Grigora ș Nicoleta-Laura [619601]

UNIVERSITATEA DIN BUCURE ȘTI
FACULTATEA DE BIOLOGIE

LUCRARE DE LICEN ȚĂ

Coordonator ș tiințific:
Prof. dr. Otilia Z ărnescu

Absolvent: [anonimizat]

2017

UNIVERSITATEA DIN BUCURE ȘTI
FACULTATEA DE BIOLOGIE

LUCRARE DE LICEN ȚĂ
ORGANOGENEZA ȘI
REGENERAREA RINICHIULUI LA
PEȘTII TELEOSTEENI-MODEL DE
STUDIU PENTRU PATOLOGIA
RENALĂ UMANĂ

Coordonator ș tiințific:
Prof. dr. Otilia Z ărnescu

Absolvent: [anonimizat]

2017

1

CUPRINS
I. INTRODUCERE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………… 2
II. ORGANOGENEZA RINICHIULUI LA PEȘTII TELEOSTEENI ………………………… 3
II.1. Pronefrosul ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………. 4
A. Structură ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………. 4
B. Funcțiile pronefrosului ………………………….. ………………………….. ………………………….. . 11
II.2. Mezonefrosul ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………. 12
A. Structură ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………….. 12
B. Funcțiile mezonefrosului ………………………….. ………………………….. ……………………….. 21
III. REGENERAREA RINICHIULUI LA PEȘTII TELEOSTEENI ………………………… 22
IV. MATERIALE ȘI METODE ………………………….. ………………………….. ……………………… 30
IV.1. Animale ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………….. 30
IV.2. Administrarea de nanoparticule de siliciu ………………………….. ………………………….. … 30
IV.3. Analiza histologică ………………………….. ………………………….. ………………………….. …… 30
IV.4. Cuant ificarea numărului de agregate bazofile și a numărului de nefroni în dezvoltare
………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………….. 32
IV.5. Analiza statistică a datelor ………………………….. ………………………….. …………………….. 33
V. REZULT ATE ȘI DISCUȚII ………………………….. ………………………….. ………………………. 34
VI. CONCLUZII ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………….. 57

2
I. INTRODUCERE

Lucrarea de față își propune să prezinte principalele aspecte teoretice și practice cu privire
la proc esele de organogeneză și regenerare a rini chiului la peștii teleosteeni, procese care au
aplicații de ordin practic în studiul patologiei renale umane.
Numărul pacienților cu insuficiență renală cronică terminală este în continuă creștere la
nivel global. În România, ritmul de creștere a numărului de bolnavi tratați a fost de 8% în anul
2010, iar numărul total de bolnavi tratați prin mijloace de substituție a funcțiilor renale
(hemodializă, dializă peritoneală și transplant renal) a fost de 10500, adică 488 la un milion de
locuitori, sub media europeană de 650.
Organogeneza rinichiului vertebratelor este unică deoarece în cursul evoluției se succed
2 sau 3 tipuri de rinichi , care cresc în complexitate. În ordinea apariției lor, cele trei tipuri de
rinichi s unt reprezentate de pronefros, mezonefros și metanefros.
Funcția majoră a rinichiului vertebratelor este de a elimina metaboliții și de a menține
echilibrul săruri -apă. Aceste roluri sunt atribuite nefronului, unitatea structurală și funcțională
a rinichiu lui.
Regenerarea este procesul prin care celulele care se pierd sau sunt lezate sunt înlocuite,
având ca scop restaurarea structurii și funcției țesutului respectiv. Potențialul regenerativ al
organelor variază în cadrul unui organism, la fel ca și în ca drul diferitelor specii.
Bolile cronice și acute ale rinichiului se caracterizează prin leziuni la nivelul nefronilor.
Mamiferele au capacitatea de a ”repara” epiteliul tubular al nefronului, limitată la porțiunea
proximală, însă nu pot adăuga noi nefroni la cei existenți. La polul opus se situează peștii, care
sunt capabili să adauge noi nefroni ” de novo ” în timpul vieții. Un studiu aprofundat al acestui
proces de neonefrogeneză ar putea constitui un pas important în dezovoltarea de noi terapii
pentru tra tarea bolilor renale la om.
Scopul acestui studiu a fost analiza dinamicii procesului de nefrogeneză la Carassius
auratus gibelio expus la nanoparticule de siliciu.

3

II. ORGANOGENEZA RINICHIULUI LA PEȘTII TELEOSTEENI

Organogeneza este procesul prin car e, după formarea celor trei foițe embrionare
(ectoderm, endoderm și mezoderm), celulele încep să interacționeze unele c u altele și să se
organizeze pentru a forma țesuturile și organele (Zărnescu, 1999).
Histogeneza și organogeneza rinichiului constituie u na din cele mai ilustrative dovez i ale
evoluției vertebratelor ( Manolache, 2002).
Organogeneza r inichiul ui vertebratelor este unic ă deoarece în cursul evoluției se succed
2 sau 3 tipuri de rinichi, care cresc în complexitate . În ordinea apariției lor, cele trei tipuri de
rinichi sunt reprezentate de pronefros, mezonefros și metanefros (D rummond și Davidson,
2010).
În general, la pești se formează primele două tipuri de rinichi , pronefros ul și
mezonefros ul (Fig. 1). Vertebratele amniote (reptilele, păsările și mamiferele ) dezvoltă și al
treilea tip de rinichi , metanefrosul, ca rinichi adult (Davidson, 2014).

Pronefros Mezonefros

Fig. 1 . Reprezentarea schematică a rinichiului la peștii teleosteeni (Adaptată după
Kunz, 2004).

Canal colector

4
II.1. Pronefrosul
A. Structură
Pronefrosul (rinichi cefalic sau primordial ) constituie forma cea mai simplă de rinichi. El
este situat cranial și este întâlnit î n timpul dezvoltării embrionare la toate vertebratele.
La începutul de zvoltării embrionare la teleosteeni rămân funcționale 2 -7 segmente
pronefrotice (de exemplu la Salmo salar rămân 3), în timp ce la unele specii pronefrosul rămâne
funcțional ca parte a rinichiului și la adult (Kunz, 2004) . În general este alcătuit din tubu ri
urinifere ce co munică printr -o pâlnie ciliată (denumită nefrostom ) cu cavitate a corpului. În
imediata apropiere a nefrostomului se găsește glomerulul, care poate fi definit ca un ghem de
capilare cu rol în transportul produșilor de excreție. Tuburile ur inare , așezate perechi, se
deschid pe fiecare parte a corpului într -un canal longitudinal numit canalul lui Wolff, acesta se
deschide în cl oacă. Pronefrosul nu are o dezvoltare morfologică și fiziologică unitară la toate
clasele de vertebrate (Dodd și Davi dson, 2016).
Rinichiul de tip pronefros este primul rinichi care se formează în timpul embriogenezei.
La vertebratele cu stadiu larvar liber înotător, inclusiv amfibieni și teleosteeni, pronefrosul este
rinichiul funcțional în viața larvară timpurie (Drumm ond și Davidson, 2010).
Pronefrosul este funcțional în cursul vieții la câteva genuri de pești, iar la majoritatea
vertebratelor pronefrosul degenerează și va fi înlocuit de mezonefros (Reimschuessel, 2001;
Drummond și Davidson 2010 ).
În general , pronefrosul la pești este format din doi nefroni fuzionați rostral, pe linia
mediană care împart un singur glomerul renal (Fig. 2) . Nefronii prezintă o regiune inițială
scurtă numită gât, care se continuă în cazul fiecărui nefron cu un segment proximal co ntort, un
segment proximal drept, un segment distal timpuriu și un segment distal târziu care se deschide
într-un canal pronefrotic comun pentru cei doi nefroni ( Davidson, 2014 ; Dodd și Davidson ,
2016 ).
Pentru studiul structurii pronefrosului peștilor , un model important s -a dovedit a fi Danio
rerio -peștele zebră (Gerlach și Wingert , 2013; Cheng și Wingert , 2014) .
Deși are o structură simplă, glomerulul vascular este alcătuit din celule tipice rinichilor
vertebratelor superioare, inclusiv celule endotelial e fenestrate, podocite și celule epiteliale
tubulare polarizate (Dodd și Davidson, 2016), el prezentând o organizare structurală comună
în cadrul diferitelor grupuri taxonomice de vertebrate și în cadru l diferitelor tipuri de rinichi ,
dar este adaptat la d iferitele cerințe corelate cu anumite momente ale dezvoltării (Tytler, 1988).
Celulel e epiteliale ce intră în alcătuirea nefronului prezintă o polaritate apical -bazală și o serie

5
de caracteristici asociate cu acest tip celular polarizat, comune în seria ve rtebratelor ( Gerlach
și Wingert , 2013).

Fig. 2. Reprezentarea schematică a segmentelor pronefrosului la Danio rerio (Adaptată
după Cheng și Wingert, 2014).

Structural, glomerulul de la Oryazis latipes poate fi împărțit, după unii autori în 2 re giuni:
o regiune vasculară și o regiune epitelială. Regiunea vasculară este considerată structura de
bază a glomerulului și este alcătuită dintr -o rețea de capilar e și mezangiu. Regiunea vasculară
este înconjurată de regiunea epitelială, care este alcătuit ă din podocite și membrana bazală
glomerulară. Podocitele sunt celule înalt specializate pentru filtrarea glomerulară, fiind
alcătuite din 3 componente: corpu l celular, procesele primare ( care leagă corpul celular de
pedicele) și pedicelele. Podocitele a deră la membrana bazală glome rulară prin numeroase
pedicele. Spațiul dintre pedicelele adiacente este acoperit de o me mbrană subțire numită
diafragmă . Corpul celular al podocitelor este separat de membrana bazală glomerulară printr –
un spațiu subpodocitar ( Ichimura și colab., 2012). Podocit ele trebuie să stabilească și să
mențină legături cu membrana bazală glomerulară și celulele învecinate pentru menținerea
integrității glomerulului. Pentru a realiza această sarcină, ele se bazează pe un citos chelet de
actină, care s -a dovedit a fi suportul mecanic pentru aderarea lor la membrana bazală
glomerulară. Se pare că această arhitectură specializată are o deosebită importanță asupra
funcției podocitelor ( Gerlach și Wingert , 2013).
Glomerulul începe să funcționeze la 48 ore după fertilizare la specia Danio rerio , însă în
acest stadiu de dezvoltare filtrarea glomerulară încă nu se realizează la o rată maximă,
permițând dextranilor cu masă moleculară mare să treacă în segmentul proximal. Maturarea
completă a glomerulu lui, apreciată printr -o selectivitate ridicată î n cadrul procesului de filtrare,
se poate obser va la 4 zile de la fertilizare (Drummond și Davidson , 2010). Filtrarea glomerulară

6
a fost pusă în evidență prin injectarea în sistemul circulator al unui embrion a moleculelor de
dextran cuplate cu fluorocromi , iar apoi s -a urmărit dacă dextranul fluorescent poate sau nu să
fie vizualizat în lumenul nefr onului și în celulele epiteliale ale tubului proximal . Embrionii
injectați cu dextran între 33 și 36 ore după f ertilizare nu au prezentat fluorescență în lumen, în
timp ce embrionii de 48 ore au prezenta t atât fluorescență în lumenul tubului renal , cât și
vezicule fluorescente în celulele epiteliale . Odată ce a părăsit glomerulul, filtratul este propulsat
de-a lung ul tubilor renali prin intermediul cililor. Activitatea cililor este esențială, diferitele
defecte în formarea sau funcția cililor conduc la formare de chisturi renale și astfel la
perturbarea activității rinichiu lui (Gerlach și Wingert, 2013).
Analiza com parativă a glomerulului renal al pronefrosului de la Danio rerio și Oryzias
latipes a demonstrat existența unor diferențe de organizare (Fig. 3 ). S-a observat că la Oryzias
latipes , glomerulii pereche rămân separați printr -o masă mezangială interglomerula ră, care
ocupă spațiul dintre cei 2 glo meruli și aorta dorsală , în timp ce la Danio rerio la 2 zile după
fertilizare , primordiile celor doi glomeruli fuzionează pe linia mediană cu capilarele
glomerulare. Este cu noscut faptul că la teleosteeni , inclusiv Oryzias latipes și Danio rerio ,
glomerulul pronef rosului este înconjurat de epiteliul parietal al capsulei Bowman pentru a
forma corpusculul renal, care este conectat la tubii pronefrici, cum se observă și în cazul
glomerulilor prezenți în mezonefros și meta nefros ( Ichimura și colab., 2012).
Pronefrosul la stadiul juvenil de Salmo trutta este alcătuit dintr -un corpuscul r enal ovoid
mare și o pereche de tubuli renali (Tytler, 1988). Corpuscul ul este menținut pentru 11 luni ,
după care glomerulul regresează. Arterele glomerulare vin direct din aorta dorsală. Spațiul
interstițial este st răbătut de vas e de sânge care iau naștere din vena cardinală ant erioară. La
acestă specie au fost caracterizate histologic și ultrastructural două regiuni distincte ale
sistemulu i tubular pronefric: o regiune scurtă, numită gât în care celulele fac tranziția de la
scvamoase la cubic e, tipic e segment ului proximal și o regiune contort ă compus ă din celule
asemănătoare cu ale segmentului conto rt proximal al opistonefrosului, care pre zintă bordură
în perie, vezicule apicale variabile ca d imensiune și număr și lizozomi (Tytler, 1988).
Opistonefrosul este de fapt, rinichiul posterior definitiv al tuturor peștilor, fiind reprezentat de
mezonefros sau chiar și metanefros în cazul vertebrat elor amniote (Hickman și Trump, 1969).
Corpusculul renal este mult mai voluminos ca cel de la adult. La alevinu l de 9 săptămâni, spre
exemplu, capsula Bowman are o dimensiune de 150 µm lărgime și 300 µm lungime, ceea ce
reprezintă de două ori lungimea de la adult. De la ecloziune până la 11 săptămâni, glomerulul
aproape ump le capsula Bowman și prim ește sânge direct din artera aortă. La capătul anterior
dar și la cel posterior al corpuscului renal există artera glomerulară. Artera posterioară se

7
formează în apropierea originii arterei mezenterice anterioare, care pătrunde prin regiunea
posterioară a pronefrosului în drum spre intestin. Glomerulul regresează după 11 săptămâni,
fiind rudimentar la 7 luni ( Tytler , 1988).

Fig. 3. Reprezentarea schematică a mor fogenezei glomerulului vascular din pronefrosul de
Danio rerio și Oryzias latipes. Glomerulul la Oryzias latipes la 3 zile post fertilizare (zpf)
(A1), 4 zpf (A2), 4.5 zpf (A3), 5 zpf (A4), 6 zpf (A5). Glomerulul la Danio rerio 34 ore post
fertilizare (opf ) (B1), 40 opf (B2), 2 zpf (B3), 3 zpf (B4),4 zpf (B5). Componentele
individuale ale glomerulului pronefric sunt indicate în albastru (primordia tubular ă și tubii
pronefrici), în verde (podocitele), în roșu (capilarele glomerulare), în maro (celulele
mezan giale intra și interglomerulare) și în negru (matrixul mezangial interglomerular) .
(Adaptată după Ichimura și colab., 2012) .

La Oncorhynchus gorbuscha , cei doi glomeruli, drept și stâng, fuzionează și formează
un singur glomerul median, care se extinde pe toată lungimea camerei pronefrice. În cursul
dezvoltării, are loc creșterea în dimensiuni a camerei pronefrice și a glomerulului până la un
maximum al lungimii de 400 µm, apoi are loc creșterea în diametru a camerei pronefrice și a
glomerulului până la un maxim de 170 µm. S -a constat însă o reducere a lungimii glomerulului

8
până la 340 µm atunci când s -a studiat cel mai mare exemplar de Oncorhynchus gorbuscha
care avea 125 mm și vârsta de 1 an (Ford și Newstead, 1958).
Caracteristicile funcționale și dezvol tarea glomerulului vascular au fost examinate la mai
multe specii de teleosteeni (Tabelul 1). Unele dintre aceste specii prezintă un singur glomerul,
format prin fuziunea a doi glomeruli inițiali, ca Danio rerio (tipul fuzionat). Acest tip mai este
întâlni t și la Salmo trutta, Osteochilus haseltii, Cirrhina mrigala, Chanos chanos, etc. Alte
specii, ca Oryzias latipes , au doi glomeruli care rămân separați unul de celălalt (tipul separat).
Tipul separat mai este întâlnit și la specii ale supraordinului Elopo morpha ( Megalops
cyprinoides, Anguilla Anguilla), care este considerat cel mai primitiv grup de pești teleosteeni,
dar și la specii ale supraordinului din care face parte și Oryzias latipes, cum ar fi Scophthalmus
maximus. Prin urmare, se crede că tipul se parat de glomerul este forma originală la teleosteeni,
iar forma fuzionată este o formă specializată la anumiți taxoni (Ichimura și colab., 2012).
Regiunea denumită gât leagă glomerulul de fiecare nefron (Davidson și Wingert, 2008)
și este alcătuită din ce lule epiteliale cubice și celule ciliate dispuse printre celulele epiteliale
(Dodd și Davidson, 2016).
Cilii sunt organe vitale pentru celulele renale, deoarece ei sunt implicați în transportul
fluidului (Gerlach și Wingert, 2013). Regiunea respectivă nu apare și la mamifere, însă a fost
observată și la alte specii de pești, considerându -se că are rol în propulsarea filtratului din
glomerul în tubul proximal, iar unele studii susțin ideea că celulele ce alcătuiesc această regiune
ar fi înrudite, sau ar avea un progenitor comun cu podocitele (Dodd și Davidson, 2016).
La Salmo trutta, regiunea gât cuprinde 4 -5 celule și marchează trecerea de la epiteliul scvamos
al capsulei Bowman la epiteliul cubic tipic segmentului proximal. Plasmalema celulelor din
această regiune este netedă, fără bordură în perie. Nucleii epiteliului sunt alungiți. Începutul
tubului proximal este marcat de o creastă forma tă dintr -un strat dublu de celule. Unele din
aceste celule prezintă cili lungi, care proemină în lumenul regiunii conto rte a segmentului
proximal . Între creastă și regiunea contort ă există o porțiune scurtă ale cărei componente
celulare se schimbă gradat, de la un epiteliu cilindric nediferențiat la celule care au fost descrise
drept celule ale segmentului proximal contort la nefronii peștilor adulți. Regiunea gât se
păstrează și în nefronii adulților de Salmo trutta (Tytler, 1988).

9
Tabel 1. Tipuri morfologice de glomeru li pronefrotici la teleosteeni.

Denumire științifică Ordin Familie
Tipul separat
Oryzias lati pes Beloniformes Adrianichthydae
Scophthalmus maximus Pleuronectiformes Scophthalmidae
Megalops cyprinoides Elopiformes Megalopidae
Anguilla anguilla Anguilliformes Anguillidae
Tipul fuzionat
Danio rerio Cypriniformes Cyprinidae
Salmo tru tta Salmoniformes Salmonidae
Cirrhina mrigala Cypriniformes Cyprinidae
Chanos chanos Gonorynchiformes Chanidae
(După Ichimura și colab., 2012).

La Oncorhynchus gorbuscha, regiunea gât prezintă un epiteliu cilindric, celulele fiind
comprimate lateral. S -a observat că această regiune se închide treptat, datorită migrării
celulelor, închiderea fiind încheiată la ma joritatea specimenelor de 50 mm ( Ford și Newstead ,
1958), iar la Clupea Harengus s-a afirmat că regiunea gât face legătura dintre capsula Bowman
și ductul arhinefric (Holstvoogd, 1958).
Funcția segmentului proximal drept nu este foarte bine cunoscută însă, s-a observat
că acest segment exprimă specific transportori de suflat și calciu, aspect care a condus la
presupunerea că poate fi implicat în asimilarea acestor tipuri de ioni (Drummond și Davidson,
2010).

10
Segmentul contort proximal este la Danio rerio, similar din punct de vedere structural
cu segmentul proximal ce intră în alcătuirea rinichiului mamiferelor, fiind alcătuit din celule
epiteliale cu microvili care formează bordura în perie. Bordura în perie a fost descrisă și în
cazul segmentului contort proximal de la specia Oncorhynchus gorbuscha (Ford și Newstead,
1958) și Clupea haregus (Holstvoogd, 1958). O caracteristică conservată a acestui segment
este prezența unei endocitoze intense, utilă pentru recuperarea celei mai mari părți a soluților
cu m asă moleculară mică. Polaritatea apicală este esențială pentru acest segment, implicată în
endocitoză. La Danio rerio segmentul contort proximal exprimă receptori pentru megalină și
cubalină și preia dextrani fluorescenți mici care trec prin glomerul. El e xprimă, de asemenea
pompă de ioni clorură/bicarbonat AE2, co -transportorul de sodiu NBC1 și pompa de ioni
sodiu/hidrogen NHE (Drummond și Davidson, 2010). S -a demonstrat că în genomul acestei
specii se găsesc două gene înrudite, ae2.1 și ae2.2 care codific ă pentru pompa de ioni clorură/
bicarbonat AE2, care se pare că are rol în menținerea pH -ului intracelular în limite optime, a
concentrației ionilor de Cl-, roluri specifice pentru majoritatea celulelor ( Shmukler și colab .,
2008).
Segmentul proximal la alt e vertebrate joacă un rol major în reabsorbția celei mai mari
părți a sărurilor, zaharurilor, proteinelor mici care trec prin bariera de filtrare glomerulară (Vize
și colab., 2003).
Despre segmentul distal timpuriu , se afirmă că exprimă un transportor de Na-K-Cl,
care la mamifere este exprimat doar în porțiunea brațului ascendent gros a segmentului distal.
Acest segment este cunoscut și ca "segment de diluare" deoarece reduce osmolaritatea
filtratului urinar (Drummond și Davidson, 2010).
La mamifere, segmentul distal contort este alcătuit din două tipuri celulare, și anume:
celule principale (care sunt implicate în tranportul ionilor de Na+, reabsorbția apei și secreția
ionilor de K+) și celule intrecalare (implicate în menținerea echilibrului acid -bază). Nu există
însă dovezi ale existenței acestor două tipuri celulare la nivelul segmentului distal târziu la
Danio rerio. Se crede însă că segmentul distal târziu la peștele zebră ar putea avea o funcție de
transportor al soluților, care ar fi asemănătoare c u a segmentul contort distal al mamiferelor
(Naylor și Davidson, 2016). Segmentul distal târziu la Danio rerio exprimă un co -transportor
de NaCl, care la mamifere este exprimat tot în segmentul distal contort (Drummond și
Davidson, 2010).
La Clupea Harengu s, acest segment este caracterizat de celule cu nuclei bazali ce
alternează cu celule ce prezintă nuclei situați central (Holstvoogd, 1958).

11
La nivelul nefronilor s -a raportat existența corpusculilor Stannius , agregate bilaterale
de celule care iau naștere la limita dintre segmentele distal timpuriu și distal târziu, ca mai
târziu să fie situați în partea dorsala a acestei regiuni (Gerlach și Wingert, 2013; Cheng și
Wingert, 2014). Corpusculii Stannius sunt considerați glande endocrine specifice
teleosteen ilor, având rol important în reglarea concentrațiilor de calciu și fosfat. Precursorii
corpusculului Stannius sunt inițial detectați ca celule împrăștiate la 24 de ore după fertilizare
care exprimă gena stanniocalcină 1 (Cheng și Wingert, 2014). Este încă neclar dacă celulele
care alcătuiesc corpusculul Stannius corespund unui tip particular de celule renale la alte
vertebrate. Se consideră că aceste celule ar fi înrudite din punct de vedere evolutiv cu macula
densa prezentă la mamifere, care are rol în reg larea presiunii sângelui (Gerlach și Wingert,
2013).
La specia Oncorhynchus gorbuscha , s-a observat existența a trei perechi rudimentare de
corpusculi Stannius, ce au forma unor excrescențe bazofile în formă de semilună, cu o
dimensiune de aproximativ 7,14 mm (Ford și Newstead, 1958).
Ultima porțiune a pronefrosului este reprezentată de canalul pronefrotic . Acesta trebuie
să fie conectat cu mediul exterior pentru a realiza o eliminare adecvată a deșeurilor. Cea mai
comună deschidere care drenează intestinul și pronefrosul este reprezentată de cloacă. Canalul
pronefrotic formează cloaca pe parcursul somitogenezei târzii. Cloaca este formată din două
tipuri celulare, celule derivate din mezodermul intermediar provenite din canalul pronefrotic și
celule epiderm ale. (Gerlach și Wingert, 2013).
B. Funcțiile pronefrosului
La pești, rinichiul de tip pronefros joacă un rol vital în osmoreglare, mai ales datorită
faptului că dezvoltarea lor este externă și astfel embrionii sunt expuși presiuni mediului apos
și sărat (Wingert si colab., 2007 ; Davidson, 2014). La Danio rerio s-a observat că la
aproximativ 5 zile după fertilizare, pronefrosul este populat de celule stem hematopoietice.
Aceste celule migrează în regiunea glomerulară și mai târziu, pe parcursul vieții, vor fi găsite
în asociație cu segmentele tubilor renali, acesta fiind o caracteristică importantă a rinichiului,
în comparație cu vertebratele superioare, exemplu mamiferele, la care locul de depozitare al
celulelor stem hematopoietice și sediul hematopoiezei este măduva osoasă (Gerlach și Wingert,
2013).

12
II.2. Mezonefrosul
A. Structură
Mezonefrosul este rinichiul funcțional la adulții teleosteenilor, la amfibieni
(Reimschuessel, 2001) și este de asemenea funcțional la embrionii mamiferelor (Marra și
Wingert, 2016 ).
La anamniote (ciclostomi, pești și amfibieni) termenul de opistonefros se referă la
mezonefros sau metanefros. De asemenea, canalul renal la anamniote este cunoscut sub
denumirea de canal arhinefrotic (Kunz, 2004).
Mezonefrosul (rinichiul primar sa u intermediar) reprezintă un stadiu mai evoluat al
organului de excreție față de pronefros. Un astfel de rinichi întâlnim funcțional la ciclostomi,
pești, amfibieni adulți, iar la amniote (reptile, păsări, mamifere), mezonefrosul funcționează
numai în stad iul embrionar, fiind un stadiu de tranziție, la fel ca pronefrosul (Dodd și Davidson,
2016).
Fomarea mezonefrosului la pești nu a fost foarte intens studiată, însă câteva studii pe
Thynnichthys sandkhol , Oryzias latipes și Danio rerio sugerează că dezvolt area
mezonefrosului se realizează pe baza tubilor pronefrotici existenți (Davidson, 2011), în etape
distincte care sunt comparabile cu nefrogeneza la mamifere (Sander și Davidson, 2014).
Formarea mezonefrosului la pești (Fig. 4) începe după 2 -3 săptămâni de la fertilizare,
când larvele au 4 -5 mm în lungime. Din momentul în care larvele au ajuns la această
dimensiune, în vârful tubilor pronefrotici se formează agregate celulare mici, alcătuite din până
la 30 celule mezenchimale (Sander și Davidson, 2014). A ceste celule pot fi ușor distinse în
secțiuni datorită caracterului lor puternic bazofil și, deși originea lor nu este cunsocută, se
consideră că derivă din mezodermul intermediar (Davidson, 2011). Aceste agregate cresc în
dimensiuni, suferă epitelizare și capătă o formă veziculară. Ulterior, aceste vezicule se alungesc
și devin tubi în curs de formare, a căror porțiune distală fuzionează cu tubii pronefrotici care
stau la bază pentru a forma nefronul primar (Davidson, 2011; Dodd și Davidson, 2016). Mai
târziu în dezvoltare, noii nefroni se formează de asemenea în porțiunile distale ale acestor
nefroni primari, dând naștere astfel la nefroni secundari.
Datorită faptului că acest proces se repetă, rinichiul adopta o organizare înalt ramificată
(Fig. 5), acest a crescând pentru a cuprinde sute de nefroni care se ramfică distal (Sander și
Davidson, 2014).
Pentru o mai bună înțelegere a formării mezonefrosului, s -au analizat secți uni histologice
ale unor larve de Danio rerio , în stadiul de 5 mm (aproximativ 11 zi le după

13

Fig. 4. Secțiuni histologice care ilustrează cele trei etape (formarea de agregate bazofile,
apariția veziculei renale și nefronul în formare) ale morfogenezei mezonefrosului la Danio
rerio ,. Colorație hematoxilină -eozină (Adaptată după Davidson , 2011).

fertilizare), atunci când s -a raportat formarea primului nefron mezonefric. S -a constatat
existe nța unui singur agregat bazofil de celule, deasupra tubului pronefric, în apropierea
extremității caudale a veziculei urinare, acolo unde se va forma primul nefron mezonefric.
Aceste celule se colorează cu albastru metilen și sunt asemănătoare cu agregatele bazofile
observate la rinichiul adulțiilor de Carassius auratus .
La aproximativ 13 zile de la fertilizare, în stadiul de 5, 5 mm, se poate observa un tubul
bazofilic rudimentar în regiunea veziculei urinare și se consideră că acesta a luat naștere din
acel agregat bazofil ce a fost observant în stadiul de 5 mm. Acest nefron în curs de dezvoltare
nu este încă matur. Pentru a determina când nefronii mezo nefroși devin functionali, s -a injectat
un dextran fluorescet de 40 kDa (dex -FITC) în c irculația larvei. Nefronii inte grați în sisteml
circulator vor filtra dex -FITC și vor acumula dextranul în segmentele proximale. Spre
deosebire de larvele de 5, 5 mm, la cele aflate în stadiul de 6 mm se poate observa absorbția și
acumularea dextranului. Aceste observații au condus la concluzia că primul nefron mezonefric
functional se forme ază între stadiile larvare de 5, 5-6 mm, cel mai probabil din agregatul bazofil
care ia naștere deasupra tubilor pronefici în stadiul de 5 mm.
Pentru a investiga creșterea agregatelor bazofile, considerate esențiale pentru dezvolatrea
mezonefrosului, s -a injecta t analogul timidinei, respectiv bromodeoxiurindină (BrdU) în
circulația larv ei. S -au realizat experimente care constau în colorarea alternativă cu
hematoxilină și eozină, respectiv prin tehnici imunohistochimice cu anticorpi anti -BrdU, a unor
secțiuni sagitale seriale, observându -se că în agregatele bazofile existau foarte multe

14

Fig. 5. Reprezentare grafică a nefronilor de tip pronefros și mezonefros. Nefronii pronefrici
sunt divizați în glomerul, gât, tub contort proximal, tub drept proximal, segment distal
timpuriu și segment distal târziu. Nefronii mezonefrici fuzionează la n ivelul segmentelor
distal timpuriu și distal târziu ale pronefrosului, dobândind un model de segmentare similar
cu al nefronilor pronefrici. Toți nefronii sunt drenați către un segment comun, duct colector
sau ureter în cloacă (Adaptată după Diep și colab ., 2015).

celule BrdU+. În plus, s -a concluzionat că aceste agregate invadează tubul pronefric, făcând
parte dintr -un proces morfologic ce stă la baza fuziunii nefronului nou -format cu tubul
pronefric.
Atunci când s -a examinat existența agregatelor bazo file la peștii adulți, deoarece
formarea nefronilor mezonefrici continuă și în perioada adultă, s -a observat că aces tea sunt
relativ rare pe secțiunile de țesut al unor pești sănătoși, în contrast cu secțiunile provenite de la
pești injectați cu gentamicin ă, la care agregatele au fost cu ușurință observate.
După formarea primului nefron mezonefric, iau naștere alți nefroni, care se situează de –
a lungul tubilor pronefrici, concentându -se mai mult în partea caudală, dar și rostral, în regiunea
glomerulului p ronefric. Pentru o caracterizare mai amănunțită a formării mezonefrosului, s -a
realizat analiza expresiei genei caderina 17 (cdh17 ) (Diep și colab., 2015) . Gena cdh17 ,
denumită și caderina, este exprimată în mod normal la nivelul epiteliului intestinal al
intestinului subțire și gros, la nivelul ductelor pancreatice, iar în condiții patologice, în cazul
unor tumori specifice sistemului digestiv, existând ipoteza că aceasta s -ar exprima și în cazul
unor tumori la nivelul renal ( Yakirevich și colab., 2015). În stadiul de 5 mm, tran scripții acestei
gene marchează tubii pronefrici, nu agreg atele bazofile. În stadiul de 5,2 -5,5 mm, exprimarea

15
lui cd17 este detectată în primul nefron mezonefric, cel mai probabil în celulele segmentelor
tubulare, nu în cele al e glo merulului. În stadiul de 6, 5 mm, transcripții săi sunt localizați în
diverși nefroni nou -formați, preponderent în partea caudală, însă în acest stadiu, nefronii nou –
formați pot fi observați și în regiunea din jurul glomerulului pronefric. Până în stadiul d e 8 mm,
se pot observa mai mulți nefroni nou -formați, atât în partea caudală, cât și în partea rostrală.
Când larva ajunge la dimensiunea de 9 mm, la aproximativ 30 zile după fertilizare,
mezonefrosul seamănă deja cu un mezonefros matur, alcătuit din cap, trunchi și coadă. Noii
nefroni iau naș tere din agregate bazofile wt1b+, observându -se transcripți wt1b în larve de 5,2 –
5,5 mm în 1 -2 agregate de celule în vârful tubilor pronefrici (Diep și colab., 2015).
La specia Danio rerio , s-a demonstrat existența a doua gene paraloage: wt1a respectiv wt1b ,
cu model de exprimare similar, dar nu identic. Ambele gene sunt prezintă 9 exoni, între ele
existând o similaritate de secvență de 70%. Gena wt1b este exprimată în stadiile târzii ale
nefrogenezei, concluzie la car e s-a ajuns în urma unor experimente ce au relevat că lipsa
acesteia nu afectează formarea structurilor glomerulare inițiale (Perner și colab., 2007). Când
larva are dimensiunea de 8 mm, numărul agregatelor wt1b+ crește la 3 -4 în viitoarea regiune
cap și 2 -3 în regiunile coadă și trunchi. Modele similare de exprimare au putut fi observate și
în cazul altor factori transcripționali renali, Pax2a și Lhx1a (Diep și colab., 2015) . Gena pax2a
este implicată în embriogeneza celulelor pronefrosului, supraexprimare a acestei gene duce la
apariția de canale colectoare ectopice (Bedell și colab., 2012). Gena lh1a joacă, de asemenea,
un rol important în controlul dezvoltării mai multor organe, prinre care și rinichiului, fiind un
marker al celulelor progenitoare ale ace stuia (Swanhart și colab., 2010). Nu s -au observat
difer ențe regionale în expresia wt1b+, pax2a sau lhx1a în agregatele de celule care s -au format
în cele trei regiuni ale mezonefrosului (cap, trunchi, coadă), ceea ce sugerează ca procesul de
nefrogeneză e ste comun de -a lungul rinichiului. Transcripții W t1b+ au mai fost găsiți și în
celulele glomerululu i, cel mai probabil în podocite (Diep și colab., 2015).
S-a demonstrat că densitatea nefronilor de -a lungul segmentelor mezonefrosului este
conservată între adulții peștilor zebră, în timp ce densitatea nefronilor de -a lungul
mezonefrosului este variabilă în cazul unui singur individ. În funcție de densitatea nefronilor,
mesonefrosul peștelui zebră a fost împărțit în 4 regiuni: regiune anterioară densă, regi une
mediană laxă, regiune mediană densă și regiune posterioară laxă. Densitatea segmentelor
nefronului sugerează faptul că există un anumit nivel de control asupra aranjamentului spațial
al nefronilor în curs de dezvoltare, însă această afirmație nu este încă susținută dovezi
moleculare (Gerlach și Wingert, 2013).

16
Spre deosebire de mezonefrosul de la mamifere, la care nefrogeneza încetează în jurul
momentului nașterii, mezonefrosul peștilor continuă să adauge noi nefroni pe măsură ce masa
corpului crește (Davidson, 2011).
Numărul maxim de nefroni mezonefrici este în strânsă legătură cu dimensiunea corpului
vetrebratului respectiv și corelată cu nevoia de a îmbunătăți funcția rinichiului pe măsură ce
masa corporală și volumul de fluid crește. La mamifere, a cest aspect este rezolvat prin
îmbunătățirea performanței nefronilor prin creșterea lor în dimensiune și prin creșterea ratei de
filtrare glomerulară (Davidson, 2014).
Modificarea dimensiunii nefronilor (diametru și lungime) nu a fost studiată la pești, de
aceea este neclar dacă aceste procese au sau nu un rol în creșterea performanței nefronilor, așa
cum se întâmpla în cazul metanefrosului (Davidson, 2011). Nefronul de tip mezonefros are un
model de organizare similar cu cel al pronefrosului, cuprinzând do uă segmente proximale și
două segmente distale (Gerlach și Wingert, 2013).
Mezonefrosul adult este situat în partea dorsală a cavității corpului și este divizat în trei regiuni
distincte (Fig. 6).

Fig. 6. Structura mezonefrosului la Danio rerio . Mezonef rosul este localizat de -a
lungul peretelui dorsal al cavității abdominale. Nefronii pot fi observați în cele trei regiuni ale
rinichiului: cranială, troncală și caudală, la pești transgenici care exprimă proteina
fluorescentă verde GPF sub controlul promot orului cadherin -17 (După Sander și Davidson,
2014).

Din partea anterioară către cea posterioară au fost descrise: o regiune cranială situată
rostral, urmată de o regiune denumită troncală și o regiune caudală (Dodd și Davidson, 2016;
Gerlach și Wingert, 2 013). Mezonefrosul adult, la fel ca și pronefrosul, este de asemenea

17
asociat cu o glandă interrenală, pentru fiecare lob, stâng și drept, aceasta fiind poziționată
ventral (Gerlach și Wingert, 2013).
La teleosteeni , regiunea anterioar ă a mezonefrosului (r inichiul cranial) funcționează adesea ca
țesut hematopoietic, ce conține și celule cromafine și puțini nefroni. Rinichiul posterior conține
mai mulți nefroni și țesut interstițial hematopoietic redus.
Există variații evidente între speciile de teleosteeni de apă dulce și cele marine, datorită
presiunilor mediului extern (Tabelul 2).
S-au descris patru tipuri de nefroni la peștii teleosteeni (Fig. 7) : nefronul glomerular la
peștii de apă dulce, nefronul glomerular la peștii marini, nefronul aglomerular la peștii marini
și nefronul peștilor eurihalini (Dantzler , 2016).

Nefronul glomerular la peștii de apă dulce
Salinitatea reprezintă un factor de mediu critic pentru toate organismele acvatice, inclusiv
peștii. Speciile de pești stenohalini sunt acele specii care populează medii acvatice cu o
salinitate stabilă, deoarece sunt caracterizate de o toleranță scăzută la salinitate (Kültz, 2015).
Teleosteenii de apă dulce stenohalini, care își mențin osmolaritatea fluidelor corpului mai
ridicată decât cea a mediulu i, au nefroni care diferă de cei ai tel eosteenilor stenohalini marini
(Dantzler, 2016). Printre peștii stenohalini de apă dulce se află specii ale genului Culea , cum
ar fi Culea inconstans (Kültz, 2015). Nefronii speciilor glomerulare tipice conțin, în plu s față
de glomerul, un segment gât ciliat, un tub proximal inițial cu o bordură în perie proeminentă,
un al doilea segment proximal cu o bordură în perie mai puțin dezvoltată, un segment
intermediar, un segment distal care se golește în canalul colector. R inichii majorității speciilor
de teleosteeni stenohalini de apă dulce, tind să aibă mai mulți nefroni cu glomeruli mai mari
comparativ cu cei ai speciilor de teleosteeni stenohaloni marini (Dantzler, 2016). Puținele
specii de teleosteeni aglomerulari de ap ă dulce (aparent specii care au trăit în mediul marin iar
apoi au trecut în apă dulce ) pare că au nefroni în întregime asemănători cu cei ai speciilor
aglomerulare marine (Dantzler, 2016) . Din categoria speciilor glomerulare de apă dulce, putem
aminti: Carassius auratus , Silurus asotus , Cyprinus carpio , Lepomis macrochiru (Hickman și
Trump, 1969).

18
Tabel 2. Structura nefronului la peștii teleosteeni
Glomerul Gât Segment
proximal
contort Segment
proximal
drept Segment
intermediar Segment
distal Canal
colector Familie și specii
Pești de apă dulce
+ + + + +/?1 + + Cyprinidae :
Carassius auratus,
Danio
malabaricus,
Lepomis
marochirus
Cyprinus carpio,
Hemibarbus
barbus
+ + + + 0 + + Siluridae :
Silurus asotus,
Platypoecillus
maculatus
Pești marini
+ + + + + + + Plotosidae :
Plotosus
anguillaris,
Congridae :
Anago anago
+ + + + + 0 + Ophichthyidae :
Ophisurus
macrorynchus;
Muraenidae :
Muraena helena;
Gadidae:
Merluccius
vulgaris
(După Hickman și Trump, 1969)

Nefronul glo merular la peștii marini
Elasmobranhii marini, se adaptează osmolarității mediului în care trăiesc, osmolaritatea
fluidelor extracelulare este determinată de concentrația ureei și a oxidului de trimetilamină.
Nefronii acestor pești sunt alcătuiți din toate componentele standard ale vertebratelor:
glomerul, urmat de regiunea gât, tub proximal, segment intermediar, tub distal, tub colector

1 La unele specii ale familiei Cyprinidae s -a raportat existența segmentului intermediar, pe
când la alte specii ale aceleiași familii ( Cyprinus carpio, Hemibarbus barbus ) nu s -au găs it
dovezi concludente ale existenței acestui segment.

19

Fig. 7 . Reprezentarea schematic ă a structurii nefronului la peștii teleosteeni (Adaptată după
Dantzler, 2016 ).

și canalul colector , dar modul de aranjare a nefronilor este foarte complex, poate cel mai
complex din seria vertebratelor. Se pare că rinichiul elasmobranhilor marini nu poate fi împărțit
într-o zonă corticală și una medulară, ca rinichiul mamiferelor. Cele 5 segmente ale nefronului
și capilarele peritubulare aranjate sunt încapsulate într -o teacă peritubulară, care se pare că ar
fi implicată în diferite procese importante pentru retenția ureei de către rinichi.
Teleosteenii marini stenohalini mențin osmolarit atea fluidelor corpului cu mult sub cea
a mediului. Rinichiul lor este împărțit în rinichi cranial, aici existând țesut limfoid,
hematopoietic și glandular, și rinichiul posterior, care conține țesut renal, dar la majoritatea
speciilor cele două sunt parți al sau complet fuzionate, neputând fi distinse la o examinare
externă. Nefronii acestor teleosteeni marini stenohalini conțin, pe lângă glomerul, regiunea gât,

20
două sau trei segmente proximale, care constituie cea mai mare parte a nefronului, uneori un
segment intermediar între primul și al doilea segment proximal, și un canal colector.
Așa cum ar fi de așteptat la animalele marine care nu trebuie să dilueze urina pentru a
excreta apa în exces, tubul distal este absent la majoritatea speciilor, iar la speci ile la care este
prezent poate indica un grad de eurihalinitate. Chiar dacă întregul tub proximal prezintă
bordura în perie, doar primul segment este similar din punct de vedere ultrastructural cu tubul
contort proximal al mamiferelor (Dantzler, 2016) .

Nefronul aglomerular la peștii marini
Așa cum ar fi adecvat pentru peștii marini care trebuie să minimizeze volumul urinei,
aproximativ treizeci de specii sunt lipsite de glomerul. Acești nefroni aglomerulari tipici au
doar un segment proximal cu bordură în perie, similar cu cel de -al doilea segment proximal al
nefronilor de la teleosteenii glomerulari și un duct colector (Dantzler, 2016) .
Specii reprezentative ale acestei categorii sunt Gastrostomus bairdii , Hippocampus
coronatus , Syngnathus schlegeli (Hick man și Trump, 1969).

Nefronul elasmobranhilor eurihalini
Speciile eurihaline sunt acele specii care populează medii caracterizate de o salinitate
variabilă. Peștii eurihalini au mecanisme care îi ajută în controlarea schimbărilor în ceea ce
privește stra tegia de osmoreglare, de la o absorbție activă a sărurilor la o secreție a acestora,
respectiv de la excreția apei la retenția ei (Kültz, 2015).
Elasmobranhii eurihalini de apă dulce, ca și elasmobranhii de apă dulce stenohalini
mențin osmolaritatea extrac elulară mai ridicată ca cea a apei, dar mai redusă ca cea a apei
marine, în principal prin reducerea concentrației ureei. Se pare că structura nefronului variază
între speciile eurihaline și cele stenohaline. De exemplu, specia eurihalină Dasyatis sabina are
o structură renală identică cu cea descrisă la elasmobranhii marini. La rinichiul speciei
stenohaline de apă dulce Potamotrygon sp ., se observă că zona dorso -laterală este înlocuită de
o zonă complexă periferică alcătuită din glomeruli și lipsită de tec ile peritubulare care
înconjoară segmentele tubulare. Este lipsit de asemenea de ansele III și IV prezente la rinichiul
elasmobranhilor marini. S -a afirmat că rinichiul altor specii stenohaline de apă dulce ar putea
avea această structură modificată și că absența anselor III și IV este datorată in capacității
nefronilor acestor specii de a reabsorbi ureea filtrată (Dantzler, 2016) .

21
Nefronul teleosteenilor eurihalini
Despre speciile de teleosteeni eurihalini se cunoaște că își pot menține osmolaritatea
fluidelor corpului mai ridicată ca cea a mediului când sunt adaptați la apă dulce și sub cea a
mediului în cazul celor adaptați la med iul marin, au nefroni similari cu cei întâlniți la
teleosteenii stenohalini de apă dulce. Ei prezintă un glomerul, de cele ma i multe ori mai mic și
mai puți vascularizat decât cel întâlnit la speciile stenohaline de apă dulce, două segmente
proximale , un segment intermediar scurt, un segment distal și un canal colector care se golește
în sistemul colector. Unele specii eurihali ne sunt aglomerulare, spre exemplu Opsanus tau . La
multe specii eurihaline, numărul de glomeruli poate varia între speciil e de apă dulce și cele
marine ( Dantzler, 2016).

B. Funcțiile mezonefrosului
În legătură cu funcțiile mezonefrosului, se cunoaște că acesta asigură homeostazia
adulților ( Davidson, 2011).
La teleosteenii marini, mezonefrosul are rolul de a excreta magneziu și sulfați,
participând la osmoreglare. La teleosteenii eurihalini, este cunoscută capacitatea lor de a putea
supraviețui și de a se adapta unor mari variații ale salinității, menținând constantă starea
fluidelor în organism, adaptându -se la medii hiperosmotice sau hipoosmotice.
În ceea ce privește filtrarea glomerulară , s-a constatat că, la teleosteenii marini, funcția
dominantă a rin ichiului este secreția de MgSO 4. Este cunoscut faptul că aceste specii au
glomeruli mai puțin dezvoltați ca speciile de apă dulce. Gradul de dezvoltare al glomerulilor
este corelat cu rata filtrării.
Funcția tubulară se bazează în principal pe excreția ele ctroliților și a apei. De asemenea,
are loc o secreție a ionilor divalenți – valorile concentrației urinei în sulfat de magneziu și uneori
în fosfat fiind mai mari ca cele ale plasmei. Este raportată și o secreție a ionului de hidrogen :
urina teleosteenil or marini este, de obicei, acidă. A fost descris și un transport tubular al
anionilor organici, ca și o excreție a produșilor finali ai azotului -amoniac, uree. Reabsorbția
tubulară a electroliților -sodiu, potasiu, clor, precum și reabsorbția glucozei (ea e ste în mod
normal absentă din urina teleosteenilor marini) sunt funcții importante ale rinichilor. La acestea
se adaugă preluarea macromoleculelor – suprafața dinspre lumen a celulelor epiteliale vine
mereu în contact cu proteinele plasmatice și alte macrom olecule (Hickman și Trump, 1969).

22
III. REGENERAREA RINICHIULUI L A PEȘTII TELEOSTEENI

Regenerarea este procesul prin care celulele lezate sau moarte sunt înlocuite, pentru a
se restabili structura și funcția țesutului din care fac parte.
Potențialul regen erativ al organelor diferă în cadrul unui organism, dar și de la o specie
la alta. Un exemplu semnificativ este rinichiul vertebratelor, organ alcătuit din nefroni, care
reglează excreția deșeurilor și echilibrul apei și sărurilor minerale din organism. De oarece
rinichiul are un rol deosebit de important în ceea ce privește osmoreglare a, este de la sine înțeles
că pe măsură ce masa corporală crește, la fel și volumul fluidelor, este necesară o îm bunătățire
a funcțiilor renale -crește numărul nefronilor și mă rimea glomerulilor odată cu greutatea
corpului. Există strategii diferite la pești și mamifere (Fig. 8) care sunt folosite pentru a crește
capacitatea rinichilor, odată cu creștere a și dezvoltarea organismului ( Davidson, 2014).
De exemplu, la om, de la naș tere la maturitate, diametrul glomerului crește de la 100 µm
la 280 µm, în timp ce lungimea tubului pro ximal crește de la 2 la 20 µm ( Davidson, 2011).
S-au realizat studii comparative la mamifere și pești în privința răspunsului regenerativ
indus de anumi te leziuni la nivel renal (Fig. 9). Regenerarea rinichiului mamiferelor a primit o
atenție considerabilă datorită potențialului de a dezvolta noi strategii terapeutice în medicina
renală. Una din caracteristicile considerabile ale rinichiului mamiferelor a dulte este abilitatea
de a se recupera după insuficiența renală acută, urmând apoptozei, prin proliferarea celulară a
țesutului intrarenal lezat ( Watanabe și colab., 2009).
Pentru a înțelege modelul de repopulare al segmentului proximal, s -au realizat
experimente folosind mai multe substanțe toxice. S -a constatat că, la câteva zile după
administrarea substanței toxice, membrana bazală este mărginită de celule svamoase,
aplatizate, bazofile. Mai târziu, ele sunt înlocuite de un epiteliu cubic, bazofil, care se va
diferenția într -un epiteliu matur .
Acest tip de reparare a fost numit regenerare renală, prin regenerare înțelegând
repopularea nefronilor existenți, la câteva zile după ce au suferit leziuni. Dacă nu se pot repara
aceste răniri, are loc apoptoza. L a mamifere, întâlnim procesul de hipertrofie renală

23

Fig. 8. Reprezentare schematică comparativă a mecanismelor de creștere a
capaci tățiii rinichilor, la mamifere ( realizată prin creșterea în dimensiuni a nefronilor existenți
și îmbunătățirea funcției ac estora ) și pești (prin creșterea numă rului nefronilor) ( Adaptată
după Davidson, 2011).

compensatorie, care se concretizează în dezvoltarea nefronilor existenți, după nefroctomie
unilaterală ( Reimschuessel, 2001).
Întelegem astfel că la mamifere, regenerar ea rinichiului se poate realiza doar prin
repopularea nefronilor deja existenți, neputându -se realiza regenerarea prin formarea de novo
a nefronilor, deoarece formarea de noi nefroni la mamifere este încheiată în stadiile embrionare
sau neonatale, ceea ce denotă o aparentă epuizare a celulelor stem în rinichii adulților. Studii
recente au arătat că la mamifere sursa de celule necesare pentru repararea leziunilor nefronilor
ar putea fi celulele din măduva osoasă sau celulele mezenchimale intrarenale care s -ar putea
dediferenția după migrarea către țesutul deteriorat, înlocuind celulele deteriorate ( Watanabe și
colab., 2009).
Spre deosebire de mamifere, la pești are loc creșterea numărulu i de nefroni ( Davidson,
2011). Rinichii peștilor au capaciatea de a ”re para” nefronii lezați, proces denumit regenerare
renală. În plus, anumite specii de pești, cum ar fi Carassius auratus , Danio rerio , Salmo trutta ,

24
specii din familia Batrachoididae , din genul Tilapia au capacitatea de a răspunde la anumite
leziuni renale p rin neogeneza de novo a nefronilor. Pentru a investiga rolul anumitor
componente ale nefronului în procesul de dezvoltare și reparare s -a apelat la obs ervarea peștilor
aglomerulari ( Reimschuessel, 2001).
Studii recente au demonstrat că procesul de neonefr ogeneză repetă modelul utilizat în
timpul organogenezei rinichilor. Peștii adaugă noi nefroni la cei deja existenți pe măsură ce
cresc ( Davidson, 2014).
Fig. 9. Reprezentarea schematică a r ăspunsul ui regenerativ în cazul rinichiului la mamifere și
pești at unci când se înregistrează pierderea nefronilor. Îndepărtarea nefronilor din cadrul
rinichiului mamiferelor duce la o creștere a capacității și o hipertrofie a nefronilor rămași. La
pești, pierderea unor nefroni este urmată de regenerarea țesutului pierdut prin intermediul
unor celule progenitoare nefrogenice (Adaptată după Davidson, 2011).

Există numeroase substanțe toxice care acționează la nivel renal, dintre care amintim:
hexaclorbutadienă, clorură mercurică, tetracloretilenă și gentamicină. Acestea au fost folosite
pentru a evidenția modelul de repopulare celula ră de -a lungul tubului proximal
(Reimschuessel, 2001).
S-a constatat că, în funcție de substanța toxică folosită, variază intervalul de timp în care
are loc regenerarea țesutului lezat, însă mod elul de bază după care are loc regenerarea

25
este similar ( Reimschuessel, 2001).
Gentamicina este un agent antibacterian aminoglicozidic care inhibă sinteza proteinelor
bacteriene. Acest medicament pr ezintă un spectru larg de activitate împotriva bacteriilor Gram
negative. Gentamicina este folosită pentru a cauza leziuni la nivel renal, prin injectarea
intraperitoneală a unei anumite doze de antibiotic. A stfel se poate observa procesul de
regenerare a rinichilor pe baza formării de novo a unor noi nefroni sau prin repopularea regiunii
respective ( Cormier și colab., 1995).
Se știe că gentamicina se leagă specific de receptorul pentru megalină al celulelor
epiteliale ale segmentelor tubulare din structura nefronului, acumularea lor la acest nivel
produce daune, care ulterior pot fi observate histologic (Hashimoto și Wakamatsu, 2011).
În cazul unor leziuni acute la nivelul rinichilor, apar an umite manifestări morfologice
(Fig.10). Inițial, celulele afectate prezintă un aspect dediferențiat, asociat cu schimbări ale
polarității celulelor specifice regiunii proximale, dar și o pierdere a bordurii în perie.
Consecutiv, are loc desprinderea celulelor, aceste celule detașate putând fi observate în lumen.
Apoi se observă regenerarea nefronilor afectați. Acest proces presupune produc erea de noi
celule epiteliale. R evenirea la funcția normală a rinichiului depinde de gradul de severitate cu
care a fost afectat acesta și se realizează, de obicei, într -o perioadă de ap roximativ 15 zile.
Studi ile realizate în ceea ce privește efectele toxice ale gentamicinei asupra speciei
Carassius auratus au relevat schimbări la nivelul segmentelor proximale ale nefronilor,
inclusiv existența unor nuclei picnotici și descuamarea epite liului caracteristic acestei regiuni.
S-a descoperit abilitatea remarcabilă de regenerare a țesutului renal la anumite specii de pești
care au fost studiate intens.
Această abilitate de regenerare a organelor și țesturilor, întâlnită la pești a fost iniția l
considerată normală. La Carassius auratus regenerarea țesutului renal implică două
mecanisme. Primul mecansim este comun cu cel al mamiferelor și implică repopularea
segmentelor afectate prin replicarea și migrarea celulelor epiteliale tubulare de -a lung ul
membranei bazale.
Al doilea mecanism nu este prezent la mamifere, fiind considerat caracteristic peștilo r.
Acesta implică neonefrogeneză , adică formarea de noi nefroni, din niște agre gate de celule
bazofile ( Augusto și colab., 1996). În mod normal, rini chii peștilor conțin agregate bazofile de
celule localizate cel mai frecvent în apropierea canalului colector ( Cormier și colab., 1995).

26

Fig. 10. Reprezentarea schematică a leziunilor de la nivelul rinichilor. A-Nefron
normal într -o secțiune transversal ă, cu celule epiteliale diferențiate, care alternează cu celule
în faza G1 a ciclului celular și celule progenitoare/celule stem. B- nefron lezat, cu resturi în
lumen. C- Nefron în timpul regenerării epiteliului ( celule mezenchimale ). Celulele situate în
spațiul interstițial dintre nefroni, pot avea un anumit impact asupra regene rării. ( Adaptată
după McCampbell și Wingert, 2014) .

Cercetând efectele expunerii la anumite doze ale aceleiași substanțe toxice –
gentamicina -s-au obținut rezultate concludente și la specia Oreochromis niloticus , care este de
asemenea capabilă să in ițieze un răspuns regenerativ ( Augusto și colab., 1996).
La embrionii de Danio rerio , consecințele expunerii la gentamicină sunt corelate cu
întrerupere polarității apical -bazale a celu lelor segmentelor tubulare și moartea acestora. Se
observă un important declin în ceea ce privește funcția renală, care se maniferstă prin
incapacitatea de a menține homeostazia apei. De asemenea, se poate observa și pierderea
bordurii în perie a pronefros ului, umflarea segmentelor tubulare și a glomerulului, existența de
resturi în lumen, cât și acumularea de leucocite în spațiul periubular. La adulții de Danio rerio
se poate observa un proces de regenerare (Fig. 11, Fig. 12) asemănător cu cel raportat la
Carassius auratus . Inițial are loc repopularea membranei bazale, consecutiv unor procese de
moarte celulară, aplatizarea și turtirea membranei bazale, ulterior -formarea de novo a
nefroni lor (McCampbell și Wingert, 2014).

27
Fig. 11. Reprezentarea schematică a regenerării la Danio rerio . A- injectarea intraperitone ală
a gentamicinei la adult. B- schema evenim entelor majore ale regenerării. I nițial se observă
resturi în lumen, apoi se observă restaurarea integrității segmentului contort proximal.
Ulterior apar agregate bazofile de ce lule, ulterior, agregatele bazofile sunt rare, sunt observați
nefroni nou -formați ( Adaptată după McCampbell și Wingert, 2014).

La Carassius auratus , s-au realizat experimente în care s -a folosit hexaclorbutadienă și
s-a urmărit de rularea răspunsului regenerativ ( Fig. 13). În urma tratamentului cu această
substanță, în prima săptămână după tratament se observă că segmentul proximal lezat este
populat de celule aplatizate, parțial dediferențiate, în curs de diviziune celulară. Origin ea
acestor celule nu a putut fi identificată, însă studii realizate pe mamifere sugerează că celule
ale epiteliului segmentului proximal sunt capabile să se dediferențieze și să reintre în ciclul
celular, cu scopul de a înlocui celulele pierdute.
În cursul săptămânilor următoare, aceste agregate bazofile se alungesc și formează
nefronii în curs de dezvoltare, care în final vor dobândi caracteristicile unor nefroni maturi
(Sander și Davidson, 2014), care se pare că prezintă un glomerul tipic, eozinofil (Wata nabe și
colab., 2009). Evenimente similare au fost observate la Oryazis latipes (Sander și Davidson,
2014).

28

Fig. 12. Reprezentarea schematică a regenerării mezonefrosului la Danio rerio . După
expunerea la gentamicină, repararea mezonefrosului are loc în două faze: inițial, este reparat
segmentul proximal, ulterior are loc neonefrogeneza, adică formarea de novo a nefronilor
(Adaptată după Dodd și Davisdon, 2016).

Examinându -se secțiuni histologice realizate prin rinichi, s -a constatat că această specie
de pește a fost capabilă să declanșeze un răspuns regenerativ, după adminis trarea gentamicinei,
răspuns similar cu cel raportat la Carassius auratus și Danio rerio . Inițial, leziunile au fost
reparate prin proliferare celulară și apoptoza, ca la mamifere. Următoarea fază a răspunsului
regenerativ a fost neogeneza de novo a nefronilor, observându -se o creștere semnificativă a
numărului de agregate de celule mezenc himale și corpuri nefrogenice (Watanabe și colab.,
2009 ). La Oryzias latipes , se pare că un num ăr semnificativ de agregate de celule bazofile,
condensate, apar la 14 zile după administrarea gentamicinei, ceea ce indică un proces
regenerativ în desfășurare. S -a concluzionat că numărul de nefroni în curs de formare este mai
mare în a 14 -a zi după admi nistrarea tratamentului, comparativ cu celelalte zile în care s -au
efectuat numărători ( Hashimoto și Wakamatsu, 2011 ).

29

Fig. 13. Reprezentare schematică a mecanismului de reparare în două faze a mezonefrosului
la Carassius auratus – cele doua faze. A- După administrarea hexaclorbutadienei, s -au
observat leziuni renale acute la nivelul segmentului proximal, concretizate în moartea
celulelor epiteliale. În prima fază, se consideră că pierderea celulelor segme ntului proximal
este compensată prin înlocuirea lo r de către celulele aparținând acestei regiuni care
supraviețuiesc, supuse dediferențierii, urmată de proliferarea și rediferențierea la celule
epiteliale mature. B- A doua fază a reparării constă în neonefrogeneză, caracterizată prin
apariția și creșterea numărului de agregate bazofie în regiunea distală a nefronilor existenți.
Aceste ce lule sunt supuse epitelizării (stadiul de veziculă renală ) iar a poi vor forma nefronii
maturi ( Adaptată după Sander și Davidson, 2014).

30
IV. MATERIALE ȘI METODE

IV.1. Animale
În experiment s -au folosit exemplare de Carassius auratus gibelio (ordinul
Cypriniformes, familia Cyprinidae ) cu o greutate medie de 90 ± 10 g și o lungime de 13 ± 2
cm, achiziționate de la Stațiunea Piscicolă Nucet.
Peștii au fost aclimatizaț i trei săptămâni în acvarii de sticlă de 180 litri, cu apă
declorinată, aerată și filtrată permanent. Perioada de iluminare a fost de 12 ore/zi și a alternat
cu cea de întuneric. Pe durata experimentelor, peștii nu au fost hrăniți pentru a reduce efectele
hrănirii asupra metabolismului (Brett și Zala, 1975).

IV.2. Administrarea de nanoparticule de siliciu
Nanoparticulele folosite în experimente au fost obținute de la Departamentul de Laser al
Institutului Național de Fizica Laserilor , Plasm ei și Radiații lor, Măgurele ( Grigoriu și colab.,
2004) . Particulele de SiO 2/Si sunt sferice și au un miez cristalin de siliciu, acoperit cu un strat
amorf de SiO 2 cu o grosime de 1 -1,5 nm (Grigoriu și colab., 2005). S-a folosit o suspensie de
nanoparticule (2 mg/mL) în 0, 7% NaCl.
Pentru caracterizarea efectului nanoparticulelor de siliciu asupra nefrogenezei s -a
injectat intraperitoneal suspensia de SiO 2/Si într -o concentrație de 3 mg/kg corp. Peștii au fost
sacrificați prin dislocare cervicală la intervale de 24, 48, 72 de ore, 7, 14 și 21 de zile.
Lotul martor a fost constituit din pești plasați în acvarii cu apă curată, declorinată,
filtrată și aerată continuu.
Tabelul III.1 prezintă numărul de exemplare sacrificate la fiecare interval de timp pe
parcursul experimentu lui.

IV.3. Analiza histologică
De la fiecare exemplar s -au prelevat fragmente de rinichi care au fost fixate, la
temperatura camerei în fixatorul Bouin și în 4% formaldehi dă în tampon fosfat salin. După
fixare țesutul a fost deshidratat prin concentrați i crescătoare de alcool etilic, clarificat în toluen,
inclus în parafină și secționat la un microtom MicroTec CUT 4060, la o grosime de 6 µm.
Secțiunile de țesut au fost colorate cu Hematoxilină -eozină -albastru alcian ( pH 2,5),
pentru analiza morfologiei generale.

31
Tabel III.1 . Număr de exemplare sacrificate în experiment
Intervalul de timp la care
s-a realizat sacrificarea
peștilor injectați cu
nanoparticule de siliciu Număr de
exemplare
sacrificate Intervalul de timp la care
s-a realizat sacrifica rea
peștilor din lotul martor Număr de
exemplare
sacrificate
24 de ore 4 24 de ore 3
48 de ore 2 48 de ore 1
72 de ore 7 72 de ore 1
7 zile 7 7 zile 5
14 zile 3 14 zile 1
21 zile 3 21 zile 3

Colorația Hematoxilină -Eozină -Albastru alcian pH 2,5
Hem atoxilina este un colorant natural, din grupul flavonoizilor. Aceasta colorează
structurile bazofile (nuclei, reticul endoplasmic rugos) în albastru -violet. Eozina, derivat
halogenat al fluoresceinei, este un anion și se comportă ca un colorant acid. Citop lasma și
majoritatea fibrelor țesutului conjunctiv sunt colorate în diferite nuanțe de roz și roșu cu eozina
(Kiernan, 2008). Albastrul alcian (8GX) este un colorant bazic, utilizat pentru evidențierea
mucopolizaharidelor sau glicozaminoglicanilor . Afinita tea colorantului pentru grupările
anionice depinde foarte mult de pH. La pH 2,5 colorantul se leagă la nivelul grupărilor carboxil
și sulfat ale esterilor, colorând astfel în albastru glicoproteinele carboxilate și
mucopolizaharidele acide sulfatate și car boxilate.
Modul de lucru
1. Deparafinarea secțiunilor prin trecerea lor prin 3 băi succesive de toluen, 5 minute/ baie;
2. Hidratarea secțiunilor prin trecerea lor prin 3 băi de etanol, de concentrații
descrescătoare ( 100○, 96○, 70○), 5 minute/ baie;
3. 2 băi cu apă distilată, 5 minute/ baie;
4. Colorare cu Albastru Alcian, pH = 2,5, 30 minute;
5. Spălare cu o soluție de 3% acid acetic glacial;
6. Spălare cu apă de robinet, 3 minute;
7. Spălare cu apă distilată, 1 minut;
8. Colorare Hematoxilină Carazzi , 10 minute;
9. Spălare cu ap ă de robinet, 5 băi a câte 2 minute/ baie;
10. Spălare cu apă distilată, 2 minute;

32
11. Colorare 1% , Eozină, 10 minute;
12. Spălare apă de robinet, 5 băi a cate 2 minute/ baie;
13. Spălare cu apă distilată, 2 minute;
14. Deshidratarea lamelor prin trecerea lor succesivă prin 3 băi de etanol de concen trații
crescătoare (70○, 96○, 100○) 5 minute/baie;
15. Clarificarea secțiunilor prin trecerea lor prin 3 băi succesive de toluen, 5 minute/baie;
16. Montarea în balsam de Canada.
IV.4. Cuantificarea numărului de agregate bazofile și a numă rului de nefroni în
dezvoltare
Pentru evaluarea nefrogenez ei după administrarea nanoparticulelor de siliciu s -a
cuantificat numărul de agregate bazofile și de nefroni în dezvoltare din rinichiul exemplarelor
injectate și martor. Tabelul III.2. prezintă nu mărul de lame histologice analizate pentru
cuantificare. Cuantificarea s -a realizat prin numărarea agregatelor bazofile și a nefronilor în
dezvoltare de pe cinci câmpuri diferite, ale aceleiași lame la obiectivul 10x.
Agregatele bazofile au fost identific ate ca fiind grupuri mici de celule bazofile, în timp
ce nefronii în dezvoltare au fost considerați grupuri organizate de celule bazofile, care de obicei
delimitează un lumen îngust.

Tabel III. 2. Număr de lame histologice cuantificate
Intervalul de timp la care
s-a realizat sacrificarea
peștilor injectați cu
nanoparticule de siliciu Număr de
lame
cuantificate Intervalul de timp la care
s-a realizat sacrificarea
peștilor din lotul martor Număr de
lame
cuantificate
24 de ore 9 24 de ore 3
48 de ore 3 48 de ore 1
72 de ore 10 72 de ore 1
7 zile 7 7 zile 5
14 zile 4 14 zile 1
21 zile 4 21 zile 3

33
IV.5. Analiza statistică a datelor
Datele statistice au fost realizate folosind funcțiile statistice, disponibile în programul
Microsoft Excel 2010. Date le redate prin intermediul graficelor repre zintă mediile și deviațiile
standard. Analiza diferențelor statistice s -a realizat în programul Microsoft Excel folosind
testul t -Student, one tail, pentru fiecare pereche de interes. Diferențele semnificative sta tistic
au fost considerate la valori ale lui *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001 .

34
V. REZULTATE ȘI DISCUȚII

La Carassius auratus gibelio , rinichiul este de tip mezonefos (Fig. 14), înconjurat de
țesut hematopoietic, situat pe peretele dorsal al cavității corpului. Mezonefrosul este considerat
mai evoluat decât pronefrosul, dezvoltându -se pe seama unor componente ale acestuia. Este
întâlnit la ciclostomi, pești, amfibieni, în vreme ce la vertebratele amniote, cum ar fi peștii,
reptilel e și mamiferele, el este funcțional numai la embrioni . Fomarea mezonefrosului la pești
nu a fost foarte intens studiată, însă pe baza a numeroase studii s -a ajuns la concluzia că
dezvoltarea mezonefrosului se realizează pe baza tubilor pronefrotici existen ți .
Din punct de vedere structural, mezonefrosului speciei Carassius auratus gibelio
(Fig.15) urmează modelul de segmentare prezentat în capitolul II.2.
Nefronul este alcătuit din corpuscul renal și tub renal.
Corpusculul renal este alcătuit din capsula B owmann și glomerulul vascular.
La vertebratele adulte, glomerulul reprezintă un aparat de filtrare a sângelui, ce cuprinde
endoteliul vascular și o serie de celule specifice, denumite podocite. În centrul glomerulului se
găsește un capilar alcătuit din cel ule endoteliale fenestrate, înconjurate de podocite. Între aceste
rânduri de celule se află membrana bazală glomerulară.
În contrast cu speciile marine, glomerulul peștilor de apă dulce este bine vascularizat, în
consecință are o rată ridicată de filtrare. Aceste specii produc cantități mari de urină diluată,
având ca scop menținerea echilibrului acid -bază și al electroliților, dar și reglarea presiunii
sângelui.
În Fig. 15, putem observa aspectul microscopic al glomerulului de la Carassius auratus
gibelio . Se observă și existența capsulei Bowmann.
În ceea ce privește segmentul proximal, acesta este format dintr -un epiteliu cubic cu
bordură în perie reprezentată de microvili (Fig. 16).
Peștii au abilitatea de a genera noi nefroni în cursul vieții, numărul l or crescând
proporțional cu dimensiunile corpului. Acest fapt poate fi corelat cu încercarea de a realiza o
corespondență cât mai precisă între creșterea volumului fluidelor din corp (ca urmare a creșterii
dimensiunilor) și cea a funcției rinichilor. Acest mecanism este în contrast cu rinichii
mamiferelor, la care nefrogeneza încetează înainte sau puțin după naștere (Dodd și Davidson,
2016) .

35
Este cunoscut faptul că, la pești, în timp ce adăugarea de noi nefroni se realizează cu o
rată bazală în timpul creșt erii, neonefrogeneza poate fi seminificativ crescută în cazul în care
apar leziuni la nivelul rinichiului (Petrache și colab., 2012) .
La exemplarele injectate cu suspensia de SiO 2, s-au observat alterări ale țesutului
respectiv, inclusiv celule epiteliale detașate de lamina bazală, tubuli dilatați și resturi celulare
în lumen, dar și prezența procesului de neonefrogeneză.
Studii anterioare au demonstrat că leziunile produse după administrarea unor substanțe
chimice toxice cu tropism asupra rinichiului peșt ilor sunt urmate de dezvoltarea unor noi
nefroni, iar procesul de regenerare observat poate fi considerat un semn de adaptare și
vindecare (Petrache și colab., 2012). Acest proces a fost observat la rinichiul mai multor specii
de pești, cum ar fi Carassius auratus (Reimschuessel și colab., 1990), Oncorhyncus mykiss
(Reimschuessel, 1993), Danio rerio (Reimschuessel, 2001), Oryzias latipes (Watanabe și
colab., 2009), Oreochromis niloticus (Augusto și colab., 1996).
Există dovezi care atestă că procesul de fo rmare de noi nefroni poate fi influențat și de
injectarea prolactinei, la specia Anguilla anguilla (Reimschuessel și colab., 1990).
Prolactina este un hormon care este eliberat sistemic din glanda pituitară, la pești având rol
major în osmoreglare.

Fig. 14. Structura normală a mezonefrosului la Carassius auratus gibelio . Colorație
Hematoxilină -Eozină -Albastru Alcian, pH 2,5, x600.

36

Fig. 15 . Structura normală a mezonefrosului la Carassius auratus gibelio . Glomerul
(G), capsula Bowmann (săgeată neagr ă), tub contort proximal (săgeată roșie) . Colorație
Hematoxilină -Eozină -Albastru Alcian, pH 2,5,x1200.

Fig. 16 . Secțiune prin rinichi la Carassius auratus gibelio (exemplar martor).Tub
contort proximal (săgeți roșii). Bordură în perie (săgeți negre ). Colorație Hematoxilină –
Eozină -Albastru Alcian, pH 2,5, x1200.

G

37
La mai multe specii de pești, rata neonefrogenezei crește substanțial după lezarea țesutului
renal. Acest fenomen a fost studiat pentru prima dată la Carassius auratus , după expunerea la
hexaclorbutadienă (Dodd și Davidson, 2016).
La 24 ore după injectarea intraperitoneală a suspensiei de SiO 2, examinarea
microscopică a lamelor a indicat apariția unor modificări histologice. Se constată că are loc
dezorganizarea țesutului renal, aceasta con stând în desprinderea celulelor de lamina bazală,
precum și existența unor nuclei apoptotici, ceea ce indică efectele toxice ale suspensiei injectate
(Fig. 17).
Modificările histologice ce apar la nivelul țesutului renal sunt însoțite de începutul
nefrogen ezei, caracterizat prin detectarea uno r agregate bazofile mici (Fig. 18 ), fapt ce
demo nstrează că rinichiul speciei Carassius auratus gibelio e capabil să se regenereze după
administrarea nanoparticulelor de siliciu. Formarea agregatelor de celule bazofile reprezintă de
fapt prima fază a procesului denumit neonefrogeneză, care constă în formarea de novo a
nefronilor. Rinichiul tipic al peștilor conține în mod normal agregate de celule bazofile situate
în mod frecvent lângă un canal colector. Se pare că aces tea, după acțiunea unor agenți cu efect
toxic asupra țesutului renal, prezintă celule mărite, cu formă semilunară, ce posedă nuclei foarte
mari.
Agregatele de celule bazofile observate la exemplarele martor (Fig. 19 ), care nu au fost
tratate cu nanopartic ule de siliciu, se deosebesc de cele prezente la exemplarele care au fost
injectate cu SiO 2, acestea fiind alcătuite din celule foarte mici, cu puțină citoplasmă și nuclei
compacți.
În Fig. 20 se poate observa o comparație între numărul de agregate bazof ile existente
în rinichiul peștilor martor și a celor sacrificați la 24 ore de la administrarea nanoparticulelor
de siliciu. Se constată că exceptând exemplarul 2 și 4 celelalte 2 exemplare la care s -a
administrat nanoparticule de siliciu prezintă mai mult e agregate bazofile comparativ cu
martorul. Un număr de agregate bazofile semnificativ mai mic decât exemplarele martor a avut
doar exemplarul 2 (P=0,016; P<0,05 ).

38

Fig. 17 . Secțiune prin rinichiul speciei Carassius auratus gibelio la 24 ore de l a
administrarea nanoparticulelor de siliciu . Se observă detașarea celulelor epiteliale de
lamina bazală ( săgeti negre ), nuclei apoptotici (săgeți roșii) . Colorație Hematoxilină –
Eozină -Albastru Alcian, pH 2,5, x800.

Fig. 18 . Agregate bazofile de celu le (săgeți), observate la un exemplar de Carassius
auratus gibelio , sacrificat la 24 ore de la injectarea intraperitoneală a nanoparticulelor
de siliciu. Colorație Hematoxilină -Eozină -Albastru Alcian, pH 2,5, x800.

39

Fig. 19 . Agregate de celule bazofile observate la exemplare martor (săgeată).
Colorație Hematoxilină -Eozină -Albastru Alcian, pH 2,5, x1200.

Fig. 20. Numărul de agregate bazofile din rinichiul peștilor la 24 de ore de la
administrarea nanoparticulelor de siliciu. Valorile sunt reprezenta te prin medie±deviația
standard. Se remarcă o diferență statistică semnificativă (* P<0,05 ) între numărul de
agregate bazofile de la martor comparativ cu exemplarul 2.

La 48 de ore de la injectarea nanoparticulelor de siliciu se constată o distrugere mai
pronunțată a tesutului renal decât cea observată la exemplarele analizate la 24 de ore de la
01234567
Martori Exemplar 1 Exemplar 2 Exemplar 3 Exemplar 4Număr de agregate bazofile
Exemplare analizate*

40
injectarea nanoparticulelor de siliciu, această distrugere implicând dezorganizarea tubilor
renali, precum și desprinderea celulelor epiteliale de lamina bazală (F ig. 21). Aceste modificări
masive ale arhitecturii țesutului renal sunt corelate cu un număr mult mai mare de agregate
bazofile numărate, comparativ cu exemplarele analizate la 24 și 72 de ore, respectiv 7, 14 și 21
de zile.
Tot în urma examinării microsc opice a lamelor cu țesut renal s-au observat agregate
bazofile, asemănătoare cu cele prezente la exemplarele sacrificate la un interv al de 24 de ore
(Fig. 22 ), dar și agregate de celule bazofile care au o morfo logie relativ modificată (Fig. 23 ).
La acestea , se observă celulele alungite, mult mai mari ca cele observate la 24 ore după
administrarea tratamentului cu SiO 2. Totodată, se remarcă și nucleii de dimensiuni mari. Aceste
observații sunt în concordanță cu cele relatate de Reimschuessel și colab., (1990 ), care au
observat aceste modificări la o săptămână de la administrarea unui tratament cu
hexaclorbutadienă.
Tot la 48 ore de la administrarea SiO 2, în urma examinărilor microscopice, s -a observat și
apariția unor nefroni în curs de dezvolta re, în grupur i compacte (Fig. 24) sau individual (Fig.
25) celulele rămânând bazofile.

Fig. 21 . Distrugere pronunțată a țesutului renal la 48 ore de la administrarea
nanoparticulelor de siliciu la niveul țesutului renal. Se remarcă dezorganizarea țesutului
renal (săgeți negre), desprinderea celulelor epiteliale de lamina bazală (săgeți galbene),
nuclei apoptotici (săgeți roșii). Colorație Hematoxilină -Eozină-Albastru Alcian, pH 2,5,
x100.

41

Fig. 22 . Agregat bazofil (săgeată) observat la 48 ore de la administr area
nanoparticulelor de siliciu. În interiorul agregatului celulele prezintă un nucleu
heterocromatic înconjurat de o citoplasmă redusă. Colorație Hematoxilină -Eozină -Albastru
Alcian, pH 2,5, x800.

Fig. 23 . Agregat de celule bazofile observat la 48 o re după administrarea
nanoparticulelor de siliciu (săgeată) în care celulele epiteliale devin cubice sau cilindrice .
Colorație Hematoxilină -Eozină -Albastru Alcian, pH 2,5 x1200.

42

Fig. 2 4. Nefroni în curs de dezvoltare, observați la 48 ore de la administ rarea
nanoparticulelor de siliciu se remarcă începerea formării lumenului . Colorație Hematoxilină –
Eozină -Albastru Alcian, pH 2,5, x1200.

Fig. 25. Nefron în curs de dezvoltare (săgeată) , observat la 48 ore de la administrarea
nanoparticulelor de s iliciu. Colorație Hematoxilină -Eozină -Albastru Alcian, pH 2,5, x1200.

43
Conf orm lui Hashimoto și Wakamatsu (2011), trebuie să amintim faptul că nefronii în curs de
dezvoltare pot fi observați în structura rinichiului adult normal și după ce numărul nefron ilor
a atins anumite valori.
În Fig. 26 , este reprezentat grafic numărul de structuri care indică nefrogeneza, incluzând
atât agregatele bazofile de celule, cât și nefroni în curs de dezvoltare. Nu există diferențe
semnificative statistic între martor și exemplarul 1 (P=0,07) sau exemplarul 2 (P=0,36).

Fig. 26 . Numărul de agregate bazofile din rinichiul peștilor la 48 de ore de la administrarea
nanoparticulelor de siliciu. Valorile sunt reprezentate prin medie±deviația standard.

La 72 ore de la admin istrarea suspensiei de SiO 2, încă se mai observă dezorganizarea
țesutului renal, care implică detașarea celulelor epiteliale de lamina bazală (Fig. 27). Se
remarcă însă faptul că distrugerile la nivelul tesutului renal sunt mai puțin pronunțate decât
cele observate la 24, respectiv 48 de ore de la administrarea nanoparticulelor de siliciu, fapt
corelat și cu un număr mai mic de agregate bazofile (Fig. 28) comparativ cu exemplarele
analizate la 24 și 48 de ore.
Fig. 29 reprezintă numărul de agregate bazofile rezultat din numărarea microscopică a
acestora, la un interval de timp de 72 de ore de la administrarea suspensiei de SiO 2. Se constată
că un singur exemplar la care s -a administrat SiO 2 prezintă mai puține agregate bazofile decât
exemplarul martor, anume exemplarul 7, la care numărul de agregate bazofile
.
0123456789
Martor Exemplar 1 Exemplar 2Număr de agregate bazofile
Exemplare analizate

44

Fig. 27 . Secțiune prin rinichiul speciei Carassius auratus gibelio la 72 ore de la
administrarea nanoparticulelor de siliciu . Se observă detașarea celulelor epiteliale de lamina
bazală (marcate pri n sageți). Colorație Hematoxilină -Eozină-Albastru Alcian, pH 2,5, x6 00.

Fig. 28 . Agregat de celule bazofile (săgeată) observat la 72 ore după administrarea
nanoparticulelor de siliciu. În interiorul agregatului celulele prezintă un nucleu
heterocr omatic înconjurat de o citoplasmă redusă. Colorație Hematoxilină -Eozină-Albastru
Alcian, pH 2,5, x8 00.

45
este semnificativ mai mic decât la martor (P=0,04; P<0,05). O diferență statistică semnificativă
mai poate fi observată pe grafic între exemplarul marto r și exemplarul 5, la care se observă un
număr mai mare de agregate bazofile decât la martor (P=0,009; P <0.01).

Fig. 29 . Numărul de agregate bazofile din rinichiul peștilor la 72 de ore de la administrarea
nanoparticulelor de siliciu. Valorile sunt r eprezentate prin medie±deviația standard. Se
remarcă o diferență statistică semnificativă (** P<0,01 ) între numărul de agregate bazofile de
la martor comparativ cu exemplarul 5, dar și cu exemplarul 7 (* P<0,05 ).

La 7 zile de la administrarea suspensiei de SiO 2, se remarcă încă distrugeri ale țesutului
renal, reprezentate de tubuli fragmentați, nuclei apoptotici precum și detașarea celulelor de
lamina bazală (Fig. 30).
Deși s -a constatat că există semne ale degradării țesutului renal, s-a observat că număru l
de agregate bazofile este mai mic ca la exemplarele analizate la 24, 48, respectiv 72 de ore de
la administrarea nanoparticulelor de siliciu, ceea ce indică faptul că, deși nefrogeneza este încă
în desfășurare, arhitectura țesutului renal începe să se re facă treptat.
Prin examinarea microscopică a țesutului renal, se observă existența atât a unor agregate
bazofile (Fig. 31 ) cât și a unor nefron i în curs de dezvoltare (Fig. 32), la unii dintre aceștia
apărând lumenul, în diferite stadii de dezvoltare ( Fig. 33, Fig. 3 4), fapt ce confirmă că procesul
de neonefrogeneză este încă în desfășurare. 0123456789Numar de agregate bazofile
Exemplare analizate** *

46

Fig. 30 . Secțiune prin rinichiul speciei Carassius auratus gibelio la 7 zile de la
administrarea nanoparticulelor de siliciu . Se observă detașarea celulelor epit eliale de lamina
bazală ( săgeată neagră), fragmentarea tubilor renali (săgeată galbenă), nuclei apoptotici
(săgeată verde) dar și prezența unui agregat bazofil (săgeată roșie). Colorație Hematoxilină –
Eozină-Albastru Alcian, pH 2,5, x12 00.

Fig. 31 . Agregate de celule bazofile (săgeți) observate la 7 zile după administrarea
nanoparticulelor de siliciu. Colorație Hematoxilină -Eozină -Albastru Alcian, pH 2,5, x1200.

47

Fig. 32 . Nefron în curs de dezvoltare (săgeată neagră), observat la 7 zile de la
administrarea nanoparticulelor de siliciu. Se remarcă începerea formării lumenului ( săgeată
galbenă). Colorație Hematoxilină -Eozină -Albastru Alcian, pH 2,5, x1200.

Fig. 33 . Nefron în curs de dezvoltare (săgeată roșie) , observat la 7 zile de la
administrarea nanoparticulelor de siliciu. Se remarcă prezența lumenului (săgeată galbenă).
Colorație Hematoxilină -Eozină -Albastru Alcian, pH 2,5, x1600.

48

Fig. 34 . Nefron în curs de dezvoltare (săgeată) , observat la 7 zile de la adminis trarea
nanoparticulelor de siliciu. Se remarcă faptul că nefronul evoluează spre forma tipică,
întâlnită la nefronii maturi. Colorație Hematoxilină -Eozină -Albastru Alcian, pH 2,5, x1200.

Analiza nefrogenezi la acest interval de timp a evidențiat că doar exemplarul 2 prezintă
un număr mai mic de agregate bazofile comparativ cu exemplarele martor (Fig. 35) . S-au
remarcat diferențe semnificative statistic între exemplarele martor și exemplarul 1 (P=0,003;
P<0,01 ), exemplarul 3 (P=0,01; P <0,05), exemplarul 4 (P=0,005 ; P<0,01), exemplarul 5
(P=0.0005; P <0,001), exemplarul 6 (P=0,0005 ; P<0,001) și exemplarul 7 (P=0,0007 ; P<0,001).

49

Fig. 35 . Numărul de agregate bazofile din rinichiul peștilor la 7 zile de la administrarea
nanoparticulelor de siliciu. Valorile sunt reprezentate prin medie±deviația standard. Se
remarcă o diferență statistică semnificativă între numărul de agregate bazofile de la martor
comparativ cu exemplarul 1 (**P <0,01) , exemplarul 3 (*P<0,05), exemplarul 4 (**P<0,01),
exemplarul 5 (***P <0,001), exemplarul 6 (***P<0,001), exemplarul 7(***P<0,001).

La 14 zile de la administrarea suspensiei de SiO 2, se poate observa încă un număr redus
de tubuli la care există celule epiteliale detașate de lamina bazală. De asemenea, se pot observa
asemăn ări structurale între rinichiul peștilor la 14 zile de la administrarea nanoparticulelor
siliciu și cel al martorilor, acest aspect sugerează faptul că procesul de regenerare a condus la
refacerea arhitecturii țesutului renal (Fig. 36).
Agregatele bazofile sunt prezente, însă într -un număr mai mic comparativ cu perioadele de
timp anterioare. 0123456789
Martori Exemplar
1Exemplar
2Exemplar
3Exemplar
4Exemplar
5Exemplar
6Exemplar
7Numărul de agregate bazofile
Exemplare analizate** * ** *** *** ***

50

Fig. 36 . Aspectul tubulilor observat la 14 zile după administrarea nanoparticulelor de
siliciu. Agregate bazofile (săgeți neagră), celule epiteliale detașate de l amina bazală (săgeată
roșie). Colorație Hematoxilină -Eozină -Albastru Alcian, pH 2,5, x400.

În Fig. 37 putem observa reprezentarea grafică a numărului de agregate bazofile la 14
zile după administrarea nanoparticulelor de siliciu. La acest interval de tim p la exemplarul
martor și la un exemplar injectat cu SiO 2 nu s-au identificat situsuri de nefrogeneză. Exemplarul
1 prezintă un număr de agregate bazofile semnificativ mai mare decât la martor (P=0,0009;
P<0,001), la fel și exemplarul 2 (P=0,0003; P <0,001) .

51

Fig. 3 7. Numărul de agregate bazofile din rinichiul peștilor la 14 de zile de la
administrarea nanoparticulelor de siliciu. Valorile sunt reprezentate prin medie±deviația
standard. Se remarcă o diferență statistică semnificativă (*** P<0,001 ) între n umărul de
agregate bazofile de la martor comparativ cu exemplarul 1, dar și cu exemplarul 2
(***P<0,001 ).

La 21 zile de la administrarea nanoparticulelor de SiO 2, a fost observat tot un număr mic
de agregate bazofile (Fig. 38 ), aspect care sugerează diminuare a intensității procesului de
nefrogeneză. Și în acest caz, nu se mai observă alterări histologice, ceea ce sugerează refacerea
structurii la nivelul țesutului renal.
În Fig. 39 putem observa reprezentarea grafică a numărului de agregate bazofile la 21
zile după administrarea nanoparticulelor de siliciu. Se poate observa că există o diferență
semnificativă între numărul de agregate bazofile prezente la exemplarul martor cu cel de la
exemplarul 2, care prezintă un număr mai mare de agregate bazofile (P=0 ,02; P <0,05).

0123456
Martor Exemplar 1 Exemplar 2 Exemplar 3Număr de agregate bazofile
Exemplare analizate*** ***

52

Fig. 38 . Aspectul histologic al rinichiului la 21 zile după administrarea
nanoparticulelor de siliciu. Colorație Hematoxilină -Eozină -Albastru Alcian, pH 2,5,
x200.

Fig. 39 . Numărul de agregate bazofile din rinichiul peștilor la 21 de zile de la
administrarea nanoparticulelor de siliciu. Valorile sunt reprezentate prin medie±deviația
standard. Se remarcă o diferență statistică semnificativă (* P<0,05 ) între numărul de agregate
bazofile de la martor comparativ cu exemplarul 2.

00,511,522,533,544,55
Martori Exemplar 1 Exemplar 2 Exemplar 3Numărul de agregate bazofile
Exemplare analizate*

53

În Fig. 40 este prezentată analiza comparativă a numărului de agregate bazofile și
nefroni în dezvoltare la intervalele de timp luate în studiu.
Activitatea nefrogenică prezentă în rinichiul de Carassius auratus gibelio pare să fie
mai crescută la un interva l de 24, dar și 48 ore după administrarea suspensiei de SiO 2, fiind
caracterizată de apariția de mici agregate de celule bazofile care, ulterior, se vor dezvolta în noi
nefroni. Această activitate poate fi remarcată la valori considerabile și la un interva l de 72 ore,
respectiv 7 zile. Zilele 14, respectiv 21, sunt caracterizate de o scădere a activității nefrogenice.
Se constată că, exceptând exemplarele analizate la 72 de ore, respect iv 14 și 21 zile de la
administra rea nanoparticulelor de siliciu, la cel elalte intervale de timp exemplarele analizate
prezintă mai multe agregate bazofile comparativ cu martorul. Un număr de agregate bazofile
semnificativ mai mare decât exemplarele martor a fost remarcat doar la exemplarele analizate
la un interval de 24 de ore de la administrarea nanoparticulelor de siliciu (P=0,003; P<0,01 ),
iar un număr de agregate bazofile semnificativ mai mic decât exemplarele martor a fost
remarcat la exemplarele analizate la 14 ( P=0,00000126431; P<0,001) , respectiv 21 zile
(P=0,0000072 4536; P<0,001). O diferență semnificativă s -a constatat și între numărul de
agregate bazofile prezente la exemplarele analizate la 24 de ore de la administrarea
nanoparticulelor de siliciu, comparativ cu exemplarele analizate la 72 de ore de la administrar ea
nanoparticulelor de siliciu (P=0,009; P<0,01 ), 14 zile (P=0,00000187672 ; P<0,001) respectiv
21 zile de la administrarea nanoparticulelor de siliciu (P=0,0000076 1333 ; P<0,001). În ceea ce
privește exemplarele analizate la 48 ore de la administrarea nanop articulelor de siliciu, există
diferențe semnificative comparativ cu exemplarele analizate la 72 de ore (P=0,02; P<0,05 ), 7
zile (P=0,01; P<0,05 ), 14 zile (P=0,0003; P<0,001 ), 21 zile administrarea nanoparticulelor de
siliciu (P=0,01; P<0,05 ). Tot o difere nță semnificatică există și între exemplarele analizate la
72 de ore comparativ cu cele analizate la 14 zile (P=0,006; P <0,01), respectiv 21 zile de la
administrarea nanoparticulelor de siliciu (P=0,03; P <0,05). Ultima diferență semnificativă
poate fi obse rvată între exemplarele analizate la 7 zile comparativ cu cele analizate la 14 zile
de la administrarea nanoparticulelor de siliciu (P=0,006; P <0,01).

54

Fig.40 . Comparație între numărul de agregate bazofile din rinichiul peștilor la anumite
intervale de timp de la administrarea nanoparticulelor de siliciu. Valorile sunt reprezentate
prin medie±deviația standard. Se remarcă o diferență statistică semnificativă (* P<0,05 ) între
numărul de agregate bazofile de la martor comparativ cu exemplarele anal izate la 24 ore
(**P <0,01) , 14 zile (***P<0,001), 21 zile (***P<0,001), între numărul de agregate bazofile
de la exemparele analizate la 24 ore comparativ cu exemplarele analizate la 72 ore
(**P <0,01), 14 zile (***P<0,001), 21 zile (***P<0,001), între numă rul de agregate bazofile
de la exemparele analizate la 48 ore comparativ cu exemplarele analizate la 72 ore (*P <0,05),
7 zile (*P<0,05), 14 zile (***P<0,001), 21 zile (* P<0.05), între numărul de agregate bazofile
de la exemparele analizate la 72 ore compar ativ cu exemplarele analizate la 14 zile
(**P <0,01), 21 zile (*P <0,05), între numărul de agregate bazofile de la exemplarele analizate
la 7 zile comparativ cu exemplarele analizate la 14 zile (*P <0,05) .
012345678
Martori 24 ore 48 ore 72 ore 7 zile 14 zile 21 zileNumărul de agregate bazofile
Interval de timp după administrarea suspensiei de SiO2*******
******
** ** * * *** * *
**

55
Studiile realizate până în prezent în ceea ce priveș te capacitatea de neonefrogeneză a
peștilor teleosteeni ca răspuns la leziunile provocate de anumite substanțe nefrotoxice au vizat
specii precum Carassius auratus la 24 ore, 4, 7, 14, 21, 28, și 70 de zile de la expunerea la
hexaclorbutadienă (Reimschuess el și colab., 1990), Oncorhyncus mykiss la 24 de ore, 10, 21 și
28 zile de la contaminarea cu tetracloretilenă (Reimschuessel, 1993), Danio rerio la 24 de ore,
2, 3, 4, 7, 14, 21 și 28 de zile de la administrarea gentamicinei (Reimschuessel, 2001), Oryzias
latipes la 4, 7, 14, 21 și 28 zile de la administrarea gentamicinei (Watanabe și colab., 2009;
Hashimoto și Wakamatsu, 2011), Oreochromis niloticus la 24 ore, 2, 3, 4, 5, 6, 7 zile de la
administrarea gentamicinei (Augusto și colab., 1996).
În experimentu l derulat de Reimschuessel și colab., (1990), volumul ocupat de agregatele
bazofile și de nefroni în curs de dezvoltare a fost mai ridicat în săptămânile 2, 3, 4 și 10 de la
administrarea substanței nefrotoxice (în acest caz, hexaclorbutadienă). Ulterior,
Reimschuessel, (1993), în cadrul altul exeriment, afirmă că agregatele bazofile și nefronii în
curs de dezvoltare au fost evidențiați la 10, 21, respectiv 28 de zile de la administrarea altei
substanțe nefrotoxice, mai precis tetracloretilenei, la specia Oncorhyncus mykiss . Observațiile
acestuia indică faptul că nefronii în curs de dezvoltare prezintă un aspect similar cu cei de la
embrionii mamiferelor și larvele peștilor.
În cazul rezultatelor obținute de Hashimoto și Wakamatsu, ( 2011) după administrare a de
gentamicină, se susține că numărul de nefroni în dezvoltare este semnificativ mai ridicat la 14
zile de la administrarea substanței nefrotoxice decât în alte zile.
Studiile realizate pe Oryzias latipes la care s -a administrat intraperitoneal gentami cină,
au demonstrat că activitatea nefrogenică a fost mai evidentă la 14 zile după administrarea
antibioticului (Watanabe și colab., 2009 ). Procesul nefrogenezei a fost caracterizat, de
asemenea, tot de apariția de numeroase agregate de celule condensate, mici, bazofile, care, din
punct de vedere morfologic, seamănă cu nefronii în curs de dezvoltare și corpii nefrogenici
care au fost observați anterior la larvele de Oryzias latipes (Fedorova și colab., 2008).
Augusto și colab., (1996) au c oncluzionat că ce le mai multe a gregate bazofile și nefroni
în curs de dezvoltare a fost observați la 2, dar și 3 zile de la administrarea gentamicinei la
Oreochromis niloticus .
În studiul nostru s -au folosit 6 intervale de timp ( 24, 48, 72 de ore, 7, 14, 21 de zile de
la administrarea nanoparticulelor de siliciu), aspect care a permis observarea evoluției
procesului de nefrogeneză.
Analiza comparativă a numărului de agregate bazofile și nefroni în curs de formare
existente atât la exemplarele martor, cât și la exemplarele sacrificate la un anumit interval de

56
timp de la injectarea cu nanoparticule de siliciu a indicat faptul că acesta este mai mare la 24,
respectiv 48 de ore. Acest aspect indică faptul că procesul de distrugere celulară datorat acțiunii
nefrotoxice a nanopa rticulelor de siliciu este compensat de inițierea nefrogenezei cu scopul
înlocuirii nefronilor distruși.
Ulterior, acest număr de agregate bazofile și nefroni în curs de dezvoltare scade,
menținându -se însă la valori semnificative la 72 de ore, și la 7 z ile de la administrarea
nanoparticulelor de siliciu. În ceea ce privește exemplarele analizate la 14 și 21 de zile de la
administarea nanoparticulelor de siliciu, numărul de agregate bazofile și nefroni în dezvoltare
scade semnificativ, aspect care sugerea ză diminuarea intensității procesului de nefrogeneză,
deoarece a avut loc refacerea arhitecturii țesutului renal. Rezultatele noastre sunt în acord cu
cele ale lui Augusto și colab ., (1996) care au demonstrat că nefrogeneza a fost mai intensă la
2, respe ctiv 3 zile de la expunerea la substanța nefrotoxică.

57

VI. CONCLUZII

 Analizele histologice au indicat că administrarea nanoparticulelor de siliciu induce
modificări ale țesutului renal reprezentate de detașarea celulelor epiteliale de lamina
bazală, fragmentarea tubulilor renali, precum și apariția unor agregate bazofile și a unor
nefroni în curs de dezvoltare.
 Alterarea țesutului renal este pronunțată la 24 și 48 de ore de la administrarea
nanoparticulelor de siliciu. La aceste interv ale de timp s -a identificat cel mai mare
număr de agregate bazofile, aspect care sugerează că procesul de distrugere celulară
este compensat de inițierea nefrogenezei cu scopul înlocuirii nefronilor distruși.
 După 7 zile de la administrarea nanoparticulelo r de siliciu, rinichiul peștilor prezintă o
structură asemănătoare cu cea a martorilor și numărul de agregate bazofile și nefroni în
formare este redus. Acest aspect indică faptul că în momentul în care arhitectura
țesutului renal este refăcută nefrogeneza este redusă.
 Analizele histologice și statistice au demonstrat existența unor variații individuale a
răspunsului regenerativ, la peștii martor și sacrificați la același interval de timp, ceea ce
sugerează că în astfel de studii trebuie inclus un număr mu lt mai mare de exemplare,
pentru analiza dinamicii procesului de nefrogeneză la pești.
 Deși nanoparticulele de siliciu s -au dovedit a fi nefrotoxice la concentrația utilizată în
acest studiu, rinichiul exemplarelor de Carassius auratus gibelio are capacit atea de a
se regenera prin intensificarea procesului de nefrogeneză.

58

VII. BIBLIOGRAFIE

1. Augusto J., Smith B., Robertson J., Reimschuessel R. 1996. Gentamicin -induced
nephrotoxicity and nephroneogenesis in Oreochromis nilotica , a tilapian fish. Dis.
Aquat. Organ . 26, 49-58.
2. Bedell V.M., Person A.D., Larson J.D., McLoon A., Balciunas D., Clarck K.J.,Neff
K.I., Nelson K.E., Bill B.R., Schimmenti L.A., Beiraghi S., Ekker S.C. 2012. The
lineage -specific gene ponzr1 is essential for zebrafish pronephric and pharyngeal arch
development. Development . 139, 793 -804.
3. Brett J.R., Zala C.A. 1975. Daily patterns of nitrogen excretion and oxygen
consumption of sockeye salmon ( Oncorhynchus nerka ) under controlled conditions. J.
Fish. Res. Board Can . 32, 2479 -2486.
4. Cheng C.N., Wingert R.A. 2014. Renal system development in the zebrafish: a basic
nephrogenesis model . Zebrafish . 179 -214.
5. Cormier S.M., Neiheisel T.W., Wernsing P., Racine R.N., Reimschuessel R. 1995. New
nephron development in fish polluted waters: a pos sible biomarker. Ecotoxicology. 4,
157-168.
6. Dantzler W. H. 2016. Comparative physiology of the vertebrate kidney . Comp. Physiol.
Vertebr. Kidney, Second Ed. 1–292 .
7. Davidson A.J. 2011. Uncharted waters: nephrogenesis and renal regeneration in fish
and mamm als. Pediatr. Nephrol . 26, 1435 –1443.
8. Davidson A.J. 2014. Kidney regeneration in fish. Nephron Exp. Nephrol . 126 , 45-49.
9. Diep C.Q., Peng Z., Ukah T.K., Kelly P.M., Daigle R.V., Davidson A.J. 2015.
Development of the Zebrafish Mesonephros. Genesis . 53, 257 –269.
10. Dodd R.C., Davidson A.J. 2016. Zebrafish renal development and r egeneration. În :
Kidney development, disease, repair and r egeneration . Little M.H (Ed). Academic
Press . 5-16.
11. Drummond I.A., Davidson A.J. 2010. Zebrafish kidney development. Methods Cell
Biol. 100, 233 –260.
12. Ford P., Newstead J.D. 1958. Studies on the development of the kid ney of the Pacific
Pink Salmon, (Oncorhynchus Gorbuscha (Walbaum) ). Can. J. Zool. 36, 15 -21.

59
13. Gerlach G.F., Wingert R.A. 2013. Kideny organogenesis in the zebrafish: ins ights into
vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wire s Dev . Biol. 2, 559 -585.
14. Grigoriu C., Nicolae I., Ciupina V., Prodan G., Suematsu H., Yatsui K. 2004. Influence
of the experimental parameters on silicon nanoparticles produced by laser ablation. J.
Optoelectr. Adv. Mat. 6, 825 –830.
15. Grigoriu C., Kuroki Y., Nicolae I., Zhu X., Hirai M., Suematsu H., Takata M., Yatsui
K. Photo and cathodoluminescence of Si/SiO 2 nanoparticles produced by laser ablation.
2005. J. Optoelectr. Adv. Mat . 7, 2979 –2984.
16. Hashi moto H., Wakamatsu Y. 2011. Glomerulogenesis and de novo nephrogenesis in
medaka fish: an evolutionary approach. În: Regenerative Nephrology . Goligorsky M.S .
(Ed). Academic Press . 1-18.
17. Hickman C.P., Trump B.F. 1969. Excretion, Ion Regulation and Metaboli sm. În: Fish
Physiology . Hoar W.S., Rand all D.J., (Eds). Academic Press. 91-227.
18. Holstvoogd C. 1958. The postembryonic development of the pronephros in Clupea
harengus L. Arch. Néerl . de Zool . 12, 455 – 466.
19. Ichimura K., Bubenshchikova E., Powell R., Fukuy o Y., Nakamura T., Obara T. 2012.
A comparative analysis of glomerulus development in the pronephros of medaka and
zebrafish. PLoS One. 7, 1-13.
20. Kiernan J.A. 2008. Histological and histochemical methodes. Theory and practice,
Fourth Edition. Editura Scion Publishing Ltd., Oxfordshire, U.K.
21. Kültz D. 2015. Physiological mechanisms used by fish to cope with salinity stress. J.
Exp. Biol. 218, 1907 -1914.
22. Kunz Y.W. 2004. Mesodermal derivatives. În: Developmental biology of teleost f ishes .
377-429.
23. Manolache V. 2002. Histologia organelor, Editura Universității din București, 120.
24. Marra A.N., Wingert, R.A. 2016. Epithelial cell fate in the nephron tubule is mediated
by the ETS transcription factors etv5a and etv4 during zebrafish kidney development.
Dev. Biol . 411, 231–245.
25. McCampbell K.K., Wingert, R.A. 2014. New tides: u sing zebrafish to study renal
regeneration. Transl. Res. 163, 109–122.
26. Naylor R.W., Davidson A.J. 201 7. Pronephric tubule formation in zebrafish :
morphogenesis and migration. Pediatr. Nephrol . 32, 211 -216.
27. Perner B., Englert C., Boolig F. 2007. The Wilms tumor genes wt1a and wt1b control
different steps during formation of the zebrafish pronephros . Dev. Biol. 309, 87 -96.

60
28. Petrache S. N., Stanca L., Serban A. I., Sima, C. 2010. Structural and oxida tive changes
in the kidney of crucian carp induced by silicon -based q uantum dots. Int. J. Mol. Sci .
13, 10193 -10211.
29. Reimschuessel R., Bennett R.O., May E.B., Lipsky M . 1990. Development of newly
formed nephrons in the goldfish kidney following hexachlorob utadiene -induced
nephrotoxicity . Toxicol. Pathol . 18, 32 -38.
30. Reimschuessel R., Bennett R.O., May E.A., Lipsky M.M. 1993. Pathological
alterations and new nephron development in rainbow trout Oncorhyncus mykiss
following tetrachloroethylene contamination. J. Zoo Anim. Med . 24, 503 –507.
31. Reimschuessel R. 2001. A fish model of renal regeneration and development. ILAR
Journal. 42, 285 -291.
32. Sander V., Davidson A.J. 2014. Kidney injury and regeneration in sebrafish. Semin.
Nephrol. 34, 437 -444.
33. Shmukler B.E., Clar k J.S., Hsu A., Vandorpe D.H., Stewart A.K., Kurschat C.E.,
Choe S.K., Zhou Y., Amigo J., Paw B.H., Alper S.L. 2008. Zebrafish ae2.2 encodes a
second slc4a2 anion exchanger . AJP-Regul . Integr . Comp . Physiol . 294, 1081 -1091.
34. Swanhart L.M., Takahashi N., Jac kson R.L., Gibson G.A., Watkins S.C., Dawid I.B.,
Hukriede N.A. 2010. Characterization of an lhx1a transgenic reporter in zebrafish. Int.
J. Dev. Biol. 54, 731 –736.
35. Tytler P. 1988. Morphology of the pronephros of the juvenile brown trout, Salmo
trutta . J. Morphol . 195, 189-204.
36. Vize P.D., Caroll T.J., Wallingford J.B. 2003. Induction, development and physiology
of the pronephric tubules. În: The kidney . Vize P.D., Woolf A.S., Bard J.B.L. (eds).
Academic Press. 19-50.
37. Watanabe N., Kato M., Suzuki N., Inoue C ., Fedorova S., Hashimoto H., Maruyama
S., Matsuo S., Wakamatsu Y. 2009. Kidney regeneration through nephron neogenesis
in medaka. Develop. Growth Differ. 51, 135 –143.
38. Wingert R.A., Selleck R., Yu J., Song H.D., Chen Z., Song A., Zhou Y., Thisse B.,
Thisse C., McMahon A.P., Davidson A.J. 2007. The cdx genes and retinoic acid control
the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PlosGenet. 3, 1922 -1938.
39. Wingert, R.A., Davidson A.J. 2008. The zebrafish pronephros: a model to study
nephron segm entation. Kidney Int. 73, 1120 –1127.

61
40. Yakirevich E., Magi -Galluzi C., Grada Z., Lu S., Resnick M.., Mangray S. 2015.
Cadherin 17 is a sensitive and specific marker for metanephric a denoma. Am. J. Surg .
Pathol . 39, 479 –486.
41. Zărnescu O. 1999. Biologia molecu lară a dezvoltării, partea I, Editura Universității
din București, 9.