Implicarea Fragmentarii Adn Ului din Spermatozoizi In Infertilitatea Masculin

Medicina

Implicarea Fragmentarii Adn Ului din Spermatozoizi In Infertilitatea Masculin

Byadmin ianuarie 1, 2024

CUPRINS

Introducere

Stadiul actual al cunoasterii

Fiziologia spermatogenezei umane

Cursa temporala a spermatogenezei

Spermatocitogeneza

Spermiogeneza

Transportul spermatozoizilor

Controlul neuronedocrin al spermatogenezei

Patologia spermatogenezei umane

Deficienta testiculara

Cauze genetice

Anomalii cromozomiale

Defecte genetice

Azoospermia obstructive

Varicocel

Hipogonadism

Criptorhidism

Cromatina de la nivelul spermatozoizilor

Condensarea ADN in nuclei spermatozoizilor

Cauza anomaliilor de la nivelul cromatinei spermatozoizilor

Condensarea defectuoasa a cromatinei

Apoptoza la nivelul spermatozoizilor

Stresul oxidative

Deficiente in procesul de recombinare

Incidenta fragmentatiilor ADN din spermatozoizi in populatia umana

Metode de determinare a fragmentatiilor de ADN din spermatozoizi

Materiale si metode

Materialul biologic

Analiza spermei , prepararea spermei

Testul de dispersie a cromatinei , Testul SCD

Metoda de lucru

Rezultate si discutii

Concluzii

Bibliografie

INTRODUCERE

Infertilitatea este una din cele mai serioase probleme sociale cu care se confrunta tarile avansate. Organizatia Mondiala a Sanatatii defineste infertilitatea ca: “… incapacitatea de a concepe un copil. Un cuplu poate fi considerat infertil daca, dupa doi ani de raporturi sexuale regulate si neprotejate, nu obtine o sarcina (neexistand un alt motiv, cum ar fi alaptarea sau amenoreea postpartum).” (WHO/infertility Who.int. 20013-03-19, Retrieved 2013-06-17).

In ceea ce priveste prevalenta, unele estimari sugereaza ca la nivel mondial, aceasta variaza intre 12% si 28% (Himmel W si col., 1997). In general aproximativ 30% (40%) din cazurile de infertilitate recunosc factori legati de partenerul masculin, 30% (40%) partenerul de sex feminin, in 10% cauzele intereseaza ambii parteneri si in 25% (20%) nu poate fi identificata o cauza specifica.

Figura 1.

http://en.wikipedia.org/wiki/Infertility

Consecintele infertilitatii sunt multiple, incluzand repercusiuni sociale, suferinte personale cu impact psihologic profund, stresul emotional si deficientele maritale sunt problemele cu care se confrunta cuplurile afectate de infertilitate.

Infertilitatea masculina este de obicei diagnosticata printr-o analiza a spermei. Spermograma este investigatia standard pentru evaluarea partenerului masculin si trebuie sa estimeze atat caracteristicile lichidului seminal, concentratia si mobilitatea spermatozoizilor, cat si aspecte legate de morfologia acestora. Acesta este cel mai frecvent tip de testare a infertilitatii, iar examenul spermei este cel mai adesea etichetat dupa cum urmeaza:

oligospermie / oligozoospermie – scaderea numarului de spermatozoizi ( <15 mil. / mL );

aspermie – lipsa completa a spermei;

hipospermie – volum seminal redus (< 1,5 mL);

azospermie / azoospermie – lipsa spermatozoizilor in sperma;

teratospermie / teratozoospermie – scaderea numarului spermatozoizilor cu morfologie normala ( < 4 % );

astenospermie / astenozoospermie – mobilitatea redusa a spermatozoizilor (< 32%); (WHO. Infertility, 2010)

Calitatea spermei este o masura a capacitatii de fertilizare a ovocitelor. Altfel spus, aceasta este o masura a fertilitatii unui individ. Prin urmare, calitatea spermei implica atat cantitatea cat si calitatea spermei. Scaderea calitatii spermei este un factor major de infertilitate masculina. O serie de factori pot influenta acuratetea rezultatelor, iar existenta de mari variatii pentru acelasi individ impun ca diagnosticul de infertilitate / subfertilitate sa fie confirmat de cel putin doua analize (Essig Maria G, 2007).

De cele mai multe ori spermograma sta la baza diagnosticului de infertilitate masculina, dar pot fi necesare teste suplimentare ce pot include:

examen fizic general realizat de urolog, androlog;

analiza mai complexa a spermei:

teste genetice;

testarea nivelului fragmentar al ADN spermatozoidal;

evaluarea viabilitatii;

teste imunologice;

analize de sange pentru:

dozari hormonale (FSH, LH, testosteron, prolactina);

cariotip si microdeletiile bratului lung cromozom Y;

testarea urinii postejaculare pentru ejacularea retrograda; (WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen, Fifth edition )

In lucrare vor fi abordate aspecte ale fiziologiei si patologiei spermatogenezei umane, strctura cromatinei spermatozoidului uman, etiologia si mecanismele afectarii structurii ADN spermatozoidal, rolul integritatii ADN, in infertilitatea umana, metoda si tehnica abordata in determinarea fragmentatiilor ADN de la nivelul spermatozoizilor, ca mod de evaluare a integritatii materialului genetic si importanta in practica clinica.

Stadiul actual al cunoasterii

Fiziologia spermatogenezei umane

Spermatogeneza este initiata la nivelul testiculului, odata cu pubertatea, reprezentand evolutia spermatogoniilor ( celule germinale primordiale) pana la stadiul de spermatozoid matur. (Prof. Marco R. Celio, Embryology.ch Universities of Fribourg , Lausanne and Bern ( Switzerland) with the support of the Swiss Virtual Campus)

Figura 2. Sectiune prin tub seminifer:

Membrana Bazala; 2. Miofibroblast; 3.Fibrocite; 4.Celule Sertoli; 5. Spermatogonie; (Prof. Marco R. Celio, Embryology.ch Universities of Fribourg , Lausanne and Bern ( Switzerland) with the support of the Swiss Virtual Campus)

In cursul spermatogenezei celulele germinale primordiale migreaza din compartimentul luminal al tubilor seminiferi, trecand prin urmatoarele stadii de dezvoltare:

• A-spermatogonie;

• B-spermatogonie;

• Spermatocit primar(spermatocit de ordinal I);

• Spermatocit secundar(spermatocit de ordinal II);

• Spermatida;

• Spermatozoid; (WHO. Infertility, 2010)

Spermatogeneza se subdivide in doua faze:

spermatocitogeneza – cuprinde evolutia spermatogoniei pana la stadiul de spermatocit secundar

spermiogeneza (spermiohistogeneza) – cuprinde diferentierea, maturarea celulei spermatice, incepand cu stadiul de spermatida. (Dale B, 1996; Hess R A, 1999, Kay Elder & Dale B, 2000).

Cursa temporala a spermatogenezei

Spermatogeneza dureaza 64 de zile si poate fi subdivizata in patru faze diferite ca lungime in timp. (Tabel 1, Fig. 3), (WHO. Infertility, 2010):

Tabel. 1 Cursa temporala a spermatogenezei

(WHO. Infertility, 2010):

Figura. 3 Spermatogeneza

(Prof. Marco R. Celio, Embryology.ch Universities of Fribourg , Lausanne and Bern ( Switzerland) with the support of the Swiss Virtual Campus)

Spermatocitogeneza

Celula stem, spermatogonia, localizata in compartimentul intratubular, la baza epiteliului tubilor seminiferi, va intra intr-un numar fix de diviziuni mitotice rezultand clone de celule fiice, ultima runda de diviziune mitotica dand nastere spermatocitului primar, care se va deplasa catre compartimentul luminal al tubilor seminiferi. Spermatocitul primar intra in diviziunea meiotica. Dupa doua diviziuni meiotice se va forma spermatocitul secundar si apoi spermatida ce va contine un numar haploid de cromozomi.

Spermatogonia, asemeni tuturor celulelor din organism, este o celula cu numar diploid de cromozomi ( 46 cromozomi, 23 de origine maternal, 23 de origine paterna). In timpul diviziunilor mitotice, numarul de cromozomi se dubleaza, astfel ca ,in urma diviziunii, fiecare celula rezultata primeste o copie a celor 46 de cromozomi prezenti initial in celula parentala.

Deci, spermatocitul primar, ca rezultat al diviziunilor mitotice ale spermatogoniei, are un numar identic de cromozomi cu aceasta.Spermatocitul primar intra in doua diviziuni meiotice succesive. In timpul acestor diviziuni meiotice are loc crossing over, process de recombinare a informatiei genetice cu obtinerea de noi combinatii de gene, si reducerea numarului de cromozomi la jumatate (spermatida), (Kay Elder & Dale B, 2000).

Spermiogeneza

Aproape de lumenul tubilor seminiferi, spermatidele intra intr-un proces de diferentiere, avand ca rezultat formarea spermatozoidului. (Figura 4. si Figura 5. ) ( Prof. Marco R. Celio, Embryology.ch Universities of Fribourg , Lausanne and Bern ( Switzerland) with the support of the Swiss Virtual Campus)

Condensare nucleara – ADN spermatidei se condenseaza (pentru a ocupa un spatiu mult mai mic),prin inlocuirea histonelor cu protamine;

Formarea acrozomului – care va contine enzime lizozomale ( hialuronidaza ) cu rol in penetrarea zonei pellucida de la nivelul ovocitului.

Formarea flagelului – structura care se formeaza distal de centrioli si opus acrozomului, axonema, va contine 9 perechi de microtubule asezati periferic si doi microtubuli, nepereche, situati central;

Reductie citoplasmatica – excesul de citoplasma este fagocitat de catre celulele Sertoli sau eliberat in lumenul tubilor seminiferi;

Flagelul va contine patru segmente:

Gatul – ce va contine doi centrioli ( proximal si distal );

Piesa intermediara – ce contine mitocondria, dispusa in spirala in jurul axonemei, cu rol in furnizarea energiei necesare deplasarii spermatozoidului;

Coada – formata din microtubulii (9+2) axonemei;

Figura. 4 Spermiogeneza 1. Primordium flagelar; 2. Complexul Golgi; 3. Vezicula acrozomala; 4. Centrioli (distal si proximal); 5. Mitocondrie; 6. Nucleu; ( Prof. Marco R. Celio, Embryology.ch Universities of Fribourg , Lausanne and Bern ( Switzerland) with the support of the Swiss Virtual Campus)

Figura. 5 Spermatozoid matur 1.Membrana plasmática; 2.Membrana acrozomala externa; 3.Acrosom; 4.Membrana acrosomala interna; 5.Nucleu; 6.Centriol proximal; 7.Centriol distal; 8.Microtubuli(sectiune longitudinala); 9.Mitocondrie; 10.Axonema; 11.Anulus; 12.Cap; A.Cap; B.Gat; C. Piesa intermediara; D. Piesa principala; E. Piesa terminala; ( Prof. Marco R. Celio, Embryology.ch Universities of Fribourg , Lausanne and Bern ( Switzerland) with the support of the Swiss Virtual Campus)

Celula Sertoli

Celulele Sertoli localizate in tubii seminiferi intre membrana bazala si lumenul acestora, au are rol in: formarea barierei intre circulatia sanguina si testicul (spermatozoizii sunt structuri imunogenice); nutritia celulelor germinative; productia fluidului din lumenul tubilor seminiferi bogat in proteine, enziyme, substante nutritive, androgeni, ioni cum ar fi potasiu si bicarbonati; indepartarea celulelor germinale anormale; sinteza de proteina de legare pentru androgeni ( androgen binding protein ABP) care leaga testosteronul in scopul transportului acestuia la nivelul tubilor; sinteza de inhibin care transportat la nivelul hipofizei inhiba secretia de FSH (follicle-stimulating hormone), ambele proteine importante in spermatogeneza (Melissa J. Oatley, et al. Sertoli Cells Dictate Spermatogonial Stem Cell Niches in the Mouse Testis, 2010).

Celula interstitiala Leydig

Celulele Leydig situate intre tubii seminiferi, sunt celule endocrine care produc testosteron, hormon sexual masculin, pe care il elibereaza in circulatia sanguina si in tesuturile vecine. Initial aceste celule sunt active in perioada embrionara de dezvoltate a testiculului si in perioada pupertara, cand isi reiau activitatea sub influenta LH (luteinizing hormone) secretat de hipofiza anterioara. Testosteronul impreuna cu hormonii secretati de cortexul suprarenal vor initia pubertatea si maturarea celulelor spermatice (Kenneth I, Aston et al., The spermgenome 2010).

Transportul spermatozoizilor

Tubii seminiferi se unesc la nivelul extrmitatii cefalice a testiculului intr-o retea de ducte, numita rete testis, care se continua cu epididimul. Epididimul, situat pe fata posterioara a testiculului are in structura peretelui fibre musculare netede ce asigura peristaltica acestuia necesara transpotului celulelor spermatice catre urmatoarea structura, vasul deferent.

Spermatozoizii ce parasesc testiculul nu au capacitatea de fertilizare, ei castiga aceasta abilitate dupa pasajul prin epididim, process numit maturare epididimala. In portiunea caudala a epididimului, spermatozoizii pot fi stocati pentru mai multe luni in absenta ejacularii.

Vasul deferent, component al cor testiculului si in perioada pupertara, cand isi reiau activitatea sub influenta LH (luteinizing hormone) secretat de hipofiza anterioara. Testosteronul impreuna cu hormonii secretati de cortexul suprarenal vor initia pubertatea si maturarea celulelor spermatice (Kenneth I, Aston et al., The spermgenome 2010).

Transportul spermatozoizilor

Tubii seminiferi se unesc la nivelul extrmitatii cefalice a testiculului intr-o retea de ducte, numita rete testis, care se continua cu epididimul. Epididimul, situat pe fata posterioara a testiculului are in structura peretelui fibre musculare netede ce asigura peristaltica acestuia necesara transpotului celulelor spermatice catre urmatoarea structura, vasul deferent.

Spermatozoizii ce parasesc testiculul nu au capacitatea de fertilizare, ei castiga aceasta abilitate dupa pasajul prin epididim, process numit maturare epididimala. In portiunea caudala a epididimului, spermatozoizii pot fi stocati pentru mai multe luni in absenta ejacularii.

Vasul deferent, component al cordonului spermatic, de la nivelul scrotului intra in cavitatea abdominala si dupa un traiect posterior vezicii urinare, se continua cu ductele ejaculatorii, acestea se unesc cu ductele secretorii ale veziculelor seminale si traverseaza prostata, glanda situata la baza vezicii urinare, ce inglobeaza uretra. Vasul deferent are in structura fibre musculare netede si inervatie simpática (Charles Thilbault, et al.The Biology of spermatozoa, et al. 2010).

Controlul neuroendocrin al spermatogenezei

Spermatogeneza este sub controlul axului hipotalamo-hipofizar. Hipotalamusul secreta factori de eliberare a gonadotrofinelor, gonadotropin-releasing hormone, GnRH, care sunt transportati la hipofiza anterioara pe calea sistemului port hipotalamo-hipofizar, stimuland eliberarea de catre hipofiza a gonadotrofinelor. Astfel, LH (luteinizing hormone), secretat de hipofiza anterioara este transportat pe cale sanguina la nivelul testiculului, unde stimuleaza celulele Leydig sa sintetizeze testosteron (din precursori, cholesterol). Testosteronul stimuleaza a doua diviziune meiotica cu formarea spermatidelor in tubii seminiferi. FSH (follicle-stimulating hormone), secretat de hipofiza anterioara, transportat pe cale sanguina, la testicul, se leaga de receptori specifici de la nivelul celulelor Sertoli, realizand conversia spermatogoniilor in spermatocite.

De asemeni, la nivelul celulei Sertoli, testosteronul stimuleaza sinteza de proteine si fluide si in schimb celula Sertoli secreta proteine de legare a androgenilor (ABP androgen- binding protein), care leaga testosteronul si il mentine in concentratii inalte in tubii seminiferi. Inhibina, hormon secretat de catre testicul, este un important inhibitor pentru FSH hipofizar (feedback negativ. (Rhoades R, Pflanzer R, 2003, Human physiology , fourth edition, Thomson Learning Inc.)

In ceea ce priveste rata de progresie a celulelor catre spermatogeneza este constanta si neinfluentata de factori externi cum ar fi hormonii ( la specia umana spermatogeneza este completa in 64 de zile). Un punct important il reprezinta programarea translatiei ARNm stocat, de exemplu. gena protamin 1 este transcrisa in spermatidele rotunde, iar ARNm este stocat pana la o saptamana inainte de a fi transcris in spermatidele elongate, indicand un control al translatiei dupa un program temporal bine definit (Rhoades R, Pflanzer R, 2003, Human physiology , fourth edition, Thomson Learning Inc.)

Patologia spermatogenezei umane

In infertilitatea masculina calitatea spermei este considerata masura surogat pentru aprecierea fertilitatii masculine. Organizatia Mondiala a Sanatatii defineste infertilitatea – inabilitatea unui cuplu, activ sexual si care nu foloseste metode de contraceptie, de a obtine o sarcina in mod spontan, in decurs de doi ani.

Cauzele care pot sa afecteze numarul spermatozoizilor, mobilitatea acestora sau capacitatea de fertilizare a ovocitelor sunt multiple si conform ghidurilor elaborate de Asociatia Europeana de Urologie 2012, sunt: Deficienta testiculara, cauzele genetice, azoospermia obstructiva, varicocelul, hipogonadismul si criptohidismul . (WHO. Infertility, 2012)

Deficienta testiculara – insuficienta spermatogenezei

Cauze congenitale:

Anorhia;

Disgenezia testiculara

Anomalii genetice – anomalii ale cariotipuiui incluzand sindromul Klinefelter , microdeletiile cromozomului Y si alte mutatii genetice;

Cauze dobandite:

Traumatisme;

Infectii – orhite ;

Factori exogeni – medicamente , iradiere , caldura locala

Boli sistematice;

Varicocel;

Interventii chirurgicale care pot afecta circulatia sanguina la nivelul testiculului;

Cauze idiopatice;

Cauze genetice

La pacientii cu < 10 mil. / mL spermatozoizi, incidenta anomaliilor cromozomiale este de 10 ori mai mare fata de populatia generala, reprezentate in principal de anomalii structurale ale autozomilor.

Anomalii cromozomiale – numerice sau structurale

Anomalii ale cromozomilor sexuali ( Sindromul Klinefelter si variante 47, XXY, 47, XY/47, XXY mozaicism);

Anomalii ale cromatinei spermatozoizilor;

Anomalii ale autozomilor;

Translocatiile Robertsoniene;

Translocatii reciproce;

Inversiuni paracentrice;

Defecte genetice

Defecte genetice X-linked;

Sindromul Kallmann;

Sindromul de rezistenta la testosteron;

Defecte genetice Y-Linked:

Microdeletii bratului lung ale cromozomului Y(Yq), regiunile AZF-a, AZF-b, AZF-c;

Defecte genetice ale cromozomilor autosomali cu anomalii fenotipice severe si infertilitate

Sindromul Prader-Willi;

Sindromul Bardet-Biedle;

Ataxia cerebeloasa si hipogonadism hipogonadotrop ( boala recesiv autosomala;

Sindromul Noonan (boala autosomal dominanta );

Distrofie miotonica ( boala autosomal dominanta, 19q13.3);

Rinichiul polichistic (boala autosomal dominanta);

Deficienta 5- reductaza ( boala autosomal recesiva);

Fibroza chistica ( mutatia genei CFTR – cystic fibrosis transmembraneconductance regulator gene , se asociaza cu absenta bilaterala de base deferente);

Absenta / anomalía unilaterala / bilaterala de vas deferent asociata cu malformatii renale;

Fragmentatiile ADN de la nivelul spermatozoizilor;

Azoospermia obstructiva

Obstructia poate fi la nivelul:

Intratesticular;

Epididimului;

Vasului deferent;

Ductelor ejaculatorii;

Cauze:

Congenitale;

Dobandite;

Post-infectioase;

Post-chirurgicale;

Varicocelul

Hipogonadismul

Se caracterizeaza prin insuficiente testiculara ce afecteaza spermatogeneza si sinteza de testosteron poate fi:

Primara – hipogonadism-hipergonadotrofic cauzat de insuficiente testiculara prin:

Maldescenta testiculara;

Sindromul Klinefelter;

Microdeletiile cromozomului Y;

Anomalii cromozomiale structurale sau numerice;

Traumatisme

Torsiuni testiculare;

Orhite;

Cauze iatrogene ( interventii chirurgicale, medicamente, iradiere, medicatie citotoxica);

Factori exogeni ( substante toxice, caldura locala, stres ocupational);

Boli sistematice (ciroza hepática, insuficiente renala);

Tumori testiculare;

Varicocel;

Cauze idiopatice;

Secundara – hipogonadism-hipogonadotrofic cauzat de insuficienta GnRH(gonadotrophin-releasing h.) si/sau FSH,LH(gonadotrofine):

congenitale :

hipogonadism-hipogonadotrofic idiopatic;

Sindromul Kallman;

Dobandite:

tumori la nivelul diencefalului (craniofaringiom, meningiom), la nivelul hipotalamusului sau hipofizei);

Fracturi de baza de craniu;

Leziuni ischemice / hemoragice hipotalamice;

Hiperprolactinemii;

Medicamente / steroizi;

Radioterapie;

Rezistenta la androgeni;

Testicul feminizat;

Criptorhidism

Cromatina de la nivelul spermatozoizilor, stabilitate si susceptibilitatea de a se modifica

Spermograma, analiza de rutina in evaluarea infertilitatii masculine, nu poate pune in evidenta defectele subtile, cum ar fi afectatea integritatii ADN de la nivelul spermatozoizilor.

Interesul pentru integritatea genomului gametului masculin s-a intensificat plecand de la ingrijorarea legata de transmiterea modificarilor ADN, ca urmare a utilizarii tehnicilor de reproducere umana asistata, in special a procedurii de injectie intracitoplasmatica a spermatozoidului (ICSI) si cea legata de posibilitatea ca amploarea modificarilor ADN sa depaseasca posibilitatile de reparare a ovocitului (Meistrich et. al.,2003)

Cromatina reprezinta o structura ce rezulta in urma interactiunii dintre ADN si proteinele cromozomale, acestea mentinand structura cromozomului, protejand ADN de actiunea dezoxiribonucleazelor si asigurand reglarea activitatii genice.

In cursul spermiogenezei, cromatina sufera un proces de condensare in care histonele sunt inlocuite cu protamine (Meistrich et. al.,2003), proces necesar protectiei ADN in timpul tranzitiei prin tractul genital masculin si feminin in procesul de fertilizare.

Histonele sunt alcatuite dintr-o singura catena polipeptidica, in care proteinele au caracter bazic, datorita aminoacizilor (25%) purtatori de sarcini pozitive (arginina, lizina, histidina) si explica legarea de ADN prin punti ionice intre gruparile fosfat, incarcate negative, ale ADN si gruparile amino ( NH2), incarcate pozitiv, ale aminoacizilor bazici din catena polipeptidica a histonelor. Aceste legaturi se realizeaza la nivelul santurilor majore ale dublului helix ADN. Componenta bazica a histonelor protejeaza ADN de denaturarea termica (Meistrich et. al.,2003)

Histonele sufera modificari chimice cum sunt: metilarea, acetilarea si fosforilarea diferitilor aminoacizi, ce duc la schimbarea sarcinii moleculelor histonice in corelatie cu activitatea genelor, cu replicarea ADN, cu diferentierea celulara.

In afara de rolul structural, histonele indeplinesc si rol de represie in reglajul genetic. Asocierea histonelor cu ADN, confera starea de condensate a cromatinei, deci impiedica transcrierea ADN (Meistrich et. al.,2003).

Protaminele, sunt proteine inalt bazice, contin cisteina, sintetizate in citoplasma spermatidelor, care se deplaseaza in nucleu pentru a inlocui histonele (Meistrich et. al.,2003).

Condensarea ADN in nucleii spermatozoizilor

Inlocuirea histonelor cu protamine implica impachetarea ADN-ului, astfel ca in spermatozoid ADN este de 6 ori mai condensat decat in cromozomii metafazici (Ward, 1993; Ward et al.,1989). In spermatogeneza initial sunt inlocuite histonele bogate in lizina cu histonele bogate in arginina (proteine de tranzitie), iar acestea sunt inlocuite cu protamine.

Nivelul de organizare al ADN in nucleul spermatozoizilor cuprinde: dublul helix ADN, complexul ADN-protamine sub forma toroidala si domeniile buclate. Toroidul, unitatea fundamentala de impachetare a ADN legat de protamine, are un diametru de 90 nm, continand 50-60 Kb (Ward et al., 2000), structura ce difera de structura cromatinei din nucleii celulelor somatice (Hud si col. 1993; Schimd et al.,2001, Solongo and Ward, 2000). Toroizii sunt legati intre ei prin punti disulfidice formate prin oxidarea gruparilor sulfidril ale cisteinei prezente in protamine. Spermatidele și spermatozoizii nu îsi replică ADN, după cum nici nu il transcriu, nefiind necesar ca ADN să fie suprarăsucit. Presiunea de stivuire a proteinelor și forțele Van der Waals condensează genomul spermatocitelor într-o stare de împachetare care-l protejează în vederea transportului pentru fecundare ( Fig. 6) .

Figura. 6 Modelul Donut-Loop pentru structura cromatinei spermatozoizilor (www.biolreprod.org)

Cauza anomaliilor de la nivelul cromainei spermatozoizilor

Mecanismul prin care apar anomalii ale cromatinei/ anomalii ale ADN in spermatozoizii umani nu sunt perfect intelese. Au fost propuse trei teorii: Condensararea defectuoasa a cromatinei, apoptoza la nivelul spermatozoizilor, stresul oxidativ; (McPherson, Longo et.al., 1993)

Condensarea (impachetarea) defectuoasa a cromatinei

Histonele suprarasucesc ADN mult mai mult decat protaminele, astfel ca pentru inlocuirea histonelor cu protamine aceasta suprarasucire trebuie indepartata prin realizarea unor brese in ADN cu ajutorul nucleazelor. Topoizomerazele au fost implicate (McPherson, Longo et. al., 1993) in controlul realizarii acestor brese, relaxarea ADN si refacerea legaturilor la nivelul ADN (McPherson, Longo et.al., 1993). Numarul breselor in ADN este maxim in timpul tranzitiei de la spermatidele rotunde la spermatidele elongate (Marcon si Boissonneault, 2004) si aproape absenta cand condensarea (impachetarea) este completa. S-a pus in evidenta corelatia pozitiva intre topoizomeraze si bresele in ADN; topoizomerazele au fost identificate la nivelul spermatogoniilor, spermatocitelor, spermatidelor rotunde si spermatidelor elongate (Chen, Longo et.al.,1996).

Este absolut necesara refacerea legaturilor la nivelul ADN. Daca bresele create nu sunt reparate datorita, spre exemplu, unei activitati in exces a topoizomerazei sau a unui déficit al inhibitorilor acesteia, pot aparea fragmentatii ale ADN spermatozoizilor din ejaculat.

Apoptoza la nivelul spermatozoizilor

Pana nu demult, s-a considerat ca inabilitatea spermatozoizilor de a sintetiza proteine noi, face imposibil ca aceste celule sa raspunda la semnalele cascadei mortii celulare programate. Observatiile recente pun in discutie posibilitatea ca esecul programului de apoptoza la nivelul spermatozoizilor sa contribuie la mentinerea defectelor ADN (Agarwal A. si Said TM, 2003). In favoarea acestei teorii vin urmatoarele observatii:

Detectarea proteinei Fas la nivelul spermatozoizilor din ejaculat;

Proportie mare de spermatozoizi cu mitocondrie, cu potential apoptotic;

La nivelul spermatozoizilor s-au pus in evidente mediatori apoptotici: Bcl-xl (Caly et. al., 2004; Sakkas et. al., 2002), caspase-3, -8 si -9, Fas receptori (Paasch et. al., 2003; Sakkas et. al., 1999b, 2002; Wang et. al., 2003; Weng et. al., 2002).

Stresul oxidativ

Speciile reactive de oxigen (SRO) in cantitati limítate, joaca un rol fiziologic important, moduland activitatea genelor si proteinelor in proliferarea, diferentierea si functia spermatozoizilor (prin stimularea fosforilarii tirozinei [Visconti si col.,1995] cu cresterea consecutive a cAMP [Aitken si col.,1995b; de Lamirande si Gagnon, 1993, 1995; Leclerc si col.,1998]). Sunt metaboliti derivati din reducerea oxigenului ( anioni superoxide [ O2-], radicali hidroxil [OH] etc.), cu abilitate de a reactiona si modifica structura diferitelor biomolecule incluzand proteine, lipide si acizi nucleici.

Antioxidantii din lichidul seminal controleaza cantitatea de SRO. Efectul patologic al SRO apare cand acestia se produc in exces si depasesc posibilitatile antioxidante ale plasmei seminale, spermatozoizii fiind sensibili la efectele speciilor de oxigen. Sursele speciilor reactive de oxigen sunt reprezentate de spermatozoizi anormali morphologic, mai ales cei cu citoplasma reziduala si leucocitele ( Aitken RJ, Buckingham D. West K, 1992). Volumul citoplasmatic redus asociat spermatozoizilor maturi, asigura o cantitate suficienta de NADPH (Nicotinamid adenin dinucleotid fosfat) necesar ciclului glutation-reductaza-peroxidaza, excesul citosolic presupunand exces de NADPH si respectiv de SRO (Aitken si col.,2004a; Gomez si col.,1996). Nivelul crescut de specii de oxigen in plasma seminala determina peroxidarea acizilor grasi nesaturati la nivelul membranei plasmatice cu influenta negativa asupra: mobilitatii spermatozoizilor, fuziunii spermatozoid-ovocit, abilitatii in reactia acrozomala (Aitken et. al. 1993 a,b, Jones et. al. 1979).

Stresul oxidativ afecteaza integritatea ADN nuclear si mitocondrial al spermatozoizilor determinand scaderea ratei de fertilizare, dezvoltare embrionara anormala si avorturi ( Lewis si Aitken, 2005).

Figura. 7 Stresul oxidativ ( www.scielo.br)

Alte cauze ce pot avea rol in fragmentarea ADN spermatozoidal:

Deficiente in procesul de recombinare

Crossing-over meiotic;

Presupune desfacerea catenelor dublului helix cu ajutorul nucleazelor specific apartinand familiei SPO11 (Bannister LA, Schimenti JC, 2004). Dublul helix trebuie refacut pana la sfarsitul meiozei I. Daca exista deficienta a punctelor de control din profaza meiozei I, cand are loc repararea ADN , fragmentarile ADN vor persista (Bannister LA, Schimenti JC, 2004; Page AW, Orr-Weaver TL, 1997).

Varsta avansata (Singh NP, Muller CH, Berger RE, 2003);

Chimioterapia, radioterapia (Moriss ID, 2002; Stahl O, Eberhard J, Jepson K, 2006;

Fumatul ( Pott RJ, Newbury CJ, Smith G, 1999);

Infectiile si inflamatiile tractusului genital (Erenpreiss J, Hlevicka S, Zalkains J si col.,2002);

Expunerea la pestricide, poluanti (Sanchez-Pena LC, Reyes BE, Lopez-Carrillo L si col.,2004; Rubes J, Selevan SG, Evenson DP, 2005);

Varicocelul ( Saleh RA, Agarwal A, Sharma RK, 2003; Werthman P, Wixon R, Kasperson K si col., 2007);

Deficienta de hormoni gonadotropi ( FSH ) (Xing W, Krishnamurthy H, Sairam MR, 2003);

Boli febrile (Evenson DP, Jost LK, Corzett M si col., 2000);

Incidenta fragmentatiilor ADN din spermatozoizi in populatia umana

Evaluarea cromatinei spermatozoizilor este o provocare din mai multe motive: este dificil de a asocia rezultatele testelor de evaluare a cromatinei cu mecanismele fiziologice cunoscute; controversa dintre rolul structurii cromatinei si practica clinica (reproducerea umana asistata, RUA); lipsa standardizarii metodelor de evaluare a integritatii cromatinei. Interpretarea rezultatelor trebuie sa aiba in vedere: structura complexa a cromatinei de la nivelul spermatozoizilor si necesitatea metodelor multiple de evaluare, multitudinea de factorilor ce pot complica interpretarea rezultatelor, stiind ca nu toate fragmentele de ADN afectate sunt letale (ADN contine regiuni necodate, introni, pe care ovocitele le pot repara). Cu toate aceste controverse, testarea cromatinei spermatozoizilor ofera la momentul actual, un bun diagnostic si prognostic in aprecierea fertilitatii sau infertilitatii (Saleh RA, Agarwal A, Nelson DR, 2002).

In RUA, daca proportia de spermatozoizi cu fragmentari ADN depaseste 30%, probabilitatea de sarcina dupa inseminare intrauterine (IUI) pare sa se apropie de zero ( Sun JG, Jurisicova A, Casper RF, 1997; Bungum M, Humaidan P, Spano M si col.,2004). Studii recente (meta-analize) concluzioneaza ca fragmentatiile ADN sunt predictive si reduc rata de sarcini dupa IVF standard si fara semnificatie in rata de sarcini dupa ICSI ( Li Z, Wang L, Cai J si col.,2006). Deci, testarea integritatii cromatinei ajuta in predictia ratei de sarcina in IUI si IVF standard, iar pentru pacientii cu un procent mare de fragmentari ADN, ICSI este metoda de electie (Bungum M, Humaidan P, Axmom A si col.,2007).

In cazul avorturilor repetate, s-a demonstrat ca proportia fragmentarilor de ADN este mare fata de populatia generala si donatorii fertili. Procentul avorturilor spontane este mare in cazul sarcinilor obtinute in urma procedurilor FIV/ICSI, pentru cuplurile al caror partener prezenta un procent mare de spermatozoizi cu fragmentari ADN (Check JH, GrazianoV, CohenR si col.,2005).

Pentru pacientii cu boli neoplazice, congelarea spermei este o obtiune in vederea pastrarii potentialului reproductiv post tratament chirurgical si chimio-radioterapeutic. Astfel ca pentru pacientii cu parametrii spermatici buni (concentratie, mobilitate) si nivel scazut de fragmentari ADN, sperma poate fi congelata in esantioane mai mari, putand fi folosita pentru IUI,iar pentru pacientii la care acesti parametrii nu sunt satisfacatori crioprezervarea se va face in esantioane mici folosite pentru IVF sau ICSI ( Kobayashi H, Larson K, SharmaR si col.,2001).

Metode de determinare a fragmentatiilor de ADN din spermatozoizi

Pentru testarea structurii cromatinei de la nivelul spermatozoizilor, in relatia cu infertilitatea masculina, s-au dezvoltat mai multe teste. Conform modelul Donut-Loop exista trei nivele la care cromatina poate fi accesata pentru a fi testata: in regiunile de legare a toroizilor (complex protamine-ADN), ce contin zonele de atasament la matrixul nuclear si sensibile la DNAz (Stolongo et. al., 2003); fibrele de cromatina de pe suprafata toroizilor; majoritatea fibrelor de cromatina din interiorul toroizilor.

Luand in considerare aceste trei nivele la care poate fi accesata cromatina, testele folosite in prezent pentru testarea fragmentatiilor ADN al spermatozoizilor sunt:

Testul TUNEL;

Testul COMET;

Testul SCSA;

Testul SCD;

Testul TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT)-mediated deoxyurydine triphosphate(dUTP)-nick labeling assay).

In cadrul acestui test se foloseste enzima TdT, pentru a lega nucleotide marcate fluorescent la capatul 3’- OH al fragmentelor de ADN, realizand un semnal care creste cu numarul de fragmente. Acest test detecteaza fragmentarile aflate pe un singur sau ambele lanturi ale ADN microscopic sau flow citometric ( Gorczyca W,Gong J, Darzynkiewcz Z, 1993). Cea mai mare parte a ADN spermatozoidal ramane inaccesibil la actiunea enzimei TdT, pentru ca toroizii ( complexe protamina-ADN) raman intacti si cea mai mare parte din ADN este localizat la nivelul acestor complexe. Astfel, ca pentru test raman accesibile regiunile de legare ale toroizilor, aceste regiuni fiind accesibile ADNz si accesibile enzimei TdT utilizata in test. Un al doilea tip de cromatina la care poate fi testata integritatea ADN, este cromatina de pe suprafata toroizilor. In acest fel testul este limitat la aceste zone ale cromatinei, zone unde sunt de altfel, situs-urile active, in primele ore ale fertilizarii, cand cromatina se decondenseaza ( Sakkas D, Manicardi GC, Bizzaro D, 2003; Spano M, Sakkas D, 2005). Recent Aitken RJ si col., au inclus in test un pas preliminar de relaxare a intregii structuri a cromatinei, pentru a avea acces la toate zonele unde pot exista fragmentari ale ADN. De asemenea au introdus un colorant de testare a viabilitatii, asfel ca, testul intereseaza doar spermatozoizii viabili, crescand sensibilitatea testului.

Semnificatia clinica a testului: poate sa reprezinte predictia pentru rata de sarcina in IUI, rata de diviziune celulara (cleavage) in FIV, rata de fertilizare in ICSI si poate oferii explicatii in cazul avorturilor spontane recurente (Sun JG, Jurisicova A, Casper RF, 1997; Benchaib M, Braun V, Lornage J si col.,2003)

Figura. 8 Testul TUNEL:

celulele spermatice cu fragmentatii de ADN sunt colorate in verde si cele fara fragmentatii ADN sunt albastre. (www.tupbebek-genetik.com)

Figura 9. Testul TUNEL (www.clevelandclinic.org)

Testul COMET (single cell gel electrophoretic test),introdus prima oara de Ostling si Johanson in 1984,este un test de electroforeza in gel care cuantifica fragmentele de ADN in celule spermatice individuale. Spermatozoizii sunt incorporati in in gel de agaroza, protaminele si histonele sunt extrase cu agenti de reducere ( McVicar CM si col.,2004; Tomsu M si col.,2002), iar ADN-ul cromozomal ramane localizat. Dupa extractia a proteinelor se formeaza un halou nuclear, in care domeniile buclate ale ADN cu lungimea de 50 kb sunt atasate de matrixul nuclear (Nadel B si col.,1995; Ward WS si col.,1989). ADN este apoi denaturant de base (alkaline COMET assay) sau in pH neutru ( neutral COMET assay) si supus unui camp electric. Fragmentele de ADN libere, neatasate matrixului nuclear vor migra catre electrodul pozitiv, realizand aspectul de “ coada de cometa”. Avantajele testului: poate fi folosit pe cantitati mici de probe si in cazul oligospermiilor severe ( probe cu un numar foarte mic de spermatozoizi), poate depista fragmentarile aflate pe lanturile simple cat si duble ale ADN-ului, are un coeficient intratest de variabilitate mic si nu este costisitor.

Semnificatia clinica a testului: poate sa evalueze integritatea ADN dupa crioprezervare, poate fi un test predictiv pentu dezvoltarea embrionara dupa FIV standard sau ICSI, mai ales pentru cuplurile cu infertilitate inexplicabila.

Figura. 10

Testul COMET Integrity of human sperm DNA assessed by the neutral comet assay. (synapse.koreamed.org)

Testul SCSA ( Sperm Chromatin Structure assay), test dezvoltat de Don Evenson este un test de sortare a celulelor marcate fluorescent, masurand susceptibilitatea la denaturare a ADN spermatic, dupa expunerea la caldura sau mediu acid si colorarea nucleilor celulelor spermatice cu o substanta fluorescenta (acridine orange), interpretarea rezultatelor realizandu-se folosind flow citometria. Se calculeaza un index de fragmentatii ADN (DFI- DNA fragmentation index)(Evenson DP, Jost LK, Marshall D, 1999).

Avantajele testului: estimeaza cu acuratete procentul spermatozoizilor cu fragmentatii de ADN.

Semnificatia clinica a testului: testul poate sa diferentieze barbatii infertili de cei fertili, considerand limita de 30% DFI ce poate sa faca predictia privind rezultatele tehnicilor de reproducere umana asistata, incluzand rata de fertilizare si implantare (Evenson D,Wixon R,2006; Bungun M, Humaidan P, Axmon A,2007; Li Z, Wang L, Cai J, 2006; EvensonD, Wixon DP, Wixon R, 2006).

Figura. 11 Testul SCSA:spermatozoizii fara fragmentatii de ADN colorati in verde,iar cei cu fragmentari ADN colorati in rosu (www.scsadiagnostics.com)

Testul de dispersie a cromatinei de la nivelul celulelor spermatice(Sperm Chromatin Dispersion test- Halo test; SCD)

Celulele spermatice transmit ovocitului genomul haploid paternal determinand formarea embrionul. Se impune astfel evaluarea integritatii acestui genom in cadrul evaluarii standard a spermei, considerand evaluarea fragmentatiilor ADN un parametru important al calitatii acesteia.

Testul SCD are la baza principiul conform caruia spermatozoizii cu fragmentatii ADN nu realizeaza haloul caracteristic determinat de domeniile buclate (loops) dispersate ale ADN, observate in cazul spermatozoizilor fara fragmentatii, dupa denaturarea si indepartarea proteinelor nucleare.

Testul presupune amestecul spermatozoizilor (a spermei preparate sau nu) cu agaroza fluida, urmand tratarea cu solutie acida pentru denaturarea ADN si indepartarea proteinelor cu o solutie tampon. Prin indepartarea proteinelor nucleare rezulta nucleoizi cu un halou periferic realizat prin dispersia domeniilor buclate (loops) ale ADN. Folosind o coloratie fluorescenta se constata ca acei spermatozoizi cu multe fragmentatii ADN produc un halou mic sau deloc, iar spermatozoizii fara fragmentatii sau cu un nivel mic, isi disperseaza domeniile buclate ale ADN-ului realizand un halou larg (Ankem MK, Mayer E, Ward WS si col.,2002; Fernandez JL, Muriel L, Goyanes V si col.,2005).

Figura. 12 Testul SCD (goldenlab.co.id)

Materiale si metode

Infertilitatea afecteaza aproximativ 15% din cuplurile care doresc sa conceapa, iar factorul masculin, ca si cauza a infertilitatii cuplului, reprezinta aproape jumatate din aceste cazuri. Pacientii, chiar si cu normospermie, pot avea un procent ridicat de fragmentatii ADN si pot reprezenta o cauza majora a infertilitatii inexplicabile. Se acorda o importanta din ce in ce mai mare fragmentatiilor ADN spermatozoidal, ca factor implicat in etiología infertilitatii, integritatea ADN fiind un marker nou folosit in aprecierea calitatii spermatozoizilor si in predictia sarcinii.

Testul de dispersie a cromatinei de la nivelul celulelor spermatice (SCD), folosit pentru determinarea nivelului de fragmentatii ADN, se bazeaza pe principiul conform caruia tratarea spermatozoizilor cu o solutie acida, inainte de indepartarea proteinelor nucleare cu solutie de liza, determina formarea unui halou perinuclear, realizat de catre zonele buclate ale ADN (loops), in cazul spermatozoizilor fara fragmentatii. Acest halou lipseste sau are o dimensiune mult mai mica pentru spermatozoizii cu fragmentatii (Fernandez et al., 2003).

Materialul biologic

Probele de sperma au fost obtinute de la pacienti care au solicitat screening de infertilitate (n = 20) si probe congelate de la donatori normospermici, anonimi, provenite de la banca de sperma Cryos-Danemarca (n = 10), in perioada aprilie 2011- martie 2013.

Probele au fost recoltate in recipiente sterile, prin masturbare dupa o perioada intre 2-5 zile de abstinenta sexuala si folosite pentru inseminari intrauterine (IUI).

Analiza spermei, prepararea spermei

Sperma a fost evaluata dupa lichefiere la 37 grade C, in atmosfera cu 5% CO2 (incubator), pentru 10-15 minute.

S-a examinat concentratia si mobilitatea spermatozoizilor folosind camera Makler (Sefi Medical Instruments, Israel), dupa ghidurile Organizatiei Mondiale a Sanatatii, 2010 (WHO Laboratory manual for examination and processing of human semen, fifth edition, 2010) si morfologia a fost evaluata folosind lame precolorate ( Prestained Morphology Slides, Cell-Vu, Millennium Sciences Inc.,New York), dupa criteriile Kruger (Kruger TF, Menkveld R, Stander FS, Lombard CJ, der Merwe JP Wan, van Zyl JA, 1986).

Volumul de sperma………………………………………………………..1,5 ml

Concentratia totala de spermatozoizi…………………………………….39 mil.

Concentratia spermei……………………………………………………15 mil./ml

Procentul de spermatozoizi cu mobilitate progresiva(A+B)………..32%

Procentul de spermatozoizi viabili………………………………………..58%

Procentul de spermatozoizi cu forme tipice (morfologie)………..…4%

Celule rotunde………………………………………………………………….<1 mil./ml

Criteriile Kruger pentru evaluarea morgfologica a spermatozoizilor:

Capul spermatozoidului trebuie sa fie oval, cu contur regulat, 5-6 µm lungime, 3,5 µm latime, acrozomul sa ocupe intre 40-70% din suprafata capului.

Gatul si piesa intermediara trebuie sa un prezinte anomalii morfologice sau exces citoplasmatic ( reziduu citoplasmatic in urma spermiogenezei incomplete) si daca este prezent sa un fie mai mare de jumatate din dimensiunea capului.

Coada trebuie sa un fie spiralata, angulata sau incolacita la capatul terminal.

Pentru inseminari intrauterine (IUI), probele de sperma au fost prepárate folosind gradienti cu densitate diferita (AllGrad 45% , AllGrad 90 %) (LifeGlobal Media LifeGlobal USA) , centrifugate la 500G, 20 de minute, dupa care s-a indepartat supernatantul, iar sedimentul a fost spalat cu mediu de spalare ( AllGrad Wash) (LifeGlobal Media LifeGlobal USA), la 500 G, 10 minute. Dupa spalare s-a indeparatat supernatantul si peste sediment s-a adaugat 0,5-0,6 ml mediu de spalare (AllGrad Wash) din care 50 µl s-au folosit pentru citire postpreparare si pentru unele probe s-a efectual testul SCD.

Probele de sperma congélate au fost decongelate si aduse la temperatura camerei inainte de efectuarea testului SCD.

Testul de dispersie a cromatinei spermatozoizilor (SCD test)

Descrierea kit-ului folosit, materiale si echipamente

S-a folosit kit-ul Halosperm, Halotech DNA, Madrid, Spania;

Lame de sticla cu lamella 22×22 mm;

Tuburi Eppendorf cu agaroza ( cu punct de topire scazut);

Solutie acida de denaturare (notata AD);

Solutie de liza ( LS);

Solutii pentru colorare ( Diff Quick);

Microscop optic conventional binocular Nikon cu obiective de 20x, 40x si respective 100x;

Microscop Olympus cu lumina inversata CKX31 cu obiective de 40x, 60x, cu camera adaptata pentru captarea imaginilor;

Frigider;

Baie de apa termostatata;

Micropipeta;

Apa distilata;

Etanol 70%, 90%, 100%;

Metoda de lucru;

Se incalzesc tuburile Eppendorf in baie de apa la 100 C pentru 5 minute pentru a lichefia agaroza;

Se transfera tuburile in baie de apa la 37 C pentru 5 minute;

Se adauga 25-30 µl din proba de sperma peste agaroza si se omogenizeaza;

Se pun 15 µl din amestec ( sperma+ agaroza ) pe o lama si se acopera cu o lamela;

Se aseaza lama pe o suprafata metalica rece si se introduce in frigider timp de 5 minute pentru ca agaroza sa se solidifice;

In 10 mL de apa distilata se adauga 80 µl de solutie de denaturare (AD) (0,08 N HCl);

Se ia lama din frigider si se indeparteaza lamela;

Se introduce lama in solutie de denaturare pentru 7 minute;

Se scoate lama din Solutia de denaturare si se introduce in Solutia de liza ( 0.8 M ditiotreitol / DTT, 1% sodium dodecyl sulfat / SDS si 2M NaCl), pentru 25 de minute;

Se scoate lama din Solutia de liza si se introduce in apa distilata pentru 5 minute;

Se introduce lama in etanol 70 %, 2 minute;

Se introduce lama in etanol 90 %, 2 minute;

Se introduce lama in etanol 100%, 2 minute;

Se usuca lama la temperatura camerei;

Se coloreaza cu Diff Quick ( solutie de albastru metilen respective eozina dizolvata in methanol);

Rezultate , Discutii

Citirea lamelor a fost efectuata de doi observatori si pentru fiecare proba au fost evaluati minim 300 de spermatozoizi.

S-au stabilit 4 modele de dispersie a cromatinei, fiind folosite in evaluarea haloului perinuclear: 1) nuclei cu halou larg (dispersie larga a cromatinei); 2) nuclei cu halou mediu; 3) nuclei cu halou mic; 4) nuclei fara halou.

Pentru a afla nivelul fragmentatiilor de ADN de la nivelul spermatozoizilor, s-au evaluat valorile testului de dispersie a cromatinei efectuat pentru pacientii infertili cu valori anormale ale spermogramei, pentru cei cu normospermie si pentru donatorii Cryos (Tabelul 2.).

Tabel 2. Nivelul fragmentatiilor de ADN de la nivelul spermatozoizilor

Tabel. 3 Nivelul fragmentatiilor de ADN de la nivelul spermatozoizilor in cazul pacientilor cu spermograme modificate

Tabelul 4. Nivelul fragmentatiilor de ADN de la nivelul spermatozoizilor in cazul pacientilor cu probe congelate.

Procentul de spermatozoizi ai caror caror nuclei nu au halou sau au un halou foarte mic, pentru pacientii infertili a variat intre 10% si 81.1%.

De semnalat ca 40% dintre pacientii cu normospermie si 60% dintre pacientii cu spermograme modificate, au prezentat fragmentari de ADN spermatozoidal intr-un procent de peste 30%. In contrast cu acestia, doar 10% dintre donatorii Cryos au avut fragmentari de ADN peste 30%, cu valori ce au variat intre 4% si 34%.

Valorile testului pentru donatorii Cryos, au fost semnificativ diferite de cele ale pacientilor infertili (media +/- deviatia standard): 16.66 +/- 9.71 fata de 35.35 +/- 18.12, P < 0.05.

Diferentele nu au fost semnificative in cazul valorilor otinute pentru pacientii infertili cu normospermie si pentru cei cu spermograme modificate: 32.0 +/- 20.15 fata de 38.51 +/- 16.18, P > 0.05.

De mentionat, rezultatele clinice in urma inseminarilor intrauterine pentru fiecate lot, asfel: din lotul pacientelor inseminate cu probe Cryos s-au raportat 5 teste de sarcina (beta hCG) pozitive, din lotul pacientilor infertili cu valori normale ale spermogramei, s-au raportat 3 teste de sarcina pozitive, iar din lotul pacientilor infertili cu valori anormale ale spermogramei, s-a raportat 1 test de sarcina pozitiv. In corelatie cu rata de sarcina trebuie avut in vedere si patologia partenerului feminin (de exemplu endometrioza severa sau femeile in varsta) cu sanse scazute la inseminare intrauterina (IUI). Altfel spus, capacitatea ovocitului de reparare al ADN spermatozoidal este compromis.

Pentru patru paciente – doi din lotul pacientilor cu valori normale ale spermogramei si ceilalti doi din lotul pacientilor cu valori anormale ale spermogramei – s-a efectuat testul SCD inante de prepararea spermei, pe fiecare fractie de gradienti dupa prima centrifugare si pe sediment. S-au constatat urmatoarele:nivélele cele mai mari de fragmentatii au fost in fractia cu densitate de gradienti mai mica si cea mai mica in sediment. (Tabelul 5).

Tabelul 5. Titlul Tabel

Conform ghidurilor OMS, analiza de rutina a spermei confera informatii valoroase cu privire la functiile testiculului si este considerat standardul de aur in evaluarea infertilitatii masculine, desi masoara numai volumul ejaculatului, concentratia spermei, mobilitatea si morfologiei spermatozoizilor.

Multe studii atrag atentia asupra contributiei factorului masculin in infertilitatea cuplului. De exemplu, subseturi de ARNm spermatozoidal sunt recunoscute ca fiind relevante in dezvoltarea timpurie a embrionului (Ostermeier et al., 2002; Schatten, 2002), chiar daca ovocitul are potential, in aceasta perioada, de a repara defectele ADN-ului celulei spermatice.

Este unanim acceptata ideea ca fragmentatiile de ADN pot fi cauzate de defecte ale condensarii cromatinei in timpul spermiogenezei, apoptozei din timpul spermatogenezei si a transportului de-a lungul tractusului genital masculin (Duran et al., 2002) sau ca o consecinta a stress-ului oxidativ (Garrido et al., 2004; Greco et al., 2005a).

Care sunt implicatiile clinice ale testului de dispersie a cromatinei celulelor spermatice ?

Fragmentatiile de ADN sunt corelate cu rata de sarcini in cadrul inseminarilor intrauterine (IUI), cand aceste fragmentatii ADN depasesc pragul de 30%, probabilitatea unei sarcini cu evolutie pana la termen este intre 19% si 1,5% (Bungum si col., 2004; Duran si col., 2002).

In schimb nu exista o corelatie statistica similara in cazul fertilizarii in vitro ( FIV) standard sau in cazul injectiei intracitoplasmatice a spermatozoidului (ICSI), probabil datorita fapului ca in cadrul acestor tehnici, selectia celui mai bun spermatozoid, respectiv a celui mai bun embrion, din punct de vedere morfologic, reduce impactul calitatii scazute ale spermatozoizilor (Benchaib si col.,2007; Bungum si col., 2004).

Pe baza rezultatelor obtinute prin masurarea fragmentatiilor ADN, se poate stabili tehnica de reproducere asistata ce ar trebui adoptata. Astfel, pentru cuplurile unde fragmentatiile de ADN prezinta valori peste 30% se va proceda la FIV sau ICSI, evitandu-se inseminarile intrauterine nejustificate, clinicianul putand lua o decizie informata in practica zilnica si putand sa actioneze in baza unor rezultate cantitative.

Bazandu-ne pe rezultatele testului de dispersie a crometinei celulelor spermatice, indicatiile clinice sunt:

1. Selectia cuplurilor ce au indicatie reala pentru inseminari intrauterine;

2. Stabilirea calitatii spermei in screening-ul infertilitatii sau in cazul programelor de donare, selectia donatorilor;

Parametri traditionali sunt rezultatul observatiilor subiective, nu pot explica si diagnostica cauzele infertilitatii masculine si nu iau in calcul cel mai important parametru, abilitatea de a transmite un genom intact pentru a initia o sarcina viabila (Aziz N & Agarwal A, 2008).

3. Pentru evaluarea eficientei tratamentelor medicale, chirurgicale;

Pacientii infertili cu varicocel prezinta valori crescute de fragmentatii de ADN nuclear, iar rezolvarea chirurgicala a varicocelului ( varicocelectomia) reduce semnificativ nivelul de fragmentatii (Werth et. al. 2008).

Procentul de spermatozoizi cu fragmentatii ADN este semnificativ crescut in cazul pacientilor cu infectii cu Chlamydia trachomatis si Mycoplasmae iar antibioterapia scade valorile acestor fragmentatii nucleare (Gallegos si col., 2008), verificand in acest fel si eficacitatea tratamentului.

4. Reprezinta un raspuns in cazul infertilitatii inexplicabile, avorturi repetate si esecuri ale tehnicilor de reproducere asistata (Muriel et.al, 2006a, 2006b; Velez de la Calle et.al, 2008; Carrell et.al, 2003; Henkel et.al, 2004; Sakkas et.al, 2004; Virro et.al, 2004).

5. Selectia celei mai bune probe de sperma pentru pacientii ale caror probe vor fi

criocongelate inainte de vasectomie sau inainte de tratamentele oncologice ( chimio- sau radioterapie).

Concluzii

Cromatina de la nivelul celulei spermatice, este o structura extrem de specializata, esentiala pentru protectia si transmiterea genomului patern. O varietate de entitati etiologice au fost asociate cu un nivel crescut de fragmentatii la nivelul ADN-ului spermatic, dar exact mecanismul fiziopatologic prin care se produc acestea nu sunt complet elucidate.

Procentul fragmentatiilor ADN, in celulele spermatice provenite de la pacienti infertili, pare sa fie mare in comparatie cu barbatii fertili, influentand rata de fertlizare, calitatea, dezvoltarea si evolutia catre stadiul de blastocist a embrionilor, rata de sarcina, rata de avorturi. Se impune obtinerea de in formatii legate de calitatea moleculelor de ADN din celulele sprmatice ce urmeaza a fi folosite in cadrul tehnicilor de reproducere asistata.

Testul de dispersie a cromatinei de la nivelul spermatozoizilor (SCD) este un test rapid, reproductibil, care nu necesita echipament complex sau scump, putand fi realizat cu echipamentul din dotarea laboratoarelor de andrologie, testul SCD putand fi introdus, alaturi de celelalte teste, in screening-ul de rutina al pacientilor infertili.

BIBLIOGRAFIE

"WHO | Infertility". Who.int. 2013-03-19. Retrieved 2013-06-17;

(Rhoades R, Pflanzer R, 2003. Human physiology, fourth edition, Thomson Learning Inc.);

Ankem MK, Mayer E, Ward WS, et al. Novel assay for determinin DNA organization in human spermatozoa: implications for male factor inferility. Urology 2002;

Aziz N & Agarwal A, 2008. Evaluation of sperm damage; beyond the World Health Organization criteria. Fertil Steril, 90, 484-5;

Bannister LA, Schimenti JC. Homologousrecombinational repair proteins in mouse meiosis. Cytogenet Genome Res 2004; 107; 191-200;

Benchaib M, Braun V, Lornage J, et al. Sperm DNA fragmentation decreases the pregnancy rate in assisted reproductive technique. Hum Reprod 2003;

Benchaib M, Lornage J, Mazoyer C, Lejeune H, Salle B & Francois Guerin J, 2007. Sperm deoxyribonucleic acid fragmentation as a prognostic indicator of assisted reproductive technology outcome. Fertil Steril, 87, 93-100;

Bungum M, Humaidan P, Axmon A, et al. Sperm DNA integrity assessment in prediction of assisted reproduction technology outcome. Hum.Reprod.2007; 22: 174-9;

Bungum M, Humaidan P, Spano M, Jepson K, Bungum L&Giwercman A, 2004. The predictive value of sperm chromatin structure assay (SCSA) parameters for outcome of intrauterine insemination, IVF and ICSI Hum Reprod, 19, 1401-8;

Bungum M, Humaidan P., Spano M. et al. The predictive value of sperm chromatin structure assay (SCSA) parameters for the outcome of intrauterine insemination, IVF and ICSI. Hum Reprod 2004;

Carrell D T, Liu L, Peterson C M, Jones K P, Hatasaka H H, Erickson L, Campbell B, 2003. Sperm DNA fragmentation is increased in couples with unexplained recurrent pregnancy loss. Arch Androl, 49, 49-55;

Cayli S, Sakkas D, Vigue L, Demir R and Husgar G ( 2004) Cellular maturity and apoptosis in human sperm : creatine kinase , caspase-3 and bcl-xl levels in mature and diminished maturity sperm. Mol. Hum. Reprod;

Check JH, Graziano V, Cohen R, et al . Effect of an abnormal sperm chromatin structural assay ( SCSA) on pregnancy outcome following ( IVF) with ICSI in previous IVF failures . Arch Androl 2005;

Chen JL and Longo FJ (1996) Expression and localization of DNA topoisomerase II during rat spermatogenesis. Mol. Reprod;

Dale B, 1996 In:(Greger R, Windhorst U. Eds.) Comprehensive Human Physiology. SpringerVerlag;

Duran E H, Morshedi M, Taylor S & Oehninger S, 2002. Sperm DNA quality predicts intrauterine insemination outcome a prospective cohort study. Hum Reprod, 17, 3122-8;

Duran EH, Morshedi M, Taylor S and Oehninger S (2002) Sperm DNA quality predicts intrauterine insemination outcome: a prospective cohort study. Hum Reprod12,3122–3128;

Elder K, Dale B, 2007. In vitro fertilization, second edition, Cambridge University Press;

Erenpreiss J, Hlevicka S, Zalkalns J, et al. Effect of leukocytospermia on sperm DNA integrity: a negative effect in abnormal semen samples. J Androl 2002; 23; 717-23;

Essig, Maria G.; Edited by Susan Van Houten and Tracy Landauer, Reviewed by Martin Gabica and Avery L. Seifert (2007-02-20). "Semen Analysis". Healthwise. WebMD. Retrieved 2007-08-05;

Evenson D, Wixon R. Meta-analysis of sperm DNA fragmentation using the sperm chromatin structure assay. Reprod Biomed Online 2006;

Evenson D,Wixon R, Meta-analysis of sperm DNA fragmentation using the sperm chromatin structure assay. Reprod Biomed Online 2006; 12:466-72;

Evenson DP , JOST LK, Corzett M, et al. Characteristics of human sperm chromatin structure following an episode of influenza and high fever: a case study. J Androl 2000;

Evenson DP, Jost LK, Marshall D, et al. Utility of sperm chromatin structure assay as a diagnostic and prognostic tool in the human fertility clinic. Hum. Reprod 1999; 14:1039-49;

Fernandez JL, Muriel L., Goyanes V, et al. Halosperm is an easy, available and cost effective alternative for determining sperm DNA fragmentation. Fertil Steril 2005;

Gallegos G, Ramos B, Santiso R, Goyanes V, Gosalvez J & Fernandez J L, 2008. Sperm DNA fragmentation in infertile men with genitourinary infection by Chlamydia trachomatis and Mycoplasma. Fertil Steril, 90, 328-34;

Garrido N, Meseguer M, Álvarez JG, Simón C, Pellicer A and Remohí J (2004) Relationship among standard semen parameters, glutathione peroxidase/glutathione reductase activity and mRNA expression and reduced glutathione content in ejaculated spermatozoa from fertile and infertile men. Fertil Steril 82(Suppl 3),1059–1066;

Gorczyca W, Gong J, Darzynkiewicz Z. Detection of DNA strand breaks in individual apoptotic cells by the in situ terminal deoxynucletoidyl transferase and nick translation assays. Cancer Res 1993;

GrecoE, Scarselli F, Iacobelli M, Rienzi L, Ubaldi F, Ferrero S, Franco G, Anniballo N, Mendoza C, and Tesarik J (2005a) Efficient treatment of infertility due to sperm DNA damage by ICSI with testicularspermatozoa. Hum Reprod20,226–230;

Henkel R, Hajimohammad M, Stalf T, Hogendijik C, Mehnert C, Menkveld R, Gips H, Schill W B, Kruger TF, 2004. Influence of deoxyribonucleic acid damage on fertilization and pregnancy. Fertil Steril, 81, 965-72;

Hess RA, 1999. Spermatogenesis, overview. Encyclopedia of Reproduction vol.4, Academic Press, New York;

Himmel, W.; Ittner, E; Kochen, MM; Michelmann, HW; Hinney, B; Reuter, M; Kallerhoff, M; Ringert, RH (1997). „ Voluntary Childlessness and being Chilfree „. British jornal of General Practice 47 (415): 111–8. PMC 1312893. PMID 9101672;

Kobayash H, Larson K , Sharma R , et al. DNA damage in cancer patiens before treatment as measured by the sperm chromatin structure assay . Fertil Steril 2001;

Kruger TF, Menkveld R, Stander FS, Lombard CJ, der Merwe JP Wan, van Zyl JA. Sperm morphologic features as a prognostic factor in vitro fertilization. Fertil Steril 1986,46;

Liz Z , Wang L , Cai J, et al . Correlation of sperm DNA damage with IVF and ICSI outcomes : a systematic review and menta-analysis. J Assist Reprod Genetics 2006;

Marcon L and Boisssonneault G (2004) Transient DNA strand breaks during mouse and human spermiogenesis new insights in stage specificity and link to chromatin remodeling . Biol Reprod 70;

McPherson SM and Longo FJ ( 1993) Nicking of rat spermatid and spermatozoa DNA: possible involvement of DNA topoisomerase ii. Dev Biol 158;

McVicar CM , McClure N, Williamson K, Dalzell LH and Lewis SE (2004) Incidence of fas positivity and deoxyribonucleic acid double –stranded breaks in human ejaculated sperm . Fertil Steril 81;

Meistrich ML, Mohapatra B, Shirley CR, Zhao M, 2003. RolesOf transition nuclear proteins in spermiogenesis. Chromosoma 111, 483-488;

Morris ID. Sperm DNA damage and cancer treatment. Int J Androl 2002; 25; 255-61;

Muriel L, Garrido N, Fernandez J L, Rehoni J, Pellicer A, De Los Santos M, Meseguer M, 2006a. Value of sperm deoxyribonucleic acid fragmentation level, as measured by the sperm chromatin dispersion test, in the outcome of in vitro fertilization and intracytoplasmatic sperm injection. Fertil Steril, 85, 371-83;

Muriel L, Meseguer M, Fernandez J L, Alvarez J, Rehoni J, Pellicer A, Garrido N, 2006b. Value of sperm sperm chromatin dispersion test in predicting pregnancy outcome in intrauterine insemination; a blind prospective study. Hum Reprod, 21, 738-44;

OstermeierGC, Dix DJ, Miller D, Khatri P and Krawetz SA (2002) Spermatozoal RNA profiles of normal fertile men. Lancet360,772–777;

Page AW, Orr-Weaver TL, Stopping and starting the meiotic cell cycle. Curr Opin Genet Dev 1997; 7; 23-31;

Passch U , Agarwal A, Gpta AK, Sharma RK, Grunewald S, Thomas Jr., AJ and Glander HJ (2003) Apoptosis signal transduction and the maturity status of human spermatozoa. Ann N Y Acad Sci 1010;

Potts RJ, Newbury CJ, Smith G, et al. Sperm chromatin damage associated with male smoking. Mutat Res 1999; 423; 103-11;

Rubes J, Selevan SG, Evenson DP, et al. Episodic air pollution is associated with increased DNA fragmentationin human sperm without other changes in semen quality. Hum Reprod 2005; 20; 2776-83;

Sakkas D, d’Arcy Y, Percival G, Sinclair L, Afnan M, Sharif K, 2004. Use of egg-share model to investigate the paternal influenceon fertilization and embryo development after in vitro fertilization and intracytoplasmatic sperm injection. Fertil Steril, 82, 74-9;

Sakkas D, Manicardi GC and Bizzaro D ( 2003) Sperm nuclear DNA damage in the human . Adv. Exp. Med. Biol.

Sakkas D, Moffatt O , Manicardi GC, Mariethoz E, Tarozzi N and Bizzaro D (2002) Nature of DNA damage in ejaculated human spermatozoa and the possible involvement of apoptosis Biol Reprod 66;

Saleh RA , Agarwal A , Nelson DR, et al. Increased sperm nuclear DNA damagein normozoospermic infertile men: a prospective study. Fertil Steril 2002;

Saleh RA, Agarwal A, Sharma RK, et al. Evaluation of nuclear DNA damage in spermatozoa from infertile man with varicocele. Fertil Seril 2003; 80; 1431-6;

Sanchez-Pena LC, Reyes BE, Lopez-Carrillo L, et al. Organophosphorous pesticide exposure alters sperm chromatin structure in Mexican agricultural workers. Toxicol Appl Pharmacol 2004; 196; 108-13;

SchattenGP (2002) Sperm mRNA—what does daddy do? Lancet7(360),742;

Schmid C, Heng HH, Rubin C, Ye CJ and Krawetz SA, 2001 Sperm nuclear matrix association of the prm1_prm2_tnp2 domain is independent of alu methylation. Mol Hum Reprod 7, 903-911;

Singh NP, Muller CH, Berger RE. Effects pf age on DNA double-stand breaks and apoptosis in human sperm. Fertil Steril 2003; 80; 1420-30;

Sotolongo B and Ward WS, 2000. DNA loop domain organization: the three dimensional genomic code. J Cell Biochem 35, 23-26;

Sotolongo B, LinoE and Ward Ws (2003) Abbreaks in human ejaculated sperm . Fertil Steril 81;

Sotolongo B, LinoE and Ward Ws (2003) Ability of hamster spermatozoa to digest theiir own DNA . Biol Reprod;

Spano M and Sakkas D (2005) The signnificance of sperm nuclear DNA strand breaks on reproductive outcome . Current Opinions in Obstetrics and Gynecology in Press;

Stahl O, Eberhard J, Jepson K, et al. Sperm DNA integrity in testicular cancer patients. Hum Reprod 2006; 21; 3199-205;

Sun JG, Jurisicova A, Casper RF, Detection of deoxyribonucleic acid fragmentation in human sperm: correlation with fertilization in vitro. Biol Reprod 1997; 56: 602-7;

Tomsu M, Sharma V and Miller D (2002) Embryo quality and IVF treatment outcomes may corelate with different sperm comet assay parameters . Human Reprod 17;

Velez de la Calle J F, Muller A, Walschaerts M, Clavere J L, Jimenez C, Wittemer C, Thonneau P, 2008. Sperm deoxyribonucleic acid fragmentation as assessed by sperm chromatin dispersion test in assisted reproductive technology program; rescults of a large prospective multicenter study. Fertil Steril, 90, 1792-9;

Virro M, Larson-ook K L, Evenson D P, 2004. Sperm chromatin structure assay ( SCSA) parameters are related to fertilization, blastocyst development and ongoing pregnancyin in vitro fertilization and intracytoplasmatic sperm injection cycles. Fertil Steril, 81, 1289-95;

Wang X . Sharma RK, Sikka SC, Thomas Jr., AJ, Falcone T and Agarwal A (2003) Oxidative stress is associated with increased apoptosis leading to spermatozoa DNA damage in patiens with male factor infertility. Fertil Steril 80;

Ward WS , Partin AW and Coffey DS ( 1989) DNA loop domains in mammalian spermatozoa . Chromosoma 98;

Ward WS, 1993.Deoxyribonucleic acid loop domain tertiary structure in mammalian spermatozoa. Biol Reprod, 1193-1201;

Weng SL, Taylor SL, Morshedi M, Schuffner A, Duran EH, Beebe S and Oehninger S (2002) Caspase activity and apoptotic markers in ejaculated human sperm . Mol. Hum. Reprod 8;

Werthman P , Wixon R, Kasperson K, et al. Significant decrese in sperm deoxyribonucleic acid fragmentation after varicocelentomy . Fertil Steril 2007; Jun 9;

Werthman P, Wixon R, Kasperson K &Evenson DP, 2008. Significant decreasein sperm deoxyribonucleic acid fragmentation after varicocelectomy. Fertil Steril, 90, 1800-4;

Xing W, Krishnamurthy H, Sairam MR. Role of folliotropin receptor signaling in nuclear protein transitions and chromatin condensation during spermatogenesis . Biochem Biophys Res Commun 2003;