Influența microbiotei intestinale asupra unor tulpini cu potențial probiotic [310066]

UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI

FACULTATEA DE BIOLOGIE

LUCRARE DE LICENȚĂ

Influența microbiotei intestinale asupra unor tulpini cu potențial probiotic

Coordonator științific:

Conf. Dr. [anonimizat]: [anonimizat]

2020 –

CUPRINS:

Introducere…………………………………………………………………………………….2

1 Biofilme microbiene……………………………………………………………………..5

1.1. Noțiuni generale………………………………………………………………5

1.2. Dezvoltatrea biofilmelor microbiene în diferite situsuri din organism………………………………………………………………………………………..9

1.2.1. Placa dentară……………………………………………………..10

2 Microbiota intestinală…………………………………………………………………13

2.1. Considerații generale……………………………………………………..13

2.2. Homeostazia intestinală………………………………………………….19

3 Probiotice- generalități………………………………………………………………24

3.1. Definiții…………………………………………………………………………24

3.2. Rol și funcții ale probioticelor………………………………………..26

Materiale și Metode………………………………………………………………………32

Rezultate și Discuții………………………………………………………………………37

Concluzii………………………………………………………………………………………47

Bibliografie…………………………………………………………………………………..48

Introducere

În cea mai mare parte a [anonimizat], suspendate liber și descrise pe baza caracteristicilor de creștere ale acestora în mediile de cultură bogate în nutriție. [anonimizat], prin care microorganismele se atașează și se multiplică pe suprafețele expuse formând biofilme, a dus la studii care au relevat că la nivelul acestor biofilme celulele bacteriene au prezentat un fenotip distinct în ceea ce privește transcrierea genelor și rata de creștere. S-a demonstrat că aceste microorganisme din biofilm posedă mecanisme specifice de atașare inițială pe o suprafață, [anonimizat] (Donlan, 2002).

Biofilmele au fost descrise în multe sisteme de când Van Leeuwenhoek a examinat “animalculele” [anonimizat], dar teoria generală a predominanței biofilmului nu a fost recunoscută până în 1978. Această teorie afirmă faptul că majoritatea bacteriilor cresc în biofilme protejate de matrice și aderente suprafețelor din toate ecosistemele acvatice cu nutrienți suficienți și că aceste celule bacteriene sesile diferă profund de omologii lor planctonici. [anonimizat] 99,9% din bacterii cresc în biofilme pe o mare varietate de suprafețe (Donlan & Costerton, 2002).

Biofilmele reprezintă 80% din infecțiile cronice microbiene umane, ceea ce duce la creșterea ratelor de spitalizare, creșterea costurilor de îngrijire a sănătății și creșterea ratelor de mortalitate și morbiditate. Boli ale tractului respirator, otită medie cronică, infecții oculare, răni cronice, infecții ale tractului urinar sunt boli asociate biofilmului. Biofilmele se pot dezvolta, de asemenea, pe suprafețe abiotice, inclusiv dispozitive medicale, cum ar fi proteze ortopedice, valve cardiace artificiale, catetere intravasculare și urinare, implanturi neurochirurgicale, cohleare și mamare, proteze dentare și dispozitive ventriculare și ocular (Magana și colab., 2018).

Intestinul uman conține trilioane de celule microbiene care formează o relație simbiotică cu gazda și joacă un rol vital atât în ​​sănătate, cât și în boală. Dezvoltarea microbiotei intestinale perinatale este influențată de mai mulți factori, inclusiv vârsta gestațională, modul de naștere, microbiota maternă, metoda de hrănire a sugarului, genetica și factori de mediu, cum ar fi alegerea alimentului (Bezirtzoglou E., 1997). Homeostazia intestinală depinde de interacțiunile complexe dintre microbiota, epiteliul intestinal și sistemul imunitar al gazdei. Diverse mecanisme de reglementare cooperează pentru menținerea homeostazei intestinale, iar o eroare a acestor căi poate duce la tulburări inflamatorii cronice (Negroni și colab., 2015).

Organizația Națiunilor Unite pentru Alimentație și Agricultură (FAO) și Organizația Mondială a Sănătății (OMS) definesc probioticele drept „microorganisme vii care, administrate în cantități adecvate, conferă un beneficiu sănătății gazdei” .Funcțiile acestor probiotice variază semnificativ în cadrul aceleiași specii, în mare parte și depind de o anumită tulpină specifică (Jäger și colab., 2019).

Probioticele prezintă un efect direct în intestin în tratamentul afecțiunilor inflamatorii și funcționale ale intestinului. Într-una dintre cele mai frecvente afecțiuni ale intestinului funcțional, sindromul de colon iritabil, studii de specialitate au demonstrate că tulpinile Lb. plantarum 299v și DSM 9843 au fost utilizate în studiile clinice pentru a reduce durerea abdominală, balonarea, flatulența și constipația. S-a observat, de asemenea, că Sacc. boulardii a scăzut intensitatea manifestărilor diareice în sindromul de colon iritabil, dar nu a fost eficient în ameliorarea altor simptome ale sindromului (Motta și colab., 1991).

Într-un studiu recent asupra culturilor bacteriene izolate de la femei cu episoade recurente de vaginoză bacteriană, patru tulpini diferite de lactobacili au demonstrat activitate inhibitoare asupra speciilor bacteriene patogene, posibil prin producerea unui mediu acid. În plus, o serie de studii observaționale au corelat sănătatea vaginală cu prezența lactobacililor (McLean și Rosenstein, 2000).

Probioticele folosesc diferite mecanisme prin care interferă cu activitatea bacteriilor patogene. Acestea produc substanțe antagonice precum bacteriocine, EPS (substanțe polimerice extracelulare), acizi organici, acid lactic, acizi grași, enzime (lipază, amilază) și peroxid de hidrogen care pot împiedica activitatea bacteriilor patogene și aderarea lor la suprafețe. Mai mult decât atât, interferă cu mecanismele de comunicare intercelulară de tip QS, prevenind formarea biofilmului și supraviețuirea agenților patogeni, precum și cu integritatea / calitatea biofilmului, în cele din urmă, conducând la eradicarea biofilmului. Mai mult, probioticele generează condiții nefavorabile de mediu pentru agenți patogeni (de exemplu, modificarea pH-ului, precum și concurența pentru suprafață și nutrienți). Aderența lor competitivă la țesuturile umane sau dispozitive medicale (catetere, proteze sau alte dispozitive medicale), previn colonizarea bacteriilor dăunătoare. În plus, prin modularea răspunsurilor imune ale gazdei și formarea de biofilme nepatogene, acestea vizează biofilme patogene care împiedică formarea biofilmelor de anumite bacterii patogene (Barzegari și colab., 2020).

Foarte puține studii abordează însă problemele legate de influența speciilor patogene și a microbiotei normale asupra tulpinilor cu potențial probiotic administrate pe cale orală în terapia antimicrobiană sau alte categorii de afecțiuni intestinale. Un bun probiotic este acea tulpină capabilă să adere la situsurile intestinale și să refacă astfel echilibrul structural și funcționa al microbiotei normale și nu doar să tranziteze temporar lumenul intestinal, fiind eliminat prin materiile fecale. Această etapă de aderența a tulpinii probiotice poate fi influențată dramatic de microbiota rezidentă sau chiar de speciile patogene prezente la un moment dat, în tractul intestinal. De aceea, scopul studiului de față a constat în evaluarea influenței unor tulpini de enterobacterii izolate din microbiota intestinală normală asupra capacității de colonizare a substratului celular a unor tulpini de bacterii lactice cu potențial probiotic.

Obiective:

1. Realizarea unor scheme de co-cultivare a tulpinilor de enterobacterii în vederea obținerii de supernatante care au acumulat molecule secretorii.

2. Evaluarea influenței supernatantelor de culturi de enterobacterii asupra capacității de aderență la substrat celular a bacteriilor lactice cu potențial probiotic.

Capitol 1

Biofilme microbiene

1.1. Noțiuni generale

În secolul al XVII-lea, Antoine Van Leeuwenhoek, folosind microscopele sale simple, a observat pentru prima dată microorganisme pe suprafețele dinților săi, o descoperire considerată a fi un biofilm. Heukelekian și Heller au observat „efectul sticlei” pentru microorganismele marine, adică creșterea și activitatea bacteriilor au fost substanțial îmbunătățite prin încorporarea unei suprafețe pe care aceste organisme s-ar putea atașa. Zobell a observat că numărul de bacterii de pe suprafețe a fost dramatic mai mare decât în ​​mediul marin. Cu toate acestea, o examinare detaliată a biofilmelor a așteptat inventarea microscopiei electronice pentru a examina în detaliu biofilmul cu rezoluție înaltă, în comparație cu microscopia ușoar (Jamal și colab., 2018)

Jones și colab. (1969 ) au folosit microscopia electronică de scanare și transmisie pentru a examina biofilmele pe filtrele “trickling” dintr-o stație de epurare a apelor uzate și au arătat că sunt compuse dintr-o varietate de organisme (pe baza morfologiei celulare). Din 1973, Characklis a studiat nămolurile microbiene în sistemele de apă industrială și a arătat că nu numai că erau foarte tenace, dar și foarte rezistente la dezinfectanți, cum ar fi clorul. Pe baza observațiilor plăcii dentare și a comunităților sesile din fluxurile montane, Costerton și colab., în 1978, a prezentat o teorie a biofilmelor care a explicat mecanismele prin care microorganismele aderă la materiale vii și beneficiile obținute de această nișă ecologică.(Jamal și., 2018)

Definiția de biofilm a evoluat în ultimii 25 de ani. Marshall, în 1976, a remarcat implicarea „fibrelor polimerice extracelulare foarte fine” care au ancorat bacteriile pe suprafețe. Costerton și colab. (1978) au observat că, aceste comunități de bacterii din sistemele acvatice s-au dovedit a fi încorporate într-o matrice polizaharidică denumită generic „glicocalix” ce mediază aderența. Costerton și colab., în 1987, au afirmat că biofilmul este format din celule unice și microcolonii, toate încorporate într-o matrice exopolimerică extrem de hidratată, predominant anionică (Donlan și Costerton, 2002).

Characklis și Marshall în 1990 au continuat să descrie alte aspecte definitorii ale biofilmelor, cum ar fi caracteristicile eterogenității spațiale și temporale și implicarea substanțelor anorganice sau abiotice păstrate împreună în matricea biofilmului. Costerton și colab., în 1995, au subliniat că biofilmele ar putea să adere la suprafețe și interfețe și între ele, inclusiv în agregate microbiene și populații aderente din spațiile suprafețelor poroase. Costerton și Lappin-Scott au declarat, în același timp, că fenomenul de aderență a declanșat expresia genelor care controlează sinteza de componente bacteriene necesare aderării și formării biofilmului, subliniind că procesul de formare a biofilmului este reglat de gene specifice transcrise în timpul atașării celulare inițiale (Donlan și Costerton, 2002)

În 2002, Donlan și Costerton au oferit cea mai importantă descriere a unui biofilm. Ei au declarat că biofilmul este „o comunitate sesilă microbiană, caracterizată prin celule care sunt atașate ireversibil de un substrat sau o interfață sau una de cealaltă, încorporate într-o matrice de substanțe polimerice extracelulare pe care le-au produs și prezintă un fenotip modificat în ceea ce privește creșterea, rata și transcrierea genelor” (Chandki și colab., 2011).

Microorganismele asociate biofilmului diferă, de asemenea, de omologii lor planctonici (microorganisme libere sau planctonice) în ceea ce privește genele care sunt transcrise. Biofilmele se pot forma pe o mare varietate de suprafețe, inclusiv țesuturi vii, dispozitivele medicale, conducte pentru sisteme de apă industrială sau potabilă sau sisteme naturale acvatice (figurile 1 și 2) (Donlan, 2002).

Fig. 1. Scanarea micrografiei electronice a unui biofilm nativ care s-a dezvoltat pe o suprafață ușoară de oțel într-o perioadă de 8 săptămâni într-un sistem de apă industrial (Donlan, 2002).

Biofilmul dezvoltat în conductele de apă este extrem de complex, conținând produși de coroziune, material argilat, diatomee de apă dulce și bacterii filamentoase. Biofilmul dezvoltat pe dispozitivul medical, pe de altă parte, pare să fie compus dintr-o singură specie microbiană și matricea polimerică extracelulară asociată (EPS) (Donlan, 2002).

Fig. 2. Scanarea micrografiei electronice a unui biofilm stafilococic pe suprafața interioară a unui dispozitiv medical. Bară, 20 μm (Donlan, 2002).

Dintre toate microorganismele, speciile bacteriene sunt principalii producători de biofilm, în condiții favorabile, deși unele pot avea o capacitate mai mare decât altele. Majoritatea speciilor demonstrează o rată de creștere ridicată, o mare adaptabilitate și o competență pentru producția de substanțe și structuri extracelulare care protejează celulele microbiene din habitatul lor și, în funcție de caracteristici, fac ca acestea să poată coloniza perfect orice tip de suprafață, chiar și în condiții adverse (Dos Santos Ramos și colab., 2018).

Bacteriile prezintă două stări de supraviețuire, și anume forma planctonică (celule individuale / libere) și agregatele celulare (biofilme). Dezvoltarea bacteriană în forma planctonică este un fenomen important pentru propagarea biofilmelor. Cu toate acestea, supraviețuirea unui biofilm ca mecanism de apărare este legată de susținerea sa, care depinde de ciclul său de viață continuu, dacă biofilmul oferă siguranță împotriva factorilor extrinseci ai mediului (Dos Santos Ramos și colab., 2018).

Există anumite avantaje ale biofilmelor bacteriene, de exemplu, implicarea din punct de vedere ecologic în relațiile simbiotice. Exemplele acestui fenomen sunt abundente în natură, iar cele care prezintă astfel de relații includ bacteriile procariote diazotrofice care colonizează rădăcinile vegetale și alte câteva bacterii găsite în tractul digestiv al rumegătoarelor, unde promovează degradarea și reciclarea materialelor insolubile (Dos Santos Ramos și colab., 2018).

Pe parcursul întregului proces de formare a biofilmului bacterian, sunt implicați factori complecși, care au fost slab înțeleși și au inspirat comunitatea științifică să analizeze întreaga dinamică a arhitecturii microbiene complexe. Contactul bacteriilor cu suprafețe biotice și abiotice este prima etapă a formării biofilmului, care este considerat un proces important și complex.

Având în vedere doar suprafețele abiotice, atracția inițială a celulelor bacteriene planctonice spre suprafață pare să se producă aleatoriu prin mișcarea browniană și forța gravitațională sau într-un mod ghidat prin chimiotaxie și motilitate. Motilitatea este una dintre caracteristicile extrem de importante, deoarece studiile au arătat că bacteriile flagelate sau bacteriile care au o capacitate de locomoție mai mare formează biofilme mai complexe iar facilitatea de a migra în alte locuri crește (Dos Santos Ramos și colab., 2018).

Bacteriile promovează o varietate de strategii de aderență pentru a rămâne în contact cu suprafața de fixare; după aceea, celulele bacteriene promovează eliberarea amestecului EPS, ceea ce le crește afinitatea pentru diferite tipuri de suprafețe, de exemplu, suprafețe poroase, aspre și eterogene chimic. Aderența reversibilă se produce prin interacțiuni fizico-chimice nespecifice între bacterie și material, inclusiv forțele hidrodinamice, interacțiunile electrostatice, forțele van der Waals și interacțiunile hidrofobe.  În plus, bacteriile folosesc unele dintre structurile lor de la suprafața peretelui celular, de exemplu, pili și fimbrii, pentru a îmbunătăți aderența pe suprafețe. De altfel, bacteriile au și mecanisme de depășire a forțelor repulsive dintre membrana celulară și suprafețele abiotice, în special reprezentate de dispozitivele biomedicale. Compoziția unui substrat sau a unei pelicule organice care acoperă aceste dispozitive aflate în contact cu serul/sângele uman este variabilă și depinde de locul formării biofilmului. Cu toate acestea, compoziția sa de bază include proteine, cum ar fi: albumina, imunoglobulina, fibrinogenul și fibronectina. Prin urmare, filmul creat acționează ca un substrat pentru stabilirea inițială a biofilmului (Dos Santos Ramos și colab., 2018).

Pe măsură ce procesul de aderență progresează, acumularea unor astfel de molecule de semnalizare are drept consecință inducerea și transcrierea genelor specifice, care reglementează diferite funcții bacteriene, cum ar fi motilitatea, virulența și producerea matricei care conține EPS și, în consecință, agravează dezvoltarea biofilmului. Generarea matricei EPS facilitează și colonizarea de către alte specii. Se presupune că în cadrul unui biofilm de multispecii, EPS crește stabilitatea celorlalte specii prin medierea interacțiunilor între polimerii diferitelor specii (Dos Santos Ramos și colab., 2018).

După finalizarea etapei de aderență reversibilă, are loc faza de aderență ireversibilă, care se datorează bacteriilor care mai au interacțiuni slabe cu suprafața, dar reușesc să se lipească de substrat datorită producției ridicate de structuri EPS, proces facilitat de mecanismele de semnalizare celulară.  Procesul de comunicare dintre celule, denumit QS, se regăsește la mai multe bacterii patogene și oferă beneficii precum: capacitatea de sporulare, exprimarea genelor de virulență, transferul ADN-ului, formarea biofilmului și chiar producția de antibiotice. Evenimentele moleculare din bacterii sunt controlate parțial de QS prin semnale chimice și un astfel de mecanism de comunicare intracelulară depinde de densitatea populației dintr-un biofilm.

În biofilmele bacteriene, QS este un fenomen comun care favorizează accesul la nutrienți permițând astfel bacteriilor să inducă răspunsuri de apărare împotriva gazdelor eucariote, optimizând în același timp capacitatea lor de a se diferenția în cele mai potrivite forme pentru susținerea și supraviețuirea lor în medii dure (Dos Santos Ramos și colab., 2018).

Infecțiile bacteriene cronice sunt în principal legate de ciclul de formare a biofilmului. Unele dintre speciile bacteriene majore, care sunt capabile să declanșeze o infecție, sunt Pseudomonas aeruginosa, principalul agent cauzal al pneumoniei și fibrozei chistice, Escherichia coli, specia cauzală a infecțiilor tractului urinar și Mycobacterium tuberculosis , care determină tuberculoza umană (Dos Santos Ramos și colab, 2018).

Biofilmele sunt comunități multidimensionale în care bacteriile rezidente coexistă în cadrul matricei extracelulare auto-derivate (ECM). Deși etapele de dezvoltare care conduc la formarea biofilmului par să fie conservate (figura 3), fiecare specie (sau consorțiu de specii în cazul biofilmelor polimicrobiene) formează o comunitate multicelulară unică. Această rețea protejată are o capacitate crescută de a rezista condițiilor de stres din mediu (Magana și colab., 2018).

Fig. 3. Etapele dezvoltării în formarea biofilmului. Una sau mai multe specii bacteriene planctonice aderă la o suprafață biotică / abiotică. Bacteriile atașate cresc ca o comunitate multicelulară formând microcoloniile care se înmulțesc și se maturizează. Această infrastructură microbiană are ca rezultat dezvoltarea unui biofilm matur. În cele din urmă, biofilmele servesc ca rezervoare bacteriene care sunt transmise înapoi în mediu prin dispersia biofilmului și apoi colonizează suprafețe noi. (Magana și colab., 2018).

1.2. Dezvoltatrea biofilmelor microbiene în diferite situsuri din organism

Cele mai multe microorganisme supraviețuiesc în comunități multispecifice, formând structuri complexe asemănătoare unui țesut, cunoscute sub numele de biofilme (Hall-Stoodley L., Stoodley P.,2002). Atunci când microorganismele formează un biofilm, ele sunt capabile să se adapteze la schimbările de mediu, modificându-și modelele de expresie genică. Structura biofilmului și modificarea corespunzătoare a expresiei genice pot proteja celulele microbiene de agenți dezinfectanți sau antibiotice (Hall-Stoodley L., Stoodley P.,2002).

Dezvoltarea biofilmului este un proces dinamic. Fiecare microorganism are propria sa metodă unică de aderare la suprafețe, incluzând atașarea prin flageli, pili, proteine și adezine polizaharidice (Hall-Stoodley L., Stoodley P.,2002).

Microorganismele pot agrega și forma biofilme atât pe suprafețele biotice cât și pe cele abiotice, ceea ce face dificilă identificarea și izolarea unei ținte terapeutice. Atașarea inițială a celulelor bacteriene este etapa critică pentru formarea biofilmului. Odată ce atașarea începe, în funcție de condițiile de mediu, bacteriile au două opțiuni: pot progresa la formarea biofilmului prin aderarea la suprafață sau pot reveni la faza planctonică. Pentru acele organisme care intră într-un biofilm, dezvoltarea încetează odată cu debutul unei faze de dispersie, stadiul în care celulele virulente alunecă din biofilm și cauzează adesea infecții în gazdă (Kostakioti M., Hadjifrangiskou M., Hultgren S.J., 2013).

1.2.1. Placa dentară

Placa dentară este deosebit de complexă deoarece constă în mii de specii bacteriene, iar speciile noi sunt încă izolate și caracterizate, fiind una dintre cele mai studiate comunități de biofilm (Arul & Palanivelu, 2014). Placa dentară a fost definită drept „o entitate structurală specifică, dar extrem de variabilă, formată din microorganisme și produsele lor încorporate într-o matrice intercelulară extrem de organizată.” Reprezintă un adevărat biofilm format dintr-o varietate de microorganisme implicate într-o gamă largă de interacțiuni fizice, metabolice și moleculare. Natura cooperativă a unei comunități microbiene oferă avantaje organismelor participante, cum ar fi o gamă mai largă de habitat pentru creștere, rezistență sporită la agenții antimicrobieni, apărarea gazdelor și o patogenitate sporită (Chandki și colab., 2011).

Placa dentară mai poate fi definită ca o comunitate diversă de microorganisme găsite pe suprafața dintelui ca un biofilm, încorporată într-o matrice extracelulară de polimeri de origine microbiană (Marsh, 2004). În procesul de formare, saliva furnizează bacteriilor sursa principală de nutrienți. Pelicula subțire care acoperă dinții numită peliculă dobândită este derivată din proteinele salivare și acoperă smalțul în câteva secunde după periaj. Proteinele și glicoproteinele sunt moleculele care se leagă de suprafața dintelui, implanturilor. Aceste molecule acționează în primul rând pentru a promova aderența și co-agregarea bacteriilor orale Aderența bacteriană la peliculă este facilitată de moleculele speciale de suprafață (adezine) în principal lectine prezente la suprafața celulei bacteriene. Aderarea și secreția bacteriană intercelulară suplimentară a polizaharidelor extracelulare, de exemplu: levani, dextrani, formează colonii bacteriene multistrat suspendate în matricea polimerică. Sarcina microbiană din salivă constituie aproximativ 10 bacterii pe mililitru (Gibbons și Van Houte, 1973).

Celulele bacteriene colonizează suprafața dintelui în 4 ore de la formarea peliculei, colonizatorii inițiali fiind Streptococii (S. viridens, S. mitis, S. oralis). Bacteriile planctonice care nu se pot lega direct de suprafața dintelui co-agregă împreună cu bacteriilor colonizatoare inițiale și, în final, se atașează indirect de suprafața dintelui. Această reacție bacterie-celulă este un mecanism important care duce la colonizarea bacteriană și formarea biofilmului dentar Colonizatorii secundari cuprind în principal speciile: Actinomyces, S. mutans, S. sobrinus. Bacteriile se înmulțesc și agregă cu speciile partenere. Fusobacterium nucleatum are proprietatea de a co-agrega cu mai multe bacterii, prin urmare, această specie este o verigă importantă în biofilmele dentare care leagă colonizatorii timpurii și târzii (Kolenbrander, Anderson, Blehart, 2002).

Comunicarea specializată între celule este transmisă ca semnale. Bacteriile sesizează schimbările din mediul local. Comunicarea specifică între specii în cadrul biofilmelor este mediată prin schimbul metabolic, schimbul genetic și sesizarea quorumului (QS) (Hojo, Nagaoka, Oshima, 2009). Senzorul de quorum (QS) reprezintă comunicarea chimică guvernată genetic între bacterii ca răspuns la densitatea celulară și influențează mai multe funcții ale bacteriilor, de exemplu, virulența, toleranța la acid și formarea biofilmului. Bacteriile gram-pozitive comunică prin canalul pepitid difuzibil mic numit „Peptide de stimulare a competenței (CST) și AI-2”. AI-2 (autoinducer-2) este o moleculă de semnalizare expusă atât de bacteriile gram-pozitive, cât și de cele gram-negative, responsabile de sesizarea quorumului (QS) (Kolenbrander, Anderson, Blehart, 2002).

Biofilmul acționează ca o barieră de apărare pentru bacterii împotriva imunității gazdei și a agenților antimicrobieni. Microbiota anaerobă reușește să ocupe treptat mediul subgingival pe măsură ce placa începe să se maturizeze. Placa supragingivală stabilește etapa pentru procesul de boală a gingivitei și coloniile microbiene subgingivale avansează gingivita la o formă stabilită de parodontită (Bassler, Wright, Silverman, 1994)

Fig. 4. Formarea plăcii de biofilm pe suprafețele dinților și rădăcinilor (după Plaque, 2014).

Noile tehnologii au oferit idei noi despre modul în care placa dentară funcționează ca biofilm. Microscopia confocală a confirmat faptul că placa are o arhitectură deschisă similară cu alte biofilme, cu canale și goluri. Gradienții se dezvoltă în zone cu biomasă densă pe distanțe scurte, în parametrii cheie care influențează creșterea și distribuția microbiană ( Marsh, 2004).

Bacteriile din placa dentară nu există ca entități independente, ci funcționează ca o comunitate microbiană coordonată, organizată spațial și complet integrată metabolic, ale cărei proprietăți sunt mai mari decât suma speciilor componente. O mai bună înțelegere a semnificației placii dentare ca biofilm de cultură mixtă va conduce la noi strategii de control ( Marsh, 2004).

Capitol 2

Microbiota intestinală

2.1. Considerații generale

Termenul „microbiota intestinală” a fost introdus pentru prima dată în comunitatea științifică de către Joshua Lederberg, care l-a numit „comunitatea ecologică a microorganismelor comensale, simbiotice și patogene, care împărtășesc literalmente spațiul corpului uman și au fost ignorate în totalitate ca factori determinanți ai stării de boală”. Corpul uman găzduiește trilioane de microorganisme, mai ales la nivelul tractului gastrointestinal. Folosind ca referință un om de 70 kg, se apreciază că 3,8 × 10 13 celule microbiene au o greutate totală de 0,2 kg (Hayek, 2013)

Conceptul de microbiota umană și rolul său în sănătatea umană au suferit schimbări semnificative în ochii comunității științifice, a medicilor și a oamenilor obișnuiți. Atitudinea anterioară față de microorganisme care erau considerate ceva străin de oameni sau chiar periculoase, s-a transformat în înțelegerea faptului că bacteriile sunt normale și chiar necesare pentru funcționarea corectă a organism uman, populând întregul corp cu o prevalență mare de microbi în intestin, tegument, cavitate bucală și sistem urogenital. Intestinul este organul uman cel mai populat de bacterii, numărul acestora depășind cu cel puțin două ordine de mărime numărul total de celule ale corpului uman ( Zoetendal, Vaughan, de Vos,2006).

Această înțelegere a permis treptat să schimbe întregul concept al microbiotei autohtone ca parte vitală a organismului și rolul său în menținerea sănătății umane. În prezent, cu apariția de noi tehnologii de secvențiere și efortul comun al programelor de analiză de microbiota americană și europeană, compoziția și principalele phylumuri bacteriene dominante, reprezentând microbiota umană au fost identificate în contrast cu studiile anterioare bazate pe bacteriologia clasică (Tannock,1995).

Conținutul bacterian al microbiotei intestinale este format în principal din Firmicutes, Bacteriodetes, Actinobacterii, Proteobacterii, Fusobacterii și Archaea cu predominanță de Firmicutes și Bacteriodetes. Microbiota intestinală indigenă tinde să formeze un biofilm complex multispecie care acoperă întregul strat de mucus cu doar puține specii bacteriene care ajung la epiteliul intestinal (Van den Abbeele și colab., 2010).

Intestinul uman conține celule microbiene care formează o relație simbiotică cu gazda și joacă un rol vital atât în starea de ​​sănătate, cât și de boală. În timp ce compoziția microbiotei specifice variază între indivizi sănătoși, repertoriul funcțional al microbiomului este conservat. Acest microbiom joacă roluri importante în homeostazia mamiferelor, inclusiv furnizarea de nutrienți esențiali, metabolizarea fibrelor alimentare în acizi grași cu lanț scurt și asigurarea dezvoltării corespunzătoare a sistemului imunitar. Prin urmare, microbiota intestinală este considerată un factor crucial pentru dezvoltarea adecvată a vieții timpurii și pentru sănătatea pe tot parcursul vieții (Ihekweazu & Versalovic, 2018).

Dezvoltarea microbiotei intestinale perinatale este influențată de mai mulți factori, inclusiv vârsta gestațională, modul de naștere, microbiota maternă, metoda de hrănire a sugarului, genetica și factori de mediu, cum ar fi alegerea alimentului. Diversitatea microbiană crește dramatic în primele luni de pruncie (Figura 5). La naștere, microbiota este aerobă, cu număr redus și diversitate redusă, cu bacterii cele mai frecvente anaerobe facultative și membri ai Enterobacteriaceae. În câteva zile, mediul intestinal devine anaerob, ceea ce duce la creșterea bacteriilor precum Bifidobacterium, care este genul bacteriilor dominante în intestinul sugar în primele luni de viață. Odată cu introducerea alimentelor solide, un microbiom mai asemănător adulților începe să se dezvolte începând cu luna a șasea de viață, dominat de Firmicutes și Bacteriodetes (Bezirtzoglou E., 1997).

Fig.5. Dezvoltarea microbiomului intestinal în perioada fragedă (Bezirtzoglou E., 1997).

Dezvoltarea microbiomului infantil depinde de diverși factori, cum ar fi metoda de hrănire a sugarului, dieta și mediul. De asemenea, modul de naștere (fie transvaginal, fie prin cezariană) afectează microbiomul din viața timpurie. De asemenea, s-a demonstrat transferul bacteriilor de la mamă la făt, ceea ce indică faptul că sarcina poate fi importantă pentru colonizarea intestinului fetal / sugar (Bezirtzoglou, 1997).

Factorii care promovează o microbiotă sănătoasă la nou-născuți includ: nașterea vaginală, nașterea la termen, alăptarea și expunerea la o varietate de microorganisme. În schimb, o cezariană, administrarea prematură, laptele cu formulă și expunerea la antibiotice au un impact negativ asupra diversității și compoziției microbiotei la sugari (Collado Yurrita, 2014).

Bebelușii prematuri prezintă o colonizare întârziată a microbiotei intestinale cu Bifidobacterium și au o prevalență ridicată de Enterobacteriaceae, Staphylococcus și Enterococcaceae. Nou-născuții pe cale naturală au o prevalență crescută a microbiotei materne derivate din vagin și intestin (de exemplu: Lactobacillus, Prevotella și Sneathia) în comparație cu nou-născuții eliberați prin cezariană. Copiii născuți prin cezariană au o prevalență relativ ridicată a bacteriilor cutanate, cum ar fi Staphylococcus, Propionibacterium și Corynebacterium, comparativ cu cei care sunt născuți vaginal (Collado Yurrita,2014).

Tratamentul mamei cu antibiotice duce la reducerea utilizării laptelui uman și spitalizarea prelungită și determină în mod normal o prevalență crescută de Proteobacterii, Firmicutes, Enterobacteriaceae( E. coli și Klebsiella spp.), Staphylococcus, Propionibacterium și Corynebacterium. Laptele cu formulă de hrănire este asociat cu creșterea diversității bacteriene, prevalența crescută a Bacteroides fragilis, Clostridium difficile și E. coli și o scădere a prevalenței bifidobacteriilor (Collado Yurrita, 2014).

Sarcina alterează microbiota intestinului matern. La oameni, modificările dramatice ale microbiotei intestinale în timpul sarcinii au fost descrise de la primul la al treilea trimestru, cu o creștere generală a abundenței relative de proteobacterii și actinobacterii și cu o abundență scăzută de Firmicutes și Bacteroidetes (Koren și colab., 2012).

Modificările fiziologice care apar în sarcină produc modificări semnificative ale metabolismului matern necesare pentru susținerea unei sarcini sănătoase. Mecanismele care duc la modificarea microbiotei în timpul sarcinii nu sunt în mare măsură necunoscute, dar se pare că modificările microbiomului în timpul sarcinii sunt importante, de asemenea, pentru a sprijini modificările stării imune materne și / sau modificările hormonale (Koren și colab., 2012). În același timp, modificările microbiotei materne în timpul sarcinii sunt importante și pentru sănătatea fetală, deoarece s-a demonstrat că microbiota maternă poate fi transferată la făt. Transferul microbiotei de la mamă la făt poate fi observat în meconiu, care nu este steril. Microbiota meconiului are o diversitate scăzută reprezentată de Firmicutes ( Staphylococcus, Enterococcus și Bacillus), Proteobacteria și Actinobacteria și un număr mic de celule bacteriene. De asemenea, placenta umană nu este sterilă. Microbiomul placentar este unic și este format din bacterii comensale aparținând filumurilor Firmicutes, Proteobacteria, Bacteroidetes, Tenericutes și Fusobacteria și are o oarecare asemănare cu microbiomul oral (Moles și colab., 2013).

Dezvoltarea microbiomului neonatal depinde de diverși factori. Se știe de mult timp că modul de naștere, modul de hrănire și expunerea la antibiotice, toate afectează dezvoltarea microbiomului neonatal. Întrucât și tratamentul cu pre- sau probiotice poate afecta microbiomul neonatal, astfel de tratamente pot fi opțiuni eficiente pentru a optimiza dezvoltarea microbiomului neonatal (Moles și colab., 2013).

O altă influență majoră asupra microbiomului intestinului infantil este dieta sugarilor. Bebelușii alăptați au o microbiota îmbogățit în Lactobacillus, Staphylococcus și Bifidobacterium, în comparație cu sugarii alimentați cu lapte praf cu microbiomi dominați de Roseburia, Clostridium și Anaerostipes. Bebelușii hrăniți cu formula de lapte au cantități mai mari de specii asociate cu inflamația, cu o maturizare mai rapidă a microbiomului lor spre cea a compoziției de tip adult (Backhed, Roswall, Peng și colab., 2015).

În timpul primului an de viață al sugarului, microbiomul neonatal relativ simplu se maturizează și se dezvoltă într-un microbiom mai complex, cu o compoziție mai reprezentativă a unui tract gastrointestinal adult îmbogățit în Bacteroides și Firmicutes. În timpul primului an de viață, microbiomul sugarului capătă, de asemenea, o funcționalitate similară cu metagenomul intestinal al mamei lor, cu o variație interindividuală în timp (Backhed, Roswall, Peng și colab., 2015).

Un număr crescut de gene bacteriene relevante pentru metabolismul polizaharidelor vegetale condiționează dezvoltarea microbiomului infantil pentru adaptarea la o dieta adultă chiar înainte de introducerea alimentelor solide. Odată introduse alimentele solide, există o schimbare susținută a compoziției microbiene cu o creștere a Bacteroidetes. Modificările suplimentare includ acizii grași cu lanț scurt în scaun și expresia genelor relevante pentru metabolismul carbohidraților, biosinteza vitaminelor și degradarea xenobiotică (Koenig și colab., 2011).

În perioada de dezvoltare timpurie a sugarului, multe expuneri pot influența evoluția microbiotei intestinale. De exemplu, tratamentul cu antibiotice în această perioadă de dezvoltare timpurie a vieții poate modifica dramatic structura microbiotei intestinale. În mod similar, expunerea la medii mai puțin curate, inclusiv contactul cu animalele de companie și cu ceilalți frați, au efecte semnificative asupra microbiomului în dezvoltare. De fapt, numărul fraților mai în vârstă se corelează pozitiv cu diversitatea și bogăția bacteriană la vârsta de 18 luni, cu creșterea abundenței relative de Firmicutes și Bacteroidetes la sugarii cu mai mulți frați (Martin și colab., 2016).

În schimb, microbiomul afectează, de asemenea, starea generală de sănătate a sugarului sau a copilului. Un studiu longitudinal comparativ al gemenilor Malawi discordanți pentru kwashiorkor a constatat că geamenul malnutrit afișa semnături anormale de microbiom în comparație cu geamenul sănătos. Ca dovadă a conceptului că microbiomul a fost un factor cauzator în dezvoltarea fenotipului kwashiorkor, comunitățile fecale înghețate din perechile gemene discordante au fost transplantate la șoareci gnotobiotici. Șoarecii care au primit microbiomul kwashiorkor au prezentat o pierdere semnificativă în greutate, cu perturbări în aminoacizi, carbohidrați și metabolism intermediar (Smith și colab., 2013).

În timp ce unii anchetatori au sugerat că microbiomul pediatric ajunge într-o configurație relativ stabilă, asemănătoare adulților, în primii 3 ani de viață. Într-un studiu care a comparat microbiota intestinală a copiilor de 1–4 ani cu adulții, microbiomul adult a avut o diversitate semnificativ mai mare (abundență și bogăție) decât copiii mici. La nivel de phylum, grupele bacteriene predominante au fost similare, inclusiv Firmicutes, Bacteroidetes și Actinobacteria. Cu toate acestea, la nivelul genului, mai multe grupări filogenetice au fost semnificativ diferite între populația de copii și adulți (Backhed și colab., 2015).

Un studiu care a comparat microbiota fecală a adolescenților (11-18 ani) cu adulții sănătoși a constatat că numărul de specii detectate a fost similar între grupuri, dar abundențele relative de genuri au diferențiat adolescenții de adulți, sugerând că microbiomul diferă, chiar și în adolescență (Agans și colab., 2011).

Hollister și colab. (2015) au comparat copiii de 7-12 ani cu adulții și au descoperit că similar cu adulții, microbiomul intestinal pediatric a fost în mare parte compus din reprezentanți ai filumurilor Bacteroidetes și Firmicutes (figura 6). Cu toate acestea, abundențele relative ale acestor bacterii diferă de cele de la adulți, cu abundențe relativ mai mici de Bacteroidetes și abundențe mai mari de Firmicutes și actinobacterii . De asemenea, aceștia au descoperit că, deși mulți taxoni au fost împărțiți între probele pediatrice și de la adulți, distribuția a fost semnificativ diferită, copiii având abundențe mai mari de bacterii aparținând genurilor Faecalibacterium, Dialister, Roseburia, Ruminococcus și Bifidobacterium (Hollister și colab.,2015).

Fig. 6.Profilele microbiotei gastrointestinale sănătoase la copii și adulți diferă în abundența relativă a taxonilor bacterieni intestinali. (a) Abundențe relative la nivel de filumuri prin secvențiere de gene 16S rRNA. Abundențe relative la nivel de gen prin (b) secvențiere 16S și (c) secvențiere metagenomică (Hollister și colab., 2015).

Hollister și colab. (2015) au caracterizat, de asemenea, profilele metagenomice ale microbiomului la copii și adulți. Copiii au demonstrat o îmbogățire a genelor care pot susține dezvoltarea continuă, inclusiv gene implicate în sinteza vitaminelor, sinteza de folat de novo și metabolismul aminoacizilor. Între timp, la adulți predomină gene implicate în fosforilarea oxidativă, biosinteza lipopolizaharidelor, ansamblul flagelar și biosinteza hormonului steroid, fenomene implicate și în procesele inflamatorii (Hollister și colab., 2015).

2.2. Homeostazia intestinală

Un obiectiv major al comunității de cercetare biomedicală este de a înțelege mecanismele care reglează sistemul imunitar intestinal într-o manieră care menține homeostazia, în ciuda prezenței a trilioane de bacterii și a altor microorganisme care locuiesc și în interiorul gazdei. Homeostazia intestinală este definită de un echilibru adecvat al răspunsurilor pro-inflamatorii împotriva speciilor dăunătoare și / sau invadatoare, în același timp tolerând speciile neinvazive și benefice (Runtsch și colab., 2014).  În timpul acestei stări, proporții sănătoase de specii bacteriene comensale, celule imune tolerante și celule gazdă pro-inflamatorii interacționează strâns unele cu altele. Cu toate acestea, dacă acest echilibru este perturbat, fie prin modificări ale compoziției microbiotei intestinale, fie prin modificări ale răspunsului gazdă, poate apărea starea de boală (Runtsch și colab., 2014).

Pentru menținerea homeostazei, mucoasa intestinală gazdă conține regiuni distincte constând din diferite tipuri de celule necesare pentru a răspunde la contactul cu diferite antigene într-o manieră adecvată  (Runtsch și colab., 2014).  Aceste regiuni includ:

straturile de mucus extern și interior, în care microbii invadatori devin prinși pentru a preveni răspândirea infecției;

stratul epitelial, în care se formează bariere fizice și chimice pentru a preveni diseminarea bacteriilor în țesuturile subiacente;

lamina propria (LP), o regiune bogată în leucocite care se află sub epiteliu, celule care răspund la semnale microbiene;

și alte țesuturi limfoide asociate cu intestin imunitar (GALT), cum ar fi Patches și ganglionii mezenterici.

Țesuturile intestinale bogate în celule conțin o serie diversă de tipuri de celule, atât hematopoietice, cât și non-hematopoietice, care joacă un rol în menținerea interacțiunilor sănătoase cu microbiota rezidentă. Unele dintre aceste tipuri de celule sunt unice pentru intestine și multe au funcții distincte în tractul gastrointestinal (GI). Multe dintre aceste celule intestinale s-au dovedit a fi necesare pentru a asigura atât apărarea împotriva agenților patogeni, cât și toleranța la comensale pentru a preveni boala (Runtsch și colab., 2014).

Un tract intestinal sănătos se caracterizează prin homeostază controlată datorită interacțiunii echilibrate între bacteriile comensale și sistemul imunitar al mucoasei gazdă. Studiile modelelor umane și animale au susținut ipoteza că descompunerea acestei homeostaze poate sta la baza patogenezei bolilor inflamatorii ale intestinului (IBD). Cu toate acestea, nu se înțelege bine modul în care microbiota intestinală stimulează sistemul imunitar al mucoasei intestinale și cum este reglementată o astfel de activare (Biswas și colab.,2011).

Traiectul intestinal al mamiferului adăpostește un număr mare de tulpinile bacteriene comensale care pot fi benefice sau patogene, în funcție de mediu și de adaptabilitatea fiecărei tulpini. De exemplu, Lactobacillus spp. și Bifidobacterium spp. sunt în general benefice pentru gazdă, în timp ce altele precum Clostridium difficile pot fi patogene în anumite medii clinice. Bacteroides spp. poate fi benefic sau patogen, în funcție de mediul intestinal (Shiba T și colab., 2003). Homeostazia intestinală depinde de interacțiunile complexe dintre microbiota, epiteliul intestinal și sistemul imunitar al gazdei. Diverse mecanisme de reglementare cooperează pentru menținerea homeostazei intestinale, iar o eroare a acestor căi poate duce la tulburări inflamatorii cronice (Negroni și colab., 2015).

Existența microbiotei autohtone poate fi benefică pentru imunitatea mucoasei gazdă. Microbiota intestinală are proprietăți de protecție, care pot duce la eliminarea bacteriilor patogene prin mai multe mecanisme. Acestea includ concurența directă pentru spațiu și nutrienți împotriva organismelor enteropatogene, stimularea secreției de peptide antimicrobiene și inducerea secreției de imunoglobulina A. Mai mult decât atât, răspunsul imun bazal rezultat din interacțiunile frecvente dintre mucoasa intestinală și microbiota ajută la reglarea și protejarea gazdei atât de bacteriile patogene, cât și de cele ne patogene (Shroff și colab., 1995).

Epiteliul intestinal reprezintă o suprafață uriașă, care este căptușit de un monostrat de celule epiteliale intestinale (IEC), care servesc ca o barieră pentru microorganismele din spațiul luminal, permițând totodată absorbția apei și a substanțelor nutritive esențiale pentru viață. Pentru îndeplinirea unor funcții atât de diverse, epiteliul intestinal cuprinde mai multe tipuri de celule specializate, împărțite în două grupe principale: celulele absorbante, reprezentate de enterocite, și celulele secretorii, inclusiv celulele Paneth, celulele Goblet și celulele enteroendocrine. Aceste subseturi de IEC sunt diferite din punct de vedere funcțional și esențiale pentru menținerea homeostazei intestinale, prin separarea lumenului intestinal de lamina proprie subiacentă și prin controlul intersecției dintre microbiota și celulele imune subiacente (Negroni și colab., 2015)

Menținerea funcției de barieră și a compoziției comensale în intestinul sănătos este, de asemenea, asigurată printr-o activare bazală a receptorilor de recunoaștere a modelului (PRR), ca receptor Toll-like (TLR), domeniu al oligomerizării nucleotide- (NOD-) precum receptor (NLR) și familii de receptori asemănătoare genei inductibile (RIG-) cu acid retinoic (RLR), capabile să detecteze și să controleze diferite structuri microbiene. PRR-urile pot activa semnalizări specifice de transducție inflamatorie care sunt strâns interconectate cu diferite căi ale morții celulare, stabilind o relație între mecanismele de apărare ale gazdei și moartea celulară (Negroni și colab., 2015).

Microbiota intestinală în sine influențează puternic dezvoltarea și funcția adecvată a sistemului imunitar intestinal.  Șoarecii germ-free prezintă defecte de dezvoltare a sistemului GALT și a celulelor epiteliale intestinale (IEC). Un mecanism prin care microbiota poate influența celulele imune intestinale este prin intermediul receptorilor de suprafață și citoplasmatici numiți receptori de recunoaștere a modelului (PRR) care recunosc motivele microbiene conservate atât pe agenți patogeni cât și pe comensali. Detectarea PRR a produselor microbiene inițiază o varietate de răspunsuri imune și căi de dezvoltare. În timp ce PRR-urile sunt doar un mecanism care influențează homeostazia, multe dintre evenimentele moleculare care mediază intersecția dintre celulele gazdă și microbiota rămân enigmatice (Runtsch și colab., 2014).

Deși TLR-urile pot juca un rol semnificativ în apărarea împotriva bacteriilor patogene invadatoare, activarea necorespunzătoare a căilor de semnalizare poate duce la inflamații excesive și leziuni tisulare. Prin urmare, este rezonabil să existe mai multe mecanisme care să prevină sau să suprime activarea TLR. Mecanismele propuse includ limitarea exprimării TLR-urilor în anumite tipuri de celule sau suprafețe celulare, blocarea implicării TLR cu factori solubili sau receptori sau atenuarea semnalizării TLR cu molecule de semnalizare inhibitoare. IRAK-M este o astfel de moleculă de reglare negativă în semnalizarea TLR și este exprimată în mod preferențial în monocite / macrofage. IRAK-M aparține familiei de proteine ​​IRAK și inhibă semnalizarea mediată de kinazele IRAK1 și IRAK4 active care sunt necesare pentru semnalizarea receptorului TLR și IL-1 (Biswas și colab., 2011).

Homeostazia epitelială intestinală este menținută de un echilibru strict între proliferarea celulelor în criptele intestinale și moartea celulelor din vârful vilozității. În intestinul gros și subțire, enterocitele diferențiate sunt îndepărtate constant și înlocuite cu celule noi (celule stem intestinale adulte nediferențiate, situate în a treia sau a patra poziție, socotite de la baza criptei). Aceste celule noi migrează de la baza criptei în zona apicală a intestinului în curs de maturizare. Stratul epitelial prezintă un echilibru strict între proliferarea celulelor și moartea celulelor pentru a menține bariera intestinală (Negroni și colab., 2015).

Unul dintre cele mai studiate organe pentru homeostază tisulară este intestinul vertebrat adult. Epiteliul intestinal al adultului îndeplinește principalele funcții ale intestinului. De-a lungul vieții adulte, epiteliul se autoînnoiește constant. La mamifere, timpul de autoreînnoire al epiteliului este de aproximativ 1-6 zile, în timp ce în metamorfozarea anuranului Xenopus laevis , epiteliul este înlocuit o dată la 2 săptămâni la adult. Această autoînnoire epitelială are loc prin proliferarea celulelor stem prezente aproape de baza pliurilor epiteliale în anurani sau în criptele intestinale ale mamiferelor (figura 7). Pe măsură ce celulele fiice migrează de-a lungul pliului epitelial sau axa vilozitate / criptă, acestea se diferențiază în diferite tipuri de celule epiteliale și, în cele din urmă, mor prin apoptoză în partea de sus a pliului sau vârfului vilozităților (figura 7), prin finalizarea ciclului de auto-reînnoire și menținerea homeostazei tisulare (Bao și colab., 2020).

Fig. 7. Schematizarea structruii criptelor de la nivelul vilozităților intestinale ale unui mamifer adult și un model al reglării apoptozei și proliferarea celulelor la nivelul criptelor (Bao ți colab., 2020).

Proliferarea celulară în criptă duce la migrarea celulelor spre vârful vilozităților unde are loc apoptoza celulară la intensitate mare. Celula care migrează va exercita o presiune „de apăsare” asupra celulei adiacente de deasupra, de exemplu, celula mijlocie din zona mărită (lângă vârful vilozității). Acest lucru poate provoca schimbări în interacțiunea celulă-celulă și / sau celulă-EMC pentru a facilita moartea celulelor. În schimb, moartea celulară va spori migrația ascendentă a celulelor din criptă pentru a înlocui celulele epiteliale diferențiate sau aflate în apoptoză de la nivelul vilozității. Acest lucru creează o tensiune / forță de „tragere” către celula adiacentă de mai jos, de exemplu, celula mijlocie din zona mărită de lângă criptă, ducând astfel la modificări în interacțiunea celulă-celulă și / sau celulă-EMC pentru a facilita proliferarea celulelor (Bao și colab., 2020).

Pentru homeostazia tisulară, proliferarea celulară și moartea trebuie să fie echilibrate. Astfel, orice modificare a uneia trebuie să fie combătută prin modificările corespunzătoare în cealaltă. Deși se presupune că acesta este în general cazul, puține studii au analizat atât proliferarea celulelor, cât și moartea celulelor din epiteliul intestinal în condiții fiziopatologice modificate (Bao și colab.,2020).

Pentru menținerea homeostazei tisulare în condiții fiziopatologice modificate, este esențial să existe modificări compensatorii prompte în proliferarea celulară și moartea celulelor. Aceasta necesită o comunicare între celulele care mor și proliferează, adesea situate departe unul de celălalt, de exemplu, celulele care mor în principal în vârful vilozităților intestinale, în timp ce celulele proliferează în cripte (Bao și colab.,2020). Receptorii multipli de recunoaștere a modelului permit celulelor epiteliale intestinale (IEC) să simtă microorganismele și să transmită semnalele către efectorii imunității mucoaselor. Între timp, stratul gros de mucus și structura profundă a criptelor intestinale invaginate tamponează semnalele microbiene pentru a preveni expunerea excesivă a antigenului și ulterior supraactivarea sistemului imunitar (Chen și colab.,2018).

Capacitatea IEC-urilor de auto-reînnoire rapidă protejează gazda de expunerea continuă la stimulii microbieni. Pe de altă parte, celulele imune rezidente interacționează strâns cu IEC-urile pentru a sprijini funcția de barieră și pentru a regla microbiota luminală.  Dovezile acumulare arată că celulele limfoide înnăscute (ILC) sunt capabile să producă IL-22 și amfiregulina (AREG) și să exercite efecte benefice asupra IEC.  Disfuncția IEC-urilor are efecte dăunătoare asupra gazdei, rezultând o translocare bacteriană crescută și riscul de a dezvolta boli inflamatorii, inclusiv boala inflamatorie a intestinului (IBD). S-a raportat că indivizii cu expresie modificată a genei IEC sunt mai susceptibili la IBD. Mai mult, s-a demonstrat că pacienții cu IBD au permeabilitate intestinală crescută, o mare parte din acestea a fost atribuită funcției de barieră IEC compromisă. Cu toate acestea, celulele și factorii care reglementează funcția IEC nu sunt încă bine înțeleși (Chen și colab., 2018).

Dovezi emergente au demonstrat că AREG joacă un rol important în reglarea homeostazei intestinale. Ca membru al familiei factorilor de creștere epidermică, AREG este esențial în reglarea diferențierii și proliferarii celulare. S-a raportat că șoarecii cu deficit de AREG (AREG – / – )dezvoltă spontan tumori gastrice. În contextul leziunilor intestinale după administrarea dextranului sulfat de sodiu (DSS), șoarecii AREG – / – dezvoltă o colită mai severă în comparație cu șoarecii de tip sălbatic B6 (WT), ceea ce sugerează un rol crucial pentru AREG în vindecarea rănilor și repararea țesuturilor. În plus, se consideră că AREG joacă un rol în rezistența și toleranța imunitară de tip 2 (Chen și colab., 2018).

Capitol 3

Probiotice- generalități

3.1. Definiții

Termenul de probiotice este derivat dintr-un cuvânt grecesc care înseamnă „pentru viață” și este folosit pentru a defini organismele vii nepatogene și efectele lor benefice derivate asupra gazdelor. Termenul „probiotice” a fost introdus pentru prima dată de Vergin, când studiază efectele dăunătoare ale antibioticelor și ale altor substanțe microbiene, asupra populației microbiene intestinale (Pandey și colab., 2015).

El a observat că „probiotika” era favorabilă microbiotei intestinale. Probioticele au fost apoi redefinite de Lilly și Stillwell drept „Un produs microbian care stimulează creșterea unui alt microorganism”. Ulterior, termenul a fost definit în continuare ca „Microorganisme nepatogene care, atunci când sunt ingerate, exercită o influență pozitivă asupra sănătății sau fiziologiei gazdei” de către Fuller (Pandey și colab., 2015).

Organizația Națiunilor Unite pentru Alimentație și Agricultură (FAO) și Organizația Mondială a Sănătății (OMS) definesc probioticele drept „microorganisme vii care, administrate în cantități adecvate, conferă un beneficiu sănătății gazdei”. În plus, Comitetul Olimpic Internațional (COI) a afirmat că „Probioticele sunt microorganisme vii care, administrate oral timp de câteva săptămâni, pot crește numărul de bacterii benefice din intestin. Acestea au fost asociate cu o serie de beneficii potențiale pentru sănătatea intestinului, precum și modularea funcției imunitare ”. În comparație cu alte suplimente alimentare, preparatele probiotice conțin microorganisme vii, viabile, definite în număr suficient pentru a oferi efecte benefice asupra sănătății (Jäger și colab., 2019).

Unele dintre microorganismele probiotice utilizate popular sunt Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus reuteri, bifidobacterii și anumite tulpini de Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus , Bacillus coagulans, Escherichia coli tulpina Nissle 1917, anumiți enterococi, în special Enterococcus faecium SF68 și drojdie Saccharomyces boulardii. Formatorii de spori bacterieni, în mare parte din genul Bacillus domină scena. Aceste probiotice sunt adăugate la alimente, în special produse lactate fermentate, fie singure, fie în combinații (Pandey și colab., 2015)

FAO și OMS au prezentat în comun orientări pentru a stabili o abordare sistematică pentru o evaluare eficientă a probioticelor din alimente pentru a fundamenta pretențiile și beneficiile asupra sănătății. Unele dintre precondițiile unui organism probiotic ideal sunt prezentate în figura 8. Orientările FAO / OMS privind probioticele ar putea fi utilizate ca standard global pentru evaluarea probioticelor din alimente, care ar putea duce la fundamentarea afirmațiilor privind sănătatea. Orientările fac necesară realizarea următoarelor activități (Pandey și colab., 2015):

Identificarea tulpinii.

Caracterizarea funcțională a tulpinii pentru atributele de siguranță și probiotice.

Validarea beneficiilor pentru sănătate în studiile umane.

Onest, nu înșelător etichetarea revendicărilor de eficacitate și conținut pentru întreaga durată de valabilitate.

Fig.8 Caracteristicile unei tulpini probiotice ideale (Pandey și colab., 2015).

Prebioticele sunt în mare parte fibre care sunt ingrediente alimentare nedigerabile și afectează în mod benefic sănătatea gazdei prin stimularea selectivă a creșterii și / sau activității unor genuri de microorganisme din colon, în general lactobacili și bifidobacterii. Un prebiotic ideal ar trebui să fie (Pandey și colab., 2015):

Rezistent la acțiunile acizilor din stomac, sărurilor biliare și a altor enzime hidrolizante din intestin.

Nu trebuie absorbit în tractul gastrointestinal superior.

Să fie ușor fermentabil de microbiota intestinală benefică .

FAO / OMS definește prebioticele ca o componentă alimentară non-viabilă care conferă beneficii sănătății gazdei asociate cu modularea microbiotei. Prebioticele formează un grup de ingrediente variate de carbohidrați, care sunt slab înțelese cu referire la originea lor, profilele de fermentație și dozele necesare pentru efectele asupra sănătății (Pandey și colab., 2015)

Unele dintre sursele de prebiotice includ: laptele matern, soia, sursele de inulină (cum ar fi anghinarea din Ierusalim, rădăcinile de cicoare etc.), ovăz crud, grâu nerafinat, orz nerafinat, yacon, carbohidrați nedigerabili și, în special, oligozaharide nedigerabile. Cu toate acestea, printre prebiotice, numai oligozaharide bifidogene, nedigerabile în special inulina, produsul său de hidroliză oligofructoză și (trans) galacto-oligozaharide (GOS), îndeplinesc toate criteriile pentru clasificarea prebiotică (Pokusaeva și colab., 2011 ).

Prebioticele precum inulina și pectina prezintă mai multe beneficii pentru sănătate, cum ar fi: reducerea prevalenței și duratei diareei, ameliorarea inflamațiilor și a altor simptome asociate cu tulburările intestinale și efectele de protecție pentru prevenirea cancerului de colon. Ele sunt, de asemenea, implicate în îmbunătățirea biodisponibilității și absorbției de minerale, scăderea unor factori de risc ai bolilor cardiovasculare și promovarea sațietății și a pierderii în greutate, prevenind astfel obezitatea (Pokusaeva și colab., 2011).

3.2. Rol și funcții ale probioticelor

Natura eterogenă a microbiotei intestinale este oglindită în mecanismele variate de acțiune ale diferitelor specii microbiene. Efectele biologice ale probioticelor pot fi împărțite în mai multe categorii largi:

Rezistență la patogeni : Se crede că probioticele mențin sau restabilesc homeostazia microbiană gazdă și reduc în mod corespunzător invazia și colonizarea patogenă. Dacă microbii endogeni sunt capabili să ocupe toate nișele funcționale, există o probabilitate redusă de invazie și colonizare patogenă în acel ecosistem. Probioticele pot ocupa fie nișe funcționale care sunt lăsate deschise de comunitatea endogenă (prevenirea infecției oportuniste), fie pot modifica direct mediul local prin secreția de SCFA(acizi grași cu lanț scurt), acid lactic, bacteriocine și specii reactive de oxigen pentru a inhiba creșterea organismelor patogene (Day și colab., 2019).

Funcționalitatea nutrițională : Anumite specii din microbiota intestinală contribuie la disponibilitatea de vitamine și la producerea de SCFA. Vitamina K, vitamina B12, piridoxina, biotina, folatul, acidul nicotinic și tiamina pot fi produse de microorganisme intestinale. Mai mult, butiratul este o sursă majoră de energie pentru enterocite și este implicat în menținerea mucoasei enterice (Day și colab., 2019).

Funcționalitatea imunitară : S-a demonstrat că probioticele au efecte diverse asupra sistemului imunitar. Unele specii probiotice pot fi clasificate ca imunostimulatoare (adică pro-inflamatorii) și se caracterizează prin capacitatea lor de a induce IL-12 (interleukină 12) și imunitatea celulelor killer natural (NK). Alte specii sunt clasificate drept imunoregulatoare (adică antiinflamatoare) datorită capacității lor de a induce IL-10 și căile de reglare a celulelor T. Efectul general asupra sistemului imunitar este total dependent de speciile probiotice specifice sau tulpina, unele funcționând ca pro-inflamatorii și altele ca agenți antiinflamatori (Day și colab., 2019).

Eliminarea contaminanților : Anumite probiotice pot reduce riscul de a ingera compuși periculoși. De exemplu, Pedicococcus pentosaecus descompune fumonisinele, un grup de micotoxine produse din ciuperci, care se găsesc pe o mare varietate de culturi (Day și colab., 2019)

Metabolizarea xenobioticelor și a medicamentelor : Cercetări recente au arătat că metabolitul microbial intestinal p -cresol poate reduce capacitatea ficatului de a metaboliza paracetamolul datorită inhibării competitive a sulfotransferazelor hepatice. Rolul microbiotei intestinale în metabolismul medicamentos și xenobiotic ar putea avea un impact profund asupra opțiunilor de terapie pentru diferite afecțiuni în viitor. Mai mult, există dovezi din ce în ce mai mari care arăta că poluanții chimici dietetici și de mediu pot interfera cu funcția bacteriană intestinală (transcriere, metabolism etc.) și, în consecință, pot afecta sănătatea gazdei prin inducerea unui răspuns pro-inflamator în intestin (Day și colab., 2019)

Metabolizarea acidului biliar : S-a arătat că anumite specii ale microbiotei intestinale – cum ar fi Bacteroides intestinalis – deconjugă și deshidratează acizii biliari primari pentru a-i converti în acizi biliari secundari. Acizii biliari secundari pot inhiba germinarea sporului Clostridium difficile și, prin urmare, pot suprima creșterea vegetativă a C. difficile (Day și colab., 2019)

Funcțiile acestor probiotice variază semnificativ în cadrul aceleiași specii, în mare parte și depind de o anumită tulpină specifică. Astfel, în evaluarea funcțiilor probioticelor, este esențial să caracterizăm funcțiile fiecărui probiotic la tulpina specifică. Până în prezent, funcțiile și efectele acestor probiotice în prevenirea sau ameliorarea bolilor sau în imunoterapia combinativă rămân practic controversate și necesită o validare continuă (Tsai și colab., 2019).

Efectul aportului probiotic asupra funcției imunitare a făcut obiectul mai multor studii umane recente. Există dovezi puternice care sugerează că tulpinile specifice de bacterii cu acid lactic, atunci când sunt consumate în anumite proporții, sunt capabile să moduleze aspecte ale răspunsurilor imune naturale și dobândite (Gill &Guarner, 2004).

Capacitatea tulpinilor specifice de probiotice de a spori aspectele imunității naturale la subiecții umani este bine documentată. Schiffrin și colab. au raportat capacitatea fagocitară crescută a leucocitelor din sângele periferic (polimorfonucleare și monocite)  la adulți umani sănătoși administrați cu lapte fermentat suplimentat cu tulpini specifice de probiotice ( Lactobacillus johnsonii  La1 sau Bifidobacterium lactis Bb12) timp de trei săptămâni (Gill & Guarner, 2004)

Îmbunătățirile în activitatea fagocitară au fost susținute timp de câteva săptămâni după întreruperea consumului de probiotice,  granulocitele au prezentat creșteri mai mari în funcția celulelor fagocitare comparativ cu monocitele.  Au fost de asemenea raportate creșteri semnificative ale expresiei receptorilor implicați în fagocitoză (CR1, CR3, FcγRI și FcαR), în neutrofile,  indice fagocitic,  și oxidare  sau capacitatea microbicidă la subiecții care primesc probiotice (Gill & Guarner, 2004).

S-a observat, de asemenea, că diferite tulpini de bacterii cu acid lactic diferă prin capacitatea lor de a influența expresia receptorului complement în celulele fagocitice. De exemplu, He și colab. au descoperit că Lactobacillus lactis a fost mai eficient la reglarea receptorilor complementului pe leucocitele din sânge decât Lb. rhamnosus .  Mai mult, efectul imunostimulator al aportului probiotic a fost dependent de doză și s-a constatat că o doză minimă de 10 9 cfu / zi a fost necesară pentru a realiza îmbunătățiri ale funcției imunitare (Gill & Guarner, 2004)

Îmbătrânirea este asociată cu scăderea imunocompetenței. S-a sugerat că suplimentarea cu probiotic ar putea fi utilizată pentru a corecta declinul legat de vârstă al funcției celulelor fagocitice la vârstnici. S-a descoperit că subiecții care primesc lapte care conține Lb. rhamnosus (HN001) sau lactită B (HN019) timp de trei până la șase săptămâni prezintă leucocite din sânge (fagocitice și monocite; fig. 1) semnificativ mai mult fagocitic, decât subiecții care primesc lapte fără probiotice (Gill & Guarner, 2004).

În mod special, subiecții cu funcție de celule fagocitice preintervenționale relativ slabe au arătat constant creșteri relative mai mari ale activității fagocitice decât subiecții cu funcție imunitară preintervențională adecvată.  Mai mult, s-a constatat că această creșterea a activității fagocitice a fost corelată cu vârsta, subiecții mai mari de 70 de ani prezentând îmbunătățiri semnificativ mai mari ale activității fagocitice decât cei sub 70 de ani (Gill & Guarner, 2004).

Unele dintre rolurile importante și cruciale pentru probiotice în menținerea sănătății umane, tratamentul bolilor și managementul sunt următoarele (Chandarakesan și colab., 2018):

Menținerea stării bune a tractului genitourinar.

Verificarea nivelului de colesterol seric.

Controlul hipertensiunii arteriale.

În vindecarea bolilor diareice. Saccharomyces cerevisiae var boulardii este foarte eficient în tratarea diferitelor afecțiuni diareice.

Probioticele sunt completate pentru a reduce efectul negativ al antibioticului și pentru a restabili orice tip de pierdere în microflora benefică.

Inhibarea fermentației de tip putrefactiv, care este una dintre postulările Metchnikoff privind beneficiile probioticelor.

Probioticele susțin funcțiile defensive ale mucoasei intestinale, inclusiv producerea și secreția de peptide antibacteriene.

Digestie îmbunătățită a lactozei împotriva alimentelor care posedă lactoză.

Scăderea apariției alergiei la persoanele sensibile.

Susținerea biodisponibilității și sintezei nutrienților și îmbunătățirea sistemului imunitar.

Probioticele sunt foarte eficiente în tratarea afecțiunilor diareice.

Îmbunătățirea sănătății tractului intestinal.

Puține rapoarte au dat o notă nouă aplicării bacteriilor probiotice, schimbând accentul de la sănătatea intestinului la sănătatea vaginală. Aplicarea probioticelor predominant în perspectiva managementului infecțiilor vaginale generale este, de asemenea, una dintre noile domenii de cercetare interesate. Declinul sau absența lactobacililor în vagin ar putea fi una dintre cauzele cheie ale vaginozei bacteriene, iar cazurile afectate prezintă un risc semnificativ crescut de gonoree, herpes simplex, clamidie și infecții virale cu virusul imunodeficienței umane (Chandarakesan și colab., 2018).

Utilizarea lactobacililor probiotici este una dintre abordările de succes și eficiente pentru a preveni infecția vaginală. Introducerea lactobacililor în vagin prin capsulă este o modalitate de succes de a îmbunătăți conținutul microbiotei și de a evita unii agenți patogeni sau de a reduce capacitatea lor de a coloniza. Această metodă pare a fi o soluție reală pentru tratamentul infecțiilor tractului urinar și vaginozei bacteriene. S-a dovedit științific că o combinație de tulpini de lactobacili diminuează atât agenții patogeni bacterieni, cât și drojdia din vagin, chiar și atunci când sunt luate pe cale orală. De asemenea, asigură o rată de vindecare mai mare atunci când este tratat cu metronidazol, în ciuda unui singur antibiotic (Chandarakesan și colab., 2018).

O doză orală regulată de 108 lactobacili probiotici viabili poate restabili și păstra sănătatea urogenitală. Se raportează că probioticele joacă un rol crucial în prevenirea diareei și controlul după tratament cu antibiotice. Saccharomyces boulardii, Bifidobacterium spp., Lactobacillus reuteri și Lactobacillus GG sunt în general folosite pentru tratamentul diareei.  Probioticele sunt foarte eficiente în inhibarea bolilor diareice cauzate de rotavirusuri la sugari (Chandarakesan și colab., 2018).

Probioticele inhibă speciile patogene care provoacă diaree prin producerea de bacteriocine sau prin concurența cu bacteriile sau virusurile patogene și împiedicându-le să se lege de celulele epiteliale.  Doar puține rapoarte dovedesc că bacteriile probiotice pot suprima colonizarea gastrică și funcțiile Helicobacter pylori , care este responsabil pentru ulcerul peptic, cancerul gastric și gastrita. De asemenea, s-a dovedit că Lactobacillus salivarius are capacitatea de a produce cantități mari de acid lactic și de a suprima creșterea H. pylori in vitro și la șoareci (Chandarakesan și colab., 2018).

Aiba și colab.  au arătat Lactobacillus salivarius capabil să producă cantități mari de acid lactic, ceea ce poate inhiba dezvoltarea H. pylori in vitro . S-a constatat că, cu cât a fost mai mare nivelul producției de acid lactic de Lactobacillus , cu atât mai puternic a fost efectul asupra reducerii activității ureazelor sintetizate de H. pylori (Aiba și colab., 1998))

Studiile au arătat o îmbunătățire a simptomelor IBD și colitei ulcerative cu consumul anumitor tulpini de lactobacili. Bacteriile cu acid lactic pot îmbunătăți mobilitatea intestinală și pot calma constipația, eventual, printr-o reducere a pH-ului intestinal. S-a raportat, de asemenea, că terapiile cu probiotice combinate pot beneficia de pacienții cu. Saccharomyces boulardii, la pacienții cu boala Crohn s-a dovedit că prelungește timpul de remisie și reduce ratele de recidivă.  S-a raportat că Lb. boulardii și Lactobacillus GG cresc nivelul IgA secretor în intestin (Gorbach și colab., 1987).

Speciile Lactobacillus produc diferiți exometaboliți precum EPS, bacteriocine, specii reactive la oxigen (ROS) și biosurfactanți cu activitate anti-biofilm. Polizaharidele produse de LAB au efecte anti-biofilm, de stimulare a sistemului imunitar și antioxidante. EPS-ul Lactobacillus spp. a fost eficientă atât în ​​bacteriile Gram-pozitive (de exemplu, Listeria monocytogenes și S. aureus) cât și în cele Gram-negative (de exemplu, P. aeruginosa și Salmonella typhymurium ). Rezultatele au arătat că, capacitatea de eliminare a biofilmului este legată de concentrația EPS (Barzegari și colab., 2020).

Activitatea anti-biofilm a bacteriocinelor a fost demonstrată în diferite rapoarte. Bacteriocina produsă de Lb. brevis DF01 previne formarea biofilmului, dar nu eradichează biofilmele Escherichia coli și S. typhimurium. Mecanismele efectelor inhibitoare ale bacteriocinei asupra biofilmelor nu sunt bine înțelese. O parte din bacteriocine eradichează biofilmul prin inducerea formării de pori pe suprafața celulei bacteriene, ceea ce duce la efluxul ATP, în timp ce altele au activitate biologică mediată de către enzimele proteolitice. Subtilosina A, o bacteriocină ciclică (proteină lantibiotică) sintetizată de Bacillus subtilis, este un alt derivat al probioticelor. Are o sarcină cationică netă care vizează în general receptorii de suprafață, mai degrabă decât legarea electrostatică a celulelor bacteriene. Pe lângă activitatea antimicrobiană a subtilozinei împotriva Gardnerella vaginalis și Listeria monocytogenes, efectul său anti-biofilm a fost raportat împotriva lui G. vaginalis singur și cu agenți antimicrobieni naturali. Având în vedere activitățile extinse ale subtilozinei, Chikindas și colab. au observat efectul anti-QS fașă de E. coli O157: H7, L. monocytogenes Scott A și G. vaginalis ATCC 14018. Subtilosina a condus la inhibarea a 60% din E coli, 80% din L. monocytogenes și 90% din biofilmele G. Vaginalis. De asemenea, sonorensina, o bacteriocină produsă de Bacillus sonorensis MT93, a fost capabilă să scadă viabilitatea celulelor S. aureus din biofilm, să inhibe atașarea și formarea biofilmului și să provoace subțierea biofilmelor mature (Barzegari și colab., 2020).

Datorită formării de exometaboliți, speciile Lactobacillus inhibă, de asemenea, biofilmul de Candida albicans prin inhibarea stadiului inițial de colonizare și formare de hifă. Lactobacilii care produc biosurfactant aveau proprietăți antimicrobiene, anti-adezive și capacitate de agregare împotriva formării biofilmului patogen. L. rhamnosus producătoare de biosurfactanți ar putea perturba structura membranei fizice sau conformațiile proteice; rezultând liza celulară. Mai mult, biosurfactanții scad semnificativ aderența și generarea de biofilm de bacterii într-o manieră dependentă de doză (Barzegari și colab., 2020).

Răspunsurile imune ale gazdei împotriva biofilmelor sunt mediate de diverși receptori celulari, expresia chemokină și citokină, care pot fi diferite în funcție de stadiul biofilmului. Probioticele și factorii lor solubili secretați se pare că sunt recunoscuți de receptorii similari (TLRs) de pe celulele epiteliale; și apoi își exercită efectele imunomodulatoare asupra imunităților intestinale și sistemice. Mai mult decât atât, probioticele pot modifica funcționalitatea răspusului imun înnăscut în diferite moduri, dintre care unele includ secreția metaboliților imunomodulatori, lipidelor și proteinelor, expresia receptorului, inducerea micro-ARN-urilor și producerea de molecule de semnalizare negativă reglatoare. Prin urmare, prin modularea răspunsurilor imune, probioticele pot afecta biofilmele indirect (Barzegari și colab., 2020). Tulpinile Streptococcus thermophilus (ST1342, ST1275 și ST285) pot activa celulele monocite pentru a secreta IL-1β, TNFα, IL-6 și IFN-γ care activează răspunsurile imune înnăscute pentru a elimina agenții patogeni. Tulpina ST1342 ar putea induce niveluri ridicate de secreție de IL-1β care are atât activități anti-virale, cât și anti-bacteriene. De asemenea, sa menționat că probioticul L. paracasei DG utilizat în general în produsele probiotice comerciale, posedă activități de stimulare a imunității prin îmbunătățirea expresiei TNFa, IL-6 și CCL20 în linia celulară a leucemiei monocitelor umane (Barzegari și colab., 2020).

Lactobacillus sp. ar putea induce producția de IFN-γ și inhiba producția de IL-10 și ar putea avea efect imunomodulator asupra S. mutans în celulele de cultură umană. Cunoașterea detaliată a mecanismelor imunitare, a citokinei și a profilurilor de exprimare a receptorilor și a mecanismelor de apărare a bacteriilor sub formarea biofilmului este necesară pentru a demonstra efectele probioticelor asupra sistemului imunitar pentru a lupta împotriva biofilmului microbian (Barzegari și colab., 2020).

Materiale și Metode

Tulpini bacteriene

Tulpini de enterobacterii izolate din microbiota normală:

Escherichia coli P5;

Serratia sp. P7;

Enterobacter cloacae 419.

Tulpini de bacterii lactice:

Lactobacillus rhamnosus 9MRS (tulpină izolată din materii fecale de nou născut);

Lactobacillus plantarum ZV (tulpină izolată din produs vegetal fermentat);

Lactobacillus brevis G (tulpină izolată din din produs vegetal fermentat).

Tulpinile utilizate în experiment fac parte din Colecția de microorganisme a Departamentului de Microbiologie. Tulpinile au fost pasate pe medii de cultură proaspete în vederea utilizării lor, după cum urmează: tulpinile de enterobacterii au fost pasate pe mediu geloză nutritivă iar tulpinile de lactobacili pe mediu MRS solid (Man Rogosa Sharp).

Metoda de co-cultivare a tulpinilor de enterobacterii

În vederea obținerii de supernatante, tulpinile de enterobacterii au fost cultivate în mediu lichid cu condiții nutritive minimale, reprezentat de bulion ntritiv, realizându-se scheme de co-cultivare în care aceste tulpini au fost grupate în mai multe variante, așa cum este descris în tabelul 1. Pentru realizarea acestei scheme, din culturile proaspete dezvoltate pe mediu solid, s-au realizat suspensii celulare în AFS (apă fiziologică sterilă) cu densitate standard 0.5 McFarland, densitate ajustată nefelometric. Toate co-cultivările au fost realizate în duplicat, în volum final de mediu bulion nutritiv de 2 ml care a fost inoculat cu suspensiile bacteriene obținute după schema prezentată în tabel.

Tabel 1. Schema de co-cultivare a enterobacteriilor în placa cu 24 de godeuri

După realizarea schemei de co-cultivare, placa cu 24 de godeuri a fost incubată, timp de 24 de ore, la 37oC. Ulterior, mediul lichid a fost transferat în tuburi eppendorf și suspus cetrifugării la 6500 rpm, timp de 10 minute (figurile 9, 10). Supernatantele (notat SN1-SN10 în tabelul anterior) obținute au fost ulterior trecute prin filtre de 0.22 µm pentru îndepărtarea completă a celulelor bacteriene și utilizate în testul de aderență (figura 11).

Fig. 9. Imagine reprezentând tuburile Eppendorf și placa din care s-a transferat cultura bacteriană.

Fig. 10. Imagini reprezentând dispunerea tuburilor în centrifugă și condițiile de centrifugare.

Fig. 11. Filtrarea supernatantelor.

Studiul calitativ și semicantitativ al capacității de aderență a tulpinilor de bacterii lactice (metoda Cravioto modificată)

Substratul celular a fost linia celularǎ de origine tumorală HeLa-2 (carcinom de col uterin), cultivată pe mediu Eagle MEM (EMEM) (Gibco), cu adaus de 10% ser fetal de vițel, glutamină 1%, penicilină-streptomicină 1%, fungizon 1% în placi Multiwell cu 6 godeuri, monostrat de 24 de ore, confluență 80-100%.

5 ml din fiecare cultură de bacteriană de bacterii lactice dezvoltată în mediu MRS lichid, a fost centrifugat la 5000 rpm, timp de 10 minute, iar depozitul de celule a fost reluat în TFS (Tampon Fosfat Salin) astfel încât să se obțină o suspensie celulară cu densitate standard Mc Farland 0,5 utilizată ulterior în testul de aderență calitativă (figura 12);

Fig. 12. Suspensiile McFarland 0,5 de tulpini lactice realizate în TFS.

monostratul celular s-a spalat de 3 ori cu TFS și s-a adaugă 1 ml de suspensie de celule bacteriene și 200 µl supernatant de cultură de enterobacterii, în diferite variante de lucru, așa cum este prezentat în tabelele 2, 3, 4, 5, 6;

plăcile au fost incubate la 37șC, timp de 2 ore, timp în care celulele bacteriene au aderat la suprafața celulelor substratului;

monostratul celular infectat cu suspensie bacterianǎ a fost spălat cu TFS (x 3) și fixat cu metanol rece (5 min);

monostratului celular și celulele bacteriene aderate a fost colorat cu soluție Giemsa 10%, timp de 20 min (figura 13);

godeurile au fost spălate cu apă de robinet;

după uscarea completă, godeurile au fost examinate la microscopul optic, cu obiectivul de imersie (x 100), pentru determinarea pattern-ului de aderență (localizat, difuz sau agregativ) și indicelui de aderență (IA%) prin raportarea numărului de celule HeLa la care bacteriile au aderat, la numărul total de celule HeLa din câmpul microscopic. Exprimarea IA s-a realizat procentual.

Tabel. 2. Schema de testare a aderenței în care sunt prezentate volumele de suspensie bacteriană și supernatant utilizate în experiment – placa 1

Tabel 3. Schema de testare a aderenței în care sunt prezentate volumele de suspensie bacteriană și supernatant utilizate în experiment – placa 2

Tabel 4. Schema de testare a aderenței în care sunt prezentate volumele de suspensie bacteriană și supernatant utilizate în experiment – placa 3

Tabel 5. Schema de testare a aderenței în care sunt prezentate volumele de suspensie bacteriană și supernatant utilizate în experiment – placa 4

Tabel 6. Schema de testare a aderenței în care sunt prezentate volumele de suspensie bacteriană și supernatant utilizate în experiment – placa 5

Fig.13. Imagini reprezentând aspectul monostratului celular în timpul și după colorarea cu soluție Giemsa 10%.

Rezultate și Discuții

Scopul studiului de față a constat în evaluarea influenței unor tulpini de enterobacterii izolate din microbiota intestinală normală asupra capacității de colonizare a substratului celular a unor tulpini de bacterii lactice cu potențial probiotic. În acest sens au fost testate supernatantele provenite din culturi de 24 de ore ale speciilor de eneterobacterii selectate, co-cultivate în diferitele variante prezentate anterior la capitolul de materiale și metode. Aceste co-cultivări au fost monospecie respectiv între două și trei specii diferite, încercându-se astfel mimarea stării de competiție dintre diferitele specii bacteriene componente ale microbiotei intestinale. Această stare de competiție se reflectă în sinteza factorilor solubili care se acumulează în lumenul intestinal și care ar putea condiționa aderența speciilor cu potențial probiotic.

Analiza microscopică a tulpinilor probiotice testate a evidențiat faptul că martorul de aderență pentru tulpina Lactobacillus rhamnosus a prezentat un pattern de aderare agregativ (figura 14), tulpina Lb. plantarum a prezentat aderență difuz (figura 27) iar Lb. brevis a prezentat aderență localizat (figura 40). Competiția cu patogenii pentru substratul celular reprezentat de celulele HeLa a determinat modificarea fenotipului de aderență și a intensității aderenței, exprimată în indice de aderență.

Tulpina Lb. rhamnosus 9MRS prezintă un pattern de aderare localizat-agregativ în competiție cu patogenii formând microcolonii sau agregate prin suprapunerea celulelor ca niște „cărămizi”. Inhibiția competitivă a fost foarte evidentă față de SN4, SN5, SN6, SN7 obținute din co-cultivarea a 2 și 3 specii de enterobacterii diferite și mai puțin evidentă față de SN1, SN2, SN3 obținute din culturi monospecie.

Fig. 14. Tipul de aderență agregativă manifestat Fig. 15. Tipul de aderență localizată manifestat de

de Lb. rhamnosus 9MRS martor Lb. rhamnosus 9MRS în competiție cu SN1

Fig. 16. Tipul de aderență localizată manifestat de Fig. 17. Tipul de aderență localizată manifestat de Lb. rhamnosus 9MRS în competiție cu SN2 Lb. rhamnosus 9MRS în competiție cu SN3

Fig. 18. Tipul de aderență localizat-agregativă Fig. 19. Tipul de aderență localizat-agregativă

manifestat de Lb. rhamnosus 9MRS mamifestat de Lb. rhamnosus 9MRS

în competiție cu SN4 în competiție cu SN5

Fig.20. Tipul de aderență localizat-agregativă Fig. 21. Tipul de aderență localizat-agregativă

manifestat de Lb. rhamnosus 9MRS manifestat de Lb. rhamnosus 9MRS

în competiție cu SN6 în competiție cu SN7

Fig.22. Tipul de aderență localizat ă Fig.23. Tipul de aderență difuză

manifestat de Lb. rhamnosus 9MRS manifestat de Lb. rhamnosus 9MRS

în competiție cu SN8 în competiție cu SN9

Fig. 24. Tipul de aderență localizată

manifestat de Lb. rhamnosus 9MRS

în competiție cu SN10

Pentru a stabili indicele de aderență al tulpinilor de bacterii lactice în prezența supernatantelor de tulpini patogene a fost determinat din 10 câmpuri microscopice, ale fiecărui godeu, numărul total de celule eucariote și numărul total de celule eucariote cu bacterii aderate și s-a realizat un procent de aderență ca media aritmetică a procentelor tuturor câmpurilor determinate. Din graficele de mai jos se poate observa, pentru tulpina probiotică Lb. rhamnosus 9MRS aceeași tendință de modificare a capacității de aderență prin creșterea indicelui de aderență în prezenta SN provenite din co-cultivarea a 2 și 3 specii de enterobacterii diferite (SN4, SN5, SN7, SN8, SN9, SN10) și o influență mai slabă manifestată de SN monospecie (SN1, SN2, SN3). Se poate deduce, de asemenea, o creștere semnificativă a IA% în prezeța SN provenite din co-cultivarea 2 specii diferite atunci când inoculul folosit inițial, la co-cultivare a fost de 200 µl/ tulpină. Acest mod de co-cultivare se pare că a stimulat sinteza de molecule de semnalizare prin mecanisme de QSR (quorum sensing and respons) manifestate între cele două specii co-cultivate, molecule care au interferat și cu capcitatea de aderență a tulpinii lactice la substratul celular (figurile 25, 26).

Fig.25. Reprezentarea procentuală a capacității de aderență a Lb. rhamnosus 9MRS

în prezența supernatantelor de tulpini patogene (E. Coli P5, Enterobacter cloacae 419, Serratia P7).

Fig.26.Reprezentarea procentuală a capacității de aderență a Lb. rhamnosus 9MRS și Lb. plantarum ZV în prezența supernatantelor de tulpini patogene (E. Coli P5, Enterobacter cloacae 419, Serratia P7).

Tulpinile Lb. plantarum ZV și-au conservat pattern-ului de aderență localizată în prezența patogenilor pe care i-a inhibat în proporție de 16% până la 2%. (fig. 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37)

Fig. 27. Tipul de aderență difuză manifestat de Fig. 28. Tipul de aderență difuză manifestat de

Lb. plantarum ZV martor Lb. plantarum ZV în competiție cu SN1

Fig.29. Tipul de aderență difuză manifestat de Fig.30. Tipul de aderență difuză manifestat de

Lb. plantarum ZV în competiție cu SN2 Lb. plantarum ZV în competiție cu SN3

Fig.31. Tipul de aderență difuză manifestat de Fig.32. Tipul de aderență difuză manifestat de

Lb. plantarum ZV în competiție cu SN4 Lb. plantarum ZV în competiție cu SN5

Fig.33. Tipul de aderență difuză manifestat de Fig.34. Tipul de aderență difuză manifestat de

Lb. plantarum ZV în competiție cu SN6 Lb. plantarum ZV în competiție cu SN7

Fig.35. Tipul de aderență difuză manifestat de

Lb. plantarum ZV în competiție cu

SN8

Fig.36. Tipul de aderență difuză Fig. 37. Tipul de aderență difuză manifestat de

manifestat de Lb. plantarum ZV Lb. plantarum ZV în competiție cu

în competiție cu SN9 SN10

În ceea ce privește modificările semicantitative ale capacității de aderență, exprimate prin valoarea IA%, la tulpina probiotică Lb. plantarum ZV izolată din produs vegetal fermentat, se poate observa că, de data aceasta, o parte din SN provenite din culturi monospecie (SN 2, SN3) au stimulat aderența în timp ce celelalte SN au inhibat-o semnificativ (figurile 38, 39). Excepție au făcut SN8 și SN9 provenite din co-cultivarea 2 specii diferite atunci când inoculul folosit inițial, la co-cultivare a fost de 200 µl/ tulpină, aceste SN stimulând semnificativ IA% (figura 39).

Fig.38. Reprezentarea procentuală a capacității de aderență a Lb. plantarum ZV în prezența supernatantelor de tulpini patogene (E. Coli P5, Enterobacter cloacae 419, Serratia P7).

Fig.39.Reprezentarea procentuală a capacității de aderență a Lb. rhamnosus 9MRS și Lb. plantarum ZV în prezența supernatantelor de tulpini patogene (E. Coli P5, Enterobacter cloacae 419, Serratia P7).

Tulpina Lb. brevis prezintă un pattern de aderență localizată spre agregativă și un indice de aderență de 100% în toate schemele de testare realizate în cadrul experimentului (figurile 40-47), fără modificări semnificative atunci când testarea s-a realizat în prezența diferitelor variante de SN (figurile 48, 49).

Fig.40. Tipul de aderență difuză manifestat de Fig.41. Tipul de aderență difuză manifestat de

Lb. brevis G martor Lb. brevis G în competiție cu SN1

Fig.42. Tipul de aderență difuză manifestat de Fig.43. Tipul de aderență difuză manifestat de

Lb. brevis G în competiție cu SN2 Lb. brevis G în competiție cu SN3

Fig.44. Tipul de aderență difuză manifestat de Fig.45. Tipul de aderență difuză manifestat de

Lb. brevis G în competiție cu SN4 Lb. brevis G în competiție cu SN5

Fig.46. Tipul de aderență difuză manifestat de Fig.47. Tipul de aderență difuză manifestat de

Lb. brevis G în competiție cu SN6 Lb. brevis G în competiție cu SN7

Fig.48.Reprezentarea procentuală a capacității de aderență a Lb. brevis G în prezența supernatantelor de tulpini patogene (E. Coli P5, Enterobacter cloacae 419, Serratia P7).

Aderența este un factor important, determinant al colonizării unor situsuri specifice. Supraviețuirea microorganismelor în diferite habitate este dependentă de capacitatea lor de a adera la diferite suprafețe sau substraturi. Acest proces de aderență implică o interacțiune între molecule complementare de pe suprafața microorganismelor (adezine) și substrat (receptori). Aderența împiedică îndepărtarea microorganismelor prin mecanismele fizice și fiziologice asigurând colonizarea anumitor situsuri (Coconier și colab., 1993). Rezultate obținute în cadrul experimentului permit aprecierea faptului că tulpinile probiotice ce sunt utilizate în diferite formule farmacologice sunt influențate în mod diferit, de microbiota intestinală, în funcție de specia dominantă din microbiotă, de diversitatea speciilor și de asocierea acestora. Prin urmare, stabilirea proprietăților unui bun probiotic trebuie să țină cont de comportamentul acestuia în tractul intestinal, unde se va afla în competiție cu celulele microbiene viabile din compoziția microbiotei, celule care pot stimula sau pot inhiba colonizarea mucoasei intestinale și prin urmare atingerea potențialului probiotic al tulpinei respective.

Concluzii

Aderența este un factor important, determinant al colonizării unor situsuri specifice.

Analiza microscopică a tulpinilor probiotice testate a evidențiat faptul că martorul de aderență pentru tulpina Lactobacillus rhamnosus a prezentat un pattern de aderare agregativ, tulpina Lb. plantarum a prezentat aderență difuz iar Lb. brevis a prezentat aderență localizat.

Pentru tulpina probiotică Lb. rhamnosus 9MRS s-a putut observa o tendință de modificare a capacității de aderență prin creșterea indicelui de aderență în prezenta SN provenite din co-cultivarea a 2 și 3 specii de enterobacterii diferite și o influență mai slabă manifestată de SN monospecie.

În ceea ce privește modificările semicantitative ale capacității de aderență la tulpina probiotică Lb. plantarum ZV izolată din produs vegetal fermentat, se poate observa că doar SN8 și SN9 (provenite din co-cultivarea 2 specii diferite atunci când inoculul folosit inițial, la co-cultivare a fost de 200 µl/ tulpină) au stimulat semnificativ IA%, de la 13% la 20%, respectiv 51%.

Tulpina Lb. brevis prezintă un pattern de aderență localizată spre agregativă și un indice de aderență de 100% în toate schemele de testare realizate în cadrul experimentului, fără modificări semnificative atunci când testarea s-a realizat în prezența diferitelor variante de SN.

În general, s-a putut observa o creștere semnificativă a IA% în prezeța SN provenite din co-cultivarea 2 specii diferite atunci când inoculul folosit inițial, la co-cultivare a fost de 200 µl/ tulpină. Acest mod de co-cultivare se pare că a stimulat sinteza de molecule de semnalizare prin mecanisme de QSR (quorum sensing and respons) manifestate între cele două specii co-cultivate, molecule care au interferat și cu capcitatea de aderență a tulpinii lactice la substratul celular.

Prin urmare, stabilirea proprietăților unui bun probiotic trebuie să țină cont de comportamentul acestuia în tractul intestinal, unde se va afla în competiție cu celulele microbiene viabile din compoziția microbiotei, celule care pot stimula sau pot inhiba colonizarea mucoasei intestinale și prin urmare atingerea potențialului probiotic al tulpinei respective.

Bibliografie

1.Agans R, Rigsbee L, Kenche H, et al. Distal gut microbiota of adolescent children is different from that of adults. FEMS Microbiol Ecol 2011;77:404–12.

2.Aiba, Y., Suzuki, N., Kabir, A.M., Takagi, A. and Koga, Y. (1998) Lactic acid‐mediated suppression of Helicobacter pylori by the oral administration of Lactobacillus salivarius as a probiotic in a gnotobiotic murine model. Am J Gastroenterol 93, 2097–2101.

3.Arul, A. S. K. J., & Palanivelu, P. (2014). Biofilm forming ability of a new bacterial isolate from dental caries: An atomic force microscopic study. Journal of Natural Science, Biology and Medicine, 5(2), 278–283. https://doi.org/10.4103/0976-9668.136162

4.Backhed F, Roswall J, Peng Y, et al. Dynamics and Stabilization of the Human Gut Microbiome during the First Year of Life. Cell Host Microbe 2015;17:852.

5.Barzegari, A., Kheyrolahzadeh, K., Mahdi, S., Khatibi, H., Sharifi, S., Memar, M. Y., & Vahed, S. Z. (2020). The battle of probiotics and their derivatives against biofilms. Infection and Drug Resistance, 13, 659–672. https://doi.org/10.2147/IDR.S232982

6.Bao, L., Shi, B., & Shi, Y. B. (2020). Intestinal homeostasis: A communication between life and death. Cell and Bioscience,10(1),66–68. https://doi.org/10.1186/s13578-020-00429-9

7.Bassler BL, Wright M, Silverman MR. Multiple signaling systems controlling expressions of luminescence in Vibrio harveyii: Sequence and function of genes encoding a secondary sensory pathway. Mol Microbio. 1994;13:273–86.

8. Bezirtzoglou E. The intestinal microflora during the first weeks of life. Anaerobe. 1997;3(2–3):173–177.

9.Biswas, A., Wilmanski, J., Forsman, H., Hrncir, T., Hao, L., Tlaskalova-Hogenova, H., & Kobayashi, K. S. (2011). Negative regulation of Toll-like receptor signaling plays an essential role in homeostasis of the intestine. European Journal of Immunology, 41(1), 182–194. https://doi.org/10.1002/eji.201040479

10.Chandarakesan, A., Muruhan, S., & Sayanam, R. R. A. (2018). Morin Inhibiting Photocarcinogenesis by Targeting Ultraviolet-B-Induced Oxidative Stress and Inflammatory Cytokines Expression in Swiss Albino Mice. International Journal of Nutrition, Pharmacology, Neurological Diseases, 8, 41–46. https://doi.org/10.4103/ijnpnd.ijnpnd

11.Chandki, R., Banthia, P., & Banthia, R. (2011). Biofilms: A microbial home. Journal of Indian Society of Periodontology, 15(2), 111–114. https://doi.org/10.4103/0972-124X.84377

12.Chen, F., Yang, W., Huang, X., Cao, A. T., Bilotta, A. J., Xiao, Y., Sun, M., Chen, L., Ma, C., Liu, X., Liu, C.-G., Yao, S., Dann, S. M., Liu, Z., & Cong, Y. (2018). Neutrophils Promote Amphiregulin Production in Intestinal Epithelial Cells through TGF-β and Contribute to Intestinal Homeostasis. The Journal of Immunology, 201(8), 2492–2501. https://doi.org/10.4049/jimmunol.1800003

13.Coconnier MH, Bernet MF, Chauviere G, Servin AL (1993) Adhering heat-killed human Lactobacillus acidophilus, strain LB, inhibits the process of pathogeicity of diarrhoeagenic bacteria in cultured human ntestinal cells. J Diarrhaoeal Dis Res 11:235-242.

14. Collado Yurrita L, San Mauro Martin I, Ciudad-Cabanas MJ, Calle-Puron ME, Hernandez Cabria M. Effectiveness of inulin intake on indicators of chronic constipation; a meta-analysis of controlled randomized clinical trials. Nutr Hosp. 2014;30(2):244–252.

15.Day, R. L. J., Harper, A. J., Woods, R. M., Davies, O. G., & Heaney, L. M. (2019). Probiotics: Current landscape and future horizons. Future Science OA, 5(4). https://doi.org/10.4155/fsoa-2019-0004

16.Donlan, R. M. (2002). Biofilms: Microbial life on surfaces. In Emerging Infectious Diseases. https://doi.org/10.3201/eid0809.020063

17.Donlan, R. M., & Costerton, J. W. (2002). Biofilms: Survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. In Clinical Microbiology Reviews. https://doi.org/10.1128/CMR.15.2.167-193.2002

18.Dos Santos Ramos, M. A., Da Silva, P. B., Spósito, L., De Toledo, L. G., Bonifácio, B. vidal, Rodero, C. F., Dos Santos, K. C., Chorilli, M., & Bauab, T. M. (2018). Nanotechnology-based drug delivery systems for control of microbial biofilms: A review. International Journal of Nanomedicine, 13, 1179–1213. https://doi.org/10.2147/IJN.S146195

19.Gibbons RJ, Van Houte J. On the formation of dental plaques. J Periodontol. 1973;44:347–60.

20.Gill, H. S., & Guarner, F. (2004). Probiotics and human health: A clinical perspective. Postgraduate Medical Journal, 80(947), 516–526. https://doi.org/10.1136/pgmj.2003.008664

21.Gorbach, S.L., Chang, T.W. and Goldin, B. (1987) Successful treatment of relapsing Clostridium difficile colitis with Lactobacillus GG . Lancet 2, 1519 (letter).

22. Hall-Stoodley L., Stoodley P. Developmental Regulation of Microbial Biofilms. Curr. Opin. Biotechnol. 2002;13:228–233. doi: 10.1016/S0958-1669(02)00318-X.

23.Hayek, N. (2013). Chocolate, gut microbiota, and human health. Frontiers in Pharmacology, 4 FEB(3), 81–91. https://doi.org/10.3389/fphar.2013.00011

24.Hollister EB, Riehle K, Luna RA, et al. Structure and function of the healthy pre-adolescent pediatric gut microbiome. Microbiome 2015;3:36.

25.Ihekweazu, F. D., & Versalovic, J. (2018). Development of the Pediatric Gut Microbiome: Impact on Health and Disease. American Journal of the Medical Sciences, 356(5), 413–423. https://doi.org/10.1016/j.amjms.2018.08.005

26.Jäger, R., Mohr, A. E., Carpenter, K. C., Kerksick, C. M., Purpura, M., Moussa, A., Townsend, J. R., Lamprecht, M., West, N. P., Black, K., Gleeson, M., Pyne, D. B., Wells, S. D., Arent, S. M., Smith-Ryan, A. E., Kreider, R. B., Campbell, B. I., Bannock, L., Scheiman, J., … Antonio, J. (2019). International Society of Sports Nutrition Position Stand: Probiotics. Journal of the International Society of Sports Nutrition, 16(1), 1–44. https://doi.org/10.1186/s12970-019-0329-0

27.Jamal, M., Ahmad, W., Andleeb, S., Jalil, F., Imran, M., Nawaz, M. A., Hussain, T., Ali, M., Rafiq, M., & Kamil, M. A. (2018). Bacterial biofilm and associated infections. In Journal of the Chinese Medical Association. https://doi.org/10.1016/j.jcma.2017.07.012

28. Koenig JE, Spor A, Scalfone N, et al. Succession of microbial consortia in the developing infant gut microbiome. Proc Natl Acad Sci U S A 2011;108 Suppl 1:4578–85

29. Kolenbrander PE, Anderson RN, Blehart DS. Communications among oral bacteria. Microbiol Mol Bio Rev. 2002;66:486–05.

30.Koren O, Goodrich JK, Cullender TC, Spor A, Laitinen K, Backhed HK, Gonzalez A, Werner JJ, Angenent LT, Knight R, Backhed F, Isolauri E, Salminen S, Ley RE. Host remodeling of the gut microbiome and metabolic changes during pregnancy. Cell. 2012;150(3):470–480.

31.Kostakioti M., Hadjifrangiskou M., Hultgren S.J. Bacterial Biofilms: Development, Dispersal, and Therapeutic Strategies in the Dawn of the Postantibiotic Era. Cold Spring Harb. Perspect.Med. 2013;3:a010306:1–a010306:24. doi: 10.1101/cshperspect.a010306.

32.Magana, M., Sereti, C., Ioannidis, A., Mitchell, C. A., Ball, A. R., Magiorkinis, E., Chatzipanagiotou, S., Hamblin, M. R., Hadjifrangiskou, M., & Tegos, G. P. (2018). Options and limitations in clinical investigation of bacterial biofilms. Clinical Microbiology Reviews, 31(3), 1–49. https://doi.org/10.1128/CMR.00084-16

33.Marsh, P. D. (2004). Dental plaque as a microbial biofilm. Caries Research, 38(3), 204–211. https://doi.org/10.1159/000077756

34.Martin R, Makino H, Cetinyurek Yavuz A, et al. Early-Life Events, Including Mode of Delivery and Type of Feeding, Siblings and Gender, Shape the Developing Gut Microbiota. PLoS One 2016;11:e0158498.

35.McLean, N.W. and Rosenstein, I.J. (2000) Characterisation and selection of a Lactobacillus species to re‐colonise the vagina of women with recurrent bacterial vaginosis. J Med Microbiol 49, 543–552.

36. Moles L, Gomez M, Heilig H, Bustos G, Fuentes S, de Vos W, Fernandez L, Rodriguez JM, Jimenez E. Bacterial diversity in meconium of preterm neonates and evolution of their fecal microbiota during the first month of life. PLoS One. 2013;8(6):e66986.

37.Motta, L., Blancato, G., Scornavacca, G., De Luca, M., Vasquez, E., Gismondo, M.R., Lo Bue, A. and Chisari, G. (1991) Study on the activity of a therapeutic bacterial combination in intestinal motility disorders in the aged. Clin Ter 138, 27–35.

38.Negroni, A., Cucchiara, S., & Stronati, L. (2015). Apoptosis, necrosis, and necroptosis in the gut and intestinal homeostasis. Mediators of Inflammation, 2015. https://doi.org/10.1155/2015/250762

39.Pandey, K. R., Naik, S. R., & Vakil, B. V. (2015). Probiotics, prebiotics and synbiotics- a review. Journal of Food Science and Technology, 52(12), 7577–7587. https://doi.org/10.1007/s13197-015-1921-1

40.Plaque, D. (2014). Color Atlas of Dental Hygiene: Periodontology. Color Atlas of Dental Hygiene: Periodontology, Isbn 3131417617, 24–30. https://doi.org/10.1055/b-002-57138

41.Pokusaeva K, Fitzgerald GF, van Sinderen D. Carbohydrate metabolism in Bifidobacteria. Gen Nutr. 2011;6(3):285–306. doi: 10.1007/s12263-010-0206-6.

42.Runtsch, M. C., Round, J. L., & O’Connell, R. M. (2014). MicroRNAs and the regulation of intestinal homeostasis. Frontiers in Genetics,5(OCT), 1–10. https://doi.org/10.3389/fgene.2014.00347

43.Shroff KE, Meslin K, Cebra JJ. Commensal enteric bacteria engender a self-limiting humoral mucosal immune response while permanently colonizing the gut. Infect Immun. 1995;63:3904–3913.

44.Smith MI, Yatsunenko T, Manary MJ, et al. Gut microbiomes of Malawian twin pairs discordant for kwashiorkor. Science 2013;339:548–54.

45.Tannock G, editor. 1995. Normal Microflora. Chapman & Hall, London.

46. Van den Abbeele P, Grootaert C, Marzorati M, Possemiers S, Verstraete W, Ge’rard P, Rabot S, Bruneau A, El Aidy S, Derrien M, Zoetendal E, Kleerebezem M, Smidt H, Van de Wiele T. 2010. Microbial community development in a dynamic gut model is reproducible,colon region specific,and selective for Bacteroidetes and Clostridium cluster IX. Appl Environ Microbiol 76: 5237–5246

47. Zoetendal EG,Vaughan E,de Vos W. 2006. A microbial world within us MicroReview. Mol Microbiol 59: 1639–1650