că dezintegrinele sunt potențiali inhibitori ai legării fibrinogenului la rceptori săi pe trombocite. Această activitate inhibitoare a dezintegrinelor este de aproximativ 1000-30000 mai puternică decât cea tetrapeptidelor Arg-Gly-Asp-Ser.

Echistatina este o proteină cu 49 resturi. Echistatina α1 care inhibă agregarea trombocitelor a fost purificată din veninul speciei Echis carinatus. Echistatina este o polipeptidă cu un singur lanț, cu o greutate moleculară de 5400 (Da) și un punct izolelectric la un pH de 8,3, conține 8 cisteine. Echistatina conține secvența arginine-glicina-acid aspartic (RGD). Echistatina inhibă agregarea trombocitelor dependent de fibrinogen proces inițiat de ADP, thrombină, epineprină, colagen sau factorul de activare l trombocitelor (Dennis et al., 1990). Structura echistatinului a fost determinată prin 1H NMR, prin calcularea distanței geometrice și simulari dinamice moleculare (Atkinson et al.,1994).

Echistatina a fost cu succes produsă prin sinteza peptidelor în fază solidă (Garsky et al.,1989) și prin expresia ADN recombinant în celule care nu aparțineau mamiferelor, precum drojdiile (Jacobson et al.,1989). Met (Metionina) din poziția 28 a echistatinei native a fost înlocuită de Leu în peptida recombinată. Echistatin Leu 28 a fost identică cu cea nativă în inhibarea agregarii trombocitelor (Gan et al., 1989).

Doua noi variante a dezintegrinelor cu lanț scurt au fost purificate din veninul de Echis carinatus leakeyi fiind numite ecistatin β si y. S-a descoperit ca proteinele sunt similare în proporție de 85% cu echistatina-α în ceea ce privește secvența de aminoacizi. Toate conțin secvențe de recunoaștere adezive Arg-Gly-Asp(RGD) dar inhibă agregarea trombocitelor de om și alte mamifere cu putere diferită (Chen et al.,1995). Analize structurale recente asupra unui analog biologic activ al echistatinei (desb46-49, Ala 8,37 echistatina) cu trei legaturi disulfidice au fost efectuate cu ajutorul graficii computerizate si a tehnicii 2D-NMR. (Chuang et al., 1996).

O mutantă a echistatinei a fost construită prin substituția CRGDC cu ARGDD în regiunea Arg-Gly-Asp. Proteina mutantă inhib mai puternic legarea fibrinogenului uman de receptorii săi, integrin αIIbβ3. Cele doua reziduri Cis noi sunt legate între ele în cazul mutantei (Yamada si Kidera, 1996). Aceste rezulate indică faptul că este posibil să se crească afinitatea spre integrine prin introducerea unei constrângeri conformaționale într-o peptidă cu regiune RGD.

Multisquamatina. Un inhibitor de agregare a trombocitelor, multisquamatina (Mr 5700) a fost izolat și purificat din veninul speciei Echis multisquamatus. Multisquamatina inhibă ADP indus uman, canin și agregarea trombocitelor la iepure, în condițiile utilizării unor trombocite bogate în plasmă. Într-o probă de legatură competitivă folosind 1251-7E3 (anticorp monoclonal pentru GPIIb, IIIa care inhibă agregarea trombocitelor) multisquamatina a demosntrat legături specifice cu GPIIb, IIIa la trombocitele de om și carnasiere. IC50 pentru înlocuirea legaturii 7E3 a multisquamatinei la om și carnasiere, GPIIb, IIIa este de 3nM respectiv 6nM. Aceste rezultate indică faptul că multisquamatina inhibă agregarea trombocitelor prin legare de înalta afinitate de receptorul integrin GPIIb,IIIa (Trikha et al.,1994).

Gabonina. Peptidul antitrombocit, gabonin, a fost purificat din veninul speciei Bitis gabonica. Gabonina este un dimer legat disulfidic (monomer 11,000 Da, 84 resturi aminoacizi). Gabonina, dependent de doză, inhibă agregarea trombocitelor umane stimulat fiind de ADP, colagen, U46619 sau thrombina în combinație cu trombocite bogate în plasmă și trombocite în suspensie. Gabonina inhibă agregarea trombocitelor, în general, prin blocarea fibrinogenului care se leagă de receptorii săi pe trombocitele activate. (Shebuski et al.,1990).

Arietina. Mr 8,500, este o proteină care conține RDG separată din veninul speciei Bitis arietans (Huang et al., 1991).

Eristostatina (eristocopin). A fost izolată și caracterizată din veninul speciei Eristocophis mahoni. Eristocopin se aseamănă mai mult cu echistatina (Scarborough et al.,1991)

Bitistatin. Proteina inhibitoare, a fost izolată din veninul speciei Bitis arietans. Este o proteină cu un singur lanț, cu 83 resturi aminoacizi și 7 legaturi disulfidice (Shebuski et al.,1989). Bitistatin arata un înalt grad de omogenitate cu echistatina (Shebuski et al.,1990).

Cartografiind peptidul eristostatin prin digestie proteolitică s-a sugerat ca are aceiași aliniere a punților S-S ca și echistatinul. Echistatina sintetică D27W cu eristostatina cresc activitatea inhibitorilor de agregare a trombocitelor (McLane et al.,1996). Echistatina și eristostatina se aseamănă în proporție de 62% asemanare între secvențe incluzând 8 cisteine. Cu toate acestea, prezintă diferențe semnificative în ceea ce privește activitatea lor biologică. Eristostatina este cel mai puternic inhibitor al ADP (McLane et al., 1990). În final se poate trage concluzia că peptidele care conțin RGD pot fi agenți antitrombotici valoroși, cu largă aplicabilitate în farmacologie.

Noi polipeptide antiagregare a trombocitelor

Polipeptidele Lebetina 1 și Lebetina 2 au fost izolate din veninul speciei Vipera lebetina prin filtrare prin gel si cromatografie în contrast de fază. Lebetina 1 conține 13 respectiv 12 resturi aminoacizi iar Lebetina 2 38 respectiv 37 resturi de aminoacizi, fiecare cu cate o legatura disulfidică. Analizele secvenței au relevant faptul că nici secvența RGD nici secvențele altor polipeptide nu sunt omologe cu aceasta. Secvențele Lebetin 1 au fost similare cu capatul N terminal al polipeptidului Lebetin 2. Lebetinele inhibă agregarea trombocitelor indusă de thrombină, colagen si PAF. Ambele grupe afisează activitate antitrombică puternică in vitro și au fost capabile să prevină in vivo trombocitopenia indusă cu colagen, la șobolani (Barbouche et al.,1996).

Pentru că aceste peptide duc lipsa oricarei secvențe active a antiagregarii trombocitelor ar putea totuși ajuta la conturarea mecanismelor încă necunoscute implicate în agregarea trombocitelor. Pot fi folosite ca și agenți antitrombotici.

Proteinele de legatura GPIb

Există o clasă a antigoagulanților din venin care sunt heterodimeri legați covalent de o intersubunitate a legaturii disulfidice. Aceasta include echicetina izolată din veninul speciei Echis carinatus. Echicetina este o proteină heterodimerică ce conține subunitați de 14 si 16 kDa, inhibă agregarea trombocitelor și secreția indusă de concentrația scazută de thrombină (mai putin de 0,2 U/ml) prin legarea glicoproteinelor trombocitare (Peng et al.,1993, 1995).

Peng în 1994 au demonstrat că β subunitatea echicetinei redusă și S-alchilata isi opreste activitatea sa inhibitorie pe legaturi vWF(von Wilebrand Factor), legandu-se pe GPIb desi cu mai putina putere decat acea a proteinei intacte. Caracteristicile structurale și întreaga secvența de aminoacizi a proteinei GPIb nu au fost încă elucidate.

Bitiscetina. Este o proteină modulatoare a factorului von Willebrand (vWF). Recent bitiscetina a fost purificată din veninul speciei Bitis arietans. Bitiscetina prezintă o structura heterodimerică compusă din subunitați legate disulfidic α (16 kDa) și β (13kDa) și o valoare a pI 9.1 . Inducerea aglutinării trombocitelor la bitiscentină este dependentă de vWF si GPIb, dar nu și de Ca și GPIIb,IIIa. Bitiscentina interacționează direct cu vWF și are nevoie de o conformație specifică a proteinei pentru a interacționa cu aceasta. Alte caracterizari ale biscentinei incluzând determinarea situs-ului de legare cu vWF este necesară pentru a înțelege mecanismul modulator al bitiscentinei (Hamako et al.,1996).

Partea II

Condițiile de experimentare

Temperatura reprezintă un factor biometeorologic deosebit de important în viața animalelor, acesta modificâmd sau chiar direcționând evoluția speciilor prin declanșarea mecanismeor adaptative ale acestora. Un impact mult mai important are factorul temperatura asupra speciilor poikiloterme. Aceste specii fiind lipsite de mecanismele de termoreglare, nu își pot menține temperatura organismului la valori care să permită desfașurarea normală a proceselor metabolice decât în condiții de temperatura liber admisă, adică cu posibilitatea alegerii temperaturii optime. Practic, aceste specii își controlează singure procesele metabolice din organism, prin expunere prelungită la soare, alternată cu perioade de retragere la umbră și alegerea locurilor cu temperatură optimă momentului și etapei fiziologice și metabolice în care se află individul.

Naulleau, G. și Marques, M. (1973) prin studii de biotelemetrie au demonstrat impactul deosebit al temperaturii asupra proceselor metabolice și în special asupra ratei metabolismului bazal, subliniind scăderea consumului de oxigen odata cu scăderea temperaturii mediului la diferite specii de poikiloterme, ceea ce presupune o încetinire a proceselor metabolice odată cu scăderea temperaturii. În cazul speciilor poikiloterme toate procesele metabolice sunt direct dependente de posibilitatea individului de a-și alege singur temperatura optimă desfașurării în condiții normale a unei anumite etape metabolice. La aceste specii, alimentația, digestia, reproducția, năpârlirea și chiar starea de sănătate sunt strict dependente și influențate de factorul temperatura.

În scopul derulării experimentului s-au construit o serie de terarii relativ mari ( L × 120 cm; l × 60 cm; H × 100 cm), care au permis menținerea a câte 8 – 10 indivizi\ terariu. Acestea au fost astfel amenajate încât să imite pe câtt posibil condițiile naturale ale habitatului acestor specii, fiind pardosite în prima treime cu pietriș de râu, porțiune în care s-a amplasat și vasul cu apă, iar în rest cu gazon pe care s-au amplasat și câteva bucați mai mari de piatră sub care viperele aveau condiții de refugiu. În aceste terarii viperele au fost întreținute în comun, în funcție de vârstă și sex, în perioada de refacere. Aceste terarii au fost denumite terarii comune.

Pietrele au fost amplasate spre mijlocul terariului, la distanță de pereți, deoarece s-a constatat tendința viperelor de a se înalța pe pereții terariului în tentativa evidentă de a evada. Acest comportament s-a constatat mai ales în prima lună de la capturare, dar unii indivizi au manifestat aceste tentative încă mult timp după prima lună de captivitate.

Peretele frontal al terariilor a fost construit din sticlă, iar ceilalți trei pereți din plasă de sârmă cu ochiuri de 1 mm × 1 mm, la partea superioară fiind deschise. Acest tip de terariu permite posibilitatea unei mai bune observări din față și de sus a viperelor și totodată oferea condiții favorabile de ventilație și de realizare a schimburilor de aer în terariu.

În vederea efectuării experimentelor în condiții cât mai optime, s-au construit înca trei terarii experimentale, respectând dimensiunile terariilor anterioare, respectiv L × 120 cm; l × 60 cm; H × 100 cm, care au fost împarțite cu ajutorul unor pereți interiori în opt parți. În aceste condiții fiecare terariu prezenta opt spații individuale cu dimensiunile de aproximativ 30 × 30 cm.

Pardoseala din tablă cu pereții dublii a fost dotată cu rezistențe electrice, care cu ajutorul unui termostat asigurau temperatura necesară fiecărei etape a experimentului. Pereți laterali au fost construiți din sticlă pentru a asigura condițiile unei observări facile a fiecărui individ în parte, iar cei despărțitori din placaj, evintându-se contactul vizual și eventual stresarea reciprocă a animalelor. Iluminatul natural deficitar a fost compensat cu ajutorul unui tub de neon, variația de temperatură în 24 h a fost cuprinsă între 12 – 15 0C.

Pe toată durata experimentului s-a asigurat un ritm circadian de 12 cu 12, adică 12 ore lumină, respectiv 12 ore întuneric.

După cum reiese din cele menționate anterior, în cadrul experimentului au fost utilizate două tipuri de terarii de dimensiuni identice. Primul tip de terariu necompartimentat, astfel amenajat încât să ofere condiții cât mai apropiate de cele naturale. În aceste terarii comune temperatura a variat în funcție de apropierea sau îndepărtarea de eleveuză între 14 – 28 0C în timpul zilei și 12 – 15 0 C în timpul nopții, viperele au avut posibilitatea sa își aleagă liber temperatura optimă. În acest tip de terariu au fost introduse viperele după încheierea etapei experimentale, pentru refacere. Cel de-al doilea tip, terariile experimentale, au fost compartimentate oferind condiții de menținere a temperaturii constante, în funcție de valoarea acesteia stabilită.

Material și metodă

Viperele introduse în experiment au fost capturate în sezonul activ al acestei specii. Peste 60 % din indivizii proaspăt capturați au refuzat consumul voluntar al hranei oferite la discreție.

Materialul biologic a fost recoltat pe teritoriile județelor Covasna, Harghita și Brașov. Marea majoritate au fost capturate de-a lungul pâraielor de munte în zone cu umiditate mai ridicată, cu vegetație abundentă și deasă. Foarte mulți indivizi au fost surprinși și capturați între orele 8 – 11 ale dimineții și după- amiaza după ora 18, când viperele se expuneau la soare pe bucați de stâncă, buturugă de copac, ori arbore doborât la pământ.

Foarte rar vipera a fost surprinsă și capturată în timp ce se deplasa, sau la distanțe mari de sursa de apă.

În majoritatea situațiilor vipera a încercat să se retragă la adăpostul vegetației, sau să se refugieze sub pietre sau la rădăcina unor copaci. Au fost însă cazuri în care acestea au rămas impasibile continuțnd să se expuna la soare fără a fi deranjate de apropierea oamenilor. Au fost puține cazurile în care viperele proaspăt capturate au manifestat agresivitate. Deși în mare parte au fost introduse în pungi de plastic transparente, acestea au ramas liniștite până la introducerea în terarii.

S-au format trei loturi, primul fiind format din femele adulte nereproductive, aflate în anul de repaos reproductiv de refacere, lotul al II- lea format din masculi adulți, iar lotul al III- lea din vipere subadulte.

Loturile formate din câte opt indivizi au fost astfel constituite încât greutatea individuală a acestora să fie cât mai apropiată.

Hrana oferită viperelor pe toată perioada desfașurarii experimentului a fost constituită în exclusivitate din șoareci albi de laborator crescuți și înmulțiți în biobaza proprie. Aceștia au fost cântăriți individual și oferiți în alimentația viperelor adulte astfel încât greutatea fiecărui șoarece a reprezentat aproximativ 24- 25 % din greutatea initială a viperelor care a fost de aproximativ 20 de grame. Același raport a fost respectat și în cazul lotului de vipere subadulte, lotul III, a căror greutate a fost de aproximativ 11 grame.

Viperele introduse în loturile experimentale au servit cel puțin o data consum voluntar de hrană în condiții de captivitate.

Imediat după ingurgitarea prăzii, viperele au fost îndepartate din terariul comun și introduse ăn terariile experimentale special amenajate pentru realizarea experimentului în condiții optime.

Fiecaruia dintre cele trei loturi introduse în experiment i s-a alocat un terariu, astfel compartimentat încât să permită urmărirea individuală a fiecărei vipere în parte, oferind totodată și condiții identice și constante de temperatură și microclimat tuturor indivizilor supuși experimentului.

SDS PAGE Laemmli – protocol de lucru

Analiza SDS PAGE a lucrării de față a fost efectuată ținând cont de protocolul Laemmli, care presupune următoarele:

Soluții:

Soluție acrilamida 30%

30 g acrilamida

0.8 g N’N’-bis-methylene-acrylamide

Diluat până la volumul de 100 ml cu apă deionizată și menținuta la întuneric la temperatura de 40C.

Lower Tris buffer (4×)

18.17 g bază Tris

4.0 ml SDS 10%

Se ajustează pH-ul la valoarea de 8.8 cu HCl concentrat. Se diluează până la 100 ml volum final și se depozitează la 4 0C.

Upper Tris buffer (4×)

bază Tris

4.0 ml SDS 10%

Se ajustează pH-ul la valoarea de 6.8 cu HCl concentrat. Se diluează până la 100 ml și se depozitează la 40C.

Buffer Tris glicină (4×)

12 g bază Tris

57.6 g glicină

Se diluează până la 100 ml și se depozitează la temperatura de 40C.

Buffer probe (5×)

3.9 ml apă deionizată

10 ml Tris 0.5 M, pH 6.8

0.8 ml glicerol

1.6 ml SDS 10%

0.4 ml 2- mercaptoetanol

0.4 ml bromfenol blue 1%

Se depozitează în frigider.

SDS 10%

Se dizolva 50 g SDS în 450 ml apă deionizată. Se agită blând și se aduce la volumul de 500 ml. Se depozitează la temperatura camerei.

g. Soluție amonium persulfat (APS)

Se dizolvă 0.1 g APS într-un ml apă deionizată. Trebuie să fie proaspăt, motiv pentru care se va obține soluția în ziua în care avem nevoie de ea.

Preparea gelului:

Gel migrare

Tabel 1

Stacking gel

Tabel 2

Buffer electrod

370 ml apă deionizată

125 ml 4× buffer

5 ml SDS 10 %

Colorare și decolorare

400 ml metanol

100 ml acid acetic glacial

500 ml apă

1 g Coomassie Blue R- 250

Pentru decolorare se procedează la fel, folosind aceleași substanțe, mai puțin Coomassie Blue R-250 (colorantul).

NOȚIUNI PRACTICE

Lucrarea de față urmarește analiza SDS PAGE a veninului provenit de la specia de vipere Berus pentru a afla cantitatea de proteină prezentă în acesta și greutatea lor moleculară.

Pentru studiu s-au luat 5 probe de venin dupa cum urmează:

femelă melanică

femelă 3 ani

femela adultă 6 ani

femelă 3 ani, femelă 4 ani, mascul 3 ani

femelă 3 ani, femelă 4 ani

Din fiecare probă s-au laut cantitați egale de venin care au fos supuse centrifugării diferențiate în vederea separarii fracțiunilor proteice din venin. Centrifugările s-au efectuat astfel:

3000 rotații pe minut la temperatura de 4 grade timp de 20 de minute

6000 rotații pe minut la temperatura de 4 grade timp de 20 minute

12000 rotații pe minut la temperatura de 4 grade timp de 20 minute

18000 rotații pe minut la temperatura de 4 grade timp de 20 minute

Mod de lucru:

Pentru fiecare proba s-au făcut 3 diluții; 1:1, 1:2, 1:3 o parte venin respectiv o parte, doua parți si trei parți PBS. Pentru fiecare probă de venin s-au obținut astfel câte trei probe cu concentrații diferite. În final avem 15 tuburi Eppendorf care urmează a fi supuse centrifugării. Înaintea centrifugării are loc precipitarea probelor cu TCA 10% si acetonă. Urmează prerăcirea la -20 de grade timp de 2 h.

După prima centrifugare separăm supernatantul de pelet. Supernatantul este mai departe supus următoarei centrifugari. Se separa din nou peletul. Această acțiune are loc la fel pe parcursul tuturor celor 4 centrifugări. La finalul acestei operațiuni vom avea 60 de probe pelet și 15 probe supernatant. Acesta din urma va constitui obiectul analizei SDS PAGE.

Determinarea concentrației proteinelor

Concentrația proteinelor se determina cu ajutorul spectofotometrului. Pentru analiza din prezenta lucrare s-au luat în calcul doar cele 5 probe ale diluției III. Probele s-au pregatit astfel:

1 ul proba + 39 ul PBS ( pentru obținerea diluției 1:40). Din amestec se iau 5 ul la care se adaugă 250 ul Bradford. Timp de 15 minute se tine la întuneric după care se face citirea.

Rezultate:

Proba 1, diluția 3 (1:3)_ 1:40….. 525 ul\ ml

Proba 2, diluția 3 (1:3)_ 1:40……420 ul\ml

Proba 3, dilutia 3 (1:3)_ 1:40……765ul\ml

Proba 4, dilutia 3 (1:3)_ 1:40……692ul\ml

Proba 5, dilutia 3 (1:3)_ 1:40……904ul\ml

Rezultatele obtinute se vor înmulții cu 40 (datorită diluției) pentru obținerea datelor reale. Rezultatele finale vor fi:

Proba 1: 21000 ul\ml

Proba 2: 16800 ul\ml

Proba 3: 30600 ul\ml

Proba 4: 27680 ul\ml

Proba 5: 36160 ul\ml

După aflarea concentrației proteinelor probele sunt supuse electroforezei. Înainte se vor pregatii gelurile astfel: un gel de concentrare de 5% și gelul de migrare de 15%.

Gel de 5% :

1.7 ml acrilamida, BIS 30%

1.5 ml Tris HCl pH 6.8

3.4 ml H2O

60 ul SDS 10%

50 ul APS ( amonium persulfat)

8 ul TEMED

Gel 15% :

5 ml acrilamida BIS 30%

2.4 ml H2O bidistilată

2.5 ml Tris HCl pH 8.8, 1.5 M

0.1 ml SDS 10%

50 ul APS 10 %

10 ul TEMED

Gelul de 5% se pune între plăci. Se lasă cel puțtin o ora pentru a avea loc polimerizarea. Se introduce apoi gelul de migrare de 15% . Se așează pieptenul pentru obținerea godeurilor. Cănd gelurile au polimerizat se scoate pieptenul, se așează plăcile in celula de electroforeză și în godeurile formate se introduc probele.

Înainte de a fi supuse electroforezei probele necesită o pregatire prelabilă. În acest sens se va pregăti o soluție tampon pentru probe astfel:

0.4 ml Tris HCl, 1.5 M, pH 8.8

4 ml SDS 10%

0.4 ml EDTA – Na 0.1 M

3 g zaharoză

0.2 ml β mercaptoetanol

20 ul albastru bromfenol

H2O distilată până la volumul final de 10 ml

Se diluează în proporție de 1:3. O parte soluție tampon + 3 parți soluție proteică. Se încălzesc pe baie de apă la 95 grade timp de 5 minute. Pentru calculul exact al proporției de probă necesară electroforezei s-au efectuat următoarele calcule:

Proba 1: 21ug\ul × x = 1ug\ul × 50 ul de unde rezultă X egal cu aproximativ 3 ul. La aceștia se adaugă 47 ul PBS ajungând la un volum de 50 ul. Pentru migrare vom lua o parte probă, adica 12.5 ul si 3 parți TP, adică 37.5 ul.

Proba 2: 16 ug\ul × X = 1ug\ul × 50 ul de unde rezultă X egal cu aproximativ 3.5 ul. La aceștia se adaugă 46.5 ul PBS ajungând la volumul de 50 ul. Pentru migrare vom lua o parte probă, 12.5 ul și 3 parți TP, 37.5 ul.

Proba 3: 30 ug\ul × X = 1 ug\ul × 50 de unde rezultă X egal cu 2 ul. La aceștia se adaugă 48 ul PBS. Pentru migrare: 12.5 ul probă + 37.5 ul TP.

Proba 4: 27 ug\ul × X = 1ug\ul × 50, rezultă X = 2 la care se adaugă 48 ul PBS. Pentru electroforeza: 12.5 ul probă + 37.5 ul TP

Proba 5: 36 ug\ul × X= 1 ug\ ul × 50, de unde rezultă X = 1.5 la care se adaugă 48.5 ul PBS. Pentru electroforeză: 12.5 ul probă + 37. 5 TP

Din fiecare probă se vor lua 30 ul care vor fi introduși în godeuri, pentru migrare. Migrarea se va face în condiții de voltaj diferite, astfel că prima parte a migrării va avea loc la 100 V, iar după aproximativ 40 minute acesta va fi schimbat la 200 V.

Markerul folosit a fost GeneDirex BLUeye Prestained Protein Ladder. După migrarea completă gelul a fost scos și colorat cu Coomasi Briliant Blue.

Profil gel

Profilul electroforetic al markerului

Profilul electroforetic al probei 1

În urma analizei profilului electroforetic am putut observa prezența a nouă benzi cu greutăți moleculare cuprinse între 85.561 și 7.697 kDa, astfel:

Banda 1: 85.561 kDa

Banda 2: 59.807 kDa

Banda 3: 39.909 kDa

Banda 4: 35.710 kDa

Banda 5: 31.047 kDa

Banda 6: 27.127 kDa

Banda 7: 16.273 kDa

Banda 8: 11.255 kDa

Banda 9: 7.697 kDa

Profilul electroforetic al probei 2

În urma analizei profilului electroforetic s-a putut observa prezența a 12 benzi cu greutăți moleculare cuprinse între 62.556 și 7.818 kDa reprezentate astfel:

Banda 1: 62.556 kDa

Banda 2: 59.523 kDa

Banda 3: 40.363 kDa

Banda 4: 35.710 kDa

Banda 5: 31.617 kDa

Banda 6: 29.128 kDa

Banda 7: 18.533 kDa

Banda 8: 16.772 kDa

Banda 9: 14.884 kDa

Banda 10: 12.146 kDa

Banda 11: 10.694 kDa

Banda 12: 7.818 kDa

Profilul electroforetic al probei 3

În urma analizei profilului electroforetic s-a obervat prezența a 9 benzi cu greutăți moleculare cuprinse între 59.482 și 7.83 kDa reprezenate astfel:

Banda 1: 59.482 kDa

Banda 2: 40.888 kDa

Banda 3: 35.710 kDa

Banda 4: 31.498 kDa

Banda 5: 28.903 kDa

Banda 6: 19.026 kDa

Banda 7: 17.035 kDa

Banda 8: 11.176 kDa

Banda 9: 7.830 kDa

Profilul electroforetic al probei 4

În urma analizei profilului electroforetic s-au prezentat 8 benzi cu greutăți moleculare cuprinse între valorile de 59.902 și 7.628 kDa fiind reprezenate în felul urmator:

Banda 1: 59.902 kDa

Banda 2: 40.710 kDa

Banda 3: 35.710 kDa

Banda 4: 31.387 kDa

Banda 5: 28.097 kDa

Banda 6: 16.693 kDa

Banda 7: 11.165 kDa

Banda 8: 7.628 kDa

Profilul electroforetic al probei 5

În urma analizei profilului electroforetic s-a putut observa prezența a 10 benzi, a căror greutate moleculară a fost cuprinsa între 59.874 si 7.138 kDa.

Banda 1: 59.874 kDa

Banda 2: 40.972 kDa

Banda 3: 35.719 kDa

Banda 4: 31.389 kDa

Banda 5: 28.235 kDa

Banda 6: 19.165 kDa

Banda 7: 17.136 kDa

Banda 8: 11.551 kDa

Banda 9: 7.915 kDa

Banda 10: 7.138 kDa

Analiza filogenetică

Arborele filogenetic numit și dendogramă, este o diagram care reprezintă grafic relațiile de rudenie dintre diferite organisme în funcție de strămoșii lor comuni. Astfel se realizează o clasificare științifică a organismelor. Aspectul grafic al acestei scheme este de obicei un arbore în care trunchiul reprezintă strămoșul comun, iar ramurile sunt organismele care au acest strămoș comun.

Analiza filogenetică și realizarea unui arbore filogenetic poate fi aplicată tuturor entităților care au un stramoș comun.

Metoda UPGMA ( unweighted pair group method with arithmetic mean) este cea mai simplă metoda prin care se pot construe dendograme, dezvoltată totuși pentru prima dată pentru construcția fenogramelor, dar care poate fi utilizată și pentru generarea de arbori filogenetici, atunci când rata evoluției este egală pentru toate liniile analizate ( Constantin Botez, 2013).

Putem observa astfel din arborele nostru ca cele ma apropiate, asemanatoare două ramuri sunt trei și cinci, iar cele mai îndepartate sau mai puțin asemănătoare sunt trei cu patru.

Evidențierea benzilor și numerotarea acestora

Analiză bioinformatică

În urma analizei bioinformatice am descoperit existența a două proteine, una prezentă la o greutate moleculară de aproximativ 16.000 kDa, iar cea de-a doua la o greutate de aproximativ 7.000 kDa. Analiza a fost efectuată cu ajutorul soft-ului UniProtKB\Swiss Prot (http://web.expasy.org/docs/swiss-prot_guideline.html). Ajungând pe această pagina selectăm opțiunea Proteomics Tools (http://www.expasy.org/proteomics/). Ajunși aici alegem TagIdent (http://web.expasy.org/tagident/). În noua pagină deschisă avem posibilitatea de a stabili un anumit punct izoelectric (pI) cuprins între 5.15 si 5.65, acestea reprezentând valorile minimă și maximă. Într-un alt câmp vom putea adăuga valorile greutăților moleculare obținute în urma analizei SDS PAGE. La final se va trece specia, în cazul nostru vipera Berus berus . în funcție de cercetarile efectuate în domeniu, de cantitatea de informații stocată în baza de date a soft-ului și de greutatile moleculare introduse ne vor fi afișate toate informațiile cu privire la proteina respectivă.

Astfel în cazul benzilor cu greutate moleculara apropiată de 16,000 kDa a fost evidențiată o proteină din grupul fosfolipazelor A2, numită fosfatidilcolina 2- acilhidrolaza sau mai pe scurt svPLA2. Lungimea secvenței de aminoacizi este egala cu 138.

Functiile proteinei: această fosfolipaza A2 din veninul de șarpe prezintă efecte anticoagulante medii, legandu-se de factorul Xa (F10). Inhibă activitatea protrombinazelor. PLA2 catalizează hidroliza Ca dependentă a celor 2 grupări acil în 3-sn-fosfogliceride.

Activitate catalitică: fosfatidilcolina + H2O = 1 acilglicerofosfocolina + carboxilate.

Cofactor: leagă un ion de Calciu.

Specificitate tisulară: este exprimată în glanda veninoasă.

Doza toxică: LD 0.95mg\ kg în cazul în care aceasta este injectată intraperitoneal.

Procese biologice: intră în metabolismul lipidelor și în degradarea acestora.

Functii moleculare: afectează homeostazia, este toxică, are funcție hidrolazică.

Secvența de aminoacizi:

10 20 30 40 50 60

MRTLWIVAVW LMGVEGNLFQ FGNMINHMVG KHAVWSYLSY GCYCGWGGQG KPQDATDRCC

70 80 90 100 110 120

FVHDCCYGRA NGCDPKLSTY SYNFQNGNIV CGNKYGCLRH ICECDRVAAI CFQKNMNTYN

130

KKYKNYSSSN CQENSDKC

Cea de-a doua proteină identificată are o valoare a greutății moleculare situată în jurul valorii de 7.000 kDa. Aceasta poartă numele de Disintegrin VB7A. Are o lungime a secvenței de aminoacizi egală cu 64.

Funcții: are o slabă acțiune inhibitoare asupra agregării trombocitelor. Inhibă aderența celulelor exprimând RGD, dependent de integrin alfa 5\ beta 1, în fibronectin imobilizat. Inhibă slab integrin alfa 2b\ beta 3 și nu inhibă deloc alfa-1\beta 1, alfa 2\ beta 1, alfa 6\beta 1.

Specificitatea tisulară este exprimată, ca și in cazul proteinei anterioare, în glanda veninoasă.

Funcții moleculare: afectează aderența celulelor, afectează homeostazia, inhibă agregarea trombocitelor.

Secvența de aminoacizi:

10 20 30 40 50 60

NSGNPCCDPV TCKPRRGEHC VSGPCCRNCK FLNAGTICKY ARGDDMNDYC TGISSDCPRN

PYKD