Influenta Uleiului Esential de Ocimum Basilicum Var. Purpurascens Asupra Statusului Oxidativ al Unui Model Animal de Dementa

BIBLIOGRAFIE

1. Àlvarez M. R., Meléndez L. A., Cosío S., M.R., 2012. Procedemientos para la extraccion de aceites esenciales en plantas aromaticas. [NUME_REDACTAT] de Investigaciones Biológicas des Noroeste, México, pag.4.

2. Behl C, Davis J, Lesley R, Schubert D (1994) Hydrogen peroxide mediates amyloid beta protein toxicity. Cell 77:817-827.

3. Bozin, B., Mimica-Dukic, N., Simin, N., Anackov, G., 2006. Characterization of the volatile composition of essential oils of some Lamiaceae spices and the antimicrobial and antioxidant activities of the antire oils. Journal of Agricultultural and [NUME_REDACTAT]. 54 (5): 1822-1828.

4. Butterfield D. A., 1996. Alzheimer's disease: a disoder of oxidative stress. Alzheimer's Disease. Review, 1:68-70.

5. Butterfield D. A., Martin L., Carney J. M., Hensley K. 1996. Aβ (25—52) peptide displays H2O2 like reactivity towards aque-ous Fe2+ nitroxide spin probes, and synaptosomal membrane proteins. [NUME_REDACTAT] 58, 217-228.

6. Ciobîcă, A.S., 2007. Aspecte neurofiziologice ale proceselor de memorare ṣi învăṭare. Interacṭiunea unor receptori colinergici cu unii receptori catecolaminergici în procesele cognitive. vol. 3. Editura „Universităṭii [NUME_REDACTAT] Cuza”, Iaṣi , pag. 33-39.

7. Chauchan, V., Chauchan, A., 2006. Oxidative stress in Alzheimer's disease. Pathophysiology, 13, 195-208.

8. Chauchan, V., Chauchan, A., 2006. Oxidative stress in Alzheimer's disease. Pathophysiology, 13, 195-208.

9. Cardoso-Ugarte G.A., Sosa- Morales M.E., 2012. Propriedades del aceite esencial de albahaca (Ocimum basilicum L.) y sus aplicaciones en alimentos. Temas selectos de Ingineria de alimentos 6-1: 54-65.

9. Edris, E., 2007. Pharmaceutical and therapeutic potentials of essential oils and their individual volatile constituient. [NUME_REDACTAT]. 21, 308-323.

10. European pharmacopoenia, 5, 2005.

11. Fukuzawa K, Tokumura A (1976) Glutathione peroxidase activity in tissues of vitamin E-deficient mice. J [NUME_REDACTAT] Vitaminol 22:405-407

11. Gheorghe, M. D., Marinescu., 2005. [NUME_REDACTAT] – Baze etiopatogenice, clinice ṣi terapeutice. [NUME_REDACTAT] Universitară, Bucureṣti, pag. 29-52.

12. Guṣuleag, M., SăvulescuT., 2003. Labiatae

13. Greabu M., Biochimia cavităṭii orale 2001. [NUME_REDACTAT] pag. 132.

14. Haorab H., 2007 . Oxidative stress activates protein tyrosin kinase and matrix metalloproteinases leadinng to blood-barrier dysfunction. J. Neurochem, 101 (2), 566-576

15. Hriṭcu, L., Clicinschi M., Nabeshima T., 2007. Brain serotonin depletion impairs short-term memory, but not long-term memory in rats. Physiology & Behavior, 91 (5), pp. 652-657, 2007.

16. Ijaz, A., F., Hussain, S., Przbylski, R., 2008. Chemical composition, antioxdant and antimicrobial activities of basil (Ocimum basilicum) essential oils depends on seasonal variations. [NUME_REDACTAT]. 108:986-995.

17. Ianusevici, V., 2008. Demenṭa Alzheimer – ghid prin labirintul comunicării. [NUME_REDACTAT], Bucureṣti, pag. 15-35.

18. Jayasinghe, C., Gotoh, N., Aoki. T. Wada, S., 2003. Phenolics composition of sweet basil (Ocimum basilicum L.). Journal of Agriculture and [NUME_REDACTAT]. 51(15) :4442-4449.

19. Jhoo JH, Kim HC, Nabeshima T, Yamada K, Shin EJ, Jhoo WK, Kim W, Kang KS, Jo SA, Woo JI (2004) Beta-amyloid (1-42)-induced learning and memory deficits in mice: involvement of oxidative burdens in the hippocampus and cerebral cortex. [NUME_REDACTAT] Res 155:185-196

19. Kintzios S., Makri O., Panagiotopulos E., Scapeti M., 2003. In vitro rosmarinic acid accumulation in sweet basil (Ocimum basilicum L.), [NUME_REDACTAT], 25:405

20. Labra, M., Miele., Ledda, B., Grassi, F., Mazzei, M. Sala, F. 2004. Morphological characterization, essential oil composition and DNA genotyping of Ocimum basilicum L., cultivars. [NUME_REDACTAT]. 167 (4): 725-731.

21. Lis-Balchin, M., 2002. Lavender. The genus Lavandula. Taylor & [NUME_REDACTAT], pag. 1-194.

22. Lyras L, Cairns N, Jenner A, Jenner P, Halliwell B (1997) An assessment of oxidative damage to proteins, lipids, and DNA in brain from patients with Alzheimer’s disease. J Neurochem 68:2061-2069.

22. Miguel, G., 2010. Antioxidant and [NUME_REDACTAT] of [NUME_REDACTAT]. Molecules, 15, 9252-9287

23. Mohandas, E., V., Raughunath, B., 2009. Neurobiology of Alzheimer's disease. [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT], 51, 55-61.

24. Marotti M., Piccaglia R., Giovaneli E., 1996. Differences in essential oil composition of basil (Ocimum basilicum L.) Italian cultivars related to morphological characteristics J. Arig. [NUME_REDACTAT]. 44: 3926-3929

25. Oliver CN, Ahn BW, Moerman EJ, Goldstein S, Stadtman ER (1987) Age-related changes in oxidized proteins. J [NUME_REDACTAT] 262 (12):5488-5491

25. Panaitescu, R., 2005. Probleme de memorie ṣi boala Alzheimer. [NUME_REDACTAT] Doamnei, Piatra-Neamṭ, pag. 32-40.

26. Paton, J. A., 2000. Journal of Ecology. vol. 88, pag. 182.

26. Politeo, O., Jukic, M., Milos, M., 2007. Chemical composition and antioxidant capacity of free volatile aglycones from basil (Ocimum basilicum L.) compared with its essential oil, [NUME_REDACTAT]. 101 (1): 379-385.

28. Praticò D, Uryu K, Leight S, Trojanoswki JQ, Lee VM-Y (2001) Increased lipid peroxidation precedes amyloid plaque formation in an animal model of Alzheimer amyloidosis. J Neurosci 21 (12):4183-4187

28. Pushpangadan P., Bradu B. L., 1995 . Basil. Advances in Horticulture, Medicinal and [NUME_REDACTAT], vol. 2. Eds. Dr. K.L. Chadha &Dr. [NUME_REDACTAT] pp. 627-657

29. Rattanachaikeensopon, P., Phumkhachoru P., 2012. Antimicrobial activity of basil (Ocimum basilicum L.) oil against Salmonela enteridis in vitro and in food. Bioscience, Biotechnologycal and Biochemistry. 74 (6): 1200-1204.

30. Rubiolo, P., Sgorbini, B., Liberto, E., Cordero, C., Bicchi, C., 2010. Essential oils and volatiles :sample preparation and analysis. Flavour and [NUME_REDACTAT] 25, 282-290.

31. Ryding, O. 1994. Notes on the sweet basil and its wild reletives (Lamiaceae). [NUME_REDACTAT] 48: 65-67.

32. Simion, J., Morales, M., Phippen, W., Fontes, R., Hao, Z., 1999. Basil: A source of aroma compounds and popular culinary and ornamental herb, Perspectives on new crops and new uses. 16 (45) :499-505

34. Sinha AK (1972) Colorimetric assay of catalase. [NUME_REDACTAT] 47:389-394

33. Sharma M., Gupta Y.K., Chronic treatment with trans resveratrol prevents intracerebroventricular streptozotocin induced cognitive impairment and oxidative stress in rats, [NUME_REDACTAT]., 2002, 71, 2489-2498.

34. Stadtman E (1992) Protein oxidation and aging. Science 257:1220-1224

33. Steflitsch, W., Steflitsch, M., 2008. Clinical aromatherapy. [NUME_REDACTAT] Men's Health, 5, 74-85.

34. Telci, I., Bayram, E., Yilmaz, G. Avci, B., 2006. Variability in essencial oil composition of Turkish basils (Ocimum basilicum L.)., [NUME_REDACTAT] and Ecology. 34 (6):489-497.

35. Toescu E. C., 2003. Neuronal ageing from an intraneuronal perspective: roles of endoplasmatic reticulum and mithocondria. [NUME_REDACTAT], 34, 311-323.

36. WINTERBOURNE C.C., HOW KINS R.E., BRAIN M., CARRELL R.W. (1975) The estimation of red cell superoxide dismutase activity, J. Lab. Clin. Med., 85, 327-341

36. Zhu, X., Arun K. Raina, Hyoung-gon Lee, [NUME_REDACTAT], Mark A. Smith. [NUME_REDACTAT], 2004. Oxidative stress signaling in Alzheimer's desease. [NUME_REDACTAT], 1000, 32-39.

Influenṭa uleiului esenṭial de Ocimum basilicum var. purpurascens asupra statusului oxidativ a unui model animal de demenṭă

INTRODUCERE

Demenṭa Alzheimer este una dintre cele mai dinamice afecṭiuni ala secolului, preconizȃndu-se că numărul de bolnavi se va dubla în următorii 20 de ani. De aceea este absolut necesară căutarea de resurse terapeutice eficiente ṣi accesibile.

Moartea neuronilor sau celulelor din sistemul nervos central reprezintă o caracteristiă esenṭială în bolile neurodegenerative, precum boala Alzheimer. Reducerea acṭiunii neuronilor în zonele creierului implicate în memorie ṣi învăṭare are consecinṭe devastatoare la nivel individual ṣi social. De aceea, prezervarea funcṭiei de bază ale neuronilor este de o importanṭă vitală.

Importanṭa radicalilor liberi poate fi inṭeleasă numai prin cunoaṣterea rolului lor. Radicalii liberi apar în anumite reacṭii de oxido-reducere în care au loc modificări structurale mari, de pe urma cărora substanṭa respectivă îṣi schimbă adesea funcṭia biologică (devine tot mai hidrosolubilă sau intervine în alt lanṭ de reacṭii metabolice).

Prin formarea radicalilor liberi au loc modificări structurale rapide, schimbări funcṭionale permiṭȃnd implicarea lor în reacṭii multiple.

Plantele aromatice ṣi medicinale ṣi extractele lor prezintă interes tot mai mare pentru cercetarea ṣtiinṭifică datorită conṭinutului în substanṭe cu proprietăṭi antioxidante ṣi antimicrobiene. Activitatea busuiocului (Ocimum basilicum L.) ṣi a extractelor acestuia (uleiuri esenṭiale) este atribuită conṭinutului în compuṣi fenolici ṣi alṭi compuṣi volatili.

Cercetătorii s-au axat asupra proprietăṭilor neurologice ale uleiului esenṭial de busuioc ṣi asupra modului de utilizare a acestuia pentru tratarea diferitelor afecṭiuni ale creierului.

Cercetările întreprinse reprezintă un model experimental de testare in vivo a modului în care reacṭionează organismele în fitoterapie, fiind urmărită totodată ṣi eficacitatea terapeutică a unor extrace uleioase.

În prezentul studiu am evaluat posibilele acṭiuni antioxidante ale uleiului esenṭial de Ocimum basilicum var. purpurascens, utilizȃnd un model de boală Alzheimer, avȃnd ca markeri ai stresului oxidativ enzime antioxidante ṣi produṣi de peroxidare ai proteinelor ṣi lipidelor.

CAPITOLUL 1 DATE GENERALE PRIVIND MECANISMELE IMPLICATE ÎN MALADIA ALZHEIMER

1.1. DEMENȚA ȘI MALADIA ALZHEIMER

Conceptul de boală Alzheiemer se află într-o transformare continuă în ultimii 20 de ani, încercandu-se sistematizarea tuturor informaṭiilor generate de cercetarea în domeniu de la nivel genetic ṣi molecular ṣi pȃnă la datele clinice si epidemiologice.

Între psihiatria sfarṣitului de secol XIX ṣi psihiatria biologică modernă de la începutul secolului XXI există legături evidente .În fiecare caz, ṣtiinṭele biologice sunt percepute ca fiind sursă de modele explicative ṣi de intervenṭie terapeutică.

[NUME_REDACTAT] a fost descrisă pentru prima dată de neurologul german [NUME_REDACTAT]. La data de 26 decembrie 1907, Dr. [NUME_REDACTAT] descoperă la pacienta sa Auguste D., in varstă de 51 de ani, o afecṭiune caracterizată prin tulburari cognitive progresive, halucinaṭii, idei derilante ṣi disfuncṭionalitate psihică. Mai tȃrziu, el publică într-o revistă de psihiatrie un articol intitulat ,,O afecṭiune gravă caracteristică cortexului cerebralˮ, aceasta constituind primul pas spre descoperirea ṣi intitularea bolii. Denumirea de ,,Boală Alzheimerˮ apare însă pentru prima dată în ,,Tratatul de Psihiatrieˮ a lui [NUME_REDACTAT] în anul 1910 (Panaitescu R., 2005).

[NUME_REDACTAT] este o boală lent progresivă a creierului care se caracterizează prin afectarea memoriei și în cele din urmă de tulburări în raționament, planificare, limbă, și percepție. Bolnavul mai prezintă incapacitate de a învăṭa lucruri noi, este lent in gȃndire; apar modificari de comportament, apatie, tulburari de mers, crize convulsive, mutism (Panaitescu R., 2005).

Simptomele pot fi confirmate printr-o patologie celulară distinctivă observată post-mortem in celula nervoasă (Ciobîca S., 2007 , vol. 1).

Cel mai frecvent simptom precoce al maladiei Alzheimer este dificultatea de a-ṣi aminti informatii recent invăṭate.

Principala manifestare a bolii Alzheimer o constituie demenṭa.

Demenṭele reprezină o categorie de afecṭiuni psihice cu substrat organic lezional cerebral, care se manifestă clinic prin degradarea progresivă ṣi de obicei ireversibilă a psihismului- în mod particular a funcṭiilor de cunoaṣtere a personalităṭii ṣi a comportamentului. Este evidentă alterarea funcṭionării în rolurile sociale ṣi profesionale ale subiectului, deṣi aceasta din urmă este relativizată ca ṣi criteriu de diagnostic diferenṭele de accesibilitate ṣi cele transculturale. În 15% din cazuri modificările pot fi reversibile ṣi anume atunci cȃnd ele nu ating gradul de severitate al unor leziuni definitive ca urmare a intervenṭiei terapeutice precoce.

Fenomenologia de tip demenṭial nu este însoṭită de alterări ale cȃmpului conṣtiinṭei ṣi poate fi identificată fals-pozitiv datorită unor factori perturbatori ai eficienṭei intelectuale precum surmenajul, stările depresive, deficitul motivaṭional sau prezenṭa unor suferinṭe somatice cu evoluṭie severă. În majoritatea cazurilor factorii etiologici incriminaṭi sunt decelabili ṣi în prezenṭa componentelor sindromului demenṭial permit încadrarea nosologică. Conform celor mai recente clasificări care apelează la criterii etiologice ṣi anatomopatologice sunt descrise demenṭele din boala Alzheimer, demenṭele vasculare ṣi cele din cadrul altor boli.

În acelaṣi an , [NUME_REDACTAT], în urma autopsiei pe creierul pacientei Auguste D., descrie tabloul clinic al demenṭei ṣi îi explică cauzele. Autopsia i-a dezvăluit existenṭa unor ,,modificări ale aspectului fibrelor nervoase, demne de luat in seamăˮ, modificări nodulare ale fibrelor nervoase ṣi depozitări stratificate ale unei ,,substanṭe particulare – proteina β-amiloidˮ, ce determină caracterul diferenṭial ṣi specific al structurii creierului în demenṭă.

Rezultatele enunṭate au fost publicate de A. Alzheimer in revista germană ,,[NUME_REDACTAT] Für Irre und Epileptischeˮ, iar la iniṭiativa lui Kraepelin, în 1910, acestă formă de demenṭă intră in dicṭionarele medicale sub numele de ,,Alzheimerˮ.

Demenṭa nu este o boală specifică. În schimb, descrie un grup de simptome care afectează gândirea și abilități sociale suficient de sever pentru a interfera cu funcționarea de zi cu zi.

Marea majoritate a demențelor constituie o clasă de afecțiuni neurodegenerative caracterizate prin alterarea persistentă și progresivă a funcțiilor cognitive, cu evoluție către invaliditate și moarte prematură. Din punct de vedere semiologic însă, demența reprezintă un sindrom clinic caracterizat printr-o deteriorare cognitivă globală, care implică un declin față de nivelul anterior de funcționare și care asociază o gamă largă de simptome psihice, psihologice ṣi comportamentale. Funcțiile cognitive afectate în mod obișnuit în demențe sunt: memoria, capacitatea de învatare, atenṭia, orientarea, calculul, limbajul, gandirea ṣi judecata. Aceste tulburări ale funcțiilor cognitive sunt uneori precedate și aproape întotdeauna însoțite de tulburări ale controlului emoțional, modificari ale personalității, sau simptome psihiatrice (apatie, depresie, tulburări psihotice) și tulburări comportamentale.

[NUME_REDACTAT]-[NUME_REDACTAT] 2003, demenṭa este definită ca o diminuare dobandită, de cele mai multe ori ireversibilă, a capacitaṭilor mentale (inteligenṭă, memorie, putere de înṭelegere), determinate de prejudicierea degenerativă a creierului, care diferă prin deficitul de inteligenṭă înnăscut adesea este legată de modificari în structura personalitaṭii.

Demenṭa de tip Alzheimer reprezintă 50-60% din totalul demenṭelor ṣi 5% din demenṭele întȃlnite peste vȃrsta de 60 de ani, incidenṭa crescȃnd paralel cu vȃsta. Factorii de risc specific sunt: sexul feminin cu mare probabilitate ṣi datorită longevităṭii mai ridicate, antecedente psihopatologice similare la rude de gradul întȃi, antecedente traumatice cranio-cerebrale personale, antecedente familiale de sindrom Down sau de limfom .

Demenṭa Alzheimer este o boală degenerativă, progresivă, care determină mai multe tipuri de modificări în circuitul persoanei afectate. Debutul bolii este lent, progresiv ṣi poate dura de la 2 la 4 ani. Instalarea bolii se recunoaṣte prin instalarea Sindromului AAA: afazie, agnozie, apraxia (Panaitescu R., 2005).

Datele statistice arată că peste vȃrsta de 65 de ani prevalenṭa bolii se dublează la fiecare 5 ani 4% după 75 de ani, 16% după 85 de ani, 32% după 90 de ani. Specific maladiei Alzheimer este că afectează memoria pentru evenimentele recente, neafectȃnd memoria imediată sau de lungă durată. Familia ṣi rudele observă modificări ale memoriei, personalităṭii sau funcṭionalităṭii, ezitări de limbaj, anxietate, mininalizarea ṣi/sau raṭionalizarea greṣelilor.

Aspectul exterior nu se modifică, comunicarea este coerentă, atȃt verbal cȃt ṣi prin expresia corporală, mimică. Tulburările gȃndirii sunt incă nesesizabile (Ianusevici V., 2005).

Sub aspect neuropatologic apar: atrofie corticală, pierderi sinaptice ṣi neuronale, aglomerări neurofibrilare cu filament helicoidale pereche, plăci nevritice cu miez amiloid, angiopatie amiloidă, reacṭii de fază acută ṣi reacṭie inflamtorie locală (Fig. 1).

Boala poate dura între 5 ṣi 7 ani ṣi are mai multe stadii. În stadiul primar al bolii dominante sunt tulburările de memorie, acompaniate de o diminuare treptată a capacităṭilor congnitive (Ianusevici V ., 2008), iar faza terminală, de aproximativ un an, se caracterizează prin mutism ,afecṭiuni neurologice ṣi somatice.

Fig. 1. Modificări morfologice la nivelul creierului în maladia Alzheimer

( sursă: http://www.brightfocus.org/alzheimers/about/understanding/brain-with-alzheimers.html)

Datele statistice arată că boala Alzheimer este cel mai frecvent tip de demenṭă întalnit la vărstnici. În 2005, în lume existau aproximativ 18 milioane de persoane ce sufereau de o asemenea demenṭă, iar estimările făcute pentru anul 2025 însumau aproximativ 34 de milioane de persoane bolnave (Panaitescu R., 2005 ).

Clasificarea demenței implică recunoașterea prezenței sale, urmată de diagnosticul diferențial al cauzei sale.

Demenṭa Alzheimer poate fi:

Demenṭă Alzheimer familială

Se referă la un număr redus de cazuri, reprezentȃnd 5% din total. Această boală are o transmitere ereditară evidentă, asociată de regulă, cu o vȃrstă mai mică de 60 de ani la debutul bolii.

În această formă de boală, factorii genetici au un rol determinant. Astfel s-a constatat că rudele de gradul întai ale persoanelor cu demenṭă Alzheimer prezintă un risc ridicat de a dezvolta boala (50% la vȃrsta de 90 de ani).

Demenṭa Alzheimer non familială

Cuprinde 95% din totalitatea cazurilor ṣi nu are la bază o transmitere ereditară evidenṭiată. Genele familiale caractrerizate în cadrul acestei forme de demenṭă, provoacă o boală cu debut în decadele 4 ṣi 5 de viaṭă.

Factori de mediu, ca alimentaṭia cu aluminiu ṣi infecṭiile virale au o contribuṭie în producerea demenṭei.

O activitate fizică ṣi intelectuală peste mediu în perioada adultă, reprezintă aparent un important factor de reducere a riscului de apariṭie a bolii. La persoanele cu predispoziṭie genetică, un nivel scăzut al educaṭiei, nutriṭie necorespunzătoare ṣi traumatisme cranio-cerebrale se corelează cu boala Alzheimer (Panaitescu R., 2005).

Förstel consideră că demenṭa Alzheimer nu determină moartea bolnavului ci bolile secundare ce apar concomitent cu aceasta (congestii pulmonare, îmbolnăviri secundare favorizate de spitalizări repetate, imobilizări indelungate la pat ṣi inactivitate letargică).

Sub aspect morfologic, boala se caracterizează prin atrofieri difuze ale scoarṭei cerebrale, prin pierderea masivă a neuronilor ṣi legăturilor sinaptice. Microscopic, pot fi puse in evidenṭă modificări specific de structură ale creierului, determinate de degenerarea proteică a fibrelor nervoase, ce vor forma din această cauză, plăci sedimentare. Aceste plăci apar datorită influenṭei toxice a substanṭei β-amiloid, localizată la nivelul celulelor nervoase, iar pe parcursul agravării bolii devin tot mai compacte.

Deṣi, corelaṭia între boală ṣi existenṭa acestor procese degenerative ale creierului este incontestabilă, nu s-a putut stabili gradul de corespondenṭă între gravitatea manifestării bolii ṣi gravitatea modificărilor patologice de structură ale creierului. S-a descoperit că degenerări morfologice apar ṣi la oamenii bătrȃni, fără ca aceṣtia să sufere din cauza unor disfuncṭii majore ale creierului.

În concluzie, nu imbătrȃnirea creierului determină apariṭia unui sindrom demenṭial, ci modul de desfăṣurare a acestui proces, specific bolii ṣi, de asemenea, repartiṭia diferenṭiată a zonelor de atrofie cerebrală ṣi integrarea în evoluṭia degenerativă a unor substanṭe proteice particulare (Ianusevici V., 2008).

1.2. MECANISME IMPLICATE ÎN PATOGENEZA BOLII ALZHEIMER

Demenṭele din maladia Alzheimer în peste 40% din cazuri sunt confirmate de contribuṭia factorilor genetici:

Caracterul familial al bolii;

Rata de concordanṭă pentru gemenii monozigoṭi este de ṣase ori mai mare decȃt pentru gemenii dizigoṭi;

Confirmarea prin transmiterea familială a unei gene autosomale.

Din punct de vedere anatomo-patalogic sunt descrise ca specifice:

Plăci senile cu structură amiloidică;

Degenerescenṭa granulovasculară a neuronilor cu atrofii neuronale extinse la nivelul întregului cortex ṣi a hipocampului;

Pierderi sinaptice care afectează 50% dintre legăturile interneuronale;

Scăderea metabolismuli acetilcolinei ṣi noradrenalinei la nivelul SNC prin deficitul de acetilcolintransferaza ṣi atrofierea neuronilor colinergici ṣi noradrenergici.

Clinic, după vȃrsta debutului se descriu: o demenṭă Alzheimer cu debut precoce între 45 ṣi 65 de ani, una cu debut tardiv peste 65 de ani ṣi una mixtă care asociază etiopatogenetic modificări vasculare. Simptomatologia debutează insidios cu tulburări de memorie, urmate de o dezorientare spaṭio-temporală care face ca subiectul să se piardă în propria locuinṭă sau să nu iṣi găsească patul în camera. Sunt tot mai evidente dispersia atenṭiei spontane, tulburările de judecată ṣi raṭionament ṣi uneori simptome anxioase, depresive sau interpretative.

Faza de stare se instalează mai rapid la cei cu debut precoce ṣi transmitere familială a bolii de la cȃteva luni pȃna la 2 ani e dominată de un sindrim demenṭial sever cu degradarea globală a psihismului ṣi a personalităṭii cu:

Dezorientare auto ṣi allopsihică;

Afazie senzorială imposibilitatea înṭelegerii limbajului vorbit, însoṭită de ecoalelie, polialelie, logoree ṣi jargonofazie;

Apraxia cu dezorganizarea motricităṭii ṣi comportament caricatural;

Agnozie vizuală pentru forme, culori ṣi fizionomii –prosopagnozie;

Episoade confuzive sau paranoide cu halucinaṭii polisenzoriale ṣi idei derilante nesistemetizate de prejudiciu;

Manifestări impulsive ṣi heteroagresivitate intermitentă;

Crize epileptiforme ṣi o hipertonie de tip extrapiramidal cu semnul roṭii dinṭate pozitiv;

Faza terminală se instalează după o evoluṭie lent progresivă cu posibile faze de platou după 8-10 ani, cu fenomene caṣectice gatism ṣi deces prin accidente ṣi infecṭii intercurente.

Evoluṭia demenṭelor în ansamblu depinde de precocitatea debutului ṣi de particularităṭile etiologice, atributele de gravitate fiind date de prezenṭa antecedentelor familiale identice ṣi de o anumită vulnerabilitate psihologică sau somatică preexistentă. Este favorizată de calitatea intergării ṣi funcṭionarii in rolurile profesionale ṣi sociale, de nivelul educativ ṣi cultural, de complexitatea relaṭiilor interpersonale care alături de terapii psihofarmacologice ṣi psihosociale pot încetini uneori sau chiar stabiliza pentru perioade de timp variabile fenomenologia deteriorativă.

Fig. 2. Neuroni sănătoṣi vs. Neuroni afectaṭi de maladia Alzheiemer

(sursa: http://coloradodementia.org/category/dementia/alzheimers-disease/)

1.2.1.Mecanisme colinergice

S-a constatat că în maladia Alzheimer, are loc o reducere uniform a marker-ilor presinaptici ai sistemului colinergic. De asemenea acetilcolintransferaza, captarea colinei ṣi sinteza de acetilcolină sunt reduse cu 30-60% faṭă de normal. Deficitele colinergice apar în cea mai mare măsură în ariile coricale implicate în memorie ṣi cogniṭie (hipocamp, lob temporal ṣi frontal).

Un deficit de markeri ai sistemului colinergic apare ṣi în stadiul iniṭial al bolii, însă, cea mai mare scădere se înregistrează în stadiul mediu ṣi avansat. Între nondemenṭa ṣi demenṭa de fază incipientă nu apar modificări semnificative, dar li se asociază simptome de hiperactivitate, comportament agresiv ṣi halucinaṭii vizuale (Gheorghe M.D. ṣi Marinescu D., 2005).

Rolul acetilcolinesterazei în patologia demenṭei ṣi maladiei [NUME_REDACTAT] colinergice sunt considerate ca fiind primele sinapse chimice ce au apărut în evoluṭia vieṭii, după cele de tip electric. Acetilcolina este neurotransmiṭătorul definitoriu al acestor sinapse ṣi este prezentă în toate structurile sistemului nervos, dar apare ṣi în structuri non-neuronale. Acetilcolina asigură funcṭionalitatea ṣi troficitatea sinapselor sistemului colinergic (Ciocîcă A. S., 2007, vol. 2).

Acetilcolina este sintetizată intraneuronal din colină ṣi acetil CoA ṣi degradată în fanta sinaptică, sub acṭiunea acetilcolinesterazei, la colină ṣi acetat, după ce a acṭionat pe receptorii specifici. Neurotransmiṭătorul acṭionează pe două tipuri de receptori: nicotinici ṣi muscarinici.

Acetilcolina are un rol excitator direct crescȃnd frecvenṭa descărcărilor neuronale. Rolul excitator se manifestă mai puternic atunci cȃnd nivelurile de dopamină, nor-adrenalină ṣi serotonină sunt scăzute (Gheorghe M. D. ṣi Marinescu D., 2005).

Acetilcolina deṭine roluri importante la nivelul cortexului cerebral, roluri demonstrate prin secṭionări bazale ale cortexului, ce au ca efect scăderi ale concentraṭiei de acetilcolină, acetilcolintransferază ṣi colinesterază.

Numeroase experimente au arătat că eliberarea de acetilcolină la nivelul cortexului este direct proporṭională cu gradul de excitabilitate corticală, care poate fi scăzută de anumiṭi agenṭi convulsivi ṣi scăzută de anestezici.

Proiecṭiile nucleului Meynert la nivelul cortexului cerebral sunt în principal realizate de acetilcolină, afectarea neurotransmisiei colinergice cerebrale (în special la nivelul cortexului frontal) fiind o caracteristică a demenṭei Alzheimer (Ciobîcă A., S., 2007, vol. 2).

La nivel biochmic apar modificări patologice, ce se asociază cu perturbări ale nivelelor de neurotransmiṭători, în principal a concentraṭiei de acetilcolină, corelate cu o scădere a receptorilor nicotinici, muscarinici ṣi a acetilcolintransferazei.

Neuronii colinergici insuficienṭi sau distruṣi de către depozitele plăcilor amioide ṣi de aglomerările neurofibrilare, pot fi înlocuiṭi, fie prin agoniṣti muscarinici sau nicotinici, fie prin inhibarea acetilcolinesterazei.

Reducerea activităṭii colinergice în regiunile limbice ṣi paralimbice afectează proiecṭiile corticale ṣi stă la baza dezvoltării simptomelor comportamnetale, iar modificări în activitatea colinergică pot induce perturbări ale somnului REM (somnul cu vise). Pe de altă parte scăderea de acetilcolină induce dezechilibre monoaminice în regiunile limbice, mezencefal ṣi treunchi cerebral ṣi poate duce la depresie ṣi anxietate (Gheorghe M. D. ṣi Marinescu D., 2005).

Neurotransmisia colinergică s-a dovedit a fi implicată într-o serie de procese psihice majore cum ar fi: memoria, învăṭarea, starea de vigilitate ṣi somnul, afectivitatea, depresie, anxietate, iar dereglări la acest nivel pot provoca diferite afecṭiuni, cea mai gravă ṣi importantă fiind maladia Alzheimer.

Rolul butirilcolinesterazei în patologia demenṭei ṣi maladiei [NUME_REDACTAT] lȃngă rolul acetilcolinesterazei ṣi al butirilcolinesterazei în funcṭia colinergică normala, s-a demonstrat ṣi un rol important al acestora în dezvoltarea ṣi progresia bolii Alzheimer.

Trăsăturile structurale ale celor două colinesteraze, le conferă acestora o specificitate de substrat diferită, acetilcolinesteraza fiind înalt specifică pentru acetilcolină, pe cȃnd butirilcolinesteraza metabolizează ṣi alte molecule. Acetilcolinesteraza este principal enzimă responsabilă de hidroliza acetilcolinei. Butirilcolinesteraza are doar rol de susṭinere la concentraṭii mari a acetilcolinesterazei, însă o poate suplini ṣi menṭine funcṭionarea corectă a sistemului colinergic.

Descoperiri recente au arătat că butirilcolinesteraza este foarte răspȃndită în creier, fiind prezentă în toate ariile corticale ṣi hipocampice inervate colinergic.

La bolnavii de Alzheimer s-au înregistrat scăderi ale activităṭii acetilcolinesterazei la 33-45% din valoarea normală, în timp ce butirilcolinesteraza îṣi creṣte compensator activitatea cu 40-90%.

La nivel molecular acetilcolinesteraza ṣi butirilcolinesteraza au secvenṭa aminoacidică identică în proporṭie de 65%, în ciuda codării lor de cromosomi diferiṭi, cromosomul 7, respectiv cromosomul 3. Ambele enzime există în mai multe forme, cele mai importante fiind forma G4, alcătuită din patru subunităṭi proteice ṣi în forma G1, alcătuită dintr-o singură moleculă proteică. În creierul normal predomină izoforma G4 a colinesterazelor, iar izoforma G1 este prezentă doar în cantităṭi mici, cu excepṭia hipocampului unde reprezintă 30-40% din totalul enzimei.

Comportamentul enzimatic al butirilcolinesterazei în boala Alzheimer, prezintă o particularitate, ce se manifestă printr-o creṣtere importantă a fracṭiunii G1 de 30-60%, situaṭie similară cu cea existentă în creierul embrionar.

În timpul progresiei bolii Alzheimer, s-au înregistrat pierderi de pȃnă la 45% de acetilcolinesterază în anumite zone ale creierului ṣi creṣteri de pȃnă la 90% a nivelului de butirilcolinesterază. În ,,situaṭii limităˮ neuronul apelează la rezerva de butirilcolinesterază situată la nivelul microgliei. Odată cu progresia bolii Alazheimer, implicarea microgliei este tot mai importantă (Gheorghe M.D. ṣi Marinescu D., 2005).

1.2.2. Mecanisme noncolinergice

[NUME_REDACTAT] la nivelul căii metabolice a glutamatului apar dereglări, acestea pot activa efectul neurotoxic al glutamatului cu o amplificare a distrugerii neuronale ṣi o activare a receptorilor N-metil D-aspartat (NMDA), receptori activaṭi de glutamat.

Receptorii NMDA interacṭionează FYN (gene din familia tirozin kinazelor oncogene), prin intermediul a două proteine de tip schelă DLG4 ([NUME_REDACTAT] Homolog4, implicate în ancorarea proteinelor sianptice) ṣi GNB2LI ([NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT]). Mecanismele de asociere ṣi disociere DLG4 ṣi GNB2LI la FYN contribuie la o hiperactivitate cronică a receptorilor NMDA în boala Alzheimer.

FYN activează în continuare receptorii NMDA ṣi provoacă un aflux de ioni de calciu (Ca2+) în citoplasmă, care în cantităṭi mari, duce la disfuncṭii mitocondriale. O activare pe termen lung a receptorilor NMDA trimite CREB (cyclic AMP response element binding protein), factor de transcripṭie , ce trimite un semnal de oprire. Datorită acestui semnal nivelurile de fosfo-CREB scad, iar acest lucru duce la diminuarea de semnale a proteinelor codate de BDNF (factori neurotrofici ai creierului), care se manifestă prin disfuncṭii celulare ṣi moartea neuronilor.

Alături de receptorii NMDA, al doilea tip important de receptori activaṭi de glutamat sunt receptorii AMPA (Fig 3). Uneori în aceeaṣi sinapsă pot exista ambele tipuri de receptori. GluR2 reprezintă un avantaj de protecṭie, însă pierderea de GluR2 poate influenṭa sensibilitatea pentru ionii de Ca2+, care mediate de neurotoxicitate duce la degenerarea neuronilor (Mohandas E. ṣi colab., 2009).

Fig. 3. Receptorii NMDA ṣi AMPA

(sursă: http://michaeldmann.net/pix_18/ltp2_a.gif)

Studii anatomopatologice pe structura cerebrală a pacienṭilor cu boală Alzeimer au evidenṭiat o reducere cu 14% a concetraṭiei glutamatului în lobul temporal ṣi 86% în zonele terminale ale căilor perforate.

De asemenea, creṣteri de glutamat determină o scădere accentuată a nivelului dopaminic, care se manifestă printr-o exacerbare a deficitului cognitiv ṣi alterări structurale ireversibile ale polului cerebral frontal. Efectul neurotoxic distruge structurile gliale ṣi influenṭează transmisia de acetilcolină, cu o eliberare masivă de butirilcolinesterază ṣi crearea unei rezistenṭe terapeutice la inhibitorii de acetilcolinesterază (Gheorghe M. D. ṣi Marinescu D., 2005).

[NUME_REDACTAT] funcṭiei serotonin-ergice se asociază cu impulsivitate ṣi acte agresive, două aspecte noncognitive frecvent întălnite la bolnavii de Alzheimer. Au fost observate post-mortem ṣi chiar in vivo, modificări la nivelul neurotransmisiei de serotonină, care par a fi responsabile de unele simptome noncognitive ale maladiei Alzheimer, de exemplu depresia (Gheorghe M. D. ṣi Marinescu D., 2005).

[NUME_REDACTAT] sau 3,4-dihidroxifeniletilenamina aparṭine clasei catecolaminelor. Are rol de precursor al noradrenalinei ṣi adrenalinei ṣi poate îndeplini roluri importante ca neurotransmiṭător independent la nivelul sistemului nervos central.

Majoritatea receptorilor dopaminici din creierul uman se găsesc în principal la nivelul nucleului A9, care formează zona compactă sau partea bazală a substanṭei negre, deṣi ei pot fi întȃlniṭi ṣi în zona ventral sau lateral a substanṭei negre (Ciobîcă A. S., 2007, vol. 2).

Receptorii dopaminici D1 joacă un rol important în medierea ṣi aspectul specific al funcṭiei cognitive, cursuri de învăṭare ṣi procese de memorie, Alzheimer (Mohandas E. ṣi colab., 2009).

Activitatea dopaminergică scade odată cu vȃrsta. Scăderea receptorilor dopaminici din creier se corelează cu o scădere a metabolismului glucozei în cortexul frontal, cingulate, temporal ṣi caudat. Acest deficit de dopamină determină modificări patologice ale comportamentului alimentar, manifestate prin indiferenṭă senzorială faṭă de alimente ṣi pot influenṭa negativ procesele cognitive. Acest tip de comportament apare datorită unor tulburări ce afectează centrii recompensei ṣi este specific bolnavilor cu demenṭă senilă ṣi Parkinson, dar apare ṣi ca o urmare a administrării de neuroleptice.

Receptorii dopaminergici, deṣi nu sunt foarte numeroṣi, deṭin alături de cei colinergici un rol foarte important în menṭinerea ,,sănătăṭii mintaleˮ a individului (Ciobîcă A. S., 2007, vol. 2).

Studii realizate pe biopsii, la pacienṭii cu maladia Alzheimer, au arătat că markerii noradrenalinici sunt aproape constant afectaṭi, în timp ce markerii pentru dopamină, somatostatină ṣi acid ɣ-aminobutiric manifestă o puternică acṭiune anxiolitică ṣi inhibă atȃt perioada de expectare a anxietăṭii, cȃt ṣi formarea asociaṭiilor amnezice legate de aceasta.

În boala Alzheimer se constată o pierdere a receptorilor nicotinici, mai ales în cortexul frontal ṣi a receptorilor D2 din structurile nigrostriatale, cȃt ṣi a receptorilor pentru seroronină din hipocamp (Gheorghe M. D. ṣi Marinescu D., 2005).

1.2.3. Mecanisme celulare biologice

Studii imunohistochimice ṣi ultrastructurale au indicat faptul că în boala Alzheimer, un eveniment patogenetic precoce este reprezentat de pierderea sinaptică în hipocamp, urmat de cortexul frontal, temporal, cingulat ṣi parietal. Această pierdere precoce a sinapselor după acest pattern anatomic a fost observată ṣi în cazul modelelor experimentale. Pierderea sinaptică duce la pierderea neuronală cu astroglioză ṣi microglioză reactive, apariṭia plăcilor de amiloid ṣi a depoziteler neurofibrilare fiind un eveniment ulterior. Pierderea sinaptică se corelează cu nivelurile Aβ42, dar nu ṣi plăcile de amiloid. De asemenea, pierderea sinaptică se corelează semnificativ cu deficitul cognitiv.

Depozitele de β -amiloid

β-amiloidul este o peptidă rezultată dintr-o proteină precursoare APP (precursorul proteinei amiloidice), inserată pe membrana celulară. APP aparṭine unei mari familii de proteine transmembranare, avȃnd un domeniu extracelular mare ṣi o regiune citoplasmatică mica (Mohandas E. ṣi colab., 2009) (Fig. 4).

Clivarea secvenṭială a APP de către β ṣi y- secretază generează β-amiloidul (Aβ) care se depozitează în creierul pacienṭilor afectaṭi sub formă de plăci senile ṣi reprezintă unul din principalele semne patologice ale maladiei Alzheimer.

Fig. 4. a) Plăci de β-amiloid b)Benzi neurofibrilare (NFT)

(sursă: http://coloradodementia.org/tag/plaques-and-tangles/)

Gena pentru transcrierea producṭiei de APP este situată pe braṭul lung al cromosomului 21 ṣi se gaseṣte sub forma mai multor izomorfe, cele mai importante fiind APP770, APP751 ṣi APP695.

Calea principală de prelucrare a APP este calea non-amiloidogenică (Fig. 5). Sub acṭiunea α-secretazei APP este clivată într-o peptidă solubilă (α-APPs), care este eliberată ṣi un fragment carbon-terminal, care rămȃne în cadrul membranei. Peptida solubilă poate avea rol neuroprotector, cel puṭin 30% din ATP fiind procesată pe această cale ṣi evitȃnd formarea de β-amiloid.

Fig. 5. Reprezentarea schematică a degradării proteinei precursoare a amiloidului (APP) și rolul produṣilor de degradare în patologia bolii Alzheimer

(sursă: http://journal.frontiersin.org/Journal/10.3389/fphys.2012.00189)

Calea de formare amilodogenică implică două etape: β-secretaza acṭionează asupra APP ṣi generează o membrană solubilă către fragmentul carbon-terminal. Mai departe ɣ-secretaza clivează acest fragment în β-amiloid40 (Aβ40) ṣi β-amiloid42 (Aβ42).

Ambele tipuri de amiloid pot fi găsite în plăcile amiloide, doar că Aβ42 este un peptid neurotoxic ṣi dispus în agregare. În condiṭii normale 90% din β-amiloidul format este A β40, peptid solubil ce poate fi eliminat din creier. Uneori poate trece din forma solubilă în cea insolubilă ṣi devine patologic, însă această transformare este lentă.

10% din β-amiloidul format este Aβ42, care se poate depune precoce la persoanele ce suferă de Alzheiemer ṣi [NUME_REDACTAT].

Relaṭiile β-amiloidului cu stresul oxidativ sunt controversate. O serie de studii îl consideră drept o sursă de radicali liberi ṣi îi atribuie rol prooxidativ (Butterfield D. A., ṣi colab, 1996) ṣi inductor al apoptozei neuronale.

De asemenea, apolipoproteina E4 (ApoE4) favorizează producerea în exces de β-amiloid ṣi reprezintă astfel un factor genetic de risc major pentru apariṭia bolii Alzheimer (Mohandas E. ṣi colab., 2009).

Depozitele de β-amiloid reprezintă o trăsătură neuropatologică centrală în maladia Alzheimer. Pe lȃngă efectul neurotoxic, acesta activează microglia, produce neurotoxine, radicali liberi, citokine, compromite funcṭia colinergică ṣi perturbă astfel grav memoria de lucru ṣi spaṭială (Gheorghe M.D. ṣi Marinescu D., 2005).

Rolul β-amiloidului în patologia neurodegenerescenṭelor nu este pe deplin elucidate, efectele sale toxice neasociindu-se întotdeauna cu depozitarea plăcilor de amiloid, însă este cunoscut faptul că nivelul de β-amiloid din creier se asociază cu gradul de severitate a demenṭei (Mohandas E. ṣi colab.. 2009).

Mecanisme inflamatorii

Astrocitele, microglia ṣi într-o măsură mai mică neuronii sunt implicate în procesul inflamator al bolii Alzheimer. β-amiloidul poate activa microglia, ceea ce duce la o creṣtere a expresivitaṭii complexului major de histocompatibilitate (Mohandas E. ṣi colab., 2009).

De asemenea această activare duce la o creṣtere a secreṭiei de citokine pro-inflamatorii, a proteinelor de inflamaṭie ṣia factorului de necroză tumorală (Gheorghe M.D. ṣi Marinescu D., 2005).

β-amiloidul induce un răspuns fagocitar în microglie ṣi expresia enzimei specifice oxidului nitric (sintetaza) provoacă daune neuronale. Microglia, prin eliberarea de enzimă degradantă de insulină, joacă ṣi rol în degradarea β-amiloidului.

Desi, încă nu se cunoaṣte dacă mecanismele inflamatorii reprezintă o cauză principală sau secundară a bolii Alzheimer, s-a dovedit că pacienṭii bolnavi, aflaṭi în stadiul uṣor sau moderat al bolii, au avut o evoluṭie mai bună după administrarea de medicaṭie antiinflamatorie (Gheorghe M.D. ṣi Marinescu D., 2005).

Mecanisme vasculare

Hipertensiunea arterială se asociază cu deficitul cognitiv ṣi cu un risc crescut pentru maladia Alzheimer, în timp ce leziunile aterosclerotice ale carotidei ṣi fibrilaṭia arterială se corelează mai mult cu boala Alzheimer decȃt cu demenṭa vasculară.

Există cazuri cȃnd sindromul demeṭial poate fi atribuit direct patologiei vasculare, însă demenṭa apare ṣi în infarctele mici ṣi profunde (lacunare). Infarctele lacunare sunt favorizate de hipertensiune ṣi se datorează lipohialinozei arterelor perforate. Un alt risc este reprezentat de leziunile hipocampului ṣi ale căilor de asociaṭie, care pot favoriza instalarea maladiei Alzheimer.

[NUME_REDACTAT] ṣi demenṭa vasculară prezintă factori de risc comuni, printre care se enumeră vȃrsta, apoenzima E4, hipertensiunea, consumul de tutun etc.

La pacienṭii bolnavi de Alzheiemer s-a dovedit o îngroṣare a vaselor sangvine, ceea ce sugerează o boală arterială. În concluzie, maladia Alzheimer se însoṭeṣte ṣi de o patologie vasculară (Gheorghe M.D. ṣi Marinescu D., 2005).

De asemenea bolile microvasculare cerebrale ṣi hipoperfuzia cerebrală pot declanṣa schimbări cognitive ṣi degenerative în boala Alzheimer.

Factorii de risc vascular, alături de vȃrsta înaintată, creează un prag critic atins în hipoperfuzia cerebrală, boală în care creierul nu este suficient vascularizat. Acest prag reprezintă o patologie neîntreruptă ṣi progresivă ṣi afectează capilarele cerebrale. Cȃnd pragul este atins, are loc o dereglare a producerii endoteliale de oxid nitric, dereglare care duce la degenerarea capilarului. Pragul critic atins în hipoperfuzia cerebrală, împreună cu un nivel scăzut de ATP ṣi energie celulară provoacă un stres oxidativ mitocondrial. Rezultă astfel o criză patologică la nivel celular ṣi subcelular care implică sinteza de proteine, dezvoltarea de plăci, răspunsul inflamator ṣi deteriorarea sinaptică, ceea ce conduce la manifestările maladiei Alzheimer (Mohandas E. ṣi colab., 2009).

Mecanisme oxidative

Cea mai mare parte din speciile reactive de oxigen provin din produṣii secundari ai lanṭului transportor de electroni, eliberaṭi în urma fosforilării oxidative în mitocondrii.

Principalii radicali liberi, reprezentaṭi de radicalii peroxid ( H2O2), radicalii hidroxil (OH-) ṣi radicalii superoxid (O2-), mediază leziuni ale celulelor, precum ṣi moartea acestora.

Radicalii liberi provoacă schimbări care vizează compuṣii organici esenṭiali pentru integritatea structurală ṣi funcṭională a neuronilor.

În boala Alzheimer lanṭul transportor de electroni nu este inhibat ceea ce duce la o acumulare de electroni în complexul I (NADH- dehidrogenază) ṣi coenzima Q.

Electronii astfel acumulaṭi, pot fi donaṭi oxigenului molecular pentru a forma redicalul superoxid (O2-). Mai departe superoxidul reacṭionează cu oxidul de azot ṣi formează radicalul peroxinitrat (NO3-).

[NUME_REDACTAT] este asociată cu disfuncṭia lanṭului transportor de electroni ṣi producerea de radicali liberi ṣi se caracterizează printr-o capacitate antioxidantă redusă.

Dovezile privind leziunile oxidative au fost obṭinute din creierul pacienṭilor cu boala Alzheimer prin recoltări postmortem.

La nivelul neuronilor bolnavilor de Alzheimer au fost identificaṭi markeri ai unui stres oxidativ intens, constȃnd în concentraṭii crescute de produṣi de peroxidare lipidică ṣi produṣi avansaṭi de glicozilare.

Speciile reactive de oxigen, rezultate prin glico-oxidare formează produṣi finali avansaṭi de glicozilare. Acestea sunt proteine modificate care pot produce mai multe specii reactive de oxigen. Există, deci, o legătură biochimică între produṣii finali de glicozilare ṣi peroxidarea lipidelor, care produc avansarea maladiei Alzheimer. Se pare că mecanismele oxidative au o implicare crescută în medierea disfuncṭiilor neuronale, acestea devenind o ṭintă în depistarea ṣi ameliorarea bolii Alzheimer (Mohandas E. ṣi colab., 2009).

Astăzi, cu greu se poate vorbi despre rolul dominant al unui neurotransmiṭător sau mecanism într-o neurodegenerescenṭă. În efortul de a găsi un tratament de ameliorare ṣi chiar de tratare a bolii, se încearcă înṭelegerea vastelor interacṭiuni ca apar între diverse sisteme de neurotransmisie cerebrală (Ciobică A. S. 2007 , vol. 2.).

1.3 STRESUL OXIDATIV ȘI MALADIA ALZHEIMER

Stresul oxidativ se defineṣte ca dezechilibrul dintre antioxidanṭi ṣi oxidanṭi cu o creṣtere a oxidanṭilor, care au efect patologic ṣi distructiv. Acest dezechilibru apare în urma oxidării sau a producerii de radicali liberi (Ciobică A. S., 2007 , vol.3).

Stresul oxidativ este produs de radicalii liberi, adică specii reactive de oxigen care sunt generate de oxigen ṣi azot ṣi bazate pe molecule care au electroni nepereche (Chauhan V. ṣi Chauhan A., 2006).

Radicalii liberi sunt substanṭe care derivă din compuși oxidați incomplet, care au trecut prin arderi parṭiale, avȃnd în structura lor grupări de oxigen capabile să iniṭieze la suprafaṭa membranelor celulare sau chiar în interiorul celulelor reacṭii agresive de oxidare.

Radicalii liberi pot fi definiṭi ca atomi sau molecule ce conṭin în structura lor un electron neîmperecheat. Aceṣti electroni au o energie ridicată, ceea ce determină instabilitatea atomului sau a moleculelor care îl conṭine. Starea de echilibru se atinge prin punerea în comun de elctroni ṣi este caracterizată printr-o energie mai scăzută, deci o stabilitate mai mare a moleculei (Ciobîcă A.S., 2007, vol.3).

Din cauza electronilor nepereche, radicalii liberi sunt foarte instabili ṣi foarte reactivi. În scopul formării perechilor de electroni, radicalii liberi caută ṣi iau electronii de la alte molecule. După pierderea electronilor, moleculele donator devin instabile ṣi trec în radicali liberi în căutare de electroni.

Radicalii liberi provin din procesele ce se petrec în organism ( fagocitoza, catabolismul incomplet, producerea de energie, detoxifierea hepatică), cȃt ṣi din mediul exterior (fum de ṭigară, aer poluat, anumite alimente ṣi medicaminte, apa de fȃntȃnă sau de robinet).

Deși oxigenul molecular este indispensabil pentru viata, in acelasi timp el are un efect negative, cunsocut ca toxicitatea oxigenului, determinate de formarea unor specii reactive.

Radicalii liberi produṣi în organism sunt toxici ṣi dacă nu sunt eliminaṭi sau neutralizaṭi ei reacṭionează cu lipide, proteine sau acizi nucleici ṣi deteriorează funcṭiile celulare. În general, daunele produse de stresul oxidativ afectează componentele celulare ṣi modifică proprietăṭile membranei precum: fluiditatea, transportul ionilor, activitatea enzimatică ṣi proteinele reticulare. Deteriorarea excesivă provocată de stresul oxidativ, duce în cele din urmă la moartea celulelor (Chauhan V. ṣi Chauhan A., 2006).

Reactiile enzimatice din organism constituie o sursă inepuizabila de radicali liberi intermediari care reacṭionează între ei sau cu alte substanṭe producȃnd compuṣi instabili.

,,Un paradox al vieṭii tereste este că molecula esenṭială pentru traiul aerob, oxigenul, nu numai că stă la baza metabolismului energetic ṣi a respiraṭiei, dar este implicat ṣi în mai multe afecṭiuni ṣi maladii degenerative.ˮ (L. Marx 1985).

Sunt mai mult de 300 de teorii care explica fenomenul îmbătrȃnirii. Dintre toate teoriile, teoria radicalilor liberi în îmbătrȃnire, postulată pentru prima data de Harman, este cea mai întȃlnită ṣi larg testată fiind bazată pe natura chimică ṣi prezenṭa în permanenṭă a radicalilor liberi. În ambele cazuri al lezării ADN-nuclear, precum ṣi cel mitocondrial, radicalii liberi induc stresul oxidativ în celule. Postulatul teoriei îmbătrȃnirii este bazat pe reacṭiile radicalilor liberi, implicate în producerea modificărilor datorate îmbătrȃnirii. Aceste modificări sunt asociate cu mediul înconjurător, boala ṣi procesul îmbătrȃnirii intrinseci. Această teorie este bazată pe natura chimică a reacṭiilor radicalilor liberi ṣi omniprezenṭa lor (Holmes ṣi colab., 1992).

Radicalii liberi au rol în deteriorarea mitocondrială ṣi în senescenṭa permanentă (Harman, 1972). Rezultatele imbătrȃnirii arată într-adevăr scăderea numărului de mitocondrii ṣi că organitele din celulele îmbătrȃnite suferă alterări biochimice (Flohe, 1982).

S-a presupus astfel, că îmbătrȃnirea este cauzată de vătămarea ADN- ului mitocondrial ṣi peroxidarea lipidelor de către radicalii liberi din membrana internă mitocondrială. Celulele replicate rapid nu permit atacul radicalilor liberi deoarece utilizează nivele scazute de oxigen (Bagchi ṣi colab., 1995; Richter, 1995). Mitocondriile de la speciile cu viaṭă scurtă generează cantităṭi mari de specii reactive ale oxigenului faṭă de speciile cu viaṭă lungă. Deteriorarea ADN-ului mitocondrial poate bloca turnover-ul mitocondrial ṣi replicarea, cu deteriorarea concomitentă a membranei (procese de peroxidare).

Se poate considera parṭial că mitocondria serveṣte în calitate de ṭintă majoră de acṭiune a speciilor reactive de oxigen, în ṭesuturile îmbătrȃnite. Ca mecanism de apărare a organismelor vii împotriva îmbătrȃnirii îl constituie experimentele care au demostrat un efect de prevenire a deteriorării oxidative legate de vȃrstă, exercitat de Cu, Zn, SOD.

Stresul oxidativ amplifică migrarea celulelor proinflamatorii, creṣte expresia unor molecule de adeziune pe suprafaṭa celulelor endoteliale ṣi induce peroxidarea lipidică la nivelul barierei hematoencefalice (Haorab J., 2007).

În funcṭie de intensitatea lor, stresul oxidativ se poate desfaṣura în interiorul sau exteriorul celulei. Stresul intacelular conduce la necroza celulară sau la o dezorganizare mai mult sau mai puṭin marcată a celulei, putȃnd fi catastrofală în cazul unei celule care nu se poate reproduce. De asemenea, stresul oxidativ extracelular este citotoxic.

Peroxizii și superoxizii, anionii care exercită o acțiune oxidantă energică provin din apa oxigenată (H2O2) precum și din alte surse sau procese, așa cum sunt cei rezultați în urma rȃncezirii alimentelor bogate în lipide (peroxizii lipidici).

Radicalii liberi provin din 2 surse majore :

– endogenă (radicalii liberi care se formează în organism pe parcursul fenomenelor metabolice sau fiziologice). Dacă, cel puṭin dintr-o anumită măsură, impactul cu radicalii liberi exogeni poate fi limitat prin abordarea unui mod de viaṭă adecvat ṣi echilibrat, nu se poate spune acelaṣi lucru ṣi despre radicalii liberi endogeni.

– exogenă (radicalii liberi pătrund în organism din mediul extern).

Organismele sunt prevăzute cu un sistem de apărare antioxidant foarte eficient.

În acest sistem un rol important îl joacă enzimele antioxidante cum ar fi superoxid- dismutaza-SOD, care detoxifică radicalul superoxid, glutation- peroxidaza-GPx, sau malondialdehida- MDA, care detoxifică peroxizii celulari. Deoarece au o mare reactivitate, radicalii liberi sunt implicaṭi în foarte multe acṭiuni nocive organismului, dar mai ales în procesul de îmbătrȃnire.

Creierul, în comparaṭie cu celelalte ṭesuturi, conṭine cel mai mare procent de grăsimi nesaturate ṣi astfel, neuronii devin cele mai sensibile celule la atacul radicalilor liberi (Ciobîca A. S., 2007,vol.3).

Studii realizate pe modele experimentale ṣi creierul uman, sugerează că stresul oxidative joacă un rol important în degenerarea neuronală din boala Alzheimer.

Îmbȃtrȃnirea, anomaliile mitocondriale, producerea de β-amiloid, patologiile NFT sau anomaliile fibrilare sunt factori care contribuie la creṣterea stresului oxidativ (Chauhan V. ṣi Chauhan A., 2006).

În procesul de îmbătrȃnire are loc lezarea ADN-ului nuclear ṣi mitocondrial ṣi inducerea stresului oxidativ în celule. Acest proces este acompaniat de grave deficienṭe cognitive, ṣi poate degenera în boli ca Alzheimer ṣi Parkinson (Ciobîcă A. S., 2007, vol. 3).

Creierul pacineṭilor cu boala Alzheimer conṭine niveluri crescute a produṣilor de peroxidare lipidică (acroleină), însă produṣi de peroxidare s-au detectat de asemenea în plasma ṣi lichidul cerebrospinal.

Daunele provocate de stresul oxidativ asupra proteinelor ṣi acizilor nucleici reprezintă un eveniment important în maladia Alzheimer.

Studiile au arătat că β-amiloidul, atȃt solubil cȃt ṣi fibrilar poate induce stresul oxidativ. Pe lăngă acestea, radicalii stresului oxidativ sunt implicaṭi în producerea anomaliilor fibrilare. Toṭi aceṣti factori favorizează o creṣtere a producṭiei de specii reactive de oxigen ṣi sunt implicaṭi în patologia bolii Alzheimer, unde sistemul de apărare antioxidant este cu mult depăṣit (Chauhan V. ṣi Chauhan A., 2006).

1.3.1. Îmbătrȃnirea ṣi stresul oxidativ

În 1956, Harman a propus pentru prima data că îmbătrȃnirea, un proces normal de viaṭă, este cauzată de radicalii liberi care mediază daunele dela nivel celular.Vȃstra este cel mai mare factor de risc pentru maladia Alzheimer.

Datorită creṣterii duratei de viaṭă prin imbunatăṭirea serviciilor medicale ṣi ale condiṭiilor de trai în general se estimează o creṣtere a prevalenṭei Alzheimer cu 70% pȃnă în 2030. Trebuie menṭionat că această afecṭiune generează ṣi costuri indirecte semnificative: de exemplu 42,9% din îngrijitorii pacienṭilor cu Alzheimer suferă de depresie. Statisticile arată că una din zece persoane cu vȃrsta de peste 65 de ani ṣi aproape jumătate din populaṭia cu vȃrsta de peste 85 de ani suferă de Alzheimer.

Oxidarea proteinelor, lipidelor ṣi a acizilor graṣi creṣte odată cu înaintarea în vȃrstă. Modificările aduse de îmbătrȃnire induc starea de oxidare în creier ṣi reprezintă un factor major în declanṣarea producerii ṣi depunerii de β-amiloid în boala Alzheimer (Chauhan V. ṣi Chauhan A., 2006) (Fig. 6).

Fig. 6. Efectele metaboliṭilor O2 asupra celulei

(după M. [NUME_REDACTAT] cavitatii orale. Ed. Tehnica, pg.132, 2001)

1.3.2. β-amiloidul ṣi stresul oxidativ

Unii autori consideră că acumularea de β-amiloid ṣi proteină TAU fosforilată (componenta de bază a degenerescenṭelor fibrilare) are iniṭial un rol antioxidant ṣi protectiv.

În cazul bolii Alzheimer, procesele de îmbătrȃnire se asociază cu stresul oxidativ de natură metabolică ṣi cel generat de diferite metale, conducȃnd la o acumulare masivă de β-amiloid ṣi proteină TAU fosforilată. Totuṣi, stresul oxidativ poate afecta funcṭia nervoasă ṣi prin procese care nu depind de procesul lent de îmbătrȃnire (Ciobîcă A. S., 2007, vol. 3).

Numeroase studii au arătat că β-amiloidul produce ṣi mediază stresul oxidativ. Alte efecte ale acestuia constau în atenuarea funcṭională a hiperemiei, deficite de memorare ṣi învaṭare la ṣoareci, creṣterea nivelului de hem-oxigenază I ṣi a proteinelor de ṣoc termic.

Concentraṭia metalelor din depozitele de amiloid pot contribui, de asemenea, la daunele produse de stresul oxidativ asupsa creierului bolnav de Alzheimer.

S-a dovedit că proteinele precursoare de amiloid ṣi peptidele β-amiloidice posedă capacitatea de a reduce cuprul, indiferent de starea de agregare în care se găsesc. În prezenṭa ionilor de cupru, β-amiloidul reduce Cu2+ la Cu+ ṣi catalizează formarea apei oxigenate (H2O2), care produce radicali hidroxil foarte toxici.

β-amiloidul induce stresul oxidativ în prezenṭa ionilor de cupru ṣi este supus la atacul radicalilor liberi. Cu2+ catalizează oxigenarea H2O2, care duce la modificarea proprietăṭilor peptidelor β-amiloidice. Creṣterea mediată a β-amiloidului în stresul oxidativ poate fi datorată creṣterii producṭiei de specii reactive de oxigen, scăderii activităṭii enzimatice la nivelul sistemului antioxidant de apărare sau a unor disfuncṭii mitocondriale.

Stresul oxidativ mai poate fi influenṭat ṣi de apoliproteina E4, care duce la angiopatii β-amiloide sau de mediatorii inflamaṭiilor, care sunt atraṣi către depozitele de amiloid ṣi care pot genera un nou stres oxidativ (Chauchan V. ṣi Chauchan A., 2006).

β-amiloidul ṣi peroxidarea lipidelor

Membrana celulară este alcătuită din fosfolipide, care sunt compuse la rȃndul lor din acizi graṣi polinesaturaṭi, ṭintele principale ale speciilor reactive de oxigen.

Prezenṭa dublei legături lȃngă o grupare metilen face legătuta dintre metilen ṣi acizi graṣi polinesaturaṭi mai slabă, iar prin urmare hidrogenul devine mai predispus la captare.

Producerea de radicali liberi, precum radicalul hidroxil, radicali alcoxi ṣi radicali peroxi, rezultă din iniṭierea unei secvenṭe de peroxidare lipidică.

În urma studiilor s-a demonstrat că β-amiloidul creṣte stresul oxidativ prin creṣterea peroxidării lipidice, în urma căreia se formnează produṣi de peroxidare lipidică. Aceṣti produṣi modifică interacṭiunea covalentă a proteinelor ṣi inhibă funcṭiile enzimelor.

Tratamentul cu β-amiloid a accelerat peroxidarea lipidică ṣi a crescut nivelul de substanṭe reactive celor din creier (acid tiobarbituric).

Deoarece lipidele sunt componente membranare, interacṭiunea dintre agregatele de β-amiloid ṣi membrană creează un proces de insuficienṭă celulară. Se cauzează astfel un stres oxidativ ṣi are loc creṣterea concentraṭiei ionilor de calciu, care în cele din urmă duce la apoptoză (Chauchan V. ṣi Chauchan A., 2006).

β-amiloidulul ṣi peroxidarea proteinelor

Pe lȃngă oxidarea lipidelor, oxidarea proteinelor reprerzintă un eveniment important la începutul patologiei maladiei Alzheimer.

Speciile reative de oxigen mediază reacṭia cu proteinele ṣi duce la formarea de carbonil, care serveṣte ca marker al distrugerii proteice. Acest marker apare în procesul de îmbătrȃnire ṣi în boala Alzheimer.

Stresul oxidativ indus de β-amiloid în creierul de ṣobolan evidenṭiază unele proteine oxidate prezente în creierul bolnavilor de Alzheimer. Aceste proteine introduce în căile biochimice corespunzătoare, produc dereglări la nivelul creierului ṣi pot duce la neurodegenerescenṭă.

α-enolaza este o enzimă citosolică implicată în calea glicolitică ṣi reprezintă o ṭintă pentru oxidarea proteinelor.

Împreună cun echilibrul de oxidare ṣi degradare a proteinelor, α-enolaza participă la patologia bolii Alzheimer (Chauchan V. ṣi Chauchan A., 2006).

β-amiloidul ṣi oxiadrea ADN

Speciile reactive de oxigen pot provoca daune oxidative la nivelul ADN-ului nuclear ṣi mitocondrial. Aceasta include modificări ale bazelor, oxidarea dezoxiribozei ṣi distrugerea ADN-ului de legătură.

Speciile reactive de oxigen ṣi interacṭiunea radicalului hidroxil cu ADN-ul generează diferite baze ale ADN-ului: 8-oxo-7,8dehidro-2-deoxiguanozin, 2,6-diamino-4-hidroxi-5 formaminopirimidine, 8-OH-adenină, 2-OH-adenină, glicol timină ṣi glicol citozină.

Daunele provocate de stresul oxidativ la nivelul AND-ului mitocondrial implică modificări ale bazelor ṣi întreruperi ale ADN-ului de legătură, ceea ce duce la formarea de componente anormale a lanṭului transportor de electroni. Rezultă pierderi masive de electroni, care produc radicali liberi ce vor deteriora celulele în continuare.

Oxidarea ADN-ului are o implicaṭie importantă în boala Alzheimer. În diferite regiuni ale creierului bolnav de Alzheimer ṣi la bătrȃni au fost observate daune crescute la nivelul ADN-ului mitocondrial, datorate stresului oxidativ.

În celulele neuronale PC21, celulele neuronale utilizate ca model pentru diferenṭierea neuronală, s-a observant că radicalii liberi produṣi de β-amiloid provoacă modificări oxidative la nivelul ADN-ului.

Produṣii rezultaṭi în urma oxidării ADN-ului apar în concentraṭii crescute ṣi în lichidul cefalorahidian la pacienṭii bolnavi de Alzheimer (Chauchan V. ṣi Chauchan A., 2006).

β-amiloidul ṣi enzimele implicate în sistemul de apărare antioxidant

Superoxid dismutaza (SOD), glutation peroxidaza (GPx), ṣi catalaza sunt principalele trei enzime implicate în protecṭia celuleor conta radicalilor liberi ṣi oxidare, avȃnd ṣi un rol important în depistarea patologiei maladiei Alzheimer. Expresia SOD în diferite regiuni ale creierului bolnav de Alzheimer este mult mai mare decȃt în creierul normal, iar mecanismele de apărare împotriva oxidării în acestă zonă devin insuficiente. Niveluri ale SOD sunt crescute în creier, celulele roṣii ṣi limfoblaṣti la aceṣti pacienṭi. Expresai ridicată a SOD în celulele neuronale ar putea reduce acumularea ṣi toxicitatea β-amiloidului.

Glutationul redus (GSH), din cauza grupării sulfhidril, participă la reacṭiile antioxidante. Alterarea metabolismului glutationului în asociere cu un stres oxidativ crescut este un factor implicat în patogeneza bolii. Scăderea cantităṭii de glutation în limfoblaṣti, care transportă gena presenilă ṣi proteinele precursoare de amioloid, indică rolul mutaṭiilor genetice a presenilei ṣi APP în stresul oxidativ ṣi în boala Alzheimer (Chauchan V. ṣi Chauchan A., 2006).

1.3.3. Mitocondria ṣi stresul oxidativ

Unii autori consideră că hipocampul ar fi zona nervoasă cu o vulnerabilitate crescută la procesul de îmbătrȃnire ṣi la atacul radicalilor liberi. Neuronii hipocampului conṭin numeroṣi markeri ai stresului oxidativ ṣi prezintă un nivel mai ridicat de ADN mitocondrial, chiar dacă numărul de mitocondrii per neuron scade. Neuronul supus unui stres oxidativ crescut ar răspunde prin încercarea de a replica efectiv mitocondria, motiv pentru care la nivelul neuronilor piramidali hipocampici pot fi identificaṭi diferiṭi markeri ai procesului de mitoză.

Aceste modificări apar în urma reducerii procesului de degradare a bioproducṭiei de mitocondrii ṣi au drept cauză alterări a circuitului de refacere a componentelor mitocondriale.

Analizele de natură morfologică indică o legătură clară între reducerea numărului ṣi a dimensiunilor mitocondriilor cu apariṭia maladiei Alzheimer (Ciobîcă A. S., 2007, vol. 3).

Mitocondria reprezintă centrul energetic al celulei ṣi joacă un rol important în stresul oxidativ, iar disfuncṭii la nivelul mitocondriei duc la moartea celulelor.

În maladia Alzheimer, producṭia de adenozintrifosfat (ATP) este deficitară ṣi însoṭită de un număr crescut de radicali de oxigen, ceea ce poate induce moartea celulelor dependente de mitocondrii. Acestea sunt deteriorate ṣi nu pot menṭine cerinṭele energetice necesare celulei.

β-amiloidul provoacă o pierdere de potenṭial mitocondrial ṣi induce stresul oxidativ în astrocite prin inactivarea NADPH-oxidazei, care poate provoca moartea neuronală (Zhu X. ṣi colab., 2004).

S-a demonstrat că stresul oxidativ generează inducerea interlizozomală de β-amiloid. Acesta are capacitatea de a destabiliza membranele lizozomale ṣi de a produce apoptoză celulară (Ciobîcă A. S., 2007, vol. 3).

Stresul oxidativ mediază apoptoza neuronală indusă de β-amiloid ṣi dă naṣtere la protein kinaza activată de stres (SAPK), proteină a cărei funcṭionare este dependent ṣi controlată de p53 ṣi bcl-2 (proteine care controlează procesul de apoptoză).

Creṣterea producṭiei de β-amiloid în celule datorită genelor mutante ale proteinelor precursoare de amiloid, conduc la disfuncṭinalitatae mitocondriilor, care însoṭite de o producṭie ridicată de NO (oxid nitric) duc la moartea celulelor (Chauchan V. ṣi Chaunchan A., 2006).

Deficieneṭele metabolice ṣi energetice ale neuronilor apărute în diferite neurodegenerescenṭe generează pe lȃngă creṣterea stresului oxidativ, dereglări ale metabolismului glucozei ṣi ionilor de Ca2+, care se corelează cu o scădere a duratei de viaṭă a neuronului. Toate aceste aspecte se manifestă mai ales la nivelul zonelor foarte importante în realizarea procesuli cognitiv: hipocam, cortex frontal, cerebel.

Deficienṭele biochimice, moleculare ṣi morfologice ale mitocondriilor au o importanṭă deosebită în apariṭia bolii Alzheimer.

La nivelul ADN-ului mitocondrial al bolnavului de Alzheimer s-au găsit foarte puṭine mutaṭii corelate însă, cu procesul de îmbătrȃnire. Rolul mitocondriei este fundamental în supravieṭiurea celulei nervoase, atȃt prin controlul exercitat asupra metabolismului energetic, cȃt ṣi prin depozitarea diverselor proteine ce reglează căile epoptotice.

Creṣterea concentraṭiei de Ca mitocondrial combinată cu creṣterea producṭiei de radicali liberi este caracteristică atȃt pentru boala Alzheimer cȃt ṣi injuriile cerebrale ischemice (Toescu ṣi colab., 2003).

Tot mai multe date sugerează o legătură clară între toxicitatea exercitată de β-amiloid, disfuncṭiile mitocondriale, stresul oxidativ ṣi moartea neuronală în cadrul diferitelor demenṭe. Aceste modificări ar fi acompaniate de creṣteri ale nilvelului de acetilcolinesterază, cu influenṭe nefaste asupra proceselor de memorare ṣi învăṭare.

Stresul oxidativ are influenṭe nefaste asupra sistemului de transmisie dopaminergic, reduce starea motivaṭională a individului ṣi duce la grave defiecienṭe cognitive.

O serie de studii sugerează corelaṭia intre intervenṭia radicalilor liberi asupra neuronilor ṣi iniṭierea morṭii celulare programate. Legătura dintre prezenṭa β-amiloidului ṣi producerea de radicali liberi ṣi apoptoza este subiectul unor cercetări ample (Fig. 7).

Neurodegenerescenṭele, deṣi cu aspecte diferite, au în comun o serie de aspecte patogene: agregări inadecvate de proteine, muaṭii genice, disfuncṭii mitocondriale ṣi modificări biochimice.

Fig. 7. a) Neuroni sănătoṣi; b) Apoptoză neuronală;

(sursă:http://www.immunochemistry.com/products/green-fam-flivo-in-vivo-apoptosis-kit.html).

Toate aceste aspecte conduc la apoptoza neuronală ṣi sunt explicate printr-un stres oxidativ susṭinut.

Există o legătură strȃnsă între statusul oxidativ al neuronului ṣi funcṭionalitatea sa, a căilor de transducṭie, a semnalelor biochimice ṣi gradul de supravieṭuire a acestuia.

Agregările proteice apar în cadrul bolilor neurodegenerative ca un fenomen patologic comun, indiferent de etiologia boli. Căile biochimice care duc la formarea agregatelor proteice sunt foarte nocive deoarece produc radicali liberi.

În urma formării acestor radicali, sistemul enzimatic antioxidant este slăbit, iar la om ṣi mamifere are loc un pas important în instalarea bolii neurodegenerative.

Afectarea sistemului de apărare antioxidant deṭine un rol important în patogeneza bolii sistemului nervos. Astfel, la bolnavii cu Alzheimer, Parkinson, dar ṣi pacienṭi cu [NUME_REDACTAT] trecuṭi de 40 de ani (la care încep manifestările bolii Alzheimer) se înregistrează o scădere a activităṭii SOD. La autism, afecṭiune non-degenerativă, nivelul SOD rămȃne neschimbat, deci sistemul de apărare antioxidant rămȃne nemodificat în cadrul unor boli în care nu regăsim agregate proteice ṣi procesele degenerative ale neuronilor.

În stadiile iniṭiale ale bolii Alzheimer, se observă o creṣtere a concentraṭiilor de surse redox active, cum er fi unele metale tranzaṭionale: fie, cupru (Ciobîcă A. S., 2007, vol.3).

Daunele aduse de stresul oxidativ scad invers proporṭional cu progresia bolii, astfel nivelurile de markeri ai stresului oxidativ cresc foarte mult iniṭial, pentru ca apoi să scadă odată cu avansarea bolii (Chauchan V. ṣi Chauchan A., 2006).

Pe lȃngă aceasta, enzimele antioxidante găsite în neuronii atacaṭi de boală, indică faptul că speciile reactive de oxigen (ROS) nu produc doar daune la nivelul structurilor celulare, ci de asemenea provoacă răspunsuri celulare (Zhu X. ṣi colab., 2004).

1.3.4. Producerea de radicali liberi în boala [NUME_REDACTAT] mamiferelor răspund la stimuli extracelulari ṣi printr-o cascadă de semnale transmit instrucṭiuni pentru a coordona răspunsurile necesare celulei.

Toate organismele aerobe produc radicali liberi, predominant radicali superoxid, formaṭi ca un produs secundar în timpul reducerii oxigenului molecular în mitocondrii.

O celulă medie utilizează 1013 molecule de O2 pe zi. Se estimează că 1% din oxigenul molecular respirat formează ROS, deci se produc aproximativ 1011 specii de radicali liberi pe zi în fiecare celulă.

Producerea de radicali este mult mai mare în celulele neuronale, datorită metabolismului de oxigen ridicat.

Deṣi creierul reprezintă doar 2-3% din masa totală a corpului, acesta utilizează 20% din oxigenul furnizat întregului organism.

Cei mai mulṭi radicali liberi sunt captaṭi în mitocondrii, însă dereglările provocate de stresul oxidativ sunt agravate cu vȃrsta înaintată, metabolism ṣi strȃns condiṭionate de unele boli, cu ar fi de exemplu Alzheimer.

Studiile au arătat că în maladia Alzheimer metabolismul cerebral este redus, la baza disfuncṭiilor fiind aṣezată mitocondria care reprezintă cea mai importantă sursă de radicali liberi endogeni ṣi a carei complexe enzimatice specific sunt reduse (citocromoxidaza (COX), complexul piruvat dehidrogenazei (PDHC)). De asemenea, structura enzimelor poate fi modificată de exemplu COX (citocromoxidaza) purificată din creierul bolnavilor de Alzheimer nu are site cinetic necesar reducerii citocromului c.

Modificările suferite de aceste enzime cheie favorizează producerea aberantă de specii reactive de oxigen (ROS), deoarece COX-1 este component a lanṭului transportor de electroni ṣi interacṭionează direct cu oxigenul molecular. Pierderea activităṭii ar putea duce la creṣterea producṭiei de superoxid ṣi ar putea realiza copii de rezervă a electronilor site-ului complexului III, provocȃnd o formare crescută de ROS în mitocondrii.

Eliminarea ROS impune eliminarea chimică a electronilor ṣi se realizează datorită ciclului acizolor tricarboxilici.

În maladia Alzheimer, mitocondriile furnizează un reactant cheie care odată ajuns în citoplasmă, eliberează radicali liberi ṣi provoacă dereglări.

Prezenṭa H2O2 nu reprezintă o ameninṭare direct pentru celulă. Deṣi nu este foarte reactivă, poate difuza liber prin membrana exterioară a mitocondriilor ṣi participă la modificări chimice, în urma cărora se produc radicali foarte reactivi care în cantităṭi mari devin toxici pentru celule.

Prin urmare, deficienṭe ale complexelor piruvat dehidrogenază ṣi α-cetoglutarat dehidrogenză au un efect negative asupra ciclului ṣi favorizează producerea de specii reactive de oxigen.

Odată ce radicalul •H2O2 este prezent în citoplasmă, interacṭionează cu fierul redox-activ ṣi produce prin reacṭia Fenton radicali •OH. Deṣi depozitele de β-amiloid ṣi NFT conṭin fier redox-activ, modificările suferite de fier sunt evindenṭiate în citoplasma neuronilor vulnerabili în boala Alzheimer. Mai are loc ṣi o degradare a metabolismului celular al fierului. Proteinele de reglare a fierului, IRP-2 sunt crescute ṣi constituie semne distinctive în boala Alzheimer.

De asemenea, în creierul afectat de boala Alzheimer se observă o creṣtere a concentrṭiei de fier corelată cu o scădere concomitentă a feritrinei.

Proteinele de reglare a fierului reglează homeostazia acestuia ṣi stocarea de feritină prin interacṭiunea cu un element de răspuns al fierului. În urma studiilor, s-a arătat că alterarea interacṭiunii dintre proteinele de reglare a fierului ṣi elementul de răspuns al fierului cauzează deraglări la nivelul homeostaziei acestuia.

Plăcile senile conṭin o cantitate abundentă de fier, esenṭială pentru iniṭierea formării radicalilor liberi.

Neuronul devine vulnerabil la ROS dacă are loc o creṣtere în fier fără o creṣtere corespunzătoare în feritină, pentru detoxifierea de fier a acestuia. Asemeni fierului, cupru, a cărei homeostazie este modificată în boala Alzheimer pare să joace un rol similar înn medierea ṣi generarea ROS ṣi este asociat cu depozitatea β-amiloidului.

Există dovezi că daunele neuronale cauzate de β-amiloid sunt mediate de radicalii liberi în membrane ṣi pot fi atenuate prin antioxidanṭi cum ar fi vitamina E sau catalaza.

Aldehidele rezultate din peroxidarea lipidică au capacitatea de a modifica proteinele membranare ṣi de a schimba funcṭia, ceea ce are efecte nefaste asupra neuronilor.

De exemplu, 4-hidroxinonenenul, indus de β-amiloid, afectează transportorul de glutamat ṣi glucoză, funcṭia mitocondrială ṣi perturbă homeostazia ionilor din membrane.

Legarea β-amiloidului la receptorul pentru produsele rezultate în urma glicozilării (RAGE) iniṭiază un răspuns inflamator oxidativ.

Plăcile senile sunt înconjurate de microglia formată de macrofagele creierului, iar activarea sa produce radicali liberi.

Echilibrul oxidativ intracelular este bine reglat, iar în boala Alzheimer, ca răspuns la stresul oxidativ apare o suprareglare a mecanismelor compensatorii.

Reducerea echivalenṭilor de NADPH sunt esenṭiali pentru a menṭine apărarea contra stresului oxidativ.

Inducerea NADPH necesită enzima hem-oxigenază care limitează rata de transformare a hemului în bilirubină. Inducṭia de hem oxigenază este corelată cu acumularea de H în neuroni.

O generaṭie crescută NADPH determină creṣterea glutationului ṣi a grupărilor sulfhidril libere. Acestrea din urmă sunt crescute în special în neuronii vulnerabili, deoarece grupările sulfhidril sunt componentă majoră a sistemului de apărare antioxidant ṣi protejează celula de ROS ṣi metaboliṭi secundari.

În citoplasma neuronilor vulnerabili, produsele stabile glicozilate ṣi 4-hidroxinonenanul sunt în principal asociate cu NFT ṣi depozite de β-amiloid. Acestea pot fi reversibile sau se degradează rapid, deci stresul oxidativ nu se limitează doar la durata de viaṭă a leziunii.

Atȃt β-amiloidul cȃt ṣi ghemurile neurofibrilare (NFT) pot avea ṣi o funcṭie antioxidantă, de aceea neuronii care conṭin NFT pot supravieṭui zeci de ani.

Formarea NFT poate fi un eveniment controlat. Stresul oxidativ poate stimula producṭia, atȃt de proteină precursoare de β-amiloid folosind căile de producere a kinazei activate de stres (Zhu X. ṣi colab. , 2004).

CAPITOLUL 2 TAXONOMIA GENULUI OCIMUM

Busuiocul este cunoscut ṣi folosit încă din antichitate. Numele genului Ocimum provine de la numele grecesc "okimon". Este considerat specie originară din China, India, Asia, Africa ṣi zonele subtropicale din America. Este răspȃndit în cultură în multe zone de pe glob. În ṭara noastră, este cultivat în grădini ṣi este recomandat a fi plantat în zonele din sud ṣi vest – vestul ṭării, în special.

[NUME_REDACTAT] cuprinde plante ierboase anuale și perene, precum și arbuști, provenind din regiunile tropicale și subtropicale ale Asiei, Africii de Sud, ṣi cu o largă răspȃndire pe glob.

Taxonomia genului este complexă din cauza hibridării interspecifice și poliploidiei. Unii autori (Pushpangadan și Bradu, 1995, cf. Telci și colab., 2006; Labra și colab., 2005) au recunoscut 150 de specii, Paton și colab., (1999) (cf. Telci și colab., 2006) a propus doar 65 de specii, pe când alți autori acceptă existența a circa 35 de specii de Ocimum.

Marotti ṣi colab. (1996), semnalează că în unele cazuri există relaṭii între caracteristicile morfologice ṣi chemotip chiar dacă nu întotdeauna este posibil de stabilit o corelaṭie strictă.

În schimb, mulṭi autori clasifică speciile de busuioc după chemotip, cum este cazul lui Goretti de Vasconcelos ṣi colab. (2003), unde O. basilicum var. minimum prezintă chemotip estragol, în timp ce O. basilicum var. purpurascens este considerat chemotipul linalool.

Ocimum basilicum apaṭine familiei Lamiaceae, ordinul Lamiales, subclasa Asteridae, clasa Magnoliopsida, încregătura Magnoliophyta, regnul Plantae. Se apreciază că exista numeroase varietăṭi ṣi rase de cultură care, deṣi aparṭin aceleiaṣi specii, pot prezenta atȃt diferenṭe morfologice (uneori destul de importante) cȃt ṣi diferenṭe in ceea ce priveṣte compoziṭia chimică. Cele mai importante specii ale genului sunt O. basilicum, O. gratissium, O. minimim, O. americanum și O. sanctum.

Busuiocul (Ocimum basilicum L.) este o plantă cusocută ṣi utilizată încă din Antichitate. Egiptenii foloseau planta ca pe o componenta din cadrul mumificării.

Unii autori situează originea plantei în diferite locuri, fie în India, Africa sau [NUME_REDACTAT], deoarece nu există dificultăṭi pentru a stabili dacă plantele sunt autohtone dintr-un loc determinat sau au fost introduse în Antichitate (Ryding, 1994).

Busuiocul se cultivă anual necesitȃnd temperaturi medii de la 7 la 27° C ṣi sol cu pH între 4,3 ṣi 8,2 bine drenat. Planta este sensibilă la îngheṭ astfel încȃt cele mai bune condiṭii pentru cultivare în aer liber sunt zilele lungi ṣi însorite de primăvară–vară.

Dintre numeroasele specii de plante medicinale, plantele genului Ocimum sunt de mare actualitate datorită bogăṭiei în principii active. Busuiocul are proprietăṭi antioxidante, ajutȃnd organismul să lupte împotriva radicalilor liberi, care sunt legaṭi de procesele de îmbătrȃnire ṣi boală. Este adaptogen, cu efect antistres, ajută procesele nervoase ṣi emoṭionale ṣi are efecte imunostimulatoare. Alături de vitamina C, caroten, calciu ṣi fosfor asigură sănătatea pielii. Frunzele sunt folosite pentru tonifierea nervoasă ṣi ajutarea memorizării, hepatoprotector antiulcerativ, antibiotic, adaptogen si radioprotector .

2.1. Ocimum basilicum

Busuiocul este o plantă aromatică care creṣte în toată lumea, se crede că are originea în India ṣi Iran, iar mai tȃrziu a fost introdusă în Europa de-a lungul secolului XII, tradiṭional, busuiocul a avut o largă utilizare ca agent aromatizant, precum ṣi în parfumerii ṣi industria farmaceutică (Ijaz ṣi colab., 2008). Pe de altă parte este o sursă de compuṣi aromatici ṣi uleiuri esenṭiale cu constituienṭi biologici ce îi conferă proprietăṭi insecticide, fungistatice ṣi antimicrobiene (Politeo ṣi colab., 2008). Aṣadar compuṣii fenolici ṣi flavonoidici au demonstrat proprietăṭile sale antioxidante (Ijaz ṣi colab., 2008), capturanṭi de radicali liberi ṣi chelaṭi de metale (Jayashinghe ṣi colab., 2003).

Busuiocul este o plantă de un verde deschis, pubescentă, aromatică. Tulpina este erectă, înaltă de 20-60 cm, ramificată de la bază iar frunzele sunt ovate, acute, la bază atenuate în pețiol, lungi de 3-5 cm, late de 2-2,5 cm, întregi sau slab dințate, pe dos cu numeroase glande secretoare și cu 4-5 perechi de nervuri secundare. Inflorescența este întrerupt spiciformă, formată din verticile pauciflore scurt pedunculate, cu câte 4-6 flori scurt pedicelate. Caliciul prezintă un tub foarte scurt, bilabiat, persistent; labiul superior orbicular, de 5-6 mm în diametru, ciliat pe margini, cel inferior cu 4 dinți (uneori 3) înguști. Corola este albă sau alburie, cu tubul scurt, bilabiată; labiul superior cu 4 lobi scurți, rotunjiți, cel inferior întreg, mai lung decât cel superior. Staminele sunt exserte, cu antere aproape sferice, sprijinite pe labiul inferior al corolei ṣi uṣor curbate în sus; prezintă filamente lungi, cele posterioare cu cȃte un mic apendice subulat. Pistilul este subțire. Sunt prezente 4 nucule, ovoidale, lungi de 1,5-2 mm, care în mediu umed devin mucilaginoase. Planta prezintă numeroase forme horticole care după Benth, se deosebesc prin mărimea și grosimea frunzelor, prin mărimea florilor și prin pubescența pronunțată a frunzelor (Gușuleac, 1961).

Această specie prezintă o mare varietate naturală. Dintre soiuri cele mai cunoscute sunt: ,,Purpurascensˮ (Fig.8.); ,,Genovese”, cel mai popular, un soi foarte aromat cu frunze mari (Fig. 9.) , considerat ca un semn al dragostei în Italia, cu cele mai comune specii de busuioc, cultivat în prezent în zonele cu climă temperată în întreaga lume; ,,Lemonˮ, originar din Mexic, cu aromă intensă de citrice (Fig. 10.); ,,Anasonˮ are o aromă dulceag-piperată, cu note pronunṭate de ananas (Fig. 11.).

Ocimum basilicum var. purpurascens este o varietate superioară a soiurilor roṣii de busuic ([NUME_REDACTAT] Basil), obṭinut conform surselor în Danemarca înaintea anului 1992, prin încruciṣarea soiurilor O. basilicum ṣi O. forskolei. Este o plantă anuală, de aproximativ 60 cm înalṭime ṣi 40 cm lăṭime, cu rădăcina bine ramificată. Foliajul este bogat, frunzele sunt uṣor zimṭate. Întreaga plantă are culoare neobiṣnuită, violet-purpurie, datorită conṭinutului mare de antocianine. Florile, de formă caracteristică pentru busuioc, sunt ṣi ele roz-violete. Înfloresc vara-toamna.

Mirosul ṣi gustul plantei sunt practic asemănătoare cu cele ale busuiocului verde.

De la busuiocul violet se recoltează pentru alimentaṭie frunzele ṣi lăstarii tineri întregi. Dacă planta nu se cultivă pentru flori, atunci ele trebuie rupte îndată ce se arată infloresceṭele.

În plantă, în general, se găsesc antociani, acid cafeic, acid rosmarinic, flavone, arginină, alanină, acid aspartic, fitosteroli, tiamină, riboflavină, acid glutamic, printre alṭi compuṣi (Kintzios S. ṣi colab., 2003).

Fig. 8. Ocimum basilicum var. Purpurascens

(sursa: http://gradinahobby.blogspot.ro/2013/01/busuioc-rosu-ocimum-basilicum-var.html)

Fig. 9. Ocimum basilicum, soiul ,,Genoveseˮ

(sursa:http://www.grow-it-organically.com/growing-basil.html)

Fig. 10. Ocimum basilicum, soiul ,,Lemonˮ

(sursa:http://gradina-de-vis.shopmania.biz/cumpara/busuioc-lamaia-lemon-basil-7276714)

Fig. 11. Ocimum basilicum, soiul ,,Anasonˮ

(sursa:http://gradina-de-vis.shopmania.biz/cumpara/busuiocul-anason-thai-basil-4620086).

2.2. Busuiocul și medicina tradiționnală

Busuiocul (Ocimum basilicum), a fost cunoscut la indieni încă din urmă cu trei milenii și s-a răspândit rapid în lumea largă datorită mirosului deosebit și gustului caracteristic, aromat.

La indieni, busuiocul era foarte apreciat, cunoscut ca planta lui Krishna și Vishnu. La romani și, mai târziu, la italieni, busuiocul era considerat iarba dragostei și a fertilității, înflorirea lui fiind celebrată prin serbări și adevărate ritualuri, ce sunt rădăcina unor practici preluate chiar în creștinism.

La greci și în toata lumea ortodoxă, busuiocul este considerat planta sacră. Agheazma se face cu busuioc și se împrăștie cu un mănunchi de busuioc pentru alungarea răului și sfințirea locurilor. Busuiocul se pune, de asemenea, la icoane să atragă protecția divină asupra casei și stăpânilor ei.

La noi, exista tradiția ca busuiocul să se semene în ziua de [NUME_REDACTAT], înainte de răsăritul soarelui. Semințele de busuioc se pun în pământ, în vase mici, la Dragobete, pe 24 februarie. Vasele se țin în casa, la lumina și, de [NUME_REDACTAT], se plantează în grădină.

Recoltarea busuiocului începe la sfârșitul lui iunie, când apar deja primele flori. Se culeg numai vârfurile înflorite, nu și partea lemnoasă. Recoltarea durează până toamna, târziu. Pe măsură ce vârfurile înflorite se taie pentru uscare, planta dă ṣi mai mulți lujeri care, la rândul lor, vor înflori.

Proprietățile medicinale ale busuiocului au fost cunoscute încă din antichitate. În scop terapeutic, de la busuioc se folosește partea aeriană care se usucă în straturi subțiri, în locuri bine aerisite.

Se spune ca busuiocul este un leac bun „pentru cei mâhniți și pentru cei cu inima greaˮ deoarece este un calmant excelent si un bun tonifiant și reconfortant al nervilor.

Preparatele din busuioc, precum infuzia, decoctul, siropul, pulberea, uleiul au acțiune antibiotică, antiseptică. Busuiocul este și un antiinflamator gastric, intestinal și renal. Este, de asemenea, antifungic și febrifug.

Busuiocul tratează foarte multe afecțiuni cum ar fi colicile intestinale, balonările, voma, gripa, răceala, bronșita acuta și cronică, durerile de cap, sinuzita, ulcerul gastric, infecțiile urinare, anorexia, diareea sau colita de fermentație.

În bucătăria mediteraneană, busuiocul este folosit ca plantă aromatică, fiind unul din ingredientele de baza ale celebrului sos pesto. Frunzele de busuioc se folosesc ṣi la prepararea altor sosuri pentru condimentarea pastelor. Chinezii ṣi tailandezii folosesc busuiocul la condimentarea multor feluri de mâncare dar ṣi la prepararea gemurilor de zmeură, căpșuni și prune.

De sute de ani, fetele nemăritate își pun un fir de busuioc sub pernă, în ajun de Bobotează, pentru ca să li se arate în vis ursitul. Tradiția este mai veche decât ne închipuim și e greu de stabilit originea ei. O legendă românească spune ca busuiocul s-ar fi născut din mormântul unei fete udat cu lacrimi de către iubitul ei, pe care îl chema Busuioc.

Tot tradiția cere ca busuiocul să fie ținut la icoană, purtat la sân, închis într-un medalion sau în geanta, ori chiar ascuns în pătuțul pruncului deoarece reprezintă un adevărat talisman care te protejează de farmece și atrage dragostea fiind simbolul fidelității și al purității.

CAPITOLUL 3 ULEIUL DE BUSUIOC ṢI PROPRIETĂȚILE LUI TERAPEUTICE

3.1. COMPOZIȚIA CHIMICĂ A ULEIULUI DE BUSUIOC

Se estimează că în lume se produc mai mult de 42 de tone de ulei esenṭial de Ocimim basilicum, cunoascut ṣi sub numele de ˮsweet basilˮ, care se caracterizează prin conṭinutul ridicat de estragol ṣi linalool. În plus, există o mare varietate de specii de Ocimum basilicum, care deṣi similare morfologic produc uleiuri esenṭiale bogate în alṭi componenṭi sau amestecuri din aceṣtia.

Astfel, se disting trei varietăṭi, care depind de poziṭia geografică:

Uleiul esenṭial din busuiocul european este considerat de cea mai înaltă calitate, conṭine linalool ṣi estragol în raport 2 sau 3:1. Alṭi constituienṭi importanṭi, dar care prezintă proporṭii scăzute sunt: 1,8-cineol, eugenol, α-terpineol ṣi geraniol.

Uleiul esenṭial din busuiocul egiptean este similar celui anterior, exceptȃnd raportul linalool-estagol, care este mai mic.

Uleiul din busuiocul bulgăresc, a cărui component mojoritar este reprezentat de cinamtul de metil.

În 1990, Charles ṣi Simion au comparat performanṭa uleiurilor esenṭiale din rădăcini ṣi flori la diverse specii de Ocimum basilicum. S-a observat un conṭinut mai crescut de uleiuri esenṭiale la nivelul florii, iar în ceea ce priveṣte calitatea uleiului, raportul linalool: methilcavicol este mai mare în flori decȃt în frunze.

[NUME_REDACTAT] basilicum L. este cea mai mare producătoare de ulei esenṭial din lume ṣi se cultivă în multe locuri. În comparaṭie cu alte componente chimice ale fracṭiunii volatile din uleiul esenṭial o mare proporṭie o constituie estragolul 9,9%.

S-a demonstrat că eugenolul din compoziṭia uleiului esenṭial de busuioc prezintă capacităṭi antioxidante.

Mondelo ṣi colab., efectuează un studiu în care identifică 62 de compuṣi în uleiul esenṭial O. basilicum var. purpurascens. Fracṭiunile monoterpenice alcoolice au fost identificate în procent de 64,5% din ulei; principalii constituienṭi au fost: linalool (29,7%), geraniol (27,4%) ṣi 4-terpineol (5,7%). Alṭi compuṣi prezenṭi în procent mai mare de 1% sunt: geraniol- acetat (13,8%), limonen (2,5%), geranial (2,0%), α-bulnesen (1,6%), neral (1,2%). În plus, la α-bulnesen, au mai fost identificate 20 de sesquiterpene. Metil-chlavicolul a fost determinat în procent de 0,1%, în timp ce metil-cinamatul nu a fost depistat. Compoziṭia uleiului apare extrem de diferit pe eṣantioane de O. basilicum var. purpurascens, după cum reiese din literatură (Fig. 12).

În studii efectuate asupra speciei O. basilicum var. purpurascens în India, s-a constatat că metil-cinamatul este componentul principal al uleiului esenṭial (70-87%). Totuṣi izomerul corect al metil cinamatului nu a fost niciodată găsit.

Ocazional, uleiurile bogate în metil-chlavicol conṭin de asemenea, o cantitate crescută de linalool (12-35%), fapt ce depinde de etapa de creṣtere, componenta plantei folosită pentru extragerea uleiului esenṭial.

În 1996 Thoppil, în timpul unui stiudiu biosintetic realizat pe numeroase specii de O. basilicum , identifică valori ale linaloolului de 36-41%, citronelal 20-24% ṣi geranial 7-10%, în uleiul obṭinut din varietatea purpurascens.

De-a lungul unor studii realizate în Brazilia, a uleiurilor esenṭiale extrase din frunze ṣi inflorescenṭe prezenṭa linaloolului constituie 39%, respectiv 81%; alṭi compuṣi reprezentativi sunt sesquiterpenele pentru ambele uleiuri; α-murolol (11%) din frunze , t-cadinol (7%) extras din inflorescenṭe.

Fig. 12. Monoterpenele din compoziṭia uleiului esenṭial de Ocimum basilicum

(sursă: http://www.cyberlipid.org/simple/simp00041)

Componentele majore ale uleiurilor esenṭiale pot constitui pȃna la 85% din uleiul esenṭial, restul fiind completat de cantităṭi infime de molecule libere.

Aroma fiecărui ulei rezulă în urma unor combinaṭii de arome potrivite de la fiecare componentă, unde ṣi cele minore au un rol esenṭial organoleptic important.

Uleiurile esenṭiale au o compoziṭie complexă, conṭinȃnd pȃnă la cȃteva sute de componente. Marea majoritate a componentelor identificate în uleiuri esenṭiale includ terpene (oxigenate sau neoxigenate), monoterpene ṣi sesquiterpene (Miguel M.G., 2010).

Uleiurile esenṭiale deṭin un complex chimic care constituie un amestec de substanṭe organice: hidrocarburi, alcooli, aldehide, cetone, esteri, cu masă moleculară mai mică de 400 Da. Sunt derivaṭi ai metabolismului secundar al plantelor ṣi pot fi asociate sau nu cu alte componente.

Uleiurile esenṭiale sunt fracṭiuni lichide, volatile, în general amestecuri organice de pȃnă la 100 compuṣi chimici, proveniṭi din familia chimică a terpenoidelor. Generează diverse arome agreabile ṣi perceptibile de om. În condiṭii scăzute de temperatură ambientală sunt lichide cu densitate scăzută, dar cu o vȃscozitate mai mare decȃt a apei.

Uleiurile esenṭiale sunt metaboliṭi secundari, sintetizaṭi de plante, produse în momentul de activare, ca răspuns împotriva factorilor ambientali ṣi ecologici, îndeplinind rol de protecṭie, atracṭia polenizatorilor. Sunt inflamabile, nu sunt toxice, dar pot provoca alergii la persoanele sensibile la anumite terpenoide (Cadly ṣi colab, 2002).

Suferă degradare chimică în prezenṭa luminii solare, a aerului, a căldurii, acizi ṣi alcani puternici, generȃnd oligomeri de natură nedeterminată. Sunt solubili în solvenṭi organici comuni, aproape nemiscibili în solvenṭii polari asociaṭi (apă, amoniac). Deṭin proprietăṭi de dizolvare pentru polimerii cu inele aromatice, prezente în lanṭul lor. Sunt acceptate ca substanṭe sigure în FDA (Code of [NUME_REDACTAT], 2003).

[NUME_REDACTAT] ssp, conṭine o amplă varietate de uleiuri esenṭiale bogate în compuṣi fenolici ṣi o gamă bogată de produse naturale, între care se găsesc polifenoli precum flavonoizi ṣi antociani. Compoziṭia chimică a uleiului esenṭial de busuioc a fost amplu studiată, arătȃnd o largă varietate de compuṣi (Rattananachaikunsop ṣi Phumpkhachorn, 2010).

Proprietăṭile ṣi utilizările ce le deṭin uleiurile esenṭiale de busuioc pot fi atribuite componenṭilor majoritari precum metilchavicol, linalool, eugenol, alcanfor ṣi metilcinamat. În 1999, Simion ṣi colab., descriu componenṭii majoritari la 6 tipuri de uleiuri esenṭiale comercializate, fiecare derivȃnd din diferite culturi ṣi chemotipuri. În uleiul esenṭial de busuioc, tipul european este considerat de cea mai înaltă calitate ṣi produce mirosul cel mai fin, conṭine linalool ṣi metil-chlavicol ca ṣi componenṭi majoritari, ṣi un procent mai scăzut de 1,8-cineol, α-pinen, ocimen, terpinelol, alcanfor, 4-terpineol, α-terpineol, eugenol ṣi sesquiterpene; uleiul esenṭial din varietatea egipteană este similar cu cel european din punct de vedere al compoziṭiei, cu o excepṭie, prezintă o concentraṭie mai slabă de linalool, în timp ce metil-chlavicolul se găseṣte în cantitate crescută.

Uleiul esenṭial de busuioc prezintă o mare varietate de compuṣi chimici, care îi afectează chemotipul, culoarea frunzelor ṣi florilor, aroma ṣi originea (Da-Silva ṣi colab., 2003).

Ijaz ṣi colab. în anul 2008, au efectuat un studiu în care au demonstrat faptul că atȃt compoziṭia chimică a uleiului esenṭial variază cu frunzele, florile ṣi originea, dar ṣi perioada de semănat ṣi cules influenṭează de asemenea semnificativ compoziṭia în ulei esenṭial. Totuṣi , în manieră generală principalele componente sunt monoterpenele ṣi fenilpropanoidele (Labra ṣi colab., 2004), monoterpene oxigenate (Telci ṣi colab., 2006; Bozin ṣi colab., 2006), hidrocarburi monoterpenice, hidrocarburi monoterpenice aromatice ṣi oxigenate, hidrocarburi sesquiterpenice, sesquiterpene oxigenate ṣi compuṣi alifatici (Bozin ṣi coab., 2006).

În urma unor cercetări s-au identificat compuṣii prezenṭi la majoritatea speciilor: 1,8-cineol, 1,3-octanol, alcamfor, linalol, metilchlavicol sau estragol; în total au fost identificaṭi 55 de compuṣi, ṣi în toate cazurile uleiurile esenṭiale au fost extrase prin hidrodistilare.

În ciuda faptului că studiile asupra compoziṭiei chimice ṣi diverselor proprietăṭi care le posedă uleiul esenṭial de busuioc sunt ample, puṭine sunt cercetările care descriu proprietăṭile fizice ale uleiului.

Antioxidanṭii au fost larg utilizaṭi ca aditivi alimentari pentru a diminua oxidarea. De asemenea, îndeplinesc un rol important în prevenirea îmbătrȃnirii, care sunt bine înrudite cu peroxidarea lipidelor.

Rolul tradiṭional al antioxidanṭilor a fost un punct important, a cărui interes a plecat de la creṣterea în procesele de elaborare ṣi transformare a alimentelor.

Datorită mecanismului său de acṭiune, uleiul esenṭial de busuioc este clasificat ca antioxidant primar deoarece acṭionează prin eliminarea ṣi inactivarea radicalilor liberi produṣi în timpul reacṭiei de oxidare, prin donarea atomilor de hidrogen, întrerupȃnd astfel reacṭia în lanṭ.

Fracṭiunea volatilă reprezintă, fără îndoială, componenta cea mai cunoscută a busuiocului, conṭiunutul fiind dependent de chemotip ṣi varietatea investigată, cu valori cuprinse între 0,04- 0,70%.

Cei mai importanṭi componenṭi ai uleiului sunt: estagolul (metilchlavicolul, peste 87% în unele chemotipuri), linaloolul (chiar peste 75%), eugenolul (peste 20%), apoi ocimen, cineol, un număr de sesquiterpene ṣi derivaṭi fenilpropanici

Tabel 1. Variația procentuală a pricipalelor compenete din uleiul esenṭial de O. basilicum

Uleiul esenṭial este definit pe plan internaṭional ca produsul obṭinut prin hidrodistilarea, distilarea cu vapori sau distilarea uscată printr-un procedeu mecanic adecvat, ale unei plante sau anumitor părṭi dintr-o plantă (Rubiolo P. ṣi colab., 2010).

Uleiurile aromatice sunt lichide aromatice uleioase, volatile, caracterizate printr-un miros puternic, rar colorate ṣi au în general densitatea mai mică decȃt a apei.

Acestea pot fi sintetizate de către toate organele plantei (flori, muguri, seminṭe, frunze, crengi, scoartă, fructe ṣi rădăcini), de unde pot fi extrase ṣi reprezintă doar o mică parte din compoziṭia plantei. Uleiurile esenṭiale conferă caracteristici importante, în urma cărora plantele aromatice sunt folosite în industria alimentară, cosmetică ṣi farmaceutică (Miguel M.G., 2010).

Uleiurile extrase din vȃrfurile înflorite ale plantei prin distilare cu vapori, sunt definite ca esenṭe ṣi poarta numele de uleiuri esenṭiale.

Compoziṭia uleiului diferă în funcṭie de tehnicile de obṭinere ale acestuia, însă procentajul unui compus nu poate fi comparat, deoarece cantitatea ṣi calitatea acestuia depinde de metoda de extragere utilizată. Aparatele ṣi modurile de operare pentru a obṭine uleiuri esenṭiale sunt bine stabilite ṣi descrise în mai multe farmacopei.

Fiind o specie alogamă, Ocimum basilicum este reprezentata de o mulṭime de genotipuri, soiuri distinctive dupa habitusul plantei, culoarea ṣi dimensiunile frunzelor, culoarea florilor, conṭinutul ṣi compoziṭia chimică a uleiului esnṭial: 1-cel cultivat în Europa ṣi America cu componenṭii majori ai uleiului esenṭial methylchavicol, linalool de calitate foarte bună cu aromă fină ṣi care nu conṭine camfor; 2-busuiocul comun din Africa -cu componentul major metilhavicol ṣi coṭinut apreciat de camfor.

La busuioc compoziṭia chimică, concentraṭia componenṭilor uleiului esenṭial sunt caractere variabile controlate genetic ṣi pot fi modificate, inclusiv prin hibridări.

Studii referitoare la ereditatea componenṭilor majori ai uleiului esenṭial la genul Ocimum a demonstrat previzibiliatea creării a patru chemotipuri de Ocimum basilicum care ar sintetiza ṣi acumula ulei esenṭial cu concentraṭia următoare a componentului major: linalool, pȃnă la 84%; metil-chavicol, pȃnă la 85%; metileugenol pȃnă la 68%; metil cinamat, pȃnă la 64%. În studii efectuate la Ocimum basilicum au fost identificate 7 chemotipuri: linalool, metilcinamat, metilcinamat/linalool, citral, meticlhavicol (estragol) ṣi metilchavicol/citral. Alṭi cercetători au constatat că componenṭii majori ai uleiului esenṭial separat din unele soiuri de Ocimum basilicum din SUA sunt linaloolul (30-40%) ṣi eugenolul (8-30%) sau linaloolul ṣi metilchavicolul.

Fig. 13. Eugenol

(sursa: http://theflavourofchemistry.wordpress.com/2011/06/06/eugenolo/)

Compoziṭia chimică a uleiurilor esenṭiale din diferite specii de Ocimum basilicum L., hibrizi ṣi soiuri, are pe lȃngă diferenṭe interspecifice ṣi diferenṭe intraspecifice. Diferenṭele intraspecifice pot apărea uneori din cauza diferenṭelor climatice, geografice sau de sezon, din cauza variabilităṭii genetice sau din cauza cantităṭii de apă sau fertilizatorilor folosiṭi. Compoziṭia chimică a uleiului mai poate diferi în funcṭie de metoda de extracṭie sau în cazul uleiurilor comerciale, prin gradul de amestecare ṣi alterare.

Este important să se păstreze integritatea unui ulei esenṭial, în scopul dea proteja sinergia sa naturală. Componentele care alcătuiesc un ulei esenṭial cooperează pentru a produce efectul lor de vindecare, fără a afecta organismul ṣi fără a produce efecte secundare. În cazul în care un singur component activ este eliminat, sinergia dintre componente se diminuează ṣi pot apărea efecte secundare (Lis-Balchin M., 2002).

Uleiurile esenṭiale posedă o activitate antioxidantă, blochează radicalii liberi ṣi joacă un rol important în prevenirea unor boli: disfuncṭii cerebrale, cancer, boli cardio-vasculare etc. (Miguel M.G., 2010).

3.2. AROAMTERAPIA ȘI ULEIUL DE BUSUIOC

Cuvȃntul ʺaromaterapieʺ combină două cuvinte: aromă-parfum sau miros dulce ṣi terapie-tratament.

Aromaterapia presupune folosirea uleiuriler esenṭiale, care prin inhalare induc efecte fizice ṣi psihice ṣi care menṭin bunăstarea organismului (Edris E., 2007).

[NUME_REDACTAT] defineṣte aromaterapia ca fiind o terapie care utilizează uleiuri esenṭiale ṣi coloizi pe bază de apă extraṣi din plante, pentru susṭinerea sănătăṭii, a echilibrului fizic, emoṭional si spiritual.

Extractele simple sau combinate pot fi vaporizate în aerul inspirat sau folosite în uleiurile pentru masaj ori adăugate în apa de baie. Moleculele inhalate din aceste extracte stimuleazã nervul olfactiv, trimiṭând mesaje sistemului limbic al creierului (centrul memoriei, al învăṭării ṣi al emoṭiei) care se presupune că induce reacṭii fiziologice de raspuns. Medicina clasică pune sub semnul întrebării efectele fiziologice independente, considerȃnd că rezultatele pozitive sunt datorate mai degrabă reflexelor condiṭionate pe care mirosurile le accentuează sau le generează. S-a demonstrat că uleiurile ṣi soluṭiile folosite au anumite efecte, dar rezultatele nu sunt omologate. Printre puṭinele riscuri posibile sunt reacṭiile alergice.

Unele plante au proprietăṭi aromatice speciale cu efect direct asupra psihicului, sănătăṭii sau chiar vieṭii individului. Uleiurile esenṭiale sunt lichide volatile obṭinute prin distilarea diferitelor părṭi ale plantelor: frunze, scoarṭă, seminṭe, fructe, rădăcini, flori, răṣini. Aromele pot fi folosite sub formă de uleiuri (pentru baie, masaj, comprese, inhalaṭii), esenṭe volatile (eliberează arome prin vaporizare în lămpi odorizante), beṭiṣoare parfumate sau ierburi uscate (eliberează arome prin fumigaṭii). Esenṭa degajată prin vaporizare sau fumigaṭii acṭionează asupra nervului olfactiv care transmite creierului un semnal ce declanṣează, în replică, un impuls asupra organismului sau psihicului. Esenṭele folosite pentru băi sau masaje acṭioneaza direct prin absorbṭia lor în piele.

Plantele aromatice au fost folosite încă din timpurile vechi ṣi de numeroase civilizaṭii.

Busuiocul a fost cunoscut si folosit înca din timpuri străvechi. Coroniṭe de busuioc au fost gasite în camerele mortuare din piramidele egiptene.

Lipsa înṭelegerii mecanismelor biochimice de acṭiune al substanṭelor din plante nu a fost niciodată un obstacol în găsirea de răspunsuri la unele probleme de sănătate ṣi utilizare eficientă în tratarea acestora.

Progresele făcute în chimia analitică au permis înṭelegerea compuṣilor biochimici sintetizaṭi în celulele plantelor aromatice.

Uleiurile esenṭiale sunt alcătuite din molecule aromatice naturale ṣi sunt dotate cu numeroase proprietăṭi fiziologice ṣi farmacologice, care au aplicaṭii în aproape orice domeniu al medicinei. Ele au rol nu doar curativ, ci ṣi de prevenire a bolilor.

Folosit în aparatul de aromaterapie sau inhalaṭii uleiul de busuioc are un efect calmant în perioadele de stres ṣi suprasolicitare, reduce tensiunea ṣi epuizarea nervoasă. În plan psihologic stimulează flexibilitatea ṣi diplomaṭia. În tratamentele ayurvedice este considerat un mijloc de curăṭare a energiilor vechi ṣi trezirea energiilor noi.

Percepṭia ṣi reacṭia la uleiurile esenṭiale diferă în funcṭie de sex, vȃrstă, însă toṭi oamenii beneficiază de aromaterapie.

Fitoterapia este terapia care foloseṣte anumite părṭi din plantă sau planta întreagă în scopuri medicinale. Aromaterapia ṣi armatologia (aromaterapie fără masaj) sunt ramuri ale fitoterapiei în care se utilizează numai uleiuri esenṭiale obṭinute prin distilare.

Deṣi sunt simple de utilizat ṣi administrat ele pot concura cu steroizii ṣi antibioticele din medicina alopată, făra a deregla mecanismele de apărare a organismului (Steflitsch W. ṣi Steflitsch M, 2008).

[NUME_REDACTAT], aromaterapia implică aplicarea unui ulei esenṭial foarte diluat sau a unui amestec de ulei esenṭial, care este masat în piele, pa mȃini, picioare, cap sau pe tot corpul. Aromaterapia poate însemna ṣi adăugarea de picături de ulei esenṭial în apa de baie sau într-un bazin cu apă fierbinte sau volatizarea uleiului folosind diverse arzătoare.

Aceasta implică , de obicei, consiliere cu privire la dietă, exerciṭii fizice, stil de viaṭă, etc., de către un aromaterapist care poate practica fără a deṭine o calificare în acest domeniu.

În Franṭa, Geramnia ṣi în alte părṭi ale Europei, aromaterapia implică utilizarea internă de uleiuri esenṭiale ca medicamente ṣi este practicată de medici calificaṭi. Aceasta include introducerea orală, rectală, vaginală de uleiuri esenṭiale în organism, precum ṣi prin masaj cu uleiuri esenṭiale mai concentrate.

În aportul oral, picături de ulei esenṭial sunt amestecate într-un pahar cu apă caldă sau pe un cub de zahăr (o lingurită de miere) ṣi luate pe plan intern. Acest lucru nu reprezintă adevărata aromaterapie, deoarece aproape toate celelalte metode se bazează pe volatizarea uleiului esenṭial ṣi în mare măsură pe efectul acestuia asupra sistemului nervos central (SNC) pe cale nazală ṣi de acolo spre sistemul limbic, în urma căruia pot fi provocate efecte secundare asupra altor părṭi ale corpului.

Pȃnă în prezent, aromaterapia a fost utilizată cu succes în diverse domenii, în special aziluri. Nu există vindecări miraculoase, dar s-a înregistrat o ameloirare a suferinṭei ṣi a durerii în special datorită masajului ṣi a prezenṭei personalului de îngrijire a pacienṭiolor.

Acestă ramură a medicinei alternative pare a fi utilă în tratamentul pacienṭilor ala căror simptome se bazează în mare parte pe stres ṣi care nu răspund la medicina convenṭională, însă este nevoie de o cercetare clinică ṣi toxicologică, înainte de a i se extinde utilizarea.

Este posibil ca un exces de ulei esenṭial în timpul sarcinii ṣi la naṣtere să fie periculos. Studiile ar trebui să vizeze starea de sănătatea a copilului, deoarece există întotdeauna pericolul de supra-sedare a acestuia ṣi a lipsei ulterioare de comunicare personală (Lis-Balchin M., 2002).

Aromaterapia ajută mulṭi pacienṭi ṣi oferă servicii medicale mai ales în îngrijirea cazurilor de cancer, demenṭă ṣi depresie (Steflitsch W. ṣi Steflitsch M., 2008).

CAPITOLUL 4 MATERIALE ȘI METODE

4.1. Material de cercetat

Experimentele din prezentul studiu s-au realizat pe 40 de șobolani albi, masculi, rasa Wistar, care cântăreau 200 – 250 g la începutul experimentului.

Animalele au fost menținute la o temperatură de 220C, umiditate de 50% și au avut acces liber la apă ad libitum și la hrană. Șobolanii au fost tratați în concordanță cu normele instituționale de bioetică privind efectuarea studiilor experimentale pe animale de laborator și toate procedurile experimentale sunt în conformitate cu [NUME_REDACTAT] și [NUME_REDACTAT] din 22 septembrie 2010 (2010/63/EU).

În vederea realizării studiului propus privind influența uleiului esențial de Ocimum basilicum var. purpurascens asupra statusului oxidativ a unui model animal de demență, au fost utilizate metode standardizate de evaluare și de analiză pentru animalele mici de laborator, conform scopului cercetărilor.

4.2. Metode de cercetare

4.2.1. Administrarea substanțelor chimice

Animalele din prezentul studiu au fost împărțite în patru loturi (10 animale/lot): (1) Control (fals-operat); (2) Amiloid beta (1-42) (operat) (Aβ1-42); (3) Amiloid beta (1-42) (operat) care au inhalat ulei de Ocimum basilicum var. purpurascens 1% (Aβ1-42+OBP1%) și (4) Amiloid beta (1-42) (operat) care a inhalat ulei de Ocimum basilicum var. purpurascens 3% (Aβ1-42+OBP3%). Modelul de Alzheimer a fost indus prin injectarea intracerebroventriculară a amiloidului beta (1-42) (Sigma, 400 pmoli), cu 20 de zile înainte de expunerea la uleiul de Ocimum sanctum. Animalele din lotul de control și cu amiloid beta (1-42) au fost supuse acelorași condiții dar în absența expunerii la uleiul de Ocimum basilicum var. purpurascens.

Administrarea amiloidului beta (1-42) s-a realizat intracerebroventricular unilateral-dreapta cu ajutorul unei microseringi Hamilton (10 µl) pe parcursul a 4 minute (4 µl, 1 µl/min) utilizând următoarele coordonate stereotaxice din atlasul lui Paxinos și Watson, 2005: 1,5 mm lateral de linia mediană; 7,4 mm ventral față de suprafața cortexului. Animalele din lotul de control au fost injectate intracerebroventricular cu soluție salină sterilă (0,9% NaCl).

4.2.2. Recoltarea probelor

Animalele au fost sacrificate și s-a colectat hipocampul de la fiecare animal. Fiecare probă de țesut nervos a fost cântărită și omogenizată (1:10) cu gheață, 0,1 M tampon fosfat de potasiu (pH 7,4) și 1,15% KCl. Omogenatele obținute au fost centrifugate (15 minute la 960 x g) iar din supernatantul obținut s-au determinat activitățile specifice ale superoxid-dismutazei (SOD), glutation-peroxidazei (GPX), catalazei (CAT), precum și nivelul glutationului redus (GSH), al proteinelor carbonilate și al malondialdehidei (MDA).

4.2.3. Determinarea activității SOD

Superoxid dismutaza (SOD) catalizează dismutarea radicalului liber de superoxid (O2 -) în oxigen și peroxid de hidrogen.

O2 + O2 + 2 H+ O2 + H2O2

SOD este o enzimă antioxidantă care protejează celulele vii împotriva efectelor nocive ale radicalilor liberi de superoxid care reprezintă una din formele cele mai nocive ale speciilor reactive de oxigen (ROS). Întrucât SOD este prezentă în toate organismele aerobe și în majoritatea compartimentelor subcelulare care generează oxigen activat, se consideră că această oxidoreductază deține un rol central în protecția contra stresului oxidativ care este asociat cu producerea de ROS.

Există trei tipuri distincte de SOD care au fost clasificate pe baza metalului conținut în structura lor. Unele izoenzime ale Cu (II) – Zn (II) – SOD au fost descoperite în citosol, iar altele în cloroplastele plantelor superioare. Mn (III) – SOD este prezentă în mitocondriile celulelor eucariote, precum și în cele procariote; Fe (III) – SOD a fost evidențiată în celulele procariote și în unele alge eucariote.

Activitatea superoxid dismutazei (SOD, EC 1.15.1.1) a fost determinată prin monitorizarea capacității sale de a inhiba reducerea fotochimică a NBT. Fiecare reacție de amestec de 1,5 ml, conține Tris 100 mM / HCl (pH 7.8), NBT 75 mM, riboflavina 2µM , EDTA 6 mM , și 200 μl de supernatant. Monitorizarea creșterii absorbției la 560 nm, este urmată de producerea albastrului formazan. O unitate de SOD este definită ca fiind cantitatea necesară pentru a inhiba rata de NBT prin reducere de 50% (Winterbourn et al., 1975). Activitatea enzimei este exprimată în unități/mg proteină.

4.2.4. Determinarea activității GPX

Glutation peroxidaza (GPX, E.C. 1.11.1.9) este o peroxidază descoperită în plasma sangvină, eritrocite și în diferite țesuturi animale (ficat, mușchi, creier, plămâni). Această enzimă catalizează reducerea hidroperoxizilor, inclusiv a peroxidului de H+, cu ajutorul glutationului redus. În organismul viu, îndeplinește un rol important de protecție a membranelor celulare împotriva prejudiciului oxidativ produs de peroxidarea lipidică.

Cu excepția GPX, fosfolipid – hidroperoxidul care este un monomer, toate celelalte GPX-uri sunt tetrameri alcătuiți din 4 subunități glicoproteice identice. Fiecare subunitate conține un rest de seleno-cisteină în centrul activ care participă direct la reducerea bi-electronică a substratului peroxidic. GPX utilizează glutationul ca ultimul donor de electroni pentru regenerarea formei reduse a seleno-cisteinei. Dacă integritatea membranei celulare și subcelulare depinde puternic de GPX, sistemul protector antioxidant al enzimei este condiționat de prezența Se+.

Activitatea glutation peroxidazei (GPX), a fost analizată printr-un test de spectrofotometrie.

Reacția de amestec constă dintr-un 1 ml de tampon fosfat 0,4 M (pH 7,0) care conține EDTA 0,4 mM, 1 ml de NaN3 5 mM, 1 ml de GSH 4 mM și 200 µl de supernatant care a fost incubat la 37°C, timp de 5 minute.

Apoi, se adaugă 1 ml de 4 mM H2O2 și se incubează la 37°C timp de 5 minute. Excesul de GSH a fost cuantificat prin metoda DTNB descrisă de către Sharma și Gupta (2002). O unitate de GPX este definită ca fiind cantitatea de enzimă necesară pentru a oxida 1nmol GSH / min. Activitatea enzimei este exprimată în unități/mg proteină.

4.2.5. Determinarea activității CAT

Activitatea specifică a catalazei (CAT, EC 1.11.1.6) s-a determinat pe baza metodei descrisă de Sinha (1972). Reacția de amestec constă din 150 µl tampon fosfat (0,01 M, pH 7,0) și 100 µl supernatant. Reacția s-a declanșat prin adăugarea a 250 µl H2O2 0,16 M, incubare la 37ºC timp de 1 minut după care a fost stopată prin adăugarea a 1 ml de acid acetic. Tuburile de reacție au fost păstrate în baia de apă pentru 15 minute până la apariția culorii verzi, iar citirile s-au realizat la spectofotometru la 570 nm. Tuburile de control lipsite de enzimă au fost depozitate în aceleași condiții. Activitatea enzimei este exprimată în µmoli de H2O2 consumați/min/mg proteină.

4.2.6. Determinarea conținutului total de GSH redus

Glutationul (GSH) s-a determinat pe baza metodei descrisă de Fukuzawa și Tokumura (1976). Astfel, s-au amestecat 200 µl supernatant cu 1,1 ml tampon fosfat de sodiu 0,25 M (pH 7,4) și 130 µl DNTB 0,04%. În final, amestecul a fost adus la un volum de 1,5 ml cu apă distilată iar absorbanța s-a citit la spectofotometru la 412 nm. Conținutul total de GSH redus a fost exprimat în µg GSH/µg proteină.

4.2.7. Determinarea nivelului proteinelor carbonilate

Gradul de oxidare al proteinelor din hipocamp a fost evaluat prin determinarea nivelului de grupări carbonil pe baza metodelor descrise de Oliver et al. (1987) și Luo and Wehr (2009). Supernatantul a fost împărțit în două probe care conțin fiecare aproximativ 2 mg de proteină. În ambele probe s-a produs precipitarea proteinelor prin adăugare de acid tricloracetic 10% (w/v, concentrația finală). Una din probe a fost tratată cu HCl 2N iar cealaltă probă cu DNPH 0,2% (w/v) în HCl 2N. ambele probe au fost incubate la 25ºC și agitate la intervale de 5 minute. Probele au fost precipitate din nou cu acid tricloracetic 10% (w/v, concentrația finală) și extrase cu etanol-acetat de etil (1:1, v/v) și apoi precipitate cu acid tricloracetic 10%. Ulterior au fost dizolvate în uree 8M cu tampon fosfat de sodiu 20 mM, pH 6,5. Resturile celulare insolubile au fost îndepărtate prin centrifugare la 13000 x g la 4ºC. Absorbanța s-a citit la spectofotometru la 370 nm comparând problele tratate cu DNPH cu cele cu HCl (control). Rezultatele sunt exprimate în nmoli DNPH/mg proteină.

4.2.8. Determinarea nivelului MDA

Malondialdehida (MDA) este un indicator al peroxidării lipidelor și a fost măsurată spectrofotometric cu ajutorul testului de acid tiobarbituric (Okhawa et al. 1979). Se adaugă 200 μl de supernatant care se amestecă cu 1 ml de acid tricloracetic 50% în HCl 0,1M și 1ml de acid tiobarbituric 26 mM. După vortexare, probele au fost menținute la 95°C timp de 20 de minute.

Ulterior, probele au fost centrifugate la 960 x g, timp de 10 minute iar supernatanții au fost citiți la 532 nm. S-a construit apoi curba de etalonare și rezultatele au fost exprimate în nmol/mg proteină.

4.2.9. Determinarea concentrației proteinelor

S-a utilizat metoda BCA (acid bicinconinic) descrisă de Smith et al. (1985).

4.2.10. Calculul statistic al datelor experimentale

Aplicând metodele statisticii matematice se poate calcula o valoare cât mai apropiată de cea reală și se poate estima și gradul de certitudine al respectivelor rezultate, deoarece este greu ca în practică să se facă un număr foarte mare de determinări.

Utilizarea statisticii matematice în investigațiile experimentale este indispensabilă, deoarece compararea gradului de corelare și estimare a fenomenelor necesită etaloane precise.

Pentru prelucrarea statistică a datelor am aplicat testul „t” al lui Student. Au fost calculate:

media aritmetică (M),

eroarea standard a mediei (E.S.M.)

Media aritmetică

Reprezintă raportul dintre suma tuturor valorilor individuale și numărul total al valorilor individuale (n) ale probelor.

unde:

xi – valorile individuale,

n – numărul total al valorilor individuale.

Eroarea standard

Deoarece media aritmetică nu scoate în evidență dispersia valorilor individuale în jurul valorii medii, precum și granițele de variație a șirului statistic, se impune calcularea acestui indice de dispersie, care este eroarea standard (Es).

unde σ reprezintă abaterea standard și se calculează după formula standard:

unde: d21 reprezintă pătratul diferențelor dintre media aritmetică și valorile individuale; n = numărul de determinări

CAPITOLUL 5 REZULTATE ȘI DISCUȚII

5.1. REZULTATE

5.1.1. Efectul inhalării uleiului esențial de Ocimum basilicum var. purpurascens asupra activităților specifice ale SOD, GPX și CAT

Analizele biochimice au evidențiat că inhalarea uleiului esențial de Ocimum basilicum var. purpurascens a determinat scăderea semnificativă a activităților specifice a SOD (p<0,0001) (Fig. X) și CAT (p<0,005) (Fig. X), precum și creșterea semnificativă a activității specifice a GPX (p<0,0001) (Fig. X) în loturile tratate cu amiloid beta (1-42) comparativ cu loturile tratate numai cu amiloid beta (1-42).

În contrast, amiloidul beta (1-42) manifestă efecte prooxidante puternice, cuantificate prin creșterea semnificativă a activităților specifice ale SOD și CAT, precum și prin scăderea semnificativă a activității specifice a GPX în omogenatele hipocampilor șobolanilor de laborator.

5.1.2. Efectul inhalării uleiului esențial de Ocimum basilicum var. purpurascens asupra conținutului total de GSH redus și a nivelului proteinelor carbonilate și MDA

Analizele biochimice au evidențiat că inhalarea uleiului esențial de Ocimum basilicum var. purpurascens a determinat creșterea semnificativă a conținutului total de GSH redus (p<0,0001) (Fig. 17), precum și scăderea semnificativă a nivelului de proteine carbonilate (p<0,0008) (Fig. 18.) și a nivelului MDA (p<0,001) (Fig. 19.) în loturile tratate cu amiloid beta (1-42) comparativ cu loturile tratate numai cu amiloid beta (1-42). În contrast, amiloidul beta (1-42) manifestă efecte prooxidante puternice, cuantificate prin scăderea semnificativă a conținutului total de GSH redus și prin creșterea semnificativă a nivelului proteinelor carbonilate și a MDA în omogenatele hipocampilor șobolanilor de laborator.

5.2. DISCUȚII

Una din cauzele majore de apariție a bolii Alzheimer este acumularea în creier a amiloidului beta. Până în momentul de față nu există un model animal care să reproducă toate deficiențele cognitive, comportamentale, biochimice și histopatologice observate la pacienții cu boala Alzheimer.

Majoritatea modelelor animale se obțin prin injectarea peptidelor amiloidice sintetice A40 și A42 analoage cu peptidele identificate în plăcile neuritice de la pacienții cu Alzheimer (Yamada and Nabeshima, 2000).

Datorită abilității sale de a induce oxidarea proteinelor și inhibarea activităților specifice ale enzimelor antioxidante, a apărut ipoteza că amiloidul beta poate acționa ca un prooxidant. Stresul oxidativ se caracterizează prin peroxidarea lipidelor, a proteinelor și a ADN, precum și prin modificarea nivelului antioxidanților (Markesbery, 1997). În urma peroxidării lipidelor se formează numeroase aldehide reactive precum 4-hidroxinonenal, malondialdehida și acroleina, care au fost identificare imunochimic în creierul pacienților cu boala Alzheimer. Dintre sistemele enzimatice cu rol antioxidant amintim glutation-peroxidaza, glutation-reductaza, glutation-transferaza, superoxid-dismutaza și catalaza, precum și substanțe de natură neproteică: glutationul, vitaminele C și E etc. (Pocernich et al., 2001).

Ocimum basilicum var. purpurascens este o nouă varietate de busuioc care recent a captat atenția cercetătorilor (Carović-Stanko et al., 2010). Datorită conținutului mare de antociani (Carović-Stanko et al., 2011), această varietate manifestă un potențial antioxidant ridicat (Kwee and Niemeyer, 2011). În literatura de specialitate, sunt semnalate puține articole care să descrie capacitatea antioxidantă a acestei varietăți (Landi et al., 2013).

În prezentul studiu, la șobolanii tratați cu amiloidul beta s-a constatat o intensificare a activităților specifice a SOD și CAT, un nivel ridicat de proteine carbonilate și MDA, precum și scăderea conținutului total de GSH redus și a activității specifice a GPX în omogenatele de hipocamp.

Intensificarea activității specifice a SOD și CAT s-a desfășurat în paralel cu creșterea nivelului proteinelor carbonilate și MDA din omogenatele de hipocamp, sugerându-se astfel necesitatea acestor evenimente pentru a îndepărta radicalii superoxid induși ca răspuns la administrarea amiloidului beta (1-42).

Intensificarea oxidării proteinelor s-a evidențiat în bolile neurodegenerative (Stadtman 1992), fiind corelată cu prezența proteinelor carbonilate (Stadtman 1992). Acestea apar ca răspuns al acțiunii directe a radicalilor liberi asupra lanțurilor de aminoacizi din structura proteinelor.

Malondialdehida este cea mai abundentă aldehidă care rezultă din peroxidarea lipidelor și poate fi considerată un marker al peroxidării lipidice. Mai mult, intensificarea peroxidării lipidice a fost constatată la modelele animale ale bolii Alzheimer induse prin administrarea amiloidului (Pratico et al. 2001).

Ambele doze de ulei volatil de Ocimum basilicum var. purpurascens inhalate de șobolani au restaurat activitățile specifice ale SOD, CAT și GPX în omogenatele de hipocamp ale șobolanilor tratați cu amiloid beta (1-42). De asemenea, ambele doze de ulei volatil de Ocimum basilicum var. purpurascens au scăzut nivelul proteinelor carbonilate și MDA și au crescut nivelul total al GSH redus în omogenatele de hipocamp ale șobolanilor tratați cu amiloid beta (1-42).

Prezentul studiu susține ipoteza potrivit căreia scăderea activităților specifice ale SOD și CAT în omogenatele de hipocamp ale șobolanilor tratați cu amiloid beta (1-42) poate fi legată de scăderea sintezei intracelulare a H2O2, concomitent cu intensificarea activității GPX. Aceste acțiuni sunt acompaniate de scăderea peroxidării lipidelor și a oxidării proteinelor, sugerându-se astfel că ulei volatil de Ocimum basilicum var. purpurascens prezintă puternice proprietăți antioxidante.

CONCLUZII

Inhalarea uleiului volatil de Ocimum basilicum var. purpurascens de către animalele tratate cu Aβ(1–42) a determinat scăderea semnificativă a activităților specifice a SOD și CAT din omogenatele de hipocamp într-o manieră doză dependentă.

Inhalarea uleiului volatil de Ocimum basilicum var. purpurascens de către animalele tratate cu Aβ(1–42) a determinat creșterea semnificativă a activității specifice a GPX din omogenatele de hipocamp într-o manieră doză dependentă.

Inhalarea uleiului volatil de Ocimum basilicum var. purpurascens de către animalele tratate cu Aβ(1–42) a determinat scăderea semnificativă a nivelului proteinelor carbonilate și MDA din omogenatele de hipocamp într-o manieră doză dependentă.

Inhalarea uleiului volatil de Ocimum basilicum var. purpurascens poate reface statusul antioxidant al creierului și poate induce efecte neuroprotective prin diminuarea stresului oxidativ indus de administrarea Aβ(1–42). De aceea, uleiul volatil de Ocimum basilicum var. purpurascens poate fi utilizat pentru ameliorarea deficitelor cognitive asociate cu boala Alzheimer.

BIBLIOGRAFIE

1. Àlvarez M. R., Meléndez L. A., Cosío S., M.R., 2012. Procedemientos para la extraccion de aceites esenciales en plantas aromaticas. [NUME_REDACTAT] de Investigaciones Biológicas des Noroeste, México, pag.4.

2. Behl C, Davis J, Lesley R, Schubert D (1994) Hydrogen peroxide mediates amyloid beta protein toxicity. Cell 77:817-827.

3. Bozin, B., Mimica-Dukic, N., Simin, N., Anackov, G., 2006. Characterization of the volatile composition of essential oils of some Lamiaceae spices and the antimicrobial and antioxidant activities of the antire oils. Journal of Agricultultural and [NUME_REDACTAT]. 54 (5): 1822-1828.

4. Butterfield D. A., 1996. Alzheimer's disease: a disoder of oxidative stress. Alzheimer's Disease. Review, 1:68-70.

5. Butterfield D. A., Martin L., Carney J. M., Hensley K. 1996. Aβ (25—52) peptide displays H2O2 like reactivity towards aque-ous Fe2+ nitroxide spin probes, and synaptosomal membrane proteins. [NUME_REDACTAT] 58, 217-228.

6. Ciobîcă, A.S., 2007. Aspecte neurofiziologice ale proceselor de memorare ṣi învăṭare. Interacṭiunea unor receptori colinergici cu unii receptori catecolaminergici în procesele cognitive. vol. 3. Editura „Universităṭii [NUME_REDACTAT] Cuza”, Iaṣi , pag. 33-39.

7. Chauchan, V., Chauchan, A., 2006. Oxidative stress in Alzheimer's disease. Pathophysiology, 13, 195-208.

8. Chauchan, V., Chauchan, A., 2006. Oxidative stress in Alzheimer's disease. Pathophysiology, 13, 195-208.

9. Cardoso-Ugarte G.A., Sosa- Morales M.E., 2012. Propriedades del aceite esencial de albahaca (Ocimum basilicum L.) y sus aplicaciones en alimentos. Temas selectos de Ingineria de alimentos 6-1: 54-65.

9. Edris, E., 2007. Pharmaceutical and therapeutic potentials of essential oils and their individual volatile constituient. [NUME_REDACTAT]. 21, 308-323.

10. European pharmacopoenia, 5, 2005.

11. Fukuzawa K, Tokumura A (1976) Glutathione peroxidase activity in tissues of vitamin E-deficient mice. J [NUME_REDACTAT] Vitaminol 22:405-407

11. Gheorghe, M. D., Marinescu., 2005. [NUME_REDACTAT] – Baze etiopatogenice, clinice ṣi terapeutice. [NUME_REDACTAT] Universitară, Bucureṣti, pag. 29-52.

12. Guṣuleag, M., SăvulescuT., 2003. Labiatae

13. Greabu M., Biochimia cavităṭii orale 2001. [NUME_REDACTAT] pag. 132.

14. Haorab H., 2007 . Oxidative stress activates protein tyrosin kinase and matrix metalloproteinases leadinng to blood-barrier dysfunction. J. Neurochem, 101 (2), 566-576

15. Hriṭcu, L., Clicinschi M., Nabeshima T., 2007. Brain serotonin depletion impairs short-term memory, but not long-term memory in rats. Physiology & Behavior, 91 (5), pp. 652-657, 2007.

16. Ijaz, A., F., Hussain, S., Przbylski, R., 2008. Chemical composition, antioxdant and antimicrobial activities of basil (Ocimum basilicum) essential oils depends on seasonal variations. [NUME_REDACTAT]. 108:986-995.

17. Ianusevici, V., 2008. Demenṭa Alzheimer – ghid prin labirintul comunicării. [NUME_REDACTAT], Bucureṣti, pag. 15-35.

18. Jayasinghe, C., Gotoh, N., Aoki. T. Wada, S., 2003. Phenolics composition of sweet basil (Ocimum basilicum L.). Journal of Agriculture and [NUME_REDACTAT]. 51(15) :4442-4449.

19. Jhoo JH, Kim HC, Nabeshima T, Yamada K, Shin EJ, Jhoo WK, Kim W, Kang KS, Jo SA, Woo JI (2004) Beta-amyloid (1-42)-induced learning and memory deficits in mice: involvement of oxidative burdens in the hippocampus and cerebral cortex. [NUME_REDACTAT] Res 155:185-196

19. Kintzios S., Makri O., Panagiotopulos E., Scapeti M., 2003. In vitro rosmarinic acid accumulation in sweet basil (Ocimum basilicum L.), [NUME_REDACTAT], 25:405

20. Labra, M., Miele., Ledda, B., Grassi, F., Mazzei, M. Sala, F. 2004. Morphological characterization, essential oil composition and DNA genotyping of Ocimum basilicum L., cultivars. [NUME_REDACTAT]. 167 (4): 725-731.

21. Lis-Balchin, M., 2002. Lavender. The genus Lavandula. Taylor & [NUME_REDACTAT], pag. 1-194.

22. Lyras L, Cairns N, Jenner A, Jenner P, Halliwell B (1997) An assessment of oxidative damage to proteins, lipids, and DNA in brain from patients with Alzheimer’s disease. J Neurochem 68:2061-2069.

22. Miguel, G., 2010. Antioxidant and [NUME_REDACTAT] of [NUME_REDACTAT]. Molecules, 15, 9252-9287

23. Mohandas, E., V., Raughunath, B., 2009. Neurobiology of Alzheimer's disease. [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT], 51, 55-61.

24. Marotti M., Piccaglia R., Giovaneli E., 1996. Differences in essential oil composition of basil (Ocimum basilicum L.) Italian cultivars related to morphological characteristics J. Arig. [NUME_REDACTAT]. 44: 3926-3929

25. Oliver CN, Ahn BW, Moerman EJ, Goldstein S, Stadtman ER (1987) Age-related changes in oxidized proteins. J [NUME_REDACTAT] 262 (12):5488-5491

25. Panaitescu, R., 2005. Probleme de memorie ṣi boala Alzheimer. [NUME_REDACTAT] Doamnei, Piatra-Neamṭ, pag. 32-40.

26. Paton, J. A., 2000. Journal of Ecology. vol. 88, pag. 182.

26. Politeo, O., Jukic, M., Milos, M., 2007. Chemical composition and antioxidant capacity of free volatile aglycones from basil (Ocimum basilicum L.) compared with its essential oil, [NUME_REDACTAT]. 101 (1): 379-385.

28. Praticò D, Uryu K, Leight S, Trojanoswki JQ, Lee VM-Y (2001) Increased lipid peroxidation precedes amyloid plaque formation in an animal model of Alzheimer amyloidosis. J Neurosci 21 (12):4183-4187

28. Pushpangadan P., Bradu B. L., 1995 . Basil. Advances in Horticulture, Medicinal and [NUME_REDACTAT], vol. 2. Eds. Dr. K.L. Chadha &Dr. [NUME_REDACTAT] pp. 627-657

29. Rattanachaikeensopon, P., Phumkhachoru P., 2012. Antimicrobial activity of basil (Ocimum basilicum L.) oil against Salmonela enteridis in vitro and in food. Bioscience, Biotechnologycal and Biochemistry. 74 (6): 1200-1204.

30. Rubiolo, P., Sgorbini, B., Liberto, E., Cordero, C., Bicchi, C., 2010. Essential oils and volatiles :sample preparation and analysis. Flavour and [NUME_REDACTAT] 25, 282-290.

31. Ryding, O. 1994. Notes on the sweet basil and its wild reletives (Lamiaceae). [NUME_REDACTAT] 48: 65-67.

32. Simion, J., Morales, M., Phippen, W., Fontes, R., Hao, Z., 1999. Basil: A source of aroma compounds and popular culinary and ornamental herb, Perspectives on new crops and new uses. 16 (45) :499-505

34. Sinha AK (1972) Colorimetric assay of catalase. [NUME_REDACTAT] 47:389-394

33. Sharma M., Gupta Y.K., Chronic treatment with trans resveratrol prevents intracerebroventricular streptozotocin induced cognitive impairment and oxidative stress in rats, [NUME_REDACTAT]., 2002, 71, 2489-2498.

34. Stadtman E (1992) Protein oxidation and aging. Science 257:1220-1224

33. Steflitsch, W., Steflitsch, M., 2008. Clinical aromatherapy. [NUME_REDACTAT] Men's Health, 5, 74-85.

34. Telci, I., Bayram, E., Yilmaz, G. Avci, B., 2006. Variability in essencial oil composition of Turkish basils (Ocimum basilicum L.)., [NUME_REDACTAT] and Ecology. 34 (6):489-497.

35. Toescu E. C., 2003. Neuronal ageing from an intraneuronal perspective: roles of endoplasmatic reticulum and mithocondria. [NUME_REDACTAT], 34, 311-323.

36. WINTERBOURNE C.C., HOW KINS R.E., BRAIN M., CARRELL R.W. (1975) The estimation of red cell superoxide dismutase activity, J. Lab. Clin. Med., 85, 327-341

36. Zhu, X., Arun K. Raina, Hyoung-gon Lee, [NUME_REDACTAT], Mark A. Smith. [NUME_REDACTAT], 2004. Oxidative stress signaling in Alzheimer's desease. [NUME_REDACTAT], 1000, 32-39.