Glucidele

Cuprins

Capitolul I. Glucidele

I.1. Noțiuni generale

I.2. Monoglucide

I.3. Oligoglucide

I.4. Poliglucide

Capitolul II. Metode de analiză a glucidelor

II.1. Noțiuni generale

II.2. Clasificarea metodelor de analiză a glucidelor

Capitolul III. Metode cromatografice de analiză a glucidelor

III.1. Noțiuni generale

III.2. Clasificarea metodelor cromatografice

III.3. Cromatografia de lichide (de înaltă performanță) HPLC

III.4. Cromatografia de gaze

Bibliografie:

Webgrafie:

Capitolul I. Glucidele

I.1. Noțiuni generale

I.1.1.Definiție

Glucidele sunt compuși organici ce conțin în molecula lor o grupare carboxil și mai multe grupări hidroxilice.

I.1.2. Nomenclatură

Denumirea de “glucide” provine din limba greacă “glikys” insemnând dulce, fapt ceea ce arată că majoritatea glucidelor au un gust dulce. Se știe că nu toate glucidele au un gust dulce spre exemplu celuloza, amidonul și pe de altă parte sunt compuși care deși sunt dulci nu sunt glucide: zaharina, glicerolul, glicocolul ș.a.. Cu toate acestea termenul de glucide a devenit denumire oficială.

“Glucidele au fost întâi definite de către Carl Schmidt în anul 1844. El le denumește ca fiind hidrați de carbon sau carbohidrați. Această denumire se referă la faptul că între atomii de hidrogen și cei de oxigen există un raport de 2 la 1 (exemplul apei). Se considera că structura compușilor se poate reda în formula moleculară Cn(H2O)m și că provin din îmbinarea carbonului cu apa astfel: un anumit număr de atomi de carbon, n, sunt legați de molecule de apă (hidratați). Însa în realitate, vorbind din punct de vedere structural, glucidele sunt de tip polihidroxicarbonilici (conțin grupări funcționale carbonil și hidroxil) adică compuși multifuncționali, iar apa nu se leagă de atomii de carbon. Deci formula Cn(H2O)m are unele incoveniente, pentru că se găsesc o serie de alți compuși care realizează acest criteriu și anume: acidul acetic – C2(H2O)2, acidul lactic – C3(H2O)3, aldehida formică – CH2O2 iar aceștia nu sunt glucide. Se poate susține că nomenclatura nu corespunde realității și nu este nici științifică.”

I.1.3. Clasificare

Glucidele pot fi alcătuite din una sau mai multe molecule. După numărul acestora există:

Oze (monoglucide)

Ozide:

Holozide:

oligoglucide (au în structura lor mai multe monoglucide între 2-10);

poliglucide (au o structura ramificată și pot conține mii de monoglucide).

Heterozide: (G + neG):

glicolipide (G+L);

glicoproteide (G+P);

acizi nucleici.

I.1.4. Rol biochimic

Rol energetic: peste 70% din energia organismelor vii se obține prin metabolizarea (arderea) glucidelor;

Furnizor de atomi de carbon pentru biosinteze în organism;

Rol constitutiv intrând în structura lipidelor, a membranelor celulare, a mucopoliglocidelor (glucide complexe) și a glicoproteidelor (substanța albă și cenușie a creierului);

Rol plastic la plante, asigurând rezistența chimică și mecanică a plantelor;

Rol în detoxifierea organismului.

I.2. Monoglucide

I.2.1. Definiție

Monoglucidele sunt compuși organici polihidroxicarbonilici. Ele se mai numesc oze sau monozaharide.

I.2.2. Clasificare

“Monoglucidele se pot clasifica după:

Poziția grupei funcționale, si anume:

Aldoze: ce prezintă o grupare carbonil la nivelul primului atom de carbon. Se mai numește și aldehidă;

Cetoze: prezintă o grupare carbonil între carbonul întâi și ultimul fără să fie într-o extremitate a catenei. Se mai numește și cetonă.

Numărul atomilor de carbon:

Dioze: cu 2 atomi de carbon. Este reprezentat doar de aldehida glicolică;

Trioze: cu 3 atomi de carbon. Sunt substanțe importante în metabolism și sunt reprezentate de aldehida glicerică și dihidroxiacetona;

Tetroze: cu 4 atomi de carbon. Sunt foarte puțin răspândite în natură. Avem ca exemple de reprezentanți apioza, eritruloza și treoza;

Pentoze: cu 5 atomi de carbon. Sunt foarte des întâlnite în natură. Reprezentanți: riboza, dezoxiriboza, xiloza, xiloza, fucoza, etc;

Hexoze: cu 6 atomi de carbon. Alături de pentoze sunt frecvent întâlnite în natură. Reprezentanți: glucoza, fructoza, altroza, galactoza, manoza, etc;

Heptoze: cu 7 atomi de carbon. Sunt foarte rar întalnite, de exemplu manoheptuloza;

Octoze: cu 8 atomi de carbon. Reprezentant : D-gliceromanooctuloza;

Nonoze: cu 9 atomi de carbon. Apar în cantitați neînsemnate în unele procese de fermentații: D-eritroglucononuloza;

Decaoze: cu 10 atomi de carbon. Obținute doar prin sinteză.

După orientarea grupării hidroxid de la nivelul atomului de carbon asimetric:

D -oze(dextro): dacă –OH-ul penultim este situat spre dreapta;

L -oze(levo): dacă -OH-ul penultim este situat spre stanga.

După sensul de rotire a luminii polarizate:

+ -oze: dacă planul luminii polarizate este rotit spre dreapta, substanța este dextrogiră (+,D), exemplu: Glucoza;

– -oze: dacă planul luminii polarizate este rotit spre stanga, substanța este levogiră (-,L), exemplu: Fructoza.”

I.2.3. Proprietăți fizice ale monoglucidelor

Sunt substanțe:

solide, cristaline;

albe cu gust dulce;

solubile în apă, mai greu solubile în alcool și insolubile în solventi organici.

I.2.4. Proprietăți chimice ale monoglucidelor

I.1.1.Reacții de adiție:

Adiția H2 Polialcooli

Monoglucidele care diferă structural doar la primii doi atomi de carbon se numesc epimere și pot fi transformate cu ușurință una în alta în organisme prin procesul denumit epimerizare.

I.1.2. Reacții de condensare:

I.2.1. Reacții de oxidare:

II.1.1. Eterificare: R1-OH + HO –R2 -H2O R1-O-R2 eter

II.1.2 Esterificare: R1-OH + HOOC-R2 –H2O R1-O-OC-R2 ester

II.2.1. Eterificare:

II.2.2. Esterificare:

II.2.3. Deshidratare:

I.2.5. Rol biochimic

Rol în procesul de respirație fiind principalele furnizoare de energie;

Rol în formarea ozidelor sau a altor substanțe importante în viață(coenzime, complexe, elemente ale imunitații etc.).

I.2.6. Glucoza

“Este un compus organic care face parte din clasa glucidelor. Glucoza este un glucid prezent atât în regnul animal cât și cel vegetal. Este principala sursă de energie a organismelor vii.

Formula chimică a glucozei este: C6H12O6. Deșii are aceeași formulă chimică ca a fructozei aceasta se diferențiază datorită formulei structurale prin modul de legare a atomilor.

“Molecula glucozei, nu este liniară (aciclică) ci ciclică (semiacetalică). La această concluzie  s-a ajuns după ce s-a observat că gruparea carbonil (-C=O) nu este liberă, ci mascată, transformându-se ușor într-o grupare hidroxilică activă .”[2]

Se cunoaște faptul că la nivelul primului atom de carbon din molecula glucozei, se găsește o grupă carbonil aldehidică. Însă, prin reprezentarea ciclică, se constată că atomul de carbon 1 se leagă de carbonul 5, cu ajutorul unui atom de oxigen, formându-se legătura 1,5 eterică (legătură lactolitică). În acest mod se formează un inel piranic, iar la nivelul carbonului 1 apare o legătura hidroxid. Se poate spune că gruparea carbonilică formează cu una din grupele hidroxilice (cea de la carbonul 5 în acest caz) un semiacetal ciclic.

Dacă semiacetalul ciclic se formează cu gruparea hidroxid de la carbonul 4 se va forma inelul furanic iar dacă se va forma de la carbonul 5 se va forma inelul piranic.

Când glucoza constituie un ciclu format din 4 atomi de carbon iar unul de oxigen aceasta se numește glucofuranoză, iar atunci când constituie un inel din 5 atomi de carbon iar unul de oxigen se numește glucopiranoză.

Având o formă ciclică glucoza are doi anomeri și anume și . Aceștia sunt determinați de orientarea grupării hidroxid de la carbonul 1. Când hidroxidul semiacetalic se află în partea dreaptă a catenei, în formula de perspectiva respectiv în partea de jos se obține anomerul iar când hidroxidul acetalic se situează în partea stângă, respectiv sus, se formează anomerul .”

Glucoza proprietăți fizice :

Este o substanța solidă, albă, cristalină;

Este solubilă în apă, insolubilă în benzen cloroform și eter, greu solubilă in alcool etilic;

Are gust dulce;

Are punct de topire foarte ridicat deoarece între numeroasele sale grupări hidroxil se formează multe legături de hidrogen;

Are 75% din puterea de îndulcire a fructozei;

Anomerii sunt mai dulci decât cei ;

Amestecul dintre glucoză și fructoză relativ echidistant se numește zahăr invertit.”

Glucoza se gasește în stare liberă în natură, în fructe, miere, în sânge și în stare legată în diglucide (zahar, lactoza), poliglucide (amidon, celuloza, glucide complexe etc.).

Glucoza dă toate reacțiile caracteristice monoglucidelor.

Concentrația glucozei în sânge este relativ constantă și se numește glicemie. Glicemia este mentinută constantă în sânge, hormonal sub acțiunea insulinei.

I.3. Oligoglucide

I.3.1. Definiție

“Oligoglucidele sunt ozide care au în structura lor între 2 și 6 resturi de monoglucide. Acestea se mai numesc și oligozaharide.

I.3.2. Clasificare

“

Diglucidele pot fi:

Reducătoare (monocarbonilice): -OH glic + -OH alc } se oxidează;

Nereducătoare (dicarbonilice): -OH glic + -OH glic } nu se oxidează.

Diglucidele reducătoare :

Maltoza= glc + glc (1,4);

Lactoza= glc + gal (1,4);

Celobioza= glc + glc (1,4).

Maltoza se formează ca produs de reacție la hidroliza amidonului cu amilaze.

Amidon amilaze maltoza + dextrine

Lactoza se gaseste în lapte în cantitate: 4-5% de animale, 6% uman.

Celobioza este unitatea structurală a celulozei. Ea se gasește liberă în omizi, viermi.

Diglucide nereducătoare:

Zaharoza: glc + fr (1,2)

I.4. Poliglucide

I.4.1. Definiție

Sunt macromolecule formate prin eliminarea apei, repetat, între un numar foarte mare de monoglucide de la 90 la sute de mii, cu formare de legături glicozidice de tip sau , în general între: C1 și C4; C1 și C6; C1 și C3; C1 și C2(rar).

Poliglucidele au rol de susținere în plante și de structură și rezervă în animale (carapace și tegumente exterioare la insecte și crustacee).

Sunt substanțe solide, amorfe, greu solubile în apă și se prezinta ca pulberi albe și prin dizolvare formează soluții coloidale.

I.4.2. Clasificare

Poliglucide:

Fără aminoglucide:

Omogene:

Hexozani: Glucani(amidon, glicogen, celuloza), Manani, Galactani, Fructani;

Pentozani: Xilani, Arabani;

Neomogene:

Mai multe monoglucide: Glucoarabani, Galactomanani;

Poliglucide bacteriene;

Cu aminoglucide:

Mucopoliglucide.

Hexozanii pot fi de origine vegetală sau animală. Cei mai răspândiți sunt glucanii care se obtin prin eliminarea apei din mai multe molecule de glucoza.

Glucani:

Amidon;

Glicogen;

Celuloza.

Amidonul este un poliglucid de origine strict vegetală, fiind cea mai importantă sursă de rezervă a plantelor. Se formează în plante prin procesul de fotosinteza la nivelul cloroplastelor obținandu-se glucoza care este depozitată sub formă de granule de amidon în diferite țesaturi ale plantei.

Se găsește în proporție de 82-62% în orez, 75-65% în porumb, 75-57% în grau, 20-15% în cartof.

Amidonul se prezintă în stare pura sub formă de pulbere albă, higroscopică, insolubil în apă caldă și puțin solubil în apă rece.

Amidonul gelifică, formând clei de amidon.

Structura:

Amiloza : 20-30% amidon; are o structură liniară, helicoidală (-helix); formată din unitați repetitive de maltoză, M= 12000-36000, n=2000-3000 unitați, cu iod dă o colorație albastră;

Amilopectina: 70-80% amidon; are o structură ramificată arborescentă; glc legat 1,4 glic, 1,6 glic(ramificații), prin hidroliza amilazică sub acțiunea amilazelor formează maltoză și dextrine, M~ 10.000000.

Dextrinele sunt poliglucide intermediare, cu grad de polimerizare mai mic decât amilopectina și se formează datorită faptului că amilazele nu pot hidroliza(rupe) legăturile de ramificație 1,6.

Amilazele sunt de două tipuri:

amilaze care sunt prezente și în regnul animal (saliva, sucul pancreatic și intestinal);

amilaze care sunt de proveniența strict vegetală (are atat cat și amilaze).

Glicogenul (amidon animal) este strict de proveniență animală și reprezintă rezerva glucidică a regnului aninele sunt poliglucide intermediare, cu grad de polimerizare mai mic decât amilopectina și se formează datorită faptului că amilazele nu pot hidroliza(rupe) legăturile de ramificație 1,6.

Amilazele sunt de două tipuri:

amilaze care sunt prezente și în regnul animal (saliva, sucul pancreatic și intestinal);

amilaze care sunt de proveniența strict vegetală (are atat cat și amilaze).

Glicogenul (amidon animal) este strict de proveniență animală și reprezintă rezerva glucidică a regnului animal. Se gasește ca atare unde este nevoie de energie: ficat, mușchi, sistem nervos.

Structura:

Foarte asemănător cu amilopectina, format din glc legat 1,4 și 1,6 glicozidic, însa cu o structră mult mai ramificată și cu masa moleculară mult mai mare;

Se prezintă ca o pulbere albă, mai solubil ca amidonul, formând soluții coloidale opalescente;

Cu iod da o colorație rosu-brun

Celuloza este un poliglucid de origine strict vegetală care îndeplinește în plante rol de susținere și de rezistența. Este prezentă în cantitate de 98-99.8% în bumbac și 30-50% în lemn.

Formată din n molecule de celobioză având o structură liniară rezultă fibre de celuloză, glc legat 1,4 glicozidic rotite la 180° una față de cealaltă. Fibra de celuloza ii oferă o rezistență chimică și mecanică. Fibra de celuloză își mărește volumul. În prezența reactivului Schweitzer [Cu(NH3)4]2OH, celuloza precipită.

Celuloza poate absorbi apa care pătrunde între fibrele de celuloza. Este o substanța albă, amorfă, fără gust, fără miros.

Poliglucidele bacteriene se mai numesc și imunopoliglucide. Ele sunt produse de bacterii și determina specificitatea imunologică.

La inoculare în organism determină imunitate împotriva infecțiilor produse de bacterii. Determină apariția de anticorpi pentru antigenii introduși.

Distrugerea antigenilor se face prin coagulare (aglutinare) sau dezagregare (bacterioliză).

Reprezentant: celobiurenic.

Mucopoliglucidele se mai numesc și aminopoliglucide. Ele sunt de origine strict animală si au rol structural (intră în structura mucoaselor). Sunt componente de bază a țesutului conjunctiv, ale membranelor celulare, dermă și tegumente.

Prezente în stare liberă ți în mod special legate de proteine în complexe glicoproteice.

Ele formează soluții vâscoase cu apa, având funcție de cimentare a țesutului conjunctiv cu rol de protecție a diverselor țesuturi. Aglutinează globulele roșii creînd specificitatea de grupe sangvine.

Capitolul II. Metode de analiză a glucidelor

II.1. Noțiuni generale

“Pentru obținerea unor rezultate bune de analiză se urmărește să se respecte trei reguli esențiale și anume:

Recoltarea și pregătirea probelor;

Efectuarea corectă a analizelor;

Calcularea și interpretarea corectă a rezultatelor obținute.

Obținerea corectă a rezultatelor constă în recoltarea unor probe reprezentative și respectarea cu strictețe a metodelor de lucru în funcție de natura acestora. Recoltarea se face de către personalul calificat iar probele pot fi colectate din depozite, unități de producție etc.

Recoltarea se face cu ustensile curate care după care proba se eticheteză și se sigilează pentru evitarea contaminării cu impurități. Se asigură ca pe perioada transportului proba să nu se altereze sau să-și modifice insușirile. Laboratoarele sunt obligate să stocheze și să țină evidența probelor analizate în format electronic în baza de date.”

II.2. Clasificarea metodelor de analiză a glucidelor

Metode chimice;

Metode enzimatice;

Metode fizice;

Imunoteste;

Metode cromatografice.

“1. O serie de metode chimice utilizate pentru determinarea monozaharidelor și a oligozaharidelor se bazează pe faptul că multe dintre aceste substanțe sunt agenți reducători și pot reacționa cu alte componente pentru a da precipitate sau complecși ce pot fi cuantificați. Concentrația glucidelor se poate determina gravimetric, spectrofotometric sau prin titrare. Glucidele nereducătoare pot fi determinate prin aceleași metode dacă sunt mai întâi hidrolizate.

Determinarea concentrației este posibilă atât la glucidele reducătoare cât și la cele nereducătoare prin realizarea unei analize de zaharuri reducătoare înainte și după hidrolizare. Există mai multe metode chimice de cuantificare a glucidelor. Cele mai multe pot fi împărțite în trei: titrare, gravimetrice și colorimetrice. Un exemplu din fiecare este prezentat mai jos.

Metode de titrare: metoda Lane-Eynon este un exemplu de titrare determinând concentrația de zaharuri reducător într-un eșantion . O biuretă este utilizată pentru a adăuga soluția de carbohidrat care este analizat într-un balon care conține o cantitate cunoscută de soluție de sulfat de cupru ajunsă la fierbere și un indicator de albastru de metilen . Zaharurile reducătoare din soluția de carbohidrați reacționează cu sulfatul de cupru prezent în balon . Odată ce tot sulfatul de cupru în soluție a reacționat , orice alt adaos de zaharuri reducătoare determinând astfel schimbarea indicatorul de la albastru la alb . Volumul de soluție de zahăr necesară pentru a atinge punctul final este înregistrată . Reacția nu este stoichemetrică , ceea ce înseamnă că este necesar să se pregătească o curbă de calibrare prin realizarea experimentului cu o serie de soluții standard de glucide de o concentrație cunoscută.

Metode gravimetrice: metoda Munson și Walker poate determina concentrația zaharurilor reducătoare dintr-o probă. Glucidele sunt oxidate de căldură și un exces de sulfat de cupru și un tartrat alcalin care sunt atent controlate duce la formarea de un precipitat de oxid de cupru.

Cantitatea de precipitat format este direct legat de concentrația de reducere a glucidelor din eșantionul inițial. Concentrația se poate determina gravimetric prin filtrare, uscare și cântărire sau prin titrare prin redizolvarea precipitatului și folosirea unui indicator adecvat.

Metode colorimetrice: glucidele reacționează cu reactivul Anthrone în condiții acide pentru a produce o culoare albastru-verde. Eșantionul este amestecat cu acid sulfuric, reactiv Anthrone și apoi se fierbe până când reacția este completă. Soluția se lasă la răcit și i se măsoară absorbanța la 620nm. Aceasta nu este o metoda stoechiometrică așa că este necesară trasarea unei curbe de etalonare folosind o serie de standarde și concentrații cunoscute.

2. Metodele enzimatice se bazează pe capacitatea lor de a cataliza reacțiile specifice. Aceste metode sunt rapide, foarte specifice și sensibile la concentrații scazute și prin urmare sunt ideale pentru determinarea glucidelor din alimente. Lichidele pot fi testate direct, întrucât alimentele solide trebuie să fie dizolvate în apă.

Determinarea glucozei ți fructozei implică o serie de pași dar mai întâi glucoza trebuie transformată în glucoză-6-fosfat (G6P) de către enzima hexakinase și ATP apoi G6P este oxidat de NADP în prezență de G6P+dehidrogenaza. Cantitatea de NADPH este proporțională cu concentrația de G6P în probă și poate fi măsurată spectrofotometri la 340nm. Apoi se determină concentrația de fructoză prin convertirea fructozei in glucoză folosind alte enzime specifice și repetarea procedurii de mai sus.

Determinarea concentrației maltozei și a zaharozei intr-o probă poate fi determinată după aflarea concentrației glucozei și fructozei determinate precedent. Acestea sunt rupte in monozaharide de enzima glucozidaza.

3. Metodele fizice au fost utilizate în determinarea concentrației de carbohidrați în alimente. Cele mai utilizate metode sunt polarimetrice, indicele de refracție, IR și a densitații.

Metoda polarimetrică: moleculele care conțin un atom de carbon asimetric au capacitatea de a roti planul luminii polarizate. Un polarimetru este un dispozitiv care măsoară unghiul luminii polarizate ce se rotește și trece printr-o soluție. Un polarimetru constă dintr-o sursă de lumină monocromatică, un polarizor, o celulă eșantion de lungime cunoscută, și un analizor pentru măsurarea unghiului de rotație. Gradul de polarizare se referă la concentrația moleculelor optic active în soluție prin ecuația a = [a] lc, unde a este unghiul măsurat de rotație, [a] este activitatea optică (care este o constantă pentru fiecare tip de molecule), l este lungimea optică și c este concentrația.

Indicele de refracție: (n) dintr-un material este viteza luminii în vid împărțită la viteza luminii în material (n = c / cm).Indicele de refracție al unui material poate fi determinată prin măsurarea unghiului de refracție (r) și unghiul de incidență (i) la o graniță între acesta și un alt material de indice de refracție cunoscută (Legea Snell’s: sin (i) / sin (r) = n2/n1). În practică, indicele de refracție al soluțiilor de carbohidrați este de obicei măsurată la o limită cu cuarț. Indicele de refracție al unei soluții de carbohidrați crește odată cu creșterea concentrației și astfel poate fi utilizat pentru a măsura cantitatea de carbohidrat prezent. De asemenea, temperatura și lungimea de undă sunt dependente și deci măsurătorile sunt de obicei realizate la o anumită temperatură (20 ° C) și lungimea de undă (589.3nm). Această metodă este rapidă și simplă de efectuat și poate fi realizată cu instrumente simple de mână. Acesta este utilizat în mod curent în industrie pentru a determina concentrațiile de zahăr de siropuri, miere, melasă, produse de tomate și gemuri.

Densitatea: unui material este masa sa împărțită volumul său. Densitatea soluțiilor apoase crește odată cu creșterea concentrației de carbohidrati. Astfel, concentrația de carbohidrați poate fi determinată prin măsurarea densității, de exemplu, folosind sticle de densitate sau Aerometrele. Această tehnică este utilizată în mod curent în industrie pentru determinarea concentrațiilor glucide de sucuri și băuturi.

Infraroșu: un material absoarbe infraroșu din cauza vibrațiilor sau de rotație a grupări moleculare. Glucidele conțin grupări moleculare care absorb radiațiile infraroșii la lungimi de undă în care niciunul dintre ceilalți constituenți alimentaro importanti absorb în consecință concentrația lor poate fi determinată prin măsurarea absorbanței în infraroșu la aceste lungimi de undă. Prin realizarea de măsurători la un număr de diferite lungimi de undă specifice, este posibil să se determine simultan concentrația de glucide, proteine​​, lipide și umiditate. Instrumente analitice bazate pe absorbanței în infraroșu sunt non-distructive și capabile de măsurătorile rapide și de aceea sunt deosebit de adecvate pentru analiza on-line sau pentru a fi utilizate într-un laborator de control al calității în care multe probe sunt analizate în mod curent.

4. Imunotestele: sunt utilizate în industria alimentară pentru analiza calitativă și cantitativă a produselor alimentare. Imunotestele specifice pentru glucide cu greutate moleculară mică sunt dezvoltate prin atașarea glucidei interesată de o proteină, apoi injectarea acesteia într-un animal. Cu timpul animalul dezvoltă anticorpi specifici pentru molecula glucidică. Acești anticorpi pot fi apoi extrași din animal și utilizați ca parte a unui kit de testare pentru determinarea concentrației de glucide specifice în alimente. Imunotestele sunt extrem de sensibile, specifice, ușor de utilizat și rapide

5. Metodele cromatografice sunt cele mai puternice tehnici analitice pentru analiza tipului și concentrației de monozaharide și oligozaharide în produsele alimentare. Cromatografia în strat subțire (TLC), cromatografia de gaze (GC) și cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC) sunt utilizate în mod obișnuit pentru a separa și identifica glucidele. Glucidele sunt separate în funcție de caracteristicile lor de adsorbție diferențială prin trecerea soluției de analizat printr-o coloană. Glucidele pot fi separate pe baza coeficienților de partiție, polarității sau dimensiunii, în funcție de tipul coloanei folosite. HPLC este în prezent cea mai importantă metodă de analiză cromatografică glucidele, deoarece este capabilă să facă măsurători rapide, specifice, sensibile și precise. În plus, GC cere ca probele să fie volatil, care necesită, de obicei, ca acestea să fie aduse în stare gazoasă, în timp ce în probele HPLC pot fi adesea analizate direct. HPLC și GC sunt utilizate în mod obișnuit în combinație cu spectrometria RMN sau de masă, astfel încât structura chimică a moleculelor care formează picurilor pot fi identificate.

Glucidele pot fi, de asemenea, separate prin electroforeză după ce au fost derivatizate pentru a fi încărcate electric, de exemplu, prin reacția cu borați. O soluție din glucide derivatizate este aplicată pe un gel și apoi se aplică o tensiune la bornele sale. Glucidele sunt apoi separate în funcție de mărimea lor: cu cât este mai mică marimea unei molecule glucidice, cu atât mai repede se mișcă într-un câmp electric.”

Capitolul III. Metode cromatografice de analiză a glucidelor

III.1. Noțiuni generale

Toate tehnicile cromatografice au ca elemente comune o fază staționară fixă și o faza mobilă, abreviate in cromatografie cu : FS respectiv FM, iar componenții unui amesctec de analizat sunt angrenați de-a lungul coloanei cromatografice de un flux de FM cu viteze diferite(eluție).

La baza tuturor metodelor cromatografice stau patru procesefundamentale și anume:

Adsorbția pe suporturi solide;

Repartiția între FS și FM;

Schimbul ionic;

Fenomenul de excludere-difuzie.

Indiferent de procesul de separare, etapele unei analize cromatografice sunt aceleași și anume:

Pregătirea FS;

Fixarea inițială a analiților in capul coloanei cromatografice pe FS prin introduceera soluției de probă;

Deplasarea selectivă a analiților angrenați de sus în jos de către FM în cadrul procesului de eluție ;

Identificarea analiților separați cu un sistem de detecție avansat pe măsură ce aceștia părăsesc coloana cromatografică;

Înregistrarea cromatogramelor, calculul ariilor picurilor, dozarea analiților separați.

Cromatograma deține mai multe benzi numite picuri cromatografice, fiecare pic răspunde unui singur analit.

Alegerea FS, se face in funcție de:

Masa moleculară a analiților

Solubilitatea analiților în solvenți organici și apă

Caracterul lor polar/nepolar

Caracterul lor ionic.

III.2. Clasificarea metodelor cromatografice

Cromatografia de adsorbție are ca FS un suport solid si anume Al2O3 sau SiO2 cu proprietăți adsorbante.

Cromatografia de repartiție: FS este o peliculă de lichid fixată pe un suport solid, inert din punct de vedere chimic, această FS lichidă este nemiscibil cu FM.

Cromatografia de schimb ionic: FS este un compus macromolecular ce conține un număr mare de grupări funcționale acide sau bazice, capabile să schimbe protoni sau ionialcalini cu cationi bi și trivalenți sau anioni ca OH⁻, Cl⁻ cu anioni mai grei și cu sarcină mai mare. Aceste FS se numesc cu schimbători de ioni respectiv rășini cationice sau anionice.

Cromatografia de excludere difuzie: FS este un gel care se comportă ca o sită moleculară, fixând anumite molecule și eliminând altele în funcție de mărimea moleculei respectiv masa moleculară.

Cromatografia chirală: FS în acest caz poate avea o structură chirală sau FM poate avea o structură chirală. Această tehnică permite separarea anioniților chirali de cei nechirali, respectiv a enantiomerilor.

Electrocromatografia capilară nicerală: este o tehnică hibridă care îmbină cromatografia cu electroforeza.

III.3. Cromatografia de lichide (de înaltă performanță) HPLC

Sub această denumire sunt descrise cele mai moderne metode de analiză cromatografică bazată pe repartiția lichid lichid, adsorbția lichid solid, schimb ionic și excludere difuzie. În cazul moleculelor mici cu masă moleculară mică se preferă metodele de repartiție, iar pentru moleculele cu masa moleculara mai mare de 10000 U(unități) se utilizează metode de excludere difuzie iar pentru analiții ionici cu masă moleculară mică se utilizează cromatografia de schimb ionic.

Cromatografia de lichide se poate practica pe coloană, iar tehnica se numește HPLC (cromatografia de lichide la înaltă presiune) sau pe o suprafață plană, iar tehnica se numețze cromatografia pe strat subțire TLC ( thin layer cromatography) sau HPTL ( high performance thin layer cromatography).

Cromatografia HPLC pe coloană

Avem două tehnici cromatografice HPLC: de adsorbție și de repartiție.

HPLC de adsorbție este foarte puțin utilizată în zilele noastre. Ca FS se utilizează cilicagelul SiO2 și alumina Al2O3. Silicagelul are proprietăți adsorbante su anumiți parametrii legați de porozitatea particulelor. În cromatografia de absorbție numai compoziția FM poate controla distribuția analiților între cele două faze, spre deosebire de cea de repartiție unde, repartiția analiților este influențată atât de FS cât și de FM.

Ca FM se utilizează un solvent organic sau un amestec de doi sau mai mulți solvenți.

HPLC de repartiție este cea mai utilizată tehnică la ora actuală și se poate practica sub forma HPLC lichid lichid sau HPLC lichid faza legată grafată.

Diferența între cele două se referă la modul de fixare a FS pe suportul solid. În primul caz procesul de repartiție este reprezentat de două tehnici:

Cromatografia de lichide HPLC în faze normale(polaritatea FS < polaritatea FM);

Cromatografia de lichide HPLC in faze inversate(polaritatea FS > polaritatea FM).

În cazul celei de-a doua tehnică FS este legată prin legături covalente. La ora actuală aceasta este cea mai utilizată tehnică.

Alegerea FM se face în funcție de anumite reguli și anume:

FM trebuie să aibă o putere mare de dizolvare, dar să nu interacționeze chimic cu analiții din probă;

FM să fie compatibilă cu sistemul de detecție;

FM să nu dizolve FS și sa nu interacționeze chimic cu aceasta. Condiție mai greu de îndeplinit practic, de aceea pentru rezolvarea acesteia se recurge la saturarea reciprocă a celor 2 faze una cu alta înaintea separării cromatografice sau folosirea unei precoloane încărcată cu FS lichidă care se poziționează înaintea sistemului de injecție a probei.

Cromatografia planară

Cromatografia planară poate fi:

Cromatigrafia pe hârtie;

Cromatografia pe strat subțire.

Cromatografia pe hârtie:

Suportul de FS este hârtia cromatografică care are o structură uniformă și porozitate diferită, ca FS propriu zisă apa este cea mai utilizată.

Hârtia cromatografică fiind hidrofilă ea este impregnată cu apă distilată prin introducerea sa intr+o cameră cromatografică saturată cu vapori de apă. Înafara apei ca și FS lichidă se mai poate utiliza solvenți organici polari cum ar fi: metanolul,glicoli, glicerina, acești solvenți se diluează in solvent organic foarte volatil, iar în soluția rezultată se introduce hârtia cromatografică. Solventul volatil se elimină prin volatilizare la temperatura camerei. Cromatografia pe hârtie are la bază mecanismul de repartiție lichid lichid. În prezent este foarte puțin utilizată pentru analiza unor cationi anorganici, respectiv medicamente radiofarmaceutice.

Cele mai utilizate sisteme sunt:

Isopropanol-amoniac-apă;

n Butanol-acid acetic-apă;

Apă-fenol;

Formamidă-cloroform-benzen;

Formamidă-benzen;

Formamidă-cloroform;

Formamidă-benzen-ciclohexan;

Dimetilformamidă-ciclohexan;

Kerasen-isopropanol 70%;

Ulei de parafină-dimetilformamidă-metanol-apă.

FM de la 1-3 sunt utilizate pentru separarea analiților hidrofili; de la 4-7 sunt utilizate pentru separarea analiților in mediu hidrofobi; de la 8-10 sunt utilizate în separarea analiților hidrofobi.

Cromatografia pe strat subțire:

Este o tehnică mult utilizată în toate laboratoarele de analiză și control chimic, în toate domeniile: medical, biologic, biochimic, chimic, mediu alimentar etc.

Este foarte asemănătoare cu cromatografia de lichide din punct de vedere al teoriei de separare, al fazelor utilizate și aplicațiilor, este mai puțin costisitoare și mai rapidă față de cromatografia pe coloană. De cele mai multe ori este utilizată pentru stabilirea condițiilor optime de separare în cromatografia de lichide pe coloană.

Cele mai utilizate FS sunt: silicagelul, alumina (Al2O3), celuloza.

Pentru straturi subțiri de silicagel și alumină separarea se bazează pe mecanismede repartiție si adsorbție, iar pentru stratul subțire de celuloza separarea se bazează doar pe repartiție. Silicagelul se poate utiliza ca atare sau poate fi modificat chimic prin legarea anmitor grupări funcționale care îi conferă caracter polar sau nepolar astfel se pot grefa grupări: CN, NH2, C6H5, toate cresc polaritatea silicagelului. Pe eticheta se va trece: Kieselgen CN sau NH2, C6H5, RP18 (RP-reverse phase, 18- are 18 atomi de carbon).

Vizualizarea analiților separați prin cromatografia pe strat subțire:

Cea mai folosită examinare a placii în UV la 254 nm, în acest caz se poate observa fluorescența proprie a fiecărui analit, iar în cazul analiților ce nu prezintă fluorescență se utilizează plăci fluorescente pe care analiții apar sub formă de pete întunecate.

O altă tehnică este expunerea plăcii la vapori de iod, ea se realizează prin introducerea plăcii cromatografice într-un spațiu închis în care există vapori de iod.

Pulverizarea de soluții caustice urmată de încălzirea la 100°C este o altă tehnică în vizualizarea analiților. Dintre reactivi cei mai utilizați sunt H2SO4 concentrat, H3PO4 sau reactivi oxidași K2Cr2O7, KMnO4 în soluție sulfurică.

III.4. Cromatografia de gaze

Este o metodă de separare care permite separarea analiților utilizând două faze și anume: FS și FM care este un gaz purtător.

Ea cuprinde două tehnici:

Cromatografia gaz-lichid: în care FS este un film (o peliculă) lichid depus pe un suport solid inert din punct de vedere chimic, iar procesul de separare se bazează pe un mecanism de repartiție. Cea mai utilizată tehnică este aceasta;

Cromatografia gaz-solid: în care FS este un solid adsorbant iar procesul de separare se bazează pe adsorbție.

Moleculele separate prin cromatografia de gaze trebuie să îndeplinească o condiție obligatorie și anume să fie aduse în fază gazoasă prin volatilizare pentru a putea fi purtate de FM de-a lungul coloanei. Acest lucru impune ca majoritatea operațiilor într-o analiză cromatografică să se realizeze la o anumită temperatură care menține analiții in fază gazoasă.

Temperatura maximă cu care se poate lucra este de 400°C. compușii care au punct de fierbere până în această temperatură se analizează cu ușurință în cromatografia de gaze întrucââât prin volatilizare nu se modifică integritatea chimică structurală.

Bibliografie:

¹ Neamțu, G. Substanțe naturale biologic active – Volumul I – Vitamine, Editura Ceres, București, 1996

5 Cornelia Purcarea, Amorin Popa, Iudith Ipate, Maria Duca, Rolul științelor și tehnologiilor în siguranța alimentară în corelație cu alimentația sănătoasă și rolul său în prevenirea unor boli metabolice, Viena, 2012

Cărăban Alina, Curs biochimie specializarea chimie pe anul 2012-2013

Popa Vasilica, Curs chimie analitică metode instrumentale pe anul 2013-2014

Webgrafie:

¹ Neamțu, G. Substanțe naturale biologic active – Volumul I – Vitamine, Editura Ceres, București, 1996, sursa:

http://www.bioterapi.ro/aprofundat/index_aprofundat_index_enciclopedic_substanteGlucidele%28nsm%29.html

² http://www.bioterapi.ro/aprofundat/index_aprofundat_index_enciclopedic_substanteMonoglucide%28oze%29.html

³

http://www.bioterapi.ro/aprofundat/index_aprofundat_index_enciclopedic_substanteGlucoza.html

4 http://www.bioterapi.ro/aprofundat/index_aprofundat_index_enciclopedic_substanteOligoglucide%28ozide%29.html

6 http://people.umass.edu/~mcclemen/581Carbohydrates.html

http://www.slideshare.net/dianapacu/proiect-chimie-zaharidele

http://www.bioterapi.ro/aprofundat/index_aprofundat_index_enciclopedic_substanteMonoglucide%28oze%29.html

http://ro.wikipedia.org/wiki/Glucoz%C4%83

http://www.scribd.com/doc/67619105/glucides

http://biblioteca.regielive.ro/referate/industria-alimentara/glucidele-si-rolul-lor-in-alimentatie-258993.html

Bibliografie:

¹ Neamțu, G. Substanțe naturale biologic active – Volumul I – Vitamine, Editura Ceres, București, 1996

5 Cornelia Purcarea, Amorin Popa, Iudith Ipate, Maria Duca, Rolul științelor și tehnologiilor în siguranța alimentară în corelație cu alimentația sănătoasă și rolul său în prevenirea unor boli metabolice, Viena, 2012

Cărăban Alina, Curs biochimie specializarea chimie pe anul 2012-2013

Popa Vasilica, Curs chimie analitică metode instrumentale pe anul 2013-2014

Webgrafie:

¹ Neamțu, G. Substanțe naturale biologic active – Volumul I – Vitamine, Editura Ceres, București, 1996, sursa:

http://www.bioterapi.ro/aprofundat/index_aprofundat_index_enciclopedic_substanteGlucidele%28nsm%29.html

² http://www.bioterapi.ro/aprofundat/index_aprofundat_index_enciclopedic_substanteMonoglucide%28oze%29.html

³

http://www.bioterapi.ro/aprofundat/index_aprofundat_index_enciclopedic_substanteGlucoza.html

4 http://www.bioterapi.ro/aprofundat/index_aprofundat_index_enciclopedic_substanteOligoglucide%28ozide%29.html

6 http://people.umass.edu/~mcclemen/581Carbohydrates.html

http://www.slideshare.net/dianapacu/proiect-chimie-zaharidele

http://www.bioterapi.ro/aprofundat/index_aprofundat_index_enciclopedic_substanteMonoglucide%28oze%29.html

http://ro.wikipedia.org/wiki/Glucoz%C4%83

http://www.scribd.com/doc/67619105/glucides

http://biblioteca.regielive.ro/referate/industria-alimentara/glucidele-si-rolul-lor-in-alimentatie-258993.html