I. Capitolul 1. Cancerul colorectal colorectal … … … 9 [603561]

1

2
Cuprins

Cuprins ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………. 2
Lista abrevierilor ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……. 4
Introducere ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………. 6
Partea Generală ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………. 8
I. Capitolul 1. Cancerul colorectal colorectal ………………………….. ………………………….. ……………………… 9
I.1.1. Date epidemiologice ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………. 9
I.1.2 Factorii de risc pentru neoplasmul colorectal. ………………………….. ………………………….. ……. 11
I.1.2.1. Factorii de risc care nu pot fi influențați ………………………….. ………………………….. ………… 12
I.1.2.2. Factorii de risc care pot fi modificați ………………………….. ………………………….. ……………… 15
I. Capitolul 2. Celulele enterice gliale ………………………….. ………………………….. ………………………….. ….. 18
I.2.1. Descriere morfologică ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………. 18
I.2.2. Markeri comuni enterogliali ………………………….. ………………………….. ………………………….. … 19
I.2.3. Receptorii e xprimați de enteroglii ………………………….. ………………………….. ……………………. 20
I.2.4. Canalele ionice prezente la enteroglii ………………………….. ………………………….. ……………….. 21
I.2.5. Factorii eliberați de enteroglii ………………………….. ………………………….. ………………………….. 21
I.2.6. Funcțiile fiziologie ale celulelor enterice gliale ………………………….. ………………………….. …… 23
I. Capitulul 3. Implicațiile inflamației în cancerul colorectal ………………………….. ………………………….. . 26
I.3.1. Inițierea și progresia tumorală colorectală indusă de inflamație ………………………….. …….. 26
I.3.2. Rolul parainflamației în cancerul colorectal ………………………….. ………………………….. …….. 27
I.3.3. Strategii terapeutice modulatoare ale inflamației în cancerul colorectal ……………………… 27
Partea a II -a. Contribuții proprii ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………… 29
II.1. Scop și obiec tive ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………… 30
II.2. Material și metode ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………… 32

3
II.2.1. Încadrarea studiului ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………….. 32
II.2.2. Criteriile de includere și excludere din studiu ………………………….. ………………………….. ….. 33
II.2.3. Analiza histopatologică a materialului biologic ………………………….. ………………………….. .. 34
II.2.4. Achiziția și analiza imaginilor microscopice ………………………….. ………………………….. ……. 38
II.2.5. Prelucrarea statistică a datelor ………………………….. ………………………….. ……………………….. 42
II.3. Studiul clinico -epidemiologic al pacienților ………………………….. ………………………….. ………………. 43
II.4. Evaluarea celulelor enterice gliale care au exprimat GFAP ………………………….. ………………………. 50
din sistemul nervos enteric. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………… 50
II.5. Evaluarea infiltratului leucocitar intratumoral ………………………….. ………………………….. ……………. 66
II.6. Corelații între parametrii evaluați la pacienții incluși în studiu. ………………………….. …………………. 75
II.7. Discuții ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………… 76
II.8. Concluzii ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……… 79
Bibliografie ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………. 80

4
Lista abrevierilor
15dPGJ2 15-deoxy -Δ12,14-prostaglandin J2
ADP Adenozin difosfat
Ald1L1 Aldehyde dehydrogenase 1 family member L1
APC Adenomatous polyposis coli gene
AQP4 Aquaporin -4
CCR Cancer colorectal
CK1 Casein kinase 1
CLA Common leucocyte antigen
COX ciclooxigenaza
DAB 3-3’diaminobenzidina
EGFR Epidermal growth factor receptor
eNTPDase2 Nucleoside thriphosphate diphosphohydrolase 2
FAP Familial adenomatous polyposis
GABA Gamma -aminobutyric acid
GDNF Glial cell -derived factor
GFAP Glial fibrillary acidic protein
GSK3 Glycogen synthase kinase 3
GSNO S-Nitrosoglutathione
GTP -aze Guanozin trifosfataze
HNPCC Hereditary non -polyposis colorectal cancer syndrome
H-RAS Gena codificatoare: Harvey rat sarcoma viral oncogene homolog
IL-1β Interleukin 1 beta
INF-γ Interferon gamma

5
iNOS inducible nitric oxide synthase
IOD Integrated optical density
LEF Lymphoid enhancing factor
miRNAs MicroARN -uri
MMR Mismatch repair system
mTOR Mammalian target of rapamycin
NGF Nerve growth factor
NO Nitric oxide
PBS Phosphate buffered saline solution
PI3K Phosphatidylinozitol 3 -kinase
PIP2 Phosphatidylinositol 4,5-biphosphate
PIP3 Phosphatidylinositol 3,4,5 -triphosphate
PKB Protein kinase B
PPARγ Peroxisome proliferator -activated receptor γ
proEGF Pro-epidermal growth factor
RAS Rat sarcoma viral oncogene homolog
RTKs Receptor tyrosine kinases
SNE Sistemul nervos enteric
TGF -β1 Transforming growth factor beta 1
TLR Toll-like receptor
UTP Uridin trifosfat
VEGF Vascular endothelial growth factor
Wnt Wingless -related integration site

6
Introducere
Deși s -au făcut progrese mari, atât în ceea ce privește evoluția și patogenia
cancerului colorectal, cât și al screeningului și metodelor diagnostice și terapeutice, acest
tip de neoplasm continuă să fie al treilea cel mai frecvent tip de cancer diagnostic at în lume
și, de asemenea, a patra cauză principală de deces la nivel mondial [1]. Mecanismele
moleculare care stau la baza apariției acestei neoplazii sunt numeroase și, nu de puține ori,
blocarea căilor de semnalizare intra/intercelulare a avut rezultat e benefice, influențând în
sens negativ tumorigeneza colorectală, acest principiu stând și la baza apariției terapiilor
țintite molecular. Cu toate acestea, această neoplazie crează mari probleme, atât ca
morbiditate cât și ca mortalitate, de unde rezultă faptul că lucrurile nu sunt întru totul bine
cunoscute și este necesar, în continuare, să fie cercetate și mai multe posibile căi impl icate
în patogenia acestui tip de neoplasm, pentru a descoperi noi ținte terapeutice și pentru a
reduce indicatorii statis tici negativi în ceea ce privește această boală.
Am ales această temă de cercetare pornind, pe de o parte, de la datele
epidemiologice exprimate în primul paragraf, iar pe de altă parte, de la suspiciunea
implicării în carcinogeneza colorectală a unor ele mente ale sistemului nervos periferic,
enterogliile, împreună cu elementele inflamatorii.
Am structurat această lucrare de licență în două părți, în conformitate cu normele și
principiile actuale, referitoare la redactarea unei lucrări de licență .
Prima parte cuprinde trei mari capitole. În primul capitol am realizat o recenzie a
celor mai noi date referitoare la cancerul colorectal, punând accent în primul rând pe

7
factorii de risc și pe principalele elemente de carcinogeneză colorectală, pentru a putea
înțelege ulterior mecanismele prin care celulele enterice gliale și elementele inflamatorii
influențează carcinogeneza colorectală. Celulele enterice gliale și elementele inflamatorii
le-am analizat în ultimele două capitole ale primei părți.
În cea de -a doua parte mi -am expus contribuțiile proprii la tema de cercetare
abordată. Astfel, dup ă ce am structurat scopul și obiectivele studiului, am descris materialul
și metodele utilizate. Ulterior, am efectuat un studiu clinico -epidemiologic al pacienților
incluși în studiu, cu scopul de a utiliza aceste date în analiza expresiei celulelor enterice
gliale și infiltratului leucocitar intratumoral. De asemenea, am realizat corelații între
parametrii evaluați la pacienții incluși în studiu, după care am comparat d atele studiului
meu cu datele existente în literatură la ora actuală, cu referire directă sau indirectă la tema
abordată. În final am expus concluziile acestui studiu.
Pe această cale, doresc să mulțumesc în mod deosebit co ordonatorului științific,
domul Prof. Univ. Dr. Vere Cristin Constantin , pentru încrederea acordată, îndrumarea
oferită, sprijinul, înțelegerea și încurajarea permanentă.
Nu în ultimul rând, doresc să mulțumesc familiei mele, pentru că m -a susținut și m –
a încurajat tot timpul în finaliz area studiilor mele la Universitatea de Medicină și Farmacie
din Craiova .

8

Partea
Generală

9
I. Capitolul 1. Cancerul colorectal colorectal
I.1.1. Date epidemiologice
Cancerul colorectal (CCR) este al treilea cel mai frecvent diagnosticat tip de cancer
în lume și, de asemenea, a patra cauză principală de deces la nivel mondial, în anul 2012
înregistrându -se peste 1.3 milioane de cazuri noi (9.7% din totalul neoplasmelor, excluzând
alte cancere cutanate, în afară de melanom) și a determinat 690 000 de decese (8. 5% din
totalul deceselor cauzate de cancer, excluzând alte cancere cutanate, în afară de melanom)
[1].
În România, conform Organizației Mondiale a Sănătății, în anul 2012, cancerul
colorectal (CCR) a avut o incidență, pentru ambele sexe, de 10 256 cazuri (13% din totalul
cazurilor de cancer, indiferent de sexul pacienților din această țară), situându -se pe locul al
doilea după cancerul de plămân, care a înregistrat un număr de 11 644 de cazuri [2,3].
Pentru sexul feminin, s -a înregistrat o incidență a CCR de 4 496 cazuri de cancer
(aproximativ 13% din totalul cazurilor de cancer la femei), acesta fiind pe locul al doilea
după cancerul de sân, care a înregistrat 8 981 de cazuri (aproximativ 25% din totalul
cazurilor de cancer la femei), în tim p ce, pentru sexul masculin, s-au înregistrat 5760 de
cazuri , CCR pentru această categorie situându -se pe locul al doilea după cancerul
pulmonar, care a înregistrat o incidență de 9317 (aproximativ 22% din totalul cazurilor de
cancer la bărbați) [2,3]. În ceea ce pri vește rata de mortalitate cauzată de CCR pentru anul
2012 în România, s -a înregistrat un număr de 5675 decese pentru ambele sexe
(aproximativ 12% din totalul deceselor prin cancer la ambele sexe), mortalitatea prin CCR
fiind pe locul al doilea după mortal itatea cauzată de cancerul pulmonar, care a înregistrat
10071 decese pentru ambele sexe (aproximativ 21% din totalul deceselor pri n cancer la
ambele sexe) [2,3]. Pentru sexul feminin, s -a înregistrat o mortalitate prin CCR de 2446
de decese (aproximativ 1 3% din totalul deceselor prin cancer la femei), acesta fiind pe
locul al doilea după cancerul de sân, care a înregistrat 3244 decese (aproximativ 17% din
totalul deceselor prin cancer la femei), în timp ce, pentru sexul mascul in s-au înregistrat
3229 dece se (aproximativ 11% din totalul deceselor prin cancer la bărbați), mortalitatea

10
prin CCR pentru această categorie situându -se pe locul al doilea după cancerul pulmonar,
care a înregistrat o mortalitate de 8024 decese (aproximativ 28% din totalul deceselor prin
cancer la bărbați), situându -se astfel pe primul loc [2,3].
În Statele Unite ale Americii numărul estimat de cazuri noi de cancer colorectal,
conform NIH (National Cancer Institute), va fi, în 2017, de 135 430 (71 420 pacienți de
sex masculin și 64 010 pacienți de sex feminin), cu 50 260 (27 150 bărbați și 23 110 femei)
decese cauzate de această n eoplazie [4]. Incidența cancerului colorectal a crescut din anul
1975 până la mijlocul anilor 1980, ulterior înregistrându -se o ușoară scădere până în anul
2000, scădere atribuită în mod egal intervenției asupra factorilor de risc, cum ar fi reducerea
fuma tului, dar și implementării unor noi metode de screening [5,6]. În ceea ce privește
supraviețuirea pacienților cu CCR în SUA, conform NCI, pentru toate cazurile
diagnosticate între 2006 și 2012, evaluate în anul 2013, s -a înregistrat o supraviețuire la 5
ani de 65 % din totalul pacienților cu CCR, iar în funcție de extindere s -a înregistrat o
supraviețuire la 5 ani de 90 % pentru pacienții cu forme localizate, 71% pentru pacienții cu
forme extinse regional și doar 14 % pentru pacienții cu forme de CCR avan sate [ 6].
În Europa , conform OMS, în anul 2012, CCR a avut o incidență pentru ambele sexe
de 447 136 cazuri (13% din totalul cazurilor de cancer, indiferent de sexul pacienților),
situându -se pe locul al doilea după cancerul de sân, care a înregistrat un număr de 458 718
de cazuri [2,3]. Pentru sexul feminin s -a înregistrat o mortalitate prin CCR de 101 620 de
decese (13% din totalul deceselor prin cancer la femei), acesta fiind pe locul al doilea
după cancerul de sân, pentru care s -au înregistrat 131 347 decese (aproxi mativ 17% din
totalul deceselor prin cancer la femei), în timp ce, pentru sexul masculin s -au înregistrat
113 246 decese (aproximativ 12% din totalul deceselor prin cancer la bărbați) , mortalitatea
prin CCR pentru această categorie situându -se pe locul al doilea după cancerul pulmonar,
care a înregistrat o mortalitate de 254 706 decese (aproximativ 26% din totalul deceselor
prin cancer la bărbați), situându -se astfel pe primul loc [2,3]. Pentru bărbați, cea mai mare
incidență a CCR s -a înregistrat în țări le din Europa Centrală, cum ar fi Ungaria, Slovacia
sau Republica Cehă, spre deosebire de rate foarte scăzute de incidență, care s -au înregistrat

11
în Grecia și Cipru [ 7]. În ceea ce privește femeile, în țări precum Danemarca și Olanda s –
au înregistrat cele mai mari rate de incidență, urmate de Ungaria și Slovacia, în timp ce
Grecia și Finlanda au înregistrat cele mai mici rate de incidență [8]. Conform studiului
EUROCARE, în Europa, supraviețuirea pacienților cu CCR s -a îmbunătățit semnificativ
începând cu anii 1980. Astfel, din 1980 până în 2000 – 2002, supraviețuirea la 5 ani a
pacienților cu CCR a crescut de la 51% până la 60% în țările din nordul Europei, de la
52% la 62% în țările din Europa de vest și de la 45% la 58% în țările din Europa de sud, o
supraviețuire mai mare cu aproximativ 2% înregistrându -se în rândul femeilor, spre
deosebire de bărbați [ 8]. În general, rata supraviețuirii a fost mai mică la pacienții în vârstă
de 75 de ani sau mai mult și, de asemenea, în rândul pacienților care în momen tul
diagnosticului au prezentat cancer metastatic (neobservându -se aproape niciun progres
pentru aceștia), spre deosebire de cei cu boală locală sau regională, la care s -au înregistrat
progrese semnificative [ 8]. În ceea ce privește supraviețuirea pacienți lor cu CCR,
diferențele majore observate în multe țări din Europa se datorează mai multor factori.
Astfel, pe de o parte, se poate vorbi de dificultăți în ceea ce privește metodele de screening
și de diagnostic endoscopic, iar, pe de altă parte, poate fi v orba de modalități de îngrijire
diferite a pacienților cu CCR, toate acestea fiind sugerate de un procent mai mare al
pacienților cu stadii avansate în unele registre ale cancerului [ 9].

I.1.2 Factorii de risc pentru neoplasmul colorectal .
Riscul de a dezvolta neoplasm colorectal de -a lungul vie ții se datorează în mare
măsură stilului de viață nesănătos. Două studii efectuate de către Dunn JE și de către
McMichael AJ și colaboratorii, asupra persoanelor care au emigrat dintr -o zonă cu
incidență scăzu tă a CCR într -o zonă cu incidență crescută a CCR, au evidențiat că pentru
pacienții imigranți din zone cu risc scăzut de CCR, riscul de a dezvolta CCR de -a lungul
vieții a crescut, indicând astfel importanța factorilor de mediu asupra carcinogenezei
colore ctale [ 10]. Dacă se iau în considerare factorii de risc care țin de stilul de viață, CCR

12
poate fi prevenit prin modificarea acestora. Sunt însă și unii factori, care predispun la CCR
și nu pot fi modificați .

I.1.2.1. Factorii de risc care nu pot fi influ ențați
I.1.2.1.1. Sindroame ereditare
Majoritatea cazurilor de CCR apar sporadic, fără o cauză genetică prestabilită.
Tipurile de CCR, datorate mutațiilor genetice preexistente, tind să se manifeste în special
la pacienții sub 50 de ani, fiind responsabi le de mai puțin de 10% din totalul cazurilor de
CCR și sunt reprezentate, în cea mai mare parte, de sindromul cancerului colorectal ereditar
non-polipozic (“HNPCC” – hereditary non -polyposis colorectal cancer syndrome) și de
polipoza adenomatoasă familială (“FAP” – familial adenomatous polyposis) [1].
Sindromul cancerului colorectal non -polipozic, cunoscut și sub denumirea de
sindromul Lynch, este o boală moștenită, asociată cu susceptibilitatea genetică la diferite
tipuri de cancer. Persoanele care au f ost diagnosticate cu sindrom Lynch au un risc
semnificativ mai mare de a dezvolta cancer colorectal, însă există un risc crescut de a
dezvolta și alte tipuri de cancer, cum ar fi cancerul endometrial sau alte neoplasme
localizate la nivelul staomacului, gl andei mamare, ovarului, intestinului, pancreasului,
prostatei, tracului urinar, ficatului, rinichiului și căilor biliare [ 11]. Genele care sunt
implicate în apariția sindromului Lynch sunt gene responsabile de repararea defectelor
ADN -ului, defecte care apar în timpul replicării celulare și includ următoarele: MLH1,
MSH2, MSH6, PMS2 și EPCAM [ 11,12 ]. Din rândul persoanelor cu sindrom Lynch,
aproximativ 18% dintre bărbați și 19% dintre femei vor dezvolta CCR după vârsta de 50
de ani, iar după vârsta de 70 de ani, aceste procente vor crește la 45% pentru bărbați și 54%
pentru femei [ 12]. Efectuarea colonoscopiilor, cu eventualele excizii ale polipilor, dacă
acestea se impun, cât și efectuarea de ultrasonografii transvaginale și biopsii endometriale
sunt indicate la intervale de supraveghere de 1 -2 ani, întrucât s -a dovedit că reduc riscul de
a dezvolta CCR, față de pacienții supra vegheți la intervale mai mari sau egale de 2 -3 ani
[13].

13
Polipoza adenomatoasă familială (FAP) reprezintă al doilea cel mai frecvent
sindrom genetic predispozant pentru CCR, având o pondere de aproximativ 1% din totalul
cazurilor de CCR [ 14]. Această boal ă se caracterizează prin dezvoltarea de -a lungul vieții,
începând cu vârsta de 10 -12 ani, a sute până la mii de polipi colorectali, polipi care, dacă
nu vor fi excizați printr -o intervenție chirurgicală, ar crește riscul de a dezvolta CCR până
la aproape 1 00%, după vârsta de 40 de ani [ 14]. Polipoza adenomatoasă familială este o
boală genetică cu transmitere autozomală, care se datorează unei mutații a genei APC
(adenomatous polyposis coli gene) [ 15]. Proctocolectomia totală, cu sau fără
mucosectomie anală cu anastomoză ileo -anală, reprezintă indicația de intervenție
chirurgicală pentru prevenția CCR, în cazul pacienților cu polipoză adenomatoasă familială
[16].

I.1.2.1.2. Antecedente personale de boli inflamatorii intestinale.
Colita ulcerativă și Boala Crohn reprezintă două dintre cele mai frecvente forme
ale bolii inflamatorii intestinale, care pot provoca inflamație cronică în tot tractul gastro –
intestinal sau doar într -o parte a sa [1]. Inflamația cronică declanșează proliferarea
compensatorie a celu lelor epiteliului de acoperire al tubului digestiv, în vederea refacerii
țesuturilor deteriorate de inflamație, iar acest lucru crește probabilitatea de apariție a
mutațiilor genetice [ 17]. Secvența următoare, în acest proces fiziopatologic, este displazia
și, ulterior, țesutul neoplazic. În cazul acestor pacienți, carcinogeneza colorectală nu
evoluează prin cunoscutul adenom, precursorul clasic al CCR, ci, mai degrabă, prin
displazia indusă de procesul inflamator cronic [ 18]. Deși riscul CCR variază foarte mult în
cazul acestor pacienți, în funcție de durata și de amploarea procesului inflamator, dar și de
localizarea lui, persoanele aflate în această grupă de risc crescut, în special cele cu colită
ulcerativă, au o probabilitate de aproximativ 50% de a dez volta CCR dacă nu sunt tratate,
iar vârsta medie la diagnostic este între 40 și 50 de ani [ 18]. Astfel, alături de pacienții
diagosticați cu sindrom Lynch și FAP, pacienții diagnosticați cu colită ulcerativă fac parte
din primele trei subgrupuri cu risc ri dicat de a dezvolta CCR.

14

I.1.2.1.3. Antecedente le heredocolaterale de CCR.
Riscul de a dezvolta CCR este aproximativ dublu pentru persoanele care prezintă
istoric familial de CCR la o rudă de gradul întâi (părinți, frați și copii), riscul crescând și
mai mult dacă o rudă de gradul întâi prezintă CCR sau dacă aceasta a fost diagnosticată cu
CCR la o vârstă mai tânără [ 19]. Creșterea riscului de a dezvolta CCR, la pacienții care au
antecedente heredocolaterale pentru această boală, se atribuie materialu lui genetic
moștenit, dar și altor factori. De menționat că antecedentele heredocolaterale de CCR se
regăsesc la aproximativ 15 -20% dintre pacienții cu CCR 20].

I.1.2.1.4. Prezența polipilor colorectali
Polipii colorectali sunt formațiuni benigne în lumenul tubului digestiv, cu punct
de plecare în mucoasă. Din punct de vedere histologic, aceștia se clasifică în polipi
adenomatoși și polipi hiperplazici [ 21]. Polipii hiperpazici sunt, în general, non –
cancerigeni, însă un gru p distinctiv dintre aceștia, polipii cu aspect zimțat, sunt recunoscuți
ca având un potențial crescut de degenerare malignă și, ca atare, sunt considerați a fi leziuni
precanceroase [ 21]. Polipii adenomatoși sau adenoamele colonice au ca punct de plecare
celulele epiteliale secretoare ale mucoasei colonice și sunt în general formațiuni benigne
[1]. CCR sporadic se dezvoltă, în aproximatv 95% din cazuri, din adenoame, astfel aceste
leziuni reprezintă leziunea precursoare clasică a CCR, însă risc crescut de a se transforma
în neoplasm colonic îl au adenoamele cu dimensiuni peste 1 cm, cu componentă viloasă
prezentă și grad ridicat de displazie [ 22]. Aceste leziuni sunt frecvent întâlnite în țările
occidentale. Persoanele care au fost supuse adenomectomiei pot dezvolta recurențe
adenomatoase, aproximativ în trei ani de la intervenție, lucru ce impune supravegherea
ulterioară a acestora prin colonoscopie, mai ales că riscul de a dezvolta CCR, la persoanele
cu antecedente de adenom, este estimat a fi aproximativ 1 0 – 20% [ 23].

15
I.1.2.2. Factorii de risc care pot fi modificați
I.1.2.2.1. Exercițiul fizic .
Activitatea fizică este puternic asociată cu un risc scăzut de a dezvolta cancer
colorectal. Există studii care arată că persoanele cu activitate fizică desfășurată în mod
constant au un risc cu 25% mai mic de a dezvolta CCR, comparativ cu cei care au un stil
de viață sedentar [ 24]. Mai mult decât atât, persoanele care, înainte de a fi diagnosticate cu
CCR, desfășurau în mod constant activitate fizică, au risc mai scăzut de mortalitate,
comparativ cu persoanele care sunt mai sedentare [ 25]. O metaanaliză publicată de Schmid
D et al. în anul 2014, a evidențiat faptul că persoanele sedentare au un risc de a dezvolta
CCR cu aproximativ 25% până la 50% mai mare , comparativ cu cele mai puțin sedentare
[26]. Chiar și persoanele sedentare, care încep să desfășoare activitate fizică mai târziu, își
pot reduce riscul de a dezvolta CCR [ 27]. Ținând cont de aceste date, Societatea Americană
de Cancer și Centrele pentru controlul și prevenirea bolilor recomandă ca adulții să
desfășoare cel puțin 150 de minute de activitate fizică moderată sau 75 de activitate fizică
intensă în fiecare săptămână. Procentul persoanelor adulte din Statele Unite ale Americii,
care au îndepli nit aceste recomandări în privința activității fizice, a crescut de la 41% în
anul 2006 la 50% în anul 2013, ulterior înregistrându -se o stabilitate a numărului de
persoane care au îndeplinit recomandările în ceea ce privește activitatea fizică [4].

I.1.2.2.2. Obezitatea
În Europa, aproximativ 11% din cazurile de cancer colorectal au fost atribuite
excesului de greutate și obezității [ 28]. Datele epidemiologice sugerează că obezitatea este
asociată cu un risc de aproximativ 30 -50% de a dezvolta CCR în r ândul bărbaților, în timp
ce, pentru femei, riscul este mai mic [ 28]. Incidența CCR a fost semnificativ mai mare la
bărbații obezi, în toate studiile epidemiologice efectuate. Au fost identificate, de asemenea,
asocieri semnificative, în rândul bărbaților, între obezitate și diferitele segmente ale
colonului, indicele de masă corporală, țara de origine, activitatea fizică, consumul de alcool
sau antecedentele heredocolaterale, elemente ce au predispus, în special, la apariția

16
cancerului de colon, în timp ce , pentru cancerul localizat doar la nivelul rectului, nu s -au
înregistrat asocieri semnificative [ 29]. În ceea ce privește obezitatea și riscul de CCR la
femei, s -a observat o asociere mai mică decât în rândul bărbaților, aspect care poate fi
explicat prin efectul protector al hormonilor estrogeni, care induc obezitate și inhibă
proliferarea celulară [ 30].

I.1.2.2.3. Dieta
Diferențele în ceea ce privește incidența CCR la nivel global, dar și modificarea
riscului de a dezvolta CCR pentru imigranți, așa cu m am relatat la începutul acestui
subcapitol, au sugerat faptul că obiceiurile alimentare influențează puternic apariția CCR
[31]. Pe de altă parte, obiceiurile alimentare pot determina atât microbiotul de la nivelul
tubului digestiv, cât și răspunsul imun și inflamator de la acest nivel [ 32]. Unul dintre cele
mai frecvente obiceiuri alimentare nesănătoase este dieta occidentală, caracterizată prin
consumul ridicat de carne roșie procesată [ 33]. Într -o metaanaliză efectuată pe 11 studii
observaționale, ris cul de a dezvolta cancer de colon, dar nu și cancer de rect, a crescut
semnificativ la cei cu o dietă occidentală [ 34]. Consumul ridicat de carne roșie procesată
poate contribui la carcinogeneza colorectală nu numai prin efectele adverse asupra
concentrați ei insulinei circulante, ci și prin conținutul mare de fier și compușii cancerigeni
eliberați în momentul prelucrării, așa cum sunt compușii N -nitrozo, amine heterociclice,
hidrocarburile aromatice policiclice, produse, în special, când carnea este prelucr ată la
temperaturi ridicate [ 35].

I.1.2.2.4. Fumatul și alcoolul .
Atât consumul de alcool, cât și fumatul reprezintă factori de risc pentru cancerul
colorectal. O gamă largă de agenți cancerigeni din fumul de țigară pot ajunge la nivelul
mucoasei colorectale prin intermediul sistemului circulator și pot induce mutații ge netice
sau epigenetice, responsabile de carcinogeneza colorectală [36]. Investigând metaboliții

17
legați de fumul de țigară din ser, Cross și colaboratorii au concluzionat că doar trei dintre
aceștia sunt asociați, în mare parte, cu carcinogeneza colorectală și anume: cotinina, O –
crezol sulfatul și hidroxicotinina, dintre aceștia, cea mai puternică asociere cu cancerul
colorectal a avut -o hidroxicotinină [ 37]. Până în prezent, trei metaanalize au concluzionat
că există o asociere pozitivă între CCR și fumat; RR (riscul relativ) pentru fumători versus
nefumători a fost de 1.07, 95% CI (coeficientul de încredere) : 0.99 – 1.16; 1.17, 95% CI:
0.97 – 1.40; 1.20, 95% CI: 1.10 – 1.30) [38]. În ceea ce privește consumul de alcool, o
metaanaliză publicată în anul 2015 a evidențiat faptul că alcoolul consumat în cantitate
mică are un RR de 0.99 la un CI de 95%: 0.95 – 1.04, în cantitate moderată RR este de
1.17, CI 95%: 1.11 – 1.24, în timp ce, în cantitate mare RR este de 1.44, CI 95%: 1.25 –
1.65 [ 39]. Mecanismul pri n care alcoolul reprezintă un factor de risc pentru CCR este
datorat, în mare parte, unui metabolit al oxidării etanolului și anume acetaldehida, care este
cunoscută ca fiind un carcinogenă [ 40]. Mecanismul prin care aceasta poate influența
carcinogeneza c olorectală nu este foarte bine cunoscut, însă o posibilă cale poate fi
reprezentată de inhibarea metilării ADN -ului și de interacțiunea cu metabolismul
retinoidului, precum și de interacțiunea cu metabolismul acidului folic; de asemenea,
microbiotul bacter ian de la nivelul colonului poate contribui la metabolizarea etanolului,
lucru ce duce la o acumulare a metaboliților acestuia la nivelul colonocitelor, stimulând
astfel tranziția de la o celulă normală la o celulă cu proprietăți neoplazice [ 41].

18
I. Capitolul 2. Celulele enterice gliale

Gliobiologia enterică, la ora actuală, este încă în fază incipientă, iar abordarea aspectelor
morfologice ale acestui tip de celule în adenocarcinomul colorectal sper să contribuie la o mai
cuprinzătoare înțelegere a rolurilor lor.
Celulele enterice gliale fac parte din sistemul nervos autonom periferic enteric, situat în
peretele tubului digestiv, sistem ce cuprinde aproximativ 100 de milioane de neuroni enterici [ 42].
Elementele celulare enterice gliale și neuronale sunt organizate în plexuri ganglionare și
aganglionare [ 42]. Neuronii enterici și celulele gliale enterice comunică între ele, folosind toate
clasele de neurotransmițători care se găsesc și în creier, formându -se astfel circuite integrative care
sunt capa bile, moment cu moment, să regleze funcțiile tubului digestiv, chiar în absența semnalelor
de comandă ale sistemului nervos central (SNC) [ 43]. Prezența unui număr impresionant de
neuroni și celule gliale în peretele tubului digestiv este explicată prin fu ncția complexă pe care
sistemul nervos enteric (SNE) o desfășoară la nivelul tubului digestiv și, este logic, să alocăm
comanda unui sistem nervos local, mai degrabă, decât unui spațiu semnificativ din creier [ 43].

I.2.1. Descriere morfologică
Prima desc riere a celulelor enterice gliale este făcută în urmă cu aproximativ 115 ani de
către Dogiel, însă conceputul de enteroglie, ca o clasă de sine stătătoare de celule, a apărut după
mult timp, Giorgio Gabella fiind cel care a introdus termenul de celulă ente rică glială în anul 1981
[43]. Etimologic, cuvântul glie provine de la grecescu γλοια , care înseamnă lipici, mucilagiu [ 44].
Având în vedere multiplele atribute ale sistemului nervos enteric, asemănătoare creierului, este
ușor de speculat precum că putem considera celulele enterice gliale drept “astrocitele” intestinului.
Într-adevăr, Gabella a observat că celulele enterice gliale sunt asemănătoare ca morfologie
“grosieră”, ultrastructură și relații cu corpurile neuronilor enterici, cu astrocitele din SNC ,
comparativ cu aceleași aspecte ale celulelor gliale din sistemul nervos periferic sau cu celulele
Schwann și celulele satelit din SNC [ 43]. Asemenea astrocitelor, celulele enterice gliale au o formă
nerergulată, stelată, cu multiple ramificații, cu un co rp celular mic, din care cea mai mare parte
este ocupată de nucleu, citoplasma fiind în cantitate foarte mică [ 45]. Media diametrului nuclear

19
al celulelor enterice gliale este de 2 -3 µm, de aproximativ 10 ori mai mică decât media diametrului
nucleilor neur onali, iar corpul celulelor enterice gliale reprezintă doar o zecime din suprafața totală
a celulei, restul de suprafață fiind ocupat de ramificațiile care se extind pe întregul corp celular și
se intercalează în jurul neuronilor enterici [ 43]. Astfel, ce lulele enterice gliale sunt capabile să
creeze un micromediu neuronal și de tampon pentru neuronii enterici, iar stabilirea de contacte
sinaptice între ramificațiile enterogliilor și neuronii enterici denotă rolul important pe care îl au
aceste prelungiri [43]. În descrierea morfologică a celulelor enterice gliale este bine, de principiu,
să ținem cont de asemănarea cu astrocitele din SNC, însă trebuie să luăm în considerare unicitatea
enterogliilor, întrucât acestea au origine embriologică diferită de cea a astrocitelor, fapt evidențiat
de dezvoltarea enterogliilor, care necesită receptorul ErbB3 pentru neureguline, în timp ce
astrocitele nu necesită acest receptor, iar, pe de altă parte, glia enterică matură nu exprimă markerul
astrocitic L1, membru al fam iliei aldehid dehidrogenazei 1 (Ald1L1 – aldehyde dehydrogenase 1
family member L1) [ 46].
Pe baza localizării lor în straturile peretelui intestinal, recent, s -a propus o clasificare a
enterogliilor în 4 tipuri: tipul I de celule enterice gliale, localizate intraganglionar, cu formă stelată,
care se mai numește și tipul protoplasmic; tipul II sau tipul fibros de enteroglii, cu o formă mai
alungită, localizate, de obicei, interganglionar; tipul III, localizate la nivelul mucoasei și tipul IV
localiz ate la nivelul tunicii musculare a tubului digestiv [ 47]. Toate celulele enterice gliale par să
provină dintr -un grup comun de progenitori derivați din crestele neurale, iar expresia unui set
comun de biomarkeri, incluzând GFAP (glial fibrillary acidic pro tein), proteina S100 și factorii de
transcripție Sox8, Sox 9 sau Sox10, reflectă originea lor comună [ 48]. În ceea ce privește raportul
dintre numărul celulelor enterice gliale și numărul neuronilor enterici trebuie spus că acesta
variază, în mod substanț ial, în funcț ie de localizare și de specie

I.2.2. Markeri comuni enterogliali
Proteina fibrilară acidă glială (GFAP), proteina S100β de legare a Ca2+, cât și factorul de
trasncripție Sox10 sunt, de departe, cei mai utilizați markeri pentru enteroglii [ 43]. Fiecare dintre
aceștia, în funcție de situație, prezintă avantaje și dezavantaje. Proteina fibrilară acidă glială este
utilă pentru evaluarea ramificațiilor gliale, dar și pentru evaluarea morfologiei gliale, însă nu

20
etichetează corpurile celulare sau nucleii [ 43]. Mai mult decât atât, expresia GFAP în enterogliile
mature este modulată de diferențierea celulară, inflamația din jur, diferitele agresiuni din
micromediu. Chiar dacă, la ora actuală, nu sunt pe deplin elucidate rolurile acestei proteine,
expresia acesteia se corelează mult cu starea funcțională a enterogliilor, fiind și motivul alegerii
pentru studiul nostru [ 49]. Factorul de transcripție nucleară Sox 10 etichetează nucleii celulelor
gliale și este cel mai bun marker pentru a cuantifica num ărul de celule gliale, însă nu oferă
informații despre morfologia glială [ 43]. Proteina S100β poate eticheta corpul celulelor enterice
gliale, fiind localizată în citoplasma acestora, însă poate eticheta și alte elemente. Această proteină
aparține familiei de proteine S100, care include mai mult de 20 de structuri proteice ce leagă Ca2+
și Zn2+ și, în concentrație nanomolară, reglează homeostazia micromediului, iar în concentrație
micromolară se corelează cu un status inflamator [ 49].

I.2.3. Receptorii exprimați de enteroglii
Celulele enterice gliale exprimă o serie impresionantă de receptori pentru majoritatea
neurotransmițătorilor sau neuromodulatorilor cunoscuți de la nivelul tubului digestiv, majoritatea
receptorilor aparținând binecunoscutei superfa milii de receptori cuplați cu proteinele G, cei mai
mulți receptori fiind pentru nucleotide, însă există și receptori pentru catecolamine, purine sau
lipide bioactive [ 43]. Receptorii exprimați de celulele enterice gliale și liganzii lor sunt sumarizați
în Tabelul 1.
Tabelul 1 . Receptorii exprimați de către celulele enterice gliale.
Receptor Ligand Referințe
P2Y4 ATP (adenozin trifosfat)
UTP (uridin trifosfat) [50]
P2Y1 ADP (adenozin trifosfat) [51]
A2B Adenozină [52]
mGluR5 Glutamat [53]
α2A Norepinefrină [54]
α3-nicotinic Acetilcolină [55
SP1R, LPA1 Lipide bioactive (sfingozina -1
fosfat, acidul lisofosfatidic) [56]

21
5-HT2 Serotonină [57]

I.2.4. Canalele ionice prezente la enteroglii
Celulele enterice gliale exprimă pe suprafața externă a membranei celulare numeroase
canale ionice. Studii electrofiziologice și imunohistochimice au arătat faptul că enterogliile
exprimă atât canale de Na+ dependente de voltaj, dar și canale de K+ [43,58 ]. De asemenea, recent
au fost descoperite hemicanale transmembranare formate din Cx -43 (connexin -43), hemicanale
care prezintă azi un mare interes, deoarece par a fi implicate în numeroase funcții ale celulelor
enterice gliale [ 43]. McClain J. și colaboratorii au demonstrat, în 2014, că pentru a -și menține
funcțiile fiziologice gastrointestinale, enterogliile prezintă răspuns prin medierea ionilor de Ca2+
[43]. Astfel, prin manipularea cu agenți farmacologici sau prin supresia genetică a conexinei Cx –
43, pe modele de animale, au evaluat răspunsul enterogliil or prin medierea Ca2+ și au observat că,
inhibând farmacologic Cx -43 cu carbenoxolona, animalele respective au prezentat încetinirea
tranzitului intestinal, rezultând rolul pe care îl are acest hemicanal în implicarea enterogliilor în
menținerea motilități i intestinale [ 43]. De asemenea, studii recente au arătat că enterogliile
exprimă și canalul de apă, aquaporina -4 (AQP4 – aquaporin -4), mai ales cele de tip I și II,
speculând că acest tip de canal ar fi implicat în transportul apei la nivelul tractului g astro -intestinal,
iar prin analogie cu creierul, AQP4 de la nivelul enterogliilor poate fi implicată în formarea și
remiterea edemului produs în afectarea patologică locală [ 59].

I.2.5. Factorii eliberați de enteroglii
Până nu de mult, celulele enterice g liale au fost considerate, în mod clasic, ca drept celule
pasive, celule cu rol important pentru susținerea neuronilor enterici; la ora actuală, această teorie
nu mai este valabilă, deoarece s -a demonstrat că acest tip de celule joacă numeroase roluri în
menținerea, în particular, a homeostaziei sistemului nervos enteric și, în general, a tubului digestiv.
Pentru îndeplinirea acestor funcții, celulele enterice gliale fie sintetizează și eliberează, fie numai
transportă o serie de compuși, prin intermediul c ărora își pot exercita funcțiile [ 43]. Cel mai
eliberat factor de către enteroglii este ATP -ul, care joacă un rol important în modularea
neurotransmisiei enterice, dar și în motilitatea intestinală [ 60].
Un alt compus eliberat de către celulele enterice gliale este reprezentat de oxidul nitric , un
neurotransmițător inhibitor cheie la nivelul sistemului nervos enteric, compus care are un rol

22
important, mai ales în patologie, prin determinarea stresului oxidativ [ 61]. Oxidul nitric, la nivelul
celulelor en terice gliale, este produs de către enzima oxidnitricsintetaza (iNOS – inducible nitric
oxide synthase) și, de obicei, apare numai ca răspuns la agresiune, iar cantitățile mari de oxid nitric
pot avea efect protectiv sau dăunător în funcție de circumstanțe , oxidul nitric putând modula, de
asemenea, transportul ionilor la nivelul canalelor membranare enterogliale [ 61].
Prostaglandina E2 (PGE2 – prostaglandin E2), produsă de celulele enterice gliale, este un
compus care poate acționa ca modulator al neurotran smisiei enterice, ca vasodilatator sau ca factor
care contribuie la stresul oxidativ în patologie, însă rolurile acestui compus în sistemul nervos
enteric intact rămân încă necunoscute [ 62].
In contrast cu factorii eliberați de enteroglii, factori care int ervin, mai ales, în inflamație,
celulele enterice gliale produc și factori protectivi, cu acțiune antioxidantă. Astfel, un antioxidant
glial este 15dPGJ2 (15 -deoxy -Δ12,14-prostaglandin J2) [ 63]. 15dPGJ2 acționează pe receptorul
PPARγ (peroxisome proliferator -activated receptor γ) și este un factor exprimat la nivelul
nucleului, care, atunci când este activat, inhibă proliferarea celulelor epiteliale din mucoasa tubului
digestiv și induce diferen țierea lor [63].
Un alt factor eliberat de celulele enterice gliale, tot cu rol antiproliferativ asupra celulelor
epiteliului tubului digestiv, este TGF -β1 (Transforming growth factor beta 1), care are un rol cheie
în controlul proliferării celulare, prin oprirea ciclului celular datorată scăderii activită ții ciclinelor
G1/S și a kinazelor dependente de acestea [ 64].
GSNO (S-Nitrosoglutathione) este un compus eliberat de către celulele enterice gliale, care
scade permeabilitatea la nivelul mucoasei tubului digestiv, prin favorizarea expresiei proteinelor
care fac parte din joncțiunile strânse de tip ZO -1, ocludina și P -MLC. Astfel, Cheadle GA și
colaboratorii au demonstrat recent, pe culturi de celule enterice gliale împreună cu celule epiteliale
intestinale, că dacă acestea sunt expuse la TNFα ( Tumor necro sis factor alpha), INF -γ (Interferon
gamma ) și IL -1β (Interleukin 1 beta ), permeabilitatea celulelor intestinale epiteliale nu crește,prin
rolul jucat de GSNO în favorizarea expresiei proteinelor joncționale [ 65].
Eliberarea, de către celulele enterice gl iale, de proEGF (pro -epidermal growth factor)
contribuie la menținerea integrității barierei intestinale epiteliale și, de asemenea, la repararea
acesteia în urma agresiunilor locale [ 66].

23
În ceea ce privește neurotrofinele eliberate de către celulele ente rice gliale, datele nu sunt
clare și cantitatea de informații referitoare la acest subiect este redusă. Cert este că celula enterică
glială poate produce și NGF (nerve growth factor), care este implicat în menținerea integrității
neuronale și a celulelor e piteliale intestinale, dar și în supraviețuire și proliferare celulară. Pe de
altă parte, factorul neurotrofic derivat din celulele enterice gliale (GDNF – glial cell -derived
factor) este atribuit uneori celulelor enterice gliale, iar alteori fibrelor mus culare netede din
peretele tubului digestiv [ 67].
Trebuie amintită și sechestrarea și/sau degradarea unor compuși neuroactivi de către celule
enterice gliale perisinaptice, care le conferă acestora un important rol în neurotransmisie. Astfel,
enterogliile exprimă peptide transportoare, cum ar fi PET2 și transportorul pentru acidul
gamaaminobutiric (GABA – gamma – Aminobutyric acid) GAT2 [ 68]. Pe de altă parte, celule
enterice gliale încorporează anumiți compuși eliberați de neuronii enterici pentru a -i degra da, așa
cum se întâmplă cu ectonucleotidaza eNTPDase2 (nucleoside thriphosphate diphosphohydrolase
2), care hidrolizează ATP -ul în ADP [ 69].

I.2.6. Funcțiile fiziologie ale celulelor enterice gliale
Menționările anterioare relevă că rolurile celulelor enterice gliale nu sunt numai de suport
trofic și susținere a neuronilor enterici, așa cum se credea până în urmă cu 15 ani. Mai ales în
ultimii 5 -6 ani, optica asupra funcțiilor celulelor enterice gliale a fost complet schimbată, dator ită
numeroaselor studii care au demonstrat implicarea acestui tip de celule în aproape toate funcțiile
tubului digestiv.
În privința suportului asigurat neuronilor enterici de către enteroglii, putem spune că
acestea furnizează precursori esențiali pentru sinteza neurotransmițătorilor, incluzând NO,
glutamatul și GABA, conțin transportori pentru anumiți neurotransmițători și ajută la degradarea
altor neuromodulatori, așa cum se întâmplă în cazul eNTPDase2 -ei [69]. De asemenea, canalele
trasmembranare glia le au rol important în neurotransmisie și previn moartea neuronilor enterici,
care poate apărea prin excitotoxicitate, prin reglarea și tamponarea pe suprafața extracelulară a
potasiului [ 58]. În ceea ce privește neurogeneza enterală , s-a demonstrat că, în cultură, celula
enterică glială este capabilă să se diferențieze în neuron funcțional enteric, însă “in vitro”
potențialul terapeutic, reprezentat de această capacitate a enterogliilor, trebuie utilizat astfel încât

24
să se păstreze și statusul de celule e nterice gliale adulte, care să -și îndeplinească funcțiile
fiziologice [ 70] .
Referitor la rolul celulelor enterice gliale în motilitatea tubului digestiv, concluziile au fost
trase mai mult indirect, însă aceste concepte au devenit din ce în ce mai credib ile, datorită
persistenței acelorași concluzii în situații diferite. Astfel, un prim studiu a evidențiat faptul că
șoarecii care au fost tratați cu 6 -aminonicotinamidă (o gliotoxină), care a indus gliopatia enterică,
au prezentat diaree [ 71]. Studii rece nte au demonstrat că prin utilizarea in vitro a unei alte
gliotoxine, fluorocitratul, celulele enterice gliale sunt implicate în transmisia neuromusculară și
motilitate [ 72]. Mai mult decât atât, s -a demonstrat că în suprimarea genetică a genei codificatoa re
a Cx -43, răspunsul celulelor enterice gliale, mediat de ionii de Ca2+ prin intermediul CX -43, este
absent și apare o afectare a motilității intestinale și a tranzitului intestinal [ 43]. Cu toate acestea,
sunt necesare studii ulterioare, care să clarific e mecanismul prin care celulele enterice gliale
influențează motilitatea tubului digestiv.
Celulele enterice gliale intervin în menținerea integrității barierei intestinale și in
modularea funcțiilor tubului digestiv, astfel încât, recent, s -a propus exis tența unei unități glio –
neuro -epiteliale, iar alterarea acesteia are multe efecte negative asupra funcțiilor tubului digestiv
[73]. Integritatea barierei intestinale epiteliale este menținută prin joncțiunile intercelulare ocluzive
sau strânse, joncțiunile de ancorare sau aderente, joncțiunile de comunicare de tip gap și joncțiunile
cu situsuri de legare formate din filamentele intermediare sau desmozomii [ 74]. S-a demonstrat că
administrarea intraperitoneală de GSNO (care poate fi secretat și de enteroglii ) inhibă, in mod
evident, permeabilitatea intestinală crescută, indusă de ablația celulelor enterice gliale, la șoareci
transgenici (lucru important pentru impiedicarea elementelor intraluminale, inclusiv bacterii, de a
trece direct în sănge). Acest fenome n este posibil prin inducerea de către GSNO a expresiei unor
proteine importante în joncțiunile intercelulare de la nivelul mucoasei tubului digestiv, cum ar fi
proteinele F -actinin perijoncționale, proteinele de tip ZO -1 (zonula occludens -1) și ocludina [ 75].
Un rol protector al enterogliilor asupra mucoasei tubului digestiv împotriva agresiunii
exercitate de bacteriile de la acel nivel poate, de asemenea, să ofere noi perspective terapeutice în
protecția și reglarea barierei tubului digestiv [ 76]. După cum se știe, Shigella Flexneri este unul
dintre principalii agenți patogeni enteroinvazivi, răspunzători de distrugerea epiteliului intestinal.
Un factor cheie de invazie a acestei bacterii este cdc42, factor care poate fi inhibat de către celulele
enteri ce gliale și, astfel, acestea s -ar opune invaziei de către S. Flexneri, oferind protecție mucoasei
intestinale [ 77]. În plus față de acest mecanism de proteție, enterogliile pot crește expresia

25
proteinelor joncționale și pot diminua secreția mucosală a cit okinei proinflamatorii IL -8 [77]. O
latură interesantă a acestui aspect este acțiunea bidirecțională dintre enteroglii și microbiomul
tubului digestiv [ 47]. Studii recente sugerează că prezența bacteriilor intestinale are un efect major
asupra dezvoltării enterogiilor mucoasei digestive, Kabouridis și colaboratorii demonstrează, în
anul 2015, că celule precursoare gliale nu mai apar în momentul în care șoarecii sunt tratați cu
antibiotice sau la șoarecii care nu au niciun germen în tubul digestiv, însă meca nismul acesta nu
este pe deplin cunoscut [ 78].
Teoretic, este posibil însă ca bacteriile să influențeze direct celulele enterice gliale prin
acțiunea asupra receptorilor TLR -3, -4, și -7 (Toll -like receptor), însă acest lucru ar însemna ca
enterogliile de la nivelul plexului Auerbach, care, în mod normal, nu sunt expuse contactului direct
cu bacteriile, să nu fie afectate [ 79]. Influența s -ar putea produce, totuși, prin intermediul celulelor
epiteliale și prin intermediul celulelor imune de la acest nivel, însă cu toate acestea, problema
continuă să rămână fără răspuns [ 80].

26
I. Capitulul 3. Implicațiile inflamației în cancerul colorectal

Până la ora actuală s -au elaborat multe studii cu privire la implicațiile inflamației în
cancerul colorectal, însă abordarea lor succintă în acest capitol este făcută cu scopul de a înțelege
corelațiile între celulele enterice gliale și infiltratul leucoci tar intratumoral. Ca atare, vom încerca
să surprindem sintetic cele mai importante informații existente despre rolurile elementelor
inflamatorii în CCR.

I.3.1. Inițierea și progresia tumorală colorectală indusă de inflamație
Este puțin probabil ca inflamația să determine CCR sporadic, deoarece majoritatea
celulelor imune intratumorale sunt recrutate după formarea tumorii și, în acest caz, inflamația nu
precede, ci urmează inițierii tumorale colorectale [ 81]. Cu toate acestea, după inițierea tumorală,
micromediul tumoral recrutează celule inflamatorii, care pot genera acumularea de mutații
suplimentare în genomul celulelor neoplazice, contribuind astfel la progresia tumorală [ –82,83 ].
În principiu, toate elementele inflamatorii au un rol antitumoral într -o primă fază, însă abilitatea
celulelor neoplazice constă în a scăpa de sub supravegherea imună, astfel că, într -o fază ulterioară,
elementele inflamatorii favorizează inițierea, progresia și metastazarea cancerului colorectal [ 83].
Celulele inflamatorii, care pot favoriza progresia tumorală, sunt limfocitele T CD4+ și CD8+, prin
producția de citokine (IL -6, -10, 17, – 21, – 22, INFγ, limfotoxine, RANKL) sau prin citotoxicitate
directă, limfocitele T reglatoare (T reg) prin produ cția de IL -10 și TGF -β și prin imunosupresie,
macrofagele și neutrofilele atrase intratumoral, prin producția de citokine (IL -1, -6, -23, VEGF,
TNF), chemokine, metaloproteinaze și prin imunosupresie, celulele NK prin producția de citokine
(INF -γ, IL -17, -22) [ 81].
Numeroase celule și elemente inflamatorii pot avea rol protumorigenic. Astfel, f actorul de
necroză tumorală, TNFα, determină alterări ale ADN -ului, împiedică repararea corectă a acestuia,
ducând, în cele din urmă la inducerea de factori angiog enetici și promovează progresia și
metastazarea tumorală [ 84]. Factorul NF-kB mediază progresia inflamației, favorizează inflamația
cronică, determină apariția de specii reactive de oxigen, favorizează scăparea celulelor de sub
controlul apoptozei, influențând pozitiv progresia și metastazarea tumorală [ 85]. De asemenea,

27
din aci dul arahidonic, provenit din membranele celulare, se produce o varietate de eicosanoide
care, în mod uzual, sunt produse de trei enzime: ciclooxigenaza (COX), lipooxigenza (LOX) și
citocromul p450, eicosanoide, cum ar fi PGE2, care stimulează proliferarea celulară, angiogeneza,
și inhibă apoptoza, dar favorizează și expresia mai multor oncogene. ce pot fi implicate în
tumorigeneza colorectală [ 82].

I.3.2. Rolul parainflamației în cancerul colorectal
Un nou tip de inflamație, cu efecte considerabile asup ra tumorigenezei colorectale, este
parainflamația [ 83]. Aceasta este un stadiu intermediar între inflamația cronică și homeostazia
bazală, caracterizată prin activarea a numeroase gene, care codifică factori implicați în răspunsul
imun înnăscut, ce favoriz ează scăderea chemokinelor și, prin urmare, un răspuns antitumoral
scăzut [ 86]. Parainflamația a fost descrisă mai întâi pe un model de șoareci, la care s -a realizat
ablația genei codificatoare pentru CKIα, o moleculă reglatoare pentru calea Wnt, cu produ cerea
unor erori în ADN și cu pierderea funcției proteinei p53, favorizând astfel progresia tumorală [ 87].
Parainflamația poate juca, de asemenea, un rol important în transformarea polipilor colorectali
izolați în neoplasm colorectal [ 83].

I.3.3. Strate gii terapeutice modulatoare ale inflamației în cancerul colorectal
Datorită rolului jucat de elementele inflamatorii în patogenia CCR, acest tip de neoplasm
ar putea fi un candidat bun pentru tratamentul sau prevenția cu agenți antiinflamatori.
Acidul acetilsalicilic (aspirina) este utilizată la ora actuală în tratamentul și prevenția
evenimentelor cardiovasculare. Conform studiilor actuale, aceasta, prin inhibarea ciclooxigenazei
și/sau parainflamației, poate fi benefică în cazul pacienților cu risc mediu sau crescut de a dezvolta
cancer colorectal sporadic sau familial [83]. S-a observat în studii prospective, efectuate la pacienți
cu risc crescut de CCR, cum ar fi cei cu FAP (Familial adenomatous polyposis), cu sindromul
Lynch sau cu istoric de adenom (elemente descrise la factorii de risc), că utilizarea aspirinei reduce
semnificativ apariția CCR [ 88]. La ora actuală, încă sunt studii clinice în curs de desfășurare
despre terapia adjuvantă cu aspirină în cazul pacienților cu CCR avansat sau pe ntru prevenția
recurenței polipilor colorectali [89].
Coxibii, o altă clasă de antiinflamatoare nesteroidiene, dar de data aceasta cu selectivitate
asupra ciclooxigenazei 2 (COX -2), utilizați în mod frecvent pentru analgezia și tratamentul

28
anumitor afe cțiuni reumatologice, pot reduce riscul de CCR în populația cu risc crescut, însă
utilizarea lor pe termen prelungit este limitată, datorită toxicității cardiovasculare pe care aceștia o
au [90].
Inhibitorii de PD -1 (programmed cell death protein 1, o p roteină care joacă un rol important
în scăderea activității protumorale a limfocitelor T imunosupresoare), nivolumabul și
pembrolizumabul, au fost utilizați în trialuri clinice de fază II, în care s -a raportat un răspuns
favorabil și o creștere a supravieț uirii pacienților cu CCR, care au asociat un defect al sistemului
de reparare a erorilor ADN, MMR, care au fost tratați cu acești anticorpi monoclonali [ 91].
Anticorpii monoclonali împotriva IL -6, tocilizumabul și siltuximabul, utilizați până acum
în afecțiunile reumatice și în boala Castelman, au fost folosiți în trialuri clinice de fază I/II la
pacienți cu tumori solide, incluzând CCR, cu efecte preliminare antitumorale [ 92].
Inhibitorii de TNF, infliximabul, etanerceptul și adalimumabul, pot, de ase menea, aduce
beneficii în tratamenul pacienților cu CCR, ei fiind utilizați, în prezent, pentru tratamentul bolii
inflamatorii intestinale (care este un factor de risc pentru CCR) sau a numeroase afecțiuni
reumatologice autoimune [ 93].
Nu în ultimul rând, aș vrea să amintesc aici anakinra, un inhibitor de IL -1β, care
este sintetizată de neutrofilele din infiltratul leucocitar intratumoral, cu rol critic în
tumorigeneza colorectală [ 94]. IL-1β induce apariția a numeroși factori de creștere, cum
ar fi VEGF, favorizând astfel progresia și metastazarea tumorală [ 95]. La ora actuală, se
află în derulare un studiu clinic de fază II cu 5 -fluorouracil și bevazicumab (un anticorp
monoclonal împotriva VEGF), în asociere cu anakinra, în tratamentul CCR metastazat
[96].

29

Partea a II -a.
Contribuții
proprii

30
II.1. Scop și obiective

Am ales această temă de cercetare pornind, pe de o parte, de la datele
epidemiologice despre cancerul colorectal, date care evidențiază o incidență crescută și o
mortalitate ridicată la nivel mondial, iar pe de altă parte, de la suspiciunea implicării în
carcinogeneza colorectală a unor elemente ale sistemului nervos periferic și anume
enterogliile, împreună cu elementele inflamatorii.
Atât elementele inflamatorii, cât și cel ulele enterice gliale pot fi responsabile de
influențarea unor mecanisme care se desfășoară, de cele mai multe ori, la nivel molecular.
Evaluarea acestor influențe și modificări poate oferi informații utile și importante în
privința inițierii, progresiei ș i metastazării tumorale colorectale, dar și a prognosticului
pacienților cu astfel de leziuni.
Prezentul studiu și -a propus evaluarea completă și amănunțită a remodelării
celulelor enterice gliale și a elementelor inflamatorii în cancerul colorectal, cu s copul de a
identifica posibile ținte terapeutice și de prognostic.
Studiul a fost efectuat prospectiv și, pentru îndeplinirea scopului principal, s -a
urmărit îndeplinirea următoarelor obiective:
 Extinderea cunoștințelor despre parametrii clinici, epidemiologici și histopatolgici
ai neoplasmelor colorectale, raportându -i la fenotipul tumoral, cu scopul de a
aprofunda mecanismele care stau la baza carcinogenezei colorectale;
 Extinderea cunoștințelor despre fiziologia și patologia celulelor enterice g liale, dar
și despre influențarea carcinogenezei colorectale de către acestea, împreună cu
elementele inflamatorii;
 Alcătuirea unei baze de date, care să conțină principalii parametri epidemiologici,
clinici, histopatolgogici, precum și imunohistochimici a i pacienților incluși în acest
studiu;
 Identificarea și definirea parametrilor imunohistochimici ai celulelor enterice gliale
și ai elementelor inflamatorii, cu scopul corelării lor ulterioare cu trăsăturile clinico –

31
patologice ale pacienților incluși în s tudiu, în vederea evaluării remodelării celulelor
enterice gliale și a infiltratului leucocitar intratumoral;

32
II.2. Material și metode
II.2.1. Încadrarea studiului

Studiul efectuat a fost de tip analitic prospectiv, observațional descriptiv, a cuprins
un număr de 58 de pacienți diagnosticați cu adenocarcinom colorectal, selectați pe o
perioadă de doi ani (2016 -2018). Pentru a evita bias -ul, în acest studiu am inclus pacienții
în mod consecutiv.
Cazuistica analizată a provenit de la pacienți care au fost internați î n Clinica de
Gastroenterolgie a SCJU Craiova, unde s -a ridicat suspiciunea de formațiune tumorală
malignă la nivel colorectal, în urma explorărilor clinice și paraclinice efectuate. Ulterior,
acești pacienți au fost supuși rezecției chirurgicale a unui seg ment colorectal, în Clinica de
Chirurgie a aceluiași spital. Materialul biologic, prelevat în urma aplicării terapiei
chirurgicale, a fost imediat pus în soluție fixatoare de formol 10% și ulterior a fost trimis
către Laboratorul de Anatomie Patologică al SCJU Craiova, unde a fost examinat inițial
macroscopic, apoi a fost supus tehnicilor de prelucrare, în vederea analizei microscopice.
Fragmente de material histologic au fost prelucrate în continuare în ,,Centrul pentru Studii
de Morfologie Microscopică și Imunologie ’’ al Universității de Medicină și Farmacie din
Craiova, unde s -a realizat studiul imunohistochimic.
A fost alcătuit un singur lot de pacienți diagnosticați cu adenocarcinom colorectal,
care a fost apoi împărțit în subloturi, în funcție de dif eritele caracteristici clinico -patologice
ale pacienților incluși în studiu, subloturi care au fost luate în considerare în momentul
efectuării testelor statistice. Nu a fost necesară existența unui lot martor, întrucât s -a urmărit
remodelarea celulelor en terice gliace și infiltratul leucocitar intratumoral doar pe probele
de adenocarcinom colorectal, iar utilizarea altor probe din diferitele afecțiuni care ar fi
necesitat excizia unui segment colorectal, în afară de adenocarcinomul colorectal, cel mai
probabil ar fi oferit date fals pozitive sau negative, care nu puteau fi folosite în testele
statistice efectuate în această cercetare.

33
Studiul a fost efectuat în conformitate cu normele și principiile Comisiei de Etică a
Universității de Medicină și Farmac ie din Craiova, fiind aprobat de aceasta și a respectat
toate prevederile forurilor internaționale care reglementează cercetarea științifică, respectiv
Declarația de la Helsinki, emisă de către Asociația Medicală Internațională (WMA – World
Medical Asociat ion). Fiecare pacient, care a fost inclus în studiu, și -a dat acordul, semnând
consimțământul informat și formularul de acceptare pentru prelevarea materialului
biologic pentru studiu și, de asemenea, pentru folosirea datelor clinice și paraclinice din
Foaia de Observație Medicală.
Așa cum am menționat, pe lângă informațiile obținute din analiza imagistică a
secțiunilor de țesut tumoral colorectal, am utilizat și informațiile clinice și paraclinice din
Foile de Observație Medicală, toate aceastea fiind îns crise pe o fișă electronică pentru
fiecare pacient în parte, excluzând toate informațiile care puteau duce la identificarea
pacienților, cum ar fi numele detaliat sau alte date de identificare personală.

II.2.2. Criteriile de includere și excludere din s tudiu
Pentru includerea în studiu am utilizat următoarele criterii:
 Vârsta peste 18 ani pentru ambele sexe;
 Absența antecedentelor personale patologice maligne de orice natură;
 Acordul de a participa la studiu, materializat prin semnarea consimțământului
informat;
 Diagnosticul clinic și histopatologic de adenocarcinom primar colorectal.
Pentru neincluderea pacienților în studiu am utilizat următoarele criterii:
 Vârsta mai mică de 18 ani;
 Prezența antecedentelor personale patologice maligne de orice natură;
 Prezența altor tipuri histopatologice de tumori maligne colorectale, în afară de
adenocarcinom colorectal;
 Nesemnarea consimțământului informat de către pacienți.

34
II.2.3. Analiza histopatologică a materialului biologic
Materialul biologic utilizat în p rezentul studiu a fost prelevat în urma intervenției
chirurgicale cu tentă curativă, efectuată în cadrul Clinicii de Chirurgie a SCJU Craiova.
Imediat după rezecție, acesta a fost introdus în soluție fixatoare de formol 10%, cantitate
variabilă în funcție de dimensiunea pieselor de rezecție colorectală, timp de 24 – 48 ore.
Soluția fixatoare de formol 10% a fost obținută din aldehidă formică, o parte și din 9 părți
de apă distilată, adăugandu -se în aceasta bicarbonat de calciu, pentru a se obține un pH
neutru în vederea neutralizării acidului formic, format spontan în soluțiile concentrate.
S-a preferat utilizarea soluției fixatoare de formol, deoarece aceasta este ief tină, nu
afectează culoarea și structura preparatelor, având mare putere de penetrare în acestea,
deformează nesemnificativ piesele, conservă bine și alte elemente precum țesutul adipos și
sângele, permițând, de asemenea, realizarea mai multor colorații ș i utilizarea materialului
biologic pentru studii de imunohistochimie.
Pentru fixarea în condiții optime a pieselor de rezecție colorectală s -a utilizat un
volum al soluției fixatoare de formol de cel puțin 10 ori mai mare decât volumul ocupat de
piesa de rezecție.
După cele 24 – 48 de ore în care piesele de rezecție colorectală au fost fixate, acestea
au fost spălate timp de 24 de ore, cu scopul îndepărtării soluției fixatoare de formol din
țesuturi, după care au fost incluse în parafină, pentru a putea realiza apoi secțiuni seriate de
3-5 µm grosime, care au putut fi colorate și analizate optim cu microscopul optic.
Materialul biologic a fost apoi supus tehnicii de deshidratare, trecându -l prin băi
succesive de alcool etilic, prin care apa folosită în etapa precedentă a fost îndepărtată din
țesuturi. În studiul nostru au fost folosite diferite preparate de alcool etilic, deshidratarea
făcându -se în borcane de sticlă prevăzute cu dop rodat, pentru prevenirea evaporării și
rehidratării probei.
Ulterior s-a efectuat clarificarea, care este o operație de eliminare a alcoolului etilic
utilizat în tehnica deshidratării, utilizând o hidrocarbură aromatică de tipul benzenului (se

35
mai pot utiliza xilenul sau toluenul), cantitatea de soluție de benzen fiind de 20 de ori mai
mare decât volumul ocupat de piese.
Clarificarea, care a durat aproximativ 3 ore, a fost urmată de includerea propriu –
zisă în parafină a probelor de țesut, parafinarea efectuându -se la temperatura de 56°C, prin
trecerea probei prin trei băi succesive timp de 6 ore pentru fiecare baie, trecerea de la o
baie la alta efectuânu -se rapid, pentru a împiedica solidificarea parafinei, după care piesele
au fost înglobate într -un bloc de parafină, care s -a solidificat.
După obținerea blocurilor de ț esut, s -au realizat secțiuni seriate de 3 -5 µm grosime
cu ajutorul unui microtom rotativ automat HM355S de înaltă precizie, echipat cu sistem de
transfer al secțiunilor inițial pe o baie de apă rece, iar apoi transferate pe o baie de apă caldă
la temperatu ra de 40°C, pentru a fi întinse și uniformizate.
Secțiunile obținute au fost apoi culese și lipite pe lame cu poli -L-lysine (un compus
ce crește mult aderența țesutului la lamă), au fost introduse într -un incubator la 60°C și
păstrate timp de 24 de h.
Lamele de țesut, utilizate în studiul nostru, au fost colorate mai întâi prin tehnica
colorării cu hematoxilină -eozină (HE), care redă citoplasma în roz, nucleii cu nucleoli în
albastru, respectiv albastru -violet și fibrele de colagen în roz palid, în timp ce fibrele de
elastină și de reticulină nu se colorează. Lamele colorate cu HE au fost analizate în cadrul
Laboratorului de Anatomie Patologică al SCJU Craiova, unde anatomopatologi specializați
în domeniu au stabilit diagnosticul histopatologic. După stab ilirea diagnosticului de
adenocarcinom colorectal au fost constituite trei subloturi de pacienți, în funcție de gradul
de diferențiere tumorală, astfel: sublotul pacienților cu adenocarcinom colorectal bine
diferențiat ( Figura 1), sublotul pacienților cu a denocarcinom colorectal moderat diferențiat
(Figura 2), respectiv sublotul pacienților cu adenocarcinom colorectal slab diferențiat
(Figura 3). Această clasificare s -a realizat în funcție de criteriile Organizției Mondiale a
Sănătății [4].

36

Figura 1. Adenocarcinom colorectal bine diferențiat în care procent ul de formare
glandulară > 95%, colorație hematoxilină -eozină, 20x.

Figura 2. Adenocarcinom colorectal moderat diferențiat în care procent ul de
formare glandulară este 50-95%) colorație hematoxilină -eozină, 20x ..

37

Figura 3. Adenocarcinom colorectal slab diferențiat în care procent ul de formare glandulară <
50%,colorație hematoxilină -eozină, 20x.
Studiul imunohistochimic a fost realizat pe aceleași piese de rezecție chirurgicală,
incluse în parafină prin metodele amintite. Tehnica colorării imunohistochimice a fost
realizată în cadrul ,,Centrului pentru Studii de Morfologie Microscopică și Imunologie’’ al
Universității de Medicină și Farmacie din Craiova.
Pentru începerea secvențe lor tehnicii de imunoshitochimie, s -a realizat mai întâi
deparafinarea secțiunilor, prin trecerea lor prin 3 băi succesive de xilol și apoi rehidratarea
lor trecându -le prin soluții de alcool cu concentrații descrescânde. În primul timp al tehnicii
imunohi stochimice a avut loc recuperarea antigenică, prin fierberea lamelor cu țesut la
microunde, într -un cuptor setat la 650W, în soluție specifică fiecărui anticorp utilizat în
această tehnică. După aceasta, lamele au fost spălate cu apă de la robinet, iar a poi cu apă
distilată.
În cea de -a doua etapă a tehnicii imunohistochimice, lamele au fost incubate cu o
soluție de peroxid de hidrogen 1% în apă distilată, timp de 30 de minute, cu scopul de a
bloca activitatea peroxidazei endogene, împiedicând astfel int erferența acesteia cu detecția

38
semnalului, ceea ce ar fi putut crea rezultate fals -pozitive. După incubarea de 30 de minute,
lamele au fost spălate cu apă distilată din abundență și apoi trecute în soluție tampon fosfat
salin (PBS – phosphate buffered sali ne solution).
În cea de -a treia etapă a acestei tehnici, lamele cu țesut au fost incubate într -o soluție
de albumină bovină pură 1%, în tampon fosfat salin (PBS – phophate buffered saline)
pentru a bloca legarea anticorpilor primari de alte structuri prot eice din țesutul de analizat,
în afară de structurile specifice. Doar după spălarea lamelor în această soluție, s -a adăugat
anticorpul primar, după care lamele au fost incubate timp de 24 de ore în frigider la 4°C.
Ziua următoare, după ce au fost scoase de la frigider și lăsate la temperatura camerei timp
de 30 de minute, lamele au fost spălate în PBS pentru înlăturarea excesului de anticorp
primar, urmând apoi adăugarea unui sistem secundar de detecție, prin folosir ea unui
anticorp secundar anti -anticorp primar, legat de un polimer de peroxidază specific pentru
absorbția imunoglobulinelor umane (Nichirei -Bioscience, Tokyo, Japan).
În ultima etapă a tehnicii imunohistochimice a avut loc deteția semnalului, prin
incubarea lamelor cu un substrat pentru peroxidază, 3 -3’diaminobenzidina (DAB, Dako),
în prezența apei oxigenate 1%, această reacție fiind urmărită la microscop cu scopul de a
stopa apariția semnalului de fond, după care lamele au fost contrastate cu hematoxil ină, în
vederea colorării nucleilor și urmăririi morfologiei generale a țesuturilor studiate. În acest
studiu am folosit anticorpul primar GFAP pentru a identifica celulele enterice gliale și
anticorpul CD45 (CLA) pentru a evalua infiltratul leucocitar intr atumoral.
Pentru a asigura păstrarea optimă a lamelor un timp mai îndelungat, acestea au fost
acoperite cu un mediu de montare pe bază de xilol DPX (Sigma -Aldrich, St. Louis, MO,
USA), peste care s -a aplicat apoi o lamelă protectoare. De menționat că anti genele țintă
supuse studiului s -au colorat în maro, iar nucleii celulelor în albastru.

II.2.4. Achiziția și analiza imaginilor microscopice
Pentru achiziția și analiza imagistică computerizată am utilizat metoda de microscopie
optică dar și metoda de microscopie multispectrală.

39
În vederea implementării metodei menționate mai sus, am utilizat un microscop Zeiss
Imager Z2, dotat cu o cameră foto de mare acuratețe și cu obiective cu factori de mărire de 10x,
20x, 40x, respectiv 60 x. Ac esta este redat în Figura 4.

Figura 4. Microscopul tip Zeiss Imager Z2, utilizat pentru achiziția imaginilor analizate în
lucrarea de licență .

Imaginile obținute cu ajutorul microsco pului și metod ei citate au fost analizate
utilizând softul Image -Pro Plus AMS 7, de analiză imagistică computerizată (Media
Cybernetics, Bethesda, MD, USA), cu ajutorul căruia, după calibrarea în funcție de
obiectivul utilizat în captura imaginilor, au fost cuantificate densitatea optică integrată
(IOD – integrated optical density) și aria semnalului de culoare.

Pentru a calcula aria totală a țesutului nervos pentru o lamă, pe care ulterior să o
raportăm la aria totală a țesutului de pe acea lamă, în vederea calculării densității
elementelor nervoase, lamele au fost scanate cu ajutorul microscopului motorizat Niko n
90i, cu obiectivul de 4x, apoi imaginile au fost exportate în softul Image -Pro Plus AMS7,
unde, după calibrarea pentru 1 mm, a fost delimitată manual suprafața totală tisulară de pe
acea lamă. De asemenea, pentru a calcula aria pentru fiecare plex nervos în parte sau pentru
a analiza numai epiteliul sau stroma tisulară au fost delimitate manual regiuni de interes,

40
cu ajutorul softului Image -Pro Plus AMS7, în funcție de profilul de culoare corespunzător
și, de fiecare dată, după calibrarea softului în func ție de obiectivul microscopului utilizat
la achiziția imaginilor. În figurile următoare sunt redate imaginile pentru analiza unor
parametri în țesutul total ( Figura 5), în epiteliu ( Figura 6) respectiv în stromă ( Figura 7).

Figura 5. Analiza , cu ajutorul softului ImagePro Plus AMS 7, a unorp arametri (arie și densitate
optică integrată) în țesutul total.

41

Figura 6. Analiza , cu ajutorul softului ImagePro Plus AMS 7, a unor parametri (arie și densitate
optică integrată) numai în stroma tisula ră.

Figura 7. Selectarea, cu ajutorul softului ImagePro Plus AMS 7, a unor parametri (arie și
densitate optică integrată) numai în epiteliul tisular. (imagine din arhiva personală)

42
II.2.5. Prelucrarea statistică a datelor
Așa cum am afirmat, principalii parametri, calculați cu ajutorul softului ImagePro
Plus AMS 7, au fost aria și densitatea optică integrată a semnalului, respectiv de culoare,
care a fost selectat. Atât pentru acești parametri, cât și pentru indicele de proliferare, s -au
obțin ut date numerice, care au fost analizate cu ajutorul softului Microsoft Office Excel
2010 (Microsoft Corporation, Redmond, Washington, USA) și, după reprezentarea grafică,
au fost exportate în softul SPSS (IBM SPSS Statistics, Versiunea 20.0), unde, mai în tâi, au
fost calculate media și deviația standard pentru fiecare grup, apoi a continuat analiza
statistică. Am folosit testul „t Student”, pentru evaluarea diferențelor statistice dintre
mediile a două grupuri de date și testul varianței ANOVA. pentru anal iza diferențelor
statistice dintre mediile a mai mult de două grupuri de date. Pentru a efectua corelații între
diferitele date, am utilizat testul de corelație Pearson. În toate cazurile în care am avut
valoarea p <0.05 am considerat diferență statistică semnificativă între mediile grupurilor
comparate. Mai mult decât atât, valoarea lui p < 0.05, 0.01 și 0.001 a reprezentat diferență
statistică semnificativă, înalt și foarte înalt semnificativă, date evidențiate prin *,* * și ***.

43
II.3. Studiul clinico -epidemiologic al pacienților

Studiul efectuat a fost unul de tip analitic prospectiv, observațional descriptiv, a cuprins un
număr de 52 de pacienți diagnosticați cu adenocarcinom colorectal, dintre care 30 (57%) de
pacienți au fost de sex masculin, iar 22 (43%) au fost de sex feminin ( Figura 8), selectați pe o
perioadă de doi ani ( 2016 -2018 ).

Figura 8. Distribuția cazurilor în funcție de sex.

Vârsta, în momentul diagnosticului, la pacienții incluși în studiu a fost cuprinsă între 43 de
ani și 87 de ani, însă pacienții au fost împărțiți apoi în două subloturi, în funcție de o limită de
vârsta de 65 de ani, astfel, în sublotul pacienților cu vârstă mai mică de 65 de ani au fost incluși
17 (33%), iar în sublotul pacienților cu vârstă mai mare sau egală cu 65 de ani au fost incluși 35
(67%) ( Figura 9). Statistica descriptivă a pacienților în funcție de vârstă și sex este redată în
Figura 10.

Masculin
57%Feminin
43%FIGURA 8. Distribuția cazurilor pe sexe.
Masculin
Feminin

44

Figura 9. Distribuția pacienților în funcție de vârsta de 65 de ani

Femei
Bãrbati020406080100ANI

Figura 10. Statistica descriptivă a pacienților în funcție de vârstă și sex (valoarea
minimă, maximă, prima quartilă, quartila a 3 -a și mediana ).
Tumorile colorectale au fost localizate preponderent distal (după treimea medie a colonului
trans vers până la canalul anal), la un procent de 79% dintre pacienți (n=4 3), spre deosebire de

45
localizarea proximală (după valva ileo -cecală până la treimea medie a colonului transvers), care a
fost caracterizată de un procent de 21% dintre pacienți (n=1 3) (Figura 11).

Figura 11. Distribuția cazurilor în funcție de localizarea tumorală.

Evaluând gradul de invazie tumorală, am constatat că la 29% dintre pacienți (n= 17) acesta
era T 1-2, în timp ce la 71% (n= 39) dintre pacienții incluși în studiu acesta era T3-4 (Figura 12).

Figura 12. Distribuția cazurilor în funcție de gradul de invazie tumorală.
Prin evaluarea gradului de metastazare în limfaticele regionale, am observat că 4 5 dintre
pacienți (43%) au prezentat metastază în unul sau cel mult doi dintre toți ganglionii limfatici
regionali examinați anatomopatologic, iar 11 pacienți (17%) au prezentat metastaze în mai mult
T1-2
29%
T3-4
71%FIGURA 12. Distribuția cazurilor în funcție
de gradul de invazie tumorală
T1-2
T3-4

46
de 2 ganglioni limfatici regionali, din totalul ganglioni lor limfatici regionali examinați ( Figura
13).

Figura 13. Distribuția cazurilor în funcție de gradul de metastazare în limfaticele
regionale.

În ceea ce privește dimensiunea tumorii, s -a observat că, la 19 pacienți (36%), formațiunea
tumorală a avut un diametru maxim mai mic de 5 cm, în timp ce la 33 de pacienți (56%)
formațiunea tumorală a avut un diametru maxim mai mare sau egal cu 5 cm ( Figura 14).

Figura 14. Distribuția cazurilor în funcție de dimensiunea tumorală.
N0-1
83%N≥2
17%FIGURA 13. Distribuția cazurilor în funcție
de gradul de metastazare în limfaticele
regionale
N0-1
N≥2

47
Analizând aspectul macroscopic, am observat că la 23 de pacienți (44%), acesta a
fost exofitic, în timp ce la 29 de pacienți (56%) acesta a fost infiltrativ ( Figura 15). Diferite
aspecte macroscopice ale tumorilor colorectale sunt redate în Figurile 16 – 17.

Figura 15. Distribuția cazurilor în funcție de aspectul macroscopic al tumorii

48

Figura 16. Diferite aspecte macroscopice ale tumorilor colorectale,
în timpul examinărilor .

49

Figura 17. Aspect macroscopic extraluminal al unei piese de rezecție chirurgicală, cu localizare
tumorală la joncțiunea recto -sigmoidiană.

Figura 18. Aspect macroscopic intraluminal din timpul tratamentului chirurgical al unei tumori
cu localizare la joncțiunea recto -sigmoidiană.

50
II.4. Evaluarea celulelor enterice gliale care au exprimat GFAP
din sistemul nervos enteric.

Celulele enterice gliale au fost evaluate prin analiza expresiei imunomarkerului
GFAP în toate secțiunile de țesut tumoral colorectal ale pacienților incluși în studiu.
Metoda de analiză a fost realizată cu ajutorul microscopiei multispectrale (Figura 19) și
softului a de analiză imagistică ImagePro Plus AMS7.

Figura 19. Exemplu de imagine obținută prin microscopie spectrală, care evidențiază celulele
enterice gliale din sistemul nerovos enteric, în cancerul colorectal. A) Imagine obținută prin
microscop ie optică, în care cu maro (DAB) se observă celulele enterice gliale. B) Imagine
compusă spectral; se văd mixate culorile albastru pentru nuclei și maro pentru antigenele țintă,
care identifică GFAP -ul din celulele enterice gliale. C) Imagine nemixată pent ru spectrul de
culoare albastru. Se observă numai culoarea pentru nuclei. D) Imagine nemixată pentru spectrul
de culoare maro. Se observă numai culoarea pentru antigenele țintă, care identifică celulele
enterice gliale (GFAP). Pătratul mare reprezintă imaginea mărită din pătratul mic.

51
Scala este de 20µm.

Pentru a evalua celule le enterice gliale din sistemul nervos enteric la pacienții cu
neoplasm colorectal, am calculat aria expresiei imunomarkerului pentru acestea și, apoi
suprafața markerului a fost raportată la mm2. Pentru a vedea ce procent din țesutul nervos
total este rep rezentat de celulele enterice gliale care exprimă GFAP, am calculat cu ajutorul
imunomarkerului S100 aria plexurilor ganglionare intratumorale Meissner ( Figura 20) și
Auerbach ( Figura 21), dar și aria filetelor nervoase multiaxonale intratumorale, mai mari
de 20µm ( Figura 22), pe care nu le -am putut încadra nici în plexul Meissner, nici în plexul
Auerbach.

52

Figura 2 0. Exemplu de imagini cu plexul Meissner. Cu maro se observă mici ganglioni nervoși
cu localizare în submucosă. De asemenea, tot cu maro se observă și filetele nervoase din
plexurile aganglionare din mucoasă și muscularis mucosae.
Imunomarkaj S100, 20x.

53

Figura 21. Exemplu de imagini cu plexul Auerbach. Cu maro se observă ganglionii nervoși ai
acestui plex, cu localizare între straturile circular și longitudinal ale tunicii musculare. De
asemenea, tot cu maro se observă și filetele nervoase din plexurile aganglionare din tunica
musculară. Imunomarkaj S100, 20x.

54

Figura 2 2. Exemplu de imagini cu filetele nervoase multiaxonale mai mari de 20µm, cu
localizare intratumorală, care nu au putut fi încadrate nici în plexul Meissner, nici în plexul
Auerbach. Im unomarkaj S100, 20x.

55
Aria țesutului nervos total, calculată prin metoda menționată, a fost exprimată ca
arie procentulă (densitate a țesutului nervos), pentru a putea fi efectuată analiză statistică
între subgrupurile din studiu. Aria procentuală a țesut ului nervos total, calculat cu ajutorul
imunomarkerului S100, a fost în medie de 0.121296±0.079121%/mm2, în timp ce aria
procentuală a celulelor enterice gliale, calculată cu ajutorul imunomarkerului GFAP, a fost
în medie de 0.003056±0.001485%/mm2, ceea ce a însemnat un procent al celulelor enterice
gliale de 2.52% din țesutul nervos total.
În ceea ce privește subîmpărțirea țesutului nervos în plexuri, evaluat cu
imunomarkerul S100, am observat că aria procentuală a plexului nervos Meissner a fos t de
0.011161±0.005783%/mm2, aria procentuală a plexului nervos Auerbach a fost de
0.048022±0.032311%/mm2, iar aria procentuală a altor filete nervoase multiaxonale, cu
diametru mai mare de 20 µm, a fost de 0.062113±0.045006%/mm2, mai mare decât a
plexuril or Meissner și Auerbach ( Figura 23).

Figura 23. Aria procentuală a țesutului nervos total, calculată conform imunomarkerului S100,
subîmpățită în plexuri nervoase.

Subîmpărțind aria ocupată de celulele enterice gliale, evaluate cu imunomarkerul
GFAP, în plexuri, am observat că aria procentuală a enterogliilor plexului nervos Meissner
a fost de 0.00013±0.000101%/mm2, aria procentuală a enterogliilor plexului nervos

56
Auerbach a fost de 0.002237±0.001562%/mm2, iar aria procentuală a enterogliilor din alte
filete nervoase multiaxonale cu diametru mai mare de 20 µm a fost de
0.001074±0.000677%/mm2, aria procentuală a enterogliilor din plexul nervos Auerbach
fiind mai mare decât ariile procentuale din celelalte două categorii ( Figura 24).

Figura 24. Aria procentuală a celulelor
enterice gliale, calculată conform imunomarkerului GFAP, subîmpățită în plexuri nervoase.

Cu alte cuvinte, enterogiile au ocupat din plexul nervos Auerbach un procent de
4.66%, din plexul nervos Meissner 1.17%, iar din aria ocupată de filetele nervoase
multiaxonale cu diametru mai mare de 20 µm un procent de 1.73%. Diferențe între expresia
celulelor enterice gliale din plexul nervos Auerbach și filetele nervoase multiaxonale cu
diametru mai mare de 20 µm se pot observa în Figura 25 A, B.

57

Figura 25 A. Expresia celulelor enterice gliale la nivelul plexului nervos Auerbach. Se observă
culoare maro, care nu markează întregul ganglion nervos, ci are o distribuție neregulată după
forma celulelor enterice gliale, care se pliază pe corpurile și prelungiril e neuronilor enterici.
Imunomarkaj GFAP, 20x.

58

Figura 25 B. Expresia celulelor enterice gliale, la nivelul elementelor nervoase multiaxonale
mai mari de 20µm, cu localizare intratumorală, care nu au putut fi încadrate nici în plexul
Meissner, nici în plex ul Auerbach. Spre deosebire de plexul Auerbach, la nivelul acestor filete
expresia celulelor enterice gliale (culoarea maro) este mai difuză, însă redusă ca intensitate.
Imunomarkaj GFAP, 20x.

59
Evaluarea celulelor enterice gliale, în diferitele stadii de diferențiere tumorală ale
cancerului colorectal, a evidențiat faptul că densitatea acestor elemente nervoase este mai
mare în tumorile colorectale bine diferențiate (G1), înregistrându -se o arie procentuală a
acestui tip de celule de 0.0041 87±0.001 532%/mm2, în timp ce în tumorile colorectale
moderat diferențiate (G2) s -a înregistrat o arie procentuală de 0.003 641±0.002 11%/mm2,
cu o scădere semnificativă a acestui parametru la 0.00123 ± 0.000812%/mm2 în tumorile
colorectale slab diferențiate (G3) ( Figu ra 26).
Comparând, cu ajutorul testului ANOVA, urmat de testul Bonferroni post -hoc,
media densităților nervoase ale celulelor enterice gliale în diferitele stadii de diferențiere
ale cancerului colorectal, am observat că a existat o diferență statistic semnificativă între
denstitatea celulelor enterice gliale din tumorile bine diferențiate și tumorile slab
diferențiate ( p=0.00 6**) și, de asemenea, între densitatea celulelor enterice gliale din
tumorile moderat diferențiate și tumorile slab diferențiate (p= 0.02 4*), în timp ce între
tumorile bine diferențiate și tumorile moderat diferențiate nu s -au întregistrat diferențe
statistic semnificative, în ceea ce privește densitatea acestui tip de celule.

Figura 26. Evaluarea celulelor enterice gliale
în diferite stadii de diferențiere tumorală ale CCR.
În funcție de vârsta pacienților incluși în studiu în momentul diagnosticului, s -a
constatat că la cei cu vârsta mai mică de 65 de ani aria procentuală a celulelor enterice

60
gliale a înregistrat o valoare d e 0.0020 56125±0.001 326%/mm2, mai mică decât la pacienții
cu vârstă mai mare sau egală cu 65 de ani, unde aria procentuală a celulelor enterice gliale
a înregistrat o valoare de 0.003 56529±0.002 275%/mm2, existând o diferență statistic
semnificativă în funcție de vârstă ( Figura 31 ).

Figura 27. Expresia celulelor enterice gliale în funcție de vârstă.

Luând în considerare localizarea tumorală, am constatat că, la pacienții cu localizare
tumorală distală, celulele enterice gliale au înregistrat o arie procentuală de
0.0031 4407±0.002 107729 %/mm2, mai mare decât la pacienții cu localizare tumorală
proximală, unde au înregistrat o arie procentuală de 0.002 568166 ± 0.002 357988 %/mm2,
în funcție de această caracteristică neexistând o diferență statistic semn ificativă ( Figura
28).

61

Figura 28. Expresia celulelor enterice gliale în funcție de localizarea tumorală.

În funcție de sexul pacienților incluși în studiu, s -a constatat că, la cei de sex
feminin, aria procentuală a celulelor enterice gliale a înregistrat o valoare de 0.003079765
± 0.00177949 %/mm2, mai mare decât la pacienții de sex masculin, unde aria procentuală
a celulelor enterice gliale a înregistrat o valoare de 0.003050512 ± 0.00209808%/mm2, în
funcție de această caracteristică neexistân d o diferență statistic semnificativă ( Figura 29).

62

Figura 29. Expresia celulelor enterice gliale în funcție de sexul pacienților.

Analizând celulele enterice gliale în funcție de aspectul macroscopic al tumorii, am
constatat că la pacienții la care aspectul macroscopic tumoral a fost preponderent exofitic,
aria procentuală a celulelor enterice gliale a înregistrat o valoare de 0.002 625845 ±
0.001 55193%/mm2, mai mică decât la pacienții la care aspectul macroscopic a fost
preponderent infiltrativ, unde aria procentuală a celulelor enterice gliale a înregistrat o
valoare de 0.003 321204 ± 0.002 35558 %/mm2, în funcție de această caracteristică
neexistând o diferență statistic semnificativă ( Figura 30).

63

Figura 30. Expresia celulelor enterice gliale în funcție de aspectul macroscopic al tumorii.

În ceea ce privește dimensiunea tumorală, am observat că la pacienții la care
diametrul maxim tumoral a fost mai mic de 5 cm, aria procentuală a celulelor enterice gliale
a înregistrat o valoare de 0.002 92145 ± 0.003 13 %/mm2, mai mică decât la pacienții la care
diametrul maxim tumoral a fost mai mare sau egal cu 5 cm, unde aria procentuală a
celulelor enterice gliale a înregistrat o valoare de 0.00314994 ± 0.001548 %/mm2, în
funcție de această caracteristică nee xistând o diferență statistic semnificativă ( Figura 31).

64
Figura 31. Expresia celulelor enterice gliale în funcție de dimensiunea tumorală.

Evaluând celulele enterice gliale în funcție de gradul de invazie tumorală, am
constatat că la pacienții la care gradul de invazie tumorală a fost T 1-2, aria procentuală a
celulelor enterice gliale a înregistrat o valoare de 0.003 449 ± 0.001 798%/mm2, mai mare
decât la pacienții la care gradul de invazie tumorală a fost T 3-4, unde aria procentuală a
celulelor enteric e gliale a înregistrat o valoare de 0.002 64 ± 0.002 26%/mm2, în funcție de
această caracteristică neexistând o diferență statistic semnificativă ( Figura 32).

Figura 32. Expresia celulelor enterice gliale în funcție de gradul de invazie tumorală.

Luând în considerare statusul limfatic ganglionar, s -a constatat că la pacienții la care
s-a înregistrat metastază în cel mult un ganglion limfatic regional (N 0-1), aria procentuală a
celulelor enterice gliale a înregistrat o valoare de 0.003 43699 ± 0.002 547%/mm2, mai mare
decât la pacienții la care s -au înregistrat metastaze în cel puțin doi ganglioni limfatici
regionali, unde aria procentuală a celulelor enterice gliale a înregistrat o valoare de

65
0.0018 7427 ± 0.0009 57%/mm2, în funcție de această caracteristică existând o diferență
statistic semnificativă ( Figura 33).

Figura 33. Expresia celulelor enterice gliale în funcție de statusul ganglionilor limfatici regionali.

66
II.5. Evaluarea infiltratului leucocitar intratumoral
Infiltratul leucocitar intratumoral a fost evaluat numai intraepitelial, nefiind luat în
considerare infiltratul leucocitar intratumoral din stromă. Imunohistochimic, infiltratul
leucocitar intratumoral a fost evaluat utilizând imunomarkerul CD45 (CLA – common
leukocyte antigen), care identifică toate leucocitele, calculând pentru acesta atât aria
semnalului, dar și densitatea optică integrată (IOD) în toate cele trei stadii de diferențiere
ale CCR, cu ajutorul microscopiei multispectrale ( Figurile 34-36).

Figura 34. Exemplu de imagine obținută prin microscopie spectrală, care evidențiază infiltratul
leucocitar intratumoral în cancerul colorectal bine diferențiat. A) Imagine obținută prin
microscopie optică, în care, cu maro (DAB), se observă leucocitele. B) Imagine compusă
spectral; se văd mixate culorile albastru pentru nuclei și maro pentru antigenele țintă care
identifică CLA -ul din leucocite. C) Imagine nemixată pentru spectrul de culoare albastru. Se
observă numai culoarea pentru nuclei. D) Imagine nemixată pentru spectrul de culoare maro. Se
observă numai culoarea pentru antigenele țintă, care identifică leucocitele (CLA).
Scala reprezintă 20µm.

67

Figura 35. Exemplu de imagine obținută prin microscopie spectrală, care evidențiază infiltratul
leucocitar intratumoral în cancerul colorectal moderat diferențiat. A) Imagine obținută prin
microscopie optică, în care, cu maro (DAB ) se observă leucocitele. B) Imagine compusă
spectral; se văd mixate culorile albastru pentru nuclei și maro p entru antigenele țintă care
identifică CLA -ul din leucocite. C) Imagine nemixată pentru spectrul de culoare albastru. Se
observă numai culoarea pentru nuclei. D) Imagine nemixată pentru spectrul de culoare maro. Se
observă numai culoarea pentru antigenele țintă, care identifică leucocitele (CLA).
Scala reprezintă 20µm.

68

Figura 36. Exemplu de imagine obținută prin microscopie spectrală, care evidențiază infiltratul
leucocitar intratumoral în cancerul colorectal slab diferențiat. A) Imagine obținută prin
microscopie optică, în care, cu maro (DAB), se observă leucocitele. B) Imagine compusă
spectral; se văd mixate culorile albastru pentru nuclei și maro pentru antigenele țintă care
identifică CLA -ul din leucocite. C) Imagine nemixată pentru spectrul d e culoare albastru. Se
observă numai culoarea pentru nuclei. D) Imagine nemixată pentru spectrul de culoare maro. Se
observă numai culoarea pentru antigenele țintă, care identifică leucocitele (CLA). Scala
reprezintă 20µm.

69
Am constat o creștere gradual ă atât a ariei cât și a densității optice integrate – IOD
(Figurile 37,38 ), de la adenocarcinomul colorectal bine diferențiat (21 24.296 ± 8 36.0828
µm2 pentru arie și 259 963.0316 ± 10 5263.5552 pentru IOD) la adenocarcinomul colorectal
moderat diferențiat (4440.312 ± 13 58 µm2 pentru arie și 52 4583.331 ± 15 3044.9749 pentru
IOD), respectiv la adenocarcinomul colorectal slab diferențiat (7 593.812 ± 1 940.834 µm2
pentru arie și 94 2815.1146 ± 23 3017.7378 pentru IOD). Comparând, cu ajutorul testului
ANOVA, urma t de testul Bonferroni post -hoc, media infiltratului leucocitar tumoral în
diferitele stadii de diferențiere ale CCR, am observat că a existat o diferență statistic
semnificativă între infiltratul leucocitar din tumorile bine diferențiate și tumorile mod erat
diferențiate ( p= 0.02 4* pentru arie; P = 0.04 3* pentru IOD), între infiltratul leucocitar din
tumorile bine diferentiate și tumorile slab diferențiate ( p= 0.000*** pentru arie; p=
0.000*** pentru IOD) și, de asemenea, între infiltratul leucocitar din tumorile moderat
diferențiate și tumorile slab diferențiate ( p= 0.00 3** pentru arie; p= 0.00 2** pentru IOD).

Figura 37. Evaluarea infiltratului leucocitar intratumoral prin calculul ariei CLA în diferite
stadii de diferențiere tumorală a CCR.

70

Figura 38. Evaluarea infiltratului leucocitar intratumoral prin calculul densității optice
integrate a CLA în diferite stadii de diferențiere tumorală a CCR.

În funcție de vârsta pacienților incluși în studiu în momentul diagnosticului, s -a
constatat că, la cei cu vârsta mai mică de 65 de ani, infiltratul leucocitar intratumoral a
înregistrat o arie de 64 32.76183 ± 21 48.097µm2 și o densitate optică integrată de
792519.080 ± 28 1709.27, valori mai mari decât la pacienții cu vârstă mai mare sau egală
cu 65 de ani, unde aria infiltratului leucocitar intratumoral a înregistrat o valoare de
3930.795528 ± 2 655.226 µm2 și o densitate optică integrată de 47 3685.3447 ± 32 7833.65,
existând o diferență statistic semnificativă în funcție de vârstă, atât pe ntru aria cât și IOD
infiltratului leucocitar intratumoral ( Figura 39,40 ).

Figura 39. Aria CLA în funcție de vârstă
Figura 40.Densitatea optică integrată a
CLA în funcție de vârstă

71
Luând în considerare localizarea tumorală, am constatat că, la pacienții cu localizare
tumorală distală, infiltratul leucocitar intratumoral a înregistrat o arie de 5106.92361 ±
2680.27806µm2 și o densitate optică integrată de 616831.4664 ± 328992.89, valori mai
mari comparativ cu pacienții cu localizare tumorală proximală, unde s -au înregistrat
3685.937161 ± 3720.38374 µm2 pentru arie și o valoare de 477365.2427 ± 494295.16
pentru densitate a optică integrată, în funcție de această caracteristică neexistând diferențe
statistic semnificative nici pentru arie și nici pentru IOD ( Figura 41, 42).

Figura 41. Aria CLA în funcție de
localizarea tumorală
Figura 42. Densitatea optică integrată în
funcție de localizarea tumorală

În funcție de sexul pacienților incluși în studiu, s -a constatat că la cei de sex feminin aria
infiltratului leucocitar intratumoral a înregistrat o valoare de 4944.844755 ± 2943.32539 µm2, iar
densitatea optică integrată o valoare de 570477.1144 ± 253870.97, valori mai mici decât la
pacienții de sex masculin, unde aria infiltratului leucocitar intratumoral a înregistrat o valoare de
4944.844755 ± 2943.32539µm2, iar densitatea optică integrată o valoare de 603126.6862 ±
369280.22, în funcție de această caracteristică neexistând diferențe statistic semnificative ( Figura
43, 44 ).

72
Figura 43. Aria CLA în funcție de sexul
pacienților.
Figura 44. Densitatea optică integrată a
CLA în funcți e de sexul pacienților.

Analizând infiltratul leucocitar intratumoral în funcție de aspectul macroscopic al tumorii,
am constatat că la pacienții la care aspectul macroscopic tumoral a fost preponderent exofitic, aria
infiltratului leucocitar intratumoral a înregistrat o valoare de 4043.113208 ± 3001.61885 µm2, iar
densitatea optică integrată o valoare de 493589.0691 ± 357717.354, valori mai mici decât la
pacienții la care aspectul macroscopic a fost preponderent infiltrativ, unde s -au înregis trat
5334.331722 ± 2676.99762 µm2 pentru arie și o valoare de 648567.0457 ± 339551.09 pentru
densitatea optică integrată, în funcție de această caracteristică neexistând diferențe statistic
semnificative ( Figura 45, 46).

Figura 45. Aria CLA în funcție de aspectul
macroscopic tumoral.
Figura 46.Densiatea optică integrată a CLA
în funcție de aspectul macroscopic tumoral.

73

În ceea ce privește dimensiunea tumorală, am observat că la pacienții la care diametrul
maxim tumoral a fost mai mi c de 5 cm, aria infiltratului leucocitar intratumoral a înregistrat o
valoare de 5 505.54 ± 2 531.452 µm2, iar densitatea optică integrată o valoare de 69 3667.6832 ±
314354.2, valori mai mici decât la pacienții la care diametrul maxim tumoral a fost mai mare sau
egal cu 5 cm, unde s -au înregistrat 46 43.28 ± 2 843.59µm2 pentru arie și o valoare de 55 6803.7349
± 348685 pentru densitatea optică integrată, în funcție de această caracteristică neexistând
diferențe statistic semnificative ( Figura 47, 48).

Figura 47. Aria CLA în funcție de
dimensiunea tumorală.
Figura 48.Densitatea optica integrată a
CLA în funcție de dimensiunea tumorală.

Evaluând celulele infiltratul leucocitar intratumoral, am constatat că la pacienții la care
gradul de invazie tumorală a fost T 1-2, aria infiltratului leucocitar intratumoral a înregistrat o
valoare de 1620.336 ± 564.6501µm2, iar densitatea optică integrată o valoare de 201437.4208 ±
74834.3, valori mai mici decât la pacienții la care gradul de invazie tumorală a fost T 3-4, unde s –
au înregistrat 5659.476 ± 2421.63 µm2 pentru arie și o valoare de 686488.9671 ± 315921.4114
pentru densitatea optică integrată, în funcție de această caracteristică existând diferențe statistic
semnificative, atât pentr u arie cât și pentru IOD ( Figura 49,50 ).

74

Figura 49. Aria CLA în funcție de gradul de
invazie tumorală.
Figura 50.Densitatea optică integrată a
CLA în funcție de gradul de invazie
tumorală.
Luând în considerare statusul limfatic ganglionar, s -a constatat că la pacienții la care s -a
înregistrat metastază în cel mult un ganglion limfatic regional (N 0-1) , aria infiltratului leucocitar
intratumoral a înregistrat o valoare de 3664.252825 ± 1944.08521µm2, iar densitatea optică
integrată o valoare de 4301 24.03 ± 224281.224, valori mai mici decât la pacienții la care s -au
înregistrat metastaze în cel puțin doi ganglioni limfatici regionali, unde s -au înregistrat
7533.271001 ± 2517.81802 µm2 pentru arie și o valoare de 920455 .09 ± 314575 .391 pentru
densitatea optică integrată, în funcție de această caracteristică existând o diferență statistic
semnificativă ( Figura 51,52 ).

Figura 51. Aria CLA în funcție de statusul
ganglionilor limfatici regionali. Figura 52. Densitatea optică integrată a
CLA în funcție de statusul ganglionilor
limfatici regionali.

75
II.6. Corelații între parametrii evaluați la pacienții incluși în studiu.

După evaluarea parametrilor: am efectuat corelații între expresia celulelor
enterice gliale și infi ltratul leucocitar intratumoral. Pentru adenocarcinomul colorectal
bine diferențiat (G1), nu am găsit corelații ale celulelor enterice gliale cu infiltratul
leucocitar intratumoral. Pentru tumorile colorectale moderat diferențiate, am găsit însă
o corelație inversă înaltă, între celulele enterice gliale și infiltratul leucocitar
intratumoral ( r = -0.779). În ceea ce privește tumorile colorectale slab diferențiate, a
fost înregistrată o corelație inversă înaltă între celulele enterice gliale și infiltratul
leucocitar intratumoral ( r = -0.764). În ceea ce privește corelațiile între aria celulelor
enterice gliale din întregul lot d e pacienți incluși în studiu și infiltratul leucocitar
tumoral s -a înregistrat o co relație inversă global ă înaltă (r = -0.701) (Figura 53 ).
0.000 0.002 0.004 0.006 0.008 0.010050000010000001500000
Celulele enterice glialeInfiltratul leucocitar tumoral

Figura 53 . Corelații între aria celulelor enterice gliale din întregul lot de pacienți
incluși în studiu și infiltratul leucocitar tumoral. Corelație inversă globală în altă (r =
-0.701).

76
II.7. Discuții

Natura exactă a transformării neoplazice colorectale, dar și progresia și metastazarea
tumorală nu sunt pe deplin elucidate la ora actuală, aspecte ce genereaza multiple studii în acest
sens, pentru identificarea unor noi strategii terapeutice.
Celulele enterice gliale, considerate mult timp doar celule de suport pentru neuronii
enterici, sunt componenta principală a sistemului nervos enteric [ 97]. În ultimele decade, rolul
celulelor enterice gliale în starea de să nătate sau boală a fost reconsiderat, întrucât numeroase
studii au evidențiat faptul că acest tip de celule constituie un element de legătură important
între celulele epiteliului intestinal, celulele sistemului imun, neuronii enterici și celulele
enteroend ocrine [ 43]. Atât celulele enterice gliale, care sunt implicate în menținerea integrității
barierei intestinale și au rol antiproliferativ [ 43], dar și celulele sistemului imun pot avea un rol
important în patogenia și evoluția neoplasmului colorectal [ 98].
Scopul studiului nostru a fost evaluarea celulelor enterice gliale din sistemul nervos
enteric, în diferite stadii de diferențiere ale tumorilor color ectale și corelarea acestori
modificări cu infi ltratul leucocitar intratumoral.
Ințelegerea interacți unii factorilor adiționali din micromediul tumoral, cum ar fi
celulele nervoase sau celulele inflamatorii, cu celulele neoplasmului colorectal poate elucida
multe dintre căile patogeniei neoplasmului colorectal.
Prezentul studiu corelează, pentru prima da tă în literatura de specialitate, scăderea
densității celulelor enterice gliale din sistemul nervos enteric în tumorile colorectale cu gradul
de diferențiere tumorală și variații inverse cu diverși factori de prognostic negativ în acest tip
de neoplasm, cu m ar fi infiltratul inflamator intratumoral [99]. Pe de o parte, noi am evidențiat
anterior faptul că plexul nervos mienteric Auerbach, dar și plexul submucos Meissner se reduc
cu gradul de diferențiere tumorală în cancerul colorectal [ 100]. De asemenea, în studii
anterioare a fost evidențiat faptul că influențele neuronale asupra procesului neoplazic
colorectal printr -o creștere a anumitor receptori, cum ar fi adrenoreceptorii β2 cu gradul de
diferențiere al tumorilor colorectale, sugerând și mai mult int er-relațiile neuroneoplazice care
se desfășoară la nivel colorectal [ 101-103]
Despre celulele enterice gliale, considerate mult timp doar celule care aveau rolul de
suport pentru neuronii enterici, se cunoaște foarte bine, la ora actuală, rolul lor în men ținerea
homeostaziei neuronilor enterici, în suportul și stabilitatea sistemului nervos enteric din
peretele intestinal, în neurotransmisia enterică, de asemenea, se cunoaște faptul că pot constitui

77
o sursă importantă a substratului pentru enzimele implica te în sinteza de neurotransmițători,
dar și rolul important în reglarea funcțiilor barierei intestinale [ 43]. Savidge TC și colaboratorii
au arătat că, în menținerea funcției barierei intestinale, un rol important îl au și enterogliile,
prin secreția GSNO (glial -derived s -nitrosoglutathione) [ 43]. Astfel, atât „in vitro” cât și „in
vivo” GSNO a fost asociat direct cu o reglare pozitivă a F -actina perijoncțional și proteinele
zonula occludens -1 și ocludina, cu rol important în menținerea integrității barier ei intestinale,
iar ablația celulelor enterice gliale, la șoarecii transgenici, produce alterări ale barierei
intestinale, în timp ce administrarea de GSNO inhibă creșterea permeabilității intestinale și
inflamația, evenimente cauzate de ablația celulelor enterice gliale [ 43].
Prin sinteza de TGF β1 (transforming growth factor β1), celulele enterice gliale inhibă
proliferarea celulelor epitaliale intestinale atât in vitro cât și in vivo, în timp ce ablația lor
determină stimularea proliferării celulare, p rin creșterea încorporării timidinei în celulele
epiteliale [ 43]. Acest lucru a fost evidențiat și în culturile cu celule neoplazice HT -29, Caco -2
și T84 din adenocarcinomul colorectal [ 43].
Alt mediator glial, cu acțiune antiproliferativă, este 15 -deoxy -Δ12,14 -prostaglandin J2
(15dPGJ2), derivat din prostaglandina D2 [ 51], proEGF (pro -epidermal growth factor)
sintetizat, de asemenea, în celulele enterice gliale, s -a dovedit a fi implicat în procesul de
reparare al epteliului intestinal [ 51].
Studiile me nționate anterior sugerează faptul că celulele enterice gliale, prin
intermediul factorilor solubili pe care îi sintetizează, joacă un rol important în menținerea
barierei intestinale și în controlul proliferării celulare, de unde se poate deduce faptul că
afectarea integrității lor în adenocarcinomul colorectal, așa cum a fost raportată în studiul
nostru, ar constitui un element favorizant al proliferării și metastazării celulare.
În contrast cu rezultatele studiului nostru, care sugerează ca densitatea c elulelor
enterice gliale variază invers cu gradul de diferențiere tumorală, un studiu recent publicat de
Vales S. Și colaboratorii a arătat faptul că celulele enterice gliale modulează funcția celulelor
stem neoplazice ale CCR (CSCs) și sunt asociate și p romovează tumorigeneza colorectală [ 44].
Conform acestui studiu, atât in vitro cât și in vivo, celulele tumorale colonice activează celulele
enterice gliale, care capătă abilități protumorigenice și aceste celule enterice gliale activate
determină creșter ea dimensiunii tumorale, via o cale dependentă de prostaglandin E2 (PGE2)
[44].

78
Este foarte bine cunoscut faptul că numeroase celule inflamatorii sau diverși factori
secretați și eliberați de acestea (citokine) au, pe de o parte, un rol antitumoral, iar, pe de altă
parte, pot fi implicați în inițiere, progresie și metastazare tumorală [ 43].
Asemenea altor tumori maligne, cancerul colorectal este infiltrat cu mai multe tipuri de
celule inflamatorii cum ar fi: neutrofile, celule NK, mastocite, celule dendritice și macrofage
asociate tumorii, dar, paradoxal, există și celule supresoare mieloide, care au un rol principal
în supresia răspunsului imun antitumoral, favorizând astfel carcinogeneza [ 43].
Diferite citokine și chemokine sunt implicate în cance rul colorectal prin mutații
genetice și schimbări epigenetice, determinând astfel rezistență la apoptoză, creștere și
proliferare tumorală, angiogeneză și metastazare [ 43]. Datorită acestui fapt, la ora actuală este
bine cunoscut rolul medicației cu antiin flamatoare nonsteriodiene în prevenția cancerului
colorectal și ca tratament adjuvant în această patologie [ 43].
Despre relația dintre sistemul imun și celulele enterice gliale se cunosc până acum
puține aspecte, mai ales în ceea ce privește această inter acțiune în cazul pacienților cu neoplasm
colorectal. Studiul nostru a fost doar unul observațional în acest sens, evidențiind pentru prima
dată faptul că există o corelație inversă între densitatea celulelor enterice gliale și infiltratul
leucocitar intrat umoral. Însă, putem specula că această relație se datorează, pe de o parte,
faptului că celulele enterice gliale, scăzând ca densitate cu gradingul tumoral, permit celulelor
sistemului imun să -și exercite efectele protumorale. Pe de altă parte, scăderea d ensității
celulelor enterice gliale cu gradingul tumoral și cu creșterea infiltratului leucocitar intratumoral
se poate explica și prin scăderea abilității celulelor enterice gliale de a acționa drept celule
prezentatoare de antigen [ 43], acest lucru permi țînd scăparea de sub răspunsul imun a celulelor
tumorale colorectale.

79
II.8. Concluzii

1. Cancerul colorectal este al treilea cel mai frecvent diagnosticat tip de cancer în lume și,
de asemenea, a patra cauză principală de deces la nivel mondial.
2. Natura exactă a transformării neoplazice colorectale, dar și progresia și metastazarea
tumorală nu sunt pe deplin elucidate la ora actuală.
3. Celulele enterice gliale, prin intermediul factorilor solubili pe care îi sintetizează, joacă
un rol important în me nținerea barierei intestinale și în controlul proliferării celulare,
de unde se poate deduce faptul că este afectată integritatea lor în adenocarcinomul
colorectal, așa cum a fost raportată în studiul nostru
4. Procentul celulelor enterice gliale a fost de 2.52% din țesutul nervos enteric total, în
cazul pacienților incluși în studiul nostru.
5. Evaluarea celulelor enterice gliale în diferitele stadii de diferențiere tumorală ale
cancerului colorectal a evidențiat faptul că densitatea acestor elemente nervoa se este
mai mare în tumorile colorectale bine diferențiate, spre deosebire de tumorile
colorectale moderat diferențiate și tumorile colorectale slab diferențiate.
6. Analizând infiltratul leucocitar intratumoral, am constatat o creștere graduală atât a
ariei cât și a densității optice integrate, de la tumorile colorectale bine diferențiate la
tumorile colorectale moderat diferențiate, respectiv la tumorile colorectale slab
diferențiate.
7. În tumorile colorectale moderat diferențiate s -a înregistrat o corela ție inversă înaltă,
între celulele enterice gliale și infiltratul leucocita r intratumoral .
8. În tumorile colorectale slab dife rențiate a fost înregistrată o corelație inversă înalt
semnificativă între celulele enterice gliale și infiltratul leucocitar intrat umoral.
9. În ceea ce privește corelațiile între aria celulelor enterice gliale din întregul lot de
pacienți incluși în studiu și infiltratul leucocitar tumoral s -a înregistrat o corelație
inversă globală înalt semnificativă.
Drept concluzie finală, putem s pune că scăderea densității celulelor enterice gliale în
cancerul color ectal cu diferențierea tumorală dar și variația inversă a acestora cu infiltratul
leucocitar intratumoral poate servi ca factor de prognostic negativ în acest tip de cancer. Totuși,
rolul jucat de celulele enterice gliale în cancerul colorectal rămâne indirect și studii ulterioare
sunt necesare pentru a confirma rezultatele cercetării noastre.

80
Bibliografie
[1]. Giovannucci EL, Keum N. Epidemiology of Colorectal Cancer. Chapter 12:
Epidemiol ogy of Colorectal Cancer. In: Loda M, Mucci LA, Mittelstadt ML,
Hemelrijck MV, Cotter MB (eds.) Pathology and Epidemiology of Cancer. Springer
International Publishing Switzerland, 2017, 391 – 409.
[2]. Ferlay J, Steliarova -Foucher E, Lortet -Tieulent J, Rosso S , Coebergh JWW, Comber
H, Forman D, Bray F. Cancer incidence and mortality patterns in Europe: estimates for
40 countries in 2012. Eur J Cancer. 2013 Apr;49(6):1374 -403.
[3]. GLOBOCAN 2012, International Agency for Research on Cancer 2017, World Heath
Organizat ion. Valabil la http://gco.iarc.fr . Accesat la 01.05.2018 .
[4]. https://cancerstatisticscenter.cancer.org/#/cancer -site/Colorectum . Accesat în
01.05.2018 .
[5]. Edwards BK, Ward E, Kohler BA, Eheman C, Zauber AG, Anderson RN, Jemal A,
Schymura MJ, Lansdorp -Vogelaar I, Seeff LC, van Ballegooijen M, Goede SL, Ries
LA. Annual report to the nation on the status of cancer, 1975 -2006, featuring colorectal
cancer trends and impact of interventions (risk factors, screening, and treatment) to
reduce future rates. Cancer. 2010 Feb 1;116(3):544 -73.
[6]. Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2016. CA Cancer J Clin, 2016,
66(1):7 –30.
[7]. van de Velde CJ, Boelens PG, Borras JM, Coebergh JW, Cervantes A, Blomqvist L,
Beets -Tan RG, van den Broek CB, Brown G, Van Cutsem E, Espin E, Haustermans K,
Glimelius B, Iversen LH, van Krieken JH, Marijnen CA, Henning G, Gore -Booth J,
Meldolesi E, Mroczkowski P, Nag tegaal I, Naredi P, Ortiz H, Påhlman L, Quirke P,
Rödel C, Roth A, Rutten H, Schmoll HJ, Smith JJ, Tanis PJ, Taylor C, Wibe A, Wiggers
T, Gambacorta MA, Aristei C, Valentini V. EURECCA colorectal: multidisciplinary
management: European consensus conference colon & rectum. Eur J Cancer. 2014
Jan;50(1):1.e1 -1.e34.
[8]. Brenner H, Bouvier AM, Foschi R, Hackl M, Larsen IK, Lemmens V, Mangone L,
Francisci S; EUROCARE Working Group. Progress in colorectal cancer survival in
Europe from the late 1980s to the early 21st century: the EUROCARE study. Int J
Cancer. 2012 Oct 1;131(7):1649 -58.

81
[9]. Karim -Kos HE, de Vries E, Soerjomataram I, Lemmens V, Siesling S, Coebergh JW.
Recent trends of cancer in Europe: a combined approach of incidence, survival and
mortality for 17 cancer sites since the 1990sEur J Cancer. 2008 Jul;44(10):1345 -89.
[10]. Dunn JE. Cancer epidemiology in populations of the United States –with
emphasis on Hawaii and California –and Japan. Cancer Res. 1975 Nov;35(11 Pt.
2):3240 -3245.
[11]. http://www.cancer.net/cancer -types/lynch -syndrome . Accesat la 01.05.2018.
[12]. Bonadona V, Bonaïti B, Olschwang S, Grandjouan S, Huiart L, Longy M,
Guimbaud R, Buecher B, Bignon YJ, Caron O, Colas C, Noguès C, Lejeune -Dumoulin
S, Olivier -Faivre L, Polycarpe -Osaer F, Nguyen TD, Desseigne F, Saurin JC, Berthet
P, Leroux D, Duffour J, Manouvrier S, Frébourg T, Sobol H, Lasset C, Bonaïti -Pellié
C; French Cancer Genetics Network. Cancer risks associated with germline mutations
in MLH1 , MSH2, and MSH6 genes in Lynch syndrome. JAMA. 2011 Jun
8;305(22):2304 -10.
[13]. Järvinen HJ, Renkonen -Sinisalo L, Aktán -Collán K, Peltomäki P, Aaltonen LA,
Mecklin JP. Ten years after mutation testing for Lynch syndrome: cancer incidence and
outcome in mutatio n-positive and mutation -negative family members. J Clin Oncol.
2009 Oct 1;27(28):4793 -7.
[14]. Ricciardiello L, Ahnen DJ, Lynch PM. Chemoprevention of hereditary colon
cancers: time for new strategies. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2016 Jun;13(6):352 –
61.
[15]. Risio M. The natural history of adenomas. Best Pract Res Clin Gastroenterol.
2010 Jun;24(3):271 -80.
[16]. Cetta F, Dhamo A. Inherited multitumoral syndromes including colorectal
carcinoma. Surg Oncol. 2007 Dec;16 Suppl 1:S17 -23.
[17]. Coussens LM, Werb Z. Inflammation and c ancer. Nature. 2002 Dec 19 –
26;420(6917):860 -7.
[18]. Triantafillidis JK, Nasioulas G, Kosmidis PA. Colorectal cancer and
inflammatory bowel disease: epidemiology, risk factors, mechanisms of carcinogenesis
and prevention strategies. Anticancer Res. 2009 Jul;29(7 ):2727 -37.
[19]. Chau R, Jenkins MA, Buchanan DD, Ait Ouakrim D, Giles GG, Casey G,
Gallinger S, Haile RW, Le Marchand L, Newcomb PA, Lindor NM, Hopper JL, Win

82
AK. Determining the familial risk distribution of colorectal cancer: a data mining
approach. Fam Cance r. 2016 Apr;15(2):241 -51.
[20]. Johns LE, Houlston RS. A systematic review and meta -analysis of familial
colorectal cancer risk. Am J Gastroenterol. 2001 Oct;96(10):2992 -3003.
[21]. Shussman N, Wexner SD. Colorectal polyps and polyposis syndromes.
Gastroenterol Rep. 2 014;2:1 –15.
[22]. Muto T, Bussey HJ, Morson BC. The evolution of cancer of the colon and
rectum. Cancer. 1975;36:2251 –70.
[23]. Neugut AI, Jacobson JS, Ahsan H, Santos J, Garbowski GC, Forde KA, Treat
MR, Waye J. Incidence and recurrence rates of colorectal adenomas: a prospective
study. Gastroenterology. 1995;108:402 –8.
[24]. Boyle T, Keegel T, Bull F, Heyworth J, Fritschi L. Physical activity and risks
of proximal and distal colon cancers: a systematic review and meta -analysis. J Natl
Cancer Inst. 2012 Oct 17;104(20):1548 -61.
[25]. Campbell PT, Patel AV, Newton CC, Jacobs EJ, Gapstur SM. Associations of
recreational physical activity and leisure time spent sitting with colorectal cancer
survival. J Clin Oncol. 2013 Mar 1;31(7):876 -85.
[26]. Schmid D, Leitzmann MF. Television viewing a nd time spent sedentary in
relation to cancer risk: a meta -analysis. J Natl Cancer Inst. 2014 Jun 16;106(7). pii:
dju098.
[27]. Chao A, Connell CJ, Jacobs EJ, McCullough ML, Patel AV, Calle EE,
Cokkinides VE, Thun MJ. Amount, type, and timing of recreational phy sical activity
in relation to colon and rectal cancer in older adults: the Cancer Prevention Study II
Nutrition Cohort. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2004 Dec;13(12):2187 -95.
[28]. Bardou M, Barkun AN, Martel M. Obesity and colorectal cancer. Gut. 2013
Jun;6 2(6):933 -47.
[29]. Harriss DJ, Atkinson G, George K, Cable NT, Reilly T, Haboubi N, Zwahlen
M, Egger M, Renehan AG; C -CLEAR group. Lifestyle factors and colorectal cancer
risk (1): systematic review and meta -analysis of associations with body mass index.
Colorec tal Dis. 2009 Jul;11(6):547 -63.
[30]. Larsson SC, Wolk A. Obesity and colon and rectal cancer risk: a meta -analysis
of prospective studies. Am J Clin Nutr. 2007 Sep;86(3):556 -65.
[31]. O'Keefe SJ. Diet, microorganisms and their metabolites, and colon cancer. Nat
Rev Gastroenterol Hepatol. 2016 Dec;13(12):691 -706.

83
[32]. Tilg H, Moschen AR. Food, immunity, and the microbiome. Gastroenterology.
2015 May;148(6):1107 -19.
[33]. Fung TT, Brown LS. Dietary Patterns and the Risk of Colorectal Cancer. Curr
Nutr Rep. 2013 Mar 1;2(1):48 -55.
[34]. Magalhães B, Peleteiro B, Lunet N. Dietary patterns and colorectal cancer:
systematic review and meta -analysis. Eur J Cancer Prev. 2012 Jan;21(1):15 -23.
[35]. Ley SH, Sun Q, Willett WC, Eliassen AH, Wu K, Pan A, Grodstein F, Hu FB.
Associations between red meat intake and biomarkers of inflammation and glucose
metabolism in women. Am J Clin Nutr. 2014 Feb;99(2):352 -60.
[36]. Giovannucci E, Martínez ME. Tobacco, colorectal cancer, and adenomas: a
review of the evidence. J Natl Cancer Inst. 1996 Dec 4;88(23):1717 -30.
[37]. Cross AJ, Boca S, Freedman ND, Caporaso NE, Huang WY, Sinha R, Sampson
JN, Moore SC. Metabolites of tobacco smoking and colorectal cancer risk.
Carcinogenesis. 2014 Jul;35(7):1516 -22.
[38]. Botteri E, Iodice S, Bagnardi V, Raimondi S, Lowenfels AB, Maisonneuve P.
Smoking and colorectal cancer: a meta -analysis. JAMA. 2008 Dec 17;300(23):2765 –
78.
[39]. Bagnardi V, Rota M, Botteri E, Tramacere I, Islami F, Fedirko V, Scotti L,
Jenab M, Turati F, Pasquali E, Pelucchi C, Galeone C, Bellocco R, Negri E, Corrao G,
Boffetta P, L a Vecchia C. Alcohol consumption and site -specific cancer risk: a
comprehensive dose -response meta -analysis. Br J Cancer. 2015 Feb 3;112(3):580 -93.
[40]. Jokelainen K, Nosova T, Koivisto T, Väkeväinen S, Jousimies -Somer H, Heine
R, Salaspuro M. Inhibition of ba cteriocolonic pathway for ethanol oxidation by
ciprofloxacin in rats. Life Sci. 1997;61(18):1755 -62.
[41]. Hillman RS, Steinberg SE. The effects of alcohol on folate metabolism. Annu
Rev Med. 1982;33:345 -54.
[42]. Furness JB. The enteric nervous system and neurogastro enterology. Nat Rev
Gastroenterol Hepatol. 2012 Mar 6;9(5):286 -94.
[43]. Gulbransen BD. Enteric glia. In: Verkhratsky A, Parpura V (eds). Colloquium
series on neuroglia in biology and medicine: from physiology to disease. Morgan &
Claypool Life Sciences, 2014, 1 (2):1 –70.
[44]. Ochoa -Cortes F, Turco F, Linan -Rico A, Soghomonyan S, Whitaker E, Wehner
S, Cuomo R, Christofi FL. Enteric Glial Cells: A New Frontier in
Neurogastroenterology and Clinical Target for Inflammatory Bowel Diseases. Inflamm
Bowel Dis. 2016 Feb;22(2) :433-49.
[45]. Hanani M, Reichenbach A. Morphology of horseradish peroxidase (HRP) –
injected glial cells in the myenteric plexus of the guinea -pig. Cell Tissue Res. 1994
Oct;278(1):153 -60.
[46]. Boesmans W, Rocha NP, Reis HJ, Holt M, Vanden Berghe P. The astrocyte
mark er Aldh1L1 does not reliably label enteric glial cells. Neurosci Lett. 2014 Apr
30;566:102 -5.

84
[47]. Liu YA, Chung YC, Pan ST, Shen MY, Hou YC, Peng SJ, Pasricha PJ, Tang
SC. 3 -D imaging, illustration, and quantitation of enteric glial network in transparent
huma n colon mucosa. Neurogastroenterol Motil. 2013 May;25(5):e324 -38.
[48]. Hoff S, Zeller F, von Weyhern CW, Wegner M, Schemann M, Michel K, Rühl
A. Quantitative assessment of glial cells in the human and guinea pig enteric nervous
system with an anti -Sox8/9/10 ant ibody. J Comp Neurol. 2008 Aug 1;509(4):356 -71.
[49]. Rühl A. Glial cells in the gut. Neurogastroenterol Motil. 2005 Dec;17(6):777 –
90.
[50]. Gulbransen BD, Sharkey KA. Purinergic neuron -to-glia signaling in the enteric
nervous system. Gastroenterology. 2009 Apr;136(4) :1349 -58.
[51]. Fung C, Boesmans W, Cirillo C, Foong JPP, Bornstein JC, Vanden Berghe P.
VPAC Receptor Subtypes Tune Purinergic Neuron -to-Glia Communication in the
Murine Submucosal Plexus. Front Cell Neurosci. 2017 Apr 25; 11:118.
[52]. Antonioli L, Fornai M, Awwad O , Giustarini G, Pellegrini C, Tuccori M, Caputi
V, Qesari M, Castagliuolo I, Brun P, Giron MC, Scarpignato C, Blandizzi C, Colucci
R. Role of the A(2B) receptor -adenosine deaminase complex in colonic dysmotility
associated with bowel inflammation in rats. Br J Pharmacol. 2014 Mar;171(5):1314 –
29.
[53]. Wang GD, Wang XY, Xia Y, Wood JD. Dietary glutamate: interactions with
the enteric nervous system. J Neurogastroenterol Motil. 2014 Jan;20(1):41 -53.
[54]. Grubišić V, Verkhratsky A, Zorec R, Parpura V. Enteric glia regula te gut
motility in health and disease. Brain Res Bull. 2017 Mar 29. pii: S0361 -9230(17)30183 –
1.
[55]. MacEachern SJ, Patel BA, McKay DM, Sharkey KA. Nitric oxide regulation of
colonic epithelial ion transport: a novel role for enteric glia in the myenteric plexu s. J
Physiol. 2011 Jul 1;589(Pt 13):3333 -48.
[56]. Segura BJ, Zhang W, Cowles RA, Xiao L, Lin TR, Logsdon C, Mulholland
MW. Lysophosphatidic acid stimulates calcium transients in enteric glia. Neuroscience.
2004;123(3):687 -93.
[57]. Boesmans W, Cirillo C, Van den Abbe el V, Van den Haute C, Depoortere I,
Tack J, Vanden Berghe P. Neurotransmitters involved in fast excitatory
neurotransmission directly activate enteric glial cells. Neurogastroenterol Motil. 2013
Feb;25(2):e151 -60.
[58]. Costagliola A, Van Nassauw L, Snyders D, Adriaensen D, Timmermans JP.
Voltage -gated delayed rectifier K v 1 -subunits may serve as distinctive markers for
enteroglial cells with different phenotypes in the murine ileum. Neurosci Lett. 2009 Sep
18;461(2):80 -4.
[59]. Jiang L, Li J, Liu X, Burnstock G, Xia ng Z. Expression of aquaporin -4 water
channels in the digestive tract of the guinea pig. J Mol Histol. 2014 Apr;45(2):229 -41.
[60]. Zhang W, Segura BJ, Lin TR, Hu Y, Mulholland MW. Intercellular calcium
waves in cultured enteric glia from neonatal guinea pig. Gl ia. 2003 May;42(3):252 -62.
[61]. Esposito G, Capoccia E, Turco F, Palumbo I, Lu J, Steardo A, Cuomo R,
Sarnelli G, Steardo L. Palmitoylethanolamide improves colon inflammation through an

85
enteric glia/toll like receptor 4 -dependent PPAR -α activation. Gut. 2014
Aug;63(8):1300 -12.
[62]. Murakami M, Ohta T, Otsuguro KI, Ito S. Involvement of prostaglandin E(2)
derived from enteric glial cells in the action of bradykinin in cultured rat myenteric
neurons. Neuroscience. 2007 Mar 16;145(2):642 -53.
[63]. Bach -Ngohou K, Mahé MM, Aube rt P, Abdo H, Boni S, Bourreille A, Denis
MG, Lardeux B, Neunlist M, Masson D. Enteric glia modulate epithelial cell
proliferation and differentiation through 15 -deoxy -12,14 -prostaglandin J2. J Physiol.
2010 Jul 15;588(Pt 14):2533 -44.
[64]. Neunlist M, Aubert P, Bonnaud S, Van Landeghem L, Coron E, Wedel T,
Naveilhan P, Ruhl A, Lardeux B, Savidge T, Paris F, Galmiche JP. Enteric glia inhibit
intestinal epithelial cell proliferation partly through a TGF -beta1 -dependent pathway.
Am J Physiol Gastrointest Liver Phys iol. 2007 Jan;292(1):G231 -41.
[65]. Cheadle GA, Costantini TW, Lopez N, Bansal V, Eliceiri BP, Coimbra R.
Enteric glia cells attenuate cytomix -induced intestinal epithelial barrier breakdown.
PLoS One. 2013 Jul 1;8(7):e69042.
[66]. Van Landeghem L, Chevalier J, Mahé M M, Wedel T, Urvil P, Derkinderen P,
Savidge T, Neunlist M. Enteric glia promote intestinal mucosal healing via activation
of focal adhesion kinase and release of proEGF. Am J Physiol Gastrointest Liver
Physiol. 2011 Jun;300(6):G976 -87.
[67]. Rodrigues DM, Li AY, Nair DG, Blennerhassett MG. Glial cell line -derived
neurotrophic factor is a key neurotrophin in the postnatal enteric nervous system.
Neurogastroenterol Motil. 2011 Feb;23(2):e44 -56.
[68]. Fletcher EL, Clark MJ, Furness JB. Neuronal and glial localization of G ABA
transporter immunoreactivity in the myenteric plexus. Cell Tissue Res. 2002
Jun;308(3):339 -46.
[69]. Lavoie EG, Gulbransen BD, Martín -Satué M, Aliagas E, Sharkey KA, Sévigny
J. Ectonucleotidases in the digestive system: focus on NTPDase3 localization. Am J
Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2011 Apr;300(4):G608 -20.
[70]. Gulbransen BD, Sharkey KA. Novel functional roles for enteric glia in the
gastrointestinal tract. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2012 Nov;9(11):625 -32.
[71]. Aikawa H, Suzuki K. Enteric gliopathy in nia cin-deficiency induced by CNS
glio-toxin. Brain Res. 1985 May 20; 334(2):354 -6.
[72]. Linan Rico A, Grants I, Needleman BJ, et al. Gliomodulation of neuronal and
motor behavior in the human GI tract. Gastroenterology. 2015;148:S -18.
[73]. Neunlist M, Van Landeghem L, Mahé MM, Derkinderen P, des Varannes SB,
Rolli -Derkinderen M. The digestive neuronal -glial-epithelial unit: a new actor in gut
health and disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2013 Feb;10(2):90 -100.
[74]. Tsukita S, Yamazaki Y, Katsuno T, Tamura A, Tsukita S. Tight junction -based
epithelial microenvironment and cell proliferation. Oncogene. 2008 Nov
24;27(55):6930 -8.
[75]. Savidge TC, Newman P, Pothoulakis C, Ruhl A, Neunlist M, Bourreille A,
Hurst R, Sofroniew MV. Enteric glia regulate intestinal barrier function an d

86
inflammation via release of S -nitrosoglutathione. Gastroenterology. 2007
Apr;132(4):1344 -58.
[76]. Matteoli G. Enteric glial cells: new players in mucosal defence against bacteria?
Gut. 2011 Apr;60(4):429 -30.
[77]. Flamant M, Aubert P, Rolli -Derkinderen M, Bourreill e A, Neunlist MR, Mahé
MM, Meurette G, Marteyn B, Savidge T, Galmiche JP, Sansonetti PJ, Neunlist M.
Enteric glia protect against Shigella flexneri invasion in intestinal epithelial cells: a role
for S -nitrosoglutathione. Gut. 2011 Apr;60(4):473 -84.
[78]. Kabour idis PS, Lasrado R, McCallum S, Chng SH, Snippert HJ, Clevers H,
Pettersson S, Pachnis V. Microbiota controls the homeostasis of glial cells in the gut
lamina propria. Neuron. 2015 Jan 21;85(2):289 -95.
[79]. Barajon I, Serrao G, Arnaboldi F, Opizzi E, Ripamonti G, Balsari A, Rumio C.
Toll-like receptors 3, 4, and 7 are expressed in the enteric nervous system and dorsal
root ganglia. J Histochem Cytochem. 2009 Nov;57(11):1013 -23.
[80]. Round JL, Mazmanian SK. The gut microbiota shapes intestinal immune
responses during health and disease. Nat Rev Immunol. 2009 May;9(5):313 -23.
[81]. Terzić J, Grivennikov S, Karin E, Karin M. Inflammation and colon cancer.
Gastroenterology. 2010 Jun;138(6):2101 -2114.e5.
[82]. Meira LB, Bugni JM, Green SL, Lee CW, Pang B, Borenshtein D, Rickman
BH, Ro gers AB, Moroski -Erkul CA, McFaline JL, Schauer DB, Dedon PC, Fox JG,
Samson LD. DNA damage induced by chronic inflammation contributes to colon
carcinogenesis in mice. J Clin Invest. 2008 Jul;118(7):2516 -25.
[83]. Lasry A, Zinger A, Ben -Neriah Y. Inflammatory n etworks underlying
colorectal cancer. Nat Immunol. 2016 Mar;17(3):230 -40.
[84]. Ou B, Zhao J, Guan S, Feng H, Wangpu X, Zhu C, Zong Y, Ma J, Sun J, Shen
X, Zheng M, Lu A. CCR4 promotes metastasis via ERK/NF -κB/MMP13 pathway and
acts downstream of TNF -α in colore ctal cancer. Oncotarget. 2016 Jul 26;7(30):47637 –
47649.
[85]. Ben-Neriah Y, Karin M. Inflammation meets cancer, with NF -κB as the
matchmaker. Nat Immunol. 2011 Jul 19;12(8):715 -23.
[86]. Bondar T, Medzhitov R. The origins of tumor -promoting inflammation. Cancer
Cell. 2013 Aug 12;24(2):143 -4.
[87]. Amit S, Hatzubai A, Birman Y, Andersen JS, Ben -Shushan E, Mann M, Ben –
Neriah Y, Alkalay I. Axin -mediated CKI phosphorylation of beta -catenin at Ser 45: a
molecular switch for the Wnt pathway. Genes Dev. 2002 May 1;16(9):1066 -76.
[88]. Cole BF, Logan RF, Halabi S, Benamouzig R, Sandler RS, Grainge MJ,
Chaussade S, Baron JA. Aspirin for the chemoprevention of colorectal adenomas: meta –
analysis of the randomized trials. J Natl Cancer Inst. 2009 Feb 18;101(4):256 -66.
[89]. https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02301286?term=NCT02301286&rank=
1 . Accesat la data de 01.05.2018.

87
[90]. Steinbach G, Lynch PM, Phillips RK, Wallace MH, Hawk E, Gordon GB,
Wakabayashi N, Saunde rs B, Shen Y, Fujimura T, Su LK, Levin B, Godio L, Patterson
S, Rodriguez -Bigas MA, Jester SL, King KL, Schumacher M, Abbruzzese J, DuBois
RN, Hittelman WN, Zimmerman S, Sherman JW, Kelloff G. The effect of celecoxib, a
cyclooxygenase -2 inhibitor, in famil ial adenomatous polyposis. N Engl J Med. 2000
Jun 29;342(26):1946 -52.
[91]. Lee V, Murphy A, Le DT, Diaz LA Jr. Mismatch Repair Deficiency and
Response to Immune Checkpoint Blockade. Oncologist. 2016 Oct;21(10):1200 -1211.
[92]. Angevin E, Tabernero J, Elez E, Cohen SJ , Bahleda R, van Laethem JL,
Ottensmeier C, Lopez -Martin JA, Clive S, Joly F, Ray -Coquard I, Dirix L, Machiels
JP, Steven N, Reddy M, Hall B, Puchalski TA, Bandekar R, van de Velde H, Tromp B,
Vermeulen J, Kurzrock R. A phase I/II, multiple -dose, dose -escalation study of
siltuximab, an anti -interleukin -6 monoclonal antibody, in patients with advanced solid
tumors. Clin Cancer Res. 2014 Apr 15;20(8):2192 -204.
[93]. Peyrin -Biroulet L. Anti -TNF therapy in inflammatory bowel diseases: a huge
review. Minerva Gastroent erol Dietol. 2010 Jun;56(2):233 -43.
[94]. Wang Y, Wang K, Han GC, Wang RX, Xiao H, Hou CM, Guo RF, Dou Y, Shen
BF, Li Y, Chen GJ. Neutrophil infiltration favors colitis -associated tumorigenesis by
activating the interleukin -1 (IL -1)/IL -6 axis. Mucosal Immunol. 2 014 Sep;7(5):1106 –
15.
[95]. Dinarello CA. Why not treat human cancer with interleukin -1 blockade? Cancer
Metastasis Rev. 2010 Jun;29(2):317 -29.
[96]. https://clinicaltrials.gov/ct2 /show/NCT02090101?term=NCT02090101&rank=
1 . Accesat la data de 01.07.2017.
[97]. Neunlist M, Rolli -Derkinderen M, Latorre R, Van Landeghem L, Coron E,
Derkinderen P, De Giorgio R. Enteric glial cells: recent developments and future
directions. Gastroenterology. 2014 Dec;147(6):1230 -7.
[98]. Kraus S, Arber N. Inflammation and colorectal cancer. Curr Opin Pharmacol.
2009 Aug;9(4):405 -10.
[99]. Târtea EA, Florescu C, Donoiu I, Pirici D, Mihailovici AR, Albu VC, Bălșeanu
TA, Iancău M, Badea CD, Vere CC, Sfredel V. Implications o f inflammation and
remodeling of the enteric glial cells in colorectal adenocarcinoma. Rom J Morphol
Embryol 2017, 58(2): In press.
[100]. Ciurea RN, Rogoveanu I, Pirici D, Târtea GC, Streba CT, Florescu C, Cătălin
B, Puiu I, Târtea EA, Vere CC. B2 adrenergic rec eptors and morphological changes of

88
the enteric nervous system in colorectal adenocarcinoma. World J Gastroenterol 2017;
23(7): 1250 -1261.
[101]. Florescu C, Istratoaie O, Târtea GC, Pirici D, Streba CT, Catalin B, Puiu I,
Tartea EA, Caragea DC, Ghilusi MC, Coman escu MV, Rogoveanu I, Vere CC. Neuro –
neoplastic interrelationships in colorectal level –immunohistochemical aspect in three
cases and review of the literature. Rom J Morphol Embryol 2016, 57(2 Suppl):639 –
650.
[102]. Târtea GC, Florescu C, Pirici D, Caragea D, Târt ea EA, Vere CC. The substrate
of the biopsychosocial influences in the carcinogenesis of the digestive tract. Journal of
Mind and Medical Sciences 2016; 3:108 -117.
[103]. Florescu C, Târtea GC, Streba CT, Pirici D, Puiu I, Târtea EA, Ghiluși M,
Comănescu MV, Rogo veanu I, Vere CC. The Evaluation of Beta -2-Adrenoreceptors’
Expression in Normal Peritumoral Tissue in Patients with Colorectal Adenocarcinoma.
Current Health Sciences Journal, 2016; 42 (4): 335 – 341.