Influente Ionice In Nutritia Algelor Verzi Unicelulare

LUCRARE DE LICENȚĂ

Influențe ionice în nutriția algelor verzi unicelulare

INTRODUCERE

Interferențele ionice dintre diferite minerale din componența solului s-au dovedit un subiect de interes prin prisma acțiunii acestora asupra plantelor. O descoperire remarcabilă în acest sens constă în evidențierea rolului fiziologic al siliciului și contribuția sa în cadrul mecanismelor defensive naturale ale plantelor și în combaterea toxicității abiotice (Currie și Perry, 2007).

O vreme îndelungată, siliciul a fost considerat unelement neesențial pentru organismele vegetale, cu excepția reprezentaților familiei Equisetaceae și a unor diatomee și alge unicelulare (Currie și Perry, 2007). În plus, putem menționa faptul că el reprezintă un „contaminant” aproape universal al experiențelor care folosesc sticlărie de laborator, iar carențele de siliciu din sol sunt foarte rare și apar de regulă pe fondul unui consum foarte intens. De aceea, el nu este inclus în rețetele soluțiilor obișnuite de cultivare pentru culturi hidroponice. Însă acest element se găsește în compoziția majorității plantelor în concentrație mai mare sau echivalentă cu cea a unor macronutrienți, reprezentând, în medie, între 0,1 și 10% din greutatea uscată (Epstein, 1994). Descoperirile recente au arătat că rolul acestui element se face simțit în mediul natural prin activarea mecanismelor defensive ale plantelor, ce au ca rezultat creșterea rezistenței la diverși factori de mediu nefavorabili, biotici sau abiotici. Dintre acești factori, cei mai studiați sunt salinitatea, seceta (Currie și Perry, 2007), seceta(Janislampi, 2012), prezența patogenilor (Chérif și colab., 1994) și acțiunea erbivorelor (Garbuzov și colab., 2011). Astfel, prezența siliciului în soluția nutritivă și capacitatea diverselor specii de a-l utiliza eficient le conferă numeroase avantaje în mediul natural, inclusiv în cadrul competiției dintre specii.

Efectele siliciului asupra plantelor au fost și sunt studiate în detaliu (Horst și Marschner, 1978), însă în cazul organismelor mai primitive, cum ar fi algele unicelulare, contribuția acestuia este încă neelucidată.

Scopullucrăriiconstă întestarea capacității silicatului de sodiu de a reduce inhibarea creșterii algei verzi unicelulare,Chlorella vulgaris, provocată de concentrațiile ridicate de clorură de sodiu și clorură de mangan. Acest efect benefic al unor compuși cu siliciu a fost evidențiat la unele plante superioare, dar nu a fost încă menționat la algele verzi. Evidențierea rolului adaptiv al compușilor cu siliciu la algele verzi unicelulare supuse stresului salin sau excesului de mangan constituie un element de noutate științifică, care dă o valoare filogenetică mai largă a acestor mecanisme adaptative cunoscute la plantele superioare și care pledează pentru vechimea acestui mecanism.

Obiectivele lucrării au constat în:

determinarea concentrației de NaCl capabilă să producă o inhibare cu 25% a procesului de creștere la culturile de Chlorella;

testarea preliminară a capacității concentrațiilor 0,2 și 0,4 mM de silicat de sodiu de a anula efectul inhibitor al concentrației de 0,3 M NaCl

testarea capacității concentrațiilor de 0,1 mM și 0,2 mM Na2SiO3de a reduce inhibarea creșterii algale provocate de concentrația de clorură de sodiu stabilită în cadrul obiectivului numărul 1;

determinarea concentrației de MnCl2 capabilă să producă o inhibare cu 25% a procesului de creștere la culturile de Chlorella;

testarea capacității concentrațiilor de 0,1 mM și 0,2 mM Na2SiO3de a reduce inhibarea creșterii algale provocate de concentrația de clorură de mangan stabilită în cadrul obiectivului numărul 3.

În afara obiectivelor științifice enunțate mai sus, a existat și dorința de a ilustra practic ideea că în contextul cunoașterii studiilor anterioare din domeniu și a unei planificări judicioase a experiențelor este posibilă obținerea unor rezultate științifice semnificative prin mijloace experimentale relativ modeste.

ASPECTE TEORETICE

Siliciul în natură și comportamentul lui în soluție

Siliciul (Si) este un element prezent ubicuitar în natură, sub diverse forme, în general sub formă de compuși anorganici.După oxigen,în sol, este al doilea element ca abundență (Shakoor, 2014), fiind prezent în general într-un procent de 31% (Sposito, 1989, citat de Janislampi, 2012).

Silicea este cel mai abundent oxid din scoarța terestră. Silicea, denumire dată dioxidului de siliciu (SiO2), se poate referi la oricare dintre cele 9 forme ale acestuia prezente în scoarța terestră, dintre care putem aminti cuarțul, calcedonia (cu structură microcristalină), silicea amorfă etc. Cuarțul este cea mai comună formă șicea mai stabilă din punct de vedere chimic.

La contactul cu apa, silicea poate reacționa, rezultând acidul ortosilicic, solubil, proces exemplificat în următoarea reacție:

SiO2, cuarț + 2H2O ↔ H4SiO4, aq

Factorii fizici, în special temperatura și pH-ul, influențează solubilitatea cuarțului. Astfel, scăderea temperaturii determină scăderea solubilității acestuia, iar un pH acid crește foarte mult rata de solubilizare (Erlindo și Angcoy, 2006).

Acest aspect este important pentru plante deoarece, pentru a fi asimilați, ionii trebuie să se afle în formă solubilă. Iar apoi, în anumite condiții, dirijate sau nu de către plantă, se pot forma cristale în corpul acesteia, ce poartă numele de fitoliți (Currie și Perry, 2007).

Într-o soluție salină ce conține diferiți ioni, cum este, de exemplu, cea a izvoarelor termale, punctul în care începe cristalizarea silicei variază în funcție de mai mulți factori, dintre care cei mai importanți sunt temperatura, pH-ul, presiunea, gradul de saturareîn acid ortosilicic al soluției și concentrația celorlalți ioni. S-a constatat că într-o soluție cu salinitate mare, viteza de polimerizare a silicei crește (Erlindo și Angcoy, 2006).

Depozitele solide de silice care se pot forma conțin fie polimeri rezultați prin dimerizarea și apoi polimerizarea acidului ortosilicic sub formă de flocoane, fie monomeri ce sedimentează datorită schimbării condițiilor de mediu din soluție, fie sunt depozite mixte.

Acidul monosilicic, Si(OH)4, are în centru atomul de Si, înconjurat de patru grupări OH, ce poartă numele în acest caz de grupări silinol (–Si–O–H). Două molecule de acid monosilicic pot intra într-o reacție de condensare, în care se formează legături Si–O–Si, rezultând un dimer.

Reacția poate continua, ducând la formarea de polimeri.

Si(OH)4 + Si(OH)4(HO)3Si – O – Si(OH)3 + H2O

Figura 1 Concentrația în acid silicic de la suprafața mărilor și oceanelor [mmol Si m-3] (https://en.wikipedia.org/wiki/Silicic_acid)

Polimerizarea se produce în condițiile în care cât mai multe grupări silinol sunt ionizate la –Si–O-. De aceea, salinitatea soluției are efect stimulant, determinând ionizarea grupărilor silinol (Erlindo și Angcoy, 2006).

Efectele influențelor ionice ale siliciului în corpul plantelor

Absorbția din soluție

Siliciul ajunge în corpul plantei în urma absorbției sale sub formă solubilă, de Si(OH)4 sau Si(OH)3O- și este supus unei polimerizări controlate în anumite părți ale plantei (Currie și Perry, 2007).

Cea mai simplă formă de silice prezentă în plante este acidul ortosilicic. În această moleculă, siliciul este combinat coordinativ cu patru grupări hidroxil, luând o formă tetraedrică. Este un compus slab acid, având pKa 9,8 (Iler, 1979, citat de Currie și Perry, 2007)

Pentru ca Si să poată fi absorbit de către plante, el trebuie să se afle dizolvat în soluția solului. În acest sens, pH-ul solului influențează forma sub care Si se găsește în sol și, implicit, cantitatea de Si disponibilă plantelor. De asemenea, în regiunile în care degradarea rocilor este intensă, de exemplu în zonele tropicale, cantitatea de Si disponibil din sol ajunge la valori foarte mici. În plus, prezența altor ioni, precum cei de aluminiu și de fier determină scăderea cantității de Si din soluție, prin formarea unor complexe insolubile de silicați (Jones și Handreck, 1967, citați de Janislampi, 2012).

Si este transportat la nivelul celulelor rădăcinii atât pasiv, prin difuzie, cât și cu consum de energie, printr-un transportor activ.Astfel, în funcție de densitatea transportorilor pentru transport radial și de prezența transportorilor pentru trecerea în xilem, cantitatea de Si ce poate fi acumulată diferă între specii. De exemplu, în cazul orezului, concentrația de Si din seva brută este de 20-100 de ori mai mare față de cea de la roșii și castraveți (Mitani și Ma, 2005). S-a constatat că, în general, dicotiledonatele nu prezintă transportori de Si pentru trecerea în xilem, aceasta făcându-se în mod pasiv, ci doar pentru realizarea transportului radial. Iar densitatea acestora la nivelul membranei determină cantitatea de Si ce poate ajunge în interiorul celulelor și poate fi acumulat în plantă (Wiese și colab., 2007, citat de Shakoor, 2014).

Transportorii de Si au fost studiați în mod special la orez, orz și porumb, plante care acumulează o cantitate însemnată de Si. Astfel, s-a constatat existența a două tipuri de transportori: cei de influx și cei de eflux.

Transportorii de influx (Lsi1 – low silicon 1) fac parte din familia acvaporinelor și subfamilia proteinelor majore intrinseci Nod26-like (NIP).Lsi1 prezintă 6 domenii transmembranare și două motive Asn-Pro-Ala, bine conservate în rândul acvaporinelor (Figura 2).Aceștia sunt proteine transportoare de ioni ce au în structură 11 domenii transmembranare, iar activitatea lor se consideră a fi realizată cu ajutorul gradientului de protoni. Totuși, Lsi2 nu au fost identificați la alte specii în afară de orez, orz și porumb (Ma, 2009).

Localizarea celor două tipuri de transportori este asemănătoare în celulele din exoderma și endoderma rădăcinii (Figura 3), unde există benzile caspariene care împiedică trecerea liberă a substanțelor dizolvate în soluția solului. Diferența constă în faptul că Lsi1 sunt localizați în partea distală a celulelor, pe când Lsi2 apare pe fața proximală.

Figura 2Structura 3D a transportorului de Si Lsi1 de la Oryza sativa, obținută prin modelarea comparativă a proteinelor (“homology modelling”) de către Mohammed și colab. (2013)

Astfel, prin intermediul Lsi1, Si din soluția solului intră în celule, le traversează și iese prin intermediul Lsi2, pentru a ajunge în seva brută. De aceea, colaborarea dintre cele două tipuri de transportori este esențială pentru reglarea cantității de Si ce este absorbită de către plantă (Ma, 2009).

Figura 3 Dispoziția transportorilor de Si Lsi1 și Lsi2 la nivelul celulelor rădăcinii de orez (Oryza sativa) (Ma, 2009)

O aplicație foarte interesantă a determinării cantității de siliciu din frunzele plantelor acumulatoare (plante care absorb pasiv siliciu odată cu apa de transpirație – de exemplu grâul) este estimarea cantității de apă transpirată de frunzele respective până în momentul analizei (Mayland și colab. 1991).

Depozitarea Si sub formă de fitoliți

În cazul porumbului și orezului, s-a constatat existența unui alt transportor membranar de Si, numit Lsi6, care este localizat în regiunea adaxială a celulelor parenchimale din frunze. În cazul distrugerii acestuia, apar depozite anormale de Si la nivelul rădăcinii și excreția Si prin gutație. De aceea, se consideră că Lsi6 intervine în aportul Si din xilem pentru depozitarea sa în frunze (Ma, 2009).

În urma aportului de siliciu sub formă solubilă de Si(OH)4 sau Si(OH)3O2-, acesta ajunge să polimerizeze, formând fitoliți sau corpi silicioși în peretele celular sau lumenul anumitor celule (Currie și Perry, 2007).Totuși, modul în care acesta se asociază cu componentele peretelui celular precum polizaharide, lignină sau proteine nu este înțeles pe deplin (Perry și Lu, 1992, citat de Currie și Perry, 2007).

Primele organisme la care au fost studiate depunerile de Si sunt diatomeele. Acestea sunt o clasă de alge unicelulare ce constituie o mare parte din planctonul marin. Ele utilizează Si la construirea unui schelet extern (numit frustulă) deși concentrațiile în care Si se găsește în apă sunt foarte mici, fiind în medie de aproximativ 35 μM în apele de suprafață (Hem 1985, citat de Schenk și colab., 2008) și la nivel global, de aproximativ 70 μM Si (Sumper și Brunner, 2008, citați de Schenk și colab., 2008)(Fig. 1).Exoscheletul silicios este mai avantajos decât un schelet alcătuit din carbon (Schenk și colab., 2008). Diatomeele formează structuri microcristaline cu tipare complexe, poroase, al căror mecanism de formare nu este pe deplin elucidat (Perry, 2009).Si intră în celulă prin difuzie, la concentrații mari, sau prin transport activ, când concentrația externă este scăzută, prin intermediul unor transportori de Si Na-dependenți. În formarea fustulelor intră în acțiune anumite compartimente celulare, numite vezicule de depozitare a Si (Schenk și colab., 2008).

Producția anuală de silice dată de organisme precum diatomeele, spongierii sau plantele o depășește cu mult pe cea industrială de la nivelul actual, ajungând până la ordinul gigatonelor (Currie și Perry, 2007).

La plante, acidul monosilicic, transportat în anumite părți ale organismului, poate ajunge până la concentrații de 100-200 mg/kg. Apare polimerizarea locală, formându-se inițial nuclei stabili cu dimensiune critică, apoi aceștia continuă să crească și formează particule sferice care se conectează între ele, rezultând lanțuri ramificate și motive structurale complexe (Perry și colab., 2003, citat de Currie și Perry, 2007). S-a constatat că în timpul creșterii particulelor, când acestea ating dimensiunea de 1-3 nm în diametru, ele prezintă o suprafață încărcată negativ destul de mare pentru a interacționa cu elementele peretelui celular sau alte substanțe aflate în apropiere (Currie și Perry, 2007).

Rezultă astfel materiale având ca unitate de bază tetraedrul de SiO4, cu distanțe O-Si și unghiuri Si-O-Si variabile. Însă în funcție de condițiile locale de pH, temperatură, concentrație de Si, prezența altor ioni, molecule sau polimeri, se formează materiale care variază mult în ceea ce privește porozitatea, duritatea, solubilitatea, compoziția și vâscozitatea (Perry și colab., 2003, citat de Currie și Perry, 2007).

În cazul plantelor, structurile din silice apar în diverse locații și forme, în funcție de specie. La unele plante, siliciul pare a fi transportat odată cu celelalte componente din soluția solului și depozitat în regiunile din care se evaporă apa, în special în frunze, datorită creșterii locale a concentrației acestuia. La alte plante, apare delimitarea anumitor regiuni specifice în care se concentrează Si, acesta neputând trece în formă coloidală prin membranele celulare. Și, desigur, există anumite specii la care formațiunile silicioase sunt atent controlate, de exemplu în cazul perilor urticanți ai urzicilor, ceea ce indică participarea Si în cadrul metabolismului (Perry, 2009).

Un alt exemplu de dispunere diferită a structurilor silicioase este dat de reprezentanții familiei Poaceae care depozitează Si sub forma unui strat de 2x5m, imediat sub cuticulă, însă și în epidermă, în țesutul vascular al tulpinii, în teaca frunzelor și în învelișurile semințelor. În schimb, la Equisetum sp., structurile silicioase sunt dispuse sub formă de noduri și rozete pe suprafața epidermală a întregului perete celular, iar aceste formațiuni sunt și ele acoperite cu spiculi. Este interesant faptul că studiul morfologic al ultrastructurii formațiunilor silicioase a arătat că acestea sunt asemănătoare microstructural între specii diferite, prezentând structuri globulare, fibroase și plate, cu distribuție variată, în funcție de regiunea anatomică ce a fost analizată (Currie și Perry, 2007).

Capacitatea plantelor de a depozita siliciul în anumite țesuturi variază foarte mult între specii. Astfel, acumulări substanțiale de Si s-au constatat în special la reprezentanții familiilor Cyperaceae, Equisetaceae și Poaceae care prezintă Si în procent >4% din greutatea uscată (până la 10%). Acumulări intermediare de Si apar în cazul familiilor Cucurbitales, Urticales și Commelinaceae (2-4 % Si), iar restul plantelor depozitează Si în cantități mici (Hodson și colab., 2005, citat de Currie și Perry, 2007).

Printre efectele date de prezența depozitelor de Si în corpul plantelor și a diferențelor fenotipice dintre specii în această privință, cel mai important în cazul plantelor ce trăiesc în mediul natural este influența concentrației de siliciu din sol asupra competiției dintre plante. Aceasta se realizează pe de o parte direct, prin efectul său asupra acumulării de biomasă (care diferă în funcție de specie) și pe de altă parte indirect, alterând ratele de atac ale erbivorelor. Prezența Si în frunze în formă insolubilă funcționează ca un mecanism de apărare al plantelor contra dăunătorilor, însă s-a constatat că nu contează atât concentrația de Si, cât dispoziția fitoliților foliari și forma acestora (Garbuzov și colab., 2011 ).

Forma fitoliților foliari diferă enorm între specii (Perry, 2009). În plus, siliciul, depozitat în celulele plantei, păstrează morfologia celulelor chiar și după ce acestea au fost degradate. De aceea, fitoliții rămași pot da informații prețioase privind apartenența taxonomică a plantei respective. Un astfel de exemplu este cazul unor rămășițe arheobotanice în care s-au descoperit depozite de graminee carbonizate. Acestea pot conține atât Setaria italica, una dintre primele cereale cultivate de om în Eurasia, cât și strămoșul său sălbatic, S. viridis. Zhang și colab., (2011) au analizat fitoliții din lema superioară și de pe paleea secundară a semințelor de Poaceae, având în vedere trei măsurători morfologice și o analiză comparativă a rezultatelor, ei au arătat că se poate realiza o distincție viabilă între cele două specii pe baza acestui criteriu.

Un alt efect important al depozitării Si sub formă de fitoliți este rolul acestuia de a rigidiza structura plantei, conferindu-i astfel beneficii precum rezistența crescută la condițiile de mediu, stabilizarea staturii plantei și a orientării frunzelor spre lumină (Janislampi, 2012). Acest efect este larg întâlnit, inclusiv în cazul ierburilor, bambusului, anumitor tipuri de lemn, la coaja unor nuci, la tulpinile și țepii anumitor plante (de exemplu, perii urticanți ai urzicilor) etc. Din acest motiv, plantele ce depozitează Si au fost utilizate în mod divers în viața oamenilor, de exemplu Equisetum sp. au fost folosite drept materiale abrazive; paiele utilizate în construirea acoperișurilor își datorează rezistența la vreme conținutului ridicat în SiO2 etc. (Perry, 2009).

În plus, unii autori consideră că Si intervine în rezistența termică și structurală a membranelor celulare (Agarie și colab., 1998, citat de Janislampi, 2012).

Efecte ale siliciului la nivelul rădăcinii

Nivelul de acumulare al Si în celulele rădăcinii variază între 0,1 și 10% din greutatea uscată a acesteia, în funcție de specie (Hodson și colab., 2005; Ma și Takahashi, 2002; citați de Ma, 2009).

Odată pătruns în celulele rădăcinii, siliciul, aflat în formă solubilă, poate influența procesele metabolice ale plantei. Un exemplu în acest sens îl reprezintă îmbunătățirea răspunsului defensiv al plantulelor de castravete în cazul infectării cu tulpini de Pythiumsp. Prezența siliciului în soluția solului a determinat o creștere mult mai rapidă a nivelelor de peroxidaze, chitinaze, polifenol oxidaze și flavonoid fitoalexine de la nivelul rădăcinii ca răspuns la infecție, față de plantulele cărora nu li s-a administrat siliciu și la carea întârziat apariția mecanismelor defensive, ducând la moartea acestora (Cherif și colab., 1994).

Un alt beneficiu al prezenței siliciului în soluția solului a fost evidențiat în cazul orezului (Oryzasativa). Deoarece orezul crește de obicei în soluri inundate, în condiții anaerobe și reducătoare, el s-a adaptat la acest mediu printr-o aerație internă a rădăcinii în cadrul unui țesut specializat, numit aerenchim (Colmer, 2003, 2006, citat de Fleck și colab., 2010). Oxigenul care ajunge în acest mod la nivelul rădăcinii, poate fi pierdut însă prin difuzie, proces numit pierdere radială de oxigen (ROL). Pentru a contracara acest proces, rădăcinile își creează o barieră (Armstrong, 1971; Colmer, 2003b, citați de Fleck și colab., 2010) care, în cazul orezului, este formată din exoderma suberizată și celulele sclerenchimatice lignificate (Kotula și Steudle, 2008, citați de Fleck și colab., 2010). S-a observat că unul dintre factorii care controlează formarea acestei bariere este gradul de aerare a soluției de creștere. Cu cât concentrația de oxigen din soluție este mai mică, cu atât rădăcinile conțin o cantitate mai mare de lignină și suberină care să împiedice pierderea radială de oxigen (Kotula et al. 2009, citați de Fleck și colab., 2010).

Calea metabolică de formare a acestor substanțe este stimulată de aportul de Si al plantei în condiții de stres (Kidd și colab., 2001; Cai et al., 2008). Aceste studii au fost efectuate pe orez crescut în soluții nutritive cu sau fără acid silicic, pentru a investiga puterea oxidativă a rădăcinii, dezvoltarea endodermei, exodermei și sclerenchimului și impactul Si asupra transcrierii anumitor gene. Astfel, s-a demonstrat că aportul de Si determină o scădere a puterii oxidative a rădăcinii și ajută la producerea de benzi caspariene în exodermă și endodermă și a depozitelor de lignină din sclerenchim. Aceste efecte reprezintă probabil cauza pentru reducerea ROL a rădăcinii și pot fi utile plantelor care trăiesc în soluri anaerobe.

Formarea ligninei și suberinei are la bază calea polifenilpropanoid, din care rezultă monolignoli. Aceștia sunt secretați în apoplast și, prin polimerizare, formează lignina. Monomerii de suberină sunt formați din acid ferulic, glicerol și derivați ai acizilor grași, componente dintre care acidul ferulic este un intermediar în calea polifenilpropanoid. Suberina se formează în apoplast prin polimerizarea monomerilor de suberină, sub acțiunea peroxidazelor de clasă III (POD) (Fleck și colab., 2010).

Fleck și colab. (2010) au evidențiat contribuția siliciului în calea metabolică de formare a acestor substanțe în condiții de stres, în sensul că acidul silicic adăugat la soluția solului stimulează reducerea ROL a rădăcinii prin stimularea producerii de benzi caspariene în exodermă și endodermă și a depozitelor de lignină din sclerenchim.

Tot la nivelul rădăcinii, s-a studiat răspunsul fiziologic al celulelor în cazul toxicității date de concentrații mari ale anumitor ioni. Un studiu sugestiv în acest sens este cel demarat de Vázquez și colab. (1999) asupra unor varietăți de porumb tolerante la aluminiu. Efectele toxice ale concentrațiilor mari din acest element au fost reduse semnificativ datorită siliciului care a permis formarea unor silicați de aluminiu greu solubili în interiorul celulelor, aceștia fiind depozitați în cadrul vacuolelor. Se pare că aluminiul captat astfel nu mai exercită efectul de stopare a creșterii celulare asupra celulelor rădăcinii, iar plantele își pot relua dezvoltarea normală în decurs de 4 zile de la expunere.

Contracararea stresului salin

Unul dintre cele mai discutate efecte ale aportului de Si în corpul plantelor este cel de contracarare a stresului salin. Salinitatea determină reducerea creșterii plantelor, influențând astfel și productivitatea culturilor. Mai exact, stresul salin determină un dezechilibru ionic la nivel celular, rezultând stres osmotic, toxicitate ionică și, în final, generează specii reactive de oxigen care atacă acizii nucleici, lipidele și proteinele celulare (Yasar și colab., 2006, citat de Sevengor și colab., 2011). De asemenea, apare degradarea clorofilei și peroxidarea lipidelor membranare, ce poate determina o scădere a fluidității și selectivității membranei și poate duce în final la moartea celulelor.

Plantele contracarează aceste efecte prin intermediul sistemelor antioxodative, din care fac parte: antioxidanți non-enzimatici, precum acidul ascorbic, glutationul, carotenoizii etc. și enzime antioxidative, dintre care cele mai studiate sunt superoxid dismutaza (SOD), ascorbat peroxidaza (APX) și glutation reductaza (GR) (Kusvuran și colab., 2007, citat de Sevengor și colab., 2011).

SOD catalizează trecerea anionilor superoxid în oxigen și peroxid de hidrogen, asupra căruia acționează catalaza care îl transformă în apă și oxigen. O altă cale de reducere a peroxidului de hidrogen este prin intermediul ascorbat peroxidazei (APX), ce utilizează ascorbatul ca donor de electroni, după care acesta este regenerat în ciclul ascorbat-glutation, iar glutationul oxidat rezultat este readus la forma redusă de către glutation reductaza (Sevengor și colab., 2011).

Există studii amănunțite în privința rezistenței plantelor la salinitate. De exemplu, Sevengor și colab. (2011) au observat corelația dintre creșterea în dimensiuni a plantulelor de dovleac și activitatea enzimelor antioxidative în cazul unor varietăți de dovleac tolerante la salinitate (varietăți de Curcubita pepo) sau sensibile la aceasta (C. moschata).

Genotipurile tolerante la salinitate au prezentat o activitate mai crescută a enzimelor antioxidative față de varietățile sensibile, ceea ce le-a oferit o protecție mai bună contra stresului salin. Acest fapt a fost dovedit practic de o scădere mai mică a greutății proaspete și a conținutului de clorofilă (Sevengor și colab., 2011).

Moussa (2006) a arătat un efect interesant al Si asupra plantulelor de porumb, măsurând masa uscată a acestora după ce au fost crescute în diferite condiții. Astfel, dacă acestea sunt crescute într-o soluție nutritivă ce conține și NaCl, creșterea este inhibată. Iar în prezența unei soluții ce conține adăugat Si (3mM/l), nu prezintă diferențe de acumulare a materiei organice. Însă dacă se combină cele două, rezultând o soluție nutritivă cu NaCl și Si, efectul inhibitor al sării este contracarat, rezultând o creștere a masei de material vegetal.

Astfel, s-a dedus că Si poate reduce stresul salin la porumb prin scăderea permeabilității membranelor plasmatice și prin menținerea formei și structurii celulelor ca urmare a creșterii cantității enzimelor antioxidative SOD și CAT. Si contracarează parțial impactul negativ al NaCl inducând o toleranță crescută a frunzelor de porumb la salinitate prin îmbunătățirea conținutului de clorofile și a activității fotosintetice (Moussa, 2006).

Același efect de contracarare a efectelor salinității crescute a fost evidențiat și în cazul grâului, a cărui creștere a fost îmbunătățită chiar și din stadiul germinativ. Astfel, la o concentrație de Si de 0,33 mM, cantitatea de Na prezentă în frunze a scăzut semnificativ, însă fără a avea efecte asupra conținutului de clorofilă al acestora (Ahmad și colab., 1992, citat de Janislampi, 2012). Iar la soia, fertilizarea cu Si în cadrul culturilor hidroponice îmbunătățește semnificativ creșterea plantelor și contracarează efectele excesului de NaCl, determinând creșterea conținutului de clorofilă (Lee și colab., 2010, citat de Janislampi, 2012).

Un alt studiu a avut drept subiecți plantulele de fasole (Vicia fabaL), crescute pe sol salin, folosind diferite practici de cultivare și cărora li s-au administrat foliar sulfați sau silicați de magneziu sau potasiu.Abbou-Baker și colab. (2011) au arătat că plantulele cărora li s-au administrat silicați au prezentat o creștere notabilă a tuturor parametrilor considerați, prin comparație cu plantulele care au fost tratate cu sulfați, care se utilizează în mod normal pentru aportul de potasiu și magneziu. Silicatul de potasiu a fost cel mai eficient (rezultând o creștere a concentrației de potasiu), iar silicatul de magneziu a avut ca efect sporirea concentrațiilor de azot și de fosfor (Abbou-Baker și colab., 2011).

Asociat cu stresul salin, apare și stresul deficitului de apă. Seceta produce efecte precum distrugerea membranelor celulare, modificarea arhitecturii interne a celulelor, afectarea procesului de fotosinteză și inhibarea diviziunii celulare (Hsiao, 1973; Taiz și Zeiger, 2006, citați de Janislampi, 2012). Fertilizarea cu siliciu în condiții de secetă s-a dovedit a fi benefică pentru plante. Acesta determină creșterea toleranței la secetă, dovedită prin creșterea masei uscate a plantelor în studii realizate pe porumb, orez și soia (Janislampi, 2012).

Întrucât primul mecanism de apărare al plantelor contra pierderilor de apă este îngroșarea cuticulei, formarea depozitelor de Si sub cuticulă determină o eficiență crescută a reținerii apei în corpul plantei (Ma, 2004, citat de Janislampi, 2012). În plus, Si poate fi implicat în reglajul osmotic al celulelor, întrucât fertilizarea cu Na2SiO3 determină creșterea conținutului de apă al frunzelor de porumb supus secetei cu 26.5% pentru concentrația de 2 mM Na2SiO3 (Kaya et al., 2006, citat de Janislampi, 2012). Iar un alt posibil mecanism ar putea fi legat de formarea depunerilor de Si la nivelul rădăcinii, după cum sugerează Lux și colab. (2002, citat de Janislampi, 2012) pentru o varietate de sorg (Sorghum sp.) tolerantă la secetă.

Există diverse studii ce demonstrează efectul benefic al Si în cazul secetei. De exemplu, la grâu s-a constatat creșterea suprafeței foliare, a grosimii frunzelor și a masei uscate în condiții de secetă în urma adăugării de Na2SiO3 (Gong și colab., 2003, citat de Janislampi, 2012). De asemenea, în cazul cartofilor, fertilizarea cu silicați de calciu sau magneziu determină creșterea înălțimii plantelor, sporirea numărului de tuberculi destul de mari pentru a fi vânduți și creșterea masei medii a acestora în condiții de secetă, având ca efect creșterea conținutului de Mn și P, concomitentă cu scăderea conținutului de azot (Pulz și colab., 2008, citat de Janislampi, 2012). Alte plante la care adăugarea Si a dat rezultate pozitive sunt tomatele, sorgul, floarea-soarelui, orezul etc., ajungând în unele cazuri să contracareze total efectul stresului dat de deficitul de apă (Janislampi, 2012).

Reducerea toxicității date de concentrații mari ale altor elemente minerale (Mn)

Micro- și macroelementele esențiale în dezvoltarea plantelor în cantități relativ mici, pot deveni toxice dacă se găsesc în concentrații mari în soluția nutritivă a plantelor.

Manganul (Mn) face parte dintre microelementele esențiale în nutriția plantelor superioare, găsindu-se în plante în mod normal în concentrații ce variază între 10-600ppm din greutatea uscată (Epstein, 1994).

Toxicitatea Mn este una dintre problemele frecvente ce apar la culturile amplasate pe soluri acide sau insuficient drenate și determină limitarea dezvoltării plantelor prin apariția simptomelor specifice: cloroză, apariția de pete maronii pe frunze, urmată de necroza și căderea acestora. Aceste pete maronii sunt de fapt depozite apoplastice de Mn oxidat și fenoli oxidați, a căror formare este catalizată de peroxidazele apoplastice (POD) ale celulelor epidermale. Se consideră că Mn2+, fiind un metal tranzițional, ce poate trece în Mn3+, este implicat și în formarea de specii reactive de oxigen, posibil printr-o reacție de tip Fenton, de unde rezultă efectul toxic al unei concentrații mari de Mn (Maksimović și colab., 2012).

În apoplast, POD acționează drept producători de H2O2, utilizând electroni proveniți de la NADH și apoi intervin în consumarea H2O2 pentru oxidarea fenolilor, acțiune pentru care poartă numele de guaiacol-POD. Aceasta participă la formarea peretelui celular secundar și la procesul de lignificare. Prezența în cantitate mare a izoformelor POD în fluidul apoplastic poate fi considerată un răspuns defensiv al plantei la concentrația crescută de Mn. Iar conținutul mare de H2O2 poate rezulta și din activitatea accentuată a superoxid dismutazei (SOD) (Maksimović și colab., 2012).

Mecanismul prin care se face reducerea efectului toxic al concentrațiilor foarte mari de mangan

Acidul silicic are o mare afinitate pentru ortodifenoli (de exemplu acidul cafeic) și formează cu aceștia mono-, di- și polimeri cu mare stabilitate și solubilitate redusă (Weiss și Herzog citați de Marschner, 1995). Acest efect de inactivare temporară a excesului de compuși fenolici (Figura 4) poate explica reducerea efectului toxic al concentrațiilor foarte mari de mangan (Horst și Marschner, 1978 citați de Marschner, 1995).

Figura 4Dimerizarea unui monomer de acid silicic complexat cu trei molecule de orto difenol (Horst și Marschner, 1978 citați de Marschner, 1995).

S-a dovedit că un pre-tratament cu siliciu la porumb poate mări toleranța la expunerea ulterioară la aluminiu în exces (Corrales și colab., 1997) dar această opinie nu este susținută de alte experiențe ulterioare (Wang și colab., 2004).

S-a demonstrat în multe studii efectul Si de a contracara toxicitatea dată de concentrația crescută de Mn în cazul plantulelor de orez, fasole, orz, dovleac, castraveți etc (Maksimović și colab., 2012; Liang și colab., 2006).Astfel, Maksimović și colab. (2012) au constatat că plantulele de castravete tratate cu Si nu prezentau simptomele toxicității Mn, deși concentrația de Mn din frunze era foarte mare. În plus, s-a observat că deși concentrația totală de Mn din frunze rămâne aceeași în urma tratamentului cu Si, acesta are o distribuție mai largă în cadrul frunzei și nu se mai formează zone cu concentrații mari care să devină puncte necrotice (Liang și colab., 2006).

În cazul castraveților, există mai multe ipoteze privind mecanismul prin care Si acționează. Cert este că în prezența Si crește toleranța foliară la Mn, fără să scadă rata de absorbție a acestuia din soluția solului. Una dintre ipoteze susține că Si determină creșterea rateide captare a Mn la peretele celular. Drept consecință, scade proporția de Mn2+apoplastic ce poate să genereze specii reactive de oxigen, scăzând astfel toxicitatea Mn. Însă acest mecanism nu oferă o explicație completă a modului de acțiune al Si, întrucât în cazul plantelor de fasole pestriță (Vigna unguiculata), s-a constatat o concentrație mai mare de Mn apoplastic la plantele tratate cu 1.44 mM Si și 50 μM Mn și care nu prezentau simptome ale toxicității, spre deosebire de plantele tratate cu 10 μM Mn, care aveau simptome evidente (Iwasaki et al., 2002a,b, citat de Liang și colab., 2006).

În plus față de fixarea Mn prin adsorbție la peretele celular, prezența Si previne acumularea de fenoli liberi în compartimentele celulare, ceea ce amplifică efectul său benefic. Aceasta se produce deoarece cantitatea și activitatea izoformelor POD din fluidul apoplastic se reduc, ceea ce are drept efect și inhibarea activității guaiacol-POD (Maksimović și colab., 2012). Astfel, fluidul apoplastic este menținut într-o stare redusă, condiție esențială pentru rezistența frunzelor la toxicitate (Liang și colab., 2006).

Si nu are un efect direct asupra reacției de tip Fenton, fapt demonstrat prin experimente in vitro în care Si a fost adăugat la soluția Mn2+/H2O2 fără a avea vreo influență asupra acesteia. De aceea, se consideră că Si intervine indirect, prin scăderea concentrației de Mn2+ liber din fluidul apoplastic și prin inhibarea activității enzimatice a guaiacol-POD, ce duce la scăderea speciilor reactive de oxigen generate de aceasta, acțiune ce are loc și in vitro (Maksimović și colab., 2012).

Contracararea efectului toxic al altor elemente

Mn nu este singurul element mineral a cărui toxicitate poate fi contracarată cu ajutorul Si. Efecte notabile s-au obținut și în cazul elementelor cunoscute ca fiind toxice în cantități mici, precum metalele grele, aluminiul și altele (Janislampi, 2012).

De exemplu, la frunzele plantelor de porumb tolerante la concentrații mari de aluminiu din sol, efectele toxice ale concentrațiilor mari din acest element au fost reduse semnificativ datorită siliciului care a permis formarea unor silicați de aluminiu greu solubili în frunze, depozitați în vacuolele frunzelor (Vázquez și colab., 1999).

Mecanismul de apărare al plantelor contra metalelor toxice, precum cuprul, nichel, zinc, crom și altele, are drept caracteristică de bază acumularea de prolină liberă odată cu formarea de depozite intracelulare ale metalelor respective. Același mecanism apare și în cazul algelor unicelulare Chlorella vulgaris. Însă unii autori consideră că prezența concentrațiilor mari de prolină este doar un simptom al toxicității metalelor și nu ar avea niciun rol în contracararea acesteia. Aceste metale induc peroxidarea lipidelor membranare și toate celelalte efecte derivate, specifice stresului oxidativ (Mehta și Gaur, 1999). Totuși, diverse studii au demonstrat că prolina are mai multe roluri în sistemul defensiv al plantei, printre care se numără menținerea echilibrului osmotic, chelatarea metalelor grele din citoplasmă, captarea radicalilor hidroxil și reducerea absorbției metalelor toxice. Mehta și Gaur (1999) au arătat efectul prolinei de protejare a membranelor celulare la C. vulgaris și de prevenire a pierderilor de K+ din celule.

Culturi de alge unicelulare – caracteristici, utilizări industriale

Algele verzi unicelulare reprezintă un material excelent pentru realizarea culturilor experimentale în laborator din două motive: se pot înmulți rapid, fiind astfel un material ușor de procurat și de utilizat tot timpul anului, iar faptul că ajung la o densitate mare (până la milioane de celule/ml) duce la eliminarea efectelor variațiilor individuale, aspect foarte important în experimentele de cercetare (Boldor și colab., 1983). Cele din genul Chlorella sunt cunoscute în mod special pentru capacitatea lor de a se înmulți rapid și într-o varietate destul de mare de condiții de mediu (Burlew, 1976).

În condiții naturale, algele cresc plutind în apa din bălți și lacuri, unde consumă dioxidul de carbon dizolvat la suprafața apei sau cel rezultat din descompunerea debriurilor organice. Nutrienții sunt în general în cantitate limitată, fiind factorul determinant al densității algale. Iar condițiile de luminozitate sunt variabile, putând ajunge până la valori de intensitate foarte mici (100 lux), care însă sunt tolerate de către alge.

Spre deosebire de aceste condiții, în laborator sau în cadrul culturilor la scară largă, algele sunt alimentate cu cantitatea maximă de nutrienți pe care o pot utiliza, singura condiție limitantă fiind luminozitatea (Burlew, 1976), deoarece dincolo de o anumită valoare a intensității luminoase, culturile algale nu mai prezintă modificări semnificative. Această valoare poate fi numită punctul de saturație luminoasă și se situează în jurul valorii de 72 μE m−2 s−1 (Gonçalves și colab., 2013).

Primele studii importante efectuate asupra culturilor de alge din genul Chlorella au avut drept scop studierea procesului de fotosinteză, datorită ușurinței de cultivare a acesteia în laborator. Apoi, în timpul războiului, se încerca izolarea unui compus antimicrobian din aceste organisme și s-a ajuns la concluzia că acest efect rezultă dintr-o serie complexă de fotooxidări ale acizilor grași nesaturați din interiorul celulelor de Chlorella, ce ar putea fi indusă și altor tipuri de acizi grași. Ulterior, s-au demarat studii amănunțite privind compoziția în substanțe organice și influența condițiilor de mediu asupra acestora, în vederea producției la scară largă (Burlew, 1976).

Există trei alternative de cultivare a microalgelor la scară largă, și anume: în iazuri, în fotobioreactoare sau în cadrul stațiilor de epurare a apelor uzate (Battah, 2014).

În cazul bioreactoarelor apare și problema contaminării, în special cu protozoare, ce poate avea efecte nefaste asupra culturii algale. În ceea ce privește bacteriile, s-a constatat că celulele de Chlorella produc un compus antimicrobian, denumit clorelină, ce menține populația bacteriană la un nivel scăzut (Burlew, 1976).

Ele pot fi cultivate, cu o eficiență mai mică, în bălți sau lacuri, deși procesul de recoltare este dificil (concentrația este sub 1%), iar alimentarea cu CO2 este precară. O variantă este chiar stimularea creșterii acestora, prin suplimentarea cu nutrienți, pentru a servi ca hrană pentru pești în cadrul crescătoriilor. O alternativă este reprezentată de culturile realizate în stațiile de epurare a apei, unde necesarul de nutrienți este asigurat de către bacteriile ce descompun resturile organice (Burlew, 1976).

La scară largă, culturile de Chlorella se utilizează în industria alimentară (inclusiv ca suplimente nutritive), cea farmaceutică și cosmetică(SharmaR. și colab., 2012) și în realizarea de biocombustibil de tip biodiesel, prin extragerea uleiurilor produse de celulele algale (Gonçalves și colab., 2013).

Există câteva avantaje pe care culturile de Chlorella le dețin în fața plantelor superioare. Unul dintre ele este faptul că microalgele se pot utiliza întregi drept sursă nutritivă, întrucât o proporție foarte mică este nedigerabilă, pe când de la plantele superioare se recoltează doar anumite părți, precum fructele sau rădăcina, în timp ce planta utilizează o mare parte din energia proprie în scopul dezvoltării vegetative. Pe de altă parte, culturile de alge absorb energia solară mult mai bine decât plantele crescute pe câmp, având în același timp toate condițiile necesare creșterii optime, întrucât acestea sunt mai ușor de controlat decât în cazul plantelor. Un alt avantaj este dat de conținutul algelor, dintre care 50% este reprezentat de proteine cu masă moleculară mică, ușor digerabile, ce sunt formate din 10 tipuri de aminoacizi esențiali (Burlew, 1976).

În plus, culturile de Chlorella au o valoare nutrițională crescută datorită conținutului ridicat în carotenoizi, lipide, polizaharide, vitamine, compuși imunostimulatori, antioxidanți și minerale. Diferite studii au arătat că, în funcție de condițiile de creștere, proporțiile dintre aceste substanțe diferă. Astfel, pentru producerea de biomasă în scop nutrițional, temperatura optimă este de 25-30˚C la lumina naturală dată de ferestrele dispuse spre nord, deoarece în aceste condiții se obține concentrația cea mai mare de clorofilă, carotenoizi, proteine și aminoacizi liberi (Sharma R. și colab., 2012).

În cadrul industriei farmaceutice, Chlorella vulgaris este apreciată și valorificată pentru conținutul crescut în carotenoizi, dintre care în cantități însemnate se găsesc astaxantina și canthaxantina și, prezente în cantități mai mici, luteină și β-caroten. Însă se utilizează și alte specii de microalge. De exemplu, Dunaliellasalina conține o cantitate mai mare de β-caroten față de C. vulgaris, ce poate fi utilizat drept supliment de pro-vitamină A, iar Botryococcus braunii, rasa A, produce alcadiene extracelulare ce pot substitui parafina și creara naturală utilizate în industria farmaceutică. De asemenea, această specie produce o cantitate substanțială de hidrocarburi, ajungând până la 85% din masa uscată, de aceea este propusă pentru obținerea de biocombustibil (Mendes și colab., 2003).

O altă utilizare a culturilor microalgale este în producerea de biodiesel. Acesta reprezintă un amestec de esteri ai acizilor grași cu catenă lungă, precum acizii oleic, stearic, lauric, palmitic etc. și poate fi obținut prin transesterificarea grăsimilor din diverse surse, cum sunt uleiurile vegetale, grăsimile animale, uleiurile provenind din microorganisme sau chiar uleiul ars. Avantajul acestui tip de combustibil este reprezentat de posibilitatea de regenerare, astfel încât poate reprezenta o alternativă la rezerva finită de combustibili fosili utilizată în prezent(Gonçalves și colab., 2013).

Totuși, obținerea de biodiesel din grăsimi utilizate în alimentație ar rezulta într-o competiție neproductivă între acestea și, eventual, în creșterea prețului amândurora. De aceea, utilizarea uleiurilor produse de culturile algale este o alternativă mult mai bună (Battah și colab., 2014).

Microalgele produc triacilgliceroli (TAG) pentru stocarea energiei. TAG sunt formați dintr-o moleculă de glicerol la care sunt cuplate trei resturi de acizi grași cu catenă lungă. TAG pot fi extrași cu ușurință din microalge și supuși apoi unei reacții de transesterificare, în timpul căreia glicerolul este înlocuit cu alcooli scurți, precum metanolul (Sharma K. și colab., 2012).

În condiții normale de cultivare a algelor, se obține o cantitate mare de biomasă, însă cu o concentrație lipidică mică (Sharma K. și colab., 2012).De aceea, în scopul producerii de biodiesel, algele sunt supuse unor condiții de creștere limitative, întrucât s-a demonstrat că astfel le crește conținutul lipidic. Dintre aceste condiții, cele mai eficiente sunt limitarea azotului, salinitatea crescută și prezența fierului în mediul nutritiv (Battah și colab., 2014).O alternativă la acestea este cultivarea algelor într-un sistem mixotrof (Liang și colab., 2009).

Limitarea azotului este cel mai eficientă la concentrația de 0.1mM NaNO3, la care dezvoltarea culturii este minimă, iar conținutul lipidic ajunge la valoarea cea mai ridicată, de aproximativ 55% din masa uscată după 12 zile de incubare. Azotul, fiind un element esențial pentru celulă, aceasta îl va păstra pentru sinteza moleculelor esențiale și va utiliza lipidele ca formă de stocare a energiei (Battah și colab., 2014). În plus, se consideră că acumularea rapidă a lipidelor duce la activarea diacilglicerol aciltransferazei care convertește acil-CoA în trigliceride și poate fi responsabilă pentru inhibarea diviziunii celulare în condiții de stres (Sukenik și Livne, 1991, citați de Battah și colab., 2014).

Nivelul de salinitate pentru care se obține concentrația cea mai mare de lipide, de aprox. 43%, se situează în jurul valorii de 0,45mM. În plus, în aceste condiții, Battah și colab. (2014) au constatat o creștere evidentă a procentului de acizi grași saturați, datorată sintezei de acid lignoceric (acid tetracosanoic) cu o pondere de 24% din conținutul total de lipide. Acesta este un acid gras cu catenă lungă, de 24 de atomi de carbon, care nu apare în celulă în condiții normale de creștere.

Întrucât conținutul lipidic se consideră a fi invers proporțional cu dezvoltarea culturilor algale, efectul salinității crescute poate fi pus pe seama inhibării parțiale a diviziunii celulare și a osmolarității crescute a mediului extracelular, ce obligă celulele să producă substanțe ce vor preveni pierderile de apă. Lipidele produse au rolul de a crește vâscozitatea membranei celulare și de a mări presiunea de turgescență a celulelor în condiții hipertonice. Astfel, în condiții de salinitate crescută, metabolismul celular se axează pe producerea compușilor osmoreglatori, în detrimentul altor constituenți celulari, pentru a menține presiunea osmotică din interiorul celulei la o valoare mai mare decât cea a mediului extracelular (Battah și colab., 2014).

Iar prezența sulfatului de fier în concentrație de 35.25 μM duce la rezultate asemănătoare celor date de salinitatea crescută (conținut lipidic de aprox. 35%). Fierul este un microelement esențial în metabolismul algelor, fiind implicat în reacții enzimatice fundamentale, în fotosinteză, făcând parte din fotosistemul II și în metabolizarea azotului și sinteza clorofilei. Însă excesul de fier poate duce la formarea speciilor reactive de oxigen. De aceea, atât deficiența, cât și excesul acestuia afectează puternic metabolismul microalgelor, ducând la scăderea eficienței fotosintetice și la reducerea ratei de diviziune (Battah și colab., 2014).

Cultivarea într-un sistem mixotrof se bazează pe faptul că Chlorella sp. se poate hrăni și cu substanțele organice prezente în mediul de cultură. Liang și colab. (2009) au obținut cele mai bune rezultate utilizând glucoză 1% sau glicerol.

Sistemul mixotrof prezintă un avantaj evident față de cel autotrof în ceea ce privește producția de lipide, rezultând o producție de 14 ori mai mare comparată cu cea obținută prin limitarea cantității de azot (Liang și colab., 2009). Deși cultivarea microalgelor în condiții de deficiență în azot sau de salinitate crescută duce la creșterea concentrației lipidice celulare de la 20-30% până la 60-70%, totuși se produce o scădere dramatică a ratei de dezvoltare a culturilor, rezultând o productivitate lipidică totală aproape neschimbată (Benemann și Oswald, 1996; Chisti, 2007, citați de Liang și colab., 2009). Au fost testate diverse variante ale sistemului mixotrof, printre care adăugarea de glucoză, glicerol sau acetat, în prezența sau absența luminii. Însă cele mai eficiente s-au dovedit cele care utilizează glucoză sau glicerol concomitent cu menținerea algelor în condiții de luminozitate normală. Pe de altă parte, concentrațiile crescute de substanțe organice au dovedit un efect inhibitor asupra creșterii algelor (Liang și colab., 2009). În aceste condiții, producția de lipide a ajuns la 54mg

La unele diatomee marine, Schenk și colab. (2008) au remarcat că excesul de NaCl din mediu nu produce modificări substanțiale în producția intracelulară de lipide, și au atribuit acest efect prezenței în exces a siliciului, care contracarează influența inhibitorie a NaCl. Cultivate într-un mediu deficient în siliciu și în prezența clorurii de sodiu, diatomeele au răspuns stresului printr-o producție lipidică de până la 73%. În schimb, prezența unei concentrații scăzute de NaCl sau de Si a dus la acumulări lipidice de până la 50% la varietățile de diatomee oleaginoase studiate. Aceste rezultate sugerează o interacțiune între metabolismul Si și prezența NaCl în celula algală (Schenk și colab., 2008).

Studiul impactului bibliografic al subiectului ales

Analiza impactului bibliografic pentru subiectul ales a fost efectuată cu ajutorul instrumentelor oferite de „site”-ul Thompson Reuters Web of Science.

După cum era de așteptat, între anii 1950 – 2015 au fost foarte multe articole indexate ISI (5239) referitoare la siliciu și diatomee, iar numărul citărilor pentru aceste articole depășește 71000 (Figura 5).

În schimb, căutarea pentru combinația de cuvinte cheie „Chlorella”, „silica” și „saline stress” nu a produs nici un rezultat (Figura 6). Acest fapt poate fi interpretat ca o posibilă identificare a unei posibile „pete albe” pe harta cunoașterii acestui subiect. De altfel și numărul de articole ISI care au ca subiect adaptarea la stresul salin la Chlorella este limitat la opt din care două au fost indexate pe parcursul elaborării acestei lucrări (Figura 7). Numărul de citări pentru aceste articole a început să crească vizibil (47 din totalul de 52 de citări) după anul 2010, fapt care denotă o creștere a interesului pentru acest subiect. Acest interes poate fi explicat, cel puțin parțial prin apariția articolelor despre obținerea unei noi generații de biocombustibil din microalge (Schenk și colab., 2008).

Figura 5 Numărul de articole ISI publicate,regăsite cu criteriul "TOPIC: (Diatom) AND TOPIC: (silica) NOT TOPIC: (silicagel).

Figura 6 Rezultatul interogării bazei de date Thompson Reuters Web of Science pentru cuvintele cheie „Chlorella”, „silica” și „salt stress”.

Figura 7Rezultatul interogării bazei de date Thompson Reuters Web of Science pentru cuvintele cheie „Chlorella”, și „saline stress”.

Atunci când la aceste cuvinte cheie se adaugă și termenul „siliciu” nu a fost regăsit nici un articol (Figura 9), fapt care denotă un câmp de cercetare insuficient de bine cercetat la acest grup sistematic. La plantele superioare aceste studii au fost găsite17 articole ISI privitoare la rolul siliciului asupra toxicității provocate de manganîncepând cu anul 1998. Citările acestor articole au avut un trend ascendent începând cu anul 2005 și au ajuns să totalizeze 502 citări spre mijlocul anului 2015 (Figura 10).

Figura 8Rezultatul interogării bazei de date Thompson Reuters Web of Science pentru cuvintele cheie „Chlorella”, și „manganese toxicity”.

Figura 9 Rezultatul interogării bazei de date Thompson Reuters Web of Science pentru cuvintele cheie „Chlorella”, „manganese toxicity” și „silica”.

Figura 10Rezultatul interogării bazei de date Thompson Reuters Web of Science pentru cuvintele cheie „plants”, „manganese toxicity” și „silica”.

PARTEA PRACTICĂ

Materiale și metode

Pentru realizarea culturilor de Chlorella s-a procedat conform cu metoda descrisă de Boldor și colab. (1983). Pentru cultivarea acestor alge este necesară asigurarea unor condiții specifice de iluminare, aprovizionare cu CO2 și cu elemente minerale.

Astfel, algele au fost cultivate în recipiente transparente cu capacitatea de 2 litri, în care am plasat câte 400 ml de mediu de cultură Arnon și 100 ml de apă distilată (pentru martori) sau soluție de testat (pentru probe). Acest mediu a fost ales pentru că este bogat în nutrienți, incluzând microelemente necesare algelor și conține azot sub mai multe forme (NH4+, NO3- și uree), ceea ce îl face mai ușor de asimilat de către celule.

Tabelul 1Compoziția mediului Arnon (Boldor și colab., 1983)

Rețeta mediului Arnon pentru alge verzi unicelulare a cuprins o soluție care a furnizat macroelementele necesare (999,5 ml/l) și o soluție de microelemente (0,5 ml/l). Compoziția celor două soluții sunt prezentate în Eroare! Fără sursă de referință..

Pentru a asigura aerarea mediului de cultură și implicit cantitatea de CO2 necesară pentru fotosinteză, s-a barbotat aer în mediul de cultură, utilizând tuburi de sticlă conectate la o pompă de acvariu prin intermediul unor furtunuri din cauciuc (Figura 11). Capătul deschis al acestor tuburi ajunge la baza cilindrilor de sticlă, antrenând totodată suspensia celulară, astfel încât condițiile de aerare și iluminare să fie aproximativ omogene în interiorul cilindrilor, evitându-se depunerea algelor pe fundul vasului. Cilindrii au fost acoperiți cu capace din material plastic pentru a evita pătrunderea corpurilor străine în interiorul acestora.

Figura 11 Schema instalației pentru cultivarea algelor

Pentru a asigura lumina necesară, s-a utilizat o baterie de tuburi fluorescente poziționate la aprox. 20 cm distanță de cilindrii de plastic de unică folosință, rezultând o iluminare de aprox. 10 000 lucși (Figura 12).

Figura 12 Instalația de creștere a algelor iluminată lateral

Temperatura de cultivare a fost monitorizată folosind un termometru plasat lângă baza vaselor de cultură.

Însămânțarea s-a realizat cu un anumit volum de suspensie algală pregătită în prealabil. Volumul exact a fost calculat în funcție de densitatea suspensiei inițiale, astfel încât în fiecare vas de cultură să se pornească de la 100 000 celule/ml, adică 50 de milioane de celule pe vas. Densitatea inițială a fost determinată folosind hemocitometrul Thoma, cu ajutorul căruia, în urma mai multor determinări, s-a făcut o aproximare statistică a numărului de celule algale dintr-un mililitru de suspensie.

După însămânțare, s-a monitorizat intensitatea dezvoltării culturilor algale prin citirea la spectrofotometru (CECIL 1020) a absorbanței soluțiilor la lungimea de undă de 676 nm, ce corespunde maximului de absorbție în cazul acestor culturi (Figura 13).

Figura 13 Spectrofotometru CECIL 1020

Acest studiua fost subdivizat în patru experiențe, fiecare experiență cuprinzând una sau două serii de câte 10 – 12 recipiente, pentru fiecare serie existând câte un martor și patru probe, în duplicat, exceptând primul experiment de orientare. Fiecare serie a fost monitorizată, în medie, timp de două săptămâni (Figura 14).

Figura 14 Culturi de Chlorella în a doua săptămână de creștere

Astfel, primul grup de experimente a vizat determinarea concentrației limită de NaCl capabilă să inhibe semnificativ creșterea algelor.Concentrațiile utilizate în cadrul experimentului nr. 1 sunt indicate în Tabelul 2.

În al doilea grup de experimente s-a urmărit dezvoltarea algelor în prezența simultană a clorurii de sodiu și a silicatului de sodiu. Concentrațiile utilizate în cadrul experimentului nr. 2 sunt indicate înTabelul 3. Datorită faptului că în condițiile de temperatură mai ridicată cu aprox. 3°C în care s-au desfășurat aceste experiențe, concentrația de 0,3 M NaCl a avut un efect inhibitor prea mare, s-au folosit datele din experiența nr. 1 pentru a estima o nouă concentrație care să reducă creșterea algală la 75% din valoarea martorului. Această concentrație de NaCl (0,28 M) împreună cu dozele reduse de siliciu sugerate de experiența nr. 2 au fost folosite în experiența nr. 3 (Tabelul 4)

Al patrulea grup de experimente a avut în vedere studierea efectului inhibitor al excesului de mangan. Datorită adaptabilității celulelor algale, au fost necesare, ca și în cazul testării efectului concentrațiilor de NaCl, mai multe serii experimentale, în care s-au testat concentrații crescânde de clorură de mangan.

În a patra grupă de experimente s-a testat efectul adăugării siliciului alături de mangan.

Tabelul 2 Compoziția mediilor de cultură din experiența nr 1.

Tabelul 3Compoziția mediilor de cultură din experiența nr 2.

Tabelul 4 Compoziția mediilor de cultură din experiența nr 3.

Elemente de statistică folosite în interpretarea rezultatelor experimentale

Pentru interpretarea statistică a rezultatelor experimentale s-au folosit abaterile standard, calculul regresiilor și analiza varianței.

Abaterea standard () a fost calculată cu ajutorul formulei:

unde

(media aritmetică);

N este numărul de repetiții;

i este un index pentru repetiția curentă și care variază de la 1 la N;

xi reprezintă valoarea pentru repetiția curentă.

Acest indicator (Sokal și Rohlf, 1969) a fost folosit pentru examinarea rapidă a diferențelor dintre variantele experimentale prin reprezentarea sub formă de bare de eroare. Atunci când barele respective de eroare nu se suprapun se poate proceda mai departe la analiza varianței. Pentru calcularea efectivă s-a folosit formula STDEV( x , y ) din foile de calcul MS Excel.

Prelucrările pentru calcularea coeficienților pentru regresiile liniare și pătratice, analiza simplă și dublă a varianței cu repetiții au fost efectuate utilizând funcțiile specifice din foile de calcul EXCEL și din programul de completare (“add- in”) specific (“Data analysis”). Ocazional pentru una dintre regresii s-au calculat și intervalele de confidență (CI) și de predicție (PI).

Rezultate și discuții

Folosirea absorbanței pentru monitorizarea creșterii algale este justificată de corelația foarte bună dintre absorbanță și numărul de celule algale pe mililitru de mediu (determinat cu ajutorul camerei Thoma) la diferite concentrații de clorură de sodiu și la diferite zile după începerea experienței (Figura 15).

Figura 15 Relația dintre absorbanță și numărul de celule algale pe ml

Experiența nr. 1 (determinarea concentrației de NaCl care inhibă creșterea algală cu 25%)

Din primele tatonări efectuate s-a observat că soluțiile de clorură de sodiu cu o concentrație mai mică sau egală cu 0,25 moli/litru nu au indus o dinamică a absorbanței culturii diferită de martor.

Figura 16 Dinamica absorbanței culturilor de Chlorella crescute în medii cu diferite concentrații de clorură de sodiu.

În cazul concentrațiilor de 0,3 moli/litru, 0,35 moli/litru și 0,4 moli/litru s-au înregistrat o scăderi ale absorbanței comparativ cu martorul. Aceste ultime trei concentrații au determinat o reducere mai accentuată a ritmului de creștere din ziua a 8-a de experimentare. Pentru continuarea experiențelor s-a decis producerea unui stres salin cu o concentrație de 0.28 M NaCl. Această concentrație a produs o reducere a mediei absorbanței de la ultimele trei date de observație (ziua a 8-a, a 12-a și a14-a) la 75% din valoarea martorului. Această recalculare s-a efectuat după ce experiența numărul 2 a arătat că la temperaturile mai mari de 25°C efectul inhibitor al concentrației de 0,3 moli NaCl/litru este prea drastic.

Rezultatele din această experiență de tatonare sunt în concordanță cu efectul stimulator manifestat de concentrațiile de clorură de sodiu 0,1 și 0,2 M asupra conținutului în clorofilă, -caroten și proteine la Chlorella vulgaris, iar concentrațiile mai mari de 0,3 M de NaCl au diminuat concentrațiile de acestor compuși în timp ce concentrația prolinei (un aminoacid a cărui concentrație se mărește în diferite tipuri de stres) a crescut odată cu cele de clorură de sodiu (Hiremath și Mathad, 2010).Semnificația ecologică a adaptabilității celulelor de Chlorella la concentrații de clorură de sodiu de până la 0,2 moli/litru constă în satisfacerea unei exigențe fiziologice majore pentru supraviețuirea în apele salmastre din estuare sau lacuri care își măresc (temporar) concentrația salină (de exemplu prin evaporare în sezonul cald). Din punct de vedere practic această constatare indică posibilitatea de a dilua cu apă de mare, în proporție de până la 50%, mediul de cultură folosit în viitoarele instalații industriale pentru culturile de Chlorellași în special în scopul obținerii de biodiesel (Battah și colab., 2014).

Experiența numărul 1 s-a desfășurat la o temperatură medie de aprox. 25°C.

Figura 17 Relația dintre concentrația de clorură de sodiu și media absorbanței de la ultimele trei date de observație (ziua a 8-a, a 12-a și a14-a) și identificarea grafică a concentrației de NaCl care reduce la 75% din valoarea martorului creșterea culturilor de Chlorella la 25°C.

Experiența nr. 2 (testarea preliminară a capacității concentrațiilor 0,2 și 0,4 mM de silicat de sodiu de a anula efectul inhibitor al concentrației de 0,3 M NaCl)

A doua grupă de experiențe a vizat testarea capacității de reducere/compensare a efectului inhibitor al creșterii indus de concentrația de clorură de sodiu 0,3 M prin introducerea în cultură a două soluții de silicat de sodiu cu concentrațiile de 0,2 și 0,4 mM.Experiența numărul 2 s-a desfășurat la o temperatură medie de aprox. 28°C, cu trei grade Celsius mai mult decât în experiența precedentă.

Concentrația de 0,2 mM silicat de sodiu a avut un efect stimulator asupra creșterii algale (Figura 18).

Figura 18 Dinamica absorbanței culturilor de Chlorella crescute în medii cu diferite concentrații de clorură de sodiu (0 sau 0,3 M/l) și/sau silicat de sodiu (0, 0,2 sau 0,4 mM).

Tabelul 5 Analiza simplă a varianței pentru compararea cu varianta martor a extincției medii din zilele 8-14 de la concentrației de 0,2 mM Na2SiO3

Experiența nr. 3 (evidențierea capacității silicatului de sodiu de a anula efectul concentrației de NaCl care inhibă creșterea algală cu 25%)

A treia grupă de experiențe a vizat testarea capacității de reducere/compensare a efectului inhibitor al creșterii indus de concentrația de clorurii de sodiu 0,28 M prin introducerea în cultură a două soluții de silicat de sodiu.

Figura 19Dinamica absorbanței culturilor de Chlorella crescute în medii cu diferite concentrații de clorură de sodiu (0 sau 0,28 M) și/sau silicat de sodiu (0; 0,1 sau 0,2 mM).

Experiența numărul 3 s-a desfășurat la o temperatură medie de aprox. 28°C, cu trei grade Celsius mai mult decât în experiența numărul 1.

Cele două concentrații testate de silicat de sodiu (Figura 19) au avut un efect stimulator asupra creșterii algelor. Barele de eroare, reprezentând câte o abatere standard scăzută sau adăugate la valoarea mediei, sugerează o diferențiere clară față de valoarea martorului începând cu a 9-a zi de experiență. Analiza simplă a varianței a indicat o probabilitate (P) de 13.7% ca diferența dintre mediile absorbanțelor din a doua săptămână de experimentare (zilele de experiență 9, 11, 14, 16 și 17) pentru varianta martor și mediile similare pentru varianta cu concentrația de 0,1 mM Na2SiO3 să fie acceptată în mod eronat (Tabelul 5). Deși varianta cu concentrația de 0,1 mM Na2SiO3nu a avut o dinamică semnificativ diferită față de cea a variantei cu concentrația de 0,2 mM Na2SiO3, pentru această ultimă concentrație, există o probabilitatea (P) mai scăzută (7,8%) ca diferența față de martor să fie considerată adevărată în mod eronat (Tabelul 6).

Oricum, diferențele găsite îndreptățesctotuși concluzia că mediul Arnon ar putea fi îmbunătățit pentru creșterea intensivă a celulelor de Chlorella prin adăugarea de silicat de sodiu în concentrație de 0,1 mM sau 0,2mM.

Tabelul 6 Analiza simplă a varianței pentru compararea cu varianta martor a extincției medii din zilele 9-17 de la concentrației de 0,1 M Na2SiO3

Pentru ultimajumătate a experienței (zilele de experiență 9, 11 14, 16 și 17), diferențele față de martor pentru varianta fără silicat de sodiu și cu clorură de sodiu (0,28 M NaCl) au fost foarte semnificative. Trebuie subliniat faptul că efectul concentraților saline este mult mai drasticdecât cel obținut în experiența numărul 1. Acest lucru a fost confirmat de o serie experimentală în care s-a folosit o concentrație de clorură de sodiu de 0,3 M.

Tabelul 7 Analiza simplă a varianței pentru compararea cu varianta martor a extincției medii din zilele 9-17 de la concentrației de 0,002 M Na2SiO3

Tabelul 8 Analiza simplă a varianței pentru compararea cu varianta martor a extincției medii din zilele 16-17 de la concentrației de 0,001 M Na2SiO3

Se remarcă valorile inițiale foarte crescute pentru cele două variante combinate („1,50 M MnCl2 + 0.1 mM Na2SiO3” și„1,50 M MnCl2+ 0,2 mM Na2SiO3”) (Figura 20). Această situație a fost vizibilă cu ochiul liber.

Figura 20Dinamica absorbanței culturilor de Chlorella crescute în mediu Arnon suplimentatsau nu cu clorură de mangan (1,5 M) și/sau diferite concentrații silicat de sodiu (0; 0,1 sau 0,2 mM) – valori observate.

Figura 21 Fotografie de la începutul experienței numărul 5.

Figura 22Dinamica absorbanței culturilor de Chlorella crescute în mediu Arnon suplimentatsau nu cu clorură de mangan (1,5 M) și/sau diferite concentrații silicat de sodiu (0; 0,1 sau 0,2 mM) – valorile pentru variantele „1,50 M MnCl2 + 0.1 mM Na2SiO3” și„1,50 M MnCl2 + 0,2 mM Na2SiO3” sunt diminuate cu valorile absorbanțelor inițiale.

CONCLUZII

Concentrația de 0.28 M/l NaCl a produs, la o temperatură medie de 25°C, în a doua săptămână de cultură o reducere a creșterii numărului de celule de Chlorella la 75% din valoarea martorului;

Studiul efectelor salinității asupra creșterii algelor trebuie să fie studiat în corelație cu temperatura mediului algal;

Mediul Arnon ar putea fi îmbunătățit pentru creșterea intensivă a celulelor de Chlorella prin adăugarea de silicat de siliciu în concentrație de 0,001 M/l sau 0,002 M/l.

;

BIBLIOGRAFIE

Abou-Baker N.H., Abd-Eladl M., Abbas M.M., 2011,Use of silicate and different cultivation practices in alleviating salt stress effect on bean plants, Aust.J. Basic & Appl. Sci.,5(9): 769-781.

Battah M.G., El-Ayoty Y.M., Esmael A.E., Abd El-Ghany S.E., 2014, Effect of different concentrations of sodium nitrate, sodium chloride, and ferrous sulphate on the growth and lipid content of Chlorella vulgaris, J. Agr. Sci. Tech.10(2): 339-353.

Boldor O., Raianu O., Trifu M., 1983, Fiziologia plantelor, lucrări practice, Editura Didactică și Pedagogică, București.

Burlew J.S., 1976, Algal culture from laboratory to pilot plant, Carnegie Institution of Washington Publication600, Washington D.C., p12, 13

Cai, K., Gao, D., Luo, S., Zeng, R., Yang, J., Zhu, X., 2008. Physiological and cytological mechanisms of silicon‐induced resistance in rice against blast disease.Physiologia Plantarum, 134(2), 324-333

Chérif M., Asselin A., Bélanger R.R., 1994, Defence responses induced by soluble silicon in cucumber roots infected byPythiumspp., Phytopathology 84(3): 236-242.

Currie H.A., Perry C.C., 2007, Silica in plants: biological, biochemical and chemical studies, Ann. Bot. 100: 1383-1389.

Corrales, I., Poschenrieder, C., Barceló, J. 1997. Influence of silicon pretreatment on aluminium toxicity in maize roots. Plant and Soil, 190(2), 203-209.

Epstein, E. 1994. The anomaly of silicon in plant biology. Proceedings of the National Academy of Sciences,91(1), 11-17.

Erlindo C., Angcoy Jr., 2006, An experiment on monomeric and polymeric silica precipitation rates from supersaturated solutions, Grensásvegur 9, Number 5 IS-108.

Garbuzov M., Reidinger S., Hartley E.S., 2011, Interactive effects of plant-available soil silicon and herbivory on competition between two grass species, Ann. Bot.108: 1355–1363.

Gonçalves A.L., Pires J.C.M., Simoes M., 2013, Lipid production ofChlorella vulgarisand Pseudokirchneriella subcapitata, Int. j. renew. energy environ. eng. 4:14.

Fleck A.T., Nye T., Repenning C., Stahl F., Zahn M., Schenk M.K., 2010, Silicon enhances suberization and lignification in roots of rice (Oryza sativa), J. Exp. Bot.62(6): 2001-2011.

Hiremath, S., Mathad, P. 2010. Impact of salinity on the physiological and biochemical traits of Chlorella vulgaris Beijerinck. J Algal Biomass Utln, 1, 51-59.

Horst, W. J., Marschner, H. 1978. Effect of silicon on manganese tolerance of bean plants (Phaseolus vulgaris L.). Plant and Soil, 50(1-3), 287-303.

Janislampi K.W., 2012, Effect of silicon on plant growth and drought stress tolerance, All Graduate Theses and Dissertations, 1360, http://digitalcommons.usu.edu/etd/1360.

Kidd, P. S., Llugany, M., Poschenrieder, C. H., Gunse, B., Barcelo, J. 2001. The role of root exudates in aluminium resistance and silicon‐induced amelioration of aluminium toxicity in three varieties of maize (Zea mays L.). Journal of Experimental Botany, 52(359), 1339-1352.

Ma J.F., 2009,Silicon uptake and translocation in plants, The Proceedings of the International Plant Nutrition ColloquiumXVI. UC Davis: Department of Plant Sciences, UC Davis. Retrieved from: https://escholarship.org/uc/item/3pq8p5p0

Mayland, H. F., Wright, J. L., Sojka, R. E. 1991. Silicon accumulation and water uptake by wheat. Plant and soil, 137(2), 191-199.

Maksimović J.D.,MojovićM., Maksimović V., Römheld V., Nikolic M., 2012, Silicon ameliorates manganese toxicity in cucumber by decreasing hydroxyl radical accumulation in the leaf apoplast, J. Exp. Bot.1-10, doi:10.1093/jxb/err359.

Marschner, H. 1995. Functions of mineral nutrients: macronutrients. Mineral nutrition of higher plants, 2, 379-396.

Mehta S.K., Gaur J.P., 1999, Heavy-metal-induced proline accumulation and its role in ameliorating metal toxicity in Chlorella vulgaris, New Phytol. 143, 253–259 .

Mendes R.L., Nobre B.P., Cardoso M.T., Pereira A.P., Palavra A.F., 2003, Supercritical carbon dioxide extraction of compounds with pharmaceutical importance from microalgae, Inorg. Chim. Acta. 356, 328-334.

Mitani N., Ma J.F., 2005,Uptake system of silicon in different plant species, J. Exp. Bot.56(414): 1255-1261.

Mohammed M.M., Mohammad A.A., Mohammad K.M., Mohammad N.M., 2013, Homology modelling and microarray analysis of silicon transporter protein in rice, barley and maize, Can. Chem. Trans.,1 (4): 326-337.

Moussa H.R., 2006, Influence of exogenous application of silicon on physiological response of salt-stressed maize (Zea mays L.),Int. J. Agri. Biol.8(2): 293-297.

Perry, C. C. 2009. An Overview of Silica in Biology: Its Chemistry and Recent Technological Advances. Biosilica in Evolution, Morphogenesis, and Nanobiotechnology, pp. 295-313, Springer Berlin Heidelberg.

Schenk, P. M., Thomas-Hall, S. R., Stephens, E., Marx, U. C., Mussgnug, J. H., Posten, C., Hankamer, B. 2008. Second generation biofuels: high-efficiency microalgae for biodiesel production. Bioenergy research, 1(1), 20-43.

Sevengor S., Yasar F., Kusvuran S., Ellialtioglu S., 2011, The effect of salt stress on growth, chlorophyll content, lipid peroxidation and antioxidative enzymes of pumpkin seedling, Afr. J. Agric. Res.6(21): 4920-4924.

Shakoor S. A., 2014, Silicon to silica bodies and their potential roles: An overview, Int. J. Agr. Sci.4 (2): 111-120.

Sharma K.K., Schuhmann H., Schenk P., 2012, High lipid induction in microalgae for biodiesel production, Energies5: 1532-1553.

Sharma R., Singh G.P., Sharma V.K., 2012, Effects of culture conditions on growth and biochemical profile ofChlorella vulgaris, J. Plant Pathol. Microb. 3:5.

Sokal, R. R., Rohlf, F. J. 1969. The principles and practice of statistics in biological research. San Francisco WH Freeman and company.

Vázquez M.D., Poschenrieder C., Corrales I., Barceló J., 1999, Change in apoplastic aluminum during the initial growth response to aluminum by roots of a tolerant maize variety, Plant Physiol.11,: 435–444.

Wang, Y., Stass, A., Horst, W. J. 2004. Apoplastic binding of aluminum is involved in silicon-induced amelioration of aluminum toxicity in maize. Plant physiology, 136 (3), 3762-3770.

Zhang J., Lu H., Wu N., Yang X., Diao X., 2011, Phytolith analysis for differentiating between Foxtail Millet (Setaria italica) and Green Foxtail (Setaria viridis), PLoS ONE 6(5): e19726. doi:10.1371/journal.pone.0019726

*** http://thomsonreuters.com/en.html

https://en.wikipedia.org/wiki/Silicic_acid