Implicatiile Polimorfismelor Glutation S Transferazelor In Etiopatogenia Polipozei Nazale

Implicațiile polimorfismelor Glutation-S-transferazelor în etiopatogenia polipozei nazale

CUPRINS

PARTE GENERALĂ – Polipoza nazală

Introducere

Definiție

Date epidemiologice

Etiopatogenie

Diagnostic

Subclasificare histopatologică a polipilor nazali

Tratament

Aspecte de biologie moleculară

Noțiuni generale privind polimorfismele genetice

Polimorfismele genetice implicate în etiopatogenia polipozei nazale

Polimorfismele GST și implicarea lor în polipoza nazală

PARTE SPECIALĂ

Introducere

Materiale și metodă

Analiza statistică

Rezultate

Discuții

Concluzii

Bibliografie

Parte generală

Polipoza nazală

Introducere

Istoria polipilor nazali începe încă din Egiptul Antic, cu peste 4000 de ani în urmă, dar au rămas în continuare o enigmă a istoriei consemnate a umanității. Polipoza nazală se regăsește într-o gamă largă de patologii, printre care fibroza chistică, sinuzita cronică, astmul bronșic, intoleranța la aspirină, prezentând componente histologice diverse, în funcție de patologia de bază asociată. Prin urmare, ar putea reprezenta un punct final comun al mai multor procese patologice, putându-se prezenta ca o leziune discretă, asimptomatică, localizată, masivă sau difuză a mucoasei nazale cu diformitate facială semnificativă. Polipoza nazală poate fi considerată, astfel, mai degrabă ca un fenotip clinic decât o patologie de sine stătătoare.

Conceptele actuale despre această patologie se axează pe procese inflamatorii secundare unei funcții dereglate a răspunsului imun local, în combinație cu un defect fundamental, care, împreună, duc la imposibilitatea de a menține integritatea barierei epiteliale nazale și a regula, astfel, un răspuns inflamator adecvat, coordonat la antigene străine. Studii recente au evidențiat un rol crucial al citokinelor epiteliale care mediază celulele sistemului imun. Cheia în înțelegerea acestor procese constă în acceptarea că atât pacienții cu sinuzită cronică și polipoză nazală, cât și pacienții indemni, sunt expuși la aceeași alergeni, fungi, bacterii (inclusiv Staphylococcus aureus), dar numai prima categorie prezintă un răspuns imun proinflamator exacerbat.

Polipoza nazală reprezintă cel mai comun grup de leziuni proliferative nazale. Prin urmare afectează un număr semnificativ de pacienți, afectând grav calitatea vieții prin simptomatologie și complicațiile care pot să apară. Senzația permanentă de obstrucție nazală, obstrucția uneori totală a cavităților nazale, anosmia și eventualele diformități rezultate pot interfera cu activitatea cotidiană a pacienților, de unde și necesitatea de a identifica și trata precoce, eficient această patologie.

Studiul de față analizează implicarea posibilă a 3 genotipuri ce codifică Glutation-S-transferazele (GST) în etiopatogenia hiposmiei din cadrul polipozei nazale. Enzimele GST sunt prezente în cantitate mare la nivelul epiteliului olfactiv și a mucoasei nazale atunci când acestea sunt expuse la diverse xenobiotice, poluanți, odoranți și ar putea, astfel, juca un rol important în chemorecepție și detoxifierea locală la nivelul acestor țesuturi. O posibilă asociere între aceste genotipuri și patologie poate constitui un factor de risc, eventual prognostic și chiar un marker de diagnostic în evoluția pacientului.

Definiție

Polipoza nazală se caracterizează prin prezența unei mucoase hiperplastice, edemațiate, proeminente la nivelul cavității nazale, având ca rezultat obstrucția nazală. Polipii sunt rotunzi sau piriformi, semitranslucizi, gelatinoși, netezi, cu baza pedunculată (figura 1) și se dezvoltă în afara cavității nazale. Localizarea comună este pe peretele lateral al nasului, la nivelul meatului mijlociu sau de-a lungul coanelor mijlocie și superioară. Se pot extinde spre porțiunea anterioară a nazofaringelui. Frecvent sunt multipli și se întâlnesc și la nivelul sinusurilor paranazale, în special etmoidale. Polii antrocoanali sunt frecvent unilaterali și apar preponderent la copii și adulți tineri (4-6% din polipoze).

Fig. 1 – Aspect macroscopic al polipilor nazali edematoși secționați, cu suprafață gălbuie, lucioasă.

Polipoza se dezvoltă frecvent la pacienții cu rinită cronică sau pansinuzită; coexistă cu astmul bronșic în proporție de 2,9-72% și se consideră că astmul are o prevalență crescută în rândul pacienților cu polipoză nazală. Chiar și în absența astmului clinic, acești pacienți au frecvent hiperreactivitate bronșică, evidențiabilă prin testul pozitiv la metacolină/histamină.

Polipoza nazală este parte integrantă a triadei Vidal/Samter, alături de astmul bronșic și intoleranța la aspirină.

Alte asocieri frecvente sunt cu fibroza chistică (20-30%), sindromul Kartagener (sinuzită cronică, situs inversus, bronșiectazii și polipoză nazală), sindromul Young, sindromul Churg-Strauss, sinuzită alergică fundică.

Nu există o creștere a prevalenței atopiei sau bolilor alergice în rândul pacienților cu polipoză nazală (nu s-au constatat diferențe între mastocitele epiteliale din polipii nazali ai pacienților alergici/nonalergici și nici corelații între densitatea eozinofilelor din țesutul polipos și testele cutanate pozitive sau concentrația IgE specifice serice).3

Date epidemiologice

Prevalența polipozei nazale în populația generală a fost estimată la 1-4%, deși dovezile în acest sens sunt puține. Studii mai vechi au sugerat o prevalență de 0,2-2,2% , iar studii care au cuprins autopsii au identificat polipoză nazală bilaterlă la 1,5-2% din pacienți. Dintre aceștia doar o parte devin simptomatici, cu o incidență anuală de 0,627/1000 de oameni.19

În paragrafele următoare este sistematizată epidemiologia polipozei nazale în funcție de diferiți factori: atopie și asocierea cu astmul, sex, vârstă, predispoziție gentică și patologii genetice asociate, intoleranța la aspirină, asocierea cu rinosinuzita alergică fungică, etnie și factori geografici.

Literatura medicală clasică a implicat că formarea polipilor nazali este un proces atopic, un răspuns la alergeni inhalatori. Deși pare intuitiv, datele curente însă sugerează o asociere slabă. Prevalența polipozei nazale la pacienții cu rinită alergică este estimată la 1,5-1,7% , prevalență care, de altfel, se apropie de estimările în populația generală. Studii pe cohorte mari au identificat o asociere puternică între astmatici și polipoza nazală, însă nu au demonstrat o asociere între atopici și polipoza nazală. Un astfel de studiu, care a cuprins peste 2.000 de pacienți, a concluzionat că polipoza nazală e mai comună la astmatici non-alergici (13%) în comparație cu astmaticii alergici (2,4%). Un studiu similar pe 106 de pacienți de la o clinică terță a identificat o prevalență a polipozei nazale de 57,6% la astmatici, în comparație cu 25% la cei non-astmatici. Prevalența între atopici (38%) și non-atopici (37%) a fost similară. În concluzie la aceste studii, pacienții astmatici sunt mai predispuși decât cei non-astmatici să dezvolte polipoză nazală, iar prezența atopiei nu pare să fie legată de patologie sau joacă un rol minor.

S-a sugerat că incidența polipozei nazale crește odată cu vârsta. Settipane a identificat un vârf al incidenței la pacienții de 50 de ani. De asmenea, a concluzionat că pacienții astmatici peste 40 de ani au un risc de 4 ori mai mare de a dezvolta polipoză nazală, față de cei sub 40 de ani.24 Un studiu pe o populație daneză, uniformă, cu 252 de pacienți, a identificat o incidență maximă între 40-60 de ani. În plus, pacienții peste 80 de ani aveau o probabilitate extrem de scăzută de a dezvolta polipoză nazală. Media vârstei de diagnostic a fost de 51 de ani la bărbați și 49 de ani la femei. Polipii unilaterali antrocoanali, în schimb, au fost diagnosticați la vârste mult mai fragede: 27 de ani la bărbați, 22 de ani la femei. Polipoza nazală la copii este extrem de rară, fiind estimată la copiii sub 16 ani la 0,1-0,216%.24 25 Un studiu pe 1.051 de pacienți pediatrici a identificat un singur caz cu polipoză nazală. Dacă se diagnostichează polipoza nazală la copii, se recomandă investigații suplimentare pentru fibroză chistică.

Ca și în cazul vârstei, impactul polipozei nazale în funcție de sex variază. Studiul danez menționat anterior a identificat o rație de 1,68 bărbați și 0,82 femei la 1.000 de locuitori.25

Genetica a fost propusă ca un alt factor etiologic al polipozei nazale. Aproximativ 14% din pacienții cu polipoză nazală au un istoric familial de polipoză nazală. Deși există o predispoziție genetică de a dezvolta polipoză nazală, nu s-a evidențiat un model ereditar Mendelian clar, iar la bază stă probabil o interacțiune de tip genă-mediu. Există variate patologii în care polipoza nazală este o manifestare a bolii. Fibroza chistică, spre exemplu, o patologie autozomal recesivă provocată de mutația genei CFTR, a cărei produs este un canal ionic de clor transmembranar, prezent mai ales în plămâni, ficat, pancreas și intestine, se manifestă, printre altele, cu polipoză nazală la aproximativ 20% din pacienți.24

O vasculită sistemică, sindromul Churg-Strauss, este o altă patologie în care se întalnește polipoza nazală. Colegiul American de Reumatologie definește această aptologie pe baza a 6 criterii, pentru un diagnostic pozitiv fiind necesare prezența a minim 4: astm, eozinofilie >10%, neuropatie, infiltrat pulmonar, anomalii ale sinusurilor paranazale, eozinofilie extravasculară. Mecanismele exacte de apariție a sindromului Churg-Strauss nu sunt cunoscute, dar activarea eozinofilică joacă un rol major. Sindromul Churg-Strauss este o vasculită a vaselor mici și medii, asociat cu rinită alergică și sinuzită cronică cu sau fără polipi nazali. Polipoza nazală e prezentă la 60% din pacienții cu sindrom Churg-Strauss și este un idicator precoce al patologiei. Corticosteroizii sunt extrem de eficienți în tratamentul polipozei nazale din cadrul sindromului Churg-Strauss.

Polipoza nazală este, de asmenea, des întâlnită la pacienți insensibili la aspirină (acid acetilsalicilic) sau antiinflamatoare non-steroidiene. La acești pacienți, medicația de acest fel induce un răspuns astmatic acut în 30-90 de minute de la ingestie. Această triadă de simptome – astm bronșic, sinuzită cronică cu polipi nazali și intoleranța la aspirină – este denumită triada Vidal sau Samter. Se estimează că în jur de 50% din pacienții cu intoleranță la aspirină prezintă polipoză nazală. Acești pacienți prezintă o rată crescută de recidivă după intervenția chirurgicală de excizie a polipilor.

Rinosinuzita alergică fungică este o entitate etiopatogenică într-un grup de pacienți cu sinuzită cronică, puternic asociată cu polipoza nazală. Pentru diagnostic este necesară prezența a următoarelor criterii: hipersensibilitate de tip I la fungi dematiacei, polipoză nazală, mucus abundent cu calcificări pe imaginile de CT, mucus eozinofilic cu cristale Charcot-Leyden fără invazie fungică în mucoasa sinusală înconjurătoare și fungi izolați din sinsuri. Aproximativ 5-10% dintre pacienții cu sinuzită cronică cu polipoză nazală prezintă rinosinuzită alergică fungică.

Cât timp mecanismele precise de formare a polipilor nazali rămân subiect de dezbatere, variațiile etnice și geografice au apărut ca un posibil factor modificator în procesul patofiziologic. În populația caucaziană s-a evidențiat faptul că polipoza nazală are o componentă predominant eozinofilică, datorită regulării pozitive a IL-5, eotaxinei și proteinei eozinofilice cationice (proteina asociată cu procesul inflamator, rezultată în urma degranulării eoziofilelor, cu propietăți neurotoxice, helminto-toxice și ribonucleolitice). Populațiile asiatice, în schimb, prezintă o componentă preponderent neutrofilică. O cohortă coreeană pe 30 de pacienți cu polipoză nazală a evidențiat că 66,7% dintre pacienți aveau o componentă non-eozinofilică a polipilor nazali.

Etiopatogenie

În decursul timpului, numeroase studii au încercat să explice patogenia polipozei nazale. Roluri importante sau dominante au fost atribuite alergiei respiratorii, infecțiilor, dezechilibrului autonom, anomaliilor enzimatice sau de structură a mucopolizaharidelor, obstrucției mecanice, citokinelor, histaminei etc. Principalul neajuns a acestor teorii a constat în faptul că ele nu reușesc să facă o disticție clară între cauza și efectele alterărilor histologice.

La ora actuală, schema cea mai coerentă de derulare a evenimentelor care determină formarea polipilor nazali este următoarea: stimuli cronici alergici și non-alergici acționează la nivelul celulelor structurale din mucoasa nazală (fibroblaști, celule epiteliale) determinând sinteza și eliberarea unor citokine, factori de creștere, amine vasoactive (histamină, serotonină), prostaglandine, leucotriene, kinine, esteraze, heparină, precum și expresia unor molecule de adeziune la nivel endotelial (VCAM-1, ICAM-1). Acumularea consecutivă de eozinofile, activarea lor și eliberarea unor mediatori citotoxici, care pot acționa și într-o manieră autocrină sau paracrină, ajută la constituirea unui cerc vicios inflamator.

În următoarele rânduri sunt evidențiate principalele mecanisme și căi de semnalizare identificate în constituirea polipozei nazale. Este de subliniat faptul că nu toți pacienții prezintă același mecanism patogenetic, mecanisme diferite fiind identificate mai ales la pacienți cu patologii asociate, precum fibroza chistică.

Alterări ale protein-kinazelor au fost identificate în numeroase patologii, printre care și cele de ordin inflamator, precum astmul și boli pulmonare obstructive cronice. Kinazele au rol important în controlul post-transcripțional al expresiei genelor inflamatorii, diferențierea celulelor T și apoptoza celulară. Studii individuale au evidențiat o relație între kinazele P38 MAP , ERK1/2 și sinuzită.

Factorii de transcriere NFκB și AP-1 au fost evidențiați ca fiind activi în sinuzită și numeroase alte patologii inflamatorii ale mucoasei. Prin legarea de sau în apropierea secvențelor specifice de ADN, factorii de transcriere regulează expresia genelor individuale sau a seturilor de gene. NFκB regulează genele responsabile de proliferarea celulară și supraviețuirea celulară și a fost asociat cu artrita inflamatorie, patologia inflamatorie intestinală și astm. Calea AP-1, alcătuită din c-Fos și c-Jun, regulează, de asemnea, transcrierea genelor legate de proliferarea celulară, mai ales ca răspuns la citokine, factori de creștere, stres și patogeni infecțioși. Regularea negativă a căii AP-1 a fost propusă ca mecanism prin care glucocorticoizii inhibă formarea polipilor nazali.7

Alte studii similare au evidențiat VEGF (vascular endothelial growth factor) ca factor important în formarea polipilor.

EGFR (epidermal growth factor receptor) este un receptor de suprafață care transmite semnale transmembranare prin funcția sa intrinsecă de tirozin-kinază. Această auto-fosforilare declanșează activare în aval și transmiterea semnalului prin alte cascade de transmitere, printre care MAPK, AKT și JNK. Citokine implicate în sinuzita cronică ar fi și TNF și IFN-alfa.

60-90% din populația celulară ai polipilor nazali este constituită din eozinofile. Astfel, formarea polipilor nazali s-a considerat un proces eozinofilic cu celule T helper 2 (TH2). Se presupune că prin degranularea și eliberarea de compuși citotoxici, precum proteina cationică eozinofilică (ECP), aceste celule inflamatoare propagă procesul inflamator și distrugerea celulară. Nivele ridicate ale citokinelor TH2 IL-5 și IL-4 au fost, de asemenea, identificate în țesutul polipoid. IL-4 promovează, pe lângă migrarea eozinofilelor, și diferențierea celulară de la TH0 la TH2. Regularea pozitivă ciclică care rezultă sporește în continuare procesul inflamator eozinofilic. IL-5 are un rol asemănător cu IL-4, promovând migrarea și diferențierea celulară, dar are și rol în prevenirea apoptozei. De asmenea, s-a identificat o regulare pozitivă a IL-8 în toata mucoasa, dar fără o asociere specifică cu formarea polipilor. În cazul polipozei nazale a pacienților cu fibroză chistică, s-au identificat markeri predominant neutrofilici, cu creșterea nivelelor IL-8 și myeloperoxidazei. Procesul inflamator în acest caz nu este dominat de eozinofile și TH2, ca în majoritatea sinuzitelor cronice cu polipi nazali, ci de un proces mediat de TH1.

Fig. 2 – Cunoștințele actuale despre medierea epitelială a răspunsului imun cu celule TH-2 și eozinofilie tisulară locală. Chiar dacă ar fi prezenți antigeni în lumenul sinusal (fungi, stafilococi, biofilme, etc.), care ar putea fi implicați în procesul inflamator, aceste flore microbiene sunt prezente în mod obișnuit la pacienții indemni, evidențiind rolul important al răspunsului inflamator dezorganizat al pacienților cu sinuzită cronică și polipi nazali.

Odată ce au fost menționate citokinele implicate, e necesară examinarea proceselor care se desfășoară în amonte și duc la propagarea și diferențierea celulelor T. În acest sens s-a studiat relația între gena FoxP3 și celulele T regulatoare (Treg). Aceste celule sunt descrise ca celule T supresoare, a căror funcție este menținerea auto-toleranței și homeostaziei sistemului imun. O funcție inadecvată se manifestă prin activare necontrolată a sistemului imun, așa cum poate fi observat în patologia autoimună. Gena FoxP3 își manifestă controlul asupra sistemului imun prin regularea producției celulelor Treg. La pacienții cu sinozită cronică cu polipi nazali s-a evidențiat o expresie scăzută a genei FoxP3 și, în consecință, o producție scăzută de Treg, în comparație cu pacienții cu sinuzită cronică fără polipi nazali și grupuri de control. La pacienții cu sinuzită cronică și polipi nazali au fost scăzute proporțional și nivelele de factor de creștere de transformare/tumoral β1 (TGF-β1). TGF-β1 este o citokină produsă de limfocite, macrofage, eozinofile, fibroblaști și e asociată cu depunerea locală de matrice extracelulară și distrugere celulară. TGF-β1 exercită o influență asupra fibroblaștilor stimulând producere de stromă fibroasă și țesut cicatricial hiperplastic. În studii in vitro cu privire la activitatea fibroblaștilor, TGF-β1 a crescut de 3 ori la pacienții cu polipi nazali la expunerea la IL-4. Pe lângă potențialul fibrotic și proliferativ, TGF-β1 a fost, de asemnea, asociat cu nivele scăzute de eotaxină (citokină chemotactică eozinofilă) și alți promotori inflamatori eozinofilici. TGF-β1 are prin urmare un rol dual atât ca agent antiinflamator, cât și ca promotor a fibrozei. Acest sistem ar putea explica tranziția de la inflamație acută/cronică la modificări fibrotice.

S-a acceptat ideea că nu toți pacienții cu sinuzită cronică care dezvoltă polipoză nazală prezintă o patologie predominant TH2-eozinofilică. 80% dintre pacienții occidentali se încadrează în acest tip, comparativ cu doar 35% din asiatici. Deși prezintă simptome similare, aspect CT și endoscopic similar, regulare pozitivă a IL-2 și TGF-β1 și negativă a FoxP3, celulelor Treg, s-au remarcat diferențe în ceea ce privește dominanța celulelor T și a celulelor inflamatorii, pacienții asiatici prezentând un model neutrofilic cu regulare pozitivă a celulelor T de tipul TH1/TH-17. Rolul celulelor TH-17 și a citokinelor asociate, IL-23 și IL-17, a fost identificat doar recent, acestea reprezentând un alt final al căii de diferențiere a limfocitelor CD4 în TH-1 sau TH-2. În loc de IL-4 (pentru TH-2) sau IL-12 (pentru TH1), inducerea celulelor TH-17 e stimulată de IL-1 și IL-6. Această producere de celule TH-17 duce la producerea de mediatori proinflamatori, fibroblaști și modificări tisulare.

Fig. 3 – Noi căi de diferențiere a celulelor T CD4+

Odată ce receptorul celulelor T CD4+ este ocupat de IL-12, acestea se diferențiază în celule TH-1, care produc IFNγ. Acest proces e regulat de Stat4 (Signal Transducer and Activator of Transcription) și T-bet. IFNγ e important în funcțiile de apărare ale organismului împotriva patogenilor intracelulari.

Ca răspuns la IL-4, celuleleT naive se diferențiază în TH-2, proces mediat de Stat6 și GATA3. Citokina IL-4 produsă de celulele TH-2 joacă un rol important în apărarea organismului împotriva infecțiilor helmintice.

IL-1 împreună cu IL-6 și IL-23 induc la om diferențierea în TH-17, proces mediat de factorii de transcriere RORγT și Stat3. Acest proces e inhibat de IFNγ, IL-4 și IL-2, acid retinoic și SOCS3 (Supressor Of Cytokine Signaling). Celulele TH-17 și citokinele asociate au rol în apărarea împotriva patogenilor extracelulari.

În prezența TGFγ-1, IL-2 și acidul retinoic (Retinoic Acid – RA) are loc diferențierea în celule Treg, proces mediat de Stat5 și FoxP3. Acestea au rol în supresia imună.

Entorotoxina Stafilococcus aureus (SAE) a fost sugerată ca posibil factor instigator sau modificator în polipoza nazală. Ca în alte reacții cu super-antigeni, SAE activează nespecific celulele T prin legarea de complexul major de histocompatibilitate II. Regularea pozitivă necontrolată duce la creșterea nivelelor de citokine pro-inflamatorii produse de celule TH-2. Acest fenomen e amplificat odată cu colonizarea S. aureus, 60% din pacienții cu sinuzită cronică cu polipi nazali prezentând colonizare, în comparație cu 33% din grupul de control. Efectul SAE evidențiat prin IgE specifice nu e universal printre pacienții cu sinuzită cronică cu polipi nazali. Pacienții astmatici sunt mai predispuși la colonizare cu S. aureus și nivele detectabile de IgE SAE, prezentând în consecință nivele ridicate de IL-5, eotaxină și ECP. Studii suplimentare sunt necesare pentru o corelare între efectele SAE, simptomele clinice și evoluția patologiei.

O mică parte din pacienții cu polipi nazali și sinuzită cronică sunt clasificați ca având patologie respiratorie exacerbată de aspirină (aspirin-exacerbated respiratory disease – AERD), cunoscută și sub denumirea de triada Vidal/Samter/aspirinei. O altă particularitate a acestor pacienți este prezența sinuzitei eozinofilice hiperpastice. Eozinofilia marcată a țesutului, mastocite infiltrate care produc histamină și nivele ridicate de cysteinil-leukotriene, secundare supraexpresiei de leukotrien-C4-sintetază, contribuie la infamația sistemică. La pacienții cu AERD e exacerbată patologia prin introducerea de inhibitori de ciclooxigenază 2 (COX-2) prin deplasarea căii de transformare a acidului arahidonic spre calea lipooxigenazei și creșterea consecutivă a leukotrienelor. Mucoasa nazală a acestor pacienți prezintă nivele scăzute de COX-1 și COX-2. Deci, chiar și înainte de injurie, pacienții produc mai puțină prostaglandină protectoare E2 (PGE2).

Fibroza chistică (FC) este o boală genetică recesivă care afectează aproximativ 1 din 2500 de oameni. Toți pacienții cu FC dezvoltă sinuzită cronică, dar dintre aceștia, doar 7-48% dezvoltă polipi nazali. FC cu polipi nazali se remarcă între celelalte grupuri de polipoze nazale prin fenotipul și diagnosticul specific. Defectele ciliare ale acestor pacienți creează un mediu propice colonizării bacteriene, mai ales cu Pseudomonas aeruginosa. Răspunsul neutrofilic rezultat în urma colonizării explică dominanța IL-8 și myieloperoxidazei în cascada inflamației și apariției polipilor nazali. Rolul patogenilor bacterieni este susținut și de prezența receptorilor toll-like (clasă de proteine care sunt exprimate în mod obișnuit pe suprafața celulelor santinelă – macrofage, celule dendritice – și care recunosc molecule derivate de la microbi) și a ineficienței corticosteroizilor în tratamentul polipozei nazale în cadrul fibrozei chistice.

În concluzie, diagnosticul de polipoză nazală ar putea fi privit mai degrabă ca un fenotip clinic, decât o patologie cu homogenitate imunologică și histologică.

Diagnostic

Diagnosticul polipozei nazale se face în urma relevărilor aduse de anamneză, examenul obiectiv și analizele paraclinice ale pacienților.

Pacienții cu polipoză nazală au istoric de rinită perenă și se prezintă cu următoarea simptomatologie: obstrucție nazală permanentă (100%), anosmie sau hiposmie (75%), rinoree, secreții nazale purulente sau drenaj posterior (când există obstrucție osteomeatală sau sinuzită), durere facială, strănut, uneori prurit ocular. Rar, poate apărea o ptoză unilaterală, punându-se problema unui diagnostic diferențial cu o malignitate orbitală. Simptome secundare pot include tulburări de somn, sforăit, cefalee, alterare a calității vieții mai intensă decât în cazul rinitelor. Aceste simptome pot fi exacerbate de stimuli nespecifici, precum schimbările de temperatură, mirosurile intense, iritanții chimici, fumul sau praful. În general, succesiunea simptomelor este următoarea: rinită vasomotorie cu rinoree profuză, urmată de obstrucție nazală intensă și ulterior, polipoză nazală. Astmul bronșic se dezvoltă ulterior, iar sensibilizarea la aspirină este ultima care apare. Această succesiune însă nu este absolută, iar ordinea evenimentelor poate varia.

Examenul fizic și endoscopic evidențiază mase polipoase. Doar rinoscopia anterioară este inadecvată pentru un diagnostic precis. Polipii sunt rotunzi sau piriformi, semitranslucizi, gelatinoți, netezi, cu baza pedunculată și se dezvoltă în afara mucoasei nazale. Localizarea tipică este pe peretele lateral al nasului, la nivelul meatului mijlociu sau de-a lungul coanelor mijlocii și superioare. Se pot extinde spre porțiunea anterioară a nazofaringelui. Frecvent sunt multipli și se întâlnesc la nivelul sinusurilor paranazale, în special etmoidale. Caracteristic este faptul că polipii nu sunt dureroși la manipulare. Se impune un diagnostic diferențial cu alte formațiuni tumorale (angiofibroame, carcinoame, papilomatoză, sarcoame) în momentul în care polipii sunt unilaterali, fermi, friabili sau sângerează spontan la manipulare.

La examinarea radiologică (CT) se poate evidenția mucocel sau piocel în sinusurile paranazale, pierderea translucenței în sinsurile maxilare, etmoidale, frontale sau lărgirea labirintului etmoidal.

Pentru o evaluare completă a pacientului sunt necesare un examen bacteriologic al secrețiilor nazale, teste cutanate alergologice pentru evidențierea atopiei, efectuarea unei spirometrii pentru aprecierea funcției pulmonare și a unei eventuale asocieri cu astmul bronșic, eventual un test de provocare cu lysin-aspirină pentru a evidenția sensibilizarea la aspirină.

39

Subclasificare histopatologică a polipilor nazali

În populația albă, eozinofilia tisulară este asociată puternic cu fenotipul de polipi nazali. Sinuzita nazală cronică eozinofilică este definită histologic de prezența a peste 10 eozinofile pe câmpul microscopic cu mărire mare (High Power Field). Acest diagnostic implică severitate clinică și radiologică mai mare, risc crescut de astm și risc crescut de recurențe ale polipilor nazali, în comparație cu sinuzitele cronice non-eozinofilice.12

Polipii nazali de tip non-eozinofilici se întâlnesc mai ales la populația asiatică, care prezintă un model inflamator preponderent neutrofilic și la paienții cu fibroză chistică, care prezintă eozinofile puține (drept urmare glucocorticoterapia inhalatoare are un impact slab asupra lor), mastocite în număr mare, active, alături de celule endoteliale, limfocite și plasmocite.37

Tratament

Tratamentul polipozei nazale este dificil, deoarece este vorba despre o patologie heterogenă, cu multiple mecanisme patogenetice care duc la același punct final clinic. Scopurile tratamentului sunt: eliminarea sau reducerea dimensiunilor polipilor, restabilirea respirației nazale și a olfacției. Reducerea simptomelor de rinită, reducerea numărului de infecții bacteriene și prevenirea recurențelor.

Principiul de bază în tratamentul polipozei nazale constă în faptul că inflamația cronică, severă a mucoasei nazale trebuie controlată. Infecțiile acute bacteriene trebuie tratate cu antibiotice (ideal orientate spre speciile izolate în culturi). Intervenția chirurgicală este rezervată cazurilor în care tratamentul medicamentos a dat greș.37

Glucocorticoizii topici, intra-nazali, reprezintă, momentan, tratamentul de elecției al polipozei nazale. Tratamentul cu aceștia scade mărimea polipilor nazali, reduce congestia nazală și rinoreea, dar pe olfacție au un efect redus. Combinația terapiei inhalatorii cu cea sistemică are un efect mai bun în acest sens. Cei mai frecvenți corticosteroizi topici sunt: beclometazona dipropionat, budesonid, fluticazonă propionat, mometazonă furoat, triamcinolon acetonid, tixocortol. Lipsa de răspuns după minim 4 săptămâni de tratament corect efectuat impune reevaluarea terapiei. Eșecul se poate datora obstrucției nazale marcate, infecției sinusale asociate, corticorezistenței, sau unei tehnici deficitare de administrare. Pacientul trebuie instruit și educat în ceea ce privește administrarea corticosteroizilor topici, explicându-i-se așa numita poziție Moffat: șezând pe genunchi, cu trunchiul arcuit, capul la nivelul solului, jetul se direcționează spre exterior, ia pacientul trebuie să rămână în această poziție minim 3 minute.37 De asemenea, se poate apela la varianta similară, ilustrată mai jos, în figura 9. Efectele adverse ale corticoterapiei topice nazale sunt, de obicei, de intensitate redusă și includ următoarele: iritație nazală, epistaxis, grețuri, disgeuzie, cefalee, infecții respiratorii. Nu s-au identificat modificări ale nivelului corticosteroizilor plasmatici, perforația septului nazal, rinită atrofică, metaplazie scuamoasă sau modificări ale epiteliului de suprafață în urma tratamentului topic.

Utilizarea antibioticelor în această patologie rămâne controversată, iar multe studii nu au demonstrat benificii mai mari în comparație cu irigările cu soluții saline. Antibioticele sunt utilizate pentru a elimina infecțiile acute și a reduce inflamația. Doxicilina are un efect modest pe pacienții cu polipoză nazală, posibil datorită efectului dual antibiotic-antiinflamator. Alte antibiotice indicate ar fi amoxicilina, ampicilina, cefaclor și cefuroxim.37

Fig. 9 – Instilarea medicației topice intra-nazale 42

Recent, a început să câștige teren terapia biologică în această patologie. Astfel, perspectivele de viitor în tratamentul polipozei nazale ar putea include terapia cu anticorpi monoclonali împotriva Ig E (Omalizumab; singurul aprobat și aflat pe piață), IL-5 (Mepolizumab și Reslizumab; aflate în faza a II-a de dezvoltare), IL-4 simultan cu IL-13 (Dupilumab; aflat în faza a II-a de dezvoltare). În trialuri și-au dovedit eficacitatea prin reducere polipilor nazali, îmbunătățirea scorului la CT și ameliorarea semnificativă a simptomatologiei. Un dezavantaj major va consta în costurile ridicate ale unei astfel de terapii.

Fig. 10 – Opțiuni terapeutice în rinosinuzita cronică cu polipi nazali 44

Chirurgia este indicată în mod clar pacienților cu complicații intra-craniale și intra-orbitale, mucocele, variații anatomice, patologie fungică atopică, polipi masivi cu remodelare osoasă, poli antrocoanali. Însă majoritatea pacienților e constituită de către cei care rămân simptomatici în ciuda tratamentului medicamentos. Intervențiile chirurgicale au menirea de a îndepărta țesut inflamator și septe osoase în cavitățile sinusale. 41 Chirurgia endoscopică funcțională pare a avea rezultate mai bune cu recurențe mai rare. 43

Aspecte de biologie moleculară

Noțiuni generale privind polimorfismele genetice

Polimorfismele genetice reprezintă una sau mai multe forme alternative (alele) ale unui locus cromozomial, care diferă prin secvența nucleotidică sau prin numărul variabil de unități nucleotidice repetitive în tandem (indel-e – cuvânt creat din cuvintele „inserție” și „deleție”, reprezentând porțiuni scurte de inserții sau deleții în genom). Definiția cuprinde și faptul că un polimorfism genetic poate fi altceva decât o formă de genă, deoarece polimorfismul genetic poate fi situat oriunde în genom, nu doar ca parte integrantă a unei gene.

Există patru clase mare de polimorfisme genetice: polimorfisme uni-nucleotidice (single-nucleotide polymorphism sau SNP), microsateliți (short tandem repeats – STR), număr variabil de repetiții în tandem/minisateliți (variable number of tandem repeats – VNTR) și numărul variabil de copii (copy number polymorphism – CNP).

SNP-urile reprezintă alterarea unei singure perechi de baze nucleotidice într-un anumit locus cromozomial.

STR-urile reprezintă secvențe de 2-6 perechi de nucleotide, care sunt repetate în tandem. În fiecare astfel de locus, STR-urile pot fi repetate de până la 100 de ori.

VNTR-urile sunt similare STR-urilor, dar unitatea repetitivă este mai mare, variind între 7 și zeci de perechi de baze azotate.

CNP-urile reprezintă variații în numărul de copii ale porțiunilor mai mari de genom, variind între 200 perechi de baze, până la 2 mega-baze. Pot avea doar două alele (prezența sau absența unui segment) sau multiple alele, datorită prezenței a 0, 1, 2 , 3 sau mai multe copii ale unui segment de ADN pe un cromozom.

Polimorfismele genetice implicate în etiopatogenia polipozei nazale

În 1992 s-au raportat cazuri de gemeni monozigoți, concordanți, care s-au prezentat cu rinosinuzită cronică cu polipi nazali, în ciuda expunerii la medii diferite. În mod similar, agregarea familială a unei patologii sugerează un substrat genetic; sunt prezente în literatura de specialitate numeroase raportări de cazuri cu familii care prezintă o prevalență înaltă a rinosinuzitei cronice fără sau cu polipi nazali (cu sau fără patologie respiratorie exacerbată de aspirină. În plus, pacienții cu rinosinuzită cronică au o probabilitate mare de a raporta atecedente heredocolaterale pozitive. Baza genetică a rinosinuzitei cronice este susținută și prin faptul că numeroase patologii cu defecte genetice cunoscute includ rinosinuzita cronică în prezentarea lor clinică. Printre acestea se numără diskinezia ciliară primară, patologii monogenice precum fibroza chistică (provocată de disfuncția unui canal de transport de clor epitelial, datorită mutației în gena CFTR – cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene). De asemenea, trăsăturile inflamatorii ale rinosinuzitei cronice prezintă similitudini cu cele ale pacienților cu astm sau rinită alergică, acestea fiind patologii complexe cu componente genetice clar stabilite.

Chiar și atunci când un polimorfism genetic este identificat ca fiind asociat cu rinosinuzita cronică cu polipi nazali, e important să se ia în considerare numeroase cauze care ar putea determina această asociere. Un polimorfism uninucleotidic (single-nucleotide plymorfism – SNP) poate provoca în mod direct patologia prin alterarea reglării unei gene sau prin alterarea funcției proteinei. Alternativ, SNP-ul identificat poate fi în dezechilibu de legatură (asociere nealeatoare de alele în loci diferiți dependente una de cealaltă și a căror descriere implică fenomenul de recombinare a ADN-ului) cu varianta de fapt cauzatoare a patologiei (ex. SNP-ul identificat se poate afla la distanță de SNP-ul cauzator, neidentificat, al patologiei, dar, pentru că aceste 2 SNP-uri sunt moștenite nealeator, SNP-ul genotipat ar prezice variație în SNP-ul negenotipat).

Majoritatea studiilor genetice legate de rinosinuzita cronică au investigat polimorfisme-candidat. Studii de tip GWAS (genome-wide association study) abordează problema dintr-o perspectivă unică, independentă de o ipoteză anume, prin secvențierea ADN-ului unui grup cu patologia investigată și compararea sa cu ADN-ul unui grup de control, indemn. Sunt analizate astfel milioane de SNP-uri și comparate cu cele ale grupului de control. Dacă un polimorfism apare mai des la grupul cu patologia investigată față de grupul de control, acel polimorfism este considerat ca fiind asociat cu patologia respectivă. Aceste studii oferă dovezi suplimentare pentru gene-candidat bănuite ca fiind implicate într-o anumită patologie și identifică candidați noi. În cazul polipozei nazale, doar două astfel de studii au fost publicate până în prezent (în legătură cu gena CFTR).

În tabelul de mai jos sunt ilustrate polimorfisme genetice identificate în multiple studii ca fiind statistic semnificativ asociate cu rinosinuzita cronică cu polipi nazali.

Tabel 1 – Polimorfisme genetice asociate cu rinosinuzita cronică cu polipi nazali

Rinosinuzita cronică și locusul CFTR

Prevalența înaltă a rinosinuzitei cronice printre pacienții cu fibroză chistică, sugerează faptul că CFTR ar contribui la patologia rinosinuzitei cronice, iar această relație s-ar putea extinde chiar și la pacienți fără simptomatologie clinică de fibroză chistică. Numeroase studii genetice și epidemiologice susțin o asociere între CFTR și rinosinuzita cronică la pacienții fără fibroză chistică. Cele mai frecvente mutații identificate au fost variante de DF508 și M470V. Un studiu mic retrospectiv în SUA a identificat la pacienții cu polipoză nazală o incidență mare a mutațiilor CFTR (66% – la 4/6 pacienți). Incidența mai mare față de cea evidențiată în alte studii similare s-a datorat faptului că acești cercetători au apelat la secvențierea completă a genei CFTR și au identificat astfel toate mutațiile, inclusiv pe cele rare. Autorii studiului au estimat că ar fi ratat 75% din polimorfisme dacă ar fi folosit doar screening genetic, care implică căutarea de mutații specifice, mai comune.

Pacienții cu fibroză chistică prezintă un clearence mucociliar scăzut, ceea ce ar predispune la infecții recurente și inflamație cronică. Modificări în apărarea gazdei asociate cu disfuncția CFTR, precum pH sinonazal alterat, transport scăzut al tiocianaților (cu funcție de antioxidanți și antimicrobiali), mucusul hipervâscos cu nivele scăzute ale oxigenului (atribuit consumului crescut de către celulele epiteliale) ar favoriza formarea biofilmului și proliferarea bacteriană. Nivelele crescute de IL-8 și ale activității receptorilor toll-like 2 contribuie la inflamație auto-întreținută și leziuni ale căilor aeriene. Trăsăturile acestea sunt prezente atât la pacienții cu fibroză chistică, cât și la pacienții cu rinosinuzită cronică, ceea ce sugerează încă o dată o relație independetă de fibroză chistică între polimorfismele genei CFTR și rinosinuzita cronică.

Rinosinuzita cronică și genele HLA

Prezentarea de antigene este o legătură importantă între imunitatea adaptativă și cea înnăscută, iar genele HLA joacă un rol major în această funcție. Moleculele principale de HLA clasa I (HLA-A, HLA-B, HLA-C) sunt prezente și exprimate aproape ubicvitar în celulele corpului uman și reprezintă, în general, antigene endogene (peptide antigenice derivate din proteine sintetizate în interiorul celulei). Moleculele principale HLA de clasa a II-a (HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP) sunt exprimate în mod continuu de celule B, celule dendritice, monocite și macrofage (expresia lor poate fi indusă și în alte celule) și mediază prezentarea antigenelor exogene. Polimorfismele HLA au fost asociate puternic cu diferite patologii inflamatorii (diabet tip I, spondilită anchilozantă), dar relația dintre polimorfismele HLA și rinosinuzita cronică rămâne neclară.

Cea mai puternică asociere identificată până acum în acest sens a fost între rinosinuzita cronică și polimorfismul HLA-DRB1*04. Însă două studii care au examinat această asociere au avut rezultate ușor diferite, în sensul că un studiu mexican a evidențiat asocierea în rinosinuzita cronică cu polipi nazali, dar fără patologie respiratorie exacerbată de aspirină și puțini pacienți cu astm, iar un studiu turcesc a evidențiat asocierea doar la pacienții care aveau pe lângă polipoza nazală și astm sau patologie respiratorie exacerbată de aspirină. Aceste discrepanțe ar putea sugera faptul că acest polimorfism e asociat cu diferite fenotipuri de rinosinuzită cronică (spre exemplu cu sau fără astm sau patologie exacerbată de aspirină) în populații diferite.

Rinosinuzita cronică și gene ale imunității înnăscute

Imunitatea înnăscută se referă la diferite mecanisme de apărare împotriva agenților patogeni, precum barierele fizice (ex. bariera epitelială, clearence-ul mucociliar), molecule antimicrobiene (ex. complement, defensine, pentraxine), celule specifice (ex. dendritice, eozinofile, neutrofile), mediatori ai reacției inflamatorii și receptori care recunosc elemente microbiale conservative.

În ultimii ani au apărut tot mai multe dovezi care sugerează un răspuns imun aberant în patologia rinosinuzitei cronice. Spre exemplu, studiile au arătat nivele scăzute de proteine antimicrobiale S100 în țesutul sinonazal al pacienților cu rinosinuzită cronică. De asmenea, s-au evidențiat nivele scăzute de receptori toll-like 9 și nivele crescute de receptori toll-like 2. 42 Un studiu recent sugerează că receptorul pentru gustul amar, T2R38, ar influența abilitatea celulelor tractului respirator superior de a combate o infecție.

Rinosinuzita cronică și genele implicate în inflamația cu celule TH-2

Rinosinuzita cronică cu polipi nazali prezintă, în țesutul sinonazal, un profil inflamator cu celule de tip TH-2 și nivele crescute de citokine specifice acestora (ex. IL-5, IL-13) și număr crescut de eozinofile. Studiile care au evidențiat această relație sunt puține la număr. Printre ele, a fost efectuat un studiu belgian, cu 700 de pacienți bine fenotipați, care a evidențiat un polimorfism în gena IL-33 (citokina IL-33 stimulează inflamația cu celule TH-2).

Rinosinuzita cronică și alte gene proinflamatorii

Deși profilul inflamator cu celule TH-2 ar fi mai caracteristic rinosinuzitei cronice cu polipi nazali decât al rinosinuzitei fără polipi nazali, atât celule TH-2, cât și celule TH-1 sunt prezente în ambele patologii. Studiile au investigat, astfel, alți mediatori ai inflamației și procese în conturarea patologiei (ex. adeziunea și comunicarea intercelulară).

Rezultatele acestor investigații au fost mixte. S-au găsit asocieri semnificative între rinosinuzita cronică și limfotoxina α (TNF-β; implicată în limfangiogeneză), receptorul α IL-22 (implicat în producerea de reactanți de fază acută și peptide antimicrobiale), receptori inhibitori ai IL-1, proteina 3 indusă de TNF-α (modulează factorul de transcriere NFκB, implicat în proliferarea celulară).42

Rinosinuzita cronică și gene implicate în remodelarea țesutului sinonazal

Remodelarea aberantă a țesutului epitelial sinonazal a fost identificată la pacienții, din diferite populații, cu rinosinuzită cronică.

Nivelele de TGF-β par a fi mai ridicate la pacienții cu rinosinuzită cronică fără polipi nazali și mai scăzute la pacienții cu rinosinuzită cronică cu polipi nazali. Nivelele metaloproteinazelor de matrice (care acționează pe componentele extracelulare ale matricei) și ale inhibitorilor acestora diferă, de asemenea, în rinosinuzita cronică cu și fără polipi nazali. Alți factori incriminați în patogenia rinosinuzitei cronice sunt inhibitorul 1 al activatorului de plasminogen (plasminogen activator inhibitor 1 – PAI-1), activatorul tisular al plasminogenului, cunoscuți cu rolul lor de remodelare tisulară și fibroză.42

Rinosinuzita cronică și genele imlicate în metabolismul acidului arahidonic

Metabolismul acidului arahidonic este perturbat la pacienții cu patologie respiratorie exacerbată de aspirină, în care prezența polipozei nazale este un criteriu de diagnostic, alături de intoleranța la aspirină și astm. Studii recente au demonstrat o perturbare a acestui metabolism la pacienții cu polipoză nazală, chiar și în absența patologiei respiratorii exacerbate de aspirină.

Alte gene implicate în rinosinuzita cronică

O gamă largă de alte molecule au fost examinate în relația lor cu rinosinuzita cronică, dar, ca majoritatea literaturii de acest tip, studiile au putere statistică limitată, o mică măsură în replicarea datelor identificate și cunoștințe vagi legate de SNP-urile identificate.

Doar un singur studiu a identificat o asociere pozitivă între o mutație nulă a genei glutation-S-transferazei GSTT1 și polipoza nazală, pe o populație turcă de 75 de pacienți cu polipoză nazală și un grup de control de 167. Alte studii similare nu au mai identificat asocieri semnificative între polipoza nazală și alte polimorfisme din această cale a GST-ului (GSTP1 sau GSTM1).50

Polimorfismele GST și implicarea lor în polipoza nazală

Profilul inflamator al polipozei nazale implică, printre leziuni epiteliale, edeme, infiltrat cu celule inflamatorii, la nivel local, o producție crescută de specii reactive de oxigen, radicali liberi, respectiv un stres oxidativ crescut asupra țesutului sinonazal; speciile reactive de oxigen pot provoca leziuni tisulare prin modificarea chimică a lipidelor, proteinelor, nucleotidelor și glucidelor. Evoluția patologiei este influențată de acest stres oxidativ.

Oxidanții influențează pompele ionice mebranare rezultând în creșterea concentrației de și scăderea de , cu deplasarea în citoplasmă. De asemenea, s-a observat o creștere a permeabilității și a absorbției de în polipii nazali. Aceste situații duc la edem al mucoasei, în primele stadii, și leziuni epiteliale în stadiile timpurii.54

Glutation-S-transferazele (GST) fac parte din principalul sistem enzimatic antioxidant, care protejează țesuturile de acțiunea nocivă a speciilor reactive de oxigen. De asemenea, reprezintă un grup major de enzime detoxifiante, prin conjugarea xenobioticelor la glutation. Principalele clase de izoenzime GST sunt α, θ, µ, π. Funcțiile acestora se află sub controlul genelor GST. Aceste gene sunt polimorfe și includ, în principal, o alelă nulă, nefuncțională. Polimorfismele GST au fost asociate cu numeroase patologii inflamatorii și neoplazice, dar rolul cert în polipoza nazală este încă dezbătut.54

PARTE SPECIALĂ

Introducere

Polipoza nazală acompaniază numeroase patologii, printre care fibroza chistică, sinuzita cronică, astmul bronșic, intoleranța la aspirină, prezentând componente histologice diverse, în funcție de patologia de bază asociată. Prin urmare, ar putea reprezenta același final al mai multor procese patologice și poate fi considerată, astfel, mai degrabă ca un fenotip clinic decât o patologie de sine stătătoare.

Conceptele actuale despre această patologie se axează pe procese inflamatorii secundare unei funcții dereglate a răspunsului imun local, în combinație cu un defect fundamental, care, împreună, duc la imposibilitatea de a menține integritatea barierei epiteliale nazale și a regula, astfel, un răspuns inflamator adecvat, coordonat la antigene străine.

Polipoza nazală reprezintă cel mai comun grup de leziuni proliferative nazale. Prin urmare afectează un număr semnificativ de pacienți, afectând grav calitatea vieții prin simptomatologie și complicațiile care pot să apară, de unde și necesitatea de a identifica și trata precoce, eficient această patologie.

Rolul enzimelor din familia GST ar putea fi important în expunerea la leziunile induse de xenobiotice la nivelul mucoasei nazale. Enzimele GST sunt prezente în cantitate mare la nivelul epiteliului olfactiv și a mucoasei nazale atunci când acesta este expus la diverse xenobiotice, poluanți, odoranți și ar putea, astfel, juca un rol important în chemorecepție și detoxifierea locală la nivelul acestui țesut.

Studiul de față analizează implicarea posibilă a 3 genotipuri ce codifică Glutation-S-transferazele (GST) (alelele nule GSTM1, GSTT1 – deci polimorfisme caracterizate prin absența completă a funcției acelor gene, similar unei deleții acelui locul – și polimorfismul Ile105Val GSTP1) în etiopatogenia hiposmiei din cadrul polipozei nazale.

Obiectivele studiului sunt:

evaluarea frecvenței alelelor/genotipurilor mutante în lotul de studiu și lotul de control;

demonstrarea existenței unei legături între prezența aleleor/genoipurilor nule ale GSTM1, GSTT1 și al polimorfismul Ile105Val GSTP1 și apariția polipozei nazale cu hiposmie la acești pacienți;

cuantificarea importanței acestor legături.

Material și metodă

Lotul de studiu

Studiul efectuat este unul analitic, observațional, de tip caz-martor. Datele au fost culese prin eșantionare, longitudinal retrospectiv, urmărindu-se frecvența alelelor/genotipurilor nule ale genei GST la pacienții cu polipoză nazală, respectiv fără polipoză nazală, precum și distribuția lor pe sexe.

Studiul cuprinde un număr total de 199 subiecți, din care 75 pacienți cu polipoză nazală, diagnostic stabilit în urma consultului clinic și paraclinic ORL (endoscopie nazală), recrutați din cadrul secției ORL a Spitalului Clinic de Urgență Cluj, Cluj-Napoca care au servit drept lot caz) și 124 subiecți fără polipoză nazală (care au servit drept lot martor), pacienți ai secției Medicală II a Spitalului Clinic Județean Cluj. Subiecții incluși în studiu au fost selecționați randomizat și s-au numărat printre pacienții consultați în ambulator în clinicile mai sus menționate în perioada 2009-2011.

Criteriile de includere la lotul caz au fost prezența polipozei nazale, respectiv absența acestei patologii pentru lotul martor. Acest lot a fost apoi divizat în mai multe subgrupuri: polipoză nazală cu astm bronșic asociat, polipoză nazală fără astm bronșic asociat, polipoză nazală cu alergie asociată, polipoză nazală fără alergie asociată, polipoză nazală de novo și polipoză nazală recurentă.

Criteriile de excludere pentru lotul martor au fost prezența polipozei nazale, astmului bronșic, a disfuncției olfactive sau a alergiilor și factorii ce au făcut dificilă sau chiar imposibilă obținerea de date, precum furnizarea de informații eronate de către subiecți.

Menționez că fiecare pacient a fost informat și a semnat un acord scris, în conformitate cu normele etice actuale în ceea ce privesc implicațiile studiului, testarea genetică și utilizarea datelor obținute în cadrul studiului. Cercetarea fundamentală se bazează pe un studiu genetic efectuat în cadrul Laboratorului de Investigații Genetice nr. 2 al Departamentului de Științe Moleculare nr. 3, Catedra de Genetică Medicală a UMF „Iuliu Hațieganu” Cluj-Napoca.

Metodă

Polimorfismele genetice analizate au fost:

polimorfismul genei GSTM1 – alela nulă M1

polimorfismul genei GSTT1 – alela nulă T1

polimorfismul genei GSTP1 – Ile105Val (ID: rs 947894)

Analiza genetică moleculară a urmat 2 etape distincte, izolarea și purificarea ADN-ului, urmată de amplificarea ADN, digestia enzimatică a ampliconilor și electroforeza fragmentelor rezultate.

Izolarea și purificarea ADN-ului genomic

Pentru această etapă s-a utilizat un kit comercial, urmându-se etapele specifice protocolului producătorului Wizard Genomic DNA Purification Kit. (Promega, MA, USA). Precizec faptul că etapele de lucru au respectat normele de protecție a probelor, incintei de lucru și a personalului, pentru a evita orice risc de contaminare.

Pentru fiecare pacient s-au utilizat 3 ml de sânge venos periferic recoltat în vacutainere cu EDTA, urmat de extracția propriu-zisă a ADN-ului prin:

liza membranei celulare;

liza membranei nucleare;

tratarea amestecului cu ARN-ază în vederea neutralizării particulelor de ARN care pot interfera cu procesul de amplificare;

precipitarea proteinelor;

precipitarea moleculelor de ADN în izopropanol;

spălarea ADN-ului cu etanol 70%;

uscarea, respectiv, rehidratarea ADN-ului cu apă liberă de nuclează.

Cantitatea și puritatea ADN-ului obținut a fost dependentă de vechimea probei, cu cât probele de sânge au fost mai vechi, cu atât cantitatea de ADN extras a fost mai mică.

Tehnica PCR multiplex (Polymerase Chain Reaction)

Multiplex polymerase chain reaction (PCR multiplex) se referă la utilizarea PCR pentru a amplifica simultan mai multe ținte (gene) dintr-un ADN, ca și cum s-ar realiza mai multe reacții PCR separate într-o singură reacție. Acest proces amplifică mostrele de ADN cu primeri multipli și o ADN-polimerază mediată de temperatură într-un ciclu termic. Design-ul primerilor trebuie optimizat, astfel încât toți primerii să funcționeze la aceeași temperatură de “călire” (annealing) în timpul procesului PCR.

PCR multiplex cuprinde următoarele etape:

Amplificarea simultană a fragmentelor ADN de interes care includ mutația (deleția).

Reacția PCR implică aproximativ 30-35 de cicluri repetitive, la finalul cărora se vor obține aproximativ 1 miliard de copii de secvențe de interes. Acestea se obțin prin următorul proces:

Denaturarea termică a ADN-ului la temperatură ridicată de >90º C, ceea ce va duce la ruperea legăturilor de hidrogen dintre bazele complementare rezultând molecule de ADN mono-catenare.

Legarea (annealing) primerilor specifici (secvențe nucleotidice scurte, specifice marginilor de flancare a secvenței de interes care este amplificată). Pentru ca acești primeri să funcționeze, trebuie coborâtă temperatura la 50–65 °C timp de 20-40 de secunde, în funcție de design-ul primerilor.

Elongarea catenelor nou formate de către ADN-polimerază prin adăugarea nucleotidelor sintetice conform complementarității (1000 de baze/minut la temperatură optimă).

Elongarea finală cu formarea unor catene noi, copii fidele ale matriței ADN utilizate. Acest pas asigură elongarea completă a oricărei molecule de ADN rămasă mono-catenar la pasul anterior. Se realizează la temperaturi de 70–74 °C (temperatura optimă a majorității ADN-polimerazelor utilizate în PCR).

Separarea electroforetică a fragmentelor de ADN cu lungimi diferite.

Detecția fragmentelor de AND și intrepretarea genotipurilor particulare.

Fig.11 – Tehnica PCR (Polymerase Chain Reaction)

Pentru evitarea erorilor de genotipare și obținerea unei analize genetice cu o precizie cât mai bună, am respectat protocoalele de lucru utilizate la ora actuală în toate laboratoarele de investigații de genetică moleculară, cu evitarea contaminării probelor biologice și a probelor de ADN prin separarea circuitelor de extracție, purificare, amplificare și post-amplificare a ADN.

Tehnica PCR-RFLP (Restriction Lenght Polymorfism/Cleaved amplified polymorphic sequence)

Această tehnica cuprinde o etapă suplimentară față de tehnica PCR multiplex descrisă mai sus, în care, după etapa de amplificare PCR, ampliconii (fragmentele de ADN amplificate în urma procesului PCR) sunt “digerate” cu enzime de restricție specifice mutației căutate (endonucleaze bacteriene).

Genotiparea GSTM1 și GSTT1

Genotiparea alelelor GSTM1 și GSTT1 s-a realizat prin protocolul PCR multiplex. Amplificarea s-a realizat într-un volum total de reacție de 25 μl, carea a cuprins 12.5μl 2xPCR Master Mix (Thermo Fischer ScientificInc., MA, USA), 10 pmoli din fiecare primer (forward și reverse) și apă liberă de nuclează până la volmul total de 25 μl. Pentru identificarea alelelor nule GSTM1 și GSTT1 s-au folosit 3 perechi de primeri (Eurogentec, Belgium), iar astfel s-au obținut 3 fragmente diferite amplificate, unul de 215 bp (pentru GSTM1), altul de 480 bp (pentru GSTT1) și un fragment de 268 bp (pentru amplificarea fragment de control cuprinzând o genă de β Globină).

Condițiile de termociclare au cuprins denaturarea la 94°C timp de 5 minute, iar apoi 35 de cicluri repetitive de denaturare inițială la 94°C, timp de 1 minut fiecare. Etapa annealing a primerilor s-a realizat timp de 1 minut la 58°C, elongarea la 72°C timp de 1 minut, iar apoi s-a realizat o polimerizare finală timp de 10 minute la 72°C (Mastercycler Gradient®,Eppendorf, Germany). Produsele amplificate rezultate în urma reacției au fost analizate prin electroforeză în gel de agaroză 2% (MetaPhor® Agarose, Cambrex BioScience Inc.).

Absența produșilor specifici amplificați a demonstrat prezența genotipului nul. Acest protocol identifică cu ușurință genotipurile homozigote nule GSTT1 și GSTM1, dar nu poate diferenția stările de homozigot și heterozigot pozitiv pentru genele GSTT1 și GSTM1.

Fig. 12 – Genotiparea alelelor nule GSTM1 și GSTT1 (Multiplex PCR). Coloanele 1,2,6: Genotipurile GSTT1 pozitiv și GSTM1 nul; Coloanele 3,4: Genotipurile nule GSTT1 și GSTM1; Coloana 5: Genotipurile pozitive GSTT1 și GSTM1; Coloana 7: Genotipurile GSTT1 nul și GSTM1 pozitiv; Coloana L: marker ADN de 100 bp.

Genotiparea GSTP1 – polimorfismul Ile105Val (rs 947894)

Genotiparea polimorfismului GSTP1 – Ile105Val s-a realizat prin tehnica PCR-RFLP (Restriction Lenght Polymorfism/Cleaved amplified polymorphic sequence). ADN ul genomic (100 ng) a fost amplificat într-un volum total de 25µl care conținea 1,5mM MgCl, 20pmol din fiecare primer necesar amplificării specifice a unui fragment de 176pb care conține mutația (Eurogentec, Belgium), 200µM dNTP și 0,5 U Taq polimerază.

Condițiile de termociclare au cuprins denaturarea inițială la 940 C timo de 30 de secunde, urmată de 35 de cicluri de reacție la 940 C timp de 30 de secunde, etapa annealing la 550 C timp de 30 de secunde, elongarea primară la 720 C timp de 30 secunde și o elongare finală timp de 5 minute la 720 C. Ampliconul obținut a fost supus digestiei enzimatice utilizând enzima de restricție BsmAI, 3 U în 2 microlitri tampon BsmA1I, în 10 microlitri de soluție amplicon pentru digestie. Digestia s-a efectuat timp de 12 ore la 370 C.

Identificarea fragmentelor obținute în urma amplificării prin reacția PCR s-a făcut prin electroforeză orizontală în agaroză 3% (MetaPhor® Agarose, Cambrex Bio Science Inc.) în TBE 1x și prin colorarea cu bromură de etidiu a gelurilor, folosindu-se un marker ADN de 50 pb.

Ampliconul nedigerat de 176 pb corespunde genotipului homozigot normal (wild type). Digestia completă a probei evidențiază două fragmente de 91 și respectiv 85pb, corespunzător genotipului heterozigot. Prezența concomitentă a celor 3 fragmente de 176, 91 și 85pb, este caracteristică genotipului homozigot mutant Ile105Val.

Fig. 13 – Genotiparea GSTP1 – polimorfismul Ile105Val (PCR-RFLP)

Coloana M: marker ADN 50pb; Coloana 1, 7: genotip homozigot mutant GSTP1 – Ile105Val; Linia 2, 5: genotip homozigot Ile/Ile; linia 3, 6 genotip homozigot Val/Val.

Analiza statistică

Pentru evaluarea rezultatelor, datele obținute după genotipare au fost centralizate într-o bază de date de tip Microsoft Excel. Analiza statistică a acestor date a fost realizată cu ajutorul programului Epi Info 3.5.3 pentru sistemul de operare Windows și a pachetului Data Analysis din Microsoft Excel.

Intrucât variabilele analizate au fost de tip calitativ (nominale neordonate și dichotomiale), iar în tabelele de contingență obținute au existat valorile probabile sub 5, am utilizat Testul Fisher pentru a stabili existența legăturii între factorul de risc vizat (variantă mutantă) și prezența bolii (polipoza nazală) precum și cuantificarea acesteia.

Riscul este prezentat ca Odds ratio (rata șansei), pentru un interval de încredere de 95%. Odds ratio aproximează riscul relativ care arată de câte ori este mai frecventă boala la cei cu factorul de risc față de cei care nu prezintă factorul de risc. Riscul relativ nu se poate calcula în acest mod de culegere a datelor, astfel încât se utilizează rata șansei. Intervalul de încredere 95% pentru un parametru al unei populații reprezintă un interval pentru care aproximativ 95% din intervalele construite similar pe eșantioane extrase la întâmplare din populația de interes vor conține parametrul urmărit. Înainte de a începe studiul am considerat că o rată a șansei mai mare decât 1,2 crește semnificativ riscul, iar o rată a șansei sub 0,8 scade semnificativ riscul.

De asemenea, au fost considerate semnificative statistic rezultatele care au avut o valoare p < 0,05. Dacă p<0,05 se respinge ipoteza nulă (nonexistența legăturii) și se consideră ca fiind adevărată ipoteza alternativă (existența legăturii). Dacă p>0,05 nu se poate respinge ipoteza nulă. P este probabilitatea de a obține un rezultat ca cel găsit din cauza întâmplării în situația în care în realitate nu există legătură între parametrii urmăriți.

Rezultate

Tabel 2 – Frecvența genotipurilor nule GSTM1/GSTT1 și a polimorfismului Ile105Val GSTP1 la pacienții cu polipoză nazală, hiposmie și lotul de control. PN = polipoză nazală.

Tabel 3 – Evaluarea riscului pentru polimorfismul Ile105Val GSTP1, polipoză nazală și hiposmie.

Tabel 4 – Evaluarea riscului pentru genotipul dublu nul GSTM1/GSTT1 la pacienții cu polipoză nazală, hiposmie și control.

Fig. 14 – Proporția pacienților din subgrupurile lotului de studiu al polipozei nazale. PN = polipoză nazală.

Fig. 15 – Distribuția genelor GSTM1 și GSTT1, precum și a polimorfismelor urmărite în subgrupurile lotului de studiu și lotul de control.

Fig. 16 – Distribuția genotipurilor GSTP1 urmărite în subgrupurile lotului de studiu și lotul de control.

După cum se poate observa în figura 15, polimorfismul predominant între pacienții cu polipoză nazală este cel al genei GSTT1, dar același polimorfism se întâlnește preponderent și în lotul de control.

Figura 16 relevă varianta genică GSTP1 Ile/Val ca fiind dominantă în lotul de studiu, însă este majoritară și în lotul martor.

Analiza statistică pentru alelele nule GSTM1/GSTT1 nu a evidențiat diferențe semnificative între lotul de studiu și cel de control (GSTM1 χ2 = 2.017, p = 0.062, OR = 0.321 CI = 0.171 to 0.592, GSTT1 χ2 = 2.120 p = 0.192, OR = 0.641 CI = 0.332 to 1.261). De asemenea, analiza comparativă pentru polimorfismul Ile105Val GSTP1, nu a relevat diferențe statistic semnificative între pacienți și control (χ2 = 3.012, p = 0.087, OR = 1.514, CI = 0.491 to 1.572) (Tabel 2).

Analiza comparativă utilizand testul Fisher pentru varianta Ile105Val GSTP1 după modelul dominant (genotip homozigot și heterozigot vs. genotip homozigot) și modelul recesiv (genotip homozigot vs. genotip heterozigot și homozigot comun) nu a relevat diferențe statistice între grupul de studiu și control. (χ2= 0.028, OR= 0.784, CI= 0.512-1.651, p= 0.723; χ2= 0.032, OR=1.645, CI=1-2.876, p= 0.523) (Tabel 3).

Analiza statistică pentru alelele nule GSTM1/GSTT1 în subgrupurile polipoză nazală de novo/ polipoză nazală recurentă, polipoză nazală cu astm bronșic/ polipoză nazală fără astm bronșic; polipoză nazală cu alergie/ polipoză nazală fără alergie nu a relevant diferențe semnificative (GSTM1 OR=1.36, p = 0.554, CI=0.48-3.18, GSTT1 OR=0.84, p = 0.742, CI=0.30-2.31); (GSTM1, OR=0.680, p = 0.522, CI=0.215-2.182, GSTT1, OR=0.466, p = 0.157, CI=0.162-1.343); (GSTM1, OR=0.980, p = 0.970, CI=0.334-2.868; GSTT1, OR=0.342, p = 0.084, CI=0.101-1.155).

Aceleși rezultate statistic nesemnificative s-au obținut și pentru analiza variantei Ile105Val GSTP1 a subgrupurilor polipoză nazală de novo/ polipoză nazală recurentă, polipoză nazală cu astm bronșic/ polipoză nazală fără astm bronșic; polipoză nazală cu alergie/ polipoză nazală fără alergie (OR=0.480, p = 0.124, CI=0.18-1.22); (OR=1.466, p = 0.448, CI=0.544-3.943); (OR=0.738, p = 0.537,CI=0.282-1.932).

Analiza comparativă pentru genotipurile dublu-nule GSTM1/GSTT1, a evidențiat diferențe statistic semnificative între lotul de studiu și control (p=0.0015, OR=4.0351; CI=1.706-9.543). De asemenea analiza genotipurile dublu-nule GSTM1/GSTT1 a relevat diferențe semnificative între subgrupurile polipoză nazală cu alergie/ polipoză nazală fără alergie (p=0.027, OR=3.455, CI=1.147-10.406). Analiza statistică combinată pentru genotipurile dublu-nule GSTM1/GSTT1, nu a identificat diferențe statistice între subgrupurile polipoză nazală de novo/ polipoză nazală recurentă și respectiv polipoză nazală cu astm bronșic/ polipoză nazală fără astm bronșic (p= 0.635, OR=0.778, CI=0.277-2.190; p=0.406, OR=0.631, CI=0.213-1.867). (Tabel 4)

Discuții

Glutation-S-transferazele (GST) fac parte din principalul sistem enzimatic antioxidant, care protejează țesuturile de acțiunea nocivă a speciilor reactive de oxigen. Sunt un grup major de enzime detoxifiante, prin conjugarea xenobioticelor la glutation. Implicarea lor în etiopatogenia polipozei nazale și a hiposmiei din cadrul acesteia rămâne însă o temă deschisă la dezbatere.54 62

Deși multiple studii au demonstrat faptul că polipoza nazală asociază hipovascularizație, iar în consecință niveluri scăzute de antioxidanți local, precum și studii care demonstreaza rolul oxidanților în etiopatogenia polipilor nazali, până în momentul de față nu există date concrete care să demonstreze că genele, respectiv enzimele din grupul GST sunt implicate în etiopatogenia polipozei nazale și a hiposmiei asociate.54 59

Potrivit rezultatelor studiului de față, nu există diferențe semnificative între pacienții cu polipoză nazală cu hiposmie și subiecții de control în aspecte ce privesc distribuția genotipurilor nule GSTM1 sau GSTT1 și a polimorfismului Ile105Val GSTP1. Rezultatele obținute sunt în concordanță cu datele furnizate de alte studii care au avut ca și subiect aceleași variante genice.50 59 60

Chiar dacă prezența alelelor nule GSTM1 sau GSTT1 la pacienții hiposmici cu polipoză nazală față de grupul de control nu a relevat diferențe statistic semnificative, a fost evidențiată o frecvență mai mare a genotipurilor nule GSTM1 în cadrul patologiei urmărite.

Similar polimorfismelor GSTM1 și GSTT1, doar un număr restrâns de studii au evaluat relația dintre polimorfismul Ile105Val GSTP1 din polipoză nazală și hiposmie. Rezultatele de față nu evidențiază nici o corelație între această variantă genică, polipoza nazală și hiposmie, date concordante literatură.58

Analiza comparativă pentru alelele nule GSTM1/GSTT1 și varianta Ile105Val GSTP1 la subgrupurile cu polipoză nazală “de novo”/polipoză recurentă, nu a relevant diferențe semnificative.

Distribuția alelelor nule GSTT1/GSTM1 și a polimorfismului Ile105Val GSTP1 la pacienții cu polipoză nazală și astm bronșic față de grupul de control, precum și evaluarea frecvenței acestor polimorfisme la subgrupurile de pacienți cu polipoză nazală și alergie/polipoză nazală fără alergie nu au fost semnificative statistic.

Rezultate semnificativ statistice au fost relevate însă în cazul genotipului dublu-nul GSTM1/GSTT1, acești pacienți având un risc mai mare de a dezvolta polipoză nazală și hiposmie față de grupul de control. Acest genotip combinat pare să fie mai frecvent întâlnit la pacienții cu polipoză nazală și alergie în comparație cu grupul pacienților cu polipoză nazală, dar fără alergie, astfel că genotipul dublu-nul GSTM1/GSTT1 poate fi considerat un factor de risc în dezvoltarea polipozei nazale și hiposmiei la pacienții alergici.

Polipoza nazală este o afecțiune complexă, multifactorială, a cărei etiopatogenie pare să fie influențată de factori genetici și de mediu, însă nici un polimorfism genic izolat nu a fost dovedit ca fiind implicat în etiopatogenia polipozei nazale, fiind așadar necesare mai mute studii în acest sens pentru a identifica gene cheie implicate în etiopatogenia polipozei nazale și a hiposmiei

Concluzii

Rezultatele studiului evidențiază faptul că între frecvența genotipurilor nule GSTM1 sau GSTT1 la pacienții hiposmici cu polipoză nazală și grupul de control nu există diferențe semnificative statistic, deși există o frecvență mai mare a polimorfismelor nule GSTM1 la pacienți cu polipoză nazală în comparație cu grupul de control. Nu există diferențe semnificative statistic nici în ceea ce privește distribuția polimorfismului Ile105Val GSTP1 între pacienți și grupul de control.

Genotipul dublu-nul GSTM1/GSTT1 a fost mai frecvent întâlnit în rândul pacienților comparativ cu grupul de control și mai frecvent în rândul pacienților cu alergii comparativ cu cei non-alergici.

Statusul de purtător al polimorfismului GSTM1 sau GSTT1 nul sau Ile105Val GSTP1 pozitiv nu sunt factori de risc pentru dezvoltarea polipozei nazale și a hiposmiei asociate acestei patologii.

Purtătorii genotipurilor dublu-nule GSTM1/GSTT1 au un risc mai mare de a dezvolta polipoză nazală și hiposmie în comparație cu grupul de control, acest risc fiind mai evident în cazul pacienților cu alergii asociate.

Bibliografie