Ingineria Tisulara

INTRODUCERE

Ingineria tisulară este un domeniu multidisciplinar care implică principiile biologiei, medicinei și ingineriei și are ca scop promovarea calității vieții umane prin restabilirea, menținerea sau ameliorarea diferitelor funcții proprii țesuturilor sau organelor.

Ingineria tisulară a pielii este un domeniu în plină expansiune datorită lipsei tot mai pregnante a unor grefe care să satisfacă nevoile de regenerare a tegumentului lezat.

Pielea este cel mai mare organ al corpului uman, având o structură complexă și îndeplinind o serie de funcții esențiale în realizarea homeostaziei. Leziunile pe care le poate suferi aceasta sunt, în funcție de aria și profunzimea lor, incompatibile cu viața.

În ultimile decenii hidrogelurile au atras o atenție sporită, realizându-se un mare progres în proiectarea, sintetizarea și utilizarea acestor materiale în variate aplicații biologice și biomedicale.

Scopul acestui studiu este de a sintetiza o serie de hidrogeluri cu potențiale aplicații în proiectarea unor substituienți cutanați.

Aceste materiale trebuie să satisfacă cele mai exigente caracteristici cu privire la biocompatibilite, stimulând în același timp proliferarea celulară și sinteza de matrici extracelulare. O altă caracteristică definitorie a acestor hidrogeluri este aceea de a suplini funcțiile intrinseci pielii native.

Colagenul este un biopolimer intens investigat în diverse arii ale ingineriei tisulare. Astfel, natura hidrofilă a colagenului datorată structurii sale moleculare, caracterizată printr-un conținut mare de aminoacizi diaminici/dicarboxilici, este foarte favorabilă pentru adeziunea celulară. Ca urmare potențialul acestui material în proiectarea unor substituienți cutanați este inerent.

Acidul hialuronic, mucopolizaharid localizat în matricea extracelulară a diverselor țesuturi, este implicat în modularea diverselor activități celulare datorită receptorilor specifici care sunt situați la nivelul membranei celulare. În ultimele trei decenii acest biopolimer a fost intens utilizat în proiectarea unor matrici structurale (scaffold-uri) cu aplicații în ingineria tisulară. De asemenea, s-a demonstrat faptul ca acesta este responsabil de hidratarea pielii, scăderea în conținut a acestuia fiind asociată cu dezhidratare și rigidizarea tegumentului [33]. Ca urmare, acidul hialuronic poate fi utilizat cu succes în conceperea unor hidrogeluri cu potențiale aplicații în ingineria tisulară a pielii.

Premiza acestui studiu este sinergismul ce poate fi realizat prin utilizarea celor doi biopolimeri. Reticularea acestora se poate realiza cu ajutorul carbodiimidelor solubile în apă, acestea dovedind, în diferite cercetări efecuate anterior, lipsa toxicitătii. Astfel, s-a optat pentru utilizarea 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimidei (EDAC), în prezența N-hidroxisuccinimide (NSH), acesta din urmă având rolul de a crește randamentul de reticulare dintre cei doi polimeri. În cuprinsul lucrării este descris în detaliu mecanisul prin care cele 2 substanțe întervin în formarea legăturilor amidice dintre lanțurile acidului hialuronic și cele ale colagenului. S-a evidențiat cu ajutorul microscopiei electronice de baleiaj structura poroasă a hidrogelurilor obținute. De asemenea s-a evaluat cinematica de retenție a fluidelor de către hidrogeluri.

CAPITOLUL 1. PIELEA

Pielea este cel mai mare organ al corpului uman, având o greutate de 4-6 kg și o suprafață de 1,70-1-75 . Este compusă din trei staturi reprezentate de epiteliu (epidermul), matrice conjunctivă (dermul) și țesut grăsos (hipodermul).

Figura 1.1 Structura pielii [1]

Epidermul asigură funcția de protecție a pielii, precum și funcția imună și fotoprotectoare. Este bine organizat și stratificat, prezentând un strat celular care este capabil de auto-reînoire printr-un proces continuu de proliferare și diferențiere [1]. Dermul prezintă un conținut ridicat de țesut conjunctiv, cu rol în asigurarea integrității mecanice a pielii. La nivelul acestuia se găsesc de asemenea și anexele pielii și receptorii pentru stimulii senzoriali.

Hipodermul este format în principal din rezervoare subcutanate de grăsime, care asigură izolație termică și previne pierderea de energie [2].

Structura pielii

1.1.1 Epiderm

Epidermul reprezintă un epiteliu stratificat pavimentos, fiind format din 4 tipuri de celule: keratinocite (80% din totalul celulelor epidermului), melanocite, celule Langerhans și celule Merkel ( ultimele trei reprezentând 20 % din totalitatea celulelor epidermale).

Structural, epidermul este format din 5 straturi:

Stratul bazal, numit și strat germinativ deoarece este singurul strat din structura epidermului în care are loc mitoza celulelor. Este cel mai profund, fiind format dintr-un singur rând de celule de formă cilindrică dispuse unele lângă altele (dispoziție în palisadă). Celulele sunt situate perpendicular pe membrana bazală, legandu-se de aceasta prin intermedediul unor formațiuni nunite semidesmozomi (dințăturile lui Henle). Este un strat avascular, conține nervi, nutriția și drenarea fiind realizată prin osmoză transbazală.

Stratul mucos, numit și stratul malpighian, este format din 6-20 staturi de celule poligonale, voluminoase, având nucleul rotund sau ovalar, cu 1-2 nucleoli. Celulele malpighiene au un aspect mai plat și o dispoziție orizontală spre partea superioară, fiind unite prin tonofilamente (filamente de prekeratină în mănunchiuri). Aspectul fibrilar face ca stratul malpighian să poarte și numele de strat filamentos. Între celulele malpighiene există un spațiu lacunar în care se găsește limfă , cu rol în asigurarea necesităților nutritive ale celulelor.

Figura 1.2 Epiderm [3]

Stratul granulos (Langhans) este situat deasupra stratului malpighian. Acest strat este format din 3-4 rânduri de celule. Acestea au un aspect romboidal, axul mare fiind paralele cu tegumentul. Aceste celule nu prezintă punți intercelulare dar prezintă un aparat fibrilar, tonofilamentele fiind dispuse mai ales la periferia celulei.

 Stratul lucidum (lucid) este situat deasupra stratului granulos, fiind întalnit doar în zonele în care pielea este groasă. La nivelul acestui strat keratinocitele sunt strâns unite de către eleidină, un intermediar în biosinteza keratinei. De asemenea, celulele nu prezintă nucleu sau alte organite celulare.

Stratul cornos este constituit din 30 de straturi de celule plate, anucleate, care se intrică între ele formând lamele care se suprapun. Partea superficială a stratului cornos, formată din elemente izolate care se desprind la cel mai mic traumatism, poartă numele de stratul disjunct.

Timpul necesar reînnoirii epidermului este de 26-28 de zile.

1.1.2 Derm

Dermul se găsește imediat sub epiderm, fiind de aproximativ patru ori mai gros decât acesta. Conține numeroase țesuturi specializate în suport precum și vase de sânge, nervi, rădăcini ale firelor de păr și glande sudoripare. Proteinele sunt reprezentate în special de colagen și elastină, acestea oferindu-i rezistență și flexibilitate. Odată cu înaintarea în vârsta este normal ca aceste proteine să se mai reducă, contribuind astfel la apariția unei tegument mai fragil la persoanele în vârstă. Unele medicamente, în mod special corticosteroizii, au de asemenea un efect de denaturare a fibrelor de colagen, determinând pe termen lung subțierea pielii, cu predispoziție la apariția echimozelor (vânătăilor) [1].

Dermul are o grosimea medie de 1-2 mm, fiind format din două porțiuni: o porțiune superficială denumită dermul papilar , corespunzând în cea mai mare parte papilei dermice, și alta profundă sau dermul reticular , numită și corion. Dermul papilar cuprinde 1/5, iar corionul 4/5 din grosimea dermului.

Atât dermul papilar, cât și cel reticular sunt formate din următoarele componente:

a. Scheletul fibrilar

Este format dintr-o rețea de fibre reprezentată de:  

fibrele de colagen- sunt cele mai numeroase, reprezentând principalul component fibrilar al dermului. Acestea sunt grupate în fascicule, formând benzi ondulate, alungite și întretăiate în toate direcțiile. Fibrele sunt constituite din fibrile care la rândul lor sunt formate din protofibrile;

fibrele elastice- conglomerat de fibre separate printr-o substanță amorfă lipomucoproteică (elastomucină). Aceste fibre sunt subțiri, sinuoase, mai mult sau mai puțin anastomozate;

fibrele de reticulină- numite și fibre argentofile, sunt fibre fine a căror structură macromoleculară se aseamănă cu cea a colagenului, având o dispoziție în formă de grilaj;

b.  Elementele celulare

Sunt clasificate în funcție de posibilitatea de migrare în:

fixe: fibroblastele (celule fusiforme cu prelungiri, aparat ribozomal și mitocondrial bine dezvoltat, cu rol în sinteza fibrelor), histiocitele (celule cu elasticitate crescută, rol în fagocitoză, pinocitoză) și mastocitele (prezintă în citoplasma granulații metacromatice reprezentând depozite de amine biologic active: histamină, heparină, serotonină, prostaglandine )

mobile, prin diapedeză trecând din vase în derm: limfocite T, neutrofile, eozinofile, hematii

c. Substanța fundamentală

Ocupă spațiile dintre fibre și celule, fiind formată din mucopolizaharide (acidul hialuronic, condroitin sulfatul, dermatan sulfatul etc) și o substanță proteică; conține, de asemenea, apă, substanțe minerale și metaboliți.

Anexele dermice înclud foliculii de păr, glandele sebacee și glandele ecrine. Foliculii de păr formează părul, iar lungimea fiecărui folicul depinde de locația anatomică. Glandele sebacee sunt asociate cu foliculii de păr, producând stratul de sebum uleios care acoperă pielea. În contrast sunt glandele ecrine (sudoripare), care sunt glandele de transpirație și acționează pentru a controla temperatura corpului și transpirația. Densitatea glandelor ecrine depinde de locația anatomică (cea mai mare fiind în palme și tălpi) [4].

1.1.3 Hipoderm

Dedesubtul dermului reticular se află hipodermul, un strat subcutanat de grăsime care este foarte vascularizat și inervat. Există o foarte mare diferență structurală între derm și hipoderm. Caracteristicile morfo-structurale ale acestuia sunt: lipsa substanței fundamentale precum și prezența lobulilor adipoși (delimitați de tracturi fibroase care vin din derm).

Funcțiile pielii

1.2.1 Funcția de aparare a pielii

Pielea îndeplinește un rol important nu numai în protecția organismului față de factorii din mediul extern ( mecanici, fizici, chimici, biotici) ci și la realizarea funcției complexe de apărare. La aceasta contribuie următoarele elemente:

integritatea structurală a tegumentelor;

prezența stratului cornos, realizând protecția față de factorii mecanici și fizici (radiațiile ultraviolete) și descuamarea continuă a porțiunii superficiale a acestuia, producând îndepartarea mecanică a substanțelor chimice, microbilor, fungilor, virusurilor etc.

realizarea „filmului hidrolipofilic superficial” și a „mantalei acide” a pielii.

Filmul hidrolipofilic superficial este o peliculă lichidiană care acoperă suprafața pielii, fiind format prin emulsionarea compomentelor lipidice și apoase. Substanțele lipidice reprezintă 20-30% din acestă peliculă, fiind un amestec de acizi grași liberi, steroli, mono-, di, și trigliceride, esteri sterolici, fosfolipide, ceruri. Din aceste lipide de suprafață, 95% sunt produse prin secreție sebacee și 5% sunt de proveniența epidermică. Secreția sudoripară furnizează cea mai mare parte din apa de suprafață, electroliți, acizi (uric, lactic, formic, citric ).

Filmul hidrolipofilic superficial are următoarele roluri:

lubrifiază suprafața pielii, făcând-o flexibilă și rezistantă la acțiunea factorilor fizici si chimici;

controlează evaporarea apei, menținând constantă componenta hidrică a stratului cornos;

acțiune antimicrobiană și antifungică;

„Mantaua acidă” a pielii este reprezentată de către mediul acid de la suprafața epidermului, pH-ul fiind cuprins între 4 si 7, cu exepția pliurilor unde aciditatea este mai scazută. Stratul lucios este foarte acid, constituind rezerva acidă a pielii.

Factorii care realizează menținerea constantă a acidității cutanate sunt:

secreția sudoripară și secreția de sebacee ( prin conținutul în acizi grași);

disocierea substanțelor hidrosolubile de la suprafața pielii;

acidul carbonic provenit din metabolismul straturilor profunde ale dermului și/sau epidermului, care este eliminat la suprafață

„Mantaua acidă” îndeplinește urmatoarele funcții:

acțiune antimicrobiană;

ancțiune de neutralizare a bazelor și acizilor prin sisteme tampon ca: acid carbonic-bicarbonați, acid lactic-lactați, acizi aminici liberi;

Un alt element care contribuie la realizarea funției de apărare a pielii este structura dermului ( celulele, fibrele și matricea extracelulară), care o face să fie mecanorezistentă.

1.2.2 Rolul pielii în menținerea homeostaziei organismului

a. Rolul pielii în homeostazia hidrică

Menținerea constantă a volumului apei din orgamism este realizată prin două sisteme de autoreglare: unul hipotalamo-hipofizar, care acționează prin hormonul antidiuretic , și altul suprarenal, care intervine prin aldosteron. Pielea are rol secundar în homeostazia hidrică, participând alături de rinichi la eliminarea apei din organism. Prin secreția sudoripară se elimină aproximativ 1000 ml de apă în 24 de ore, iar prin perspirație insensibilă încă 300 ml.

b. Rolul pielii în reglarea hemodinamică

Pielea are un rol important în mecanismele de reglare hemodinamică, prin bogația sa în plexuri vasculare și posibilitatea de a face să stagneze cantități variabile de sânge la nivelul ei. Acestea pot atinge până la 30% din masa sanguină circulantă în conditiile vasodilatației periferice generale.

c. Rolul pielii în homeostazia hormonală

Pielea are un rol important în metabolizarea unor hormoni, ca testosteronul, estrogenii, progesteronul, cortizonul, enzima implicată fiind 5 alfa-reductază.

1.2.3 Funcția imunologică a pielii

Pielea a fost considerată mult timp doar o barieră de tip mecanic față de mediul inconjurător, dar actualmente este demonstrat rolul său în dinamica de apărare prin punerea în joc a sistemului imunitar. SIS (Skin immune System) intervine mai ales în reacțiile de hipersensibilitate. Componentele SIS sunt: limfocitele T, celulele dendritice prezentatoare de antigen, mastocitele, macrofagele tisulare, granulocitele neutrofile și keratinocitele.

Limfocitele T circulante se infiltrează în pielea sanatoasă, devenind rezistente pentru o perioadă nedeterminată de timp. Celulele dendritice prezentatoare de antigen sunt reprezentate de: celulele Langerhans, celulele dendritice nedeterminate, celulele cu văl, celulele interdigitale, celulele reticulare dendritice și celulele Granstein. Dintre acestea, celulele Langerhans sunt cele mai implicate în raspunsul imun cutanat.

1.2.4 Funcția de penetrabilitate a pielii

Pielea este atât un înveliș impermeabil, protector, care limitează pierderea de apă din organism, cât și o membrană fragilă, semipermeabilă, permițând difuzia selectivă a unor substanțe chimice. Căile absorbției percutanate sunt reprezentate de stratul cornos, foliculul pilo-sebaceu și ductul sudoripar. Studiile recente indică faptul că principala cale de absorbție percutanată a substanțelor chimice este difuzia pasivă prin stratul cornos.

Sunt presupuse mai multe etape în absorbția percutanată: difuzia prin stratul cornos, desfacerea moleculelor în epiderma viabilă, difuzia prin dermul papilar și transferul în circulația sanguină. Foliculii pilo-sebacei și ducturile sudoripare joacă un rol minor în absorbția percutanată.

Factorii care influentează absorbția percutanată sunt reprezentati de creșterea temperaturii cutanate și hidratarea pielii. Lipidele și substanțele liposolubile trec mai usor, în timp ce substanțele organice cu grupări hidrofile se absorb mai lent. Moleculele mici, solubile atât în lipide cât și în apă, sunt cele mai ușor absorbite. Variațiile regionale ale permeabilității cutanate pot fi general explicate prin grosimea diferită a stratului cornos.

Pielea supusă acțiunii unor chimicale (diferiți solvenți, denaturanți, sulfactanți) este mult mai permeabilă decât pielea intactă. Pansamentele ocluzive, prin cresterea hidratării și a temperaturii cutanate, duc de asemenea la creșterea absorbției unor substanțe [2].

Compoziția pielii

Din punct de vedere chimic pielea prezintă următoarea compoziție: apă-70.0%, proteine-25.5%, lipide-2.0%, minerale-0.5%.

a. Colagenul

Colagenul formează rețeaua structurală a pielii și este cea mai abundentă proteină din corp. Este compusă în principal din glicină, prolină și hidroxiprolină (aminoacizi). Este una dintre cele mai rezistente proteine din natură oferind țesuturilor tărie și durabilitate. Cu vârsta colagenul începe să se deterioreze determinând apariția pielii subțiri și flasce.

Cele mai frecvente secvențe de aminoacizi din lanțurile de colagen sunt: lizină-hidroxilizină-prolină și lizină-hidroxilizină-hidroxiprolină.

Colagenul cel mai abundent din piele este de tipul I și II; fibrilele lui formează rețele responsabile de proprietățile mecanice ale pielii. Celelalte tipuri de colagen prezente în piele sunt V,VI și XII, dar acestea se găsesc în cantități mai mici și având rol de susținere.

Cunoașterea procentului de colagen corespunzător fiecarui tip din structura pielii este importantă din mai multe motive. În primul rând agenții diferiți capabili să stimuleze sinteza de colagen, putând afecta diferit tipurile de colagen.

S-a observat faptul că vitamina C are capacitatea de a stimula sinteza de colagen de tip I și III. La fel ca și sinteza, degradarea colagenului este un proces continuu, natural. Pe măsură ce îmbătrânim degradarea colagenului devine din ce în ce mai pronunațată contribuind la slăbirea și rigidizarea pielii.

Colagenul proaspăt sintetizat de către fibroblastele tinere și sănătoase are o structură coerentă, ordonată. Conformația colagenul este afectată de către razele UV, radicalii liberi, alterarea metabolismului glucozei, fumat sau alți factori, structura sa devenind distorsionată, ducând astfel la apariția ridurilor precum și a altor imperfecțiuni. Minimizarea acestor factori, în scopul menținerii degradării colagenului sub control, este insuficientă. O metodă mai avansată este de a inhiba enzimele numite metaloproteineaze matriciale. Aceste enzime (în special cele numite colagenaze) scindează colagenul în bucăți mici care apoi sunt reciclate.

b. Elastina

Elastina reprezintă 6% din proteinele structurale. Molecula are următoarea compoziție: glicină – 33%, prolină – 10-13%, puțină lizină, 50-60% aminoacizi nepolari de genul dezmozinei și izodezmozinei. Molecula are o greutate de 72000 daltoni. Dezmozina și izodezmozina sunt responsabile de caracterul puternic hidrofob al moleculei precum și de caracterul său elastic. Biosinteza elastinei cuprinde două etape: intracelulară și extracelulară. Sinteza este realizată de aceleași celule ca și in cazul colagenului.

c. Glicozaminoglicanii

GAG sunt molecule polizaharidice neramificate formate din unități dizaharidice repetitive care prezintă pe suprafață lor numeroase sarcini negative date de radicalii sulfat și carboxil. O unitate repetitivă este formată dintr-un glucid aminat (N-acetil-galactozamină sau N-acetil-glucozamină) și un acid uronic.

Sarcinile negative au următoarele roluri: Atrag ionii de Na+ care vor atrage la rândul lor apă și se va realiza structura de gel puternic hidratată. Sarcinile negative se resping între ele, prin urmare, moleculele de GAG ocupă un volum mare în raport cu greutatea lor moleculară. Marea majoritate a GAG, cu excepția acidului hialuronic, se leagă covalent de un miez proteic, formând proteoglicani.

Clasificarea GAG se face în 5 clase în funcție de tipul unității repetitive, numărul de grupări sulfat și localizarea lor:

Acidul hialuronic (hialuronan) format din acid glucuronic și N-acetil-glucozamină.

Dermatan sulfatul format din acid iduronic și N-acetil-galactozamină

Heparină (heparan sulfatul) formată din acid iduronic și N-acetil-glucozamină

Condroitin sulfatul format din acid glucuronic și N-acetil-galactozamină

Keratan sulfatul format din galactoză și N-acetil-glucozamină.

Acidul hialuronic reprezintă GAG cu cea mai mare masă moleculară (cuprinde aprox. 50.000 unități dizharidice). Molecula are un aspect de bastonaș cu lungimea de aproximativ 1 mm. Nu se leagă covalent de un miez proteic, fiind de asemenea singurul GAG nesulfatat. Se găsește în cantități mari în țesutul embrionar iar la adult se găsește în corpul vitros, în lichidul sinovial și în gelatina Wharton.

Ceilalți GAG au molecule mai mici (conțin aprox. 300 unități dizaharidice). Ei sunt sintetizați în aparatul Golgi, unde se sulfatează, se epimerizează și formează legături covalente cu miezurile proteice, dând astfel naștere la proteoglicani.

Proteoglicanii se găsesc în matricea conjunctivă. Ei sunt alcătuiți dintr-un miez proteic pe care se leagă 3-5 molecule de GAG de tipul condroitin sulfatului, keratan sulfatului sau dermatan sulfatului. Acești proteoglicani se atașează periodic la fibrila de colagen, intervenind în organizarea matricei conjunctive extracelulare. Au urmatoarele roluri:

• Mediază adezivitatea celulă – celulă și celulă – matrice.

• Mediază comunicarea intercelulară și comunicarea dintre celulă și moleculele matricei extracelulare.

• Controlează coagularea (la nivelul vaselor)

• Controlează metabolismul lipoproteic (la nivelul vaselor)

• Controlează creșterea musculaturii netede

• Controlează creșterea neuriților (nervilor)

• Controlează permeabilitatea membranei bazale [5].

1.4 Mecanisme de refacere, protecție și afecțiuni ale pielii

Vindecarea rănilor este un proces complex care implică o angiogeneză programată, fiind un rezultat al sinergismului dintre diferite tipuri de celule, proteine, mucopolizaharide etc.

Mulți factori patologici pot împiedica vindecarea precum vârsta înaintată, malnutriția, diabetul, bolile vasculare, ischemia, bolile renale. Factori locali sunt ischemie, infecție, inflamație prelungită, prezența corpilor străini și macerarea țesuturilor. În plus, un micro-mediu anormal al rănii poate duce la dificultăți de vindecare cum ar fi: existanța unui dezechilibru de enzime proteolitice sau prezența unor inhibitori ale acestora, distribuția anormală a moleculelor bioactive (cum ar fi factorii de creștere) etc.

În piele, interacțiunile dintre keratinocite, fibroblaste, melanocite și celulele sistemului imunitar sunt strâns legate. Întreruperea acestui sistem de feedback-uri poate determina proliferarea necontrolată a keratinocitelor sau a melanocitelor.

Arsurile rezultate prin contact termic, electric, chimic sau traumele mecanice sunt două din cele mai importante motive ale lezării pielii acute și pierderilor țesuturilor cutanate.

În funcție de adâncimea țesutului afectat al pielii, rănile sunt clasificate în 4 grupe: superficiale (epidermale), superficiale parțiale în grosime, profunde parțiale în grosime și totale în grosime.

Un alt tip de leziune a pielii este rana cronică rezultată din diferite boli precum diabet, boli genetice sau intervenții chirurgicale.

Pielea este bine vascularizată, acest lucru fiind esențial pentru regenerarea ei. Dacă mecanismul normal de însănătoșire a rănii este compromis datorită slabei vascularizații (în special datorită vârstei înaintate sau a diabetului), regenerarea pielii poate fii lentă sau aceasta poate dispărea în totalitate. Aceasta este o problemă majoră în țările occidentale cu o populație din ce în ce mai îmbătrânită și cu o incidență crescută de diabet. Realizarea unei neovascularizații rapide în ingineria citotisulară a materialelor este foarte importantă.

Vindecarea rănilor este un proces foarte bine organizat, fiind alcătuit din 3 faze: inflamare, formare și remodelare de țesut.

Inflamația este răspunsul înnăscut, foarte eficient, al organismului la un agent patogen. Faza inflamatoare implică doua reacții diferite: un răspuns vascular, incluzând coagularea sângelui și hemostaza și un răspuns celular incluzând infiltrarea de neutrofile și macrofage.

Imediat după lezarea pielii, integritatea pereților capilari poate fi afectată, apărând hemoragia. Aceasta este limitată prin intermediul unor mecanisme reflexe. Trombocitele sunt primele tipuri de celule care răspund la o leziune vasculară, jucând un rol important în realizarea hemostazei. Trombocitele activate eliberează o serie de mediatori incluzând adenozina, difosfat, serotonină, tromboxan A2, proteine adezive precum fibronectină, fibrinogenul și trombospondina.

Neutrofilele sunt responsabile de înlăturarea bacteriilor, a proteinelor degradate și a altor materiale străine din rană prin degradare enzimatică și fagocitoză. Monocitele se transformă în macrofage în faza inflamatorie târzie. Macrofagele produc o serie de factori chemotactici, factori de creștere și factori angiogenici care adună fibroblastele și ajută la migrarea celulelor, proliferarea acestora, producția de matrici extracelulare si creșterea unor noi vase de sânge. În concluzie macrofagele au un rol principal în angiogeneză, în formarea țesutului granular și în tranziția de la faza inflamatoare la faza de proliferare (înmulțirea celulelor).

Faza formării țesuturilor (reepitelizarea) începe în câteva ore de la lezarea pielii fiind a doua fază a vindecării acesteia.

În contrast cu răspunsul aproape imediat al re-epitalizării, remodelarea dermală începe abia după 4 zile de la lezarea pielii, ca răspuns la abundența factorilor de creștere și a prezenței citokinelor la locul rănii. Procesul de remodelare poate continua luni sau ani de zile. În cele din urmă dermul denaturat este înlocuit gradual de un fenotip (cicatrice) stabil post-rănire care este alcătuit în general din colagen de tip I. Rezistența la tracțiune a cicatricei ajunge la un maxim de 70% din dermul de înainte de rănire [6].

CAPITOLUL 2. BIOMATERIALE UTILIZATE IN INGINERIA TISULARĂ A PIELII

2.1 Aspecte generale ale ingineriei tisulare a pielii

Ingineria tisulară este un domeniu în plină expansiune, al cărui scop este de a dezvolta noi strategii în vederea producerii de diverse țesuturi atât in vivo cât și in vitro pentru a restaura, a susține sau a îmbunătății o funcție tisulară.

Figura 2.1 Principiul de bază al ingineriei tisulare [7]

Aplicațiile ingineriei tisulare ale pielii se axează pe regenerarea epidermului și a dermului, neabordând regenerarea celorlalte structuri intrinseci ale pielii ca glandele sebacee, foliculi piloși, a căror piedere este insensibil semnificativă în comparație cu denaturarea epidermului și a dermului.

Pentru unele componente dermale ca: vasele sanguine și celulele sistemului imunitar stimularea regenerării prin metodele ingineriei tisulare nu este necesară deoarece acestea prezintă abilități native de a repopula regiunea de piele lezată.

Cu toate că epidermul prezintă o capacitate înaltă de vindecare, regenerarea acestuia este unul din scopurile țintă ale ingineriei tisulare deoarece există situații când aria epidermică denaturată este mare sau regererarea este deficitară.

Vindecarea dermală este importantă pentru redobândirea elasticității, flexibilității și rezistenței pielii.

Cel mai frevent traumatism ce alterează integritatea structurală și funțională a pielii este arsura termică. Procesul de regenerare a rănilor este stimulat și controlat de către citokine și o serie de factori de crestere. În funcție de adâncimea leziunii, pielea se poate autoregenera. Astfel, leziunile epidermale care nu au distrus stratul germinativ se pot regenera complet ca urmare a proliferării și deplasării spre tegument a keratinocitelor. Leziunile care distrug complet epidermul nu mai prezintă aceasta abilitate. Aria leziunii prezintă de asemenea un interes deosebit. Astfel, traumatismele care au distrus complet dermul și care prezintă o aria cu diametru mai mare de 1 cm necesită grefare pentru a preveni formarea de cicatrici inestetice și cu proprietăți mecanice scazute [8].

2.1.1 Alografele și autogrefele

Transplantul autolog este în prezent un standarul pentru leziunile care au distrus stratul epidermal al pielii. În cazul pacienților cu o suprafață mare a arsurilor, microorganismele reprezintă un pericol de temut deoarece pot determina apariția infecției locale, iar de aici a septicemiei [10, 11].

Autogrefele sunt recoltate cu ajutorul dermatomului, care detașează epidermul și partea supreficială a dermului. Celulele dermale care au rămas la nivelul regiunii donoare au rolul de a regenera epidermul.

Această abordare prezintă dezavantajul că în cazul leziunilor mari, regiunile donoare să fie limitate.

Alogrefele (grefele prelevate de la un individ non-identic, genetic de aceeași specie), xenogrefele (grefele prelevate de la specii diferite genetic) și membranele amniotice, au fost folosite ca o alternativă la autogrefe de-a lungul a mulți ani. Totuși acestea sunt folosite doar temporar pentru rană. Respingerea grefei este o problemă majoră atât pentru alogrefe cât și xenogrefe, care apare în doar câteva zile sau săptămâni după implantarea acesteia. În plus sursa precară de prelevare și posibilitatea de transmitere a bolilor limitează aplicarea lor [12].

2.1.2 Substituienți de piele proiectați prin inginerie tisulară

Pentru a depăși limitările asociate cu grefele de piele, substituienții concepuți prin ingineria tisulară sunt realizați pentru a suplini nevoia de grefă de piele, putând fi folositi cu ușurință atât în tratarea rănilor acute cât și a celor cronice. De-a lungul a 40 de ani a fost comercializat un număr mare de substituienți de piele atât naturali cât și sintetici.

Acești substituienți oferă protecție împotriva dezhidratării și a contaminarii cu microoraganisme, eliberând de asemenea o serie de substanțe ce stimulează refacerea dermală ca citokinele, factorii de creștere și oferind material proteic în scopul refacerii matricei extracelulare. Ei pot fi folosiți și în combinație cu autogrefele ca mijloc de protecție al acestora la factorii externi [13].

Substituienții epidermali

Pentru producerea substituienților epidermali este necesară prelevarea, de la pacient, a unei biopsii de 2-5 . Astfel după ce țesutul recoltat este sterilizat, are loc prelevarea de keratinocite. Acestea, în medii de cultură cu o compoziție bine stabilită în care sunt prezente de asemenea și fibroblaste de șoarece, se divid, formând astfel populații ce pot fi utilizate în vederea re-epitelizării zonei lezate a pacientului [14].

Substituienții dermali și epidermali

Pentru tratarea arsurilor de profunzime (grad 3 si 4), atât dermul cât si epidermul trebuiesc regenerați. Substituienții dermali au ca principal obiectiv restabilirea rezistenței mecanice a zonei lezate.

O serie de astfel de substituienți sunt prezentați în cele ce urmează [15-20]:

TransCyte pentru arsuri

TransCyte este o acoperire temporară, biosintetică, reprezentată de către niște membrane semipermeabile din silicon și celule fibroblaste de la noi născuți pe o meșă din nylon acoperită cu colagen porcin.

Este indicat pentru acoperirea temporară anterioară autogrefării sau pentru acoperirea temporară a arsurilor care nu necesită auto-grefare (arsuri de grosime medie).

Pentru arsurile faciale TransCyte a demonstrat a fi superior față de unguentele cu antibiotice și creme, cu un timp de vindecare semnificativ mai mic.

Figura 2.2 Transcyte [18]

Dermagraft pentru arsuri

Dermagraft este o meșă de poli(acid-lactic), bioresorbabilă, însămânțată cu fibroblaste neonatale alogene. Fibroblastele proliferează și produc colagen dermal, factori de creștere, glicozaminoglicani și fibronectină, materialul din meșă fiind absorbit gradual.

Figura 2.3 Eficacitate Dermagraft [18]

Integra pentru arsuri

Integra este compusă din două straturi: un strat dermal bazat pe colagen de tip bovin, care se integrează cu celulele proprii ale pacientului și o foaie temporară de silicon epidermal, care este jupuită odată ce rană se vindecă. Este indicată pentru tratamentul post-excizional pentru arsurile de grosime totală sau parțială. Prezintă un risc ridicat de infectare a rănii ceea ce este un dezavantaj. Totuși Integra pare a fi mai bună decât o auto-grefă, alogrefă sau xenogrefă în ceea ce privește viteza de vindecare a rănii.

Figura 2.4 Integra [18]

Apligraf pentru arsuri

Apligraft este un echivalent al pielii umane având o structură formată din două straturi. Este compus din colagen tip I de bovină, keratinocite alogenice și fibroblaste obținute de la prepuțul neonatal.

Trebuie să fie aplicat proaspăt deoarece are o valabilitate de 5 zile la temperatura camerei. Este folosit ca acoperire temporară deasupra autogrefelor pentru arsuri. Cicatricea țesutului, pigmentația, pliabilitatea, netezimea, au fost aproape de normal cu Apligraf. Nu au fost raportate infecții, răspunsuri umorale sau celulare și nici decese.

Fig. 2.5 Apligraf [18]

2.2 Biomateriale utilizate în ingineria tisulară a pielii

În ultimele trei decenii a existat o explozie în ceea ce privește dezvoltarea de noi biomateriale cu aplicații în ingineria tisulară a pielii. Aceste materiale sunt folosite ca scaffold-uri, având rolul de a mima matricea extracelulară, stimulând în același timp proliferarea și diferențierea celulară. Materialele utilizate în crearea unor matrici extracelulare artificiale au la bază biomateriale naturale și materiale sintetice.

2.2.1 Materiale naturale

În comparație cu matricile extracelulare (ECM), biomaterialele de origine naturală adică biopolimerii, prezintă o structură macromoleculară și performanțe similare. Teoretic, biomaterialele naturale nu ridică probleme legate de imunogenicitate care pot apărea în cazul polimerilor sintetici. Cele mai importante clase de materiale natural-derivate utilizate în realizarea de scaffold-uri sunt:

Colagenul este cel mai utilizat biopolimer ca scaffold în vederea proiectării substituienților de piele. Poate fi obținut din surse alogene sau xenogene, având omologia moleculară suficientă pentru a preveni apariția unor potențiale raspunsuri imunitare. Se pot creea astfel hidrogeluri ale căror proprietăți fizico-chimice care pot fi controlate prin densitatea de reticulare. Totuși, astfel de tratamente pot compromite eficiența, de exemplu, reticularea excesivă crește rigiditatea matricilor, reduce adeziunea celulară și viabilitatea celulelor. În stare naturală colagenul are o rată de degradare superioară în comparație cu cel reconstituit [21].

Alginatul, un biopolimer extras din alge, ce a fost utilizat pentru conceperea unor hidrogeluri cu aplicații in ingineria tisulară a pielii. Aceste hidrogeluri prezintă proprietăți mecanice ce pot fi controlate prin densitatea agentului de reticulare; au fost concepute pentru a fi cuplate cu o serie de peptide, pentru a spori interacțiunile matrice-celulă [22].

Chitosanul, un derivat din exo-scheletul crustaceelor, este un biopolimer care prezintă o bună biocompatibilitate și degradare controlată, fiind foarte bun pentru aplicații în ingineria tisulară. Structura moleculară a chitosanului este similară cu cea a glicozaminoglicanilor prezenți în matricile extra-celulare. De asemenea, chitosanul prezintă numeroase site-uri reactive care pot fi funcționalizate pentru a regla comportamentul celular. A fost deja folosit în numeroase aplicații ale ingineriei tisulare, de la conceperea de țesuturi moi, precum piele, până la țesuturi structurale dure precum os sau cartilaj [23].

fibronectina și fibrina – fibronectina, component al matricei extracelulare, stimulează adeziunea celulară; fibrina este o rețea complexă rezultată prin polimerizarea fibrinogenului în prezența trombinei (substanță de natură proteică). Nu este o componentă regulară a matricilor extracelulare, dar se poate folosi ca o matrice temporară [25].

Numeroase alte materiale naturale au fost folosite în scopul conceperii scaffold-urilor în ingineria dermului, incluzând acid hialuronic, condroitin sulfatul, laminină și elastină.

Polimerii din fibrele de mătase sunt des folosiți ca material pentru suturi. Fibrina de mătase are proprietăți mecanice, elasticitate, biocompatibilitate și biodegradabilitate foarte bune și se poate procesa foarte ușor, aceste calități recomandând-o pentru exploatarea în domeniul biomedical, pentru ingineria tisulară [26].

2.2.2 Materiale sintetice

Acum câteva decenii (1954-1960), materialele utilizate în proiectarea substituienților de piele temporari includeau: plasticuri prin pulverizare (un copolimeri de acetat de hidroxiclorură de vinil și acid sebacic), polyox (un polimer de oxid de etilenă) și burete de ivalon. Mai apoi s-au utilizat nailon velur laminat, spume poliuretanice laminate cu film de polipropilenă, filme de Gore-Tex ( poli(tetrafluoroetilenă)) și membrane de polimeri pe bază de silicon laminate ultrasubțiri.

Acum 3 decenii câteva membrane unilaminate au fost concepute pentru a acoperi rănile fiind aplicate pe experimente preclinice pe animale precum și în studii clinice. Hydron ( poli(hidroxietil metacrilat)) a fost folosit pentru arsuri raportandu-se faptul că are valoare clinică limitată.

În anii 1980 o serie de membrane bilaminate (Integra și Biobrane) au fost realizate, acestea fiind compuse dintr-un strat exterior, subțire de silicon, un strat de filamente de nailon iregulat și un strat de colagen pe interior. Membrana din silicon era folosită pentru a imita epiderma naturală fiind semipermeabilă, permițând difuzia vaporilor de apă dar protejând în același timp de contaminarea microbiană. Compozitul pe bază de nailon și colagen erau folosite pentru a imita dermul, caracterizat printr-o elasticitate mare. Un deceniu mai târziu, stratul interior al membranei bilaminate a fost îmbunătățit prin adăugarea de fibroblaste care să secrete biopolimeri în vederea obținerii de matrici extracelulare [27].

Dintre biomaterialele sintetice folosite in ingineria tisulară a pielii amintim: poliuretani, polipropilenă, poli(etilenglicolul), poliglicolidele, polilactidele, poli(lactidă-co-glicolidă), poli(tetrafluroroetilenă), poli(Ɛ-caprolactonă), poli(etilen-tereftalat). În ciuda ușurinței lor de manipulare și fabricare, siguranța acestor materiale rămâne o preocupare. Chiar dacă ele nu pot fi direct toxice, folosirea acestora a condus, în unele cazuri, la apariția unui raspuns imun. Chiar dacă interacțiunea celulară-material este limitată, aceste materiale pot fi ușor și eficient modificate prin atașarea factorilor de creștere. Pot fi utilizați, în scopul îmbunătățirii performantelor celulare, pentru combinații ale acestora cu biopolimeri ce se găsesc nativ în matrici extracelulare [28] .

2.2.3 Acidul hialuronic (HA)

În 1934 Karl Meyer și John Palmer, au descris o procedură pentru a izola un nou glicoz-aminoglican, din umoarea vitroasă a globului ocular bovin. Ei au arătat că această substanță conține un acid uronic și un amino-zaharid, propunându-i numele de acid hialuronic (uneori este folosit termenul de hialuronan).

Figura 2.6 Acidul hialuronic

Masa moleculară a acidului hialuronic variază de la aproximativ 0.4 kDa (dizaharide) la câteva mii de kDa. Atât proprietățile fizico-chimice cât și funcțiile biologice celulare ale acidului hialuronic depind de masa sa moleculară [29].

Acidul hialuronic este implicat într-un număr de fenomene celulare biologice datorită receptorilor specifici de hialuronan prezenți în membrana celulară: motilitate celulară, proliferare celulară, diferențiere celulară, interacțiuni celulă-celulă, participând de asemenea și în producerea unor substanțe celulare fiziologice precum citokinele și melanoproteinazele.

Acidul hialuronic este un glicozaminoglican des întâlnit în matricile extracelulare din multe țesuturi ale corpului. Este un biomaterial de mare importanță, găsindu-și aplicații în diverse arii: chirurgie oculară, în tratarea osteoartritei, inginerie tisulară, eliberarea controlată a medicamentelor, chirurgie estetică [30].

Proprietățile fizico-chimice ale acidului hialuronic sunt visco-elasticitatea bună, lubrifierea și capacitatea mare de a reține apă.

Aplicațiile medicale ale acidului hialuronic pot fi clasificate în trei tipuri :

aplicații care vizează proprietăților fizico-chimice ale acidului hialuronic;

aplicații care se axează pe funcțiile biologice celulare ale acidului hialuronic;

aplicații care vizează atât proprietățile fizico-chimice cât și funcțiile celulare biologice ale HA.

Structură și surse

Acidul hialuronic este prezent în toate vertebratele. Este un constituient major al matricilor extracelulare, localizandu-se, ca de exemplu, în umoarea vitroasă a ochiului omului (0.1-0.4 mg/g greutate umedă), în fluidul sinovial al articulației (3-4mg/ml), și în matricea produsă de celulele cumulus în jurul ovocitului (0.5mg/ml). Creasta cocoșului are o cantitate mare de acid hialuronic (până la 7.5 mg/ml). Mai recent acidul hialuronic a fost extractat din bacterii streptococe prin fermentație, eliminând astfel posibilitatea transferului unori boli [33].

Acidul hialuronic conține grupe funcționale (carboxilice sau hidroxilice) de-a lungul structurii sale, putând fi astfel grefat sau reticulat.

Rolul acidului hialuronic

Efectul de îmbătrânire afectează conținutul de acid haluronic din pielea umană. Ca urmare a îmbătrânirii, concentrația și conținutul de acid hialuronic scade. La tineri concentrația de acid hialuronic raportată la țesutul uscat este de 0.030%. Concentrația scade cu vârsta, astfel la 60 de ani avem o concentrație de 0.015% iar la vârsta de 75 de ani la 0.007%. Deci, va avea loc o scădere cu 77% a concentrației de-a lungul vieții. S-a demonstrat că acidul hialuronic definește hidratarea biomatricilor dermului, scăderea conținului de acid hialuronic determinând deshidratarea și îmbătrânirea pielii [33].

Proprietăți fizice ale hidrogelurilor pe bază de acid hialuronic

Mecanismele prin care sunt formate hidrogelurile, densitatea de reticulare și natura materialului utilizat, dictează dinamica de încorporare a moleculelor precum și a celulelor. Porozitatea matricilor este măsurată prin imagistică folosind microscopul electronic. Hidrogeluri pe bază de HA pot prezenta pori interconectați cu o medie a diametrelor de 40 până la 230 µm și cu o porozitate de 58-66% .

Degradarea hidrogelurilor pe bază de acid hialuronic

Cinetica dorită pentru degradarea hidrogelurilor depinde de aplicație. Degradarea este esențială în aplicații numeroase de eliberare de molecule mici sau mari și în aplicațiile de regenerare a țesutului funcțional.

În cazul hidrogelurilor cu aplicații in ingineria tisulară a pielii ar trebui să existe o corespondență între rata degradării acestuia și rata de formare a țesutului nou.

Pentru hidrogeluri sunt trei mecanisme de bază de degradare: hidroliză, clivaj enzimatic și dizolvare. Multe din hidrogelurile sintetice sunt degradate prin hidroliza legăturilor esterice. Hidrogelurile pe bază de polimeri carbohidrați cum ar fi acidul hialuronic și chitosan sunt degradate enzimatic. Degradarea enzimatică a matricilor pe bază de acid hialuronic în mediu biologic este catalizată de către hialuronidază. De asemenea s-a descoperit ca stabilitatea enzimatică a acidului hialuronic poate fi modulată prin grefarea cu aminoacizi [32].

Proprietățile soluțiilor de acid hialuronic

Controlul dizolvării HA este important deoarece dizolvarea și degradarea soluției sunt procese concurente. Dizolvarea completă este importantă pentru a maximiza reticularea intermoleculară și a reduce reacțiile intramoleculare dăunătoare. Parametrii hidrodinamici ai solutiilor de acid hialuronic pot fi măsurați folosind tehnici viscometrice și cromatografice, putând fi astfel evaluate sisteme reticulate pe bază de HA cu diferite grade de reticulare [30].

Modificări chimice și reticularea acidului hialuronic

Fig. 2.7 Acidul hialuronic

Fabricarea de scaffold-uri noi pe bază de acid hialuronic poate fi îndeplinită prin modificări chimice variate, rezultând astfel materiale robuste din punct de vedere mecanic și chimic.

Derivații rezultați au proprietăți fizico-chimice care diferă semnificativ fața de polimerul original, pastrându-se totuși biocompatibilitatea și biodegradabilitatea acidului hialuronic nativ.

Cea mai comună metodă de reticulare a acidului hialuronic este reticularea în scopul formării de hidrogeluri, în condiții acide, neutre sau alcaline.

Pentru a funcționaliza HA se pot de asemenea grefa o serie de substanțe care, ulterior, permit atașarea de medicamente în vederea eliberarii controlate a acestora în locul țintă. Astfel, grupările cele mai utilizate pentru modificările covalente ale acidului hialuronic sunt : gruparea carboxilică și funcțiunile hidroxilice.

Grupările hidroxilice și carboxilice din hialuronan pot fi reticulate cu formarea de legături eterice respectiv esterice. Dacă HA este tratat cu un acid sau o bază, acesta va suferi o deacetilizare parțială, rezultând grupări amino libere. Aceste grupări amino pot fi utilizate la reticulate, astfel, prin interacțiunea acestora cu grupările carboxilice se formează punți amidice.

Reacțiile de reticulare pot fi realizate folosind ca agenți de reticulare: carbodimide, aldehide, sulfide și epoxide polifuncționale. Auto-reticularea și foto-reticularea pot fi de asemenea realizate [34, 35].

Colagenul

Colagenul reprezintă aproximativ 5% din greutatea organismului, adică 25–35% din cantitatea totală de proteine. Se caracterizează printr-o serie de specificități: compoziția în aminoacizi, secvența aminoacizilor în lanțul polipeptidic, reactivitatea histochimică, periodicitatea la microscopul electronic. În colagen, toate unitățile peptidice se formează în poziția trans, ducând astfel la formarea triplului helix.

Capacitatea de a forma agregate supramoleculare în spațiile extracelulare este una din proprietățile caracteristice moleculelor care aparțin clasei de proteine. Cea mai caracteristică formă de agregat de colagen întâlnită este cea de fibrilă sau fibră [36,37].

Figura 2.8 Conformatia triplu helix a colagenului [40]

Colagenul are multe aplicații în domeniul biomedical și în ingineria tisulară datorită imunogenicitătii și toxicității scăzute și proprietăților unice. În afară de proprietățile mecanice, hemostatice și de adeziune celulară foarte bune, colagenul are și o excelentă biocompatibilitate precum și o biodegradabilitate dictabilă.

Datorită structurii fibroase, colagenul conferă rezistență și stabilitate țesuturilor corpului, cum ar fi tendoanelor, ligamentelor și pielii. Colagenul de tip I reprezintă un substrat ideal în procesele de reparare. Unele studii au demonstrat faptul că diferite tipuri de celule (epiteliale, endoteliale, keratinocite, fibroblaste, osteoblaste și condrocite) sunt capabile să adere și să prolifereze pe fibrele de colagen de tip I.

Structura colagenului

Moleculele de colagen prezintă două zone distincte: o zonă cu structură “ordonată” sau “cristalină” și o altă zonă cu o structură “dezordonată” sau “amorfă”.

Zona ordonată este constituită, în primul rând, din glicină, alanină, prolină, hidroxiprolină, iar legăturile de hidrogen se repetă periodic, la intervale regulate de-a lungul lanțului.

Zona dezordonată este constituită, în primul rând, din aminoacizi cu resturi laterale voluminoase și cu polarități diferite. Ea reprezintă cam 1/3 din molecula proteică.

Colagenul cuprinde o familie de molecule distincte genetic, care au o configurație unică de triplu helix cu 3 subunități polipeptidice (lanțuri α). Masa moleculară a unui α helix este 90-95000 Da.

Au fost izolate și identificate 19 tipuri de colagen. Colagenul de tip I este cel mai abundent.

Colagenul tip I, α1(I) 2α2(I), reprezintă circa 90% din totalul colagenului țesuturilor conjunctive, el participă în alcătuirea pielii, tendoanelor, corneei, a organelor interne etc. Acest tip de colagen a fost cel mai mult studiat, fiind cel de la care s-au obținut cele mai multe informații cu privire la structura și proprietățile colagenelor.

Compoziția în aminoacizi a colagenului

Din cei 20 de aminoacizi care participă la formarea macromoleculei de colagen, din punct de vedere cantitativ, cei mai importanți sunt: glicina, reprezentând aproximativ 30% din totalul aminoacizilor, prolina și hidroxiprolina (22,1%), alanina (11%), acizii glutamic și aspartic (11,8%), lizina și arginina (7,8%), serina (3,6%)

Structura colagenului

În perioada 1900-1910, chimistul german Emil Fischer a obținut date care sprijineau ipoteza că, aminoacizii din proteine se află combinați în lanțuri lungi, numite catene polipeptidice, iar legătura formată între doi aminoacizi, este legătura peptidică. F. Sanger (1945-1952) a determinat pentru prima dată secvența aminoacizilor din lanțurile polipeptidice de insulină. Folosindu-se metoda Sanger, s-a determinat structura primară a hemoglobinei și a mai multor proteine. Molecula de colagen tip I, de la vertebrate, are o formă de bastonaș, cu lungimea de 3000Ǻ și diametrul de 15Å, fiind formată din trei lanțuri α-polipeptidice, din care, două lanțuri α1 și un lanț α2.

Un lanț α-polipeptidic este format din aproximativ 1050-1100 amino-acizi, înlănțuiți într-o anumită ordine, determinată genetic (dependentă de specia din care provine), legați între ei prin legături peptidice. Greutatea moleculară a unui lanț este de 90000-95000 Da iar masa moleculară a colagenului este de aproximativ 300000 Da. Lanțurile α1 sunt mai bogate în amino-acizi polari, prolină, hidroxiprolină și mai sărace în aminoacizi neutri, în comparație cu lanțurile α2 [41].

Rolul colagenului în ingineria tisulară

Importanța colagenului în vindecarea rănilor a fost apreciată de mult timp, cicatricile fiind compuse din fibre de colagen. Colagenul nu contribuie doar la formarea cicatricilor ci și în stadiile inițiale ale vindecării.

Agregarea trombocitelor este cauzată de eliberarea de adenozindifosfat, eliberarea fiind indusă de colagen și alte substanțe.

Natură hidrofilă a colagenului datorată structurii sale moleculare, caracterizată printr-un conținut mare de aminoacizi diaminici/dicarboxilici, este foarte favorabilă pentru adeziunea celulară. Toate aceste caracteristici ale colagenului au impulsionat utilizarea lui pentru dezvoltarea diferitelor tipuri de pansamente sau grefe în scopul regenerării leziunilor cutanate [39].

CAPITOLUL 3. HIDROGELURI PENTRU INGINERIA TISULARĂ A PIELII

3.1 Aspecte generale despre hidrogeluri

Hidrogelurile sunt rețele polimerice hidrofile care pot absorbi de la 10-20% până la de câteva mii de ori apă în raport cu masa lor în stare uscată [42].

De la lucrarea de pionierat a lui Wichterle și Lim din 1960 în vederea obținerii unor hidrogeluri pe bază de 2-hidroxietil metacrilat (HEMA), domeniul s-a dezvoltat continuu și se dezvoltă în continuare exploziv, datorită aplicațiilor multiple și importante pe care hidrogelurile le au, în special în medicină și farmacie, dar și în alte domenii cum ar fi de exemplu agricultură [43]. În medicină si farmacie, principalele utilizări ale hidrogelurilor sunt cele în domeniul biosenzorilor, eliberarii controlate a medicamentelor și ingineriei tisulare.

Utilitatea hidrogelurilor se datorează proprietaților acestora:

Elasticitatea și conținutul lor în apă le face, din punct de vedere al interacțiunilor biologice la nivel molecular, similare cu țesutul natural;

multe hidrogeluri oferă suprafețe inerte (pentru diversele dispozitive implantabile) care previn adsorbția nespecifică a proteinelor (opsonizare);

diferite molecule (medicamente, factori de creștere) pot fi legate covalent de hidrogeluri prin intermediul unor reacții chimice bine controlate;

capacitatea de retenție a apei și proprietățile mecanice ale hidrogelurilor pot fi reglate relativ ușor prin modificarea gradului de reticulare;

pot fi proiectate hidrogelurile care să-și modifice proprietățile sub acțiunea unor factori externi, cum ar fi temperatură, pH, etc.

Lanțurile polimerice care formează structura hidrogelului sunt susceptibile la dizolvare, de aceea pentru a preveni dizolvarea in mediu apos, acestea sunt reticulate.

Reticularea lanțurilor macromoleculare poate fi:

Fizică, prin formarea unor legături ionice, a unor legături de hidrogen sau datorită forțelor hidrofobice. Aceste hidrogeluri se mai numesc și geluri fizice.

Chimică, prin formarea unor legături covalente între diferiți atomi ai lanțului polimeric, rezultând așa-numitele hidrogeluri permanente sau „geluri chimice”. Acestea se obtin prin:

Homo sau copolimerizare, prin mecanism radicalic (în majoritate cazurilor), a unor (macro) monomeri ce formează polimeri solubili în apă. Pentru obținerea rețelei este necesară prezența unui (co) monomer cu două sau mai multe grupări polimerizabile. Pentru evitarea utilizării inițiatorilor sau activatorilor potențial toxici, polimerizarea poate fi inițiată prin iradiere cu radiații de energie mare (radiații y sau β).

reacția de policondensare sau poliadiție ale unor compuși cu grupe funcționale antagoniste la capete, între care există și compusi cu funcționalitate mai mare de 2.

reacții polimer analoage asupra grupelor funcționale ale unui polimer preformat, solubil în apă.

reticularea polimerilor preformați prin iradiere cu radiații de energie ridicată, când au loc ruperi de catene și recombinări ale macroradicalilor formați [44].

Hidrogelurile pot fi proiectate să-si modifice proprietățile sub acțiunea unor stimuli externi. Acest tip de hidrogeluri, cunoscute sub denumirea de hidrogeluri sensibile la stimuli (sensitive/responsive hydrogels), se definesc ca fiind hidrogeluri care suferă o modificare drastică a uneia din proprietățile sale (de obicei volumul), sub acțiunea unor stimuli din mediul înconjurator [45].

În funcție de tipul de stimul la care reacționează, hidrogelurile se clasifică în:

hidrogeluri sensibile la temperatura- Modificarea temperaturii determină o micșorare sau o marire bruscă a volumului de apă reținut de hidrogel. Caracteristica definitorie a acestor geluri este temperatura de tranzitie.

hidrogeluri sensibile la pH – În fuctie de pH-ul mediului se modifică gradul de umflare al hidrogelului datorită conținutului acestuia în grupări acide sau bazice, care se ionizează mai mult sau mai puțin în funcție de concentrația ionilor de hidrogen (bineînteles și în funcție de pK-ul fiecărei grupări). Astfel de hidrogeluri permit, în funcție de valoarea pH-ului din zona respectivă, eliberarea controlată a medicamentelor în diverse locuri din corp (stomac, intestin).

hidrogeluri sensibile la tăria ionică – hidrogeluri care suferă modificari în funcție de concentrația sarurilor din mediu.

hidrogeluri sensibile la campurile magnetice și electrice – cu aplicații în sisteme de eliberare controlată a medicamentelor.

Capacitatea de sorbție a unui hidrogelului este o caracteristică definitorie a acestuia. Atunci când un hidrogel în stare uscată începe să absoarbă apă, primele molecule vor hidrata grupările cele mai polare, hidrofile. Pe masură ce aceste grupări sunt hidratate, rețeaua polimerică își marește volumul, expunându-si grupările hidrofobe, care de asemenea vor interacționa cu moleculele de apă, hidratându-le. După ce toate grupările hidrofile și hidrofobe au interacționat cu moleculele de apă, rețeaua va absorbi în continuare apă, având ca “motor” presiunea osmotică (în principal cea oncotică), care este mai ridicată în hidrogel. Acestei umflări adiționale i se opun reticulărilor de natură chimică/fizică dintre lanțurile polimerice. Ca urmare, hidrogelul va atinge un echilibru de gonflare. Apa adițională, care a fost absorbită după ce toate grupările ionice, polare sau hidrofobice s-au saturat, se numește apă liberă, fiind considerată fluidul care umple spațiile dintre lanțurile rețelei polimerice.

Gradul de umflare și modulul de elasticitate ale hidrogelurilor depind de agentul de reticulare, de concentrația acestuia, precum și de densitatea sarcinilor electrice ale lanțurilor polimerice [46].

3.2 Hidrogeluri pe bază de biopolimeri cu aplicații pentru ingineria tisulară a pielii

Hidrogelurile sunt folosite în aplicații medicale variate precum eliberarea de medicament, biosensori și ingineria tisulară.

Ingineria tisulară este un domeniu relativ nou, în plină explansiune, prin care sunt generate noi surse de țesuturi transplantabile folosind principiile ingineriei și biologiei. În majoritatea cazurilor, celulele sunt depuse pe materiale biodegradabile proiectate sub formă de matrici poroase (scaffold-uri). Pe masură ce celulele își sintetizează propria lor matrice extracelulară, materialul se degradează treptat, în final fiind formată o structură ce poate fi transplantată.

Hidrogelurile sunt bune pentru aplicațiile biologice datorită conținutului mare de apă și biocompatibilității. În ultimile decenii hidrogelurile au atras o atenție sporită, realizându-se un mare progres în proiectarea, sintetizarea și utilizarea acestor materiale în variate aplicații biologice și biomedicale.

Strategii recente ale aplicațiilor hidrogelurilor includ folosirea lor în ingineria tisulară ca matrici extracelulare artificiale ce pot fi populate cu celule.

Proteinele, în special factorii de creștere care ajută la dezvoltarea țesutului, pot fi încorporate în hidrogeluri. Modul de eliberare poate fi regulat, prin controlarea proprietăților chimice și fizice ale gelurilor, permițând astfel o eliberare de la câteva zile până la câteva luni.

Proiectarea hidrogelurilor și sinteza lor la scară industrială are un potențial semnificativ în regenerarea pielii [46].

CAPITOLUL 4. STRATEGIA EXPERIMETALĂ

Reticularea. Carbodiimidele

După cum s-a menționat anterior, reticularea lanțurilor macromoleculare poate fi realizată prin diverse mecanisme. Unul din mecanismele de reticulare este cel care utilizează agenți de reticulare precum carbodimidele, aldehidele, sulfidele și epoxidele polifuncționale.

Carbodiimidele sau metanodiiminele sunt compuși de originine organică care conțin urmatoarea grupare funcțională: RN=C=NR. În chimia organică compușii care conțin o astfel de grupare sunt agenți de dezhidratare, fiind adesea utilizați pentru a activa grupările carboxil ale acizilor carboxilici în vederea formării unor legături amidice sau esterice.

Avantajele utilizarii carbidiimidelor ca agenți de reticulare sunt date de posibilitatea formării legăturilor amidice la temperaturi scăzute, evitându-se astfel denaturarea compușilor, precum și de realizarea acestor legături în sisteme apoase.

Există de asemenea și carbodiimide insolubile în apă: dicicclohexil carbodiimida (DCC) și N, N’- diizopropil carbodiimida (DIC), acestea necesitând solvenți organici în care polizaharidele, ca HA, sunt insolubile.

1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDAC sau EDC) este cea mai utilizată carbodiimidă datorită solubilitații ridicate în apă [47]. Toxicitatea reacțiilor catalizate de această carbodiimidă a fost evaluată ca fiind scazută datorită faptului că EDAC-ul este transformat într-un derivat inofensiv de uree [48].

Nakajima and Ikada au efectuat o serie de cercetări care au dezvaluit mecanismul intim de acțiunea al EDAC-ului. În descrierea mecanismului se consideră următoarea convenție:

În prima etapă are loc protonarea carbodiimidei, rezultând astfel carbocationul 1, care, în abstență de acizi carboxilici disociați, este hidrolizat în derivatul de uree 2 (vezi A). În cazul prezenței ionului carboxil, carbocationul 1 adiționează nucleofil la acesta, rezultând O-acilureea 3 (vezi B).

Formarea legăturii amidice este posibila prin 2 rute:

amina primară 5, nedisociată, adiționează nucleofil la O-acilureea 3, rezultând amida 6 și derivatul de uree 2 (vezi C).

Ionul carboxilat, care este puternic nucleofil, poate reacționa cu O-acilureea 3 dând acidul anhidric 7, care la rândul său va reacționa cu amina primară 5, rezultând amida 6 (vezi D). Nakajima and Ikada [47] au postulat faptul că sirul de reacții D are loc doar atunci când acidul carboxilic este ciclizabil (poate forma un inel cu el insusi, de exemplu acidul maleic).

În cazul în care nu este prezentă o altă substanță nucleofilă, apa poate hidroliza O-acilureea 3 în derivatul de uree 2 și acidul carboxilic inițial E. Deoarece fracția molară a apei este cu mult mai mare decât a aminei primare 5, hidroliza O-acilureei 3 (vezi E) este mult mai plauzibilă decât formarea amidei (C si D).

De asemenea, O-acilureea nu este stabilă în soluție, putând suferi dizlocuirea N→O, rezultând N-acilureea 4, o forma mult mai stabilă din punct de vedere energetic ce se leagă covalent de acidul carboxilic (vezi F).

Mulți cercetători afirmă că majoritatea moleculelor de O-aciluree se transformă în N-aciluree, astfel, formarea legăturii amidice este inhibată.

Utilizarea esterilor succinimidici

EDAC necesită un mediu acid pentru protonare. La pH 4.75 rata de hidroliză a O-acilureei a fost estimată la 2-3 [49], ceea ce determină o dezactivare a acesteia (E), formarea legăturii amidice nemaiavând loc.

De asemenea, după cum s-a precizat anterior, există o susceptibilitate ridicată în transformarea O-acilureei în N-aciluree (mult mai stabilă energetic). Deci, O-acilureea este destul de nereactivă cu aminele primare, determinând astfel, un randament scazut de formare a legăturilor amidice.

Totusi, rata cuplarii O-acilureei cu aminele primare poate fi crescută cu ajutorul N-hidroxisuccinimidei (NHS) , rezultând compuși mult mai stabili la hidroliză.

Mecanismul de acțiune al N-hidroxisuccinimidei

Atunci când NHS reacționează cu O-acilureea rezultă un ester succinimidic, compus mult mai stabil la hidroliză (timpul de înjumatățire fiind de 40 min la un pH de 6 ). De asemenea, formarea N-acilureei este inhibată steric.

Astfel (vezi G), gruparea hidroxil a NHS 8 adiționează nucleofil la O-acilureea 3, rezultând derivatul de uree 2 și esterul succinimidic 9. Acesta din urmă interacționează cu amina primară (5) rezultând amida 9 și NHS regenerată.

4.2 Materiale și metode

În vederea proiectării hidrogelului s-au utilizat următoarele materiale:

Colagen tip I+III acido-solubil, extras din derm bovin, (0,96 %, δ = 0,97 g/), obținut de la firma Lohmann & Rauscher, Newied, Germania. Conținutul în aminoacizi per 1000 de unități este prezentat in Tabelul 4.1

Tabel 4.1 Compoziția în aminoacizi a colagenului

Acidul hialuronic (sarea sa de Na) produs prin fermentație cu ajutorul Strectococcus Equi a fost achiziționat de la Sigma Aldrich iar 1-etil-3-(3-dimetil-aminopropil) carbodiimida (EDAC) și N-hidroxisuccinimida (NHS) au fost furnizat de către Fluka Analytical.

Sinteza hidrogelului pe bază de colagen și acid hialuronic

Pentru obținerea hidrogelului pe bază de colagen și acid hialuronic s-au utilizat urmatoarele rapoarte:

Tabel 4.2 Rapoate utilizate în strategia experimentală

Datorită faptului că HA se găseste sub formă de sare de Na, a fost necesară trecerea prealabilă a acestuia printr-o coloană de schimbătoare de ioni. Această operație s-a realizat cu ajutorul unor rășini schimbatoare de ioni. Acestea prezintă o suprafață specifică mare, ceea ce favorizează adsorbția și eliberarea unor cantități mari de ioni.

Rășinile folosite în cadrul experimentului au ca și substrat polistirenul sulfonat (Figura 4.1)

Figura 4.1 Polistirenul sulfonat

Forma acidă a HA care prezintă o susceptibilitate mai mare de formare a legaturilor amidice.

Astfel, soluția de HA 1% (m/v) a fost adusă la o temperatură de 4°C pe baie de gheața, după care s-a adăugat EDAC/NHS și s-a menținut sub agitare magnetică timp de 60 de minute. Apoi, s-a introdus soluția de colagen 1% (m/v) a cărei pH a fost în prealabil ajustat sub valoarea 4 (pH izolelectric al colagenului). Reacția a fost lăsată pe baia de gheață 24 h.

Hidrogelurile obținute s-au purificat prin spălari repetate în apă distilată, timp de 3 zile, apoi au fost supuse congelării la -20 °C și liofilizării la – 62 °C și 0.03 mbari.

4.3 Metode de caracterizare

A.Spectroscopia în infraroșu cu transformată Fourier (FTIR)

Spectroscopia FTIR reprezintă o metodă analitică de identificare a materialelor organice, precum și a celor anorganice. Radiațiile infraroșii (IR) reprezintă radiațiile electromagnetice ale căror lungimi de undă (λ) sunt cuprinse între 0,8 – 200 μm (corespunzând domeniului spectrului electromagnetic cuprins între regiunea vizibilă și regiunea microundelor). Domeniul IR este divizat în trei subdomenii: IR apropiat, IR mijlociu si IR indepărtat. În vederea determinării structurii compușilor organici se înregistrează spectrul IR mijlociu, cu lungimi de undă situate în regiunea 2,5 – 25 μm ( cărora le corespunde numerele de undă cuprinse între 400-4000 ).

În urma excitării eșantionului de analizat cu radiații IR, o parte din aceste radiații sunt absorbite de probă iar o parte o traversează. Lungimile de undă la care acestea sunt absorbite sunt specifice fiecărui tip de legătură dintre atomii constituienți a unei molecule. Datele obținute sunt convertite într-un spectru real printr-un algoritm matematic cu ajutorul transformatei Fourier.

Spectrul FTIR permite vizualizarea intensității benzilor de absorbție în funcție de numărul de undă ῡ (frecvența ν, sau lungimea de undă λ) a radiației absorbite.

Spectrele FTIR au fost realizate cu Spectroscopul Bio-Rad Win-IR prin tehnica pastilării cu KBr. Pentru toate eșantioanele s-au înregistrat 100 de scanări între 4000-400 , cu o rezoluție de 4 . Pentru obținerea pastilelor de KBr, proba de analizat (5 mg) se mojarează cu KBr anhidră (500mg) iar amestecul rezultat este matrițat sub forma unui disc foarte subțire, cu un diametru de 10 μm.

B. Microscopia electronică de baleiaj (MEB)

Microscopia electronică de baleiaj (MEB) reprezintă o tehnică ce permite vizualizarea morfologiei și structurii materialelor. Un fascicol de electroni produs de către tunul electronic situat în partea superioară a microscopului urmează o traiectorie verticală prin coloana acestuia, apoi traversează o serie de lentile electromagnetice care au rolul de a-l focaliza și direcționa către suprafața probei. Suprafața probei, odată bombardată, emite alți electroni, aceștia sunt convertiți într-un semnal care mai apoi este transmis spre un monitor ce afișează imaginea prelucrată. Astfel, microscopia electronică de baleiaj permite vizualizarea clară a structurii generale a eșantionului analizat.

Analiza morfologică a hidrogelului pe bază de colagen și acid hialuronic a fost efectuată prin utilizarea microscopului electronic model VEGA II LSH, produs de firma TESCAN, Cehia. Acesta prezintă un tun de electroni cu filament din tungsten, ce îi permite obținerea unei rezoluții de 3 nm la 30 KV, având puterea de mărire cuprinsă între 30 și 1.000.000 X, tensiunea de accelerare între 200 V la 30 kV iar viteza de scanare între 200 ns și 10 ms/pixel. Probele, liofilizate, au fost apoi tăiate cu o lamă în bucăți mici care s-au fixat de substrat. Anterior fixării lor în camera MEB, eșantioanele secționate au fost acoperite cu un strat (3 nm) de aliaj aur-paladiu. Examinarea s-a realizat la 30 kV. Din datele prelevate de MEB se poate evalua porozitatea, distribuția și mărimea porilor.

În Figura 4.2 poate fi vizualizat microscopul electronic de baleiaj VEGA precum și reprezentarea schematică a principiului de funcționare al acestuia.

Figura 4.2 Microscopul electronic SEM VEGA (A) și reprezentarea schematică a principiului de funcționare (B) [50]

C. Teste de umflare

Testele de umflare se realizează prin evaluarea gradului maxim de retenție a apei, fiind definitoriu în evaluarea caracterizărilor fizico-chimice ale hidrogelului. Cu ajutorul acestui studiu putem determina, printre altele, densitatea de reticulare evidențiată prin scăderea gradului de retenție la echilibru.

Astfel, în evaluarea interacțiunii materialelor obținute în cadrul acestui studiu cu fluidele apoase s-a utilizat metoda volumetrică. Volumul de soluție reținut de fiecare probă s-a determinat cu ajutorul unei microcoloane (QIAquickRSpin Colummn 50, O = 10 mm) ce a fost atașată la o microseringă (Figura. 4.3). Microcoloana prezintă cu un capac ce nu permite evaporarea apei.

În vederea efectuării testelor, probele liofilizate (~ 20 mg) s-au imersat într-o soluție tampon fosfat (pH = 7,4), determinările s-au realizat la 37 °C, la diferite intervale de timp, timp de 5 de ore.

Curbele care caracterizează cinetica de retenție a eșantioanelor evaluate pot fi trasate prin determinarea, la diferite intervale de timp, a gradul de retenție a apei de către probe.

Figura 4.3 Micro-coloana QIAquick® Spin Column și reprezentarea componentelor dispozitivului de măsurare [50]

4.4 Rezultate și discuții

4.4.1 Sinteza hidrogelurilor pe bază de acid hialuronic și colagen

În acest studiu, s-a emis ipoteza că grupele carboxil ale acidului hialuronic pot interacționa cu grupările amino ale colagenului, formând astfel legături amidice, reacția fiind catalizată de EDAC și NHS.

Ca agent de reticulare s-a utilizat EDAC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimidă), o carbodiimidă solubilă în apă, a cărei toxicitate a fost evaluată ca fiind scazută [48].

EDAC nu va fi încorporat în noua structură, el transformându-se la final într-un derivat solubil in apă care poate fi îndepărtat cu ușurință prin dializă. Mecanismul prin care intervine în formarea legăturilor amidice dintre grupările carboxil ale acizilor glucuronici cu resturile de aminoacizi care prezintă grupări animo primare din structura colagenului a fost descris anterior.

Succint, EDAC reacționează cu gruparea carboxil pentru a forma un intermediar instabil (O acilureea), care, în absența nucleofililor poate suferi o transformare trecând în N-aciluree (forma mult mai stabilă din punct de vedere energetic). În prezența substanțelor nucleofile, precum aminele primare, O acilureea reacționează cu acestea, rezultând astfel o legătura amidică.

De asemenea, randamentul de reticulare cu EDAC este dependent de pH (domeniul optim fiind cuprins între 4 si 5), de prezența N-hidroxisuccinimidei și de temperatură (temperatura necesară unui randament maxim fiind cuprinsă între 0-4 °C).

4.4.2 Spectrele FTIR ale hidrogelurilor pe bază de colagen și acid hialuronic

Pentru a investiga structura chimică în scopul evidențierii existenței acidului hialuronic și a colagenului în compoziția hidrogelului s-a utilizat spectroscopia FTIR.

Datele de spectroscopie FTIR obținute pentru hidrogelurile pe bază de colagen și acid hialuronic sunt prezentate în figura 4.4.

Prezența picurilor la 1034 cm-1 în Col/HA 1 și Col/HA 2 indică existența legăturii semiacetalice C-O-C dintre unitățile zaharidice ale acidului hialuronic. De asemenea, picurile în 3300 cm-1 și 3074 cm-1 indică prezența legăturilor amidice din strucura colagenului. Deci, se poate deduce prezența atât a acidului hialuronic cât și a colagenului în noul hidrogel obținut.

Figura 4.4 Spectrele FTIR colagen/acid hialuronic/ hidrogel colagen-HA

4.4.3 Caracterizarea MEB(microscopie electronică prin baleiaj) a microstructurii hidrogelurilor pe bază de colagen și acid hialuronic

Imaginile furnizate (figura 4.5) de microscopia electronică de baleiaj ne oferă informații privitoare la arhitectura compozitului acid hialuronic-colagen. Se pot observa structura poroasă a acestuia, cu pori intercomunicabili, ale căror dimensiuni variază între 50-100 µm.

Figura 4.5 Imaginile MEB ale hidrogelului pe bază de HA-Colagen

4.4.4 Testele de umflare

Gradul de umflare este una dintre cele mai importante proprietăți ale hidrogelurilor, fiind în funcție de porozitatea acestuia și natura biomaterialului. Abilitatea de retenție a apei este una din cerințele de bază ale biomaterialelor utilizate în proiectarea substituienților dermali sau cu aplicații în ingineria citotisulară. În figura 4.6 este prezentată evoluația în timp a volumului de soluție tampon fosfat (PBS) reținut de cele doua probe. P1, P2 reprezintă hidrogelurile pe bază de acid hialuronic și colagen obținute prin reticularea celor 2 biopolimeri, pentru prima probă (P1) colagenul a fost adus la pH 4 cu ajutorul acidului acetic, în timp ce pentru cea de-a doua probă (P2) s-a utilizat acidul clorhidric. Diferențele de volum absorbit dintre cele 2 eșantioane supuse umflării se datorează diferențelor de masă dintre ele și nu datorită agentului utilizat pentru corectarea pH-ului.

Figura 4.6 Gradul de umflare al probelor

4.5 Concluzii și perspective

Scopul acestei lucrări a fost de a sintetiza o serie de hidrogeluri pe bază de acid hialuronic și colagen cu potențiale aplicații în proiectarea substituienților de piele.

S-a demonstrat posibilitatea reticulării celor doi biopolimeri prin formarea unor legături amidice între grupările carboxil ale acizilor glucuronici și grupările amino ale resturilor de aminoacizi din structura colagenului.

1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimiida poate fi folosită cu succes în catalizarea acestei reacții. De asemenea, utilizarea N-hidroxisuccinimidei este absolut necesară pentru a crește randamentul acesteia.

Formarea noului hidrogel necesită un timp îndelungat de interacțiune între cei 2 polimeri (24 h), totul realizându-se într-un mediu cu un domeniu limitat de variație a temperaturii (0-4 °C). În acest interval activitatea catalitică a 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimiidei este maximă.

Obiectivarea existenței acidului hialuronic cât și a colagenului în compoziția hidrogelului s-a realizat cu ajutorul spectroscopiei în infraroșu cu transformată Fourier. S-a demonstrat astfel existența picurilor caracteristice acidului hialuronic și colagenului, în ambele materiale realizate în cadrul studiului experimental.

S-a evidențiat, cu ajutorul microscopiei electronice de baleiaj, existența structurii poroase a hidrogelulurilor, cu pori intercomunicabili ale căror dimensiuni variază între 50 și 100 µm. Astfel, suprafața specifică mare a materialului favorizează posibilitatea migrării fibroblastelor și keratinocitelor în interiorul acestuia. Ca urmare, ingineria tisulară a pielii poate beneficia de noile hidrogeluri, acestea putând fi cu succes folosite ca suporturi matriciale (scaffold-uri) în vederea populării cu celule proprii tegumentului uman.

În ceea ce privește perspectivele actualei lucrări, se dorește evaluarea citotoxicității materialelor obținute precum și a capacității de migrare, diferențiere și proliferare a celulelor ce vor fi însămânțate ulterior în hidrogeluri.

De asemenea se dorește realizarea unui program experimental al cărui scop va fi de a evidenția influența modificării raportului colagen/acid hialuronic asupra proprietăților fizico-chimice ale hidrogelului.

BIBLIOGRAFIE

[1] Valerie C. Scanlon, Tina Sanders, Essentials of Anatomy and Physiology, pag. 109, Fifth Edition, 2007

[2] Haulică I., Fiziologie umană, Editura Medicală, București, pag. 616-628, 2007

[3] Valerie C. Scanlon, Tina Sanders, Essentials of Anatomy and Physiology, pag. 110, Fifth Edition, 2007

[4] Kenneth Saladin, Anatomy and physiology-The unity of form and function,pag. 192-210, 3rd Edition, 2006

[5] Petra Ramasastry, Donald T Downing, Peter E Pochi, Chemical composition of human skin, Journal of Investigative Dermatology , vol 54, pag. 139–144

[6] Cavani, A.; Zambruno, G. Marconi, A.Manca, V. Marchetti, M. Giannetti, J. Invest. Dermatol., 600–604, 1993

[7] Stock U.A., Vacanti J.P., Tissue engineering: Current state and prospects, Annual Review of Medicine 52, 443–451, 2001

[8] R.F. Diegelmann, M.C. Evans, Wound healing: an overview of acute, fibrotic and delayed healing, Front. Biosci. 9, 283–289, 2004

[9] R. Papini,Management of burn injuries of various depths, BMJ 329, 158–160, 2004

[10] C. Blanpain, W.E. Lowry, A. Geoghegan, L. Polak, E. Fuchs, Self-renewal, multipotency, and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche, Cell 118,635–648, 2004

[11] T. Tumbar, G. Guasch, V. Greco, C. Blanpain, W.E. Lowry, M. Rendl, E. Fuchs, Defining the epithelial stem cell niche in skin, Science 303, 359–363, 2004

[12] R.V. Shevchenko, S.L. James, S.E. James, A review of tissue-engineered skin bioconstructs available for skin reconstruction, J. R. Soc. Interface 7 (2010) 229–258.

[13] R.A. Stanton, D.A. Billmire, Skin resurfacing for the burned patient, Clin. Plast. Surg. 29, 29–51, 2002

[14] Y.J. Bolivar-Flores, W. Kuri-Harcuch, Frozen allogeneic human epidermal cultured sheets for the cure of complicated leg ulcers, Dermatol. Surg. 25, 610–617, 1999

[15] J. Bolivar-Flores, E. Poumian, M. Marsch-Moreno, G. Montes de Oca, W. Kuri- Harcuch, Use of cultured human epidermal keratinocytes for allografting burns and conditions for temporary banking of the cultured allografts, Burns 16, 3–8, 1990

[16] L.A. Duinslaeger, G. Verbeken, S. Vanhalle, A. Vanderkelen, Cultured allogeneic keratinocyte sheets accelerate healing compared to Op-site treatment of donor sites in burns, J. Burn Care Rehabil. 18, 545–551, 1997

[17] M.R. Madden, A.A. LaBruna, D.P. Hajjar, L. Staiano-Coico, Transplantation of cryopreserved cultured epidermal allografts, J. Trauma 40 (1996) 743–750.

[18] D.M. Supp, S.T. Boyce, Engineered skin substitutes: practices and potentials, Clin.Dermatol. 23, 403–412, 2005

[19] E.G. Kolokol'chikova, L.I. Budkevich, A.E. Bobrovnikov, A.K. Badikova, V.P. Tumanov, Morphological changes in burn wounds after transplantation of allogenic fibroblasts, Bull. Exp. Biol. Med. 131, 89–93, 2005

[20] R.A. Clark, K. Ghosh, M.G. Tonnesen, Tissue engineering for cutaneous wounds, J. Invest. Dermatol. 127, 1018–1029, (2007)

[21] Kadler, K. E.; Holmes, D. F.; Trotter, J. A.; Chapman, J. A. Biochem. J.,1–11, 1996

[22] Lee, C. H.; Singla, A.; Lee, Y. Int. J. Pharmacol. 2001, 221, 1–22.

[23] Ruszczak, Z. Adv. Drug Deliv. Rev. 2003, 55, 1595–1611.

[24] Li, S. T. In The Biomedical Engineering Handbook, 2nd ed.; Bronzino, J. D., Ed.;

CRC Press: Boca Raton, FL, 2000; Vol. 1.

[25] Hudon, V.; Berthod, F.; Black, A. F.; Damour, O.; Germain, L.; Auger, F. A. Br. J.

Dermatol. 2003, 148, 1094–1104.

[26] Tremblay, P. L.; Hudon, V.; Berthod, F.; Germain, L.; Auger, F. A. Am. J. Transplant. 2005, 5, 1002–1010.

[27] Butler, C. E.; Orgill, D. P. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol., 23–41, 2005

[28] Koide, T. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci., 1281–1291, 2007

[29] Turley EA, Noble PW, Bourguignon LY. Signaling properties of hyaluronan receptors. J Biol Chem 2002; 277:4589–4592.

[30] Misra S, Ghatak S, Zoltan-Jones A, Toole BP. Regulation of multidrug resistance in cancer cells by hyaluronan. J Biol Chem 2003; 278:25285–25288.

[31] Lesley J, Hyman R. CD44 can be activated to function as an hyaluronic acid receptor in normal murine T cells. Eur J Immunol 1992; 22:2719–2723.

[32] Levesque MC, Haynes BF. Cytokine induction of the ability of human monocyte CD44 to bind hyaluronan is mediated primarily by TNF-alpha and is inhibited by

[33] Salustri, A., & Fulop, C. (Eds.). (1998). Role of hyaluronan during ovulation and fertil-ization. http://www.glycoforum.gr.jp

[34] Schante, C., Zuber, G., Herlin, C., & Vandamme, T. F. (2011). Synthesis of N-alanyl-hyaluronamide with high degree of substitution for enhanced resistance to hyaluronidase-mediated digestion. Carbohydrate Polymers, 86(2), 747–752.

[35] Schante, C. E., Zuber, G., Herlin, C., & Vandamme, T. F. (2011). Chemical modifications of hyaluronic acid for the synthesis of derivatives for a broad range of biomedical applications. Carbohydrate Polymers, 85(3), 469–489

[36]Boudko, S., Frank, S., Kammerer, R. A., Stetefeld, J., Schulthess, T.Landwehr, R., Lustig, A., Bachinger, H. P., and Engel, J. (2002).

[37] Nucleation and propagation of the collagen triple helix in singlechain and trimerized peptides: Transition from third to first order kinetics. J. Mol. Biol. 317, 459–470.

[38] Canty, E. G., and Kadler, K. E. (2002). Collagen fibril biosynthesis in tendon: A review and recent insights. Comp. Biochem. Physiol. A Mol. Integr. Physiol. 133, 979–985.

[39] Prockop, D. J., and Kivirikko, K. I. (1995). Collagens: Molecular biology, diseases, and potentials for therapy. Annu. Rev. Biochem. 64, 403–434.

[40] http://www.bio.miami.edu/tom/courses/protected/MCB6/ch19/19-22.jpg

[41] Chirita Mihai, Chirita Gheorghe, Tratat de biolomecule, vol 2, pag. 1-100, Editura Sedcom Libris

[42] N. A. Peppas, Hydrogels, in Biomaterials Science: An Introduction to Materials in Medicine, 2-nd edition, editori: B. D. Ratner, A. S. Hoffman, F. J. Schoen, J. E. Lemons, Academic Press, New York, 2004, pag. 100.

[43] O. Wichterle, D. Lim, Hydrophilic gels in biologic use, Nature 185, 117 (1960).

[44] W. E. Hennink, C. F. Van Nostrum, Novel crosslinking methods to design hydrogels, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 13 (2002).

[45] C. de las Heras Alarcon, S. Pennadam, C. Alexander, Stimuli responsive polymers for biomedical applications, Chem. Soc. Rev. 34, 276 (2005)

[46] E. Ho, A. Lowman, M. Marcolongo, Synthesis and characterization of an injectable hydrogel with tunable mechanical properties for soft tissue repair, Biomacromolecules 7, 3223 (2006).

[47] Nakajima N. and Ikada Y.. Mechanism of amide formation by carbodiimide for bioconjugation in aqeous media, Bioconjugate Chem., 1995, 6, 123-130

[48] Park S. N., Park J. C., Kim H. O., Song J. M. and Suh H. Characterization of porous collagen/hyaluronic acid scaffold modified by 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide cross-linking. Biomat. 2002, 23,1205-1212

[49] Hoare, D. G. and Koshland, D. E., Jr. A method for the quantitative modification and estimation of carboxylic acid groups in proteins, J. Biol. Chem. 1967, 242 (10), 2447-2453

[50] Simona Potorac, Rețele interpenetrate pe bază de colagen funcționalizat și polimeri sintetici cu aplicații biomedicale, Teza de doctorat, pag 76-77, 2011

BIBLIOGRAFIE

[1] Valerie C. Scanlon, Tina Sanders, Essentials of Anatomy and Physiology, pag. 109, Fifth Edition, 2007

[2] Haulică I., Fiziologie umană, Editura Medicală, București, pag. 616-628, 2007

[3] Valerie C. Scanlon, Tina Sanders, Essentials of Anatomy and Physiology, pag. 110, Fifth Edition, 2007

[4] Kenneth Saladin, Anatomy and physiology-The unity of form and function,pag. 192-210, 3rd Edition, 2006

[5] Petra Ramasastry, Donald T Downing, Peter E Pochi, Chemical composition of human skin, Journal of Investigative Dermatology , vol 54, pag. 139–144

[6] Cavani, A.; Zambruno, G. Marconi, A.Manca, V. Marchetti, M. Giannetti, J. Invest. Dermatol., 600–604, 1993

[7] Stock U.A., Vacanti J.P., Tissue engineering: Current state and prospects, Annual Review of Medicine 52, 443–451, 2001

[8] R.F. Diegelmann, M.C. Evans, Wound healing: an overview of acute, fibrotic and delayed healing, Front. Biosci. 9, 283–289, 2004

[9] R. Papini,Management of burn injuries of various depths, BMJ 329, 158–160, 2004

[10] C. Blanpain, W.E. Lowry, A. Geoghegan, L. Polak, E. Fuchs, Self-renewal, multipotency, and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche, Cell 118,635–648, 2004

[11] T. Tumbar, G. Guasch, V. Greco, C. Blanpain, W.E. Lowry, M. Rendl, E. Fuchs, Defining the epithelial stem cell niche in skin, Science 303, 359–363, 2004

[12] R.V. Shevchenko, S.L. James, S.E. James, A review of tissue-engineered skin bioconstructs available for skin reconstruction, J. R. Soc. Interface 7 (2010) 229–258.

[13] R.A. Stanton, D.A. Billmire, Skin resurfacing for the burned patient, Clin. Plast. Surg. 29, 29–51, 2002

[14] Y.J. Bolivar-Flores, W. Kuri-Harcuch, Frozen allogeneic human epidermal cultured sheets for the cure of complicated leg ulcers, Dermatol. Surg. 25, 610–617, 1999

[15] J. Bolivar-Flores, E. Poumian, M. Marsch-Moreno, G. Montes de Oca, W. Kuri- Harcuch, Use of cultured human epidermal keratinocytes for allografting burns and conditions for temporary banking of the cultured allografts, Burns 16, 3–8, 1990

[16] L.A. Duinslaeger, G. Verbeken, S. Vanhalle, A. Vanderkelen, Cultured allogeneic keratinocyte sheets accelerate healing compared to Op-site treatment of donor sites in burns, J. Burn Care Rehabil. 18, 545–551, 1997

[17] M.R. Madden, A.A. LaBruna, D.P. Hajjar, L. Staiano-Coico, Transplantation of cryopreserved cultured epidermal allografts, J. Trauma 40 (1996) 743–750.

[18] D.M. Supp, S.T. Boyce, Engineered skin substitutes: practices and potentials, Clin.Dermatol. 23, 403–412, 2005

[19] E.G. Kolokol'chikova, L.I. Budkevich, A.E. Bobrovnikov, A.K. Badikova, V.P. Tumanov, Morphological changes in burn wounds after transplantation of allogenic fibroblasts, Bull. Exp. Biol. Med. 131, 89–93, 2005

[20] R.A. Clark, K. Ghosh, M.G. Tonnesen, Tissue engineering for cutaneous wounds, J. Invest. Dermatol. 127, 1018–1029, (2007)

[21] Kadler, K. E.; Holmes, D. F.; Trotter, J. A.; Chapman, J. A. Biochem. J.,1–11, 1996

[22] Lee, C. H.; Singla, A.; Lee, Y. Int. J. Pharmacol. 2001, 221, 1–22.

[23] Ruszczak, Z. Adv. Drug Deliv. Rev. 2003, 55, 1595–1611.

[24] Li, S. T. In The Biomedical Engineering Handbook, 2nd ed.; Bronzino, J. D., Ed.;

CRC Press: Boca Raton, FL, 2000; Vol. 1.

[25] Hudon, V.; Berthod, F.; Black, A. F.; Damour, O.; Germain, L.; Auger, F. A. Br. J.

Dermatol. 2003, 148, 1094–1104.

[26] Tremblay, P. L.; Hudon, V.; Berthod, F.; Germain, L.; Auger, F. A. Am. J. Transplant. 2005, 5, 1002–1010.

[27] Butler, C. E.; Orgill, D. P. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol., 23–41, 2005

[28] Koide, T. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci., 1281–1291, 2007

[29] Turley EA, Noble PW, Bourguignon LY. Signaling properties of hyaluronan receptors. J Biol Chem 2002; 277:4589–4592.

[30] Misra S, Ghatak S, Zoltan-Jones A, Toole BP. Regulation of multidrug resistance in cancer cells by hyaluronan. J Biol Chem 2003; 278:25285–25288.

[31] Lesley J, Hyman R. CD44 can be activated to function as an hyaluronic acid receptor in normal murine T cells. Eur J Immunol 1992; 22:2719–2723.

[32] Levesque MC, Haynes BF. Cytokine induction of the ability of human monocyte CD44 to bind hyaluronan is mediated primarily by TNF-alpha and is inhibited by

[33] Salustri, A., & Fulop, C. (Eds.). (1998). Role of hyaluronan during ovulation and fertil-ization. http://www.glycoforum.gr.jp

[34] Schante, C., Zuber, G., Herlin, C., & Vandamme, T. F. (2011). Synthesis of N-alanyl-hyaluronamide with high degree of substitution for enhanced resistance to hyaluronidase-mediated digestion. Carbohydrate Polymers, 86(2), 747–752.

[35] Schante, C. E., Zuber, G., Herlin, C., & Vandamme, T. F. (2011). Chemical modifications of hyaluronic acid for the synthesis of derivatives for a broad range of biomedical applications. Carbohydrate Polymers, 85(3), 469–489

[36]Boudko, S., Frank, S., Kammerer, R. A., Stetefeld, J., Schulthess, T.Landwehr, R., Lustig, A., Bachinger, H. P., and Engel, J. (2002).

[37] Nucleation and propagation of the collagen triple helix in singlechain and trimerized peptides: Transition from third to first order kinetics. J. Mol. Biol. 317, 459–470.

[38] Canty, E. G., and Kadler, K. E. (2002). Collagen fibril biosynthesis in tendon: A review and recent insights. Comp. Biochem. Physiol. A Mol. Integr. Physiol. 133, 979–985.

[39] Prockop, D. J., and Kivirikko, K. I. (1995). Collagens: Molecular biology, diseases, and potentials for therapy. Annu. Rev. Biochem. 64, 403–434.

[40] http://www.bio.miami.edu/tom/courses/protected/MCB6/ch19/19-22.jpg

[41] Chirita Mihai, Chirita Gheorghe, Tratat de biolomecule, vol 2, pag. 1-100, Editura Sedcom Libris

[42] N. A. Peppas, Hydrogels, in Biomaterials Science: An Introduction to Materials in Medicine, 2-nd edition, editori: B. D. Ratner, A. S. Hoffman, F. J. Schoen, J. E. Lemons, Academic Press, New York, 2004, pag. 100.

[43] O. Wichterle, D. Lim, Hydrophilic gels in biologic use, Nature 185, 117 (1960).

[44] W. E. Hennink, C. F. Van Nostrum, Novel crosslinking methods to design hydrogels, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 13 (2002).

[45] C. de las Heras Alarcon, S. Pennadam, C. Alexander, Stimuli responsive polymers for biomedical applications, Chem. Soc. Rev. 34, 276 (2005)

[46] E. Ho, A. Lowman, M. Marcolongo, Synthesis and characterization of an injectable hydrogel with tunable mechanical properties for soft tissue repair, Biomacromolecules 7, 3223 (2006).

[47] Nakajima N. and Ikada Y.. Mechanism of amide formation by carbodiimide for bioconjugation in aqeous media, Bioconjugate Chem., 1995, 6, 123-130

[48] Park S. N., Park J. C., Kim H. O., Song J. M. and Suh H. Characterization of porous collagen/hyaluronic acid scaffold modified by 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide cross-linking. Biomat. 2002, 23,1205-1212

[49] Hoare, D. G. and Koshland, D. E., Jr. A method for the quantitative modification and estimation of carboxylic acid groups in proteins, J. Biol. Chem. 1967, 242 (10), 2447-2453

[50] Simona Potorac, Rețele interpenetrate pe bază de colagen funcționalizat și polimeri sintetici cu aplicații biomedicale, Teza de doctorat, pag 76-77, 2011