Influenta Sarurilor Unor Metale Grele Asupra Cromozomilor Mitotici Si Germinarii la Vicia Faba

LUCRARE DE DISERTAȚIE

INFLUENTA SARURILOR UNOR METALE GRELE ASUPRA CROMOZOMILOR MITOTICI SI GERMINARII LA VICIA FABA

CUPRINS

INTRODUCERE

SCOPUL INVESTIGATȚIILOR

Capitolul I CARACTERIZAREA GENERAL BIOLOGICĂ A SPECIEI VICIA FABA

Încadrarea sistematică, originea și răspândirea speciei

Descrierea anatomică și morfologică a speciei

Condiții de cultură. Boli si dăunători

Întrebuințări

Capitolul II DIVIZIUNEA CELULARĂ MITOTICĂ

2.1. Fazele diviziunii mitotice

Capitolul III MUTAȚIILE

3.1. Definirea mutației și tipuri de mutații

3.2. Factorii mutageni

3.2.1. Factorii mutageni fizici

3.2.2. Factorii mutageni chimici

3.3. Mecanismul molecular al mutațiilor induse chimic

3.4. Importanța mutațiilor

3.5. Aberații cromosomiale

3.5.1. Modificări cromosomiale structurale

Capitolul IV SARURILE METALELOR GRELE (sulfatul de cupru si acetatul de plumb)

4.1Poluarea cu metale grele …………………………………

4.2 Săruri de cupru ………………..………….……………………………… 18

4.3 Săruri de plumb

Capitolul V MATERIAL ȘI METODE DE LUCRU

5.1. Material biologic

5.2. Mod de lucru

Capitolul VI REZULTATE ȘI INTERPRETĂRI

6.1. Influența sulfatului de cupru și a acetatului de plumb asupra diviziunii mitotice la Vicia faba

6.1.1. Frecvența totală a celulelor în diviziunea mitotică în meristemele radiculare de Vicia faba tratate cu sulfat de cupru

6.1.2. Frecvența totală a celulelor în diviziunea mitotică în meristemele radiculare de Vicia faba tratate cu acetat de plumb

6.1.3. Frecvența celulelor în diferite faze ale diviziunii mitotice în meristemele radiculare de Vicia faba cu sulfat de cupru și acetat de plumb

6.1.3.1. Frecvențele celulelor în profaza – Vicia faba tratat cu sulfat de cupru

6.1.3.2. Frecvențele celulelor în metafaza – Vicia faba tratat cu sulfat de cupru

6.1.3.3. Frecvențele celulelor în anafaza – Vicia faba tratat cu sulfat de cupru

6.1.3.4. Frecvențele celulelor în telofaza – Vicia faba tratat cu sulfat de cupru

6.1.3.5. Frecvențele celulelor în profaza – Vicia faba tratat cu acetat de plumb

6.1.3.6. Frecvențele celulelor în metafaza – Vicia faba tratat cu acetat de plumb

6.1.3.7. Frecvențele celulelor în anafaza – Vicia faba tratat cu acetat de plumb

6.1.3.8. Frecvențele celulelor în telofaza – Vicia faba tratat cu acetat de plumb

6.2. Aberații structural-cromosomiale în A-T mitotică la Vicia faba, consecutiv tratamentului cu sulfat de cupru

6.3. Aberații structural-cromosomiale în A-T mitotică la Vicia faba, consecutiv tratamentului cu acetat de plumb

CONCLUZII GENERALE

BIBLIOGRAFIE

SCOPUL INVESTIGAȚIILOR

În cadrul lucrării de față, ne-am propus să cercetăm și să comparăm rezultatele obținute prin expunerea la două saruri de metale – sulfat de cupru și acetat de plumb a meristemelor radiculare la Vicia faba.

Studiul a vizat evidențierea efectului acestor aditivi asupra frecvenței celulelor în diviziunea mitotică și a capacității de inducere a aberațiilor cromozomiale în ana – telofază în meristemele radiculare de Vicia faba.

Alegerea temei a avut drept punct de sprijin faptul că, din punct de vedere științific, este abordat un subiect interesant și de actualitate in contextul impactului poluarii asupra mediului si organismelor vii.

I. CARACTERIZAREA GENERAL BIOLOGICĂ A SPECIEI

VICIA FABA (2n = 16)

SPECIA Vicia faba l.- CARACTERIZARE GENERAL BIOLOGICĂ

Încadrarea sistematică, originea și răspândirea speciei

Planta erbacee , annuală trofică , autogamă ,legumicolă cu valoare terapeutică ,furajeră ,industrială ,meliferă ,cultivată.

Regn: Plantae

Încrengătură: Magnoliophyta

Clasă: Magnoliopsida

Subclasă:Rosidae

Ordin: Fabales

Familie:Fabaceae

Gen:Vicia

Specie:V. faba

Istoric

Vicia faba este o plantă care a intrat în cultură din timpuri îndepărtate , unii autori fiind chiar de părere ca este cea mai veche leguminoasă cultivată.

In Egipt s-au gasit semințe de bob în mormintele dinastiei a XII-a ( 2400-2200 i.Hr). Aceasta nu se deosebeste prea mult de formele cultivate în zilele noastre . în Asia primii care au cunoscut bobul sunt chinezii ( 2800 i.Hr) . Ei au inceput sa-l cultive abia în secolul I i.Hr..

Vicia faba L. era raspândită în Troia si în insula Creta . în antichitate era apreciat ca o plantă alimentară de egipteni , evrei , greci. În Atena antică era rezervată o zi pe an cinstirii acestei plante. Ea nu lipsea din ofrandele ce se aduceau zeilor la anumite sărbători.

Românii îl foloseau la fabricarea pâinii în amestec cu grâul . Therofrast (371-286 i.Hr), în opera sa furnizează amănunte privind cultura sa.

Vicia faba s-a menținut în cultura importantă de-a lungul timpurilor în Europa centrală si occidentală . Suprafetele ocupate de această plantă s-au micșorat numai după ce cartoful si fasolea , plante importate din America s-au extins în agricultura europeană.

In prezent ocupă pe Glob 3.2 mil ha(FAO 1986). Se cultivă mult în China ( 1 800 000 ha), Africa cca 800 mii ha ( Egipt 140 mii ha) , America de N si Centrală , 90 mii ha , America de S 200 mii ha . în Europa se cultivă pe 310 mii ha( Italia , 135 mii ha , Spania, 50 mii ha, Franța , 41 mii ha , Portugalia, 26 mii ha. etc.) . plantă este cultivată în bazinul Dunării înca din Neolitic., în acest sens Ion Pachia Tatomirescu (1997) în lucrarea sa Zalmoxianismul si plantele medicinale sustine ca în acea vreme plantă se numea la daci modzulia din care mai tarziu a derivat numele de mazarila, mazaroi, iar mai tarziu a fost numita bob.

ECOLOGIE

Putin pretențios fată de căldură, semințele germinează la minimun 3-4 ° C , si optim 18-20 °C . La înflorire are nevoie de temperatura moderată (15-20 ° C). Suporta bine înghețurile ușoare de primăvară, fără a coborâ temperatură de -5° C .

Pretentios fata de umiditate , mai ales la germinare , inflorire , formarea pastairilor . Secetea provoaca avortarea florilor . Preferă solurile grele , argiloase , care păstrează umiditatea cu reacția ionică ușor acidă până la ușor alcalină . Cele mai potrivite sunt solurile brune-roșcate si cernozoimurile levigate cu un pH de 6-7.5. În general solul trebuie să fie profund, afânat , bine aprovizionat cu apă si elemente nutritive. În România cele mai bune condiții de cultură se află în Transilvania si Nordul Moldovei.

Descrierea anatomică și morfologică a speciei

Rădăcina este pivotantă , cu ramificații secundare prevăzute cu nodozităti colțuroase , neregulate . Pătrunde în sol până la 1,20 m, rădăcinile laterale ,abudent ramificate , se răspândesc pe o rază de 50-60cm .

Tulpina ,in 4 muchii, este erectă, goală în interior, glabra , slab ramificată , având o înălțime de 80-120 cm .

Frunzele paripenat-compuse cu 2-3 perechi de foliole mari prevăzute cu nectarii (glande), reprezentând puncte de atracție pentru afide .

Foliolele sunt eliptice, glabre, cărnoase de culoare verde , verde-cenușiu sau verde-albăstrui , de 4-9 cm lungime si 2-6 cm lățime .

Stipelele sunt mari , au formă ovoid-lanceolată și sunt prevăzute adeseori cu pete violet-negricioase , care de fapt reprezintă nectarii extraflorali.

Florile sunt mari de 2,5 – 3 cm lungime , de culoare albă , cu o pata neagră pe fiecare aripioară si dungi închise pe partea mijlocie a stindardului. Florile au un miros slab, placut .

Florile sunt grupate câte 3-7 în raceme .

Vicia faba este o plantă autogamă , se întâlnesc însă și cazuri de fecundare încrucișată . Insectele ajută în mod mecanic la deschiderea florilor .

Fig1. imagine preluata :http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/e/e1/Illustration_Vicia_faba1.jpg/642px-Illustration_Vicia_faba1.jpg

Fructul este o păstaie care la maturitate devine neagră ori brun-inchisă . Schimbarea culorii pastăii din verde , când este nematură , în neagra la maturitate , se datorează oxidării tirozinei răspândită în tesuturile pericarpului . Fructul este de formă cilindrică ori turtită , catifelat la exterior.

Lungimea păstăii este de 4-14 cm , lățimea de 1,5-2,0 cm si cuprinde 3-5 boabe .

Semințele sunt de formă cilindrică până la plată, având lungimea de 0,7-30mm și culoare gălbuie , cafenie , roșiatică , sau negricioasă . Hilul este liniar și așezat la una din extremitățile seminței .

1.3 Condiții de cultură. Boli si dăunători

Cerințe fată de climă si sol

Clima

Specia Vicia faba este puțin pretentioasă la căldură. Plantele mici pot suporta înghețuri ușoare de până la -4° C. Totuși în sudul Europei se găsesc în cultura și soiuri de toamnă , care pot rezista la iernile blânde din aceste regiuni .

Temperatura minimă de germinație este de 3-4° C , boboul răsare în 17 zile , dacă temperatura solului este de 8° și în 7 zile, când temperatura este de 20°

Temperatura favorabilă fructificării este de 15-20° C

Vicia faba este o cultură cu cerințe mari fată de umiditate . Seceta nu este suportată de plantă, chiar daca nu durează mult, o sensibilatate mare o arată bobul fată de secetă atmosferică .

Solul

Vicia faba se dezvoltă pe soluri grele, bogate în argilă , cu un conținut satisfăcător în calciu , capabile să retină bine umiditatea .

Nu se poate cultiva în locuri mlăștinoase ori sărăturoase. Solurile ușoare se pot folosi doar dacă climatul este umed sau cultura este irigată, în astfel de soluri se folosesc îngrășăminte naturale si minerale .

In România Vicia faba este răspândită în zona solurilor podzolice.

Boli si dăunători

Boli

Cea mai importantă boală este rugina , produsa de ciuperca Uromyces viciae-fabae

Semnalele bolii sunt : pustule ruginii prăfoase pe frunze, mai târziu apar pustule brune-negricioase .

Dăunători

Gărgărita bobului- Bruchus rufimanus . Femelele depun ouăle pe păstaile tinere . Larvele rod pereții si pătrund în fructe , unde se dezvoltă până la transformarea în adult , hrănindu-se cu conținutul boabelor .

Mijloace de combatere : gazarea boabelor îndată dupa treierat, folosirea unei semințe cu o vechime de 2 ani.

Gărgărita frunzelor de mazăre- Sitona sp. Atacă frunzele tinere, adesea vătămând regiunea de creștere . Larvele acestei specii produc si ele daune prin faptul că trăind în sol distrug nodozitățile.

Mijloace de combatere: semănatul mai devreme , folosirea soiurilor ce au un ritm rapid de creștere , tratarea boabelor cu nitragin , aplicarea de îngrăsăminte , prăfuire cu preparate chimice DDT sau HCH la apariția adultului.

1.4 Întrebuințări

Vicia faba are intrebuințări multiple.Astfel, in alimentația omului se folosesc păstăile tinere, semințele verzi si uscate, ajunse la maturitate, iar, uneori,chiar frunzele, preparate sub diferite forme: salate, supe, ciorbe, soteuri, mancare, creme.

Semintele, uscate, prajite si macinate, se pot utiliza la obtinerea surogatului de cafea, iar sub forma de făina, in amestec cu cea de grau sau de secara, servesc la prepararea unui sortiment de paine.

Toate partile plantei constituie un bun furaj pentru animale, iar din frunze se poate extrage acid citric.

In cultura, Vicia faba , asemeni altor leguminoase, este o buna premergatoare pentru alte plante, contribuie la imbunătățirea insușirilor solului, se poate folosi ca îngrășământ verde.

Datorită plantelor cu port înalt si viguroase, se recomandă pentru cultivarea în benzi, între care se amenajează culise in scopul protejării împotriva vântului si a curenților reci de aer, a legumelor sensibile, ca pepenii, castraveții, fasolea.

Valoarea alimentară a părților comestibile rezida mai ales din conținutul ridicat in proteine, care în boabele uscate poate atinge 25 – 30% si in vitaminele C, B1, caroten.

Păstăile tinere si boabele verzi sunt perfect digerabile si au proprietăți astringente, constituind un remediu pentru deranjamente stomacale

II. DIVIZIUNEA CELULARĂ MITOTICĂ

2.1. Fazele diviziunii mitotice

În diviziunea celulară se disting două categorii de evenimente: evenimente reproductive, prin care sunt dublate structurile funcționale ale celulei, esențiale fiind dublarea cromosomilor, și evenimente distributive, prin care materialul rezultat în urma replicației este repartizat celulelor fiice (Tudose, 1992).

MitozBruchus rufimanus . Femelele depun ouăle pe păstaile tinere . Larvele rod pereții si pătrund în fructe , unde se dezvoltă până la transformarea în adult , hrănindu-se cu conținutul boabelor .

Mijloace de combatere : gazarea boabelor îndată dupa treierat, folosirea unei semințe cu o vechime de 2 ani.

Gărgărita frunzelor de mazăre- Sitona sp. Atacă frunzele tinere, adesea vătămând regiunea de creștere . Larvele acestei specii produc si ele daune prin faptul că trăind în sol distrug nodozitățile.

Mijloace de combatere: semănatul mai devreme , folosirea soiurilor ce au un ritm rapid de creștere , tratarea boabelor cu nitragin , aplicarea de îngrăsăminte , prăfuire cu preparate chimice DDT sau HCH la apariția adultului.

1.4 Întrebuințări

Vicia faba are intrebuințări multiple.Astfel, in alimentația omului se folosesc păstăile tinere, semințele verzi si uscate, ajunse la maturitate, iar, uneori,chiar frunzele, preparate sub diferite forme: salate, supe, ciorbe, soteuri, mancare, creme.

Semintele, uscate, prajite si macinate, se pot utiliza la obtinerea surogatului de cafea, iar sub forma de făina, in amestec cu cea de grau sau de secara, servesc la prepararea unui sortiment de paine.

Toate partile plantei constituie un bun furaj pentru animale, iar din frunze se poate extrage acid citric.

In cultura, Vicia faba , asemeni altor leguminoase, este o buna premergatoare pentru alte plante, contribuie la imbunătățirea insușirilor solului, se poate folosi ca îngrășământ verde.

Datorită plantelor cu port înalt si viguroase, se recomandă pentru cultivarea în benzi, între care se amenajează culise in scopul protejării împotriva vântului si a curenților reci de aer, a legumelor sensibile, ca pepenii, castraveții, fasolea.

Valoarea alimentară a părților comestibile rezida mai ales din conținutul ridicat in proteine, care în boabele uscate poate atinge 25 – 30% si in vitaminele C, B1, caroten.

Păstăile tinere si boabele verzi sunt perfect digerabile si au proprietăți astringente, constituind un remediu pentru deranjamente stomacale

II. DIVIZIUNEA CELULARĂ MITOTICĂ

2.1. Fazele diviziunii mitotice

În diviziunea celulară se disting două categorii de evenimente: evenimente reproductive, prin care sunt dublate structurile funcționale ale celulei, esențiale fiind dublarea cromosomilor, și evenimente distributive, prin care materialul rezultat în urma replicației este repartizat celulelor fiice (Tudose, 1992).

Mitoza (gr. mitosis = fir) sau diviziunea ecvațională, este modalitatea de diviziune celulară prin care, dintr-o celulă somatică (diploidă) rezultă două celule fiice cu număr egal de cromosomi, atât între ele, cât și cu celula mamă. Mitoza este diviziunea celulară care are loc în celule somatice și asigură transmiterea fidelă a caracterelor la celulele fiice; ea poate suferi însă, diferite influențe care adaugă aparentei stabilități a caracterelor, noi valențe. Ciclul celular mitotic, la plante și animale, cuprinde în principal următoarele procese: duplicarea cromosomilor unicromatidici (și a centrozomului la animale) și deplasarea spre poli a cromosomilor fii, după care, urmează diviziunea citoplasmei. În procesul mitozei se organizează aparatul mitotic alcătuit din structuri cromatice și acromatice, care este complet în metafază. Pentru realizarea acestuia, sunt necesare proteine specifice, a căror sinteză necesită un mare consum de energie.

Totalitatea proceselor prin care trece celula somatică de la formare și până la scindarea ei în două celule fiice, cu număr de cromosomi egal cu numărul de cromosomi al celulei din care au provenit, alcătuiesc ciclul celular.

Ciclul mitotic (Fig.2) cuprinde: interfaza (perioada dintre două diviziuni succesive) și cele patru faze ale diviziunii mitotice propriu-zise – profaza, metafaza, anafaza și telofaza – cu o durată variabilă, în funcție de specie, tipul de celule, temperatură etc., de la câteva ore, la zeci și sute de ore.

Interfaza

Interfaza are cea mai mare durată în timp în ciclul mitotic și este caracterizată de procese de biosinteză. Durata interfazei este variabilă, de la câteva ore până la câteva zile. La plante, la un ciclu tipic de 20-24 de ore, mitoza durează 70-110 minute (profaza = 30 – 45 min., metafaza = 5 – 10 min., anafaza = 15 – 20 min. și telofaza = 20 – 30 min.), (Toma și Niță, 1995). La celula animală, un ciclu tipic durează 18 – 24 de ore, din care durata fazei G1 este de aproximativ 6 ore (în general variază cel mai mult), faza S (timpul necesar replicării genomului) durează 6 – 8 ore, iar faza G2 este, de regulă, cea mai scurtă (mai ales când mitozele se succed rapid). Mitoza, de obicei durează mai puțin de o oră (Lewin, 1994).

Cercetările microfotografice și microradiografice au demonstrat că interfaza este foarte puțin activă din punct de vedere morfologic, dar este cea mai activă din punct de vedere metabolic; cantitatea de ADN se dublează de la 2C la 4C. Pe baza acestor observații, Howard și Pelc, în 1953 au împărțit interfaza în trei perioade:

– perioada G1 (engl. gap = gol) – perioada presintetică, este perioada în care nu are loc sinteza de ADN, ci doar o activare a enzimelor. Cromosomii sunt monocromatidici; se sintetizează ARN (în special ARNm) și proteine;

– perioada S (engl. synthesis = sinteză) – perioada de sinteză a ADN; până la sfârșitul fazei S, toată cantitatea de ADN se replică (pe parcursul fazei S cantitatea totală de ADN crește de la 2C la 4C). La sfârșitul acestei perioade, cromosomii sunt alcătuiți din două cromatide foarte lungi și subțiri;

– perioada G2 – perioada postsintetică, este perioada când sinteza ADN se oprește; are loc biosinteza proteinelor și a ARN, care se desfășoară și în celelalte perioade ale interfazei. Celula conține cromosomi bicromatidici.

Fig. 2. Ciclul celular mitotic (după Alberts și colab., 1994)

Pe parcursul interfazei (Fig.3), cromosomii sunt hidratați, despiralizați și nu se observă la microscopul optic (Watson, 1974).

Fig. 3 Aspectul nucleului în interfază, în celulele meristemului radicular la Vicia faba (2n=16) (după Hartl și Jones, 1998)

În afară de celulele la care ciclul mitotic se desfășoară în mod normal, există celule în repaus sau în perioada G0, asemănătoare fazei G1, dar diferită prin faptul că celulele nu pot intra în faza S. În faza G0 intră celulele neproliferative. Uneori, celulele se pot afla în repaus în faza 4C (exemplu: celulele embrionare din semințe), astfel încât, intră direct din G0 în G2; alteori, din G0 pot intra în G1 timpuriu (Lewin, 1994).

În explicarea cauzelor ce determină intrarea celulei în diviziune mitotică (trecerea din G2 în mitoză) există diferite ipoteze. Se pare că declanșarea mitozei este determinată de modificarea raportului nucleu / citoplasmă.

Profaza

În profază au loc următoarele procesele: mărirea volumului nucleului, condensarea cromosomilor, stabilirea polilor pentru diviziune, dezorganizarea membranei nucleare, dispariția nucleolilor și formarea fusului acromatic.

La începutul acestei faze, cromosomii se prezintă sub formă de filamente subțiri, lungi, alcătuind un spirem. În profaza timpurie (Fig.4), ei se dispun în tot spațiul nuclear (în celulele vii se observă ușor, având indicele de refracție 1,50 față de cel al carioplasmei de 1,37). În profaza târzie (Fig.5), gradul de spiralizare al cromosomilor crește și ei devin mai scurți și mai compacți, apărând formați din două cromatide, foarte apropiate între ele și înfășurate una în jurul celeilalte. La începutul profazei, are loc o primă spiralizare a cromosomilor denumită “spiralizarea mică”, care se realizează prin micșorarea numărului de spire și mărirea diametrului lor. Spre sfârșitul profazei, are loc a doua spiralizare denumită “spiralizare somatică”, în care numărul de spire continuă să scadă, ele apropiindu-se tot mai mult.

În profază, distanța dintre cromosomi crește treptat și are loc dezorganizarea nucleului și a membranei nucleare, în același timp, dispariția nucleolilor și formarea fusului mitotic. Centriolii migrează spre cei doi poli ai celulei, plasându-se în două puncte opuse. Între centrioli se organizează fusul de diviziune (fus acromatic, fus mitotic sau fus nuclear), alcătuit dintr-un număr mare de filamente, cu extremitățile inserate pe centrioli, la poli. Fusul nuclear este un organit tranzitoriu, cu ajutorul căruia se realizează distribuirea egală a cromosomilor în cele două celule fiice. Filamentele fusului de diviziune sunt de două tipuri: filamente fusoriale de sprijin (continue) de la un centriol la altul care condiționează structura fusului și filamente cromosomiale (kinetice), care sunt sintetizate și pleacă de la centromerul fiecărui cromosom și înaintează simultan, cu aceeași viteză, spre cei doi poli ai celulei.

Fig. 4 Aspect al nucleului unei celule din meristemul radicular de la Vicia faba (2n=16), aflată în profază timpurie (după Hartl și Jones, 1998)

Fig. 5 Aspect al nucleului unei celule din meristemul radicular de la Vicia faba (2n=16), aflată în profază târzie (după Hartl și Jones, 1998)

Stadiul final al profazei – prometafaza, se caracterizează prin totala dezorganizare a membranei nucleare, care se fragmentează în porțiuni relativ mari, care păstrează infrastructura de membrană dublă și rămân, în parte, în interiorul fusului de diviziune, participând mai târziu la formarea membranelor nucleilor fii. Cromosomii exercită mișcări neregulate între polii celulei și planul ecuatorial al acesteia.

Metafaza

În această fază are loc desăvârșirea aparatului mitotic, iar cromosomii, spiralizați la maxim, se dispun în placa ecuatorială metafazică (Fig.6). Mișcarea de dispunere a cromosomilor în placa ecuatorială, la distanță egală de polii fusului de diviziune prezintă trei componente:

adunarea cromosomilor într-o poziție de echilibru între cei doi poli, mișcare datorată, în principal, interacțiunii între polii fusului și centromeri;

orientarea cromosomilor în placa ecuatorială, astfel încât, centromerii să fie situați în axul longitudinal al fusului de diviziune, cromatidele fiind orientate lateral;

distribuirea cromosomilor în placa metafazică se realizează în jurul unui fus central gol (în secțiune transversală apare ca un halo), cromosomii fiind dispuși la periferia fusului, cu brațele (cromatidele) orientate în afară.

Morfologia cromosomilor se studiază în metafază, deoarece în această fază, ei sunt condensați în cel mai înalt grad. Fiecare cromosom este alcătuit din două cromatide și prezintă în lungul acestora, spre sfârșitul metafazei, o fisură longitudinală, care reprezintă spațiul dintre cele două cromatide surori. La sfârșitul metafazei (Fig.7), cromatidele surori încep să se separe (clivarea longitudinală), făcându-se trecerea spre anafază.

Fig. 6 Aspect al cromosomilor unei celule din meristemul radicular de la Vicia faba (2n=16), aflată în metafază timpurie (după Hartl și Jones, 1998)

Fig. 7 Aspect al cromosomilor unei celule din meristemul radicular de la Vicia faba (2n=16), aflată în metafază târzie(după Hartl și Jones, 1998)

Anafaza

Anafaza se caracterizează prin formarea, din cromatidele surori, a cromosomilor fii și migrarea lor spre cei doi poli ai celulei. Formarea cromosomilor fii debutează în anafaza timpurie, când are loc clivarea centromerilor, cromatidele rămânând încă apropiate unele de altele. O dată terminată clivarea centromerilor, începe separarea cromatidelor în lungul fisurii longitudinale evidențiate în metafază (Fig.8). După Lewin (1994), la celulele animale, în anafază, centromerul este duplicat funcțional. Când și acest proces se încheie, cromatidele fiice, fiecare cu câte un centromer propriu, încep migrarea spre poli (Fig.9), devenind cromosomi fii.

Se admite că mișcarea cromosomilor spre poli este o consecință a scurtării filamentelor fusoriale de sprijin, care leagă polii fusului (prin pierderea sau adiția de tubulină din microtubuli). Alungirea determină stabilitatea fusului, iar scurtarea este mecanismul implicat în mișcarea cromosomilor spre poli. Această mișcare este posibilă datorită existenței în structura fusului mitotic a unor proteine de natură actinică. În cazul în care setul de cromosomi migrează aproape perfect sincron, se formează “placa anafazică” sau “dublul aster”. Chiar dacă mișcarea cromosomilor nu este sincronă, ea nu începe decât după ce toți cromosomii sunt plasați în placa ecuatorială.

În celulele animale, de regulă, autosomii migrează concomitent, iar heterosomii au o viteză de migrare diferită. În celulele plantelor, spre sfârșitul anafazei, fusul mitotic se mărește în volum în regiunea ecuatorială și ia formă de butoiaș, formând ulterior fragmoplastul.

Fig. 8 Aspect al cromosomilor unei celule din meristemul radicular de la Vicia faba (2n=16), aflată în anafază timpurie (după Hartl și Jones, 1998)

Fig.9 Aspect al cromosomilor unei celule din meristemul radicular de la Vicia faba (2n=16), aflată în anafază târzie (după Hartl și Jones, 1998)

Telofaza

Telofaza este ultima fază a mitozei, caracterizată prin prezența fenomenelor opuse celor din profază. Cromosomii suferă un proces de despiralizare și revin la aspectul interfazic. Fragmentele de membrană nucleară migrează spre periferia fusului de diviziune; numărul lor crește printr-o sinteză suplimentară. Aceste vezicule se agregă în jurul masei cromosomiale, se turtesc, înconjoară nucleul interfazic și formează noua membrană nucleară. O parte din veziculele membranoase ajung la nivelul liniei de demarcație dintre cele două celule fiice. Are loc și reorganizarea nucleolilor la nivelul regiunilor ce îndeplinesc funcția de organizatori nucleolari (Fig.10 și Fig.11).

Fig.10 Celulă din meristemul radicular de la Vicia faba (2n=16), aflată în telofază timpurie (după Hartl și Jones, 1998)

Fig.11 Aspect al nucleilor fii, aparținând unei celule din meristemul radicular de la Vicia faba (2n=16), aflată în telofază târzie (după Hartl și Jones, 1998)

Citochineza

În mod obișnuit, diviziunea nucleară este urmată de citochineză (plasmodiereză, citodiereză sau plasmotomie).

Citochineza poate avea loc centripet – la plantele inferioare (Cladophora, Spirogyra), când membrana ce separă cele două celule fiice apare sub forma unui inel ce crește centripetal, asemănător unei diafragme (Toma și Niță, 1995). La plantele superioare, citochineza are loc centrifug. După Buvat, în zona ecuatorială a fragmoplastului, se dispun vezicule proteice, printre care se intercalează fragmente ale reticulului endoplasmic, ce migrează în această regiune dinspre poli. Împreună cu elementele microtubulare, se formează o structură fibrilară. În jurul fibrelor microtubulare se aglomerează vezicule mici golgiene (Fig.12a,b). Veziculele se măresc, se contopesc și vin în contact cu pereții celulei mame, formând lamela mediană (Fig.12c). Celulele fiice formate, elaborează membrana primară, străbătută de plasmodesme (Fig.12d,e).

a b c d e

Fig. 11 Formarea peretelui despărțitor, între celulele-fiice, consecutiv diviziunii mitotice la plantele superioare (după De Robertis și De Robertis,1983)

În celulele normale, mitoza și citochineza sunt riguros coordonate. Dacă are loc blocarea citochinezei, mitoza se desfășoară normal, producându-se o celulă binucleată.

Odată cu replicarea cromosomilor, are loc și replicarea organitelor citoplasmatice sau separarea lor din celula mamă în celulele fiice, după care acestea își completează, prin noi sinteze, setul de organite intracitoplasmatice. În profază, reticulul endoplasmic este transformat într-un sistem discontinuu de vezicule sferice, dispuse în special în regiunile periferice ale citoplasmei. În metafază, mitocondriile se adună în jurul fusului; în anafază, ele se grupează în jurul regiunii ecuatoriale, odată cu separarea celulelor fiice având loc și repartizarea acestora. În interfaza celulelor fiice, el revine la forma tipică.

În diviziunea mitotică, metafaza și anafaza sunt fazele cele mai scurte ale diviziunii, în timp ce profaza, uneori și telofaza, sunt cele mai lungi. Desfășurarea în timp a mitozei depinde și de tipul celulei, vârstă, starea fiziologică, condiții de mediu (mai ales temperatura). Mitoza poate fi blocată prin acțiunea șocurilor de temperatură, narcoticelor, otrăvurilor etc. (Raicu și colab., 1973).

III. MUTAȚIILE

3.1. Definirea mutației și tipuri de mutații

Noțiunea de mutație a fost introdusă de Hugo de Vries, autorul binecunoscutei teorii mutaționiste, unul dintre descoperitorii legităților elaborate de Mendel, în 1901.

Mutația – provenind din limba latină: „mutatio” – reprezintă o modificare a conținutului informațiilor ereditare ale unui individ prin alterări produse la nivelul molecular, cromozomial, gnomic sau celular sub impactul unor factori de natură fizică, chimică, biologică sau, pur și simplu, prin hazard, modificare ce nu este provocată de recombinarea genetică sau de segregare. Aceste modificări pot apărea în mod spontan – și atunci sunt denumite mutații naturale – sau pot fi induse experimental, fiind vorba de mutațiile artificiale. În aceste două tipuri de mutații nu sunt deosebiri de ordin cantitativ. Existența mutațiilor naturale la plante și animale a fost de multă vreme pusă în evidență. Încă în secolul al XVI-lea farmacistul Sprenger din Heidelberg, Germania, a observat la Chelidonium majus apariția unei plante cu frunzele și petalele de o formă anormală, caracter ce s-a transmis la descendenți, astfel că noua formă a primit denumirea de Chelidonium laciniatum. Mutațiile, alături de recombinările intra și intercromozomiale, constituie principala sursă de asigurare a variabilității individuale, câmpul de acțiune al selecției naturale.

În accepțiunea zoologului evoluționist Ernst Mayr (1963), mutațiile reprezintă „modificări discontinue cu efect genetic”, părere considerată corectă, având în vedere faptul că, în contextul variabilității individuale, o mutație reprezintă o noutate evidentă, o discontinuitate clară în șirul de variație din cadrul unei anumite populații.

Mutațiile pot afecta diferite unități ale materialului genetic. Pe această bază, pot fi clasificate în:

mutații genice, când afectează genele;

mutații cromozomiale, când afectează cromozomii;

mutații genomice, în cazul în care afectează întregul genom.

Această clasificare, în care se ține cont de mărimea substratului ereditar afectat, de cantitatea informațiilor modificate, este cea mai adecvată, din punctul de vedere al biologului.

Din punctul de vedere al experimentelor fenotipice, mutațiile pot fi clasificate în:

dominante

codominante

semidominante

recesive

Evident, o asemenea clasificare a mutațiilor se referă în special la organismele diploide, la care mutageneza a creat relații de alelism între gene. La organismele haploide, orice mutație capătă o exprimare fenotipică imediată, deși această clasificare a genelor rămâne variabilă, mai ales în cazul diferitelor tulpini sau sușe ale speciilor haploide, între care există relații de dominanță sau de recesitate în cazul încrucișării.

În funcție de locul unde sunt plasate, mutațiile pot fi clasificate în:

mutații autosomale, plasate pe autosomi

mutații heterosomale, plasate pe heterosomi – aceste mutații manifestă sex-linkage

mutații extranucleare ale genelor din citoplasmă

O altă categorie de mutații sunt cele letale și semiletale, care afectează gene de importanță majoră în organism, prin a căror blocare se realizează moartea individului înainte de maturitatea sexuală.

Mutațiile pot afecta gene de diferite tipuri (structurale, operatoare, reglatoare) care iau parte la realizarea reglajului genetic. De asemenea, pot afecta regiuni mai mici sau mai mari situate de-a lungul genei. Cercetările mai noi au arătat că cea mai mică unitate mutațională este perechea de nucleotide. Acestea sunt denumite mutații punctiforme (care sunt mutații intragenice).

Dacă, prin mutație, gena normală a tipului sălbatic se transformă într-o alelă diferită, atunci este vorba de o mutație directă (forward mutation), în timp ce prin mutație de reversie (back mutation) această genă se transformă în tipul inițial.

În cazul organismelor multicelulare, în care mutațiile se produc în celule din care nu rezultă gameți, ci numai anumite țesuturi și organe, avem de-a face cu mutații somatice, care se manifestă numai la țesutul și organul respectiv. Acest tip de mutație nu se transmite la descendenți decât în cazul în care țesutul sau organul respectiv se obține prin înmulțirea vegetativă, indivizi caer au apoi posibilitatea să se reproducă sexuat.

Mutația genică afectează și structura și funcția unei gene și se realizează prin tranziție și transversie, prin inserții (adiții), deleții, inversii sau transpoziții.

Schimbările care au loc în secvența de nucleotide a ADN sub acțiunea mutagenilor, apar prin greșeli de încorporare care au loc în timpul unei runde de replicare, și prin greșeli de împerechere care urmează greșelilor de încorporare și care se realizează în timpul replicării ulterioare.

Mutațiile ce apar în timpul replicării ADN-ului se numesc mutații prin erori de copiere. Încă din 1953, Watson și Crick au admis că apariția bazelor azotate în forma lor rară poate reprezenta cauza mutației în timpul replicării ADN.

Mutația cu schimbarea cadrului de citire, numită și mutație comutatoare de mesaj genetic, determină modificarea informației genetice, respectiv a mesajului genetic. Schimbarea de baze din ADN este transcrisă într-o secvență schimbată a bazelor, respectiv codonilor, din ARNm care, la rândul său, va condiționa o secvență alterată de aminoacizi în proteină.

Judecate prin prisma schimbărilor ce la produc la final (la sfârșitul procesului de translație), mutațiile genice pot fi considerate:

Nonsens (nonsens mutations) sunt mutații terminatoare de catenă (chain termination mutation), sunt acele mutații care, deși duc la schimbări în codul genetic, nu se referă în schimbarea succesuinii aminoacizilor în molecula proteică, ci doar a numărului lor. Sunt mutații care, prin înlocuirea unui nucleotid dintr-un codon, duc la transformarea codonului respectiv în codon STOP

Mutații cu sens greșit (missens mutation), sunt mutațiile care transformă un codon funcțional (din cei 61) într-un alt codon funcțional, având ca efect înlocuirea unui aminoacid din lanțul polipeptidic cu altul (cazul anemiei falciforme: înlocuirea acidului glutamic cu valina). Se folosește și termenul de mutație înainte (forward mutation). În această situație, o genă se transformă în alelă (A a), sau o alelă se transformă într-o altă alelă (a a1).

Mutații cu același sens sunt mutațiile care, deși produc schimbarea unui nucleotid din codon, nu schimbă aminoacizii din lanțul polipeptidic. De exemplu, UUA, UUG, CUU, CUC, CUG specifică leucina. Trecerea unuia într-altul nu are semnificație pentru compoziția proteinei. Mutațiile fără efect fenotipic mai sunt numite și silențioase sau neutre.

Mutații de reversie sau mutații înapoi (black mutation)

3.2. Factorii mutageni

Sunt foarte variați și pot fi clasificați după cum urmează:

Factori mutageni fizici: cuprind radiații ionizante, neionizante și de temperatură. Dintre acestea, radiațiile au o mare eficiență în producerea mutațiilor și sunt utilizate pe scară largă în diverse laboratoare.

Factori mutageni chimici: cuprind o gamă extrem de largă de substanțe chimice, diferite structural și funcțional, care au și efecte carcinogene și teratogene.

3.2.1. Factorii mutageni fizici

Radiațiile și șocurile termice s-au dovedit a avea efecte mutagene. În anul 1959, R. Prakken a clasificat radiațiile electromagnetice, după capacitatea lor de ionizare, în:

radiații neionizante, care generează reacții fotochimice

radiații ionizante, care generează reacții radiochimice

Radiațiile electromagnetice au lungimea de undă cuprinsă între 0,005Å și până la peste 1m. Radiația cosmică are lungimea de undă sub 0,005Å. Ordinea crescătoare a lungimii de undă a radiațiilor electromagnetice este următoarea:

razele gamma, au λ = 0,005 – 1,4 Å și o energie de activare de 1 – 1000MeV

razele Röentgen (X), au λ = 0,06 – 100 și o energie de activare cuprinsă între 0,01 și 0,1MeV

razele ultraviolete (U.V.), au λ = 136 – 4.000 și fac parte din spectrul solar invizibil

lumina vizibilă are λ = peste 400nm

razele infraroșii au λ = 100 – 1.000µm

undele radio, au λ = peste 1mm, ajungând la sute de metri

Radiațiile corpusculare sunt reprezentate de:

raze β (electroni)

protoni (nuclei de hidrogen)

neutroni lenți sau rapizi

raze α (nuclei de heliu)

diferite particule grele

a) radiații neionizante (UV, λ = 136 – 4.000Å)

Efectul lor mutagen a fost evidențiat de E. Atenburg, în 1934, prin iradierea ouălor musculiței de oțet (Drosophila melanogaster). Soarele este emițătorul cel mai puternic de radiații UV, dar efectul lor asupra organismelor animalelor este atenuat datorită stratului de ozon din atmosferă, la o mare altitudine, care absoarbe toate radiațiile cu λ mai mică de 2.900Å și asigură protecția organismelor vii.

Acțiunea UV se exercită prin absorbției energiei fotonilor cu diferite lungimi de undă de moleculele substratului, care intră astfel într-o stare de excitație. Razele UV care acționează asupra materialului genetic au λ = 2.000 – 3.000Å, dar acțiunea cea mai puternică o exercită cele cu λ = 2.580Å. Ele sunt absorbite, în special, de bazele azotate, care prezintă un spectru de absorbție de 2.600Å, iar dintre acestea, bazele pirimidinice – timina și citozina, care sunt mai sensibile față de bazele purinice – adenina și guanina.

b) radiațiile ionizante (radiațiile electromagnetice și radiațiile corpusculare)

Au efect similar asupra substratului, exercitându-se ca unde sau ca particule încărcate cu energie diferită. Ele acționează la nivelul atomilor, fiind capabile să dezorganizeze sferele de electroni care înconjoară nucleul atomic.

Radiațiile electromagnetice având o energie și o viteză foarte mare, întâlnind în drumul lor un atom neutru, sunt capabile să smulgă unul sau mai mulți electroni de pe orbită exterioară a atomului. Prin pierderea unui electron, atomul rămâne cu o sarcină electrică pozitivă în plus, devenind cation (ion pozitiv).

Electronul eliberat nu rămâne liber, ci se atașează unui alt atom care, primind o sarcină electrică negativă, devine un anion (ion negativ). Acest proces se numește ionozare. Deși ionii produși în urma iradierii au o viață foarte scurtă, de ordinul 10-6 dintr-o secundă, totuși ei au o mare posibilitate de a intra într-o serie întreagă de reacții chimice cu substanțele din materia iradiată.

Dintre radiațiile ionizate, cele mai puternice sunt sunt radiațiile electromagnetice și în special razele gamma și razele Röentgen. Ele au o lungime de undă mai mică și o putere de penetrație foarte mare, producând fenomenul de ionizare.

Una din cauzele mutațiilor naturale este considerată radiația cosmică. Acest tip de radiație naturală este formată din nuclei de carbon, azot și oxigen. Unele din aceste particule se ciocnesc cu nuclei ai unor atomi din aer și dau naștere la radiația cosmică secundară, care este formată din radiații electromagnetice și radiații corpusculare acționând permanent asupra Pământului. Împreună cu gazul radon din atmosferă și cu radiațiile care provin prin dezintegrarea naturală a elementelor radioactive din scoarța pământului, toți acești factori alcătuiesc fondul natural de radiații terestre. Viața pe Pământ a apărut și s-a dezvoltat în condițiile acestui fond natural de radiații, care constituie o sursă permanentă de mutații.

Efectele genetice ale radiațiilor ionizate sunt dependente de: doză, debitul dozei, tipul radiației, viteza diviziunilor celulare, numărul și lungimea cromozomilor, concentrația oxigenului intracelular și extracelular, reversibilitatea leziunilor cromozomiale. Pătrunzând în celule, radiația ionizantă afectează cromozomii, producând modificări structurale corelate sau nu cu mutații.

3.2.2. Factori mutageni chimici

În cercetările de inducere experimentală a mutațiilor, s-a testat o gamă largă de agenți chimici, care se caracterizează prin capacități diferite de a interacționa cu materialul genetic. Dintre substanțele chimice mutagene utilizate, amintim: acidul nitros, nidroxilamina, acizii alkilanți, analogi ai bazelor azotate, antimetaboliții și precursorii lor, coloranții bazici, antibioticele.

Primele cercetări pentru evidențierea capacităților mutagene ale unor substanțe chimice au fost realizate de cercetătoarea Ch. Anerbach, în Anglia, în perioada celui de-al doilea război mondial. Ulterior, cercetările s-au intensificat considerabil, descoperindu-se capacitatea mutagenă a numeroși agenți chimici și modul lor de acțiune la nivelul celular și molecular. S-au elaborat totodată teste eficiente pentru estimarea capacităților mutagene a diverselor substanțe chimice și s-au indus mutații utile pentru ameliorarea plantelor, animalelor și microorganismelor.

Se aproximează că în mediul înconjurător, cel al civilizației industriale, există circa 60.000 de substanțe diferite, cifră în care nu sunt incluse pesticidele, substanțele farmaceutice și aditivii alimentari. Pe plan mondial, aproximativ 1.000 de substanțe noi sunt create și introduse în mediul ambiant în fiecare an.

Faptul că unele substanțe chimice afectează cromozomii, provocând printre altele ruperea lor similar radiațiilor, le conferă denumirea de substanțe radiomimetice. Spre deosebire de radiații, substanțele chimice respective au efect specific, producând ruperea cromozomilor mai ales în regiunile heterocromatice. Substanțele chimice pot induce aberații variate de tip cromozomial sau cromatidic.

Agenții mutageni fizici afectează prioritar materialul genetic (ADN și ARN), producând modificări în informația genetică a organismului.

Dintre agenții chimici care afectează sinteza și metabolismul ADN și ARN, fac parte cei care inhibă sinteza ADN și a precursorilor săi (azoserina, adenina, amino-pterina, 5-fluorodezoxiuridina, etc) și agenții care modifică proprietățile chimice și fizice ale ADN (agenți alkilanți, mitomicina-C, actinomocina-D, hidrazida maleică etc).

S-a ajuns la concluzia că blocarea sintezei unei anumite baze azotate determină apariția unor erori în procesul de împerechere normală a nucleotidelor purinice și pirimidinice în macromolecula ADN, fenomen pus în evidență de apariția unor aberații la nivelul cromozomilor și de inducerea de mutații.

Altă categorie de agenți chimici acționează asupra fusului celular a cărui activitate este inhibată. Inhibarea fusului nuclear are ca efect oprirea diviziunilor celulare, dar cromozomii ca atare nu sunt afectați, continuând diviziunea obișnuit. Colchicina e substanța cea mai folosită din această categorie de agenți chimici, ea îmbinând o mai mare eficacitate în acțiune, cu o toxicitate relativ scăzută. Comportamentul modificat sub acțiunea colchicinei este cunoscut sub denumirea de C-mitoză și C-meioză.

O altă categorie de agenți chimici inhibă citokineza și au ca efect inhibarea diviziunilor celulare, fără a afecta structura cromozomilor sau, respectiv, a nucleului. Rezultatul unei prime diviziuni în prezența unor astfel de agenți este o celulă binucleată. Celulele multinucleate se formează când se succed mai multe diviziuni, în prezența unui inhibitor al citokinezei. Printre acești agenți, se numără derivații halogenați ai benzenului și toluenului, aminopurinele, cofeina, teofilina și teobromina. În estimarea efectului asupra diviziunilor celulare a acestor agenți, trebuie să se țină seama de faptul că nucleii celulelor binucleate sau multinucleate fuzionează adesea în timpul meiozei și, ca urmare, variază nu numai numărul de nuclei/celulă, ci și numărul de genomuri/nucleu.

În prezent, este cunoscută o gamă foarte largă de agenți mutageni chimici. În primul rând este vorba de un număr mare de agenți alkilanți, care au una sau mai multe grupe alkilfuncționale (-CH3, -CH2-CH3) și o puternică acțiune mutagenă și carcinogenă. Unul dintre cei mai cunoscuți agenți alkilanți este iperita, sulfură de etil diclorată insolubilă în apă, dar solubilă în solvenți organici și grăsimi. Are miros caracteristic. O acțiune mutagenă o au, de asemenea, dietilsulfatul și etilmetansulfonatul, utilizați pentru inducerea de mutații la plante și animale.

Alt grup de agenți mutageni chimici este reprezentat de precursori ai ADN și analogi ai bazelor azotate purinice și pirimidinice, cum sunt: 5-bromuracil, 5-bromdezoxiuridin, 2-oxipurina, 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina, etc. Prin includerea acestor analogi ai bazelor azotate în macromoleculele de ADN, se produc așa-numitele „greșeli de includere”, iar replicarea ADN care conține analogi ai bazelor azotate, se produc „greșeli de replicație”.

De asemenea, există agenți mutageni chimici simpli, non-alkilanți, cum sunt formaldehida (HCHO), acidul nitros (HNO2), hidrozina (H2N-NH2), hidroxilamina (H2N-OH), etc. Au loc modificări atât în macreomolecula de ADN, cât și în cea de ARN.

Există și agenți mutageni chimici care necesită o activitate metabolică prealabilă. Această biotransformare se realizează în special cu ajutorul enzimelor hepatice. Din acest grup face parte -2-acetil-aminofluorena, N-hidroxi-1-naftilamina, alfatoxina, etc.

În sfârșit, trebuie menționați coloranții folosiți în citologie pentru punerea în evidență a acizilor nucleici, cum sunt albastru de metilen, albastru de toluidină, proflavina, acridin oranjul, etc.

3.3. Mecanismul molecular al mutațiilor induse chimic

Încă din 1953, J.D. Watson și F.C.H. Crick au emis ipoteza că mutația este „o eroare” în secvența nucleotidelor macromoleculare de acizi nucleici.

Ipoteza Watson-Crick privind mecanismul molecular al mutațiilor consideră în esență că printre cauzele care duc la apariția mutațiilor la nivel celular pot pot fi menționate:

modificarea structurii macromoleculei de ADN

deleția sau adiția unuia sau mai multor nucleotide în macromolecula de ADN

substituția unuia sau mai multor nucleotide în macromolecula de ADN

inversia unei secvențe de nucleotide în macromolecula de ADN

Toate aceste modificări ale informației genetice conținute în macromolecula de ADN se pot manifesta sub formă de mutații.

Sub influența diverșilor factori mutageni în procesele de replicație ale acizilor nucleici, se produc unele erori care duc la apariția unor mutații. Înlocuirrea unei baze purinice în macromolecula de ADN sau ARN cu o altă bază purinică sau a unei baze pirimidinice cu o altă bază pirimidinică a fost denumită de E. Freese (1963) tranziție, în timp ce schimbarea unei baze purinice cu o bază pirimidinică sau invers a fost denumită transversie.

Erorile de includere a unor nucleotide în macromolecula de ADN și erorile de replicație a ADN constiuie, la nivel molecular, mecanismele de bază care realizează modificarea informației genetice și respectiv, apariția procesului mutațional.

Acțiunea agenților mutageni se realizează și prin rupturi sau chiar prin polimerizări ale unor macromolecule. Unele modificări se stabilizează în procesul replicației acizilor nucleici determinând modificări structurale în macromoleculele de ADN și ARN. Apar astfel modificări ale informației genetice, deci a procesului de biosinteză a proteinelor. Deci, mutațiile au un mecanism similar de apariție, care constă în modificarea informației genetice înscrisă biochimic în macromoleculele de acizi nucleici.

Pentru a face distincție între efectele diferiților agenți, sunt necesare anumite măsuri experimentale:

perioada de tratament trebuie să fie cât mai scurtă, dar cu cât durata ciclului de diviziune este mai lungă, cu atât și timpul de tratament poate fi prelungit;

doza utilizată trebuie să fie cât mai scăzută, pentru a evita inhbarea puternică a diviziunii celulare;

să se fixeze materialul pentru analize la intervale de timp cât mai multe, cât mai scurte și care să acopere cel puțin durata completă a unui ciclu de diviziune;

să se țină seama de factorii care ar putea influența efectul agenților (pH, tensiunea caldura, temperatura);

aberațiile cromozomiale se analizează în metafază și anafază, dar mai ales în metafază, utilizânu-se un tratament cu soluție de colchicină, posterior acțiunii agenților mutageni chimici.

Agenții chimici afectează mai ales interfaza și profaza timpurie. Cei cu acțiunea în timpul interfazei vor influența diferit perioadele G1, S și G2. Agenții cu efect în perioada G1 sau S vor inhiba replicarea cromozomilor prin acțiunea asupra sintezei ADN, pe când agenții cu efect în G2 vor afecta numai formarea cromatidelor libere, întrucât în acest stadiu ADN-ul și cromozomii sunt deja replicați.

3.4. Importanța mutațiilor

Mutațiile reprezintă calea de a obține forme care nu au mai existat până la momentul respectiv în natură. Această proprietate a mutației îi conferă un rol cu totul deosebit în evoluție. Mutația s-a manifestat o dată cu apariția genei, astfel încât organismele actuale nu sunt decât un rezultat al unui lung proces, în care mutația, recombinarea și selecția au rol primordial.

Prin mutație se poate modifica un caracter sau un număr mai mic de caractere. Datorită faptului că frecvența mutațiilor naturale este mic, s-au căutat posibilități de inducere artificială a mutațiilor pentru a mări această frecvență.

Mutațiile obținute au importanță deosebită în procesul de ameliorare. Datorită unor caractere valoroase pe care le posedă, pot fi folosite în programele de hibridări, în scopul îmbunătățirii formelor existente sau al creerii de forme noi, valoroase, corespunzătoare cerințelor practicii agricole.

3.5.Aberații cromozomiale

Cariotipul celular din organismele diferitelor specii animale sau vegetale este în general suficient de constant pentru a asigura identificarea acestor specii. Aceasta înseamnă că, într-un țesut dat, fiecare celulă are un număr constant de cromozomi, de formă și mărime diferită în limitele unor variații statistice. Aceste constante cromozomiale sunt determinate la rândul lor de prezența la nivelul fiecărui cromozom a unui număr anumit de gene, dispuse într-o ordine definită și a unui centromer având o poziție constantă. Prezența constricțiilor secundare a sateliților, a corpusculilor heterocromatici, de număr și mărime variabile, poate contribui la caracterul unui cromozom sau a unui complement cromozomial. Ca urmare a unor fenomene naturale sau provocate, cromozomii pot suferi modificări de ordin structural sau numeric. Ambele tipuri de modificări se produc cu o frecvență în general scăzută, care depinde de specie și de o seamă de factori, în parte necunoscuți. Aberațiile cromozomiale produse cu agenții fizici, chimici, biologici și studiul condițiilor în care ele apar reprezintă nul din domeniile cele mai moderne ale cercetărilor contemporane de genetică.

3.5.1. Modificări cromozomiale structurale

În acest tip de modificări, numărul de gene este neschimbat sau variazăpuțin în plus sau în minus, predominând stabilirea unor noi aranjamente ale genelor. Aberațiile cromozomiale care duc la rearanjamente în ordine liniară ale genelor, se pot clasifica în patru clase, după cum urmează:

deleții sau deficiențe

duplicații

inversiuni

translocații

Anomalii structurale ale cromozomilor și cauzele lor (Socaciu, 1996)

În cazul primelor categorii de aberații, este afectat de obicei câte un cromozom, în timp ce în a patra pot fi lezați unul, doi sau mai mulți cromozomi. Aceste tipuri de aberații cromozomiale pot fi în general detectate prin metode citologice și genetice.

Delețiile: prin deleție se înțelege ruperea și pierderea unei porțuni dintr-o cromatidă a unui cromozom, porțiunea delatată neavând centromer, nu se poate deplasa în anafază și va fi eliminată. În cazul excepțional al fragmentării unui cromozom cu centromer difuz, fragmentul va putea migra, fenomenul conducând la o creștere a numărului de cromozomi. Porțiunea de cromozom care a rămas cu centromer poate migra în mod normal, spre polii celulei.

Delețiile pot fi terminale și interstițiale.

Deleția terminală se formează printr-o ruptură produsă de refacere capătului rupt. Deleția interstițială apare prin două rupturi într-un cromozom, urmate de reunirea capetelor rupturii.

Existența unei deleții terminale adevărate persistente eset discutabilă, pentru că producerea ei presupune pierderea unui telomer normal, ceea ce implică transformări la capătul de cromozom rupt care să prevină fuziunea terminațiilor cromatidelor.

Prin pierderea de material genetic absent, delețiile au efecte dăunătoare asupra organismului.

Duplicațiile: prin duplicație se înțelege existența unui fragment suplimentar al unui cromozom care există fie atașat de un membru al complementului cromozomial normal, fie sub formă de fragment cromozomial ca atare. Atunci când fragmentul este atașat de un cromozom, duplicația poate fi în tandem, în tandem invers sau deplasată într-o altă regiune cromozomială. Duplicațiile sunt mai frecvente și mai puțin letale decât delețiile.

Inversiunile: această aberație cromozomială implică rearanjarea unei secvențe de gene într-o ordine inversă. Dacă se limitează la brațul unui cromozom, rearanjamentul se consideră o inversiune paracentrică, iar dacă include și centromerul formează o inversiune periparacentrică (inversiunile greu de decelat prin teste genetice se evidențiază în stare heterozigotică în pachiten și cromozomi uriași din glandele salivare).

În anafaza meiozei, când în porțiunea inversată s-a produs un singur crossing-over, se observă o punte și un fragment acentric. Cromatidele care se formează sunt anormale, ca urmare a duplicației și deleției care se produc.

Fragmentul acentric se elimină iar puntea se rupe fie prin tensiunea mișcării anafazice, fie prin formarea peertelui celular.

Dacă pe un braț al unui cromozom există două inversiuni, ele pot fi adiacente, incluse sau suprapuse.

Inversiunile pericentrice afectează ambele brațe cromozomiale și centromerul. Dacă cele două rupturi care provoacă formarea inversiunii sunt la distanță egală de centromer, cromozomul care se formează este similar cu omologul său normal. Dacă rupturile au loc la distanțe inegale de centromer, poziția acestuia în cromozomul ce poartă inversiunea se modifică. Cromatidele care apar după un cossing-over la nivelul unei inversiuni pericentrice diferă de cele produse după o inversiune paracentrică prin faptul că în locul unei cromatide noi, cu terminații identice, însoțite de duplicații și deleții, care produc sterilitate. La nivel citogenic, inversiunea poate fi observată numai în pakiten sau prin producerea de cromozomi cu terminații identice ale celor două brațe.

Translocațiile: ruperea a doi cromozomi neomologi, urmată de un schimb de segmente cromozomiale, se numește translocație reciprocă. Cei doi cromozomi nou-formați prin reperare funcționează normal dacă au fiecare un singur centromer. Dacă în urma translocației s-au produs cromozomi cu doi centromeri sau fără nici unul, aceștia nu pot segrega normal în timpul diviziunii celulare și vor fi eliminați.

Translocația simplă, care presupune trecerea terminației unui cromozom la capătul altuia; se produce foarte rar, pentru că telomerele unui cromozom intact nu permit adaosul de cromatină. În unele cazuri, o regiune intermediară a unui braț de cromozom se mută în poziția interstițială pe celălalt braț sau pe un cromozom neomologi. O astfel de deplasare presupune producerea prealabilă a trei rupturi.

Translocările homozigote se comportă ca și cromozomii normali din care provin ele, cu deosebirea că s-au format noi grupe de linkage. Translocările heterozigote se recunosc prin configurații caracteristice în profaza I și metafaza I ale diviziunii reducționale.

Ruptura cromatidică: majoritatea autorilor sunt de acord că ruptura unei cromatide apare ca o regiune necolorată, fragmentul cromatidic distal deplasat față de axul cromatidei. Poate fi unică (single cromatid break) și izocromatidică, când două rupturi sunt localizate în același loc pe două cromatide-surori. Rupturile pot fi homozomale, dacă afectează un singur cromozom sau heterozomale dacă afectează doi sau mai mulți cromozomi. În raport cu cauza care le produce, rupturile sunt considerate induse atunci când produse de o cauză cunoscută sau spontane când cauza nu este cunoscută. Datorita rupturilor cromatidice poate avea loc fie fenomenul de restituție (vindecare), fie reunirea filamentelor-surori („sister strand reunion”), care duce la formarea unui cromozom dicentric evident în metafază. În anafază se formează o punte anafazică și cu un fragment acentric. Fragmentul acentric este eliminat, iar puntea anafazică se rupe și prin reunirea terminațiilor cromatidice rupte, se produce un nou cromozom dicentric. În acest fel, se realizează ciclul descris de B. Mollinstock (1942) sub denumirea de ruptură – fuziune punte – ruptură.

Lacuna cromatidică: această aberație este reprezentată de o zonă decolorată, deosebindu-se de ruptura cromatidică prin faptul că fragmentul distal rămâne în continuare aliniat cu restul cromatidei. Dacă cele două regiuni necolorate se află la același nivel pe cele două cromatide-surori ale unui cromozom aberația se numește lacună izocromatică.

Cromozomii „lipicioși” (stickness): în acest tip de modificare, cromozmii apar picnotici și „lipicioși”, limitele dintre cromozomii în metafază fiind slab marcate. Acest tip de modificare cromozomială se observă ca un efect primar al radiațiilor asupra cromozomilor și poate duce la apariția de punți cromatice anafazice și de fragmentare. Același tip de modificare cromozomială apare în urma tratamentelor cu unele substanțe chimice radiomimetice.

Numele mutației provine de la faptul că în anafaza I cromozomii aderă unii de alții, iar obstacolele care apar ulterior se datorează rupturilor produse în timpul mișcării anafazice.

Pulverizarea cromozomială: în forma sa completă, această modificare a cromozomilor în metafază reprezintă destrămarea complementului cromozomial într-o multitudine de fragmente punctiforme. Acest fenomen poate fi descris astfel: „fragmente de cromozomi fine, împrăștiate, de același ordin și mărime cu granulele cromatice ale nucleilor din interfază”. O formă atenuată sau incipientă a acestui fenomen este reprezentată de eroziunea cromozomilor, iar forme intermediare între cele două aspecte frecvent asociate.

Izocromozomul: reprezintă un cromozom la care cele două brațe sunt de lungime egală și genetic omoloage. Izocromozomul se formează printr-un fenomen numit diviziune greșită (missdivision) și constă din divizarea centromerului perpendicular pe axul longitudinal al cromozomului și nu de-a lungul acestui ax. Astfel, cele două jumătăți de centromer au fiecare atașate două cromatide de câte un braț cromozomial. Acest tip de cromozom patologic poate fi produs prin iradieri cu raze X la plante – spontan – în patologia cromozomială.

Endoduplicația: o formă de poliploidizare caracterizată prin apariția de diplocromozomi în profază și metafază este endoduplicația. Acest tip de duplicare internă a cromozomilor a fost descris în culturi de leucocite de la bolnavi de leucemie, la plante, în unele celule tumorale la șoarece.

Fenomenul de endomitoză a fost descris la Gerris lateralis (1937) , care a arătat că în procesul de formare a celulelor endopoliploidie, cromozomul se comportă normal, până în profază tardivă, cand membrana nucleară nu dispare și nu se formează fusul mitotic. Cromatidele se separă între ele și se despiralizează. Această mitoză parțială se termină cu dublarea numărului de cromozomi din celulă (endopoliploidie). Deosebirea dintre o metafază după o endoreduplucație și o metafază după o endomitoză, în care centromerii nu s-au mai divizat este imposibilă, cu toate că mecanismul lor de formare este diferit. În endoduplicare, multiplicarea cromozomilor are loc în interfază, în timp ce în endomitoză replicarea cromozomilor se desfășoară normal, dar repararea lor nu are loc, procesul mitotic fiind deficitar.

Mozaicismele cromozomiale: orice individ având celule cu 2 sau mai multe tipuri cromozomiale distincte reprezintă un mozaicism cromozomial. Mozaicismele cromozomiale au o mare importanță în practica medicală.

Mozaicismul cromozomial poate apărea în timpul embriogenezei, în acest caz fiind numit mozaicism de dezvoltare (C. E. Ford, 1963), sau după terminarea embriogenezei și atunci e numit mozaicism proliferativ. Diagnosticul de mozaicism cromozomial se poate pune după următoarele criterii:

Celulele cu număr nemodal, trebuie să aibă toate același cariotip.

Celulele cu număr nemodal, trebuie să depășească pe cele pe care se pot atribui unei variații întâmplătoare, de tehnică.

Celulele atipice similare trebuie găsite în probe din culturi izolate din țesuturi diferite și din același țesut.

IV. SARURILE METALELOR GRELE (sulfatul de cupru si acetatul de plumb)

4.1 Poluarea cu metale grele

În ultimul timp poluarea mediului înconjurător cu metale grele a atras atenția din cauza problematicii deosebit de complexe ridicate de acest fenomen deoarece majoritatea metalelor grele nu se găsesc sub formă solubilă în apă sau, dacă într-adevăr există, speciile chimice respective sunt complexate cu liganzi organici sau anorganici, fapt care influențează radical toxicitatea acestora.

Anual, milioane de tone de poluanți toxici sunt eliberate în aer, atât din surse naturale, dar mai ales din cele antropogene. Există patru categorii de surse de emisie: staționare (procesele industriale, arderile industriale și casnice), mobile (trafic auto), naturale (erupții vulcanice, incendii de pădure) și poluările accidentale (deversări, incendii industriale).

O dată ajunse în mediu, metalele grele suferă un proces de absorbție între diferitele medii de viață (aer, apă, sol), dar și între organismele din ecosistemele respective. Astfel, din aer, metalele grele pot fi inhalate direct sau pot contribui la poluarea solului prin precipitații. Din solul contaminat, plantele, pe de o parte, asimilează metalele dizolvate, iar, pe de altă parte, se produce poluarea prin infiltrație a apelor subterane, din care, ulterior, are loc transferul poluanților spre apele de suprafață și spre cele potabile. Plantele contaminate cu metale grele reprezintă hrană pentru animale și om.

Printre cele mai periculoase metale grele se disting plumbul și cuprul.

4.2 Săruri de cupru ( Sulfatul de cupru)

Cuprul a fost primul metal întrebuințat de om pentru scopuri practice. La început s-a folosit cuprul nativ, aflat în zăcăminte, apoi s-a trecut la extragerea cuprului din minereurile oxidice, prin încălzire cu carbine.

Denumirea de cupru provine de la numele insulei Cipru, bogată in zăcăminte de cupru și care, după ce a fost cucerită de la perși de către romani, a devenit sursa principală a Romei pentru extragerea acestui metal. Romanii l-au denumit initial aes cyprium, apoi cyprium, cyprum, și în final cuprum, denumire care s-a păstrat până astăzi și de la care provine și simbolul elementului.

Acest metal este răspândit destul de mult în natură, dar în puține locuri se află în cantități mari. Prezintă o culoare roșie-gălbuie, caracteristică, cu o puternică strălucire în stare polarizată. Densitatea cuprului la 20° C este de 8,98 g/ cm3 . Este un metal moale, cu duritate 2,5-3 în scara Mohs și ductil. Este maleabil și are o excepționala conductibilitate termică și electrică, formează aliaje cu numeroase metale.

Sulfatul de cupru (II), CuSO4, cunoscut și sub numele de piatră vânătă, sub formă hidratată, CuSO4 . 5H2O, este sarea de cupru cel mai mult folosită în tehnică. În industrie se prepară din deșeuri de cupru prin tratare cu acid sulfuric diluat, în prezență de aer:

2Cu + 2 H2SO4 + O2 2 CuSO4 + 2H2O

Deoarece cuprul este un metal mult folosit, chiar sub formă de deșeuri, ca să fie transformat în compuși, mai economică este fabricarea sulfatului de cupru din minereuri mai sărace în cupru sau din cenușă de pirită rămasă de la fabricarea acidului sulfuric, dacă acestea sunt cuprifere.

În stare anhidră, sulfatul de cupru este cristalizat în cristale albe, rombice, care, prin hidratare, devin albastre. Prin încălzire se descompune:

2 CuSO4 2CuO + 2SO2 +O2

Sulfatul de cupru pentahidratat este cristalizat în sistemul triclinic. El are patru molecule de apă în același plan cu atomii de oxigen din grupele SO4, legate coordinativ de ionul de cupru, iar a cincea legătură de apa este legată prin legături de hidrogen de alți atomi de oxigen. De aceea, prin tratarea unei soluții de sulfat de cupru pentahidratat se produce o deshidratare treptată în trihidrat și apoi monihidrat, iar peste 200o C rezultă SO4 anhidru. Sulfatul de cupru este de altfel singura sare solubilă a cuprului care apare în natură ca mineral.

Sulfatul de cupru are numeroase întrebuințări. În viticultură, este folosit, în combinație cu laptele de var, pentru combaterea Peronosporei viticola; în agricultură este utilizat pentru apărarea grâului împotriva mălurii, pentru stropirea frunzelor de cartofi contra Phitosphora infestans etc. Lemnul se impregnează cu o soluție de sulfat de cupru(II) pentru protejarea împotriva ciupercilor.

Cuprul este prezent în aproape toate organele animale precum și în plante. S-au izolat mai multe proteinate de cupru, inclusiv enzime. Tirozinaza a fost prima enzimă, în activitatea căreia cuprul s-a dovedit a avea rolul esențial. Proteinele de cupru sunt predominant oxidaze sau transportori reversibili de oxigen, dar există însă puține date, până în prezent, privitoare la chimia și structura lor.

În hemolimfa unor crustacee și a unor moluște se găsește o substanță proteică, de culoare albastră, numită hemocianină, care conține cupru. Analog fierului conținut în hemoglobină, cuprul din hemocianină, funcționează drept catalizator în procesele redox ale celulelor.

Este prezent în alimente, fiind introdus odată cu acestea în organismul animal însă este prezent și la plante. Cea mai mare parte din cupru se elimină prin bilă și mai puțin prin urină. Mici cantități de săruri de cupru, spre deosebire de sărurile altor metale grele (Pb), nu sunt dăunătoare pentru om. Compușii insolubili de cupru nu sunt toxici, cei solubili devin însă toxici atunci când doza lor crește: 10g CuSO4 este o doză mortală pentru om, iar o doză la 1-2 g CuSO4 poate provoca accidente toxic. Aliajele cuprului au aplicații în toate ramurile industriilor moderne : electrotehnică, termotehnică, industria metalurgică și în industria chimică.

4.3 Săruri de plumb (acetatul de plumb)

Plumbul este un metal de culoare cenușiu-albăstruie, cu luciu metalic care dispare repede și se acoperă de un strat subțire de oxid protector. Plumbul curat este moale, se zgârie cu unghia, este ductil, dar cu rezistență foarte mica la tracțiune. Plumbul dur conține stibiu, cupru și alte metale ca impurități. Apa curată nu atacă plumbul, deoarece are un potential cu puțin mai mare decât hidrogenul. Plumbul și combinațiile sale sunt toxice. Intoxicația cronică, numită saturism, apare la lucrătorii care folosesc plumb, cum sunt muncitorii tipografi și vopsitori,pentru care sunt necesare măsuri de protective, deoarece nu există terapie eficace.

Acetatul de plumb – Pb(CH3COO)2, sarea de plumb a acidului acetic, are masa moleculară 325,19. Se obține prin tratarea oxidului sau carbonatului de plumb cu acid acetic.

Pb3O4 + 4 CH3COOH PbO2 + 2 Pb(CH3COO)2 + H2O

Miniu de plumb acid acetic oxid de plumb acetat de plumb apă

Este o substanță cristalină, foarte toxică cu un gust dulceag, solubilă , însă ionizează foarte slab. Soluția de acetat de plumb se folosește în medicină (sub denumirea de apa de plumb), în industria textilă ca mordant( în imprimerie și vopstorie).

Plumbul împreună cu combinațiile acestuia reprezintă una dintre sursele poluante cele mai importante.

Poluarea cu plumb dar și cu combinațiile pe care le formează, are loc mai ales datorită evacuărilor întreprinderilor și din gazele de eșapament ale autovehiculelor. Spălat de apele meteorice acesta ajunge în râuri, mări și oceane. Se estimează ca plumbul îmbogățește anual apele oceanelor cu 25.000 tone. Acest element chimic poate să apară și în băuturile alcoolice distilate în vase artizanale, din utilizarea unor vase insuficient spălate care au conținut insecticide cu plumb. Apele ușor acide, cu conținut de CO2 pot dizolva plumbul din conducte .

Plumbul și diferiți compuși ai acestuia pătrund în organism pe cale digestivă sau respiratorie afectând grav sănătatea oamenilor. Se poate localiza în ficat, rinichi, iar cu timpul se poate localiza și în oase. Afectează globulele roșii, vasele sangvine, poate bloca hematopoeza prin sistemul nervos central, provocând astfel encefalopatia saturiană și sistemul nervos periferic provocând dereglări motorii.

Toxicitatea plumbului și a compușilor acestuia este recunoscută la plante, însă datele sunt insuficiente și foarte puțin concludente. Ionescu (1982) amintea că plumbul joacă un rol în producerea unor leziuni asupra organelor aeriene ale plantelor și se acumulează în frunze și în fructe.

V. MATERIAL ȘI METODE DE LUCRU

5.1. Material biologic

Specia supusă testărilor, Vicia faba, provine de la Laboratorul de Genetică al Facultății de Biologie.

5.2. Modul de lucru

În citogenetică se folosesc mai multe metode rapide de punere în evidență a cromosomilor, așa cum este și metoda Feulgen de colorare a cromosomilor. Această metodă de colorare a fost elaborată de R. Feulgen și H. Rossenbeck (1924) și a fost modificată de J. A. De Tomasi (1939). În biochimie, reacția Feulgen pozitivă este considerată ca fiind un indice sigur al prezenței ADN.

Numai cromatina cromosomilor, în celulele de diviziune, se colorează efectiv în roșu-violaceu, în prezență de fucsină bazică, în timp ce ARN-ul (din nucleoli și citoplasmă) și celelalte elemente celulare nu se colorează.

În vederea studierii cromosomilor în mitoze (la grâu, orz, ovăz, mazăre, bob, fasole, măzăriche, etc.), trebuie parcurse mai multe etape:

Germinarea

Prefixarea

Fixarea

Hidroliza

Colorarea

Efectuarea preparatelor microscopice

Efectuarea preparatelor permanente

Etapele prelucrării microscopice

Etapele prelucrării fotografice

Prepararea cariotipurilor

Realizarea idiogramei

Germinarea

Semintele de Vicia faba au fost aranjate în cutii Petri, la temperatura camerei (18 – 20ºC).

Au fost pregătite două serii experimentale:

Seria 1

martor care a germinat în apă distilată fiind în aceste condiții până în momentul în care rădăcinițele ajung la lungimea de aproximativ 1cm.

Lotul 1 A – germinare în soluție de sulfat de cupru 0,5% în apa distilata

Lotul 1B – germinare în soluție de sulfat de cupru 0.25% în apa distilata

Seria 2

martor care a germinat în apa distilata fiind în aceste condiții până în momentul în care rădăcinițele ajung la lungimea de aproximativ 1cm.

Lotul 2 A – germinare în soluție de acetat de plumb 0,5% în apa distilata

Lotul 2 B – germinare în soluție de acetat de plumb 0.25% în apa distilata

Spălarea

Această etapă presupune trecerea semintelor germinate (după circa 3 zile), la temperatura camerei, timp de 2 ore, în apă distilată. Se efectuează astfel înlocuirea soluțiilor de saruri de metale cu apă distilată.

Fixarea

Are rolul de a omorî celulele, împiedicând modificarea structurii interne și externe a celulelor. Ca fixator poate fi folosit alcool etilic absolut la acid acetic glacial (3:1), la temperatura camerei timp de 24 de ore.

Păstrarea în alcool etilic 70º

Această păstrare se face la frigider, până la prelucrare. Rădăcinițele se trec în sticluțe cu alcool 70º, se notează pe fiecare sticluță varianta experimentală și se păstrează la frigider.

Spălarea

Se face cu acid clorhidric 1N, timp de 5 minute. Se trec câteva rădăcinițe în sticluțe curate și se acoperă cu acid. Etapa are rolul de a îndepărta alcoolul etilic.

Hidroliza

Are rolul de a macera țesuturile prin dizolvarea parțială a substanțelor pectice, astfel fiind ușurat procesul de colorare și apoi de etalare a celulelor pe lamă.

Hidroliza se face la rece cu o soluție de acid clorhidric 50% (50ml HCl și 50ml apă distilată), la temperatura camerei. Timpul de hidroliză variază în funcție de consistența țesuturilor și se determină prin tatonări pentru fiecare specie în parte. Pentru stabilirea timpului de hidroliză se lucrează mai întâi pe rădăcinițe aparținând martorului. Se trece câte 1 – 2 în câte o sticluță, se adaugă acidul și se lasă un anumit timp pentru hidroliză (de exemplu, 8 minute, 10 minute, 12 minute, pentru ceapă). Se alege varianta la care colorarea realizată ulterior este cea mai bună. Doar după stabilirea timpului de hidroliză se va trece la colorarea materialului provenit din variantele mutagenizate, în alte condiții existând riscul compromiterii întregului experiment.

Colorarea

Se poate face cu o soluție specială – reactivul Carr (carbol-fucsină). Se îndepărtează acidul clorhidric 50% din sticluțe; se lasă sticluțele cu gura în jos pe hârtie de filtru, pentru a se scurge foarte bine; apoi se adaugă colorantul, doar atât cât să cuprindă rădăcinițele. Dacă se constată o virare de culoare de la violet la albastru, colorantul se schimbă. Se lasă la frigider apoi 24 – 48 de ore (sau chiar mai mult), pentru realizarea colorării.

Acest colorant determină colorarea nucleelor și cromosomilor în roșu-vișiniu, citoplasma rămânând roz-pal. Colorarea cu Carr constă în reacția grupelor aldehidice de ADN (eliberate prin hidroliza cu HCl 50%) cu fucsină bazică din colorant. Regiunea meristematică a vârfului rădăcinițelor se colorează intens, deoarece majoritatea celulelor sunt în diviziune. Restul rădăciniței, unde frecvența diviziunilor este redusă, rămâne necolorată. De aceea, pentru realizarea preparatului, se va tăia cu lama doar vârful rădăciniței, care apare mult mai colorat decât restul rădăcinii. Pentru intensificarea colorării, rădăcinile se lasă în soluție timp de 12 ore.

Efectuarea preparatelor microscopice

Pentru realizarea unui preparat reușit, se ia o lamă de sticlă curată, degresată și uscată. Pe această lamă se pune în regiunea de mijloc o picătură de acid acetic 45%, apoi cu ajutorul unei pensete, se iau 1 – 2 rădăcinițe din fiola în care s-a făcut colorarea. În această picătură se pune vârful rădăcinițelor tăiat cu o lamă de 1 – 2mm. S-a înlăturat surplusul de colorant de pe lamă, iar peste rădăcinițe s-a așezat o lamelă, de asemenea degresată și uscată.

Ținând fix de un colț al lamei cu o bucată de hârtie de filtru, ca să nu se miște lamela pe lamă, se lovește constant, cu un băț de chibrit, lamela în regiunea în care se află vârful rădăciniței, astfel încât să se obțină, pe cât posibil, un singur strat. De asemenea, și cromozomii trebuie etalați cât mai bine, pentru a putea fi observați în metafază, în vederea realizării cariotipului. După etalare, se îndepărtează surplusul de acid acetic 45% cu o hâtrie de filtru.

Preparatul astfel pregătit se va observa la microscop. Un preparat microscopic trebuie să prezinte nucleii și cromozomii intens colorați în roșu-violaceu, iar citoplasma apare incoloră; celulele să fie bine etalate, iar o parte din ele să nu aibă membrană celulară, astfel încât cromozomii să fie dispersați pe cât posibil, să poată fi individualizați.

Examinarea preparatelor la microscop

pentru indicele mitotic (atât pentru martor, cât și pentru variantele experimentale): se citesc câte 5 – 10 preparate, pentru fiecare variantă. Pe fiecare preparat se citesc câte 10 câmpri microscopice. În fiecare câmp se numără celulele în diviziune (în P, M, A și T) și celulele în interfază. Se notează totul în tabelul preliminar. Cele 10 câmpuri microscopice se aleg aleator pe preparat, însă trebuie să aibă o densitate bună de celule, iar acestea să nu fie suprapuse. Nu se citesc decât celulele întregi; celulele de pe marginea câmpului, care se văd pe jumătate, nu se iau în calcul;

pentru aberațiile cromozomiale în ana-telofaza mitozei: pe aceleași preparate pe care se fac citirile pentru indicele mitotic, în paralel se citesc câte 50 ana-telofaze (toate de pe un preparat în cazul în care sunt puține). Se notează în tabelul preliminar cele normale și cele cu aberații, precum și tipul de aberații.

VI. REZULTATE SI INTERPRETARE

6.1. Influența sulfatului de cupru si a acetatului de plumb asupra diviziunii mitotice la Vicia faba

6.1.1. Frecvența totală a celulelor în diviziunea mitotică in meristemele radiculare de Vicia faba tratate cu sulfat de cupru

Așa cum se observă din graficul de mai sus, aditivul sulfatul de cupru nu influențează major proporția de celule aflate în diviziune, constatându-se o ușoară creștere (9,42 %) în cazul primei variante experimentale, comparativ cu martorul (7,92 %) și cea de-a doua variantă experimentală (9,22 %). Putem aprecia, în aceste condiții, că la o concentrație de 0,5 %, sulfatul de cupru are efect biostimulator asupra diviziunii mitotice la Vicia faba.

6.1.2. Frecvența totală a celulelor în diviziunea mitotică in meristemele radiculare de Vicia faba tratate cu acetat de plumb

Așa cum se observă din graficul de mai sus, acetatul de plumb nu influențează major proporția de celule aflate în diviziune, constatându-se doar o ușoară scăderea a acesteia (5,02 %) în cazul primei variante experimentale, comparativ cu martorul (5,45 %) și de asemenea se constată o scădere a proporției celulelor aflate în diviziune (2,88 %) în cazul celei de-a doua variante experimentale.

Putem aprecia, în asemenea condiții, că la o concentrație de 0,5 % și la 0,25 % (mai ales), acetatul de plumb are efect bioinhibitor asupra diviziunii mitotice la Vicia faba.

6.1.3. Frecvența celulelor în diferitele faze ale diviziunii mitotice in meristemele radiculare de Vicia faba tratate cu sulfat de cupru si acetat de plumb

6.1.3.1. Frecvențele celulelor în profază – Vicia faba tratat cu sulfat de cupru

Așa cum se observă din graficul de mai sus, sulfatul de cupru nu influențează major proporția de celule aflate în profază, constatându-se o ușoară scădere a acesteia (6,12 %) în varianta experimentală 1 și o ușoară scădere și în varianta experimentală 2 (5,98 %), comparativ cu martorul (6,29 %).

Putem aprecia, în aceste condiții, că la o concentrație de 0,5 %, mai ales la 0,25 %, sulfatul de cupru are efect bioinhibitor asupra celulelor în profază la Vicia faba

6.1.3.2. Frecvențele celulelor în metafaza – Vicia faba tratat cu sulfat de cupru

Așa cum se observă din graficul de mai sus, sulfatul de cupru nu influențează major proporția de celule aflate în metafază, constatându-se o ușoară creștere a acesteia (2,63 %) în varianta experimentală 1 și o ușoară creștere și în varianta experimentală 2 (1,11%), comparativ cu martorul, (0,37 %).

Putem aprecia, în aceste condiții, că la o concentrație de 0,5 %, mai ales la 0,25 %, sulfatul de cupru are un efect biostimulator asupra celulelor în metafază la Vicia faba.

6.1.3.3. Frecvențele celulelor în anafaza – Vicia faba tratat cu sulfat de cupru

Așa cum se observă din graficul de mai sus, sulfatul de cupru nu influențează major proporția de celule aflate în anafază, constatându-se o ușoară creștere a acesteia (0,38 %) în cazul variantei experimentale 1 și o creștere puțin mai mare (0,61%) în cazul variantei experimentale 2, comparativ cu martorul (0,37 %).

Putem aprecia, în aceste condiții, că la o concentrație de 0,5%, respectiv 0,25 %, sulfatul de cupru are efect biostimulator asupra celulelor aflate în anafază la Vicia faba.

6.1.3.4. Frecvențele celulelor în telofaza– Vicia faba tratat cu sulfat de cupru

Așa cum se observă din graficul de mai sus, sulfatul de cupru nu influențează major proporția de celule aflate în telofază, constatându-se o ușoară scădere a acesteia (0,43 %) în cazul variantei experimentale 1 și o scădere (0,46 %) și în cazul variantei experimentale 2, comparativ cu martorul (1,11 %).

Putem aprecia, în aceste condiții, că la o concentrație de 0,5 %, respectiv 0,25 %, sulfatul de cupru are efect bioinhibitor asupra celulelor aflate în telofază la Vicia faba.

6.1.3.5. Frecvențele celulelor în profază – Vicia faba tratat cu acetat de plumb

Așa cum se observă din graficul de mai sus, acetatul de plumb influențează major proporția de celule aflate în profază, constatându-se o scădere a acesteia (2,44 %) în cazul primei variante experimentale și o scădere mai mare (1,13 %) în cazul variantei experimentale 2, comparativ cu martorul (4,92 %).

Putem aprecia, în aceste condiții, că la o concentrație de 0,5 %, respectiv 0,25 %, acetatul de plumb are efect bioinhibitor asupra celulelor aflate în profază la Vicia faba.

6.1.3.6. Frecvențele celulelor în metafaza– Vicia faba tratat cu acetat de plumb

Așa cum se observă din graficul de mai sus, acetatul de plumb nu influențează major proporția de celule aflate în metafază, constatându-se o creștere a acesteia (1,61 %) în cazul variantei experimentale 1 și o ușoară creștere (0,50 %) în cazul variantei experimentale 2, comparativ cu martorul (0,22 %).

Putem aprecia, în aceste condiții, că la o concentrație de 0,5 %, respectiv 0,25 %, acetatul de plumb are efect biostimulator asupra celulelor aflate în metafază la Vicia faba.

6.1.3.7. Frecvențele celulelor în anafaza – Vicia faba tratat cu acetat de plumb

Așa cu se observă din graficul de mai sus, la martor nu apar celule în anafază, față de celulele din varianta experimentală 1 și respectiv 2, unde proporția celulelor în anafază (0,62 %) din varianta experimentală 1 este cel puțin mai mare decât proporția celulelor în anafază din varianta experimentală 2 (0,56 %), comparativ cu martorul (0 %).

În aceste condiții, putem aprecia că acetatul de plumb la concentrația de 0,5% are efect biostimulator comparativ cu concentrația de 0,25 % asupra celulelor aflate în anafază.

6.1.3.8. Frecvențele celulelor în telofaza – Vicia faba tratat cu acetat de plumb

Așa cum se observă din graficul de mai sus, acetatul de plumb influențează destul de mult proporția de celule aflate în telofază, constatându-se o creștere a acesteia (0,90 %) în cazul variantei experimentale 1 și de asemenea o creștere mai ușoară (0,61 %) în cazul variantei experimentale 2, comparativ cu martorul (0,33 %).

Putem aprecia, în aceste condiții, că la o concentrație de 0,5%, respectiv 0,25 %, mutagenul are efect biostimulator asupra telofazei la Vicia faba.

6.2. Aberatii structural-cromozomiale în A-T mitotică la Vicia faba, consecutiv tratamentului cu sulfat de cupru

Proporția A-T aberante în meristemul radicular la Vicia faba

Așa cum se observă din graficul de mai sus, sulfatul de cupru influențează suficient de mult proporția de celule aflate în A-T aberante, constatându-se o creștere (85,45%) în cazul primei variante experimentale și în cazul celei de-a doua variante experimentale (87,30%), comparativ cu martorul (25%).

Proporția diferitelor tipuri de aberanță în A-T mitozei

Punți cromatidice (1)

Din graficul anterior se poate observa că sulfatul de cupru influențează într-o proporție mică celulele în A-T cu o punte. Astfel, se constată că proporția de celule în A-T cu o punte crește (7,27%) în prima variantă experimentală și în cea de-a doua variantă experimentală (6,34%), comparativ cu martorul (0%).

Sulfatul de cupru are efect stimulator asupra celulelor în A-T cu o punte la Vicia faba.

Punți cromatidice (2)

Din graficul anterior se poate constata că sulfatul de cupru influențează într-o proporție mică celulele în A-T cu 2 punți. Astfel, se constată că proporția de celule în A-T cu două punți crește (9,09%) în prima variantă experimentală și în cea de-a doua variantă experimentală (4,76%), comparativ cu martorul (0%).

Sulfatul de cupru are efect stimulator asupra celulelor în A-T cu 2 punți la Vicia faba.

Punți cromatidice (3)

Din graficul anterior se poate constata că sulfatul de cupru influențează într-o proporție mică celulele în A-T cu 3 punți. Astfel, se constată că proporția de celule în A-T cu trei punți crește (1,81%) în prima variantă experimentală și în cea de-a doua variantă experimentală (4,76%), comparativ cu martorul (0%).

Sulfatul de cupru are efect stimulator asupra celulelor în A-T cu 3 punți la Vicia faba.

Fragmente (1)

Din graficul de mai sus se poate observa că sulfatul de cupru determină o scădere a proporției celulelor în A-T cu 1 fragment, atât în cazul primei variante experimentale (10,90%), cât și în cazul celei de-a doua variante experimentale (7,93%), comparativ cu martorul (15%).

Fragmente (2)

Din graficul de mai sus se observă că sulfatul de cupru influențează major proporția de celule în A-T cu 2 fragmente, constatându-se o creștere a proporției de celule în A-T cu 2 fragmente (7,27%) în cazul primei variante experimentale cât și în a doua variantă experimentală (12,69%), comparativ cu martorul (0%).

Sulfatul de cupru, în condițiile prezentate anterior, are efect major asupra proporției de celule în A-T cu 2 fragmente la Vicia faba

Fragmente (3)

Din acest grafic se poate observa că sulfatul de cupru nu influențează major proporția de celule în A-T cu 3 fragmente. Se constată că proporția celulelor în A-T cu 3 fragmente crește ușor în prima variantă experimentală (3,63%), cât și în a doua variantă experimentală (3,14%), comparativ cu martorul (0%).

Punți și fragmente (P+F)

Din graficul de mai sus se observă că sulfatul de cupru nu influențează major proporția de celule în A-T cu punți și fragmente. Se poate constata că proporția celulelor în A-T cu P+F crește în prima variantă experimentală (16,36%) și în a doua variantă experimentală (14,28%), comparativ cu martorul (5%).

Din aceste constatări putem aprecia că sulfatul de cupru la concentrație de 0,5% are efect stimulator, la fel ca și la 0,25%, asupra celulelor în A-T cu P+F la Vicia faba.

Micronuclei (1)

Din graficul de mai sus se poate observa că sulfatul de cupru determină o creștere a proporției de celule în A-T cu 1 micronucleu, atât în cazul primei variante experimentale (14,54%) și în cazul celei de-a doua variante experimentale (9,52%), comparativ cu martorul (0%).

Micronuclei (2)

Din acest grafic se poate poate constata că sulfatul de cupru nu influențează major proporția de celule în A-T cu 2 micronuclei, constatându-se o creștere ușoară în cazul primei variante experimentale (10,9%) și în cea de-a doua variantă experimentală (6,34%), comparativ cu martorul (5%).

În această situație, putem susține că sulfatul de cupru are efect stimulator la o concentrație de 0,5% și la 0,25%, asupra celulelor în A-T cu 2 micronuclei la Vicia faba

.

Cromozomi retardatari

Din graficul de mai sus se poate observa că sulfatul de cupru determină o ușoară creștere a proporției de celule în A-T cu cromozomi retardatari, atât în prima variantă experimentală (1,81%), cât și în a doua variantă experimentală (6,81%), comparativ cu martorul (0%).

Cromozomi inelari

Din graficul anterior se poate observa că sulfatul de cupru determină o creștere considerabilă a proporției celulelor în A-T cu cromozomi inelari în cazul celei de-a doua variante experimentale (9,52%), comparativ cu martorul (0%) și prima variantă experimentală (0%).

Alte aberații

Din graficul de mai sus se poate observa că sulfatul de cupru nu influențează major proporția de celule în A-T cu alte aberații (1,81%) în cazul primei variante experimentale și în cazul celei de-a doua variante experimentale (1,58%), comparativ cu martorul (0%).

6.3. Aberațiile structural-cromozomiale în A-T mitotică la Vicia faba, consecutiv tratamentului cu acetat de plumb

Proporția A-T aberante în meristemul radicular la Vicia faba

Din graficul de mai sus se poate observa că acetatul de plumb influențează major proporția de celule în A-T aberante, constatându-se o creștere a acesteia atât în varianta experimentală 0,5% (69,83%) căt și în varianta experimentală 0,25% (62,19%), comparativ cu martorul (0%).

În aceste condiții, putem să precizăm că acetatul de plumb are efect stimulator, la concentrație de 0.5% și 0,25%, asupra aparitiei celulelor cu A-T aberante.

Aberații structural-cromozomiale în A-T mitotică la Vicia faba, consecutiv tratamentului cu acetat de plumb

Proporția diferitelor tipuri de aberații în A-T mitoze

Punți cromatidice (1)

Din graficul anterior se poate observa că acetatul de plumb determină o creștere a proporției celulelor aflate în A-T cu 1 punte, atât în prima variantă experimentală (6,02%) cât și în varianta experimentală 2 (2,43%), comparativ cu martorul (0%).

Punți cromatidice (2)

Din graficul anterior se poate observa că acetatul de plumb determină o creștere a proporției celulelor aflate în A-T cu 2 punți, atât în prima variantă experimentală (7,22%) cât și în varianta experimentală 2 (6,09%), comparativ cu martorul (0%).

Punți cromatidice (3)

Din graficul anterior se poate observa că acetatul de plumb determină o creștere a proporției celulelor aflate în A-T cu 3 punți, atât în prima variantă experimentală (3,61%) cât și în varianta experimentală 2 (3,65%), comparativ cu martorul (0%).

Fragmente (1)

Din graficul de mai sus se poate observa că acetatul de plumb determină o creștere a proporției celulelor aflate în A-T cu 1 fragment, atât în prima variantă experimentală (8,43%) cât și în varianta experimentală 2 (9,75%), comparativ cu martorul (0%).

Fragmente (2)

Din graficul de mai sus se poate observa că acetatul de plumb determină o creștere a proporției celulelor aflate în A-T cu 2 fragmente, atât în prima variantă experimentală (6,02%) cât și în varianta experimentală 2 (8,53%), comparativ cu martorul (0%).

Fragmente (3)

Din graficul de mai sus se observă că acetatul de plumb influențează proporția de celule în A-T cu 3 fragmente determinând o creștere a acesteia în cazul primei variante experimentale (6,02%) și o ușoară creștere în cazul variantei experimentale 2 (1,21%).

Putem aprecia că acetatul de plumb are efect stimulator la concentrația de 0,5% asupra celulelor în A-T cu 3 fragmente la Vicia faba.

Punți și fragmente (P+F)

Din graficul de mai sus se poate observa că acetatul de plumb influențează proporția de celule în A-T cu P+F, determinând o creștere a acesteia atât în varianta experimentală 1 (3,61%), cât și în varianta experimentală 2 (3,65%), comparativ cu martorul (0%).

Acetatul de plumb, în aceste condiții, are efect stimulator asupra aparitiei celulelor în A-T cu P+F, la concentrația de 0,5% și 0,25%, la Vicia faba.

Micronuclei (1)

Din graficul de mai sus se poate observa că acetatul de plumb influențează proporția de celule în A-T cu 1 micronucleu, determinând o creștere a acesteia atât în varianta experimentală 1 (14,45%), cât și în varianta experimentală 2 (10,97%), comparativ cu martorul (0%).

Acetatul de plumb, în aceste condiții, are efect stimulator asupra celulelor în A-T cu 1 micronucleu, la concentrația de 0,5% și 0,25%, la Vicia faba.

Micronuclei (2)

Din graficul de mai sus se observă că acetatul de plumb determină o creștere ușoară a proporției de celule în A-T cu 2 micronuclei în cazul primei variante experimentale (2,4%) și în cazul celei de-a doua variante experimentale (1,21%), comparativ cu martorul (0%).

Cromozomi retardatari

Din graficul de mai sus se observă că acetatul de plumb determină o creștere ușoară a proporției de celule în A-T cu cromosomi retardatari în cazul primei variante experimentale (4,81%) și în cazul celei de-a doua variante experimentale (3,65%), comparativ cu martorul (0%).

Cromosomi inelari

Din graficul de mai sus se poate observa că acetatul de plumb influențează proporția de celule în A-T cu cromosomi inelari, constatându-se o creștere a acesteia în prima variantă experimentală (3,61%) și în a doua variantă experimentală (4,87%), comparativ cu martorul (0%).

Alte aberații

Din graficul de mai sus se observă că proporția celulelor cu alte aberații crește sub influența acetatul de plumb la 0,5% și mai ales la 0,25%. Astfel, putem constata o creștere a proporției celulelor cu alte aberații în cazul variantei experimentale 1 (3,61%) și în varianta experimentală 2 (6,09%).

CONCLUZII

Investigațiile asupra diviziunii mitotice în meristemele radiculare la Vicia faba au evidențiat efectul celor doua saruri de metale folosite, asupra acestui proces vital.

Spre deosebire de acetatul de plumb, care a indus o scădere a proporției de celule în diviziune, acționând de o maniera inhibitoare, sulfatul de cupru a produs o creștere a procentului de celule în diviziune, acționând ca stimulator al acestui proces.

Studiile asupra diviziunii mitotice au evidențiat apariția unor aberații cromosomiale în ana-telofaza mitozei. Numărul de ana-telofaze aberante este direct proporțional cu creșterea concentrației soluției de saruri folosite. Ambele saruri au indus creșterea frecvenței aberațiilor ana-telofazice în meristemele radiculare la Vicia faba, comparativ cu martorul netratat.

Aberațiile cromosomiale au fost reprezentate în principal de punți , fragmente , cromosomi retardari și micronuclei.

BIBLIOGRAFIE

Acatrinei Gh. , Acatrinei L. , 1998 – Diviziunea celulelor la plante sub influența substanțelor biologic active , Editura Cermi , Iași ;

Artenie V. , 1987 – Biochimia și organizarea moleculară a cromozomului eucariot , Centrul de multiplicare al Universității „ Al. I. Cuza " , Iași ;

Anghel I. , Toma N. , 1987 – Cromozomii , Editura Științifică și Enciclopedică , București ;

Anghel I. , Toma N. , 1987- Mutațiile genelor , Editura Tehnică , București ;

Baciu T. , 1979 – Îndrumător pentru folosirea pesticidelor , Editura Ceres , București ;

Băra I. , 1996 – Vademecum în genetică , Editura Corson , Iași ;

Băra I. , 1999 – Genetica , Editura Corson , Iași ;

Băra I. , Cîmpeanu M.-M. , 2003 – Genetica , Editura Corson , Iași ;

Bârliga B. , 1967 – Bolile și dăunătorii legumelor , pomilor fructiferi și viței de vie , Editura agrosilvică , București ;

Butnaru G. , 1985 – Genetică , Editura Institutului Agronomic , Timișoara ;

Butnaru G. , Nicolae I. , Tămaș E. , 1999 – Genetică moleculară , Editura Mirton , Timișoara ;

Cândea E. , 1984 – Dăunătorii legumelor și combaterea lor , Editura Ceres , București ;

Ceaușescu I. , 1984 – Cultura legumelor , Editura Ceres , București ;

Ceaușescu I. , Bășașa M. , Nistor S. , Voican V., 1980 – Legumicultură generală și specială , Editura Didactică și Pdagogică , București ;

Ceaușescu I. și colab. , 1984 – Legumicultură generală și specială , Editura Didactică și Pdagogică , București , 17 – 26 , 153 – 216 , 586 – 607 ;

Cîmpeanu M.-M. , Maniu M. , Surugiu I. , 2002 – Genetica – metode de studiu , Editura Corson , Iași ;

Constantinescu D. , Hațieganu E. , 1983 – Biologia moleculară a celulei vegetale, Editura Medicală , București ;

Corneanu M. , 2000 – Genetica , Editura Sitech , Craiova ;

Crăciun T. , 1981 – Genetica plantelor horticole , Editura Ceres , București ;

Crăciun T. , 1983 – Geniul genetic și ameliorarea plantelor , Editura Ceres , București ;

Diaconu P. , 1972 -Ereditatea și factorii mutageni , Editura Ceres , București , 107 – 120 ;

Docea E. , Frățilă E. , Rădulescu E. , 1979 – Bolile legumelor și combaterea lor , Editura Academiei , București ;

Gavrilă L. , 1986 – Genetică , Editura Tipografia Universității , București ;

Gheorghiță G. , 1999 – Bazele geneticii , Editura Alma Mater , Bacău ;

Iacob N. , Lăcătușu M. , Mihalache G. , Ceianu I. , 1975 – Combaterea biologică a dăunătorilor , Editura Științifică , București ;

Indrea D. , Butnaru M. , Florescu E. , Tinca P. , 1983 – Legumicultură , Editura Didactică și Pedagogică , București , 154- 158 ;

Lazăr A. , Glodeanu C. , Severin V. , 1989 – Fitopatologie , Editura Institutului Agronomic , Iași ;

Lazanyi A. , Almissy L . , Hantz A. , 1962 – Studiul citologic al sistemului activ din rădăcina de bob tratat cu unele substanțe , Editura Academiei Române , Cluj-Napoca , 43-47 ;

Maier I. , 1962 – Cultura legumelor , vol. I . Editura agrosilvică , București , 51-45;

Maier I. , 1963 – Cultura legumelor , vol. II , Editura agrosilvică , București , 7-66 ;

Maniu-Tudose M. , 2001 – Efecte histoanatomice și citogenetice induse de tratamentul cu factori chimici la linii pure genetic de Hordeum vulgare L. , Teză de doctorat , Iași , 34-38 ;

Mititiuc M . , 1984 – Fitopatologie , Editura Universității , Iași ;

Mititiuc M . , 1993 – Bolile plantlor legumicole. Prevenirea și combaterea lor , Editura Universității ”Al. I. Cuza” , Iași ;

Movileanu V. , Popa N. , 1996 – Genetică – lucrări practice Compendiu , Editura ȘtiinȘța , Chișinău ;

Nenițescu C. D. , 1966 – Chimie organică , ed. a VI-a , vol. I , Editura Didactică și Pedagogică , București ;

Nenițescu C. D. , 1968 – Chimie organică , ed. a VI-a , vol. II , Editura Didactică și Pedagogică , București ;

Nicolae I. , 1978 – Mutageneza experimentală , Editura Ceres , București ;

Pop I. , Mititelu M. , 1983 – Botanică sistematică , Editura Didactică și Peda-gogică , București , 348-352 ;

Raicu P. , Nachtigal M. , 1969 – Citogenetica – principii și metode , Editura Academiei Române , București ;

Raicu P. , Stoian V. , Nicolaescu M. , 1974 – Mutațiile șși evoluția , Editura Enciclopedică Română , București , 99 –116 ;

Raicu P. și colab. , 1983 – Genetica – metode de laborator , Editura Academiei Române , București ;

Raicu P. , Stoian V. , 1989 – Gene și cromozomi , Editura științifică și Enci-clopedică , București 142 –162 , 194 –200 ;

Snusnard P. D. , Simmons M. J. , Jenkins J. B. , 1997 – Principles of Genetics , John Willy and Sons Inc. , New York , London , 206-215 ;

Socaciu C. , Neamțu G. , Câmpeanu Gh. , 1995 – Biochimie vegetală , Editura Didactică și Pedagogică , București ;

Socaciu C. ,1996 – Mutageneza chimică , Editura Genesis , Cluj –Napoca ;

Suciu Z. , Pleșca T. , Goian M. , 1987 – Cultura legumelor în grădină , seră și solar , Editura Facla , Timișoara ;

Toma C. , Niță M. ,1995 – Celula vegetală , Editura Universității „ Al. I. Cuza " , Iași ;

Tudose I. , Pricop M. , Tudose M. , 1991 – Cytogenetic effects induced by nicotinic acid in Vicia faba L. (2n=12) and Triticum aestivum (2n=42) , An. șt. Univ. ”Al. I. Cuza” , T XXXVII , s a II-a , Biologie vegetală , Iași ;

Banu C. si colaboratorii, 2000 – Aditivi si ingrediente pentru industria alimentara, Editura tehnica, Bucuresti.

BIBLIOGRAFIE

Acatrinei Gh. , Acatrinei L. , 1998 – Diviziunea celulelor la plante sub influența substanțelor biologic active , Editura Cermi , Iași ;

Artenie V. , 1987 – Biochimia și organizarea moleculară a cromozomului eucariot , Centrul de multiplicare al Universității „ Al. I. Cuza " , Iași ;

Anghel I. , Toma N. , 1987 – Cromozomii , Editura Științifică și Enciclopedică , București ;

Anghel I. , Toma N. , 1987- Mutațiile genelor , Editura Tehnică , București ;

Baciu T. , 1979 – Îndrumător pentru folosirea pesticidelor , Editura Ceres , București ;

Băra I. , 1996 – Vademecum în genetică , Editura Corson , Iași ;

Băra I. , 1999 – Genetica , Editura Corson , Iași ;

Băra I. , Cîmpeanu M.-M. , 2003 – Genetica , Editura Corson , Iași ;

Bârliga B. , 1967 – Bolile și dăunătorii legumelor , pomilor fructiferi și viței de vie , Editura agrosilvică , București ;

Butnaru G. , 1985 – Genetică , Editura Institutului Agronomic , Timișoara ;

Butnaru G. , Nicolae I. , Tămaș E. , 1999 – Genetică moleculară , Editura Mirton , Timișoara ;

Cândea E. , 1984 – Dăunătorii legumelor și combaterea lor , Editura Ceres , București ;

Ceaușescu I. , 1984 – Cultura legumelor , Editura Ceres , București ;

Ceaușescu I. , Bășașa M. , Nistor S. , Voican V., 1980 – Legumicultură generală și specială , Editura Didactică și Pdagogică , București ;

Ceaușescu I. și colab. , 1984 – Legumicultură generală și specială , Editura Didactică și Pdagogică , București , 17 – 26 , 153 – 216 , 586 – 607 ;

Cîmpeanu M.-M. , Maniu M. , Surugiu I. , 2002 – Genetica – metode de studiu , Editura Corson , Iași ;

Constantinescu D. , Hațieganu E. , 1983 – Biologia moleculară a celulei vegetale, Editura Medicală , București ;

Corneanu M. , 2000 – Genetica , Editura Sitech , Craiova ;

Crăciun T. , 1981 – Genetica plantelor horticole , Editura Ceres , București ;

Crăciun T. , 1983 – Geniul genetic și ameliorarea plantelor , Editura Ceres , București ;

Diaconu P. , 1972 -Ereditatea și factorii mutageni , Editura Ceres , București , 107 – 120 ;

Docea E. , Frățilă E. , Rădulescu E. , 1979 – Bolile legumelor și combaterea lor , Editura Academiei , București ;

Gavrilă L. , 1986 – Genetică , Editura Tipografia Universității , București ;

Gheorghiță G. , 1999 – Bazele geneticii , Editura Alma Mater , Bacău ;

Iacob N. , Lăcătușu M. , Mihalache G. , Ceianu I. , 1975 – Combaterea biologică a dăunătorilor , Editura Științifică , București ;

Indrea D. , Butnaru M. , Florescu E. , Tinca P. , 1983 – Legumicultură , Editura Didactică și Pedagogică , București , 154- 158 ;

Lazăr A. , Glodeanu C. , Severin V. , 1989 – Fitopatologie , Editura Institutului Agronomic , Iași ;

Lazanyi A. , Almissy L . , Hantz A. , 1962 – Studiul citologic al sistemului activ din rădăcina de bob tratat cu unele substanțe , Editura Academiei Române , Cluj-Napoca , 43-47 ;

Maier I. , 1962 – Cultura legumelor , vol. I . Editura agrosilvică , București , 51-45;

Maier I. , 1963 – Cultura legumelor , vol. II , Editura agrosilvică , București , 7-66 ;

Maniu-Tudose M. , 2001 – Efecte histoanatomice și citogenetice induse de tratamentul cu factori chimici la linii pure genetic de Hordeum vulgare L. , Teză de doctorat , Iași , 34-38 ;

Mititiuc M . , 1984 – Fitopatologie , Editura Universității , Iași ;

Mititiuc M . , 1993 – Bolile plantlor legumicole. Prevenirea și combaterea lor , Editura Universității ”Al. I. Cuza” , Iași ;

Movileanu V. , Popa N. , 1996 – Genetică – lucrări practice Compendiu , Editura ȘtiinȘța , Chișinău ;

Nenițescu C. D. , 1966 – Chimie organică , ed. a VI-a , vol. I , Editura Didactică și Pedagogică , București ;

Nenițescu C. D. , 1968 – Chimie organică , ed. a VI-a , vol. II , Editura Didactică și Pedagogică , București ;

Nicolae I. , 1978 – Mutageneza experimentală , Editura Ceres , București ;

Pop I. , Mititelu M. , 1983 – Botanică sistematică , Editura Didactică și Peda-gogică , București , 348-352 ;

Raicu P. , Nachtigal M. , 1969 – Citogenetica – principii și metode , Editura Academiei Române , București ;

Raicu P. , Stoian V. , Nicolaescu M. , 1974 – Mutațiile șși evoluția , Editura Enciclopedică Română , București , 99 –116 ;

Raicu P. și colab. , 1983 – Genetica – metode de laborator , Editura Academiei Române , București ;

Raicu P. , Stoian V. , 1989 – Gene și cromozomi , Editura științifică și Enci-clopedică , București 142 –162 , 194 –200 ;

Snusnard P. D. , Simmons M. J. , Jenkins J. B. , 1997 – Principles of Genetics , John Willy and Sons Inc. , New York , London , 206-215 ;

Socaciu C. , Neamțu G. , Câmpeanu Gh. , 1995 – Biochimie vegetală , Editura Didactică și Pedagogică , București ;

Socaciu C. ,1996 – Mutageneza chimică , Editura Genesis , Cluj –Napoca ;

Suciu Z. , Pleșca T. , Goian M. , 1987 – Cultura legumelor în grădină , seră și solar , Editura Facla , Timișoara ;

Toma C. , Niță M. ,1995 – Celula vegetală , Editura Universității „ Al. I. Cuza " , Iași ;

Tudose I. , Pricop M. , Tudose M. , 1991 – Cytogenetic effects induced by nicotinic acid in Vicia faba L. (2n=12) and Triticum aestivum (2n=42) , An. șt. Univ. ”Al. I. Cuza” , T XXXVII , s a II-a , Biologie vegetală , Iași ;

Banu C. si colaboratorii, 2000 – Aditivi si ingrediente pentru industria alimentara, Editura tehnica, Bucuresti.