Ingineria Genica In Sistemul Procariot DE Expresie
INGINERIA GENICĂ ÎN SISTEMUL PROCARIOT DE EXPRESIE
CUPRINS
LISTA ABREVIERILOR
INTRODUCERE
CAPITOLUL I. Cadrul teoretic
Învelișul celular al bacteriei
Bacteriile Gram – pozitive și Gram-negative
Aparatul genetic al celulelor bacteriene
Activitatea genică la procariote
Prezentarea principiilor metodei de clonare și exprimare a genelor în sistem procariot
Exprimarea genelor în sistem procariot
Bazele tehnico-materiale ale ingineriei genice
CAPITOLUL II. MATERIALE ȘI METODE
2.1 Vectori de clonare:
2.1.1 Vectori de clonare plasmidiali
2.1.2 Vectori derivați din fagi filamentoși
2.1.3 Vectori de clonare hibrizi de tip fagimide
2.1.4 Vectori derivați din genomul bacteriofagului λ
2.1.5 Vectori de clonare hibrizi de tip cosmide
2.2 Tehnici moleculare utilizate in selecția asistată de markeri genetici
2.2.1. Tehnica PCR
2.2.1.1.Tehnica RFLP
2.2.1.2. Tehnica AFLP
2.2.1.3. Tehnicile MAAP
2.2.1.3.1. Tehnica RAPD
2.2.1.3.2. Tehnica DAF
2.2.1.3.3. Tehnica AP – PCR
2.2.1.4 Tehnica RT – PCR
2.2.1.5. Tehnica microsateliților – SSR
2.2.1.6. Tehnica EST
2.2.1.7. Tehnica SCAR
2.2.1.8. Tehnica SNP
2.2.1.9. Tehnica STS
2.2.1.10. Tehnica ARMS –PCR
2.2.2. TEHNICA SSCP
2.2.3. TEHNICI BAZATE PE SECVENȚIERE
CAPITOLUL III.
3 .1.Fctorii de îmbunatațire a randamentului de proteine funcționale în E.coli
3.1.1 Exprimarea mai redusa o pliere mai buna
3.1.2 Perturbare metabolica redusă la minim
3.1.3 Limitări stoichiometrice
3.1.4 Formarea agregatelor de proteine
3.1.5 Concluziile cu privire la obținerea unui randament mare de proteine recombinate
3.2 Producția vaccinurilor de glicoproteina în Escherichia coli
3.2.1 Crearea glicocoproteinelor folosite pentru vaccinul împotriva shigellozei.
3.2.2 Experimente în bioreactor
3.2.3 Metodele de analiză
3.2.4 Rezultatele obținute în crearea vaccinului anti- shigellozic
3.2.5 Efectul concentrațiilor IPTG reduse și cultivare redusă temperatură
3.2.6 Efectul de surse de emisii de carbon și de energie cu privire la eficiența glicozilare
3.2.7 Producția de glycoproteine în cultura fed – batch
3.2.8 Concluzii cu privire la obținerea vaccinurilor de glicoproteine
3.3 Efectele secundare ale însoțitorilor de gene co- exprimate în producerea proteinelor recombinate
3.3.1.DnaK
3.3.2.GroEL ( S )
3.3.3.Rezolvarea: proteoliza însotitorului-modulator
3.3.4.Concluzii cu privire la efectele secundare ale însoțitorilor de gene
CONCLUZII ȘI RECOMANDĂRII
BIBLIOGRAFIE
ANEXE
DECLARAȚIA PRIVIND ASUMAREA RĂSPUNDERII
LISTA ABREVIERILOR
A – adenină
ADN – acidul dezoxiribonucleic
AP-PCR – Arbitrary Primed PCR
ARN – acidul ribonucleic
ATP – acidul adenozintrifosforic
C – citozină
DAF – Amplification Fingerprinting
E. coli -Escherichia coli
EST – Expressed Sequence Taq
G – guanină
HGH – Human Growth Hormone
IPTG – isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid
MAAP – Multiple Arbitrary Amplicon Profiling
PCR- reacția de polimerizare în lanț
Rbs – Ribosome Binding Site
RAPD – Random Amplified Polymorphic DNA
S. dysenteriae – Shigella dysenteriae
SCAR – Sequence Characterized Amplified Region
SNP – Single Nucleotid Polymorphism
SSCP – SINGLE STRAND CONFORMATION POLYMORPHISM
SSR – Simple Sequence Repeats
T – timină
U – uracil
INTRODUCERE
Termenul de Inginerie genetică părea, acum ceva timp, ca fiind desprins din domeniul științifico-fantastic. Astăzi, a devenit o realitate bine conturată și cu rezultate promițătoare în toate domeniile vieții cotidiene.
Ingineria genică poate fi definită drept ansamblu de metode și tehnici prin care este posibilă manipularea materialului genetic la nivel celular și molecular pentru a obține pe căi netradiționale produși utili omului și genotipuri noi, având la bază tehnologia moleculelor recombinate (hibride) de ADN[2].
Ingineria genetică cuprinde tehnici efectuate în vitro cu gene, cromozomi sau celule întregi în scopul construirii unor structuri reprogramate genetic. Cuprinde o inginerie genetică celulară reprezentată de fuziunea de protoplaști și o inginerie genetică moleculară reprezentată de tehnologia ADN recombinant. Tehnologia ADN recombinant reprezintă un ansamblu de metode prin care se realizează în vitro, molecule de ADN recombinante, permitând, clonarea unor gene de origini diferite, atît în celula procariotă cît și în celula eucariotă. Realizarea acestei tehnologii presupune construirea unor vectori de clonare, izolarea unor gene de interes (denumite inițial ADN pasager, în prezent, ADN heterolog) și utilizarea unui echipament enzimatic corespunzător: endonucleaze de restricție, ADN ligaze, polimeraze, exonucleaze, fosfataze alcaline, revertranscriptaze, terminaltransferaze, etc.
Ingineria genică se profilează ca direcție științifică și tehnologică în anii '70. Apariția ei a fost determinată, în primul rând, de aprofundarea cunoștințelor de genetică la nivel celular și molecular, de dezvoltarea cunoștințelor privind materialul genetic al organismelor vii, și anume:
descoperirea mecanismelor principale de transmitere a informației ereditare: transformația (A.Avery, C.MacLeod, M.MacCarty, 1944) – prin intermediul fragmentelor de ADN; sexducția (J.Lederberg, E.Tatum, 1946) – prin conjugarea bacteriilor și transducția (J.Lederberg, 1952) – cu ajutorul fagilor;
descoperirea structurii moleculei de ADN (J.Watson, F.Crick, 1953);
descoperirea și izolarea enzimelor de restricție și legare a fragmentelor de ADN (H.Smith, 1970);
descoperirea fenomenului transcripției inverse a informației genetice de la ADN (H.Temin, S.Mizutani, D.Baltimor, 1970);
descoperirea sintezei chimice a genelor (A.Kornberg, 1967; H.Khorana, 1970, 1976) .
Argumentarea importanței și actualității temei cercetate
Datorită cercetărilor în tehnologia ADN-ului recombinat, au fost elaborate metode de transfer de gene în celulele procariote, care pot sintetiza multe proteine utile. Astfel, a devenit posibilă producerea și chiar comercializarea pe scară largă a unor hormoni (insulina, somatostatina, somatotropina), a interferonului, a preparatelor de diagnosticare etc.
Obținerea insulinei umane și a altor hormoni.
Din 60 de milioane de diabetici, circa 4 milioane necesită un tratament cu insulină.
În 1916, E.Sharpy-Schafer a descoperit că insulina este secretată de celule care alcătuiesc insulele Langherhans din pancreas, ceea ce l-a determinat să numească hormonul insulină. În .Banting și H.Best, , au izolat din pancreasul de câine hormonul insulină, demonstrând acțiunea lui antidiabetică. În 1923, firma farmaceutică americană “Eli Lilly” pune deja în vânzare prima insulină animală (în prezent, pentru a obține circa 100 grame de insulină, este nevoie de de pancreas de bou (greutatea medie a unui pancreas de bou este de 200-250 grame)).
Insulina umană este alcătuită din două catene polipeptidice A și B, compuse respectiv din 21 și 30 de aminoacizi, a căror secvență a fost stabilită în 1955 de F.Sanger.
În perioada 1963-1965, trei grupe de cercetători (americani, germani și chinezi) au reușit sinteza artificială a insulinei prin intermediul a 170 de reacții chimice, lucru ce făcea imposibilă producerea insulinei pe cale industrială.
Noile tehnologii industriale de obținere a insulinei umane au fost posibile odată cu extragerea genei insulinei (W.Gillbert și colaboratorii săi, 1980) și crearea moleculelor recombinate de ADN în baza plasmidelor (fig.1).
Fig.1. Schema obținerii insulinei umane
Moleculele recombinate de ADN sunt transferate în colibacili (Escherichia coli), unde are loc realizarea informației genetice codificate în molecula de ADN. Paralel cu proteinele specifice bacteriei, se sintetizează și insulina. Pentru a proteja insulina umană (ea nu este proprie colibacililor și este distrusă de enzimele bacteriene), în molecula recombinată de ADN se încadrează, pe lângă gena insulinei, și o genă reglatoare care codifică o proteină specifică colibacililor (de exemplu galactozidaza). Ca rezultat al manifestării informației genetice a moleculei recombinate de ADN, se obține o catenă polipeptidică hibridă, din care mai apoi se separă insulina.
Datorită utilizării tehnologiei ADN-ului recombinat, se obțin aproximativ 200 grame de insulină de pe de mediu de cultură, adică tot atâta cât se poate extrage din aproape de pancreas de bou sau porc.
Un hormon de mare importanță biologică este hormonul de creștere sau somatotropina (HGH – Human Growth Hormone), secretat de lobul anterior al hipofizei. Molecula hormonului cuprinde 191 de aminoacizi. Absența lui provoacă nanismul hipofizar, ce are o frecvență de 7-100 per milion de persoane. Tratamentul cu acest hormon se realizează începând cu vârsta de 4-5 ani și până la puberitate, în doze de minimum 6 mg pe săptămână per persoană. Somatrotopina este un hormon cu o specificație înaltă și nu poate fi utilizat de la animale. Din hipofiza unui cadavru se extrag doar 4-6 mg de hormon, heterogen și impurificat. Iată de ce, producerea acestui hormon prin tehnici de inginerie genică prezintă un interes deosebit.
Sinteza acestui hormon pe cale artificială s-a început cu producerea de ADNc (ADN-ul copie) cu ajutorul revers-transcriptazei, având ca matrice ARNm din hipofize (transcripție inversă). Acesta a fost clonat, apoi tăiat cu enzime de restricție pentru obținerea secvenței nucleotidice corespunzătoare somatotropinei, cu excepția fragmentului ce determină primii 23 de aminoacizi. Fragmentul în cauză era clonat separat, ca rezultat al unei sinteze chimice, apoi cele două segmente unite, la ele se adăugă segmente reglatoare și pe baza plasmidelor se obține plasmidiul recombinat cu gena HGH (a somatotropinei). Colibacilii, primind acest plasmid recombinat, sintetizau somatotropina (la 1 litru de mediu de cultură se obține 2,0-2,5 mg somatotropină).
În prezent, cu ajutorul bacteriilor recombinate sunt obținuți și alți hormoni, de exemplu, thimopoietina ce conține 49 de aminoacizi și este secretată de timus.
În ce privește hormonii cu molecule mai mici (sub 20 de aminoacizi), este preferabilă sinteza lor pe cale chimică.
Obținerea interferonilor.
Interferonii sunt produși de celule specializate pentru lupta împotriva infecțiilor virale. Ei au fost descoperiți în 1957 de F.Isaacs și I.Lindenmann de Cercetări Medicale de lângă Londra. Interferonii reprezintă niște substanțe proteice (din 146-166 de aminoacizi) și sunt produși în cantități infime de celula animală sau umană, când un virus pătrunde în organism.
Există mai multe tipuri de interferoni: interferonul leucocitar (α), interferonul fibroblastelor (β) și interferonul limfocitelor T sau interferonul imun (γ).
Ei pot fi obținuți prin tehnici clasice (din celulele sanguine și din fibroblaste) și prin tehnici de recombinare genică.
Pentru a obține interferon din celulele sanguine sau din fibroblastele cultivate, acestea sunt infectate crea moleculelor recombinate de ADN în baza plasmidelor (fig.1).
Fig.1. Schema obținerii insulinei umane
Moleculele recombinate de ADN sunt transferate în colibacili (Escherichia coli), unde are loc realizarea informației genetice codificate în molecula de ADN. Paralel cu proteinele specifice bacteriei, se sintetizează și insulina. Pentru a proteja insulina umană (ea nu este proprie colibacililor și este distrusă de enzimele bacteriene), în molecula recombinată de ADN se încadrează, pe lângă gena insulinei, și o genă reglatoare care codifică o proteină specifică colibacililor (de exemplu galactozidaza). Ca rezultat al manifestării informației genetice a moleculei recombinate de ADN, se obține o catenă polipeptidică hibridă, din care mai apoi se separă insulina.
Datorită utilizării tehnologiei ADN-ului recombinat, se obțin aproximativ 200 grame de insulină de pe de mediu de cultură, adică tot atâta cât se poate extrage din aproape de pancreas de bou sau porc.
Un hormon de mare importanță biologică este hormonul de creștere sau somatotropina (HGH – Human Growth Hormone), secretat de lobul anterior al hipofizei. Molecula hormonului cuprinde 191 de aminoacizi. Absența lui provoacă nanismul hipofizar, ce are o frecvență de 7-100 per milion de persoane. Tratamentul cu acest hormon se realizează începând cu vârsta de 4-5 ani și până la puberitate, în doze de minimum 6 mg pe săptămână per persoană. Somatrotopina este un hormon cu o specificație înaltă și nu poate fi utilizat de la animale. Din hipofiza unui cadavru se extrag doar 4-6 mg de hormon, heterogen și impurificat. Iată de ce, producerea acestui hormon prin tehnici de inginerie genică prezintă un interes deosebit.
Sinteza acestui hormon pe cale artificială s-a început cu producerea de ADNc (ADN-ul copie) cu ajutorul revers-transcriptazei, având ca matrice ARNm din hipofize (transcripție inversă). Acesta a fost clonat, apoi tăiat cu enzime de restricție pentru obținerea secvenței nucleotidice corespunzătoare somatotropinei, cu excepția fragmentului ce determină primii 23 de aminoacizi. Fragmentul în cauză era clonat separat, ca rezultat al unei sinteze chimice, apoi cele două segmente unite, la ele se adăugă segmente reglatoare și pe baza plasmidelor se obține plasmidiul recombinat cu gena HGH (a somatotropinei). Colibacilii, primind acest plasmid recombinat, sintetizau somatotropina (la 1 litru de mediu de cultură se obține 2,0-2,5 mg somatotropină).
În prezent, cu ajutorul bacteriilor recombinate sunt obținuți și alți hormoni, de exemplu, thimopoietina ce conține 49 de aminoacizi și este secretată de timus.
În ce privește hormonii cu molecule mai mici (sub 20 de aminoacizi), este preferabilă sinteza lor pe cale chimică.
Obținerea interferonilor.
Interferonii sunt produși de celule specializate pentru lupta împotriva infecțiilor virale. Ei au fost descoperiți în 1957 de F.Isaacs și I.Lindenmann de Cercetări Medicale de lângă Londra. Interferonii reprezintă niște substanțe proteice (din 146-166 de aminoacizi) și sunt produși în cantități infime de celula animală sau umană, când un virus pătrunde în organism.
Există mai multe tipuri de interferoni: interferonul leucocitar (α), interferonul fibroblastelor (β) și interferonul limfocitelor T sau interferonul imun (γ).
Ei pot fi obținuți prin tehnici clasice (din celulele sanguine și din fibroblaste) și prin tehnici de recombinare genică.
Pentru a obține interferon din celulele sanguine sau din fibroblastele cultivate, acestea sunt infectate cu un virus, iar după 24 de ore prin centrifugare și purificare se izolează din mediul de cultură. Dintr-un litru de sânge se poate extrage până la 1 mkg (10-3 grame) de interferon.
În 1980, savanții americani W.Gilbert și C.Weissmann și japonezul T.Taniguki au produs interferonul uman cu ajutorul unor colibacili cu genomul modificat.
Celulele de E. coli nu pot transforma predecesorul interferonului în interferon activ, de aceea, inițial, complexul de ADN, format dintr-o regiune nucleotidică reglatoare și o regiune ce determină structura interferonului, este supus acțiunii enzimelor de restricție, care taie molecula de ADN aproximativ la frontiera acestor două catene (genei interferonului nu-i ajunge un triplet ATG). Codonul omis (ATG) este anexat prin sinteză chimică.
Gena interferonului se încadrează în continuare într-un plasmid, care se transferă în E. coli. Astfel, colibacilii sintetizează interferonul uman. Dintr-un litru de suspensie de E. coli (circa 1011 celule) se pot extrage până la 5 mg de interferon (adică de 5000 de ori mai mult decât din 1 litru de sânge).
Tehnicile de inginerie genică permit obținerea preparatelor hibride de interferon cu un spectru larg de acțiune.
Scopul : Studierea tehnicilor și factorilor de biosindeză a proteinelor recombinate în sistemul procariot de expresie.
Obiective :
1) De a analiza literatura;
2)De a însuși tehnicile moleculare utilizate în selecția asistată de markeri genetici ;
3) De a însuși metodele de îmbunătățire a randamentului de obținere a proteinelor recombinate funcționale în E. Coli;
CAPITOLUL I. Cadrul teoretic
PROCARIOTELE
Celulele procariote se caracterizează printr-o organizare relativ simplă, dar posedă toate însușirile de bază ale unei celule vii: membrană, aparat genetic, aparat enzimatic pentru sinteza substanțelor organice. Membrana plasmatică formează un singur compartiment citoplasmatic, fără o structură internă bine organizată. Conțin un singur cromozom (nucleoidul), constituit dintr-o singură moleculă inelară de ADN, fără a prezenta un nucleu bine conturat. Din acest motiv ele au fost denumite procariote. Principalii reprezentanți ai acestei grupe de organisme vii sunt bacteriile și algele cianofite. Bacteriile sunt procariotele care se întâlnesc cel mai frecvent în mediul înconjurător, fiind considerate cele mai mici entități vii, autonome, guvernate de informația conținută în ADN. În natură se întâlnesc diverse tipuri de bacterii. În dependență de formă se deosebesc:
bacili – bacterii în formă de bastonaș (Escherichia coli);
coci – bacterii sferice (Micrococcus cerolyticus);
diplococi – doi coci într-o capsulă (Diplococcus pneumoniae – provoacă pneumonia);
streptococi – șiraguri de coci (Streptococcus pyogenes – provoacă angina și scarlatina);
stafilococi – ciorchine de coci (Staphylococcus aureus – provoacă boli ale căilor respiratorii);
spirilă – spirală cu flagel (Spirrilum);
vibrion – formă de virgulă, cu flagel (Vibrio cholerae – provoacă holera).
1.1 Învelișul celular al bacteriei
În dependență de structura învelișului celular se disting bacterii Gram – pozitive și bacterii Gram – negative (fig. 2). Denumirea depinde de culoarea pe care o obțin bacteriile în rezultatul colorării după Gram (cu colorant bazic).
Celulele sunt înconjurate de un perete celular rigid format dintr-un peptidoglican numit mureină. Unele bacterii sunt înconjurate de capsule mucilaginoase care asigură formarea coloniilor. Capsulele, de rând cu peretele celular, au rol de protecție a celulelor. Astfel, sușele (bacterii dintr-o specie care se caracterizează prin anumite proprietăți) de pneumococi posesori de capsule sunt virulenți și provoacă pneumonia, în timp ce sușele lipsite de capsule sunt avirulente, deoarece sunt distruse de fagociți.
1.2 Bacteriile Gram – pozitive și Gram-negative
La bacteriile Gram-pozitive învelișul celular este alcătuit dintr-o membrană plasmatică acoperită de un perete celular gros la care sunt asociați acizii teihoici, lipoteihoici și polizaharidele.
Membrana plasmatică are o structură asemănătoare cu cea a eucariotelor. Bistratul de fosfolipide este asociat cu proteine integrale (proteine canal) și semiintegrale (proteine enzime). Enzimele bacteriene sunt asociate la suprafața citoplasmatică a membranei, catalizând transportul activ al substanțelor, procesele lanțului respirator, sistemele de transformare a energiei. Membrana plasmatică conține H+-ATP-aza, componentele necesare pentru sinteza fosfolipidelor, peptidoglicanului, lipopolizaharidelor, conține de ancorare a moleculelor de ADN. Membrana plasmatică bacteriană reprezintă o structură multifuncțională care combină funcțiile realizate de diferite compartimente ale celulei eucariote.
Fig. 2.Structura bacteriilor Gram–pozitive și Gram–negative
În bacteriile Gram – pozitive se pot depista niște structuri membranare veziculare sau veziculo-membranare numite mezozomi, care se formează prin invaginarea membranei plasmatice. La moment se consideră că mezozomii sunt niște analogi ai mitocondriilor din celulele eucariote și participă la procesele de respirație aerobă.
1.3 Aparatul genetic al celulelor bacteriene
Materialul genetic al celulelor bacteriene este reprezentat prin nuocleoid și plasmide.
Nucleoidul constituie partea principală a genomului bacterian și reprezintă o moleculă circulară de ADN cu lungimea de aproximativ care conține aproximativ 5×106 perechi de nucleotide (pb). Nucleoidul este fixat de membrana plasmatică prin punctul de origine a replicării. Bacteriile se divid foarte intens, astfel, ADN se replică permanent. Deoarece bacteriile nu posedă microtubuli (fus de diviziune) care ar asigura migrarea cromozomului bacterian, diviziunea celulară de tipul mitozei este imposibilă. Pentru a asigura segregarea nucleoizilor în celulele nou-formate ei se îndepărtează în rezultatul creșterii membranei plasmatice, iar după formarea peretelui despărțitor nimeresc în celule diferite (fig. 3)
Fig. 3. Etapele reproducerii celulei bacteriene
Din punct de vedere chimic nucleoidul constă din 80% ADN (comparativ, la eucariote – 40%), proteine și ARN. Proteinele din cadrul nucleoidului au proprietăți bazice și se aseamănă cu proteinele histonice ce asigură compactizarea ADN-ului la eucariote. ADN-ul bicatenar se asociază cu proteinele bazice prin răsucire. La fiecare 40 mii nucleotide (40kb) ADN-ul astfel compactizat formează niște bucle prin asocierea fizică la alte proteine bazice (fig. 4). Mecanismul de menținere a structurilor superspiralizate nu este deocamdată cunoscut, dar posibil sunt implicate moleculele de ARN. Fig. 4. Etapele condensării ADN-ului la procariote
Sub aspect funcțional, majoritatea secvențelor de ADN reprezintă secvențe unicale – gene structurale. Genele care codifică principalele clase de ARNr sunt grupate în tandem și se repetă de 7 ori în genomul E.coli.
Plasmidele reprezintă molecule circulare de ADN capabile să se replice independent de nucleoid și care constituie 0.05-10% din genomul bacterian. Ele sunt responsabile de sinteza unor metaboliți (aminoacizi, antibiotici, factori de rezistență la antibiotici etc). Pentru replicare și transcripție plasmidele utilizează produsele codificate de genele din nucleoid, în timp ce inițierea replicării este dirijată de gene plasmidice. După numărul de copii per genom există:
plasmide cu un număr mic de copii (1-5) – de obicei sunt molecule mari, numărul și activitatea cărora se află sub un control strict al nucleoidului;
plasmide cu un număr mediu de copii (10-50) – molecule de dimensiuni medii, se află sub control parțial;
plasmide cu un număr înalt de copii (>50) – molecule mici, semiautonome.
După genul de activitate în celulă deosebim:
plasmide R – codifică sinteza factorilor de rezistență la antibiotice;
plasmide Col – asigură sinteza colicinilor – proteine capabile de a distruge bacteriile lipsite de aceste plasmide;
plasmide F (plasmide de sex) – asigură transferul de gene în cadrul conjugării bacteriene.
1.4 Activitatea genică la procariote
Materialul genetic la procariote se caracterizează printr-o serie de particularități, si anume:
1. genomul bacterian este alcătuit din două categorii de determinanți genetici:
a. genele esențiale (eucromozomiale), localizate în cromozomul bacterian;
b. genele accesorii, localizate în afara cromozomului bacterian, există, mai mult sau mai puțin, autonom (plasmidele, elementele genetice transpozabile, fagii);
2. molecula de ADN este circulară (marginile ei sunt unite prin legături covalente);
3. molecula de ADN nu formează complexe cu proteinele histonice si nehistonice (este nudă);
4. genomul bacterian este reprezentat printr-un număr relativ restrâns de gene;
5. genomul bacterian conține un singur grup linkage (caracteristic „cromozomului bacterian” sau nucleoidului);
6. bacteriile sunt organisme haploide (atunci când nu are loc replicarea ADN), dar pot fi diploide si parțial diploide, în funcție de sinteza ADN);
7. transmiterea caracterelor ereditare este diferită de cea a eucariotelor, întrucât lipseste procesul clasic al reproducerii sexuale.
Cromozomul bacterian este alcătuit dintr-o moleculă de ADN dublu catenară circulară. Lungimea ei variază între 1000-1400 μm, diametrul fiind de 2,5 nm. Numărul de nucleotizi este de 4,1· 10 6, iar masa moleculară de circa 2,5· 10 9 daltoni.
Se presupune, că nucleoidul văzut la microscopul electronic reprezintă ADN-ul condensat, genetic neactiv (Ryter, Cohen, 1975), iar secvențele de ADN ce se transcriu sunt prezentate sub formă de bucle, externe nucleoidului.
Numărul de gene în cromozomul bacterian este de câteva mii (de exemplu, coli – circa 4000).
După funcția lor, genele respective se divizează în:
· gene structurale, ce determină structura primară a proteinelor (circa 90% din
gene). În genom ele pot fi grupate în operoni (Jacob, Monod, 1961);
· gene reglatoare, ce determină activitatea genelor structurale prin intermediul
produsului lor (represor si aporepresor);
· gene operatoare, ce reprezintă receptorul semnalelor (represorului sau inductorului) si asigură funcționarea ordonată a operonului. Ele sunt parte componentă a operonului;
· promotor – genă ce reprezintă un sector al operonului de care se leagă ARN – polimeraza, si determină începutul transcripției;
· terminator, ce reprezintă un sector al operonului unde are locul sfârsitul transcripției informației genetice necesare;
· inițiator – genă ce determină sinteza produsului care declansează replicarea ADN;
· replicator ce reprezintă unități funcționale de ADN si dirijează replicarea;
· secvențe de inserție – reprezintă fragmente mici de ADN (1-2 gene, circa 800-1400 de nucleotizi) care se pot deplasa în genomul bacterian, singure sau în complex cu unele gene structurale (transpozoni);
· suprafețe de legare – fragmente de ADN care se leagă de membrana celulară (mezozomi);
· gene rARN si tARN ce determină sinteza rARN (10-20 de gene) si tARN (circa 50 de gene);
· gene criptice (tăcute) – ce nu se manifestă (exprimă) în mod normal în cursul vieții.
Odată cu descoperirea importanței acizilor nucleici în biosinteza proteinelor si a mecanismelor de realizare a mesajului genetic a apărut problema modalității de asigurare a cantității optime de proteine necesare organismului. Se stie, că sinteza unei proteine sau a unei enzime nu este constantă în timp, ea trebuie să se adapteze variatelor cerințe ale funcției celulei.
Schema generală a reglării activității genelor procariote a fost propusă de geneticienii F. Jacob si J. Monod în 1961 si expusă în lucrarea „Mecanismul reglajului genetic în sinteza proteinelor”. Fenele cu funcții înrudite, care funcționează asociat, sunt organizate în operon
Un operon este transcris într-o singură moleculă de ARNm si este alcătuit din gena-promotor, gena-operator, gena reglatoare, genele structurale si terminator.
Promotorul reprezintă o porțiune specifică de ADN care inițiază transcripția mesajului genetic de unde începe sinteza moleculelor de ARNm. De promotor se leagă ARN-polimeraza. Această secvență cuprinde cel puțin 1000 de nucleotizi. Urmează gena – operator, de care depinde funcționarea operonului. Operatorul serveste drept țintă pentru proteina – represor, care împiedică o genă să funcționeze, adică să fie transcrisă si translată. Urmează genele structurale, care controlează sinteza unor proteine specifice cu rol structural sau enzimatic.
La procariote genele structurale funcționează în grup, iar la eucariote funcționează individual.
Genele structurale sunt urmate de un sector de ADN, numit terminator, care condiționează sfârsitul transcripției ARNm.
Genele promotor si operator sunt precedate de către o genă reglatoare. Ea este separată de genele operonului, asupra căruia acționează. Gena reglatoare, prin produsul său chimic (represor), dirijează activitatea genei operatoare si a genelor structurale prin inducția sau represia transcripției.
Reglajul genetic la procariote este de două tipuri:
1. inductibil – intervin în sinteză enzimele catabolismului.
În lipsa substratului în celula bacteriană, proteina represor se fixează pe gena operator si blochează transcripția genelor funcționale. În consecință, nu se produc enzime, ce ar participa la descompunerea substratului. Atunci când în celulă apare substratul, moleculele lui se fixează pe represor. Astfel, acesta nu se mai poate fixa pe operator. În rezultat, genele structurale se activează, are loc transcripția ARNm si sinteza enzimelor specifice necesare pentru metabolizarea substratului. Atâta timp cât în mediu si în celulă este prezent substratul, enzima ce-l descompune se sintetizează permanent. Dacă substratul
din mediu este consumat, represorul se eliberează si trece în formă activă, blochează operatorul, iar genele structurale nu mai funcționează.
2. represibil – intervine în sinteza enzimelor anabolismului.
Conform acestui mecanism, proteina represor blochează operatorul numai atunci când este asociată cu substratul. Când în celula bacteriană nu există substrat, operatorul este liber si genele structurale funcționează. Are loc transcripția ARNm si sinteza enzimelor necesare. Acest proces continuă până când apare surplus de substrat, care se uneste cu proteina represor si blochează operatorul. În rezultat, genele structurale se inactivează si sinteza enzimei respective se întrerupe.
Rezultatele experiențelor lui F.Jacob si J.Monod au fost confirmate si completate în multe laboratoare. Sistemul operonului reprezintă unul dintre mecanismele de reglare a sintezei dintre proteine. Se presupune că organismele eucariote posedă sisteme asemănătoare, dar au un caracter mai complicat.
1.5 Prezentarea principiilor metodei de clonare și exprimare a genelor în sistem procariot
ADN în sine are doar două funcții importante și anume păstrarea informației genetice și furnizarea acesteia pentru biosinteza de proteine. Păstrarea include transmiterea materialului genetic nemodificat de la o generație la alta. Acest fapt este realizat prin replicarea ADN-ului și împărțirea egală a celor două copii în timpul diviziunii celulare. A doua funcție este legată de descifrarea informației pentru biosinteza de proteine. Mesagerul informației între ADN și proteine este ARN-ul, care este sintetizat în procesul de transcriere a ADN de către o enzimă numită ARN polimeraza. ARNm rezultat servește ca matriță în procesul de traducere a ADN-ului, prin biosinteza proteinelor, care are loc în ribozomi. Practic ARN-ul este purtatorul informației din nucleu în citoplasmă unde are loc biosinteza proteinelor. Dogma centrală a biologiei moleculare presupune transmiterea unidirecțională a informației de – la proteine, prin intermediul ARN. Informația genetică nu poate fi transmisă invers, de la proteine , informația genetică poate fi transmisă de la ADN în cazul retrovirusurilor la care materialul genetic este ARN. Nu există cazuri de transmitere a informației de direct la proteine .
Clonarea genelor constă în izolarea unei gene dintr-un genom și introducerea ei în alte celule gazdă pentru multiplicare și în unele cazuri pentru exprimare. Prin multiplicarea celulelor cu genele clonate se pot obține milioane de copii ale unei singure gene. Sumar, procesul clonării constă din următoarele etape:
• amplificarea genei de interes
• introducerea genei de interes într-un vector de clonare
• introducerea moleculelor recombinate în celule gazdă
• selecția celulelor transformate (purtătoare ale moleculei recombinate)
• verificarea moleculelor recombinate
1.6 Exprimarea genelor în sistem procariot
Clonarea genelor vizează în principal două obiective posibile: multiplicarea unui fragment ADN sau exprimarea genei clonate. Clonarea în scopul multiplicării fragmentului este utilizată atunci când ADN supus analizei este de fapt un amestec de fragmente care nu pot fi separate cu ajutorul electroforezei și la care se urmărește cunoașterea secvenței. În acest scop amestecul de fragmente se clonează într-un vector de clonare, iar clonele pozitive sunt apoi secvențializate.
Celulele de E. coli sunt utilizate pe larg în obținerea de proteine recombinate. Ele pot fi numite adevărate fabrici de proteine la comandă, care însă câteodată „refuză” să sintetizeze proteinele comandate și de ce cele mai dese ori străine celulei bacteriene. Clonarea în scopul exprimării genei și obținerii de proteină recombinată include câteva aspecte care sunt importante pentru exprimare. Gena codificatoare poate fi clonată direct în vectorul de exprimare. Plasmidele de exprimare conțin neapărat un promotor recunoscut de ARN polimeraza celulei gazdă, un situs de legare a ribosomilor (rbs), un codon START (AUG) și unul STOP la capetele situsului multiplu de clonare. Foarte important în acest caz este păstrarea cadrului deschis de citire, adică împărțirea exactă pe codoni a genei de la primul codon tradus până la ultimul. Promotorii din aceste tipuri de plasmide sunt de tip inductibil. Cel mai des utilizat inductor este IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid), care este un analog al galactozei. Spre exemplu, vectorii de tip pET de asigură de obicei o supraexprimare a genelor clonate. Plasmidul pET21 conține promotorul de la fagul T7, situsul de recunoaștere a ribosomilor, codonul START în situsul multiplu de clonare și codonul STOP după o etichetă de 6 histidine. Dacă se optează pentru prezența unei etichete 6×His la capătul C-terminal a proteinei pentru facilitarea purificării, atunci din genă se va înlătura codonul STOP. Dacă această etichetă nu este necesară, atunci în genă se va păstra codonul STOP și traducerea se va opri înainte de etichetă. Promotorul T7 nu este recunoscut de către ARN polimeraza de coli și simpla prezență a plasmidului în celulele bacteriene nu va sigura o exprimare a genei. Vectorii pET necesită tulpini de E. coli care conțin gena pentru ARN polimerază de la fagul T7. Această genă se află sub controlul promotorului lac UV5 și a operatorului lac.
Operatorul lac este o secvență recunoscută de către o proteină numită represorul lac. Atunci când în mediu nu există lactoză (sau analogi ai lactozei) represorul lac se fixează la operatorul lac și împiedică transcrierea genei pe care o reglează, care în acest caz este gena pentru T7 ARN polimerază. În absența T7 ARN polimerazei nu va exista nici transcrierea genei țintă din plasmid. Represorul lac este codificat de gena lacI care se află atât în genomul bacteriei gazdă cât și în plasmidul de exprimare. Agentul care induce exprimarea este un analog al galactozei IPTG. Moleculele de IPTG se fixează de represorul lac și cauzează disocierea acestuia de la operatorul lac, astfel promotorul lac devine accesibil pentru ARN polimeraza de E. coli care va transcrie gena pentru T7 ARN polimerază. Aceasta din urmă va recunoaște promotorul T7 din plamsid și va transcrie gena țintă. Acest sistem de exprimare este unul foarte puternic și care poate asigura o producție de proteină care va alcătui până la 50% din proteinele totale bacteriene.
Operatorul lac este o secvență recunoscută de către o proteină numită represorul lac. Atunci când în mediu nu există lactoză (sau analogi ai lactozei) represorul lac se fixează la operatorul lac și împiedică transcrierea genei pe care o reglează, care în acest caz este gena pentru T7 ARN polimerază. În absența T7 ARN polimerazei nu va exista nici transcrierea genei țintă din plasmid. Represorul lac este codificat de gena lacI care se află atât în genomul bacteriei gazdă cât și în plasmidul de exprimare. Agentul care induce exprimarea este un analog al galactozei IPTG. Moleculele de IPTG se fixează de represorul lac și cauzează disocierea acestuia de la operatorul lac, astfel promotorul lac devine accesibil pentru ARN polimeraza de E. coli care va transcrie gena pentru T7 ARN polimerază. Aceasta din urmă va recunoaște promotorul T7 din plamsid și va transcrie gena țintă. Acest sistem de exprimare este unul foarte puternic și care poate asigura o producție de proteină care va alcătui până la 50% din proteinele totale bacteriene
1.7.BAZELE TEHNICO-MATERIALEALE INGINERIEI GENICE
Datorită cercetărilor de genetică moleculară, a fost posibilă cunoașterea structurii de profunzime a unor gene și genomuri, fapt ce a condus la elaborarea tehnologiei ADN-ului recombinat și la transferul de gene peste barierele de specie.
Tehnica recombinării genetice în vitro include trei etape principale:
extragerea sau sinteza chimică a ADN-ului din diferite specii;
construirea unei molecule hibride (recombinate) de ADN;
reintroducerea moleculei recombinate de ADN într-o celulă vie pentru reproducerea și expresia ei (fig. 1).
Fig 5. Etapele principale ale ingineriei genice.
Extragerea ADN-ului se produce utilizându-se o serie de enzime specifice, în primul rând, cele de restricție, capabile să rupă molecula de ADN în anumite locuri. Enzima de restricție extrasă din Escherichia coli Eco RI recunoaște următoarea secvență de nucleotide:
G↓ AATTC
CTTAA↑G.
Restrictazele reprezintă instrumentul de bază al ingineriei genice, deoarece au capacitatea unică de a tăia molecula de ADN în anumite sectoare (loci). Prima restrictază a fost obținută din bacteriile Haemophillus influenzae serotipul α și se folosea pentru fragmentarea ADN-ului virusului SV-40 și cartarea lui (Kelly, Smith, 1970).
Nu toate restrictazele se utilizează în ingineria genică, ci doar acele care au următoarele proprietăți:
pot tăia molecula de ADN în fragmente discrete;
posedă o specificitate de acțiune înaltă (taie molecula de ADN într-o anumită succesivitate – “site”-ul de recogniție);
pot forma, în rezultatul restricției, “margini lipicioase” la capetele fragmentului de ADN (această proprietate nu este caracteristică tuturor restrictazelor);
pot fi izolate relativ ușor în stare pură din mediul incubațional.
La repartiția ADN-ului este implicată ADN-ligaza, care poate lega unele fragmente de restricție. Acestea și alte enzime stau la baza obținerii moleculelor recombinate de ADN (fig.6).
Pentru transferul genelor de la unele organisme la altele sunt utilizați vectorii (moleculele speciale de ADN ce transferă informația genetică dintr-o celulă în alta) reprezentați prin plasmide, virusuri, liposomi, ADN mitocondrial și ADN cloroplastic.
Sistemele vectoriale, utilizate pentru transferul informației străine în celulele (organismele) – gazdă, trebuie să corespundă următoarelor cerințe:
inofensivitatea vectorului;
multiplicarea rapidă în celula-gazdă și lipsa posibilităților de multiplicare în celulele altor organisme;
prezența unui număr restrâns de situri de recogniție;
prezența genelor marker pentru selectarea de clone după moleculele recombinate de ADN;
izolarea relativ ușoară, clonarea și expresia în celulele (organismele) străine.
În calitate de vectori, plasmidele au căpătat o răspândire deosebită.
Plasmidele reprezintă niște molecule inelare de ADN specifice bacteriilor. Ele pot exista autonom și determină unele caractere ale bacteriilor, cum ar fi: capacitatea de conjugare, rezistența la antibiotice, agresivitatea.
Plasmidele necesare pentru transferul de gene trebuie să posede un număr restrâns de regiuni sensibile la acțiunea enzimelor de restricție. În acest caz, se poate realiza ruperea și apoi inserția de ADN exogen în plasmid.
Primul plasmid bacterian, folosit ca vector pentru transferul de gene, a fost cel notat pSC 101, realizat de S.Cohen (1973).
Fig.6. Obținerea moleculelor recombinate de ADN:
– metoda ligazică; B) – metoda terminală.
Ca vector plasmidic, la plante se folosește plasmidul Ti (Tumour inducing) de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, care condiționează formarea tumorilor pe tulpinile a numeroase specii de plante dicotiledonate.
A doua tehnică de introducere a unei gene într-o bacterie folosește ca vector un bacteriofag (fagul leambda – λ), al cărui genom (10-50 gene) integrează gena străină. Ea se va sintetiza întocmai ca și celelalte gene ale virusului, dacă acesta din urmă se va replica în celula bacteriană.
Pentru celulele eucariote animale, vectorii virali care se folosesc sunt, de regulă, virusul tumoral SV-40 și virusul papiloma bovin (BPV). Se crede că vectorii virali vor putea fi utilizați și la plante.
Un tip particular de vectori reprezintă liposomii, picături foarte mici de lipide produse artificial, în care pot fi incluse gene, precum și diferite medicamente, enzime etc.
Genomul mitocondriilor și cloroplastelor este similar celui bacterian și, ca urmare, se crede că el va putea fi utilizat pentru transferul unor gene la organismele eucariote.
Celulelor utilizate în experimentele ingineriei genice le sunt înaintate o serie de cerințe care au menirea de a asigura securitatea investigațiilor științifice. Conform “Regulilor despre molecule recombinate de ADN” celulele-gazdă trebuie să satisfacă următoarele cerințe:
capacitatea sporită de implicare în investigațiile științifice;
incapacitatea de sinteză a anvelopei protectoare în afara laboratorului;
capacitatea lizării ADN-ului său în afara laboratorului;
imposibilatatea transferului informației ereditare altor organisme;
imposibilitațea poluării mediului înconjurător în rezultatul transformării și/sau transfecției.
În prezent, de rând cu E. coli, în calitate de obiecte de studiu (celule gazdă), se utilizează bacilul fânului (Bacillus subtilis), celulele de drojdii, culturile de celule și țesuturi vegetale și animale, culturile de protoplaști.
După obținerea moleculelor recombinate de ADN, ele trebuie transferate în celulele (organismele) procariote sau eucariote pentru funcționarea lor ulterioară (replicarea și transmiterea informației ereditare).
De menționat că, în cazul operării cu genele organismelor eucariote, genele eucariotelor superioare, de regulă, nu se manifestă în celulele procariote, iar genele eucariotelor inferioare se manifestă doar parțial. Iată de ce, în aceste experimente se acordă o deosebită atenție direcției transferului de informație ereditară a moleculelor recombinate, adică: de la celula procariotă în celulele pro- sau eucariote și invers, de la celula eucariotă în eu- sau procariote.
Moleculele recombinate ale procariotelor funcționează ușor în celulele procariote (în calitate de repliconi).
Sunt descrise și cazuri de funcționare a genelor procariotelor în celulele eucariotelor.
K.Merril și colab.(1971), In.Hors și colab.(1975) au demonstrat posibilitatea transferului genei β-galactozidazei din E. coli în fibroblastele umane ale unui bolnav de galactozimie cu ajutorul fagului (galactozimia este o boală autozomială recesivă ce provoacă dereglarea metabolismului ca rezultat al lipsei enzimei 1-D-galactozo-1-fosfaturidiltransferazei).
Expresia genelor eucariotelor în celulele procariote, de asemenea, este posibilă. Devis (1976) a transferat gena histidinei drojdiilor în E. coli cu ajutorul fagilor. Astăzi se obțin pe scară largă produse ale organismelor eucariote în baza bacteriilor (hormoni, interferoni etc.).
Informația ereditară străină (a moleculei recombinate), care pătrunde în celula (organismul) gazdă, este protejată pe diferite căi:
metilarea ADN-ului (virusurile);
transferul moleculei liniare de ADN în formă circulară (fagul λ);
blocarea sistemului de restricții al celulei-gazdă (fagul T3);
acțiunea restrictazelor.
În același timp, celula-gazdă își protejează informația ereditară prin diferite mecanisme:
acțiunea restrictazelor specifice;
metilarea ADN;
acțiunea vecinătății epigenetice;
acțiunea nespecifică a nucleazelor celulare;
protecția mecanică prin membranele celulare;
acțiunea proteinelor histonice și nehistonice;
acțiunea interferonului.
CAPITOLUL II. MATERIALE ȘI METODE
Ingineria genetică cuprinde tehnici efectuate în vitro cu gene, cromozomi sau celule întregi în scopul construirii unor structuri reprogramate genetic. Cuprinde o inginerie genetică celulară reprezentată de fuziunea de protoplaști și o inginerie genetică moleculară reprezentată de tehnologia ADN recombinant. Tehnologia ADN recombinant reprezintă un ansamblu de metode prin care se realizează în vitro, molecule de ADN recombinante, permitând, clonarea unor gene de origini diferite, atît în celula procariotă cît și în celula eucariotă. Realizarea acestei tehnologii presupune construirea unor vectori de clonare, izolarea unor gene de interes (denumite inițial ADN pasager, în prezent, ADN heterolog) și utilizarea unui echipament enzimatic corespunzător: endonucleaze de restricție, ADN ligaze, polimeraze, exonucleaze, fosfataze alcaline, revertranscriptaze, terminaltransferaze.
Vectori utilizați în clonarea genetică coli
Vectorii reprezintă molecule de ADN în interiorul cărora se introduc fragmentele de ADN de studiat (ADN pasager, heterolog), ce poate fi de origine pro- sau eucariotă.
Vectorii pot fi clasificați în funcție de diferite criterii:
a) posibilitatea studierii exprimării fragmentelor de ADN pasager, vectorii se împart în: vectori de clonare – nu au în structură secvențe de tip promotor și, ca atare, permit doar clonarea unor fragmente de ADN pasager, dar nu și analiza exprimării acestora, și vectori de exprimare (implicit și de clonare) – au în structură secvențe de tip promotor, permițănd atât clonarea, cât și analiza exprimarii fragmentului clonat.
b) tehnica de clonare folosită, vectorii pot fi: vectori de clonare inserțională – ADN pasager este clonat prin inserție la un situs unic de restricție din vector și vectori de clonare prin inlocuire (substituție) – ADN clonat inlocuiește un fragment din vector, în urma digestiei cu 2 endonucleaze de restricție.
c) structura și modul de funcționare, vectorii se împart în: vectori plasmidiali (sunt derivați din, și au structură de plasmide); vectori virali (sunt derivați din, și au structura de genom viral ); vectori hibrizi – fagimide (au structură hibridă, de genom de fag filamentos și de plasmid) și cosmide (au structură hibridă, de genom de fag λ și de plasmid).
d) spectrul de gazde, există vectori: vectori congenerici (pot fi folosiți doar la tulpini ale aceluiași gen taxonomic) și vectori shuttle (navetă, suveică) – se replică stabil în, și pot fi folosiți în tulpini aparținând la două genuri microbiene, de exemplu: Escherichia/Pseudomonas, Escherichia/Saccharomyces etc.
2.1.1 VECTORI DE CLONARE PLASMIDIALI
Proprietățile plasmidelor ca vectori de clonare
Pentru a putea fi folosite ca vectori de clonare, plasmidele necesită o serie de caracteristici:
a) Să nu conțină gene tra, deci să nu genereze proces de conjugare bacteriană și, ca atare, să nu fie autotransmisibile. Această caracteristică este esențială atât, pentru diversele etape de cercetare, cât și pentru securitatea cercetătorului (foarte mulți vectori de clonare plasmidiali prezintă ca markeri de selectie gene de rezistentă la antibiotice, iar dacă vectorii ar fi autotransferabili ar exista/crește riscul ca gene de antibiorezistentă să ajungă în diverse microorganisme patogene)[2].
b) Să conțină situsuri unice pentru un număr cât mai mare de endonucleaze de restricție (la acest nivel se efectuează insertia ADN pasager).
c) Situsul de inserție să nu fie localizat în genele implicate în replicarea și partiția plasmidului.
d) Să prezinte markeri genetici absenți în celula receptoare.
e) Să aiba o greutate moleculară mică, pentru a fi ușor de izolat și de manipulat.
f) Să prezinte cât mai multe copii per celulă.
Primul plasmid natural care a fost folosit în experimente de clonare genetică este plasmidul Col E1 de coli (Fig.2.1.) Acest plasmid are o greutate moleculară de 4.6 x 106 Da, este neconjugativ, produce colicina E1 și conferă gazdei imunitate la această colicină. Selecția celulelor transformate (care au primit plasmidul) pe baza acestui marker (imunitatea la colicina) este o tehnică dificilă și, în final, reprezintă un dezavantaj al folosirii acestui plasmid în experimentele de clonare genetică. Pe de altă parte, plasmidul Col E1 poartă și gene mob care îi conferă capacitatea de transfer în trans, în prezența unui alt conjugon. Ca urmare, există riscul diseminarii necontrolate a plasmidului Col E1 recombinat.
Ulterior, au fost folosite alte plasmide naturale – pSC101 și pRS2124 – care, datorită genei de rezistență la tetraciclină și, respectiv, rezistență la ampicilină, permit o selecție mai ușoară a transformanților.
În urma unor asemenea testări a plasmidelor naturale, s-a concluzionat că este necesară construcția unor plasmide artificiale, destinate exclusiv experimentelor de clonare.
Fig.2.1. Plasmidul Col E1.
2.1.2 VECTORI DERIVAȚI DIN FAGI FILAMENTOȘI
Fagii filamentoși (M13, f1, fd, Pf1) au genomul format dintr-o moleculă ADN m.c. circular închis, cu greutate moleculară medie de 2 x 106 D. După pătrunderea în celula bacteriană, ADN fagic inițiază ciclul de replicare cu ajutorul unei forme intermediare de replicare dublu catenare. Replicarea se face dupa modelul cercului rotativ și are ca rezultat formarea unui mare numar de catene ADN, notate prin conventie – catene ″−″ (catena infectantă este notată cu ″+″). Aceste catene − vor servi ca matrița în transcrierea genelor fagice.
M13 este un fag filamentos specific pentru Escherichia coli. Are genom ADN m.c. (6.4 kb) cu omologie mare cu genomul fagilor f1 și fd. 90% din genom este reprezentat de gene ce codifică proteine. Aceste gene sunt separate între ele doar prin câteva nucleotide, singurele regiuni intergenice mai extinse sunt între genele VIII și III (IG 2), și respectiv, între II și IV (IG 1). Replicarea fagului M13 are loc pe modelul descris mai sus și este realizată de ADN polimeraza I a gazdei bacteriene. După sinteza catenei − (și, deci, formarea intermediarului dublu catenar de replicare), catena + este ″nickată″ și, în continuare, este sintetizată catena + pe matriță −. Ceea ce rezultă este o catenă + foarte mare, un concatemer format dintr-un mare număr de genomuri fagice. Ulterior, această moleculă va fi scindată în genomuri individuale[2].
Toate genele din fagii filamentosi sunt esențiale și, ca atare, vectorii derivați din acesti fagi trebuie să prezinte toate genele fagilor sălbatici. Exista totuși o regiune de 500 nucleotide, situată intre genele II și IV, în care poate fi inserat ADN heterolog.
Vectorii din seria mp (dintre care cei mai folositi sunt M13 mp 18/19 – 7.5 kb, Fig.3.7.) sunt derivați dintr-un fag M13 recombinant (M13 mp1), care are un mic fragment de ADN din vectorul pUC 18/19 inserat în principala regiune intergenica (IG 1). Acest fragment de ADN de E.coli cuprinde :
1. gena lac I = genă ce codifică represorul operonului Lac
2. gena lac Z′ = gena lac Z defectivă, ce codifică capătul NH4-terminal al βgalactozidazei
3. situsul PCS = situs de policlonare
Aceste secvențe permit identificarea clonelor celulare infectate cu vector recombinat folosind același sistem histochimic, bazat pe complementația intra-alelica a celor 2 gene lac Z defective (una pe cromosom, cealaltă pe vector) și, respectiv, pe blocarea transcrierii de la promotorul lac prin inserția ADN heterolog.
Diferența între M13 mp 18 și varianta 19 constă în orientarea situsurilor de restricție în cadrul PCS.
În procesul de infectare a unei celule bacteriene de catre un fag M13 este esențială etapa de interacțiune dintre fag și pilii de sex ai celulei bacteriene. Ca atare, în experimentele de introducere a unui vector M13 – derivat recombinat într-o tulpină bacteriană este necesară folosirea tulpinilor bacteriene F +, iar de regulă se folosesc tulpini F ′. În afară de acest caracter, tulpinile bacteriene folosite trebuie să mai aibă urmatoarele caractere :
(I) lacZΔM15 = o genă lac Z mutantă în care a fost deletată regiunea ce codifică capul NH4-terminal al β-galactozidazei. Astfel, secvența lacZΔM15 codifică pentru capul COO –
terminal al β-galactozidazei și este capabilă să desfășoare _complementație cu gena lac Z ′ de pe vector, restaurând activitatea normală a acestei enzime.
(II) Δ(lac-proAB) = deleția unui segment cromosomal ce include celelalte gene ale operonului Lac, precum și genele proAB implicate în biosinteza prolinei. Genele proAB există însă pe episomul F′, complementând deleția cromosomală și asigurând menținerea episomului F ′ în celula respectivă.
(III) (III) lac I q = o genă lac I mutantă ce sintetizează de aproximativ 10 ori mai mult represor Lac I decât forma salbatică, represând astfel și mai mult exprimarea operonului Lac, care este oricum la un nivel scăzut de transcriere în absența inductorilor. }i această genă este de regulă localizată pe episomul F ′.
(IV) (IV) hsdR17 și hsdR4 = mutații ce conduc la pierderea activitații de restricție a ADN străin de celula respectivă, dar nu și a activitații de modificație desfașurată de sistemele enzimatice de restricție/modificație de tip I. Astfel, ADN heterolog nemodificat (nemetilat) clonat direct în vectori derivați din fagul M13 și propagat în tulpini bacteriene ce poartă asemenea mutații va fi modificat (metilat) de către enzimele gazdei și, deci, protejat împotriva proceselor de restricție în cazul clonărilor ulterioare în alte tulpini hsd +.
Câteva exemple de asemenea tulpini bacteriene sunt: E.coli JM 105, 107, 109, 110, XL1-Blue.
2.1.3 VECTORI DE CLONARE HIBRIZI DE TIP FAGIMIDE
Fagimidele sunt vectori hibrizi ce combină caractere de plasmide cu caractere de fagi filamentoși.
Caracterele de plasmide: au o origine a replicării din ColE1, segment ce asigură replicarea de tip cerc rotativ și menținerea vectorului în forma plasmidială; au o genă de rezistență la antibiotic, caracter selectabil în tulpinile bacteriene ce poartă acest vector.
Caractere de fag filamentos: au regiunea intergenica majora (IG 1) dintr-un fag filamentos. Această regiune conține toate secvențele necesare în cis pentru întreaga replicare a vectorului pe modelul replicării fagilor filamentosi și pentru morfogeneza particulelor virale.
Datorită acestor caractere duale, fagimidele pot fi propagate și menținute în forma plasmidială în tulpină bacteriană gazdă atunci când aceasta este cultivată în condiții obișnuite, standard. Când celulele gazdă sunt infectate cu un fag filamentos helper, atunci modul de replicare a vectorului se schimbă sub acțiunea produsului genei II (endonucleaza II) codificat de virusul helper. Acest produs interactionează cu regiunea intergenică din vector, inițiind replicarea pe modelul fagilor filamentoși și generând astfel monocatene ADN ce vor fi apoi clivate, circularizate și împachetate în particule fagice. ADN m.c. purificat din aceste particule în experimente de secvențiere sau pentru obținerea de sonde ADN m.c.
Actualmente se folosesc ca virusuri helper în asemenea experimente, virusuri cu genom modificat prin manipulări genetice (de exemplu, M13 K07), astfel încât nu pot genera propriile particule fagice și au gena II mutantă ce acționează mai bine pe IG din fagimid decât pe IG propriu.
Cei mai reprezentativi vectori de clonare de tip fagimide sunt pUC 118/119 și pBluescript.
2.1.4 VECTORI DERIVAȚI DIN GENOMUL BACTERIOFAGULUI λ
De când a fost folosit pentru prima dată ca vector de clonare (Murray și Murray 1974), bacteriofagul λ (se citește lambda) a ocupat un rol central în experimentele de clonare. Pe baza analizelor de genetică și fiziologie a acestui virus, în prezent, au fost construiți și sunt comercializați o serie de vectori suficient de sofisticați.
Genomul fagului λ, prezentînd dimensiuni mari, nu poate fi utilizat ca atare ca vector de clonare. Cu atât mai mult cu cât ADN-ul său conține multe situsuri pentru enzime de restricție în gene esențiale pentru ciclul litic al fagului. Pe de alta parte, particulele fagice nu pot prelua o cantitate mult mai mare de ADN decât propriul genom.
Totuși, toate aceste impedimente au fost depășite :
1. regiunea centrală a genomului viral (ce reprezintă aproximativ 1/3 din genom) nu este esențială pentru creșterea litică și, ca atare, poate fi înlocuită de ADN heterolog; această regiune a fost denumită ″stuffer″
2. prin manipulare genetică situsurile de restricție au fost eliminate din regiunile esențiale
3. mai mult decât atât, folosind oligonucleotide sintetice, situsurile de restricție au fost plasate exact în pozițiile cele mai favorabile
Toate aceste metode au condus la dezvoltarea unui mare număr de vectori ce pot accepta și propaga fragmente de ADN heterolog, folosind un set foarte larg de enzime de restricție.
În funcție de tehnica de inserare a ADN heterolog, vectorii derivați dinfagulλ se clasifică în :
a) vectori inserționali – se caracterizează prin faptul că prezintă un unic situs pentru o anumita endonuclează de restricție, situs la nivelul căruia se insera ADN heterolog, fără a înlocui vreo regiune din vector;
b) vectori de substituție (înlocuire) – prezintă 2 situsuri pentru o aceeasi endonucleaza de restricție, cele 2 situsuri flancând o regiune neesențiala a vectorului (regiunea ″stuffer″); aceasta regiune va fi inlocuită cu ADN heterolog, generând vectorul recombinat.
Alegerea vectorului λ adecvat
Nici unul din vectorii derivați din fagul λ nu sunt adecvați pentru toate experimentele de clonare moleculara. Ca urmare, este necesară alegerea vectorului cel mai adecvat scopului urmărit și, în consecință trebuie luați în considerare 3 factori:
2. enzima (sau enzimele de restricție) ce vor fi folosite;
3. dimensiunea fragmentului de ADN heterolog ce urmează a fi clonat;
4. dacă vectorul va fi folosit și pentru exprimarea ADN heterolog în E.coli.
Construcția de vectori ce conțin situsuri multiple de clonare a simplificat foarte mult mecanismele de clonare moleculară în vectori derivați din fagul λ Totuși, dimensiunea insertului ramâne înca un factor important de luat în considerare. Aproape 60% din genomul viral (brațul stâng – 20 kb – incluzând genele capsidei și genele cozii – de pîna și brațul drept – 8-10 kb – de pâna la cos) este necesar pentru ciclul litic al fagului λ Deci, treimea centrală a genomului viral poate fi înlocuită de ADN heterolog. Cu toate acestea, viabilitatea bacteriofagului descrește simțitor atunci când dimensiunea totală a genomului este în afara limitelor de 78-105% față de fagul λ sălbatic.
Sisteme de selecție a vectorilor λ-derivați recombinanti
1) folosirea unor sisteme genetice ce se găsesc în regiunea de înlocuit (″stuffer″). De exemplu, există vectori derivați din λ și care poartă în regiunea stuffer o gena lac Z (ce codifică pentru βgalactozidază). Atunci când sunt introduși în gazde bacteriene lac− , iar acestea cultivate în prezența substratului cromogen X-gal, formează plaje de liza de culoare albastru inchis. Introducerea în acesti vectori de substituție a unui fragment de ADN heterolog, conduce la eliminarea genei lac Z și, ca urmare, vectorii recombinati vor forma plaje de liza incolore.
2) în cazul vectorilor de inserție – de exemplu, λgt10 – care conține un unic situs pentru EcoRI localizat în gena cI, se recomandă folosirea unei tulpini de Escherichia coli mutantă – care are o mutație hfl (high frequency of lysogenisation). În asemenea mutante, produsul genei fagice cII se acumulează în cantități foarte mari, acest produs fiind de fapt un reglator pozitiv al genei cI, care, la rândul ei, determină represia ciclului litic și intrarea în ciclul lizogen. Ca urmare, vectorii nerecombinați vor intra automat în ciclul lizogen și, deci, nu vor produce plaje de liză.
Introducerea ADN heterolog prin inserție la situsul Eco RI din gena cI va inactiva această genă și, ca urmare, toate genomurile fagice recombinate vor intra în ciclul litic. Această metodă este extrem de folositoare pentru screningul unor banci de gene clonate în vectorul λgt10.
3) un alt tip de selecție se bazează pe faptul ca multiplicarea fagului λ sălbatic este restrictată în gazde ce poartă profagul P2. Acest fenotip este denumit Spi+ (sensibil la interferența cu P2). Totuși, tulpinile de fag λ ce nu au genele implicate în recombinare (red și gam) pot crește bine în gazde lizogene pentru P2 și prezintă, deci, fenotip Spi− .
Pe baza acestor constatări au fost construiți o serie de vectori derivați din λ (λ DASH, λ EMBL) care au genele red și/sau gam în regiunea ″stuffer″. Inlocuirea acestei regiuni cu un ADN heterolog conduce la obtinerea de vectori recombinati ce prezintă fenotip Spi− și care, deci, cresc eficient în tulpini de E.coli lizogene pentru P2.
4) în anumite condiții, menținerea genelor red și/sau gam în vectorii fagici recombinati prezintă o serie de avantaje. Produsul genei red este implicat în evenimentele de recombinare timpurii din timpul ciclului litic, evenimente ce ″resolva″ ADN viral replicativ (de forma theta) în molecule CCC. Ulterior, aceste molecule devin matrițe pentru replicarea de tip cerc rotativ, formându-se oligomeri lineari ai ADN viral ce vor fi împachetați în particulele fagice mature.
Produsul genei gam inactivează exonucleaza V a gazdei codificată de genele recB și recC ale gazdei bacteriene. În absența produsului genei gam, exonucleaza V (RecBC) degradează moleculele lineare concatenate ale ADN viral produse prin replicare de tip cerc rotativ. Astfel, într-o bacterie infectată cu un fag gam− , există foarte puține molecule virale disponibile pentru împachetare. Ca urmare, fagii red− și gam− trebuie propagați în gazde recA+ (RecA este proteină majoră a recombinării în Escherichia coli).
5) Un ultim factor genetic ce trebuie luat în considerare în alegerea unui vector derivat din fagul λ este prezența situsului chi. Bacteriofagul λ sălbatic nu conține nici un situs chi. Situsurile chi sunt situsurile preferate pentru recombinarea mediată de enzima RecBC a gazdei. Mutantele λ ce poartă o secvența chi octanucleotidică supreseaza fenotipul Spi− ce apare în mod normal la fagii red− gam− în tulpini sălbatice de E.coli. Această supresie poate fi explicată prin faptul că, în prezența situsurilor chi, procesul de recombinare ce dă nastere la molecule virale împachetabile este crescut, astfel incât plajele de liză formate sunt aproape la fel de mari ca și în cazul fagilor red+ gam+.
Majoritatea vectorilor λau aceste 2 gene (red și gam) în regiunea ″stuffer″, astfel incât atunci când în vector este introdus ADN heterolog, vectorii recombinați prezintă fenotip red− gam−. Totuși, ADN heterolog eucariot conține foarte frecvent secvențe ce mimează situsuri chi și, ca urmare, vectorii recombinati vor avea fenotip Spi+ și, deci, nu vor putea fi selectati pe baza acestui sistem genetic. Astfel de vectori se recomandă a fi propagati în gazde recBC− pentru a putea fi selectați prin sistemul Spi−/Spi+.
Mai recent au fost construiți și vectori λ care permit nu numai clonare și propagarea ADN heterolog, dar și exprimarea acestuia în gazde bacteriene (de exemplu, λgt11).
2.1.5. VECTORI DE CLONARE HIBRIZI DE TIP COSMIDE
Cosmidele sunt vectori hibrizi ce conțin ADN plasmidial și situsul cos din genomul fagului λ Prezentând secvența ori din plasmidul Col E1 și gena de rezistență la ampicilină (Apr), cosmidele se pot replica și menține în celula bacteriană în forma pasmidială (CCC) și permit selecția transformanților pe mediu cu ampicilină[2].
Situsul cos permite împachetarea în vitro a vectorului recombinat (obtinere de particule fagice mature) și, implicit, propagarea sa prin transducție sau transfecție.
Dintre cele 2 forme moleculare, plasmid și ″genom fagic″, cea de-a doua formă este cea care permite menținerea si propagarea stabilă a unui ADN heterolog de dimensiuni mari.
Acești vectori permit clonarea unor fragmente mari de ADN genomic, de aproximativ 45 kb, permițând astfel propagarea unor gene eucariote în intregime într-o singură moleculă de ADN recombinant. Insertul acceptat de cosmide este mult mai mare decât în cazul vectorilor derivați din fagul λ (aproximativ 24 kb), ceea ce reprezintă un avantaj în realizarea băncilor genomice la eucariote.
O altă utilizare a cosmidelor este clonarea și analiza unei regiune de ADN genomic ce face parte dintr-o familie de gene. De exemplu, genele mamaliene pentru globine, care sunt cuprinse într-o regiune de 75 kb, pot fi clonate în doar 2 specii moleculare de cosmide.
2.2 Tehnici moleculare utilizate in selecția asistată de markeri genetici
2.2.1. TEHNICA PCR
Tehnica PCR sau reacția în lanț a polimerazei, dezvoltată la mijlocul anilor ’80, a revoluționat genetica moleculară, făcând posibilă studierea și analizarea genelor prin metode mult mai accesibile și foarte simple. Această tehnică a fost descoperită de Kary Mullis în anul 1983, plecând de la caracteristicile replicării ADN și anume, cu ajutorul enzimei ADN polimeraza care utilizează o catenă a ADN ca matriță pentru sinteza unei noi catene complementare. Prin această tehnică se produc un număr enorm de copii a unor secvențe de ADN (gene) fără a se apela la clonare .
Tehnica PCR exploatează unele caracteristici ale replicării ADN, unde pentru amplificarea secvenței de ADN dorite se utilizează o secvență de oligonucleotide numită primer sau amorsă. Primerii sunt secvențe scurte de 15 – 35 nucleotide, complementare capetelor ale secvenței de ADN ce se dorește a fi amplificată; ei sunt specifici fiecărei gene și sunt sintetizați cu ajutorul unor sintetizatoare automate de ADN. Pentru amplificarea secvențelor specifice de ADN, prin tehnica PCR, se folosește o soluție tampon (PCR buffer) în care se introduce ADN ce conține gena de interes, primerii sintetizați, Taq polimeraza și cele patru tipuri de deoxinucleotid-trifosfați (dATP, dGTP, dCTP și dTTP).
Tehnica PCR presupune parcurgerea a trei etape principale, într-un aparat în care realizarea ciclurilor termice este controlată automat de Termocycler:
– Denaturarea ADN, presupune încălzirea soluției în care se află ADN la timp de 5 minute, efectul fiind ruperea legăturilor de hidrogen și separarea celor două catene.
– Atașarea primerilor se realizează prin răcirea pȋnă la – a soluției în care se află secvența de amplificat. Primerii se leagă la capetele 3’a celor două catene de ADN ale genei pe care dorim să o amplificăm. De obicei, este nevoie de doi primeri numiți sens și antisens, dar amplificarea se poate realiza și cu un singur primer, în cazul tehnicii PCR ancorat.
– Elongația se produce la temperatura de circa , temperatură la care Taq-polimeraza funcționează optim, în faza de extensie, iar ciclul se repetă de 25 – 40 ori. Amplificarea este aproximativ exponențială, realizându-se după 3 cicluri 2 copii, după 10 cicluri 256 copii, iar după 32 cicluri 1,73 miliarde copii ale secvenței supuse amplificării . După amplificare, gena de interes se vizualizează în lumină ultravioletă, la nivelul gelului de agaroză în care fragmentele au fost colorate cu bromură de etidiu. Dacă amplificarea s-a produs, în gel se vor observa una sau mai multe benzi, corespunzătoare secvenței specifice de ADN.
În tehnica PCR, alegerea primerilor este primordială și putând fi utilizați două tipuri de primeri:
– primeri specifici – sunt dirijați spre un situs foarte precis al ADN, reprezentat de genele sau fragmentele de gene cunoscute. Prin primer specific se înțelege o secvență cunoscută de ADN utilizată pentru începerea sintezei unei anumite gene, cu structură cel puțin parțial cunoscută. Primeri specifici pot fi dirijați și spre regiunile situate în amonte sau aval de secvențele unice, la nivelul secvențelor minisatelit sau microsatelit. Secvențele de tip satelit, specifice fiecărui individ sunt astfel amplificate. Evidențierea acestor polimorfisme se utilizează în momentul de față în medicina criminalistică pentru identificarea suspecților, pornind de la diferite mostre de țesut (sânge, spermă, bulbi de păr etc.), pentru marcarea cărnii, sau altfel spus, urmărirea ei pe parcursul filierei de distribuție și consum.
– primeri aleatori – sunt de dimensiuni reduse (în medie 10 – 20 nucleotide ). Alegerea secvențelor care constituie acești primeri este complet arbitrară. În cursul reacției PCR acești primeri se vor hibrida de fiecare dată când în ADN se vor găsi secvențe care le sunt complementare și de orientare opusă.
Tehnica PCR și-a găsit aplicare în cele mai diverse domenii:
– în selecția animalelor: prin stabilirea genotipurilor la locii care codifică sinteza cazeinei, β-lactoglobulinei, leptinei, factorului de transcripție pituitar (Pit1) care este responsabil pentru expresia hormonului de creștere la mamifere, este posibilă aplicarea selecției timpurii, reținând la reproducție numai animalele a căror genotip se asociază cu producții cantitative și calitative mai ridicate.
– în alimentație: se poate folosi pentru alegerea tulpinilor de levuri sau mucegaiuri ce vor putea fi utilizate ca probiotice (aditivi furajeri) în hrana animalelor.
– în reproducție: se folosește pentru identificarea sexului încă din faza de embrion. Utilizând primeri specifici pentru amplificarea unor secvențe de ADN de pe heterozomul Y, se poate stabili sexul. Dacă embrionul este de sex mascul (XY) se va produce amplificarea secvenței specifice de pe cromozomul Y și va putea fi vizualizată în gelul de agaroză. Dacă embrionul este de sex femel (XX) nu se va produce amplificarea secvenței respective, în gelul de agaroză lipsind banda caracteristică.
– în medicină: se folosește pentru identificarea unor gene mutante (oncogene), care conduc la apariția unor tumori maligne, în monitorizarea evoluției și terapiei cancerului, în detectarea infecțiilor bacteriene și virale.
– în institutele medico – legale: se folosește pentru determinarea paternității, sau pentru identificarea persoanelor care s-au făcut vinovate de delicte penale: crimă, viol etc.
VARIANTE ALE TEHNICII PCR
2.2.1.1.Tehnica RFLP (Restriction Fragment Length
Polymorphism)
Această tehnică se bazează pe proprietățile de hibridare care există între două fragmente de ADN, prezentând un grad înalt de omologie (RFLP- bazat pe hibridare) și tehnica PCR – denumită PCR-RFLP, în care se evidențiază polimorfismele existente la nivelul situsurilor enzimelor de restricție.
a) Tehnica RFLP bazată pe hibridare cu o sondă, implică parcurgerea următoarelor etape:
– extracția ADN din organismele ce urmează să fie analizate;
– digestia ADN cu ajutorul enzimelor de restricție;
– separarea fragmentelor obținute în urma digestiei, în funcție de mărimea lor, prin electroforeză în gel de agaroză;
– transferul ADN sub formă denaturată pe o membrană de nylon (Southern blotting) în care poziția relativă a diferitelor fragmente de ADN din gel se păstrează pe parcursul transferului;
– hibridarea ADN cu sonda marcată prealabil, în regiunile în care prezintă omologie;
– vizualizarea regiunilor hibridate cu ajutorul unui film sensibil la radiații (autoradiografie) sau cu ajutorul unei reacții enzimatice, care dă o colorație specifică.
În tehnica RFLP pot fi utilizate diferite tipuri de sonde, care permit evidențierea unor tipuri diferite de polimorfism. Sondele mono- sau oligogenice pun în evidență unul sau mai mulți loci; ele dau un profil simplu care include câteva benzi. Utilizarea acestui tip de sonde permite vizualizarea polimorfismelor de secvență, localizate la nivelul situsurilor de restricție, precum și a polimorfismelor de inserție/deleție, situate între situsurile de restricție. Acest tip de sondă a fost utilizat pentru a alcătui hărți genetice la om, pentru a identifica unele varietăți de măr și pentru a pune la punct un test de depistare a anemiei falciforme. Sondele poligenice sau multilocus pot fi dirijate spre zonele care prezintă ariabilitate foarte mare, cum sunt secvențele de tip micro și minisatelit, alcătuite de 2 până la 16 perechi de baze, repetate în tandem. Cu ajutorul sondelor multilocus, se observă, în general un grad ridicat de polimorfism între genotipurile înrudite. Acest tip de sondă a fost utilizat pentru prima dată de Jeffreys și colaboratorii in 1985 la hibridarea cu ADN genomic uman digerat și amprentizarea genetică a fiecărui individ. Ulterior, au fost descoperite alte secvențe satelit și la alte mamifere, la insecte și plante. Sondele multilocus permit evidențierea polimorfismului de secvență la nivelul situsurilor de restricție, polimorfismului de inserție/deleție precum și polimorfismului determinat de numărul unităților repetitive, pentru fiecare individ în parte .
b) Tehnica RFLP, bazată pe PCR, utilizează o enzimă de restricție pentru digerarea unui produs de amplificare, obținut cu primeri specifici, iar în gelul de agaroză se vor obține benzi de dimensiuni diferite, corespunzătoare celor trei genotipuri (homozigoți pe una din cele două alele și heterozigoți).
Markerii RFLP sunt markeri cu polimorfism limitat ce identifică variațiile secvenței de ADN la nivelul unui situs de restricție, prin analiza RFLP. O sursă abundentă de markeri genetici, utilizați în tehnicile de cartare a genomului animal au la bază modificările unor secvențe de ADN care se produc la nivelul situsurilor de restricție
De regulă aceste variații sunt cauzate de mutații punctiforme (substituția unei nucleotidecu o alta), inserții sau deleții, în interiorul situsului de restricție și astfel, enzima de restricție, nu mai recunoaște situsul respectiv și nu mai taie. Aceasta va determina obținerea unor fragmente de restricție de lungimi diferite (polimorfice) care pot fi ușor vizualizate și identificate în gelul de agaroză datorită lungimii lor diferite. Din această cauză ele se vor separa în gelul de electroforeză sub forma unor benzi situate în diferite regiuni. Greutatea moleculară se apreciază cu ajutorul unui ADN standard de etalonare – ladder. În practică, mărimea unui fragment ce se detectează prin Southern blotting este de 300 pb – 15 kb cu diferențe detectabile mai mici de 50 pb.
Prin tehnica PCR se detectează produși între 60 pb-2kb, cu diferențe chiar de câteva baze. Indivizii diferiți genetic pentru un anumit locus, vor prezenta fragmente de restricție de lungimi diferite, într-un număr diferit pentru un anumit cuplu format din sonda moleculară – enzimă de restricție. În acest context, fiecare sistem format din ADN genomic – enzimă de restricție, poate defini un locus polimorf care are cel mult două alele diferite .
Cu ajutorul RFLP se pot identifica variațiile genetice dintre indivizi doar la nivelul situsurilor de recunoaștere a enzimelor de restricție, respectiv dintre indivizii care posedă unul din cele trei genotipuri existente în locusul de interes (AA, Aa, aa) și nu se pot detecta variațiile la nivelul întregului genom, care la mamifere este de ordinul 3x 109 pb.
2.2.1.2. Tehnica AFLP
Tehnicile moleculare care permit obținerea amprentelor genetice și vizualizarea polimorfismelor, a diferențelor dintre eșantioane la nivel de ADN, se bazează pe două principii: hibridare cu sonde sau amplificare prin reacția PCR. Polimorfismul bazat pe numărul de repetiții în tandem, a motivelor de tip satelit, este azi cel mai utilizat în studiul diversității genetice a raselor de animale și a soiurilor de plante.
AFLP este o tehnică bazată pe punerea în evidență a polimorfismelor tot la nivelul situsurilor de restricție. Această tehnică a fost descrisă de Vos și colaboratorii în anul 1995 și se bazează pe amplificarea selectivă, cu ajutorul PCR, a unei categorii de fragmente obținute printr-o restricție particulară, care utilizează 2 enzime de restricție și adaptori, marele avantaj al metodei este acela că nu necesită informații preliminare despre genom.
Tehnica AFLP se bazează pe amplificarea selectivă a fragmentelor de restricție, obținute din ADN genomic total digerat și ea parcurge trei etape:
– restricția ADN genomic și legarea adaptorilor oligonucleotidici;
– amplificarea selectivă a seturilor de fragmente de restricție;
– analiza fragmentelor amplificate, în gel de poliacrilamidă.
Pentru prepararea unei matrițe AFLP, ADN genomic este izolat și digerat simultan cu 2 enzime de restricție, de exemplu: EcoRI și MseI. EcoRI are un situs de recunoaștere de 6 pb (taie rar) iar, MseI are un situs de recunoaștere de 4 pb (taie frecvent).
Fragmentele obținute prin restricție pot fi grupate în 3 clase:
– marea majoritate (90%) prezintă două situsuri MseI la extremitățile lor;
– aproximativ 10% prezintă un situs EcoRI și un situs MseI;
– câteva fragmente prezintă 2 situsuri EcoRI.
Procedeul AFLP se bazează pe detecția predominantă a fragmentelor EcoRI – MseI care au o extremitate tăiată cu o enzimă care taie rar și o extremitate tăiată de o enzimă care taie des. Succesul tehnicii AFLP depinde de digestia completă a ADN genomic. Pentru aceasta trebuie acordată o importanță sporită izolării ADN de înaltă calitate, intact și fără contaminări cu nucleaze sau inhibitori .
Legarea adaptorilor, după inactivarea prin căldură a endonucleazelor de restricție, de tip Eco RI și MseI, dublu catenari, se face la extremitățile fragmentelor de ADN.
Structura adaptorilor este următoarea:
– secvență nouă, care va servi ca situs țintă pentru atașarea primerilor PCR în etapa următoare a AFLP;
– o secvență care permite restaurarea situsului de restricție;
Sunt utilizate două tipuri de adaptori: cei care restaurează situsul EcoRI și cei care restaurează situsul MseI. Primerii care sunt utilizați în reacția PCR nu se fixează pe ADN genomic, dar se vor fixa pe adaptori. După digestia ADN genomic și legarea adaptorilor, fragmentele de restricție vor fi amplificate prin PCR. În structura primerilor PCR vom regăsi de o parte secvența adaptorilor și un situs de restricție (este acela la nivelul căruia se vor fixa primerii PCR în următoarea reacție PCR), iar de cealaltă parte o nucleotidă selectivă, adăugată la extremitatea a primerilor PCR.
Numărul nucleotidelor selective poate varia de la 0 la 3 pe primer. Fixarea nucleotidelor specifice determină ca un singur subansamblu de fragmente de restricție să fie recunoscut și amplificat. Condițiile de reacție sunt alese de așa natură ca singurele fragmente de ADN care corespund perfect cu primerul să fie amplificate. Dacă se lucrează cu genoame complexe, cum sunt cele de la plante sau animale, PCR-ul este realizat în două etape consecutive. În prima reacție, numită preamplificare, ADN genomic este amplificat cu doi primeri AFLP, având câte o singură nucleotidă selectivă și produsul PCR al preamplificării este diluat și utilizat ca matriță pentru a 2-a amplificare selectivă, iar în al doilea PCR se vor utiliza primeri AFLP, ce conțin câte trei nucleotide selective.
Această strategie, de amplificare în două etape, permite obținerea unei amprente genetice foarte clare, care poate fi analizată pentru detectarea polimorfismelor și între indivizii strâns înrudiți. Unul din marile avantaje ale tehnicii AFLP este permisivitatea modulării numărului de profiluri genetice. Este posibilă creșterea sau reducerea complexității profilului, adaptând diferiți parametrii, iar factorul cel mai important pentru determinarea numărului de fragmente, amplificate într-o reacție simplă AFLP, este numărul de nucleotide selective din primerii selectivi. Numărul de fragmente detectate în gel, pentru o amprentă genetică, scade când numărul nucleotidelor selective crește.
Alegerea numărului de nucleotide selective este strâns legată de mărimea genomului, cu cât mărimea genomului este mai redusă cu atât numărul fragmentelor amplificate este mai restrâns și amprenta genetică mai simplă. Pentru organismele cu genoame mari (5×108- 5x109pb) se utilizează primeri selectivi cu câte trei nucleotide, astfel încât să se amplifice în medie 50 fragmente pe probă și pe perechea de primeri selectivi, acest număr poate varia însă între 10 și 100, în funcție de secvența nucleotidică și complexitatea genomului. Al doilea factor, ce determină numărul de fragmente amplificate, este compoziția în baze G și C a nucleotidelor selective din primeri. În general, se amplifică mai puține fragmente când nucleotidele selective sunt G și C.
Tehnicile amprentelor genetice sunt multiple, fiecare are caracteristici particulare de specificitate de locus, nivel de polimorfism, tehnicitate. Alegerea unei metode trebuie întotdeauna să fie luată în considerare în funcție de obiectivul cercetării:
– pentru studii de diversitate ca și pentru măsurarea variațiilor inter sau intrapopulaționale, distanței genetice, pentru clasificarea în sistematică a populațiilor distincte genetic.
– pentru clonarea pozițională ca și pentru obținerea unei densități mari de markeri moleculari, într-o regiune precisă din genom (hipervariabilă), din vecinătatea unei gene care urmează să fie clonată;
– pentru stabilirea hărților genetice la speciile puțin studiate sau acolo unde sondele și primerii PCR nu au fost încă dezvoltați.
Marele avantaj al tehnicii AFLP este sensibilitatea în detectarea polimorfismului la nivelul genomului total. Cu toate acestea, tehnica AFLP a devenit un standard molecular pentru clasificarea în sistematică a populațiilor distincte genetic. Polimorfismele identificate în ADN sunt transmise mendelian și utilizate apoi pentru genotipizare, identificarea markerilor moleculari și cartografierea genelor .
2.2.1.3. Tehnicile MAAP
Din categoria tehnicilor MAAP (Multiple Arbitrary Amplicon Profiling) face parte tehnica RAPD (Random Amplified Polymorphic
DNA), alături de tehnicile DAF (Amplification Fingerprinting ) și AP-PCR (Arbitrary Primed PCR).
2.2.1.3.1. Tehnica RAPD
Tehnica RAPD se bazează pe determinarea polimorfismului la nivel alelic în ceea ce privește producerea unor produși de amplificare sau lipsa lor, în urma utilizării unui primer oligonucleotidic, arbitrar, într-o poziție care să-i permită realizarea amplificării.
Această variantă a tehnicii PCR nu necesită clonarea sau secvențierea ADN și poate detecta mai mulți loci simultan.
Principiul tehnicii este simplu: ADN izolat de la un individ este supus unei reacții PCR utilizând primeri oligonucleotidici, de secvență arbitrară, care vor hibrida la secvențele sale complementare, în cazul în care acestea există. Dacă din întâmplare, doi primeri consecutivi, aflați în vecinătate, se atașează la matriță în sensuri opuse, fiecare pe una din cele două catene, la o distanță nu prea mare unul de celălalt, fragmentul delimitat de ele va fi amplificat, iar dacă unul din cele două situsuri este absent la unul din indivizi, la acesta amplificarea nu va avea loc, evidențiindu-se un polimorfism de prezență/absență. Secvențele de primeri scurți, împerecheați aleator (8 – 12 perechi de baze) sunt folosiți la amplificarea ADN de tip RAPD, de obicei rezultând un polimorfism de prezență/absență, în gel. O astfel de situație, care permite amplificarea randomizat, în mai multe puncte, poate fi realizată la nivelul întregului genom.
Deoarece RAPD este o tehnică bazată pe PCR, vom prezenta câteva din particularitățile definitorii ale acesteia. Modificarea unei singure baze în genom este suficientă pentru a împiedica atașarea primerului în acel loc și a împiedica amplificarea fragmentului delimitat de acel primer. Analiza RAPD poate detecta modificarea unei singure baze în ADN genomic, în anumite condiții .
Polimorfismul detectat de RAPD poate rezulta din câteva tipuri de modificări:
– inserția unei secvențe mari de ADN, între secvențele de atașare a primerilor, care fac fragmentul delimitat de aceste secvențe prea mare pentru a fi amplificat;
– deleția unui fragment de ADN ce conține unul din situsurile de atașare a primerilor duce de asemenea la lipsa amplificării segmentului;
– substituția unui nucleotid poate afecta hibridarea primerului la un anumit situs de atașare, putând evidenția sau nu un polimorfism (dispariția unei benzi);
– inserția sau deleția unui mic fragment de ADN poate duce la modificarea mărimii unui fragment amplificat și a poziției benzii în gel.
Modificările de mărime se observă rar, dar cel mai adesea polimorfismul se manifestă prin aceea că un fragment amplificat poate fi prezent sau absent. Polimorfismul detectat prin RAPD este folosit ca și marker molecular. Markerii RAPD se comportă ca markeri dominanți când sunt urmăriți în descendență. Acest comportament rezultă din faptul că un fragment amplificat este prezent în gel (ca o alelă dominantă A) sau absent (ca alelă recesivă a). În analiza descendenților, un fragment este observat în stare homozigotă (analog cu AA), fiind amplificat atât ADN de la un părinte, cât și de la celălalt, sau în stare heterozigotă (analog cu Aa), când este amplificat numai ADN provenit de la unul din părinți, celălalt prezentând un polimorfism reperezentat prin absența fragmentului.
În stare heterozigotă, absența fragmentului de la unul din părinți este mascată de prezența benzii datorată fragmentului amplificat de la celălalt părinte. Prin urmare, analiza RAPD nu poate discerne între starea homozigotă (AA) și cea heterozigotă (Aa).
În cazul markerilor codominanți însă (în care fiecare părinte posedă o bandă distinctă, pe care celălalt nu o posedă), starea heterozigotă (AB) în descendență (prezența ambelor benzi în hibridul din F1) poate fi deosebită de stările homozigote (AA) și (BB). In anii `90 s-a arătat că 95% din fragmentele RAPD se comportă ca markeri dominanți (un singur fragment amplificat distinctiv la unul sau ambii părinți și descendenți) și sub 5% se comportă ca markeri codominanți.
Calculul numărului de fragmente care poate fi așteptat teoretic la folosirea unui primer care hibridează 100% cu matrița, poate fi calculat din lungimea primerului și din complexitatea genomului țintă, presupunând că nucleotidele sunt prezente în proporții egale. Produșii de amplificare se separă prin electroforeză în gel de agaroză și se evidențiază după colorare în bromură de etidiu .
2.2.1.3.2. Tehnica DAF
In 1991, Caetano-Anolles și colaboratorii , au introdus o metodă numită DNA Amplification Fingerprinting (DAF). Ei au folosit primeri scurți, cel mai adesea de lungime între 5 – 8 nucleotide. De asemenea, ei au modificat anumiți parametrii PCR, folosind pași atât de joasă cât și de înaltă stringență, precum și un program al ciclurilor cu numai două temperaturi în loc de standardul cu trei. Produșii de amplificare au fost separați prin electroforeză în gel de poliacrilamidă și vizualizați prin colorare cu argint. Nivelul complexității profilului benzilor poate fi predeterminat prin manipularea condițiilor de reacție. Ca urmare a apariției mai multor variante de amprentare a întregului genom, bazate pe PCR cu primeri arbitrari, Caetano-Anolles și colab., au propus în (1994), denumirea acestor metode înrudite cu numele generic de Multiple Arbitrary Amplicon Profiling (MAAP) .
Totuși, datorită simplității și utilității, numele și metoda originală RAPD, cunoaște cea mai largă răspândire. Această tehnică permite amplificarea unui număr mai mare de fragmente de dimensiuni foarte mici, care ulterior vor fi separate într-un gel de poliacrilamidă.
2.2.1.3.3. Tehnica AP – PCR
Lungimea primerului utilizat, este un criteriu principal de distincție între cele trei tehnici descrise anterior; astfel că pentru RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) sunt primerii decameri (9-10 pb), pentru DAF (DNA Amplification Fingerprint) primerii au 5-15 pb, iar pentru AP-PCR (Arbitrary Primed PCR) primerii au lungimea de18-32 pb. Tehnicile AP-PCR și DAF pot releva numeroase benzi (până la 100) în timp ce RAPD-ul produce un număr mic de benzi, până la zece .
Avantajele tehnicilor Multiple Arbitrary Amplicon Profiling (MAAP) rezidă din: simplitate, rapiditate, costuri scăzute, și faptul că nu necesită cunoștințe anterioare despre genom, nu necesită digestie sau transfer pe o membrană, marcare radioactivă sau fluorescentă, cu ajutorul lor fiind generați markeri moleculari utilizând markerii deja disponibili [52] . Tehnica RAPD fiind rapidă, poate fi utilizată în hibridări interspecifice, introgresia genelor, identificarea clonelor, descoperirea markerilor sex-linkați, măsurarea distanțelor genetice la plante, animale și om.
Dezavantajele tehnicii constau în reproductibilitatea scăzută, iar schimbările de scurtă durată a condițiilor de reacție pot cauza benzi nereproductibile. O singură procedură cuprinde trei etape importante. Tehnica AP-PCR utilizează primeri de 18 pb și a fost dezvoltată și utilizată ca metodă reprezentativă [10,12].
2.2.1.4 Tehnica RT – PCR
Această tehnică este tot o variantă a tehnicii PCR, în care amplificarea pornește de mesager (ARNm). În prezența enzimei revers transcriptaza, ARNm devine matriță pentru sinteza ADN complementar (ADNc), după care procesul de amplificare decurge în mod normal. Cuantificarea expresiei genice se bazează pe presupunerea că se păstrează o anumită proporționalitate între cantitatea de ADN de la începutul reacției și cantitatea produsului de amplificare .
Trebuie subliniat faptul că aplicarea reacției PCR la moleculele de ARN necesită o modificarea a reacției PCR în prima etapă. Pentru că molecula de ARN nu poate fi copiată în prezența Taq polimerazei, această etapă este catalizată de revers transcriptază, enzimă în prezența căreia este sintetizată molecula de ADN de pe matrița de ARN. Copia de ADN este apoi amplificată în prezența Taq polimerazei.
Descoperirea enzimelor termostabile (ex. ADN-polimeraza – obținută din bacteria Thermus thermophilus) cu ajutorul cărora pot fi obținute copii termostabile de ADN atât de pe matrițe de ADN cât și de pe matrițe de ARN face posibilă aplicarea RT – PCR în condițiile în care va fi necesară o singură reacție în prezența unei singure enzime [11]. Această tehnică oferă o informație mai detaliată referitoare la detectarea cu sensibilitate ridicată a unor gene exprimate în cantități reduse, într-o anumită celulă.
2.2.1.5. Tehnica microsateliților – SSR
La organismele procariote și eucariote o parte din ADN genomic este reprezentat de secvențe de ADN înalt repetitive, de complexitate mică și considerate noninformaționale. Microsateliții sau SSR (Simple Sequence Repeats) sunt secvențe înalt repetate, care conțin motive de 2 – 5 perechi de baze, repetate în tandem și care flanchează o secvență unică de ADN. Se pare că aceștia sunt rezultatul crossing-overului inegal. Tehnica PCR este aceea care va fi utilizată pentru relevarea profilurilor individuale, furnizând markeri specifici de locus ce se transmit codominant.
Un microsatelit nu este specific la un locus particular, dar regiunile flancatoare sunt specifice Acești markeri bazați pe PCR necesită investiții considerabile pentru a putea fi generați, dar sunt înalt polimorfici pentru folosirea lor în aplicațiile MAS (selecția asistată de markeri moleculari). Polimorfismul este determinat de diferențele existente în lungimea produșilor de amplificare. Acest polimorfism va duce la evidențierea mai multor alele la acest locus. Fiind o regiune înalt polimorfică se pot distinge foarte multe alele, dar care pot determina diferențele chiar și între indivizi înrudiți. Motivele repetate în tandem pot fi utilizate și ca sonde, dirijate către ADN genomic, unde să-și găsească regiunile complementare.
2.2.1.6. Tehnica EST
Această reacție bazată pe PCR necesită atât clonare cât și informații despre secvență, utilizând informațiile proiectului de secvențiere a genelor, când sunt generate clone de ADNc. Această secvență este folosită pentru designul unor primeri de 18 – 20 pb cu care se vor amplifica secvențe învecinate.
Markerul EST este de obicei detectat după mărime în produsul de amplificare și este un marker codominant. Crearea acestor primeri se realizează cu costuri foarte mari, dar aceștia sunt foarte utili prin diversele aplicații în cartare, descoperirea genelor asociate cu locii caracterelor cantitative – QTL (Quantitative Traits Loci) și ar trebui să contribuie considerabil la înțelegerea mecanismelor la acești loci .
2.2.1.7. Tehnica SCAR
În cadrul acestei tehnici, fragmentele de ADN amplificate prin tehnica PCR-RAPD, sunt clonate și pe baza lor se construiesc primeri specifici care vor avea lungime mai mare decât primerii RAPD. Prin utilizarea primerilor SCAR în PCR, nu se rezolvă problema reproductibilității reduse, deseori întâmpinată de markerii RAPD. Obținerea unui marker codominant poate deveni un avantaj în plus, în convertirea markerilor RAPD în markeri SCAR [11].
Totuși, markerii SCAR pot manifesta dominanță completă când unul sau ambii primeri coincid parțial cu variația din secvența unui anumit locus. Markerii SCAR dominanți pot fi făcuți deseori codominanți, prin digestia produsului PCR cu diferite enzime de restricție.
2.2.1.8. Tehnica SNP
Această tehnică se caracterizează prin detectarea mutațiilor punctiforme la un locus particular, mutații determinate de substituția unei singure nucleotide cu alta. Prin această tehnică pot fi evidențiate diferențele de secvență existente între alele, cum ar fi substituția A în T de exemplu AAGGCTAA în ATGGCTAA [2]. Pentru ca o variație de secvență să fie considerată SNP ea trebuie să apară cu o frecvență de până în 1% în populație, ceea ce în populația umană va detemina mai mult de 90% din întreaga variație genetică .
Aceasta înseamnă apariția mutației la fiecare 100 până la 300 perechi de baze din totalul de 3 miliarde. Două din trei polimorfisme SNP sunt determinate de înlocuirea citozinei cu timina, ce apar atât în regiunile codificatoare cât și necodificatoare, polimorfisme de tip citozină – timină au fost descrise și de Schenkel F.S. și colaboratorii în anul 2005 .
2.2.1.9. Tehnica STS
Această tehnică bazată pe PCR, detectează o secvență unică într-un punct definit din genom. Pe baza acestei tehnici pot fi convertiți markerii genetici RAPD în markeri STS, pentru același locus. Tehnica nu necesită clonare dacă există informații anterioare despre secvență, pentru definirea primerilor. Designul primerilor de 18 – 20 pb, poate fi conceput după secvența fragmentelor RAPD excizate din gel, pentru a amplifica ulterior fragmente de ADN unice (de exemplu poate fi secvența unui produs PCR – RAPD sau a sondelor RFLP).
Polimorfismul este în general detectat ca o diferență de mărime în produsul de amplificare STS față de produsul RAPD, de la același locus. Dacă nu există nici o diferență de mărime, se apelează la restricția enzimatică pentru a tăia produșii de amplificare și pentru identificarea polimorfismului lor. Poate fi astfel detectat un polimorfism de câteva nucleotide. Din moment ce primerii STS sunt mai lungi decât primerii RAPD și bazați pe o secvență specifică, această metodă detectează polimorfismul de la același locus, fiind potrivită pentru studii de cartare genică. Dezavantajul metodei este că proiectarea și crearea primerilor poate implica o investiție importantă .
2.2.1.10. Tehnica ARMS –PCR
O modificare a metodei PCR, care permite detecția mutațiilor punctiforme cunoscute, prin amplificare cu primeri specifici de alelă, este metoda ARMS-PCR. Aceasta este o metodă care nu implică utilizarea izotopilor radioactivi, iar genotipizarea este posibilă prin simpla examinare a migrării produsului PCR prin elecroforeză în gel de agaroză. Tehnica este cunoscută ca detectarea mutațiilor prin amplificare refractară, descrisă pentru prima dată de Newton C.R. și colab., 1989. Metoda constă în utilizarea a doi primeri care prezintă aceeași secvență de nucleotide cu excepția nucleotidei terminale – unul complementar cu alela normală, iar celălat cu alela mutantă.
Pentru amplificarea enzimatică se folosește Taq-polimeraza, enzimă care nu are activitate exonucleazică 3’-, ceea ce implică necesitatea unei perfecte complementarități a primerului cu capatul al matriței ADN. Rezultatul se obține în urma electroforezei în gel de agaroză prin prezența sau absența produsului de amplificare respectiv.
Specificitatea este obținută dacă primerul oligonucleotidic este complementar cu secvența alelei dorite, dar nu este complementar cu cealaltă alelă la capătul , sau în imediata vecinătate a capătului 3' al primerului specific de alelă. Neamplificarea este rezultatul nepotrivirii dintre ADN matriță și oligonucleotidul din primer. Pentru că Taq-polimeraza nu are activitate exonucleoazică în direcția 3'-5', această nepotrivire împiedică eficient elongarea la capatul 3' cu ajutorul Taq polimerazei. Metoda este aplicabilă, în general, în detecția mutațiilor punctiforme cunoscute, mici deleții și inserții, polimorfisme și alte variații în secvența ADN.
De aceea, o mutație (sau un polimorfism) poate fi detectată prin utilizarea unui construct oligonucleotidic adecvat, care permite o elongare eficientă, în cazul unui cromozom mutant și o elongare ineficientă, în cazul unui cromozom normal .
2.2.2. TEHNICA SSCP
Această tehnică este utilă în detectarea polimorfismului determinat de cel puțin o nucleotidă. Evidențierea polimorfismului se face în timpul electroforezei în gel de poliacrilamidă. Acest polimorfism se bazează pe diferențele de conformație ale unei singure catene (mutantă) ce diferă de cealaltă într-un singur punct, datorită unei substituții, deleții sau inserții [6]. În anumite condiții, acizii nucleici dintr-o catenă de ADN formează în soluție o structură secundară. Structura secundară depinde de compoziția în baze, structură care poate fi alterată și de substituția unei singure nucleotide. Această diferență va determina o mobilitate electroforetică diferită în condițiile unui gel nedenaturat (gel de poliacrilamidă nedenaturat). Vizualizarea fragmentelor ce urmează a fi detectate se face după o prealabilă colorare cu argint sau după marcarea radioactivă [1].
2.2.3. TEHNICI BAZATE PE SECVENȚIERE
Prima secvență descifrată a fost ARNt-ul purtator de alanina publicată de către Robert Holley și colegii săi de in 1964 [26]. Aceștia au utilizat enzime specifice care au rupt molecula de ARNt în segmente mici până când s-a reușit secvențierea directă prin metode de degradare enzimatică. Abia în fost descifrată secvența completă a ARN monocatenar de la fagul MS2, de către Walter Fiers în laboratorul său din Ghent. S-a stabilit atunci structura completă a genomului viral și organizarea acestuia, corespondența dintre codoni și cele trei proteine codificate de genele fagului MS2 și că un codon stop cauzează terminarea transcripției .
Secvențierea ADN poate fi făcută prin procedee chimice – metoda Maxam și Gilbert sau cu ajutorul terminatorilor de lanț – metoda dideoxi sau Sanger, aceasta din urma fiind astăzi utilizată mai mult. Prima metodă a fost pusă la punct de către Maxam si Gilbert ȋn 1977 și este de fapt o clivare chimică . Cea de-a doua, metoda dideoxi sau Sanger, a fost pusă la punct în același an de către Sanger și se bazează pe întreruperea controlată a sintezei enzimatice a ADN, amplificat prin PCR.
În ambele cazuri, fragmentele obținute sunt supuse marcării radioactive (cu 32P, de exemplu) înaintea separării pe baza greutății moleculare într-un gel de poliacrilamidă. Vizualizarea și analizarea produșilor rezultați se face prin autoradiografie.
O metodă mult mai convenabilă și mai precisă este marcarea fluorescentă a fragmentelor și secvențierea automată. Fragmentele de ADN sunt migrate într-un gel de poliacrilamidă iar aparatul (secvențiatorul), prevăzut cu un fascicul laser, excită fiecare moleculă marcată fluorescent și transformă valorile fluorescente în secvența în nucleotidice a fragmentului analizat. Un astfel de aparat (ALFexpress Auto Read) poate detecta 200 pb pe oră. Fiecărei secvențe de acizi nucleici îi corespunde o diagramă a succesiunii de baze numită electroforegramă. În această diagramă fiecărei baze îi corespunde un vârf și o colorație caracteristică.
O altă tehnică este secvențierea automată, în cazul căreia, catena de ADN care va intra în reacția de secvențiere depinde de primerul utilizat, putând fi supusă secvențierii atât catena sens cât și cea antisens. În studiile de secvențiere a genelor, pentru precizia rezultatelor obținute sau atunci când sunt căutate mutații punctiforme, se recomandă secvențierea ambelor catene și compararea rezultatelor obținute. În acest caz, este necesară cunoașterea ambilor primeri, care să inițieze sinteza genei ce urmează să fie descifrată.
În cazul în care se dorește descifrarea structurii unui fragment de ADN, sau a unei gene, de la specii a căror genom nu este saturat în hărți genetice, pentru amplificare se utilizează primeri universali, cum este cel de la fagul M13 .Pentru fragmente de dimensiuni diferite se aleg vectori corespunzători pentru clonare, de exemplu: plasmide (0,1-10 kb), fagi (8-20 kb), cosmide (35-50 kb), BAC (cromozom artificial bacterian 75-300 kb) și YAC (cromozom artificial de drojdie 100-1000 kb) la care genomul este complet descifrat și sunt întocmite hărțile de restricție.
Etapele secvențierii:
1. Izolarea ADN genomic sau a fragmentului (genei) de interes ce urmează să fi clonat sau secvențiat;
2. Purificarea ADN izolat;
3. Amplificarea prin PCR a fragmentului de analizat cu ajutorul primerilor specifici sau a primerilor universali, în prezența celor patru dNTP marcați florescent, fiecare cu altă culoare – (adenina în verde, timina în roșu, guanina în negru și citozina în albastru) și a polimerazei ;
4. Vizualizarea produșilor de amplificare prin migrarea în gel de agaroză (procedeu care face posibilă atât identificarea produșilor de amplificare, determinarea lungimii fragmentelor amplificate și a calității produsului de amplificare;
5. Purificarea produșilor de amplificare; pentru ca produșii de amplificare să poată fi utilizați în reacții de secvențiere trebuie să aibă un grad înalt de puritate (evitându-se contaminarea cu inhibitori și prezența rezultatelor eronate) ;
6. Secvențierea automată;
7. Citirea secvențelor pe catena analizată;
8. Alinierea secvențelor de pe cele două catene sens și antisens;
Reacția de secvențiere începe întotdeauna după ce ADN supus secvențierii a fost inițial amplificat prin PCR, purificat și cuantificat.
CAPITOLUL III. REZULTATE ȘI DISCUȚII
Dezvoltarea mai multor tehnologiilor a permis producerea cu succes a polipeptidelor recombinate în bacterii și cercetatorii in biologie au deschis unele căi noi care sunt mai ușore, rapide și necostisitoare.
Cu toate acestea, abordarea transgenezei a rămas oarecum imprevizibilă, deoarece multe constructii proteice au opus rezistenta producerii sau se acumulează ca agregate.
Exista mai mulți factori fizici / chimici care ar putea îmbunătăți acumularea de proteine native. În același timp, sa constatat că rezultatul folosirii acestora de cele mai multe ori este unul neregulat și că aproape orice proteina are nevoe de propriul set specific de condiții optime pentru a realiza aranjarea corectă.
Încercarea de a înțelege punctele critice specifice pentru producerea de proteine recombinante nu a stabilit obiectivul de determina protocoale universale utile, dar a contribuit la creșterea ratei de succes în propunerea de noi combinații empirice.
Cu toate acestea, rezultatele publicate în literatura recentă a permite o mai bună înțelegere a unor mecanisme-cheie in controlul producției de proteine în E. coli și ar putea permite elaborarea unor metodologii raționale pentru îmbunătățirea caracteristicile cantitative și calitative ale polipeptidelor produse.
3 .1 Fctorii de îmbunatațire a randamentului de proteine funcționale în E.coli
3.1.1 Exprimarea mai redusa o pliere mai buna
Exprimarea recombinantă poate fi reglată prin controlul numărului plasmidelor din celula. Acest factor depinde de originea secvențe de replicare : in timp ce plasmidele pe bază de pUC se pot acumula în sute de exemplare per celulă, plasmidele bazate pBR322 in zeci de copii ,iar sisteme de pSC101 și p15A doar câteva. De asemenea a fost observat că inducerea in condiții de stres de etanol, alcool benzilic sau sare de aditie, precum si de șoc termic tranzitoriu ar putea îmbunătăți capacitatea de pliere in bacteriile tratate . Toate aceste perturbatii se efectuiaza pentru protejarea structurii macromoleculei și pentru efectul pozitiv observat din punct de vedere al randamentelor finale de proteine recombinate datorita acumularii de insotitori. Această ipoteză a fost experimental dovedită prin care sa demonstrat ca însotitorii ar putea preveni agregarea proteinelor recombinate și ar reprezenta o importanta îmbunătățire biotehnologica. O astfel de abordare este optima dar rămâne încă greoaie din cauza necesitații de a compara mai multe combinații de însotitori.
Ca alternativă, sint tulpini care ar putea îmbunătăți producerea unei singure proteine țintă sau
un grup de proteine structural similare care au fost generate de mutageneza aleatorie. Atât ștergerea și cit excesul de proteine in E. coli a condus la acumularea crescută de proteine recombinante. Mecanismele implicate variază de la metabolism îmbunatațit la optimizarea
mecanismului de control al calității proteinelor.
Tulpinile Walker au fost introduse ca "gazde mutante care permite sinteza unor membrane și unor proteine globulare " pentru mai mult de zece ani motivul acestuisucces (parțial) a ramas necunoscut. A fost surprinzător să se descopere că mutațiile prezente în diferite tulpini
au fost într-adevăr convergente și au implicat un singur mecanism, și anume că au contribuit la eficiența redusă a promotorul lac UV5 care controlează expresia ARN T7 polimeraza . Acesta a fost prima dovada ca reducerea nivelul T7 ARN polimeraza în tulpini pentru exprimarea recombinata poate fi un element cheie spre controlul calității proteinei exprimate și creșterea acumulării sale. Pentru a evalua ipoteza, controlul acumulării polimerazei fost
obținută prin intermediul expresiei acordata inhibitorului său T7 lizozim. Rezultatele au confirmat faptul că, într-o anumită măsura a existat o corelație inversă între polimeraza
disponibila și acumularea de proteine acest rezultat este în acord cu presupunerea că reducerea ratei de expresie ar putea limita povara metabolica a celulelor pentru a mari calitatea de pliere a proteinelor.
Din punct de vedere practic, sinteza a mai puține polipeptide per celulă ar avea ca rezultat o pliere mai corectă a proteinelor, deoarece mecanismul celular ar lucra mai eficient în limitele sale. Această condiție evită acumularea polipeptidelor care au tindința de agregare și care produc un efect toxic. În mod evident, nu toate proteinele au aceleași cerințe. De exemplu, se estimează că doar 85 din toate proteinele din E. coli au strictă GroEL-dependența pentru pliere lor completa , în timp ce 180 sunt puternic dependente de DnaK și o nevoie de minoritate în
ambele chaperones. Prin urmare, producția de proteine recombinate care sunt fie strict dependente de GroEL sau se poate folosi orice tip de însoțitor pentru a ajunge la structura lor maternă va exercita o presiune cu totul diferit de celula gazdă în ceea ce privește concurența pentru limitarea componentelor tehnicii de pliere. Deci, reglementarea strictă a expresiei recombinate constă în limitarea sarcinii metabolice și a toxicitații.
O abordare complementară ar trebui să investigheze ceea ce este necesar pentru orice însoțitori
de proteine ca să se plieze corect în celule de orgine diferită, cele eucariote cu scopul de expresa omologii procarioți în sistemul recombinant.
3.1.2 Perturbare metabolica redusă la minim
Producția de transcrieri care provin de la un singură copie a genei ADN țintă integrate în cromozomi reprezintă o soluție pentru obținerea de randament suficient de
proteine heterologe și reducerea la minimum a sarcinii metabolice pentru celulele gazdă . În aceste condiții , fiziologia celulei nu este perturbată de prezența unui număr mare de copii -instabile de plasmide și prin producerea masivă de antibiotice și enzimele de rezistență. Randamentele de proteine sunt asigurate suficient, permițând transcrierea și traducerea extrem de eficient .Un astfel de rezultat a fost obținut pentru exprimarea XylS / Pm
sistem prin combinarea mai multor elemente de stimulare într-o casetă unică de expresie cuprinzând promotorul ,5' – regiunea ARNm netradusă și regulatorul de codificare secvența XylS. Efectul sinergic de mutatii într-un un singur punctîn secvențele care reglementează transcrierea șipași de traducere permit îmbunătățirea randamentelor finale de proteinede 75 de ori . Atât producția, cât transcriere a crescut ,deci traducerea îmbunătățită a contribuit la acumularea proteinei finale. Interesant ,nivelul optim de stimulare a fost mai ridicate , niveluri de transcripție – proteină specifică nu corespunde în mod automat la randamentele mai mari de proteine funcționale. Aceste rezultate au fost explicate ca efect
de mașini de pliere post-translațională de saturație , o strangulare care a cauzat misfolding proteine si agregare .Astfel de exemplu, subliniază încă o dată modul în care randamentele finale întotdeauna depind de pasul de limitare în lanțul lung de evenimente
care duce de transcrierea plierii corecte a proteinelor.
3.1.3 Limitări stoichiometrice
Întrebarea cu privire la ratele ridicate de expresie poate duce la randamente scăzute își găsește răspunsul în observația că proteinele , în majoritatea cazurilor , depind de factorii moleculari pentru structura lor funcțională . Acești factori pot fi la fel diferiți ca însoțitori, partenerii care interacționează în cazul complecșilor mai mari, sau proteinele membranare implicate
în traficul din celulă . Eficiența de ansamblu este procesul care conduce la producerea unei proteine complet activă și se bazează pe disponibilitatea tuturor partenerilor esențiale . Prin urmare ,este necesar să se identifice elementul molecular critic implicat în procesul de pliere a unei polipeptide specifice. Acest lucru permite concentrarea pe supraproducție fără a provoca cheltuiala energetică. De exemplu , un anumit însoțitor este recomandat numai in cazul proteinelor recombinate și e nevoie de sprijinul lor masiv în mod corect , în caz contrar acesta reprezintă un concurs metabolic pentru proteina recombinantă țintă . În cazul secretarii de
proteine recombinate ,Sec – transloconului apare un blocaj major , deoarece capacitatea sa de purtător poate fi ușor saturată , așa cum este ilustrat prin Schlegel și colab. În consecință ,
intermediarii de proteine se acumuleaza în citoplasmă și precipitatul în agregate .
Când toxicele , acestea afectează creșterea celulelor corectă și divizarea ,duce la formarea de biomasa diminuată. Reducerea activității de translație recombinate poate duce la
restabilirea condițiilor fiziologice și promovează acumulare periplasmică de prelucrat și atunci proteinele heterologe sunt corect pliate. Această realizare reamintește rezultatele obținute cu o bibliotecă de vectori folosiți pentru a produce proteine secretate ale cărei componente
poseda forțe de translatie care acoperă o gamă largă. Acesta a fost obținut prin modificarea aleatorie a traducerii regiunii de inițiere a secvenței de semnal și vectorii rezultați au fost testați în combinație cu un set de proteine heterologe . Rezultatele au arătat că rata de traducere optimă este îngustă.Există o limită superioară peste care picăturile de producție datorită saturarii sistemului și o limită inferioară sub care echipamentul sinteza a proteinelor nu este complet exploatat . În trecut, aceasta a fost , de asemenea, a demonstrat că secretoare
constructe termodinamic favorizate de către cotranslational traseu SRP ar putea facilita producerea de proteine functionale pentru că această opțiune ar evitat acumularea SecB – dependent în citoplasma parțial pliate , intermediari inactive sau toxice ,de asemenea
eliminarea genei responsabile de exprimarea Trigger Factor ( TF ) Chaperone ar limita
toxicitatea celulară și de ar crește acumularea de proteine recombinate SRP – dependente ,deoarece TF se leaga 01:01 polipeptide în curs de dezvoltare din ribozomi ,
sa argumentat că TF concurează cu recunoașterea semnalului de particule de proteine în curs de formare . Prin urmare , în absența TF în acumularea citoplasmatică intermediarii de proteine s-ar reduce drastic .Cu toate acestea , ratele de prea ridicate de expresie ar putea
duce în cele din urmă la afectarea secreției independente de strategia de ștergere și de calea aleasă de export , deoarece SecB și SRP împărtășesc aceeași unitate translocon. Rezumând ,îmbunătățirea producției de proteine recombinate - obligat dependente se bazează pe capacitatea de calibrare a secreției și ratele transloconului. De asemenea, limitele de producție
sunt în funcție de acumularea periplasmică a proteinelor heterologe . Chiar și după succes export
prinSec – transloconului , proteinele vor suferi aglomerarea moleculară în spațiul periplasmic redus și va fi predispus la agregare. Consecința este că randamentele de proteine recombinate periplasmice acumulate rămân scăzute . Teoretic există posibilitatea de pliere( – disulfură independent ) a proteinelor în citoplasma bacterienă , în care instalația de pliere este mult mai eficientă , și apoi de a le exporta în periplasmă prin translocarea Twin – calea argininei. Factorii care reglementează această rută de export a fost investigată recent și poate avea unele aplicații biotehnologice, cum ar fi posibilitatea de a evalua corectm plierea proteinelor fuzionate .
Proteine dependente de disulfură – obligațiuni pot fi obligați să se plieze în citoplasma bacteriilor mutante ( de oxidare tulpini cum ar fi AD494 sau Origami ) în care căile de reducere au fost afectate parțial sau total. Unii cercetători au propus ca secreția de astfel de proteine în
mediu. Cu toate acestea , controlul parametrilor care reglementează acumularea de proteine din mediul respectiv este greoaie și condițiile pot critic schimba ratele producției . În ceea ce privește " tulpini de oxidare " , rezultatele sunt de multe ori înșelătoare în termeni de randament, probabil,
deoarece condițiile non- fiziologice impuse celulelei incetinesc creșterea economică a acestora . Supraproductia de izomeraze poate ajuta la o pliere corectă a proteine . Cu toate acestea , DsbC izomeraza folosit ca o etichetă de fuziune nu este suficientă pentru a obține randamente sigure de
de proteine funcționale țintă, chiar dacă este statistic mai eficient decât alți operatori de transport. Până în prezent , o abordare mai completă și inovatoare pentru producerea de
proteine - disulfură bogat funcționale rămâne modelul propus de grupul Ruddock e care permite oxidare și pliere asistat de co – exprimă atât sulfhidril oxidaza și izomeraza disulfură ( DsbC sau PDI ) în citoplasma bacterii de tip sălbatic. În absenta sulfhidril oxidaza , cele mai multe dintre proteinele de fuziune dependente de disulfură fuzionate a DsbC că acumulate în citoplasma de tip sălbatic ca agregate solubile, în care , probabil, ( pliat ) transportatorul păstrează în soluție ținta agregată a proteinei . În conformitate cu modelul propus inițial de
Nomine și colab , astfel de agregate solubile de fuziune proteinele sunt micelii cu un miez compus din ermetic din proteine tinta agregata și un hidrofil extern t format din operatorii de transport . Natura amfifil al aceste structuri a fost valorificat recent pentru produceream de nanopills cu capacitate de legare bacterienă. Modelul propus, miceliile sunt formate din proteine conjugate în care stratul exterior are capacitatea de a lega în mod specific ținta biologică.Încărcătura , compusă de polipeptide agregate doar parțial active , este apoi eliberată
prin clivaj enzimatic controlat .
3.1.4 Formarea agregatelor de proteine
Formarea agregatului este o constantă de proteină recombinată. Spre deosebire de ipoteze anterioare , proteinele agregate pot conserva un consistent din activitate biologică . Prin urmare, este semnificativ pentru a studia procesul de agregare in vivo și a
intelege modul in care factorii fizico-chimice pot îmbunătăți caracteristicile lor pentru valoare lor
biotehnologică. Au fost propuse două abordări opuse pentru a face față cu agregarea proteinelor recombinante :
încercrea de a limita sau a forța procesul de acumulare a agregatelor utile ( funcționale și non – toxice ). Reversibil dinamic procesul de agregare – dezagregare a fost forțat pentru a îmbunătăți randamentele de proteine recombinate solubile prin stimularea celulei bacteriene pentru a dizolva organismele lor de incluziune in vivo . Ca o alternativă , agregare a fost exploatată ca un
mijloc valoros pentru acumularea proteinei recombinate funcționale în organismele de incluziune și simplificarea purificării ei pentru aplicații biotehnologice . Din această perspectivă , identificarea fondurilor genetice favorabile pentru producerea organismele de incluziune în special dense este justificată de interesul pentru îmbunătățirea prelucrărea proteinei , obținerea
a titrurilor mai mari în fermentare și de purificare simplificată volumelor reduse. Pandey și colab indus producerea proteinelor recombinate cu modelul într -o bibliotecă bacteriană
obținută aleator knock -out a reușit în izolarea de clone care produc organisme de incluziune mai dense prin centrifugare în gradient de densitate Percoll . Din nefericire ,
autorii nu a evaluat daca proteina ambalată în organismele de incluziune dense avut caracteristici structurale și funcționale comparabile cu materialul de control sau le-au pierdut , așa cum sa observat în cazul lipazei . Valoarea biologică a proteinelor prins în includerea
organismelor pot fi legate de structura lor fizică , mai degrabă
decât la caracteristicile lor funcționale . De exemplu , controlul parametrii de fermentare a permis obținerea organismelor de incluziune cu geometrii variabile . Atunci când este utilizat pentru a tratarea suprafețelor , ele facilitează adeziunea eucariotelor.
3.1.5 Concluziile cu privire la obținerea unui randament mare de proteine recombinate
Producție foarte bună proteină recombinantă este adesea strict necesară pentru a acumula suficient material pentru cercetarile de baza.Studiile precum și pentru aplicații biotehnologice și clinice .Un articol de stimulare indică faptul că cercetarea se oprește în cazul în care nu sunt disponibile reactivi . Mai exact , autorii remarcă faptul că proteinele care au o legătură genetică clar cu boli umane , dar pentru care anticorpii fiabile și inhibitori chimici nu sunt accesibili , sunt în mod sistematic mai puțin studiat Cunoștințele acumulate în ultimii
20 ani concepe producere a proteinei recombinate într-un lanț lung de evenimente succesive . Oricare dintre acestea pot fi limitate sau poate deveni limitat după ce un alt obstacol a
fost eliminat . Prin urmare , optimizarea procesului poate fi văzută ca o îndepărtare progresivă de deficiențe . Acum suntem probabil aproape de înțelegerea fiecărui pas implicat în întregul proces . De exemplu, mai multe proteine care-și pot îmbunătăți secreția au fost identificate, mecanismele prin care rata de expresie scăzută poate duce la
randamente mai mari de proteine au fost descrise în detaliu , tulpini bacteriene
și vectori calibrați pentru a lucra la condiții fiziologice
sunt acum disponibile . Eforturile viitoare trebuie dedicate pentu o metodă rațională de identificare rapidă și eficientă . Combinatorial există platforme pentru compararea experimentală
condițiile de producție a proteinei la diferiți factori : tulpini bacteriene , temperaturi de creștere , concentrația osmolit ,fuziune la diferite tag-uri , promotor și transcriereaputerea factor , stabilitate ARNm și traducere eficientă , însoțitor co – expresie , sau o peptidă semnal.
3.2 Producția vaccinurilor de glicoproteina în Escherichia coli
În vaccinuri conjugate capsular sau lipopolizaharide ( LPS ) antigeni de bacterii patogene sunt covalent legat de proteinele de transport. Spre deosebire de cele bacteriene în care polizaharide sunt izolate, vaccinurile conjugate induc T – limfocite imunologice dependente
memorie, deci sunt de lungă durată. Eficacitatea și siguranța vaccinuri conjugate s-a dovedit de mai multe ori . De exemplu imunizarea de rutina a sugarilor cu vaccinurile conjugate împotriva Haemophilus influenzae de tip B a dus la o scădere rapidă și dramatică a boalii respective, după punerea în aplicare . Tehnologii de producție de vaccinuri conjugate sunt complexe , procesele cuprind multe etape ( figura 3.2.1 ) . Acestea implică ( 1 ) cultivarea separată de tulpini bacteriene producătoare antigene polizaharidice și proteina de transport , ( 2 ) separarea purificarea de LPS și proteine de transport , ( 3 ) scindarea chimică a polizaharidelor LPS din lipid urmată de o a doua etapă de purificare , ( 4) cuplaj chimic de polizaharide cu proteina de transport , și ( 5 ) o a treia etapă de purificare pentru obținerea produsului final . La fiecare pas apar pierderi considerabile , și datorită naturii aleatorie a cuplării chimice finala
produsele sunt insuficient definite . Procesele sunt de lungă durată și costisitoare .
Fig.3.2.1
În ultimii ani, ideea că bacteriile nu efectuează glicozilarea proteinelor a fost respinsă . După transferul funcțional a sistemului de glicozilare N-linked de Campylobacter jejuni în Escherichia coli acum este posibil de a produce polizaharid – proteină
conjugate într-o expresie procariote industrială standard,. S-a arătat că polizaharide bacteriene diverse antigen O cu un zahăr N – acetil la reducerea final poate fi transferat de la undecaprenyl – pirofosfat precursori pentru proteine periplasmic AcrA (provenind de jejuni ) în E. coli. Mai mult decât atât , secvența consens necesară pentru glicozilare N – legată de PglB oligozaharid de C. jejuni a fost definită ca D / EXNZS / T ( unde X și Z pot fi orice aminoacid cu excepția prolinei ), ceea ce face posibil sa inginer anumite site-uri de glicozilare în proteine care altfel nu sunt glicozilate. PglB bazate pe sistemul de E. coli a fost sugerată ca o metodă simplă și rentabilă pentru producția in vivo de vaccinuri conjugate . Pentru realizarea producțiilor suficiente de proteine recombinate produse în sisteme de expresie bacteriene
este de obicei necesară pentru a ajunge la celula finală cu densități ridicate în bioprocese . Deși – plasmida gratuit , de tip sălbatic E. coli pot fi cultivate la concentrații foarte mari de biomasă
de la greutate uscată de celule per litru în cultură cu alimentare discontinuă cu săruri minerale mass-media definite, pentru a ajunge la titruri ridicate de recombinare cu proteine pliate corect în tulpini purtătoare de plasmidă rămâne o provocare .
3.2.1 Crearea glicocoproteinelor folosite pentru vaccinul împotriva shigellozei.
Shigelloza este estimat că provoacă 163 episoade de boală și 1 milion de decese pe an în țările sărace , cu copii sub varsta de cinci ani care sunt afectați în mod deosebit . Există o nevoie urgentă pentru crearea vaccinurilor eficiente de combatere a acestei boli. Shigelloza este
cauzată de patru specii majore Shigella , S. dysenteriae , S. flexneri , S. boydii și S. sonnei . Deși S. dysenteriae serotipul 1 nu este printre cele mai frecvente clinice izolate , este de dorit să se includă polizaharida, respectivul antigen în formulări de vaccin multivalente deoarece tulpina este asociată cu o rată ridicată de cazuri fatale , raspandire a pandemiei si rezistenta la antibiotice multiple.
Escherichia coli CLM24 a fost folosită ca tulpină gazdă în toate experimentele. Această tulpină a fost derivat din W3110 de deleția genei care codifică cromozomial pentru O polizaharidă ligază Waal. Ampicilina-selectabil, copiere mediu pMIK44 număr de plasmidă a fost folosit
pentru exprimarea periplasmic a Acra sub controlul L-arabinoză (ara) pBAD promotor inductiv (originea replicare : ColE1 ) . Recombinată Acra și-a exprimat de la
pMIK44 care conține 2 nativ și o inginerie N – glicozilare site-uri și este fuzionat cu o etichetă hexahistidină la capătul C-terminal și a peptidei semnal pelB La
capătul N -terminal ( secreție Sec – dependentă aperiplasmă ) .Ampicilina – selectabil , numărul de copii mediu plasmida pGVXN150 ( furnizate de GlycoVaxyn AG ,manuscris în curs de pregătire ) a fost folosit pentru periplasmic expresie a unei variante toxoid ( L552V , ΔE553 ) din
P. aeruginosa exotoxina A ( EPA) sub controlul PBAD ( origine de replicare : ColE1 ) . EPA recombinat exprimate din pGVXN150 conține două construcții genice situri de glicozilare ( N262 și N398 ) și este fuzionat cu un etichetă hexahistidină la capătul C-terminal și aDSBA
peptidă semnal la capătul N -terminal ( Sec – dependent secreție aperiplasmă ) . Tetraciclină- selectabil , numărul redus de copii plasmidă pGVXN64 a fost utilizat pentru biosinteza
de polizaharide O antigen de S. dysenteriae serotip 1 . pGVXN64 ( origine de replicare : IncPa ) a fost construit prin inserarea unui fragment BamHI 11 kb de pSDM7 [ 18 ] care conținedysenteriae RFP și RFB S. clustere de gene în poziția Bam pLAFR1. Clusterele rfp și gena codifica RFB glycosyltransferases și polimerazele necesare pentru sinteza undecaprenyl –
pirofosfat – legate de polizaharide Shigella O1și au fost exprimate la nativă lor promotori ( constitutivi ) în pGVXN64 . Spectinomicină – selectabil , numărul de copii redus plasmida
pGVXN114 a fost utilizat pentru exprimarea oligozaharid PglB de jejuni sub controlul
promotor Ptac hibrid, care poate fi indusă de izopropil – b – D – tiogalactopiranozidă ( origine a replicării :IncW ) . Recombinant PglB exprimate de pGVXN114 conține o hemaglutinina ( HA ) tag oligopeptidă capăt pentru a facilita detectarea acesteia asupra
Western blot . Represor Lacl fost constitutiv exprimate din aceeași plasmidă . pGVXN114 a fost construit prin inserarea unui fragment de 2,2 kb EcoRI – BamHI de pMAF10 în pEXT21 digerat cu EcoRI și BamHI . Plasmida spectinomicină – rezistent pGVXN115 a fost utilizat pentru expresia indusă a IPTG inactiv PglBmut ( substituții de aminoacizi W458A și
D459A ) . pGVXN115 a fost construit prin inserarea unui 2.2 kb fragment EcoRI – BamHI de pWA1 [ 9 ] în pEXT21 digerat cu EcoRI și BamHI .
Pentru biosinteza de glycoconjugates în flacoanele agitate , E. coli recombinant care conțin plasmide de expresie de proteine de transport , polizaharide Shigella O1 și PglB
au fost cultivate în mediu LB ( L – 1 pe bază de cazeină tripton , L – 1 extract de drojdie , L – 1 NaCl ) suplimentat cu 100 mg L – 1ampicillin , 10 mg L – 1 și tetraciclină 80 mg L – 1 spectinomicinei la 37 ° C și la o agitație de 160 rpm . Culturile balon Shake -au preparat cu o scăzută raportul suprafață la volum ( 70 ml mediu în 100 mlm Baloane Erlenmeyer ) și au fost inoculate la un neindusă LB cultură peste noapte la o OD600 0,05 la 0.1.
Exprimarea PglB și proteine de transport ( ARCA , EPA ) a fost induse la o OD600 de 0.4-0.5 prin adăugarea de izopropil- BD- tiogalactopiranozidă ( IPTG ) și L – – arabinoza , respectiv . IPTG a fost adăugat ca Soluție 1000 x concentrat ( 1 ml – L 1 din ) și
L – arabinoza ca 200 x soluție concentrată ( 5 ml L- L – 1 ) . Patru ore după prima inducerea , un al doilea s-au adăugat puls de L – – arabinoza . probele pentru
Analiza Western blot au fost retrase de 4 ore după prima inducție și după incubare peste noapte ( incubare totală timp de 20-24 h , timp total de inducție 19-22 h) .Efectul concentrațiilor reduse inductor a fost analizată în culturile balon agită paralele, în careconcentrația adăugată
IPTG a fost 1,000 pM , 50 pM , 20 pM și 5 pM ,respectiv . A adăugat sumele L – arabinoza care au fost nu sa schimbat . Pentru testarea efectului de cultivare redusă temperatură , se agită culturi balon au fost crescute la 30 ° C pentru a OD600 de .4-.5 și apoi induse cu oricare sau 50uM IPTG . După inducție ,incubarea temperatura a fost redus la 23 ° C. adaugă
cantități de L – arabinoză au fost aceleași ca în experimentele efectuate la 37 ° C.
Inoculare pentru bioreactoare a fost produs prin cultivarea tulpinilor recombinate de E. coli peste noapte la 37 ° C și 150 rpm în mediu LB cu antibiotice folosind 500 ml Baloane baffled ( 200 ml volum de lichid ) . Un OD600 finală 2.5- fost atins în aceste culturi .
Pentru testele de creștere în mediu fără suplimente complexe un mediu de săruri minerale limitate de carbon definit a fost utilizat cu L – 1 glucoză ca sursă de carbon unic
și energie. Trei baloane de agitare replică (total volum de 300 ml , volumul de lichid 50 ml) au fost inoculate la o OD600 de 0,025 cu celule neinduse din peste noapte
Culturi LB care au fost spălate de două ori cu mediu mineral încălzit în prealabil . Culturile au fost incubate balon la 37 ° C și 150 rpm și ratele de creștere specifice
au fost calculate din valorile OD600 între 0,1 și 0,8 măsurată după o perioadă de pre – incubare de 3 ore . În acest curbele de creștere logaritmică Gama de OD au fost liniare.
3.2.2 Experimente în bioreactor
Pentru o scară mai largă de cultivare a E. coli recombinate , fie Bioreactoare MCS11 ( MBR , Wetzikon , Elveția ) cu un volum total de și sau un bioreactor KLF
( Bioinginerie , Wald , Elveția) cu un volum total de au fost folosite . Temperatura a fost controlată întotdeauna la 37 ( ± 0,1 ) ° C. Culturi lot au fost efectuate in situ cu autoclavizat
Mediu LB suplimentat cu 100 pg ml – 1 ampicilină , 10 pg ml – 1 tetraciclină , 80 pg ml – 1spectinomycin și 0,2 ml L – 1 polipropilen glicol ( PPG , antispumant agent ) . Volumul de lichid a fost de ,viteza de agitare a fost setată la 1000 rpm șibioreactor a fost aerat cu un
debit de aer de 1,4 P P – 1 min – 1 ( rezultând pO2 ≥ 60 % ) . bioreactor culturile discontinue au fost inoculate cu neindusă peste noapte LB agită culturi balon la o OD600 de 0,05 .
Exprimarea proteinelor recombinante a fost indusă la un OD600 de 0,5 prin adăugarea a IPTG și L – 1 Larabinose . Pentru cultivarea chemostat cu mediu LB o acidulată
soluție de alimentare care a fost utilizat a fost compus din L – 1 extract de drojdie , L – 1 triptonă , l – 1 clorură de sodiu , L – 1m KH2PO4 și 0,1 ml L – 1 H2SO4 concentrat . pentru testarea efectului de surse alternative de dioxid de carbon și de energie ,
o , alimentare de mediu semi – definit acidulată a fost utilizat cu următoarea compoziție : L – 1 glicerol sau glucoză , L – 1 extract de drojdie , L – 1 triptonă , L – 1 KH2PO4 ,
L – 1 NH4CI , L – 1 MgSO4 · 7H2O , L – 1 acid citric , 0,1 ml L – 1 HCI 37 % , 1 ml L – 1 PPG antispumant și 10 ml L – 1 de 100 × soluție oligoelement . 100 × oligoelement
soluție a fost compus din ( adăugat în această ordine ) : 8 ml L – 1 HCI 37 % , L – 1 CaCO3 , L – 1 FeCl3 6 H2O , L – 1 MnCI2 4 H2O , L – 1 CuSO4 5 H2O , L – 1
CoCl2 6 H2O , L – 1 ZnSO4 · 7H2O , 0,30 10- L – 1 H3BO3 , L – 1 NaMoO4 2 H2O , și L – 1 Na4EDTA 2 H2O ( echimolare de cationii ) . Concentrația săruri de minerale a fost ales astfel încâtcarbonand sursa de energie a fost de nutrienti – creștere de limitare . Calculele respective au fost bazate pe randamentele de creștere pentru
fiecare element și concentrația maximă de biomasă susținută de L – 1 așa cum este descris de către glucoză Egli. Antibioticele au fost adăugate în concentrații similare ca și în
mediu pentru cultivare lot . Pentru a evita orice căldură indusă reacția componentelor LB cu săruri de fosfat sau ioni metalici , media furaje chemostat au fost sterilizate prin filtrare
( Sartobran 300 unitate secvențială cu 0,4 microni și 0,2 dimensiuni um porilor , Sartorius Stedim Biotech SA , Aubagne , Franța) . În funcție de gradul de spumare în bioreactor , sterilizează termic PPG antispumant a fost adăugat în concentrații de 0,1 la 1 ml L – 1 larezervorul de alimentare . Experimentele chemostat pH a fost controlat la 7,0 ± 0,05 prin adăugare automată de KOH . Volumul de lichida fost menținută constantă la de măsurare automată greutate reactorului șirata de diluție a fost setat la 0,1 h – 1. Culturile au fost ținute oxic ( pO2 ≥ 20 % ) prin utilizarea Rata de aerare de 1 Lair L – 1 min – 1 și o viteză de agitare de 1300 rpm . Culturi chemostat au fost inoculate cu o OD600 de 0,05 cu neindusă peste noapte LB agită balon culturi. Celulele au fost crescute în modul de lot timp de 2-3 ore la o
OD600 de 0,6 , în acest moment punct pompa pentru alimentarea mediu a fost pornit . Culturile au fost induse chemostatm după 20 h ( ≈ 2 modificări de volum ), prin trecerea la un feed mediu conținând L – – arabinoză în plus față alte componente . După 4 ore de inducție arabinoză
mediu de hrană a fost trecut înapoi la compoziția inițială , și IPTG a fost adăugat direct în reactor( inducție secvențială , separată de proteine de transport și oligozaharid ) .
Pentru cultivare fed – batch cu hrană liniar ( strategia A )Mediul de pornire ( V = ) a conținut L – 1 glicerol L – 1 extract de drojdie , L – 1 tripton , L – 1
KH2PO4 , L – 1 ( NH4 ) 2SO4 , L – 1 MgSO4 · 7H2O și 10 ml – L 1 de 100 x soluție de microelemente ( a se vedea mai sus ) . Antibioticele au fost adăugate în concentrații similare ca și în mass-media de lot și de cultivare chemostat . anterior inoculare pH a fost ajustat la pH 7 cu KOH . La o OD600 de 24 , un flux liniar de 50 ml L – 1 h- fost
a început cu A1 soluție furaje care conțin L – 1 glicerol , L – 1 triptonă , L – 1 MgSO4 · 7H2O și 10 ml L – 1 100 × soluție oligoelement . După 1 oră , când OD600 a ajuns la 35 ,viteza de alimentare a fost crescut la 65 ml L – 1 h-1 . După alte 2 h, atunci când OD600 au atins 47 , celulele au fost induse prin adăugarea de L – – arabinoză
și IPTG direct în reactor , în același timplinear a fost trecut la hrănească soluție A2
conținând L – – arabinoză și 80 uM IPTG în plus față de componentele de alimentare soluție A1 . viteza de avans a fost redus la 30 ml L – 1 h-1 Cinci ore mai târziu .
Volumele totale adăugate de soluții de alimentare A1 și A2 au fost 180 ml L – 1 și 975 ml – – 1 , respectiv . Pentru cultivare fed – batch cu doi nutrienți și inductor impulsuri ( strategie B ) mediul de pornire ( V = ) conținea L – 1 glicerol , L – 1 extract de drojdie , L –
1 tripton , L – 1 KH2PO4 , L – 1 ( NH4 ) 2SO4 , L – 1 MgSO4 · 7H2O și concentrații de oligoelemente și antibiotice similare de a începe mediu de strategie A.
La o OD600 de 15 următoare nutrienți și inductor a fost adaugat in puls : 170 ml L – 1 de soluție B1 furajelor care conțin L – 1 glicerol , L – 1 triptonă , IPTG ,
L – – arabinoză și L – 1 MgSO4 · 7H2O . după o cultivarea în continuare a de-al doilea de nutrienți și inductor s-a adăugat puls : 170 ml L – furajelor soluție conținând B2
L – 1 glicerol , L – 1 tripton și L – – arabinoza . Pentru cultivare fed – batch, cu două impulsuri și liniar hrăni ( strategie C )mediul de pornire ( V = ) a fost similar cu strategia A. La o OD600 de 15 , un prim nutrient S-a adăugat puls fără inductori : 130 ml L – furajelor soluție C1 conținând L – 1 glicerol , L – 1 drojdie extrage și L – 1 tripton , 125 mg L – 1 ampicilină , 12,5 mg L – 1 tetraciclină , 100 mg L – 1 spectinomicină . la
o OD600 de 30 , un al doilea nutrient și inductor de puls s-au adăugat : 100 ml L – furajelor soluție conținând C2 L – 1 glicerol , L – 1 triptonă , L – 1 MgSO4 · 7H2O , L – – arabinoză și IPTG . În același timp, un flux linear a fost început cu o rată de
19 ml L – h 1 cu ajutorul alimentării soluție C3 care conținea L – 1 h – 1 tripton , L – 1 h – – arabinoză , 33 ml L – 1 100 × oligoelemente , L – 1 MgSO4 · 7H2O ,
IPTG , 67 mg L – 1 ampicilină , 6,7 mg L – 1 și tetraciclină 54 mg L – 1 spectinomicină . Volumul total al adăugat furaje soluție C3 fost 280-300 ml L – 1 . toate pornire
soluții de mass-media , puls și furaje pentru cultivare fed – batch au fost sterilizate prin filtrare . Steril PPG a fost adăugat direct în reactorul ( 1 ml L-1 ) pentru a combate spumarea .
În timpul fazei de inducție suplimentar PPG a fost adăugată în cazul în care necesare ( max. 1 ml L-1 ) . Culturile cu alimentare discontinuă au fost inoculat cu culturi neinduse LB balon se agită peste noapte la o OD600 de 0,1 . PH-ul a fost menținut la 7,0 ( ± 0,1 )
prin adăugare automată de KOH și 20 % v / v acid fosforic. Viteza de agitare a fost setată la 1200 rpm și rata de aerare a fost 0,5-1,0 Lair L – 1 min – 1 la începutul
culturilor . La un OD600 peste 10pătrunderii aer a fost îmbogățit progresiv cu pur O2 ( manual
ajustări ), în scopul de a menține saturația de oxigen între 10 și 100 % . Densitatea optică a fost urmată parcursul proceselor ( probele au fost diluate corespunzător
cu deionizată H2O ) și uscată de celule ( CDW ) a fost urmată pornind de la o OD600 de aproximativ cinci . Probele pentru analiza Western blot ( din totalul proteinelor celulare , a se vedea de mai jos ) s-au extras din reactor înainte de inducție
și la intervale regulate după inducerea direct în pahare răcite cu gheață .
3.2.3 Metodele de analiză
Extracte de proteine periplasmic au fost preparate prin lizozim tratament. Pe scurt , peletele de celule s-au resuspendat la o OD600 de 20 în tampon de liză compus din Tris HCI pH 8,0 , EDTA , 20 % greutate / volum zaharoză , 1 mg ml – 1 lizozim și protează Complete
amestec inhibitor ( Roche , Basel , Elveția ) și incubate 1 h la 4 ° C. După centrifugare la 5000 x g și 4 ° C timp de 15 min , probele au fost retrase din supernatant și suplimentat cu volume similare de 2 × SDS tampon de probă PAGE . Pentru măsurători de densitate optică
( 600 nm , cale lumina ) valori goale de cuve cu apă sau mediu au fost scăzute și probe
peste o OD600 de 0,6 s-au diluat corespunzător cu H2O deionizată . Rate specifice de creștere au fost calculate prin mai mici pătrate regresie liniară din părți liniare ale logaritmică OD600 curbele de creștere . Din totalul proteinelor celulare ( TCP ) probele au fost preparate prin resuspendarea pelete celulare obținut 0.1-2 mL volum cultură în SDS-PAGE
proba tampon la o OD600 de 10 . Celulele au fost solubilizate prin încălzirea la ≥ 95 ° C timp de 5 minute . Glyoconjugates în extractele celulare de E. coli recombinant au fost analizate prin
SDS – PAGE și analiza Western blot folosind ulterioară membrane de nitroceluloză Hybond ECL ( GE Healthcare , Waukesha , SUA) conform procedurilor standard . Geluri SDS – poliacrilamidă ( 10 %) au fost utilizate pentru blotting întotdeauna încărcate cu 10 pl de TCP sau 20 pl periplasmic extract per bine , de exemplu , volume similare de extracte de celule
provenind de la cantități similare de biomasă au fost utilizate , care să permită o comparație semi- cantitativ între probele pe același blot . Pentru detectarea de Acra și AcrAShigella
Glycoconjugates O1 , iepure anticorpi anti – Acra au fost utilizate ( descrise în [ 8 ] ) . EPA și EPA – Shigella O1 au fost detectate cu un iepure comercial anti – EPA antiser ( Sigma , Buchs , Elveția ) . pentru glicoproteine specifice detectarea de anticorpi purificați prin afinitate
crescut în iepure împotriva glycoconjugates Acra – Shigella O1 S-au folosit ( GlycoVaxyn AG , Schlieren , Elveția ) . Capră peroxidază de hrean ( HRP ) – cuplat anticorpi secundari anti – iepure ( Biorad , Reinach , Elveția ) și substratul HRP SuperSignal ™ West Dura
( Thermo Fisher Scientific , Rockford , USA ) au fost utilizate pentru detectare chemiluminescență cu o imagistica ChemiDoc –It sistem ( UVP , Upland , Statele Unite ale Americii ) . Digera Proteinase K S-au efectuat probe de proteine denaturate SDS – PAGE
după cum urmează : 50 pl probe de proteine au fost suplimentate cu 1 pl de soluție de proteinaza K ( 10 mg / ml ) și se incubează timp de 1 h la 60 ° C , urmată de incubare timp de 5 minute la 95 ° C pentru a inactivaproteaza În celulele uscate a fost determinat prin centrifugare 2 ml
probe de cultură ( 9000 x g , 1 min ) , și resuspendare spălarea granulelor de două ori în soluție salină tamponată cu fosfat și uscarea peletele de celule timp de 48 ore la 105 ° C.
3.2.4 Rezultatele obținute în crearea vaccinului anti- shigellozic
Glicozilarea Acra și EPA cu Shigella dysenteriae de tip 1 polizaharide O- specifice
în studiile anterioare sa arătat că glicoproteina Acra , o componentă periplasmic a unui eflux multidrog pompă în C. jejuni , a fost N – glicozilate cu E. coli O7 , E. coli 9a , E. coli O16 , O11 și P. aeruginosa C. Jejuni oligo-și polizaharide din E. coli recombinant când oligozaharid funcțional PglB a fost co-exprimat. Aici ne arată că Acra ( 40 kDa ) a fost glicozilate cu S. tip dysenteriae 1 polizaharide ( Shigella O1 ) în E. coli CLM24 care conțin plasmide
pMIK44 ( periplasmic expresie Acra ) , pGVXN114 ( PglB expresie ) și pGVXN64 ( grup de gene de Shigella O1 sinteză ) ( Anexa 1 , banda 1 ) . glicozilarea Acra cu Shigella O1 a fost abolită , atunci când pGVXN114 a fost înlocuit de pGVXN115 , o plasmidă care codifică
inactiv PglBmut variantă oligozaharid (Anexa 1, banda 2 ) . Anticorpi împotriva antigenelor O1 Shigella reacționat cu glicozilată Acra în timp ce nici o glicoproteina
a fost detectat în extractul periplasmic aPglBmut tulpina (Anexa 1, benzi 3 și 4 ) . Benzile slabe din jurul 40 kDa vizibil în culoarul 4 se poate datora contaminării cu antigene O UDP – legate .
Exprimat Periplasmically anatoxina EPA ( 69 kDa ) care conține două inginerie situri de glicozilare pe proteine suprafață ( pGVXN150 ) a fost , de asemenea, glicozilate cu
Shigella O1 în E. coli CLM24 co- exprimă PglB și Genele sinteză Shigella polizaharidice (Anexa 1,culoarul 5 ) . Din nou , nu au fost detectate benzi glicozilate în extract periplasmic de celule care exprimă PglBmut (Anexa 1, banda 6 ) . Glicozilată EPA a fost detectat de către
anticorpi anti – Shigella O1 în timp ce nu benzi de glicoproteine au fost detectate atunci cand celulele au exprimat PglBmut (Anexa 1,benzi 7 și 8 ) . Nici Acra nici EPA prezenți în formă solubilă în periplasma a fost complet glicozilată în recombinant E. coli
(Anexa 1, benzi 1 și 5 ) . Similar cu alte O- polizaharid – conjugați proteine produse în E. coli , o scară de benzi glicoproteine apărut în Western blot (Anexa 1, benzi 1 , 3 , 5 și 7 ) . Aceasta indică o polizaharide cu diferite lungimi de lanț generate de enzimele Wzy și WZZ . Wzy este responsabil pentru polimerizarea subunităților polizaharidice repetitive și WZZ controlează numărul de polimerizare pași în sinteza O- antigen. În cazul AcrAShigella
O1 ( Acra – O1 ) , un al doilea scară de benzi între 100 și 130 kDa a putut fi detectată cu anti –
Anticorpi Shigella O1 , ceea ce indică formarea de diglycosylated Acra – O1 (Anexa 1, banda 3) . O a doua scară a fost absent în EPA – Shigella O1 ( EPA – O1 ) , deși
au fost introduse două situri de N-glicozilare . Cu toate acestea , fie site-ul a fost glicozilate în variante APE în cazul în care numai unul dintre cele două locuri a fost prezent. Acest lucru sugerează producția ineficientă de diglycosylated forme de EPA – O1 . Semnalele general ca la un molecular greutate sub 70 kDa detectat cu anti – EPA și anti – Anticorpi Shigella O1 (Anexa 1, benzi 5 și 7 ), cel mai probabil reprezintă proteolitic degradate EPA – O1 ca
prezentat de o proteinază K test digestie . Creștere de tulpini producătoare glycoconjugate din mediu mineral .
Săruri minerale mass-media sunt de preferat pentru stabilirea cu precizie
bioprocese controlate . Prin urmare , acesta a fost testat dacă produc glicoconjugat tulpinilor de E. coli poate fi cultivate în mediu mineral definită cu glucoză ca numai carbon și energie . Prototrophic , plasmida – tulpină gazdă gratuit E. coli CLM24 ( W3110 ΔwaaL ) a crescut cu o rată de creștere specifică de 0,55 ± 0,02 h – 1 la 37 ° C în mediu mineral glucoză . Cu toate acestea ,specificul rata de creștere atât a E. coli CLM24 ( pMIK44 , pGVXN64 ,
pGVXN114 ) și CLM24 ( pGVXN150 , pGVXN64 , pGVNX114 ) în mediu mineral glucoză fără inductori a fost semnificativ redus la 0,30 ± 0,01 h – 1 și 0,34 ± 0,02 h – 1 , respectiv , care este de 3 – 4 ori mai mici decât ratele de creștere specifice ale acestor tulpini în LB
mediu complex înainte de inducție.Insuficiență creștere nu poate fi explicată numai prin
prezența a trei antibiotice , deoarece rata specifică de creștere de CLM24 ( pMIK44 , pGVXN64 , pGVXN114 ) în antibiotic – mediu mineral gratuit a fost , de asemenea, redus în mod semnificativ ( 0,40 ± 0,01 h – 1 ) comparativ cu CLM24 . Mai probabil
rata de creștere redusă a fost determinată de un blocaj în precursor aprovizionarea pentru sinteza ADN-ului plasmidic. pentru a depăși creșterea afectată , am adăugat complexul extract de drojdie suplimente și triptonă la formulări mijlocii pentru lot ulterior , chemostat și fedbatch experimente.Formarea Glycoconjugate în LB cultura lot și efect de inducție asupra creșterii
Anterior , glicoconjugate în E. coli recombinant au fost produsă în culturi balon shake . Pentru o mai mare eficiență a fost necesară cultivarea de producție în bioreactoare . Ca
Primul pas , glicoconjugate au fost produse într- o scară
cultură lot într-un bioreactor complet aerat folosind LB mediu . Formarea Acra – O1 a fost observată la 5 ore după inducție simultană a expresiei genice pentru transportatorul
proteine și PglB ( Anexa 2 ) . Nici Acra , nici Acra – O1 au fost prezente în cantități detectabile înainte
inducție (Anexa 2 , banda a) . În timp ce Acra a apărut în mai puțin de 1 oră după inducție , glicozilată Acra era nu detectate inainte de 4 ore de inducție (Anexa 2, benzi
b f ) . Inducerea sintezei glicoconjugat determinat o puternică inhibarea creșterii la locul de producție (Anexa 2) . Imediat după inducție , rata de creștere specifică
a scazut cu un factor de 10. Un efect similar a fost observată în baloane de agitare LB, în timp ce creșterea în baloane de agitare neinduse încetinit treptat în jos între OD600 de 0,5 o 1,5 ( datele nu sunt prezentate ) , care este tipică pentru E. coli creștere în mediu LB. Pentru a
analiza care dintre cele două proteine recombinate a fost responsabil pentru inhibarea creșterii , LB agită culturi balon au fost induse fie cu L – – arabinoză ( Acra
expresie ) sau IPTG ( expresie pglB ) la o OD600 de 0,5 . În timp ce rata specifică de creștere după inducție cu L – arabinoză a fost similară cu cea a neindusă
culturi , inducție cu IPTG doar duce la un mod similar inhibarea creșterii de puternic ca atunci când ambii inductori au fost adaugat. Ratele specifice de creștere ale EPA – O1
producerea tulpina înainte și după inducerea în LB lot cultură au fost similare cutulpina producătoare Acra – O1. Rata inițială de creștere specifică a plasmidfree
E. coli CLM24 în cultură lot LB ( 1,3 ± 0,04 h – 1 , n = 3 ) a fost doar ușor mai mare decât cea a neindusă tulpini care poartă plasmidele de producție glicoconjugat. Am constatat că randamentul glicoconjugat în LB agită balon culturi a fost mai mare atunci când perioada de inducție a fost de
extins la 20 de ore și atunci când baloane non- nedumeriți și un mic raport suprafață la volum au fost utilizate (70 ml în 100 ml baloane ) . Prin urmare , astfel de culturi au fost folosite ca punct de referință pentru formarea glicoconjugat în culturile cu alimentare discontinuă .
3.2.5 Efectul concentrațiilor IPTG reduse și cultivare redusă
temperatură
Având în vedere efectul inhibitor al creșterii induse IPTG expresie a pglB , sa testat dacă utilizarea concentrații reduse IPTG și / sau cultivare redusă
temperatura creșterandamentul de glicoconjugate în E. coli . Concentrații mici IPTG și creștere redusă de temperatură s-au dovedit a crește randamentul de
proteine de membrana pliate corect exprimate de Plac / PTAC plasmide, controlate. Cu toate acestea , nici dintre cele două schimbări crescut randamentele glicoproteina . O reducere progresivă a IPTG la la 5 pM afectat marginalnivelul Acra – O1 și EPA – O1 . Utilizarea unei temperaturi mai mici de cultivare înainte de inducție ( 30 ° C ) și trece la temperatura camerei ( 23 ° C ), la inductie a fost , de asemenea, nu benefic . Nivelul Acra – O1 a fost redus în mod semnificativ , în timp ce cantitatea de sintetizat EPA – O1 nu părea să fie afectate . Interesant , benzile au fost glicoproteine mutat în medie, la mase moleculare mai mari la
temperatură redusă de cultivare. Datorat absenței efectelor pozitive puternice de redus
Concentrațiile inductor sau temperaturi mai scăzute , o IPTG concentrație de și o temperatură de cultivare 37 ° C s-au folosit pentru experimente ulterioare .
3.2.6 Efectul de surse de emisii de carbon și de energie cu privire la eficiența
glicozilare
Experimentele chemostat au fost efectuate în scopul de a evalua oportunitatea de energie – carbon și suplimentare ,surse pentru producția glicoconjugat accentuate producției de biomasă . Cultivare chemostat permite de a schimba un singur factor ( compoziție medie ), păstrând în același timp toate altă cultură parametrilor la fel . Egali rata de diluare
Rata de creștere specifică și concentrația biomasei starea de echilibru este determinată de concentrația delimitarea nutrient (ți ) în hrană . Pentru a evita acumularea de
excesul de nutrienti si spalare de celule în timpul de inducție , o rată de diluție de 0,1 h – fost aleasă , care este mai mică decât rata de creștere specific observat în timpul fază de inducere în culturile discontinue LB.O strategie inducție secvențială cu 4 h L – arabinoză
spălați – in ( L – 1 h-1 ) , urmat de un puls IPTG ( ) a fost utilizat pentru a reduce stresul cauzat de producerea de proteine recombinante . Chemostate au fost induse după două modificări de volum .Pentru a păstra timpul de cultivare înainte de inducerea ca
mai scurt posibil ca o măsură de precauție împotriva modificari genetice ( de exemplu , pierderea plasmidă ) . Deși acest lucru este ceva mai mică decât de obicei recomandate 3-5 schimbările de volum , valorile OD600 constante în timpul perioadei de inducție indicat
care culturile au ajuns la o stare de echilibru(Anenexa 3 , A). În cultură chemostat cu mediu LB
( L- 1 de nutrienți organici ), o stare de echilibru OD600 de fost atinsă. Densitățile optice la starea de echilibru au crescut cu un factor de trei până la patru în glucoză – LB și glicerol – LB chemostate (Anenexa 3 ,A), în pofida că sunt mai mici cantități totale de nutrienți organici în mediu ( L – 1 ) . Acra a fost produs după început de un co- de alimentare L – arabinoza în culturile chemostat cu toate cele trei medii (Anenexa 3 ,B , benzi puternice , mai mici ) . Acest lucru indică faptul că celulele au fost cultivate în carbonand condiții limitate de energie , deoarece promotorul pBAD , care controlează expresia Acra din plasmida pMIK44 , este foarte sensibil la catabolite represiune. În ciuda expresie puternică a Acra , nu formarea de
Glycoconjugates Acra – O1 poate fi detectat în 6 ore de inducție pglB în mediu LB , ambele cu secvențială și adăugarea simultană a L – arabinoză și IPTG (Anenexa 3 ,B). Glicozilarea ineficientă nu sa datorat producție redusă sau absentă a PglB . benzi puternice au fost detectate cudimensiunea PglB cu anticorpi anti – HA închemostat LB după inducție. Intensitatea acestor benzi este comparabil cu cea obținută cu creștere rapidă LB culturi lot care au avut a fost indusă cu IPTG fie singur sau cu IPTG și arabinoza la o OD600 de 0,5 glicoconjugat semnificativ(Anenexa 3 ,C). Sinteza a fost detectabilă atunci când fie glucoza sau glicerol au fost adăugate la mediu LB ca principal carbon și energie în culturile chemostat. Pe scurt , cu utilizarea fie de glucoză sau glicerol ca principal carbon și energie sursă în semidefined mass-media a fost posibil pentru a ajunge la 5-10 ori mai mare ,concentrațiile de biomasă și în același timp păstrând o randament rezonabil de glicozilare.
3.2.7 Producția de glycoproteine în cultura fed – batch
Pe baza rezultatelor din lot și chemostat experimente , un mediu semi- definit cu glicerol , extract de drojdie și triptonă a fost ales pentru cultura fed – batch . Am folosit glycerol în loc de glucoză ca principală carbon – și energie sursă , pentru a evita interferențele cu glucoza sensibil
Promotor pBAD . Spre deosebire de glucoza , nivelurile de cAMP sunt acumulare mare și acetat este scăzută , chiar dacă exces cantități de glicerol sunt prezente în E. coli culturi. Două strategii alimentare discontinuă au fost evaluate în primul rând : liniar de alimentare de nutrienți ( strategia A ) și două de nutrienți consecutive și impulsuri inductor ( strategie B) . Cu ambele strategii , 30 de ori mai mari densități finale optice ( 600 nm ) , comparativ pentru a se agită LB au fost atinse culturi balon pentru AcrAO1 tulpina producătoare. Cu toate acestea ,
O strategie cu inducție , la o OD600 de 47 nu a reușit să aibă randament cu cantități suficiente de proteine glicozilate . În contrast , Strategia B cu inducție , la o OD600 de dat Acra – O1 în cantități comparabile ca și în LB se agită balon. Un posibil factor care a influențat glicozilare a fost rata specifică de creștere la inducție , care a fost de 2 ori mai mică cu strategia O comparație
de strategie B. Strategia C cu inducție , la o densitate celulară intermediar ( OD600 = 30 ) și adăugarea două impulsuri nutritive urmate de un flux liniar de L – arabinoză
și triptonă duce la cele mai înalte niveluri de glicozilare în cultură cu alimentare discontinuă. Spre deosebire de o strategie , antibioticele au fost incluse înlinear strategiei C, care ar putea fi îmbunătățit retenția plasmidă , și Glycoconjugate astfel formarea . Strategia de alimentare discontinuă C a fost apoi testat pentru producerea de a doua Glycoconjugate EPA – O1 . două independent ruleaza alimentare discontinuă a dat niveluri similare de glicoproteina ca
găsite în LB culturi balon shake după o cultivare totală timp de 25 h. În final OD600 a fost
crescut de la 2 în sticlă, sub agitare la 80 în cultură cu alimentare discontinuă , astfel productivitatea volumetrică a fost a crescut cu un factor de 40 . Formarea glicoproteina EPA – O1 în cultură cu alimentare discontinuă a fost văzut cu o mai pronunțată retard în comparație cu culturile producătoare Acra – O1. Această diferență nu a fost datorită expresiei reduse sau întârziată deproteina de transport. Similar cu culturi lot , inducția de transport proteine și sinteza PglB în culturile alimentare discontinuă conduce la o reducere imediată a creșterii ratei specifice.
Benzile sub dimensiunea de EPA care au fost detectate din totalul probelor de proteine de celule din culturi induse de cele mai multe probabil reprezintă trunchiate , glicozilate și / sau ne-glicozilată EPA . Benzile dispărut complet dupătratament cu proteinază K. Acra – O1 a fost purificat de culturi balon shake cu un randament de 0,6 mg L – 1 prin utilizarea șoc osmotic extracția urmată de Ni – NTA afinitate și fluoroapatite cromatografie . Pe baza randamentelor glycoconjugate comparabile per celulă , dar o 30 – creștere 40 ori a densității celulare finale cu procedura descrisă cu alimentare discontinuă , 18 la 24 mg L – Bioconjugate purificat împotriva Shigella dysenteriae tip 1 pot fi produse cucurentul E. coli in vivo sistem ( productivitate bazat pe proces totală Timp : 0.75-1.0 mg L – 1 h – 1 ) [13].
3.2.8 Concluzii cu privire la obținerea vaccinurilor de glicoproteine
Acest studiu devedește cum vaccinurile conjugate pot fi produse în E. coli transgenice într -un mod simplu și eficient prin tehnologii moderne de cuplare chimică. Potențialul procesului in vivo
este subliniat de cuplarea cu succes de antigen O polizaharid a patogenului intestinal
Shigella dysenteriae în două proteine de transport diferite folosind condiții adecvate de creștere și de inducție , în cultură cu alimentare discontinuă a fost posibilă creșterea productivității
pentru sinteza in vivo de vaccinuri conjugate cu un factor de 40 , comparativ cu agitarea culturei în balon , facilitând o producție mare din punct de vedere economic .
3.3 Efectele secundare ale însoțitorilor de gene co- exprimate în
producerea proteinelor recombinate
Disponibilitatea insuficientă a însoțitorilor moleculari se observă ca o problemă majoră pentru o pliere buna de proteine în producerea de proteine recombinate . Prin urmare , co – producția de seturi selectate de însoțitori de celule împreună cu polipeptide străine este o abordare comună pentru a crește producția de împăturite în mod corespunzător a proteinelor recombinate în “fabricile bacteriene”. Cu toate acestea , sumele dezechilibrate de modulatoare pliante manipulatoare reticente s-ar putea să declanșeze activități proteolitice nedorite , dăunătoare în ceea ce privește stabilitatea calității și randamentului proteinelor recombinate . Acest minireview rezumă cele mai recente observații de efecte secundare negative , legate de însotitor , cea mai mare parte concentrându-se pe DnaK și GroEL seturi , atunci când se utilizează aceste proteine ca agenți de asistent pliant . Aceste evenimente sunt discutate
în contextul complexității rețelei calității de celule șicomplexitate în consecință a răspunsurilor fiziologice declanșate de modificarea proteinelor .
Un eveniment biologic comun de slabă calitate produs în sinteza proteinelor țintă și o cauză majoră pentru enzime recombinate și produse farmaceutice excluse de pe piața este plierea incorecta .Mijloacele de îmbunatațire a calității de proteine ar putea fi extrem de controversate , este , în general, presupus că versiunea proteinei solubile , în ciuda posibila apariție a unor agregate solubile și prezența speciilor funcționale din proteine în proteine agregate, este forma cea mai de dorit a produsul final al unui proces de producere a proteinei . În mod tradițional ,
solubilitate câștigă a fost abordat de către tuningdown rata de producție ( de exemplu, prin scăderea temperaturii ) , reducerea dozei genei recombinante sau puterea promotorului , sau furnizarea sume suplimentare de gazdă chaperones , deoarece acestea sunt văzute ca limitând timpul supraproductie de specii de proteine predispuse la pliere incorectă.
Sub contextul ridicat de încărcare de substrat de celule recombinante, însoțitori, actori principali în controlul calității de sistem , ar putea fi supra- titrați și , prin urmare, proteine sunt excluse de la căile de pliere la conformația nativă , acumulînduse ca particule refractile numite corpuri de incluziune. Prin urmare , mai multe chaperones(însoțitori de gene) individuale sau seturi de însotitori au fost selectați pentru supraproducție , împreună cu ținta de proteină recombinantă . coli ( E. coli ) , mai dintre aceste abordări au implicat două citosolice principale de însoțitori, și anume DnaK și GroEL , precum unele dintre co- chaperones. Cu toate acestea , examinarea de raspunsuri fiziologice la producerea de proteine în bacterii și alte microorganisme, a dezvaluit ca insotitor de co -producție , ca o strategie adresată de calitate , s-ar putea arăta în cele din urmă efecte secundare nedorite în ceea ce privește randamentul și calitatea proteinei ( Tabelul 3. 1 ) . Aici vom rezuma indicațiile principale subliniind insotitor efectele secundare , în principal, concentrându-se pe DnaK , GroEL și pliere lor .
Tabelul 3. 1 Principalele efecte secundare nedorite observate în timpul însoțitorilor de co-producție cu privire la calitatea și randamentul de proteinelor recombinante produse în E. coli, așa cum este exemplificat prin studii reprezentative.
3.3.1.DnaK
DnaK , omologul din eucariote Hsp70 , este maiorul însotitor citosolic în E. coli , și joacă un rol important rol încontrolul calității conformaționale . De fapt , DnaK este implicat în diferite activități , cum ar fi prevenirea de agregare , pliere și refolding de misfolded specii și proteine dezagregare. Din acest motiv , abordări de DnaK a fost adesea folosit în co -producție , fie împreună cu DnaJ de co- Chaperone sau ambele cu DnaJ și schimb de nucleotide
Factorul GrpE pentru a reduce agregarea și a spori solubilitatea proteinei recombinante.
S-au observat co- însoțitori , dacă este necesar , deoarece supra- expresie a genei dnaK singur este toxic pentru celula , ceea ce duce la inhibarea creșterii și septation anormală. Deși această abordare sa dovedit a fi util în multe cazuri, acest set de modulatoare de pliere nu a fost în mod constant de succes pentru a spori solubilitatea țintă de proteine recombinate și solubilitate a fost de multe ori îmbunătățită la cheltuielile de randament proteine. Acest fapt a fost atribuită atât celule de inhibare a creșterii și laproteoliza proteina recombinantă. În afară de menționat activitățile sale, publicații recente descriu că DnaK este de asemenea implicată în degradarea – agregare predispuse polipeptide dar funcțional ( sau potrivite pentru a fi activate ) prin orientarea lor la proteaze , cum ar fi Lon și ClpP . De fapt , absența unui DnaK funcțional duce la
creșterea rezistenței proteolitică a unei proteine țintă. Prin urmare , acest rol dublu de însoțitor , care acționează atât ca un modulator pliere și ca amplificator proteolitic , contribuie la explicarea divergenței de rezultatelor obținute în urma co – producției sale ,deși solubilitatea proteinei recombinante pot fi îmbunătățite prin nivelurile mari de DnaK și co- chaperones , calitatea de proteine ar putea fi compromisă , deoarece o parte importantă a acestei efect este obținut prin creșterea speciilor agregate solubile, cu activitate specifică variabila . În plus , randamentul de proteină recombinantă scade datorită stimulării activitații de proteoliză
efectuată de DnaK. Apariția un astfel de efect secundar DnaK – mediate demonstrează că strategiile dezvoltate pentru a optimiza producția de proteine recombinate unde procesele trebuie să fie redefinite , având în vedere că solubilitatea și calitatea conformationala trebue independent
controlată . Mai mult decât atât , deoarece DnaK este , de asemenea, un regulator negativ
răspunsului șoc termic, o concentrare sporită de DnaK peste nivelurile fiziologice poate duce la
jos – reglementarea de alte proteine de soc termic . De fapt ,au fost raportate niveluri scăzute ale GroEL însoțitoare în celulele – overproducing DnaK. Astfel , luând în cont că selectarea setul corespunzător de pliere a modulatorilor este încă un proces de încercare și eroare , acest scenariu
poate duce apoi la o depreciere mai pronunțată pliere de proteine care necesită nu numai interacțiune cu DnaK dar și cusistemul GroEL .
3.3.2.GroEL ( S )
Echipa însotitorului GroELS și șocul termic sunt de o importanță vitală pentru E. coli cu GroEL fiind o parte esențială a proteine pentru creștere , la toate temperaturile] . Co – producția din această echipă însotitor a fost aplicată pe scară largă pentru a îmbunătăți solubilitatea proteinelor care tind să formeze OI-urilor , în multe cazuri, cu un succes remarcabil. Cu toate acestea , de asemenea,există și eșecuri de GroELS la îmbunătăți solubilitatea care au fost raportate , în mare parte impactul GroELS a fost neutru , și anume fără a crește cantitatea de proteine pliate în mod corespunzător sau scăderea cantității de proteină țintă IB – depus. În special , eșecurile de GroELS co- producție s-au observat îmbunătățirea solubilității proteinei țintă când scopul pentru producerea de proteine mari , acest este o constatare ușor de înțeles proteine ca mari nu pot
introduce în cavitatea formată de însoțitor GroEL ceea ce conduce la o preferință de GroEL pentru substraturi proteice cu mase moleculare de 10/20 – 55/60 kDa. În plus , studiile anterioare au indicat faptul că este GroEL sunt implicate în promovarea degradarii proteolitică prin
obiectivul obligatoriu de proteine . De fapt , rolul naturale de GroEL nu numai include funcții chaperoning dar cuprinde , de asemenea, un rol vital în promovarea degradarii proteolitice . De exemplu , GroEL joacă un rol central în promovarea degradarii proteolitică a unei proteine de reglementare pentru a reduce potențialele efecte negative ale expresiei genelor . În plus , este de asemenea GroELS implicat în " proteine de îndepărtare a gunoiului " , și anume încurajarea
degradarea proteolitică de agregate de proteine endogene generate în timpul șocului termic.
Un studiu detaliat cu privire la implicarea GroELS în țintă degradarea proteinelor a fost efectuată la temperaturi – producția indus de creștere factorului fibroblastic bazic . Producție induse de temperatură conduce la formarea de factor de crestere solubil și factorul de creștere
depozitată sub formă de OI. Proteina purificată din fracțiunea solubilă a temperaturii celulei induse ,celulele sunt active biologic , determinată prin măsurătorile activității mitogenice. Co – producție de GroELS nu previne formarea IB dar conduce pentru a finaliza IB
dizolvare urmată de degradarea proteolitică de bază factor de creștere a fibroblastelor. În acest caz , dizolvarea IB urmată de degradarea proteolitică a proteinei țintă a fost mai eficient cu GroELS decât cu DnaKJ /Sistem GrpE.
3.3.3.Rezolvarea: proteoliza însotitorului-modulator
În ciuda rapoartelor menționate , DnaK indică că induce proteoliza în producția de proteine recombinate , este dificil de a găsi , în literatura de specialitate orice încercare de a rezolva
această problemă . Chiar și în E. coli medii genetice knock-out pentru principala gena proteazei citosolic ( Lon ) .Activitatea proteolitică este încă un obstacol pentru producția de proteine recombinate, probabil, prin inducerea de alte sisteme proteolitice. Cu toate acestea , într-un studiu recent s-a abordat această problemă prin re -hosting DnaK și ei co- Chaperone
DnaJ într-un sistem lipsit de ortologi ale proteazelor bacteriene responsabile pentru degradarea proteinei mediate de DnaK . Scopul unei astfel de abordare a fost pentru a decupla activitatea de pliere efectuată de DnaK de la celelalte activități ale sale legate de proteoliză , deoarece DnaK
a fost extrem de conservat în evoluție ( omologi DnaK pot fi găsite în toate împărățiile vieții ), raționamentul a fost că activitatea de pliere poate fi conservat în alte organisme , dar nu atât de activitatea proteolitică asociată deoarece este dependentă de proteazele bacteriene Lon și ClpP . Celule de insecte au fost alese ca gazdă pentru E. coli DnaKJ pereche de însotitor , care a fost introdus în sistem de producție la infecția celulelor cu vectori baculovirus recombinant care poartă gene corespunzătoare . În acest sistem eucariot , gena însoțitor de co -exprimare a condus la un randament îmbunătățit și activitatea biologică a unei proteine reporter a arătat , de asemenea, stabilitate crescută în prezența a chaperones bacteriene , indicativ de lipsa de proteoliză DnaK – mediate . Acest lucru a fost în contrast cu ceea ce au avut anterior și a fost descris în E. coli pentru producerea de aceeași combinație de proteine și însoțitor, același
studiul a aratat , de asemenea, efecte pozitive ale setului de modulatori de pliere bacterieni
pe producția de alte trei proteine recombinate în sistemul de celule de baculovirus de insecte ,
și anume VP1 și VP2 de la capsida de picior – și – Virus Boala gura , și un om – galactozidază . Mai târziu , legate de studiu s-a extins această abordare în vivo modelul utilizând baculovirusuri recombinate codificare chaperones bacteriene pentru a infecta larve de insecte , un sistem de utilizare ca biofactory dar unde randamentele sunt de obicei reduse ca urmare a agregării proteinei . În acest sistem , absența de proteoliză DnaK – induse a fost , de asemenea, evidentă ,
și co -producție a chaperones bacteriene care au amplificat solubilitate de proteine cu aproape 100 % , luate împreună , aceste studii arată nu doar cât de eficiente discriminarea de activități a fost o strategie adecvată pentru a exclude efectele nedorite ale însoțitor DnaKJ
pereche , dar , de asemenea, dovedi ca modulatori pliante bacteriene sunt funcționale în alte sisteme recombinante.
3.3.4.Concluzii cu privire la efectele secundare ale însoțitorilor de gene
În ciuda succesului lor dovedit ca modulatori de pliere în procese de producție de proteine , însoțitorii de gene bacterieni ( în special DnaK și GroEL și cofactorii asociați) , de asemenea,
prezintă efecte secundare nedorite legate de activitățile lor în promovarea proteolizei proteinelor țintă ( fig.3.3.1 ) . acest fapt ar putea explica , cel puțin parțial , rezultatele raportate la utilizarea acestor chaperones în ‘‘fabrici de celule microbiene’’ producerea de proteine. Din cauza lipsei de coincidență și controlul divergent de solubilitate proteine si de calitate observate în bacterii , însotitorii de co -producție ar putea îmbunătăți solubilitate ca urmare a unei reducerea nedorite a randamentului de proteine recombinant . Probabil , cele mai multe eșecuri ale însotitorilor de gene de co –exprimare pe solubilitatea proteinei țintă nu au fost raportate în literatura de specialitate și , în unele cazuri , un efect pozitiv presupus de însoțitorul de co -producție s-ar putea reflecta doar în prezența agregatelor solubile ,dar nu de proteinele funcționale. Mai mult decât atât , supraproducția de chaperones ca supraproducția de orice alte proteine pot contribui la încărcarea metabolică conducând astfel la reducerea ratei de creștere , precum și randamentele finale scăzute de biomasă. Ca un prim exemplu , re – hosting de chaperones bacteriene sa dovedit a fi o modalitate de a deconecta plierea de asistență și proteoliza . Cu toate acestea ,
studii suplimentare sunt necesare pentru a explora alte modalități alternative de a minimiza
efecte secundare în productia de proteine a sistemului de însoțitori, păstrând capacitatea de pliere a acestora.
CONCLUZII ȘI RECOMANDĂRI
1. Studiul literaturii a demonstrat că ingineria genică în sistemul procariot a dus la posibilitatea producerii și chiar comercializarii pe scară largă a unor hormoni (insulina, somatostatina, somatotropina), a interferonului etc.
2. Datorită dezvoltării mai multor tehnologii moderne a permis producerea cu succes a polipeptidelor recombinate în bacterii, deci cercetatorii în biologie au deschis unele căi noi de obținere a preparatelor pentru diagnosticare, pentru terapia genică mai ușore, mai rapide și necostisitoare.
3. Rezultatetele cercetarilor demonstrează că producerea polipeptidelor recombinate depinde de mai mulți factori (tulpini bacteriene , temperaturi de creștere , concentrația osmolitului, fuziune la diferite tag-uri , promotor, stabilitate ARNm și traducere eficientă , însoțitor co – expresie).
4. În lucrare este descrisă procedura de producere a vaccinurilor conjugate în E. coli transgenice într -un mod simplu și eficient prin tehnologii moderne de cuplare chimică.
5. Rezultatetele cercetarilor demonstrează că majoritatea proteinelor au o specificitate înaltă , deci au necesitatea de anumite cantități de însoțitorii/chaperoni de gene și deasemenea de anumite tipuri de însoțitorii pentru o pliere corectă în sistemul procariot de expresie.
6. Beneficiarii rezultatelor acestor cercetari pot fi reprezentați de bioindustrii , care ar putea implementa aceste modele de producere a polipeptidelor recombinate la nivel indusrial în țara noastră.
BIBLIOGRAFIA
1. Aluaș M., Simon S., (2012). Metode experimentale avansate pentru studiul si analiza bio-nano-sistemelor. Cluj-Napoca: Casa Cărții de Știință, ISBN 978-606-17-0115-5.
2. P: Antibody responses to Haemophilus influenzae type B and
diphtheria toxin induced by conjugates of oligosaccharides of the type
B capsule with the nontoxic protein Crm197. Infect Immun 1983,
39(1):233-238.
3. Bentley WE, Mirjalili N, , Davis RH, Kompala DS: Plasmidencoded
protein: the principal factor in the “metabolic burden”
associated with recombinant bacteria. Biotechnol Bioeng 1990, 35:668–681
4. Battistoni A, Carrì MT, Mazzetti AP, Rotilio G: Temperature-dependent
protein folding in vivo – lower growth temperature increases yield of
two genetic variants of Xenopus laevis Cu, Zn superoxide dismutase in
Escherichia coli. Biochem Biophys Res Commun 1992, 186:1339–1344.
5. Daniels MJ, Barber CE, Turner PC, Sawczyc MK, Byrde RJW, Fielding AH:
Cloning of genes involved in pathogenicity of Xanthomonas campestris
Pv campestris using the broad host range cosmid pLAFR1. EMBO J 1984,
3(13):3323-3328.
6. Genetica microorganismelor și inginerie genetică microbiană ,Note de curs și tehnici de laborator. http://www.bio.unibuc.ro/pdf/micro/documente_de_studiat/Cap3-1_Vectori_clonare.pdf
7. http://chimie-biologie.ubm.ro/Cursuri%20on-line/JELEA%20MARIAN/2.%20Microorganisme%203%20Bacterii%20-%20Note%20de%20curs.pdf
8. http://www.learner.org/courses/biology/textbook/gmo/gmo_3.html
9. http://nogovernment.wordpress.com/2013/08/29/aspartamul-este-excrement-de-bacterii-modificate-genetic/
10. http://www.revista-informare.ro/showart.php?id=109&rev=4
11. http://ro.wikipedia.org/wiki/Inginerie_genetic%C4%83
12. Ferrer-Miralles N, Domingo-Espin J, Corchero JL, Vazquez E, Villaverde A:
Microbial factories for recombinant pharmaceuticals. Microb Cell Fact
2009, 8:17.
13. Fisher AC, Rocco MA, DeLisa MP: Genetic selection of solubility-enhanced
proteins using the twin-arginine translocation system. Meth Mol Biol
2011, 705:53–67.
14. Fusee M., Swann W., Calton G., (1981). Immobilization of Escherichia coli cells containing aspartase activity with polyurethane and its application for L-aspartic acid production. Applied Enviromental Microbiology
15. INGINERIA GENICĂ .www.justmed.eu/files/inginerie_genica.doc
16.Kondo A, Kohda J, Endo Y, Shiromizu T, Kurokawa Y, Nishihara K, et al:
Improvement of productivity of active horseradish peroxidase in
Escherichia coli by coexpression of Dsb proteins. J Biosci Bioeng 2000,
90:600-606.
17. Langer T, Lu C, Echols H, Flanagan J, Hayer MK, Hartl FU: Successive action
of DnaK, DnaJ and GroEL along the pathway of chaperone-mediated
protein folding. Nature 1992, 356:683-689.
18. Martinez-Alonso M, Gonzalez-Montalban N, Garcia-Fruitos E, Villaverde A:
Learning about protein solubility from bacterial inclusion bodies. Microb
Cell Fact 2009, 8:4.
19. Mullis K.B., (1990). Target amplification for DNA analysis by the polymerase chain reaction. Ann. Biol. Clin. ().;48(8):579-82.
20. M S R M USMF “Nicolae Testemițanu” ,CURS DE BIOLOGIE MOLECULARĂ,CHIȘINĂU, 2000 .
21. OLEG BUDEANU și VICTOR CROITORU, TEHNICI AVANSATE ȋn BIOLOGIA MOLECULARĂ , Chisinau, 2013
22. Production of glycoprotein vaccines in Escherichia coli , 2010. http://www.microbialcellfactories.com/content/9/1/61 (vizitat la 11.04.2014)
23. Recombinant polypeptide production in E. coli-towards a rational approach to improve the yields of functional proteins, 2013. http://www.microbialcellfactories.com/content/12/1/101 (vizitat la 11.04.2014).
24. Side effects of chaperone gene co-expression in recombinant protein production ,2010. http://www.microbialcellfactories.com/content/9/1/64 (vizitat la 11.04.2014).
25. Skretas G, Makino T, Varadarajan N, Pogson M, Georgiou G: Multi-copy
genes that enhance the yield of mammalian G protein-coupled
receptors in Escherichia coli. Metab Eng 2012, 14:591–602
26.Tosa T., Sato T., Mori T., Chibata I., (1974). Basic studies for continous production of L-aspartic acid by immobilized Escherichia coli Cells. Applied Microbiology.
27. Ukkonen K, Veijola J, Vasala A, Neubauer P: Effect of culture medium. Host
strain and oxygen transfer on recombinant Fab antibody fragment yield and
leakage to medium in shaken E. coli cultures. Microb Cell Fact 2013, 12:73â
28 . http://www.editura.bioflux.com.ro/docs/carsai.pdf
ANEXE
Anexa 1
Glicozilarea Acra și EPA cu Shigella O1
polizaharide.
Anexa 2
Creșterea și formarea glicoconjugatului în lot
cultură.
Anexa 3
Cultivare în chemostat (D = 0,1 h-1) din Acra-O1 producătoare de E. coli folosind diferite substraturi de creștere. (A) curs Ora optic densitate de la inoculare, bare indică perioada de L-arabinoză (ara) co-furajelor și săgețile indică momentul de timp de adăugarea a IPTG. (B) formarea Glycoconjugatelor în culturile chemostat analizate cu anticorpi anti-Acra pe Western blot (probe normalizate). (C) Exprimarea pglB în cultură chemostat LB față de cultură discontinuă (Western blot anti-HA, probe normalizate).
BIBLIOGRAFIA
1. Aluaș M., Simon S., (2012). Metode experimentale avansate pentru studiul si analiza bio-nano-sistemelor. Cluj-Napoca: Casa Cărții de Știință, ISBN 978-606-17-0115-5.
2. P: Antibody responses to Haemophilus influenzae type B and
diphtheria toxin induced by conjugates of oligosaccharides of the type
B capsule with the nontoxic protein Crm197. Infect Immun 1983,
39(1):233-238.
3. Bentley WE, Mirjalili N, , Davis RH, Kompala DS: Plasmidencoded
protein: the principal factor in the “metabolic burden”
associated with recombinant bacteria. Biotechnol Bioeng 1990, 35:668–681
4. Battistoni A, Carrì MT, Mazzetti AP, Rotilio G: Temperature-dependent
protein folding in vivo – lower growth temperature increases yield of
two genetic variants of Xenopus laevis Cu, Zn superoxide dismutase in
Escherichia coli. Biochem Biophys Res Commun 1992, 186:1339–1344.
5. Daniels MJ, Barber CE, Turner PC, Sawczyc MK, Byrde RJW, Fielding AH:
Cloning of genes involved in pathogenicity of Xanthomonas campestris
Pv campestris using the broad host range cosmid pLAFR1. EMBO J 1984,
3(13):3323-3328.
6. Genetica microorganismelor și inginerie genetică microbiană ,Note de curs și tehnici de laborator. http://www.bio.unibuc.ro/pdf/micro/documente_de_studiat/Cap3-1_Vectori_clonare.pdf
7. http://chimie-biologie.ubm.ro/Cursuri%20on-line/JELEA%20MARIAN/2.%20Microorganisme%203%20Bacterii%20-%20Note%20de%20curs.pdf
8. http://www.learner.org/courses/biology/textbook/gmo/gmo_3.html
9. http://nogovernment.wordpress.com/2013/08/29/aspartamul-este-excrement-de-bacterii-modificate-genetic/
10. http://www.revista-informare.ro/showart.php?id=109&rev=4
11. http://ro.wikipedia.org/wiki/Inginerie_genetic%C4%83
12. Ferrer-Miralles N, Domingo-Espin J, Corchero JL, Vazquez E, Villaverde A:
Microbial factories for recombinant pharmaceuticals. Microb Cell Fact
2009, 8:17.
13. Fisher AC, Rocco MA, DeLisa MP: Genetic selection of solubility-enhanced
proteins using the twin-arginine translocation system. Meth Mol Biol
2011, 705:53–67.
14. Fusee M., Swann W., Calton G., (1981). Immobilization of Escherichia coli cells containing aspartase activity with polyurethane and its application for L-aspartic acid production. Applied Enviromental Microbiology
15. INGINERIA GENICĂ .www.justmed.eu/files/inginerie_genica.doc
16.Kondo A, Kohda J, Endo Y, Shiromizu T, Kurokawa Y, Nishihara K, et al:
Improvement of productivity of active horseradish peroxidase in
Escherichia coli by coexpression of Dsb proteins. J Biosci Bioeng 2000,
90:600-606.
17. Langer T, Lu C, Echols H, Flanagan J, Hayer MK, Hartl FU: Successive action
of DnaK, DnaJ and GroEL along the pathway of chaperone-mediated
protein folding. Nature 1992, 356:683-689.
18. Martinez-Alonso M, Gonzalez-Montalban N, Garcia-Fruitos E, Villaverde A:
Learning about protein solubility from bacterial inclusion bodies. Microb
Cell Fact 2009, 8:4.
19. Mullis K.B., (1990). Target amplification for DNA analysis by the polymerase chain reaction. Ann. Biol. Clin. ().;48(8):579-82.
20. M S R M USMF “Nicolae Testemițanu” ,CURS DE BIOLOGIE MOLECULARĂ,CHIȘINĂU, 2000 .
21. OLEG BUDEANU și VICTOR CROITORU, TEHNICI AVANSATE ȋn BIOLOGIA MOLECULARĂ , Chisinau, 2013
22. Production of glycoprotein vaccines in Escherichia coli , 2010. http://www.microbialcellfactories.com/content/9/1/61 (vizitat la 11.04.2014)
23. Recombinant polypeptide production in E. coli-towards a rational approach to improve the yields of functional proteins, 2013. http://www.microbialcellfactories.com/content/12/1/101 (vizitat la 11.04.2014).
24. Side effects of chaperone gene co-expression in recombinant protein production ,2010. http://www.microbialcellfactories.com/content/9/1/64 (vizitat la 11.04.2014).
25. Skretas G, Makino T, Varadarajan N, Pogson M, Georgiou G: Multi-copy
genes that enhance the yield of mammalian G protein-coupled
receptors in Escherichia coli. Metab Eng 2012, 14:591–602
26.Tosa T., Sato T., Mori T., Chibata I., (1974). Basic studies for continous production of L-aspartic acid by immobilized Escherichia coli Cells. Applied Microbiology.
27. Ukkonen K, Veijola J, Vasala A, Neubauer P: Effect of culture medium. Host
strain and oxygen transfer on recombinant Fab antibody fragment yield and
leakage to medium in shaken E. coli cultures. Microb Cell Fact 2013, 12:73â
28 . http://www.editura.bioflux.com.ro/docs/carsai.pdf
ANEXE
Anexa 1
Glicozilarea Acra și EPA cu Shigella O1
polizaharide.
Anexa 2
Creșterea și formarea glicoconjugatului în lot
cultură.
Anexa 3
Cultivare în chemostat (D = 0,1 h-1) din Acra-O1 producătoare de E. coli folosind diferite substraturi de creștere. (A) curs Ora optic densitate de la inoculare, bare indică perioada de L-arabinoză (ara) co-furajelor și săgețile indică momentul de timp de adăugarea a IPTG. (B) formarea Glycoconjugatelor în culturile chemostat analizate cu anticorpi anti-Acra pe Western blot (probe normalizate). (C) Exprimarea pglB în cultură chemostat LB față de cultură discontinuă (Western blot anti-HA, probe normalizate).
Copyright Notice
© Licențiada.org respectă drepturile de proprietate intelectuală și așteaptă ca toți utilizatorii să facă același lucru. Dacă consideri că un conținut de pe site încalcă drepturile tale de autor, te rugăm să trimiți o notificare DMCA.
Acest articol: Ingineria Genica In Sistemul Procariot DE Expresie (ID: 156965)
Dacă considerați că acest conținut vă încalcă drepturile de autor, vă rugăm să depuneți o cerere pe pagina noastră Copyright Takedown.