Imbunatațirea Unor Dispozitive Medicale, în Vederea Dezvoltării Unor Biomateriale Noi cu Proprietați Antimicrobiene

PROIECT DE DIPLOMĂ

Conducători științifici Student

S.L. Dr. Ing. Adriana LUNGU

Dr. Chim. Mădălina  ALBU 

Lucrarea de față iși propune îmbunatațirea unor dispozitive medicale, în vederea dezvoltării unor biomateriale noi cu proprietați antimicrobiene care înlocuiesc tratamentul medicamentos atunci când acesta nu are capacitatea de trata țesuturile moi infectate. Biomaterialele pe baza de colagen si violet de gențiană sunt studiate intens datorită proprietăților antimicrobiene si de biocompatibilitate. Pentru obținerea acestor biomateriale, în gelul de colagen a fost încorporată carboximetilceluloză datorită viscozitații ridicate la concentrații scăzute și violet de gențiană datorită efectului antimicrobian. Lucrarea este structurată în două părți: prima parte de literatură, care conține date referitoare despre structura, proprietațile și aplicațiile colagenului, obținerea biomaterialelor de colagen și violet de gențiană precum și aplicațiile acestora în domeniul medical, iar în partea a doua am urmărit modul de obținere al biomaterialelor de colagen, imersarea carboximetilcelulozei a violetului de gențiană, și reticularea cu glutaraldehidă. În urma analizelor de laborator efectuate, s-au obținut rezultate benefice in ceea ce privește efectul antimicrobian al biomaterialelor.

This paper proposes to improve medical devices, in order to develop new biomaterials with antibacterial properties to replace drug therapy when does not have the capacity to prevent infection of soft tissue. Biomaterials of collagen and gentian violet were extensively studied due to their antibacterial properties and biocompatibility. To obtain this biomaterials, in collagen gel has been incorporated carboxymethycellulose due to the high viscosity at low concentrations and gentian violet due to their antibacterial properties. Thus, the paper consist in two parts: one for literature wich contains data about the structure, properties, and applications of collagen and gentian violet as well as their applications in the field of biomedical; the second part consist in personal contribution in the preparation of collagen biomaterials, immersing carboxymethycellulose, gentian violet and cross-linking with glutaraldehyde. Following laboratory analysis, the results were favorable regarding the composites antimicrobian effect.

I. STADIUL ACTUAL AL DEZVOLTĂRII ÎN DOMENIU

Capitolul 1. Introducere

1.1. Considerații generale ale colagenului

Colagenul este considerat ca fiind unul dintre cele mai utilizate biomateriale. Este folosit tot mai mult în aplicațiile medicale datorită proprietaților sale: biocompatibilitate foarte bună care îi oferă o toxicitate scazută, biodegradabilitate ridicată, sprijină adeziunea celulară și prezintă reacție imunologică scazută.

Colagenul este un polimer natural constituit din 20 de aminoacizi, ce formează o structura complexa organizată în patru structuri: primară, secundară, tertiară și cuaternară. Secventa primară a colagenului, indică natura, numarul și secvența resturilor de α aminoacizi din lantul α polipeptidic.

Aminoacizii sunt substanțe cristaline care se topesc prin descompunere , având o solubilitate ridicată in apă insă prezintă insolubilitate in solvenții organici.

În compozitia colagenului avem aminoacizi precum: alanină, prolină, leucină, serină, fenilalanină, lizină, cisteina, arginină, tirozină, valină.

Pană în prezent, s-au identificat 29 de tipuri diferite de colagen ce prezintă organizare moleculară și distribuție tisulară diversă, toate având aceeași structură și doar colagenul de tipul I, II, III, V si XI este cunoscut ca fiind fibrilar. Lanțul α din structura lui conține mai mult de 100 de aminoacizi cu gruparea Gly-X-Y. Lanțul pro α este sinterizat de o secventă de ARN mesager(ARNm), fiind transferat de la Aparatul Golgi către celule. În timpul transferului rezultă anumite reziduri care sunt hidrolizate de enzima lisin oxidaza. Sunt aproximativ 25 de conformații diferite ale lanțurilor α iar gruparea acestor lanțuri in seturi de câte 3, formează cele 29 tipuri de colagen.

Tabel. 1. Avantajele si dezavantajele colagenului [4]

Principalele aplicații medicale in care se utilizează colagen sunt sistemele cu eliberare controlată de medicament, pansamente pentru arsuri/răni, capsule pentru livrarea proteinelor, matrici pentru culturi celulare si aplicații in ingineria tisulară, înlocuirea pielii, vase si valve artificiale.

Colagenul este o proteină abundentă și poate fi extras din aproape fiecare animal viu, însa pentru aplicații biomedicale se preferă colagenul extras din pielea și tendoanele bovinelor, pielea și coada porcilor. Se poate folosi și colagenul extras din pești și meduze însă se folosește mai mult pentru uz clinic și industrie.

Fig. 3. Sursa de proveniență a colagenului

Captiolul 2. Compoziția și structura colagenului

2.1. Compoziția colagenului

Colagenul este format din 20 de aminoacizi, aranjați în secvențe caracteristice, formând o structură foarte complexă, organizată în patru structuri: structură primară, secundară, terțiară și cuaternară.

Aminoacizii sunt constituenți simpli din structura proteinelor, ce rezultă prin hidroliza acidă, hidroliza bazică sau hidroliza enzimatică. Sunt substanțe cristaline care se topesc prin descompunere și oferă o solubilitate ridicată în apă dar și insolubilitate in solvenți organici.

Fig. 4. Formula generală a aminoacizilor

Structura primară a colagenului, indică natura, numărul și secvența resturilor de α-aminoacizi din lanțul α-polpeptidic, fără a considera aranjamentul spațial iar până în prezent sunt cunoscute cel puțin 29 de tipuri de colagen, prezentând diversitate în organizarea moleculară, supramoleculară și distribuție tisulară.

Colagenul de tipul I, II, III și V prezintă structură de fibre mici având ca surse de proveniență pielea, oasele, tendoanele, cartilajele, corpul vitros sau sistemul vascular.

Colagenul de tip IV prezintă structură de rețea nefibroasă și se gasește în membrana bazală, corpul vitros sau rinichi. Colagenul de tip VI are structură de filamente cu diametrul de până la 100nm găsindu-se în piele, tendoane sau oase.

Colagenul de tip VII, este structurat în fibrile și se gasește în piele, placentă și uter, colagenul de tip VIII având structură de matrice hexagonală se găsește în membrană, iar cel de tip IX cu o structură fibrilară,se gasește în corpul vitros.

Colagenul de tip X , cu structură de matrice hexagonală este prezent în cartilajul de mineralizare, pe când colagenul de tip XI și XII, cu structuri de fibre fine, se gasește în cartilaj, cel de tipul XI, respectiv în tendon, cel de tip XII.

Tipurile de colagen enumerate, au fost grupate în șapte clase, în funcție de caracteristicile structurale asemănătoare ce le formează, astfel, tipurile de colagen I, II, III, V și XI fac parte din clasa colagenului fibrilar, care constituie structura proteică de bază din piele, tendon, cartilaj, os, plămâni, ficat etc.

Colagenul de tip I este cel mai cunoscut si cel mai abundent tip de colagen, regăsindu-se în aproape toate țesuturile, reprezentând cca. 80% din totalul colagenului din țesutul conjunctiv. Este o componenta majoră a țesuturilor conjunctive, cum ar fi tendoane, ligamente, piele, oase, dentină, cornee și capsulele fibroase ale organelor interne. Fibrele insolubile ale acestei proteine au o rezistență la tracțiune mare, care oferă suport mecanic pentru mai multe funcții fiziologiceTipul V este distribuit uniform și a fost detectat mai târziu, fiind considerat un „colagen minor”, datorită cantităților mici prezente în țesuturi, comparativ cu tipurile I, II și III, ce sunt considerate „colagen major”. Tipurile de colagen minor tind să se asocieze tipurile principale formând rețele de fibre. De exemplu, tipurile IX și XI se asociază cu colagenul tip II în cartilaje. Colagenul tip VI formează filamente, molecula VII formează fibrile de ancorare, iar tipurile de colagen IV, VIII și X formează structuri cuaternare sub formă de rețea plasă.

2.2. Structura colagenului

Colagenul prezintă proprietăți foarte bune și are capacitatea de a se regenera, fiind implicat și în morfogeneză. Este implicat în transmiterea forței în os și în mușchii din vecinatate, deasemenea are rol și in stocarea forței in exces, favorizînd locomoția. Colagenul se găsește și in țesuturile mineralizate, în oase și dinți.

În acest caz rolul colagenului este de a asigura flexibilitatea țesutului respectiv și de a conferi rezistență împotriva fracturilor. Pe langă țesutul osos, colagenul se găseste și în tendoane, piele, vase de sânge și mușchi unde asigură flexibilitatea necesară îndeplinirii

Colagenul este prezent și în cornee unde rolul lui este de a asigura proprietățile optice.

Structura colagenului este una complexa iar K. Lindeström-Lang, Bernal și Colab propun urmatoarea clasificare structurală:

structura primara reprezinta inlantuirea aminoacizilor in catenele polipeptidice ale macromoleculei de colagen;

structura secundara – se refera la un singur lant polipeptidic (helix minor orientat de la stanga spre dreapta) din triplul helix al moleculei de colagen;

structura tertiara – este reprezentata de molecula de colagen alcatuita din trei lanturi a  rasucite impreuna de la dreapta spre stanga, in jurul unui ax comun, realizandu-se astfel un triplu helix sau helixul major;

structura cuaternara – reprezinta modul de agregare a macromoleculelor de colagen la formarea fibrilelor, fibrelor si tesutului colagenic.

2.2.1. Proprietăți mecanice ale fibrei de colagen

Comportarea mecanică și fizico-chimică a colagenului se datorează dualismului structurii sale cristaline și amorfe, cumulând proprietațile cristalelor și gelurilor.

Colagenul este o proteină fibroasă, care în tesuturi calcifiate acționeaza ca nucleu pentru depozitarea sării, iar în țesuturile moi acționează ca „schelet” care susține țesutul și dă rezistentă în confruntarea cu forțele mecanice externe.

Proprietățile sale mecanice conțin elemente de elasticitate, vâscozitate și plasticitate. De asemenea el reacționează la diferite necesități funcționale, fapt demonstrat cu exactitate pe tractul reproductiv feminin în timpul sarcinii și în faza “recuperatorie” postnatala.

În derma pielii rețeaua de colagen este mai densa și mai complicată decât cea din membranele bazale; este o țesatură compactă tridimensională. Zona de limitare față de țesutul subcutanat nu este o linie fermă, fibrele continuandu-se în tot țesutul, astfel încât aranjamentul fibrelor devine din ce în ce mai lax.

Direcția predominantă a fibrei este paralela cu suprafața, dar mănunchiurile de fibre perpendiculare sunt destul de frecvente și tind să crească cantitativ, cu cât pielea este mai groasă. Elasticitatea pielii este favorizată și de conținutul de 4% elastină.

Colagenul nu este o proteină inertă și imobilă chiar și în formă matură și “insolubilă”. El reactionează la diferiți stimuli, în special la organismele tinere, încă în crestere. Colagenul reacționează la trauma și tensionare nu numai în locul traumatizat sau tensionat, ci în întreg organismul, chiar și la indivizii în vârsta, atât din punct de vedere chimic (schimbare de entropie), cât și din punctul de vedere al proprietăților mecanice.

2.2.2. Proprietati biologice ale fibrei de colagen

Există un bogat material experimental care demonstrează faptul că forma de colagen exogen aplicat pe răni sporește rata de vindecare și îmbunătațeste proprietățile mecanice ale rănilor. Trebuie ținut seama că fiecare țesut conține o mulțime de enzime care participă la realizarea activității metabolice. În unele țesuturi conjunctive, alături de alte enzime, acționează și colagenaza, enzimă capabilă de a degrada colagenul nativ. În sucul pancreatic se găsește o cantitate foarte mică de colagenază, care în centrul său activ conține un rest de serina.

Colagenazele de țesut sunt metalo-enzime, întrucât sunt inhibate de cisteină care leagă metalele. S-au identificat, în extractele hepatopancreatice de la crab și enzime cu proprietăți intermediare între cele ale colagenazelor din țesut și a celor din pancreas. Colagenaza scindează molecula nativă de colagen în două părți inegale și anume un sfert și trei sferturi din lungimea lanțului moleculei.

Colagenazele bacteriene sunt metalo-enzime, având moleculele de zincul atașat de un rest de histidină în centrul activ; enzima este inhibată prin legarea chelatică a metalului.

Colagenul grăbește vindecarea rănilor printr-o serie de funcții și proprietăți :

Funcția de ghidare;

Proprietăți chemotactice;

Nucleația;

Reutilizarea;

Antigenitatea.

2.3. Surse de colagen

Colagenul, la nivelul tendoanelor se gaseste un procentaj de 25-35%, la nivelul pielii 20-30%, în oase și cartilagii 10-20%, pereții vaselor de sange 5-12%, organele precum inimă, ficat, rinichi 0.5-2%, iar sistemul nervos central reprezentând un procentaj de 0.2-0.4%.

Colagenul fibrilar de tip I, are ca sursă principală de extracție pielea animală,aceasta fiind un țesut conjunctiv dens. Pentru a fi utilizat ca biomaterial, colagenul extras trebuie să aibă structură cât mai apropiată de triplu helix, aceasta fiind principala caracteristică a moleculei de colagen.

Colagenul fibrilar poate fi extras și din tendon și cartilaj, utilizând în principal tratamente enzimatice, dar aceste surse sunt folosite mai mult pentru studii biochimice și biomedicale.

2.3.1. Colagen ca înlocuitor de piele:

Implanturile pe bază de colagen au fost utilizate pe scară largă ca vehicule pentru transportul celulelor analozatorului cutanat sau pentru transportul medicamentelor, pentru procesul de înlocuire al pielii și tratarea rănilor. Colagenul de tipul I este cel mai indicat în procesul de înlouire al pielii datorită rezistenței mecanice și biocompatibilitătii sale.

2.3.2. Colagen utilizat în vivo:

Majoritatea matricilor de colagen utilizate in scopuri clinice sunt realizate prin extragerea colagenului din țesuturi. În procesul de extracție, colagenul si alte proteine sunt denaturate. Acesta este rezultatul reticularii în vivo.

Principala utilizare a colagenului variază pentru fiecare tip de matrice și astfel rezultă diferite proprietăți.

Majoritatea matricilor sunt din materiale compozite având componente sintetice pentru a asigura rezistentă suturilor si rezistență împotriva solicitărilor mecanice apărute la locul de implantare.

2.3.3. Echivalentul colagenului din țesutul dermal

Cele mai utilizate matrici de țesut echivalent sunt pentru înlocuirea pielii. Majoritatea produselor disponibile se bazează pe o plasă fabricată din colagrn fără alte componente principale. Colagenul de obicei este separat de țesuturile simple și în acest proces, colagenul este degradat si denaturat, rezultând pierderea completă a arhitecturii inițiale.

Multe dintre aceste matrici sunt formate din colagen fără alte adaosuri:

Integra este primul substitut de piele aprobat de FDA, format dintr-un silicon elastomer, semi-permeabil, suturabil(polisiloxan, adeziv medical Dow coming silastic), vindecat într-o component de bază realizat dintr-un agent de reticulare degradabil(deshidratare în vid si glutaraldehidă) coprecipitarea colagenului bovin si 8 % sulfat de condroitină. Integra este folosit pentru reconstrucția pielii în două etape, în excizia chirurgicală a leziunilor sau în excizia leziunilor benigne sau maligne. După integrare, care dureaza 2-3 săptămâni, membrana de silicon este îndepartată, iar țesutul nou format este grefat cu o parte de piele. Matricea dispare dupa o lună și nu determină un răspuns imun tranzitoriu.

Alloderm este o matrice dermică decelularizată derivată din piele umana de cadavru prin îndepartarea epidermei cu NaCl si decelularizarea componentei pielii cu sulfat dodecil de sodiu.

Pentru depozitare, matricea dermală acelulară rezultată a fost uscată prin îngheț intr-o soluție crioprotectoare(dextran, taharoză, rafinoză), urmat de un proces de uscare in doua etape. Pentru utilizare matricea dermica este rehidratată cu o soluție salină care se schimbă de doua ori. Studiile clinice au aratat că substitutul de piele este potrivit in cazul arsurilor, testele aratând vascularizare, repopularea celulară și incorporarea in rană.

Dermograft este fabricat prin însamantarea și menținerea fibroblastelor pe plase de Vicryl pentru o perioadă de 2-3 săptămâni până se obține o porțiune de țesut pentru un efect terapeutic. Produsul este aprobat de FDA pentru tratamentul venos, ulcerelor neuropatice și diabetoase.

Produsul este devitalizat prin congelare și este folosit pentru acoperirea temporară pentru arsurile cu grosime parțială și este ejectat spontan de vindecarea ranilor. Acest lucru determina scăderea posibilității de spitalizare comparativ cu tratamentele convenționale, prevenția schimbului pansamentului frecvent și scăderea timpului de închidere a rănilor; matricea ECM conține fibronectină, colagen de tip I, proteoglicani și factori de creștere.

2.3.4. Materiale de umplutură

Zyderm I, introdus in 1977 și aprobat de FDA in 1981, este un preparat injectabil, solubil, implant de colagen bovin prentru tratarea liniilor fine, superficiale. Colagenul acid, solubil este extras din țesut dermic bovin cu acid acetic și este apoi tratat cu pepsină pentru a da colagenului sărac in telopeptide antigenicitate scăzută.

Colagenul este 96% de tip I si 0,4% de tip III, a fost purificat peste 99% și disperat în soluție salină tamponată cu fosfat(PBS) conținand 0,3% clorhidrat de lidocaină având concentrația de 35 mg/ml.

Soluția monomerică de colagen polimerizează spontan la 37ºC. Zyderm II, aprobată in 1883 este similară cu Zyderm I, dar conține 65% mg/ml colagen și este utilizat pentru tratarea liniilor ușoare până la moderate. Zyderm I si II oferă doar un efect clinic de scurtă durată, de 2-3 luni. Zyplast, aprobat de FDA in 1985, este similar cu Zyderm I dar este chimic reticulat cu glutaraldehidă, făcându-l mai puțin sensibil la degradare prin colagenază care mărește rezistența in vivo.

Arteplast, introdus in 1991, este un material injectabil compus din microsfere de 20-40 µm de polimetilmetacrilat(PMMA), suspendat într-o soluție de colagen denaturat. Din cauza problemelor legate de compatibilitate, Arteplast a fost înlocuit de Artecoll care conține microsfere de PMMA mai mari(30-50 µm) suspendat în Resoplast. Mai apoi produsul a fost aprobat de FDA în 2006 și comercializate ca

Artefill, material de umplutură permanentă pentru corectarea cutelor de la nivelul nasului.

2.3.5. Colagen porcin

Submucoasa intestinului subțire este derivată din intenstinul subțire de porc. În urma decelularizării, matricea rămasă, formată din colagen in principal și un complex de molecule funcționale și structural, apoi se sterilizează și partea de țesut este gata pentru a fi folosită ca matrice pentru înlocuirea pielii.

Beneficiile decelularizării părții de țesut, păstrând în același timp ultrastructura 3D este imunogenicitatea scăzută care apare atunci când se implantează o matrice și abilitatea corpului de a repopula o astfel de matrice cu celule proprii.

Arhitectura precisă nu poate fi replicate 100% deoarece acțiunea decelularizării și sterilizarea afectează structura de protein, cu toate acestea pentru înlocuirea matricei bogate în țesut această abordare are o importanță particular deoarece unele elemente din țesuturile portante pot fi replicate.

Evolence este format din colagen imersat în soluție tampon cu fosfat de concentrație 35 g/ml.

Colagenul este derivat din pepsină tratată din tendoanele porcilor. Procesul de purificare monomeri de telopeptide săraci în colagen sunt polimerizați și reticulați cu D-riboză. Produsul a fost aprobat de FDA in 2008 pentru tratamentul ridurilor faciale profunde iar efectul durează un an. Riscul unui răspuns de hipersensibilitate este < 0,1 % iar produsul nu necisită testare inițială.

2.3.6. Colagen uman

Sm Cosmoderm, aprobat de FDA in 2003 este format din colagen extras și purificat din culturi de țesut prepuțial fibroblastic uman.

Din moment ce este un produs derivat din corpul uman, nu exista risc de răspuns imun, de aceea pacienții nu sunt testați înainte de procedură. Colagenul este suspendat

în PBS ce conține 0,3% clorhidrat de lidocaină iar produsul este comercializat în concentrații de 35 si 65 mg/ml. O varinată cu o durată de acțiune mai îndelungată este o formă de Cosmoplast, iar pentru o stabilitate mai mare este reticulată cu glutaraldehidă.

Cymetra este un produs de injectare intradermică fiind compusă din Alloderm criofacturat Cymetra este furnizată ca și pulbere uscată prin îngheț cu o dimensiune medie particulei de 123µm și este reconstituit prin rehidratarea in 330mg în 1ml de clorhidrat de lidocaină. Efectul său durează mai mult decât Zyplast dar mai puțin decât Alloderm, datorită suprafeței mai mari.

Autologen este o matrice dermică obținută din piele autologă obținută de la pacient în timpul unei interventii chirurgicale anterioare. Derma este pulverizată mecanic și solubilizează cu modificatori chimici pentru a forma o dispersie predominant nativă, colagen de tip I, părți de colagen de tip III si VI, elastină, fibronectină, condroitin sulfat și proteoglicani. Datorită originii, atât Dermaplast și Autologen nu necesită teste anterioare. Totuși, prezintă dezavantaje, risc de transmitere a bolilor și timpul de procesare de 3-4 săptamâni. Aceste produse nu sunt in prezent disponibile.

2.3.7. Metode de a controla arhitectura colagenului in vivo și vitro stabilirea conformației colagenului: densitate, direcție si diametru

Exista o gamă largă de înlocuitori de colagen, dar pentru a determina funcția țesutului cu colagen va fi nevoie controlul compartimentului si arhitecturii în vitro.

Unele mecanisme au fost inspirate de macanismele în vivo, dar majoritatea sunt derivate din principii inginerești determinate din ințelegerea noastră a proteinei.

Colagenul de tip I este folosit pentru cultura 3D a celulelor, oferind un mediu biomimetic pentru a studia componentele celulare.

Matricile de colagen conțin hidrogeluri de colagen care sunt in principiu formate din apă. Așadar, densitatea acestor matrici nu este adecvată pentru modelarea densitații matricii in țesut.

Aceste matrici, in general sunt utilizate pentru studiul interacțiilor dintre celulă și matrice, celulele fiind capabile să remodeleze matricea în care au fost însamânțate pentru orientarea fibrelor de colagen și pentru a controla alinialinierea celulelor.

În timpul acestui proces matricea este remodelată iar acest lucru duce la pierderea apei din hidrogel, sporind creșterea densității colagenului.

Aceste progrese au fost făcute pentru a crește controlabil densitatea matricilor de colagen necesară controlului comprimării plastice a hidrogelurilor de colagen pentru eliminarea excesului de lichid și pentru creșterea densității de colagen. Această aplicație de comprimare plastică este foarte utilizată pentru modelarea in vitro.

Colagenul fiind o proteină dominantă a majorității țesuturilor din organism trebuie controlată arhitectura și împachetarea fibrilelor de colagen pentru un țesut eficient.

Sunt numeroase matricile de colagen disponibile în prezent, însă pentru utilizarea în vivo ca înlocuitor de piele, ca material de umplutură și structuri vasculare și structuri vasculare artificiale, dar cel mai bun este bazat pe păstrarea arhitecturii colagenul din țesut. Pentru a înțelege cum este modificată această proteină în vivo de către celule, sarcini mecanice și alte proteine, putem aplica această procedură, de a controla arhitectura colagenului.

Acest control trebuie facut fără a compromite viabilitatea celulară, acțiunea și diferențierea celulară adecvată.

2.4. Tehnici de extracție:

2.4.1. Surse de colagen

Pielea este un organ de simț, conjunctiv-epitelial, care acoperă suprafața corpului pe toata întinderea sa, având rol de barieră, de protecție, de eliminare a produșilor toxici și de menținere a temperaturii corpului. În funcție de dimensiunea corpului, pielea are o suprafata de 1,5-2 m și prezintă sensibilitate cutanată, tactilă, doloră și termică.

Pielea are urmatoarele funcții: de protecție, de secreție, de excreție, senzorială, de apărare, homeostazie, imunologică si semipermeabilitate.

La nivelul pielii pot aparea modificări în urma unor boli genetice, boli cauzate de anumiti factori externi(raze UV, temperaturi prea scăzute sau prea ridicate) traumatisme, accidente. Aceste modificări pot duce la infectarea sau pierderea țesutului dacă nu sunt remediate la timp. În acest sens se apelează la medicina regenerativă care are rolul de a restabili funcția normală a unui țesut prin regenerarea sau înlocuirea acestuia. În cazul în care este nevoie de înlocuirea unui țesut care este afectat sau care este absent cele mai bune rezultate în medicina regenerativă se obțin în cazul în care se utilizează biomaterialele naturale, din organismul propriu, însa trebuie să ținem cont de locul, dimensiunea țesutului afectat astfel încat timpul de vindecare și gradul de discomfort să fie cât mai mic.

Pielea prezinta trei straturi: epidermal, dermul și hipodermul

Epidermul este stratul extern, prezintă un epiteliu stratificat, celula fiind mereu in proces de regenerare. Este stratificat, celula fiind mereu in proces de regenerare. Este lipsit de nervi și de vase de sânge, nutriția fiind realizată prin difuziunea limfei din derm prin membrana bazală.

Dermul este un strat conjunctiv fibros rezistent, cu origine mezodermica, fiind separat de epidem prin membrana bazală. Dermul prezinta doua straturi, papilar și stratul profund, reticular. La nivelul dermului avem glande sebacee, fibre elastice, fibre de colagen si fibre musculare netede. În stratul reticular se gasesc și leucocite și elemente ce dau pielii funcția de organ hematopoetic.

Hipodermul este alcatuit din fibre conjunctive, tesut adipos cu rol de nutriție, izolator termic si mecanic.

Fig. 1. Straturile pielii[1]

Vascularizația pielii: reprezinta 10% din debitul cardiac. Pielea prezintă arteriole, capilare, venule și vase limfatice.

Inervatia cutanată: aici se gasesc receptori pentru tact, temperatură, durere, reglarea funcțiilor vasomotorii și secreția glandulară.

Pielea are urmatoarele funcții: de protecție, de secreție, de excreție, senzorială, de apărare, homeostazie, imunologică si semipermeabilitate

Colagenul se găseste sub diferite forme în pielea animalelor în funcție de anumiți factori precum: specie, vârsta, țesut, cu o repartiție de 25-35% în tendoane, 20-30% în piele, 10-20% în oase și cartilaje iar în sistemul nervos central în proporție de 0,2-0,45%.

Sunt prezentate urmatoarele surse de proteine colagenice în funcție de prelucrarea chimică la care pot fi supuse:

Din aceste surse se poate extrage colagen sub formă de geluri(colagen denaturat), gelatină(colagen denaturat parțial), polipeptide și aminoacizi(hidrolizat).

Colagenul de tipul I are ca sursa de extracție pielea animală și prezintă aplicații în domeniul medical și cosmetic.

Colagenul fibrilar poate fi extras atât din tendon cât și din cartilaj prin metode enzimatice având aplicații în domeniul biochimic și biomedical.

Colagenul de tipul IV poate fi extras din placentă fiind utilizat în industria cosmetică și farmaceutică.

Prelucrarea deșeurilor de piei se poate face prin:

Prelucrarea chimică prin hidroliză

Prelucrare mecanică

Prelucrarea chimică presupune sortarea, mărunțirea și hidroliza în mediul acid sau alcalin, la 120ºC, presiune 2 atm, timp de 4-6 ore.

Prelucrarea mecanică se realizează prin măcinare în mediu acid uscat și umed, realizand fibre și pudre fibroase.

2.4.2. Metode de extracție a colagenului din pielea animală

Sunt diverse metode de obținere a colagenului cea mai veche fiind reprezentată de fierberea țesuturilor în apă, denaturând astfel colagenul rezultând gelatin. Pentru a putea fi utilizat ca biomaterial, colagenul trebuie să prezinte o stare asemanatoare cu cea din organism, astfel metodele de extracție se împart în doua grupe:

TECN- tehnică de extracție a colagenului în stare nedenaturată, obtinându-se 70% macromolecule de colagen nedenaturat(nu iși schimba structura elicoidală).

TECD-tehnica de extracție a colagenului în stare denaturată, obtinându-se 90% molecule denaturate.

Tehnologii de extracție a gelurilor de colagen

Presupune o serie de procese chimice, biochimice care sunt realizate prin mai multe procedee în funcție de aplicațiile pentru care sunt realizate.

2.5. Biomaterialele pe bază de colagen

Biomaterialele joacă un rol important în succesul unui dispozitiv medical și în dezvoltarea ingineriei tisulare având rol în restabilirea funcției normale corporale. http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S175161611630114X

Biocompatibilitatea materialelor reprezintă proprietatea de a înlocui funcția sau țesutul ce urmează a fi înlocuit fără a da un răspuns imun și fără a afecta țesutul înconjurător. Biocompatibilitatea depinde de locul implantării, de tipul si dimensiunea defectului, de compoziția si structura materialului si de tipurile de interacții dintre material si țesutul gazdă. Este foarte importantă in cazul implanturilor permanente sau cele de lungă durată(implanturi cardiace, stomatologice, materiale de umplere a defectelor, ortopedice, vasculare) dar și pentru cele temporare precum cateterele. Un biomaterial, înainte de a fi implantat este supus mai multor teste pentru a elimina posibilitatea respingerii de catre organism sau posibilitatea infectării care poate duce la necrozarea țesutului respectiv. Așadar, se fac teste biologice: teste de citotoxicitate(in vivo/vitro), teste de imunitate(ELISA), toxicitate, compatibilitate, genotoxicitate(indica numărul de aberații cromozomiale).

Fig. 2. Reprezentarea schematică a biomaterialelor utilizate in medicina regenerativă[2]

Biomaterialele pe baza de colagen și violet de gențiană sunt studiate intens datorită proprietăților antimicrobiene și de biocompatibilitate.

Biomaterialele pe bază de colagen pot fi obținute prin două tehnici:

Prima este o matrice de colagen decelularizată păstrandu-se forma originală și structura ECM. A doua tehnică constă in extracția, purificarea și polimerizarea colagenului și a componentelor sale pentru a forma matrici funcționale.

Ambele tehnici au fost supuse unor metode diverse de reticulare care se aplică în formarea matricei colagenice acelulare sau ECM.

Gilbert Sellaro și Badzlak au avut în vedere trei metode de decelularizare a pielii: fizice, chimice si enzimatice.

Metodele fizice implică procesul de congelare care perturbă celulele prin formarea cristalelor de gheață, presiunea mare care sparge celulele si procesul de agitare care induce liza celulară iar cele mai des utilizate în combinație cu metodele chimice pentru a facilita patrunderea moleculelor active în țesut.

Metodele chimice includ o varietate de reactivi ce pot fi utilizați pentru a elimina conținutul celular al ECM. Pot fi tratamente alcaline, cu agenți precum EDTA, detergenți ionici sau neionici și soluții de osmolaritate. Tratamentele enzimatice precum utilizarea tripsinei care scindează specific proteinele și nucleazele care elimină ADN si ARN-ul sunt utilizate frecvent în producerea matricilor acelulare. Cu toate acestea, nici una dintre aceste metode nu pot produce ECM lipsită de resturi celulare și sunt necesare tehnici specifice pentru a obține un astfet de material.

Un alt tip de biomaterial se obține prin prelucrarea unei soluții de colagen cu alti biocompuși precum glicozaminoglicani, elastină sau chitosan.

Pentru producerea biomaterialelor s-au dezvoltat mai multe tipuri de extracție a colagenului din țesuturi biologice.

Metodele de extracție se bazeaza pe urmatoarele principii: extracție in soluție de acid, extracție in soluție de săruri neutre și în soluție proteolitică- Extracția proteolitică alterează structura moleculară a colagenuluiprin clivarea regiunilor telopeptidice terminale rezultand o scădere a fibrilelor de tropocolagen. Pentru a evita acest lucru proteze endogene pot fi îmbibate in timpul solubilizarii acidului.

Moleculele de colagen sunt formate din trei lanțuri α care sunt asamblate împreună datorită structurii moleculare. Fiecare lanț α este format din mai bine de o mie de aminoacizi ce se bazează pe secvența GLY-X-Y. Prezența glicinei este esențială la fiecare trei poziții aminoacide pentru a permite o împachetare strânsă a celor trei lanțuri α în moleculele de tropocolagen și pozițiile X și Y sunt în mare parte ocupate de prolină și hidroxiprolină.

Sunt aproximativ 25 de conformații diferite de lanțuri α, fiecare producând o genă unică. Combinarea acestor lanțuri, în seturi de câte trei, sunt asamblate pentru a forma cele 29 de tipuri de colagen până în prezent cunoscute.

Catena pro α este sintetizată de ARN mesager unic în Reticulul Endoplasmatic Rugos și este transferat la Aparatul Golgi al celulei.

În timpul transferului, unele proline si lisine sunt hidrolizate de enzima lisin oxidază. Lisinele specific sunt glicolozate și apoi lanturile α sunt autoasamblate în procolagen înainte de incapsularea lor în vezicule excretorii. În urma trecerii lor prin membrane plasmatică, propeptidele sunt scindate în afara celulei pentru a permite auto-poliemrizarea de către telopeptide. Aceste fibrile de colagen sunt cele mai utilizate în formarea biomaterialelor pe bază de colagen.

A B C D

Fig. 4. A-Schematizarea unui segment triplu helix a lanțului α

B-Molecule de tropocolagen asamblate

C-Fibrile de colagen cu diametru intre 10-300 nm

D-Fibre de colagen agregate formând fibre de colagen cu diametrul între 0,5-3 µm.[5]

Capitolul 3. Aplicații ale colagenului

Aplicații ale colagenului în medicina regenerativă:

Chirurgie generală

Dermatologie

Stomatologie

Oftalmologie

COLAGEN Chirurgie cardiovasculară

Ortropedie

Neurochirurgie

Chirurgie abdominală si toracică

Otologie

Urologie

Livrarea controlată a medicamentelor

3.1. Colagenul utilizat în chirurgia generală

În chirurgia generală, colagenul este utilizat pentru obținerea pansamentelor cu rol de absorbție(hemostază). În timpul intervențiilor chirurgicale au loc hemoragii masive care pot duce la deces daca nu sunt controlate la timp. De aceea s-au dezvoltat numeroase metode pentru a stopa hemoragia masivă, iar pansamentele pe bază de colagen s-au dovedit a fi benefice în acest caz.

3.2. Colagenul utilizat în dermatologie

În dermatologie, colagenul este folosit pentru umplerea ridurilor sau a urmelor lăsate de acne prin injectarea acestuia subcutanat. Avantajul acestei terapii este că nu necesită intervenții chirurgicale și timpul de refacere este foarte scurt.

3.2. Colagenul utilizat în stomatologie

În stomatologie este folosit pentru pansarea și inchiderea rănilor acolo unde a avut loc extracția unuia sau mai multor dinți, pentru vindecarea locului respectiv, pentru cuagularea sângelui, hemostază, umplerea defectelor din os și a ligamentelor din jurul osului. Este folosit și în paradontoză, unde are loc retragerea gingiei urmată de pierderea dinților, colagenul având rolul de a ancora țesutul dur în gingie.

3.3 Colagenul utilizat în oftalmologie

În oftalmologie, se utilizează colagen pentru transplantul de cornee, lentile, fibre de sutură, iar cea mai utilizată aplicație este eliberarea medicamentelor înglobate în lentile din colagen pentru tratarea anumitor afecțiuni de la nivelul ochiului. Deasemenea se utilizează și pentru fabricarea unor membrane subțiri, protectoare care sunt aplicate pe ochi, asigurând schimbul de oxigen după care se degradează dând umiditate ochiului.

3.4. Colagenul utilizat în chirurgia cardiovasculară

În chirurgia cardiovasculară, este folosit colagen împreună cu antimicrobieni pentru a elimina posibilitatea infectării rănilor la inchiderea sternului. Deasemenea, se folosesc grefe cardiovasculare, materiale ce conțin celule autologe însămânțate cu celule care au rolul de asubstitui țesutul afectat.

3.5. Colagenul utilizat în ortopedie

În ortopedie este utilizat ca substituient de os, grefă osoasă, umplerea defectelor osoase, fixarea implanturilor, creșterea morfoproteinelor iar împreună hidroxiapatita prezintă proprietăți de osteoinducție deci poate fi folosit cu success în înlocuirea osului.

3.6. Colagenul utilizat în neurochirurgie

Seckel (1990), a reprezentat o tehnică prin care extremitățile nervului periferic rupt au fost poziționate la o anumită distanță într-un tub umplut cu lichide serice cu o activitate neurotrofică. În locul respectiv se acumulează precursori de matrice extracelulară și acționează ca un schelet pentru migrarea celulelor între cele două margini ale nervului conducand în cele din urmă, după două săptămâni, la formarea unui țesut și mai apoi la regenerarea nervului.

3.7. Colagenul utilizat în chirurgia abdominală și cea toracică

În chirurgia abdominală și toracică, biomaterialele pe baza de colagen se folosesc în cazul herniilor pentru refacerea sau întărirea peretelui abdominal. Inițial se utilizau alte materiale, mai apoi plasele din oțel sau tantal și plase din fibre sintetice. Fibrele sintetice

au prezentat fenomene de respingere și chiar de evacuare prin piele, de aceea s-a încercat acoperirea plaselor cu gel de colagen având rol de barieră între organism și fibrele sintetice.

3.8. Colagenul utilizat în otologie

Salen și Simbach au excizat timpanul la pisici și l-au înlocuit cu o membrană de colagen. După o săptămână membrana s-a îngroșat și a devenit opacă. În 10 zile s-a observat o vascularizare și apariția unui țesut granular, iar după 3 săptămâni epitelizarea era completă. La 5-8 săptămâni zonele periferice aveau aspectul unui timpan normal.[45]

3.9. Colagenul utilizat în urologie

În urologie, se injectează colagen la nivelul vezicii urinare, în caz de incontinența urinară. Este un tratament ce se repetă periodic, durează câteva minute și se face sub anestezie generală. Practic colagenul dă elasticitate vezicii urinare pentru a asigura procesele normale alea sfincterului dar are și rol în cresterea celulelor și vascularizația țesutului.

3.10. Colagenul utilizat în livrarea controlata a medicamentelor

Dispozitivele de livrare controlată de medicamente sunt utilizate pentru cedarea substanțelor bioactive în organism, în funcție de efectul dorit. În funcție de aplicația dorită, agenții bioactivi care sunt aleși pentru eliberare se vor combina cu diverși polimeri. În acest mecanism de cedare a medicamentelor este important atât răspunsul organismului la medicament cât și modul de cedare.

Ca și aplicații, aceste dispozitive au fost utilizate cu succes in oftalmologie, în tratarea cancerului sau în transportul antibioticelor.

[1] http://beautyflame.ro/wp-content/uploads/2013/05/epiderma.jpg

[2] http://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S0079670015000386-gr1.jpg

[3] http://www.proto-col.com/blog/wp-content/uploads/2014/07/COLLAGEN-DIAGRAM.jpg

[4] Jerome and Ramshaw, 1992; Rao, 1995; Friess, 1998; Fujioka et al., 1998; Maeda et al., 1999

[5] Materials 2010, 3, 1863-1887; doi:10.3390/ma3031863, Rémi Parenteau-Bareil 1,2, Robert Gauvin 1,2 and François Berthod 1,2,*

[6]http://chimedu1.wikispaces.com/file/view/formula_aminoacizi.PNG

[7] [45]Tanner, J.C., Marcucci, M.A., Bradley, W.H., Morgan, J.W., J. Urol., 1968, 99, 710.