Infectii Intraspitalicesti

Capitolul I: Generalități

I.1 Infecții intraspitalicești

Infecțiile intraspitalicești pot fi definite ca infecții contactate într-un spital în care pacientul a fost internat pentru o cauza diferită. (Ducel G et al. Guide pratique pour la lutte contre l’infection hospitalière. WHO/BAC/79.1.) Acestea implică și infecțiile ce apar după externarea pacientului din clinică. (Benenson AS. Control of communicable diseases manual, 16th edition. Washington, American Public Health Association, 1995.)

Infecțiile nosocomiale sunt frecvente atât în țările dezvoltate, dar mai ales în cele subdezvoltate datorită sistemului medical slab dezvoltat. Infecțiile nosocomiale sunt principala cauză a morbidității crescute în cazul pacienților hospitalizați.

Peste 1,4 milioane de oameni din toată lumea suferă de complicații apărute în spitale.( Tikhomirov E. WHO Programme for the Control of Hospital Infections. Chemiotherapia, 1987, 3:148– 151.) Cele mai ridicate procente ale apariției de infecții nosocomiale au fost înregistrate în spitalele est-meditaraneene , 11,8% și în spitalele din regiunile sud-estice ale Asiei 10% . În cazul Europei s-a înregistrat un procent de 7,7 % , iar în regiunile vest-pacifice 9% . (Mayon-White RT et al. An international survey of the prevalence of hospital-acquired infection. J Hosp Infect, 1988, 11 (Supplement A):43–48.)

Cele mai sugestive tipuri de infecții nosocomiale sunt speticemiile, pneumoniile, infecțiile urinare infecțiile de situs chirurgical și infecții ale tractului respirator. De asemenea, s-a observat că apar mai ales în unitățile de terapie intensivă și în cazuri acute de intervenții chirurgicale și ortopedice.

Cei mai frecvenți agenți patogeni ce provoacă infecțiile sunt cei din genul Streptococcus , Acinetobacter , Proteus, Escherichia, Pseudomonas , Clostridium , etc.

Aceștia se transmit de la persoană la persoană, din mediu sau din apă și hrană contaminată, persoane infectate, inclusiv personal medical, piele sau suprafețe .

Adesea infecțiile implică microorganisme nososcomiale precum Staphilococcus aureus meticilin-rezistent, enteroccoci rezistenți la vancomicină, etc.( Nosocomial infections and their control strategies Hassan Ahmed Khan1, Aftab Ahmad2, Riffat Mehboob , 2015 )

Utilizarea necorespunzătoare și abuzivă de antibiotice duce la formarea de noi tulpini rezistente iar combaterea infecțiilor determinate de acestea sunt adesea dificil de combătut.

I.2. Infecții determinate de Staphilococcus aureus

S. aureus este considerat unul dintre cei mai importanți patogeni responsabili de infecțiile nosocomiale. Este un coc Gram-pozitiv, non-formator de spori, imobil, facultativ anaerob, catalazo- și coagulazo-pozitiv. (Vandenesch F, Lina G, Henry T. Staphylococcus aureus hemolysins, bi-component leukocidins, and cytolytic peptides: a redundant arsenal of membrane-damaging virulence factors? Front Cell Infect Microbiol 2012; 2: 12.) Este un organism oportunist, astfel că există în organismul uman , în principiu conolizând mucoasa nazală. Pacienții cu imunitate și imunocompetență scăzută sunt susceptibili la infecții provocate de S. aureus. Acesta provoacă atât infecții la nivel superficial cât și la nivel profund și abces. Bolile determinate de S. aureus includ toxiinfecție alimentară datorită ingerării de enterotoxine, sindromul șocului toxic (Al Laham N, Mediavilla JR, Chen L, Abdelateef N, Elamreen FA, Ginocchio CC, et al. MRSA clonal complex 22 strains harboring toxic shock syndrome toxin (TSST-1) are endemic in the primary hospital in Gaza, Palestine. PLoS One 2015; 10(3): e0120008.) și toxine de determină exfolierea pielii în cazul sindromului pielii opărite, astfel, virulența acestora se datorează unor endotoxine sau exotoxine, enzime sau modulatori imuni. ( Nosocomial infections and their control strategies Hassan Ahmed Khan1, Aftab Ahmad2, Riffat Mehboob , 2015 )

I.3 Infecțiile cu E. coli

E.coli este un patogen adesea cauză a infecțiilor nosocomiale.( Lausch KR, Fuursted K, Larsen CS, Storgaard M. Colonisation with multi-resistant Enterobacteriaceae in hospitalised Danish patients with a history of recent travel: a cross-sectional study. Travel Med Infect Dis 2013; 11(5): 320-3) E.coli este un organism Gram-negativ, oxidazo-negativ și facultativ anaerob. Acesta este, ca și S.aureus , oportunist, astfel că se găsește în microbiota normală , colonizând tractul gastro-intestinal atât al oamenilor, cât și al altor animale.

Este un microorganism responsabil de o serie de boli frecvent întâlnite în cadrul spitalelor, precum infecțiile tractului urinar, septicemii, meningită neonatală, peritonită și gastroenterită.

Factorii de virulență sunt reprezentați de endotoxine, proteine ale capsulei, sisteme secretorii de tip 3.( Zhao W, Yang S, Huang Q, Cai P. Bacterial cell surface properties: role of loosely bound extracellular polymeric substances (LB-EPS).

Colloids Surf B Biointerfaces 2015; 128: 600-7)

I.4 Metode de combatere a infecțiilor

Infecțiile intraspitalicești sunt extrem de importante deoarece acestea afectează sănătatea publică, creând un stres emoțional și scăderea calității vieții, iar în cazurile netratate sunt incompatibile cu viața. (Prevention of hospital-acquired infections – WHO WHO/CDS/CSR/EPH/2002.12 pag 9) . Utilizând tratemente necorespunzătoare cu antibiotice , se formează tulpini rezistente ce provoacă infecții greu de combătut. Studii ale lui Kollef și colab. au arătat că mortalitatea este mai ridicată în cazul pacienților ce nu au primit un tratament rapid și corespunzător. [Management of serious nosocomial bacterial infections: do current therapeutic options meet the need? H. Lode]

Pentru a combate astfel de infecții sunt utilizate substanțe cu proprietăți antibacteriene , dezinfectanți, instrumental steril și se încearcă utilizarea responsabilă și adecvată a antibioticelor.

De-a lungul timpului s-au cautat soluții cât mai eficiente împotriva bacteriilor ce contaminează spațiile, instrumentalul sau personalul clinicilor medicale.

În ultimul timp s-a observat o dezvoltare a unor noi metode antibacteriene precum a nanoparticulelor ce sunt dopate cu diverse substanțe care interferă cu viața bacteriilor astfel încât modificarea indusă de acestea să ducă la moartea bacteriilor.

Scopul acestei lucrări este observarea modului de acțiune a unor nanoparticule de dioxid de titan dopate cu molecule de cupru și zinc asupra unor tulpini de S.aureus și E.coli.

Având proprietăți antibacteriene, nanoparticulele determină moarte celulară astfel încât acestea pot fi utilizate în cazul prevenirii infecțiilor intraspitalicești și menținerea unui mediu ideal de recuperare în clinici si spitale fără a se contamina cu bacterii nedorite.

Nanoparticulele pot fi utilizate în diverse moduri. Pentru combaterea infecțiilor intraspitalicești o metoda de utilizare a acestora poate fi introducerea pe piață de vopseluri tratate cu nanoparticule care sa înhibe viața bacteriană.

Capitolul II : Bacterii

II.1. Ce sunt bacteriile?

Bacteriile au fost definite de Fr. Jacob ca fiind un ,,minimum vital,, sau organismele cele mai simple, dotate cu atributele viului: organizare, autonomie, invarianță. Reprezintă o categorie aparte de organisme unicelulare cu o morfologie caracteristică, destul de limitată, dimensiuni mici și caractere de colorabilitate ușor de stabilit prin observații microscopice. Odată cu observarea unor particularități foarte diferite, a devenit necesară stabilirea unor caractere diferențiale, care să permită stabilirea cu certitudine a apartenenței unui microorganism la grupul bacteriilor. Stanier (1971) a definit bacteriile sau procariotele prin antiteză cu eucariotele, utilizând caractere discriminatorii, care stabilesc diferențe nete între celulele procariote și eucariote; ulterior, K. Woese a adus completari esentiale

II.2. Clasificarea bacteriilor

Desi sistemul actual de clasificare filogenetica a bacteriilor se bazeaza pe criterii oferite de biologia moleculara (Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology – ultima editie fiind publicata intre 2001-2012), o schema generală de clasificare fenotipica a bacteriilor, inca foarte utila din punct de vedere practic, utilizează drept criteriu structura peretelui celular; mai exact, în funcție de prezența, structura, și gradul de dezvoltare al peretelui celular, bacteriile se împart în 4 diviziuni:

1. Diviz. FIRMICUTES (lat. firmus = tare, cutes = înveliș) = bacteriile Gram pozitive; Cls. 1. Firmibacteria – bacterii cu perete celular gros, rigid, prin conținutul mare în mureină

Cls. 2. Thallobacteria – bacterii filamentoase = Actinobacteria (den. veche Actinomycetes)

2. Diviz. GRACILICUTES (lat. gracilis = fragil) = bacteriile Gram negative;

Cls. 1. Scotobacteria (gr. scotos= intuneric)= bacterii care se pot dezvolta in absenta luminii;

Cls. 2. Photobacteria: – Subcls. Oxyphotobacteria, respectiv Cyanobacteria;

– Subcls. Anoxyphotobacteria – bacteriile sulfuroase roșii ( Chromatiaceae); – ,, ,, verzi (Chlorobacteriaceae); – ,, nesulfuroase roșii (Rhodospirillaceae).

3. Diviz. TENERICUTES (lat. teneri = moale) = bacteriile fără perete celular = micoplasme.

Cls. Mollicutes (lat. molli = moale, pliabil), genul reprezentativ fiind Mycoplasma; sunt cele mai mici bacterii cunoscute capabile de creștere pe medii acelulare; membrana plasmatică a micoplasmelor are un caracter unic printre bacterii, in sensul ca aceasta conține steroli care protejează celula de șocul osmotic si ii confera un polimorfism accentuat.

4. Diviz. MENDOSICUTES (lat. mendosus = fals, greșit) = care grupeaza in prezent microorganismele incadrate in Domeniul Archaea, respectiv microorganisme cu organizare celulară de tip procariot, dar care la nivel molecular sunt sunt mai asemanatoare cu eucariotele decât cu procariotele, reprezentând o directie de evolutie aparte. Astfel archaeele prezinta un perete celular „fals”, în compoziția căruia intră pseudomureina sau o mureină neconvențională (lipsită de acidul Nacetilmuramic = NAM), lipidele membranare sunt diferite, glicerolul fiind înlocuit cu acidul N– acetil-talosaminuronic; alte deosebiri: structura particulară a moleculelor de ARNt, a ARNr 16S, sensibilitatea diferita la antibiotice. Archaeele sunt foarte raspândite in natura, nu doar in medii cu conditii extreme, ci si in sol, mediul marin si oceanic; au fost identificate si specii comensale, prezente in microbiota intestinala normala a omului si animalelor, participând la procesul de digestie (specii metanogene); nu au potential patogen direct

NOTE DE CURS MICROBILOGIE LAZAR DANIELA

II.3. Virulența bacteriană

II.4. Peretele celular și anvelopa bacteriană

Anvelopa bacteriană este prima structură care apără bacteria de factorii dăunători acesteia din mediul extern. Este o structură esențială care dă forma celulei și menține de asemenea presiunea osmotică internă a acesteia. Aceasta funcționează ca o interfață senzitivă și sită moleculară, care mediază atât fluxul de informație și transportul solutiilor.

În același timp, anvelopa bacteriană reprezintă țintă pentru numeroase antibiotice. Ca atare, monitorizarea și mentenanța integrității anvelopei celulare față de agenții și conditiile perturbatoare sunt cruciale pentru supraviețuirea bacteriei .( Sina Jordan1, Matthew I. Hutchings2 & Thorsten Mascher1, 2007)

Bacteriile Gram-negative sunt înconjurate de un perete celular peptidoglicanic subțire, care este apoi înconjurate de o membrană externă cu conținut lipopolizaharidic. Bacteriile Gram-pozitive nu au o membrană externă, însă, printre straturile de peptidoglicani sunt intercalați polimeri anionici, denumiți acizi teicoici (Thomas J. Silhavy1, Daniel Kahne2, and Suzanne Walker2, 2010).

II.4.1. Peretele celular al bacterilor Gram-negative

Dupa decenii de controverse, tehnica microscopiei electronice a relevant clar structura suprapusă a anvelopei celulare (Glauert și Thornley, 1969) .

Peretele celular al bacteriilor Gram-negative are un conținut scăzut în mureină, doar 8-10%, lipsesc acizii teichoici, dar apare o structură suplimentară, denumită membrană externă, care reprezintă o dublare a membranei plasmatice.

Peretele celular la bacteriile Gram-negative are 3 straturi: membrana externă (ME), peretele celular peptidoglicanic și membrana citoplasmatică sau internă (MI) . Cele 2 membrane delimitează un compartiment celular apos pe care Peter Mitchell (1961) l-a numit pentru prima dată periplasmă. În aceeși perioada au fost dezvoltate și metodele biochimie astfel încât au fost izolate și caracterizate un set de proteine existente în periplasmă (Heppel, 1967) și pentru a caracteriza compoziția celor două membrane, membrana internă și membrana externă . Studiile posterioare au întărit teoriile existente deja.

Membrana externă

De la exterior către interior, primul strat prezent în structura bacteriilor este membrana externă, o caracteristică distinctivă a bacteriilor Gram-negative, bacteriile Gram-pozitive neavând acest strat.

Ca și alte membrane biologice, ME este un bistrat lipidic. ME nu conține fosfolipide, ele fiind existente în foița internă a acestei membrane. Foița externă a ME este alcătuită din glicolipide, în principal lipopolizaharide (LPS) (Kamio și Nikaido, 1976) . LPS sunt molecule ce provoacă șocul endotoxic asociat cu septicemia cauzată de bacteriile Gram-negative (Raetz și Whitfield, 2002) . Sistemul imun uman este sensibil la aceste molecule deoarece reprezintă un indicator sigur al infecțiilor.

Cu câteva excepții, proteinele componente al ME pot fi divizate in 2 clase: lipoproteine și proteine de barieră. Lipoproteinele conțin părți lipidice care sunt atașate de capătul amino terminal al unui rest de cisteină (Sankaran și Wu , 1994). Se consideră că aceste jumătăți de lipide ancorează lipoproteinele de foița internă a membranei externe. Cu alte cuvinte, acastea nu sunt proteine transmembranare. Exista aproximativ 100 de lipoproteine prezente în membrana externă la E.coli și funcțiile celor mai multe dintre ele încă nu sunt cunoscute (Miyaday et al. 2004) .

Aproximativ toate proteinele transmembranare ale membranei externe sunt dispuse sub conformație de beta-barieră. Aceste proteine prezintă conformație beta pliată , înfășurate în cilindre.

Unele dintre acestea, cum ar fi porinele, OmpF și OmpC funcționează pentru a permite difuzia pasivă a moleculelor mici precum mono și dizaharide sau aminoacizi la nivelul ME. Aceste porine au 16 domenii transmembranare, existând ca trimeri și sunt foarte abundente, împreună existând în jur de 250000 de copii per celulă.

O altă clasă de proteine ale membranei externe care au o structură mai complexă, având în jur de 2—24 de domenii transmembranare, dar prezente la un nivel scăzut, au funcție de canale cu specificitate mare de transport pentru liganzi precum chelatorii de Fe sau vitamine precum vitamina B12 (Nikaido 2003).

Membrana externa este esențială pentru supraviețuirea bacteriei E. Coli , dar conține foarte puține enzime. De exemplu, există fosfolipaza (Snijder et al 1999), o protează (OmpT) (Vandeputte-Rutten et al 2001), și o enzimă ce modifică LPS (PagP) (Hwang et al 2002). Situsul activ al acestor enzime este localizat în afara stratului sau la exterioul celulei (OmpT) . Singura funcție a membranei externe este de barieră protectoare .

Lipopolizaharidele au un rol critic în funcția de barieră a membrane externe. LPS este o dizaharidă glucozaminică cu 6-7 lanțuri acil, un miez polizaharidic și un lanț polizaharidic denumit antigen-O (Taetz și Whitfield, 2002) . Lanțurile acil sunt saturate și acestea facilitează împachetarea strânsă. Stratul continuu nonfluid format de moleculele de LPS este o bariera eficientă împotriva moleculelor hidrofobe. Acestea, împreună cu porinele ce limitează transportul moleculelor hidrofobe mai mari de 700 Da, conferă membranei externe o permeabilitate selectivă foarte eficientă. (Nikaido, 2003)

Peretele peptidoglicanic

Peptidoglicanul este alcătuit din unități dizaharidice repetitive de N-acetilglucozamină-N-acetil-acid muramic, legate încrucișat. (Vollmer et all 2008) . Acesta este un polimer foarte mare ce poate fi izolat și observat la microscop. Din cauza rigidității sale, conferă forma celulei.

Agenți precum enzime sau antibiotice pot distruge peptidoglicanii cauzând liza celulei datorată presiunii turgescenței citoplasmatice. Liza poate fi prevenită în mediu cu osmolaritate mare. Cu toate acestea, fără peptidoglican , celulele îsi pierd forma caracteristică. Celulele rezultante se numesc sferoplaști. (PROTOPLAȘTI?!)

La E.coli, metodele de obținere a sferoplaștilor determină formarea de celule nonviabile, dar care își pot continua metabolimul și biosinteza pentru încă o oră.

Membrana externă este practic prinsă de peptidoglicani printr-o lipoproteină, denumită Lpp, mureină sau lipoproteina lui Braun. (Braun, 1975) . Lipidele atașate de capătul amino terminal a acestei proteine mici sunt legate în membrana externă. Lpp este cea mai abundentă proteină în E. Coli, existând mai mult de 500000 de molecule per celulă.

În plus, proteine precum OmpA leagă necovalent peptidoglicani. Mutanții ce nu conțin Lpp sunt eliminate prin vezicule. (Yem și Wu 1978).

Periplasma

Membrana externă și membrana internă delimitează un compartiment celular de numit periplasm. Acesta este dns împachetat în proteine și e mult mai vâscos decât citoplasma. (Mullineax et all 2006)

Campartimentarea celulară permite bacteriilor Gram negative să detecteze și să sechestreze potențialele enzime degradative precum RNaze sau fosfataze alcaline. Din această cauză periplasma a fost denumită un precursor evolutival lizozomilor din celulele eucariote. (De Duve și Wattiaux, 1966) .

Alte proteine prezente în acest compartiment celular ar fi proteine de legare periplasmică (PERIPLASMIC BIDING PROTEIN) ce funcționează în transportul glucidelor și aminoacizilor și chemotaxie, dar și molecule like-chaperone ce funcționează în biogeneza anvelopei (Ehrmann, 2007).

Membrana internă

Multe dintre proteinele membranare sunt implicate în producerea de energie, biosinteza de lipide și proteine sau transport sunt conservate la bacterii dar localizarea celulară este difeită, în cazul acestor fiind localizate la nivelul membranei bacteriene interne.

Membrana internă este un bistrat fosfolipidic. La E.coli ptincipalul fosfolipid este fosfatidil etanolamina și fosfatidil glicerol, dar conține și putine molecule de fosfatidil serină și cardiolipină.

Alte molecule lipidice minore sunt carrierii poliisopreoid (C55), ce funcționează în translocarea intermediarilor glucidici activați ce sunt necesari în biogeneza anvelopei bacteriene. (Raetz și Dpwhan , 1990).

Mecanisme transanvelopare

Diverse tipuri de structuri de suprafață precum flagelul (DePamphilis and Adler 1971; Macnab 2003), cu rol în motilitatea bacteriană și sistemul secretor de tip III (Kubori et al , 1998), care injectează toxinele în citoplasma celulelor eucariote gazdă în timpul procesului infecțios și pompele de eflux (Koronakis et al 2000, Eswaran et al. 2004 , Murakami et al. 2006, Symmons et al. 2009) , care pompează molecule toxice, precum antibioticele, din celule, prin anvelopa bacteriană, către mediul exterior sunt responsabile în mare parte de rezistența bacteriilor la antibiotice ale bacteriilor patogene, fiind un mecanism molecular format din componente proteice individuale care trec peste peptidoglicani și sunt localizate în toate compartimentele celulare.

Structura unora dintre aceste mecanisme este cunoscută la o rezolutie suficientă pentru a înțelege și observa dimensiunile ale diferitelor compartimente celulare la E. coli , dar trebuie menționat faptul că volumul periplasmei variază foarte mult (Stock et al. 1977).

Biogeneza anvelopei bacteriene

Toate componentele anvelopei celulare la bacteriile Gram-negative sunt sintetizate fie în citoplasmă, fie la suprafața internă a membranei interne.

Ca atare, toate aceste componente trebuiesc translocate din citoplasmă sau transportate de-a lungul membranei interne. Componentele periplasmice trebuiesc eliberate din membrana internă, componenta peptidoglicanică trebuie eliberată și polimerizată , iar componentele membranei externe trebuiesc transportate prin mediul apos, vâscos al periplasmei și asamblate într-un bistrat lipidic asimetric.

Asamblarea acestora are loc în afara celulei, în mediu ostil ce nu are surse de energie.

Toate proteinele sunt sintetizate în citoplasmă. Proteinele destinate pentru periplasmă sau pentru membrana externă sunt inițial realizate sub formă de precursor cu o secvență amino terminală de aminoacizi. Aceste semnale le face să fie ținta translocării din citoplasmă (Driessen and Nouwen, 2008). Această translocare este catalizată de o proteină esențială, heterotrimerică a membranei interne denumită SecYEG (Van der Berg et al. 2004). Secvența semnal și proteina heterotrimerică sunt conservate biologic (Rapoport 2007).

ATP-aza SecA esențială și forța proton motrice conduc această translocare (Zimmer et al 2008).

Proteinele periplasmice și proteinele membranei externe sunt în general translocate posttranslațional, deci sintetizarea și translocarea nu sunt cuplate. Proteinele trebuiesc secretate în mod liniar de la capătul amino către capătul carboxi-terminal; SecYEG nu poate fi împachetată în moleculă. Proteina chaperone SecB citoplasmatică menține aceste proteine neîmpachetate până sunt sintetizate complet (Randall și Hardy 2002). În timpul secreției, secvența semnal este eliminată prin proteoliză cu ajutorul Peptidazei Semnal I (Paetzel et al. 2002). Alte componente ale transloconului Sec, precum SecD, SecF și YajC au funcții importante, dar nu vitale în timpul translocării, crezându-se că facilitează secreția proteinelor în periplasmă.

O dată eliberate, proteinele periplasmice au ajuns la locul țintă, dar se crede că proteinele chaperon funcționează pentru a preveni împachetarea greșită și agregarea acestora. De exemplu, proteina periplasmică MalS, ce conține legături disulfurice necesită osidaza disulfurică DsbA pentru o împachetare corectă. În absența acesteia, proteaza periplasmică DegP (HtsA) poate substitui (Spiess eu al. 1999).

Proteinele chaperon periplasmice funcționează pentru protecția proteinelor membranei externe la trecerea lor prin periplasmă. Au fost caracterizate 3 astfel de proteine cu activitate generală de chaperon: SurA, ce funcționează și pe post de peptidil-prolin izomerază (Behren și Gross 2001; Bitto și McKay 2003), Skp (Chen și Henning 1996; Walton et al. 2009) și DegP, menționată mai sus (Krojer et al. 2008; Shen et al. 2009).

Analize genetice indică faptul că aceste 3 proteine funcționează în paralel pentru asamblarea proteinelor membranei externe; SurA funcționează pe o cale iar DegP și Skp funcționează pe o altă cale. Mutanții ce nu conțin una dintre aceste căi sunt viabili, dar pierderea ambelor căi de asamblare duce la o moarte celulară (Rizzitello et al 2001).

Mutanții ce nu conțin SurA și Skp sau SurA și DegP nu sunt viabili și prezintă defecte masive în asamblarea proteinelor peretelui extern.

Astfel, prin definiție, aceste 3 căi chaperon sunt redundante, deși această redundanță nu reflectă în mod egal rolurile acestora în asamblarea proteinelor membranei externe.Totuși, proteinele majore ale peretelui extern prezintă o afinitate pentru calea SurA (Sklar et al. 2007). as does the minor OMP LptD

(Vertommen et al. 2009; see later). Până în prezent nu au fost evidențiate proteine ale membrane externe care să prefere calea DegP/Skp, fapt ce se poate datora faptului că multe printre proteinele membrane externe minore nu prezintă preferințe.

Rolul primar al căii DegP/Skp a fost identificat și anume de a salva proteinele membrane externe care au ieșit din calea normal de asamblare, în mod special cele aflate sub condiții de stres.

Este de asemenea posibil ca alte proteine periplasmice să aibă funcție chaperon. Acestea duc proteinele membranei externe într-un situs existent în membrana externă, recent descoperit, denumit complexul Bam. Acest complex este compus dintr-o proteină b-barell mare, BamA ( denumită și YaeT sau Omp85) și 4 lipoproteine , BamBCDE ( respectiv YfgL, NlpB, YifO și SmpA) (Wu et al. 2005; Sklar et al. 2007).

În plus, domeniul BamA are în capătul amino-teminal 5 domenii POTRA (polypeptide transport ascociated). Patru din cele 5 domenii POTRA au domenii împachetate aproape identic în ciuda faptului că au un număr scăzut de aminoacizi poziționați identic.

La E. coli primele 2 domenii POTRA nu sunt esențiale pentru viața bacteriei. BamA este o proteină înalt conservată în bacteriile Gram-negative, existând câte 5 astfel de domenii în toate aceste organisme.De asemenea, au fost descoperiți omologi ai BamA în mitocondrii și cloroplaste. (Moslavac et al. 2005) care sunt considerate a fi derivate din bacteriile Gram-negative. Acești omologi pot avea 1, 2 sau 3 domenii POTRA, iar proteinele funcționale sunt asemănătoare cu cele B-barrier din membrana externă a bacteriilor Gram-negative. BamD este singura lipoproteină esențială din complexul Bam (Malinverni et al 2006) și este, de asemenea, înalt conservată la bacteriile Gram-negative. Restul de 3 lipoproteine nu sunt esențiale, iar conservarea acestora variază. Nu a fost înțeles mecanismul de împachetare al proteinelor b-barrier sau funcțiile individuale ale proteinelor componente din complexul Bam, dar există dovezi ce sugerează că domeniile POTRA ale BamA pot fi model de împachetare printr-un proces denumit aplificare b (Kim et al. 2007).

Lipoproteinele sunt de asemenea formate inițial cu o secvență amino-teminală , eliminată printr-o peptidază, peptidaza semnal II (Paetzel et al. 2002). Secvența semnal ce procesează lipoproteina necesită formarea unui tioeter gliderid la un rest de cisteină, ce va deveni în final capătul amino-terminal al lipoproteinei mature. O data ce a fost eliminată secvența semnal, un lanț acil-gras adițional este adăugat la cisteina terminală (Sankaran și Wu 1994). Aceste jumătăți lipidice ancorează lipoproteina nou formata de foița externă a membranei interne.

Unele lipoproteine rămân ancorate in membrana internă și biogeneza lor este completă după procesarea secvenței semnal și adiția lipidică.

Totuși, majoritatea lipoproteinelor în E. coli sunt destinate membranei externe. Sistemul Lol, care transportă lipoproteinele la membrana externă a fost bine caracterizat. (Natita și Tokuda, 2006). Există un transportor ABC (LolCDE) in membrana internă ce utilizează hidroliza ATP pentru a extrage moleculele din membrana internă și pentru a le transporta către un carrier mai solubil din periplasmă denumit LolA. Acesta aduce moleculele ăn situsul din membrana externă, LolB. Lipidele din membrana internă au un semal de ”evitare Lol” ce le determină să rămână în membrana internă. Cel mai comun astfel de semnal este un rest de aspartat aflat în poziția 2 a lipoproteinei mature.

Cel de-al doilea sistem translocator din membrana internă este denumit Tat, care translocă proteinele împachetate. Ecoli utilizează sistemul Tat pentru proteince ce au grupări prostetice care trebuiesc adăugate in citoplasmă și care conțin o fracție mică de proteine secretate. Alte bacterii, precum cele termofile, folosesc sistemul Tat intens, probabil pentru că este mai ușor de împachetat proteinele în citoplasmă decât în mediul ostil în care trăiesc.

În ceea ce privește componența, sistemul Tat este remarcabil de simplu: trei componente. TatB și TatC realizează marcarea proteinelor pentru translocare cu ajutorul TatA, dar cum recunoaște sistemul substratul împachetat și cum realizează reacția de translocare este încă necunoscut.

Proteinele destinate în pentru membrana internă sunt translocate cu ajutorul sistemului Sec.

Totuși, în general, aceste proteine sunt alese pentru translocarea cotranslațională prin particule semnal de recunoaștere (SRP) și receptoriul pentru SRP, FtsY (Bernstein, 2000).

Probabil , translocarea postrtranslațională a acestor substraturi hidrofobe ar fi ineficientă și probabil defectuasă datorită potențialului lor mare de agregare.

SRP-urile procariote sunt mult mai simple decât cele eucariote. Acestea conțin o singură proteină Ffh (fifty four homolog) și ARN, denumit Ffs (four point five S RNA). Atât Ffh , cât și Ffs sunt GTP-aze, ca și omoloagele acestora eucariote.

Proteinele transmembranare α-helix, ce sunt caracteristice membranelor biologice atât la eucariote cât și la procariote, funcționează ca și semnal de secreție. Primul segment transmembranar funcționează ca semnal de secvență, pentru a iniția translocarea secvenței ce o urmează. Aceste secvențe membranare au proprietatea de a fi mai lung și mai hidrofob decât secvențele tipice de semnalizare , acestea servind la recunoașterea cu ajutorul SRP (Hedge și Berstein 2006).

Acest semnal nu este tăiat; el rămâne atașat, rămânând un helix transmembranar tipic.

Al doilea helix transmembranar are rolul de a stopa reacția de translocare și iese prin translocatorul SecYEG , rămânând apoi în membrana internă. (Van der Berg et al. 2004; Driessen și Nouwen 2008).

Al treilea helix transmembranar funcționeaza ca o secvență semnal netăiată. Aceste semnale de translocare start/stop altenate leagă proteinele membranei interne în mod treptat.

Proteinele membranei interne de dimensiuni mici, mai ales cele cu comenii periplasmice pot fi inserate în membrană printr-o translocază secunodara, denumită YidC. Familia de proteine YidC poate fi regăsită în mitocondrii și cloroplaste. Ca și omologul lor mitocondrial, YidC are rol important în asamblarea proteinelor cu funcții legate de generarea de energie, precum subunitatea c a ATP-azei.

YidC are un rol important și în inserarea proteinelor mari în timpul transferului lateral al helixurilor transmembranare în bistratul lipidic, SecYEG-dependent. (Xie și Dalbey 2008)

LPS-urile includ un miex polizaharidic și anitigenul O, ambele sintetizate în stratul intern al membranei interne. LPS-urile sunt deplasate prin miscări flip-flop în stratul extern al membranei interne, reacție catalizată de Waal (Raetz și Whitfield 2002).

În ultimii ani , studiile de combinări genetice , bioxhimie și bioinformatică au fost îndreptate sărea a identifica 7 proteine esențiale ce au ca funcție transportul LPS din foița externă a membranei externe , la suprafața celulară. Aceste proteine au fost denumite Lpt (lipopolysaccharide transport); LptA (aka YhbN) (Sperandeo et al. 2007), LptB (aka YhbG) (Sperandeo et al. 2007), LptC (aka YrbK) (Sperandeo et al. 2008), LptD (aka Imp or OstA) (Braun and Silhavy 2002; Bos et al. 2004), LptE (RlpB) (Wu et al. 2006), LptF (aka YjgP) (Ruiz et al. 2008), and LptG (aka YjgQ) (Ruiz et al. 2008).

Proteinele transmembranre mari, LptD și lipoproteina LptE formează un complex în memrana externă. LptA este sintetizată cu o secvență semnal clivabilă și rămâne în periplasmă. LptF și LptG sunt proteine ale membranei interne care, cel mai probabil, interacționează cu proteina citoplasmatică LptB, o ATP-ază, pentru a forma transportorul ABC , care, împreună cu proteina LptC biotopică extrag LPS din membrana internă și le transportă către proteina periplasmică LptA, ce le transmit mai departe la LptD și LptE, iar în final, către situsul de asamblare din membrana externă.

Un model alternativ presupune formarea unui mecanism de transport transanvelopar analog cu pompele de eflux, ce conține toate cele 7 proteine de transport Lpt și presupune transportul LPS direct din membrana internă către suprafața celulară .

Ceea ce este clar este faptul că , în cazul inexistenței uneia dintre cele 7 proteine, LPS-urile se acumulează pe foița externă a membranei interne (Sperandeo et al. 2008; Ruiz et al. 2008).

Asemeni LPS-urilor, fosfolipidele sunt sintetizate în foița internă a membranei interne. MsbA poate determina mișcarea flip-flop a acestor molecule în bistrat, ajungând pe stratul extern al membranei interne (Doerrler et al. 2004), dar este propabil să existe și alte mecanisme ce determină mișcarea fosfolipidelor în bistrat.

Cum ajung fosfolipidele în membrana externă este încă un subiect necunoscut. Ceea ce a fost descoperit este faptul că fosfolipidele adăugate in membrana externă (Jones și Osborn 1977), ajung rapid in membrana internă, chiar si molecule precum colesterol care nu se găsesc în mod normal în bacterii. Acest lucru poate sugera existența unor situsuri de fuziune sau semi-fuziune ce permit traversarea fosfolipidelor prin difuzie transmembranară (Bayer 1968), dar a rămas la stadiul de ipoteză.

II.4.2. Peretele celular al bacteriilor Gram-pozitive

Peretele celular al bacteriilor Gram-pozitive diferă de cel al bacteriilor Gram-negative . În primul rând, membrana exteenă nu este prezentă în cazul bacteriilor Gram-pozitive. Membrana externă este un component al peretelui celular ce conferă rezistența bacteriilor Gram-negative față de mediul extern, excluzând moleculele toxice și conferind o stabilitate suplimentară în jurul celulei. Pentru că indirect membrana externă stabilizează membrana internă, stratul de peptidoglicani din componența peretelui celular al bacteriilor Gram-negative, este relativ subțire.

Pentru a supraviețui presiunii turgescente exercitate asupra membranei, microorganismele Gram-pozitive sunt înconjurate de straturi de peptidolicani, mult mai groase decât cele prezente la E. coli.

Printre moleculele de peptidoglicani există polimeri anionici lungi, denumiți aici teicoici, compuși majoritar din resturi de glicerol fosfat, glicozil fosfat sau ribitol fosfat. Una din aceste clase de polimeri , acizii teicoici din peretele bacterian sunt atașați covalent de peptidoglican; o altă clasă, acizii lipoteicoici, sunt ancorați de lipidele mebranei (Nehau 2003).

Împreună, acești polimeri reprezintă peste 60% din masa peretelui bacteriilor Gram-pozitive, făcându-le contribuitorii majoritari ai anvelopei bacteriene, atât din punct structural cât și funcțional.

În plus, la suprafața bacteriilor Gram-pozitive, sunt ancorate proteine , dintre care unele sunt analogul proteinelor din periplasma bacteriilor Gram-negative (Dramsi et al. 2008) .

Unele conțin domenii helicale in membrana și unele sunt atașate de ancorele lipidice incluse în membrană. Alte proteine sunt asociate covalent sau strâns de peptidoglicani (Scott și Barnett 2006). De asemenea, altele se leagă de acizii teicoici.

Studii efectuate pe S.aureus au relevat compoziția proteinelor de suprafață. Aceasta poate suferi compoziții drastice în funcție de mediul în care se dezvoltă sau condițiile de creștere, reflectând rolul important al anvelopei celulare în adaptarea la mediul de viață (Pollack și Neuhaus, 1994).

Peptidoglicanii bacteriilor Gram-pozitive

Structura chimică a peptidoglicanilor în cazul bacteriilor Gram-pozitive este asemănătoare cu cea a bacteriilor Gram-negative, mai exact, un polimer de dizaharid peptidic, cuplat prin legături glicozidice pentru a forma legături glicanice liniare încrucișate într-o rețea, ca un schelet, prin cozile peptidice atașate la repetițiile dizaharidice.

Diferența majoră între peptidoglicanii cele 2 tipuri de bacterii implică grosimea straturilor ce înconjoară membrana plasmatică. În timp ce stratul de peptidoglicani al bacteriilor Gram-negative este de doar câțiva nanometrii, în cazul celor Gram-negative este de 20-100 nm , fiind dispuse mai multe straturi. Există multe diferențe , însă cele mai notabile se referă la legăturile peptidice încrucișate dintre lanțurile glicanice (Vollomer 2008; Vollomer et al. 2008).

S.aureus conțin legături încrucișate în care peptidele sunt legate printr-un rest de pentaglicină provenit din al treilea aminoacid al uneia dintre lanțuri. Acesta este asamblat de un set de peptidil transferaze nonribozomale , denumite FemA, FemB și FemX (Ton-That et al. 1998; Rohrer și Berge-Bachi 2003). Stafilococii pot tolera, deși cu dificultate, pierderea de FemA sau FemB, dar nu pot tolera pierderea de FemX, care atașează prima unitate de glicină la scheletul peptidic (Hegde și Shrader 2001; Hubscher et al. 2007).

Scheletul peptidic ramificat de la S. aureus și alte organisme Gram-pozitive au o mulțime de roluri. Unul dintre funcții este e a servi ca situsuri de atașare pentru proteine, atașându-se covalent.

Peptidoglicanii sunt implicați de asemenea în rezistența la antibioticele β-lactamice (Chambers 2003) . β-lactamii inactivează transpeptidazele ce catalizează legarea încrucișată a peptidelor din sinteza peptidoglicanilor, reacționând cu situsul nucleofil activ al transpeptidazelor. Transpeptidazele care cuplează scheletul ramificat peptidic au un mecanism similar cu cel al peptidazelor care cuplează scheletul peptidic neramificat. Cu toate acestea, substratul acestora este suficient de specific încât acestea recunosc doar scheletul peptidic neramificat și unele dintre ele au rezistență la β-lactame (Rohrer și Berger-Bachi 2003; Pratt 2008; Sauvage et al. 2008). De exemplu, tulpinile de S.aureus rezistente la meticilină exprimă o transpeptidază, PBP2A care cuplează doar substraturi ramificate cu pentaglicină.

Proteinele de suprafață

S.aureus colonizează pielea și suprafețe mucoase . Se infiltrează ocazional în epiteliu și provoacă infecții extrem de serioase. Abilitatea de a adera la țesuturi este un pas crucial în colonizarea gazdei de către S.aureus, proces în care sunt implicați și o serie de factori. Aceștia includ acizi teichoici dar și proteine de suprafață care recunosc componente matrixului extracelular ale gazdei, precum fibrinogen, fibronectină și elastină (Clarke și Foster 2006). Unele dintre aceste proteine, denumite adezine, sunt atașate prin interacții ionice necovalente de peptidoglicani sau acizi teicoici, dar multe sunt atașate covalent de scheletele peptidic în apropiere de straturile de peptidoglicani ( Dramsi et al. 2008; Sjoquist et al. 1972; Fischetti et al. 1990).

Proteinele destinate pentru interacția covalentă la suprafața celulei, conțin o secvență semnal amino-teminală ce permite secreția prin membrana citoplasmatică și un motiv pentapeptid carboxil terminal, cunoscut ca LPXTG (DeDent 2008) . Enzimele denumite sortaze catalizează reacția de transpeptidare dintre aceste motive și resturile de glicină din scheletul peptidic al pecursorilor peptidoglicanici. Se crede că reacția de transpeptidare are loc în 2 etape: în primul rând, la nivelul situsului activ al sortazei are loc atacul nucleofilic asupra legăturii pepridice dintre un rest de treonina și glicină al motivului proteinei pentru a produce o legătură intermediară covalentă în care porțiunea amino-terminală a proteinei-substrat este atașată la enzimă și o etapă secundă în care restul glicinic al scheletului peptidic intră în situsul activ și are loc un atac nucleofilic între partea amino-terminală a glicinei și intermediarul acil-enzimă, regenerând enzima și formând o nouă legătură triglicerid-amidă ce leagă proteina de peptidoglicanul precursor. Complexul peptidoglican precursor-proteină este apoi incorporat în peptidoglican (Dramsi et al. 2008; Marraffini et al. 2006 ).

Acizii teichoici

Acizii teichoici sunt polimeri de suprafață celulară anionici găsiți la un spectru larg de organisme Gram-pozitive, inclusiv S. aureus. Există 2 tipuri de acizi teichoici: acizi teichoici ai peretelui, cuplați cu peptidoglicani și acizi lipoteichoici, ancorați de membrana celulară.

Acizii teichoici de perete sunt atașați printr-o legătură fosfodiesterică de C6 hidroxil al restului de acidului muramic din structura peptidoglicanului. Deși variațiile strucutrale sunt considerabile, cel mai comun acid teicoic de perete este compus din unități dizaharidice unite de lanțuri de poliribitol fosfat sau poliglicerol fosfat, repetate de până la 60 de ori. Aceștia se extind perpendicular prin peptidoglicani , formând ceea e e numit stratul pufos.

Acizii lipoteicoici sunt similari cu acizii teichoici de perete, în sensul că aceștia sunt compuși din polimeri de poliglicerol fosfat și D-alanină sau un rest glucidic.

Cu toate acestea, ei sunt diferiți. De exemplu, aceștia conțin unități de glicerol fosfat de chiralitate opusă față de cele din acizii teicoici de perete. De asemenea, în schimbul atașării de peptidoglicani, sunt atsașați de glicolipidele membranare și de obicei au mai puține unități de glicerol fosfat. De asemenea, se extind prin stratul de peptidoglicani.

Împreună, acizii teicoici formează ceea ce a fost denumit ca un schimb continuu de anioni ce au originea în suprafața celulară a organismelor Gram-pozitive, dar se extind și sub bariera peptidoglicanică. Importanța acesteia este subliniată prin faptul că bacteriile Gram-pozitive ce nu au acizi teicoici de perete (fie că nu conțin clustere , fie pentru că sunt crescute pe medii cu surse limitate de fosfat) produc alte tipuri de polimeri polianionici în care sursele de ioni negativi sunt reprezentate de carboxilați sau grupări sulfat.

Desi nici un acid teichoic nu este esențial, degradând căile de biosinteză a unuia dintre acești polimeri , determină organismele ce au diviziunea celulară deficitară sau defecte morfologice , precum si altele, să aibă mai puține defecte de creștere. De asemenea, este imposibil să elminiam ambele căi deoarece genele implicate sunt letale (Oku et al. 2009; Morath et al. 2005).

Acizii teichoici reprezintă un procent semnificativ din masa peretelui celular, având multiple funcții, variate și dependente de specie.

Deoarece sunt anionici, aceștia leagă cationi, având rol in homeostazia cationică (Marquis et al. 1976). Legăturile dintre metalele cationice și acizii teichoici de perete influențează, de asemenea, rigiditatea și porozitatea peretelui celular. Densitatea de sarcini negative din acizii teicoici de perete poate fi reglată prin modificări ce induc sarcini pozitive în scheletul polimerului, aceste modificări având efect asupra interacțiilor bacteriei cu alte celule sau alte molecule.

De exemplu, în S. aureus, o dalain-transferază cuplează resturi de D-alanină cu grupări hidroxil libere din scheletul poliribitol fosfat. Tulpini de S. aureus ce nu conțin esteri de D-alanină sunt mai susceptibili la acțiunea peptidelor cationice antimicrobiene și la liza enzimatică produsă de neutrofilele gazdă (Collins et al. 2002; Peschel et al. 1999; Peschel et al. 2000). De asemenea, aceste reduc autoliza, denotând rolul funcțional al acizilor teicoici de perete în activarea enzimelor hidrolitice implicate in sinteza și degradarea peretelui celular.