I. Morfogeneza dentară 7 [302994]

CUPRINS

Introducere 5

I. Morfogeneza dentară 7

A. [anonimizat] 7

B. Formarea și dezvoltarea sistemului dentar 7

1. Histodiferențierea la nivelul organului adamantin 9

2. Histodiferențierea la nivelul papilei dentare 10

3. Histodiferențierea la nivelul sacului dentar 10

C. Amelogeneza. Dentinogeneza. Cementogeneza 11

1. Formarea dentinei 12

2. Mantaua dentinară 12

3. Formarea dentinei circumpulpare 12

4. Dentina peritubulară 13

5. Cementogeneza 13

II. Histologia pulpei dentare 14

A. Histoarhitectonica pulpară 14

B. Teritorii celulare în arhitectonica pulpei dentare 14

1. Zona odontoblaștilor 15

2. [anonimizat] 15

3. Zona bogată în celule 15

4. [anonimizat]-zisă 15

C. Celulele pulpei dentare 16

1. Odontoblastul – structură 16

2. Fibroblastul 17

3. [anonimizat], limfocitul, [anonimizat] 18

D. [anonimizat]: proteoglicani, glicoproteine, fibronectina 20

E. [anonimizat]: [anonimizat], fibrele de elastină 21

F. Circulația pulpară 21

1. Arteriolele pulpare. Capilarele pulpare. Venulele pulpare. Limfaticele pulpare 21

2. Pericitele 23

G. Inervația pulpei dentare. Plexul Raschkow. Plexul Bradlaw 27

III. Celulele si nișele stem adulte 29

A. Ciclul celular 29

1. Celula – definiție, structură și morfologie 29

B. Celulele stem și celulele progenitoare. Nișele stem pulpare. 30

1. Celulele stem embrionare. 34

2. Celulele stem adulte 35

3. Celulele stem hematopoietice 36

C. Funcțiile celulelor stem și caracteristicile acestora 38

1. Potența celulară 38

2. Celulele stem mezenchimale: [anonimizat] 40

3. Potențialul de diferențiere al celulelor stem mezenchimale 41

4. Condrogeneza. Osteogeneza. Miogeneza. Tendogeneza. Adipogeneza 41

D. Surse de celule stem de la nivelul feței 43

1. Celule stem de origine conjunctivă 44

2. Celulele stem de la nivelul ligamentului periodontal 45

3. Celulele stem de la nivelul mucoasei orale 46

4. [anonimizat]: dintele ca model 46

IV. Material și metodă de studiu 47

A. Material biologic 47

B. Metoda de prelevare a țesuturilor 47

C. Metoda imunohistochimică 47

1. Pregătirea lamelor de microscopie 47

2. Anticorpii primari utilizați 48

3. Metoda imunohistochimică 48

4. Documentarea rezultatelor 49

V. Rezultate 50

VI. Discuții 60

A. Întrebuințări ale celulelor stem 61

B. Celulele stem orale 62

C. Nișa stem a pulpei dentare 64

1. Caracteristici ultrastructurale și imunofenotipice ale celulelor stem 64

D. Studiu comparativ între două subpopulații stem utilizând markerii CD3, STRO-1 și c-kit 70

E. Utilizările celulelor stem de la nivelul pulpei dentare. Medicina regenerativă și ingineria tisulară 76

Concluzii 79

Bibliografie 80

Index de figuri în text 83

[anonimizat]: celulele stem și proprietățile regenerative ale acestora.

Celulele stem reprezintă o populație de celule heterogene care se găsesc în aproape toate țesuturile organismului uman: [anonimizat], ficat, [anonimizat], [anonimizat], [anonimizat]. Aceste celule au atras atenția cercetătorilor datorită proprietăților pe care le posedă și anume: potențial de diferențiere în alte tipuri celulare și capacitate de auto-reînnoire.

În ultimii 100 de ani s-au făcut eforturi masive în a înțelege mecanismele biochimice, moleculare și morfologice ale celulelor stem și se mai fac și în prezent, deoarece aceste celule pot oferi o sursă valoroasă pentru numeroase tratamente medicale în medicina regenerativă. În fiecare țesut menționat mai sus există o nișă de celule stem, un mediu ideal în care celulele stem își au reședința.

O serie de populații celulare stem au fost izolate de la nivelul țesuturilor orale: pulpa dentară, dinți incluși, ligament periodontal, sac folicular, delta apicală, glande salivare ceea ce face ca aceste celule stem să fie atractive, atât prin proprietățile pe care le posedă, cât și pentru accesul facil la sursă.

În medicina dentară, diferențierea celulelor stem în alte tipuri celulare, inclusiv osteoblaste, condrocite, adipocite, celule musculare le face să fie deosebit de atractive pentru folosirea în regenerarea parodonțiului, corectarea defectelor osoase maxilo-faciale, pentru refacerea țesuturilor dentare afectate cum ar fi dentina, ligamentul periodontal și pulpa dentară. Endodonția regenerativă reprezintă o nouă modalitate de tratament, care urmărește restabilirea vitalității pulpei dentare și continuarea dezvoltării rădăcinii pe baza celulelor stem. Prin tehnici de bioinginerie medicală, în laborator s-a putut realiza un germene dentar care poate să genereze un dinte corect structurat ce poate îndeplini cu succes după transplantarea în cavitatea bucală toate funcțiile fiziologice normale. În afara utilizărilor în sfera stomatologică, pe baza celulelor stem se pot genera și alte celule din organism cum ar fi hepatocite, precursori neuronali, epiteliu cornean, celule pancreatice etc.

Celulele stem dentare oferă oportunități imense de exploatare în medicina regenerativă și de aceea este nevoie de studii pe termen lung care să evalueze diferitele populații de celele stem orale pentru a se folosi în contexte clinice specifice.

Scopul acestui studiu a fost de a explora imunohistochimic pulpa dentară adultă, pentru a obține date fundamentale asupra potențialului stem/progenitor la acest nivel.

Aduc mulțumiri Dl. Prof. Dr. Med. Dr. Biol. Dr. Hab. Mugurel Constantin Rusu pentru suportul acordat în interpretarea rezultatelor și coordonarea Lucrării mele de Licență.

Morfogeneza dentară

Formarea și dezvoltarea aparatului dento-maxilar

În urma unirii celor doi gameți, masculin și feminin, rezultă oul-zigotul. În primele faze, diviziunea zigotului se va face prin segmentație totală și egală, apoi prin segmentație totală, dar inegală. Prin diviziunea succesivă, crește numărul de celule, apare o specializare structurală și funcțională a acestora, cu apariția în final de țesuturi, organe, aparate și sisteme, acestea alcătuind unitatea morfofuncțională – organismul uman 1.

Între săptămânile 3 și 8 de viață intrauterină are loc dezvoltarea structurală a capului și gâtului, din cele 5 perechi de arcuri faringiene, ce apar din ziua 22 aproximativ și reprezintă baza embriologică a diferențierii tuturor structurilor capului și gâtului. Fiecare arc va conține artera sa proprie, nervul său, o bară cartilaginoasă (scheletul arcului faringian) și un blastem muscular striat 1.

Arcurile branhiale sunt numerotate de la 1 la 6 în sens cranio-caudal. Primul arc branhial, arcul mandibular dă naștere mandibulei în totalitate, maxilarului, cea mai mare parte a lui și parților moi ale aparatului dento-maxilar. Arcul 2 – hioidian și arcul 3 – tiroidian, dau naștere părților moi și scheletului anterior al gâtului. Arcurile 4, 5 și 6 formează părțile inferioare ale gâtului și părțile superioare ale toracelui 1.

Formarea și dezvoltarea sistemului dentar

În cursul dezvoltării sale, organul dentar trece printr-o succesiune de etape, după cum urmează:

1. Creșterea și diferențierea celulară, ce cuprinde: proliferarea epitelială, diferențierea tisulară, organogeneza (diferențierea morfologică)

2. Mineralizarea țesuturilor dentare;

3. Erupția dentară, însoțită de creșterea radiculară;

4. Uzura dentară și atrofia orizontală a parodonțiului.

Din punct de vedere al dentației, omul este difiodont, adică prezintă 2 seturi de dinți: dentiția primară (dinții temporari, deciduali sau de lapte) și dentiția secundară (dinții permanenți, sau definitivi). Fiecare arcadă conține câte 10 dinți temporari: incisiv central, incisiv lateral, canin, molar prim și molar secund. Acestora le succed dinți definitivi: incisivii, caninii și premolarii (dinți succesionali) în timp ce molarii definitivi nu au precursori pe arcadă (dinți accesionali). Dinții accesionali (molarul 1, molarul 2 și molarul 3) apar distal de dinții arcadei temporare 2. Dezvoltarea dintelui și a structurii sale de suport urmează o schemă generală, comună, dar care nu respectă aceeași cronologie pentru toți dinții (grupele dentare se dezvoltă într-o anumită perioadă de timp, specifică grupei respective). Formarea dinților este un proces de lungă durată care începe din săptămâna 6, dar se încheie după naștere, în jurul vârstei de 14 – 15 ani, odată cu formarea apexului molarului de 12 ani. Fiind un proces lung, procesul de odontogeneză poate fi afectat de factori de mediu și se pot produce astfel anomalii de dezvoltare dentară 1.

Dezvoltarea dinților începe printr-o fază de proliferare din saptămâna a 6-a de viață intrauterină, când celulele mucoasei stomodeumului suferă o intensă multiplicare, dând naștere lamei dentare primare, viitorul organ odontogen. Din lama dentară primitivă vor lua naștere dinții temporari. Apoi, printr-o proliferare în interior și în profunzime față de ea însăși, va da naștere lamei dentare secundare, din care se vor forma, începand cu săptămâna 20, mugurii dinților de înlocuire, implicit dentiția secundară 1.

Partea profundă a lamei dentare, de la nivelul unor centri ectodermali proliferează selectiv în zece locuri ce vor căpăta aspect bulbos, zece formațiuni rotund – ovalare, mugurii dinților temporari, aceasta fiind prima formă de reprezentare a odontonului. Procesul de proliferare al mugurilor nu este simultan pentru toți dinții ci începe dinspre anterior spre posterior, între săptămânile 6 – 8. Mugurii incisivilor și caninilor se dezvoltă aproximativ la sfârșitul săptămânii 7, mugurii molarilor primi – în săptămâna 8, iar mugurii molarilor secunzi în săptămâna 10 2.

Mugurii dinților permanenți se vor forma mai târziu, cu diferențe cronologice între formarea mugurilor permanenți ai dinților succesionali și cei ai dinților accesionali. Mugurii dinților succesionali provin dintr-o prelungire linguală a lamei dentare, și evoluează din luna 5 de viață intrauterină, în sens antero-posterior, până în luna 10 postnatal. Mugurii dinților accesionali se formează din prelungirea distală a lamei dentare (mugurele M1 apare în luna 4 de viață intrauterină, mugurele M2 apare postnatal, după unii autori la 4 luni, după alți autori în primul an, iar mugurele M3 apare aproximativ la 4 ani după naștere). În cursul evoluției morfologice, odontonul trece prin urmatoarele stadii: inițial mugure dentar, cupă dentară și în final, clopot dentar 3.

În linii mari, succesiunea fazelor este identică pentru toți dinții, atât pentru cei temporari, cât și pentru cei definitivi, particularitățile fiind legate în special de forma viitoarei coroane și de numărul rădăcinilor 1.

În săptămâna a 8-a, prin invadare mezenchimală, mugurele dentar va da naștere papilei dentare, ce va fi acoperită de componenta ectodermală, sub forma unei cupe. Pe măsură ce cupele cresc dimensional, se vor apropia de lama dentară, scurtându-se distanța față de acestea. În cursul săptămânilor 8-12, cupa va lua forma de clopot, papila delimitându-se clar de mezenchimul adiacent. În stadiul de clopot celulele ectodermale se diferențiază între ele, cele de la nivelul convexității clopotului se aplatizează și vor forma epiteliul adamantin extern, iar celulele de la nivelul concavității clopotului capătă formă cilindrică și vor forma epiteliul adamantin intern 1.

Etapele de histodiferențiere și proliferare se suprapun, făcând ca în stadiile de cupă și clopot să poată fi decelate 3 populații celulare: epitelial – ectodermală (va forma organul adamantin), ectomezenchim condensat sub forma papilei dentare, în interiorul cupei / clopotului și ectomezenchim de înveliș al primelor două structuri histologice, ce constituie sacul dentar sau folicular. Ectodermul va evolua în continuare către formarea smalțului, în timp ce din ectomezenchim vor deriva toate celelalte structuri ale dintelui și aparatului de suport al acestuia 1.

Histodiferențierea la nivelul organului adamantin

Organul adamantin cuprinde de la periferie spre interior 4 straturi: epiteliul adamantin extern, epiteliul adamantin intern, reticulul stelat și stratul intermediar. Locul de unire al EAE și EAI este reprezentat de bucla cervicală, cu rol de protecție pentru organul smalțului. Celulele EAE au morfologie neuniformă: celulele epiteliale încă nediferențiate în ameloblaste sunt cuboidale sau prismatice, iar cele de la nivelul ameloblastelor sunt aplatizate și cu dispoziție neregulată. 1,3

Celulele stratului reticular au formă stelată, cu prelungiri citoplasmatice lungi și dau volumul organului adamantin. Stratul intermediar conține celule dispuse pe 3-4 straturi, așezate direct pe celulele EAI. Epiteliul adamantin intern cuprinde celule cilindrice, cu nuclei ovalari și organite dispersate în citoplasmă, așezate pe un singur rând. Din EAI se vor diferenția ameloblastele (adamantoblastele) 1.

După proliferarea și configurarea celor 4 straturi ale organului adamantin se prefigurează doar o mică porțiune, incizală sau ocluzală a viitoarei coroane dentare. Creșterea continuă, formarea smalțului si a dentinei avansează apical, organul adamantin se mărește formându-se coroana dentară 3.

Histodiferențierea la nivelul papilei dentare

În stadiul de clopot dentar, celulele ectomezenchimale se vor dispune sub forma unui strat de celule alungite în aproprierea membranei bazale care le separă de epiteliul adamantin intern. Între celulele acestui strat și membrana bazală rămâne un spațiu acelular ce va facilita creșterea în înălțime ulterioară a celulelor. Aceste celule vor da naștere ulterior dentinei coronare. Celulele miezului mezenchimal al papilei dentare sunt responsabile de formarea pulpei dentare 1 4.

Histodiferențierea la nivelul sacului dentar

Sacul folicular, de origine ectomezenchimală, înconjoară mugurele dentar și cupa dentară. Concomitent histodiferențiererii organului adamantin și papilei dentare, celulele sacului folicular devin mai concentrate și separă papila dentară de o zona mezenchimală nediferențiată, mai laxă 1.

Celulele nediferențiate ale sacului folicular vor da naștere cemetoblaștilor (care vor realiza procesul de cementogeneză), osteoblaștilor, care vor forma osul alveolar, iar fibroblaștii vor realiza formarea ligamentului dentoalveolar 1.

Organul adamantin, papila dentară și sacul dentar sunt componente esențiale ale formării dintelui și aparatului său de susținere. În lipsa oricăruia dintre cele trei elemente s-ar produce dezechilibre, cu afectarea ulterioară a dintelui 1.

Amelogeneza. Dentinogeneza. Cementogeneza

După epuizarea celor două stadii principale ale histodiferențierii: formarea ameloblastelor si a odontoblastelor, urmează ultimele două și anume: formarea dentinei și formarea smalțului 1.

Deși ameloblastele preced apariția odontoblastelor, în ceea ce privește diferențierea celulară raportul se inversează, formându-se în primul rând dentină, iar după ce aceasta a atins o anumită dimensiune se va forma și smalțul. Această etapă constă în formarea tramei organice – matricea organică și ulterior în depunerea sărurilor- mineralizarea. Amelogeneza își are debutul la nivelul marginii incizale sau a vârfului cuspidian al viitorului dinte, după ce, în urma morfodiferențierii, joncțiunea amelodentinară a prefigurat forma dintelui. În prima fază are loc diferențierea citologică a ameloblastelor, unde celulele epiteliale interne își pierd potențialul mitotic, devin preameloblaste, iar acestea la rândul lor suferă modificări ce le dau în final potențial secretor, devenind ameloblaste. Urmează a doua fază, cea de mineralizare a matricei primare a smalțului, fază ce începe de la marginea incizală/vârful cuspidului și se continuă spre colet, iar subiacent acestui strat există deja strat de predentină mineralizată. În matricea secretată de ameloblaste apar nuclee de cristale de apatită, care ulterior încep să se încarce cu săruri minerale de tipul hidroxi-/fluoro-/carbon-apatită, cristale dispuse regulat, perpendicular pe membrana ameloblastului sau a procesului Tomes. În momentul formării complete a coroanei, prin depunerea succesivă a straturilor de smalț, pulpa acestuia se reduce în dimensiuni, epiteliul adamantin intern se alipește cu epiteliul adamantin extern, rezultând cuticula Nasmith, fără a cărui protecție smalțul ar fi supus resorbției 1.

Formarea dentinei

Morfogeneza dentinei se realizează similar la nivelul coroanei și a rădăcinii. La nivel radicular, pe lângă formarea dentinei radiculare are loc și formarea aparatului de susținere al dintelui 1, 5.

Odontoblastele, celulele răspunzătoare de formarea dentinei vor sintetiza colagen de tip I, glicoproteine si glicozaminoglicani, rezultând un produs primar – predentina. Astfel, formarea dentinei începe cu secreția predentinei și mineralizarea ulterioară a acesteia 1.

Topografic, predentina apare inițial la nivelul marginilor incizale sau la nivelul vârfului cuspizilor; deoarece formarea odontoblastelor înaintează în direcție apicală, și depunerea matricii organice va avansa la fel. În timp ce frontul de predentină înaintează apical, dentina se îngroașă coronar. Pe parcursul formării dentinei, la nivelul celulelor mezenchimale răspunzătoare de proces au loc modificări: diferențierea celulelor mezenchimale în preodontoblaste, preodontoblastele devin ulterior odontoblaste tinere, ca în final să aibă loc diferențierea odontoblastelor tinere în odontoblaste mature 1, 5.

Mantaua dentinară

Dentina dispusă la perfierie poartă numele de manta dentinară și se formează printr-un mecanism diferit de cel implicat în formarea dentinei circumpulpare. Mantaua dentinară reprezintă un strat de 10 – 30 μm dispus sub joncțiunea amelodentinară. În rest, în jurul camerei pulpare, se găsește dentină circumpulpară 6.

Formarea dentinei circumpulpare

Între spațiul pulpar și mantaua dentinară se află dentina circumpulpară produsă exclusiv de odontoblastele mature. Dentina circumpulpară apare după formarea mantalei dentinare 6. La nivelul predentinei circumpulpare se găsesc fibrile β de colagen și substanță fundamentală mucopolizaharidică, dispuse perpendicular față de procesele odontoblastice.

Pentru a se mineraliza, matricea dentinară trebuie să parcurgă mai multe etape (transformarea stratificată a predentinei, maturarea predentinei), în care au loc reacții histochimice diferite. În timpul acestui proces se formează predentină crudă, predentină tânără și în final predentină matură, mineralizabilă 1.

Dentina peritubulară

La nivelul dentinei există spații tubulare la nivelul cărora se vor plasa procesele odontoblastice și terminațiile nervoase. Dentina peritubulară este formată prin mineralizarea organică a matricei, produsă de odontoblaste, proces ce se desfășoară rapid, omogen, de către cristalele de hidroxiapatită 1.

Cementogeneza

Prin proliferarea celulelor ectomezenchimale ia naștere o parte a cementului radicular. Cementoblastele, celulele responsabile de procesul de cementogeneză sunt asemănătoare odontoblastelor și sunt localizate doar la joncțiunea dintre suprafața dentară și ligamentul periodontal. Ele produc un reticul matricial fin și fibrile de colagen. Cementoblastele sunt dispuse în contact cu peretele dentinar, sub forma unui singur rând celular, configurând astfel cementul celular și fibrilar intrinsec. Fibrele lui Sharpey, fibre scurte de colagen orientate perpendiculat pe matricea odontoblastică, reprezintă precursorul cementului acelular sau a cementului fibrilar extrinsec 1.

La fel ca în cazul dentinei, cementul continuă să fie depus și după terminarea creșterii dintelui.

Histologia pulpei dentare

Histoarhitectonica pulpară

Pulpa dentară reprezintă componenta centrală a dintelui și este constituită dintr-un țesut conjunctiv moale, lax, nemineralizat, bine vascularizat și inervat. Are multe trăsături comune țesutului conjunctiv: conținutul în apă reprezintă 75% din propria greutate, față de numai 25% componentă organică, cu elemente celulare, fibroblaști înglobați într-o matrice extracelulară, alcătuită din substanță fundamentală și fibre de colagen. Tipul, aranjamentul și structura elementelor pulpei dentare sunt similare atât în dentiția temporară, cât și în cea permanentă 5.

Pulpa dentară ocupă spațiul pulpar și este împărțită în două compartimente individualizate: porțiunea coronară, denumită cameră pulpară, pulpă coronară și porțiunea radiculară, denumită canal radicular, pulpă radiculară 1.

Organul pulpar este înconjurat de dentină, țesut dur, mineralizat, care are rol de protecție și de susținere spațială. Deși ritmul de formare al dentinei primare este unul rapid, formarea dentinei secundare este mai lentă, procesul continuând atât timp cât pulpa își menține vitalitatea 1.

Printre funcțiile pulpei dentare se numără: funcția inductivă – cu formarea organului smalțului; funcția formativă, cu rol în formarea dentinei; asigură nutriția și protecția pulpei dentare prin limfa dentinară ce irigă canaliculele dentinare și prin inervația ce răspunde stimulilor negativi prin procese vasomotorii. O altă funcție a pulpei dentare este cea imunologică, activată de procesele inflamatorii, procese patologice 6, 5.

Teritorii celulare în arhitectonica pulpei dentare

De la periferie spre centru se descriu patru zone: zona odontoblastică; zona acelulară Weil (stratul subodontoblastic); zona bogat celulară și zona centrală, miezul pulpei.

Zona odontoblaștilor

Se localizează la periferia organului pulpar și este reprezentată de un strat de celule, plasat imediat subiacent predentinei și în contact cu aceasta. În pulpa coronară densitatea odontoblaștilor este maximă, atingând 30 000-75 000/mm2. În aproprierea coletului și mai ales la nivel radicular, densitatea odontoblaștilor se reduce. Această zonă este formată preponderent din corpurile odontoblaștilor, vase capilare și terminații nervoase libere 6.

Zona săracă în celule – acelulară

Această zonă este denumită și stratul bazal Weil. Este plasată imediat subiacent odontoblaștilor, cu localizare predominant în pulpa coronară, lipsind de obicei în pulpa radiculară. În această zonă celulele lipsesc, este traversată de numeroase prelungiri ale fibroblaștilor provenite din zona pulpară subiacentă și conține un plex capilar și fibre nervoase amielinice, care alcătuiesc plexul Raschkow 6.

Zona bogată în celule

Această zonă poartă și numele de zona Hohl și este delimitată la exterior de zonă acelulară și spre interior se întrepătrunde treptat cu zona centrală a pulpei. Conține o densitate celulară crescută, cu o proporție mare de fibroblaști, dar și macrofage și limfocite 6. Diviziunile celulare sunt rare în pulpa normală. Ori de câte ori apar odontoblaști mortificați, se declanșează mitoze ale celulelor stem care pun la dispoziție celule capabile să înlocuiască odontoblaștii distruși 6.

Zona centrală – pulpa propriu-zisă

Reprezintă un amestec dispersat de fibre conjunctive, celule, vase sanguine și fascicule nervoase pulpare, ce vor fi descrise separat, în rândurile ce urmează.

Celulele pulpei dentare

Odontoblastul – structură

Ocupă al doilea loc ca frecvență, după fibroblast și este celulă caracteristică pulpei dentare. Odontoblastul este alcătuit din: corp celular, gât și prelungirea sa citoplasmatică, fibra Tomes.

Corpul celular

Forma corpului celular este în relație directă cu starea de activitate sau de repaus funcțional al odontoblastului. Odontoblastul în activitate are un nucleu mare, ovalar, situat la polul bazal al celulei, cu cromatină abundentă și 1-4 nucleoli. Conține organite celulare bine diferențiate: reticul endoplasmatic, ribozomi, aparat Golgi, lizozomi, mitocondrii distribuite uniform în citoplasmă. Odontoblastul în repaus este, de fapt, o celulă cu activitatea mult încetinită, dar nu oprită 6.

Gâtul odontoblastului

Reprezintă elementul de legătură ce unește corpul celular de prelungirea citoplasmatică. Conține microtubuli cu rol în transportul diverselor substanțe între cele 2 compartimente celulare. Prelungirile citoplasmatice sunt de 2 tipuri: majore, periferice – fibra Tomes și minore, care unesc odontoblastul cu fibroblști sau celule vecine 6. Fibra Tomes imprimă dentinei caracterul de țesut viu, deoarece rămâne inclusă în țesutul mineralizat. Conține numeroase filamente, organite, vezicule, mitocondrii și ocazional granule asemănătoare lizozomilor. Prelungirea periferică ajunge până la joncțiunea dentino-adamantină, unde își etalează arborizațiile terminale 6.

Printre funcțiile odontoblastului se numără: realizarea procesului de dentinogeneză, sinteza glicoproteinelor și a proteoglicanilor, sinteza colagenului tip 1, secreția fosfatazei alcaline, fosfatazei acide, fosforinei, funcție nutritivă, de susținere a predentiei și funcție senzitivă 6. Un rol special îl are în declanșarea răspunsurilor pulpare, prin localizarea mai aproape de mediul extern este prima celulă lezată de agenții vulneranți, declanșând mecanisme de protecție ale complexului pulpodentinar: depunerea de dentină secundară, de reparație 6.

Variante ale odontoblastului

Odontoblastul secretor

Își are originea în crestele neurale, cu rol în sinteză activă, alternând cu perioade de repaus. La microscopul electronic de baleiaj, de transmisie, IHC (cu anticorpi monoclonali antiproteine de citoschelet) se observă unele prelungiri odontoblastice ce traversează în totalitate dentina, iar altele numai parțial. Conține numeroase filamente, organite, vezicule, mitocondrii și ocazional granule asemănătoare lizozomilor 6.

Odontoblastul tranzițional

Acest stadiu celular este identificabil doar în microscopia electronică, observându-se: celula se îngustează, nucleul apare migrat de la polul bazal, cu cromatina condensată, reticulul endoplasmatic rugos diminuă și apar vacuole autofagice – markeri de reorganizare citoplasmatică 6.

Odontoblastul în repaus/bătrân

Este o celulă mai puțin înaltă, cu citoplasma redusă, nucleul intens bazofil, situat spre polul apical, iar la microscopul electronic se observă organite celulare reduse cantitativ, aglomerate, constituind o regiune subnucleară proeminentă și citoplasma supranucleară – lipsită de organite celulare și granule secretorii 6.

Fibroblastul

Ocupând întregul teritoriu al pulpei dentare, fibroblastul este cea mai numeroasă celulă, din punct de vedere cantitativ. Fibroblastele sunt celule mezenchimale, pulpoblaste sau pulpocite, cu un nivel progresiv de  diferențiere. Fibroblastele pulpare sunt celule cu nucleu ovoid, celule care sintetizează și secretă colagenul și substanța fundamentală 6. Printre funcțiile fibroblastului se numără: formează substanța fundamentală din pulpa dentară; controlează metabolismul colagenului; sunt celule odontoformatoare, fiind capabile să dea naștere unor noi odontoblaști 6.

Fibroblastul există sub două forme: fibroblastul activ, distribuit uniform în substanța fundamentală, cu citoplasmă clară, omogenă și cu nucleu palid și fibroblastul în repaus, citoplasmă redusă cantitativ și localizată în jurul nucleului și nucleul închis la culoare.

Celulele mezenchimale, macrofagele, limfocitul, celulele polimorfonucleare, mastocitul și plasmocitul

Pulpa dentară conține celule mezenchimale nediferențiate, celule multipotente care au capacitatea de a se diferenția în majoritatea tipurilor de celule mature. Ca localizare, acestea se găsesc sub stratul de odontoblaste, în zona bogat celulară, cu legături citoplasmatice între odontoblaste și celulele mezenchimale subiacente 6. Datorită conexiunii dintre acestea, în timpul lezării odontoblastelor, se trimit stimuli către celulele mezenchimale nediferențiate, stimuli care le pot determina să se dividă și să se diferențieze în odontoblaste sau în alte tipuri celulare, în funcție de necesitate 6. O altă localizare a celulelor mezenchimale este în toată pulpa dentară, dispersate, în juxtapoziție față de vasele sanguine. La fel și aici, stimulate, acestea au capacitatea de a se divide și a se diferenția în alte tipuri celulare mature ca de exemplu, mastocitele, odontoclastele etc 6.

Macrofagele

Reprezintă principalele celule defensive ale pulpei dentare, mobile și cu o activitate intensă. Sunt localizate în zona centrală pulpară și perivascular. Macrofagele sunt celule mari, de formă neregulată, prezintă prelungiri scurte, nucleu rotund și excentric. Există numeroase similitudini între macrofag și fibroblast, de multe ori putând fi greu de deosebit. În caz de inflamație, macrofagele se deplasează rapid spre locul respectiv 6.

Rolurile macrofagelor: elimină detritusurile celulare, bacteriile în inflamații; au rol în apărare: fagocitarea specifică sau nespecifică a particulelor străine opsonizare la nivel tisular și receptori la nivel celular; participă în procesul imun mediat celular, procesează antigenul și îl prezintă limfocitelor; sintetizează monokine, interferon, lizozim, fracțiuni ale complementului, secretă interleukina-1, citokine 6.

Limfocitul

Este cea mai mică celulă mobilă, are formă rotundă și nucleu rotund sau ovalar, hipercrom. Apare rar în pulpa dentară sănătoasă, de obicei se întâlnește în inflamațiile cronice. Limfocitele sunt precursoare ale plasmocitelor și au rol în mecanismele imune mediate celular 6.

Celulele polimorfonucleare

În inflamația pulpară se găsesc numeroase neutrofile, eozinofilele și bazofilele sunt uneori și ele prezente. Este important de știut că, deși neutrofilele nu sunt în mod normal prezente în pulpa dentară sănătoasă, odată cu lezarea și moartea celulară ele migrează rapid în zonele din proximitatea capilarelor și a venulelor. Au rol important în distrugerea și fagocitoza bacteriilor sau a celulelor moarte 6.

Plasmocitul

Provine din limfocitul B, are formă ovalară, nucleu excentric, hipercrom, fără nucleol și citoplasma este bazofilă. Se găsește rar în pulpa dentară sănătoasă, dar numărul lor crește în cursul inflamației. Funcția plasmocitului: sinteză de anticorpi 6.

Mastocitul

Are formă rotundă sau ovalară, cu nucleul situat central, heterocromatic. Membrana are prelungiri scurte, groase și neramificate, conține receptori pentru IgE , iar citoplasma prezintă numeroase granulații specifice, rotunde, egale, cu dublă membrană. Mastocitul se găsește rar în pulpa dentară sănătoasă, numărul lor crește în inflamația pulpară cronică. Rolul lui principal este în răspunsurile inflamatorii, în care histamina este principalul mediator chimic 6.

Matricea extracelulară – componență și funcții: proteoglicani, glicoproteine, fibronectina

Matricea extracelulară a pulpei dentare este asemănătoare cu matricea extracelulară a oricărui țesut conjunctiv lax și reprezintă locul în care pulpa dentară își desfășoară toate procesele vitale. Constituie un sistem coloidal care poate fi afectat în cazul apariției unui stimul patologic precum: edemul, căldura, mediatorii chimici. Modificarea calității matricei extracelulare influențează direct funcționalitatea pulpară. Matricea extracelulară este alcătuită din proteoglicani, glicoproteine: fibronectină, laminină, tenascină 6.

Proteoglicanii sunt reprezentați de glicozaminoglicani și anume produși sulfatați: condroitin sulfat, dermatan sulfat, heparan sulfat, keratan sulfat și produși nesulfatați: acidul hialuronic. Printre numeroasele funcții ale acidului hialuronic, acesta intervine în homeostazia apei în țesuturi; are o mare afinitate pentru apă ceea ce conferă un grad permanent de hidratare a țesutului conjunctiv; acționează ca absorbant biologic al solicitărilor mecanice și intervine în procesele de vindecare și regenerare. Odată cu erupția dintelui proporția celulară în pulpa dentară devine: 60% acid hialuronic, 28% dermatan-sulfat și 12% condroitin-sulfat 6.

Fibrele conjunctive pulpare – componență și funcții: fibre de colagen, fibre de reticulină, fibrele de elastină

Fibrele de colagen reprezintă produsul de sinteză al fibroblaștilor pulpari. La nivelul pulpei dentare, fibrele de colagen ocupă 3-5% din greutatea acesteia. Colagenul este format din molecule de tropocolagen, o proteină solubilă. Există patru tipuri de fibre de colagen: colagen tip I, întâlnit în țesuturile conjunctive, respectiv și în pulpa dentară; colagen tip II, localizat în țesutul cartilaginos, colagen tip III, găsit și în pulpa dentară, iar colagenul tip IV este prezent doar în membranele bazale. În pulpa dentară, raportul colagen tip I/colagen tip III este de 55/45. Colagenul pulpar este format din fibre mici și fibre mari de colagen, dispuse paralel, într-o rețea difuză. Se găsește și în jurul nervilor pulpari, sub formă de teacă, cu rol în protecția acestora 6.

Fibrele de reticulină sunt denumite și fibre precolagenice, datorită compoziției lor asemănătoare și sunt fibre de colagen tip III, localizate în zonele perivasculare și perineurale 6. Fibrele de elastină sunt puține și prezente doar în pereții arteriolelor pulpare 6.

Circulația pulpară

Arteriolele pulpare. Capilarele pulpare. Venulele pulpare. Limfaticele pulpare

Artera maxilară internă, prin ramurile sale dentare: artera alveolară superioară și posterioară, artera infraorbitală și artera alveolară inferioară, vascularizează intens pulpa dentară. La polul apical al pulpei dentare se găsește foramenul apical, loc prin care are loc comunicarea pulpei dentare cu restul organismului 6.

Prin formenul apical pătrund în spațiul endodontic: 1-2 arteriole, venule, vase limfatice și fascicule nervoase senzitive și simpatice 6.

Arteriolele pulpare

Asemenător vaselor de acest tip, arteriolele prezintă tunică externă, tunică medie și tunică internă. Arteriolele pulpei dentare au pereții subțiri, calibru redus, iar tunica medie prezintă doar 1-2 straturi musculare. Arteriolele se comportă precum un sfincter precapilar, controlând circulația sângelui spre patul capilar. Acest sfincter se contractă și se dilată, permițând/restricționând accesul sângelui în patul vascular 6.

Capilarele pulpare

Capilarele pulpei dentare fac legătura dintre arteriole si venule. Sunt vase formate dintr-un singur strat de celule endoteliale turtite, cu nuclei lobați și membrană bazală înfășurată într-o masă amorfă de proteoglicani. În jurul capilarelor sunt localizate pericitele, celulele lui Rouget, celule cu capacitate contractilă, reducând calibrul vascular. O mică parte dintre capilarele pulpei dentare au structură fenestrată, ceea ce le conferă o permeabilitate crescută față de restul capilarelor, asigurând un transport rapid și o aprovizionare corespunzătoare cu electroliți, substanțe nutritive, metaboliți 6.

Venulele pulpare

Sunt alcătuite din tunică internă, cu mai puține filamente comparativ cu cea a arteriolelor, tunică medie subțire și discontinuă și tunică externă, care uneori poate lipsi. Venulele au pereții mult mai subțiri comparativ cu ai arteriolelor, nu prezintă valvule și au structură mai delicată 6.

Limfaticele pulpare

Apar în zona periferică pulpară și se unesc cu alte capilare limfatice pentru a forma vasele colectoare. Aceste vase se unesc cu canale limfatice din ce în ce mai mari, care ies prin apex și se anastomozează cu limfaticele parodontale și ale osului alveolar. Au cale comună de drenaj cu limfaticele parodontale, spre ganglionii limfatici submandibulari și cervicali 6.

Rolurile limfaticelor pulpei dentare: reduc presiunea coloidosmotică din pulpa dentară, au rol antiinflamator și stimulează vindecarea pulpară în inflamația reversibilă, prin reechilibrarea presiunii tisulare și îndepărtarea stimulilor toxici 6.

Pericitele

Celulele stem mezenchimale sunt unele dintre cele mai studiate celule stem, datorită potențialului lor de auto-reînnoire și capacității de diferențiere în multiple linii celulare precum adipocite, osteocite, condrocite, mioblaste, celule de origine mezodermală. În anul 1960, Friedenstein și colaboratorii au izolat pentru prima dată, in vitro, din măduva osoasă a rozătoarelor celule fibroblastoide, care au aderat și au format unități de fibroblaste. Ulterior, celulele stem mezenchimale au fost izolate din țesutul adipos, țesutul fetal, tendoane, mușchi, placentă, lichidul amniotic, cordonul ombilical, ligamentul periodontal, pulpa dentară, etc 7.

Societatea Internațională pentru Terapia Celulară – Comitetul Celulelor Stem Tisulare a realizat o listă de criterii pe baza cărora o celulă poate fi încadrată în celulele stem mezenchimale umane: celula trebuie să adere la plastic, să exprime antigene de suprafață CD73, CD90, CD105, să nu exprime CD11b, CD14, CD19, CD34, CD45, HLA-DR și să se diferențieze în osteoblaști, adipocite sau condroblaști, in vitro. De-a lungul anilor s-au făcut cercetări referitoare la localizarea anatomică a celulelor stem, rămânând încă de elucidat acest aspect. Crișan și colaboratorii au menționat în anul 2008, în urma cercetărilor făcute că celulele stem mezenchimale pot fi izolate din orice organ vascularizat, concluzionând că celulele perivasculare pot fi in vivo sursa celulelor stem. Celulele vasculare cuprind celulele adventiciale și pericitele, ambele categorii prezentând proprietăți asemănătoare celulelor stem mezenchimale: potențial de multidiferențiere (adipogeneză, osteogeneză, miogeneză, condrogeneză), exprimă markeri celulari de suprafață: CD73, CD90, CD105, nu exprimă CD31, CD34, CD45 și factorul von Willebrand 8.

Pericitele, denumite și celulele lui Rouget sau celule murale, reprezintă celule perivasculare, localizate în jurul celulelor endoteliale din capilare și microvase (peri=în jurul, cyte=celulă). Acestea au fost descoperite pentru prima dată în anul 1873, de către Rouget și denumite celule adventiceale nepigmentate, iar în anul 1923, Zimmermann le-a denumit “pericite” 7. Pericitele sunt celule asemănătoare fibroblastelor, prezintă un nucleu ce ocupă mare parte din spațiu și o citoplasmă slab reprezentată. Majoritatea sunt de origine mezodermală, însă cele localizate în retină și creier sunt derivate din creasta neurală. Vasele sanguine mari, arterele și venele, sunt alcătuite din 3 lamine: tunica intimă, tunica medie și adventicea. Pericitele sunt localizate între tunica medie și intima în vasele mari și în jurul stratului endotelial în vasele mici. Pericitele comunică prin contact direct cu celulele endoteliale, astfel ele având rol în proliferarea și diferențierea celulelor endoteliale și transmiterea forțelor contractile endoteliului. Procentul de pericite și celule endoteliale diferă de la țesut la țesut, fiind în concordanță cu funcțiile, presiunea vasculară și fluxul sanguin al țesutului în care se află. De aceea, retina și creierul au cel mai mare raport de 1:1, pielea și plămânii raport 1:10, iar în țesutul muscular striat raportul este de 1:100. Pe lângă proprietățile pericitelor de a se diferenția în adipocite, condrocite, osteocite, ele se pot diferenția și în celule musculare netede sau în fibroblaste producătoare de colagen tip I, în caz de inflamație 8.

Morfologia pericitelor diferă în funcție de localizare și tipul vasului. De obicei pericitele au formă alungită, stelată cu numeroase ramificării, prezintă corp celular, nucleu sau perikarion din care pornesc diferite prelungiri care înconjoară endoteliul. Regiunea nucleului sau corpul celular este mic și oval și se află adiacent endoteliului, în anumite cazuri pătrunde în spațiul interstițial. Prelungirile principale sunt orientate paralel cu axul lung vascular, iar cele secundare înconjoară pereții vasculari. Citoplasma pericitelor poate avea două sau mai multe straturi. Nucleul este proeminent, comparativ cu cantitatea redusă de citoplasmă. În vecinătatea fiecărui pol al nucleului sunt prezente mitocondrii și în cantitate redusă glicogen, reticul endoplasmatic, ribozomi, complexe Golgi etc 7.

Importanța pericitelor

Pericitele necesită o mare atenție, deoarece au importante funcții reglatoare, au rol în dezvoltarea vasculară, în stabilizare, maturare și remodelare. Stabilizează permeabilitatea vasculară, controlează presiunea sanguină, intervin în coagulare, în vasculogeneză și angiogeneză, ajută la repararea țesuturilor, la vindecarea rănilor 9.

Studiile recente au demonstrat că pericitele secretă o varietate de agenți vasoactivi, exprimă tropomiozina, actina, miozina, au receptori colinergici și adrenergici, reglând diametrul vaselor și presiunea sanguină. Un alt rol important al pericitelor îl reprezintă funcția imunomodulatorie, prin secretarea de citokine, chemokine, ce modulează răspunsul inflamator. Au activitatea fagocitotică asemenea macrofagelor și funcții speciale la nivelul ficatului, rinichilor și creierului. Creierul are cea mai mare densitate de pericite, datorită existenței barierei hemato-encefalice care menține departe potențialul toxic al factorilor sanguini. La nivelul creierului, pericitele sunt precursori ai macrofagelor și prin intermediul pinocitelor curăță fluidul extracelular. În ficat, pericitele au funcții speciale și sunt numite celule hepatice stelate sau celule Ito. Remodelează matricea extracelulară a țesutului hepatic, secretă proteine ale matricei extracelulare și metaloproteinaze, intervin în metabolismul vitaminei A, repară țesutul hepatic, iar la nivelul rinichilor, intervin în filtrarea sanguină 10.

Angiogeneza și vasculogeneza

Angioblaștii și hemangioblaștii, precusori ai măduvei osoase, migrează în zonele avasculare și formează plexul vaselor primare. TGF- β1 stimulează diferențierea PDGFR- β și a progenitorilor pericitelor. Angiogeneza reprezintă formarea vaselor sanguine, prin intermediul altor vase preexistente. Plexul primar al vaselor sanguine se remodelează și devine funcțional. Interacțiunea dintre celulele endoteliale și pericite asigură proliferarea și recrutarea unor noi pericite care formează noi vase sanguine. În final, pericitele se diferențiază morfologic în funcție de țesutul în care ajung, cu funcțiile aferente, care au fost prezentate mai sus 9.

Izolarea pericitelor

Surse de izolare a pericitelor pot fi: retina bovină, creier bovin, mușchi scheletic, piele, țesut adipos, placentă, cordon ombilical, rinichi și ficat. Protocoalele de izolare a pericitelor încep prin digestia mecanică și enzimatică a materialului tisular, folosind colagenaze. După digestia enzimatică, suspensia obținută este trecută printr-o sită cu ochiuri de 100 sau 40 μm pentru a îndepărta segmenetele mari de vase și țesutul fibros. Ulterior urmează creșterea vasculară sau imunoselecția pozitivă, (utilizând FACS sau MACS), în conformitatea cu markerul CD146, culturile primare ale vaselor fiind inițial formate din populații celulare mixte 7.

Cercetătorii au folosit diferite medii de cultură pentru creșterea pericitelor. Nakagawa și colaboratorii au folosit pericite cerebrale de șoarece, cultivate pe farfurii neacoperite, utilizând DMEM cu 10% ser fetal de bovină. Tsang și colaboratorii au izolat celule perivasculare utilizând DMEM cu 15% celule stem embrionice de bovine. Hosseini și colaboratorii au cultivat celule perivasculare în 75% α-MEM și 15% FBS. S-a ajuns la concluzia că toate mediile au oferit potențial de creștere pentru pericite și este clar că nu există un mediu unic pentru izolarea acestora 7.

Există mai mulți markeri de identificare a pericitelor: CD146, PDGFR- β, NG2, RGS-5, α-SMA. Markerul CD146 este un marker perivascular, care exprimă endoteliul vascular, pericite și celule musculare netede, găsit de asemenea și în sinusoidele pericitelor, dându-le potențial de auto-regenerare. PDGFR- β este un marker exprimat de pericite, astrocite, fibroblaști. α-SMA este un marker universal pentru celulele musculare netede, asociat cu funcția contractilă a acestora. NG2 exprimă pericitele în timpul angiogenezei și vasculogenezei. Diferența expresiei markerilor NG2/ α-SMA este asociată în funcție de localizare: capilarele exprimă NG2 +, α-SMA -, venulele NG2-, α-SMA + și arteriolele NG2+, α-SMA+ 7.

Pericitele sunt caracterizate prin expresia pozitivă a markerilor perivasculari CD146, PDGFR- β , NG2, RGS-5, α-SMA și a markerilor celulelor stem mezenchimale CD44, CD73, CD90, CD105. În schimb, ele sunt negative pentru markerii endoteliali și hematopoietici CD31, CD34, factorul von Willebrand și markerul CD56. Pericitele pot fi diferențiate de celelalte celule perivasculare care sunt negative pentru markerul CD146 și pozitive CD34 8 7.

Inervația pulpei dentare. Plexul Raschkow. Plexul Bradlaw

Pulpa dentară este un organ cu o inervație extrem de bogată, realizată de fibre nervoase senzitive, simpatice și parasimpatice. Numărul și gradul de concentrare al nervilor variază în funcție de stadiul de dezvoltare al dintelui și de localizare 6.

Nervii senzoriali răspund la stimulii nocivi prin senzația de durere, atunci când stimulul acționează la nivelul dentinei sau mai profund, pe pulpa dentară. Fibrele nervoase simpatice, provenite din ganglionul simpatic cervical superior, sunt responsabile de reglarea fluxului sanguin în arteriolele pulpare prin deschiderea sau închiderea șuturilor arteriolo-venoase, dar modulează și dentinogeneza. Fibrele nervoase pătrund în pulpa dentară ca fascicule de axoni mielinici și amielinici, încojurați de o teacă de țesut conjunctiv. Fibrele nervoase amielinice sunt cele mai însemnate din punct de vedere cantitativ, aproximativ 70-80%. Ele sunt încojurate de celule Schwann, indispensabile vieții și funcțiilor fibrelor nervoase periferice. Fibrele nervoase mielinice sunt fibre A-delta, au calibru redus și rol în transmiterea durerii pulpare. Au teacă groasă de mielină și sunt înconjurate de celule Schwann 6.

Fibrele nervoase pătrund în pulpa dentară la nivelul foramenului apical și a canalelor accesorii, urmând ulterior trasee de ramificare, similare vaselor sanguine pe care le însoțesc. În zona centrală a pulpei dentare, fibrele nervoase sunt dispuse în evantai, se divid în ramuri din ce în ce mai mici și suferă o arborizare periferică, dând naștere plexului Raschkow 6.

Plexul Raschkow. Plexul Bradlaw.

Plexul nervos subodontoblastic devine evident doar după erupția dentară și se formează complet după terminarea formării rădăcinii dentare. Este alcătuit din fibre amielinice cu diametru mic, reprezintă un câmp receptor imens, sumând cel puțin 8 ramificații terminale de la fiecare fibră nervoasă ce traversează foramenul apical. Din plexul Raschkow se desprind ramuri nervoase care trec printre odontoblaști ca terminații nervoase libere, pătrund în canaliculele dentinare și dau naștere unui alt plex – plexul Bradlaw. Plexul Bradlaw, deși conține terminații nervoase libere, acestea nu se comportă precum unele reale, ci se termină la joncțiunea odontoblast-predentină și pot fi stimulați aici împreună cu celelalte terminații care au traseu nervos și la nivelul dentinei 6.

Celulele si nișele stem adulte

Ciclul celular

Celula – definiție, structură și morfologie

Celula este unitatea de bază morfo-funcțională a materiei vii, un produs al evoluției cu o structură complexă, aflată într-o relație de autonomie și echilibru dinamic cu mediul înconjurător. Celula parcurge mai multe etape: de creștere, dezvoltare, autoreglare și reproducere. Componentele principale ale unei celule sunt membrana, citoplasma și nucleul 11.

Diviziunea celulară reprezintă totalitatea proceselor biologice care conduc la formarea, dintr-o celulă mamă, a două celule fiice, etapă în care are loc distribuirea materialului biologic celular din celula parentală, în cele două celule fiice. Diviziunea celulară se poate face prin două etape: prin diviziune directă (amitoză) și prin diviziune indirectă (mitoză și meioză) 11.

Ciclul celular este perioada de timp parcursă de la apariția unei celule și încheierea propriei sale diviziuni. În acest ciclu se disting două mari perioade: intercineza sau interfaza și cineza sau faza (amitoza, mitoza și meioza). Durata ciclului celular variază în funcție de celulă, specie, individ. Celulele eucariote au o durată a ciclului celular de 10-25 ore, o oră fiind reprezentată de mitoză. Unele mamifere au o durată a ciclului celular de 16 ore dintre care 15 ore pentru interfază și o oră pentru mitoză. În organismul animal există și celule care se divid foarte repede, ele parcurgând tot ciclul celular în 8 ore, dar există și celule care se divid mai rar, și care au un ciclu celular de 100 de zile sau chiar mai mult. În același timp în organism există și celule care nu se mai divid deloc (neuronul, rabdocitul, hematia) 11.

În funcție de modul în care celulele parcurg ciclul celular există trei categorii: categoria I (celulele și-au pierdut capacitatea de a se divide): neuronii, rabdocitele, leiocitele, hematiile; categoria II (celulele au o mare capacitate de diviziune: cele din măduva osoasă hematogenă, cele din straturile bazale ale epiteliilor, etc. și categoria III (celulele cu o capacitate redusă de diviziune, dar care atunci când sunt puse în condiții speciale se pot divide rapid): hepatocitele, celulele glandulare endocrine, etc 11.

Ciclul celular este influențat de factori stimulatori precum temperatură, hrană, substanțe activatoare, starea de sănătate a celulelor, dar și de factori inhibitori: lumina, radiațiile, frigul și unele substanțe chimice inhibitoare, care blochează sinteza de ADN 11.

Fiecare ciclu celular cuprinde două perioade dinamic și calitativ distincte: interfaza și mitoza/meioza. Multiplicarea celulară are la origine replicarea ADN-ului cromozomial, replicare care are loc în perioada interfazică. În nucleul celulelor se găsește ADN-ul, moleculă foarte complexă ce îndeplinește importante funcții în sinteza proteinelor și în transmiterea informației genetice către celulele-fiice în urma diviziunii celulare. ADN-ul este alcătuit din două lanțuri de nucleotide unite prin legături de hidrogen; el se poate găsi în interiorul nucleului în două forme, în funcție de perioada din timpul ciclului celular: sub formă de cromatină, adică răsfirat, necondensat (în interfază) sau sub formă de cromozomi, fiind condensat, mai gros, vizibil la microscopul optic (în timpul diviziunii celulare) 11.

După particularitățile de desfășurare și celulele care rezultă în urma diviziunii, există două modalități de cariochineză: mitoza se realizează doar în celulele somatice și reprezintă procesul de diviziune celulară prin care celula-mamă se divide în două celule-fiice identice din punct de vedere genetic, astfel, cromozomii din nucleul celulei-mame se împart în două seturi indentice în nucleii celulelor-fiice. Meioza se realizează doar în celulele sexuale și reprezintă procesul de diviziune celulară prin care celula-mamă se divide în patru celule-fiice – acestea au însă numai jumătate din numărul de cromozomi ai celulei-mamă 11.

Celulele stem și celulele progenitoare. Nișele stem pulpare.

Primele înregistrări ale omului referitoare la originea vieții și dezvoltarea organismului uman se regăsesc în Grecia antică, perioadă în care grecii credeau că entitățile vii pot apărea spontan. Aristotel (384-322 î. Hr.) nu a fost de acord cu teoria apariției spontane, motivând că această ordine ar putea proveni din dezordine. Acest concept a fost acceptat până la jumătatea anilor 1600, când Francesco Redi, fizician italian, a demonstrat că nu toate formele de viață apar spontan (Six jar experiment). La mijlocul anilor 1800, Franz Leydig susținea că orice formă de viață provine dintr-o altă formă de viață preexistentă acesteia. De-a lungul anilor, cercetători precum Purkyne, Robert Hooke, Rudolph Virchow și alții au venit cu noi ipoteze legate de punctul de plecare al entităților vii. În anul 1858 Virchow a demonstrat teoria conform căreia celula provine dintr-o altă celulă preexistentă (Omnis cellula e cellula) și a fost un susținător convins al Teoriei celulare. Aproape 100 de ani mai târziu, în 1961, James Till, fizician și Ernest McCulloch, hematolog, au descoperit întâmplător existența celulelor stem adulte într-o suspensie de măduvă osoasă, celule capabile de proliferare nedefinită. Această descoperire timpurie a avut, probabil, cel mai mare impact asupra celulelor stem și asupra progreselor terapeutice din acea vreme până în prezent 12.

Nișa celulelor stem

Nișa celulară reprezintă un subgrup de celule tisulare și substrate extracelulare ce pot găzdui pe termen nelimitat una sau mai multe celule stem, controlând capacitatea lor de auto-reînnoire și diviziunea în celulele fiice 13.

Nișa celulară reprezintă un micromediu specific, distribuit la nivelul organismului precum măduva osoasă, creier, pancreas, piele, pulpa dentară, cu rol în reglarea procesului de reparare, regenerare și menținerea integrității tisulare de către celulele stem 13.

Semnale specifice derivate din zonele exacte ale nișelor stem permit celulelor să rămână în viață, să își schimbe numărul și funcțiile. Matricea glicoproteică, celulele și spațiile tridimensionale determinate de aceste structuri, formează ultrastructura nișelor stem. Aceste elemente venind în contact determină apariția unor interacțiuni moleculare cu rol important în reglarea funcțiilor celulelor stem. Proteinele au un control paracrin asupra funcțiilor celulelor stem, rol important având și componentele non-proteice 14. Molecule simple cum sunt ionii anorganici pot contribui la funcționarea normală a nișei. Calciul și alte produse metabolice ce influențează comportamentul celulelor stem reprezintă o modalitate de reglare a funcțiilor celulelor stem. Stresul oxidativ afectează funcțiile și soarta celulelor stem 15.

Moleculele solubile precum Wnt, Notch, factorul de creștere al fibroblaștilor etc. sunt factori paracrini cu rol în reglarea funcțiilor celulelor stem, cu inducerea proliferării și diferențierii acestora 15.

Receptorii Notch (Notch1, Notch2, Notch3) sunt proteine transmembranare ce realizează legături cu genele Notch-specifice. Complexele Notch activează două sisteme enzimatice-TACE/ADAM10 si γ-secretaza. Aceste sisteme enzimatice degradează proteinele și eliberează componenta intermediară (NICD) ce conține semnale nucleare de localizare 15. Componenta intermediară formează un complex cu proteina RBP-Jk/CBF1, acest complex activează transcripția unor gene ce participă la proliferarea celulară sau la menținerea celulei în stare nediferențiată. Semnalele Notch joacă un rol cheie în determinarea naturii celulei stem și menținerea acestora prin activare sau inhibare. De exemplu, pierderea simultană de Notch1 și Notch 2 conduce la dispariția progenitorilor celulelor stem și le limitează potențialul de diferențiere (Riccio, 2008).

Caderinele, integrinele și alte molecule de adeziune au rol în interacțiunile celulare, în semnalizare și polaritatea celulelor. Adeziunea prin intermediul caderinei și integrinei este importantă și pentru orientarea axului celulelor stem din piele și creier 15.

Competiția celulelor stem pentru ocuparea unei nișe reprezintă un mecanism de control al calității celulelor și poate să îmbunătățească eficiența transplantării în tratamentele cu celule stem. Adeziunea între celulele stem și nișa este reglată de caderina, prin 2 mecanisme: prin intermediul celulelor stem propriu-zise și prin intermediul celulelor nișei. Adeziunea poate fi reglată și de factori intrinseci derivați din celulele stem. Celulele stem foliculare și germinale sunt ancorate la nivelul nișei prin intermediul caderinei. Interacțiunile caderinei și integrinei cu celulele stem determină legarea acestora de nișă și expunerea la diferite semnale emise de la nivelul nișei 16.

Dezvoltarea embrionară și originea celulelor stem

În ultimii 100 de ani s-au făcut eforturi masive în a înțelege mecanismele biochimice, moleculare și morfologice ale dezvoltării embrionare, de la fertilizare până la naștere. Pentru a înțelege proprietățile celulelor stem este necesară trecerea în revistă a dezvoltării embrionare timpurii. În cursul procesului de dezvoltare embrionară, diviziunea celulei ou dă naștere unei diviziuni celulare simetrice, orientată în primul rând în creșterea mărimii embrionului, prin acumulare de populații celulare nediferențiate, însă în curs de specializare ulterioară în alte tipuri de celule. Celulele rezultate în urma diviziunii simetrice sunt cunoscute sub numele de blastomere. Blastomerele rețin potențialul genetic de a se divide și produce celule fiice, care vor deveni ulterior celule specializate. Embrionul propriu-zis, cunoscut sub numele de blastocist, este format din trei categorii unice de celule: ectodermul primitiv, epiblastul și trofectodermul 12.

Dezvoltarea și organizarea anatomică a celor trei tipuri liniare este esențială deoarece ele vor da naștere endodermului, mezodermului și ectodermului embrionului. Este cunoscut faptul că identitatea uneia dintre cele 3 linii celulare este reglementată de factorul de transcriere CDx2. Supraexpresia de CDx2 în celulele stem embrionare le determină să se diferențieze în trofoblaste și să prezinte caracteristici de celule stem trofoblaste 12.

Cercetarea lui Martin Evans a arătat că embrionii pot fi obținuți in vitro cu succes și celulele stem derivate se pot diferenția într-o varietate de tipuri celulare mature. Astfel, celula stem (denumită și celulă sușă) este definită ca o celulă care, prin diviziune, produce două celule ce au capacitatea de a rămâne în stadiul de celulă stem (păstrând astfel caracterul nediferențiat) sau de a se diferenția în urma unor diviziuni succesive. În acest fel, celula stem se poate divide fie simetric (caz în care rezultă fie două noi celule stem, fie două celule diferențiate), fie asimetric (rezultând o celulă stem și o celulă diferențiată). Capacitatea celulei stem de a da naștere unei celule identice se numește diviziune, iar cea de a da naștere unor alte tipuri de celule se numește diferențiere, celula stem căpătând astfel denumire de celulă pluripotentă sau multipotentă. Celulele stem se impart în două mari categorii: celule stem embrionare și celule stem adulte 17, 18.

Tab.1. Clasificarea celulelor stem și capacitatea lor de diferențiere

Celulele stem embrionare.

Celulele stem embrionare, celule derivate din blastocist, pot da naștere oricărui tip de celulă/țesut și se numesc și celule stem totipotente. Se pot obține din țesut embrionar, însă din considerente etice utilizarea lor este restrânsă. Descoperirea celulei stem embrionară a avut loc în 1981, când s-a reușit izolarea de celule de la un embrion de șoarece, iar cultivarea lor în medii diferite a dus la formarea mai multor tipuri celulare prezente în șoarecele adult. După aceste reușite, cercetările și rezultatele au devenit din ce în ce mai edificatoare și mai cu seamă promițătoare 12,17.

În anul 1994, Bongo reușește să provoace dezvoltarea embrionilor supranumerari obținuți prin fecundare in vitro, până la stadiul de blastocist, embrion de 5 zile. În acest stadiu de dezvoltare a embrionului se diferențiază un grup de celule periferice, care stau la originea formării placentei și un grup de celule care formează masa centrală, butonul embrionar. Autorul izolează și cultivă celule din butonul embrionar și constată că unele se diferențiază, iar altele mor, după câteva zile. Echipa condusă de Thomson, în 1995, izolează și cultivă celule stem embrionare de primate, iar trei ani mai târziu reușesc să multiplice în cultură celule stem umane provenite dinr-un embrion în stadiu de blastocist 12.

În anul 1998, James Thomson, a izolat pentru prima dată tipuri de celule stem pluripotente din embrioni de om; apoi s-a demonstrat că aceste celule au capacitatea de a se specializa, având potențial regenerativ atunci când sunt plasate între celulele unui țesut sau organ. Aceste celule se pot transforma în fiecare dintre cele peste 200 de tipuri celulare ale adultului. Diferențierea și menținerea pluripotenței celulelor stem embrionare are nevoie de expresia câtorva factori de transcripție și proteine de suprafață, care asigură supresia genelor care duc la diferențierea și menținerea pluripotenței. Aceste celule pluripotente necesită semnale specifice pentru diferențierea corectă, dacă sunt injectate în alt corp. Datorită proprietăților sale combinate de expansiune nelimitată și pluripotentă, celulele stem embrionare rămân o sursă teoretică pentru medicina regenerativă și reînlocuirea tisulară după traumatisme și boli 12.

La începutul acestui mileniu cercetătorii au stabilit existența a trei tipuri de celule stem, având caracteristici morfofuncționale distincte: celule stem de tip adult, de tip embrionar și de tip fetal.

Celulele stem adulte

Celulele stem adulte sunt denumite și celule somatice și pot fi regăsite atât la copil, cât și la adult. Ele pot fi definite ca celule nediferențiate, sunt rare și în general în număr mic, adesea localizate printre organe și țesuturi adulte, care suferă procese de auto-reînnoire. Ele au capacitatea de a se diferenția în una sau mai multe tipuri celulare specializate ale acelui sistem de organe sau țesuturi. Celulele stem adulte sunt limitate în capacitatea de diferențiere, definite ca fiind unipotente sau multipotente. Deseori sunt numite celule stem somatice, denumirea deosebindu-le de celulele stem de origine embrionară. Măduva osoasă este una dintre cele mai bogate surse de celule stem adulte, însă cantitatea de celule stem scade pe parcursul înaintării în vârstă, iar la femeile fertile este mai mică decât la bărbații de aceeași vârstă 12 17.

Începând cu studiile lui McCulloch și până în prezent, au fost descoperite multitudini de celule stem somatice, caracterizate prin potențialul lor de a popula țesuturi și organe unde sunt necesare astfel de celule. Celulele stem adulte au fost descoperite în: creier, măduvă osoasă, țesut cardiac, țesut hepatic, epiteliu ovarian, testicul, pulpă dentară, sac folicular etc. Aceste celule pot oferi o sursă valoroasă pentru numeroase tratamente medicale. În fiecare țesut menționat mai sus există o nișă de celule stem, un mediu ideal în care celulele stem își au reședința. Această nișă este responsabilă atât cu propagarea celulelor stem, cât și cu diferențierea acestora în alte tipuri celulare. Trebuie menționat faptul că celulele stem adulte au o capacitate finită de a suferi diviziune celulară, limitată la una sau câteva descendențe. Această proprietate le diferențiază de celulele stem embrionare 17.

Experimentele efectuate pe șoareci cuprind celule stem generate direct din fibroblastele adulte, însă mulți dintre aceștia nu supraviețuiesc mult timp cu organele realizate. Terapiile cu celule stem adulte sunt folosite cu succes pentru mulți ani în cazul leucemiei, a neoplaziilor osoase și sanguine prin transplantul de măduvă. În cazul în care celulele stem sunt obținute din autogrefă, riscul de rejecție este inexistent. Folosirea acestor celule în cercetare și terapie nu este atât de controversată ca folosirea celulelor embrionice 17.

Celulele stem adulte sunt dificil de identificat după fenotip. După mai mult de 20 de ani de cercetări, acest lucru este posibil, cel puțin la șoareci, folosind anticorpi împotriva membranei antigenelor și markeri ai ciclului celular. Cu toate acestea, chiar și în acest caz rămâne imposibil de definit, în cadrul unei populații celulare, care celulă stem se va comporta ca o bonă a CSH, capabilă sa repopuleze 17.

Tab.2. Celule stem embrionare versus celule stem adulte

Celulele stem hematopoietice

Celulele stem hematopoietice sunt definite ca fiind o populație heterogenă de celule stem multipotente care se pot diferenția în celulele mieloide sau limfoide, celule prezente în sistemul sanguin adult. Celulele stem hepatopoietice adulte apar mai târziu în dezvoltare și nu au legătură cu hemangioblastele, dar mecanismele de control transcripțional care conduc la formarea timpurie a CSH în timpul embriogenezei joacă un rol important, ulterior, în dezvoltarea fătului și chiar la adult 18.

În anul 1978, Schofield relata că CSH își au reședința într-o nișă a măduvei osoase, aceasta fiind necesară pe tot parcursul vieții pentru generarea constantă a diferitelor tipuri de celule sanguine. În ultimii patruzeci de ani, acest concept a fost extins, existând o delimitare exactă între nișa măduvei osoase și nișa vasculară tot cu rol în dezvoltarea CSH. Endosteumul, interfața dintre măduva osoasă și os, este infiltrată cu celule osteoblastice care secretă numeroase citokine ce dirijează dezvoltarea, întreținerea și comportamentul CSH de la nivelul nișei endosteale. Sângele, vascularizația sunt indispensabile dezvoltării embrionare, ele fiind astfel primele țesuturi diferențiate. Hematopoieza primară a embrionului are loc mai întâi în sacul vitelin, în placentă și ficat, stabilizându-se ulterior în măduva osoasă fetală. Mai multe structuri, linii germinative produc celule sanguine în timpul dezvoltării. Celule sanguine endoteliale prezente în aorta dorsală și posibil și în alte organe, aprovizionează embionul cu celule stem hematopoietice. Mecanismele celulare și moleculare implicate în acest process au fost analizate pe culturi de stromă și celule hematopoietice. De exemplu, culturile de celule endoteliale folosesc factori angiocrini pentru a regla diferențierea celulelor progenitoare sau auto-reînnoirea 18.

Deși celulele stem hematopoietice au fost detectate inițial în regiunile endosteale ale măduvei osoase, studii recente arată existența lor și la nivelul nișei perivasculare, unde au fost descoperite celule stem progenitoare. Studii elaborate de Mendez-Ferrer au arătat ca celulele reticulate perivasculare, care exprimă CXCL12, joacă un rol important în întreținerea numărului de celule stem hematopoietice. Ding și colaboratorii confirmă ulterior rolul direct al celulelor perivasculare în hematopoieză 18.

În anul 1970, Friedenstein și colaboratorii au identificat existența celulelor stem mezenchimale ca formatoare de colonii de unități de fibroblaste. Prima descriere a potențialului de tri-descendență a CSM a fost detaliată de Pittenger și colaboratorii și a avut o mare importanță în înțelegerea acestor tipuri celulare unice. CSM se folosesc în ingineria tisulară și au multiple aplicații terapeutice datorită multipotențialului lor și ușoara izolare din numeroase țesuturi. Studiile actuale prezintă capacitatea CSM de auto-reînnoire, de diferențiere, nișele biologice și mecanismele moleculare de dezvoltare ale acestora 19.

Funcțiile celulelor stem și caracteristicile acestora

Potența celulară

Diferențierea celulară este indusă de stimuli interni și stimuli externi. Stimulii interni sunt reprezentați de bagajul genetic al celulei respective, iar stimulii externi de factorii de contact, semnalele intercelulare (molecule secretate de celule învecinate) și factori prezenți în mediul extracelular. Există însă și probleme în acest sens, iar celulele stem rămân încă la stadiul de studii și experimente, deoarece mai trebuie identificate seturi de factori care determină diferențiere unei celule într-o direcție sau în alta. 20

Tab.3. – Potențialul de diferențiere al celulelor: clasificare

Totipotența

Reprezintă proprietatea unei singure celule, care în urma diviziunii produce toate tipurile celulare diferențiate din organism. Un astfel de exemplu de totipotență îl reprezintă zigotul, prima diviziune celulară existentă după fecundarea ovulului de către spermatozoid. În urma procesului de fecundare, dezvoltarea umană începe prin prezența unei singure celule, totipotente-zigotul. Ulterior, acesta se divide în celule identice totipotente, care ulterior formează endodermul, mezodermul și ectodermul 21.

În urma celei de-a 16-a diviziuni, celulele totipotente ale morulei se diferențiază în celule care vor deveni masa internă a blastocistului sau a trofoblastului exterior. La 4 zile după fertilizare și după multiple cicluri de diviziune, celulele totipotente încep să se specializeze, iar masa celulară interioară, sursa celulelor stem devine pluripotentă 21 22.

Pluripotența

Există o singură celulă stem care are potențial pluripotent și se poate diferenția în oricare dintre cele trei straturi germinale – celulele stem embrionare umane. Celulele nonpotente pot fi derivate artificial în celule stem pluripotente, iar un astfel de exemplu este celula somatică adultă, la nivelul căreia se induce o expresie forțată a anumitor gene și factori de transcriere. Deși reprezintă un real avantaj, deoarece s-ar elimina controversele etice referitoare la celulele embrionare, celulele stem cu pluripotență indusă prezintă și dezavantaje precum îmbătrânirea celulalară precoce, potențialul tumorigen și de aceea nu au fost aprobate în cercetările clinice 21.

Multipotența

Reprezintă potețialul celulelor progenitoare de a se diferenția în alte tipuri celulare, însă un număr limitat. De exemplu, celula hematopoietică se poate diferenția în limfocit, monocit, neutrofil, etc, dar nu se poate diferenția în alte tipuri celulare nonsanguine. Există studii care demonstrează că au totuși potențial de regenerare în tipuri celulare neînrudite. Un astfel de experiment a arătat că fibroblastele au fost transformate în neuroni funcționali17. Celule multipotente au fost prelevate și din stroma mezenchimală a molarului trei. Celulele stem multipotente prelevate de la nivelul dinților sunt niște surse importante, ușor de prelevat și este demonstrat faptul că acestea se pot diferenția în osteoblaste, condrocite, adipocite, etc. 21.

Oligopotența

Reprezintă potențialul celulelor de a se diferenția în alte tipuri celulare, însă în număr mic. Exemple ale acestei categorii sunt celulele stem limfoide și mieloide. De exemplu, o celulă limfoidă poate da naștere unei celule B sau T, dar nu se poate diferenția în eritrocit 21.

Unipotența

Reprezintă potențialul unei celule de a se diferenția într-un singur tip celular. Un astfel de exemplu îl reprezintă precursorii mastocitari 21.

Celulele stem mezenchimale: potențialul de auto-reînnoire și menținere

Potențialul de auto-reînnoire se referă la acele căi biologice și mecanismele prin care unele celule stem rămân nediferențiate. LIF – factorul inhibitor al leucemiei, FGF – factor de creștere fibroblastică și WNT, împreună cu alți factori de creștere și citokine, sunt implicați în menținerea sursei de celule stem mezenchimale 19. Factorii enumerați mai sus au un rol important în procesul de auto-reînnoire al CSM, în menținerea acestora nediferențiate. LIF, o citokină pleiotropică menține starea de celulă stem mezenchimală, activează sau blochează activitățile osteoblastelor și osteoclastelor. Mecanismele acțiunii LIF în procesul de auto-reînnoire al celulelor stem mezenchimale este încă necunoscut, dar pot fi implicate mecanisme paracrine cu celulele învecinate 17.

O altă cercetare arată că Wnts poate fi de asemenea implicată în procesul de menținere al celulelor stem mezenchimale, așa cum face și în cazul reînnoirii celulelor neurale, hematopoietice, dermice, intestinale. Celulele stem mezenchimale ale unor specii de mamifere sunt expresia unor markeri celulari stem embrionici: oct-4, sox-2, rex-1 17.

Potențialul de diferențiere al celulelor stem mezenchimale

Pentru a analiza potențialul de diferențiere al celulelor stem mezenchimale, este necesară cunoașterea provenienței tisulare a acestora. În prezent se izolează celule stem din măduva osoasă și din alte țesuturi mezodermale precum țesutul adipos, țesutul muscular, osos sau din tendoane.

Numeroase studii demnostrează că există potențial de diferențiere al celulelor stem și din țesuturi fără origine mezodermală, experimente făcute pe țesuturi de șoarece de la nivel cerebral – creier, rinichi, timus, ficat, pancreas, plămân. Există oare o nișă de celule stem mezenchimale comună tuturor acestor țesuturi sau CSM funcționează autonom, într-o manieră independent de mediul lor? 21

Condrogeneza. Osteogeneza. Miogeneza. Tendogeneza. Adipogeneza

Studiile realizate la nivelul celulelor stem mezenchimale arată că acestea prezintă potențial condrogenetic de diferențiere, potențial care realizat in vitro imită procesul de dezvoltare cartilaginoasă realizat in vivo 19. Markerii de expresie pozitivi asociați diferențierii condrogenetice sunt SOX-9, scleraxis, tipuri de colagen II și IX, proteine agrecan și biglican, matrice proteică oligomerică cartilaginoasă și alții. Ca și în celelalte cazuri, potențialul de diferențiere condrogenetică este momentan incomplet deslușit, însă s-a demonstrat că proteinele recombinate sau infecțiile adenovirale ale celulelor stem mezenchimale cu TGF-B1, TGF-B2, BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-12, BMP-13 și GDF-5 induc rapid condrogeneza CSM, dintr-o varietate de țesuturi mezodermale 19.

Osteogeneza

Studiile arată că markerii BMP-2 și BMP-6 induc osteogeneza celulelor stem mezenchimale. BMP-2 induce acetilarea mediată a p300 Runx2, o genă osteogenică a cărei răspuns este transactivarea Runx2. Procesul de acetilare este specific histonelor deacetilazelor 4 și 5, prin deacetilarea Runx2 și degradarea ulterioara prin Smurf1 și Smurf2 19. Citokina Tnf-α, asociată cu degradarea osoasă inflamatorie, mediază și degradarea de Smurf1 și Smurf2. Studii realizate pe șoareci arată niveluri crescute de Smurf1 și Smurf2, concomitente cu niveluri scăzute de proteină Runx2. Aceste constatări sugerează că abordările terapeutice ale celulelor stem mezenchimale bazate pe ingineria tisulară, BMP, Runx2 și deacetilarea histonelor, pot spori imunoterapia TNF-α în distrucțiile osoase 19. Wnts au un rol important în inițierea și producerea osteogenezei. Noi descoperiri referitoare la mecanismul de formare osoasă și pierderea globală de gene osteogene runx2, reprezintă importante modele în înțelegerea reglării transcripționale a osteogenezei și potențialului celulelor stem mezenchimale de diferențiere descendentă 23.

Adipogeneza

PPARY, hormonul receptor peroxizom al activării proliferării y stimulează potențialul adipogenic al celulelor stem mezenchimale și inhibă potențialul osteogenetic, în timp ce TAZ, un coregulator al Runx2 stimulează osteogeneza și inhibă adipogeneza. Acest mecanism este plauzibil, ținând cont că ambele linii celulare derivă dintr-o sursă comună de celule stem mezenchimale 19.

Miogeneza

Studiile efectuate pentru demonstrarea potențialului miogenetic al celulelor stem mezenchimale s-au bazat pe o mică populație de celule stem scheletice, derivate din mușchi sau celule satelite. În cadrul unui studiu recent s-a demonstrat potențialul crescut de inducere a procesului de miogeneză al celulelor stem mezenchimale, după transformarea și activarea Notch 1, însă mecanismele de acțiune sunt incomplet cunoscute 19. Alte studii de succes au arătat importanța contactului celulă-celulă în stimularea potențialului cardiomiogenetic. Astfel, s-au utilizat culturi de celule stem mezenchimale și cardiomiocite, urmărind stimularea celulelor stem și producerea de cardiomiocite, într-un experiment de infarct miocardic realizat pe șoarece 19.

Tendogeneza

Studii realizate cu ajutorul proteinele GDF, aparținătoare ale familiei TGF-β, au demonstrat posibilitatea de transformare în tendoane, in vivo. Ca și celelalte, diferențierea specifică a genelor marker în tendogeneza celulelor stem mezenchimale este parțial cunoscută. Studii recente arată că R-Smad8, tradusă specific prin semnale BMP-2 in murina C3H10T12, transformă mai degrabă celulele în tendocite, în defavoarea osteoblastelor. Domeniul de activare R-Smad8 poate fi utilizat în a forma complexe de transcriere specifice în diferențierea tendogenetică 19.

Surse de celule stem de la nivelul feței

Țesuturile faciale reprezintă o varietate importantă, nu doar din punct de vedere estetic, cât și funcțional: ele sunt necesare pentru funcții precum respirația, vorbirea, mirosul, mestecatul etc. În cazul anomalilor congenitale, în infecții sau în urma traumatismele, o parte dintre țesuturile faciale lipsesc. De aceea, este absolut necesară reconstrucția acestora din punct de vedere estetic și funcțional 25.

În urma experimentelor efectuate, s-a demonstrat că celulele stem de la nivelul țesuturilor oro-faciale pot fi o importantă sursă celulară folosită în reconstrucție, însă încă sunt necesare multe cercetări științifice în acest domeniu, pentru demonstrarea potențialului, limitărilor și utilitatea lor la nivelul ființelor umane. Sursele stem celulare de la nivelul faciesului sunt reprezente de: structuri dentare – pulpa dentară, sacul folicular al dinților incluși, glande salivare, mușchi masticatori oro-faciali, nișa retrodiscală 25.

În ultimii ani, cercetările au demonstrat că celule de origine ectodermală sau mezodermală localizate la nivel oro-facial, au proprietăți de auto-reînnoire, diferențiere multiliniară și potențial de inducere a formării tisulare in vivo. Există două tipuri de celule stem progenitoare la nivel facial: celulele stem progenitoare provenite de la nivelul țesuturilor conjunctive: pulpa dentară, ligamentul periodontal, lamina propria a mucoasei orale, porțiunea retrodiscală a articulației temporo-mandibulare și alt tip de celule stem, provenite din epiteliul oral, glandele salivare și dezvoltarea organelor dentare 17.

Celulele stem oro-faciale exprimă o gamă largă de markeri moleculari, markeri atribuiți de asemenea și celulelor stem din măduva osoasă, dar exprimă puțină informație. Markerii moleculari exprimați sunt: CD14, un marker imunologic înnăscut, CD31 PECAM-1, CD34, CD45. Până în prezent nu s-a descoperit niciun marker celular de suprafață care să identifice populațiile stem celulare sau să poată diferenția celule stem izolate din diferite țesuturi oro-faciale 26. Celulele stem din pulpa dentară, lamina proprie orală, ligamentul periodontal etc sunt o populație celulară heterogenă, care pare a fi supusă unei proliferări mai rapide ex vivo, comparativ cu celulele stem din măduva osoasă. Această descoperire, în schimb, nu garantează reușita folosirii acestora în diferite scopuri terapeutice 25.

Celule stem de origine conjunctivă

Celulele stem hematopoietice localizate în măduva osoasă sunt formate de celulele stromale și osteoblaste. Celule stromale ale măduvei osoase sunt denumite astfel deoarece indică localizarea lor, iar ca funcții primare ele realizează hematopoieza și au capacitatea de a genera os heterotopic. Ținând cont că mezenchimul există doar în perioada prenatală, vom folosi în continuare termenul de celule stem ale țesutului conjunctiv, făcând referire la celulele stem postnatale, incluzând aici pulpa dentară, ligamentul periodonta, papila apicală și lamina proprie a mucoasei orale 26.

Celulele stem conjunctive din teritoriul oro-facial sunt celule mononucleate, celule aderente. Ex vivo, diferențierea celulelor aderente mononucleate în osteoblaste, condrocite și adipocite reprezintă certitudinea că acestea sunt celule stem. În schimb, deși ex vivo are loc acest fenomen, in vivo, diferențierea celulelor stem în multiple linii celulare, sunt departe de a fi celule stem pure 26.

Celulele stem de la nivelul ligamentului periodontal

Rădăcina dintelui este atașată osului alveolar prin intermediul ligamentului periodontal. Acest ligament conține vase de sânge, nervi și contituie o zonă de amortizare a forțelor între os și dinte. Pe lângă funcția de absorbant al presiunilor exercitate în masticație, ligamentul periodontal menține și homeostazia periodontală și cementară. Celulele folicului dentar, cu origine în creasta neurală derivată din mezenchim, se diferențiază în celule care formează ligamentul periodontal, prezente și în dezvoltarea germenului dentar și a rădăcinii dentare 26.

Celulele izolate de la nivelul ligamentului periodontal al dinților extrași sunt reprezentate de: cementoblaști, adipocite, celule formatoare de colagen și exprimă markeri imunologici precum Stro-1 și CD146. În comparație cu tendinopatia unde țesutul adipos se acumulează în tendon, la nivelul țesutului periodontal nu se acumulează țesut adipos, ceea ce rezultă că celulele stem din această regiune sunt incapabile de adipogeneză. Celulele stem de la nivelul ligamentului periodontal au rol în reparația tisulară prin proprietatea acestora de a suprima celulele inflamatorii. Aceste descoperiri arată că celulele stem faciale reprezintă mai degrabă celule de semnalizare în vindecarea rănilorși nu celule de înlocuire 26.

Celulele stem de la nivelul mucoasei orale

Epiteliul mucoasei orale este reprezentat de epiteliul oral, subiacent acestuia aflându-se țesut conjunctiv, reprezentat de lamina propria. De la nivelul epiteliului mucoasei orale au fost izolate celule mononucleate și aderente, celule cu un potențial mare de proliferare ce se presupun a fi celule stem, celule progenitoare. Celulele stem de la acest nivel diferă de celulele stem din pulpa dentară sau ligamentul periodontal datorită expresiei lor cu marker CD49d – integrina a2 sau VLA-4. În schimb, acestea prezintă o slabă expresie de transcripție a factorilor precum Runx2. Inițial s-a descoperit faptul că celulele stem mezenchimale participă la regenerarea tisulară, însă, date recente arată că acestea interacționează cu celule imune și celule inflamatorii care infiltrează țesutul lezat. In vitro, celulele stem gingivale-macrofage obțin un răspuns anti-inflamator fenotip T2. In vivo s-a obținut același rezultat, celulele stem gingivale intervenind în reparația tisulară. Macrofagele T2 polarizate au un rol important în procesul de vindecare inflamatorie, datorită proprietăților acestora și anume: eliberează factori trofici și suprimă secreția de citokine pro-inflamatorii 26.

Celulele stem epiteliale oro-faciale: dintele ca model

Dezvoltarea dintelui reprezintă un model clasic de interacțiune epitelial-mezenchimală. Atenția este atrasă de incisivii rozătoarelor care continuă să erupă și să crească pe tot parcursul vieții, acest aspect fiind interesant de studiat și demonstrat .

Mineralizarea smalțului și a dentinei, în comparație cu pulpa dentară nemineralizată, oferă o unică oportunitate de a studia contrastul realizat de o singură origine stem celulară, papila dentară, care se diferențiază în țesuturi mineralizate și țesuturi nemineralizate. Există puține studii făcute în acest sens, însă trebuie amintită descoperirea recentă care arată că o axă stem celulară de la nivelul glandelor salivare, prin intermediul semnalelor acetilcolinei, a crescut potențialul de proliferare și morfogeneză a keratinei 5-pozitive de progenitori stem, în timp ce inervația parasimpatică a menținut populația stem epitelială progenitoare (Knox și colaboratorii, 2010) 26 27.

Material și metodă de studiu

Material biologic

Pentru acest studiu au fost prelevate specimene bioptice – pulpe dentare adulte clinic sănătoase, de la 5 pacienți obținute cu consimțământul informat al acestora.

Cazurile donatoare au avut vârsta medie de 30 de ani, iar sex ratio a fost de 3:2. Motivul extracțiilor: boală parodontală sau extracții în scop ortodontic

Metoda de prelevare a țesuturilor

Protocol de prelevare a pulpei dentare de la nivelul molarilor de minte semi-incluși: anestezie, incizie mucoasă, sindesmotomia – secționarea ligamentelor alveolo-dentare superficiale, extracția propriu-zisă cu ajutorul elevatoarelor și a cleștilor de extracție. Ulterior extracțiilor, dinții au fost secționați în două jumătăți, astfel: cu ajutorul unei freze diamantate de formă cilindrică, de turbină, s-au realizat două șanțuri pe fețele mezială și distală a molarilor, cu unirea acestora pe linie mediană. Au rezultat astfel două jumătăți dentare în interiorul cărora s-a observat pulpa dentară, încă vitală. Aceasta a fost îndepărtată cu ajutorul unui ac Tirre-nerfs, depozitată în recipiente speciale, în formol tamponat 8 % și introdusă la frigider la o temperatură de 5 grade Celsius.

Metoda imunohistochimică

Pregătirea lamelor de microscopie

Specimenele tisulare au fost fixate timp de 24 ore în formol tamponat (8%) și au fost prelucrate cu un histoprocesor automat (Diapath, Martinengo, BG, Italy), cu includere în parafină. Secțiunile au fost tăiate manual la 3 micrometri și au fost montate pe lame de sticlă electrostatice SuperFrost® (Thermo Scientific, Menzel-Gläser, Braunschweig, Germany) pentru imunohistochimie. Pentru aprecierea histologică am folosit secțiuni groase de 3 micrometri colorate cu hematoxilină-eozină.

Anticorpii primari utilizați

Am folosit anticorpi primari pentru:

CD10 (clona 56C6, Biocare Medical, Concord, CA, USA, 1:20);

CD117/c-kit (rabbit monoclonal, clona Y145, Biocare Medical, Concord, CA, USA, 1:100);

CD34 (mouse monoclonal, clona QBEnd/10, Biocare Medical, Concord, CA, USA, 1:50);

CD45 (mouse monoclonal, clona PD7/26, Biocare Medical, Concord, CA, USA, ready-to-use);

nestină (mouse monoclonal, clona 10c2, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA, 1:500);

Stro-1 (mouse monoclonal, clona STRO-1, Sigma-Aldrich, Sigma-Aldrich Co., MO, USA, 1:100);

enolaza neuron-specifică (neuron-specific enolase, NSE, mouse monoclonal, clona BBS/NC/VI-H14, Dako, Glostrup, Denmark, 1:200);

CD 105 (policlonal, Thermo Scientific, Pierce Biotechnology, Rockford, USA, 1:50).

Metoda imunohistochimică

Pentru imunomarcarea cu CD34, Stro-1 țesuturile au fost deparafinate și hidratate, apoi au fost blocate peroxidazele endogene cu Peroxidazed 1 (Biocare Medical, Concord, CA, USA). Pentru digestia enzimelor s-a folosit tripsina – Carezyme I. Biotina endogenă a fost blocată și s-a aplicat blocant de background pentru a reduce colorația nespecifică. A fost aplicat anticorpul primar la diluția indicată, la temperatura camerei, pentru 60 minute. Apoi a fost folosită o detecție în doi timpi cu HRP (horseradish peroxidase) cu un sistem de detecție 4 plus, fiind aplicat un cromogen (DAB) compatibil cu HRP. Secțiunile au fost supracolorate cu hematoxilină (albastru) și clătite cu apă deionizată. Pentru spălare s-a folosit soluție TBS (Tris-Buffered Saline) la pH de 7,6.

Pentru imunomarcarea cu CD10 și CD45 țesuturile au fost deparafinate și hidratate, apoi au fost blocate peroxidazele endogene cu Peroxidazed 1 (Biocare Medical, Concord, CA, USA). Pentru descoperirea la căldură a epitopului a fost utilizată o cameră de demascare – Decloaking Chamber (Biocare Medical, Concord, CA, SUA) și soluție de recuperare pH 6 (Biocare Medical, Concord, CA, SUA) care este un tampon formulat special pentru stabilizarea pH-ului la temperaturi ridicate. S-a folosit Background Blocker (Biocare Medical, Concord, CA, USA) pentru a reduce colorația de fond nespecifică. Anticorpii primari au fost aplicați la diluțiile specifice respective. A fost folosit sistemul de detecție MACH 4 (Biocare Medical, Concord, CA, USA) care este o metodă de detecție cu HRP universală în doi timpi (probă/polimer). A fost aplicat un cromogen (DAB) HRP-specific. Secțiunile au fost supracolorate cu hematoxilină (albastru) și clătite cu apă deionizată. Pentru spălare s-a folosit soluție TBS (Tris-Buffered Saline) la pH de 7,6.

Pentru imunomarcarea cu CD117/c-kit, nestină țesuturile au fost deparafinate și hidratate, apoi au fost blocate peroxidazele endogene cu Peroxidazed 1 (Biocare Medical, Concord, CA, USA). Pentru descoperirea la căldură a epitopului a fost utilizată o cameră de demascare – Decloaking Chamber (Biocare Medical, Concord, CA, SUA) și soluție de recuperare pH 6 (Biocare Medical, Concord, CA, SUA) care este un tampon formulat special pentru stabilizarea pH-ului la temperaturi ridicate. S-a folosit Background Blocker (Biocare Medical, Concord, CA, USA) pentru a reduce colorația de fond nespecifică. Anticorpii primari au fost aplicați la diluțiile specifice respective. A fost folosit sistemul de detecție MACH 2 rabbit HRP polymer detection (Biocare Medical, Concord, CA, USA) care constă dintr-un singur reactiv aplicat peste anticorpul primar. A fost aplicat un cromogen (DAB) HRP-specific. Secțiunile au fost supracolorate cu hematoxilină (albastru) și clătite cu apă deionizată. Pentru spălare s-a folosit soluție TBS (Tris-Buffered Saline) la pH de 7,6.

Documentarea rezultatelor

Lamele de microscopie au fost analizate; au fost făcute microfotografii care au fost scalate pe o stație calibrată. Am utilizat o stație de lucru Zeiss compusă dintr-un microscop AxioImager M1 cu o cameră AxioCam HRc și comandat printr-un software de procesare digitală a imaginii microscopice AxioVision (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany).

Rezultate

Am evaluat pe lame fenotipul CD10 la nivelul pulpei dentare (fig.1, fig.2). Am observat că stroma pulpei dentare a prezentat o rețea celulară bine reprezentată cu fenotip CD10-pozitiv. Celulele stromale ale acestei rețele au prezentat de regulă morfologii multipolare. De asemenea, endotelii microvasculare au exprimat CD10. Am în vedere faptul că acest marker indică potențial stem, fapt ce asociază capacitatea clonogenică și de multidiferențiere cu celulele endoteliale ale pulpei dentare.

Enolaza neuron-specifică a fost exprimată, în conformitate cu specificitatea sa neurală, în nervi pulpari (fig.3, fig,4). Aceasta a permis identificarea pe lamele de microscopie a componentelor plexului Raschkow din mantaua pulpară (fig.4). Ocazional, enolaza neuron-specifică a fost exprimată și în endotelii microvasculare pulpare (fig.4) fapt ce poate indica un multi- sau bi-potențial nativ al celulelor endoteliale.

Expresia Stro-1 în pulpa dentară (fig.5, fig.6, fig.7) a fost pozitivă în celule stromale și în celule endoteliale microvasculare. În mantaua pulpară am decelat două subseturi de celule, unele Stro-1-negative, altele Stro-1-pozitive. De asemenea celule endoteliale au prezentat fenotip Stro-1+, ceea ce a sugerat faptul că atât celulele endoteliale cât și cele stromale care au exprimat Stro-1 ar putea aparține liniei celulare endoteliale.

Endoteliile microvasculare au exprimat de asemenea CD34 (fig.8) și endoglina (CD105) (fig.15). De asemenea am pus în evidență celule stromale izolate care au exprimat pozitiv CD45 (fig.9), marker hematopoietic. Însă, astfel de celule nu au exprimat CD34. Am interpretat lipsa de corelare între cele două fenotipuri moleculare prin aceea că expresia singulară a CD45 indică mai degrabă celule ale sistemului imun. Endoglina a fost exprimată și în celule stromale izolate.

Rețelele stromale ale pulpei dentare au fost de asemenea marcate pozitiv cu anticorpul anti-nestină (fig.10, fig.11, fig.12). Celulele stromale nestin-pozitive au avut morfologie multipolară și prelungiri decelabile, dihotomice. De asemenea, expresia nestinei a fost puternică în stratul odontoblastelor. Mai mult, endotelii microvasculare au exprimat pozitiv nestina.

Rețelele stromale pulpare au exprimat de asemenea pozitiv CD117/c-kit (fig.13, fig.14). Expresia c-kit nu a fost superpozabilă cu expresiile CD34 și CD45, ceea ce a exclus interpretarea c-kit în corelație cu linia hematopoietică. Corelația pozitivă dintre fenotipurile c-kit+ și nestină+ indică mai degrabă o populație stromală cu potențial stem sau progenitor.

Fig. V-1 – Imunoexpresia pulpară a CD10.

Fig. V-2 – Pulpă dentară adultă, imunomarcare cu CD10. Miez pulpar cu vase largi de tip arteriolar și nervi. Stroma pulpară exprimă CD10 la nivelul unei rețele globale de celule stromale. Capilare născânde cu fenotip CD10 pozitiv.

Fig. V-3. Pulpă dentară adultă, imunomarcare cu enolază neuron-specifică. Antigenul este exprimat pozitiv într-un nerv pulpar de calibru important secționat oblic. În partea inferioară a imaginii este un tandem neuro-vascular cu un nerv pulpar de calibru mic ce exprimă enolaza neuron-specifică. Vasul respectiv are calibru mare și perete subțire, este deci de tip venulă. Celulele endoteliale exprimă enolază neuron-specifică și se identifică celula perivasculară cu fenotip NSE pozitiv. NSE nu este exprimat în mantaua pulpară.

Fig. V-4. Pulpă dentară adultă, imunomarcare cu enolază neuron-specifică. Celule din mantaua pulpară, plexul subodontoblastic, nu exprimă antigenul, însă endoteliile pulpare, vasculare nu exclusiv. Celule stromale izolate, fibroblastoide, exprimă NSE.

Fig. V-5. Pulpă dentară adultă, imunomarcare cu STRO-1. Mantaua pulpară cu expresie heterogenă. Endotelii imunonegative.

Fig. V-6. Pulpă dentară adultă, imunomarcare cu STRO-1. Două celule Stro-1 pozitive, de talie mare, rotund ovalare, la limita dintre miezul pulpar și mantaua pulpară, par a configura lumene vasculare.

Fig. V-7. Pulpă dentară adultă, imunomarcare cu STRO-1. Celule stromale de aspect fibroblastoid, aparent lipsite de prelungiri, exprimă Stro-1. Expresia endotelială a Stro-1 în endoteliile microvasculare este heterogenă.

Fig. V-8. Pulpă dentară adultă, imunomarcare cu CD34. Expresia exculsivă a antigenului în celulele endoteliale vasculare. Celulele mantalei pulpare sunt CD34 negative. Rețelele stromale pulpare sunt de asemenea CD34 negative.

Fig. V-9. Pulpă dentară adultă, imunomarcare cu CD45. Expresia CD45 într-o celulă stromală pulpară aparent lipsită de prelungiri.

Fig. V-10. Pulpă dentară adultă, imunomarcare cu nestină. Rețeaua stromală a miezului pulpar exprimă nestină. La limita miez-manta o celulă de talie mare, cu raport nucleu-citoplasmă mare și prelungiri dihotomice sugerează un fenotip stem.

Fig. V-11. Pulpă dentară adultă, imunomarcare cu nestină. Vas pulpar cu perete gros, înglobat în stroma nestin-pozitivă.

Fig. V-12. Pulpă dentară adultă, imunomarcare cu nestină. Mantaua pulpară nestin-pozitivă. Expresia puternică a antigenului în stratul odontoblastelor.

Fig. V-13. Pulpă dentară adultă, imunomarcare cu CD117/CD-kit. Expresie consistentă, dar heterogenă CD117/CD-kit în mantaua pulpară.Pulpă dentară adultă, imuno-markare cu CD117/c-kit. Nervi pulpari imuno-negativi. Rețea stromală pulpară C-kit pozitivă, construită din celule multipolare cu prelungiri. Sunt identificate și celule C-kit pozitive apolare. Expresia C-kit este heterogenă în stroma pulpară.

Fig. V-14. Pulpă dentară adultă, imunomarcare cu CD117/CD-kit. Nervi pulpari imuno-negativi. Rețea stromală pulpară C-kit pozitivă, construită din celule multipolare cu prelungiri. Sunt identificate și celule C-kit pozitive apolare. Expresia C-kit este heterogenă în stroma pulpară.

Fig. V-15. Pulpă dentară adultă, imunomarcare cu CD105. Expresia CD105 pozitivă în endoteliile vasculare, dar și în celulele izolate ale stromei pulpare, cu nuclei heterocromatici și citoplasmă puțină.

Discuții

Denumirea de celule stem (CS) se referă la o varietate mare de celule provenite din diferite surse. Celulele stem sunt prezente în cele mai multe, dacă nu toate organismele multicelulare și sunt cei mai importanți factori ai creșterii și regenerării. Ele sunt definite ca celule biologice capabile de auto-reînnoire și diferențiere într-o varietate de alte tipuri celulare. Celulele stem sunt considerate cele mai importante componente biologice necesare creșterii și dezvoltării corecte în timpul embriogenezei 17.

Celulele stem se împart în două mari categorii: celule stem embrionare și celule stem adulte. Celulele stem embrionare sunt celule totipotente, capabile de diferențiere în orice alt tip de celulă, însă controversele bioetice și legale, la care se adaugă o rată crecută a rejetului după transplantarea CS embrionare și asocierea cu formarea de teratoame, face ca acestea să nu fie folosite în prezent în medicina regenerativă 17.

De aceea, o mai mare atenție au atras celulele stem adulte cu potențial promițător în viitor, în medicina regenerativă. CS mezenchimale au fost izolate din aproape toate țesuturile: măduvă osoasă, creier, ficat, mușchi scheletic, păr, periost, lichid amniotic, pulpa dentară, sac folicular, glande salivare etc. Spre deosebire de celulele stem embrionare, acestea nu prezintă potențial de rejecție dacă sunt recoltate de la același individ la care vor fi implantate după diferențiere 19.

În încercările de identificare a surselor de CS mezenchimale, cercetătorii au confirmat că acestea se găsesc adiacent vaselor de sânge. Pericitele, denumite și celulele lui Rouget sau celule murale, reprezintă celule perivasculare, localizate în jurul celulelor endoteliale din capilare și microvase (peri=în jurul, cyte=celulă). Acestea au fost descoperite pentru prima dată în anul 1873, de către Rouget și denumite celule adventiceale nepigmentate, iar în anul 1923, Zimmermann le-a denumit “pericite”. Alte denumire utilizate pentru pericite sunt: “celule pericapilare intramembranare”, „celule Rouget”, „celule pericapilare”, „celule perivasculare”, „celule adventițiale”, „celule nediferențiate”, „celule periendoteliale”. Pericitele au fost descoperite la nivelul capilarelor din creier, din retină, din cortexul cerebral și la nivelul nervului optic 8.

Pericitele sunt celule heterogene care includ toate celulele localizate perivascular cu morfologie asemănătoare. Acestea se găsesc în vasele mici, capilare și venule post-capilare. Pentru evidețierea acestora s-au folosit tehnici de impregnare cu argint și microscopie electronică de transmisie, iar pentru identificarea formei și aranjamentului microscopia electronică 34.

Morfologia pericitelor diferă în funcție de localizare și tipul vasului. De obicei pericitele au formă alungită, stelată cu numeroase ramificării, prezintă corp celular, nucleu sau perikarion din care pornesc diferite prelungiri care înconjoară endoteliul. Regiunea nucleului sau corpul celular este mic și oval și se află adiacent la endoteliu, în anumite cazuri pătrunde în spațiul interstițial. Prelungirile principale sunt orientate paralel cu axul lung vascular, iar cele secundare înconjoară pereții vasculari. Citoplasma pericitelor poate avea două sau mai multe straturi. Nucleul este proeminent, comparativ cu cantitatea redusă de citoplasmă. În vecinătatea fiecărui pol al nucleului sunt prezente mitocondrii și în cantitate redusă glicogen, reticul endoplasmatic, ribozomi, complexe Golgi etc 7.

Pericitele au roluri importante în menținerea homeostaziei, participă la reglarea locală a permeabilității, au rol supresor asupra proliferării celulelor endoteliale în timpul angiogenezei, prezintă funcții asemănătoare macrofagelor și reglează fluxul sanguin 7.

Întrebuințări ale celulelor stem

Celulele stem mezenchimale au atras atenția cercetătorilor nu doar prin proprietățile lor de diferențiere în alte tipuri celulare, cât și datorită potențialului acestora de a migra spre zonele de injurie sau de inflamație atunci când sunt injectate intravenos, participând în acest fel la regenerarea tisulară. Acest proces se produce prin secreția unor citokine și factori de creștere ce duc la sinteza de noi componente tisulare. Atunci când celulele stem sunt transplantate alogen, se presupune că nu sunt ținta limfocitelor T citotoxice și natural killer, putând fi astfel depășite barierele sistemului major de histocompatibilitate 19.

În prezent, celulele stem mezenchimale multiplicate în cultură au fost folosite pentru tratarea unor patologii complexe precum: infarctul miocardic, scleroza laterală amniotrofică, leucodistrofia, accidentul vascular cerebral, diabetul, lupusul eritematos sistemic etc 20.

Deși utilizarea lor ar aduce mari beneficii medicinii regenerative, există însă și probleme legate de siguranța folosirii acestor celule, din cauza lipsei unei metode standardizate de izolare, multiplicare, identificare. Alte probleme întămpinate în prezent ar fi legate de lipsa calificării personalului care manipulează ex vivo celulele, timpul și costul ridicat, riscul de transmitere al unor afecțiuni virale datorate mediilor de cultură și potențialului tumorigen 20.

Celulele stem orale

În urma experimentelor făcute s-a demonstrat că surse de celule stem există în număr mare la nivelul cavității orale: pulpa dentară, ligament periodontal, sac folicular, gingie și mucoasa orală, nița retrodiscală, delta apiclă. Aceste celule exprimă markeri de suprafață specifici și se pot diferenția in vitro în osteoblaste, condrocite, adipocite 35.

În afara abundenței de surse orale, un mare avantaj îl reprezintă posibilitatea de a beneficia de aceste celule în urma unor intervenții stomatologice uzuale: extracția dinților în scopuri ortodontice, extracția dinților parodontotici, gingivectomii, extracția molarilor de minte incluși. Spre deosebire de alte surse de celule stem, cum ar fi măduva osoasă, accesul la celulele stem orale este extrem de facil și ar putea avea în viitor o influență majoră asupra dezvoltării medicinei regenerative 35.

Patologiile dentare precum caria dentară, anomaliile genetice etc sunt probleme comune care afectează mare parte a populației globului. Din motive estetice, psihologice și medicale refacerea structurilor dentare este o problemă importantă de ordin social. Medicina dentară evoluează continuu adăugând permanent noi tehnici și materiale pentru a înlocui țesuturile pierdute 35.

În ultimii 10 ani oamenii de știință au făcut progrese majore în ceea ce privește științele celulare și biologia moleculară, cu scopul de a găsi alternative inovatoare în regenerarea dentară. Astfel, studiile arată că celulele stem oferă un potențial uimitor în homeostazia dentară, repararea și refacerea acestora. Cu toate acestea, descoperirea nu este lipsită de provocări, probleme ce trebuie rezolvate înainte de orice aplicare clinică a acestor resurse. Cunoașterea surselor și diferitelor tipuri de celule stem dentare, precum și mecanismele care fac posibilă supraviețuirea acestora este estențială și garantează succesul abordărilor terapeutice bazate pe celulele stem în stomatologia modernă 35.

Obiectivul stomatologiei regenerative este acela de a re-crea procesele embriologice prin care un dinte trece în timpul dezvoltării. Acesta este un proces complex, ce presupune multiple interacțiuni epitelial-mezenchimale, celule ale epiteliului oral și celule mezenchimale derivate din creasta neurală ce dau naștere structurilor mineralizate dentare 35.

Celulele stem sunt celule capabile de auto-reînnoire, generează celule fiice cu proprietăți diferite și repopulează gazda. Celulele stem dentare sunt considerate o nouă sursă de celule stem ce pot fi utilizate în medicina regenerativă, prin extragerea acestora din sursa respectivă și modificate și reintroduse la același individ, eliminând astfel potențialul de rejecție 35.

Pentru prima dată celulele stem dentare au fost izolate în anul 2000 din pulpa dentară de Gronthos și colaboratorii și în anul 2003 de la nivelul dinților exfoliați, Gronthos și Shi. Alte surse în care se găsesc celule stem sunt reprezentate de: papila apicală a dinților temporari, sacul folicular, mucoasa orală, glandele salivare etc 35.

Celulele stem dentare au caracter multipotent și sunt capabile să se diferențieze în adipocite (Waddington, 2008), osteoblaste (Mendonca Costa, 2008), condrocite (Waddington, 2009), miocite (Kerkis, 2008), celule neuronale (Gandia, 2008) etc. Aceste celule au arătat potențial de regenerare și diferențiere în multiple țesuturi: os (Granziano, 2008), țesut cardiac (Gandia, 2008), mușchi (Kerkis 2008), dinte (Onyekwelu, 2007, Nedel 2009) 35.

Mediul de cultură în care aceste celule stem cresc le dictează potențialul de diferențiere în osteoblaști, osteocite, condroblaști sau condrocite, iar această proprietate le face să prezinte un mare interes în ingineria tisulară în vedere utilizării lor ca transplant autolog la nivelul osului și cartilajelor 35.

Deși toate studiile arată că celulele stem dentare pot aduce imense beneficii medicinii regenerative, identitatea exactă a acestor celule rămâne o provocare din cauza lipsei unui marker unic, specific. Analizele standard de identificare se bazează pe morfologia lor, aderența la suprafețe solide, capacitatea de diferențiere și abilitatea de a repara țesuturile afectate 35.

Celulele stem dentare se caracterizează prin expresia negativă a antigenilor hematopoietici: CD 45, CD34, CD14 și expresia pozitivă a CD29, CD73, CD105, CD44 și colagen, vimentină, laminină, fibronectină etc 35.

Dovezile furnizate de diferite studii confirmă că celulele pulpei dentare au caracter mezenchimal și si pot diferenția în multiple linii celulare, însă purificarea acestora momentan nu este posibilă, producerea celulelor stem dentare omogene reprezentând o provocare actuală 35.

Nișa stem a pulpei dentare

Caracteristici ultrastructurale și imunofenotipice ale celulelor stem

Pentru a înțelege numeroasele aplicații terapeutice ale CSM este necesară o bună cunoaștere a acestor celule. De-a lungul anilor au fost făcute numeroase încercări de a dezvolta un profil antigenic de suprafață pentru o mai bună purificare și identificare a celulelor stem mezenchimale. O particularitate importantă de demonstrat este aceea de a izola celule stem mezenchimale din diverse țesuturi și de a le putea identifica cu același fenotip imunologic. Majoritatea studiilor efectuate pe măduva osoasă umană și de șoarece, furnizează informații cu privire la existența a 16 proteine de suprafață. Chiar și între celulele izolate din diferite surse există o cantitate mică de variații imunologice 10.

Markeri negativi

Studiile arată că CSM nu exprimă CD11b (un marker celular imun), glicoforina-A (un marker eritrocitar), CD45 (un marker al celulelor hematopoietice). Markerul CD34, un marker primitiv al CS hematopoietice este rar exprimat în CSM umane, în schimb, acesta este prezent în CSM ale șoarecilor. De asemenea, markerii CD31 (expresia celulelor endoteliale și hematopoietice) și CD117 (marker al celulelor stem progenitoare) sunt absenți în CSM adulte și CSM ale șoarecilor. Problema actuală o reprezintă lipsa unui marker caracteristic, pozitiv al CSM. Cercetările au raportat o multitudine de markeri pozitivi, fiecare grup de cercetare folosind alt set. De aceea, fără un marker caracteristic, studiile in vivo asupra nișelor stem și descendențelor sunt dificile 19.

Markeri pozitivi

Stro-1 este cel mai cunoscut marker al celulelor stem mezenchimale. Populația de celule negative pentru Stro-1 nu este capabilă să formeze colonii, adică nu conțin CFU-Fs. Celulele Stro-1 pozitive pot deveni CSH de tip fibroblaste, celule musculare netede, adipocite, osteoblaste, condrocite, ceea ce este în concordanță cu rolul funcțional al CSM. Cu toate acestea, Stro-1 este puțin probabil să fie un marker general, din trei motive: nu se cunoaște niciun omolog Stro-1 la șoareci; expresia pozitivă Stro-1 nu este exclusivă celulelor stem mezenchimale, iar în al treilea rând, expresia CSM se pierde treptat în timpul expansiunii culturii, limitând utilizarea etichetei Stro-1 în timpul izolării și identificarea CSM în timpul anumitor pasaje 19.

Toate aceste restricții fac ca Stro-1, marker al celulelor stem mezenchimale să fie utilizat doar în asociere cu alți markeri, precum CD106 sau VCAM-1. Luate împreună, studiile arată că Stro-1 și CD106 sunt buni markeri al celulelor stem mezenchimale umane. Alți markeri existenți: CD 271/NGFR, CD105, CD90/Thz-1, CD44, CD29, CD13, Flk-1/CD309, Sca-1 și CD10 17.

Concluzie: Stro-1, CD73 și CD106 sunt cei mai folositori markeri, însă funcțiile lor încă rămân a fi studiate.

Caracterizarea celulelor stem și a progenitorilor celulari este extrem de importantă și relevantă pentru identificarea lor și utilizarea în cercetare sau pentru diferite terapii, în medicina regenerativă, caracteristici ce presupun cunoașterea funcțională și a markerilor fenotipici. În afara localizării lor tisulare tipice și identificării pe baza markerilor proteici sau epitopilor specifici, de obicei celulele stem nu pot fi clasificate doar pe baza unui singur marker proteic, ci a 6-8 markeri în același timp, datorită creșterii disponibilităților comerciale a anticorpilor monoclonali, citometriei etc 10.

De exemplu, analiza combinațiilor lineare pozitive și negative la markerii proteici, permite diferențierea celulelor stem hematopoietice de cele endoteliale, prin detecția simultană a expresiei diferitelor antigene. Există mai multe studii în prezent, în care sunt menționate caracteristicile celulelor stem de la nivelul sângelui periferic, tumori, ochi, intestin și alte localizări, studii realizate pe baza fenotipurilor celulelor stem 10.

În studiul de față, mai mulți cercetători au analizat celule stem diferite, derivate din țesuturi diferite, prezente chiar și în condiții patologice, precum boli hepatice, unde autorii au observat o mare implicare a acestora în regenerarea hepatică, prin realizarea fibrozei. A fost realizat un tabel în care au fost trecute țesuturile analizate, proveniența lor: umană sau animală, fenotipurile și markerii la care acestea au răspuns pozitiv/negativ. Fiecare grup de cercetare, pe măsură ce avansa în studiu, upgrada tabelul cu rezultatele obținute, pe baza cercetărilor făcute și pe baza literaturii adiționale. În tabel erau prezentate fenotipurile diferitelor celulele embrionice stem-like vSELs, celule stem neurale NSCs, celule stem hematopoietice HDCs, celule stem ale sistemului epitelial limbic LSCs, progenitori endoteliali EPCs, celule adipoase SA-ASCs, pericite și celule stem canceroase CSCs. Analizând tabelul, se observă că există o mare varietate a markerilor fenotipici analizați. Markerii exprimați de toate celulele evaluate au fost: CD34, CD45, CD105, CD133.

Analiza fenotipică a markerilor specifici celulelor stem a arătat că la nivelul ficatului, progenitorii endoteliali sunt caracterizați prin markerul KDR și expresia CD146 sau CD451 sau CD452, în concordanță cu analiza sangelui periferic și a celulelor adipoase endoteliale, un imunoreactivitatea CD45 nu a identificat EPCs 10.

Nivelurile de expresie pentru CD90 și CD146 par să fie diferite între celulele progenitoare endoteliale din ficat și țesutul adipos. De asemenea celulele stem din măduva osoasă și ficat, ambele caracterizate prin expresia CD45, diferă în exprimarea markerilor CD34 și CD 133, subliniind că detectarea a doi markeri este insuficientă pentru a putea identifica cu certitudine celule stem 22.

Celulele stem neuronale și progenitoare formează neurosfere cu potențiale diferite. Celulele precursoare neuronale au fost identificate cu expresiile CD133, CD15, CD24, A2B5, PSA-NCAM. Cu toate acestea, cele mai înalte niveluri CD 133, CD15 au fost identificate la progenitorii neuronali, în timp ce NSC a prezentat un nivel scăzut la acești markeri proteici 10.

Rămân deschise întrebările referitoare la diferența celulelor, au ele origine comună, dar organul/țesutul în care se găsesc le induce o expresie diferită? Sau fenotipurile lor diferă din cauza metodelor diferite de izolare? Paradigma conform căreia genele neuronale sunt exprimate doar în celulele cu origine neuroectodermală pare să nu fie validă, deoarece există și alte gene care exprimă celule stem de origine diferită, care nu participă la neurogeneză.Variațiile markerilor de expresie pot indica potențialul diferit al celulelor din țesuturi diverse sau surprinderea acestora în faze diferite ale ciclului celular. Fără nici o îndoială, sunt necesare investigații ulterioare pentru elucidarea mecanismelor, funcțiilor celulelor stem, diferențierea și utilitatea acestora în terapiile medicinei regenerative 22.

Izolarea celulelor stem

Celulele stem adulte găsite în pulpa dentară locuiesc ca mici nișe de celule nediferențiate. Celula stem mama prezintă capacitate nelimitată de auto-reînnoire, este multipotentă și dă naștere celulelor fiice cu potențial de reînnoire limitat.

Celulele stem fiice au un rol important în repararea tisulară, prezintă un înalt potențial proliferativ, de obicei rămân în stare latentă în țesuturile adulte, dar în momentul apariției unui stimul negativ la nivelul dintelui, acestea răspund injuriei producând celule odontoblaste. Studiile anterioare au încercat să realizeze izolarea celulelor stem și caracterizarea liniilor progenitoare. Celulele STRO-1 pozitive au fost izolate din pulpa dentară și exprimă markeri de celule vasculare CD 146 și antigene de pericite 3G5 (Shi și Gronthos, 2003; Miura și colaboratorii, 2004) 28.

Iohara și colaboratorii, demonstrează în anul 2006 că o populație de celule din pulpa dentară, care nu încorporează ADN-ul, leagă colorantul Hoechst 33342 și prezintă proprietăți asemenea celulelor stem. Din încercările inițiale de a izola colonii de celule stem prin expansiunea unei singure celule progenitoare din pulpa dentară s-a ajuns la concluzia că există o varietate substanțială de posibiltăți, în raport cu potențialul lor odontogenic pusă pe seama statusului embrional al celulei progenitoare 28.

În cursul dezvoltării dentare, celulele derivate din creasta neurală, cu origine ectomezenchimală, contribuie la formarea papilei dentare. Aceste celule neurale prezintă multipotență (Rao și Anderson, 1197; Deng și colaboratorii, 2004).

Smith și colaboratorii, în anul 2005, utilizează receptorul LANGFR, receptor cu afinitate scăzută pentru factorul de creștere nervoasă, izolează din pulpa dentară adultă o populație nesemnificativă numeric, al cărui potențial este neclar.

Studiul de față și-a propus să compare caracteristicile dintre existența unei singure populații stem progenitoare din pulpa dentară și existența a două populații stem progenitoare, utilizând metode de izolare diferite 28.

Material și metodă

Izolarea celulelor progenitoare cu proprietatea de adeziune preferențială la fibronectină

Studiul a fost realizat pe pulpa dentară a unor incisivi de șobolani Wistar, în vârstă de 28 de zile, combinată cu 4 mg/ml pentru o oră, la 37 ° C. Celulele au fost centrifugate, iar la 800 de grame din noul amestec s-au adăugat –MEM (ribonucleozide și dezoxiribonucleozide), 10 000 unități/ml penicilină, 10 g/ml streptomicină și 25 ml amfotericină B. Produsul obținut a fost depozitat peste noapte în șase godeuri, la 37° C cu 10g/ml de fibronectină. Rezultatul obținut: 4000 celule/ cm2 au fost însămânțate pe fibronectină și incubate din nou pentru 20 de minute la temperatura de 37° C, în timp ce celelalte celule neaderente au fost îndepărtate. La mediile de cultură nou însămânțate a fost adăugat 10% ser fetal de vițel pentru formarea coloniilor celulare 28.

Izolarea celulelor progenitoare prin activarea sortării celulare activate magnetic – celule progenitoare LANGFR pozitive

De această dată s-a folosit o singură suspensie celulară, centrifugată și resuspendată în 80 ml PBS/0,5% BSA/ 2mM EDTA, la un pH de 7,2, pentru 30 de minute, la 4° C. Douăzeci de microlitrii de microperle au fost adăugate celulelor și au fost sortate celulele aderente utilizând o coloană Miltenyi Biotech MS plasată într-un câmp magnetic. Pentru formarea coloniilor celulare s-au însămânțat 4000 celule/cm2 și cultivate în ser cu –MEM 28.

Eficiența formării coloniilor și dublarea populațiilor celulare

În cadrul studiului s-au numărat coloniile celulare însămânțate în fiecare godeu în zilele 3, 6, 10, 12, raportate procentual la numărul inițial de celule. În ziua a doisprezecea coloniile celulare au fost izolate și tratate cu EDTA-tripsină 0,25% și au fost notate la fiecare pasaj dublările celulare care s-au produs.

Concluzii: Studiul realizat pe plupa dentară a unor incisivi de șobolani Wistar, în vârstă de 28 de zile a demonstrat: formarea adipocitelor, determinată cu ajutorul markerului Oil Red O, diferențierea osteoblastelor, confirmată cu expresia Runx2 și osteopontină prin imunocitochimie și RT-PCR, iar diferențierea condrocitelor a fost indicată prin sinteza ridicată de proteoglicani, prin colorarea cu toluidină albastră. Imunocitochimia a fost utilizată pentru identificarea markerilor celulari stem exprimați prin expansiunea celulelor clonale și diferențierea markerilor folosind medii de culturi diferite 28.

După selectarea preferențială a celulelor cu aderență la fibronectină, din cele treizeci de colonii numărate în ziua a doisprezecea, reprezentând 36 000 de celule însămînțate, doar 185 dintre ele au prezentat potențial de aderență la fibronectină. S-a continuat izolarea acestora, însă o singură colonie a arătat o dublare a popolației, de aceea a fost luată independent pentru analiza ulterioară. Din cele 106 celule LANGFR pozitive folosite inițial pentru sortarea celulară activată magnetic, a supraviețuit clonării o singură colonie și la fel ca în cazul precedent, aceasta a fost ulterior analizată individual. Ambele populații celulare au prezentat caracteristici mezenchimale, atât cele aderente pozitiv la fibronectină, cât și cele LANGFR pozitive 28.

Studiate individual, cele două populații clonale au prezentat caracteristici foarte diferite, însă, examinate pentru expresia ARNm, ambele au prezentat expresia markerilor clasici de celule stem adulte cu CD31 și MSX-1 (celulele LANGFR pozitive, au prezentat expresia ARNm ridicată comparativ cu celulele FBN pozitive). Ambele populații prezintă multipotență și puse pe medii de cultură apropiate, s-a demonstrat existența markerilor pentru formarea adipocitelor, osteoblastelor și condrocitelor 29.

Celulele stem din pulpa dentară imatură, cu origine din creasta neurală contribuie la formarea papilei dentare alcătuită din populații celulare ectomezenchimale. Rezultatele studiului actual sunt interesante, deoarece celulele din creasta neurală au fost izolate dintr-un număr limitat de țesuturi non-neurale, incluzând aici intestinul (Kruger și colaboratorii, 2002), măduva osoasă (Hermann și colaboratorii, 2004), corneea (Amano și colaboratorii, 2006), pielea (Toma și colaboratorii, 2001, 2005) 30.

Pulpa dentară a fost gândită să conțină o serie de celule stem progenitoare, iar acest studiu caracterizează două populații celulare potențiale. Localizarea populațiilor celulare stem poate fi diferită și se presupune că nișa celulară de unde provin dictează caracteristicile și soarta celulelor progenitoare, precum si menținerea lor într-o stare diferențiată sau nediferențiată (Scadden, 2006) 20.

Tecles și colaboratorii, menționează în anul 2005 că, în momentul apariției unui stimul negativ la nivel pulpar, progenitori celulari stem răspund injuriei prin migrarea lor din regiunile perivasculare ale cavității pulpare, la locul de prejudiciu. Important de știut este faptul că, în studiul de față, populația progenitoare aderentă la fibronectină nu a exprimat markeri de suprafață CD105, markeri de expresie endotelială, de aceea nișele stem celulare pot proveni din localizări îndepărtate de regiunea perivasculară 28.

Nișele pulpare răspund diferit, sinergic sau secvențial la acelasi stimul negativ sau nișele pulpare diferite prezintă același tip de răspuns? Răspunsul la această întrebare continuă sa fie studiat și ar putea îmbunătăți reparația tisulară în viitor.

Studiu comparativ între două subpopulații stem utilizând markerii CD3, STRO-1 și c-kit

Datorită proprietăților lor de reparare a țesuturilor lezate și restabilirea parțială a funcțiilor organelor, celulele stem reprezintă un punct de interes pentru cercetătorii științifici în vederea descoperirii unor strategii terapeutice de utilizat în medicina regenerativă. Printre funcțiile celulelor stem se numără: capacitatea de auto-reînnoire, proliferare și diferențiere în alte linii celulare, diferențiere ce poate fi constatată prin schimbarea morfologiei celulei și expresia unor proteine tisulare specifice 31.

Printre multiplele localizări ale celulelor stem: măduva osoasă, piele, intestin, ficat, rețeaua sanguină etc., se numără și pulpa dentară, reprezentată de un țesut conjunctiv localizat în camera pulpară a dintelui. Această localizare prezintă un mare interes pentru cercetările actuale, prin facilitatea izolării acesteia, prin proceduri minim-invazive, comparativ cu alte surse. Celule stem adulte, din sursă umană pot fi obținute din pulpa dentară a dinților permanenți, a dinților temporari în faza de exfoliere, dinți supranumerari, de la nivelul papilei dentare apicale a dinților imaturi, de la nivelul ligamentului periodontal, etc.

Studiile anterioare au demonstrat că celulele stem reprezintă o populație celulară heterogenă, fără existența unui singur marker specific care să le exprime. Markerii uzali exprimați de celulele stem mezenchimale sunt: CD34, CD 44, CD 45, CD 73, CD 90, CD 105, CD 271, STRO-1, HLA-DR. STRO-1 este considerat a fi un marker specific al celulelor stem mezenchimale, în timp ce unele populații celulare pot fi pozitive pentru CD34, CD 117, dar negative pentru CD45. C-Kit, un receptor membranar al tirozin-kinazei, interacționează specific cu factorii celulelor stem și exprimă diferite tipuri celulare: melanocite, celule stem hematopoietice, celule stem adipoase, celule stem din măduva osoasă și de asemenea, Laino și colaboratorii au demonstrat că expresia c-Kit a fost găsită și la nivelul celulelor stem din pulpa dentară adultă. Așa cum am amintit mai sus, celulele stem din pulpa dentară exprimă markeri multipli, printre care și CD271, CD105, Notch2. CD271, unul dintre cei doi receptori ai neurotrofinelor, o familie de factori de creștere proteică ce stimulează celulele neuronale, inhibă diferențierea celulelor stem mezenchimale în osteocite, adipocite, condrocite și miocite (Mikami, Ishii Y, Watanabe, Shirakawa, Suzuki, Irie S și colaboratorii). Numeroase studii au confirmat multipotența celulelor stem, capacitatea de a se diferenția în tipuri celulare precum osteoblaste, celule musculare netede, adipocite, celule neuronale, dar, în prezent, numeroși antigeni de suprafață au exprimat existența celulelor stem, dar există o mare varietate de expresie, în funcția de sursa de proveniență. Feng și colaboratorii și Lv Fj și colaboratorii, concluzionează în studiile lor că izolarea celulelor stem mezenchimale, in vivo rămâne momentan neclară și declară că aceste celulele par a avea origine fibroblastică sau pericitică 27.

În studiul de față, Pisciotta, Alessandra Carnevale, Gianluca Meloni și Simona Ricc au analizat și comparat caracteristicile a două subpopulații ale celulelor stem din pulpa dentară adultă. S-a plecat de la ideea că ambele subpopulații celulare au selecție imună pozitivă pentru STRO-1 și c-Kit și s-a dorit compararea acestora în funcție de markerul CD34, pozitiv și negativ. Caracteristicile evaluate în acest studiu au fost: proliferarea celor două subpopulații, mentenanța stem, potențialul de diferențiere, senescența și apoptoza.

Societatea Internațională pentru Terapia Celulară – Comitetul Celulelor Stem Mezenchimale și Tisulare, menționează markerul CD34 ca fiind marker negativ al celulelor stem hematopoietice, în timp ce, markerul CD34 este universal recunoscut ca fiind un marker al celulelor stem hematopoietice. De-a lungul anilor, numeroase studii au analizat expresia markerului CD34 la nivelul celulelor stem, însă funcția lui rămâne momentan neclară. Tocmai de aceea, Pisciotta si colaboratorii au realizat un studiu comparativ între cele două populații: subpopulația celulelor stem din pulpa dentară adultă cu expresie pozitivă la STRO-1, c-Kit și pozitivă la CD34, comparativ cu subpopulația pozitivă la STRO-1, c-Kit și negativă la CD34. S-a ajuns la concluzia că cele două subpopulații prezintă caracteristici distincte raportate la rata de proliferare, mentenanța, senescența si apoptoza celulară. Cea mai importantă deosebire dintre cele două subpopulații a fost observată, in vitro, între liniile mezodermale și ectodermale. Ambele subpopulații nu au prezentat diferențe semnificative pe linie mezodermală, în schimb, subpopulația celulelor stem din pulpa dentară adultă STRO-1+/c-Kit+/CD34+ a prezentat tendință spre linia neurogenă. Celulele stem provenite din pulpa dentară adultă derivă și din mezoderem și din neuro-ectoderm, de aceea, studiul de față a studiat diferența celor două subpopulații pentru o mai bună întelegere și aplicabilitate a acestora în medicina terapeutică 27.

Metodă de lucru

Izolarea și sortarea celulară

Pentru studiul de față, Pisciotta și colaboratorii au folosit pulpa dentară adultă de la nivelul molarilor trei, incluși, obținută în urma unor extracții de rutină, cu acordul informat al pacientului. După extragerea pulpei dentare, aceasta a fost introdusă într-o imersie de: 3 mg/ml colagenază tip I+4 mg/ml dizolvată în α –MEM, timp de o oră, la 37o C. După dezagregarea enzimatică, pulpa dentară a fost disociată și filtrată în 100 μ m, pentru a obține o suspensie celulară. Aceasta a fost introdusă în eprubete de 25 cm2 și aplicată în mediu de cultură (α-MEM cu 10% ser fetal de vițel inactivat termic, 2 mM L-glutamină, 100 U/mL penicillină, 100 μg/mL streptomicină), la 37o C și 5% CO2. În zilele 3-4 cultura obținută a fost tripsinizată, resuspendată și placată la densitatea de 1,6 celule/cm2. În ziua a7-a, opt populații celulare au fost izolate din coloniile generate de celule singulare și extinse până la obținerea a 70% confluență și 5×106 celule au fost folosite pentru următoarea sortare magnetică (pasajul 2). Markerii STRO-1+/c-Kit + au fost obținuți utilizând antigene anti-STRO-1 de la șoarece și anti-c-Kit de la iepure [Abs, Santa Cruz]. Utilizând tehnologia MACS, prin folosirea antigenului anti-CD34 provenit de la șoarece, s-au separat cele două subpopulații cercetate: STRO-1+/c-Kit+/CD34− și STRO-1+/c-Kit+/CD34+ 27.

Proliferarea celulară

A fost analizată rata de proliferare a ambelor subpopulații de celule stem provenite din pulpa dentară adultă, însămânțate la o densitate de 4×103 celule/cm2, timp de o săptămână, până la obținerea confluării celulare, și numerate în fiecare zi. Numărătoare celulară a fost realizată pentru fiecare grup experimental, iar densitatea celulară exprimată în celule/ cm2 +/- deviația standard 27.

Populația dublată s-a calculate folosind formula:

, unde N7d reprezintă celulele numărate în ziua a șaptea, N1d – celulele numerate în ziua 1.

Pentru a determina rata de dublare a ambelor subpopulații, acestea au fost însămânțate pe mediu de cultură cu densitatea de 4×103 celule/cm2, până s-a obținut o confluență de 80% (pasajul 6). Pentru fiecare grup experimental s-au folosit trei eșantioane, aplicând următoarea formula:

, unde N este numărul de celule recoltate și Ns numărul de celule inițiale. Indicele de dublare a populațiilor a fost obținut prin adăugarea indicelui de dublare al fiecărui pasaj, la pasajul celular anterior 27.

Senescența și apoptoza celulară

Pentru a analiza cele două caracateristici ale subpopulațiilor celulelor stem, au fost analizate pasajele 6, însămânțate în 12 eșantioane și lăsate până au confluat. S-a calculat procentajul de senescență celulară pentru câte 3 eșantioane din fiecare grup de analizat. Apoptoza celulelor pozitive/negative la CD34 s-a analizat urmărind forma activată a caspazei 3. Toate celulele subpopulațiilor din pasajele 1 și 6 au fost procesate prin metoda Western blot și s-a analizat forma activată a caspazei 3 cu semnale celulare anti-caspază 3. Densitatea caspazei 3 activate s-a pus în evidență cu un software NIS (Nikon) (suma valorilor pixelilor minus valoarea de fundal pentru fiecare pixel dintr-o zonă delimitată), normalizând ulterior valoarea de fond și controlul unei benzi de actină 27.

Diferențierea multiliniară

Pentru determinarea diferențierii subpopulațiilor stem în linii cu potențial osteogenetic, miogenetic, adipogenetic și neurogenetic s-au folosit trei eșantioane pentru fiecare grup analizat. Pentru evaluarea acestei proprietăți, au fost însămânțate aproximativ 3×103 celule/cm2 , în mediu osteogenic (mediul de cultură a fost suplimentat cu 5% FCS, 100 μM 2P-acid ascorbit, 100 nM dexametazonă, 10 mM β- glicerofosfat). Pentru evaluarea expresiei proteinelor specifice de os, s-au folosit anti-osteopontină de șoarece, anti-osteocalcină de șoarece, anti-runx2 de iepure, timp de patru săptămâni după inducția osteogenică a ambelor subpopulații de celule stem din pulpa dentară adultă 27.

Pentru analiza potețialului miogenetic s-a realizat cultura celor două subpopulații cu C2C12 mioblaste de șoarece în concentrație de 10:1, în DMEM Glucoză înaltă, suplimentată cu 10% FCS, 2 mM L-glutamină, 100U/ml penicilină, 100 mg/ml steptomicină. După confluare, mediul de creștere a fost înlocuit cu DMEM Glucoză înaltă, suplimentată cu 1% FCS și 10 nM insulină, menținute în acest nou mediu timp de 2 săptămâni. S-a dorit testarea in vitro a tipurilor celulare non-miogenetice de a forma noi miotubuli și verificarea formării miotubulilor prin directa contribuție a celor două subpopulații de celule stem provenite din pulpa dentară adultă 27.

Pentru analiza potențialului adipogenic ambele subpopulații au fost însămînțate 24 de eșantioane, la o densitate celulară de 2×104 celule/cm2 și incubate în mediu adipogenic (0,5 mM izobutil-metilxantină, 1 μM dexametazonă, 10 μM insulină, 200 μM indometacină, 50 mg/ml gentamicină) , pentru trei săptămâni. Culturile au fost evaluate la fiecare trei zile în vederea formării cristalelor de lipide prin intermediul colorării uleiului rosu O și țesutului AdipoRed (conform instrucțiunilor; Lonza) 27 29.

Pentru analiza potențialului neurogenic, ambele subpopulații analizate au fost însămânțate pe 6 eșantioane la o densitate celulară de 2×104 celule/cm2. Ulterior, celulele au fost însămânțate pe medii de cultură suplimentate cu 1mM β- mercaptoetanol. După 24 de ore au fost spălate în PBS și differentiate în α-MEM ce conținea 10 mM β-mercaptoetanol, 2% dimetil sulfoxid și 200 μM butilat-hidroxianisol, lăsate până când au prezentat morfologie neuronală 27 31.

Expresia nestinei și CD271

Nestina reprezintă un filament proteic intermediar, aparținând familiei proteinelor, care este exprimată în timpul diviziunii celulare, în fazele inițiale ale dezoltării sistemului nervos central. Antigenul de suprafață CD271 este unul dintre cei doi receptori ai neurotrofinei, aparținând familiei factorilor de creștere proteici care activează și susțin diferențierea celulelor neuronale 27.

Rezultate

Cu ajutorul citometriei s-au analizat cele două subpopulații și s-a determinat procentual coeficientul de exprimare al markerilor STRO-1, c-Kit, CD34. Datele arată că ambele subpopulații au prezentat markerii STRO-1, c-Kit, iar 0,5% au fost negative la CD34, în timp ce aproximativ 20% din subpopulații a fost pozitivă la CD34 27.

La evaluarea subpopulațiilor celulelor stem din pulpa dentară adultă s-a obervat că: ambele subpopulații au prezentat o creștere în ziua a5-a, CD34- a înregistrat o proliferare importantă în ziua a8-a, în timp ce subpopulația CD34+ a înregistrat o scădere masivă între zilele 6 și 8. Datele CPD analizate arată că subpopulația CD34- a avut o creștere constantă în toate pasajele examinate, în timp ce subpopulația CD34+ a înregistrat un maxim de creștere în pasajul 3, apoi a încetinit în pasajele 4 și 5. În plus, timpul de dublare al subpopulației CD34- a fost mai scăzut comparativ cu cealaltă subpopulație: 19,91 +/- 2:30 ore, comparativ cu 24.55 +/- 4:20 ore 27.

Rezultate privind senescența și apoptoza subpopulațiilor analizate

S-a observat la microscop ca subpopulația CD34- a prezentat niveluri scăzute de β-galactozidază, comparativ cu subpopulația CD34+ care a prezentat procentaje semnificative. În cadrul subpopulației CD34+ s-a observat existența nucleilor picnotici, care denotă un proces de degenerare a nucleului celular, proces prezent în apoptoză și reducerea în volum a nucleului, fenomen prezent în pasajele finale 27.

Diferențierea multiliniară

Ambele subpopulații celulare stem provenite din pulpa dentară adultă au demonstrat că au potențial osteogenic, prin expresia osteocalcinei, exprimând markeri precum osterix și osteopontină. O altă confirmare a potențialului osteogenic îl reprezintă expresia colagenului de tip I, observată la analiza Western blot 27.

În ceea ce privește potențialul miogenic, ambele subpopulații au prezentat formarea mioblaștilor C2C12, apariția miotubulilor confirmând acest proces.

În ceea ce privește potențialul adipogenic, nu au fost observate diferențe între cele două subpopulații, ambele având capacitate de diferențiere, demonstrată prin apariția cristalelor lipidice, observate la microscop 27.

În ceea ce privește potențialul neuronal, subpopulația CD34+ a exprimat β-III-Tubulina, comparativ cu subpopulația CD34-. La analiza markerilor CD271 și a nestinei, s-a observat că subpopulația CD34- nu a exprimat niciunul dintre cei doi markeri, în timp ce populația CD34+ a fost pozitivă pentru ambii markeri, ceea ce demonstrează existența potențialului de activare și diferențiere în celule neuronale, implicate în dezvoltarea sistemului nervos central 27.

Utilizările celulelor stem de la nivelul pulpei dentare. Medicina regenerativă și ingineria tisulară

În ultimii ani biologia celulară și ingineria tisulară au luat amploare, încercând să ofere soluții medicinii regenerative. Medicina regenerativă însumează o serie de alte discipline cu scopul de a crea regenerarea țesuturilor funcționale, înlocuirea sau repararea unui organ sau a unei funcții pierdute odată cu înaintarea în vârstă, repararea în cazul unor boli sau defecte congenitale. Medicina regenerativă cuprinde biologia celulelor stem, biologia moleculară, genetică, inginerie chimică, nanotehnologie și alte discipline, care încearcă să proiecteze factori de creștere sau celule vii, in vitro, gata de transplantare 32.

Un nou concept atrăgător în terapia regenerativă actuală care ar putea face posibilă în viitor înlocuirea transplantului convențional este reprezentat de transplantul de celule stem pentru a repara țesuturile și organele afectate. Scopul medicinii regenerative este de a dezvolta terapii de înlocuire a organelor și țesuturilor deteriorate ca urmare a bolilor, leziunilor, îmbătrânirii cu un organ de bioinginerie complet funcțional, realizat pe baza tehnologiei tri-dimensionale, organ artificial care imediat transplantării in vivo ar putea deveni funcțional 32.

Pierderea unui dinte poate cauza multiple probleme fizionomice, fonatorii și funcționale. Un dinte de bioinginerie ar putea restaura funcțiile orale afectate 32.

Oshima și colaboratorii au realizat cu ajutorul bioingineriei medicale un astfel de dinte, care ulterior transplantării la nivelul cavității orale a unui șoarece adult a erupt ca o structură dentară corectă și a prezentat performanță masticatorie, funcții parodontale și reacții la stimulii nocivi. Transplantul unui astfel de dinte a fost propus și ca o alternativă viabilă pentru a repara defectele de resorbție osoasă apărute după pierderea dinților naturali 32.

În studiul de față s-a reușit realizarea unui dinte de bioingierie, controlat ca dimensiune, formă, lungime și transplantat în regiunea în care se pierduse un dinte. Procesul a fost urmat de integrare osoasă și restabilirea funcțiilor fiziologice, ceea ce face ca această terapie să aibă mare potențial în viitor 32.

Fig.1. Schema generală de producere a unui dintre prin inginerie medicală, utilizând celule stem (sursa: Stem cell sources for tooth regeneration, Keishi Otsu)

Scopul studiului realizat de George și Huang a fost să demonstreze că pulpa dentară și dentina afectate pot fi regenerate cu ajutorul celulelor stem progenitoare și a tehnologiilor de inginerie tisulară 33.

A fost testată posibilitatea regenerării vasculare a pulpei dentare umane la nivelul unui canal radicular gol, pe un dinte devital și producerea de dentină de neoformație pe baza pereților dentinari deja existenți, cu ajutorul celulelor stem. Studiul s-a realizat pe șoarece și au fost folosite celule stem de la nivelul papilei apicale dentare, izolate, însămânțate pe medii de cultură cu poli D,L-lactic-glicolidă și ulterior inserate în fragmentele dentare de șoarece. Rezultatele au arătat că spațiul radicular a fost ocupat în întregime de un țesut asemănător pulpei dentare, cu o vascularizație bine reprezentată. În plus, la nivelul canalului radicular s-a depus un strat continuu de țesut asemănător dentinei. Această structură nou produsă părea a fi produsă de un strat de celule de tip odontoblaști, deoarece au exprimat sialofosfoproteină dentinară, sialoproteină osoasă, fosfatază alcalină și CD105 33.

Acest studiu a oferit primele dovezi care arată că pulpa dentară afectată poate fi regenerată de novo în spațiul radicular, prin producere de celule asemănătoare odontoblaștilor, celule producătoare de dentină 33.

Pe lângă zonele de interes prezentate în studiile de mai sus, alte cercetări care au utilizat celulele stem prezintă rezultate interesante.

Endodonția regenerativă urmărește restabilirea vitalității pulpare și continuarea dezvoltării rădăcinii dentare, proces care implică eliberarea în interiorul canalului radicular a cheagului sanguin cu rol de matrice, împreună cu factori de creștere și celule stem. În vivo, transplantarea celulelor stem la șoareci imunocompromiși a dat rezultate satisfăcătoare, generând formațiuni asemănătoare complexelor pulpo-dentinare: țesut vascularizat asemănător pulpei dentare, în jurul căruia se afla un strat de odontoblaști și structuri asemănătoare tubulilor dentinari.

Alte provocări terapeutice bazate pe aplicabilitatea celulelor stem dentare sunt reprezentate de formarea sau regenerarea unui parodonțiu funcțional. Utilizarea celulelor stem parodontale și de la nivelul deltei apicale crescute pe medii de hidroxiapatită amestecată cu fosfat tricalcic a dus la reconstrucția unei rădăcini dentare perfect funcționale, inclusiv cu formarea de ligamente periodontale în jurul acesteia.

Concluzii

În urma cercetărilor și studiilor efectuate s-a ajuns la concluzia că pulpa dentară reprezintă o sursă importantă de celule stem, alături de alte țesuturi prezente la nivelul cavității bucale.

Prelevarea celulelor stem dentare este minim invazivă, facilă și se poate realiza atât de la nivelul dinților temporari, cât și la nivelul dinților permanenți.

Identificarea acestor noi surse de celule stem oferă imense oportunități de exploatare și utilizare în medicina regenerativă, în tehnicile de inginerie tisulară care vizează regenerarea structurilor dentare lezate, refacerea defectelor oro-faciale congenitale sau dobândite sau vindecarea altor boli sistemice importante.

Rezultatele folosirii celulelor stem provenite din surse orale sunt promițătoare și au generat rezultate interesante în cercetările efectuate: reparația dentinei afectate, a pulpei dentare și ligamentului parodontal, regenerare osoasă și nervoasă. Cel mai spectaculos rezultat este reprezentat de germenele dentar obținut in vitro cu ajutorul celulelor stem prin bioinginerie medicală, germene ce a generat la rândul lui un dinte complet și corect structurat, cu potențial de erupție după transplantarea în cavitatea bucală.

Cu toate acestea, este nevoie de studii numeroase și desfășurate pe termen lung pentru a înțelege proprietățile, funcțiile și limitele celulelor celulelor stem în dezvoltarea, patogeneza și regenerarea tisulară și pentru a fi utilizate in vivo în contextele clinice specifice.

În anatomia moleculară paneluri de markeri pentru celule stem sunt superpozabile pe subseturile de nișe stem dentare; identificările specifice trebuie să țină seama de condițiile experimentale, in vivo sau in vitro.

Deși experimente numeroase au identificat potențialul nișelor stem dentare pentru medicina regenerativă, majoritatea rezultatelor au fost obținute după xenogrefe, om-la-animal. Acestea trebuie privite cu circumspecție și apreciate specific.

Sunt necesare studii care să aprecieze substructurile celulelor din nișa dentară, către confirmarea sau infirmarea ipotezei conform căreia celula primordială a nișei este celula endotelială și nu pericitul.

Bibliografie

1. Rusu MC. Anatomia dezvoltării oro-faciale. București: INFOMEDICA; 2003.

2. Dumitriu HT. Tratat de Parodontologie: Editura Viața Medicală Românească; 2015.

3. Boboc G. Aparatul dento-maxilar. II ed; 2003.

4. V. A. Elemente de embriologie; 1963.

5. Schroeder HE. Oral Structure Biology: Embryology, Structure, and Function of Normal Hard and Soft Tissues of the Oral Cavity and Temporomandibular Joints: G. Thieme Verlag; 1991.

6. Andrei I. Tratat de Endodonție; 2015.

7. Diaz-Flores L, Gutierrez R, Madrid JF, et al. Pericytes. Morphofunction, interactions and pathology in a quiescent and activated mesenchymal cell niche. Histology and histopathology 2009; 24(7): 909-69.

8. Hirschi KK, D'Amore PA. Pericytes in the microvasculature. Cardiovascular research 1996; 32(4): 687-98.

9. Ashton N, de Oliveira F. Nomenclature of pericytes. Intramural and extramural. The British journal of ophthalmology 1966; 50(3): 119-23.

10. Tarnok A, Ulrich H, Bocsi J. Phenotypes of stem cells from diverse origin. Cytometry Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology 2010; 77(1): 6-10.

11. Dragoș Ștefănescu IS, Mircea Covic. Genetică medicală: Polirom; 2001.

12. Sell S. Stem cells handbook. II ed: Humana press.

13. Spradling A, Drummond-Barbosa D, Kai T. Stem cells find their niche. Nature 2001; 414(6859): 98-104.

14. Scadden DT. The stem-cell niche as an entity of action. Nature 2006; 441(7097): 1075-9.

15. Mitsiadis TA, Feki A, Papaccio G, Caton J. Dental pulp stem cells, niches, and notch signaling in tooth injury. Advances in dental research 2011; 23(3): 275-9.

16. Chen S, Lewallen M, Xie T. Adhesion in the stem cell niche: biological roles and regulation. Development 2013; 140(2): 255-65.

17. Alison MR, Islam S. Attributes of adult stem cells. The Journal of pathology 2009; 217(2): 144-60.

18. Corselli M, Chin CJ, Parekh C, et al. Perivascular support of human hematopoietic stem/progenitor cells. Blood 2013; 121(15): 2891-901.

19. Kolf CM, Cho E, Tuan RS. Mesenchymal stromal cells. Biology of adult mesenchymal stem cells: regulation of niche, self-renewal and differentiation. Arthritis research & therapy 2007; 9(1): 204.

20. Huang GT, Gronthos S, Shi S. Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs. those from other sources: their biology and role in regenerative medicine. Journal of dental research 2009; 88(9): 792-806.

21. Nuti N, Corallo C, Chan BM, Ferrari M, Gerami-Naini B. Multipotent Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells: a Literature Review. Stem cell reviews 2016; 12(5): 511-23.

22. Weissman IL, Anderson DJ, Gage F. Stem and progenitor cells: origins, phenotypes, lineage commitments, and transdifferentiations. Annual review of cell and developmental biology 2001; 17: 387-403.

23. Yasui T, Mabuchi Y, Toriumi H, et al. Purified Human Dental Pulp Stem Cells Promote Osteogenic Regeneration. Journal of dental research 2016; 95(2): 206-14.

24. Chen Y, Zhang F, Fu Q, Liu Y, Wang Z, Qi N. In vitro proliferation and osteogenic differentiation of human dental pulp stem cells in injectable thermo-sensitive chitosan/beta-glycerophosphate/hydroxyapatite hydrogel. Journal of biomaterials applications 2016; 31(3): 317-27.

25. Robey PG, Bianco P. The use of adult stem cells in rebuilding the human face. Journal of the American Dental Association 2006; 137(7): 961-72.

26. Mao JJ, Prockop DJ. Stem cells in the face: tooth regeneration and beyond. Cell stem cell 2012; 11(3): 291-301.

27. Pisciotta A, Carnevale G, Meloni S, et al. Human dental pulp stem cells (hDPSCs): isolation, enrichment and comparative differentiation of two sub-populations. BMC developmental biology 2015; 15: 14.

28. Waddington RJ, Youde SJ, Lee CP, Sloan AJ. Isolation of distinct progenitor stem cell populations from dental pulp. Cells, tissues, organs 2009; 189(1-4): 268-74.

29. Carbone A, Valente M, Annacontini L, et al. Adipose-derived mesenchymal stromal (stem) cells differentiate to osteoblast and chondroblast lineages upon incubation with conditioned media from dental pulp stem cell-derived osteoblasts and auricle cartilage chondrocytes. Journal of biological regulators and homeostatic agents 2016; 30(1): 111-22.

30. Ledesma-Martinez E, Mendoza-Nunez VM, Santiago-Osorio E. Mesenchymal Stem Cells Derived from Dental Pulp: A Review. Stem cells international 2016; 2016: 4709572.

31. Carnevale G, Pisciotta A, Riccio M, et al. Human dental pulp stem cells expressing STRO-1, c-kit and CD34 markers in peripheral nerve regeneration. Journal of tissue engineering and regenerative medicine 2016.

32. Oshima M, Mizuno M, Imamura A, et al. Functional tooth regeneration using a bioengineered tooth unit as a mature organ replacement regenerative therapy. PLoS One 2011; 6(7): e21531.

33. Huang GT. Dental pulp and dentin tissue engineering and regeneration: advancement and challenge. Frontiers in bioscience 2011; 3: 788-800.

34. Shepro D, Morel NM. Pericyte physiology. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology 1993; 7(11): 1031-8.

35. Casagrande L, Cordeiro MM, Nor SA, Nor JE. Dental pulp stem cells in regenerative dentistry. Odontology 2011; 99(1): 1-7.

Index de figuri în text

Fig. V-1 – Imunoexpresia pulpară a CD10. 52

Fig. V-2 – Pulpă dentară adultă, imunomarcare cu CD10. Miez pulpar cu vase largi de tip arteriolar și nervi. Stroma pulpară exprimă CD10 la nivelul unei rețele globale de celule stromale. Capilare născânde cu fenotip CD10 pozitiv. 52

Fig. V-3. Pulpă dentară adultă, imunomarcare cu enolază neuron-specifică. Antigenul este exprimat pozitiv într-un nerv pulpar de calibru important secționat oblic. În partea inferioară a imaginii este un tandem neuro-vascular cu un nerv pulpar de calibru mic ce exprimă enolaza neuron-specifică. Vasul respectiv are calibru mare și perete subțire, este deci de tip venulă. Celulele endoteliale exprimă enolază neuron-specifică și se identifică celula perivasculară cu fenotip NSE pozitiv. NSE nu este exprimat în mantaua pulpară. 53

Fig. V-4. Pulpă dentară adultă, imunomarcare cu enolază neuron-specifică. Celule din mantaua pulpară, plexul subodontoblastic, nu exprimă antigenul, însă endoteliile pulpare, vasculare nu exclusiv. Celule stromale izolate, fibroblastoide, exprimă NSE. 53

Fig. V-5. Pulpă dentară adultă, imunomarcare cu STRO-1. Mantaua pulpară cu expresie heterogenă. Endotelii imunonegative. 54

Fig. V-6. Pulpă dentară adultă, imunomarcare cu STRO-1. Două celule Stro-1 pozitive, de talie mare, rotund ovalare, la limita dintre miezul pulpar și mantaua pulpară, par a configura lumene vasculare. 54

Fig. V-7. Pulpă dentară adultă, imunomarcare cu STRO-1. Celule stromale de aspect fibroblastoid, aparent lipsite de prelungiri, exprimă Stro-1. Expresia endotelială a Stro-1 în endoteliile microvasculare este heterogenă. 55

Fig. V-8. Pulpă dentară adultă, imunomarcare cu CD34. Expresia exculsivă a antigenului în celulele endoteliale vasculare. Celulele mantalei pulpare sunt CD34 negative. Rețelele stromale pulpare sunt de asemenea CD34 negative. 55

Fig. V-9. Pulpă dentară adultă, imunomarcare cu CD45. Expresia CD45 într-o celulă stromală pulpară aparent lipsită de prelungiri. 56

Fig. V-10. Pulpă dentară adultă, imunomarcare cu nestină. Rețeaua stromală a miezului pulpar exprimă nestină. La limita miez-manta o celulă de talie mare, cu raport nucleu-citoplasmă mare și prelungiri dihotomice sugerează un fenotip stem. 56

Fig. V-11. Pulpă dentară adultă, imunomarcare cu nestină. Vas pulpar cu perete gros, înglobat în stroma nestin-pozitivă. 57

Fig. V-12. Pulpă dentară adultă, imunomarcare cu nestină. Mantaua pulpară nestin-pozitivă. Expresia puternică a antigenului în stratul odontoblastelor. 57

Fig. V-13. Pulpă dentară adultă, imunomarcare cu CD117/CD-kit. Expresie consistentă, dar heterogenă CD117/CD-kit în mantaua pulpară.Pulpă dentară adultă, imuno-markare cu CD117/c-kit. Nervi pulpari imuno-negativi. Rețea stromală pulpară C-kit pozitivă, construită din celule multipolare cu prelungiri. Sunt identificate și celule C-kit pozitive apolare. Expresia C-kit este heterogenă în stroma pulpară. 58

Fig. V-14. Pulpă dentară adultă, imunomarcare cu CD117/CD-kit. Nervi pulpari imuno-negativi. Rețea stromală pulpară C-kit pozitivă, construită din celule multipolare cu prelungiri. Sunt identificate și celule C-kit pozitive apolare. Expresia C-kit este heterogenă în stroma pulpară. 58

Fig. V-15. Pulpă dentară adultă, imunomarcare cu CD105. Expresia CD105 pozitivă în endoteliile vasculare, dar și în celulele izolate ale stromei pulpare, cu nuclei heterocromatici și citoplasmă puțină. 59