Hematopoieza Prenatală

1. HEMATOPOIEZA PRENATALĂ

Hematopoieza este procesul de formare al elementelor figurate sangvine ce se desfășoară pe toată durata vieții, în două etape distincte: o etapă prenatală și o etapă postnatală (3).

Hematopoieza prenatală apare pentru prima dată în insulele sangvine Wolff și Pander și cuprinde trei stadii de dezvoltare:

– hematopoieza primordială (prehepatică);

– hematopoieza hepato-splenică;

– hematopoieza medulo-limfatică (1, 2, 3).

1.1 Hematopoieza primordială

În această etapă, hematopoieza se desfasoară în mezodermul sacului vitelin începând cu a 7-a zi embrionară. Astfel, celulele hematopoietice primitive sunt printre primele țesuturi distincte care apar (4, 5).

Eritrocitele primitive se formează în sacul vitelin, iar cele definitive sunt produse de ficat și, mai târziu, de către splină și măduva hematoformatoare. Până în ziua a 12-a embrionară eritrocitele circulante sunt nucleate, ca mai apoi, între zilele 14-16 embrionare nucleii să se condenseze. Din punct de vedere morfologic volumul și cantitatea de hemoglobină la eritrocitele primitive sunt de 6 ori mai mari decât la cele definitive (8).

Celulele mezodermale implicate în inițierea și susținerea hematopoiezei au fost denumite “hemangioblaști” deoarece, atât de hematopoieza primitivă cât și vasculogeneza par a avea un predecesor comun (6, 7, 11, 12), fapt demonstrat prin faptul că celulele situate la periferia insulelelor hematopoietice formează o rețea neregulată de celule alungite, cu prelungiri, ce se unesc și formează un tub endotelial (respectiv, un vas de sânge), iar celulele centrale se detașează de cele periferice, devin globuloase, cu citoplasma intens bazofilă (14).

1.2 Hematopoieza hepato-splenică

Această etapă este susținută de mezenchimul hepatic și splenic și se caracterizează prin migrarea celulelor pluripotente la acest nivel, unde există condiții superioare pentru hematopoieză.

În ficatul embriofetal hematopoieza apare timpuriu, regresând treptat astfel încât la naștere această funcție dispare (9).

În anul 1978 și, ulterior în 1985, Stutman considera ficatul fetal ca fiind o stație obligatorie pentru celulele ce provin din sacul vitelin. Acestea pătrund în mezenchim și în celulele epiteliului timic devenind limfocite (3).

Inițial splina joacâ rolul de distrugere a eritrocitelor îmbătrânite sau uzate prematur, ulterior ea preluând și funcția de organ hematopoietic “mieloid” alături de ficat, astfel că până în luna a 7-a de gestație (la hominide), în ochiurile rețelei splenice se întâlnesc atât megacariocite cât și limfocite tinere și eritrocite identice cu cele din măduva hematogenă. În ultimul trimestru de gestație, splina devine organ limfoid, iar la parturiție, în parenchimul splenic încă se mai întâlnesc hematii nucleate (3).

De asemenea, în această perioadă, un alt ogan implicat în hematopoieză este timusul având rol atât în producerea unui număr redus de mielocite și eritroblaste cât și de a popula organele limfoide secundare și periferice cu timocite (limfocite tip T) (3, 9).

1.3 Hematopoieza medulo-limfatică

Această etapă devine funcțională o dată cu intrarea în activitate a măduvei osoase hematoformatoare și a ganglionilor limfatici, paralel cu involuția hematopoiezei splenice, hepatice și timice.

La sfârșitul vieții uterine se produce o specializare a organelor hematopoietice în organe limfoide și organe mieloide, acestea putând, ulterior, să revină la capacitatea hematoformatoare totală datorită memoriei pe care o pastrează celulele mezenchimale sușe (3).

1.4 Morfologia sângelui fetal

În primele stadii de dezvoltare, sângele fetușilor se caracterizează prin macrocitoză, anizocitoză marcantă și policromazie precum și prin prezența unui număr mare de eritrocite nucleate.

Studii efectuate pe sângele fetal de cabaline și ovine până în ziua nașterii și după aceea câteva săptămâni postnatal, au evidențiat modificări importante la nivelul volumului eritrocitar mediu în sensul reducerii volumului acestuia, precum și la nivelul concentrației medii de hemoglobină corpusculară ce descrește o dată cu dimensiunile eritrocitului. De asemenea, ca o caracteristică generală, la fetuși, morfologia eritrocitelor este asemanatoare cu cea a animalelor tinere sau cu cea a adultelor ce au suferit o hemoragie acută (13).

HEMATOPOIEZA POSTNATALĂ

Hematopoieza postnatală implică două procese fundamentale ce constau în dezvoltarea progresivă a caracterelor structurale și funcționale ale liniilor celulare specifice precum și proliferarea celulară.

Celulele care stau la baza dezvoltării tuturor tipurilor de celule sangvine au origine mezenchimală și sunt reprezentate de celulele stem hematopoietice. Apariția lor are loc de timpuriu, la aproximativ 18 zile de la nidația oului, localizându-se, inițial, în insulele Wolff și Pander din peretele sacului vitelin, apoi la nivelul ficatului embrionar (38). Acestea au o structură morfologică nediferențiată, evaluarea proteinelor de suprafață fiind singura metodă definitorie pentru identificare (37).

Principalele caracteristici ale acestor celule sunt:

– sunt pluripotente, fiind la originea dezvoltării tuturor populațiilor celulare sangvine;

– au capacitate de autoregenerare, cu menținerea constantă a numărului lor;

– se multiplică și produc descendenți fără a fi stimulate antigenic;

– din punct de vedere morfologic sunt identice cu orice limfocit imunocompetent;

– au sensibilitate crescută la acțiunea radiațiilor, dar scazută la acțiunea citostaticelor (38, 39).

Din celulele stem hematopoietice iau nastere celule cu capacitate de diferențiere din ce în ce mai restransă. Acestea se împart în 3 categorii:

– celule stem hematopoietice multipotente;

-celule stem hematopoietice bipotente;

– celule stem hematopoietice monopotente.

Celulele stem hematopoietice multipotente se regăsesc atât în teritoriul medular al hematopoiezei cât și în circulația sangvină. Acestea au proprietatea de citoproliferare continuă sub acțiunea Interleukinei 3 (IL-3) rezultând două celule distincte, una sub aspectul de celulă stem pluripotentă iar cea de-a doua fie celulă stem unipotenta, fie celulă stem bipotentă (2).

Celulele stem bipotente sau celulele stem unipotente, denumite și “hemocitoblaști”, asigură populațional toate liniile celulare ce compun hematopoieza normală.

Procesul de hematopoieză implică o succesiune de etape precum: citoproliferarea, citodiferențierea, citomaturarea și citodiabaza (2).

Citoproliferarea reprezintă capacitatea celulelor de a se multiplica, producând colonii. Aceasta se realizează, cel mai adesea, prin diviziune mitotică, dar se întâlnește și diviziunea amitotică (21).

Diviziunea amitotică se realizează prin ștrangularea nucleului urmată de separarea acestuia în alți doi nuclei cu citoplsme proprii (3).

Diviziunea mitotică are patru faze de desfășurare: profaza, metafaza, anafaza și telofaza.

În literatura de specialitate sunt descrise două variante ale diviziunii mitotice: o variantă “hemoplastică” atunci când prin diviziunea unei celule iau naștere două celule identice cu “celula mamă” și o variantă “heteroplastică” când o celulă se divide în alte două mai evoluate. Un exemplu de diviziune hemoplastică este întâlnită în leucemia acută cu celule imature iar în leucemia cronică sunt predominante diviziunile heteroplastice (3).

Citodiferențierea este fenomenul prin care precursorii medulari capată caracteristici corespunzatoare cu funcțiile pe care le vor avea celulele adulte. Aceasta începe o dată cu apariția hemocitoblaștilor și se menține până la maturarea celulară a fiecarei linii hematopoietice (2). De asemenea, odată cu diferențierea celulelor hematopietice apar și modificări imunologice (21).

Citomaturarea se desfasoară între celulele rezultate în cadrul unei linii hematopoietice și celulele stromale ce au rol de celule “doică”. În procesul de maturare al unei celule se observă menținerea unui sincronism evolutiv nucleo-citoplasmatic (22).

În unele situații speciale, când cererea de celule hematopoietice este foarte mare, citomaturarea are loc și la nivelul sinusoidului limitrof cu insulele de hematopoieză (3).

Citodiabaza constă în trecerea celulelor maturate, din organele hematopoietice în sângele periferic. Aceasta trecere are loc printr-o implicare activă a celulelor și a sinusurilor vasculare ce efectuează o triere selectivă a acestora (3).

În clinică, multe entități morbide produc modificări ale procesului de diabază putând apărea fie o blocare a acesteia fie o insuficiență funcțională.

În cazul blocării citodiabazei se produc grave disocieri între aspectul citologic ale sângelui periferic și măduvei hematoformatoare. Astfel, în timp ce măduva hematopoietică atestă existența unei hipercelularități uniforme a tuturor liniilor celulare, în sângele periferic se evidențiază o intensă anemie regenerativă, trombocitopenie, și leucopenie gravă (2).

În insuficiența funcțională a diabazei, întâlnită în unele anemii, stări leucemic-like sau leucemii, se constată apariția celulelor blastice, imature, în sângele periferic (2,3).

Ca și o noutate în domeniul hematopoiezei, au apărut noi studii ce dovedesc faptul că celula stem hematopoietică multipotentă își poate schimba direcția de dezvoltare devenind o celulă stem necesară construirii unui alt țesut sau organ. Există cazuri demonstrate de transplant de măduvă osoasă la șobolani cu ficatul afectat în care acesta crește din nou cu ajutorul celulelor hematopoietice transplantate (1).

MEDULOGRAMA NORMALĂ LA CAL ȘI OAIE

(dupa Manolescu N, 1999, Pârvu G., 1984)

Hematopoieza, ca proces fiziologic complex, se desfășoară în două zone principale:

– hematopoieza medulară;

– hematopoieza extramedulară.

Hematopoieza medulară generează toate celulele implicate în hematopoieza: celule stem multipotente, bipotente și unipotente (hemocitoblaști). Hemocitoblaștii sunt celule “cap de serie” pentru liniile celulare eritropoietice, megacariocitare, limfocitare primordiale și mielomonocitare (3).

In paginile urmatoare voi prezenta schematic etapele transformarii celulei stem hematopoietice in linii celulare specializate.

ERITROPOIEZA

Formarea eritrocitelor are ca punct de plecare proeritroblastul, celula “cap de serie”, nucleată, de dimensiuni mari, în care începe sinteza de hemoglobină.

În decursul a 5-7 zile proeritroblastul se diferențiază, în etape succesive: eritroblast bazofil → eritroblast policromatofil → eritroblast oxifil → reticulocit → eritrocit (3, 4, 5).

În cursul procesului de maturare, proeritroblastul va suferi numeroase transformări progresive până când va deveni eritrocit. Acestea constau în:

– reducerea dimensiunilor celulei și nucleului;

– creșterea cantității de cromatină nucleară condensată;

-creșterea raportului dintre volumul citoplasmatic și volumul nuclear;

– creșterea conținutului de hemoglobină în paralel cu scăderea ARN-ului ribozomal.

În final, eritroblastul oxifil suferă un proces de eliminare a nucleului și se transformă în reticulocit. Acesta intră în circulația sangvină, rămânând în acest stadiu 1-2 zile, după care devine eritrocit matur (3, 4, 5).

Descrierea citomorfologică a celulelor eritroide în diferitele faze de dezvoltare

(după Cowell R.L., 2008)

La cabaline, în sângele periferic nu sunt identificate reticulocite decât în cazuri foarte rare deoarece acestea părăsesc măduva hematogenă în stare matură (3,4,5,7).

Desfășurarea normală a eritropoiezei necesită o serie de factori cu rol plastic și funcțional precum: fierul, cobaltul, cuprul, vitamina B12, acidul folic, vitamina B6, vitamina B2, acidul pantotenic, acidul ascorbic, aminoacizi esentiali, a căror prezență este indispensabilă în procesele de diviziune și maturare dar și de sinteză a hemoglobinei (8).

Eritrodiabaza și eritropoieza sunt corelate cu necesarul de oxigen al organismului, astfel, în cazul scăderii cantității de oxigen transportat la țesuturi se constată o creștere a producției de hematii până la compensarea hipoxiei. Aceste două procese sunt reglate atât prin mecanisme nervoase cât și umorale (8).

Reglarea nervoasă se realizează prin intervenția centrilor nervoși hipotalamici posteriori cu rol în:

– stimularea directă a activității eritropoietice a măduvei hematoformatoare;

– intensificarea descărcării de eritropoietină;

– mobilizarea masei eritrocitare din organele de depozit (8).

Reglarea umorală este realizată de eritropoietina, considerată hormon tisular de origine renală, ce are drept țintă măduva osoasă hematopoietică, având următoarele efecte:

– stimulează formarea proeritroblaștilor din celulele “sușe” prediferențiate;

– controlează ritmul mitozelor în evoluția eritroblaștilor;

– stimulează sinteza de hemoglobină;

– accelerează trecerea reticulocitelor în circulație (8).

Stimulul principal pentru producerea eritropoietinei este hipoxia tisulară ce stimulează mecanismele renale și extrarenale de producere a eritropoietinei.

Eritroliza. Distrugerea eritrocitelor normale, îmbătrânite, are loc în macrofage (hemoliza extravasculară) și, accidental, în sângele circulant (hemoliza intravasculară) atunci când pătrund în sânge unele substanțe hemolizante (veninuri, toxine bacteriene, medicamente etc.) sau ca urmare a acțiunii unor anticorpi hemolizanți (8).

La ovine eritrocitele adulte sunt discoide, fiind printre cele mai mici din seria mamiferelor, având un diametrul de 3,2 – 6,5 µm în medie (3, 23).

Eritrocitele cabalinelor au formă de disc biconcav cu diametrul de 5-6 µm, ce se grupeaza în “fișicuri” (23).

GRANULOCITOPOIEZA

Granulocitopoieza reprezintă procesul de multiplicare și maturare a celulei “cap de serie”, numită mieloblast, până la stadiul de granulocite circulante în sânge (neutrofile, eozinofile și bazofile) cu capacitate de fagocitare și secreție ( 3, 8, 9).

Stadiile de dezvoltare ale granulocitelor de la imatur la matur sunt: mieloblast → promielocit → mielocit → metamielocit → granulocit nesegmentat → granulocit segmentat.

Descrierea citomorfologică a celulelor sistemului granulocitar în diferitele faze de dezvoltare

(dupa Cowell R.L., 2008 și Berceanu S., Manolescu N., 1985)

NIVELE DE CITODIFERENȚIERE – LINIA GRANULOCITOFORMATOARE (2, 3, 8, 9)

Compartimentul celulelor stem pluripotente și unipotente

celula stem pluripotentă

↓

celula stem bipotentă mielomonocitară

↓

celula stem unipotentă angajată mieloid

↓

Compartimentul de proliferare

Mieloblast

↓

Promielocit eozinofil Promielocit neutrofil Promielocit bazofil

↓ ↓ ↓

Mielocit eozinofil Mielocit neutrofil Mielocit bazofil

↓

Compatimentul de maturare și rezervă

↓

Metamielocit nesegmentat Metamielocit nesegmentat Metamielocit nesegmentat

eozinofil neutrofil bazofil

↓ ↓ ↓

Metamielocit segmentat Metamielocit segmentat Metamielocit segmentat

eozinofil neutrofil bazofil

↓ ↓ ↓

Granulocit nesegmentat Granulocit nesegmentat Granulocit nesegmentat

eozinofil neutrofil bazofil

↓ ↓ ↓

Granulocit segmentat Granulocit segmentat Granulocit segmentat

eozinofil neutrofil bazofil

Transformările produse în acest ciclu de maturare sunt :

1. în stadiul de promielocit apar granulații citoplasmatice azurofile, ce rămân vizibile până în stadiul de mielocit;

2. după stadiul de promielocit are loc reducerea progresivă a bazofiliei citoplasmei și creșterea cantității de cromatina nucleară condensată;

3. în stadiul de mielocit și metamielocit apar granulațiile specifice neutrofilelor;

4. în stadiul de metamielocit nucleul capată un aspect reniform;

5. în stadiul de granulocit are loc segmentarea progresivă a nucleului, cu formarea a 2-5 lobuli.

La cabaline, neutrofilul matur are cromatina nucleară densă, iar nucleul este multilobat. Datorită densificării cromatinei sub formă de plăci, forma nucleului apare neregulată. La iapă, apendicele nuclear reprezintă unul dintre cei doi cromozomi X și are forma unui “băț de tobă” (3).

Neutrofilele ovinelor conțin trei tipuri de granule, respectiv granule primare, secundare și terțiare. Comparativ cu celelalte specii, granulele terțiare sunt numeroase, mari și dense (24, 25, 26).

Eozinofilul segmentat reprezintă elementul caracteristic sângelui de cal, acesta având talia cea mai mare din randul granulocitelor. Nucleul este, de obicei, bilobat, iar granulele sunt foarte mari și dese ocupând toată citoplasma (3, 4).

În perioada parazitismului sezonier, răspunsul imunologic al ovinelor este acompaniat de eozinofilie. Există studii care demonstrează totuși, instalarea unei eozinofilii intense înainte de sezonul de pașunat, explicația fiind ca magnitudinea eozinofilică este o reflectare a unei rezistențe imunologice familiale la parazitismul cu nematode (27, 28). Uneori, eozinofilia poate fi asociată cu bazofilia marcantă (26).

MEGACARIOCITOPOIEZA

Trombocitele se formează în măduva osoasă hematoformatoare din aceeași celulă stem multipotentă descrisă la eritropoieză, dar care, sub influența unui factor umoral (trombopoietina), se orientează către linia megacariocitară, parcurgând stadiile succesive de megacarioblast → megacariocit bazofil → megacariocit granular trombocitogen. Membrana megacariocitului matur realizează numeroase invaginări care pătrund în citoplasmă, și apoi, prin delimitare, se desprind din masa megacaricitului rezultând trombocitele. Astfel, din megacariocitul epuizat rămâne doar nucleul ce este fagocitat de macrofagele din maduvă, iar trombocitele rezultate traversează capilarele de la nivelul măduvei și pătrund în circulația sangvină (3, 8).

Descrierea citomorfologică a celulelor sistemului megacariocitar în diferitele faze de dezvoltare (dupa Cowell R.L., 2008 și Berceanu S., Manolescu N., 1985)

Din totalul trombocitelor, 2/3 dintre acestea se regăsesc în sângele circulant iar restul (în special cele tinere) se stochează în splina (8).

Reglarea trombocitopoiezei se realizează de către o proteină denumită trombopoietina. Aceasta este sintetizată în ficat, dar și în rinichi, testicule, creier și celulele stromale din măduva osoasă. Ea are omologie înaltă cu eritropoietina, find esențială pentru formarea unei cantități adecvate de trombocite. S-a constatat că șoarecii lipsiți de trombopoietină sau de receptorul acesteia au o reducere de 90% a numărului de trombocite (11, 12).

Trombocitele joacă un rol important în hemostaza pe mai multe căi:

– formarea pseudopodelor;

– absorbția unor factori plasmatici (serotonina și fibrinogenul);

– transportul mediatorilor coagulării și agregării,

– aderența la suprafețele rugoase;

– determină vasoconstricție locală;

– atrage, fixează și concentrează factori și mediatori din mediul extern;

– după ce aderă la locul lezat, prin agregare (alipirea în grămezi), rezultă trombul plachetar (trombusul alb), care astupă leziunea ca un dop sau un tampon mecanic (8,13).

La ovine, trombocitele se prezintă sub formă de agregate mici, înconjurate de o membrană celulară fină, iar în citoplasmă se observă granulații de dimensiuni și forme diferite. Rata de supraviețuire a acestora în sânge este de 10 zile (3, 29).

Una dintre cele mai mici concentrații de trombocite la nivel sangvin din seria mamiferelor este întâlnită la cabaline, 90000 – 410000/mm³ de sânge (3, 30). Din punct de vedere morfologic acestea au formă rotundă, ovală sau elongată, cu diametrul cuprins între 2,5 – 3,5 µm, iar citoplasma este bazofilă și conține numeroase granulații azurofile (3, 31).

MONOCITOPOIEZA

Seria monocitară reprezintă un procent mic din totalul celulelor măduvei hematoformatoare, monocitele având origine comună cu granulocitele, respectiv celula stem orientată mielopoietic.

Celulele sistemului monocitar prezintă 4 stadii de dezvoltare, respectiv: monoblast → promonocit → monocitul medular → monocitul din sângele periferic și macrofagul din țesuturi (6, 14).

Promonocitul este o celulă de dimensiuni cuprinse între 18 – 22 µm, cu nucleu mare, ovalar, uneori incizat, ce conține 1 – 2 nucleoli. Citoplasma este intens bazofilă, fără granulații, uneori cu vacuole rare (8).

Monocitele mature medulare au morfologie similară cu cele prezente în sângele periferic (6).

La cabaline, monocitul sangvin se prezintă ca o celulă cu nucleu mare, larg, cu formă variabilă (rotundă, bilobată, trilobată, de potcoavă, sau, uneori, neregulată); cromatina are aspect dantelat, iar citoplasma este gri-albastra, cu granule mici, azurofile și, uneori, cu câteva vacuole clare (23, 32).

În sângele ovinelor, monocitele pot îmbraca forme de la rotundă până la neregulată, având un diametru cuprins între 13–19 µm (24, 25, 26). Nucleul este mare, dantelat spre bilobat, iar cromatina are aspect asemanator “tablei de sah”. Citoplasma este bazofilă și conține granule mici, neclare, de culoare purpurie. Vacuolele citoplasmatice au forme neregulate și sunt frecvent întâlnite în citoplasma monocitarară (10, 23).

Macrofagele tisulare pot atinge diametre cuprinse între 50 – 200 µm și poartă diferite denumiri, în funcție de țesutul în care se gasesc astfel: microglie, macrofag alveolar (de tip A, B și C), splenic, celula Kupffer, macrofag peritoneal, melanofag, osteoclast, etc. Citoplasma lor poate da naștere la prelungiri care ajung la distanțe foarte mari față de corpul celular până la particula ce urmează a fi fagocitată. Nucleul acestor celule poate îmbraca forme diferite putând fi rotund, ovalar sau reniform și poate conține 1 – 2 nucleoli. Pe masura îmbătrânirii, macrofagele pot prezenta mai multi nuclei în aceeași citoplasmă ce provin, se pare, din fuzionarea mai multor macrofage (3).

Funcțional, monocitul circulant și macrofagul tisular formează un sistem complex cu rol important în reacția de apărare a organismului denumit "complexul monocito – macrofagic. Principalele functii ale acestui complex sunt:

– de a fagocita diferite organisme pătrunse în interiorul organismului precum bacterii, paraziti, virusuri dar, mai ales, de a distruge celulele degenerate, infectate sau necrozate;

– de a secreta substanțe bactericide (lizozim), antivirale (interferon), de reglare a leucopoiezei (granulopoietina), de apărare nespecifică (prin fracțiunile complementului), de diferențiere a limfocitelor B în plasmocite (prin producerea de interleukină), precum și de a sintetiza substanțe implicate în funcția imunitară a acestor celule, dar și hormoni și factori de creștere precum:

– factorul de creștere pentru trombocite (PDGF);

– factorul de creștere pentru fibroblaste (FGF);

– factorul de creștere pentru plasmocitoame (PGF);

– factorul de stimulare al coloniilor de granulocite (G-CSF);

– factorul de stimulare a coloniilor de granulocite și macrofage (GM-CSF);

– factorul de activare al neutrofilelor (38).

– de a realiza interactiuni complexe intre macrofgele prezentatoare de antigen si limfocite (8).

LIMFOCITOPOIEZA

Limfocitopieza constă în transformările succesive ale celulei stem pluripotente din măduva osoasă hematogenă (și din ficat în prima jumătate a perioadei fetale) spre linia limfocitară, se multiplică și se diferențiază parcurgând fazele de prolimfoblast → limfoblast → prolimfocit → limfocit adult. Limfocitele astfel formate ajung în organe limfoide primare diferite, unde sunt “instruite”, dobândind imunocompetență. În funcție de locul unde sunt distribuite, limfocitele se împart în două categorii: limfocite B (burso-dependente), ce sunt procesate la nivelul măduvei hematogene și limfocite T (timo-dependente) procesate la nivelul timusului (16, 17, 18).

Migrarea selectivă a limfocitelor B și T din organele limfoide primare în cele secundare este un fenomen esențial pentru imunitate, întrucât asigură concentrarea și conservarea limfocitelor în organele limfoide secundare, în limfă și apoi în sânge și țesuturi, de unde (după câteva ore), revin la aceleași organe limfoide secundare de unde au migrat. Acest fenomen se numeste ecotaxie și prin el se asigură contactul limfocitelor cu antigenul apărut în organism, precum și activarea limfocitelor virgine în limfocite stimulate antigenic (8).

Nivele de citodiferențiere ale liniei limfoide

(dupa Manolescu N., 2003)

Celula stem pluripotentă

↓

Celula stem bipotentă orientată limfoid

↓ ↓

Prolimfoblast B Prolimfoblast T

↓ ↓

Limfoblast B Limfoblast T

↓ ↓

Prolimfocit B Prolimfocit T

↓ ↓

Limfocit adult B Limfocit adult T

(virgin sau neexspus antigenic) (virgin sau neexspus antigenic)

Distribuția limfocitelor T și B in sângele periferic și țesuturile limfoide ale oilor și fetușilor acestora (Chandra și colab., 1974)

Din acest tabel se concluzionează faptul că la adulte, toate organele limfoide conțin un număr mai mare de limfocite T decât limfocite B, iar la fetuși, raportul se păstrează, dar numeric sunt mai crescute atât limfocitele T cât și B, cu excepția splinei. De asemenea, la fetuși se observă un număr mai mic de limfocite B în țesuturi comparativ cu adultele, fenomen explicat prin contactul mult mai scăzut cu antigenii la acest nivel.

Atât la adulte cât și la fetuși se constată un număr crescut de limfocite T în timus, fapt ce confirmă că acest organ este sediul de formare și instruire a acestor tipuri de celule (7).

Din punct de vedere citomorfologic celulele precursoare limfocitului se caracterizează prin:

– limfoblastul este o celulă de dimensiuni mari, cu un raport nucleu/citoplasmă în favoarea nucleului. Citoplasma este intens bazofilă, agranulată, iar nucleul este rotund sau ovoid având 1-2 nucleoli, cromatina fiind dispusă în formă de bulgări.

– prolimfocitul are nucleul compact, fiind format din grunji mari de cromatină, în interiorul căreia se observă urme de nucleoli. Citoplasma este palidă, bazofilă, conținând, uneori 5-6 granule azurofile fine (3, 4, 10, 19).

– limfocitul, în funcție de dimensiunea lui se împarte în trei categorii: mic, mediu și mare. Limfocitul mic are dimensiuni mai mici decât neutrofilul, citoplasma este bazofilă, nucleul este rotund, cu cromatina densă iar nucleolii nu sunt vizibili. Limfocitele medii, denumite adeseori prolimfocite, au dimensiuni aproximative cu cele ale neutrofilului, citoplasma este puțin mai multă decât limfocitele mici, nucleul este rotund iar cromatina apare “pătată”, nucleolii sunt rareori vizibili. Limfocitele mari, denumite deseori limfoblaste, au dimensiuni mai mari decât neutrofilele, citoplasma este de culoare albastru-închis, nucleul apare dantelat sau neregulat, iar cromatina se prezintă sub forma unei rețele “pieptanate”. Nucleolii sunt proeminenți, adesea vizibili, fiind în număr variabil (6).

În circulația sangvină, limfocitele T sunt mai numeroase (70-80% din totalul limfocitelor) și au o durată de viață mai mare decât limfocitele B. Cu toate că celulele B reprezintă numai 10% din populația limfocitelor, în organele limfoide secundare (în special în splina și limfonoduri) proporția populațiilor de limfocite T și B este aproape egală. În organele limfoide periferice limfocitele mor în 4-5 zile dacă nu intră în contact cu un antigen corespunzator, iar dacă sunt stimulate antigenic încep să prolifereze și își completează evoluția, diferențiindu-se în celule efectoare și în celule cu memorie imunologică. Astfel, limfocitele B activate se vor transforma în plasmocite secretoare de anticorpi (imunoglobuline) și celule B cu memorie,iar limfocitele T activate vor evolua către populații diferențiate de celule T cu funcții efectoare, reglatoare sau ajutatoare (8).

Limfocitele T citotoxice (Tc) acționează direct asupra antigenelor precum și a celulelor proprii modificate producând liza acestora (8).

Limfocitele T amplificatoare (Ta) stimulează diferențierea și multiplicarea limfocitelor B care aparțin exclusiv clonelor deja activate de către limfocitele T helper (8).

Limfocitele T ajutatoare (helper sau Th) stimulează funcționarea altor celule ale sistemului imun prin intermediul unor mediatori proteici. Rolul acestora este de:

– stimulare a limfocitelor B prin creșterea capacității acestora de a produce imunoglobuline;

– stimulare a creșterii și multiplicării limfocitelor citotoxice;

– activare a eozinofilelor și macrofagelor în bolile parazitare (8).

Limfocitele T supresoare (Ts) diminuează funcțiile citotoxice ale limfocitelor T citotoxice prin stoparea proliferării excesive a celulelor limfoide. Prin funcțiile lor specifice, limfocitele Ts mențin intensitatea răspunsului imun în limite normale (8, 38).

În mod normal, populațiile Th și Ts se găsesc într-o permanentă stare de echilibru, raportul Th/Ts situandu-se între limitele de valori 1,2 – 3,6 (38).

Limfocitele T contrasupresoare (Tcs) contracarează activitatea celulelor Ts prin blocarea efectului lor inhibitor asupra limfocitelor T helper, citotoxice și limfocitelor B (8).

Limfocitele T de hipersensibilitate tardivă (Td), după contactul cu antigenul, eliberează limfokine ce atrag macrofagele și celulele polimorfonucleare generând o reacție locală intârziată (8).

Limfocitele B, după ce au intrat în contact cu antigenul, se activează, proliferează și se transformă în plasmocite, iar o mică parte, în limfocite B de memorie. Efectorii imunologici care apar în urma activării limfocitelor B sunt reprezentați de imunoglobuline specifice responsabile de imunitatea umorală (20).

Limfocitele NK (natural killer) sunt celule specializate în recunoașterea și distrugerea celulelor tumorale precum și a celor infectate viral sau bacterian. Ele au granulații azurofile în citoplasmă și secretă limfokine cu rol în controlul creșterii și diferențierii populațiilor de limfocite T și B. Deși limfocitul NK are multe asemănări morfologice și funcționale cu limfocitul T, se consideră că cele două tipuri de limfocite au origini diferite (8).

Celula mastocitară (mastocitul) este o celulă secretoare de IgE care participă la reacțiile imunoalergice alături de alte celule hematopoietice. Aceasta este o celulă de talie mare, mononucleată, rotundă, ovală, poliedrică sau neregulată, cu diametrul până la 25 µ. Nucleul este rotund, situat central sau ușor lateral, cromatina este laxă, iar nucleolul este prezent doar în cazul formei adulte. Raportul nucleu/citoplasmă este de 1/1. Citoplasma este slab bazofilă și conține un număr variabil de granulații fine (8). După aspectul lor morfologic, granulele mastocitare sunt împartite în 3 categorii:

– granule electronodense, omogene;

– granule mai slab electronodense decât primele, ce conțin o matrice fin granulară;

– granule foarte slab electronodense, formate dintr-o rețea de filamente fine, în ochiurile căreia se observă mici granule electronodense (33, 34).

Celula dendritică este o celulă imunitară implicată în întreg procesul de apărare al organismului, localizându-se atât în sângele periferic cât și în tegument și în structurile limfopoietice secundare (8). Talia celulei este de 25 – 30 µ, prevazută cu multiple prelungiri de diferite lungimi și grosimi ce se insinuează printre alte celule din măduva hematogenă sau limfonoduri. Nucleul are forma neregulată, cu nucleoli greu identificabili. Citoplasma poate fi acidofilă sau bazofilă, cu vacuole, mitocondrii, lizozomi și reticul endoplasmatic rugos (35).

Valorile fiziologice medii ale populației celulare limfocitare, macrofagice, dendritice și NK

(dupa Emilia Balint, 2010)

Variația procentului de celule limfoide din sângele periferic la cabaline și ovine determinat prin microscopie electronică

(Manolescu, 1979)

3. ORGANELE SISTEMULUI IMUNOLOGIC

Organele sistemului imunologic sunt acele structuri la nivelul carora au loc formarea, diferentierea, proliferarea si maturarea celulelor implicate in realizarea raspunsului imun. Dezvoltarea sistemului limfoid incepe o data cu aparitia celulei stem multipotente la nivelul ficatului si maduvei oasoase hematoformatoare de la nivelul fetusului. (4,5)

Dupa rolul pe care acestea il indeplinesc in procesele de ontogeneza si diferentiere a populatiilor celulare, ele se impart in:

– organe limfoide primare (centrale);

– organe limfoide secundare (periferice).

Deosebiri esentiale intre organele limfoide primare si cele secundare

(dupa Oliescu A., Panait M., 2004)

3.1 Organele limfoide primare

Organele limfoide primare au rol in ontogeneza, diferentierea si maturarea limfocitelor, in absenta contactului cu antigenul. Caracteristicile comune ale acestora sunt:

– apar de timpuriu in cursul procesului de ontogeneza al organismului;

– au origine comuna, endodermo-mezodermala;

– involueaza treptat, o data cu varsta, dar nu dispar complet;

– activitatea mitotica a celulelor prezente la nivelul lor este foarte intensa si se realizeaza in absenta stimularii antigenice;

– extirparea precoce a acestora determina aparitia deficientelor imunologice;

– la nivelul lor are loc producerea, instruirea, proliferarea si maturarea tuturor populatiilor de limfocite (8).

Organele limfoide primare la mamifere sunt reprezentate de timus si maduva osoasa hematoformatoare.

3.1.1 Timusul

Timusul este un organ limfoepitelial primar cu rol deosebit in imunogeneza, situat in regiunea cervico-toracala la rumegatoare, iar la cabaline in spatele sternului, intre lobii pulmonari (1, 2).

Din punct de vedere organo-genetic, timusul este singurul organ limfatic complet dezvoltat la nastere. Acesta se dezvolta din epiteliul ventral al celei de-a III-a pungi brahiale in urma interactiunii ectodermului brahial cu endodermul faringian (8, 9).

Din punct de vedere anatomic, timusul este constituit din capsula, stroma si parenchim.

Capsula se prezinta ca o structura fibroasa, bistratificata, ce trimite septumuri spre interiorul timusului impartindu-l in doi lobi si mai multi lobuli. Fiecare lobul este constituit dintr-o zona corticala situata la periferie si o zona medulara situata spre interior.

Stroma este constituita preponderent din celule epiteliale si celule dendritice. Celulele epiteliale emit tonofilamente ce se anastomozeaza si formeaza o retea fina in ochiurile careia se dispun numeroase tipuri de celule, predominante fiind timocitele. Acestea sunt celule rotunde, similare limfocitelor, avand diametrul de 7-9 microni (6). La nivelul zonei medulare, celulele epiteliale concura dand nastere corpusculilor Hassal (2). Acestia au dispozitie concentrica, fiind compusi dintr-o masa centrala, constituita din una sau mai multe celule granulare, si o capsula formata din celule epitelioide (3). Noile studii indica faptul ca diferentierea corpusculilor Hassal din celulele epiteliale de la nivelul medularei timice are loc dupa pierderea expresiei autoimune reglatoare (7).

Celularitatea parenchimului timic este predominata de timocite aflate in diferite stadii de dezvoltare si cu diferite grade de instruire. Ele au ca origine celula stem pluripotenta care migreaza din maduva hematogena, pe cale sangvina, sub forma de celule “pre T”. Acestea migreaza spre zona corticala a parenchimului unde sunt inconjurate de prelungirile celulelor doica, prolifereaza, se diferentiaza si se maturizeaza migrand apoi spre zona medulara (2).

De asemenea, in medulara se intalnesc doua tipuri de celule dendritice: celule reticulare dendritice si celule dendritice interdigitate ce au rolul de a prezenta antigenele organelor limfoide secundare (2).

Din punct de vedere fiziologic, timusul este un organ esential pentru maturarea limfocitelor. La adulte acesta participa la furnizarea seturilor diferentiale ale antigenelor complexului major de histocompatibilitate si asigura educarea limfocitelor T. De asemenea, la nivelul timusului are loc si dubla selectie a limfocitelor “instruite” , una pozitiva in care sunt recunoscute proteinele complexului major de histocompatibilitate si una negativa prin care sunt eliminate limfocitele care reactioneaza fata de antigenele self, prezentate de catre macrofage sau de catre celulele dendritice (2, 10).

La cabaline, involutia timica se apropie de final la varsta de 6 ani, iar la rumegatoarele mici in jurul varstei de 2 ani, dar raman totusi portiuni de tesut timic activ (30).

3.1.2 Maduva osoasa hematoformatoare

Maduva osoasa hematoformatoare este o categorie speciala de tesut conjunctiv care formeaza parenchimul organelor hemato- si limfopoietice. Acest tesut se intalneste in structura oaselor lungi (in perioada embrio – fetala), in structura oaselor plate (stern), a celor late (coaste, carpiene, tarsiene), dar si in epifizele oaselor lungi (in perioada postnatala) (32).

Din punct de vedere structural, maduva osoasa hematoformatorae, se imparte in doua mari compartimente:

-un compartiment reprezentat de un micromediul hematopoietic ce este format dintr-un complex de celule stromale mezenchimale, o retea matriceala fibrilara extracelulara si un complex de factori de crestere produs de celulele stromale (31).

– un compartiment reprezentat de parenchimul medular in care se regasesc insule de hematopoieza asezate in jurul unei celule trofice cu functie de celula “doica” . Aceste celule au un rol important in eritropoieza prin faptul ca inmagazineaza fierul pe care, ulterior, il predau eritroblastilor dispusi in jurul lor sub forma de insule, iar in mielo- si megacariopoieza secreta factori de stimulare a acestor procese (31). Populatia celulara a acestui compartiment este foarte heterogena, in afara de celulele stem pluripotente si derivatele lor foarte tinere, gasim celule din seria granulocitara (cele mai numeroase), seria megacariocitara, seria eritrocitara, seria limfocitara si seria monocitara.

Celularitatea maduvei osoase hematoformatoare variaza in functie de varsta animalului, astfel, la tineret raportul intre tesut adipos si celule este de 1:4, acesta modificandu-se odata cu inaintarea in varsta, astfel ca la adulte raportul ajunge la 1:1,iar la cele batrane se ajunge la 4:1 in favoarea tesutului adipos (11).

La fel ca si in timus, si la nivelul maduvei are loc o selectie riguroasa a precursorilor imaturi functional, formati si ramasi aici pentru scolarizare (12).

3.2 Organele limfoide secundare

Organele limfoide secundare sunt componente ale sistemului imunologic la nivelul carora sunt stocate limfocite T si B mature si virgine. Pe masura ce vin in contact cu antigenele, limfocitele sufera procese de ontogeneza si diferentiere, in functie de tipul antigenului si de receptorii lor de membrana, transformandu-se fie in celule producatoare de anticorpi,limfocitele B, fie in limfocite T citotoxice si respectiv in limfocite T sau B de memorie (2).

Caracteristicile organelor limfoide periferice:

– apar tarziu in cursul procesului de ontogeneza;

-au origine mezenchimo-mezodermala;

– persista toata viata;

– activarea mitotica a celulelor limfoide de la nivelul lor este scazuta in lipsa antigenului;

– extirparea lor precoce sau tardiva nu are urmari semnificative asupra homeostaziei organismului si asupra capacitatii acestuia de a elabora raspunsul imun;

– au zone distincte de stocare a celor doua categorii de limfocite (T si B) si anume: zone timodependente constituite in majoritate de limfocite T si zone timoindependente in care predomina limfocitele B.

– in functie de caracteristicile antigenului poate prolifera un singur tip de limfocite sau ambele tipuri d, determinand modificari de ordin structural la nivelul ariei sau ariilor in care sunt prezente aceste celule (2).

Principalele organe limfoide secundare sunt reprezentate de:

– limfonoduri;

– splina;

– structuri limfoide asociate mucoaselor.

3.2.1 Limfonodurile

Limfonodurile sunt structuri limfoide adaptate functiei de filtrare a limfei, cat si celei de limfopoieza.

Sub aspect anatomic, ganglionii limfatici sunt structuri de forma rotunda sau reniforma, solitare sau dispuse in grupuri, de dimensiuni variabile, localizati, in principal, la nivelul conexiunilor vaselor limfatice pentru a realiza o filtrare eficienta a limfei care circula prin acestea.

Sub aspect histologic, structura unui ganglion se constituie din capsula, stroma si parenchim.

Capsula se prezinta ca o structura fina, subtire, alcatuita din fibre de colagen, reticulina si fibrocite. Din loc in loc, din capsula se desprind fibre conjunctive ce se indreapta spre profunzimea ganglionului constituind mai multe septumuri conjunctive intraganglionare ce reprezinta suportul pentru sustinerea vaselor sangvine si a fibrelor nervoase (2).

Stroma limfonodala este constituita dintr-o impletitura de fibre reticulare, sintetizate de fibroblaste, ce formeaza o retea sau traiecte sinuoase in care patrunde limfa si celulele existente in aceasta si pe care se ataseaza numeroase macrofage (2).

Parenchimul limfondal prezinta trei zone distincte: corticala, paracorticala si medulara. La nivelul zonei corticale se gasesc foliculii limfoizi aflati in diferite stadii evolutive (primari si secundari). Foliculii primari sunt constituiti din aglomerari de limfocite mici, in majoritate de tip B, care nu au fost stimulate antigenic, macrofage, celule reticulare dendritice, iar in partea exterioara este prezent un rand de limfocite T. Foliculul secundar este un fost folicul primar ce si-a schimbat structura datorita aparitiei unui antigen. In mijlocul lui se remarca un centru germinativ constituit din limfoblaste de tip B, in diferite faze evolutive, inconjurat de o coroana de limfocite mici (14). Aceste tipuri de celule nu persista mult timp in centru germinativ, ci fie migreaza catre zona medulara pentru a se transforma in plasmocite, fie parasesc limfonodul sub forma de limfocite B de memorie. De asemenea, la nivelul centrului germinativ s-au decelat si alte tipuri de celule precum subpopulatii de limfocite T din grupa celor reglatoare,macrofage si celule foliculare dendritice (2, 13).

Zona paracorticala este timodependenta, continand un numar mai redus de celule reprezentate de limfocite T de talie mica, macrofage si celule dendritice interdigitate (15).

Zona medulara prezinta numeroase cordoane medulare care, in ganglionul nestinulat antigenic, cotin un numar redus de limfocite si macrofage, ca mai apoi, dupa stimulare, ele devin bogate in plasmocite. Aceste plasmocite sunt rezultatul maturarii imunoblastilor B de la nivelul foliculilor limfoizi secundari ai zonei corticale.

Citologic, limfonodul normal are o populatie heterogena formata atat din celule limfoide (75-85% ) cat si nonlimfoide. Celulele limfoide sunt mici, bine diferentiate, cu citoplasma bazofila in cantitate mica. Nucleul este rotund, cu cromatina condensata, profund bazofila (16). De asemenea, in limfonodul normal se pot intalni si un numar mic de limfocite medii si mari (adesea denumite limfoblaste) ce sunt de 1.5-3 ori mai mari decat hematiile. Cromatina lor este mai putin condensata, uneori nucleolii pot fivizibili, citoplasma este bazofila, pala, mai abundenta decat a limfocitelor mici (18, 19, 20, 21).

Plasmocitul (< 3%) este mic, 11 – 15 microni, rotund, cu nucleu excentric, cromatina condensata. Citoplasma este abundenta, albastra inchis, avand un aparat Golgi proeminent. Celulele plasmatice imature (transformate din limfocite B) sunt mai mari, cromatina este mai putin condensata, iar raportul nucleu/citoplasma este mai crescut. Citoplasma este bazofila si poate contine vacuole discrete.(32)

Macrofagele se caracterizeaza printr-o citoplasma abundenta, adesea cu vacuole sau granulatii in interior.

Ocazional, se pot intalni un numar mic de neutrofile, eozinofile si mastocite, reprezentand mai putin de 1% din totalul populatiei celulare limfonodale.

Mastocitul are dimensiuni cuprinse intre 15 – 17 microni, uneori ajungand pana la25 – 30 microni, citoplasma este,de obicei, acoperita de granulatii metacromatice, iar nucleul este sferic si dens. (32)

Celulele reticulare si endoteliale sunt celule de dimensiuni mari, ce oscileaza intre 20 – 30 microni, cu nucleii mari, rotunzi sau ovalari, proeminenti, citoplasma fiind uneori absenta (11, 16, 17).

3.2.2 Splina

Splina este cel mai voluminos organ hemato-limfoid secundar strabatut doar de vasele sangvine, cele limfatice,atat aferente cat si eferente fiind absente (2).

Principalele functii ale acestui organ de importanta maxima pentru organism sunt:

– sediu al raspunsului imun cu rol in retinerea si fagocitarea struncturilor straine patrunse in organism pe cale sangvina;

– actioneaza ca un filtru masiv, avand posibilitatea de as stoca pana la 1/3 din cantitatea totala de sange a organismului (22, 23);

– indeparteaza, prin fagocitoza, hematiile anormale sau pe cele imbatranite;

– depoziteaza trombocitele pe care le introduce in circulatie in caz de nevoie (2);

– rol in formarea celulelor sangvine, in metabolismul hemoglobinei si a fierului (24, 25).

Sub aspect structural, splina este constituita din capsula,stroma si parenchim, iar din punct de vedere functional este structurata in trei compartimente: unul pentru depozitarea eritrocitelor si trombocitelor reprezentat de pulpa rosie, unul in care se initiaza si se dezvolta raspunsul imunologic, situat la nivelul pulpei albe si unul la nivelul caruia are loc selectia antigenelor, situat intre pulpa alba si cea rosie (2).

Capsula splenica deriva din mezoteliul peritoneal si este formata din fibre elastice si de colagen ce-i permit acesteia marirea in volum in timpul activitatii functionale specifice. Ea trimite travei conjunctive in interiorul organului impartindu-l in mai multe compartimente de forma piramidala. Pe suprafata trabeculelor se ataseaza fibre reticulare care vor forma, in interiorul fiecarei piramide, o retea.

Parenchimul splenic este structurat in: pulpa alba,pulpa rosie si zona marginala.

Pulpa alba reprezinta componenta limfoida a organului, fiind constituita, din punct de vedere histologic, din doua tipuri principale de structuri:

– foliculii germinativi, timoindependenti, alcatuiti din limfocite B;

– tecile periarteriolare, timodependente,alcatuite din mai multe randuri suprapuse de limfocite T.

Foliculii primari splenici sunt similari cu cei de la nivelul limfonodurilor, fiind situati frecvent la nivelul bifurcatiilor arterei centrale splenice sau a ramificatiilor principale ale acesteia. In timpul raspunsului imun foliculii primari cresc in volum si se transforma in foliculi germinativi (foliculi limfatici Malpighi) (22, 23).

Pulpa rosie reprezintã un teritoriu de producere al anticorpilor precum si un sistem foarte eficient de filtrare a sangelui (26).

Din punct de vedere structural, pulpa rosie este formata din cordoane splenice si sinusuri venoase. Cordoanele splenice sunt constituite din fibre de reticulina, celule reticulare si macrofage ce se grupeaza in retea. La nivelul acesteia se localizeaza toate tipuri de celule albe si un numar crescut de eritrocite. Sinusurile venoase sunt situate intre codoanele splenice, sunt captusite cu celule endoteliale ce sunt implicate in fagocitarea intensa a antigenelor (24).

Intre cele doua pulpe se interpune o zona bogat vascularizata la nivelul careia sunt retinute cele mai multe antigene provenite din sange. Populatia celulara prezenta este mai bogata in limfocite decat pulpa rosie, fiind intalnite limfocite T, limfocite B si plasmocite (27).

Din punct de vedere citologic, tesutul splenic normal este similar celui limfonodal. Populatia celulara este abundenta datorita populatiei mixte de limfocite mici si de limfoblasti (28, 29). Limfocitele mici au dimensiuni mai mici decat neutrofilelesegmentate, fiind inconjurare de un strat subtire de citoplasma bazofila. Limfoblastele au dimensiuni mari,nucleuleste neregulat, uneori dantelat, cu numerosi nucleoli, cromatina apare veziculoasa. In completarea populatiei limfocitare se pot observa si cateva macrofage, celule plasmatice, putine neutrofile, mastocite si trombocite grupate (11).

3.2.3 Structuri limfoide asociate mucoaselor

Mucoasele aparatului respirator, ale tubului digestiv, conjunctivale, urogenitale,ale glandei mamare reprezinta veritabile cai de acces pentru microorganisme si produsele lor de secretie sau excretie. Pentru a preintampina repercursiuni ce apar in urma interactiunii cu antigenul, toate mucoasele organismului sunt populate cu celule sau grupuri de celule de tip T si B. Acestea se asociaza la randul lor cu macrofagele si cu neutrofilele pentru a initia un raspuns imunologic (2).

In categoria structurilor limfoide asociate cailor digestive si respiratorii sunt incadrate: placile Peyer, amigdalele, sistemul limfatic BALT (bronchus associated lymphoid tissue) si sistemul limfoid intestinal GALT (2).

3.2.3.1 Placile Peyer sunt aglomeratii de celule limfoide ce se intalnesc intre duoden si ileon, fiind mai numeroase si mai dezvoltate in partea distala a intestinului (2, 22).

Epiteliul situat deasupra foliculilor contine numeroase macrofage, celule reticulare, dendritice, limfocite T si B, dar si o serie de celule modificate cu rol de a transporta particulele straine si microorganismele spre stratul subepitelial. Aceste celule, denumite “celule asociate cu foliculii” sau “celule M” prezinta numeroase microvilozitati scurte si neregulate (2)

Foliculii limfatici contin preponderent limfocite B, cordoanele interfoliculare sunt dominate de celulele T, iar venulele post-capilare reprezinta calea de acces a limfocitelor T si B circulante (23).

Limfocitele prezente la acest nivel au rol important in imunitatea locala, ele sintetizand imuoglobulina IgA dar si in reglarea microflorei intestinale (10).

3.2.3.2 Amigdalele sunt primele organe limfoide de la nivelul aparatului digestiv ce vin in contact cu materialele straine ingerate. La primate acestea sunt in numar de 6 si se localizeaza in jurul faringelui alcatuind impreuna inelul Waldeyer:

– o pereche de amigdale palatine localizate intre plierii valului palatin;

– o pereche de amigdale tubare localizata la inceputul trompei lui Eustache;

– o amigdala linguala localizata inaintea “V-ului' lingual;

– o amigdala faringiana localizata pe fata posterioara a faringelui (2).

Tesutul limfoid al amigdalelor este format din foliculi limfoizi, timoindependenti in care predomina limfocitele B, si din zone timodependente bogate in limfocite T si macrofage.

3.2.3.3 Formatiunile limfoide asociate mucoasei respiratorii (BALT)

Se aseamana foarte mult cu cele ale sistemului limfoid asociat mucoaselor tubului digestiv, dar prezinta unele diferente:

– limfocitele sunt dispuse pe toata intinderea mucoasei respiratorii sau se localizeaza sub forma de noduli, asemanatori placilor Peyer;

– populatia celulara a mucoaselor respiratorii mai contine diferite tipuri de macrofage (alveolare, bronsice, interstitiale, intravasculare) ce au o mare capacitate de fagocitoza, neutrofile, prezente in numar mare la nivelul bronhiilor, dar si eozinofile (2).

CLASIFICAREA PATOLOGIEI PRENEOPLAZICE SI NEOPLAZICE ALE SISTEMULUI HEMATOPOIETIC SI TESUTURILOR LIMFOIDE

Una dintre primele clasificari ale tumorilor sistemului limfoid este cea publicata in Registrul American de Patologie (American Registry of Pathology) din anul 1934, intitulata “Classification of Lymphatic and Reticular Tumors” (1). In acest sistem de clasificare sunt incluse urmatoarele categorii:

– limfomul limfocitic (include celulele mici);

– leucemie acuta sau cronica;

– tumori solide nodulare sau difuze aleucemice.

– limfosarcomul (include celule de dimensiune medie);

– tumori solide aleucemice;

– forme leucemice.

– sarcomul cu celule reticulare (include toate celulele de dimensiune mare)

– reticulocitomul leucemice;

– leucemia monocitica;

– forme aleucemice ale aceluiasi tip de celule.

O alta clasificare a hemopatiilor a fost facuta de catre Robb-Smith in anul 1938. Sistemul de clasificare propus de acesta a fost foarte complex si se baza pe faptul ca fiecare tip de celula se poate transforma atat benign cat si malign.

In anul 1942, Gall si Mallory au elaborat o noua clasificare ce cuprindea urmatoarele tipuri de tumori:

– sarcom cu celule reticulare;

-limfom cu celule stem;

– limfom clasmatocitic;

– limfom limfoblastic;

– limfom limfocitic;

– limfom folicular;

– limfom Hodkin;

– sarcom Hodgkin. (1)

Jackson si Parker au fost cei care au imbunatatit clasificarea propusa de Gall si Mallory, astfel ca in anii 1939 si 1944 a fost publicata o noua clasificare ce subdiviza boala Hodgkin in paragranulom, granulom si sarcom, aceasta devenind clasificarea standard acceptata in Statele Unite.

Urmatoarea schimbare majora a clasificarii a fost introdusa in anii 1956 si 1966 avand ca punct de plecare tipul si arhitectura celulara. Astfel, acest sistem a separat neoplasmele foliculare de cele cu arhitectura difuza concluzionand faptul ca toate neoplasmele limfoide, indiferent de tipul celular, inclusiv boala Hodgkin au prognostic mai bun daca au o arhitectura nodulara sau foliculara. Dezavantajele acestei clasificari rezida, in primul rand, din faptul ca limfomul limfoblastic cu celule mici si limfomul limfocitic difuz slab diferentiat au introduse in aceeasi categorie desi primul tip de limfom este mult mai agresiv. In al doilea rand, sarcomul Hodgkin, in care predomina celulele Reed Sternberg, si-a pierdut statutul de subtip cu depletie limfocitara. (1)

In anul 1974, a fost elaborata prima clasificare a limfomului pe baza principiilor imunologice de catre Karl Lennert din Kiel, Germania si a fost denumita “Kiel Classification”, aceasta devenind standardul in Europa. Lennert a afirmat faptul ca neoplasmele limfoide maligne au si omoloage benigne in diferite stadii de diferentiere.

Tot in anul 1974, Jarret si Mackey au clasificat limfoamele dupa criteriul morfologic folosind sistemul Working Formulation. Astfel, se are in vedere stabilirea unei corelatii intre tipul de celule implicate in proliferare si localizarea limfomului:

– Limfoame de grad redus

– limfomul difuz cu limfocite mici de tip intermediar

– limfomul plasmocitoid si al zonei mantalei

– limfomul folicular cu celule mici clivate si celule mixte

– Limfoame de grad intermediar

– limfomul difuz cu celule mici clivate si limfomul difuz mixt

– limfomul difuz cu celule mari clivate

-Limfoame de grad inalt

– limfomul imunoblastic

– limfomul limfoblastic

– limfomul cu celule mici, neclivate.

In anul 1976 apare, pentru prima data, o clasificare a hemopatiilor maligne realizata de un grup international franco-americano-brianic intitulata “FAB Classification” ce se baza pe cuantificarea mieloblastilor si eritroblastilor. Astfel, hemopatiile maligne au fost impartite in trei grupe:

1. Leucemii acute limfoblastice

1.1 Leucemia cu celule mici, uniforme

1.2 Leucemia cu celule mari, variate

1.3 Leucemia cu celule mari, vacuolare (de tip Burkitt)

2. Leucemii acute mieloblastice

2.1 Leucemia acuta mieloblastica fara maturatie

2.2 Leucemia acuta mieloblastica cu maturatie minima

2.3 Leucemia acuta mieloblastica cu maturare

2.4 Leucemia acuta promielocitara/microgranulocitara

2.5 Leucemia acuta mielomonocitara

2.6 Leucemia acuta monoblastica

2.7 Eritroleucemia acuta

2.8 Leucemia acuta megakariocitara

3. Sindroame mielodisplazice (6,7,8)

La jumatatea anilor 1970 Institutul National de Cancer al Statelor Unite ale Americii a elaborat un proiect international ce a cuprins totii pacientii inscrisi in trialuri clinice din centrele de tratament oncologic din intreaga lume. Strateagia lor a fost sa urmareasca un numar cat mai mare de cazuri al caror diagnostic era cunoscut pentru a concluziona care dintre clasificarile oncologice curente era cea mai exacta.

In urma acestui studiu a rezultat un “working formulation for clinical usage” care era superior celor anterioare din punct de vedere al ratei de supravietuire si al reproductibilitatii celulare. (3) Astfel, s-au inlocuit denumirile de “limfocitic bine diferentiat” cu “limfocitic mic”, “limfocitic slab diferentiat” cu “celule mici scindate” si “limfom cu celule mari” cu “limfom histiocitic”.(2)

In anii 1980 si 1990 au fost descrise noi afectiuni ce nu sunt incluse in clasificarea Kiel sau in “Working Formulation”, astfel, la inceputul anilor 1990, un grup de 19 hematopatologi din Europa, Statele Unite ale Americii si Asia s-au intrunit pentru a ajunge la un consens privind clasificarea limfomului (“REAL system”). Pentru elaborarea acesteia s-a tinut cont de morfologia celulara, imunofenotip, caracteristicile genetice si clinice, topografia tumorala si comportamentul clinic al tumorii. (3)

Criteriile diferite de abordare a tumorilor au creat o importanta variabila in definirea fiecarui subtip de tumora. Astfel, morfologia celulara a avut intotdeauna o importanta majora, iar in unele cazuri aceasta a fost definitorie. De asemenea, arhitectura tumorala a ajutat la stabilirea tipului folicular de tumora, proliferarea vasculara a fost trasatura principala a limfomului T celular angioimunoblastic, structura si imunofenotiprea au definit limfomul cu celule in manta (B celular) si zona marginala a limfomului. In limfomul cu celule mari anaplazice citoplasma abundenta, anizocarioza remarcabila si nuclei in forma de “copita de cal” (specifica) au fost trasaturile definitorii pentru acest tip de tumora.

Sistemul de clasificare REAL (Revised European American Classification) grupeaza tumorile maligne limfoide in trei categorii majore: B-celulare, T-celulare si boala Hodgkin.

1. Neoplasmele B celulare

1.1 Neoplasme cu celule B precursoare

1.1.1 Leucemia limfoblastica B-celulara/Limfomul B-celulara

1.2 Neoplasme B-celulare periferice

1.2.1 Leucemia limfocitara cronica B-celulara/leucemia prolimfocitica/limfomul cu limfocite mici

1.2.2 Limfomul limfoplasmocitoid/Imunocitom

1.2.3 Limfomul cu celule de manta

1.2.4 Limfomul centrofolicular

1.2.5 Limfomul B-celular al zonei marginale

1.2.6 Limfomul splenic marginal

1.2.7 leucemia cu celule paroase

1.2.8 Plasmocitom/mielom cu celule plasmatice

1.2.9 Limfomul B-celular cu celule mari (limfomul B-celular timic)

1.2.10 Limfomul Burkitt

1.2.11 Entitate provizorie: limfom cu celule B înaltă calitate, Burkitt-like

2. Neoplasme T-celulare si NK celulare

2.1 Neoplasmul cu celule T precursoare:

2.1.1 Limfomul limfoblastic cu celule T precursoare/leucemia cu celule T precursoare

2.2 Neoplasmele periferice T-celulare si cele cu celule NK

2.2.1 Leucemia limfocitica cronica T-celulara/leucemia prolimfocitara

2.2.2 Leucemia cu celule mari granulare (tipul T si tipul NK)

2.2.3 Mycosis fungoides/sindromul Sezary

2.2.4 Limfomul T-periferic nespecific (cu celule medii, mixte, mari sau limfoepitelioide)

2.2.5 Limfomul angioimunoblastic T-celular

2.2.6 Limfomul angiocentric

2.2.7 Limfomul intestinal T-celular

2.2.8 limfomul cu celule T adulte/leucemia

2.2.9 Limfomul cu celule mari anaplazice

3. Boala Hodgkin

3.1 Predominanta limfocitara

3.2 Scleroza nodulara

3.3 Depletie limfocitara

3.4 Entitate provizorie: Boala Hodgkin clasica „bogata” in limfocite. (4)

In anul 2006, in cadrul Simpozionului International „Progrese în diagnosticul, supravegherea și controlul bolilor la animale în secolul XXI – baza siguranței alimentelor”. Dr. Emilia Balint a propus o clasificare a limfoamelor bazata pe modificarile citologice si anatomo-clinice.

I. DIN PUNCT DE VEDERE CITOLOGIC

A. Limfoame hodgkinine

– paragranulomul Hodgkin

– granulomul Hodgkin

– sarcomul Hodgkin

B. Limfoame non-hodgkiniene

– limfom imunoblastic

– limfom cu celule rotunde mari sau mici incizate (B celulare)

– limfom cu celule rotunde mari sau mici neincizate (T celulare)

– limfomul histiocitar

– limfomul cerebriform (T celular)

– mielomul

– mastocitomul

– maladia Waldenstrom (B celulara)

II. DIN PUNCT DE VEDERE ANATOMO-CLINIC

A. tipul solitar limfonodal

– localizat (unicentric)

– generalizat (multicentric)

B. tipul solitar visceral

– localizat (unicentric)

– generalizat (multicentric)

C. tipul mixt (limfonodo-visceral) (16)

In anii 2001 si respectiv 2008, Organizatia Mondiala a Sanatatii (WHO) a elaborat o noua clasificare avand la baza atat clasificarea sistemului REAL cat si cea a sistemului FAB.

Dupa aparitia clasificarii elaborate de Organizatia Mondiala a Sanatatii din anul 2001, medicii veterinari au fost reticenti in aplicarea acesteia deoarece nivelul de cunoastere al limfoamelor si leucemiilor la animale din punct de vedere al nivelului genetic si citogenetic era slab datorita faptului ca aceste determinari nu erau folosite in diagnosticul curent al acestor maladii.

In anul 2002, renumitul Prof. Valli impreuna cu colaboratorii sai, au elaborat o clasificare a tumorilor hematopoietice la animalele domestice avand la baza clasificarea tumorilor hematopietice umane elaborata de Organizatia Mondiala a Sanatatii, observand-se o similitudine foarte mare intre acestea doua.

Clasificarea histologica comparativa a tumorilor hematopoietice

la animale domestice si om (18)

In anul 2008, Organizatia Mondiala a Sanatatii publica o clasificare revizuita a neoplasmelor limfoide avand ca principiu major individualizarea fiecarei boli in acord cu morfologia, imunofenotiparea, citogenetica, biologia moleculara si caracteristicile clinice ale acesteia. Aparitia geneticii moleculare a permis, atat medicinei umane cat si celei veterinare, diagnosticarea leziunilor cromozomiale prin metode precum hibridizarea fluorescenta in situ (FISH) astfel facand posibila aplicarea sistemul de clasificare al Organizatiei Mondiale a Sanatatii in majoritatea hemopatiilor maligne animale. (9). Avantajul acestui sistem rezida din faptul ca poate fi realizat pe celule interfazice facand astfel posibila analiza celulelor din blocurile de parafina. De asemenea, evaluarea clonalitatii reprezinta o sustinere majora a diferentierii bolilor limfoproliferative benigne de cele maligne. (10, 11) Si de acesta data medicii veterinari au demonstrat ca exista o remarcabila similitudine intre tumorile umane si cele animale prin publicarea a numeroase studii de profil. (12, 13, 14, 15)

CLASIFICAREA NEOPLASMELOR LIMFOIDE CONFORM ORGANIZATIEI MONDIALE A SANATATII DIN ANUL 2008 (5)

A. NEOPLASME CU CELULE B

1. Neoplasme cu celule B precursoare

– leucemie/limfom limfoblastic cu celule B precursoare

– leucemie limfoblastica acuta cu celule B precursoare

2. Neoplasme cu celule B mature

– leucemia limfocitica cronica/limfomul limfocitic cu celule mici

– leucemia B-celulara prolimfocitica

– limfom splenic cu celule B ale zonei marginale

– leucemia cu celule paroase

– limfomul splenic/leucemia neclasificabila* (acest tip histologic reprezinta o entitate provizorie ce nu a fost suficient studiata pentru a o recunoaste ca o boala distincta)

– limfomul splenic difuz B-celular cu celule mici in pulpa rosie

– varianta de leucemie cu celule paroase

– limfomul limfoplasmocitic

– Waldenstrom macroglobulinemia

– mielomul celulelor plasmatice

– plasmocitomul solitar al osului

– plasmocitomul extraosos

– limfomul cu celule B al zonei marginale extranodulare tip MALT

– limfomul cu celule B al zonei marginale ganglionare

– limfomul pediatric nodal al zonei marginale ganglionare

– limfomul folicular

– limfomul pediatric folicular

– limfom primar cutanat de centru folicular

– limfom cu celule ale mantalei

-limfomul cu celule mari, difuze

– limfomul cu celule mari B bogat in celule T/histiocite

– limfomul primar cu celule mari B bogat in celule T/histiocite

– limfomul primar cutanat cu celule mari B bogat in celule T/histiocite

– limfomul cu celule mari B bogat in celule T/histiocite, pozitiv la virusul Epstein-Barr, intalnit la varstnici

– limfomul cu celule mari B bogat in celule T/histiocite asociat cu inflamatia cronica

– granulomatoza limfomatoida

– limfomul primar mediastinal (timic) cu celule mari B

– limfomul intravascular cu celule mari B

– limfomul cu celule mari B, pozitiv la receptorul tirozin-kinazei (ALK-anaplastic lymphoma kinase, CD246)

– limfomul plasmablastic

– limfomul cu celule mari B rezultat in urma asocierii herpesvirusului uman 8 cu boala Castleman

– limfom primar efuzionat

– limfomul Burkitt

– limfomul B-celular, neclasificat, cu caracteristici intermediare intre limfomul difuz cu celule mari B si limfomul Burkitt

– limfomul B-celular, neclasificat, cu caracteristici intermediare intre limfomul difuz cu celule mari B si limfomul Hodgkin clasic

3. Neoplasme cu celule T precursoare

– leucemie/limfom limfoblastic cu celule T precursoare

– leucemie limfoblastica acuta cu celule B precursoare

4. Neoplasme cu celule T mature

– leucemia prolimfocitara T-celulara

– leucemia limfocitara cu celule T granulate

– boala limfoproliferativa cronica a celulelor NK*

– boala limfoproliferativa T-celularala copii, pozitiva la virusul sistemic Epstein-Barr

– limfomul hydroa-vacciniforme-like

– leucemia/limfomul cu celule T adulte

– limfomul extraganglionar NK/T-celular, tipul nazal

– limfom T-celular asociat enteropatiei

– limfomul hepatosplenic T-celular

– limfomul subcutanat cu celule T paniculitis-like

– micozis fungoides

– sindromul Sezary

– boli limfoproliferative cutanate primare pozitive la antigenul de membrana CD30

– papuloza limfomatoida

– limfomul cu celule mari, anaplazice, tipul cutanat primar

– limfomul cu celule T gamma-delta, tipul cutanat primar

– limfomul cu celule T citotoxice epidermotrop agresiv pozitiv la glicoproteina transmembranara CD8, tipul cutanat primar

-limfomul T celular cu celule mici/medii pozitiv la glicoproteina CD4, tipul cutanat primar

– limfomul T-celular periferic, fara indicatori specificati

– limfomul T-celular angioimunoblastic

– limfomul anaplazic cu celule mari pozitiv la receptorul tirozin-kinazei (ALK-anaplastic lymphoma kinase, CD246)

– limfomul anaplazic cu celule mari negativ la receptorul tirozin-kinazei (ALK-anaplastic lymphoma kinase, CD246)*

5. Limfomul Hodgkin

– limfomul Hodgkin nodular cu predominanta limfocitara

– limfomul Hodgkin clasic

– limfomul Hodgkin clasic cu scleroza nodulara

– limfomul Hodgkin clasic cu predominanta limfocitara

– limfomul Hodgkin clasic cu celularitate mixta

– limfomul Hodgkin clasic cu depletie limfocitara

6. Neoplasme cu histiocite si celule dendritice

– sarcomul histiocitic

– histiocitoza cu celule Langerhans

– sarcomul cu celule Langerhans

– sarcomul cu celule dendritice interdigitate

– sarcomul cu celule dendritice foliculare

– tumora cu celule fibroblastice reticulare

– tumora cu celule dendritice intermediate

– Xantogranulomul juvenil diseminat

7. Boli limfoproliferative posttransplant

– leziuni timpurii

– hiperplazia plasmocitara

– infectii mononucleare-like posttransplantare

– boli limfoproliferative polimorfe aparute posttransplant

– boli monomorfice post transplant cu celule B sau T/NK

– limfomul Hodgkin clasic tipul posttransplant (5)

* acest tip histologic reprezinta o entitate provizorie ce nu a fost suficient studiata pentru a o recunoaste ca o boala distincta

PATOLOGIA ORGANELOR SISTEMULUI HEMATOPOIETIC

5.1 PATOLOGIA LIMFONODALA

5.1.1 Citologia normala limfonodala

In mod normal linia celulara predominanta este reprezentata de limfocite mici (75-95% din totalul celulelor prezente), restul celulelor fiind un melanj format din limfocite de dimensiuni medii, limfoblaste, macrophage, celule plasmatice si neutrofile. De asemenea, se intalnesc si niste formatiuni mici, rotunde, bazofilice, numite corpusculi limfoglandulari ce reprezinta fragmente de citoplasma de la nivelul celulelor limfoide. (1)

5.1.2 Limfadenopatia

Exista trei procese patologice generale ce determina adenopatia limfonodala: inflamatia (limfadenita), stimularea imunologica (hiperplazia sau limfadenopatia reactiva) si neoplazia (limfomul sau metastaze tumorale).

5.1.2.1 Limfadenita

5.1.2.1.1 Limfadenita acuta

Limfadenita acuta se caracterizeaza fie prin variatii cantitative ale populatiei celulare fie prin variatii calitative ce apar in special la anumite linii celulare de la nivelul limfonodului. Abundenta mare de elemente celulare de pe frotiuri precum si numarul crescut al mitozelor fata de normal ne indica faptul ca se desfasoara o hiperactivitate limfocitara. Astfel, tabloul citologic este dominat de celulele reticulo-histiocitare, limfoblasti, limfocite mari sau limfocite medii. Numarul mare de celule reticulo-histiocitare, realizeaza, in unele cazuri, aspectul de “reticulita” constituind una dintre reactiile de aparare fata de germenii microbieni sau virusuri. Tot in aceste conditii patologice se pot intalni si un numar crescut de limfocite medii (2).

Pe langa modificarile numarului unor celule obisnuite ale populatiei limfonodale, trebuie semnalata si cresterea sau aparitia unor celule ce apar destul de rar in conditii normale. Astfel, in cazul limfadenitei neutrofilice, numarul neutrofilelor prezente pe un camp microscopic cu obiectivul de 100X este de cel putin 5, iar in cazul celei eozinofilice numarul eozinofilelor ajunge la 3/camp microscopic.(1, 3)

Limfadenita eozinofilica apare frecvent in cazul infectiilor fungice (Phytium, Basidiobolus haptosporus, Conidiobolus cornatus) determinand o infiltratie eozinofilica marcanta la nivelul limfonodurilor. Aceasta inflamatie este specifica limfonodurilor ce dreneaza pielea, sistemul respirator si cel digestiv. De asemenea, unele procese alergice pot determina o limfadenita eozinofilica secundara.(1)

Limfadenita purulenta se caracterizeaza prin numarul mare de neutrofile respectiv >20 de neutrofile/camp microscopic (100X).

In diferite tipuri de adenite se mai poate intalni un numar variabil de plasmocite, uneori si mastocite alaturi de celelalte modificari reactive. (2)

In afara de variatiile cantitative amintite, trebuie subliniate si unele modificari calitative aparute la nivelul anumitor celule. Astfel, in inflamatiile acute, poate fi considerat caracteristic faptul ca peste 50% din reticulo-histiocitare, la coloratia May-Grunwald-Giemsa, prezinta o citoplasma intens bazofila ce este rezultatul excesului de ARN aparut in citoplasma. Unele dintre celulele cu citoplasma mai intens bazofila, sunt considerate, de multi autori, “forme de iritatie” limfonodala. De asemenea, la nivelul nucleului se poate observa “relaxarea” retelei de cromatina si, uneori, confluarea sau marirea nucleolilor ce pot ajunge la dimensiuni gigante. (2)

Adenograma este de un real folos in reprezentarea modificarilor ce survin la nivelul limfonodurilor. Astfel se pot intalni trei mari categorii:

Unele adenograme pastreaza, in general, valorile procentuale ale liniilor celulare , in limite constante dar se observa o crestere abundenta a celularitatii indicand o hiperplazie sau o hiperactivitate limfocitara.

Alte adenograme inregistreaza depasiri ale valorilor normale la nivelul celulelor reticulo-histiocitare, limfocitelor mari si a celor medii. Asemenea variatii se intalnesc in cadrul diferitelor procese septic microbiene si mai ales in viroze.

In afara de cele doua mari categorii de adenograme, in unele adenite provocate indeosebi de stafilococi sau streptococci, adenograma indica valori crescute ale granulocitelor neutrofile, indicand evolutia inflamatie catre un proces exudativ muco-purulent. (2)

5.1.2.1.2 Limfadenita cronica

Majoritatea ganglionilor afectati de o inflamatie cronica se afla intr-o stare de hiperactivitate limfocitara observandu-se o abundenta a elementelor celulare, precum si modificari celulare evidente precum:

Accentuarea bazofiliei citoplasmei la mai mult de 50% dintre celulele reticulo-histiocitare;

Accentuarea bazofiliei citoplasmei plasmocitelor si a unora dintre limfocite;

Aparitia unor vacuole de dimensiuni diferite la unele celule reticulo-histiocitare sau limfocite mari;

Existenta unui oarecare grad de fragilitate celulara.(4)

Din punct de vedere morfologic, inflamatia cronica cuprinde 4 categorii:

 1. Inflamatia cronica nespecifica caracterizata prin acumulari difuze de macrofage si limfocite in zona afectata ceea ce stimuleaza proliferarea fibroblastica rezultand formarea unei cicatrice tipice care inlocuieste tesutul normal.

2. Inflamatia cronica cu specificitate limitata face parte din cadrul anatomoclinic in care leziunile trebuie corelate cu simptomatologia clinica si de laborator; se caracterizeaza prin aparitia de macrofage, celule epitelioide, limfocite , celule gigante multinucleate (ex. in tuberculoza). Principalele celule ale granulomului sunt macrofagele epitelioide ce pot avea o functie secretorie. Celulele gigante sunt formate din fuziunea a multiple macrofage.

  3. Inflamatia granulomatoasa de corp strain este nonnecrotica si se formeaza in prezenta de particule materiale. Macroscopic aspectul este de noduli cu diametrul de maxim 1 cm, bine vascularizati care pot sangera usor.la examenul microscopic se constata prezenta de tesut conjunctiv de neoformatie (fibre fine de colagen si reticulina, fibroblasti, fibrocite, vase de neoformatie) cu infiltrat inflamator cronic si patognomonic prezenta de celule gigante de corp strain, celule cu diametru de 100mm, avand o citoplasma eozinofila, cu multi nuclei situati neregulat, predominant in centrul. celulei si de asemenea, destul de frecvent cu resturi de corpi straini fagocitati.

4. Inflamatii granulomatoase specifice ce cuprind leziuni inflamatorii proliferative care pot duce la sustinerea diagnosticului etiologic, chiar in absenta evidentierii specifice a agentului cauzal; de exemplu Bacilul Koch poate fi evidentiat din punct de vedere bacteriologic dupa aproximativ 2-3 luni, perioada in care bolnavul poate sa fie in perioada de stare a tratamentului. (5)

La ovine, in limfadenita cazeaoasa (produsa de Corynebacterium pseudotuberculosis ovis sau bacilul Preisz Nocard) se constata cresterea in volum a limfonodurilor de la nivelul capului, capului, prescapulari, precrurali, poplitei, bronhici si mediastinali avand un centrul cazeos si straturi succesive de necroza (ca foile de ceapa) inconjurate de o membrana groasa, bogata in eozinofile. (6)

5.1.2.2 Hiperplazia sau limfadenopatia reactiva

Hiperplaziile reactive ale ganglionilor limfatici prezintă cea mai frecventă formă de limfadenopatie benigna. Ele pot avea un caracter de reacție regională a ganglionilor limfatici în caz de existență a unui focar de infecție în regiunea pielii, țesutului subcutanat, tumorilor mucoase, a migdalelor sau a dinților. În cazurile de limfadenopatie localizată poate fi observat locul de pătrundere a agentului infecțios, de obicei în zona drenată de ganglionii limfatici (3).

Deseori hiperplazia reactivă a ganglionilor limfatici se întâlnește în infecțiile respiratorii virale acute. Spre deosebire de limfoamele maligne și alte limfodenopatii specifice în caz de hiperplazie reactivă pot în același timp și rapid să se mărească toate grupele de ganglioni limfatici și periferici sau câteva regiuni de ganglioni limfatici (3).

In functie de zona afectata de hiperplazie, respectiv centrii foliculari, zona paracorticala, cordoanele medulare sau sinusurile medulare, din punct de vedere citologic se pot observa cresteri numerice ale anumitor linii celulare. Astfel, in cazul hiperplaziei foliculare se constata o crestere numerica a limfocitelor mari si medii, acestea ajungand pana la 15-25% din totalul populatiei celulare, celulele plasmatice poate varia intre 5-10%, iar uneori se pot inregistra si crestere a numarului de macrofage de peste 2%. Hiperplazia parafoliculara se caracterizeaza prin cresterea numarului de celule imunoblastice in asociere cu celulele plasmatice. (3)

In hiperplazia paracorticala populatia celulara predominanta este reprezentata de limfocitele mici, dar se intalnesc si un numar mic de celule limfoide blastice precum si numeroase macrofage ce contin fragmente de celule apoptotice fagocitate precum si cromatina condensata. (11, 12, 13, 14)

O alta hiperplazie reactiva limfonodala este reprezenta de histiocitoza sinusala benigna ce se caracterizeaza prin prezenta unor macrofage cu citoplasma eozinofilica si nucleu veziculos intalnita in cazul antracozei (macrofage încărcate cu cărbune în ganglionii mediastinali), a anemiei hemolitice (macrofage cu hematii), precum si in infectii si neoplasme. Un caz particular de histiocitoza sinusala il reprezinta “boala Rosai – Dorfman” caracterizata prin prezenta, in sinusurile medulare (semn patognomonic), a unor macrofage incarcate cu limfocite, plasmocitoza intersinusala si fibroza capsulara. (60) La examinarea citologica a frotiului ganglionar se constata prezenta unor histiocite cu unul sau mai multi nuclei, simpli sau multilobati, fara atipii, cu cromatina fina. Citoplasma lor este abundenta, pala, incarcata cu numeroase limfocite intacte si celule plasmatice. O parte dintre histiocite au inglobate neutrofile precum si resturi celulare fagocitate ce acopera, uneori in totalitate, nucleul. De asemenea, celularitatea frotiului este reprezentata si de limfocite mature, celule plasmatice, neutrofile si macrofage. (61, 62, 63, 64)

Boala Kikuchi, este, de asemenea, o histiocitoza reactiva, de data aceasta, necrotica, caracterizata prin prezenta abundenta a histiocitelor cu nucleu curbat, in forma de “semiluna”, precum si a detritusurilor necrotice, monocitelor plasmocitoide, limfocitelor de dimensiuni variabile, iar, ca si o caracteristica a acestei boli, se constata absenta totala a neutrofilelor, iar celulele plasmatice sunt intr-un numar extrem de mic. (65, 66, 67)

Limfadenopatia dermatopatică (reticuloza lipo-melanică) este o alta hiperplazie reactiva caracterizata prin prezenta lipidelor si melaninei in citoplasma macrofagelor, intalnita deseori la debutul Mycosis Fungoides. (60)

Exista numeroase studii anatomo-clinice si experimentale care atesta faptul ca, in anumite conditii, procesele inflamatorii cronice se pot transforma in limfoame sau leucemii. Aceasta opinie a fost exprimata inca din anii '50 cand Rubin Popa, a observat faptul ca, la unele cazuri cu septicemie stafilococica cu evolutie lenta, hiperplazia limfohistiocitara generalizata duce la modificarea structurii foliculare a limfonodurilor si a splinei. In aceeasi perioada, Macavei, Haragus, Perian, Papilian si Cotofaru au demonstrat ca la unii pacientii cu faringite, reumatism sau tuberculoza, in decurs de cateva lunii sau chiar ani, leziunea microscopica s-a transformat, dintr-o limfadenita nespecifica sau specifica, in leucemie sau limfom malign. De asemenea, Berceanu si colab (1976) au publicat dovezi incontestabile asupra raporturilor existente intre starile limfoproliferative benigne sau reactive si maligne, asociate de multe ori cu boli autoimune. (68)

TUMORILE LIMFONODURILOR

Tumorile limfonodurilor sunt de doua tipuri: primare și secundare.

Tumorile primare

Limfomul, desi este destul de rar intalnit in patologia ecvina si ovina, este neplasmul hematopoietic cu frecventa cea mai mare de aparitie. Incidenta acestuia este de aproximativ 1.3-2.8% iar prevalenta de 0,002-0.5% din totalul populatiei cabaline. (Savage, 1998 si Schneider, 2003).

Sunt reprezentate de limfoamele maligne care sunt împărțite în limfom Hodgkin și limfom non-Hodgkin (cunoscut si sub denumirea de limfosarcom sau limfom malign).

Limfomul Hodgkin este rar intalnit la animalele domestice, producand un sindrom asemanator celui din patologia umana. Tabloul clinic este dominat de adenopatie la nivelul limfonodurilor craniene, ingvinale, pelvine si mezenterice. Din punct de vedere histologic, aceste se caracterizeaza prin prezenta unei componente tumorale reprezentata de celule Sternberg-Reed si a unei componente netumorale, reactiva , formata din limfocite normale, eozinofile, plasmocite, histiocite, neutrofile, vase de neoformatie si fibroza. (14)

Tinand cont de proportia celor doua component precum si de arhitectura, limfomul Hodgkin se clasifica in:

Limfom Hodgkin nodular cu predominanta limfocitara ce prezinta putine celule Sternberg-Reed si frecvente limfocite sub forma de hiperplazie difuza;

Limfom Hodgkin clasic cu:

Scleroza nodulara in care sunt numeroase focare de hiperplazie limfocitara cu un numar mare de celule Sternberg-Reed si celule Hodgkin, la care se adauga o puternica proliferare fibroblastica

Numeroase limfocite

Celularitate mixta caracterizat prin prezenta unei populatii eterogene formata din celule Sternberg-Reed, celule Hodgkin, si celule inflamatorii (neutrofile, eozinofile, histiocite, limfocite, plasmocite, fibroblaste si fibrocite).

Depletie limfocitara – se constata doua tipuri distincte: tipul sarcomatos in care sunt prezente celule Sternberg-Reed si histiocite si tipul cu limfocite foarte putine in care se observa celule Sternberg-Reed incadrate de proliferari fibroblastice. (14, 15, 16)

Celula Sternberg-Reed nu are o morfologie celulara constanta, aceasta aparand sub mai multe forme:

Celula Sternberg-Reed mononucleata (celula Hodgkin)

Celula Sternberg-Reed lacunara

Celula Sternberg-Reed pleiomorfa

Celula Sternberg-Reed limfo-histiocitara

Celula Sternberg-Reed mumificata

Celula Sternberg-Reed clasica se caracterizeaza prin dimensiunile mari (20-50 microni), citoplasma abundenta, amfofila, omogena sau fin granular; are 2 nuclei dispusi “in oglinda” sau “in ochi de bufnita”. Fiecare nucleu are cate un nucleol mare, eozinofil.

Celula Hodgkin are caracteristicile celulei Celula Sternberg-Reed clasice, dar are dimensiuni mai mici si este mononucleata.

Celula Sternberg-Reed lacunara are un nucleu lobulat, cu nucleoli multipli, mici, citoplasma este palida, abundenta, dar in momentul fixarii aceasta se retracta, formand un halou pericelular (artefact).

Celula Sternberg-Reed pleiomorfa are nuclei multipli, neregulati, dispusi sub forma de coroana.

Celula Sternberg-Reed limfo-histiocitara este de mici dimensiuni, iar nucleul este rasucit avand nucleoli foarte si, uneori nevizibili.

Celula Sternberg-Reed mumificata are un nucleu compact, fara nucleoli, cromatina este uniforma, citoplasma bazofila. Aceasta varianta reprezinta, de fapt, celula Sternberg-Reed degenerate, aflata in necrobioza. (14)

Tumorile secundare

Sunt reprezentate de metastaze ganglionare ale unui cancer primar.

Metastazarea la nivel limfonodal poate imbraca un caracter degenerativ ca o consecinta a reactiei histiocitare la acest nivel, mai ales in stadiile incipiente. (17)

Sistematizarea datelor din literatura evidentiaza urmatoarele tipuri de modificari reactive ce apar la nivel limfonodal:

Cresterea numarului de limfocite in zone corticale, paracorticale si medulare;

Predominanta centrilor germinativi populati cu precursori plasmocitari;

Proliferarea histiocitelor (macrofagelor) in sinusurile limfonodale;

Depletie limfocitara;

In unele zone, pot aparea procese de fibroza si modificari degenerative.

Pe baza acestor modificari, limfonodurile pot fi grupati in 3 categorii:

Limfonoduri in care se dezvolta un mediu nefavorabil proliferarii celulelor tumorale datorat cantitatii crescute de limfocite T si macrofage asociata cu hiperplazia centrilor germinativi;

Limfonoduri cu depletie limfocitara ce permit proliferarea celulei canceroase;

Limfonoduri cu aspect normal ce indica fie lipsa de reactie fata de celulele tumorale din cauza slabei lor antigenitati, fie existenta unui numar redus de celule tumorale si fara capacitate metastazanta sau proliferative, fie prin complete regresie a metastazelor.(17)

Patogeneza procesului de extindere a procesul tumoral din tumora primara in limfocentru este destul de complexa , aceasta parcurgand o serie de etape:

Etapa filtrarii ce consta in retinerea celulelor maligne pe baza stricta a unui proces mechanic;

Etapa imunologica nespecifica in care se constata o intensa activitate limfonodala caracterizata prin intensificarea fagocitozei macrofagice, histiocitoza activa sinusala, hiperplazie foliculara sau reticulara difuza asociata cu cresterea numarului de celule pironinofile ce denota existenta unor micrometastaze. In urma fagocitozei celulelor tumorale, in special a celor aflate in apoptoza spontana sau in necrobioza indusa, are loc prelucrarea informatiei antigenice si trasferul acesteia la celulele dendritice si apoi la nivelul celulelor imunocompetente efectoare (limfocite T, limfocite K si limfocite NK).

Etapa imunologica specifica caracterizata prin prezenta unei celularitati cu predominanta limfocitara (limfocite T) in paracorticala limfonodala ceea ce denota o rectie imuna mediata cellular care intarzie metastazarea;

Etapa anticorpodependenta este redusa ca timp si se caracterizeaza prezenta plasmocitelor in limfonodurile invadate de celule tumorale.

Etapa diseminarii limfonodale poate fi:

Ultraprecoce: cand celulele tumorale traverseaza bariera limfonodala fara a declansa vreo reactie imunologica;

Precoce: cand celulele tumorale sunt transportate pasiv de catre macrofage;

Tardiva: in care celulele tumorale au o deplasare active;

Ultratardiva: in care se constata invadarea cvasitotala a limfonodului, umpland sinusurile subcorticale.(17)

Metastazele cele mai frecvente intalnite la nivel ganglionar sunt cele provenite de la tumorile carcinomatoase. Celulele epiteliale metastatice apar fie individuale fie grupate. Aceste au dimensiuni mari, nu au nicio asemanare cu liniile celulele intalnite in limfonodul normal sau hiperplazic.

De asemenea se pot intalni si melanocite provenite de la un melanom malign, fibroblaste (celule fusiforme) ce sugereaza un sarcom sau un numar crescut de mastocite (>3%), grupate, de obicei, in focare sau cuiburi ce indica un mastocitom. (8, 9)

2. PATOLOGIA MADUVEI HEMATOFORMATOARE

2.1 CITOLOGIA NORMALA A MADUVEI HEMATOFORMATOARE

Celularitatea medulara normala variaza in functie de varsta animalului, raportul dintre grasime si celule scazand direct proportional cu inaintarea in varsta. Modificarile celulare ce apar ca urmare a instalarii unei patologii se pot manifesta fie sub forma unei displazii medulare, caracterizata prin alterarea morfologiei celulare, fie sub forma unei discrazii medulare inregistrandu-se o proportie anormala a stadiilor de dezvoltare ale seriilor celulare.

Hipocelularitatea medulara poate fi rezultatul unor conditii imunosupresive, hipoplazice (insuficienta renala), a unor boli infectioase, intoxicatii sau boli idiopatice, iar hipercelularitatea medulara se poate diagnostica in cazul hiperplaziei eritroide, hiperplazia mieloida sau granulocitara, boli mieloproliferative, infiltratii de celule neoplazice, tumori plasmocitare sau mastocitare.

Clasificarea bolilor proliferative non-neoplazice si neoplazice ale maduvei osoase hematogene (3)

Sindroame mieloproliferative

Leucemia acuta mieloblastica (LAM)

Sistemul de clasificare French-American-British Group (FAB) recunoaște 8 subtipuri de leucemii acute mieloblastice sau non-limfoblastice. Astfel, din punct de vedere citomorfologic, acestea se caracterizeaza astfel:

Leucemia acuta mieloblastica fără maturație prezinta o populație blastică formată din mieloblaști mari, agranulari. Diagnosticul nu poate fi stabilit în microscopie optică (MO), ci doar pe baza demonstrării prezenței granulațiilor citoplasmatice în microscopia electronică (ME), a exprimării de către celulele blastice a unor antigene aparținând liniei mieloide (CD13, CD33, mieloperoxidaza), ca și absența exprimării antigenelor specifice liniei limfoide (21, 22).

Leucemia acuta mieloblastica cu maturare minimă in care populația blastică (80-90% din celulele non-eritroide) este formată din mieloblaști mari cu rare granulații azurofile fine. Diagnosticul este pozitiv dacă > 3-5% din celule reacționează pozitiv pentru mieloperoxidază sau negru Sudan (21, 22).

Leucemia acuta mieloblastica cu maturare – circa 30-80% dintre celulele non-eritroide sunt mieloblaști bine diferențiați, cu citoplasma bogată, avand un număr variabil de granulații azurofile. Reacția pentru mieloperoxidază este intens pozitivă, ca și cea cu negru Sudan (21, 22).

Leucemia acuta promielocitară in care populația mieloidă este dominată de prezența promielocitelor (patologice), celule mari cu nucleu rotund sau ancoșat, citoplasma abundentă cu numeroase granulații azurofile, mai mari ca cele normale. Reacția mieloperoxidazică este foarte intensă. Există și o variantă microgranulară in care promielocitele au un nucleu neregulat, lobulat, reniform sau similar celui monocitar, iar citoplasma conține granulații fine. (21, 22).

Leucemia acuta mielomonocitară caracterizata prin prezenta precursorilor liniilor granulocitare și monocitare în proporții variabile, fiecare linie reprezentând >20%, dar nu >80% din celulele nucleate medulare. Monoblaștii sunt celule mai mari decât mieloblaștii, cu nucleu rotund sau ovalar, cu cromatina fin dispersată, nucleoli evidenți, citoplasma este abundentă, cu granulații azurofile. In sangele periferic se constata un număr crescut de monocite și promonocite (72).

Leucemia acuta monoblastică – monoblaștii, promonocitele și monocitele reprezintă 80% din celulele non-eritroide. Există două variante: – o leucemie acuta monoblastica in care 80% din celulele monocitare sunt monoblaști, cu nucleu cu cromatina fin granulară și citoplasmă abundentă, bazofilă, agranulară, si o leucemie acuta monoblastica in care monoblaștii sunt în număr mai redus, iar 20% dintre celule prezintă maturație (72).

Eritroleucemia acută caracterizata prin prezenta precursorii eritrocitari >50% din totalul celulelor nucleate medulare. Acestia sunt caracterizați prin modificări megaloblastice și anomalii nucleare, similare celor din mielodisplazii. Peste 20% din celulele nucleate sunt mieloblaști (sub această cifră, se consideră a fi un sindrom mielodisplazic). Este descrisă și o formă de eritroleucemie pură, fără prezența de mieloblaști în măduva osoasă (21).

Leucemia acuta megakariocitară este o forma rara de leucemie de se caracterizeaza prin prezinta a numeroși megakarioblaști cu stadii diferite de diferențiere: forme nediferențiate, mai mici, cu nucleu cu cromatina densă, omogenă și nucleoli greu vizibili, cu citoplasma redusă, sau forme diferențiate, mai mari, cu cromatina fin granulară, citoplasma abundentă si cu granulații azurofile in sangele periferic (69, 70, 71).

Leucemia mieloida cronica

Leucemia mieloidă cronică este o boală clonală a celulei stem hematopoietice caracterizată prin creșterea proliferării elementelor mieloide în toate stadiile de diferențiere. Prezența în număr foarte mare a acestora în sângele periferic este esențială pentru stabilirea diagnosticului, alături de alte semne importante precum creșterea granulocitelor bazofile, scăderea fosfatazei alcaline leucocitare, creșterea nivelului seric al vitaminei B12 precum și a transcobalaminelor I și III. (23)

La nivelul sangelui periferic se constata o anemie normocitara, normocroma, leucocitoza, predominant neutrofilelor segmenetate, metamielocite, mielocite, mieloblasti, eozinofilie, bazofilie (marker de mieloproliferare cronica), numar de trombocite crescut sau normal la debutul bolii (24)

Tabloul sangelui periferic din punct de vedere al transformarii blastice se prezinta astfel:

Anemie cu eritroblasti

Numar crescut de mieloblasti (25 – 30%)

Promielocite

Mielocite

Metamielocite

Cresc monoblastii

Bazofilie

Metacariocite mici. (24)

Policitemia (eritrocitoza)

Policitemia este boala a sangelui caracterizata printr-o crestere excesiva a numarului de eritrocite. In functie de cauzele aparitiei aceasta poate fi relativa sau absoluta.

Policitemia relativa se instaleaza ca urmare a pierderii volumului plasmatic sau a unei deshidratari severe ce are ca si consecinta cresterea masei totale eritrocitare.

Policitemia absoluta se caracterizeaza prin cresterea numarului de eritrocite, avand fie cauze primare fie secundare.

Policitemia primara (policitemia vera) este o boala maligna clonala a celulelor hematopoietice caracterizata prin hiperplazie medulara la nivelul liniei eritroide fiind raporata la caini, pisici, bovine si cabaline. (26) Caracteristica de baza in diferentierea policitemia primare de cea secundara este dozarea activitatii eritropoietinei, aceasta fiind scazuta in cazul policitemiei primare si crescuta in cazul celei secundare.(26, 27)

Hemograma arata poliglobulie, hemoglobina (Hb) hematocritul (Ht) si viteza de sedimentare a hematiilor (VSH) crescute, leucocitoza si trombocitoza. De asemenea, se constata o scadere a feritinei si o crestere a capacitatii de legare a fierului. Medulograma evidentiaza o hipercelularitate cu hiperplazie, megacariocite anormale.(25)

Trombocitemia esentiala

Trombocitemia esentiala este o boala cronica maligna a celulelor stem hematopoietice caracterizata prin cresterea excesiva a numarului trombocite datorata proliferarii masive a megacariocitelor, fiind intalnita, in special, la animalele batrane. Frotiul de sange periferic indica prezenta unor plaje trombocitare, fragmente de megacariocite, trombocite gigant si, uneori, bazofilie. (24, 28)

Leucemia cu mastocite

Leucemia cu mastocite este un sub tip extrem de agresiv al leucemiei mieloide acute, fiind semnalata la canide, feline si cabaline.(31) Aceasta se caracterizeaza prin proliferarea progresiva si infiltrarea mastocitelor in diferite organe. La om, diagnosticul de leucemie cu mastocite este indicat de un procent de mastocite atipice mai mare de 10% in sangele periferic si de 20% in maduva hematogena. (29, 30)

Sindromul mielodisplazic

Sindromul mielodisplazic, denumit si stare pre-leucemica, este o afectiune clonala dobandita, care afecteaza celulele hematopoietice suse si evolueaza, cel mai adesea spre leucemie acuta. Acesta este caracterizat prin hematopoieza insuficienta si numar scazut de reticulocite, asociate cu o maduva osoasa normo- sau hipercelulara, cu celule care prezinta anomalii morfologice evidente sau modificari displazice (de dimensiune, forma si organizare a celulelor).

Celulele mieloide nu isi pierd capacitatea de a prolifera si de a se diferentia, dar sufera o maturare incompleta, care are drept rezultat o productie inadecvata de celule sanguine mature. La nivelul liniei eritoide, displaziile intalnite includ anomalii nucleare (nuclei multipli, fragmentare nucleara, forme nucleare bizare, mitoze anormale, punti internucleare si cromatina anormal de densa), anomalii citoplasmatice (corpi Howell-Jolly, hemoglobinizare deficitara si sideroblasti inelari), precum si asincronism nucleo-citoplasmatic (nucleu cu cromatina densa si citoplasma cu hemoglobinizare slaba). Modificarile disgranulopoietice cele mai frecvente sunt hipogranularitatea si hiposegmentarea, iar cele dismegacariocitare sunt micromega-cariocitoza si prezenta unor nuclei mici, multipli la nivelul megacariocitelor (20).

Sangele periferic prezinta citopenie care afecteaza una sau mai multe linii celulare. Numarul de reticulocite este scazut, iar unele eritrocite pot fi macrocitare, cu anomalii de tipul corpusculilor Howell-Jolly, inelelor Cabot si punctatiilor bazofile. Eritrocitele nucleate sunt si ele relativ frecvente, adesea prezentand si modificari displazice. Neutrofilele mature pot sa prezinte nuclei hipolobulati si au foarte putine granulatii intra-citoplasmatice, sau deloc. In plus, se pot observa granulocite imature in sangele periferic. Una din caracteristicile particulare ale sindromului mielodisplazic este cresterea numarului monocitelor. Monocitoza este o trasatura distinctiva a variantei leucemiei monomielocitare cornice. Rareori, se pot vedea micromegacariocite in sangele periferic. (18, 19, 20)

Boala inflamatorie

Organismul animal este un sistem foarte complex ce reactioneaza la provocarile din mediu. Deși factorii de agresiune pot fi diferiți, organismul reacționează prin inflamație, un răspuns fiziologic ce implică mai multe etape succesive.

Inflamația acută este prima reacție a organismului la agentul agresor și poate dura de la câteva ore până la câteva zile. In infectiile bacteriene se observa o hiperplazie a seriei granulocitare, cu deviere accentuata spre stanga prin inmultirea celulelor in stadiul mai tanar de maturatie. Granulatiile citoplasmatice sunt foarte abundente, de dimensiuni mari. In starile septice, celulele cu granulatii eozinofile sunt diminuate, iar in procesele infecto-alergice numarul acestora creste. Plasmocitoza reactiva este frecventa in ambele imprejurari. In infectiile virale apare o reactie a celulelor reticulare-limfoide si a histiomonocitelor, asociata uneori cu o infiltratie moderata limfocitara la nivel medular si sangvin. Seria granulocitara este proportional mai diminuata.(58, 59)

Procesele autointretinute imunologic evolueaza obisnuit cu reactii granulocitare cu deviere spre stanga in medulograma, insotite de eozinofilie si reactii importante reticulo-limfoide, limfocitare si plasmocitare (59).

In neoplaziile viscerale se pot observa aspecte similare proceselor imunologice, plasmocitoza medulara avand o crestere importanta iar infiltratia limfocitara este adesea accentuata. Rar se constata si prezenta cuiburilor de celule heterotipice, tahicromatice, cu monstruozitati caracteristice pentru micrometastazele din maduva (59).

In procesele inflamatorii cronice, maduva este frecvent hipoplazica, cu mult tesut adipos. Seria granulocitara poate fi diminuata, cu o inmultire relativa a celulelor reticulare sincitiale, reticulare-limfoide si a plasmocitelor (59).

Anemia regenerativa

Evidentierea anemiei regenerative pe frotiul medular se face prin evaluarea raportului precursorilor medulari si eritroizi (M/E). In mod normal acest raport variaza intre 2:1 si 4:1, in cazul anemiei regenerative constatandu-se o scadere a acestuia datorita cresterii numarului de celule eritroide, in special a eritroblastilor policromatofili si oxifili. (1)

SINDROAME LIMFOPROLIFERATIVE

1. Leucemia acuta limfoblastica (LAL)

Leucemia acuta limfoblastica (LAL) este o hematopatie maligna caracterizata prin proliferarea necontrolata in maduva hematogena a limfoblastilor. Pe baza caracteristicilor acestora, pot fi identificate doua tipuri de LAL: LAL cu precursori ai limfocitelor T si LAL cu precursori ai limfocitelor B.

Leucemia acuta limfoblastica T are o evolutie mai rapida decat cea cu limfocite B precum si un grad de malignitate mai inalt, dar o frecventa de aparitie mult mai scazuta.

Hemoleucograma furnizează semne directe pentru diagnosticul de leucemie (prezența blaștilor leucemici) și indirecte, de insuficiență medulară (anemie, neutropenie, trombocitopenie). Celulele blastice sunt fie de dimensiuni mici, mari sau pot prezenta vacuole citoplasmatice (Burkitt-like); nucleul este rotund (pre B) sau esancrurizat (pre T), cromatina este densa, nucleolii sunt prezenti in numar de 1-2, citoplasma este redusa, agranulata, bazofila. In limfonoduri si in splina se remarca o intensa proliferare limfoblastica cu frecvente diviziuni celulare. In viscere se remarca o infiltratie difuza de limfoblaste, inclusiv in spatiile vasculare (24).

Frotiul medular evidențează celularitate crescută, omogenă pe seama infiltratului medular cu blaști leucemici. Pe frotiu celulele hematopoietice normale, respectiv seriile eritroblastică și megacariocitară sunt slab reprezentate cantitativ deși calitativ aspectele sunt normale. În plus, raritatea elementelor mature din seria mieloidă și dispariția stadiilor intermediare de diferențiere pe linia limfoidă, realizând așa numitul hiatus leucemic, conferă frotiului medular un aspect caracteristic monomorf, contrar polimorfismului celular medular normal. (24, 32, 34)

2. Leucemia cronica limfoblastica

Leucemia limfocitara cronica este o boală primitivă a țesutului limfatic caracterizată prin proliferarea malignă și acumularea unei clone de limfocite mici, imunologic incompetente. In peste 95% din cazuri clona maligna provine dintr-un limfocit de tip B, iar proliferarile limfocitelor T reprezinta sub 5% din cazuri, cele mai frecvente sunt cele cu limfocite T Helper (24).

Hemoleucograma arata in principal o crestere importanta a numarului de limfocite mici, mature. Pe frotiu apar numeroase „umbre nucleare", care sunt resturi rezultate prin distrugerea limfocitelor maligne in timpul prepararii frotiului, din cauza fragilitatii lor crescute (24).

Anemia si trombocitopenia caracterizeaza fazele avansate ale bolii, cu prognostic rezervat. Medulograma evidentiaza hipercelularitate si infiltrarea maduvei cu limfocite mici. Zonele de tesut hematopoietic normal sunt reduse. (24, 33, 35)

Limfomul – ultimul stadiu

In utimul stadiu al limfomului malign se constata o diseminare extraganglionara a limfocitelor tumorale implicand ficatul, lichidul cerebrospinal, pulmonul, maduva hematogena. (47)

Plasmocitoza

Cresterea numarului de plasmocite la nivelul maduvei hematogene, a tesuturilor, a exudatelor sau a sangelui denota instalarea unei boli sau a unei infectii. Diagnosticul diferential se face pe baza anamnezei si a examenului clinic si citopatologic, plasmocitoza fiind prezenta in mielomul multiplu, limfomul cutanat cu celule B, in infectii pulmonare (precum pneumonia, tuberculoza sau abces), dar si in cazul stimularii cu diferite antigene (vaccinare) cu conditia ca sa fie, in timp, pasagera si legata direct de o limfocitoza, initial “T” si apoi “B”.(48, 49, 50)

Plasmocitomul

Plasmocitomul reprezinta o proliferare maligna a plasmocitelor in maduva hematoformatoare.

Hemoleucograma releva o anemie macrocitara, trombocitopenie, leucopenie, aglutinarea eritrocitelor si, uneori, rare celule limfoblastice. (36, 37, 38, 39, 40, 41, 42), iar medulograma prezinta o populatie omogena de celule plasmatice atipice. (43) Morfologia plasmocitelor atipice variaza: uneori au aspect apropiat de cel normal, dar de regula, pezinta anomalii exprimate cu nuclei bi- sau tri- lobati , alteori cu aspect “plasmoblastic”. Se pot intalni si plasmocite hipervacuolizate, plurinucleate sau gigante. (59)

Reactiile pseudoleucemice (paraleucemice)

Aceste boli se prezinta ca veritabile limforeticulopatii reactive caracterizate prin modificari calitative, dar in special si cantitative ale liniei leucocitare, valorile leucocitelor depasind dublu sau triplu valorile normale, in absenta oricaror atipii sau mitoze.

Adenograma si splenograma prezinta valori crescute ale celulelor limfoblastice si reticulare, ulterior aceste organe prezentand un numar mare de celule immunologic active (imunoblasti, imunocite, plasmocite).(25)

Starile limfoproliferative pseudoleucemice sunt reactii imunobiologice de granita ce sunt pasibile de transformare neoplazica in urma unor solicitari antigenice repetate.

Un loc aparte in cadrul proliferarilor limforeactive il reprezinta anemia infectioasa a ecvinelor, medulograma acestora evidentiind un tablou caracteristic, atat in forma acuta cat si in cea cronica de boala. In forma acuta se evidentiaza o puternica proliferare limfoblastica limfocitara insotita de o hiperplazie reticulara. Aceasta proliferare determina o inhibitie puternica a celulelor sistemului eritropoietic si mielopoietic. In forma cronica dominant celulara este reprezentata de elemente reticulo-monocitoide, de multe ori avand un pregnant atipism. (25)

Sindromul de hiperimunizare

Inocularea unui antigen este urmata, la diferite intervale, de o succesiune de modificari citomorfologice la nivelui organelor sistemului imunitar. In prima faza are loc o pregatire a celulelor imunocompetente, urmand ca, la 7-14 zile postinocul, sa inceapa si sa se accentueze biosinteza de anticorpi specifici antigenului inoculat (50).

La nivelul maduvei hematoformatoare se remarca o scadere a elementelor liniei celulare eritropoietice si o crestere putin semnificativa a liniilor celulare monocitopoietice, limfopoietice si reticulare. In timus se instaleaza o hiperplazie a celulelor reticulare si limfoblastice, in amigdale apare o puternica proliferare reticulara si limfoblastica, cu o importanta diferentiere plasmoblasto-plasmocitara, iar in splina si limfonoduri au loc cele mai intense si mai precoce modificari citomorfologice ce se traduc, in functie de numarul de antigene inoculate, astfel:

a. in cazul inocularii unui antigen se constata:

– reactia celulara dureaza, in medie, 14 zile;

– proliferare intensa a celulelor reticulare in primele 3-4 zile de la inocularea antigenului, ajungand la valori normale in ziua a 6-7 postinocul;

– proliferarea celulelor germinoblastice in zilele 4-5 postinocul, urmata de o scadere lenta a numarului acestora pana la valoarea normala in zilele 11 – 12 postinocul;

– limfoblastii prolifereaza in aceeasi dinamica cu germinoblastii;aceste celule reprezinta imunoblasti ce apar in urma contactului limfocitului mic cu antigenul;

– limfocitele scad numeric incepand cu ziua a 3 postinocul, atingand valori axime spre ziua 6 – 7 si revin la valori normale intre zilele 13-14 postinocul. Un aspect important ce se intalneste la nivelul limfocitelor (1/5 din total) este hiperbazofilia ce se instaleaza ca urmare a contactului cu antigenul (imunocite);

– macrofagele cresc de 4 – 5 ori intre ziua 2 – 4 de la inoculare, scazand apoi rapid spre valori normale intre a 5 a si a 6 a si postinocul;

– plasmoblastii – plasmocitele sunt, de fapt, celulele ce efectueaza reactia imuna umorala prin elaborarea imunogobulinelor specifice. Elementele plasmocitare apar in procente mici (3 – 5 %) inca din ziua a 5-a postinocul, ajungand, in ziua a 7-a la valoarea maxima de 30 – 40 %, instalandu-se apoi un platou pana in ziua a 10-a, urmat apoi de o scadere masiva pana la normalin ziua a 14-a.

b. in cazul inocularii mai multor antigeni se constata:

– reactia celulara dureaza, in medie, 21 zile;

– primele reactii postvaccinale se instaleaza intre 3-7 zile postinocul prin proliferarea celulelor reticulare;

– elementele celulare plasmoblastro-plasmocitare apar intre 8 – 10 zile, avand o intensitate maxima intre 10 – 15 zile;

– elementele macrofagice apar incepand cu a 2-a zi postinocul si se mentin la valori ridicate pana spre ziua a 7-a sau a 8-a.

Modificarile celulare ce apar in urma vaccinarii atesta faptul ca o polivaccinare este mai avantajoasa pentru organismul animal dupa cum indica tipul celular de reactie al sistemului celular al imunitatii.(50)

SINDROAME HISTIOCITARE

Anemia hemolitica autoimuna (AHAI)

Aceasta anemie apare ca urmare a reactiilor antigen-anticorp ce au loc la suprafata eritrocitelor si duc, in final, la liza lor. In patologia animalelor aceasta este putin cunoscuta, desi boala poate fi indusa experimetal. (25)

Diagnosticul acestei boli se face prin coroborarea semnelor clinice, hematologice si rezultatul testului Coombs de seroaglutinare incrucisata. La examenul hematologic se remarca o scadere a conținutului de hemoglobină, a numărului de eritrocite precum si cresterea numarului de reticulocite. Anemia este normo- sau hipercromă. De asemenea, se observă policromatofile, anizocitoză, poikilocitoză, dar si creșterea procentului de microsferocite ca rezultat al traumării eritrocitelor în splină. Investigarea medulogramei evidențiază hiperplazia țesutului eritroid. (43)

Histiocitoza cu celule Langerhans

Histiocitoza cu celule Lagerhans (HCL) este o boala caracterizata prin proliferarea histiocitelor, celule ce apartin de sistemul fagocito-mononuclear.

In conditii normale, celulele Langerhans sunt prezente in structura epidermului, in splina si ganglioni limfatici. Ried si colab. au identificat un progenitor hematopoietic al macrofagelor si al celulelor Langerhans. Monocitul sanguin se diferentiaza la nivelul diferitelor tesuturi in histiocite specifice tisulare (macrofag alveolar, celula Kupffer, osteoclast etc.) si in mai multe tipuri de celule dendritice. Celulele Langerhans sunt celule dendritice, care fixeaza si prezinta antigenele (celule prezentatoare de antigen) altor celule, in special limfocitului T(3).

Leziunea specifica este reprezentata de granulom, format din histiocite, limfocite, eozinofile, neutrofile si plasmocite. Aspectul histologic variaza dupa stadiul evolutiv al bolii si dupa localizare. In faza initiala, leziunea este proliferativa, formata predominant din histiocite, fara criterii histologice de malignitate. Un procent redus de histiocite este reprezentat de celule Langerhans anormale. Pe masura ce leziunea progreseaza, apar zone de necroza si infiltrat granulocitar dominat de eozinofile. In faza tardiva, celulele Langerhans dispar, iar aspectul histologic este dominat de fibroza. Celulele Langerhans patologice sunt celule mononucleare mari slab vacuolizate, iar in citoplasma, se evidentiaza prezenta de granule (corpi Langerhans) ce sunt produse prin invaginarea membranei celulare. (44)

Sarcomul histiocitar/histiocitoza maligna

Incidenta patologiei histiocitare maligne la cabaline este foarte scazuta. Caracteristica comuna a acestor boli este reprezentata de hemofagocitoza, histiocitele neoplazice manifestand o puternica activitate de eritrofagocitoza. Aspectul histologic al leziunilor este consecvent, indiferent de localizare. Citologic, tumora este formata din celule mari, pleiomorfe, mononucleare și celule gigante multi-nucleate cu atipii marcante. (12, 45, 46)

3. PATOLOGIA SPLINEI

Splina este unul din cele mai importante organe ale sistemelor limfatic și imunitar. Din punct de vedere citologic prezinta o populatie mixta de limfocite mici si limfoblaste, similara cu cea a limfonodului normal. (51, 52) Limfocitele mici au dimensiuni mai reduse decat neutrofilele segmentate, nucleul este rotund sau usor dantelat, cromatina este condensata, iar citoplasma este redusa, de culoare bleu. Limfoblastele se recunosc dupa dimensiunea lor mare, nucleul neregulat, dantelat, cromatina veziculara, nucleoli multipli si citoplasma bazofila. (1) De asemenea, se intalnesc fibrocite si celule endoteliale ce apartin tesuturilor de conectivitate si vascular, macrofage, celule plasmatice, neutrofile, mastocite si trombocite agregate. (51, 53)

Hiperplazia splenica

Hiperplazia splenica este rezultatul unei vaste patologii inflamatorii, atat septica cat si aseptica. In cazul afectiunilor mediate imun precum si in infectiile sistemice produse de bacterii, ricketii, protozoare si fungi inflamatia este de intensitate slaba pana la moderata. In general, citologia hiperplaziei splenice se caracterizeaza prin cresterea numarului de macrofage, celule plasmatice si limfoblaste in detrimentul limfocitelor mici. (51) Desi scaderea numarului de limfocite mici este relativa, totusi acestea raman celulele intalnite predominant in frotiu. De asemenea, se constata o crestere usoara a numarului de neutrofile. In infectiile cronice se remarca o crestere pronuntata a celulelor plasmatice si a macrofagelor. (3)

Hematopoieza extramedulara

Hematopoieza extramedulara este intalnita frecvent la animalele cu afectiuni severe ale maduvei heatoformatoare, la cele cu anemie hemolitica cronica, afectiuni mieloproliferative, neoplazii limfoproliferative, precum si in sindroamele mielodisplazice. (54)

Din punct de vedere citologic anemia hemolitica se caracterizeaza prin prezenta precursorilor eritroizi (proeritroblast, eritroblast, normoblaste bazofile, normoblast acidofil, eritroblastul policromatofil) insotite de limfocite mici si mari. De asemenea, sunt prezente si macrofage ce contin hemosiderina si fragmente eritrocitare. (3)

Neoplazia hemolimfatica

Citologia splenica normala contine o populatie mixta de celule ce au o varietate de marimi, forme si culori. In cazul splenomegaliei produsa ca urmare a unor neoplazii limfoproliferative sau a unor afectiuni mieloproliferative se constata o populatie omogena de celule neoplazice ce inlocuiesc parenchimul ramanand doar cateva celule limfoide normale si macrofage. In functie de tipul neoplaziei se constata prezenta de precursori limfatici, eritroizi, granulocitari, monocitari, celule plasmatice, mastocite, histiocite sau celule primitive nediferentiate. In limfom si in leucemia limfatica acuta, celulele normale sunt inlocuite de o populatie omogena de limfoblaste mari, hipercromatice, cu o citoplasma abundenta de culoare albastra inchisa su cu un nucleu rotund sau dantelat ce contine nucleoli multiplii. Leucemia limfatica cronica si limfomul cu celule mici sunt mai greu de diagnosticat din punct de citologic deoarece aceste neoplasme au o abundenta de limfocite mici care sunt greu de diferentiat fata de populatia limfoida normala. In mieloza eritremica se identifica prezenta a numeroase celule rotunde, mari, cu nuclei mari, excentrici, cu cromatina granulara fina si cu un singur nucleol, iar citoplasma este albastra inchis continand cateva granule fine oxifile; de asemenea se pot observa si un numar mic de eritroblasti policromatici si ortocromatici.(3)

Neoplazia splenica

Neoplasmele primare splenice sunt reprezentate de fibrosarcoame dezvoltate din capsula sau trabeculi, endotelio-angiosarcoame provenite din vasele sangvine, limfosarcoame cu origine in foliculii Malpighi si reticulosarcoame din pulpa rosie.(59)

Hemangiosarcomul se caracterizeaza, din punct de vedere citologic, prin prezenta unor modificari la nivelul structurii vasculare fiind prezente anastomoze, celule endoteliale imature, celule musculare de tip vascular (miocite) malignizate si celule adventiciale malignizate. Morfologic, miocitele malignizate sunt celule ovoide, cu nucleu tachicrom, citoplasma bazofila avand 1-2 prelungiri la capetele celulei; celulele endoteliale maligne sunt de talie mare, citoplasma este bazofila si prezinta o prelungire groasa ce imprima celulei aspectul de racheta, nucleul este situat excentric, cu cromatina densificata; celulele adventiciale maligne au talie mare, citoplasma este bazofila, extrem de bogata in granule oxifile iar nucleul este plasat excentric.(12, 57)

Leiomiosarcomul se remarca prin prezenta unor grupuri de celule alungite, a caror nuclei sunt hipocromatici , cu un index mitotic crescut. (56) Fibrosarcomul este caracterizat prin prezenta celulelor mari, fusiforme, cu citoplasma bazofila, cu nucleu mare, cu cromatina relaxata lasand sa se distinga prezenta a 1-2 nucleoli.(57)

Reticulosarcomul splenic are mai multe variante histomorfologice: tumora nediferentiata, imatura, ce are aspect de masa protoplasmatica sincitiala palida, din care se detaseaza numerosi nuclei bilobati sau neregulati, cu cromatina pulverulenta. Alteori celulele sunt diferentiate in sens de reticulo-endotelio-sarcom, reticulo-limfo-sarcom sau hematopoietic (spre eritroblasti, mieloblasti sau plasmocite(59).

Limfosarcomul splenic poate fi limfocitic, cu aspect histomorfologic monoton, alcatuit din celule asemanatoare limfocitelor mici, dar care au o structura nucleara fina, contin nucleoli, iar citoplasma este intens bazofila, lipsita de granulatii, sau poate fi limfoblastic, caracterizat prin prezenta unor celule mari, cu citoplasma larga, bazofila, uneori vacuolara (59).

Metastazele splenice ale tumorilor apatinand tesuturilor hematopoieticesunt foarte frecvente. Modificarile morfofunctionale splenice reactive, prezente in cazul tumorilor cu alta localizare cresc permeabilitatea peretilor sinusali astfel incat celulele tumorale patrund printre celulele endoteliale migrand spre mantaua perisinusala. Macrofagele nu fagociteaza celulele integre, de aceea, odata cu popularea cordoanelor Billroth incepe proliferarea tumorala. (59)