Imunofluorescenta

CUPRINS

PARTEA I – Imunofluorescența – principii și implicații în diagnosticul dermatologic

I.1. Introducere

I.1.1. Importanța diagnosticului dermatologic de certitudine

I.1.2. Imunofluorescența – principiile metodei

I.1.3. Poziționarea imunofluorescenței în contextul diagnosticului dermatologic

I.2. Structuri supramoleculare în pielea umană

I.2.1. Introducere

I.2.2. Structuri de adeziune intraepidermice

I.2.3. Joncțiunea dermo-epidermică

I.3. Fiziopatologia și diagnosticul bolilor buloase autoimune

I.3.1. Introducere

I.3.2. Clasificare

I.3.3. Fiziopatologia și diagnosticul pemfigusurilor

I.3.4. Fiziopatologia și diagnosticul bolilor buloase autoimune subepidermice

I.4. Fiziopatologia și diagnosticul bolilor autoimune de țesut conjunctiv

I.4.1. Introducere

I.4.2. Lupus eritematos

PARTEA A II-A. Contributia personală

II.1. Definirea problemei

II.2. Scopul studiului

II.3. Descrierea tehnicilor de laborator

II.3.1. Descrierea microscopiei de fluorescentă

II.3.2.Descrierea tehnicilor de imunofluorescență

II.3.3. Interpretarea fluorescentei

II.3.4. Aspecte tehnice particulare

II.4. Descrierea modalităților practice de interpretare a imaginilor de imunofluorescență – prezentarea modelelor de fluorescentă și implicațiile practice

II.4.1. Imunofluorescență în bolile buloase autoimune

II.4.2. Imunofluorescența în bolile autoimune de țesut conjunctiv(lupus eritematos)

II.5. Studiu retrospectiv asupra aplicațiilor imunofluorescenței în diagnostic

II.5.1. Descriere generală

II.5.2. Obiective

II.5.3. Material și metodă

II.5.4. Rezultate

II.5.5. Discuții

II.6. Concluzii

BIBLIOGRAFIE

PARTEA I – Imunofluorescența – principii și implicații în diagnosticul dermatologic

I.1. Introducere

Spectrul afecțiunilor dermatologice este extrem de larg și include descrierea a peste 2000 de boli cutanate de severitate variabila [], unele dintre acestea fiind grevate de potențial letal in condițiile nediagnosticării corecte sau/si tratamentului inadecvat.

Unele dintre aceste afecțiuni cutanate pot fi diagnosticate doar pe baza aspectului clinic (de exemplu psoriazisul vulgar) insă exista și o categorie importantă de pacienți la care este necesară efectuarea unor analize de laborator detaliate atât pentru confirmarea diagnosticului cat și ca element de conducere a terapiei.

I.1.1. Importanța diagnosticului dermatologic de certitudine

În cazul majorității afecțiunilor cutanate nu se poate demonstra atât o cauză identificat cât și unică pentru o boală precizată; de asemenea, multe dintre cauzele recunoscute pot avea un rol demonstrat în mai multe tipuri de maladii cutanate []. Definirea actuală a majorității afecțiunilor cutanate se bazează pe o constelație de elemente clinice, histopatologice și, în anumite situații, imunopatologice sau genetice.

Obținerea unui diagnostic de certitudine este esențială pentru practica medicală actuală având corelații evidente cu alegerea terapiei adecvate și stabilirea prognosticului, dar are un rol important și in studiile epidemiologice sau în cercetarea terapeutică [].

Nu in ultimul rând, in epoca modernă este foarte actuală problema construirii unor sisteme de codificare diagnostică, așa-numitele „diagnostic related groups” (DRG) [] utilizate pe scară largă pentru evaluarea costurilor asociate diverselor maladii in scopul finanțării prin sistemele de asigurări de sănătate. Este evident că la baza construirii unor baze de date valide se situează maxima precizie și corectitudine a diagnosticului de boală.

I.1.2. Imunofluorescența – principiile metodei

Definiție

Imunohistochimia este o tehnică de evidențiere a prezenței unor macromolecule specifice la nivelul țesuturilor, pornind de la reacția specifică antigen-anticorp se bazează pe cuplarea anticorpilor cu substanțe ce permit vizualizarea la examenul microscopic. Imunofluorescența reprezintă o formă de imunohistochimie in care se utilizează anticorpi marcați prin cuplare cu un compus fluorescent.

Scurt istoric

La momentul actual imunohistochimia este considerată o metodă calitativă extrem de valoroasă alături de anatomia patologică convențională, permițând o analiză structurală și topografică și o analiză fenotipică.

In dermatologie aplicațiile metodei au pornit de la dezvoltarea tehnicii de imunofluorescență de către A. Coons (1941), o descoperire ce a făcut posibilă examinarea microscopică a antigenelor și anticorpilor pe secțiunile tisulare []. Ulterior, depozite granulate de IgG și C3 au fost descrise de-a lungul joncțiunii dermo-epidermice în lupusul entematos. In 1964 Beutner și Jordan au utilizat această tehnică nou introdusă pentru a demonstra prezența anticorpilor antikeratinocitari in serul pacientilor cu pemfigus, prin imunofluorescenta indirecta, iar Jordan si colaboratorii au efectuat in anul 1971 imunofluorescenta directa pe piele lezionala si perilezionala pentru evidentierea depozitelor de IgG in spatiile intracelulare ale epidermului []. Inițial atenția a fost îndreptată în direcția purificării serurilor utilizate, căutării compușilor de marcare ideali, îmbunătățirii secționării la criostat, obținerii unor imagini cât mai precise5. În anii ce au urmat, s-au introdus noi metode de îmbunătățire a sensibilității și specificității tehnicii prin utilizarea unor substraturi mai noi sau modificate (de exemplu salt-spHt skin – tehnica pe piele clivată).

Ulterior au fost dezvoltate tehnici noi de investigare: imunoperoxidare, imunoelectro-nomicroscopie, analiza western-blot și ELISA (enzyme linked immunoabsorbent assay); cu toate acestea imunofluorescența este în continuare utilizată pe scară largă și are aplicații importante în diferite categorii de afecțiuni cutanate. De la introducerea sa în dermatologie, imunofluorescența a contribuit într-o măsură foarte mare la dezvoltarea conceptelor și cunoștințelor legate de bolile autoimune buloase și de țesut conjunctiv, în același timp devenind un instrument diagnostic indispensabil în practica medicală curentă [].

Principii

Imunohistochimia se bazează pe capacitatea de răspuns imunogen a organismului ce produce proteine din grupul globulinelor – anticorpi (imunoglobuline/Ig) ce reacționează specific și se leagă de antigene – macromolecule străine sau nerecunoscute ca self (proprii organismului). Antigenul reprezintă o moleculă proteică la nivelul căreia se descrie epitopul – o secvență recunoscută specific pe principiul complementarității de către regiunile determinante ale complementarității ale anticorpului care formează paratopul. Anticorpii sunt glicoproteine ce prezintă regiuni variabile ce formează situsul de recunoaștere a antigenului și regiuni constante ce pot funcționa ca epitopi pentru alți anticorpi.

În condițiile în care imunoglobulinele marcate se cuplează exclusiv cu antigenul țintă, aceste complexe permit localizarea unor antigene specifice în probele de țesuturi supuse examinării și vizualizarea acestora prin microscopie optică sau electronică, după incubarea țesutului cu soluția ce conține anticorpii marcați.

Folosirea anticorpilor marcați s-a dovedit extrem de utilă în detectarea unor proteine specifice sau a altor macromolecule de tip acizi nucleici sau polizaharide.

Anticorpii utilizați în scop de cercetare și diagnostic se obțin prin injectarea unui antigen într-un animal de laborator (șoarece, șobolan, iepure, etc). Acești anticorpi sunt cuplați cu o moleculă fluorescentă (fluorofor) în cazul imunofluorescenței și purificați prin cromatografie.

Anticorpii astfel obținuți pot fi policlonali (serul acestor animale va conține o serie de anticorpi, ce recunosc diferiti epitopi ai aceluiași antigen) sau monoclonali (obținuți prin fuziunea limfocitelor cu o linie de celule canceroase – hibridom care secretă anticorpi in vitro prin dilutii clonale se vor genera clone celulare care produc același tip de anticorpi).

Tipuri de imunofluorescență

Directă

Imunofluorescența directă este cea mai simplă formă de imunohistochimie într-o singură treaptă []. Principiul metodei constă în punerea în contact antigenului necunoscut cu anticorpi marcați fluorescent [8].

Indirectă

Imunofluorescența indirectă este o tehnică de detectare a anticorpilor circulanți în ser [8]. Principiul metodei constă în aducerea în contact a serului pacientului cu un fragment tisular expunând antigenul țintă la anticorpii investigați [8]. Anticorpii fixați tisular sunt apoi detectați prin incubare cu anticorpi secundari (antiimunoglobuline) marcați fluorescent [8].

I.1.3. Poziționarea imunofluorescenței în contextul diagnosticului dermatologic

Tehnicile de imunofluorescența pot demonstra anomalii imunologice cutanate cu implicații diagnostice. Detectarea acestor anomalii s-a demonstrat a fi cea mai valoroasă în evaluarea maladiilor buloase autoimune și a bolilor autoimune de țesut conjunctiv.

Imunofluorescența și tehnicile de imunoperoxidare utilizând anticorpi monospecifici sau monoclonali pot fi de asemenea folosite în stabilirea diagnosticului limfoamelor cutanate cu celule T [] sau în diferențierea proliferărilor tumorale prin utilizarea anticorpilor specifici împotriva diferitelor componente sau produse celulare (keratina, vimentina, filamente gliale) [].

Mappingul antigenic prin imunofluorescența a devenit util în elucidarea structurii membranei bazale și a joncțiunii dermo-epidermice cu implicații în diagnosticul epidermolizelor buloase. Această tehnică poate fi utilizată chiar în diagnosticul antenatal []. Imunfluorescența directă și indirectă utilizând preparate salt-split skin se pot efectua pentru a distinge entități patologice dificil de diferențiat, respectiv pemfigoidul bulos și epidermoliza buloasă dobândită [].

Imunofluorescența reprezintă o metodă diagnostică importantă în cadrul investigațiilor paraclinice utilizate în dermatologie, cu aplicații în patologii cutanate diverse [].

I.2. Structuri supramoleculare în pielea umană

I.2.1. Introducere

Pielea reprezintă o structură complexă ce a fost descrisă prin studii imunologice, biochimice, biofizice și de biologie moleculară []. Se compune din două straturi distincte: epidermul, epiteliu pavimentos pluristratificat (derivat din ectoderm) și dermul, strat de țesut conjunctiv (derivat din mezoderm) constituit din substanță fundamentală, fibre de colagen și elastice și celule, la nivelul căruia se regăsesc și rețelele vasculare și nervoase și anexele pielii. Anexele pielii sunt derivate ale ectodermului și sunt reprezentate de glandele sudoripare apocrine și ecrine, glandele sebacee, părul și unghiile. Sub derm se localizează hipodermul (țesutul subcutanat), constituit din adipocite.

In cele ce urmează se vor detalia elementele de interes din punctul de vedere al obiectivelor acestei lucrări – descrierea structurilor la nivelul cărora se identifică procese patologice evidențiabile prin imunofluorescența.

I.2.2. Structuri de adeziune intraepidermice

Keratinocitele reprezintă aproximativ 80% din populația celulară a epidermului. Conțin filamente intermediare de keratină în citoplasmă și formează desmozomi sau joncțiuni desmozomale modificate cu structurile adiacente. Pe măsura diferențierii în celule cornoase, keratinocitele se dispun dinspre profunzime spre suprafață în mai multe straturi: strat bazal, spinos, granulos, cornos. Termenul de strat malpighian este folosit pentru definirea straturilor inferioare (bazal, spinos, granulos). Un strat suplimentar – stratul lucidum poate fi identificat în zonele cu strat granulos și cornos gros și formează porțiunea inferioară a stratului cornos, în special la nivel palmo-plantar. Caracteristicile fiecărui strat de celule epidermice reflectă caracteristicile mitotice și sintetice ale keratinocitelor.

Keratinocitele stratului bazal sunt interconectate între ele și de celulele stratului spinos prin desmozomi și de lamina bazală prin hemidesmozomi. Desmozomii realizează legăturile interkeratinocitare în toate straturile epidermului, menținându-se până la nivelul sice și celule, la nivelul căruia se regăsesc și rețelele vasculare și nervoase și anexele pielii. Anexele pielii sunt derivate ale ectodermului și sunt reprezentate de glandele sudoripare apocrine și ecrine, glandele sebacee, părul și unghiile. Sub derm se localizează hipodermul (țesutul subcutanat), constituit din adipocite.

In cele ce urmează se vor detalia elementele de interes din punctul de vedere al obiectivelor acestei lucrări – descrierea structurilor la nivelul cărora se identifică procese patologice evidențiabile prin imunofluorescența.

I.2.2. Structuri de adeziune intraepidermice

Keratinocitele reprezintă aproximativ 80% din populația celulară a epidermului. Conțin filamente intermediare de keratină în citoplasmă și formează desmozomi sau joncțiuni desmozomale modificate cu structurile adiacente. Pe măsura diferențierii în celule cornoase, keratinocitele se dispun dinspre profunzime spre suprafață în mai multe straturi: strat bazal, spinos, granulos, cornos. Termenul de strat malpighian este folosit pentru definirea straturilor inferioare (bazal, spinos, granulos). Un strat suplimentar – stratul lucidum poate fi identificat în zonele cu strat granulos și cornos gros și formează porțiunea inferioară a stratului cornos, în special la nivel palmo-plantar. Caracteristicile fiecărui strat de celule epidermice reflectă caracteristicile mitotice și sintetice ale keratinocitelor.

Keratinocitele stratului bazal sunt interconectate între ele și de celulele stratului spinos prin desmozomi și de lamina bazală prin hemidesmozomi. Desmozomii realizează legăturile interkeratinocitare în toate straturile epidermului, menținându-se până la nivelul stratului cornos, unde sunt prezenți în zonele inferioare, dar dispar anterior descuamării spre porțiunile superficiale în urma degradării proteolitice, mecanism implicat în fenomenul de descuamare [14].

Pe baza studiilor morfologice și biochimice se descriu două tipuri majore de structuri ce realizează adeziunea interkeratinocitară, mediate predominant de moleculele de adeziune celulară din familia caderinelor, localizate la nivelul celor două structuri specializate de adeziune intercelulară: joncțiunile aderens și desmozomii [15], [16].

I.2.2.1. Joncțiunile aderens

Acestea mediază adeziunea intercelulară rapidă dar de rezistență scăzută []; ancorează microfilamente de actină și conțin E-caderine clasice în porțiunea transmembranară și α catenine, I catenine și plakoglobină în porțiunea intracitoplasmatică [15] (Figura 2.1). Caderina interacționeză direct prin porțiunea intracitoplasmatică cu p catenina sau plakoglobina ce la rândul lor interacționează cu a catenina ce ancorează actina [15]. Interacțiunea dintre E-caderine și catenine este esențială pentru menținerea adeziunii normale interkeratinocitare [].

Figura 2.1. Jonctiunea aderens

I.2.2.2. Desmozomii

Aceștia mediază adeziunea intercelulară cu rezistență crescută [15]. Desmozomii reprezintă joncțiunile intercelulare ce realizează coeziunea între keratinocitele învecinate, cu rolul cel mai important în adeziunea interkeratinocitară. Sunt structuri de dimensiuni mici, electronodense, ce leagă filamentele de keratină intracitoplasmatice de membrana celulară și de keratinocitele învecinate.

Placa desmozomală este constituită din din proteine nonglicozilate: plakoglobina, desmoplakina 1 și 2, plakofilina [16]. Desmoplakinele 1 și 2 aparțin familiei plakinelor, proteine ale filamentelor intermediare, care includ de asemenea antigenul pemfigoidului bulos (BP230), plectina, envoplectina și periplakina [16]. Aceste proteine joacă un rol important in ancoraa-a citoschcletului la nivelul desmozomilor.

Interacțiunea dintre cele două celule conectate se realizează prin intermediul glicoproteinelor transmembranare ce aparțin familiei caderinelor și includ desmogleinele l și 3 și desmocolinele 1 și 2 [14]. Prezintă domenii intracitoplasmatice, transmembranare și extracelulare (Figura 2.2). Domeniul intracelular al acestor proteine se insera în placa desmozomală realizând coeziunea cu citoscheletul.

Figura 2.2. Desmozomul

Desmogleinele conțin patru caderine repetitive în domeniul extracelular și prezintă cel puțin trei izoforme (desmogleine 1-3) [16]. Exprimarea desmogleinelor 1 și 3 este limitată la nivelul epiteliilor scuamoase stratificate [15]. Desmogleina 3 este exprimată doar în stratul bazal și suprabazal al epidermului, pc când desmogleina 3 se regăsește în tot epidermul, predominant în straturile superioare []. La nivelul mucoaselor, desmogleina 3 este intens exprimată, pe când desmogleina 1 este în cantitate scăzută []. Desmogleina 2 se regăsește în toate țesuturile ce conțin desmozomi (inclusiv epitelii simple și miocard) [15].

Desmocolincle se prezintă ca trei izoforme (desmocoline 1-3). Desmozomii conțin perechi desmogleină-desmocolină, dar mecanismul molecular de interacțiune este necunoscut [15].

Structura anormală a desmozomilor sau disoluția acestora determină apariția fenomenului de acanloliză, întâlnit în boala Hailey-Hailey (anomalii desmozomale ereditare) sau in afecțiuni autoimune de tip pemfigus în care se produc anticorpi împotriva unor proteine din structura desmozomilor [14].

I.2.3. Joncțiunea dermo-epidermică

Reprezintă interfața dintre epiderm și derm, este ondulată, ceea ce crește stabilitatea legăturii dermo-epidermice și mărește suprafața de contact dintre aceste două structuri. Reprezintă un suport al epidermului, determină polaritatea creșterii, direcția de organizare a citoscheletului în stratul bazal, inițiază semnale de creștere și are rol de barieră semipermeabilă [14].

Poate fi divizată în patru structuri supramoleculare, distribuite supero-inferior astfel: complexe hemidesmozomi-filamente de ancorare, lamina lucida, membrana bazală propriu-zisă (lamina densa) și sublamina densa [] (Figura 2.3). Aceste subdiviziuni reprezintă ariile de fragilitate ce pot determina clivajul dermo-epidermic în condiții de boli genetice, procese autoimune, traumatisme (1).

Figura 2.3. Joncțiunea dermo-epidermică

1. Complexele hemidesmozomi – filamente de ancorare atașează keratinocitele bazale de membrana bazală.

Hemidesmozomii prezintă componente citoplasmatice, membranare și extracelulare. Placa de atașare intracitoplasmatică reprezintă structura de care se atașează tonofilamentele intracelulare; la nivelul său se descriu antigenul pemfigoidului bulos 230 (BP230/BPAg1) și plectina [14]. BPAg 1 și plectina sunt proteine din familia plakinelor, cu un rol important în realizarea adeziunii între filamentele intermediare de keratină și porțiunea intracitoplasmatică a hemidesmozomilor [15].

Porțiunea transmembranară a hemidesmozomilor este constituită din antigenul pemfigoidului bulos 2 (BP180/ BP Ag 2) și α6β4 integrina [14]. BP Ag2 s-a demonstrat a fi colagen de tip XVII și are un domeniu intracelular localizat la nivelul plăcii hemidesmozomale, dar și o zonă extracelulară încorporată în structura de proximitate – lamina lucida [14]. Domeniul citoplasmatic al BPAg2 se asociază cu BPAg1, subunitatea P4 integrina și plectina []. Integrinele sunt receptori transmembranari heterodimerici ce promovează interacțiunile intercelulare sau între celule și matricea extracelulară []. Partea citoplasmatică a subunității β4 conține secvențe ce par a fi necesare pentru asamblarea hemidesmozomilor – porțiunea proximală membranei se asociază cu plectina, pe când capătul carboxiterminal leagă BPAg2 [15]. Domeniul proximal extracelular al subunității α6 integrina leagă BPAg2 [15].

Componentele extracelulare ale hemidesmozomilor sunt placa densă subbazală și filamentele de ancorare. Acestea au origine în hemidesmozomi, se insera în lamina densa, traversând lamina lucida și conțin proteine de tip laminină 5 [14].

Importanța acestor structuri și molecule este evidentă în cazurile în care acestea sunt alterate sau absente – pemfigoid bulos, epidermoliza buloasă joncțională (absența sau hipoplazia congenitală a hemidesmozomilor).

2. Lamina lucida este zona ce se găsește imediat sub celulele bazale, este electrontransparentă și conține componența extracelulară a hemidesmozomilor. La nivelul ei se găsesc proteine necolagene – laminine, entactine, fibronectine [14], ce realizează coeziunea între celulele epidermice și lamina densa. Lamina lucida este zona cea mai fragilă a joncțiunii dermo-epidermice. Studii specializate de microscopie electronică de transmisie sugerează ca lamina lucida ar reprezenta de fapt un artefact de deshidratare a țesuturilor [].

3. Lamina densa (lamina bazală) este o zonă electronodensă constituită din filamente foarte fine. Conțin o moleculă procolagen-like de tip colagen triplu helix ce interacționează cu glicoproteine și este clasificat ca și colagen tip IV ce asigură suportul structural și flexibilitatea zonei [14]. Alături de acesta, în anumite zone se întâlnește colagen tipV, proteoglicani, laminină, antigenul epidermolizei buloase dobândite – colagen tip VII [14].

4. Sublamina densa (lamina reticulară) reprezintă porțiunea cea mai profundă a joncțiunii dermo-epidermice și este constituită din fibrilele de ancorare, plăcile de ancorare și proteinele filamentoase ale dermului papilar – colagen tip I, III, V, VI și procolagen (tip I, III) [14, 15].

Fibrilele de ancorare sunt structuri fibrilare, flexibile, cu origine în lamina densa și extensie către derm unde se pot insera în structuri asemănătoare biochimic laminei bazale (plăcile de ancorare) sau se reinseră în lamina densa, realizând bucle. Sunt constituite din colagen tip VII, sintetizat de keratinocite, ale cărui anomalii cantitative și calitative sunt incriminate în patogenia epidermolizei buloase distrofice recesive sau dominante [15]. La nivelul sublaminei densa se descriu și fibre elastice ce contribuie la întărirea coeziunii epiderm-derm.

I.3. Fiziopatologia și diagnosticul bolilor buloase autoimune

I.3.1. Introducere

În ultimele decenii au fost efectuate progrese importante în ceea ce privește cunoașterea, înțelegerea și descrierea maladiilor buloase autoimune. Aceste afecțiuni, deși rare, au un impact dramatic asupra stării de sănătate și calității vieții pacientului. Identificarea antigenelor țintă specifice în maladiile buloase autoimune a determinat descoperirea multor componente de adeziune intercelulară sau ale joncțiunii dermo-epidermice. De asemenea s-a evidențiat faptul că mutațiile acestor proteine stau la baza apariției unor afecțiuni buloase genetice.

Cunoșterea bazelor imunologice ale maladiilor buloase autoimune s-a îmbunătățit semnificativ și astfel au putut fi descrise și definite, pe lângă pemfigusuri, o varietate de entități clinico-patologice [], cum ar fi pemfigoidul bulos [], pemfigoidul cicatriceal [], dermatita cu IgA linear, pemfigusul cu IgA [], pemfigusul paraneoplazic []. Aceste afecțiuni se clasifică predominant pe baza elementelor clinice, histologice și imunopatologice dar utilizarea tehnicilor de laborator mai recente, cum ar fi imunoblottingul sau imuno-electronomicroscopia, au ajutat la definirea acestor afecțiuni prin expunerea antigenelor țintă și a epitopilor specifici.

Afecțiunile imunobuloase sunt caracterizate din punct de vedere patogenic de prezența anticorpilor îndreptați împotriva elementelor de adeziune interkeratinocitară epidermică sau componentelor joncțiunii dermoepidermice. Cele mai importante modalități de investigare a acestor maladii reprezintă examenul histopatologic și imunofluorescența directă și indirectă, deși tehnicile de cercetare avansată (imunoblotting, imunoelectronomicroscopie) pot rafina diagnosticul [].

I.3.2. Clasificare

In funcție de localizarea clivajului, evidențiată prin examinare histopatologică, maladiile imunobuloase se împart în două mari categorii: afecțiuni cu bulă localizată intraepidermic, și respectiv afecțiuni cu bulă localizată subepidermic. În cadrul acestora se descriu specific mai multe tipuri de boli [, ] (Tabelul 3.1)

Tabelul 3.1. Clasificarea bolilor buloase autoimune

I.3.3. Fiziopatologia și diagnosticul pemfigusurilor

Termenul de pemfigus derivă din grecescul „pemphix", ce în traducere înseamnă bulă și descrie un grup de afecțiuni buloase cutanate cronice în care este caracteristică apariția autoanticorpilor îndreptați împotriva structurilor de adeziune interkeratinocitară intraepidermică, rezultând pierderea acestei adeziuni prin procesul denumit acantoliză []. Deși denumirea de pemfigus se referea în trecut la majoritatea erupțiilor buloase cutanate, pe măsura trecerii timpului testele diagnostice au evoluat și afecțiunile buloase au fost reclasificate []. La ora actuală pemfigusurile sunt recunoscute ca entități clinico-patologice autoimune cutanate sau mucoase cu potențial letal, caracterizate de apariția de bule sau eroziuni la nivel cutaneo-mucos și, din punct de vedere histologic, de prezența acantolizei [33].

I.3.3.1. Fiziopatologie

A fost studiată ipoteza predeterminării genetice a diferitelor forme de pemfigus []. Se pare că exprimarea diferitelor alele HLA ar avea o influență asupra epidemiologiei pemfigusurilor, existând o asociere determinată a HLA cu antigenele DR4, DR14, DQ1 și DQ3 [30]. Studiile au identificat faptul ca rudele sănătoase ale pacienților cu pemfigus vulgar purtătoare de haplotipuri DR4/DQ8 și DR14/DQ5 produc o cantitate scăzută de anticorpi specifici pemfigusului vulgar []. Alelele HLA de clasa a 2-a DRβ1*0402 și DRβ1*1401 sunt de asemenea prevalente în pemfigusul postmedicamentos []. Varianta endemică a pemfigusului foliaceu este caracterizată de prevalenta a două alele HLA clasa a Il-a, respectiv DRβ1*04 si DRβ1*0101 [33]. Cu toate acestea, apariția formelor familiale de pemfigus sau transmiterea la copii este extrem de rară [35]. Tehnicile de investigare utilizate au permis descrierea tipurilor specifice de boală in cadrul pemfigusurilor și identificarea a multe dintre antigenele țintă [30, 31] (Tabelul 3.2).

Tabelul 3.2. Imunologia pemfigusurilor

Pemfigusurile se clasifică în funcție de localizarea histopatologică a bulei la nivelul epidermului. În formele superficiale (foliaceu, eritematos, fogo selvagem) clivajul apare la nivel superior în epiderm, imediat sub stratul cornos, pe când în formele profunde (vulgar, vegetant) bula se situează profund, deasupra stratului bazal epidermic.

Marca pemfigusului reprezintă prezența autoanticorpilor de tip IgG îndreptați împotriva; structurilor de adeziune interkeratinocitară, cu apariția acantolizei. Acești autoanticorpi joacă un rol major în detașarea keratinocitară și apariția bulelor. Nou-născuții mamelor cu pemfigus vulgar pot prezenta erupție buloasă tranzitorie din cauza transferului de Ig G matern în timpul vieții intrauterine []. Pe măsura catabolizării acestor anticorpi de cãtre copil, leziunile se remit. De asemenea, s-a demonstrat faptul ca fracțiunile IgG ale pacienților cu pemfigus pot determina apariția de bule în absența complemenuilui sau a celulelor inflamatorii în culturi celulare de piele []. Mai mult decât atât, transferul pasiv de IgG de la pacient la șoareci determină apariția de bule cu elemente histologice caracteristice [].

Se cunoaște faptul că cele mai importante structuri de adeziune interkeratinocitară epidermică sunt desmozomii. Studiile ultrastructurale ale leziunilor la pacienții cu pemfigus au demonstrat că disoluția desmozomilor determină apariția bulelor []. Autoanticorpii patogenici în pemfigusuri sunt îndreptați împotriva unor antigene țintă ce aparțin acestor structuri. Antigenele specifice au fost descrise prin studii imunoelectronomicroscopice, de imunoprecipitare și imunoblotting, pentru fiecare tip de pemfigus.

Principalele antigene țintă în pemfigusuri sunt desmogleinele, glicoproteine transmembranare din clasa caderinelor. Desmogleina 1 este exprimată primar în straturile superficiale ale epidermului și redus în mucoase pe când desmogleina 3 este exprimată intens la nivelul mucoaselor și redus în epiderm [23]; mucoasa orală exprimă cantități mari de desmogleina 3 și cantități mici de desmogleina 1, pe când exprimarea ambelor antigene este mare la nivelul feței, scalpului și toracelui superior și redusă la nivelul membrelor inferioare []. În zonele în care ambele desmogleine sunt exprimate, s-a sugerat faptul că o moleculă este capabila să compenseze pierderea funcției celeilalte [] și distribuția leziunilor în diversele forme de pemfigus este corelată cu distribuția diferitelor izoforme ale acestei proteine. Pacienții cu pemfigus vulgar ce prezintă doar anticorpi antidesmogleină 3 dezvoltă de regulă doar leziuni la nivelul mucoaselor, pe când pacienții ce dezvoltă autoanticorpi împotriva ambelor tipuri de desmogleine prezintă în cele mai multe cazuri erupție cutanată și mucoasă generalizată []. Patogenicitatea autoanticorpilor antidesmogleină este demonstrată de multiple studii [37, 38, 39]. De asemenea, majoritatea cercetărilor relevă existența unei corelații directe între activitatea bolii și titrul anticorpilor circulanți, prezenți la circa 80% din pacienții cu boala activă [33, ].

Cu toate acestea se descriu și cazuri în care nu se regăsește o corelație între profilul autoanticorpilor și fenotipul clinic, indicând faptul că anticorpii antidesmogleine nu sunt singurii patogenici în pemfigusuri []. Investigațiile serologice și imunoelectronomicroscopice au demonstrat faptul că anticorpii patogenici în pemfigusul vulgar se pot lega și de alte antigene țintă din structura desmozomilor, respectiv desmocolinele [33]. A fost raportată și prezența unor antigene non-caderinice: desmoplakina (identificată ca antigen țintă în formele severe de pemfigus vulgar alături de desmogleina), receptori pentru acetilcolină sau molecule de tip anexină [30]. Relevanța patogenică a acestor antigene țintă în pemfigusuri este încă în curs de elucidare.

Prezentarea clinică a bolii pare să depindă de subclasa anticorpilor produși [33]. În pemfigusul vulgar și foliaceu există o producție policlonală de autoanticorpi și majoritatea celor circulanți sunt din subclasa IgG4 [33]. Pacienții în remisiune au în principal IgG1, la fel ca și rudele sănătoase ale pacienților cu pemfigus vulgar ce au de asemenea cantități scăzute de IgG1 [33]. Prin urmare anticorpii IgG1 antidesmogleină 3 sunt prezenți în măsură egală la persoane ce prezintă boala sau sunt sănătoase, pe când IgG4 sunt prezenți aproape exclusiv la pacienți cu boală activă [33]. Se pare că un factor trigger încă neidentificat ar determina producția de IgG1 nonpatogenice împotriva desmogleinei 3, pe când exprimarea clinică a bolii depinde de prezența unei susceptibilități genetice necesară pentru producerea IgG4 patogenice [33]. Nu se cunoaște dacă activitatea patogenică diferită a acestor anticorpi apare din cauza funcțiilor efectoare diferite sau faptului ca subclasele sunt îndreptate împotriva unor epitopi diferiți de pe suprafața antigenelor țintă [45].

Se cunosc puține date despre cauza apariției acestor anticorpi. La anumiți pacienți se poate identifica o cauză externă, spre exemplu medicamente conținând gruparea sulfhidril sau chiar anumite alimente (usturoi) [33]. Medicamentele incriminate în apariția pemfigusului sunt: penicilamina, inhibitori de enzimă de angiconversie (enalapril, captopril, fosinopril), antiinflamatoarea nesteroidiene, interferon, rifampicina, nifedipina, propranololul, interleukina, levodopa, fenobarbitalul []. Este posibil ca asocierea cu anumite HLA să fie factorul predispozant determinant în dezvoltarea anticorpilor patogenici [33].

Mecanismul exact de inducere a acantolizei de către acești anticorpi este necunoscut, fiind sugerate mai multe ipoteze [33]: Apariția complexelor antigen-anticorp ar determina inhibiția directă a funcției de adeziune a desmogleinelor prin mecanismul de împiedicare sferică [], sau complexele ar provoca apariția unui semnal intracitoplasmatic de activare a plasminogenului, determinând producerea de plasmină activă ce induce disocierea celulară []; este posibil de asemenea ca adeziunea să fie întreruptă prin intermediul plakoglobinei sau a altor proteine intracitoplasmatice []; autoanticorpii par a juca, pe de altă parte, un rol în reorganizarea citoscheletului keratinocitar determinând micșorarea celulelor și colapsul citoscheletului, eveniment ce precede acantoliza vizibilă [].

Patogenia pemfigusului paraneoplazic este strâns legată de neoplasmul subiacent [33]. Printr-un mecanism necunoscut tumora induce apariția autoanticorpilor utilizând o cale imunologică neelucidată. Apare astfel o producție de autoanticorpi de tip IgG împotriva mai multor tipuri de antigene, în principal desmogleine, dar și împotriva tuturor proteinelor ce aparțin familiei plakinelor [33]. În pemfigusul paraneoplazic se descrie apariția unor leziuni orale extensive și refractare, precum și a unor erupții cutanate polimorfe diferite de formele clasice de pemfigus.

Infiltratul inflamator în pemfigusuri este sărac, ceea ce sugerează faptul ca imunitatea celulară nu este direct implicată în patogenia acestor afecțiuni [33]. Cu toate acestea, se pare ca limfocitele Th1, Th2 și limfocitele B pot accentua procesul de formare a bulelor [].

I.3.3.2. Diagnostic

Diagnosticul pemfigusurilor se efectuează prin evaluarea elementelor clinice, histologice și imunologice. Deoarece niciunul dintre aceste criterii nu este specific în mod absolut este necesară corelarea celor trei tipuri de elemente pentru a stabili diagnosticul [33].

Formele profunde de pemfigus includ pemfigusul vulgar și vegetant, pe când pemfigusul eritematos și foliaceu sunt superficiale din punct de vedere al nivelului apariției acantolizei/bulei.

Clinic, diferențele între cele două forme majore de pemfigus par a reflecta variațiile regionale ale exprimării antigenelor țintă, leziunile apărând în zonele în care exprimarea acestor antigene este maximă [41]. Leziunile orale sunt frecvente în pemfigusul vulgar și absente de obicei în pemfigusul foliaceu. În ambele forme de pemfigus leziunile scalpului, feței, toracelui superior apar frecvent, pe când cele de la nivelul membrelor inferioare sunt rareori prezente. Aceeași variație anatomică se regăsește și în exprimarea antigenelor țintă specifice celor două forme de boală [33].

Exprimarea clinică este prin urmare diferită între diversele forme de pemfigus, toate fiind însă caracterizate de prezența bulei cu localizare intraepidermică. Bula este flască, fragilă, conține lichid clar, se situează pe piele normală sau eritematoasă și determină apariția unei eroziuni dureroase ce se vindecă fără apariția de cicatrice. Un element clinic caracteristic este semnul Nicolsky – o presiune aplicată lateral față de o leziune activă determină separarea dermo-epidermică și apariția unei bule/eroziuni. Semnul Nicolsky este pozitiv în pemfigusuri dar și în anumite cazuri de necroliză toxică epidermică.

Histopatologic, pemfigusurile sunt caracterizate de apariția acantolizei – keratinocitele epidermice își pierd conexiunile intercelulare, se detașează, se rotunjesc și plutesc liber în cavitatea/bula formată; keratinocitele segregate se numesc celule acantolitice și pot fi detectate pnn examenul citologic Tzanck în toate tipurile de pemfigus (examinarea se efectuează prin raclarea fundului bulei și relevarea prezenței celulelor acantolitice – celule rotunde mari cu citoplasma bazofilă – ce este sugestivă pentru pemfigus). Cu toate acestea examinarea Tzanck nu poate înlocui examenul histopatologic pentru că prezența keratinocitelor acantolitice poate fi detectată și în alte circumstanțe, respectiv afecțiuni veziculo-buloase sau pustuloase nonacantolitice, ca rezultat al acantolizei secundare [31].

Forma de pemfigus poate fi evaluată prin examinarea histopatologică a unui fragment cutanat sau mucos. Prelevarea trebuie să se efectueze dintr-o leziune recentă, activă – bulă recentă sau marginea activă a unei eroziuni mucoase, și identifică locul de formare a bulei. Analiza histologică evaluează de asemenea și prezența, intensitatea și compoziția infiltratului inflamator celular precum și alte elemente asociate, în acest fel generând diagnostice diferențiale.

În pemfigusul vulgar bula se situează suprabazal, celulele acestui strat rămânând atașate membranei bazale, dar separate una de cealaltă (aspectul clasic definit ca „pietre de mormânt"). Cavitatea bulei conține celulele acantolitice. Dermul superficial conține infiltrat inflamator minim mixt cuprinzând și eozinofile. Rareori modificarea inițială este spongioza eozinofilică fără ca acantoliza să fie evidentă la acel moment [30].

În plus, față de acantoliza suprabazală, în pemfigusul vegetant se observă o proliferare inferioară a celulelor epidermice către derm, abcese hipertrofice epiteliale determinate de lecucocitele polimorfonucleare [33].

În pemfigusul foliaceu și eritematos acantoliza se situează în stratul granulos al epidermului, deci bula se formează superficial. În aceste afecțiuni se observă frecvent hiper și parakeratoză [32].

Valoarea examenului histopatologic în pemfigusuri constă în posibilitatea de a încadra afecțiunea investigată în contextul maladiilor buloase intraepidermice, identificarea acantolizei fiind înalt sugestivă pentru pemfigus dar fără a prezenta o specificitate absolută. Acantoliza este un proces de disoluție a legăturilor interkeratinocitare descris atât în pemfigusuri imunologice, dar și în cele neimunologice (boala Hailey-Hailey, în care apare o disfuncție desmozomală congenitală) și de asemenea în alte tipuri de afecțiuni dermatologice: boala Grover, infecțiile cu herpesvirusuri, carcinomul spinocelular forma adenoidă, boala Darier, ș.a.

Prin urmare, în pemfigusuri elementele histopatologice corelate cu examinarea clinică orientează diagnosticul și sugerează chiar și forma de pemfigus investigată, dar pentru confirmarea diagnosticului sunt necesare investigații suplimentare imunopatologice.

Imunopatologie: toate formele de pemfigus sunt caracterizate de prezența autoanticorpilor antikeratinocitari fixați în piele sau circulanți. Anticorpii fixați în țesut sunt prezenți în leziuni și pielea sănătoasă perilezională la circa 90% până la 100% din pacienți și sunt detectați prin imunofluorescență directă (1,10). Acești anticorpi sunt prezenți extrem de rar în alte afecțiuni și sunt mai sensibili și mai specifici pentru diagnosticul de pemfigus decât anticorpii circulanți. De cele mai multe ori sunt anticorpi de tip IgG, dar uneori se determină și depuneri de anticorpi IgA, IgM, cu sau fără depunere de complement [33].

Diagnosticul de pemfigus este confirmat prin imunofluorescență directă ce evidențiază prezența anticorpilor IgG (IgG1, IgG4), C3, IgM sau IgA sub formă de depozite pe suprafața keratinocitelor epidermice în leziuni și perilezional [30]. Acest diagnostic este discutabil în condițiile în care imunofluorescență directă este negativă [32].

Autoanticorpii circulanți sunt detectați prin imunofluorescența indirectă din serul pacienților utilizând ca substrat piele umană, esofag de maimuță sau de porc de Guineea. Prezența autoanticorpilor circulanți este citată la circa 80% din pacienții cu boala activă, dar pot fi de asemenea detectați în titruri scăzute la pacienții cu arsuri extinse, infecții fungice, reacții postmedicamentoase sau myasthenia gravis [33]. Este acceptat în general faptul că există o corelare între titrul anticorpilor circulanți și activitatea bolii. Determinări seriate ale acestor anticorpi pot fi utile în managementul terapeutic al bolii, deoarece o creștere a titrului precede de obicei o recurența a afecțiunii și de asemenea titrul lor scade în timpul tratamentului și este nedetectabil la pacienții în remisiune []. Totuși, anumite studii relevă faptul ca în monitorizarea remisiunii imunologice a pacienților imunofluorescența directă este mai valoroasă decât metoda indirectă [, , ].

Studiile de imunoabsorbție link-ate enzimatic (ELISA-enzyme linked immunosorbent assays) pot efectua în mod sensibil și specific serodiagnosticul în pemfigusuri – peste 95% din pacienții cu pemfigus vulgar au anticorpi antidesmogleină 3 și 50% au anticorpi antidesmogleină 1 [30]. Testarea ELISA este mai specifică și mai sensibilă decât imunofluorescența indirectă și ar putea fi utilizată în monitorizarea activității bolii [].

Imunoprecipitarea și imunoblottingul au detectat antigenele țintă sub forma unor benzi proteice cu o greutate moleculară specifică ce au fost separate prin electroforeză.

I.3.4. Fiziopatologia și diagnosticul bolilor buloase autoimune subepidermice

Această categorie de afecțiuni include mai multe entități patologice ce prezintă un grad mare de suprapunere al elementelor clinice și histopatologice, fiind dificil de diferențiat doar pe baza acestor criterii. Sunt caracterizate de prezența bulelor cu localizare subepidermică.

I.3.4.1. Fiziopatologie

Bolile imunobuloase subepidermice sunt caracterizate (cu excepția dermatitei herpetiforme) de prezența autoanticorpilor îndreptați împotriva uneia sau mai multor componente ale joncțiunii dermo-epidermice, determinând apariția bulelor cu localizare subepidermică. Mecanismul de inducere a apariției bulelor de către acești autoanticorpi este în mod principal prin activarea proceselor inflamatorii [].

Examenul histopatologic și testele de imunofluorescența nu sunt în toate cazurile distinctive între aceste afecțiuni iar identificarea antigenelor țintă a demonstrat faptul că pot exista antigene comune pentru mai multe entități clinice sau, mai mult decât atât, un pacient poate prezenta mai multe antigene țintă. Pe lângă toate acestea la momentul actual încă se descriu noi antigene incriminate în patogenia acestor afecțiuni, iar altele sunt în curs de elucidare (de exemplu în dermatita herpetiformă).

Tabelul 3.3 prezintă o imagine de ansamblu asupra elementelor imunopatologice caracteristice acestor afecțiuni.

Tabelul 3.3: Imunopatologia bolilor buloase autoimune subepidermice

Pemfigoidul bulos, cea mai frecventă afecțiune buloasă autoimună subepidermică, descrisă în special la vârstnici sub forma unei erupții buloase pruriginoase generalizate, este caracterizat de prezența autoanticorpilor îndreptați împotriva a două antigene țintă bine caracterizate: antigenul pemfigoidului bulos 180 (BP180, BPAG2, colagen de tip XVII), o proteină transmembranară cu un domeniu extracelular mare și antigenul pemfigoidului bulos 230 (BP230, BPAG2), o proteină citoplasmatică din grupul plakinelor [58]. Aceste două proteine sunt componente ale hemidesmozomilor, fiind regăsite la nivelul plăcii dense.

Există și raportări ale unor alte tipuri de antigene țintă descrise în cazuri individuale, cea mai frecventă fiind proteina P200 (200 Kda), asociată epidermului și dermului [].

Studii in vitro și in vivo au demonstrat rolul patogenic al autoanticorpilor în pemfigoidul bulos [], acesta afecțiune reprezentând unul dintre cele mai reprezentative modele de boală autoimună. Formarea bulelor începe prin depunerea autoanticorpilor ce leagă C3 de-a lungul joncțiunii dermo-epidermice. Acești autoanticorpi sunt în principal din clasa IgG, predominant subtipurile IgGi si IgG4 []. Modelele experimentale animale au demonstrat rolul important al complementului, neutrofilelor și macrofagelor în patogenia bolii [, , , ]. Toate aceste date sugerează un posibil mecanism de apariție a bulei [30]:

Autoanticorpii se leagă de antigenele țintă și activează complementul, ale cărui componente declanșează cascada inflamatorie și atrag leucocite, degranulează mastocitele și eliberează mediatori ai inflamatiei. Celulele inflamatorii activate eliberează enzime lizozomale și proteaze ce clivează antigenele țintă și destructurează hemidesmozomii, rezultând bulele.

Pemfigoidul gestationis reprezintă o afecțiune buloasă autoimună intens pruriginoasă, caracteristică perioadei de graviditate sau corelată rareori cu tumori trofoblastice, coriocarcinom și mola hidatiformă [30]. Autoanticorpii de tip IgG, subclasele IgGl și IgG3, sunt îndreptați împotriva antigenelor pemfigoidului bulos BP180 și BP230 [30]. Modelele experimentale animale au demonstrat faptul că anticorpii anti BP180 sunt patogenici și necesită activarea complementului [62]. De asemenea există dovezi privind implicarea limfocitelor T și a eozinofilelor în apariția bulelor []. Autoanticorpii reacționează cu componentele membranei bazale ale placentei din trimestrul al doilea al sarcinii și se regăsesc în pielea fetală și sângele cordonului ombilical []. Deși mecanismul patogenie al acestei afecțiuni este incomplet elucidat, simptomele clinice ale bolii apar după exprimarea colagenului de tip XVII în placentă în timpul primului trimestru de sarcină [30].

Epidermoliza buloasă dobândită, o afecțiune mecano-buloasă caracteristică predominant vârstei adulte, se caracterizează prin prezența autoanticorpilor de tip IgG ce reacționează specific cu colagenul de tip VII din structura fibrilelor de ancorare situate în lamina densa și sublamina densa. In vitro, acești anticorpi alături de sistemul complement, elastaza neutrofilică și gelatinaza B mediază infiltrarea cu leucocite și clivajul dermo-epidermic [67]. Rolul patogenic al acestor anticorpi poate fi exercitat prin interferența cu asocierea moleculelor colagenului VII și asamblarea în fibrile de ancorare sau prin afectarea interacțiunii acestui tip de colagen cu alte proteine matriceale, cum ar fi laminina 5 [58].

Dermatita herpetiformă este manifestarea cutanată a enteropatiei la gluten. Mecanismul prin care ingestia de gluten induce apariția de depozite de IgA la nivel cutanat și, consecutiv, apariția de bule, este necunoscut. Datele actuale se bazează pe observații clinice și de laborator, fără să fi fost obținute modele experimentale pe animale. Aceste observații, introduse în teoriile patogenice, sunt următoarele []: asocierea genetică cu anumite tipuri HLA, existența enteropatiei la gluten la toți pacientii asociată cu stimularea sistemului imun mucos, depunerea de IgA în dermul papilar, infiltratul cu neutrofile în papilele dermice, îmbunătățirea impresionantă a simptomatologiei la terapia cu Dapsonă și agravare la ingestia de iod anorganic.

Anticorpii caracteristici sunt de tip IgA (predominant IgA1, atât monomerici cât și polimerici, posibil derivați din mucoasa intestinala și ser) și se regăsesc sub formă de depozite granulare în vârful papilelor dermice [30]. Rareori se detectează și anticorpi de tip IgM, IgG, sau C3 [30]. Depozitele de IgA sunt dependente de gluten și sunt eliminate progresiv din piele în condițiile instituirii unei diete fără gluten. Gliadina, un produs de digestie și o componentă alcool-solubilă a glutenului, pare a fi componenta antigenică incriminată [68]. O teorie patogenica posibilă implică faptul că gliadina este clivată de transglutaminaza tisulară rezultând peptide antigenice ce sunt prezentate limfocitelor Th ce activează limfocitele B rezultând în final producerea de anticorpi IgA îndreptați împotriva mai multor structuri: gliadina, gliadina cross-linkată cu transglutaminaza 2, transglutaminaza 2, transglutaminaza epidermică/3, reticulina, endomissium [].

Descoperirea anticorpilor antitransglutaminaze și a relevanței acestora în patogenia afecțiunii reprezintă una dintre descoperirile relativ recente (în anul 2002) ale cercetării în domeniu []. Pacienții cu dermatita herpetiformă exprimată clinic prezintă anticorpi antitransglutaminaza epidermică mai frecvent decât cei cu boala celiacă [70]. Precipitatele dermice de IgA conțin această proteină și există o colocalizare a depozitelor de IgA și a transglutaminazei epidermice în dermul superior și vase, prin urmare dermatita herpetiformă ar putea fi rezultatul unui proces imun extrem de complex [70]. Cu toate acestea, mecanismul de depunere a IgA în piele și a apariției bulelor este încă necunoscut. Serul acestor pacienți nu conține autoanticorpi.

I.3.4.2. Diagnostic

Există un mare grad de suprapunere clinică și chiar histopatologică în cadrul afecțiunilor imunobuloase subepidermice, prin urmare diagnosticarea specifică a acestor afecțiuni necesită evaluarea elementelor clinice și histologice ce orientează diagnosticul și confirmarea sau rafinarea acestuia prin metode de investigare imunopatologice.

Suprapunerile clinice sunt determinate de elementele comune imunopatologice. Acest grup de afecțiuni este caracterizat de prezența bulelor cu localizare subepidermică. Bulele sunt în tensiune, au conținut scrocitrin sau hemoragie și apar pe tegument eritematos sau de aspect normal. Având în vedere localizarea lor subepidermică, semnul Nicolsky este negativ.

Din punct de vedere histologic, citodiagnosticul Tzanck poate avea o utilitate preliminară și în evaluarea maladiilor imunobuloase subepidermice, întrucât absența celulelor acantolitice exclude pemfigusul.

Examinarea histopatologică a fragmentelor bioptice oferă elemente importante pentru încadrarea cazului studiat în categoria maladiilor imunobuloase subepidermice prin descrierea locului de formare a bulei și, de asemenea, relevă și alte elemente asociate, precum prezența, intensitatea și compoziția infiltratului inflamator celular. Prelevarea fragmentelor de biopsie se efectuează similar pemfigusurilor (recoltare bulă recentă sau fragment de piele eritema-toasă).

Din punct de vedere histopatologic, caracteristică acestui grup de afecțiuni este localizarea subepidermică a bulei, însă există și la acest nivel un grad mare de suprapunere a elementelor evidențiate, examinarea histopatologică fiind insuficientă pentru stabilirea diagnosticului de certitudine. Se descriu însă aspecte ce pot orienta diagnosticul, prezentate în cele ce urmează [30, 58, 68].

în pemfigoidul bulos se vizualizează bula situată la joncțiunea dermo-epidermică și un infiltrat inflamator mixt compus din eozinofile, limfocite, histiocite și eozinofile. Bula poate conține numeroase eozinofile și neutrofile. Poate fi observată spongioza eozinofilică.

Pemfigoidul gestationis prezintă bulă subepidermică. Leziunile recente de aspect urticarian relevă prezența edemului epidermic și dermic și ocazional zone de spongioza eozinofilică.

Epidermoliza buloasă dobândită poate prezenta două aspecte histopatologice, ambele cu bulă subepidermică: o formă inflamatorie ce asociază infiltrat inflamator dermic variabil, compus în principal din neutrofile, eozinofile sau limfocite, asemănător pemfigoidului bulos sau cicatriceal și o formă noninflamatorie în care infiltratul este minim sau absent.

În dermatita herpetiformă se poate identifica prezența bulei subepidermice ce conține predominant neutrofile. Poate fi prezent de asemenea infiltrat cu eozinofile, similar pemfigoidului bulos. Dacă biopsia se efectuează dintr-o zonă de tegumenteritematos, se identifică edem al dermului papilar și infiltrat cu neutrofile asociat cu infiltrat limfocitar perivascular superficial. Din punct de vedere histopatologic dermatita herpetiformă poate fi imposibil de diferențiat de pemfigoidul bulos (în condițiile apariției infiltratului eozinofilic), lupusul eritematos sistemic bulos sau dermatita cu IgA liniar.

Imunopatologic, maladiile buloase autoimune subepidermice, cu excepția dermatitei herpetiforme, sunt caracterizate de prezența autoanticorpilor îndreptați împotriva uneia sau mai multor componente ale joncțiunii dermo-epidermice.

Pemfigoidul bulos: diagnosticul acestei afecțiuni se efectuează prin corelarea prezentării clinice, a elementelor histopatologice și a testelor de imunofluorescență, esențiale pentru confirmarea diagnosticului. La majoritatea pacienților imunofluorescență directă va evidenția prezența depozitelor fine, liniare de IgG (IgG4, IgG1) și/sau C3, rar IgM, IgA, de-a lungul joncțiunii dermo-epidermice [24, 30]. Tehnica pielii clivate poate fi utilă pentru diferențierea afecțiunii de epidermoliză buloasă dobândită prin evidențierea localizării depozitelor la nivelul versantului epidermic („tavanul") bulei [24]. 60-80% din pacienți prezintă imunofluorescență indirectă pozitivă pentru autoanticorpi circulanți de tip IgG (rar IgA, IgE) [58], acest test determinând diagnosticul de certitudine. Efectuarea tehnicii pe piele clivată crește sensibilitatea metodei și este recomandat a fi efectuată de rutină la toți pacienții cu pemfigoid bulos30. Cu toate acestea, mai ales în situațiile în care imunofluorescență indirectă este negativă, poate fi utilă efectuarea imunoelectronomicroscopiei, imunoblottingului sau reacțiilor ELISA pentru detectarea antigenelor țintă specifice pemfigoidului bulos (BP230, BP180). Imunoelectronomicroscopia demonstrează prezența anticorpilor la nivelul laminei lucida in vivo [] și legarea acestora de antigenele țintă de la nivelul plăcii dense (BP230) și hemidesmozomilor (BP180) in vitro []. Imunoblottingul identifică de asemenea la majoritatea pacienților acești autoanticorpi. Mai recent, testele ELISA ce utilizează proteine recombinate au început să fie utilizate ca teste diagnostice de rutină în anumite centre de cercetare, sensibilitatea acestei metode fiind comparabilă cu cea a imunofluorescenței indirecte pe pielea clivată [58].

Pemfigoidul gestationis: imunfluorescența directă demonstrează prezența de C3 cu/fără IgG la nivelul membranei bazale în toate cazurile de boală activă [30]. Imunofluorescența indirectă relevă prezența factorului HG (anticorp ce fixează C3) la nivelul membranei bazale în 50% din piele clivată [30] și demonstrează localizarea depozitelor la nivelul versantului epidermic al bulei [24].

Imunoelectronomicroscopia confirmă depozitarea IgG la nivelul laminei lucida în partea proximală a filamentelor de ancorare. Imunoblottingul și tehnicile ELISA au demonstrat faptul că antigenul major implicat în patogenia acestei boli este BP180 [30].

Epidermoliza buloasă dobândită: diagnosticul este confirmat de testele de imunofluorescența directă pozitivă la toți pacienții pentru IgG, uneori IgA, C3 sau IgM, dispuse liniar de-a lungul joncțiunii dermo-epidermice la nivelul dermic („podeaua") bulei evidențiate prin tehnica pielii cliva [24]. Imunofluorescența indirectă este pozitivă în circa 50% din cazuri [30] predominant pentru IgG, uneori pentru IgA cu evidențierea depunerii de imunoreactanți la nivelul dermic al bulei în tehnica pielii clivate [].

Tehnicile ELISA sunt mai sensibile dar nu se utilizează de rutină. Imunoblottingul și testele ELISA au identificat antigenele țintă ca fiind componente ale colagenului de tip VII [30].

Dermatita herpetiformă: diagnosticul este confirmat prin imunofluorescența directă pozitivă în 100% din cazuri. Caracteristică este evidențierea depozitelor granulare de IgA la nivelul papilelor dermice (85% dintre pacienți) sau depozite granulare continue de-a lungul membranei bazale (5-10% dintre pacienți) [68], ocazional fiind identificat un pattern fibrilar al depozitelor de IgA. Rareori se identifică IgG, IgM sau C3 [30].

Imunofluorescența indirectă este negativă pentru anticorpii îndreptați împotriva antigenelor membranei bazale sau de la nivelul dermului. Prin utilizarea ca substrat a esofagului de maimuță se pot însă identifica anticorpi IgA antiendomissium la circa 80% dintre pacienții cu dermatită herpetiformă, antigenul endomissial fiind transglutaminaza tisulară [68].

Studiile de imunoblotting sunt negative. Imunoelectronomicroscopia a evidențiat asocierea depozitelor de IgA cu microfibrilele dermice [30].

I.4. Fiziopatologia și diagnosticul bolilor autoimune de țesut conjunctiv

I.4.1. Introducere

Bolile autoimune de țesut conjunctiv reprezintă o categorie de afecțiuni poligenice cu mecanism patogenic autoimun caracterizate de existența proceselor inflamatorii cronice la nivelul diferitelor organe și care prezintă deseori elemente clinice heterogene sau comune mai multor afecțiuni [].

Cercetările efectuate de-a lungul timpului au contribuit la rafinarea și înțelegerea conceptului de boli de țesut conjunctiv prin descrierea maladiilor incluse în această categorie și a fenomenelor autoimune ce determină apariția lor. În condițiile în care se utilizează criterii adecvate de diagnostic și investigații moderne, aceste afecțiuni pot fi distinse în majoritatea cazurilor pe baza elementelor clinice, patologice și imunologice. Criteriile imunologice prezintă o importanță deosebită prin prisma identificării de noi antigene și autoanticorpi ce pot fi asociați în mod specific cu anumite tipuri sau subtipuri de boală.

Marca acestui grup de afecțiuni este reprezentată de producția de autoanticorpi circulanți identificați prin diferite metode imunohistochimice și reuniți sub denumirea de anticorpi antinucleari (ANA) – anticorpi îndreptați împotriva a diferite antigene nuclear [74].

I.4.2. Lupus eritematos

Lupusul eritematos reprezintă o afecțiune autoimună multisistemică ce asociază și manifestări cutanate și cuprinde o varietate de forme clinico-patologicc ce au ca elemente comune fenomenele de autoimunitate policlonală a limfocitelor B și elemente clinice distinctive [72, ]. Modul de exprimare clinică la nivelul pielii poate orienta diagnosticul în favoarea unei forme precizate de lupus eritematos. Afectarea cutanată în contextul lupusului eritematos sistemic se situează pe locul doi ca frecvență a manifestărilor clinice după cele articulare [].

I.4.2.1. Clasificare

Lupusul eritematos cutanat se manifestă prin apariția unor leziuni specifice sau nespecifice [, 76]. În cadrul categoriei leziunilor cutanate specifice manifestările sunt clasificate sub formă acută, subacută și cronică. Această subclasificare s-a bazat pe observațiile legate de cele trei tipuri distincte de leziuni ce sunt observate frecvent [77]: eritemul malar „în fluture" cu evoluție tranzitorie (forma acută), leziunile discoide, persistente, cu tendința la vindecare cu cicatrice (forma cronică) și erupția fotoindusă cu evoluție mai trenantă comparativ cu forma acută dar fără potențial de formare a cicatricelor (forma subacută). În categoria lupusului eritematos cronic au fost incluse de asemenea și alte forme de afectare cutanată – lupusul eritematos tumidus, mucos, hipertrofic/verucos, paniculita lupică, chilblain lupus (leziuni cu aspect de degerătură) și overlapul lupus-lichen. Alte variante descrise sunt lupusul eritematos sistemic bulos și sindromul Rowell. Lupusul eritematos cutanat acut reprezintă manifestările cutanate ce apar în contextul lupusului eritematos sistemic dar orice formă de lupus eritematos cutanat se poate asocia cu afectarea sistemică [77].

Lupusul eritematos discoid este caracterizat de prezența papulo-plăcilor eritemato-scuamoase, bine delimitate, cu scuamă albă, keratozică, aderentă și dopuri foliculare, ce se vindecă prin apariția cicatricelor atrofice, telangiectazii și hipopigmentare. Localizarea predilectă este la nivelul feței, scalpului, urechilor, zonei decolteului și zonelor extensoare ale antebrațelor. Leziunile respectă de obicei șanțurile nazolabiale. Afectarea scalpului apare la circa 60% din pacienți și se vindecă prin apariția alopeciei ireversibile cicatriceale la circa 1/3 dintre aceștia [76]. Distribuția leziunilor exclusiv la nivelul capului și gâtului caracterizează forma localizată de lupus eritematos dicoid pe când extinderea acestora către alte zone topografice caracterizează forma diseminată de boală.

Leziunile pot fi induse de fotoexpunere sau pot fi precipitate de traume cutanate (fenomenul Koebner).

Uneori, leziunile discoide apar la nivelul mucoaselor, incluzând buzele, mucoasa orală, nazală, genitală, conjunctivă, sub forma unor plăci eritematoase ce pot evolua spre ulcerații dureroase și cu potențial de malignizare în condițiile unei evoluții de lungă durată.

Forma discoidă de lupus eritematos este cea mai frecventă manifestare a lupusului eritematos cronic cutanat. Pacienții pot prezenta artralgii, cu toate acestea evoluția spre forma sistemică de boală este întâlnită doar la 5-10% dintre pacienți [77].

Lupusul eritematos tumidus reprezintă o variantă rară a lupusului eritematos cronic cutanat ce se manifestă sub forma unor plăci edematoase infiltrate cu aspect urticarian, cu modificări epidermice minime.

Paniculita lupică (lupus profund Kaposi-Irgang) prezintă leziuni subcutanate sub forma unor noduli fermi cu tegumentul supraiacent aderent, 70% dintre pacienți prezentând de asemenea leziuni tipice discoide. Circa 50% dintre pacienți prezintă manifestările sistemice ale lupusului eritematos [76].

Lupusul eritematos chilblain prezintă din punct de vedere clinic plăci violacee la nivel acral (degete, față) precipitate de expunerea la temperaturi scăzute. De obicei asociază prezența leziunilor tipice de lupus discoid la nivelul feței. 20% dintre acești pacienți prezintă forma sistemică de lupus eritematos [76].

Lupusul eritematos cutanat subacut se caracterizează prin prezența unor papule sau plăci eritematoase cu aspect psoriaziform eritemato-scuamos sau inelar (policiclic – cu margini eritematoase elevate). Se vindecă fără apariția de cicatrice, dar cu posibilă depigmentare reziduală și asociază fotosensibilitate, manifestându-se predominant în zonele fotoexpuse (torace posterior, umeri, decolteu, zonele extensoare ale antebrațelor, mai puțin frecvent la nivelul feței). Prognosticul pe termen lung al acestei forme nu este complet elucidat dar se pare că circa 50% dintre pacienți pot dezvolta forma sistemică de boală [76]. Cu toate acestea, manifestări severe de tip nefrită lupică se întâlnesc în doar 10-15% din cazuri [77].

Lupusul eritematos cutanat acut se poate prezenta sub formă localizată la nivelul feței, denumit rash malar sau „în fluture", aspectul fiind de leziuni eritemato-edematoase la nivelul proeminențelor malare și piramidei nazale, cu respectarea șanțurilor nazo-labiale. Poate fi afectată de asemenea fruntea, bărbia și zona decolteului. În formele generalizate se descrie o erupție morbiliformă generalizată predominant Ia nivelul zonelor extensoare ale mâinilor și antebrațelor ce respectă in mod caracteristic zona articulațiilor interfalangiene. Această formă de lupus este precipitată sau exacerbată de expunerea la soare și are o durată de evoluție variabilă (zile până la săptămâni). Se vindecă fără apariție de cicatrice, dar cu posibilă hiperpigmentare reziduală. în toate situațiile lupusul eritematos cutanat acut evoluează paralel și simultan cu afectare sistemică [76].

Lupusul eritematos sistemic bulos reprezintă denumirea unei erupții bulose ce poate să apară în contextul lupusului eritematos sistemic, autoanticorpii fiind îndreptați împotriva colagenului de tip VII din structura membranei bazale. Aspectul clinic poate fi asemănător pemfigoidului bulos sau epidermolizei buloase dobândite. Există de asemenea raportări ale unor cazuri de maladii buloase autoimune apărute la pacienți cu lupus eritematos, cum ar fi dermatita herpetiformă, pemfigoidul bulos sau pemfigusul eritematos [].

Sindromul Rowell reprezintă o erupție acută și de o mare severitate caracterizată prin apariția unor leziuni de tip eritem polimorf sau necroliză toxică epidermică ce apare pe fondul preexistent al formei acute sau subacute de lupus eritematos sau chiar de novo, ca manifestare de debut [77].

Leziunile cutanate nespecifice lupusului eritematos dar care pot să apară mai ales în contextul afectării multisistemice sunt [77]: leziuni vasculare (fenomen Raynaud, livedo reticularis, eritem palmar, telangiectazii periunghiale, vasculita urticariană, purpura palpabilă, infarcte, ulcerații cutanate, leziuni de tip panarterita nodoasă, tromboflebită), alopecie (difuză, reversibilă în forma sistemică), sclerodactilie, calcinoză, noduli reumatoizi (mai ales în sindroamele de overlap cu alte boli autoimune de țesut conjunctiv), eritromelalgie, mucinoză papulo-nodulară, anetodermie, acanthosis nigricans, eritem polimorf, ulcere de gambă, lichen plan, leziuni bulose nespecifice.

I.4.2.2. Fiziopatologie

Patogenia lupusului eritematos este incomplet elucidată. Se presupune că autoanticorpii non-organ specifici din forma sistemică de lupus sunt rezultatul stimulării răspunsului imun celular de către factori de mediu cum ar fi radiațiile ultraviolete, infecții (bacteriene sau virale) și/sau expunerea la substanțe chimice. Acest răspuns imun, convențional înfaza preliminară, devine crossrcactiv cu antigene proprii din cauza unei predispoziții genetice a pacientului ce determină alterarea răspunsului imun [76]. Prin mecanismele fiziologice de mutații somatice ale limfocitelor B, de maturare a afinității si de răspândire a epitopilor, producția de autoanticorpi se extinde și la antigene asociate fizic antigenului țintă inițial []. Factorii genetici și de mediu ar putea fi implicați în apariția fenomenelor de autoimunitate prin următoarele mecanisme []: imunitatea generală a individului este modificată, răspunsul la antigene specifice poate fi alterat, abilitatea țesuturilor țintă de a rezista sau de a modula atacul imun este modificată. Asocierea anumitor tipuri de HLA cu lupusul eritematos este recunoscută (HLA DR2, DR3 pentru forma acută, HLA-B8, DR3 pentru forma subacută, HLA-B7, B8, Cw7, DR2, DR3, DQw1, A2 în formă discoidă). După declanșarea fenomenelor de autoimunitate, perpetuarea acestora este menținută prin mecanisme incomplet elucidate dar prezența constantă a autoantigenelor poate fi un factor de întreținere a cercului vicios patogenic [76].

Deși autoanticorpii produși nu sunt specifici de organ există totuși o „selecție" a organelor afectate, și chiar la persoane ce prezintă același tip de autoanticorpi afectarea multisistemică poate fi diferită, mecanismul sau motivul acestei afectări diferite fiind necunoscut. Unii dintre acești autoanticorpi prezintă o specificitate mai mare pentru boală (de exemplu anticorpii anti ADN dublu catenar și anti Sm) iar alții sunt întâlniți mai frecvent (anticorpii antinucleari și antiRo). Raportări ulterioare [], [] sugerează faptul ca acești autoanticorpi se formează împotriva unor vezicule ce conțin ADN rezultate în urma apoptozei celulare, așa numiții apoptotic bodies; anticorpii anti ADN leagă receptorul ADN de pe leucocite și blochează legarea și fixarea ADN-ului liber de către celulele mononucleare; determină de asemenea eliberarea IFN y de către aceste celule, amplificând reacțiile imunologice și inflamatorii.

Există de asemenea date ce susțin ipoteza că autoanticorpii din lupusul eritematos sistemic nu sunt elementele patogenice primare [75]: nu prezintă o specificitate absolută de boală, nu se detectează în toate cazurile, titrul lor este independent de activitatea bolii, pot fi transfuzați voluntarilor umani fără a induce boala. Cu toate acestea, pe modele experimentale animale s-a observat potențialul de intensificare a inflamației la nivelul leziunilor de către anticorpii anti ADN [75]. De asemenea, s-a evidențiat rolul complexelor imune ce conțin anticorpi antinucleari în apariția leziunilor tisulare (renale dar și la nivelul altor organe) [].

Factorii etiologici incriminați în apariția leziunilor cutanate de lupus eritematos sunt radiațiile ultraviolete, infecțiile virale, expunerea la medicamente sau alte substanțe chimice (inclusiv fumul de țigară), traumatismele, medicamentele, expunerea la frig, sarcina, terapiile hormonale.

Mecanismul prin care radiațiile ultraviolete (atât UVA cât și UVB) devin patogenice este necunoscut. Se presupune că ar induce formarea de neoantigenc sau modularea autoantigenelor, creșterea eliberării de mediatori imuni (ILl, TNFa, PGE, radicali liberi de oxigen, proteaze, histamină) și perturbarea circuitelor imunoreglatoare cutanate prin afectarea limfocitelor T cutanate ce au ca rol suprimarea fenomenelor inflamatorii anormale de la nivelul pielii [75, 76]. Datele sugerează rolul limfocitelor T în patogenia formelor cutanate de lupus eritematos – la nivelul leziunilor există o proliferare oligoclonală a limfocitelor T îndreptată împotriva autoantigenelor [] și un număr scăzut de celule Langerhans cu rol de prezentare a acestora limfocitelor T. Depunerea de imunoglobuline și complement la nivelul joncțiunii dermo-epidermice apare după fenomene inițiale de înflamație perivasculară, prin urmare se pare că acestedepozite imune nu joacă un rol primar, de inițiere a lanțului patogenic in formele cutanate de lupus critematos [76]. Datele demonstrează existența apoptozei keratinocitarc induse de UVB ce facilitează exprimarea aberantă pe suprafața celulară a anumitor autoantigene Ro []. La autoanticorpii îndreptați împotriva acestor autoantigene ar putea determina injuria tisulară prin fenomene de liză mediată de complement sau citotoxicitate mediată celular. Exprimarea pe suprafața celulară a antigenelor Ro este determinată și de infecția cu alfavirusuri (rubeola) sau citomegalovirus [76]. Nu există o asociere stabilită între anumiți autoanticorpi și leziuni cutanate specifice în lupusul eritematos discoid, tumidus sau paniculita hipică, totuși se descrie prezența anticorpilor antinucleari în titruri foarte mici în 30-40% din cazuri și uneori anticorpi anti ADN monocatenar, precum și anticorpi anti Ro, La, U1RNP, factor reumatoid pozitiv, valori scăzute ale complementului în cazuri rare [76]. Anticorpii anti ADN dublu catenar sunt excepțional întâlniți în lupusul discoid, dar au fost descriși în lupusul eritematos cutanat acut. Datorită asocierii puternice a formei cutanate acute cu lupusul eritematos sistemic, profilul autoanticorpilor este similar (titru mare ANA, anticorpi anti ADN dublu catenar, anti SM, hipocomplementemie). Anticorpii anti Ro (o ribonucleoproteină de 6okDa) sunt prezenți în lupusul eritematos cutanat subacut în proporție de 70-90% din cazuri, alături de anticorpii anti La (30-50%), ANA (60-80%), factor reumatoid pozitiv (30%) [76] precum și anticardiolipinici, anti Sm, antitiroidieni, anti ADN dublu catenar, anti U1RNP în procente mai mici. Alți autori [77] descriu prezența anticorpilor anti Ro la majoritatea formelor de lupus eritematos cronic cutanat investigate, ridicând suspiciunea ca răspunsul imun împotriva acestui antigen este mai important în inițierea răspunsului patogenic decât imunitatea mediată celular sau producția de autoanticorpi. Importanța acestor autoanticorpi în dezvoltarea leziunilor cutanate este încă în curs de investigare.

I.4.2.3. Diagnostic

Lupusul eritematos sistemic

Diagnosticul se stabilește pe baza criteriilor revizuite ale Colegiului American de Reumatologie pentru clasificarea lupusului eritematos sistemic []. Pentru stabilirea diagnosticului este necesară prezența simultană sau seriată într-un interval de timp a cel puțin patru criterii.

Lupusul eritematos cutanat

Diagnosticul se bazează pe examinarea histopatologică a leziunilor. Forma de lupus cutanat (acută, subacută, cronică) se stabilește pe baza corelațiilor clinico-patologice, examenul histopatologic fiind mai puțin sugestiv pentru diferențierea formelor de boală [77]. Leziunile cutanate specifice lupusului eritematos sunt caracterizate din punct de vedere histopatologic de câteva elemente distinctive: hiperkeratoza și dopurile foliculare keratozice, atrofia epidermică, degenerescenta vacuolară (hidropica) a stratului bazal, îngroșarea membranei bazale, edem dermic, infiltrat inflamator limfocitar perivascular și porianexial. în proporții diferite aceste trăsături histopatologice sunt întâlnite în diferitele forme de lupus eritematos cutanat și sunt prezentate în cele ce urmează [75, 76, 77].

În lupusul eritematos cutanat acut leziunile pot prezenta mai ales în fazele inițiale trăsături histologice nespecifice: infiltratul inflamator este puțin abundent, se poate identifica o ușoară degenerescentă hidropica a stratului bazal focal, edem mucinos în dermul superficial, extravazare de eritrocite. în formele severe se pot întâlni necroze keratinocitare similare necrolizei toxice epidermice.

În forma subacută a lupusului eritematos cutanat modificările specifice sunt mai evidente decât în cea acută. La nivelul epidermului se descrie atrofie epidermică ușoară, degenerescentă hidropică a stratului bazal, rareori necroză keratinocitară. Modificările dermului includ edem si infiltrat inflamator mononuclear moderat perivascular situat de obicei în dermul superficial. Spre deosebire de forma discoidă se descriu într-un procent extrem de mic modificări de tipul hiperkeratoză, dopuri foliculare, îngroșarea membranei bazale sau infiltrat perifolicular.

Lupusul eritematos cronic cutanat de tip discoid este caracterizat de prezența hiper-keratozei, dopurilor foliculare, atrofiei epidermice și a degenerescentei hidropice a stratului bazal. Corpii coloizi (citoizi Civatte), amorfi, eozinofili, apăruți în urma fenomenului de diskeratoză a celulelor epidermice, pot fi vizibili la nivelul epidermului și a dermului superficial. Interlinia dermo-epidermică este îngroșată, se descrie edem și infiltrat inflamator limfohistiocitar abundent la nivelul dermului superficial și profund perivascular și perianexial, vasodilatație, capilarele prezentând pereți îngroșați, edemațiați, eritrocite extravazate în dermul superficial, melanofage conținând melanină din cauza degenerescentei keratinocitelor stratului bazal, uneori depozite de mucină sau fibrinoid. Colorația PAS evidențiază mai pregnant modificările membranei bazale și a capilarelor.

Lupusul eritematos tumidus prezintă modificări minime epidermice, dar se evidențiază prezența unui infiltrat limfohistiocitar marcat la nivelul dermului și depozite de mucină.

În paniculita lupică, modificările majore sunt la nivelul țesutului subcutanat sub forma paniculitei lobulare limfohistiocitare. Infiltratul inflamator se poate regăsi și la nivelul dermului profund. Pereții vasculari sunt îngroșați și invadați de limfocite (vasculită limfocitară), leucocitele polimorfonucleare sunt absente, se descrie necroza hialină a țesutului adipos, degenerarea fibrinoidă a colagenului, degenerarea mucinoasă și calcificări în leziunile cu evoluție de lungă durată.

Sindromul de overlap lupus eritematos-lichen plan este caracterizat histologic de prezența simultană a reacției lichenoide tipice pentru lichenul plan precum și a elementelor caracteristice lupusului eritematos.

Caracteristicile imunopatologice ale lupusului eritematos includ autoanticorpii circulanți detectați prin metode serologice (incluzând imunofluorescența indirectă) și depozitele imune cutanate evidențiate prin imunofluorescența directă.

Caracteristica majoră a testării prin imunofluorescența directă a pielii lezionale în lupusul eritematos cutanat este depunerea de anticorpi la joncțiunea dermo-epidermică și în jurul foliculilor piloși []. Aceste depozite sunt descrise în mod tipic sub formă granulară și sunt constituite în principal din IgG, IgM, uneori IgA; de asemenea, se pot evidenția și depozite de complement [75].

În funcție de forma clinică de lupus eritematos se descriu caracteristici variabile la examinarea prin imunofluorescența directă, ce contribuie la stabilirea diagnosticului diferențial între formele de boală: dispunerea imunoreactanților de-a lungul membranei bazale corpilor citoizi, citoplasmei sau nucleului keratinocitar sau la nivelul pereților vasculari. Imunofluorescența indirectă în lupusul eritematos este utilizată pentru detectarea ANA circulanți în serul pacienților. Deși au existat și încă sunt în curs de dezbateri rolul testului ANA pentru diagnosticul și managementul bolilor autoimune de țesut conjunctiv, testarea clasică prin imunofluorescența indirectă este considerată și la ora actuală metoda cea mai sensibilă de screening pentru depistarea lupusului eritematos sistemic [74].

PARTEA A II-A. Contributia personală

II.1. Definirea problemei

Imunofluorescența reprezintă o tehnică de imunohistochimie prin marcare cu compuși fluorescenți, utilizată pentru demonstrarea prezenței anticorpilor fixați la nivelul țesuturilor sau circulanți în fluidele organismului. Această metodă este utilizată de circa 4 decenii în domeniul dermatologiei, atât pentru investigarea fiziopatologiei afecțiunilor cutanate cât și în scop diagnostic în multiple patologii []. Imunofluorescența prezintă avantajele de a fi o tehnică simplu de efectuat și reproductibilă [], cu o sensibilitate crescută pentru anumite categorii de afecțiuni in care este indispensabilă pentru confirmarea diagnosticului dar și cu valoare prognostică substanțială în situații definite.

Dezavantajele metodei constau în faptul că se efectuează o reacție imunologică delicată, ceea ce presupune o evaluare atentă a rezultatelor și utilizarea unor tehnici corecte de prelevare și prelucrare a probelor [87]. Apariția rezultatelor fals pozitive sau fals negative este posibilă și impune, pe lângă o bună cunoaștere și efectuare a tehnicii, evaluarea rezultatelor testării în contextul examinării clinice și histopatologice [87].

Deși ar putea fi considerată o tehnică de investigare „clasică", având în vedere istoria sa, deseori clinicienii sunt mai puțin familiarizați cu detaliile tehnice asociate metodei și cu spectrul larg al modelelor de fluorescentă posibile, prin urmare pot avea dificultăți în interpretarea corectă a rezultatelor. Este esențial ca medicul dermatolog să cunoască și să interpreteze în mod adecvat rezultatele testelor de imunofluorescențã, corelațiile diagnostice necesitând atât expertiza medicului histopatolog cât și a medicului dermatolog. Este necesară o colaborare între cele două specialități în scopul rafinării rezultatelor și precizării diagnosticelor.

Nu în ultimul rând, identificarea unor soluții de creștere a accesibilității metodei prin utilizarea unor substraturi diferite pentru efectuarea tehnicii, mai facil de prelevat decât cele clasice, ar reprezenta un beneficiu semnificativ atât din punctul de vedere al medicului cât și al pacientului supus investigației.

II.2. Scopul studiului

Cercetarea efectuată are ca obiectiv evaluarea importanței, valorii și aplicațiilor imunofluorescenței în practica dermatologică.

S-a efectuat în acest scop un studiu retrospectiv prin care am urmărit ca obiective de etapă:

Evaluarea sensibilității, specificității și valorii predictive a imunofluorescenței directe pentru diagnosticul bolilor buloase și lupusului eritematos;

Evaluarea aspectelor de imunofluorescența directă identificate și a contribuției acestora la precizarea diagnosticului patologiilor studiate;

Se prezintă o imagine de ansamblu asupra poziționării tehnicilor de imunofluorescența în practica dermatologică prin evaluarea valorii, importanței dar și a limitelor utilizării imunofluorescenței în diagnostic sau/și în monitorizarea evoluției afecțiunilor cutanate. Se elaborează o descriere specifică a afecțiunilor cutanate din punct de vedere al rezultatelor obținute prin imunofluorescența.

Am urmărit evaluarea sensibilității tehnicii, comparativ cu metoda clasică și limitele acesteia în ceea ce privește patologiile în care este aplicabilă.

II.3. Descrierea tehnicilor de laborator

În cadrul cercetării au fost analizate diferite tipuri de afecțiuni dermatologice investigate prin tehnici de imunofluorescență directă și indirectă. Probele de țesut supuse examinării au fost analizate prin microscopie de fluorescentă.

II.3.1. Descrierea microscopiei de fluorescentă

Utilizarea anticorpilor marcați cu un compus fluorescent și evidențierea complexelor antigen-anticorp la microscopul cu fluorescentă definesc imunofluorescență.

Fluorescența

Fluorescența reprezintă unul dintre numeroasele procese de luminiscență în care moleculele emit lumină în timpul relaxării rapide a moleculelor fluorescente după excitarea prin absorbția luminii []. Fluoroforul reprezintă grupul funcțional al unei molecule care, excitat cu o anumită lungime de undă, va emite o radiație electromagnetică cu o lungime de undă superioară în spectrul rizibil. Fluoroforii reprezintă deci molecule fotosensibile în care spectrul de emisie și absorbție este controlat prin structura chimică. Se leagă specific în celulă și se compartimentează în funcție de aplicație (la nivelul ionilor intracelulari, ADN-ului, membranelor lipidice, proteinelor, receptorilor membranari).

Parametrii ce influențează fluorescența sunt spectrul de absorbție/excitație, spectrul de emisie, intensitatea și durata acesteia.

Spectrul de absorbție este compus din multiple tranziții de la starea de repaus la diferitele nivele de vibrație ale stării de excitație. Spectrul de emisie se constituie din multiplele tranziții de la nivelul minim de vibrație al stării de excitație la diferitele nivele de vibrație ale stării de repaus.

Fotostingerea (photobleaching) se produce prin excitarea repetată a moleculelor prin care moleculele de fluorofor suferă modificări chimice ireversibile și devin nefluorescente [88, 89]. Procesul depinde de nivelul de iluminare și poate fi speculat pentru diminuarea autofluorescenței prin expunerea probelor înainte de adăugarea anticorpilor marcați fluorescent. Fotostingerea poate fi contracarată prin creșterea sensibilității de detecție și scăderea nivelului de iluminare.

Mediul își exercită influența asupra fluorescenței prin următorii parametrii: concentrația moleculelor de fluorofor, interacțiunea cu alți fluorofori, tipul de solvent utilizat, compoziția ionică a soluțiilor, ph-ul acestora sau formarea de complexe moleculare [89].

Introducerea fluoroforilor în celule se efectuează prin tehnici diferite: „injectare" cu microseringă, esterificarea grupărilor ionizate, în acest fel molecula trecând mai ușor prin zona lipidică a membranei sau permeabilizarea membranei.

Concentrația markerului se etalonează prin compararea rezultatului măsurătorii cu o curbă de etalonare obținută in vitro pe soluții de concentrații cunoscute.

Tipurile de probe utilizate sunt celule vii prin care se măsoară concentrația specie de interes în celulele vii supuse acțiunii unor factori externi controlați (cel mai adesea se folosesc în cazul măsurării dinamicii concentrației ionilor intracelulari) sau celule fixate -se măsoară concentrația fluoroforului introdus în celulă după aplicarea unor proceduri specifice de fixare (cel mai adesea această metodă este folosită pentru vizualizarea unor componente macromoleculare sau structuri supramoleculare).

Fluroforii prezintă spectre diferite de absorbție și emisie, determinând apariția a diferite culori în spectrul vizibil (albastru, verde, galben, portocaliu, roșu). Substanța folosită inițial de Coons a fost beta-antracen, care produce fluorescentă albastră [].

Pentru că la ora actuală există o mare varietate de fluorofori, o problemă importantă este modul de selecție a markerului adecvat pentru țesutul studiat. Această alegere este determinată în majoritatea cazurilor de echipamentul utilizat (respectiv sursa de excitare și filtrul de emisie) și de aplicație. Fluroforul ideal ar trebui să îndeplinească următoarele caracteristici: să se asocieze specific cu molecula, structura sau celula țintă, să fie nontoxic, să aibă o intensitate crescută, să nu prezinte fotostingere, să nu disocieze []. Costul probei poate să reprezinte de asemenea un criteriu de selecție.

Fluoroforii utilizați uzual în studiile de imunofluorescență cu aplicații în dermatologie sunt fluorescein-izotiocianat (FITC – fluorescein isothiocyanate) ce determină apariția unei culori verde-măr, izotianat de tetrametilrodamină (TRITC – tetramethylrodamine isothiocyanate), ce produce o fluorescența roșie și ficoeritrina iphycoerythrin), de asemenea determinând apariția unei fluorescențe de culoare roșie [88].

Fluroforii pot marca atât anticorpi policlonali cât și monoclonali, dar și fragmente Fab, fără a interfera cu formarea complexelor antigen-anticorp [].

În trecut laboratoarele își produceau proprii anticorpi marcați fluorescent. La ora actuală avem la dispoziție o gamă largă de seruri comerciale marcate fluorescent ce pot fi utilizate atât în scop diagnostic cât și în scop de cercetare [92].

Structura microscopului de fluorescență

Microscopul de fluorescență se constituie din: sursa de lumină (excitare) ce reprezintă o lampă cu xenon sau lampă cu vapori de mercur, casetele filtru-filtru de răcire, filtru neutru, filtru de excitare, filtru dicroic, filtru de emisie, sistem optic (obiectiv, ocular etc), detector (fotomultiplicator, cameră pentru înregistrarea imaginilor).

Detecția luminii emise se realizează utilizând un fotomultiplicator, cu rezoluție temporală bună dar care nu permite detectarea detaliilor imaginii sau prin intermediul camerei de luat vederi, cu rezoluție temporală mai slabă (în funcție de sensibilitate, capacitate de transfer a informației către calculator) dar cu rezoluție spațială limitată doar de performanțele camerei si ale sistemului optic al microscopului.

Tipurile de tehnici de microscopie de fluorescență sunt:

a. microscopia de câmp larg: se bazează pe sistemul clasic de formare a imaginii in microscop, lărgimea fasciculului de lumină fiind limitată de diafragme obișnuite
rezultând o limitare drastică a rezoluției spațiale din cauza suprapunerii luminii
provenite de la acele părți ale obiectului care nu sunt în planul de focalizare.

b. microscopia confocală: lărgimea fasciculului de lumină este limitată la dimensiunide ordinul micronilor, rezultând îmbunătățirea rezoluției spațiale (dezavantajulconstând în faptul că necesită surse de lumină puternice – lasere).

Creșterea calității imaginii în microscopia de fluorescentă se poate efectua prin corectarea iluminării (alegerea corectă a lungimii de undă de excitație și a puterii de excitație cu excitație la vârful spectrului de absorbție și minimizarea fotostingerii) și de asemenea prin eficientizarea colectării fluorescentei prin creșterea aperturii numerice a obiectivului.

În cadrul cercetării prezentate s-a efectuat microscopie de câmp larg, utilizând ca fluorofor fluorescein-izotiocianat.

II.3.2.Descrierea tehnicilor de imunofluorescență

II.3.2.1 Imunofluorescență directă

Este o procedură de marcare histologica într-o singură treaptă pentru identificarea in vivo a anticorpilor legați de antigene tisulare, utilizând un fragment de țesut obținut de la pacient. Detectează prezența imunoglobulinelor, complementului sau fibrinogenului în țesutul prelevat.

Din punct de vedere al etapelor tehnice ale procedurii se descriu următoarele:

Recoltarea fragmentului de țesut (biopsie cutanată, mucoasă)

Fragmentul bioptic se recoltează prin efectuarea unei biopsii de tip punch sau chirurgicală; dimensiunea pieselor trebuie să se situeze între 3 și 5 milimetri. Locul de recoltare al biopsiei prezintă o importanță deosebită în funcție de patologia studiată pentru a optimiza șansele de obținere a unei reacții pozitive. Recomandările actuale [] sunt prezentate în cele ce urmează:

Pemfigus, pemfigoid și alte maladii buloase autoimune cu bulă subepidermică: se recoltează biopsie perilezională, din pielea sau mucoasa perilezională de aspect normal [87] sau eritematoasă [93] adiacentă, dar fără să includă o bulă recentă sau activă. Trebuie evitată recoltarea de țesut din zone ulcerate, erodate sau cu bulă în suprafață, în aceste situații fiind posibilă apariția unor rezultate fals negative din cauza degradării complexelor imune [87]. În cazurile de pemfigoid se evită recoltarea din zonele acrale, în special membrele inferioare, la nivelul cărora antigenele specifice se regăsesc într-o densitate mică. Se specifică locul de recoltare a biopsiei pe buletinul ce însoțește piesa la laboratorul de histopatologie.

Dermatita herpetiformă: recoltarea fragmentului de țesut se efectuează din piele aparent sănătoasă, la 3-5 mm de marginea activă a leziunii. Se recomandă prelevarea mai multor fragmente bioptice simultan, întrucât densitatea antigenelor este relativ mică în aceasta afecțiune. Se specifică locul biopsiei pe buletinul ce însoțește piesa bioptică.

Lupus eritematos: se recoltează un fragment de țesut din tegument eritematos sau din periferia activă a unei leziuni recente. Se specifică pe buletinul de însoțire a piesei locul biopsiei și tipul de localizare – piele fotoexpusă sau fotoprotejată. Este de preferat să se evite prelevarea de fragmente din leziuni ulcerate sau situate la nivelul feței. În lupusul eritematos se recomandă efectuarea simultană de biopsii din tegument lezional și sănătos din zone neexpuse la soare (de preferat de la nivelul feselor sau feței interne a coapselor).

Transportul și prelucrarea fragmentului bioptic

Recoltarea fragmentului trebuie să se efectueze cât mai rapid pentru a evita procesele de autoliză. Dupa recoltare, fragmentul de țesut este fie crioprezervat fie introdus într-un mediu adecvat de transport și ulterior congelat. Crioprezervarea se efectuează prin congelarea fragmentului de țesut proaspăt, fără adăugare de fixatori chimici. Acest procedeu fizic de fixare a țesutului se efectuează prin mai multe metode, utilizând agenți de tip azot lichid, dioxid de carbon solid sau prin introducere la criostat, la o temperatură de -20 grade Celsius.

Introducerea în mediul de transport este metoda cea mai folosită în practica curentă, din motive tehnice ce țin de distanța în timp și spațiu dintre locația în care se efectuează prelevarea biopsiei și laboratorul de histopatologie. In aceste condiții, în care nu se poate efectua crioprezervarea imediat după recoltarea țesutului, fragmentul se păstrează în ser fiziologic la o temperatură de 4 grade Celsius pentru maxim 24 de ore []. Rezultate similare pot fi obținute prin plasarea fragmentului în mediu de transport Michel, o soluție ce conține sulfat de amoniu, care împiedică degradarea țesutului. Compoziția mediului Michel: 25ml 1 mol/l citrat de potasiu buffer (ph 7), 50 ml 0,1 mol/l soluție metil maleimidă, 875 ml apă distilată, 550 g sulfat de amoniu; ph final între 7,2 și 7,4 [].

În acest mediu țesuturile pot fi păstrate până la 2 săptămâni [94] la temperatura camerei și ulterior prelucrate. Dupa scoaterea din mediu, fragmentul se spală în trei reprize a câte 10 minute, folosind soluția tampon fosfat salin. Ulterior, fragmentele sunt congelate și pot fi păstrate la -70/-80 grade Celsius până ce țesutul va fi prelucrat [93], [].

Fixarea fragmentului reprezintă etapa decisivă în obținerea unor rezultate optime la imunofluorescență directă și se efectuează conform celor descrise mai sus, printr-un proces fizic – crioprezervare imediată sau chimic – fixatori, prin acestea fiind oprite cât mai rapid procesele vitale celulare și păstrându-se cu alterări minime volumul, forma, relieful și raporturile spațiale și moleculare în țesut. Fixatorii chimici acționează prin mecanisme de tip insolubilizare prin precipitare a unor constituenți celulari, formare de compuși de adiție între fixator și unii constituenți celulari sau coagularea proteinelor.

Ocazional, anumite fragmente prelevate pot fi introduse în mod accidental sau intenționat în soluție de formaldehidă 4%, mediul clasic de transport al pieselor utilizate pentru examinare histopatologică convențională. Deși utilizarea acestui mediu de transport are un impact negativ asupra nivelului de fluorescență a biopsiilor mucoase sau cutanate se păstrează totuși un anumit nivel al reacției []. În aceste situații prelucrarea tesutului se efectuează prin parafinare, parcurgând etapele de fixare (formaldehida 4%), spălare, deshidratare (cu alcool in concentrații crescânde începând cu 50 grade), clarificare (îndepărtarea alcoolului din piesă utilizând clarificatori miscibili cu parafină-alcool anilic sau hidrocarburi benzenice), impregnare (pătrundere o piesei cu parafină topită și solidificare in bloc prin răcire obținând o consistență omogena) și secționare la microtom. Utilizarea formaldehidei ca mediu de transport pentru piesele ce urmeazã a fi prelucrate pentru imunofluorescența directă nu este recomandată, întrucât acest mediu influențează negativ rezultatele acestei testări [95]. O expunere chiar și de scurtă durută (2 minute) determină pierderea completă a markerilor diagnostici pentru pemfigus; expunerea prelungită poate determina rezultate fals pozitive la nivelul nucleilor, ce pot fi interpretate in mod eronat ca sugestive pentru lupus erilematos. După expuneri între 10 minute si 2 ore, reactivitatea pentru pemfigoid bulos și dermatită herpetiformă prezintă nivele diferite de specificitate [95].

Secționarea fragmentelor crioprezervate se efectuează prin plasarea acestora in criostat. Numărul secțiunilor de obținut se stabilește în funcție de numărul serurilor fluorescente utilizate și de cel al secțiunilor adiționale utilizate ca și control. Grosimea acestora se situeaza între 4 și 6 microni. Se pot monta până la 5-6 secțiuni pe o lamă de microscop, separate prin linii drepte efectuate cu un creion cerat pentru a preveni amestecarea serurilor [94]. Pot fi de asemenea folosite lame eu camere speciale pentru separare sau flecare lamă poate fi incubată cu un singur tip de ser. Lamele sunt ulterior uscate în aer pentru 15-30 minute.

Imunomarcarea criosecțiunilor se efectuează imediat după secționare prin incubare cu anticorpi marcați fluorescent timp de 20-30 minute la 37 grade Celsius [92]. De rutină, se folosesc seruri ce conțin anticorpi anti IgG, IgA. IgM, C3 și anti fibrinogen [94]. In circumstanțe speciale se pot folosi și alte tipuri de seruri. Se îndepărtează excesul de serprin spălare cu tampon fosfat salin (ph 7.4) timp de 30 minute în trei reprize a câte 10minute. Ulterior se acoperă lama cu glicerina tamponată (90% glicerina în tampon fosfat salin) și se examinează la microscopul cu fluorescentă.

În cazul secțiunilor la parafină, imunomarcarca se efectuează după deparafinare cu hidrocarburi benzenice, hidratarea cu alcool în concentrații descrescătoare șl demascarea situsurilorantigenice prin utilizarea temperaturii (HIER-heat-induced epitope retrieval) sau a enzimelor proteolitice (PIER- proteolitic enzyme induced epitope retrieval).

Imunofluorescența directă efectuată prin tehnica salt – split skin(piele clivată) a fost dezvoltată pentru a putea efectua diagnosticul diferențial între pemfigoidul bulos și epidermoliza buloasă dobândită. Fragmentul de piele perilezională prelevat de la pacient este procesat în soluție 1M NaCl timp dc 24 de ore, în felul acosta producându-se o separare dermo-epidermică la nivelul laminei lucida. Proba se prelucrează apoi conform tehnicii standard de imunofluorescența directă.

II.3.2.2. Imunofluorescența indirectă

Imunofluorescența indirectă reprezintă o tehnică de marcare histologică serologică efectuată in două trepte prin care se examinează serul pacientului în scopul detectării prezenței anticorpilor specifici unui antigen definit [].

Această tehnică poate fi utilă pentru confirmarea diagnosticului de maladie buloasă autoimună sau pentru efectuarea diagnosticelor diferențiale între aceste tipuri de afecțiuni. Tipurile de substraturi utilizate pentru detectarea anticorpilor circulanți în maladiile buloase includ piele umană, esofag de maimuță [], esofag sau buză de porc de guineea [98], esofag sau buză de iepure, vezică urinară de șoarece [] sau piele umană salt-split []. Sensibilitatea și specificitatea acestor substraturi variază pentru diferitele maladii buloase []. De exemplu, esofagul de maimuță prezintă o sensibilitate crescută pentru anticorpii circulanți în pemfigusul vulgar [], pe când buza de porc de guineea poate fi utilă pentru detectarea anticorpilor circulanți in pemfigusul foliaceu [98]. Utilizarea substraturilor multiple pentru același ser poate crește sensibilitatea metodei.

Din punctul de vedere al etapelor tehnice ale metodei se descriu următoarele [88]: Se recoltează 5-10 ml sânge de la pacient, fără anticoagulant, se centrifughează pentru extragerea serului și se efectuează diluții seríate (1:10,1:20,1:40,1:80 etc).

Prima etapă a metodei constă în punerea în contact a serului cu secțiuni ale substratului adecvat ce conține antigenul corespunzător. Secțiunile substratului sunt montate pe lama de microscop și incubate cu serul pacientului timp de 30 de minute. Se îndepărtează ulterior excesul de proteine necomplexate prin spălare cu tampon fosfat salin în trei reprize a câte 10 minute. Se testează simultan seruri de control cu reactivitate cunoscută pozitivă și negativă.

Etapa a doua este similară tehnicii standard de efectuare a imunofluorescenței directe. Secțiunile sunt incubate cu ser ce conține anticorpi marcați fluorescent anti IgG, IgA, IgM la 37 grade Celsius timp de 30 de minute. Se îndepărtează apoi excesul de ser prin spălare cu tampon fosfat salin în trei reprize a căte 10 minute. Lamele sunt uscate în aer și acoperite cu glicerina tamponată și se examinează la microscopul cu fluorescentă.

Imunofluorescența indirectă pe substrat salt-split este utilă pentru efectuarea diagnosticului diferențial între pemfigoidul bulos și epidermoliza buloasă dobândită. Substratul selectat este incubat cu soluție 1M de NaCl pentru 72 de ore pentru a crea un clivaj artificial la nivelul laminci lucida. Ulterior proba se procesează conform tehnicii standard.

Imunofluorescența indirectă utilizând complementul

Reprezintă o tehnică serologică în trei etape prin care cantități foarte scăzute de anticorpi sunt detectate datorită afinității crescute a acestora pentru fixarea complementului [88]. Acest principiu de amplificare determină o sensibilitate foarte mare a tehnicii [88].

Prima etapă este similară cu cea efectuată în imunofluorescența indirectă standard, cu excepția inactivării prealabile a complementului din serul pacientului prin încălzire la 56 grade Celsius timp de 30 de minute [101]. Astfel activitatea de fixare a complementului de către complexele antigen-anticorp este distrusă []. Substratul de țesut este apoi pus în contact cu serul pacientului și se efectuează spălarea.

În a doua etapă secțiunile de țesut sunt incubate cu o sursă de complement, de obicei fiind utilizate ser uman sau ser de porc de guineea [88]. Anticorpii de tip IgG sau IgM ce fixează complementul, care au fost legați de antigen în prima etapă, își pot exercita activitatea activând cascada complementului și generând simultan numeroase molecule de C3 [88] legate de complexul antigen-anticorp în țesut. Se efectuează o nouă spălare a probei.

Etapa a treia constă în detectarea complementului prin punerea în contact a probei cu ser ce conține anticorpi anti C3 uman marcați fluorescent. După incubare și spălare cu tampon fosfat salin, secțiunile sunt examinate la microscopul cu fluorescentă. Ca și pentrutehnica de imunofluorescență indirectă standard se efectuează și probe de control cu seruri cunoscute pozitive și negative [].

În anumite afecțiuni există o cantitate foarte mică de anticorpi IgG sau IgM legată de antigenul tisular, astfel încât aceștia nu pot fi detectați prin imunofluorescență indirectă standard. Astfel, această tehnică poate fi utilă în aceste circumstanțe prin generarea moleculelor de C3 de către complexele antigen-anticorp [99], prezentând o sensibilitate crescută.

Valoarea practică a acestei tehnici se limitează la pemfigoidul/herpesul gestationis [88]. Factorul HG (herpes gestationis) este un anticorp antimembrană bazală ce fixează complementul ce se găsește în cantități minime în serul pacientelor cu pemfigoid gestationis și nu este detectabil prin imunofluorescență indirectă standard. Factorul HG poate fi detectat în 50% din cazuri prin imunofluorescență indirectă ce utilizează complementul, tehnica fiind utilă în situațiile în care biopsia nu se poate efectua sau rezultatele imunofluorescenței directe sunt echivoce [90].

Variante de imunofluorescență indirectă

Tehnica salt-split: descrisă anterior, aceasta este utilizată pentru diferențierea anumitor maladii buloase subepidermice, în care aspectele de imunofluorescență directă sunt similare. După incubarea pielii umane în soluție 1M de NaCl se produce clivajul la nivelul laminei lucida. Anticorpii specifici pemfigoidului bulos se detectează la nivelul tavanului și podelei bulei, pe când cei prezenți în epidermoliza buloasă dobândită se regăsesc doar la nivelul podelei bulei [87, 105].

Metoda mappingului antigenic: este o tehnică ce se utilizează complementar microscopiei electronice în scopul efectuării diagnosticului diferențial între diferitele forme de epidemoliză buloasă [105]. Se efectuează utilizând anticorpi primari monoclonali sau policlonali îndreptați împotriva diferitelor componente antigenice ale joncțiunii dermo-epidermice, incluzând antigenul pemfigoidului bulos, laminina și colagenul de tip IV. Planul de clivaj este determinat de identificarea tipurilor de antigene situate pe tavanul sau podeaua bulei induse mecanic. Toate aceste trei antigene sunt observate la nivelul podelei bulei – clivaj intraepidermic în bulele superficiale, laminina și antigenul pemfigoidului bulos la nivelul tavanului bulei și colagenul tip IV pe podeaua bulei- clivaj în lamina lucida în cazul bulelor joncționale, pe când în formele distrofice toate cele trei antigene se regăsesc la nivelul podelei bulei- clivaj în sublamina densa [105].

Metoda marcării duble: în această tehnică se utilizează simultan două tipuri de fluorofori, respectiv izocianatul de fluoresceină și izocianatul de tetrametilrodamină pentru a demonstra codistribuția a doua elemente antigenice în țesut [105]. Marcarea se poate efectua atât în metoda indirectă cât și în cea directă [105].

II.3.3. Interpretarea fluorescenței

Pentru interpretarea corectă a rezultatelor obținute prin această metodă, trebuie deosebită fluorescența specifică de cea nespecifică [88]. Anumite elemente tisulare, cum ar fi fibrele elastice din derm, emit fluorescență naturală atunci când sunt iradiate cu lumină ultravioletă [101]. O parte a acestei autofluorescențe poate fi blocată prin folosirea unor filtre speciale de absorbție [88].

Epidermul și dermul normal prezintă un fundal de fluorescență verzui-palid ce reflectă legarea nespecifică a serului la țesuturi [88]. Această fluorescență ușoară facilitează localizarea elementelor histologice diferite și localizarea corectă a imunoreactanților [88]. Fundalul de fluorescență poate fi redus prin utilizarea unei diluții adecvate a serului cu anticorpi marcați fluorescent [88]. Un aspect granular de fluorescență nespecifică poate să apară din cauza prezenței imunoglobulinelor agregate în serul folosit [101].

Pentru interpretarea unei probe de imunofluorescență directă se iau în considerare patru elemente importante: locul depunerii imunoreactanților, clasa de imunoglobuline sau tipul imunoreactantului, numărul imunoreactanților și orice alte depozite în alte zone decât localizarea principală [87]. Utilizând aceste elemente se poate stabili un algoritm ce determină obținerea unui diagnostic corect în majoritatea cazurilor de maladii buloase autoimune [].

În interpretarea imunofluorescenței indirecte se evaluează două elemente: clasa anticorpilor circulanți și localizarea acestora în substratul de țesut [87]. Majoritatea anticorpilor circulanți aparțin clasei IgG în pemfigus, pemfigoid bulos, pemfigoid ciactricial, pemfigoid gestationis, epidermoliza buloasă și lupus eritematos bulos [87]. IgA se regăsește caracteristic în dermatita lineară cu IgA și în pemfigusul cu IgA [87]. în dermntita herpetiformft nu s-a evidențiat prezența anticorpilor circulanți [90].

II.3.4. Aspecte tehnice particulare

În mod clasic se descriu două tipuri de probe ce pot fi examinate prin tehnici de imunofluorescență, respectiv fragmentele de tegument sau mucoase prelevate prin biopsie în cazul imunofiuorescenței directe, sau serul pacientului prin tehnica de imunofluorescență indirectă.

Au fost propuse însă și alte variante, introduse mai recent, ce pot fi folosite ca substrat în cele două tehnici descrise.

Examinarea lichidului de bulă în maladiile buloase autoimune prin efectuarea citologiei Tzanck reprezintă un instrument util în orientarea diagnosticului. Prezența celulelor acantolitice la examenul citologic este sugestivă, dar nu diagnostică pentru pemfigusul vulgar. Prin urmare, efectuarea imunofluorescenței directe pe lichidul de bulă pentru demonstrarea prezenței imunoreactanților ar putea crește specificitatea examinării Tzanck, pe lângă avantajul rapidității acestui test []. Concluzia unui studiu preliminar [108] relevă faptul ca imunofluorescență directă efectuată pe lichidul de bulă este comparabilă ca sensibilitate cu rezultatele obținute la testarea pe probe de tegument în pemfigusul vulgar cu debut recent. Se citează de asemenea efectuarea imunofiuorescenței indirecte având ca substrat fluid de la pacient lichidul de bulă [105].

O altă perspectivă este cea propusă pentru prima dată în anul 2003 de către Schaerer și Trueb [109], care studiază posibilitatea efectuării imunofluorescenței directe utilizând ca substrat firul de păr anagen prelevat de la pacienți cu pemfigus vulgar. Pornind de la premiza demonstrată că teaca epitelială externă a foliculului pilos este similară ca structură cu keratinocitele epidermice [] și exprimă similar keratinocitelor antigenele țintă ale pemfigusului – respectiv desmogleina 1 și 3 [], s-a evidențiat astfel modelul specific "în rețea" al pemfigusului la examinarea prin imunofluorescență directă a firului de păr, obținându-se rezultate similare cu cele demonstrate la efectuarea imunofluorescenței directe cutanate în cazul pacienților investigați astfel.

Studiile efectuate ulterior au demonstrat pozitivitatea imunofluorescenței directe efectuate pe firul de păr și în alte loturi de pacienți [, , ].

Utilizarea acestor substraturi diferite pentru efectuarea imunofluorescenței directe ar prezenta avantaje evidente comparativ cu metodele clasice ce presupun manevre invazive prin care se recoltează țesut (tegument, mucoase) sau sânge de la pacient. Evident, prelevarea firelor de păr (sau chiar a fluidului din bulă) reprezintă manevre neinvazive, nedisconfortante pentru pacient și mult mai ieftine, ușor de efectuat in cazul pacienților la care este dificil de recoltat biopsii – de exemplu copii, adulți necooperanți, localizări mucoase. Monitorizarea remisiunii imunologice in pemfigus prin efectuarea de imunofluorescențe directe repetate folosind ca substrat firul de păr in locul biopsiilor cutanate sau mucoase ar reprezenta de asemenea un alt avantaj major al metodei.

Pana la momentul actual, literatura de specialitatea este limitată in ceea ce privește informațiile legate de validarea acestor metode.

II.4. Descrierea modalităților practice de interpretare a imaginilor de imunofluorescență – prezentarea modelelor de fluorescență și implicațiile practice

Tehnicile de imunofluorescență contribuie la autentificarea diagnosticului sau monitorizarea evoluției în mai multe tipuri de afecțiuni cutanate. Interpretarea imaginilor obținute în urma prelucrării probelor supuse examinării poate reprezenta o provocare pentru clinician, de aceea este indispensabilă cunoașterea și descrierea corectă a modelelor de fluorescență evidențiate precum și modalitatea de corelare a acestora cu patologii specifice în scopul precizării diagnosticului sau monitorizării evoluției.

În cadrul cercetării efectuate imaginile de imunofluorescență vizualizate au fost interpretate și corelate patologic conform modelelor generale prezentate în cele ce urmează. Descrierea acestor modele poate reprezenta un ghid util clinicianului pentru încadrarea corectă a unei afecțiuni investigate într-o categorie precizată de boli.

II.4.1. Imunofluorescență în bolile buloase autoimune

Imunofluorescență este considerată standardul de aur în diagnosticul maladiilor buloase autoimune și reprezintă metoda de confirmare a unui diagnostic de etapă orientat de examinarea clinică și histopatologică [88, 105].

Studiile de imunofluorescență directă și indirectă oferă imagini sugestive pentru diagnosticul de confirmare a acestor afecțiuni în majoritatea cazurilor. Modelele de fluorescentă detectate, relativ la tipul, localizarea și modul de dispunere a imunoreactanților în probe prezintă o mare specificitate și sensibilitate și determină obținerea unui diagnostic de certitudine în majoritatea cazurilor de maladii bulose autoimune [87, 107].

II.4.1.1. Modele de imunofluorescență directă în maladiile buloase autoimune

În maladiile imunobuloase imunofluorescență directă detectează prezența moleculelor de tip imunoglobuline, complement sau fibrinogen în fragmentul de țesut prelevat de la pacient. Anterior au fost detaliate elementele ce influențează rezultatul acestei testări prin prisma efectuării unei tehnici corecte de prelevare a biopsiei, zona ideală de obținere a fragmentului în funcție de afecțiunea investigată, tipurile de țesut utilizate, mediile ideale de transport, modul de prelucrare a probelor de țesut pentru obținerea unor rezultate optime ale testelor de imunofluorescență. Toate aceste elemente prezintă o importanță deosebită, influențând în mod semnificativ rezultatele acestor studii, prin urmare cunoașterea și implementarea corectă a acestor aspecte tehnice de către medicii ce utilizează această metodă de investigație reprezintă o premiză esențială pentru obținerea unor rezultate coerente.

După cum am detaliat anterior, în maladiile buloase autoimune biopsia de piele sau mucoase trebuie prelevată din arii perilezionale pentru obținerea unor rezultate optime ale testărilor, pentru că la nivelul bulei sau zonelor inflamate depozitele imune pot fi parțial sau total degradate determinând apariția unor rezultate fals negative [87]. De asemenea, cercetări recente au investigat posibilitatea utilizării altor tipuri de probe ca substrat pentru imunofluorescență directă, respectiv fluid de bulă sau folicul pilos în cazul pacienților cu pemfigusuri [108, 109, 110, 111, 112, 113].

În evaluarea modelelor de imunofluorescență directă și stabilirea diagosticului de certitudine și diferențial se recomandă evaluarea a patru elemente: zona primară de depunere a imunoreactanților, clasa de imunoglobuline sau alte tipuri de depozite imune, numărul depozitelor imune sau, daca sunt de mai multe tipuri, depozitul cu fluorescența de intensitatea cea mai mare, depunerea de imunorcactanți în alte zone decât cea principală [87].

Se descriu pentru imunofluorescență directă câteva modele specifice ce pot fi sintetizate astfel [87, 88, 105]:

Depozite intercelulare

Depunerea de imunoreactanți în spațiul intercelular rezultă din legarea anticorpilor de proteinele desmozomale keratinocitare și este specifică pemfigusurilor [107]. Atunci când se identifică fluorescenta în spațiul intercelular este util să se evaueze clasa de imunoglobuline implicată, nivelul preferențial în care se leagă la nivelul epidermului (zona de maximă intensitate) și eventuala prezență a imunoreactanților în alte zone decât cea principală [87].

Depozite de IgG

Reprezintă marca pemfigusurilor (cu excepția pemfigusului cu IgA) și testarea este pozitivă în 90-100% din cazurile de boala activă [87] dacă specimenul de biopsie este prelevat respectând condițiile tehnice menționate anterior. Diagnosticul de pemfigus este discutabil dacă imunofluorescența directă este negativă [].

Modelul de fluorescență apare sub forma unor depozite liniare tipice pe suprafața keratinocitară descris clasic sub formă de „rețea" (Figura 4.1).

Figura 4.1. Pemfigus vulgar – IgG x 2oo, aspect de rețea

Aspectele întâlnite în pemfigusul vulgar sau foliaceu (pemfigusuri superficiale sau profunde) și variantele lor pot fi identice, dar de obicei fluorescența este limitată la ariile suprabazale în pemfigusul vulgar, pe când în formele superficiale de pemfigus intensitatea este maximă în straturile superioare ale epidermului [87, ]. Este posibil ca această constatare să provină din diferențele cantitative ale antigenelor țintă principale incriminate în patogenia celor două afecțiuni, respectiv desmogleina 3 pentru pemfigusul vulgar și desmogleina 1 pentm pemfigusul foliaceu []. Această constatare nu este însă utilizată în scop de efectuare a diagnosticului diferențial între cele două forme de boală [].

Aspectul fluorescenței este de rețea continuă în jurul keratinocitelor la o examinare cu magnificare standard dar la o mărire superioară se poate observa dispunerea punctată sau granulară a depozitelor ce reflectă legarea anticorpilor de proteinele desmozomale [87].

În pemfigusuri poate fi detectată și depunerea de complement (C3) cu un pattern similar celui al IgG dar cu o frecvență a apariției și o intensitate mai scăzută a fluorescenței [92] (Figura 4.2). Depunerea exclusivă de C3 la nivel intercelular nu poate confirma diagnosticul de pemfigus.

Figura 4.2: Pemfigus vulgar – C3 x 200, intensitate mai scăzută a fluorescenței

Depozite de IgA

Daca imunoreactanții depuși la nivel intercelular epidermic sunt exclusiv de tip IgA se stabilește diagnosticul de pemfigus cu IgA, cunoscut în literatura de specialitate și sub numele de dermatoză pustuloasă subcornoasă cu depozite intercelulare de IgA sau dematoză neutrofilică intraepidermică cu depozite intercelulare de IgA [87]. Fluorescența poate fi identificata predominant în straturile superioare ale epidermului sau constant în toate ariile epidermice [87]. Dacă pacienții prezintă atât depozite de IgA cât și depozite de IgG exclude această formă de pemfigus.

Depozite intercelulare și la nivelul membranei bazale

Prezența imunoreactanților de tip IgG la nivelul membranei bazale a epidermului și în spațiul intercelular este identificată în pemfigusul eritematos și în pemfigusul paraneoplazic [87].

În pemfigusul eritematos, o formă localizată de pemfigus foliaceu, se descrie prezența la nivelul membranei bazale de depozite de IgG, IgM și C3 cu aspect granular sau de bandă fibrilară iar la nivel intercelular se identifică aspectul clasic de rețea a depunerii depozitelor de IgG [87, ].

Pemfigusul paraneoplazic prezintă de asemenea atât depozite de IgG, frecvent și C3 la nivel intercelular dar si la nivelul membranei bazale. Deseori depunerile intercelulare prezintă o fluoresceță scăzută sau nespecifică, iar la nivelul membranei bazale fluorescența are aspect linear sau granular [118]. În cazul acestei afecțiuni se descriu mai frecvent rezultate fals negative ale imunofluorescenței directe [117].

Tabelul 4.1 prezintă o imagine de ansamblu, comparativă, a caracteristicilor imunofluorescenței în pemfigusuri, aceste aspecte fiind importante prin prisma contribuției imunofluorescenței in stabilirea diagnosticului de pemfigus. Imunofluorescența directă stabilește diagnosticul de pemfigus dar nu precizează tipul, însă poate fi extrem de sugestivă pentru un anumită formă de boală, mai ales în cazul pemfigusului paraneoplazic sau eritematos.

Tabelul 4.1.Imunofluorescența directã în pemfigusuri

Un dezavantaj al testărilor prin imunofluorescență reprezintă dificultatea diferențierii între formele de pemfigus (profund, superficial) doar pe baza modelului de fluorescență. Interpretarea diferențelor de intensitate intre straturile epidermului în funcție de forma de pemfigus (mai intens în straturile superficiale în pemfigusul foliaceu față de intensitate mai mare în straturile profunde în pemfigusul vulgar) trebuie interpretata cu precauție. Subtipul exact de pemfigus se precizează doar prin examinarea histopatologică a unui fragment de țesut ce conține bulă recentă [87].

Depozite la nivelul membranei bazale

Depunerea imunoreactanților exclusiv la nivelul membranei bazale se evaluează prin prisma a patru elemente: tipul imunoreactanților, numărul acestora, patternul morfologic, depuneri prezente în alte zone [90]. Se descriu următoarele modele de imunofluorescența directă [87]:

Depozite de IgG și/sau C3

Depunerea acestor imunoreactanți (rar a altor tipuri) la nivelul membranei bazale este întâlnită in pemfigoidul bulos, pemfigoidul gestationis, epidermoliza buloasă dobândită [87]. Diferențierea exclusiv pe baza imunofluorescenței directe a acestor afecțuni este in anumite cazuri dificilă și poate fi necesară efectuarea imunofluorescenței indirecte pentru confirmarea diagnosticului. Există insă anumite indicii ce pot orienta diagnosticul: depunerea mai intensă de C3 decât de IgG sugerează diagnosticul de pemfigoid bulos (Figura 3, 4) sau gestationis, pe când o intensitate mai mare a depozitelor de IgG față de C3 susține diagnosticul de epidermoliză buloasă dobândită [1], cauzele apariției acestor diferențe de fluorescenți nefiind elucidate.

Pemfigoidul bulos, se identifică prezența depozitelor de IgG și C3 de-a lungul membranei bazale la aproape 90% respectiv >90% din cazuri [119] (Figura 4.3, 4.4). Rareori se identifică prezența de IgM sau IgA. Depozitele au fost descrise ca având aspect liniar, tubular sau granular [87]. Această variație a patternului poate rezulta din diferențele de unghi din care se efectuează riosecțiunile, din intensitatea depunerilor și din locul de prelevare a biopsiei [87, ] Tehnica efectuată pe piele clivată identifică în majoritatea cazurilor depunerea imunoreactanților la nivelul versantului epidermic al bulei dar au fost de asemenea identificate depuneri la nivelul versantului dernne al bulei [87]. Ocazional, pemfigoidul bulos poate prezenta imunofluorescența directă pozitivă doar pentru C3 [119].

Figura 4.3. Pemfigoidul bulos – C3 x 200, intens pozitiv liniar membrana bazală

Figura 4.4. Pemfigoid bulos – IgG x 200, slab pozitiv liniar membrana bazală

Este important de reamintit faptul că în această afecțiune trebuie evitată recoltarea biopsiei cutanate de la nivelul gambelor sau plantelor pentru că densitatea antigenelor specifice este mai mică la acest nivel și sensibilitatea metodei scade în aceste cazuri. Fragmentul bioptic trebuie prelevat din tegument perilezional, așa cum s-a detaliat anterior, sau se poate recolta din piele sănătoasă de la nivelul feței anterioare a coapsei sau a antebrațului în cazul în care nu există leziuni active.

Pemfigoid gestationis: în toate cazurile de boală activă imunofluorescența directă este pozitivă [120] și identifică depozite omogene liniare de C3 de-a lungul membranei bazale, acest test fiind diagnostic [118]. În 25-50% din cazuri se identifică asociat și prezența de depozite de IgG [118, ]. Imunofluorescența directă pozitivă poate persista câteva luni după rezoluția leziunilor. Aceste depozite sunt regăsite și la nivelul placentei sau tegumentului fetal. Prin tehnica pielii clivate se evidențiază depozite pe versantul epidermic al bulei [87].

Depozite multiple

Epidermoliza buloasă dobândită: depozitele de IgG liniare, groase, intense, omogene, sunt întâlnite în toate cazurile, de asemenea în majoritatea cazurilor se identifică și depozite de C3 [120] dar cu o intensitate a fluorescentei mai scăzută decât pentru IgG. 2/3 din cazuri prezintă și depozite de IgA iar la 50% din pacienți se identifică depozite de IgM [87, 118]. Prin tehnica pielii clivate este relevată legarea imunoreactanților la nivelul versantului dermic al bulei [87].

Depozite de IgA

Aceste depozite se identifică în dermatita herpetiformă și dermatita cu IgA liniar, imunofluorescența directă fiind un element diagnostic esențial de diferențiere a celor două afecțiuni.

Dermatita herpetiformă: diagnosticul este confirmat prin imunofluorescența directă pozitivă în 100% din cazuri [87]. Se evidențiază depozite granulare de IgA la nivelul papilelor dermice (85% dintre pacienți) (Figura 4.5) sau depozite granulare continue de-a lungul membranei bazale (5-10% dintre pacienți) []. Ocazional se poate identifica un pattern fibrilar al depozitelor de IgA. Rareori și cu o fluorescentă mai scăzută se identifică depozite de IgG sau IgM iar C3 este identificat în 50% din cazuri [118] (Figura 4.6).

Figura 4.5. Dermatita herpetiformă – IgA x 200, granular papile dermice

Figura 4.6. Dermatită herpetiformă – C3 x 200, granular papile dermice

Tabelul 4.2 sintetizează aspectele de imunofluorescență directă caracteristice maladiilor buloase autoimune subepidermice. Cunoașterea acestor modele de fluorescentă și corelarea lor cu patologiile specifice este esențială pentru diagnosticarea corectă a acestor afecțiuni.

Tabelul 4.2. Imunofluorescența directă in bolile buloase autoimune subepidermice

Imunofluorescența directă utilizând ca substrat pielea clivată reprezintă o metodă practică, simplă, de diferențiere între grupul de afecțiuni de tip pemfigoid pe de o parte și epidermoliza buloasă dobândită și lupusul eritematos sistemic bulos pe de altă parte [87]. Această distincție poate fi greu de efectuat în anumite cazuri doar utilizând criteriile clinice, histopatologice și imunofluorescența directă pe tegument neclivat.

Depozitele de imunoreactanți din pemfigoid (toate tipurile) se situează la nivelul laminei lucida, corespunzător localizării domeniului extracelular al antigenului BP180 ce conține epitopii dominanți recunoscuți de autoanticorpii patogenici caracteristici pemfigoidului bulos [87].

În epidermoliza buloasă dobândită depozitele de imunoreactanți se situează la nivelul sublaminei densa, zonă în care se regăsește antigenul țintă-colagenul de tip VII, de la nivelul fibrilelor de ancorare. Incubarea fragmentului de biopsie cu sol NaCl 1 mol/l determină clivarea laminei lucida în zona sa inferioară. Prin urmare depozitele caracteristice pemfigoidului bulos se vor localiza pe versantul epidermic al zonei de clivaj, pe când în epidermoliza buloasă dobândită situarea inumoreactanților se descrie la nivelul versantului dermic. Depuneri exclusiv la nivelul versantului dermic pot fi întâlnite rareori in pemfigoidul bulos [, ]. De asemenea se pot întâlni situații in care se descrie o fluorescență dermică simultan cu fluorescență epidermică dar de intensitate mai scăzută [87], probabil acest fapt fiind determinat de recunoașterea unor epitopi din structura antigenului BP180 situați in apropierea laminei densa [].

Mappingul antigenic prin fluorescențe combinate este o altă tehnică de diferențiere a pemfigoidului bulos de epidermoliza buloasă dobândită. Utilizând diferiți markeri fluorescenți se determină locația cunoscută a colagenului VII cu fluorescența roșie și locația depozitelor de IgG cu fluorescența verde [88].În pemfigoidul bulos se constată un pattern diferențiat pe culori ce constă in benzi roșii și verzi ce nu se suprapun, pe când in epidermoliza buloasă dobândită patternul este de tip overlap, fără a exista o distingere netă a benzilor fluorescente [88, ].

II.4.1.2.Modele de imunofluorescența indirectă in maladiile buloase autoimune

Imunofluorescența indirecta este o tehnică utilă pentru stabilirea unui diagnostic de certitudine sau diagnostic diferențial în maladiile buloase autoimune. Pentru obținerea unui rezultat optim al acestei testări este foarte importantă utilizarea substratelor adecvate, în funcție de afecțiunea investigată. În evaluarea rezultatelor obținute prin imunofluorescența indirectă se iau in considerare următorii parametrii: clasa anticorpilor circulanți și localizarea depozitelor la nivelul tegumentelor [87]. Majoritatea autoanticorpilor circulanți aparține clasei IgG în pemfigusuri, grupul pem-figoid, epidermoliza buloasă dobândită [87]. IgA este caracteristic pemfigusului cu IgA și dermatitei cu IgA liniar [87]. În dermatita herpetiformă nu au fost detectați autoanticorpi circulanți. Locul de fixare a depozitelor se situează fie la nivel intercelular epidermic fie la nivelul membranei bazale epidermice [87].

Depozite intercelulare

Depozite de IgG

Autoanticorpii circulanți din clasa IgG dispuși în rețea intercelulară sunt caracteristici pemfigusului vulgar și apar la peste 80% din pacienți [120]; se întâlnesc de asemenea și în pemfigus eritematos, paraneoplazic sau postmedicamentos. Utilizarea unor substrate diferite îmbunătățește sensibilitatea metodei, esofagul de maimuță fiind substratul preferat pentru pemfigusul vulgar [122]. Titrul anticorpilor circulanți este corelat cu activitatea bolii prin urmare metoda poate fi folosită pentru monitorizarea evoluției și răspunsului terapeutic [90]. În pemfigusul paraneoplazic pe lângă depozitele intercelularc cu aspect de rețea pentru IgG se pot identifica de asemenea depozite similare la nivelul membranei bazale deoarece autoanticorpii caracteristici acestei afecțiuni sunt îndreptați atât împotriva unor proteine desmozomale cât și hemidesmozomale. Substratul ideal pentru imunofluorescența indirectă în pemfigusul paraneoplazic este vezica urinară de șoarece, sensibilitatea metodei fiind de circa 75% iar specificitatea de 83% []. Această testare reprezintă cea mai bună metodă de screening pentru pemfigusul paraneoplazic [87].

Acești autoanticorpi pot fi detectați și la pacienți ce nu prezintă pemfigus. Aspectul caracteristic pemfigusului a fost descris și în cazul unor pacienți cu arsuri, erupții postmedicamentoase (penicilină), grefe cutanate, pemfigoid bulos sau pemfigoid cicatriceal [87].

Depozitele de IgA intercelulare epidermice cu aspect de rețea sunt caracteristice pemfigusului cu IgA și se identifică în circa 50% din cazuri []. Titrul anticorpilor circulanți este deseori scăzut sau nedetectabil. Au fost descrise șî câteva cazuri în care s-au identificat atât IgA cât și IgG circulanți [].

Depozite la nivelul membranei bazale

Depozite de IgG

Acești autoanticorpi sunt prezenți în serul pacienților cu pemfigoid bulos, pemfigoid gestationis, epidermoliză buloasă dobândită [87]. Aspectul obținut prin imunofluorescență indirectă este similar în toate aceste afecțiuni, deși depozitele pot fi mai groase și mai intense în epidermoliză buloasă dobândită față de afecțiunile din grupul pemfigoid [90]. Prevalenta acestor autoanticorpi în diferitele maladii imunobuloase subepidermice este diferită, prin urmare aceste teste ar putea fi utile în mod indirect pentru diferențierea între diferitele afecțiuni [87].

Pemfigoidul bulos: circa 75% dintre pacienți au autoanticorpi circulanți de tip IgG îndreptați împotriva membranei bazale [120]. Rezultatele fals pozitive sunt rare, prin urmare testarea pozitivă este diagnostică. Prin tehnica pielii clivate se crește sensibilitatea metodei și se efectuează diferențierea față de epidermoliză buloasă dobândită datorită faptului că în pemfigoidul bulos imunoreactanții se situează în majoritatea cazurilor exclusiv la nivelul versantului epidermic al bulei, rareori fiind prezent un pattern dermo-epidermic. Din aceste motive se recomandă ca această tehnică sa fie efectuată de rutină la pacienții cu pemfigoid bulos [120].

Imunfluorescența indirectă poate fi efectuată utilizând ser, fluid de bulă sau urina pacientului (în acest caz sensibilitatea fiind mai mică), acestea din urmă fiind o alternativă pentru pacienții necooperanți (adulți, copii) [120].

Efectuarea imunofluorescenței indirecte pe mucoase nu crește sensibilitatea metodei [120]. Pemfigoid gestationis: imunofluorescență indirectă este pozitivă în doar 25% din cazuri pentru detectarea autoanticorpilor de tip IgG [120]. Aceștia se regăsesc la nivelul versantului epidermic în tehnica pielii clivate [120].

Factorul herpes gestaționis, un anticorp de tip IgG ce fixează complementul, este identificat in 50% din cazuri [92]. Tehnica aceasta reprezintă o metodă de imunofluorescență indirectă amplificată, prin care cantități foarte mici de anticorpi, nedetectabili prin metoda clasică, sunt identificate datorită capacității lor de fixare a complementului. Metoda a fost descrisă în detaliu din punct de vedere al tehnicii, anterior în cursul acestei lucrări. Substratul este piele umană, de preferat clivată, ce este incubată cu serul pacientului și apoi cu o sursă de complement activ (ser uman proaspăt) iar în final cu anticorpi anticomplement marcați fluorescent. Anticorpii fixatori de complement se leagă de membrana bazală și apoi leagă un număr crescut de molecule de complement la locul depozitelor. Acest număr mare de molecule de complement de la nivelul membranei bazale se leagă de anticorpii anticomplement și produc fluorescentă vizibilă [87]. Deoarece procedura tehnică este mai laborioasă decât cea a metodei clasice de imunofluorescență indirectă testarea este frecvent negativă, prin urmare nu se efectuează de rutină ci doar în cazurile în care examinarea histopatologică și prin imunofluorescență directă nu este diagnostică [87].

Epidermoliza buloasă dobândită: testarea este pozitivă în circa 50% din cazuri utilizând piele umană normală sau esofag de maimuță ca substrat [87]. Prin tehnica pielii clivate se evidențiază depunerea lai nivel dermic a imunoreactanților [120], ceea ce facilitează diagnosticul diferențial cu afecțiunile din grupul pemfigoid.

Alți autoanticorpi

În dermatita herpetiformă a fost descrisă prezența autoanticorpilor circulanți îndreptați împotriva unor antigene nontegumentare: anticorpi antiendomissium, antireticulină sau antigliadină [87]. Aceștia nu prezintă valoare diagnostică pentru dermatita herpetiformă.

Tabelul 4.3 prezintă o sinteză a modelelelor de imunofluorescență indirectă în maladiile buloase autoimune și corelarea acestora cu afecțiunile specifice.

II.4.2. Imunofluorescența în bolile autoimune de țesut conjunctiv(lupus eritematos)

Imunofluorescență este o investigație utilă în diagnosticul bolilor de țesut conjunctiv, mai ales în cazurile de lupus eritematos dar cu aplicații utile și pentru efectuarea diagnosticului diferențial în alte boli de țesut conjunctiv.

Lupusul eritematos reprezintă o categorie de afecțiuni în care atât metoda directă cât și cea indirectă de imunofluorescență își regăsesc utilitatea diagnostică.

II.4.2.1. Imunfluorescența directă în lupusul eritematos

Examinarea pielii pentru evidențierea depunerii de imunoreactanți, efectuată prin imunofluorescență directă, nu înlocuiește examenul histopatologic [] acesta fiind de elecție pentru stabilirea diagnosticului de lupus eritematos, corelat cu examenul clinic al pacientului și/sau alte investigații paraclinice.

Biopsia se prelevează din periferia activă a unei leziuni recente, din tegument eritematos sau dintr-o leziune veche netratată [87, 93]. Este de preferat să se evite prelevarea de fragmente din leziuni vechi ulcerate sau situate la nivelul feței [93]. Efectuarea simultană de biopsii din tegument lezional și sănătos din zone neexpuse la soare (de preferat de la nivelul feselor sau feței interne a coapselor) este de asemenea recomandată [93].

Caracteristica majoră a testării prin imunofluorescență directă a pielii lezionale în lupusul eritematos cutanat este depunerea de anticorpi la joncțiunea dermo-epidermică și în jurul foliculilor piloși [130]. Aceste depozite sunt descrise în mod tipic sub formă granulară și sunt constituite in principal din IgG, lgM, uneori IgA [130]. De asemenea se pot evidenția și depozite de complement [130].

În funcție de forma clinică de lupus eritematos se descriu următoarele caracteristici la examinarea prin imunofluorescență directă:

Lupus eritematos discoid: se evidențiază prezența autoanticorpilor de tip IgG, IgM și a complementului de-a lungul joncțiunii dermo-epidermice in leziuni cutanate cu evoluție de minim 6 săptămâni la circa 80% dintre pacienți [] (Figura 4.7, 4.8, 4.9). De asemenea se poate distinge prezența IgM și IgA la nivelul corpilor citoizi [87] (Figura 4.10). Au fost descrise câteva patternuri ale fluorescentei de-a lungul joncțiunii dermo-epidermice: liniar, granulri sau difuz („shaggy") [87] dar de regulă aspectul este omogen în leziunile cu evoluție de lungă durată [131]. Benzile liniare sunt continue și pot fi subțiri sau groase, depozitele granulare au aspect discontinuu și sunt fine sau groase iar depozitele difuze reprezintă benzi îngroșate de-a lungul joncțiunii dermo-epidermice [87].

Figura 4.7 Lupus eritematos cronic – IgG x 400, granular membrană bazală

Figura 4.8. Lupus eritematos cronic – IgM x200, granular membrană bazală

Figura 4.9. Lupus eritematos cronic – C3 x200, granular membrană bazală

Figura 4.10. Lupus eritematos cronic – IgM x 200, intens pozitiv corp citoizi si pozitiv granular membrană bazală

Frecvența depunerii de imunoreactanți în leziunile de lupus discoid depinde de locul de prelevare a biopsiei, de durata de evoluție a leziunii și de tratamentele anterioare [87]. Testarea este pozitivă în 60-94% din fragmentele recoltate de la nivelul leziunilor și sunt de obicei absente în tegumentul nelezional [87]. Unele studii raportează faptul că imunofluorescența directă pozitivă a fost evidențiată în 96% din leziunile de la nivelul feței, 65% din alte zone fotoexpuse și 30% pe leziuni din tegument neexpus [87, ]. Pozitivarea testului este mai scăzută în leziunile de la nivelul trunchiului și în cele tratate cu dermatocorticoizi (61%) față de cele netratate [132]. Chiar și tratamentele efectuate anterior, cu până la 3 săptămâni anterior biopsiei, scad procentul rezultatelor pozitive la testarea prin imunofluorescență directă [132]. Durata de evoluție a leziunilor influențează de asemenea rezultatele acestei testări, în sensul că doar 1/3 din leziunile cu evoluție sub 30 de zile sunt pozitive, în timp ce aproximativ 80% din leziunile cu evoluție de circa 1 an prezintă imunofluorescență directă specifică pentru lupus eritematos [87, 132].

Imunoreactanții sunt detectați și la nivelul mucoasei orale și conjunctivei []. C1q este prezent la 29% dintre pacienți și prezența acestuia semnifică un risc crescut pentru a dezvolta forma sistemică de boală [131]. Properdina, un indicator al activării complementului, poate fi evidențiată la nivelul joncțiunii dermo-epidermice în circa 70% din leziuni de obicei în asociere cu depozite de imunoglobuline, C3, C4 și de asemenea poate fi prezentă în pielea nonlezională [131]. Nivelele sale serice sunt crescute în lupusul eritematos discoid și sistemic [131].

Depozitele de imunoreactanți la nivelul joncțiunii dermo-epidermice se pot întâlni și în alte afecțiuni, precum și în zone de tegument expuse cronic la soare, acestea nefiind specifice lupusului eritematos [87, 131] (Tabelul 4.4.). Cu toate acestea, în lupusul eritematos depozitele sunt marcate și conțin mai multe clase de imunoglobuline, combinația de IgG și IgM fiind în favoarea diagnosticului de lupus eritematos discoid87, pe când în celelalte condiții acestea sunt mai puțin accentuate la nivelul joncțiunii dermo-epidermice și mai intense Ia nivelul pereților vasculari [131].

Pentru confirmarea diagnosticului de lupus eritematos discoid, locul ideal de prelevare a biopsiei cutanate este dintr-o leziune veche, netratată, situată intr-o zonă nefotoexpusă [87]. Diagnosticul histopatologic rămâne metoda cea mai specifică pentru diagnosticul lupusului eritematos discoid și trebuie efectuat înainte de imunofluorescența directă.

Lupusul eritematos cutanat subacut: imunofluorescența directă este pozitivă în 54% până Ia 100% din leziunile de lupus eritematos subacut [87], mai frecvent în leziunile papulo-scuamoase decât în cele inelare [131]. Depozitele imune se localizează la nivelul joncțiunii dermo-epidermice (frecvent IgG, IgM) sau în corpii citoizi (IgM, IgA) cu patternuri similare celor descrise pentru forma discoidă [87].Se descrie și un pattern special cu aspect de particule fluorescente fine („dustlike pattern") sau granular, constituite din citoplasmă și nucleul keratinocitelor bazale [87], [132] (Figurile 4.11, 4.12, 4.13). Acest pattern a fost considerat mai specific pentru această formă de boală deoarece probabil reflectă legarea anticorpilor anti-Ro și/sau anti-La de antigenele țintă din interiorul keratinocitelor [87]; Cu toate acestea, acești anticorpi se regăsesc și la pacienți care nu prezintă afecțiunea, la care se întâlnește acest model de fluorescență, prin urmare specificitatea acestuia nu este atât de mare cum s-a considerat inițial [87].

Tabelul 4.4. Afecțiuni ce prezintă depozite imune la nivelul joncțiunii dermo-epidermice

Figura 4.11. Lupus eritematos subacut – IgG x 400, pozitiv granular membrană bazală și pozitiv la nivelul unor keratinocite epidermice

Figura 4.12. Lupus eritematos subacut – IgG x 200, pozitiv granular membrană bazală și pozitiv fin granular în grupuri mici de keratinocite

Figura 4.13. Lupus eritematos subacut – IgG x 400, pozitiv granular keratinocite

Conform datelor publicate, imunofluorescența directă pe piele nelezională prezintă procente extrem de variabile ale pozitivității, respectiv între 18-100% din cazuri, iar în cazul rezultatelor pentru pielea nelezională nefotoexpusă se menține variabilitatea procentelor între 0-100% din cazuri [87].

Lupusul eritematos cutanat acut: imunoglobulinele de tip IgG, IgM, IgA precum și complementul (C1, C3), rareori IgE, IgD, fibrină sau alți factori ai complementului, se evidențiază prin imunofluorescența directă la nivelul joncțiunii dermo-epidermice în peste 80% din leziunile cutanate de tip acut [87, 131]. Apar mai frecvent în zonele fotoexpuse și sunt prezente invariabil în leziunile acute, deși în cele timpurii sau cu evoluție de lungă durată testarea poate fi negativă [131]. În leziunile de lupus eritematos acut a fost de asemenea demonstrată prezența fibrinei și properdinei; depozitele de properdină au fost evidențiate și în pielea normală și par a se corela cu activitatea bolii [131]. Dispunerea imunoglobulinelor la nivelul joncțiunii dermo-epidermice este considerată caracteristică lupusului eritematos și a fost denumită banda lupică129.Unii autori folosesc acest termen exclusiv pentru leziunile apărute în piele nelezională pe când alții îl folosesc atât pentru depozitele evidențiate la nivelul leziunilor cât și în tegumentul nelezional [87]. În lupusul eritematos acut aceste depozite imune sunt constituite în mod caracteristic din mai multe clase de imunoglobuline, prezența simultană de IgG, IgM și IgA fiind înalt sugestivi pentru diagnostic, ca și combinația IgG și IgM [131]. Prezența unui singur tip de imunoreactant este în favoarea unui alt diagnostic decât lupusul eritematos [131]. Circa 75% dintre pacienți prezintă banda lupică și la nivelul pielii nonlezionale fotoexpuse, pe când în tegumentul nelezional nefotoexpus procentul se situează la circa 50% [131]. Aspectul fluorescenței de-a lungul membranei bazale poate fi liniar, granular sau difuz („shaggy") (1),intensitatea fluorescenței fiind corelată cu nivelul anticorpilor anti ADN dublu catenar, direct proporțională cu activitatea bolii [].

Evidențierea depozitelor granulare sau omogene de imunoglobuline la nivelul membranei bazale este evidențiabilă în mucoasa lezională și nonlezională în 100%, respectiv 71% din cazurile de lupus eritematos acut [].

Un alt model de fluorescență întâlnit este evidențierea corpilor citoizi la nivelul dermului papilar (IgM, IgA. rar complement sau IgG) sau localizarea depozitelor imune la nivelul pereților vaselor dermului superficial, similar vasculitelor (1) (Figura 4.14). În anumite situații se poate identifica fluorescență la nivelul nucleilor keratinocitelor epidermice (IgG), de obicei la pacienți cu anticorpi antiU1RNP (1) dar și în cazul prezenței altor tipuri de anticorpi antinucleari, in 10 panã la 30% din cazuri [87, 131].

Figura 4.14. Lupus eritematos acut – IgM x 200, slab pozitiv granular membrană bazală, pozitiv în pereții vaselor

Prevalența depunerilor de imunoglobuline și complement în lupusul eritcmatos acut depinde de mai mulți factori, printre care morfologia leziunilor, locul de prelevare a leziunilor, tratamentele anterioare și activitatea bolii [87]. În forma sistemică de lupus eritematos se pot întâlni la nivel cutanat și leziuni specifice de tip discoid sau subacut, la nivelul cărora procentul pozitivării imunofluorescenței directe este similar celui din aceste forme de boală. În leziunile specifice formei acute (rashul malar, erupția generalizată morbiliformă fotoindusă) procentul se situează intre 50-100% [87]. Procentul scade la nivelul pielii nelezionale și este mai mare în pielea fotoexpusă comparativ cu cea protejată de expunerea la soare [87]. De asemenea zona topografică de recoltare a biopsiei influențează rezultatele testării, fragmentele recoltate de la nivelul feței fiind mai frecvent pozitive decât cele de la nivelul trunchiului [87]. Terapia imunosupresoare sistemică scade frecvența pozitivării, ca și scăderea gradului de activitate al bolii [132].

În cadrul unuia dintre articolele de referință ale domeniului, Mutasim și Adams [87] efectuează o sinteză a datelor în ceea ce privește procentele raportate de diferiți autori relativ la pozitivarea imunofluorescenței directe în lupusul eritcmatos. Rezultatele sunt extrem de variabile: pentru pielea lezională procentul pozitivării este de 50-100% în lupusul eritematos acut, 73-90% în forma subacută, 60-94% în forma discoidă; dacă biopsia se prelevează din tegument sănătos fotoexpus procentele sunt de 73-90%, respectiv 18-100%, 0-10% pentru diferitele forme de boală; în cazul tegumentului sănătos nefotoexpus rezultatele raportate sunt de 26-92% pentru forma acută de boală, 0-100% pentru forma subacută și 0-10% pentru forma discoidă de lupus eritematos.

Așa cum rezultă din privirea comparativă a rezultatelor globale în ceea ce privește forma de boală și tipul de piele examinat,aceste procente sunt extrem de variabile între diferitele raportari,diferențe ce provin cu certitudine și din faptul că pozitivarea imunofluorescenței directe în lupusul eritematos este influențată semnificativ de factori multiplii,suplimentar față de parametrii examinati în studiile publicate.

II.4.2.2. Imunofluorescența indirectă în lupusul eritematos

Metoda este utilizată pentru detectarea anticorpilor antinucleari (ANA) circulanți în serul pacienților cu lupus eritematos.

Testul ANA presupune identificarea autoanticorpilor prezenți în serul pacientului îndreptați împotriva antigenelor prezente în nucleii celulari ai mamiferelor []. Versiunea curentă a testului folosește ca substrat o linie de celule umane tumorale (Hep-2) [137]. Autoanticorpii sunt detectați prin punerea în contact cu ser ce conține anticorpi marcați fluorescent specifici pentru imunoglobulinele umane legate de nuclei la nivelul substratului celular. Conform statisticilor testarea este pozitivă la circa 98-99% dintre pacienții cu lupus eritematos sistem, doar1-2% dintre cazuri fiind ANA negative utilizând substratul de celule tumorale umane [137].

Evaluarea rezultatelor acestui test este cuantificată în titruri ale reacției, titrul ANA reprezentând ultima diluție a serului în care se identifică fluorescență nucleară. Această interpretare implică un element de subiectivitate determinat de evaluarea tehnicianului de laborator în ceea ce privește diluția la care nu se mai observă fluorescența. Au fost propuse și alte metode cantitative de măsurare (de exemplu in unități internaționale) însă și la momentul actual titrul ANA este cel mai utilizat ca metodă cantitativă de evaluare a rezultatelor testului [137].

Titrul ANA considerați normal pentru un individ sănătos de către cele mai multe laboratoare se situează sub 1/40, valoarea anormală fiind considerată 1/40-1/80. Totuși studiile efectuate pe pacienții cu lupus eritematos sistemic în comparație cu populația sănătoase au demonstrat faptul că această valoare nu este cea mai potrivită pentru specificitatea maximă a diagnosticului și au situat acest titru ca fiind semnificativ la o valoare de peste 1/160 in cazul pacienților cu lupus eritematos [137]. Chiar și utilizând această valoare se descriu valori de peste 1/160 ale ANA la adulții tineri sănătoși în circa 5% din razuri [137].

Prin această metodă pot fi identificate mai multe modele de fluorescență: omogen, periferic, particulat, nucleolar sau centromeric,acestea având în majoritatea cazurilor o specificitate mică pentru boala și nefiind relevante pentru atitudinea terapeutică [137]. Un pattern periferic al ANA poate fi sugestiv pentru anticorpii antiADN dublu catenar, dar și alți autoanticorpi pot determina apariția acestui model de fluorescență [137]. Metodele serologice de determinare specifică a fiecăruia dintre autoanticorpii circulanți în lupusul eritematos sunt de tip ELISA., westernblot. ș.a. Cu toate acestea imunofluorescența indirectă rămâne metoda de elecție pentru screeningul de detectare a ANA [137].

II.5. Studiu retrospectiv asupra aplicațiilor imunofluorescenței în diagnostic

II.5.1. Descriere generală

Se prezintă studiul retrospectiv efectuat pe un lot de 64 de pacienți cu patologii cutanate diferite la care s-a efectuat imunofluorescența. Lotul a fost constituit din pacienți internați în perioada 2010-2012 în Ambulatoriul de dermatologie și secția de Dermatologie a Spitalului Clinic Județean de Urgență Brașov. Am efectuat analiza fișelor de observație și am evaluat rezultatele obținute la testarea prin imunofluorescență. Pentru cazurile analizate a fost evaluat algoritmul de diagnostic utilizat și contribuția imunofluorescenței în precizarea diagnosticului de certitudine.

II.5.2. Obiective

Prin efectuarea acestui studiu s-a urmărit ca obiectiv principal evaluarea importanței, valorii și aplicațiillor imunofluorescenței în practica dermatologică. Obiectivele de etapă ale studiului efectuat au fost:

Evaluarea sensibilității, specificității și valorii predictive a imunofluorescenței directe pentru diagnosticul afecțiunilor buloase autoimune și lupusului eritematos;

Evaluarea aspectelor de imunofluorescență directă identificate și a contribuției acestora la precizarea diagnosticului diferitelor patologii studiate;

Elaborarea unei sinteze a rezultatelor imunofluorescenței directe raportat la tipul de afecțiune.

II.5.3. Material și metodă

Studiul a fost efectuat astfel:

1. Selecția pacienților

Prin studierea datelor de înregistrare a pacienților în cadrul laboratoarelor de anatomie patologică/imunopatologie au fost identificate cazurile în care s-a efectuat imunofluorescența directă.

Din totalul cazurilor identificate anterior au fost selectate toate cazurile cu diagnosticul de lupus eritematos și pemfigus, și o parte dintre cazurile cu alte tipuri de maladii buloase autoimune pentru care se efectuase imunofluorescență directă.

2. Colectarea datelor

Pentru cazurile selectate au fost colectate datele referitoare la elementele clinice si paraclinice din fișele de observație ale pacienților.

Datele colectate au cuprins:

identificarea pacientului: pentru asigurarea confidențialității, fiecărui pacient i-a fost atribuit un cod;

date clinice: au fost înregistrate date referitoare la contextul clinic;

date de laborator: au fost înregistrate investigațiile paraclinice efectuate pentru confirmarea diagnosticului. Pentru imunofluorescența directă a fost înregistrată descrierea consemnată în buletinul de analiză; au fost de asemenea colectate fotografiile efectuate în cazurile în care imaginile obținute prin imunofluorescența fuseseră anterior înregistrate prin fotografiere.

3. Analiza datelelor obținute

Pentru cazurile selectate s-a efectuat:

evaluarea algoritmului de diagnostic utilizat;

evaluarea rezultatelor imunofluorescenței directe;

corelarea rezultatelor imunofluorescenței directe cu diagnosticul de caz.

Au fost selectate 64 cazuri, patologii cutanate diferite în care a existat opțiunea pentru efectuarea imunofluorescenței (Tabelul 5.1.). În cazul tuturor pacienților a fost analizat rezultatul metodei directe, metoda indirectă fiind efectuată într-un număr foarte redus de cazuri – 7 cazuri (1 caz pemfigus vulgar, 4 cazuri pemfigoid bulos, 1 caz epidermoliză buloasă dobândită).

Distribuția pacienților pe tipuri de patologii cutanate

Din totalul de 64 de pacienți investigați, 41 au fost diagnosticați cu maladii buloase autoimune, 23 cu boli autoimune de țesut conjunctiv. Proporția majoritară a pacienților în lotul analizat a fost constituită de cazurile de maladii buloase autoimune (Figura 5.1).

Tabelul 5.1. Descrierea lotului de pacienți incluși în studiu

Figura 5.1. Distribuția pacienților pe tipuri de afecțiuni

În lotul pacienților cu maladii buloase autoimune au fost analizate 19 cazuri de pemfigus (14 pemfigus vulgar, 1 pemfigus vegetant, 3 pemfigus eritematos, 1 pemfigus paraneoplazic), 16 cazuri de pemfigoid bulos, 4 cazuri de dermatită herpetiformă, 1 epidermoliză buloasă dobândită, 1 pemfigoid gestationis. Nu au fost indentificate cazuri de pemfigus cu IgA sau pemfigus postmedicamentos. Cazurile de pemfigus au reprezentat proporția majoritară în lotul pacienților cu maladii imunobuloase (59%) (Figura 5.2).

Figura 5.2. Distribuția pacienților cu boli buloase autoimune

Figura 5.3. Distribuția pacienților cu boli autoimune de țesut conjunctiv

Bolile autoimune de țesut conjunctiv au fost distribuite astfel: lupus eritematos 23 cazuri 14 formă cronică, 5 formă subacută, 4 formă acută). Cazurile de lupus eritematos forma cronică a reprezentat proporția majoritară în lotul pacienților cu boli autoimune de țesut conjunctiv (82%) (Figura 5.3).

Vârsta medie a lotului de pacienți a fost de 53,34 de ani, cu o predominență a sexului feminin (57% femei – 36 cazuri, 42,2% bărbați – 28 cazuri).

Imaginile prezentate exemplifică câteva aspecte clinice sugestive pentru tipurile de afecțiuni investigate (Figurile 5.4-5.16).

Figura 5.16. Lupus eritematos cronic – atrofie cicatriceală la nivelul scalpului

Diagnosticul a fost stabilit pe baza examenului clinic și a investigațiilor paraclinice, orientate în funcție de patologia investigată. S-au efectuat pe lângă examinările de laborator uzuale, examen histopatologic, investigații imunologice, testare prin imunofluorescență directa/imunofluorescență indirectă. În cazul tuturor pacienților a fost efectuat examen histopatologic al leziunilor cutanate și imunofluorescență directă pe fragmente cutanate lezionale sau perilezionale. În cazurile de boli atutoimune de țesut conjunctiv, s-a efectuat imunofluorescență indirectă pentru depistarea ANA. Într-un număr redus de cazuri de maladii buloase autoimune s-a efectuat imunofluorescență indirectă pentru evidențierea depunerilor specifice de imunoglobuline.

A fost calculată sensibilitatea și specificitatea imunofluorescenței directe pentru diagnosticul de boli autoimune pentru lotul de pacienți cu maladii imunobuloase (19 pacienți) și pentru diagnosticul de lupus eritematos în lotul pacienților cu boli autoimune de țesut conjunctiv, precum și valoarea predictivă pozitivă și negativă a imunofluorescenței directe pentru diagnosticul de pemfigus și lupus eritematos, aceste patologii fiind reprezentate de un număr semnificativ de cazuri în lotul analizat.

Descrierea algoritmilor de diagnostic

În cazul maladiilor buloase autoimune și a lupusului eritcmatos, care au reprezentat proporția majoritară a cazurilor investigate, au fost utilizați algoritmi de diagnostic ce au inclus efectuarea imunofluorescenței directe sau, în anumite cazuri, și a imunofluorescenței indirecte (figurile 5.17, 5.18, 5.19 ).

Figura 5.17. Algoritm de diagnostic in pemfigus

Figura 5.18. Algoritm de diagnostic in maladiile buloase subepidermice

Figura 5.19. Algoritm de diagnostic in lupus eritematos

II.5.4. Rezultate

Maladii buloase autoimune

Au fost investigate 41 de cazuri de maladii buloase autoimune: 19 de cazuri de pemfigus, forme clinice diferite,14 fiind pemfigus vulgar, și 22 de cazuri de alte boli buloase autoimune – pemfigoid bulos, dermatită herpetiformă, epidermoliză buloasă dobândită, pemfigoid gestationis.

În cazurile de pemfigus imunofluorescența directă efectuată pe fragmente cutanate sau mucoase a confirmat diagnosticul in 18 din cazurile investigate (depozite intercelulare intraepidermice de IgG+/-C3, IgM, IgA) (Figurile 5.20.-5.23). Imunoreactanții de tip IgG au fost identificați in toate situațiile. Depunerea de C3 a fost identificată în 15 dintre cazurile investigate, cu aspecte similare dar cu o intensitate mai scăzută a fluorescenței. Depunerea de IgM șiIgA a fost evidențiată în 4 cazuri de pemfigus vulgar si 1 caz de pemfigus vegetant.

Figura 5.20. Pemfigus vulgar-C3x200 Figura 5.21. Pemfigus vulgar IgGx200

Figura 5.22. Pemfigus vulgar-IgMx200 Figura 5.23. Pemfigus vulgar IgAx200

IFD a fost fals negativă unui caz de pemfigus vulgar oral în care prelevarea s-a efectuat de la nivelul leziunilor de mucoasă orală. Testarea prin imunofluorescența indirectă a confirmat diagnosticul de pemfigus vulgar cu leziuni orale.

Maladiile imunobuloase subepidermice investigate, care nu au prezentat aspecte specifice ale depunerii imunoreactanților pentru diagnosticul de pemfigus, au fost considerate rezultate real negative ale testării. Nu au fost identificate rezultate fals pozitive ale imunofluorescenței directe pentru diagnosticul de pemfigus.

S-a calculat sensibilitatea și specifitatea imunofluorescenței directe, precum și valoarea predictivă pozitivă și negativă a metodei în diagnosticul pemfigusurilor raportat la numărul total de pacienți cu maladii imunobuloase investigați prin IFD.

Sensibilitatea imunofluorescenței directe a fost de 94,73% (IC 95% 0,75- 0,99), specificitatea 100% (IC 95% 0,75-1), valoarea predictivă pozitivă 100% (IC 95% 0,92-1), valoarea predictivă negativa 93,33% (IC 95% 0,08-0,35) (P<0.0001).

S-a constatat că în formele profunde de pemfigus fluorescența apare predominant în ariile suprabazale pe când în cele superficiale aceasta este maximă în straturile superioare ale epidermului.

În cazurile de pemfigus paraneoplazic investigate a fost identificată depunerea simultană de IgG+/-C3 la nivel intercelular epidermic dar și la nivelul membranei bazale cu aspect linear sau granular.

În urma analizei efectuate am sintetizat aspectele identificate referitor la tipul și frecvența apariției diferitelor tipuri de imunoreactanți în funcție de tipul de pemfigus investigat (Tabelul 5.2).

Tabelul 5.2. Frecvența apariției depozitelor de imunoreactanți în pemfigus (IFD)

Au fost studiate cazuri de maladii buloase autoimune subepidermice: 16 cazuri de pemfigoid bulos, 4 cazuri dermatită herpetiformă, 1 epidermoliză buloasă dobândită, 1 pemfigoid gestationis. Toate cazurile au prezentat rezultate pozitive, diagnostice, la imunofluorescența directă.

În cazurile de pemfigoid bulos s-a identificat prezența C3 în toate situațiile, cu o apariție a depozitelor de IgG în 15 dîn cele 16 de cazuri, iar IgM și IgA în 3, respectiv 1 caz (Figurile 5.24 și 5.25). Fluorescența a prezentat aspect mai intens pentru c3 decât pentru ceilalți imunoreactanți, cu o dispunere lineară de-a lungul membranei bazale în majoritatea cazurilor, fiind identificate și două situații de dispunere granulară.

Figura 5.24. Pemfigoid bulos IgG x100

Figura 5.25. Pemfigoid bulos C3 x100

Singurul caz de pemfigoid gestationis a prezentat depozite de IgG și C3 cu aspect liniar omogen de-a lungul membranei bazale.

În cazul de epidermoliză buloasă dobândită au fost evidențiate prin imunofluorescența directă depozite de IgG și C3 groase, intense, de-a lungul membranei bazale, cu o intensitate mai mică a fluorescentei în cazul C3 față de IgG (Figurile 5.26 și 5.27). Nu au fost identificate depuneri de IgM sau IgA.

Pentru dermatita herpetiformă au fost identificate prin imunofluorescența directă depozite de IgA granulare în vârful papilelor dermice în toate cazurile analizate fară evidențierea aspectului de dispunere granulară continuă de-a lungul membranei bazale. În 2 dintre cele 4 cazuri analizate testarea a fost pozitivă pentru C3. Nu a fost identificată prezența de IgM sau IgG.

S-a constatat o intensitate mai crescută a fluorescenței pentru C3 fată de IgG in cazurile de pemfigoid bulos față de cazul de epidermoliză buloasă dobândită

Pe baza analizării cazurilor investigate am efectuat o sinteză a tipului si frecvenței apariții imunoreactanților în funcție de tipul de boală (Tabelul 5.3).

În lotul de pacienți cu maladii imunobuloase investigat s-au calculat sensibilitatea,specificitatea si valorile predictive pozitive si negative conform rezultatelor imunofluorescenței directe.

Sensibilitatea imunofluorescenței directe a fost de 100% (IC 95% 0,85-1), specificitatea 100% (IC 95% 0,81-1), valoarea predictivă pozitivă 95% (IC 100% 0,92-1), valoarea predictivă negativa 100% (IC 95% 0,08-0,35) (P<0.0001).

Tabelul 5.3. Frecvența apariției depozitelor de imunoreactanți în funcție de tipul de afecțiune (IFD)

Boli autoimune de țesut conjunctiv și alte afecțiuni

Au fost investigate 23 de cazuri de lupus eritematos, confirmate prin investigațiile paraclinice specifice: 14 cazuri de lupus eritematos cronic, 5 cazuri de lupus eritematos subacut și 4 forme acute/sistemice de boală. Imunofluorescența directă a fost efectuată în toate cazurile analizate, testarea fiind pozitivă în majoritatea situațiilor (Tabelul 5.4).

Tabelul 5.4. IFD pozitiv în lupus eritematos

În lotul de pacienți analizat au fost incluse toate cazurile de lupus eritematos identificate, pentru care se efectuase imunofluorescența directă. Pacienții prezentau forme diferite de lupus eritematos, leziuni recente sau cu evoluție îndelungată, dispuse pe zone fotoexpuse sau protejate; o parte dintre cazuri se aflau în curs de terapie la momentul efectuării imunofluorescenței.

În cazul formelor de lupus eritematos cronic cutanat imunofluorescența directă a relevat aspecte specifice: depozite liniare de IgG, IgM, complement de-a lungul membranei bazale cu/fără prezența depozitelor de IgM, IgA, IgG la nivelul corpilor citoizi în 10 cazuri dintre cele 14 investigate. Au fost detectate depozite de IgG și IgM dispuse granular discontinuu sau linear de-a lungul membranei bazale în toate cazurile de imunofluorescența directă pozitivă; depunerea de C3 a fost identificată în cazul a 7 pacienți iar evidențierea depozitelor de IgA și IgM+/-IgG la nivelul corpilor citoizi a fost evidențiată în cazul a 3 pacienți; 2 pacienți au prezentat rezultat negativ al testării.

Leziunile din care s-a practicat biopsie cutanată au fost distribuite astfel: 10 cazuri la nivelul feței, 2 cazuri la nivelul altor zone fotoexpuse, 2 cazuri în zone neexpuse. Rezultate negative ale testării au fost întâlnite în 1 caz în care biopsia s-a recoltat de la nivelul altor zone fotoexpuse decât fața și în 1 caz în care fragmentul s-a recoltat din zone nefotoexpuse.

În formele subacute de boală imunofluorescența directă a prezentat rezultate pozitive în 4 din cele 5 cazuri investigate, cu evidențierea depozitelor de IgG, IgM granulare sau liniare la nivelul joncțiunii dermoepidermice +/- IgM, IgA Ia nivelul corpilor citoizi sau aspect granular al IgG în nucleul sau citoplasmă celulelor bazale (Figurile 4.11,4.12,4.13,5.28).

În lupusul eritematos acut/sistemic imunoflorescența directă a fost pozitivă in 4 din 4 cazuri investigate, prelevarea efectuându-se de la nivelul unor leziuni specifice și evidențiind aspecte caracteristice: banda lupică (IgG, IgM, complement la nivelul joncțiunii dermoepidermice), IgM, IgA la nivelul corpilor citoizi sau depozite la nivelul pereților vasculari (Figura 5.29)

În toate cazurile cu rezultat pozitiv al testării au fost identificate depozite imune granulare sau lineare la nivelul joncțiunii dermoepidermice cu aspect de bandă, constituite din IgG, IgM +/- IgA, C3. În cazul a 2 pacienți a fost identificată și fluorescență cu IgM +/- IgA la nivelul corpilor citoizi si ȋn 2 cazuri au fost evidențiate depuneri de IgG, IgM la nivelul pereților vaselor dermice superficiale.

Figura 5.28. Lupus Eritematos subacut IgM x200

Figura 5.29. Lupus eritematos acut IgG x 200

Detectarea titrurilor ANA a fost efectuată în toate cazurile de lupus entematos analizate. Testarea a fost pozitivă în 2 cazuri de lupus eritematos cronic, 3 cazuri de lupus eritematos subacut și în toate cele 4 cazuri de lupus eritematos acut/sistemic (Tabelul 5.5).

S-a calculat sensibilitatea, specificitatea și valoarea predictivă negativă și pozitivă a imunofluorescenței directe pentru diagnosticul de lupus eritematos ȋn lotul de 23 pacienți analizat.

Tabelul 5.5. ANA pozitiv în lupus eritematos

Sensibilitatea IFD pentru diagnosticul lupusului eritematos cronic este de 85.7% (CI 95%0,6-0,95), specificitatea 46,14% (CI 95% 0,35-0,87), valoarea predictivă pozitivă 63,15% (CI 95%0,99-6,63), valoarea predictivă negativă 74% (CI 95% 0,05-0,83) (p 0,0022).

Sensibilitatea IFD pentru diagnosticul lupusului eritematos subacut este de 80% (CI 95% 0,37-0,96), specificitatea 33,33% (CI 95% 0,12-0,64),valoarea predictivă pozitivă 40% (CI 95% 0,63-2,2),valoarea predictivă negativă75% (CI 95% 0,08-4,35) (p 0,5).

Sensibiliatea IFD pentru diagnosticul lupusului eritematos acut/sistemic este de 100%(CI 95% 0,51-1),specificitatea 37,5% (CI 95% 0,13-0,69),valoarea predictivă pozitivă 44,4% (CI 95% 0,93-2.7) valoarea predictivă negativă 100% (CI 95% 0,84-0,99) (p 0,49). S-au calculat valorile pentru diagnosticul de lupus eritematos.

Sensibilitatea IFD pentru diagnosticul lupusului eritematos este de 88,5% (CI 95% 0,75-0,93), specificitatea 38,9% (CI 95% 0,5 0,78),valoarea predictivă pozitivă 43,5% (CI 95% 0,71-0,89),valoarea predictivă negativă 73,3% (CI 95% 0,52-0,84) (p 0,031). Toate aceste date sunt sintetizate ȋn Tabelul 5.6:

Tabelul 5.6. Valori statistice ale IFD în lupus eritematos

Aspecte particulare de imunofluorescență identifícate și contribuția acestora la precizarea diagnosticului

Maladii buloase autoimune

Pe baza analizei celor 41 cazuri de afecțiuni buloase autoimune investigate am efectuat anumite observații ce pot contribui la stabilirea unei imagini de ansamblu în ceea ce privește interpretarea rezultatelor testării prin imunofluorescență directă în acest tip de maladii.

Pemfigus

Am constat pozitivarea testării prin imunofluorescență directă cu evidențierea aspectelor diagnostice în 18 din cele 19 de cazuri investigate. În toate cazurile aspectul fluorescenței a fost de depozite intercelulare epidermice cu aspect de rețea continuă pe suprafața keratinocitelor. Aspectul definitoriu pentru pemfigusuri este depunerea de IgG cu aspect de rețea intercelulară epidermică, cu sau fără asocierea prezenței de C3 (cel mai frecvent), IgM sau IgA. A fost identificat un rezultat fals negativ al imunoflorescenței directe ȋn condițiile recoltării biopsiei de la nivelul mucoasei orale. Efectuarea metodei indirecte a confirmat ȋn cele din urmă diagnosticul de pemfigus vulgar oral. Această observație vine ȋn sprijinul raportarilor din literatură de specialitate care descriu o sensibilitate mai mică a imunuoflrescenței directe efectuată pe fragmente mucoase, raportând procente de 71-89% ale pozitivării mucoaselor [, ] față de 90-100% la testarea pe piele [87].

În studiul personal a fost analizat 1 caz de biopsie mucoasă, rezultatul fiind fals-negativ, sensibilitatea metodei fiind mult mai mică comparativ cu rezultatele obținute la testarea cutanată. Prin urmare rezultatele fals negative pot sa apară în condițiile testării pe mucoase, posibil din cauza degradării rapide a imunoreactanților intr-o zonă cu inflamație accentuată. Se descrie de asemenea apariția rezultatelor fals negative în cazuri de pemfigus paraneoplazic [87] dar în cazul pacienților investigați nu au fost detectate astfel de rezultate, toate cazurile de pemfigus paraneoplazic prezentând imunofluorescență directă pozitivă. În studiul personal nu au fost investigate cazuri de pemfigus postmedicamentos sau pemfigus cu IgA, acestea reprezentând alte circumstanțe în care se descriu mai frecvent apariția rezultatelor negative ale testării prin imunofluorescență directă [87].

A fost analizată diferența de intensitate a fluorescenței în funcție de nivelul localizării bulei în epiderm și s-a constatat că în formele profunde de pemfigus fluorescența apare predominant in ariile suprabazale pe când în cele superficiale aceasta este maximă în straturile superioare ale epidermului, constatare ce vine în sprijinul diagnosticării formei clinice de pemfigus dar trebuie corelată cu rezultatul examenului histopatologic ce stabilește cu precizie localizarea bulei la nivelul epidermului.

În cazurile de pemfigus eritematos și paraneoplazic investigate a fost identificată depunerea simultană de lgG+/-C3 la nivel intercelular epidermic dar și la nivelul membranei bazale cu aspect liniar sau granular.

Boli buloase autoimune subepidermice

Imunofluorescența directă a fost pozitivă în 100% din cazurile de maladii imunobuloase subepidermice investigate.

S-a constatat o intensitate mai crescută a fluorescentei pentru C3 față de IgG în cazurile de pemfigoid bulos față de cele de epidermoliză buloasă dobândită, această observație putând veni în sprijinul diferențierii celor două afecțiuni care prezintă aspecte relativ similare în ceea ce privește modelul de fluorescență identificat. Cu toate acestea, tehnica pielii clivate ar fi cea care efectuează diagnosticul diferențial între cele două maladii, evidențiind prezența imunoreactanților la nivelul versantului epidermic al bulei în cazurile de pemfigoid bulos, respectiv la nivelul versantului dermic în epidermoliză buloasă dobândită.

Boli autoimune de țesut conjunctiv

În cazurile de lupus eritematos cronic analizate imunofluorescența directă a fost pozitivă în cazul a 12 dintre cei 14 pacienți investigați (86%). Rezultate negative ale testării au fost întâlnite în cazul a 2 pacienți la care recoltarea biopsiei cutanate s-a practicat din leziuni situate la nivelul altor zone fotoexpuse decât fața respectiv din tegumentele nefotoexpuse (Tabelul 5.7).

Tabelul 5.7.Procentul pozitivãrii IFD în lupusul eritematos cronic în funcție de zona de recoltare

Au fost detectate depozite de IgG și IgM dispuse liniar sau granular discontinuu de-a lungul membranei bazale în toate cazurile cu rezultat pozitiv, depunerea de C3 a fost identificată în cazul a 7 pacienți iar evidențierea depozitelor de IgA și lgM+/-IgG la nivelul corpilor citoizi a fost evidențiată în cazul a 3 pacienți (Tabelul 5.8).

Tabelul 5.8. Localizarea imunoreactanților în lupusul eritematos cronic (IFD)

Rezultatele negative ale testării (14% din cazuri), au fost întâlnite în situații în care biopsia s-a recoltat de la nivelul altor zone decât fața, ceea ce vine în sprijinul observației că la nivelul feței se întâlnește cel mai mare procent al rezultatelor pozitive, frecvența rezultatelor pozitive scăzând în cazul recoltării din leziuni situate la nivelul altor zone fotoexpuse decât fața sau din leziuni nefotoexpusc și fiind negativă în tegumente nelezionale [87, 132].

Scăderea pozitivării imunofluorescenței directe este descrisă și în relație cu vechimea leziunilor și tratamentele efectuate anterior [87, 132]. În lotul investigat rezultatele pozitive au fost întâlnite atât în cazul leziunilor cu evoluție sub 1 lună cât și în cazul leziunilor cu durată mai mare de evoluție, prin urmare nu a putut fi stabilită o corelație între vechimea leziunilor și procentul pozitivării imunofluorescenței directe. Pacienții nu efectuaseră tratament în ultima lună anterior investigării, ceea ce întărește constatarea că leziunile netratate prezintă un procent mai mare al pozitivării imunofluorescenței directe comparativ cu cele tratate, având în vedere procentul mare al rezultatelor pozitive obținute în lotul analizat.

Examenul histopatologic este cel care stabilește diagnosticul de lupus eritematos cronic, imunofluorescența directă fiind utilă în situațiile în care acesta este insuficient de sugestiv sau specific. Subliniez faptul că imunofluorescența directă poate fi interpretată ca pozitivă și în alte situații în care se identifică prezența imunoreactanților la nivelul joncțiunii dermoepidermice, mai frecvent întâlnite în cazul recoltării biopsiei de la nivelul feței (spre exemplu în rozacee), prin urmare se recomandă precauție și evaluarea atentă a modelului de fluorescență identificat în corelație cu examenul histopatologic și evaluarea clinică pentru a stabili un diagnostic de certitudine. În sprijinul diagnosticului de lupus eritematos poate fi interpretată prezența simultană de depozite de IgG și IgM și dispunerea mai intensă a acestora la nivelul joncțiunii dermoepidermice, comparativ cu alte afecțiuni în care se întâlnește de regulă un singur imunoreactant și dispunerea este mai intensă la nivelul pereților vasculari.

În forma subacută a lupusului eritematos procentul de pozitivare a imunofluorescenței directe a fost de 80% (4 din 5 cazuri analizate). S-au evidențiat depozite granulare sau liniare de IgG, IgM și C3 la nivelul joncțiunii dermoepidermice în toate cazurile, dispunere de IgA și/sau IgM la nivelul corpilor citoizi într-un 1 caz (Tabelul 5.9).

Tabelul 5.9.Localizarea imunoreactanților în lupusul eritematos subacut

Rezultatele negative ale testării au fost întâlnite în cazurile a unui singur pacient la care recoltarea biopsiei s-a efectuat din leziuni aflate în curs de tratament, acesta fiind un factor ce poate influența rezultatul testării.

În lupusul eritematos acut/sistemic testarea a fost pozitivă în 4 din cele 4 cazuri analizate (100%), prelevarea efectuându-se de la nivelul leziunilor specifice. În toate cazurile cu rezultat pozitiv al IFD au fost identificate depozite imune la nivelul joncțiunii dermoepidermice cu aspect de bandă, constituite din IgG, IgM+/-IgA, C3. In cazul a 2 pacienți a fost identificată și fluorescenta cu IgA, IgM la nivelul corpilor citoizi și în 2 cazuri au fost evidențiate depuneri de IgG, IgM la nivelul pereților vaselor dermice superficiale (Tabelul 5.10).

Tabelul 5.10. Localizarea imunoreactanților în lupusul eritematos acut/sistemic (IFD)

Nu au fost identificate în lotul de pacienți analizat cazuri de fluorescență granulară a celulelor bazale în forme de lupus eritematos sistemic, deși acest aspect poate fi întâlnit dar cu o frecvență mică de apariție [87].

Diagnosticul final de lupus eritematos sistemic se bazează pe evaluarea celor 11 criterii de diagnostic elaborate pentru aceasta afecțiune, imunofluorescența directă având doar un caracter orientativ în situațiile de diagnostic incert. Prezența a cel puțin 3 imunoreactanți la nivelul depozitelor evidențiate, dintre care unul este IgG, are o specificitate diagnostică mare și poate fi interpretată în favoarea diagnosticului de lupus eritematos sistemic.

Evidențierea anticorpilor antinucleari reprezintă metodă de screening ideală pentru lupusul eritematos sistemic prezentând un grad mare de sensibilitate. În lotul de pacienți investigat aceasta testare a fost pozitivă în 100% din cazuri.

Sinteza rezultatelor imunofluorescenței directe raportat la tipul de afecțiune

În urma analizei celor 64 de cazuri investigate prin imunofluorescență directă și coroborând datele obținute cu analiza raportărilor literaturii de specialitate am efectuat o sinteză rezultatelor imunofluorescenței directe identificate sau posibile în funcție de tipul
de afecțiune investigat (Tabelul 5.11).

Aceasta sinteză poate reprezenta un ghid util clinicianului ce utilizează diagnostic imunofluorescență directă pentru a confirma sau exclude patologi diferite. Având în vedere variabilitatea modelelor de fluorescență identificate distincția poate fi dificilă în anumite situații, prin urmare este necesara o bună cunoaștere a elementelor caracteristice identificate prin această metodă.

Tabelul 5.11.Descrierea rezultatelor IFD în funcție de tipul de afecțiune

Legendã:* date rezultate din studiul raportãrilor din literatura de specialitate

II.5.5. Discuții

În cadrul studiului efectuat s-au urmărit aspectele legate de interpretarea valorii imunofluorescenței directe în diagnosticul afecțiunilor cutanate. Metoda de selectare a pacienților (includere cazuri la care s-a efectuat, pe lângă alte tipuri de evaluări diagnostice, imunofluorescență directă) nu permite aprecieri legate de incidența sau prevalenta acestor afecțiuni, întrucât decizia de efectuare, în cazurile analizate, a imunofluorescenței directe, s-a bazat atât pe algoritmii de diagnostic prezentați anterior dar, în anumite cazuri, și pe criterii relativ subiective – metoda a fost efectuată și în scop de excludere a diagnosticelor diferențiale în diferite tipuri de patologii, reprezentate printr-un număr mic de cazuri în cercetarea efectuată.

Prin urmare au existat numeroase situații de patologii în care imunofluorescența directă a fost efectuată doar într-un număr redus de cazuri din totalul celor internate în perioada menționată întrucât nu era necesară pentru precizarea diagnosticului (boli autoimune de țesut conjunctiv).

Au fost analizate toate cazurile de pemfigus identificate întrucât imunofluorescență directă a fost efectuată în toate situațiile conform algoritmului de diagnostic; rezultatele obținute au fost prezentate anterior.

În cazurile de maladii imunobuloase subepidermice imunofluorescența directă a prezentat o sensibilitate maximă, ceea ce este conform cu datele raportate în literatura de specialitate. Întrucât proporția majoritară a acestor cazuri era reprezentată de pemfigoidul bulos, în care imunofluorescența directă este pozitivă, nu am inclus în studiu toate cazurile de pemfigoid bulos identificate deoarece cercetarea nu ar fi adus elemente noi.

S-au analizat toate cazurile de lupus eritematos pentru care s-a efectuat imunofluorescență directă,dar au existat și cazuri în care nu a existat opțiunea efectuării acestei investigații, diagnosticul de lupus eritematos fiind bazat pe examinarea histopatologică sau/și alte tipuri de investigații paraclinice ce nu includ imunofluorescența directă.

Având în vedere elementele menționate anterior, pe baza analizării lotului selectat, am efectuat o interpretare statistică a valorii imunofluorescenței directe pentru diagnostícele de pemfigus și lupus eritematos, întrucât acestea au fost reprezentate de un număr semnificativ de cazuri.

Pentru toate tipurile de afecțiuni investigate în cadrul studiului am efectuat o evaluare a modelelor de fluorescență identificate și a contribuției imunofluorescenței directe în precizarea diagnosticului.

În urma evaluării rezultatelor obținute la testarea prin imunofluorescență directă am efectuat o descriere specifică a afecțiunilor raportat la modelele de fluorescență identificate și corelat cu datele rezultate din studiul literaturii de specialitate.

II.5.5.1. Sensibilitatea, specificitatea și valoarea predictivă a imunofluorescenței directe în maladiile buloase autoimune și bolile de țesut conjunctiv

Maladii buloase autoimune

Având în vedere multiplele elemente comune clinico-histologice ce caracterizează grupul maladiilor buloase autoimune, diagnosticul bazat doar pe criterii clinice sau/și histopatologice nu este de certitudine în cazul acestor afecțiuni [87]. Imunofluorescența directă este o metodă extrem de valoroasă pentru confirmarea unui diagnostic de suspiciune și pentru efectuarea diagnosticului diferențial între aceste maladii. Imunofluorescența indirectă este utilă în situațiile în care metoda directă este negativă sau nespecifică și de asemenea pentru diferențierea pemfigoidului bulos de epidermoliza buloasă dobândită [87].

Valoarea predictivă a acestor testări este importantă prin prisma evaluării validității metodei în confirmarea diagnosticului acestor afecțiuni. Valoarea predictivă pozitivă reprezintă statistic posibilitatea ca un pacient cu testare pozitivă să prezinte boala iar valoarea predictivă negativă semnifică statistic posibilitatea ca un pacient cu testare negativă să nu prezinte boala [87].

Conform raportărilor, imunofluorescența directă reprezintă standardul de aur pentru diagnosticul pemfigusurilor întrucât este pozitivă în 90 până la 100% din cazurile de boală activă la examinarea pe piele [87]. Rezultatele negative ale testării pot fi întâlnite în mod real în cazul pemfigusului postmedicamentos, în care sunt incriminate și mecanisme de alterare directă a legăturilor intercelulare de către substanța incriminată fără implicarea unor mecanisme imune [87]. Rezultatele fals negative apar în circa 10% din cazuri [] și sunt cel mai probabil rezultatul unor erori de recoltare sau de prelucrare a probelor, spre exemplu recoltarea unui fragment de țesut dintr-o zonă inflamată sau cu bulă prezentă, ceea ce implică degradarea imunoreactanților și negativarea testului, cel mai frecvent aceste raportări fiind întâlnite în cazuri de pemfigus paraneoplazic [87].

Valoarea predictivă pozitivă a imunofluorescenței directe pentru diagnosticul pemfigusurilor, conform raportărilor din literatură se apropie de 100% [87]. Valoarea predictivă negativă în cazul pemfigusurilor este estimată la circa 85-90% [87] deoarece, după cum am expus anterior, există posibilitatea apariției unor rezultate fals negative. În pemfigusul oral sensibilitatea imunuoflorescenței directe în leziunile mucoase se situează în jurul valorii de 80% []. În cazul în care la un pacient cu rezultat negativ persistă suspiciunea diagnostică de pemfigus se recomandă repetarea testului sau tentarea confirmării diagnosticului prin imunofluorescență indirectă [87].

În cazurile de pemfigus analizate imunofluorescența directă a fost pozitivă în 18 cazuri stabilind diagnosticul de certitudine, și a prezentat un rezultat fals negativ. Sensibilitatea imunofluorescenței directe a fost de 94,73% (CI 95% 0,75- 0,99), specificitatea 100% (CI 95% 0,75-1), valoarea predictivă pozitivă 100% (CI 95% 0,92-1), valoarea predictivă negativa 93,33% (CI 95% 0,08-0,35) (P<0,0001).

Rezultatele sunt conforme cu datele publicate în literatura de specialitate și situează valoarea predictivă pozitivă a imunofluoresceței directe în pemfigusuri la valori de 100% în formele active de boală (toate cazurile cu imunofluoresccntă directă pozitivă diagnostică sunt pemfigus) [87].

Un rezultat negativ al testării nu exclude definitiv diagnosticul de pemfigus întrucât se descrie posibilitatea apariția rezultelor fals negative. Se recomandă în aceste situații repetarea testării sau efectuarea metodei indirecte pentru confirmarea diagnosticului. În cazurile investigate a fost întâlnit un rezultat fals negativ, în cazul unui pacient la care recoltarea fragmentului bioptic s-a efectuat de la nivelul mucoasei orale; această observație vine în sprijinul susținerii datelor din literatură, ce se referă la o sensibilitate mai scăzută a imunofluorescenței directe efectuată pe fragmente mucoase dar fiind un eveniment singular nu se pot efectua interpretări statistice relativ la această constatare. Efectuarea imunofluorescenței indirecte a confirmat diagnosticul de pemfigus.

Conform raportărilor din literatură valoarea predictivă negativă a imunofluorescenței directe în pemfigusuri se situează la procente de 85-90% [87]. În studiul efectuat acesta a fost de 93,33%, proporția scăzută a rezultatelelor fals negative fiind influențată și de faptul că în lotul de pacienți analizat nu au fost identificate cazuri de pemfigus postmedicamentos, pemfigus paraneoplazic cu IFD negativ sau pemfigus cu IgA.

Pentru maladiile buloase autoimune subepidermice atât valoarea predictivă pozitivă cât și cea negativă a imunofluorescenței directe se apropie de 100% [87], prin urmare metoda este indispensabilă în obținerea unui diagnostic de certitudine. Rezultatele fals negative, deși rare, pot să apară din cauza unor erori tehnice de prelucrare a probelor sau a recoltării incorecte a fragmentului de țesut supus examinării [87].

100% din cazurile de maladii imunobuloase subepidermice investigate au fost confirmate prin imunofluorescență directă, valoarea predictivă pozitivă a metodei fiind în această categorie de afecțiuni de 100% conform datelor raportate in literatură [87]. Nu au fost identificate rezultate negative ale imunofluorescenței directe. Conform datelor publicate valoarea predictivă negativă a imunofluorescenței directe se situează la valori de aproape 100% [87].

Imunofluorescența indirectă, utilă ca metodă de confirmare diagnostică în anumite situații în care metoda directă oferă rezultate neconcludente sau este dificil de efectuat (de exemplu în cazurile de pemfigus oral), este de asemenea folosită și în situații specifice pentru efectuarea diagnosticului diferențial (între pemfigoid bulos și epidermoliza buloasă dobândită) sau ca metodă de screening (în pemfigusul paraneoplazic) [87]. Valoarea predictivă pozitivă a metodei prezintă valori variabile în funcție de afecțiunea investigată, în pemfigusul vulgar aceasta fiind extrem de mare deoarece testarea este pozitivă in circa 80-90% din cazuri [87, 120] dar există și posibilitatea apariției rezultatelor fals pozitive, prin urmare valoarea predictivă pozitivă nu este maximă. Valoarea predictivă pozitivă se situează însă în jur de 100% pentru pemfigoidul bulos rezultatele fals pozitive sunt extrem de rare și metoda este recomandată de rutină pentru diagnosticul acestei afecțiuni [120]. Valoarea predictivă negativă se situează la nivelul unor procente mai mici pentru că multe dintre aceste afecțiuni prezintă în mod real un rezultat negativ al testării, rezultatele fals negative fiind de asemenea posibile ca rezultat al utilizării unui substrat neadecvat, unor erori tehnice sau fenomenului de prozonă [87].

În lotul de pacienți analizat imunofluorescența indirectă pentru evidențierea depunerii imunoreactanților a fost efectuată într-un număr redus de cazuri (1 caz pemfigus vulgar, 4 cazuri pemfigoid bulos, 1 caz epidermoliză buloasă dobândită) prin urmare nu au putut fi efectuate interpretări semnificative statistic în ceea ce privește valoarea metodei în diagnosticul maladiilor imunobuloase. Se poate constata însă valoarea metodei pentru confirmarea diagnosticului de pemfigus vulgar în cazul pacientului cu leziuni de mucoasă orală la care imunofluorescența directă efectuată anterior a prezentat un rezultat fals negativ.

Coroborând rezultatele obținute cu datele publicate in literatura de specialitate se confirmă sensibilitatea și specificitatea ridicată a testării prin imunofluorescența directă în pemfigusuri și valoarea metodei în confirmarea diagnosticului prin prisma valorii predictive pozitive și negative calculate.

Boli autoimune de țesut conjunctiv

Deși imunofluorescența nu poate înlocui examinarea histopatologică în diagnosticul afecțiunilor autoimune de țesut conjunctiv, există situații în care examenul histopatologic este neconcludent, in aceste cazuri examinarea pielii lezionale prin imunofluorescența directă fiind utilă pentru precizarea diagnosticului. De asemenea această metodă de investigație poate fi utilă pentru distingerea diferitelor forme de lupus eritematos, având în vedere faptul că frecvența depozitelor de imunoreactanți, morfologia și localizarea acestora variază in funcție de subsetul de boală [87]. Nu în ultimul rând imunofluorescența directă poate facilita efectuarea diagnosticului diferențial între lupusul eritematos și alte afecțiuni ce pot prezenta elemente clinice și histopatologice similare, spre exemplu infiltratul limfocitar Jessner-Kanof sau erupția polimorfă la lumină [87].

Unul dintre studiile publicate [] a evaluat valoarea predictivă a imunofluorescenței directe în leziunile de lupus eritematos acut, rezultatele fiind de 64% valoare predictivă pozitivă și 98% valoare predictivă negativă, concluzia fiind că circa 30% dintre pacienții cu IFD pozitiv nu prezintă lupus eritematos acut, pe când imunofluorescența directă negativă practic exclude acest diagnostic.

În cadrul lotului de pacienți analizat sensibilitatea imunofluorescenței directe pentru diagnosticul lupusului eritematos acut este 100% (CI 95% 0,51-1), specificitatea 37,5% (CI 95% 0,13-0,69), valoarea predictivă pozitivă 44,4% (CI 95% 0,93-2.7)
valoarea predictivă negativă 100% (CI 95% 0,84-0,99) (p=0.49).

Există o concordanță între datele obținute în studiul efectuat și datele raportate anterior în literatura de specialitate in ceea ce privește valoarea predictivă negativă ridicată a imunofluorescenței directe în lupusul eritematos acut, cu alte cuvinte un rezultat negativ al testării trebuie să orienteze diagnosticul în altă direcție decât lupusul eritematos.

Cazul de lupus eritematos sistemic în care testarea a fost negativă se afla in curs de terapie sistemică imunosupresoare,ceea ce este in sprijinul constatării că rezultatele imunofluorescenței directe pot fi influențate de parametrii ce țin de terapia in curs de desfășurare. Deși valoarea predictivă negativă a imunofluorescenței directe efectuată din tegumente lezionale în formă sistemică de lupus eritematos a fost evaluată la valori de 98% in literatura de specialitate [87] și a fost de 100% în studiul efectuat, aceste date trebuie interpretate cu precauție și în contextul evaluării tuturor parametrilor ce influențează rezultatele acestei testări (locul de prelevare al biopsiei, tipul de leziune biopsiată, tratamentele în curs de desfășurare, gradul de activitate al bolii).

În lotul de pacienți investigat sensibilitatea imunofluorescenței directe pentru diagnosticul lupusului eritematos cronic este de 85.7% (CI 95% 0,6-0,95), specificitatea 46,14% (CI 95% 0,35-0,87), valoarea predictivă pozitivă 63,15% (CI 95% 0,99-6,63), valoarea predictivă negativă 74% (CI 95% 0,05-0,83) (p=0.0022).

Sensibilitatea IFD pentru diagnosticul lupusului eritematos subacut este de 80% (CI95% 0,37-0,96), specificitatea 33,33% (CI 95% 0,12-0,64),valoarea predictivă pozitivă 40% (CI 0,63-2,2),valoarea predictivă negativă 75% (CI 95% 0,08-4,35) (p=0.5).

Sensibilitatea IFD pentru diagnosticul lupusului eritematos este de 88,5%(CI 95% 0,75-0,93), specificitatea 38,9% (CI 95% 0,5-0,78), valoarea predictivă pozitivă 43,5% (CI 95% 0,71-0,89), valoarea predictivã negativă 73,3%(CI 95% 0,52-0,84) (p=0,031).

Deși prezintă o sensibilitate relativ ridicată, se observă faptul că, în ceea ce privește specificitatea imunofluorescenței directe pentru diagnosticul lupusului eritematos, aceasta este scăzută (37,5% pentru forma sistemică de lupus, 46,14% pentru forma cronică, 33,33% pentru forma subacută și 38,9% pentru diagnosticul general de lupus eritematos), rezultate pozitive fiind întâlnite și în alte afecțiuni.

Forma de lupus eritematos este diagnosticată prin îmbinarea elementelor clinice și histopatologice, imunofluorescența directă având doar un caracter orientativ în cazurile incerte din cauza specificității scăzute. Testarea serologică este mult mai specifică pentru diagnosticul de lupus eritematos sistemic, titrurile mari de anticorpi antinucleari detectați prin IFID sau ELISA și prezența anticorpilor specifici antiantigene nucleare (U1RNP, Sm) fiind înalt sugestive pentm forma sistemică de lupus eritematos [87].

În ultimele decade au existat dezbateri în ceea ce privește semnificația diagnostică și prognostică a imunofluorescenței directe pozitivă efectuată pe piele nelezională, nefotoexpusă la pacienții cu lupus eritematos sistemic, în medie întâlnită la circa 50% dintre pacienți [131]. Unii autori [] sugerează faptul că în cazul unui rezultat pozitiv obținut pe piele nelezională nefotoexpusă (de exemplu fese) specificitatatea diagnostică este extrem de ridicată atunci când se evidențiază prezența a cel puțin trei imunoreactanți la nivelul joncțiunii dermoepidermice. De asemenea, prezența IgG în pielea normală protejată se detectează rareori in absența formei sistemice de boală [131]. O altă controversă a fost legată de asocierea pozitivării acestui test pe piele nelezională, nefotoexpusă, cu riscul de a dezvolta o formă gravă de boală, cu prognostic rezervat prin prisma apariției nefritei lupice dar s-a raportat faptul că acești pacienți nu prezintă în mod obligatoriu această asociere [], [].Apariția depozitelor imune poate fi de asemenea identificată în alte afecțiuni, precum sclerodermia sistemică, boala mixtă de țesut conjunctiv, dermatomiozită, purpura anafilactoidă, vasculită hipocomplementemică, poliartrita reumatoidă, pemfigoid bulos, dermatita herpetiformă [131]. Acest fenomen de membrană poate fi de asemenea demonstrat în așa numitul lupus eritematos discoid tranzitoriu [131], în care leziunile discoide sunt acompaniate de prezența depozitelor imune în pielea sănătoasă protejată dar fără a avea elemente clinice și serologice pentru forma sistemică a bolii.

Importanța demonstrării prezenței ANA în diferitele forme de lupus eritematos este recunoscută – detectarea lor reprezintă unul dintre cele unsprezece criterii de diagnostic ale lupusului eritematos sistemic (ARA). Deși au existat și încă sunt în curs dezbateri despre rolul testului ANA pentru diagnosticul și managementul bolilor autoimune de țesut conjunctiv, testarea este considerată și la ora actuală metoda cea mai sensibilă de screening pentru depistarea lupusului eritematos sistemic [130]. În lotul de pacienți cu lupus eritematos acut testarea a fost pozitivă în 100% din cazuri.

În urma analizei rezultatelor obținute prin imunofluorescența directă în lotul de pacienți investigat se observă apariția unor procente mai scăzute ale sensibilității, specificității și valorii predictive pozitive în cazurile de lupus eritematos față de bolile buloase autoimune, prin urmare metoda prezintă o valoare diagnostică mai redusă dar poate constitui un element de sprijin pentru diagnostic în cazurile incerte. Cu toate acestea valoarea predictivă negativă este ridicată, în cazul obținerii unui rezultat negativ al imunofluorescenței directe diagnosticul de lupus eritematos fiind mai degrabă improbabil, aspect evidențiat mai ales pentru formele acute/sistemice și subacute de boală.

II.6. Concluzii

Cercetarea efectuată a urmărit investigarea aspectelor ce definesc la momentul actual utilizarea imunofluorescenței în practica dermatologică, un obiectiv principal fiind acela de a analiza valoarea metodei în evaluarea afecțiunilor cutanate și de a oferi o perspectivă de ansamblu, actualizată, asupra aplicațiilor unei investigații de laborator utilizată de peste 4 decenii în dermatologie dar care își menține și în prezent valoarea diagnostică și prognostică pentru categorii importante de afecțiuni.

În ceea ce privește obiectivul principal, referitor la evaluarea importanței, valorii și aplicațiilor imunofluorescenței în practica dermatologică, studiul retrospectiv efectuat pe un lot de 64 de pacienți cu patologii cutanate diferite a furnizat date utilizate pentru efectuarea unei analize actualizate și detaliate a aplicațiilor imunofluorescenței în diagnosticul afecțiunilor cutanate, prin prisma rezultatelor identificate in cadrul lotului investigat și raportat la datele publicate în literatura de specialitate.

Concluziile ce rezultă în urma efectuării acestui studiu sunt:

1) Imunofluorescența directă este o metodă ce contribuie esențial în stabilirea diagnosticului de certitudine în maladiile imunobuloase intraepidermice, cu o sensibilitate și specificitate ridicate, rezultatele fals pozitive sau negative fiind extrem de rar întâlnite. Pentru diagnosticul pemfigusurilor, în studiul efectuat, sensibilitatea metodei a fost de 94,73%, specificitatea 100%, valoarea predictivă pozitivă 100%), valoarea predictivă negativă 93,33%. Valorile predictive pozitive și negative ridicate confirmă utilitatea metodei pentru precizarea diagnosticului de certitudine.

2) Imunofluorescența directă prezintă o valoare diagnostică importantă și în cazul maladiilor imunobuloase subepidermice, în lotul de pacienți investigat toate cazurile prezentând pozitivitate la testarea prin imunofluorescentă directă.

– Întrucât numărul de pacienți cu acest tip de afecțiuni inclus în studiu a fost redus, nu au putut fi efectuate interpretări statistice semnificative ale valorii metodei în acest tip de maladii. Deși au fost identificate în etapa inițială de selecție numeroase cazuri de pemfigoid bulos cu rezultat pozitiv al imunofluorescenței directe, ar fi fost necesară efectuarea tehnicii pe piele clivată pentru precizarea diagnosticului diferențial cu alte subtipuri de maladii imunobuloase subepidermice (epidermoliză buloasă dobândită), Acest aspect reprezintă o limită a cercetării efectuate, impusă însă de constatările efectuate în etapa de selecție a cazurilor.

– Cu toate acestea, rezultatele pozitive ale imunofluorescenței directe în toate cazurile de maladii imunobuloase subepidermice analizate sunt concordante cu datele din literatura de specialitate ce descriu valori predictive pozitive și negative de aproape 100% ale imunofluorescenței directe în acest tip de afecțiuni.

3) Bolile autoimune de țesut conjunctiv reprezintă o categorie importantă de afecțiuni în cadrul căreia efectuarea imunofluorescenței contribuie la precizarea diagnosticului, mai ales în cazurile de lupus eritematos.

– În lotul de pacienți investigat, sensibilitatea imunofluorescenței directe pentru diagnosticul lupusului eritematos cronic a fost de 85.7%, specificitatea 46,14%, valoarea predictivă pozitivă 63,15%, valoarea predictivă negativă 74%.

– Sensibilitatea imunofluorescenței directe pentru diagnosticul lupusului eritematos subacut este de 80%, specificitatea 33,33%, valoarea predictivă pozitivă 40%, valoarea predictivă negativă 75%.

– Sensibilitatea imunofluorescenței directe pentru diagnosticul lupusului eritematos acut/sistemic a fost de 100%, specificitatea 37,5%, valoarea predictivă pozitivă 44,4%, valoarea predictivă negativă 100%.

– În urma analizei rezultatelor obținute prin imunofluorescență directă în lotul de pacienți investigat se observă apariția unor procente mai scăzute ale sensibilității, specificității și valorii predictive pozitive în cazurile de lupus eritematos față de pemfigusuri, prin urmare metoda prezintă o valoare diagnostică mai redusă, dar poate constitui un element de sprijin pentru diagnostic în cazurile incerte. Cu toate acestea valoarea predictivă negativă este ridicată, în cazul obținerii unui rezultat negativ al imunofluorescenței directe diagnosticul de lupus eritematos fiind mai degrabă improbabil, aspect evidențiat mai ales pentru formele acute și subacute de boală.

Analiza rezultatelor identificate pentru lotul de pacienți investigat, ce a inclus patologii diferite, a permis, coroborat cu raportările din literatura de specialitate, realizarea unei descrieri specifice a afecțiunilor din punctul de vedere al rezultatelor imunofluorescenței directe, această imagine de ansamblu venind în sprijinul unei corecte efectuări a corelațiilor clinico-patologice, în scopul stabilirii diagnosticului de boală.

Prin prisma elementelor prezentate anterior se poate afirma faptul că primul obiectiv principal ce a stat la baza acestei lucrări a fost atins, întrucât s-a efectuat evaluarea sensibilității, specificității și valorii predictive a imunofluorescenței directe pentru diagnosticul pemfigusurilor și lupusului eritematos, evaluarea aspectelor de imunofluorescență directă identificate și a contribuției acestora la precizarea diagnosticului diferitelor patologii studiate, elaborarea unei sinteze a rezultatelor imunofluorescenței directe raportat la tipul de afecțiune, rezultând o imagine globală asupra importanței, valorii și aplicațiilor imunofluorescenței în practica dermatologică.

În urma prezentării tuturor acestor elemente se poate concluziona că lucrarea a îndeplinit toate obiectivele propuse, întrucât clarifică aspectele tehnice asociate efectuării imunofluorescenței, oferind o imagine de ansamblu, actualizată asupra importanței și aplicațiilor imunofluorescenței în diagnosticul dermatologic.

BIBLIOGRAFIE

. Burns DA, Cox NH. Introduction and historical bibliography. în: Burns T, Breathnach S, Cox N, Griffiths C, Rook's textbook of dermatology. Wiley-Blackwell 2010; ediția 8; vol 1: 1.1-1.

. Cox NU, Coulson IH. Diagnosis of skin disease. în: Burns T, Breathnach S, Cox N, Griffiths C, Rook's textbook of dermatology. Wiley-Blackwell 2010; ediția 8; vol 1: 5-1-5-26

. Harr T, Itin PH. Pharmacogenomics in dermatology. J Dtsch Dermatol Ges 2005; 3:214-221

. Hensen P, Furstenberg T, Luger TA et al. Case mix measures and diagnosis-related groups: opportunities and threats for inpatient dermatolog}'. J Eur Acad Dermatol Vcncreol 2005; 19: 582-588

. Mutasim DF, Pelc N.I, Supapanachart N. Established methods in the investigation of bullous diseases.Dermatol Clin 1993; 11: 399-418

. Ueki H, Yaoita H. A color atlas of dermato-immunohistocytology.Wolfe Medical Publications 1989; ediția 1

. Wojnarowska F, Eady RA, Bürge SM. Bullous eruptions.în: Champion RH, Burton .IL, Burns DA, Breathnach SM, Textbook of dermatoloyy. Blackwell Science 1998; ediția 6: 1817-1898

. Simionescu O, Nicolaescu M, Costache M. Dicționar de dermatologie. Ed. Universitară "Carol Davila" 2003

. Berger CL. Diagnosis of cutaneous T cell lymphoma by use of monoclonal antibodies reactive with tumor-associated antigens.J Clin Invest 1982; 70: 1205

. Freedberg IM. Epidermal differentiation and keratinization. în: Update: Dermatology in general medicine, editat Fitzpatrick TB et al, McGraw-Hill 1983: p 159

. Fine JD.Applicability of 19-DEJ-1 monoclonal antibody for the prenatal diagnosis or exclusion of epidermolysis bullosa.Prenat Diagn 1990; 10: 219

. Gammon WR. Differentiating anti-lamina lucida and anti-sublamina densa anti-BMZ antibodies by indirect immunofluorescence on 1.0M sodium chloride-separated skin.J Invest Dermatol 1984; 82:139

. Giurcăneanu C, Giurcăneanu D, Nedelcu I. Dermato-venerologie. Note de curs. Ed. Rotech Pro 2001

. Haake AR, Holbrook K. The structure and development of skin.în: Freedberg IM, Eisen AZ, Wolff K, Dermatology in general medicine. McGraw-Hill 1999; ediția 5; vol. 1:70-114

. Amagai M. Pemphigus. în: Bolognia JL, Jorizzo JL, Rapini RP, Dermatology. Mosby Elsevier 2008; editia 2; vol 1: 417-431

. Wojnarowska F, Venning VA.Immunobullous diseases.în: Burns T, Breathnach S, Cox N, Griffiths C, Rook's textbook of dermatology. Wiley-Blackwell 2010; ediția 8; vol. 2:40.1-40.62

. Amagai M, Koch PJ, Nishikawa T. Pemphigus vulgaris antigen (desmoglein 3) is localized in the lower epidermis, the site of blister formation in pemphigus. J Invest Dermatol 1996; 106: 351-355

. Shirakata Y, Amagai M, Hanakawa T. Lack of mucosal involvement in pemphigus foliaceus may be due to low expression of desmoglein 1. J Invest Dermatol 1998; 110:76-78

. Yancey KB, Allen DM. The biology of the basement membrane zone.în: Bolognia JL, Jorizzo JL, Rapini RP, Dermatology. Mosby Elsevier 2008; editia 2; vol 1: 403-415

. Borradori L, Sonnenberg A. Structure and function of hemidesmosomes: more than simple adhesion complexes. J Invest Dermatol 1999; 112: 411-418

. Ruoslahti E. Integrins. J Clin Invest 1991; 87:1-5

. Goldberg M, Escaig-Haye F. Is the lamina lucida of the basement membrane a fixation artifact? Eur J Cell Biol 1986; 42:365-368

. Mutasim DF, Adams BB.Immunofluorescence in dermatology.J Am Acad Dermatol 2001545: 803-822

. Anhalt GJ, Mutasim DF. Bullous pemphigoid, cicatricial pemphigoid and pemphigoid gestationis.în: Jameson JL, Principles of molecular medicine. Humana Press 1998: p817-820

. Mutasim DF, Pelc NJ, Anhalt GJ. Cicatricial pemphigoid.Dermatol Clin 1993; »: 499*510

. Beutner EH, Chorzelski TP, Wilson RM, Kumar V, Michel B, Helm F. IgA pemphigus foliaceus: report of two cases and a review of the literature. J Am Acad Dermatol 1989; 20: 89-97

. Mutasim DF, Pelc NJ, Anhalt GJ. Paraneoplastic pemphigus.Dermatol Clin 1993; 11:473-481

. Kirstchig G, Wojnarowska F. Autoimmune blistering diseases. Clin Exp Dermatol 1994; 19: 97-112

. Wojnarowska F, Venning VA. Immunobullous diseases. în: Burns T, Breathnach S, Cox N, Griffiths C, Rook's textbook of dermatology. Wiley-Blackwell 2010; ediția 8; vol 2:40.1-40.62

. Amagai M. Pemphigus. în: Bolognia JL, Jorizzo JL, Rapini RP, Dermatology. Mosby Elsevier 2008; editia 2; vol 1:417-431

. Stanley JR. Pemphigus. în: Freedberg IM et al, Dermatology in general medicine. McGraw-Hill 1999; ediția 5; vol.i: 654-666

. Ioannides D, Lazaridou E, Rigopoulos D. Pemphigus. J Eur Acad Dermatol 2008; 22:1478-1496

. Ahmed AR, Mohimen A, Yunis AJ. Linkage of pemphigus vulgaris antibody to the major histocompatibility complex in healthy relatives of patients.J Exp Med 1993; 177:419-424

. Brandsen R, Frusic-Zlotkin M, Lybimov H et al. Circulating pemphigus IgG in families of patients with pemphigus: comparison of indirect immunofluorescence, direct immunofluorescence and immunoblotting. JAm Acad Dermatol 1997; 36:44-52

. Matzner Y, Erlich HA, Brautbar C et al. Identical HLA class II alleles predispose to drug-triggered and idiopathic pemphigus vulgaris. Acta Derm Venereol 1995; 75:12-14

. Merlob P, Metzker A, Hazaz B. Neonatal pemphigus vulgaris. Pediatrics 1986; 78:1102-1105

. Schiltz JR, Michael B. Production of epidermal acantholysis in normal human skin in vitro by the IgG fraction from pemphigus serum. J Invest Dermatol 1976; 67: 254-260

. Anhalt GJ, Labib RS, Vcorhees JJ.Induction of pemphigus in neonatal mice by passive transfer of IgG from patients with the disease.NEngl J Med 1982; 306:1189-1196

. Hashimoto K, Lever WF. An electron microscopic study on pemphigus vulgaris of the mouth and the skin with special reference to the intercellular cement. J Invest Dermatol 1967; 48: 540

. Ioannides D, Hytiroglou P, Phelps RG, Bystryn JC. Regional variation in the expression of pemphigus foliaceus, pemphigus erythematosus and pemphigus vulgaris antigens in human skin. J Invest Dermatol 1991; 96:159-161

. Burge SM, Wilson CL, Dean D. An immunohistological study of desmosomal components in pemphigus. Br J Dermatol 1993; 128:363-370

. Ishii K, Amagai M, Hall RP. Characterization of autoantibodies in pemphigus using antigen-specific enzyme-linked immunosorbent assays with baculovirus-expressed recombinant desmogleins. J Immunol 1997; 159: 2010-2017

. Fitzpatrick R, Newcomer R. Correlation of disease activity and antibody titres in pemphigus.Arch Dermatol 1980; 116: 285-290

. Bystryn JC, Rudolf JL. Pemphigus. Lancet 2005; 366:61-73

. Wolf R, Tamir A, Brenner S. Drug-induced versus drug-triggered pemphigus. Dermatologica 1991; 182: 20-210

. Tsunoda K, Ota T, Aoki M. Induction of pemphigus phenotype by a mouse monoclonal antibody against the amino-terminal adhesive interface of desmoglein 3. J Immunol 2003; 170: 2170-2178

. Tsunoda K, Ota T, Aoki M. Induction of pemphigus phenotype by a mouse monoclonal antibody against the amino-terminal adhesive interface of desmoglein 3. J Immunol 2003; 170: 2170-2178

. Aoyama Y, Owada MK, Kitajima Y. A pathogenic autoantibody, pemphigus IgG, induces phosphorylation of desmoglein 3 and its dissociation from pakoglobin in cultured keratinocytes. Eur J Immunol 1999; 29: 2233-2240

. Lever V. Pemphigus and pemphigoid. Springfield: Thomas 1965

. Veldman C, Stauber A, Wassmuth R. Dichotomy of autoreactive Thi and Th2 cell responses to desmoglein 3 in patients with pemphigus vulgaris (PV) and healthy carriers of PV-associated HLA class II alleles. J Immunol 2003; 170: 635-642

. Bystryn JC. Interpretation of immunofluorescence tests in dermatology. Prog Dermatol 1985; 19:1-8

. David M, Weissman-Katzenelson V, Ben-Chetrit et al. The usefulness of immunofluores-cent tests in pemphigus patients in clinical remission. Br J Dermatol 1989; 120:391-395

. Ratnam KV, PPang BK. Pemphigus in remission: value of negative direct immunofluorescence in management. J Am Acad Dermatol 1994; 30:547-550

. O'Loughlin S, Goldman GC, Provost TT. Fate of pemphigus antibody following successful therapy: preliminary evaluation of pemphigus antibody determinations to regulate therapy. Arch Dermatol 1978; 114:1769-1772

. Cheng SW, Amagai M, Nishikawa T. Monitoring disease activity in pemphigus with enzyme-linked immunosorbent assay using recombinant desmogleins 1 and 3. Br J Dermatol 2002; 147: 261-265

. Liu Z, Giudice GJ, Zhou X et al. A major role for neutrophils in experimental bullous pemphigoid. J Clin Invest 1997; 100:1256-1263

. Waisbourd-Zinman 0, Ben-Amitai D, Cohen AD et al. Bullous pemphigoid in infancy: clinical and epidemiological characteristics. J Am Acad Dermatol 2008; 58:41-48.

. Liu Z, Li N, Diaz LA et al. Synergy between a plasmingen cascade and MMP-9 in autoimmune disease.J Clin Invest 2005; 115: 879-887.

. Bird P, Friedmann P, Ling N et al. Subclass distribution of IgG autoantibodies in bullous pemphigoid. J Invest Dermatol 1986; 86: 21-25.

. Liu Z, Diaz LA, Troy JL et al. A passive transfer model of organ-specific autoimmune disease, bullous pemphigoid, using antibodies generated against hemidemosomal antigen BP180. J Clin Invest 1993; 92: 2480-2488.

. Liu Z, Giudice GJ, Zhou X et al. A major role for neutrophils in experimental bullous pemphigoid.J Clin Invest 1997; 100:1256-1263.

. Chen RR, Fairley JA, Zhao ML et al. Macrophages, but not T and B lymphocytes are critical for subepidermal blister formation in experimental bullous pemphigoid: mac-rophage-mediated neutrophil infiltration depends on mast cell activation. J Immunol 2002,169: 3987-3992

. Dvorak AM, Mihm MC, Osage JE et al. Bullous pemphigoid, an ultrastructural study of the inflammatory response: eosinophil, basophil and mast cell granule changes in multiple biopsies from one patient. J Invest Dermatol 1982; 78:91-101.

. Gunther C, Wozel G, Dressler J et al. Tissue eosinophilia in pemphigoid gestationis: association with eotaxin and upregulated activation markers on transmigrated eosinophils. Am J Reprod Immunol 2004; 51:32-39.

. Shimanovich I, Mihai S, Oostingh GJ et al. Granulocyte-derived elastase and gelatinase B are required for dermal-epidermal separation induced by autoantibodies from patients with epidermolysis bullosa acquisita and bullous pemphigoid. J Pathol 2004; 204:519-527

. Hull CM, Zone JZ. Dermatitis herpetiformis and linear IgA bullous dermatosis, în: Bolognia JL, Jorizzo JL, Rapini RP, Dermatology. Mosby Elsevier 2008; ediția 2; vol 1:447-456

. Mowat AM. Coeliac disease- a meeting point for genetics, immunology and protein chemistry. Lancet 2003; 361:1290-1292

. Sardy M, Karpati S, Merkl B et al. Epidermal transglutaminaze (TGase 3) is the auto-antigen of dermatitis herpetiformis. J Exp Med 2002; 195: 747-757

. Prost C, Labeille B, Chaussade V. Immunoelectron microscopy in subepidermal autoimmune bullous diseases. J Invest Dermatol 1987; 89: 567-573

. Ishiko A, Shimizu H, Ebihara T et al. Human autoantibodies against the 230-kD bullous pemphigoid antigen (BPAgi) bind only to the intracellular domain of the hemi-demosome, whereas those against the 180-kD bullous pemphigoid antigen (BPAg2) bind along the plasma membrane of the hemidesmosome in normal human and swine skin. J Clin Invest 1993; 91:1608-1615

. Lotti TM, Bianchi B, Menchini G. Epidermolysis bullosa.în: Katsambas AD, Lotti TM, European handbook of dermatolog ical treatments. Springer 2003; ediția 2:147-165

. Jacobe HT, Sontheimer RD. Autoantibodies encountered in patients with autoimmune connective tissue diseases. în: Bolognia JL, Jorizzo JL, Rapini RP, Dermatology. Mosby Elsevier 2008; ediția 2; vol 1: 549-560

. Goodfield MJD, Jones SK, Veale DJ. The "Connective Tissue Diseases".în: Burns T, Breathnach S, Cox N, Griffiths C, Rook's Textbook of Dermatology. Wiley-Blackwell 2010; ediția 8; vol 3: 51.1-51.138

. Sontheimer RD. Lupus erythematosus.în: Freedberg IM, Eisen AZ, Wolff K et al, Fitzpatrick's Dermatology in General Medicine. McGraw-Hill 1999; ediția 5; vol 2: 1993-2009

. Lee LA. Lupus erythematosus.în: Bolognia JL, Jorizzo JL, Rapini RP, Dermatology. Mosby Elsevier 2008; ediția 2; vol 1:561-573

. Yell JA, Wojnarowska F. Bullous skin disease in lupus erythematosus. Lupus 1997; 6:112-121

. Harley JB, Scofield RH. Systemic lupus erythematosus: RNA-protein autoantigens, models of disease heterogenicity and theories of etiology. J Clin Immunol 1991; 11: 297

. Marrak P, Kappler J, Kotzin BL. Autoimmune disease: why and where it occurs. Nat Med 2001; 7: 899-905

. Lorenz HM, Herrman M, Winkler T et al. Role of apoptosis in autoimmunity. Apoptosis 2000; 5: 443-449

. Scmidt-Acevedo S, Perez-Romano B, Ruiz-Argulles A. „LE cells" result from phagocytosis of apoptotic bodies induced by antinuclear antibodies. J Autoimmun 2000; 15:15-20

. Brențjens J, Ossie E, Albini B et al. Disseminated immune deposits in lupus erythematosus. Arhtritis Rheum 1977; 20: 962-968

. Furukawa F. Selective expansions of T cells expressing Vbeta8 and Vbetai3 in skin lesions of patients with cutaneous lupus erythematosus.J Dermatol 1996; 23: 670

. Furukawa F. Selective expansions of T cells expressing Vbeta8 and Vbetai3 in skin lesions of patients with cutaneous lupus erythematosus.J Dermatol 1996; 23: 670

. American College of Rheumatology. 1997 Update of the 1982 American College of Rheumatology revised criteria for classification of systemic lupus erythematosus. Web.20.Ol.20i3http://tinvurl-rnm/lQQ7SLEcriteria

. Burnham TK, Neblett TR, Fine G. The application of fluorescent antibody technique to the investigation of lupus erythematosus and various dermatoses.J Invest Dermatol 1963; 4i: 451-456

. Mutasim DF, Adams BB. Immunofluorescence in dermatology'. J Am Acad Dermatol 2001:45:803-822

. Rani Z, Hiissain I. Immunofluorescence in immunobullous diseases. J Pak Assoc Dermatol 2003; 13; 76-88

. Berland K. Basics of fluorescence. în: Periasamy A, Methods in Cellular Imaging. Oxford Universitv Press, 2001:5-19

. Mutasim DF, Pelc NJ, Supapanachart N. Established methods in the investigation of bullous diseases. Dermatol Clin 1993; 11:399-418

. Harper IS. Fluorophores and their labeiing procedures for monitoring various biological signals. în: Periasamy A, Methods in Cellular Imaging. Oxford University Press, 2001: 20-39

. Wojnarowska F, Eady RA, Burge SM. Bullous eruptions. în: Champion RH, Burton JL, Burns DA, Breathnach SM, Textbook of Dermatology. Oxford: Blackwell Science 1998; ediția 6:1817-1898

. Univeristy of Utah Health Care. „Diagnostic Immunodermatology Services". Web.

23.09.2013[ http://healthcare.utah.edu/dermatology/labservices/imunodermatology/selection.php]

. Kirstching G, Wojnarowska F. Autoimmune blistering diseases: An update of diagnostic methods and investigations. Clin Exp Dermatol 1994; 19: 97-112

. Arbesman J, Grover R, Helm TN et al. Can direct immunofluorescence testing still be accurate if performed on biopsy specimens after brief inadvertent immersion in formaline? J Am Acad Dermatol 2011; 65; 106-111

. Vodegel RM, De Jong M, Meijer HJ et al. Enhanced diagnostic immunofluorescence using biopsies transported in saline. BMC Dermatology 2004; 4:10

. Mera SL, Young GW, Bradfield JW. Direct immunofluorescence of skin using formalin-fîxed paraffin-embedded sections. J Clin Pathol 1980; 33: 365-369

. Beutner EH, Kumar V, Krasnv SA, Chorzelski TP. Defined immunofluorescence in immunodermatology. în: Beutner EH, Chorzclski TP, Kumar V, Immunopathology of the skin. John Wiley and Sons 1987; ediția 3:3-40

. Katz SI, Halprin KM, Inderbitzin TM. The use of human skin for the detection of antiepithelial autoantibodies: a diagnostic and prognostic test. J Invest Dermatol 1969; 53: 390-399

. Kumar V, Beutner EH. Monkey esophagus: a unique antigenic substrate in immunodermatology. în: Beutner EH, Chorzelski TP, Kumar V, Immunopathology of the skin. John Wiley and Sons 1987; ediția 3: 65-90

. Valenzuela L, Bergfeld WF, Deodhar SH. Interpretation of immunofluorescent patterns in skin diseases. Chicago: American Society of Clinical Pathologists Press 1984; ediția 1

. Woodley DT, Saudcr D, Tallcv MJ et al. Ixxralization of basement membrane components after dermal-epidermal junction separation..J Invest Dermatol 1983; 81: 149-153

. Judd KP, Mescon H. Comparison of different epithelial substrates useful for indirect immunofluorescence testing of sera from patients with active pemphigus. J Invest Dermatol 1979; 72: 314-316

. Feibleman C, Stolzner G, Provost Tr. Pemphigus: superiority of monkey esophagus in the determination of pemphigus antibody. Arch Dermatol 1981; 117: 561-562

. Mohn KH, Sathish P, Raghavendra R et al. Techniques of immunofluorescence and their significance. Indian J Dermatol Venereol Leprol 2008:74: 415-419

. Vassileva S. Immunfluoresccnce in dermatology'. Int J Dermatol 1993; 32:153-161

. Jordon RE, Triftshauser CT, Scroeter AL Direct inimunofluorescent studies of pemphigus and bullous pemphigoid. An h Dermatol 1971; 103: 486-491

. Aithal V, Kini U. Role of direct immunofluoresccncence on Tzanck smears in pemphigus vulgaris. Diagn Cytopathol 2007; 35: 403-407

. Schacrer L, Tnieb KM. Direct immunofluorescence of plucked hair in pemphigus. Arch Dermatol 2003; 139: 228-229

. Wilson CU Dean D, Wojnarowska F. Pemphigus and the terminal hair follicle. J Cutan Pathol 1991; 18: 428-431

. Daneshpazhooh M, Asgari M, Naraghi ZS ct al. A study on plucked hair as a substrate for direct immunofluorcscence in pemphigus v11lgaris.J Eur Acad Dermatol Venereol 2009; 23:129-131

. Kumaresan M, Rai R, Sandhya V. Immunofluorescence of the outer root sheath: an aid to the diagnosis in pemphigus. Clin Exp Dermatol 2010; 36: 298-301

. Daneshpazhooh M, Zahra S. Naraghi MD et al. Direct immunofluorescence of plucked hair for evaluation of imnuinologic remission in pemphigus vulgaris. J Am Acad Dermatol 2011; 65/6:173-177

. Stanley JR. Pemphigus. In: Frecdberg IM, Eisen AZ, VVolff K et al, Fitzpatriek's dermatohxiy in general medicine. McGraw-Hill 1999: ediția 5: vol 1:654-665

. Bystryn JC, Abel FL, DeFeo D. Pemphigus foliaceus: subcorneal intercellular antibodies of unique specificity. Arch Dermatol 1974; 110: 857-861

. Mahoney MG, Wang Z, Rothenbcrger K et al. Explanation for the clinical and microscopic localization of lesions in pemphigus foliaceus and vulgaris. J Clin Invest 1999! 103:461-468

. Nousari HC, Anhalt GJ. Pemphigus vulgaris, paraneoplastic pemphigus and pemphigus foliaceus. în: Kanitakis J, Vassileva S, Woodley D, Diagnostic immunohistochemistry of the skin. London: Chapman and Hali Medical 1998: ediția 1:79-83

. Kalaaji AN, Nicolas MEO. Mayo Clinic Atlas of Immunofluorescence in Dermatologi/. Patterns and Target Antigens. Mayo Clinic Scientific Press 2006

. Mutasim DF, Anhalt GJ, Diaz LA, Patel HP. Linear immunofluorescence staining of the cutaneous basement membrane zone produced by pemphigoid antibodies: the result of hemidesmosome staining. J Am Acad Dermatol 1987; 16:75-82

. Kntz SI. Herpes gcstationis (pemphigoid gestationis). Freedberg IM, Eisen AZ, WolfF K et al, Fitzpatrick's dermatology in general medicine. McGraw-Hill 1999; ediția 5: voi 1: 686-689

. Borradori L, Bernard P. Pemphigoid group. în: Bolognia JL, Jorizzo JL, Rapini RP, Dermatology. Mosby Elsevier 2008; ediția 2; voi 1:431-445

. Domloge-HultschN, Anhalt GJ, Gammon WR, Lazarova Z, Brigmann R, Welch M. Antiepiligrin cicatricial pemphigoid: a subepithelial bullous disorder. Arch Dermatol 1994; 130:1521-1529

. Schmidt Ii, Obe K, Brocker E-B, Zillikens D. Serum levels of autoantibodies to BP180 correlate with disease activity in paticnts with bullous pemphigoid. Arch Dermatol 2000; 136:174-178

. Mutasim DF. Levels of autoantibodies to BP180 correlate with disease activity in paticnts with bullous pemphigoid (editorial). Arch Dermatol 2000; 136: 253-254

. De Long MC, Bruins S, Heeres K. Bullous pemphigoid and epidermolysis bullosa aquisita: differentiation by fluorescent overlay antigen mapping. Arch Dermatol 1996; 132:151-157

. Helou J, Allbritton J, Anhalt GJ. Accuracy of indirect immunofluorescence testing in the diagnosis of paraneoplastic pemphigus. J Am Acad Dermatol 1995; 32:441-447

. Supapannachart N, Mutasim DF. The distribution of IgA pemphigus antigen in human skin and the role of IgA anti-cell surface antibodies in the induction of intniepidermal acantholysis. Arch Dermatol 1993; 129: 605-608

. Heng A, Nwnneshiudu A, Hashimoto T. Intraepidermal neutrophilic IgA/IgG antidesmocollin 1 pemphigus. Br J Dermatol 2006; 154:1018-1020

. Lee LA. Lupus erythematosus. In: Bolognia JL, Jorizzo JL, Rapini RP, Dermatology. Mosby Elsevier 2008; ediția 2; voi 1:561-574

. Goodfield MJD, Jones SK, Veale DJ. The „Connective Tissue Diseases". în: Burns T, Breathnach S, Cox N, Griffiths C, Rook's Textbook of Dermatology. Wiley-Blackwell 2010; ediția 8; voi 3: 51.1-51.138

. Dahl MV. Usefulness of direct immunofluorescence in patients with lupus erythematosus. Arch Dermatol 1983; 119: 1010-1017

. Burge SM, Frith PA, Miliard PR. The lupus band in oral mucosa, conjunctiva and skin. Br J Dermatol 1989; 121: 743-752

. Sontheimer RD, Gilliam .IN. A reappraisal of the relationship between subepidemal imunoglobulin deposits and DNA antibodies in systemic lupus erythematosus. J Invest Dermatol 1979; 72: 29-32

. Sliiohara T, Knno V, Lichen planus and lichenoid dermntoses. In: Bolognia JL, Jorizzo JL, Knpini Rl', Dermatology. Mosby Elsevier 2008; ediția 2; voi 1: 159-180

. Jacobe HT, Sontheimer RD. Autoantibodies encountered in patients with autoimmune connective tissue diseases. In: Bolognia JL, Jorizzo JL, Rnpini RP, Dermatology. Mosby Elsevier 2008; ediția 2; vol 1:549-560

. Chryssomallis F, loannides D, Teknetzis A. Treatment for oral pemphigus. Int JDermatol 1994; 33'- 803-807

. Scully C, Paes de Almeida O, Porter SR. Pemphigus vulgaris: the manifestatation and long-term management of 55 patients with oral lesions. .Br J Dermatol 1999; 140: 84-89

. Krasny SA, Beutner EH, Chorzclski TP. Specificity and sensitivity of indirect and direct immunofluorescence findings in the diagnosis of pemphigus. In: Beutner EII, Chorzclski TP, Kumar V, Immunpathologyyof the skin. John Wiley and Sons 1987; ediția 3: 207-248

. Harman KE, Albert S, Black MM. Guidclines for the management of pemphigus vulgaris. BrJ Dertnatol 2003; 149: 926-937

. George R, Kurian S,.Jacob M. Diagnostic cvaluation of the lupus foind test in discoid and systemic lupus crythematosus. Int J Dermatol 1995; 34: 170-173

. Sontheimer RD. Lupus eytlhematosus.În: Freedberg IM, Eisen AZ, Wolff K et al, Fitzpatriek's Dermatology in General Medieine. McGraw-Hill 1999; ediția 5; vol 2: 1993-2009

. Davis BM, Gillian JN. Prognostic significance of subcpidcrmal immunc deposits in uninvolved skin of patients with systemic lupus erythematosus: a 10-ycar longitudinal study. J Invest Dermatol 1984; 83: 242-247

. Wetheimer D, Barland P. Clinical significance of immunc deposits in the skin in SLE. Arthritis Rheum 1976; 19: 1249-1255