INFLUENȚA MICROBIOTEI INTESTINALE ASUPRA UNOR TULPINI CU POTENȚIAL PROBIOTIC [310067]

INFLUENȚA MICROBIOTEI INTESTINALE ASUPRA UNOR TULPINI CU POTENȚIAL PROBIOTIC

INTRODUCERE

Probioticele prezintă un efect direct în intestin în tratamentul afecțiunilor inflamatorii și funcționale ale intestinului. Într-[anonimizat]. Studii de specialitate au demonstrate că tulpinile L. plantarum 299v și DSM 9843 au fost fost utilizate în studiile clinice pentru a [anonimizat], flatulența și constipația. S-a observat, [anonimizat]. boulardii a [anonimizat] a fost eficient în ameliorarea altor simptome ale sindromului (Motta și colab., 1991)

Într-[anonimizat], posibil prin producerea unui mediu acid. În plus, o serie de studii observaționale au corelat sănătatea vaginală cu prezența lactobacililor (McLean and Rosenstein, 2000).

Probioticele folosesc diferite mecanisme prin care interferă cu activitatea bacteriilor patogene. [anonimizat], [anonimizat], [anonimizat] (lipază, amilază) și peroxid de hidrogen care pot împiedica activitatea bacteriilor patogene și aderarea lor la suprafețe. [anonimizat], [anonimizat] / [anonimizat], conducând la eradicarea biofilmului. [anonimizat] ([anonimizat]-ului, precum și concurența pentru suprafață și nutrienți). Aderența lor competitivă la țesuturile umane sau dispozitive medicale (catetere, proteze sau alte dispozitive medicale), previn colonizarea bacteriilor dăunătoare. [anonimizat], acestea vizează biofilme patogene care împiedică formarea biofilmelor de anumite bacterii patogene.

Foarte puține studii abordează însă problemele legate de influența speciilor patogene și a microbiotei normale asupra tulpinilor cu potențial probiotic administrate pe cale orală în terapia antimicrobiană sau alte categorii de afecțiuni intestinale. [anonimizat]. Această etapă de aderența a [anonimizat]. [anonimizat] a constat în evaluarea influenței unor tulpini de enterobacterii izolate din microbiota intestinală normală asupra capacității de colonizare a substratului celular a unor tulpini de bacterii lactice cu potențial probiotic.

Obiective:

1. [anonimizat] a tulpinilor de enterobacterii în vederea obținerii de supernatante care au acumulat molecule secretorii.

2. Evaluarea influenței supernatantelor de culturi de enterobacterii asupra capacității de aderență la substrat celular a bacteriilor lactice cu potențial probiotic.

MATERIALE ȘI METODE

Tulpini bacteriene

Tulpini de enterobacterii izolate din microbiota normală:

Escherichia coli P5

Serratia sp. P7

Enterobacter cloacae 419.

Tulpini de bacterii lactice

Lactobacillus rhamnosus 9MRS (tulpină izolată din materii fecale de nou născut)

Lactobacillus plantarum ZV (tulpină izolată din produs vegetal fermentat)

Lactobacillus brevis G (tulpină izolată din din produs vegetal fermentat)

Tulpinile utilizate în experiment fac parte din Colecția de microorganisme a Departamentului de Microbiologie. Tulpinile au fost pasate pe medii de cultură proaspete în vederea utilizării lor, după cum urmează: tulpinile de enterobacterii au fost pasate pe mediu geloză nutritivă iar tulpinile de lactobacili pe mediu MRS solid (Man Rogosa Sharp)

Metoda de co-cultivare a tulpinilor de enterobacterii

În vederea obținerii de supernatante, tulpinile de enterobacterii au fost cultivate în mediu lichid cu condiții nutritive minimale, reprezentat de bulion ntritiv, realizându-se scheme de co-cultivare în care aceste tulpini au fost grupate în mai multe variante, așa cum este descris în tabelul 1. Pentru realizarea acestei scheme, din culturile proaspete dezvoltate pe mediu solid, s-au realizat suspensii celulare în AFS (apă fiziologică sterilă) cu densitate standard 0.5 McFarland, densitate ajustată nefelometric. Toate co-cultivările au fost realizate în duplicat, în volum final de mediu bulion nutritiv de 2 ml care a fost inoculat cu suspensiile bacteriene obținute după schema prezentată în tabel.

Tabel 1. Schema de co-cultivare a enterobacteriilor în placa cu 24 de godeuri

După realizarea schemei de co-cultivare, placa cu 24 de godeuri a fost incubată, timp de 24 de ore, la 37oC. Ulterior, mediul lichid a fost transferat în tuburi eppendorf și suspus cetrifugării la 6500 rpm, timp de 10 minute (figurile 9, 10). Supernatantele (notat SN1-SN10 în tabelul anterior) obținuet au fost ulerior trecute prin filtre de 0.22 µm pentru îndepărtarea completă a celulelor bacteriene și utilizate în testul de aderență (figura 11).

Fig. 9. Imagine reprezentând tuburile Eppendorf și placa din care s-a transferat cultura bacteriană.

Fig. 10. Imagini reprezentând dispunerea tuburilor în centrifugă și condițiile de centrifugare.

Fig. 11. Filtrarea supernatantelor.

Studiul calitativ și semicantitativ al capacității de aderență a tulpinilor de bacterii lactice (metoda Cravioto modificată)

Substratul celular a fost linia celularǎ de origine tumorală HeLa-2 (carcinom de col uterin), cultivată pe mediu Eagle MEM (EMEM) (Gibco), cu adaus de 10% ser fetal de vițel, glutamină 1%, penicilină-streptomicină 1%, fungizon 1% în placi Multiwell cu 6 godeuri, monostrat de 24 de ore, confluență 80-100%.

5 ml din fiecare cultură de bacteriană de bacterii lactice dezvoltată în mediu MRS lichid, a fost centrifugat la 5000 rpm, timp de 10 minute, iar depozitul de celule a fost reluat în TFS (Tampon Fosfat Salin) astfel încât să se obțină o suspensie celulară cu densitate standard Mc Farland 0,5 utilizată ulterior în testul de aderență calitativă (figura 12);

Fig. 12. Suspensiile McFarland 0,5 de tulpini lactice realizate în TFS.

monostratul celular s-a spalat de 3 ori cu TFS și s-a adaugă 1 ml de suspensie de celule bacteriene și 200 µl supernatant de cultură de enterobacterii, în diferite variante de lucru, așa cum este prezentat ăn tabelele 2, 3, 4, 5, 6;

plăcile au fost incubate la 37șC, timp de 2 ore, timp în care celulele bacteriene au aderat la suprafața celulelor substratului;

monostratul celular infectat cu suspensie bacterianǎ a fost spălat cu TFS (x 3) și fixat cu metanol rece (5 min);

monostratului celular și celulele bacteriene aderate a fost colorat cu soluție Giemsa 10%, timp de 20 min (figura 13);

godeurile au fost spălate cu apă de robinet;

după uscarea completă, godeurile au fost examinate la microscopul optic, cu obiectivul de imersie (x 100), pentru determinarea pattern-ului de aderență (localizat, difuz sau agregativ) și indicelui de aderență (ID%) prin raportarea numărului de celule HeLa la care bacteriile au aderat, la numărul total de celule HeLa din câmpul microscopic. Exprimarea IA s-a realizat procentual.

Tabel. 2. Schema de testare a aderenței în care sunt prezentate volumele de suspensie bacteriană și supernatant utilizate în experiment – placa 1

Tabel 3. Schema de testare a aderenței în care sunt prezentate volumele de suspensie bacteriană și supernatant utilizate în experiment – placa 2

Tabel 4. Schema de testare a aderenței în care sunt prezentate volumele de suspensie bacteriană și supernatant utilizate în experiment – placa 3

Tabel 5. Schema de testare a aderenței în care sunt prezentate volumele de suspensie bacteriană și supernatant utilizate în experiment – placa 4

Tabel 6. Schema de testare a aderenței în care sunt prezentate volumele de suspensie bacteriană și supernatant utilizate în experiment – placa 5

Fig.13. Imagini reprezentând aspectul monostratului celular în timpul și după colorarea cu soluție Giemsa 10%.

REZULTATE ȘI DISCUȚII

Scopul studiului de față a constat în evaluarea influenței unor tulpini de enterobacterii izolate din microbiota intestinală normală asupra capacității de colonizare a substratului celular a unor tulpini de bacterii lactice cu potențial probiotic. În aces sens au fost testate supernatantele provenite din culturi de 24 de ore ale speciilor de eneterobacterii selectate, co-cultivate în diferitele variante prezentate anterior la capitolul de materiale și metode. Aceste co-cultivări au fost monospecie respectiv între două și trei specii diferite, încercându-se astfel mimarea stării de competiție dintre diferitele specii bacteriene componente ale microbiotei intestinale. Această stare de competiție se reflectă în sinteza factorilor solubili care se acumulează în lumenul intestinal și care ar putea condiționa aderența speciilor cu potențial probiotic.

Analiza microscopică a tulpinilor probiotice testate a evidențiat faptul că martorul de aderență pentru tulpina Lactobacillus rhamnosus a prezentat un pattern de aderare agregativ (figura 14), tulpina Lb. plantarum a prezentat aderență difuz (figura 27) iar Lb. brevis a prezentat aderență localizat (figura 40). Competiția cu patogenii pentru substratul celular reprezentat de celulele HeLa a determinat modificarea fenotipului de aderență și a intensității aderenței, exprimată în indice de aderență.

Tulpina Lb. rhamnosus 9MRS prezintă un pattern de aderare localizat-agregativ în competiție cu patogenii formând microcolonii sau agregate prin suprapunerea celulelor ca niște „cărămizi”. Inhibiția competitivă a fost foarte evidentă față de SN4, SN5, SN6, SN7 obținute din co-cultivarea a 2 și 3 specii de enterobacterii diferite și mai puțin evidentă față de SN1, SN2, SN3 obținute din culturi monospecie.

Fig. 14. Tipul de aderență agregativă manifestat Fig. 15. Tipul de aderență localizată manifestat de

de Lb. rhamnosus 9MRS martor Lb. rhamnosus 9MRS în competiție cu SN1

Fig. 16. Tipul de aderență localizată manifestat de Fig. 17. Tipul de aderență localizată manifestat de Lb. rhamnosus 9MRS în competiție cu SN2 Lb. rhamnosus 9MRS în competiție cu SN3

Fig. 18. Tipul de aderență localizat-agregativă Fig. 19. Tipul de aderență localizat-agregativă

manifestat de Lb. rhamnosus 9MRS mamifestat de Lb. rhamnosus 9MRS

în competiție cu SN4 în competiție cu SN5

Fig.20. Tipul de aderență localizat-agregativă Fig. 21. Tipul de aderență localizat-agregativă

manifestat de Lb. rhamnosus 9MRS manifestat de Lb. rhamnosus 9MRS

în competiție cu SN6 în competiție cu SN7

Fig.22. Tipul de aderență localizat ă Fig.23. Tipul de aderență difuză

manifestat de Lb. rhamnosus 9MRS manifestat de Lb. rhamnosus 9MRS

în competiție cu SN8 în competiție cu SN9

Fig. 24. Tipul de aderență localizată

manifestat de Lb. rhamnosus 9MRS

în competiție cu SN10

Pentru a stabili indicele de aderență al tulpinilor de bacterii lactice în prezența supernatantelor de tulpini patogene a fost determinat din 10 câmpuri microscopice, ale fiecărui godeu, numărul total de celule eucariote și numărul total de celule eucariote cu bacterii aderate și realizat un procent de aderență ca media aritmetică a procentelor tutror câmpurilor determinate. Din graficele de mai jos se poate observa, pentru tulpina probiotică Lb. rhamnosus 9MRS aceeași tendință de modificare a capacității de aderență prin creșterea indicelui de aderență în prezenta SN provenite din co-cultivarea a 2 și 3 specii de enterobacterii diferite (SN4, SN5, SN7, SN8, SN9, SN10) și o influență mai slabă manifestată de SN monospecie (SN1, SN2, SN3). Se poate deduce, de asemenea, o creștere semnificativă a IA% în prezeța SN provenite din co-cultivarea 2 specii diferite atunci când inoculul folosit inițial, la co-cultivare a fost de 200 µl/ tulpină. Acest mod de co-cultivare se pare că a stimulat sinteza de molecule de semnalizare prin mecanisme de QSR (quorum sensing and respons) manifestate între cele două specii co-cultivate, molecule care au interferat și cu capcitatea de aderență a tulpinii lactice la substratul celular (figurile 25, 26).

Fig.25. Reprezentarea procentuală a capacității de aderență a Lb. rhamnosus 9MRS

în prezența supernatantelor de tulpini patogene (E. Coli P5, Enterobacter cloacae 419, Serratia P7).

Fig.26.Reprezentarea procentuală a capacității de aderență a Lb. rhamnosus 9MRS și Lb. plantarum ZV în prezența supernatantelor de tulpini patogene (E. Coli P5, Enterobacter cloacae 419, Serratia P7).

Tulpinile Lb. plantarum ZV și-au conservat pattern-ului de aderență localizată în prezența patogenilor pe care i-a inhibat în proporție de 16% până la 2%. (fig………………)

Fig. 27. Tipul de aderență difuză manifestat de Fig. 28. Tipul de aderență difuză manifestat de

Lb. plantarum ZV martor Lb. plantarum ZV în competiție cu SN1

Fig.29. Tipul de aderență difuză manifestat de Fig.30. Tipul de aderență difuză manifestat de

Lb. plantarum ZV în competiție cu SN2 Lb. plantarum ZV în competiție cu SN3

Fig.31. Tipul de aderență difuză manifestat de Fig.32. Tipul de aderență difuză manifestat de

Lb. plantarum ZV în competiție cu SN4 Lb. plantarum ZV în competiție cu SN5

Fig.33. Tipul de aderență difuză manifestat de Fig.34. Tipul de aderență difuză manifestat de

Lb. plantarum ZV în competiție cu SN6 Lb. plantarum ZV în competiție cu SN7

Fig.35. Tipul de aderență difuză manifestat de

Lb. plantarum ZV în competiție cu

SN8

Fig.36. Tipul de aderență difuză Fig. 37. Tipul de aderență difuză manifestat de

manifestat de Lb. plantarum ZV Lb. plantarum ZV în competiție cu

în competiție cu SN9 SN10

În ceea ce privește modificările semicantitative ale capacității de aderență, exprimate prin valoarea IA%, la tulpina probiotică Lb. plantarum ZV izolată din produs vegetal fermentat, se poate observa că, de data aceasta, o parte din SN provenite din culturi monospecie (SN 2, SN3) au stimulat aderența în timp ce celelalte SN au inhibat-o semnificativ (figurile 38, 39). Excepție au făcut SN 8 și SN9 provenite din co-cultivarea 2 specii diferite atunci când inoculul folosit inițial, la co-cultivare a fost de 200 µl/ tulpină, Aceste SN stimulând semnificativ IA% (figura 39).

Fig.38. Reprezentarea procentuală a capacității de aderență a Lb. plantarum ZV în prezența supernatantelor de tulpini patogene (E. Coli P5, Enterobacter cloacae 419, Serratia P7).

Fig.39.Reprezentarea procentuală a capacității de aderență a Lb. rhamnosus 9MRS și Lb. plantarum ZV în prezența supernatantelor de tulpini patogene (E. Coli P5, Enterobacter cloacae 419, Serratia P7).

Tulpina Lb. brevis prezintă un pattern de aderență localizată spre agregativă și un indice de aderenșă de 100% în toate schemele de testare realizate în cadrul experimentului (figurile 40-47), fără modificări semnificative atunci când testarea s-a realizat în prezența diferitelor variante de SN (figurile 48, 49).

Fig.40. Tipul de aderență difuză manifestat de Fig.41. Tipul de aderență difuză manifestat de

Lb. brevis G martor Lb. brevis G în competiție cu SN1

Fig.42. Tipul de aderență difuză manifestat de Fig.43. Tipul de aderență difuză manifestat de

Lb. brevis G în competiție cu SN2 Lb. brevis G în competiție cu SN3

Fig.44. Tipul de aderență difuză manifestat de Fig.45. Tipul de aderență difuză manifestat de

Lb. brevis G în competiție cu SN4 Lb. brevis G în competiție cu SN5

Fig.46. Tipul de aderență difuză manifestat de Fig.47. Tipul de aderență difuză manifestat de

Lb. brevis G în competiție cu SN6 Lb. brevis G în competiție cu SN7

Fig.48.Reprezentarea procentuală a capacității de aderență a Lb. brevis G în prezența supernatantelor de tulpini patogene (E. Coli P5, Enterobacter cloacae 419, Serratia P7).

Aderența este un factor important, determinant al colonizării unor situsuri specifice. Supraviețuirea microorganismelor în diferite habitate este dependentă de capacitatea lor de a adera la diferite suprafețe sau substraturi. Acest proces de aderență implică o interacțiune între molecule complementare de pe suprafața microorganismelor (adezine) și substrat (receptori). Aderența împiedică îndepărtarea microorganismelor prin mecanismele fizice și fiziologice asigurând colonizarea anumitor situsuri. (Coconier și colab., 1993). Rezultate obținute în cadrul experimentului permit aprecierea faptului că tulpinile probiotice ce sunt utilizate în diferite formule farmacologice sunt influențate în mod diferit, de microbiota intestinală, în funcție de specia dominantă din microbiotă, de diversitatea speciilor și de asocierea acestora. Prin urmare, stabilirea proprietăților unui bun probiotic trebuie să țină cont de comportamentul acestuia în tractul intestinal, unde se va afla în competiție cu celulele microbiene viabile din compoziția microbiotei, celule care pot stimula sau pot inhiba colonizarea mucoasei intestinale și prin urmare atingerea potențialului probiotic al tulpinei respective.

Concluzii

Aderența este un factor important, determinant al colonizării unor situsuri specifice.

Analiza microscopică a tulpinilor probiotice testate a evidențiat faptul că martorul de aderență pentru tulpina Lactobacillus rhamnosus a prezentat un pattern de aderare agregativ, tulpina Lb. plantarum a prezentat aderență difuz iar Lb. brevis a prezentat aderență localizat.

Pentru tulpina probiotică Lb. rhamnosus 9MRS s-a putu observa o tendință de modificare a capacității de aderență prin creșterea indicelui de aderență în prezenta SN provenite din co-cultivarea a 2 și 3 specii de enterobacterii diferite și o influență mai slabă manifestată de SN monospecie.

În ceea ce privește modificările semicantitative ale capacității de aderență la tulpina probiotică Lb. plantarum ZV izolată din produs vegetal fermentat, se poate observa că doar SN 8 și SN9 (provenite din co-cultivarea 2 specii diferite atunci când inoculul folosit inițial, la co-cultivare a fost de 200 µl/ tulpină) au stimulat semnificativ IA%, de la 13% la 20%, respectiv 51%.

Tulpina Lb. brevis prezintă un pattern de aderență localizată spre agregativă și un indice de aderenșă de 100% în toate schemele de testare realizate în cadrul experimentului, fără modificări semnificative atunci când testarea s-a realizat în prezența diferitelor variante de SN.

În general, s-a putut observa o creștere semnificativă a IA% în prezeța SN provenite din co-cultivarea 2 specii diferite atunci când inoculul folosit inițial, la co-cultivare a fost de 200 µl/ tulpină. Acest mod de co-cultivare se pare că a stimulat sinteza de molecule de semnalizare prin mecanisme de QSR (quorum sensing and respons) manifestate între cele două specii co-cultivate, molecule care au interferat și cu capcitatea de aderență a tulpinii lactice la substratul celular.

Prin urmare, stabilirea proprietăților unui bun probiotic trebuie să țină cont de comportamentul acestuia în tractul intestinal, unde se va afla în competiție cu celulele microbiene viabile din compoziția microbiotei, celule care pot stimula sau pot inhiba colonizarea mucoasei intestinale și prin urmare atingerea potențialului probiotic al tulpinei respective.